KR101785847B1

KR101785847B1 - 선형 이중가닥 ＤＮＡ를 활용한 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ 시스템을 이용한 표적 유전체 교정

Info

Publication number: KR101785847B1
Application number: KR1020160058214A
Authority: KR
Inventors: 방두희; 이지현; 임현섭; 전소영
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2017-10-17
Anticipated expiration: 2036-05-12
Also published as: KR20160133380A

Abstract

본 발명은 선형 이중가닥 DNA를 활용한 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 표적 유전체 교정에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 가이드 RNA와 도너 DNA가 결합된 선형 이중가닥 DNA를 CRISPR-Cas9 기반 유전체 교정에 사용함으로써 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 고-효율로 치환 돌연변이를 유도할 수 있는 효과를 제공한다.

Description

선형 이중가닥 ＤＮＡ를 활용한 ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ 시스템을 이용한 표적 유전체 교정{Targeted genome editing based on CRISPR/Cas9 system using short linearized double-stranded DNA}

본 발명은 가이드 RNA 및 도너 DNA를 발현하는 선형 이중가닥 DNA를 활용한 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 표적 유전체 교정에 관한 것이다.

차세대 시퀀싱(next-generation sequencing, NGS) 및 마이크로어레이에 기반을 둔 유전자 연구들로부터 유전병(Mendelian diseases)에 연관된 많은 잠재적 원인 변이(causal variant) 및 암에 관련된 체세포 변이(somatic variant)와 더불어 수백 개의 인간 형질에 관련된 수천 개의 유전자 위치들(loci)이 동정되었다.

최근에 개발된 RNA 유전자가위(RNA-guided CRISPR)(clustered regularly interspaced short palindrome repeats)-연관된 뉴클레아제 Cas9에 기반된 유전체 교정(genome editing)은 표적 넉-아웃, 전사 활성화 및 single guide RNA(sgRNA)(즉, crRNA-tracrRNA 융합 전사체)를 이용한 억제에 대한 획기적인 기술을 제공하며, 이 기술은 수많은 유전자 위치를 표적 함으로써 확장성을 입증하였다. 그러나, 넉-아웃 또는 전사 조절과는 달리, CRISPR-기반 SNV(single nucleotide variation) 발생은 주로 단일 유전체 위치(single genomic locus)에 제한된다. 최근에 대장균 공학으로 널리 알려진 전략인 올리고뉴클레오티드-매개 상동 재조합(homologous recombination, HR) 방법이 인간 세포에서 다중 치환 돌연변이를 도입하기 위해 제시되고 있으나, 유전체-수식 사건의 희박한 발생(10⁵~10⁷ 세포 중 하나) 및 낮은 수율로 인해 여전히 어려움이 있다.

M. Jinek et al. Science 2012, 337, 816-821 O. Shalem et al. Science 2014, 343, 84-87 T. Wang et al. Science 2014, 343, 80-84 L. A. Gilbert et al. Cell 2014, 159, 647-661 S. Konermann et al. Nature 2015, 517, 583-588 L. Cong et al. Science 2013, 339, 819-823 P. Mali et al. Science (New York, N.Y.) 2013, 339, 823-826 D. Yu et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2000, 97, 5978-5983 H. H. Wang et al. Nature 2009, 460, 894-898

본 발명의 목적은 CRISPR-Cas9 기반 유전체 교정 시스템에서 가이드 RNA와 도너 DNA가 결합된 형태를 세포에 전달함으로써 고-효율로 치환 돌연변이를 유도하는 선형 이중가닥 DNA를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 선형 이중가닥 DNA의 CRISPR-Cas9 기반 유전체 교정 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 가이드 RNA를 발현하기 위한 프로모터; 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 터미네이터; 및 도너 DNA(donor DNA)를 포함하는 선형 이중가닥 DNA를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 선형 이중가닥 DNA; 및 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터를 포함하는 CRISPR-Cas9 기반 유전체 교정용 조성물을 제공한다.

본 발명은 가이드 RNA와 도너 DNA가 결합된 선형 이중가닥 DNA를 CRISPR-Cas9 기반 유전체 교정에 사용함으로써 진핵 세포 또는 원핵 세포에서 고-효율로 치환 돌연변이를 유도할 수 있는 효과를 제공한다.

도 1은 본 발명의 sgRNA와 도너 DNA 결합을 통한 전달 시스템의 필요성을 나타낸 도면이다.
도 2는 기존 전달 방법과 비교하여 본 발명의 sgR-DNA를 통한 전달 방법의 유용성을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 sgR-DNA 컨스트럭트를 나타낸 것이다.
도 4는 대장균에 전달하기 위한 본 발명의 sgR-DNA 컨스트럭트를 합성하는 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 인간 세포에 전달하기 위한 본 발명의 sgR-DNA 컨스트럭트를 합성하는 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 대장균에 전달하기 위해 합성된 본 발명의 sgR-DNA 컨스트럭트와 galK 유전자를 교정하기 위한 실험 과정을 나타낸 것이다.
도 7은 대장균에 전달하기 위해, sgRNA를 발현하는 선형 이중가닥 DNA를 합성하는 과정을 나타낸 것이다.
도 8은 대장균 galK 위치에서의 상동 재조합 효율을 도너 길이(63 nt, 93 nt, 123 nt)에 따라 나타낸 것이다.
도 9는 대장균 galK 위치에서, sgRNA 및 ssODN과 sgR-DNA를 사용했을 때의 상동 재조합 효율을 나타낸 것이다.
도 10은 대장균의 다중 위치 유전체 교정 확인을 위해 표적으로 한 유전체 전체에 걸쳐 분포된 11개의 aro 유전자와 이를 표적으로 하는 sgR-DNA 라이브러리를 이용하여 실험한 것을 나타낸 것이다.
도 11은 대장균의 다중 위치 유전체 교정 효율을 나타낸 것이다.
도 12는 인간 세포에 전달하기 위해 합성된 본 발명의 sgR-DNA 컨스트럭트를 나타낸 것이다.
도 13은 EGFR 표적에 대해 4개의 미스매치 서열을 갖는 도너 DNA를 나타낸 것이다.
도 14는 인간 세포에 전달하기 위해, sgRNA를 발현하는 선형 이중가닥 DNA를 합성하는 과정을 나타낸 것이다.
도 15는 인간 세포 EGFR 위치에서의 상동 재조합 효율을 나타낸 것이다.
도 16은 인간 세포 EGFR 위치에서의 삽입-결손 효율을 나타낸 것이다.
도 17은 Sanger 시퀀싱을 통해 단일 클론에서 표적 유전자 위치의 유전자형을 확인한 것이다.
도 18은 오프 표적 위치에서의 삽입-결손 효율이 EGFR 표적 위치보다 낮음을 나타낸 그래프이다.
도 19는 오프 표적 위치에서 각각의 염기 위치에 대한 삽입-결손 발생의 비율 분포를 나타낸 것이다.
도 20은 오프 표적 위치에서 삽입-결손 크기의 분포를 나타낸 것이다.
도 21은 BRAF 위치에서의 치환 효율을 나타낸 것이다.
도 22는 KRAS 위치에서의 치환 효율을 나타낸 것이다.
도 23은 인간 세포의 다중 위치 유전체 교정 확인을 위해 표적으로 한, 유전체 전체에 걸쳐 분포된 10개의 유전자와 이를 표적으로 하는 sgR-DNA 라이브러리를 이용하여 실험한 것을 나타낸 것이다.
도 24는 인간 세포의 다중 위치 유전체 교정 효율을 나타낸 것이다.
도 25는 프로그램이 가능한 마이크로어레이로부터 절단된 올리고뉴클레오티드 풀을 이용하여 sgR-DNA 라이브러리 구축하는 과정을 나타낸 것이다.

CRISPR/Cas9-기반 유전체 교정에 있어서, 본 발명자들은 고-효율의 치환 돌연변이 발생 기술의 부족이 적당한 전달 시스템의 부재에서 기인할 수 있다는 가설을 세웠다. 단일 표적-특이 성분으로서, sgRNA 벡터를 이용한 넉-아웃 수식과는 달리, 치환 수식은 계획된 돌연변이를 포함하는 부가적인 도너 DNA를 필요로 하므로, 표적 부위에 sgRNA 및 매칭되는 도너 DNA를 위치시키기 위해서는 결합을 통한 전달 시스템이 필요하다(도 1). 이 가설에 근거하여, 본 발명자들은 다중 위치 교정 방식에서 CRISPR/Cas9-기반 치환 교정을 촉진하기 위해 선행 전달 방법보다 쉽게 제조될 수 있는 sgRNA 전사체를 인코딩하는 DNA 및 도너 DNA의 조립을 통해 sgR-DNA(즉, matched sgRNA-donor DNA pair)를 개발하였다(도 2). 본 발명의 CRISPR/Cas9-기반 시스템의 능력을 확인하기 위해, 대장균 공학에 이 시스템을 적용하고 나서, 포유동물 세포 공학으로 확장하였다. 그리고 나서, sgR-DNAs 풀(pool)이 대장균(11-plex) 및 인간 유전체(10-plex) 둘 다에서 치환 돌연변이의 다중 발생에 이용될 수 있는 지를 관찰함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 가이드 RNA를 발현하기 위한 프로모터; 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 터미네이터; 및 도너 DNA(donor DNA)를 포함하는 선형 이중가닥 DNA를 제공한다.

본 발명의 선형 이중가닥 DNA은 CRISPR-Cas9 시스템에서 표적 유전자를 인식하는 가이드 RNA를 발현할 수 있는 구조물로서, 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 및 도너 DNA가 결합된 구조로 되어 있어 가이드 RNA와 매칭된 도너 DNA 쌍이 동시에 세포 내로 전달되고, Cas9 단백질에 의한 표적 DNA의 절단 시 도너 DNA의 상동 재조합을 통해 표적 DNA 대신 미스매치 코돈을 포함하는 도너 DNA가 유전체 내에 포함되어 표적 DNA의 치환 돌연변이 효율을 높일 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서, 용도 "절단"은 뉴클레오티드 분자의 공유결합 백본의 파손(breakage)을 의미한다.

바람직하게는, 본 발명의 선형 이중가닥 DNA는 가이드 RNA를 발현하기 위한 프로모터; 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 터미네이터; 및 도너 DNA가 순차적으로 연결된 구조일 수 있다. 따라서, 세포 내로 전달된 선형 이중가닥 DNA는 프로모터에 의해 가이드 RNA로 전사되고, 터미네이터를 통해 전사가 종결되므로, 도너 DNA의 전사는 일어나지 않게 된다. 상기 도너 DNA는 표적 DNA의 절단 후 상동 재조합에 참여하여 표적 DNA의 치환 돌연변이를 유도하게 된다.

상기 표적 DNA는 내재적 DNA(endogenous DNA) 또는 인위적인 DNA(artificial DNA)일 수 있으나, 바람직하게는, 내재적 DNA이다.

상기 선형 이중가닥 DNA는 마이크로어레이에서 쉽게 제조할 수 있어 벡터를 사용하는 선행기술 대비 생산 공정이 간단하고, 비용이 절감되며, 원핵 세포 또는 진핵 세포의 유전체 교정에 사용할 수 있어 확장성을 가지고 있는 것을 특징으로 한다.

상기 프로모터는 표적 DNA에 특이적인 가이드 RNA를 세포 내에서 발현하기 위한 프로모터로서, 세포의 종류에 따라 당업자 수준에서 적절히 채택하여 사용할 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예컨대, T7 프로모터, SP6 프로모터, rpr-1 프로모터, rrk 프로모터, 또는 U6 프로모터등 교정하고자 하는 생물의 유전체에서 작동하는 프로모터를 사용할 수 있다.

상기 가이드 RNA는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, 세포 내로 전달된 선형 이중가닥 DNA의 전사를 통해 발현되어 표적 유전자를 인식하고 Cas9 단백질과 복합체를 형성할 수 있고 Cas9 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA이다. 따라서, 상기 가이드 RNA는 표적 DNA를 인식할 수 있는 스페이서; 및 표적과 무관한 불변 서열(non-variable sequence)로 이루어진 가이드 RNA 스캐폴드를 포함한다.

상기 스페이서는 가이드 RNA가 표적 DNA를 인식할 수 있게 하는 서열을 의미하며, 표적 DNA 위치의 근처에 있는 protospacer adjacent motifs(PAMs) 서열의 일부 또는 전체를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 PAMs에 인접한 서열을 사용할 수 있다. 또한, 상기 스페이서는 표적 세포의 종류에 따라 적당한 변형이 가해질 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 인간 세포에 도입하기 위해 PAM에 인접한 서열에 엑스트라 5'G를 결합시켜 스페이서를 제조할 수 있다.

상기 가이드 RNA 스캐폴드는 두 개의 RNA, 즉, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA(transactivating crRNA, tracrRNA)로 이루어져 있는 것일 수 있으며, 또는 crRNA 및 tracrRNA의 필수적 부분의 융합에 의해 생성된 단일 사슬 RNA (single-chain guide RNA, sgRNA)일 수 있다. 상기 가이드 RNA는 crRNA 및 tracrRNA를 포함하는 이중 RNA (dual RNA)일 수 있다. 만약 상기 가이드 RNA 스캐폴드가 crRNA 및 tracrRNA의 필수적인 부분 및 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 가이드 RNA 스캐폴드라도 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.

바람직하게는, 단일-사슬 가이드 RNA일 수 있다.

상기 터미네이터는 가이드 RNA를 코딩하는 DNA의 전사를 종결하기 위해 가이드 RNA를 코딩하는 DNA 말단에 연결되는 것으로, 프로모터에 맞게 당업자의 적정 선택 수준에서 채택하여 사용할 수 있어 특별히 제한하지는 않으며, 예컨대, RNA Polymerase III terminator 또는 -TTTTTT- 서열일 수 있다.

상기 도너 DNA는 PAM 서열을 포함하고, 표적 DNA에 대해 1 내지 3개의 뉴클레오티드의 미스매치를 갖는 변이 코돈을 포함하는 상동 서열로 이루어진 것일 수 있다.

또한, 상기 도너 DNA는 치환 후 같은 코돈을 갖는 PAM을 포함하도록 설계하여 염기 변이가 발생한 후 PAM 서열의 추가적인 인지가 일어나지 않도록 도너 DNA 서열 내에 PAM 서열을 포함하도록 할 수 있다.

상기 Cas9 단백질은 CRISPR/Cas9 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때, 활성 엔도뉴클레아제를 형성한다. Cas9 유전자 및 단백질의 정보는 국립생명공학정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)의 GenBank에서 구할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 Cas9 단백질이 세포 내로 전달될 경우, 단백질 전달 도메인(protein transduction domain)과 연결될 수 있다. 상기 단백질 전달 도메인은 폴리-아르기닌(poly-arginine) 도메인 또는 HIV로부터 유래한 TAT 단백질일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 Cas9 단백질은 Cas9 단백질을 발현하는 벡터, 즉, Cas9 단백질 코딩 핵산을 포함하는 벡터의 형태로 형질주입을 통해 전달될 수 있다. 상기 Cas9 단백질 코딩 핵산은 CMV 또는 CAG와 같은 프로모터 하에서 Cas9 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 같은 벡터의 형태일 수 있다.

상기 선형 이중가닥 DNA 및 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터의 전달은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란 처리(DEAE-dextran treatment), 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 원생동물에서 PEG-매개 형질주입 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게는, 상기 선형 이중가닥 DNA 및 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에 공동-형질주입(co-transfection) 또는 단계적 형질주입(serial-transfection)을 통해 전달될 수 있다.

상기 단계적 형질주입은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터를 원핵 세포 또는 진핵 세포에 형질주입한 후 선형 이중가닥 DNA를 형질주입하는 것일 수 있다.

본 발명의 선형 이중가닥 DNA 및 Cas9 단백질로 이루어진 CRISPR-Cas9 시스템은 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 단일 위치 또는 다중 위치 유전자의 표적화된 돌연변이를 유도하는데 유용하게 사용될 수 있다.

상기 진핵 세포 또는 원핵 세포는 대장균, 효모, 곰팡이, 식물, 곤충, 양서류, 포유동물 등의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는 인 비트로에서 배양된 세포, 이식된 세포, 일차 세포 배양, 인 비보 세포, 인간을 포함하는 포유동물의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 선형 이중가닥 sgR -DNA 디자인

(T7 중합효소, Cas9 , sgRNA 및 ssODNs를 발현하는 플라스미드)

T7 중합효소를 인코딩하는 플라스미드 N249는 George Church(Harvard medical school)로부터 얻었고, Cas9를 인코딩하는 pET-Cas9는 pMJ806(Addgene plasmid 39312)로부터 Cas9 서열을 pET-28a에 클로닝하여 만들었다. GFP-연결된 인간 코돈 최적화된 Cas9 뉴클레아제를 발현하는 플라스미드(Addgene plasmid 44719) 및 전사를 위해 U6 프로모터의 조절하에 있는 gRNA(Addgene plasmid 41824)는 Addgene (USA)에서 구입하였다. 표적 부위를 포함하는 이중가닥 DNA는 AflII-digested gRNA 클로닝 벡터에 클로닝하였다. 표적 유전자 위치를 위한 ssODNs는 IDT(USA)에서 합성하였다. 대장균 및 인간 세포를 위한 single-stranded oligodeoxynucleotide(ssODNs) 서열은 표 1에 나타내었다.

(sgR -DNA 라이브러리 디자인)

sgR-DNA 컨스트럭트는 T7 프로모터(24 bp) 또는 U6 프로모터(264 bp), sgRNA를 코딩하는 DNA(97 bp), 종결 서열(6 Ts) 및 도너 DNA(63 bp, 93 bp, 또는 123 bp)로 구성된다(도 3).

첫째, sgRNA 디자인을 위해, 표적 유전자 위치 근처에 있는 protospacer adjacent motifs(PAMs)를 선별하고, 선별된 PAM에 근접한 서열을 sgRNA의 스페이서로 결정하였다(SEQ ID NO. 1-12). 인간 세포를 위한 sgR-DNA에서, PAM에 근접한 19-bp 서열에 엑스트라 5'G를 붙여 sgRNA의 스페이서를 만들었다. 20-bp 스페이서를 77-bp 스캐폴드에 융합시켜 sgRNA를 인코딩하는 DNA를 만들었다(SEQ ID NO. 13-25).

도너 DNA는 3-nt 변이 코돈 및 30-nt, 45-nt 또는 60-nt 호몰로그 암(homology arms)을 포함하도록 구축하였다(SEQ ID NO. 26-52). 또한, 표적 코돈과 함께 적어도 2-nt 미스매치를 갖는 변이 코돈을 도입하도록 설계하여 NGS 에러로부터 구별될 수 있게 하였다. 추가로, 도너 DNA는 치환 후 같은 코돈을 갖는 PAM을 포함하도록 설계하여 SNV 발생 사건 후 PAM 서열의 추가적인 인지가 일어나지 않도록 하였다. 그 후에, sgR-DNA는 sgRNA를 인코딩하는 DNA 및 도너 DNA의 조립을 통해 구축되었다.

(대장균에 전달하기 위한 sgR -DNA 라이브러리 컨스트럭트 )

sgR-DNA 컨스트럭트(각각 30-nt, 45-nt 또는 60-nt의 호몰로그 암을 포함하는 190 bp, 220 bp 또는 250 bp)은 다음과 같은 세 부분으로 합성하였다:

i) T7 프로모터(20 nt)의 오른쪽 부분, 스페이서(20 nt) 및 sgRNA 스캐폴드에 상응하는 영역을 인코딩하는 서열(20 nt);

ii) sgRNA 스캐폴드를 인코딩하는 서열(77 nt), 종결 서열(6Ts); 및

iii) 도너 DNA(63 nt, 93 nt, 또는 123 nt)(도 4).

각 부분은 고체-상 올리고뉴클레오티드 합성(IDT, USA)에 의해 독립적으로 합성하였다.

i), ii) 및 iii) 부분을 T7 포워드 프라이머, 표적 특이 middle 올리고(서열은 표 1에 도시됨)를 사용하여 조립하였다.

단일 위치 교정을 위해, 올리고뉴클레오티드로부터 sgR-DNA를 합성하기 위한 조성은 다음과 같다: 10μM T7_fwd_primer(SEQ ID NO. 53) 1㎕, 1μM galK_gRNA (SEQ ID NO. 54) 1㎕, 1μM gRNA_rev(SEQ ID NO. 55) 1㎕, 1μM galK_middle(SEQ ID NO. 56) 1㎕, 10μM galK_63_donor_rev 또는 galK_93_donor_rev 또는 galK_123_donor_rev 중 1개(SEQ ID NO. 26-28) 1㎕, 2×Pfu polymerase master mix(intron) 10㎕, 증류수 5㎕. 대장균 유전체의 11개 위치 (유전자 aroA, aroB, aroC, aroD, aroE, aroF, aroG, aroK, aroL, aroM, aroP)를 교정하기 위해, 올리고뉴클레오티드로부터 sgR-DNA를 합성하기 위한 조성은 다음과 같다:

10 μM T7_fwd_primer(SEQ ID NO. 53) 1㎕, 1μM aroX_gRNA(SEQ ID NO. 57-67) 1㎕, 1 μM gRNA_rev(SEQ ID NO. 55) 1㎕, 1μM aroX_middle(SEQ ID NO. 68-78) 1㎕, 10μM aroX_donor_rev(SEQ ID NO. 29-39) 1㎕, 2× Pfu polymerase master mix(intron) 10㎕, 증류수 5㎕

i-pfu 2×PCR Master Mix Solution(Intron, Korea)으로 PCR을 수행하여 sgR-DNA 컨스트럭트를 만들고, PCR 사이클링은 다음과 같이 수행하였다: 95℃에서 5분간 초기 변성; 이어서, 95℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 연장을 20 사이클; 및 72℃에서 5분간 최종 연장.

조립된 컨스트럭트는 2% 아가로스 젤에서 분리하고 나서, MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen, Germany)에서 정제하였다.

(인간 세포로 전달하기 위한 sgR -DNA 라이브러리 컨스트럭트 )

sgR-DNA 컨스트럭트(490 bp)은 다음과 같은 세 부분으로 합성하였다:

i) U6 프로모터(264 bp);

ii) U6 프로모터에 상응하는 영역을 인코딩하는 서열(19 nt), 스페이서(20 nt), sgRNA 스캐폴드를 인코딩하는 서열(77 nt), 종결 서열(6Ts) 및 도너 DNA에 상응하는 영역(18-35 nt); 및

iii) 도너 DNA(123 nt)(도 5).

각 부분은 독립적으로 합성하였다. i) 부분은 인간 세포 적용을 위해 프로모터를 U6 fwd 프라이머(SEQ ID NO. 79) 및 rev 프라이머(SEQ ID NO. 80)를 이용하여 gRNA 클로닝 벡터로부터 증폭하여 이중가닥 U6 프로모터(SEQ ID NO. 81)를 얻었고(표 1에 서열이 기재됨), ii)(SEQ ID NO. 82-94) 및 iii)(SEQ ID NO. 40-52) 부분은 고체-상 올리고뉴클레오티드 합성(IDT, USA) 에 의해 합성하였으며(표 1), 이들 부분들은 PCR을 이용하여 조립하였다.

i-pfu 2x PCR Master Mix Solution(Intron, Korea)로 PCR하여 sgR-DNA 컨스트럭트를 만들었다. 이중가닥 U6 프로모터와 올리고뉴클레오티드로부터 각각의 sgR-DNA를 합성하기 위한 조성은 다음과 같다: 10μM U6_fwd_primer(SEQ ID NO. 79) 1㎕, 1μM 이중가닥 U6 프로모터 1㎕(SEQ ID NO. 80), 1μM gene_gRNA(SEQ ID NO. 82-94) 1㎕, 10μM gene_donor_rev(SEQ ID NO. 40-52) 1㎕, 2×Pfu polymerase master mix(intron) 10㎕, 증류수 6㎕. 해당 조성의 혼합물을 다음의 PCR 반응을 통하여 각각 증폭하였다: 95℃에서 5분간 초기 변성; 이어서, 95℃에서 30초간 변성, 58℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 30초간 연장을 20 사이클; 및 72℃에서 5분간 최종 연장.

조립된 컨스트럭트는 2% 아가로스 젤에서 분리하고, MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen, Germany)에서 정제하였다.

(대장균 세포 배양 및 전기천공)

대장균 균주 EcHB3(EcNR2 derivative; inactivation of cat, bla, galK, malK by MAGE, the sequences of targeting oligonucleotides are from Wang et al.)는 HB Kim으로부터 얻고, 적당한 항생물질(Kanamycin, 30 ㎍/mL; 및 spectinomycin, 100 ㎍/mL)이 첨가된 LB 또는 LB 아가 플레이트에서 30℃에서 배양하였다. 1mM의 IPTG를 사용하여 lac 프로모터를 유도하였다.

전기천공은 Bio-Rad Gene Pulser를 사용하여 수행하였다. pN249 또는 pET-Cas9 플라스미드를 전기천공할 때, 세포는 OD₆₀₀=~0.8될 때까지 30℃에서 배양하였다. 15000 rpm으로 1분 동안 원심분리하여 1mL의 세포를 수확하였다. 1mL의 냉장 ddH₂O로 펠렛을 2회 세척하고, 50㎕의 적당한 플라스미드와 함께 재현탁하였다. 1-mm 갭 큐벳에서 세포 상등액에 1.8kV의 펄스를 주어 전기천공하고, 항생물질이 없는 LB 배지에 첨가하고, 3시간 동안 회복시킨 후 적당한 항생물질이 첨가된 LB로 옮겼다.

sgR-DNA 또는 선형 DNA 단편의 전기천공을 위해, IPTG 유도성 프로모터(pT7lacO promoter)에 의해 조절된 Cas9 또는 T7 중합효소를 발현하도록 세포를 1mM의 IPTG의 존재에서 키웠다. 지수기 중간(OD₆₀₀=~0.8)에 42℃에서 15분 동안 세포에 열-쇼크를 가해 열 유도성 프로모터(pL promoter)에 의해 조절되는 λ-red 재조합 시스템이 발현되도록 하였다. 그리고 나서, 1mL의 세포를 수확하고, ddH₂O로 2회 세척하고 나서, 0.1μM 또는 1μM의 선형 DNA 단편을 펄스하였다. 조작 효율을 확인하기 위해 표적 영역 증폭을 위해 전기천공을 수행한 후 세포를 오버나이트 동안 배양하였다.

(인간 세포 배양 및 트랜스펙션 )

10% 열에 의해 불활성화된 우태아혈청(Gibco/Life Technologies) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco/Life Technologies)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium(Gibco/Life Technologies, USA)에서 37℃, 5% CO₂의 가습 조건에서 HEK 293T 세포를 배양하였다. 트랜스펙션 전날에, 세포를 6-웰 플레이트 또는 100-mm 배양접시에서 플레이팅하였다.

단일 위치 교정 실험을 위해, 제조업체의 설명서에 따라 Lipofectamine 3000(Invitrogen, USA)를 사용하여 1.6㎍의 sgR-DNA 및/또는 0.8㎍의 pCas9-GFP를 세포에 트랜스펙션 시켰다.

다중 위치 교정 실험을 위해, 10㎍의 sgR-DNA 및 5㎍의 pCas9-GFP를 세포에 트랜스펙션 시켰다.

( 플로우 사이토메트리 분석)

pCas9-GFP and sgR-DNA library로 트랜스펙션 후 48시간에 BD-FACS Aria II or III instrument(BD Biosciences, USA)를 이용하여 HEK 293T 세포를 선별하였다. 간단히 말해, 배양된 세포를 트립신 처리하고, 원심분리하여 펠렛을 얻고 PBS로 세척하였다. 펠렛은 소팅 버퍼(2mM EDTA, 25mM HEPES, 및 1% 소혈청 알부민을 포함하는 PBS)로 재현탁하여, 최종 밀도가 3-4×10⁶ cells/mL이 되도록 하였다. 마지막으로, 세포 스트레이너를 통해 세포를 여과하여 단일-세포 현탁액을 제조하였다.

(클론 증식 및 유전자형 분석)

정의된 돌연변이를 가진 클론 세포 주를 만들기 위해, 트랜스펙션 후 48시간에 pCas9-GFP 및 sgR-DNA로 트랜스펙션된 GFP-양성 세포를 완전 배지를 포함하는 96-웰 플레이트의 웰에 단일 세포 플레이팅 하였다. 세포를 2-3주간 키우고 나서, 클론 세포 주로부터 유전체 DNA를 추출하였다. 표적 영역은 PCR에 의해 증폭하고, Sanger 시퀀싱을 이용하여 유전자형을 분석하였다.

(유전체 DNA 분리)

유전체 DNA는 트랜스펙션 후 또는 DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Germany)를 이용한 FACS 분석 후 48시간에 분리하였다. 세포를 수확하고, 세포 펠렛을 200㎕의 PBS로 재현탁하고, proteinase K로 용해시켰다. 세포 용해물을 스핀 컬럼에 로딩하고, 2회 세척하고, 뉴클레아제-프리 워터로 용출하였다. 분리된 유전체 DNA는 Qubit dsDNA BR Assay Kit(Life Technologies, USA)를 이용하여 정량하였다.

(대장균 실험에서 시퀀싱에 의한 표적 수식의 확인)

PCR 프라이머는 PCR 산물의 크기가 대량 200bp가 되는 표적 영역을 증폭하도록 디자인하였다(표 1). 도너 DNA의 포획을 막기 위해, 프라이머는 수식을 위해 만들어진 코돈에서 충분히 떨어진 유전체 영역을 포획하도록 디자인하였다.

대장균 유전체에서 galK 유전자 부분만 PCR 증폭하기 위한 PCR 조성은 다음과 같다: 대장균 5㎕, 10μM galK_fwd_primer(SEQ ID NO. 95) 1㎕, 10μM galK_rev_primer(SEQ ID NO. 96) 1㎕, 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 10㎕, 증류수 3㎕

다중 위치 교정 확인을 위해서는 대장균 유전체에서 11개 위치에 대한 각각의 aroX_fwd_primer, aroX_rev_primer 쌍(SEQ ID NO. 41-62)을 이용하여 PCR 증폭하였고 PCR 조성은 다음과 같다: 대장균 5㎕, 10μM aroX_fwd_primer(SEQ ID NO. 97-107) 1㎕, 10μM aroX_rev_primer(SEQ ID NO. 108-118) 1㎕, 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 10㎕, 증류수 3㎕

표적 영역은 다음의 사이클링 조건하에서 Kapa HiFi HotStart ReadyMix(Kapa Biosystems, USA)를 이용하여 증폭되었다: 95℃에서 3분간 초기 변성; 이어서, 95℃에서 20초간 변성, 60℃에서 15초간 어닐링, 72℃에서 15초간 연장을 27 사이클; 및 72℃에서 1분간 최종 연장.

PCR 산물을 모으고 SPARK DNA Sample Prep Kit(Enzymatics, USA)로 준비하고 나서 마지막으로 HiSeq 2500 system(Illumina, USA)를 사용하여 차세대 시퀀싱을 하여 11개 위치에 대한 유전자 서열 정보를 얻었다.

(인간 세포 실험에서 시퀀싱에 의한 표적 수식의 확인)

단일 위치 교정 실험에서, PCR 산물의 크기가 대략 400bp가 되는 표적 영역을 증폭하도록 PCR 프라이머를 디자인 하였다(표 1).

다중 위치 교정 실험에서, 포획 영역은 치환 위치의 100-134 bp 업스트림에서 시작하여 100-129 bp 다운스트림에 이른다(표 1). 도너 DNA의 포획을 막기 위해, 프라이머는 수식을 위해 만들어진 코돈에서 충분히 떨어진 유전체 영역을 포획하도록 디자인하였다.

단일 위치 교정 확인을 위해 변이가 도입된 해당 유전자 부분만 각각의 프라이머 쌍(SEQ ID NO. 119-124)를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였으며 PCR 조성은 다음과 같다: 200ng의 유전체 DNA 1㎕, 10μM gene_fwd_primer(SEQ ID NO. 119-121) 1㎕, 10μM gene_rev_primer(SEQ ID NO. 122-124) 1㎕, 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 10㎕, 증류수 3㎕

다중 위치 교정 확인을 위해 변이가 도입된 10개 위치에 해당하는 각각의 프라이머 쌍(SEQ ID NO. 125-144)을 이용하여 PCR 증폭을 수행하였으며 PCR 조성은 다음과 같다: 200ng의 유전체 DNA 1㎕, 10μM gene_fwd_primer(SEQ ID NO. 125-134) 1㎕, 10μM gene_rev_primer(SEQ ID NO. 135-144) 1㎕, 2×KAPA HiFi HotStart ReadyMix 10㎕, 증류수 3㎕

PCR 산물을 모으고 SPARK DNA Sample Prep Kit(Enzymatics, USA)로 준비하고 나서 마지막으로 HiSeq 2500 system(Illumina, USA)를 사용하여 차세대 시퀀싱을 하여 단일 위치나 10개 위치에 대한 유전자 서열 정보를 얻었다.

( 오프 -표적 효과 분석)

MIT CRISPR Design Tool(http://crispr.mit.edu/) 및 E-CRISP software(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/)를 사용하여 EGFR 표적 서열에 대해 8개의 잠재적 오프-표적 절단 부위를 선별하였다.

MIT CRISPR Design Tool로부터, 121개의 잠재적 오프-표적을 얻었고, 스코어(OT-1, 2, 3, 및 4)에 근거하여 4개의 최상위 오프-표적을 선별하였다.

E-CRISP 소프트웨어를 이용하였을 때, 3에서 인풋 "Tolerated edit distance to the target sequence" parameter를 설정하였다. 17개의 잠재적 오프-표적을 얻었고, Efficacy-Score(E-Score)에 근거하여 4개의 최상위 오프-표적을 선별하였다(OT-5, 6, 7 및 8). 선별된 오프-표적 부위는 표 2에 도시하였다. PCR 프라이머는 PCR 산물의 크기가 155-199 bp이 되도록 오프-표적 부위를 증폭하도록 디자인 하였다(표 1, SEQ NO. 145-160). 오프-표적 영역은 Kapa HiFi HotStart ReadyMix를 이용하여 증폭하였고, 다음의 사이클링 조건에서 수행하였다: 95℃에서 3분간 초기 변성; 이어서, 95℃에서 20초간 변성, 60℃에서 15초간 어닐링, 72℃에서 15초간 연장을 27 사이클; 및 72℃에서 1분간 최종 연장.

앰플리콘을 모으고, SPARK™ DNA Sample Prep Kit (Enzymatics, USA)로 준비하고 나서 마지막으로 HiSeq 2500 system(Illumina, USA)를 사용하여 시퀀싱하였다.

(데이터 가공 및 분석)

샘플은 Illumina HiSeq 2500 system에서 시퀀싱하였다. 저급 말단(phred quality score < 25)을 잘라내고, 평균 phred quality < 20를 갖는 판독물을 제거하였다. 대장균 실험에서 재조합 효율을 동정하기 위해, 계획된 수식을 갖는 판독물을 계수하였다. 인간 세포 실험에서, Novoalign V2.07.18(Novocraft Technologies, Malaysia)를 사용하여 참조 인간 유전체 서열(hg19)에 판독물을 배열하고, 예상 절단 부위(즉, PAM 서열의 3bp 업스트림)의 ±10 bp 이내 삽입 또는 결손을 갖는 판독물을 계수하였다. 치환 효율을 분석하기 위해, 수식 서열을 포함하는 판독물을 계수하였다.

< 실시예 2> sgR -DNA를 통한 대장균의 단일 위치 유전체 교정의 확인

실시예 1에서 제조된 sgR-DNA가 유전체를 조작할 수 있는지 입증하기 위해, NHEJ 경로가 없는 대장균에서 sgR-DNA를 시험하였다. 본 발명자들은 galK _OFF EcNR2 균주에서 야생형 서열로 돌아가기 위해 galK gene의 성숙전 종결 코돈(I239*)을 표적으로 삼았다. 이를 위해, T7 프로모터의 조절 하에서 발현되는 sgRNA-DNA, 표적 유전체 위치에 상보적인 20 nt의 sgRNA 스페이서, 및 야생형 서열(TAA에서 TAT로)을 포함하는 63 nt 또는 93 nt 또는 123 nt의 도너 DNA; 및 교정 후 다시-절단되는 것을 억제하기 위한 PAM 수식을 디자인하였다(도 6). 그리고 나서, 디자인된 sgR-DNA를 PCR 조립을 통해 구축하였다(도 4).

sgR-DNA 기반 조작 시스템을 작동시키기 위해, galK _OFF 세포에 T7 중합효소 발현 벡터(pN249) 및 Cas9 발현 벡터(pET-Cas9)를 전기천공시키고 나서, 전기천공을 통해 sgR-DNA를 도입하였다(도 6).

한편, sgRNA(여기서, "선형 sgRNA"라 함) 및 ssODN을 발현하는 선형 이중가닥 DNA를 이용하는 다른 전달 방법의 효율을 시험하였다(도 7).

HR로 인한 유전자 교정의 빈도는 도너의 길이에 따라 증가하였다(도 8). 또한, 123 nt의 도너를 사용했을 때, sgR-DNA를 이용한 실험에서 11%의 효율(세 차례 실험의 평균)이 관찰되나, ssODN과 함께 선형 sgRNA를 이용하였을 때는 낮은 교정 효율(4%, 세 차례 실험의 평균)이 관찰되었다(도 9). 이들 결과는 본 발명의 선형 컨스트럭트가 대장균에서 유전체를 수식하는데 이용될 수 있음을 입증하는 것이다.

< 실시예 3> sgR -DNA를 통한 대장균의 다중 위치 유전체 교정의 확인

다음으로, sgR-DNA 컨스트럭트가 다중 위치 유전체 교정을 향상시키는데 적용될 수 있는지를 분석하였다. 방향족 아미노산의 생합성을 유도하는 유전체 전체에 걸쳐 분포된 11개의 aro 유전자(aroA, aroB, aroC, aroD, aroE, aroF, aroG, aroK, aroL, aroM, 및 aroP)를 표적으로 선별하고, 123 nt의 도너 DNA를 디자인하고 구축하였다. 그리고 나서, 11개의 aro 유전자를 표적으로 하는 sgR-DNA 라이브러리의 풀을 세포에 전달하고, 단일 조작과 같은 과정에 따라 효율을 조사하였다(도 10). 대조군으로, sgR-DNA에서 sgRNA 및 도너 DNA를 결합한 효과를 조사하기 위해 ssODN과 함께 선형 sgRNA로 구성된 라이브러리의 풀을 시험하였다.

실험 결과, 모든 표적 위치에서 HR 사건이 관찰되었고(도 11, sgR-DNA의 경우 평균 2.5% 효율을 나타낸 반면, 선형 sgRNA 및 ssODN을 이용한 경우 극히 낮은 교정-효율(0.19%)이 관찰되었다. 이러한 효율 감소는 알로스테릭 억제와 유사하게 설명할 수 있을 것이다. 비록 한 개의 유전자 위치가 교정되나, 세포는 다른 유전자(알로스테릭 유전자 위치)를 표적으로 하는 남아있는 sgRNA에 의해 죽을 수 있다. 본 발명자들은 선형 sgRNA 및 ssODN을 이용한 교정 방법이 훨씬 민감하게 영향을 받는 것으로 추측하였다. 왜냐하면, 효율이 낮고 짝이 없는 sgRNA 및 ssODN이 우세한 반면, sgR-DNA는 항상 sgRNA 및 매칭된 도너 DNA를 수행하기 때문이다.

< 실시예 4> sgR -DNA를 통한 인간 세포의 단일 위치 유전체 교정의 확인

포유동물 세포에서 의도된 SNV 발생을 위한 sgR-DNA를 확립하기 위해, 폐암에서 발암 변이(driver mutation)인, 야생형 Leu858의 Arg858으로의 아미노산 변화에 해당하는 EGFR의 염기 치환을 표적으로 하였다. 이를 위해, 인간 전사 프로모터에 의해 조절되는 sgR-DNA로 바꾸고(도 12), 3개는 계획된 아미노산 변화(즉, p.L858R)를 도입하고, 다른 하나는 대장균 조작과 유사한 PAM 수식을 도입하기 위한 4개의 미스매치 서열을 포함하는 도너 DNA를 디자인하였다(도 13). 그리고 나서, PCR 조립을 통해 sgR-DNA를 구축하고(도 5, HEK293T 세포에 전달하고, NGS를 통해 효율을 조사하였다. 대조군으로, sgRNA 및 ssODN을 발현하는 선형 이중가닥 DNA를 이용하는 전달 방법의 효율을 시험하였다(도 14). 그 외에, GFP를 이용하여 강화된 Cas9이 도입된 세포에 대해 FACS 시스템을 이용하였다.

NGS 결과, sgR-DNA에 의한 HR-매개된 치환은 0.6%의 수율을 나타내어 sgR-DNA가 포유동물 세포에서 HR 반응을 매개함을 입증하였다(도 15). 대장균 교정의 경우와는 달리, NHEJ에 의한 삽입-결손(indels)이 우세하여 23.9% 정도로 높은 효율을 가지고 있었다(도 16). FACS에 의해 강화된 Cas9-도입된 세포에서, 선별되지 않은 세포와 비교하여 sgR-DNA에 의해 교정된 세포의 증가된 비율(치환: 2.0%)이 관찰되었다. 유사하게, 삽입-결손 효율 역시 증가하였다.

추가로, Sanger 시퀀싱을 통해 FACS-분리된 단일 클론에서 표적 유전자 위치의 유전자형을 확인하였다(도 17). 선별된 43개의 클론 중에서, 2개의 클론이 이질 대립유전자(hetero allele)에서 미스매치 돌연변이를 가지고 있었다(SNV 발생율의 2.3%); 돌연변이 클론 #1(p.L858R 변경된 대립유전자 및 야생형 대립유전자를 전달) 및 돌연변이 클론 #2(p.L858R 변경된 대립유전자 및 12-bp 결손이 있는 대립유전자를 전달).

< 실시예 5> 오프 -표적 절단 효율 시험

2개의 오프-표적 예측 툴에서 선별된 sgRNA의 8개의 잠재적인 오프-표적 부위(OT)에 대해 NGS를 통해 확인하였다.

NGS 데이터에서, 각각의 염기 위치에서 삽입-결손의 발생 및 삽입-결손 크기의 분포를 플로팅하여 측정된 시퀀싱 에러로 표시된 단지 삽입-결손의 basal rate(<0.04%)이 관찰되었다(도 18, 19 및 20). 삽입-결손은 오프-표적(off-target) 부위의 주변 내에 무작위로 분포해 있으나, 삽입-결손은 표적 부위의 예상 절단 부위(즉, PAM 서열의 3bp 업스트림)에서 빈번하게 일어난다. 더욱이, 오프-표적 부위에서 대다수의 삽입-결손은 길이가 1bp이나, 표적 부위에서 삽입-결손의 크기는 길이가 수십 bp 이상이었다.

sgR-DNA 기반 방법의 효율에서 변이를 시험하기 위해, 추가로 각각 아미노산 돌연변이 p.V600E 및 p.G12C에 해당하는 BRAF 유전자 또는 KRAS 유전자의 염기 치환을 표적으로 하여 시험하였다.

실험 결과, 각 유전자 위치에서 치환 효율은 0.19% 및 0.34%이었다(도 21 및 22). 이 결과를 근거로 하여, 임의의 치환 돌연변이가 sgR-DNA에 의해 도입될 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 6> sgR -DNA를 통한 인간 세포의 다중 위치 유전체 교정의 확인

실시예 4에서 제조된 sgR-DNA가 포유동물 세포의 다중 위치 교정으로 확장할 수 있는지를 시험하였다. sgR-DNA 기반 방법을 암 체세포 변이 데이터베이스(COSMIC)에서 높은 빈도에 근거하여 선별된 10개의 유전자 위치로 확장하였다. 다양한 암 종류와 연관된 선별된 10개의 돌연변이는 CTNNB1 p.T41A, DNMT3A p.R882H, GNAQ p.Q209P, GNAS p.R201C, HRAS p.Q61L, IDH2 p.R140Q, NOTCH1 p.R1598P, NRAS p.G12D, PIK3CA p.E545K 및 TP53 p.R273H(도 23)이었다. 본 발명자들은 개별의 sgR-DNA를 구축하고, sgR-DNA 라이브러리를 생산하기 위해 수집하였다. 또한, sgR-DNA 기반 유전체 교정, 몇 가지 대조군 실험을 수행하고, NGS를 통해 유전자 위치를 분석하였다.

NGS 결과, sgR-DNA 기반 방법으로부터 총 0.28%의 치환이 나타났고, FACS-선별된 세포 집단에서 더 높은 치환 효율(0.97%)을 나타냈다(도 24). 다중 실험 결과는 비록 sgRNA 및 ssODN을 이용한 방법의 효율이 여전히 sgR-DNA 보다는 더 높으나, sgR-DNA가 다중 위치 교정을 위해 이용될 수 있음을 시사한다. 교정되도록 설계된 유전자 위치의 수가 증가할 때 여전히 sgR-DNA가 유리할 것으로 예상된다. 왜냐하면, ssODN의 상대 농도의 감소가 sgRNA 및 ssODNs를 이용할 때 효율 감소를 유발할 것이기 때문이다.

요약하면, 본 발명은 sgR-DNA 기반 접근이 sgRNA 및 도너 DNA를 인코딩하는 선형 이중가닥 DNA의 전달을 위한 새로운 방법이고, 다중 HR-매개된 유전체 수식을 수행할 수 있음을 입증하였다. 본 발명은 대장균에서 유전체 수식뿐만 아니라 인간 유전체 수식에도 이용될 수 있다. 본 발명의 시스템은 진핵생물 및 원핵생물 둘 다를 교정하기 위한 다재다능한 도구임을 암시한다. 또한, sgR-DNA의 구축은 매우 직접적이고, 작은 선형 DNA 단편을 생산하는 PCR만이 관련된다. 그리고, 단지 2개의 올리고뉴클레오타이드가 필수적인 226nt의 가변 영역을 포괄하기 위한 컨스트럭트로 이용되나, 선행 방법에서는 플라스미드를 위한 2개의 올리고 및 ssODN을 위한 1개의 올리고가 필요하다. 이는 sgRNA 생성 및 도너 DNA 제조를 위한 벡터 클로닝 같은 실험 과정이 필요 없고, 비용을 절감시킨다. 그리고, sgR-DNA 라이브러리의 구축을 위한 프로그램이 가능한 마이크로어레이로부터 절단된 올리고뉴클레오티드 풀을 이용할 수 있을 것으로 예상된다(도 25).

SEQ ID NO.	명칭	서열(5’→ 3’)
1	galK_spacer	GCAGCTTTAACATCTGCCGC
2	aroA_spacer	ATTATTTCGAGCAGCTGGCG
3	aroB_spacer	CGCTGATTGACAATCGGCAA
4	aroC_spacer	TTTTAATGGATCACCTGTTA
5	aroD_spacer	GAAATATTATTGCTTATGCC
6	aroE_spacer	ACTGGATGGCCTGATTCACG
7	aroF_spacer	GGATCTGAACGGGCAGCTGA
8	aroG_spacer	CAGTTGACGTAACAGAGCAT
9	aroK_spacer	TTTCCAGCATGTGAATAATC
10	aroL_spacer	ACAATTGATCGTCTGTGCCA
11	aroM_spacer	ATTGATTGCACGGCTGGCTG
12	aroP_spacer	ATGCGCTTTTACGGCTTTGG
13	EGFR_spacer	GTCTTCCGCACCCAGCAGTT
14	BRAF_spacer	GGACAACTGTTCAAACTGAT
15	KRAS_spacer	GATGACTGAATATAAACTTG
16	CTNNB1_spacer	GAGAGAAGGAGCTGTGGTAG
17	DNMT3A_spacer	GGTCTCCAACATGAGCCGCT
18	GNAQ_spacer	GGGTCGATGTAGGGGGCCAA
19	GNAS_spacer	GCTCAAAGATTCCAGAAGTC
20	HRAS_spacer	GCTGGATACCGCCGGCCAGG
21	IDH2_spacer	GCCGGAAGACAGTCCCCCCC
22	NOTCH1_spacer	GTCACGCTTGAAGACCACGT
23	NRAS_spacer	GACTGAGTACAAACTGGTGG
24	PIK3CA_spacer	GGCTCAGTGATTTCAGAGAG
25	TP53_spacer	GCTGGGACGGAACAGCTTTG
26	galK_63_donor_rev	CGCGATTTGTGCGCCGTCGAGCGGCAGATGATAAAGCTGCTGCAATACGGTTCCGACCGCGAC
27	galK_93_donor_rev	TCCGCTTCACTGGAAGTCGCGGTCGGAACCGTATTGCAGCAGCTTTATCATCTGCCGCTCGACGGCGCACAAATCGCGCTTAACGGTCAGGAA
28	galK_123_donor_rev	GCCGGGTTAAGTTCTTCCGCTTCACTGGAAGTCGCGGTCGGAACCGTATTGCAGCAGCTTTATCATCTGCCGCTCGACGGCGCACAAATCGCGCTTAACGGTCAGGAAGCAGAAAACCAGTTT
29	aroA_donor_rev	AAAGAAAGATTTGGCTATTTATTGCCCGTTGTTCATTCAGGCTGCCTGGCTAATACGCGCGATCTGCTCGAAATAATCCGGAAATGTTTTGGCCGTGCATTTGGGATCAAGAATCGTCACTGG
30	aroB_donor_rev	GCTTGATAAGCGGCCTGACCTTTCTTGTTGTTACGCTGATTGACAATCGGCAATCGCGTTGATAACAAGCTCGTGCGAAACGCCGCTGCGAACTTCACTCTTACCAATTGCCAACGGAAGAAT
31	aroC_donor_rev	ATTCATTTTTTACCAGCGTGGAATATCAGTCTTCACATCGGCATTTTGCGCCCGTTGACGAATCAGGTGATCCATTAAAACGATCGCCAGCATCGCTTCTGCGATCGGCACTGCGCGGATCCC
32	aroD_donor_rev	AAAAAAGCGTCTGCGCCAGGGCAAATCTCGGTAAATGATTTGCGCACGGTATTAACTATTATTCATCAGGCATAAGCAATAATATTTCGGCGGGAACACCCTCCCCGCCGAACTAAAAAATAT
33	aroE_donor_rev	ATTTTTTATTCTCGTCCCACTCTTCCCTGTCCGGAAACTGGATGGCCTGATTCACGCCGAGATTTCCTCCTGCAATTGCTTTATAACTGGTTCTACGTCAGGCAGAACACCGTGCCAGAGAAG
34	aroF_donor_rev	TGATCGCGTAATGCGGTCAATTCAGCAACCATAATAAACCTCTTAAGCCACGCGAGCGGTGATCTGCCCGTTCAGATCCTGATGAATTTCACGCAGCAAGGCATCGGTCATTTCCCAGCTAAT
35	aroG_donor_rev	CACTCTGACGGCGCATCCGACAATTAAACCTTACCCGCGACGCGCTTTTACTGCATTCGCGATTTGACGTAACAGAGCATCCGTATCTTCCCAGCCGATGCAGGCATCGGTGATGCTCTTACC
36	aroK_donor_rev	ATCCACCTTAATTACTGTACCCGCAGACGAGTGTATATAAAGCCAGAATTAGTTGCTTTCGATCATGTGAATAATCTGATTTGCAACCACTTTAGCGCTTTGATCATCAGTACGAATGGTCAC
37	aroL_donor_rev	TATTTCACGGGATGAACGTTAAGTATAGGCGCTCGAAAATCAACAATTGATCGTCTGTGCGATCGCGCTGCGAATTTCAGAAATCACCTGGCTGGGTTCGTTTGTTGCGTCGATGATAATATG
38	aroM_donor_rev	TAGTTGAACATCTACTTCACTATAGGGGCCAGAGGCGCTGGCTGTCACGCAAAATTACACGATTAATTCGGCAGCCAGCCGTGCAATCAATACGTTAGACAGCAAGACAGGAACATCGAGCTG
39	aroP_donor_rev	GGAATGGCGATTTCGGTATACCTGATCCCGGTATGGCTGATCGTGTTAGGTATCGGCTATATCTTTAAAGAGAAAACGGCCAAAGCCGTAAAAGCGCATTAATCTCTCTACGCCCTCACCCGT
40	EGFR_donor_rev	CCTCCTTACTTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCACCCAGCAGTTTAGCTCTCCCAAAATCTGTGATCTTGACATGCTGCGGTGTTTTCACCAGTACGTTCCTGGCTGCCAG
41	BRAF_donor_rev	CATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGAGACCCACTCCATCGAGATTTTTCTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGA
42	KRAS_donor_rev	ATATTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCGCAAGCTCCAACTACCGACAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTTATAATAAAAATAA
43	CTNNB1_donor_rev	TTGGGAGGTATCCACATCCTCTTCCTCAGGATTGCCTTTACCACTCAGAGAAGGAGCTGTAGCAGTAGCACCAGAATGGATTCCAGAGTCCAGGTAAGACTGTTGCTGCCAGTGACTAACAGC
44	DNMT3A_donor_rev	GAAGAGGTGGCGGATGACTGGCACGCTCCATGACCGGCCCAGCAGTCTCTGCCTCGCGAAATGGCTCATGTTGGAGACGTCAGTATAGTGGACTGGGAAACCAAATACCCTGGGGGAGAAAAG
45	GNAQ_donor_rev	TAGAAACATGATAGAGGTGACATTTTCAAAGCAGTGTATCCATTTTCTTCTCTCTGATCTAGGGCCCCCTACATCGACCATTCTGCAAGGTTAACAATACTCATATTAATAACATATAAAGTA
46	GNAS_donor_rev	TTACTGGAAGTTGACTTTGTCCACCTGGAACTTGGTCTCAAAGATTCCAGAAGTCAGCACGCAGCAGCGAAGCAGGTCCTGAAACAAAATTGAGGTCAATGGATCTCACCAAAGCCAACCGAA
47	HRAS_donor_rev	CACACACAGGAAGCCCTCCCCGGTGCGCATGTACTGGTCCCGCATGGCGCTGTACTCTTCTAAGCCGGCGGTATCCAGGATGTCCAACAGGCACGTCTCCCCATCAATGACCACCTGCTTCCG
48	IDH2_donor_rev	TAGGCGTGGGATGTTTTTGCAGATGATGGGCTCCCGGAAGACAGTCCCCCCCAGAATGTTTTGGATAGTTCCATTGGGACTTTTCCACATCTTCTTCAGCTTGAACTCTGTGAGGACAGAGAT
49	NOTCH1_donor_rev	GGGGAAGATCATCTGCTGGCCGTGTGCGTCACGCTTGAAGACCACGTTTGTGTGCAGCACAGGGCTGAGCTCCCGCAGGAAGTGGAAGGAGCTGTTGCGCAGCTGCTCCGGCGGCATCAGCAC
50	NRAS_donor_rev	ATATTCATCTACAAAGTGGTTCTGGATTAGCTGGATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACACCGTCTGCTCCAACCGACACCAGTTTGTACTCAGTCATTTCACACCAGCAAGAACCTGTTGGAAA
51	PIK3CA_donor_rev	GCACTTACCTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTCCTGCTCAGTGATTTCAGAGAGAGAATTTTGTGTAGAAATTGCTTTGAGCTGTTCTTTGTCATTTTCCCTTAATTCATTGTCTCTAGCTA
52	TP53_donor_rev	CCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCACAAACGTGCACCTTCAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTACTCAGGATAGGAAAAGAGAAGCA
53	T7_fwd_primer	GAAATTAATACGACTCACTATAGG
54	galK_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGGCAGCTTTAACATCTGCCGCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
55	gRNA_rev	AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
56	galK_middle	CGGAAGAACTTAACCCGGCAAAAAAAGCACCGACTCGG
57	aroA_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGATTATTTCGAGCAGCTGGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
58	aroB_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGCGCTGATTGACAATCGGCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
59	aroC_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTAATGGATCACCTGTTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
60	aroD_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAAATATTATTGCTTATGCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
61	aroE_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGACTGGATGGCCTGATTCACGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
62	aroF_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGGGATCTGAACGGGCAGCTGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
63	aroG_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGCAGTTGACGTAACAGAGCATGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
64	aroK_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGTTTCCAGCATGTGAATAATCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
65	aroL_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGACAATTGATCGTCTGTGCCAGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
66	aroM_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGATTGATTGCACGGCTGGCTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
67	aroP_gRNA	GAAATTAATACGACTCACTATAGGATGCGCTTTTACGGCTTTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
68	aroA_middle	GATCAAGAATCGTCACTGGAAAAAAAGCACCGACTCG
69	aroB_middle	AATTGCCAACGGAAGAATAAAAAAAGCACCGACTCG
70	aroC_middle	CACTGCGCGGATCCCAAAAAAAGCACCGACTCG
71	aroD_middle	CCCGCCGAACTAAAAAATATAAAAAAAGCACCGACTCG
72	aroE_middle	ACCGTGCCAGAGAAGAAAAAAAGCACCGACTCG
73	aroF_middle	CGGTCATTTCCCAGCTAATAAAAAAAGCACCGACTCG
74	aroG_middle	TCGGTGATGCTCTTACCAAAAAAAGCACCGACTCG
75	aroK_middle	CATCAGTACGAATGGTCACAAAAAAAGCACCGACTCG
76	aroL_middle	GTTGCGTCGATGATAATATGAAAAAAAGCACCGACTCG
77	aroM_middle	ACAGGAACATCGAGCTGAAAAAAAGCACCGACTCG
78	aroP_middle	TACGCCCTCACCCGTAAAAAAAGCACCGACTCG
79	U6_fwd_primer	AAGGTCGGGCAGGAAGA
80	U6_rev_primer	CGGTGTTTCGTCCTTTCCA
81	double-stranded U6 promoter	AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
82	EGFR_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGTCTTCCGCACCCAGCAGTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTGGCAGCCAGGAACGTA
83	BRAF_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGGACAACTGTTCAAACTGATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTCAGATATATTTCTTCATGAAGACCT
84	KRAS_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGATGACTGAATATAAACTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTTATTTTTATTATAAGGCCTGCTGAAA
85	CTNNB1_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGAGAGAAGGAGCTGTGGTAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGCTGTTAGTCACTGGCAG
86	DNMT3A_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGGTCTCCAACATGAGCCGCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTTTTCTCCCCCAGGGTA
87	GNAQ_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCGATGTAGGGGGCCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTACTTTATATGTTATTAATATGAGTATTGTTAACC
88	GNAS_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGCTCAAAGATTCCAGAAGTCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTTCGGTTGGCTTTGGTGA
89	HRAS_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGCTGGATACCGCCGGCCAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCGGAAGCAGGTGGTCATT
90	IDH2_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGCCGGAAGACAGTCCCCCCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTATCTCTGTCCTCACAGAGTT
91	NOTCH1_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGTCACGCTTGAAGACCACGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGTGCTGATGCCGCCGGAG
92	NRAS_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGACTGAGTACAAACTGGTGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTTTCCAACAGGTTCTTGCTG
93	PIK3CA_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGGCTCAGTGATTTCAGAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTAGCTAGAGACAATGAATTAAGGG
94	TP53_gRNA	GTGGAAAGGACGAAACACCGCTGGGACGGAACAGCTTTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTTGCTTCTCTTTTCCTATCCTGA
95	galK_fwd_primer	ATCCATGATCCCGCAGTTAC
96	galK_rev_primer	GGACATGGTGATCAGCGG
97	aroA_fwd_primer	CGCGACATACAATGATCACC
98	aroB_fwd_primer	TGCTGCGTGACAAGAAAGTC
99	aroC_fwd_primer	GATCACCAAAGGCCGTCAC
100	aroD_fwd_primer	AATTTCTCGTCTGGCTGGTG
101	aroE_fwd_primer	CAAAGCGTAATGCTGATGGTT
102	aroF_fwd_primer	GCGCAGTGAAATGAAATACG
103	aroG_fwd_primer	ATCTGGTGGAAGGCAATCAG
104	aroK_fwd_primer	ATGAACGCAATCCGCTGTAT
105	aroL_fwd_primer	ATGCGCTATATCGCGAAGTT
106	aroM_fwd_primer	GTCATCGCGATTTACTGCAA
107	aroP_fwd_primer	GGCGGTACTGGTGATTATGC
108	aroA_rev_primer	TGACTCACAAGGTCCGAAAA
109	aroB_rev_primer	TTCATCCATTTAACACCCCA
110	aroC_rev_primer	GCTACTGGCAAGCAGAGCC
111	aroD_rev_primer	CCAAATGGAGAATTAGCGCA
112	aroE_rev_primer	AGAGATCGCGCATGTCAGTT
113	aroF_rev_primer	GTTCCAGACGCTTCGCTAAT
114	aroG_rev_primer	TTATCAGGCCTGTGGTGATTC
115	aroK_rev_primer	GTTCCCCGAGAGTAACGACA
116	aroL_rev_primer	TTACCGTCTGTCCTGGCTTT
117	aroM_rev_primer	TGGAAAAGCCGATTGATTTC
118	aroP_rev_primer	GTCATCGCGATTTACTGCAA
119	EGFR_fwd_primer	GCAGCGGGTTACATCTTCTTTC
120	BRAF_fwd_primer	GCCAAAAATTTAATCAGTGGAAAAA
121	KRAS_fwd_primer	CTGCACCAGTAATATGCATATTAAA
122	EGFR_rev_primer	CAATACAGCTAGTGGGAAGGCA
123	BRAF_rev_primer	ACACATTTCAAGCCCCAAAA
124	KRAS_rev_primer	TAAGCGTCGATGGAGGAGTT
125	CTNNB1_fwd_primer	GCTGATTTGATGGAGTTGGAC
126	DNMT3A_fwd_primer	CCATGTCCCTTACACACACG
127	GNAQ_fwd_primer	CTGACTCCACGAGAACTTG
128	GNAS_fwd_primer	CTACTCCAGACCTTTGCTTTAG
129	HRAS_fwd_primer	GTCTTTTGAGGACATCCACC
130	IDH2_fwd_primer	CGTGCCTGCCAATGGTGA
131	NOTCH1_fwd_primer	TTGATGGGGTGCTTGCGC
132	NRAS_fwd_primer	TGATCCGACAAGTGAGAGACA
133	PIK3CA_fwd_primer	CTGTGAATCCAGAGGGGAAA
134	TP53_fwd_primer	TGCTTACCTCGCTTAGTGCTC
135	CTNNB1_rev_primer	TGAAGGACTGAGAAAATCCCT
136	DNMT3A_rev_primer	GCTGTGTGGTTAGACGGCTT
137	GNAQ_rev_primer	CCCTAAGTTTGTAAGTAGTGCT
138	GNAS_rev_primer	TCAAGAAACCATGATCTCTGTT
139	HRAS_rev_primer	GAAGGTCCTGAGGGGGTC
140	IDH2_rev_primer	ATTCTGGTTGAAAGATGGCG
141	NOTCH1_rev_primer	GGACTGTGCGGAGCATGTA
142	NRAS_rev_primer	AGCTTTAAAGTACTGTAGATGTGGC
143	PIK3CA_rev_primer	TGCTGAGATCAGCCAAATTC
144	TP53_rev_primer	TTAAATGGGACAGGTAGGACC
145	OT-1_fwd_primer	ACTGACAGAAGAAAAACCCGAGAC
146	OT-2_fwd_primer	AGCAATGTGGTGGAAGCAAT
147	OT-3_fwd_primer	CACCAATTGAAAAACCAGCTTTA
148	OT-4_fwd_primer	GAGAATCTCATTTCTTTCAAAATGC
149	OT-5_fwd_primer	GAAAATAAGCCATTGTTTTGACC
150	OT-6_fwd_primer	GAGGGTTCATTATCATCCTAGTCA
151	OT-7_fwd_primer	GGCCACAGAGGTGAGAAGAG
152	OT-8_fwd_primer	CCACCCTTGCTTCTACCCTT
153	OT-1_rev_primer	GCTCCCTAGCCTGGGTAACT
154	OT-2_rev_primer	CAGCCAGGTAGAGGGAAAAAG
155	OT-3_rev_primer	GGGAAAAACCAAACACCAAGTA
156	OT-4_rev_primer	CAGAGCATTTTGGCAAATCA
157	OT-5_rev_primer	TGGCCTCCTGCTCTAGCAGT
158	OT-6_rev_primer	CCAAAGTACAAACATGAAGCTG
159	OT-7_rev_primer	TGGATATTCACTGTGGCAGG
160	OT-8_rev_primer	CCTCAGCAATGAGAGTTCCC

염색체	가닥	위치	서열	EGFR 표적 서열과 해당 서열간의 미스매치 수
19	-	38916086	TTCCTCCCCACCCAGCAGTTTAG	3
20	+	48177634	TTGTTCCACACCCAGCAGTTCAG	3
17	-	40723680	GTCTCCCGGGCCCAGCAGTTCAG	3
5	+	43514894	GTCTTCCACTCACAGCAGTTCGG	3
4	-	72942318	TTCTTCCACACACAGCAGTTTGG	3
16	-	60869491	ATCTTCCTCACCCTGCAGTTAAG	3
1	-	48382921	GACTTCAGCACCCAGCATTTCAG	3
17	-	72766545	GGCTTCCCCACCCAGCAGGTGAG	3

<110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> Targeted genome editing based on CRISPR/Cas9 system using short linearized double-stranded DNA <130> P16U16C0909 <150> 2015-0066054 <151> 2015-05-12 <160> 160 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK_spacer <400> 1 gcagctttaa catctgccgc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroA_spacer <400> 2 attatttcga gcagctggcg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroB_spacer <400> 3 cgctgattga caatcggcaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroC_spacer <400> 4 ttttaatgga tcacctgtta 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroD_spacer <400> 5 gaaatattat tgcttatgcc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroE_spacer <400> 6 actggatggc ctgattcacg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroF_spacer <400> 7 ggatctgaac gggcagctga 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroG_spacer <400> 8 cagttgacgt aacagagcat 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroK_spacer <400> 9 tttccagcat gtgaataatc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroL_spacer <400> 10 acaattgatc gtctgtgcca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroM_spacer <400> 11 attgattgca cggctggctg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroP_spacer <400> 12 atgcgctttt acggctttgg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_spacer <400> 13 gtcttccgca cccagcagtt 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF_spacer <400> 14 ggacaactgt tcaaactgat 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_spacer <400> 15 gatgactgaa tataaacttg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTNNB1_spacer <400> 16 gagagaagga gctgtggtag 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNMT3A_spacer <400> 17 ggtctccaac atgagccgct 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNAQ_spacer <400> 18 gggtcgatgt agggggccaa 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNAS_spacer <400> 19 gctcaaagat tccagaagtc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS_spacer <400> 20 gctggatacc gccggccagg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDH2_spacer <400> 21 gccggaagac agtccccccc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOTCH1_spacer <400> 22 gtcacgcttg aagaccacgt 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS_spacer <400> 23 gactgagtac aaactggtgg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_spacer <400> 24 ggctcagtga tttcagagag 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TP53_spacer <400> 25 gctgggacgg aacagctttg 20 <210> 26 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK_63_donor_rev <400> 26 cgcgatttgt gcgccgtcga gcggcagatg ataaagctgc tgcaatacgg ttccgaccgc 60 gac 63 <210> 27 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK_93_donor_rev <400> 27 tccgcttcac tggaagtcgc ggtcggaacc gtattgcagc agctttatca tctgccgctc 60 gacggcgcac aaatcgcgct taacggtcag gaa 93 <210> 28 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galK_123_donor_rev <400> 28 gccgggttaa gttcttccgc ttcactggaa gtcgcggtcg gaaccgtatt gcagcagctt 60 tatcatctgc cgctcgacgg cgcacaaatc gcgcttaacg gtcaggaagc agaaaaccag 120 ttt 123 <210> 29 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroA_donor_rev <400> 29 aaagaaagat ttggctattt attgcccgtt gttcattcag gctgcctggc taatacgcgc 60 gatctgctcg aaataatccg gaaatgtttt ggccgtgcat ttgggatcaa gaatcgtcac 120 tgg 123 <210> 30 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroB_donor_rev <400> 30 gcttgataag cggcctgacc tttcttgttg ttacgctgat tgacaatcgg caatcgcgtt 60 gataacaagc tcgtgcgaaa cgccgctgcg aacttcactc ttaccaattg ccaacggaag 120 aat 123 <210> 31 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroC_donor_rev <400> 31 attcattttt taccagcgtg gaatatcagt cttcacatcg gcattttgcg cccgttgacg 60 aatcaggtga tccattaaaa cgatcgccag catcgcttct gcgatcggca ctgcgcggat 120 ccc 123 <210> 32 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroD_donor_rev <400> 32 aaaaaagcgt ctgcgccagg gcaaatctcg gtaaatgatt tgcgcacggt attaactatt 60 attcatcagg cataagcaat aatatttcgg cgggaacacc ctccccgccg aactaaaaaa 120 tat 123 <210> 33 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroE_donor_rev <400> 33 attttttatt ctcgtcccac tcttccctgt ccggaaactg gatggcctga ttcacgccga 60 gatttcctcc tgcaattgct ttataactgg ttctacgtca ggcagaacac cgtgccagag 120 aag 123 <210> 34 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroF_donor_rev <400> 34 tgatcgcgta atgcggtcaa ttcagcaacc ataataaacc tcttaagcca cgcgagcggt 60 gatctgcccg ttcagatcct gatgaatttc acgcagcaag gcatcggtca tttcccagct 120 aat 123 <210> 35 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroG_donor_rev <400> 35 cactctgacg gcgcatccga caattaaacc ttacccgcga cgcgctttta ctgcattcgc 60 gatttgacgt aacagagcat ccgtatcttc ccagccgatg caggcatcgg tgatgctctt 120 acc 123 <210> 36 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroK_donor_rev <400> 36 atccacctta attactgtac ccgcagacga gtgtatataa agccagaatt agttgctttc 60 gatcatgtga ataatctgat ttgcaaccac tttagcgctt tgatcatcag tacgaatggt 120 cac 123 <210> 37 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroL_donor_rev <400> 37 tatttcacgg gatgaacgtt aagtataggc gctcgaaaat caacaattga tcgtctgtgc 60 gatcgcgctg cgaatttcag aaatcacctg gctgggttcg tttgttgcgt cgatgataat 120 atg 123 <210> 38 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroM_donor_rev <400> 38 tagttgaaca tctacttcac tataggggcc agaggcgctg gctgtcacgc aaaattacac 60 gattaattcg gcagccagcc gtgcaatcaa tacgttagac agcaagacag gaacatcgag 120 ctg 123 <210> 39 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aroP_donor_rev <400> 39 ggaatggcga tttcggtata cctgatcccg gtatggctga tcgtgttagg tatcggctat 60 atctttaaag agaaaacggc caaagccgta aaagcgcatt aatctctcta cgccctcacc 120 cgt 123 <210> 40 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR_donor_rev <400> 40 cctccttact ttgcctcctt ctgcatggta ttctttctct tccgcaccca gcagtttagc 60 tctcccaaaa tctgtgatct tgacatgctg cggtgttttc accagtacgt tcctggctgc 120 cag 123 <210> 41 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BRAF_donor_rev <400> 41 catccacaaa atggatccag acaactgttc aaactgatga gacccactcc atcgagattt 60 ttctgtagct agaccaaaat cacctatttt tactgtgagg tcttcatgaa gaaatatatc 120 tga 123 <210> 42 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KRAS_donor_rev <400> 42 atattcgtcc acaaaatgat tctgaattag ctgtatcgtc aaggcactct tgcctacgcc 60 gcaagctcca actaccgaca gtttatattc agtcattttc agcaggcctt ataataaaaa 120 taa 123 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Sequence <220> <223> CTNNB1_rev_primer <400> 135 tgaaggactg agaaaatccc t 21 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNMT3A_rev_primer <400> 136 gctgtgtggt tagacggctt 20 <210> 137 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNAQ_rev_primer <400> 137 ccctaagttt gtaagtagtg ct 22 <210> 138 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GNAS_rev_primer <400> 138 tcaagaaacc atgatctctg tt 22 <210> 139 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HRAS_rev_primer <400> 139 gaaggtcctg agggggtc 18 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IDH2_rev_primer <400> 140 attctggttg aaagatggcg 20 <210> 141 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NOTCH1_rev_primer <400> 141 ggactgtgcg gagcatgta 19 <210> 142 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NRAS_rev_primer <400> 142 agctttaaag tactgtagat gtggc 25 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PIK3CA_rev_primer 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Artificial Sequence <220> <223> OT-8_rev_primer <400> 160 cctcagcaat gagagttccc 20

Claims

가이드 RNA를 발현하기 위한 프로모터; 가이드 RNA를 코딩하는 DNA; 터미네이터; 및 도너 DNA(donor DNA)가 순차적으로 연결된 선형 이중가닥 DNA.
삭제
제1항에 있어서,
프로모터는 T7 프로모터, SP6 프로모터, rpr-1 프로모터, rrk 프로모터 또는 U6 프로모터 중 어느 하나를 포함하는, 선형 이중가닥 DNA.
제1항에 있어서,
가이드 RNA는 표적 DNA를 인식하는 스페이서; 및 crRNA 및 tracrRNA로 이루어진 단일-사슬 가이드 RNA 스캐폴드를 포함하는 것인, 선형 이중가닥 DNA.
제4항에 있어서,
표적 DNA는 내재적 표적 DNA인, 선형 이중가닥 DNA.
제4항에 있어서,
스페이서는 protospacer adjacent motifs(PAMs) 서열의 일부 또는 전체를 포함하는, 선형 이중가닥 DNA.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
터미네이터는 RNA Polymerase III terminator 또는 -TTTTTT- 서열 중 어느 하나인, 선형 이중가닥 DNA.
제1항에 있어서,
도너 DNA는 PAM 서열을 포함하고, 표적 DNA에 대해 1 내지 3개의 뉴클레오티드의 미스매치를 갖는 변이 코돈을 포함하는 상동 서열로 이루어진 것인, 선형 이중가닥 DNA.
제1항의 선형 이중가닥 DNA; 및
Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터를 포함하는 CRISPR-Cas9 기반 유전체 교정용 조성물.
제11항에 있어서,
선형 이중가닥 DNA 및 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포에 공동-형질주입(co-transfection) 또는 단계적 형질주입(serial-transfection)을 통해 전달되는, CRISPR-Cas9 기반 유전체 교정용 조성물.
제12항에 있어서,
단계적 형질주입은 Cas9 단백질 또는 Cas9 단백질을 발현하는 벡터를 원핵 세포 또는 진핵 세포에 형질주입한 후 선형 이중가닥 DNA를 형질주입하는 것인, CRISPR-Cas9 기반 유전체 교정용 조성물.
제11항에 있어서,
조성물은 원핵 세포 또는 진핵 세포에서 단일 위치 또는 다중 위치 유전자의 표적화된 돌연변이를 유도하는 것인, CRISPR-Cas9 기반 유전체 교정용 조성물.