KR101796160B1 - 돼지의 산자수 예측용 dact3 유전자의 snp 마커 및 이를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지의 산자수 예측용 DACT3 유전자의 SNP 마커 및 이를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다산 돼지의 조기 선발 및 산자수 예측을 위한 산자수 연관 SNP 마커, 이를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물, 마이크로어레이, 키트 및 돼지 다산 개체 조기 선발 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 SNP들은 산자수와 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 본 발명의 SNP 마커를 이용하면 유전자 검사를 통해 돼지의 산자수를 조기에 예측할 수 있는 이점이 있다. 따라서, 본 발명은 다산의 종돈의 조기선발 및 종의 개량에 활용할 가치가 대단히 높다.

Description

돼지의 산자수 예측용 DACT3 유전자의 SNP 마커 및 이를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법{SNP markers of DACT3 gene for prediction of pigs litter size and methods for selection of fecund pigs using the same}

본 발명은 돼지의 산자수 예측용 DACT3 유전자의 SNP 마커 및 이를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 다산 돼지의 조기 선발 및 산자수 예측을 위한 산자수 연관 DACT3 유전자의 SNP 마커, 이를 이용한 마이크로어레이, 키트 및 돼지 다산 개체 조기 선발 방법에 관한 것이다.

한국 육류 소비자의 식육 종류별 선호도는 돼지고기 59%, 닭고기 21.6%, 쇠고기 18.5%, 기타 0.9%로서 돼지고기가 전체 육류 소비량의 절반 이상을 차지하고 있는 것으로 보고되고 있다 (농림수산식품부, 2006).

또한, 돼지고기 부위별 선호도를 보면 삼겹살 67%, 목심 26%로서 지방 함량이 높은 부위가 우위를 점하고 있다 (농협 중앙회, 2006). 이는 우리나라 국민들은 구워먹는 문화를 선호하고 있어서 구이 및 수육에 적합한 부위에 대한 기호성이 우월한 것으로 판단된다.

또한, 외국에서 구워먹을 수 있는 부위의 수입량이 지속적으로 증가하는 추세여서 국내 양돈 농가의 경쟁력은 더욱 어렵게 하고 있다. 하지만 현재 사용되고 있는 종돈은 대부분 수입이 되고 있고 (랜드레이스, 요크셔, 듀록 등) 외국에서 살코기 생산 위주로 품종이 육종된 것이어서 우리나라 소비자들의 돈육 소비 패턴과는 맞지 않는다.

버크셔 돼지는 육질이 부드럽고 다즙하며 근내 지방도가 우수하고, 고소한 맛을 내는 것으로 그 육질의 우수성이 잘 알려져 있지만 낮은 산자수와 이유두수로 번식효율이 저조한 단점이 있다. 즉 버크셔 품종은 국내 소비문화에 적합한 육질을 가진 장점에도 불구하고, 교잡종에 비해 산자수가 적기 때문에 일반 양돈농가에 보급시키는 것에는 한계가 있다.

한편, 산자수는 다른 형질에 비하여 매우 높게 평가되는 경제적 형질이지만, 상대적으로 유전력이 낮고 개량에는 어느 정도 한계가 있어 쉽게 이루어지지 못하고 있는 실정이다. 산자수는 매우 복잡한 형질로서 배란율, 초기 배아의 생존율, 태아의 생존율, 자궁의 용량과 능력, 젖꼭지 수 등의 형질에 의해서 결정된다. 이런 이유로 산자수 연관 유전자에 대한 연구도 타 형질에 비해서 많이 이루어지지 않는 것이 현실이다. 하지만 최근에는 산자수와 이유두수 개량을 위한 돼지 산자 능력 검정 사업의 중요성이 재인식되어 국내에서는 물론 유럽에서는 산자수가 많은 모돈의 집단을 만들어 그 집단에서 계속적으로 우수계통을 육성하고 있는데 이를 하이퍼 프로리픽 라인 (hyper-prolific line)이라고 한다. 중요한 돼지 경제 형질 중 하나인 산자수에 연관 유전자의 SNP를 확보하면, 산자수 연관 유전자의 SNP를 선점할 수 있고 나아가 산자수 연관 SNP를 활용하여 다산 개체를 조기 선발하여 육종할 수 있으며 이로 인해 양돈산업의 경쟁력을 키울 수 있음은 물론 양돈 농가의 수익성 창출에도 큰 도움을 줄 수 있다.

본 발명의 선행기술로는 한국공개특허 제10-2016-0050106호(2016.05.11)에 유전자의 발현량 및 메틸화 프로필을 활용한 돼지의 산자수 예측방법이 개시되어 있다.

본 발명의 목적은 돼지의 산자수와 연관관계를 나타내는 돼지의 산자수 예측용 DACT3 유전자의 SNP 마커를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 SNP 마커를 이용한 돼지의 산자수 예측용 조성물, 마이크로어레이 및 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 SNP 마커를 이용한 돼지 다산 개체 선발 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 더욱 명확하게 된다.

본 발명자들은 돼지 산자수에 연관된 유전자의 SNP를 탐색하기 위하여 산자수가 많은 돼지와 산자수가 적은 돼지의 자궁 조직으로부터 RNA 및 DNA를 분리하여 RNA-Seq 연구방법을 활용하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 517번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 517번째 염기를 포함하는 5 내지 2422개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 SNP 마커가 제공된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 돼지의 산자수 예측용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 제한효소 Bsr I를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 돼지의 산자수 예측용 SNP 마커 조성물을 포함하는 마이크로어레이가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 돼지의 산자수 예측용 SNP 마커 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트가 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 피검체의 DNA로부터 상기 SNP 마커가 포함된 폴리뉴클레오티드를 증폭하고, 상기 증폭된 SNP 마커를 판독하여 돼지의 다산 개체를 선발하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, i) 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계; ii) 서열번호 1의 염기변이 부위, 또는 이 부위 염기와 염기쌍을 이루는 상보사슬에서의 염기부위를 포함하는 DNA를 증폭시키는 단계; iii) 얻어진 DNA 증폭산물에 제한효소를 처리하는 단계; 및 iv) PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형) 분석법으로 SNP 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 다산 개체 선발 방법이 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 DNA를 증폭시키는 단계는, 서열번호 1의 SNP 마커 증폭용 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1의 염기변이 부위의 염기서열에 따른 유전자형을 분석하기 위한 제한효소 Bsr I를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR-RFLP 분석법으로 분석한 결과 SNP 유전자형 GG, GA 및 AA 중 GG 유전자형을 나타내는 경우 다산 개체라고 예측할 수 있다.

본 발명에서 제공하는 DACT3 유전자의 SNP 마커는 산자수와 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 본 발명의 SNP 마커를 이용하면 유전자 검사를 통해 돼지의 산자수를 조기에 예측할 수 있는 이점이 있다.

본 발명의 상기 SNP 마커를 활용하여 다산 개체를 조기에 선발하여 육종할 수 있으며, 이로 인한 양돈산업의 경쟁력을 키울 수 있고 농가의 수익성 창출에 도움이 될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다산의 종돈의 조기선발 및 종의 개량에 활용할 가치가 대단히 높다.

본 발명의 돼지 산자수 연관 유전자의 SNP는 genome 상 exon 위치에 존재하여 다양한 변이를 일으킬 수 있는 가능성이 있다. 이들 변이는 돼지에게 다산성 형질에 크게 영향을 미칠 것으로 예상된다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 산자수 연관 유전자의 SNP 마커는 산자수를 나타내는 형질과 높은 연관성을 나타내고 있으므로, 종돈의 조기 선발에 활용할 가치가 높고 또한 양돈 농가의 수익성 창출과 국내 양돈 산업의 효율성 증대를 이끌어 내어 돼지고기 수입량을 줄일 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 의한 서열번호 1의 돼지 DACT3 유전자 SNP 마커의 위치를 나타내는 도면.
도 2는 본 발명에 의한 PCR-RFLP 분석 기법으로 검출한 서열번호 1의 돼지 DACT3 유전자 증폭 영역 내 517번째 G↔A 단일염기다형(SNP)으로 인한 각 개체의 SNP 유전자형별 분자표지(DNA marker) 전기영동 사진.

본 발명에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 갖는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "SNP 마커"란, 개체 또는 종을 식별하기 위해 이용되는 DNA 서열 상의 단일 염기 다형성 대립인자 염기쌍을 의미한다. SNP는 비교적 그 빈도가 높고 안정하며 유전체 전체에 분포되어 있고 이에 의하여 개체의 유전적 다양성이 발생하므로, SNP 마커는 개체 간의 유전적 근접성을 알려주는 지표의 역할을 할 수 있다.

SNP 마커는 일반적으로 단일 염기 다형성에 수반되는 표현형의 변화를 포함하지만 경우에 따라 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 SNP 마커의 경우 아미노산 서열의 변이 또는 돼지의 유두 수와 같은 개체의 표현형의 차이를 나타낼 수 있다.

본 발명의 용어 "다형성(polymorphism)"이란, 하나의 유전자 좌위(locus)에 두 가지 이상의 대립유전자(allele)가 존재하는 경우를 의미하며 다형성 부위 중에서, 개체에 따라 단일 염기만이 다른 것을 단일염기 다형성이라 한다. 바람직한 다형성 마커는 선택된 집단에서 1% 이상, 더욱 바람직하게는 5% 또는 10% 이상의 발생빈도를 나타내는 두 가지 이상의 대립유전자를 가진다.

본 발명의 용어 "대립유전자(allele)"란, 상동염색체의 동일한 유전자좌위에 존재하는 한 유전자의 여러 타입을 의미한다. 대립유전자는 다형성을 나타내는데 사용되기도 하며, 예컨대, SNP는 두 종류의 대립인자(biallele)를 갖는다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 버크셔 돼지 종에서 RNA-Seq 방법을 이용하여 돼지 산자수 연관 유전자의 SNP 마커를 발굴하여 다산 개체를 조기 선발하고 돼지 산자수를 예측할 수 있도록 하였다.

본 발명에서는 산자수가 많은 돼지와 적은 돼지의 자궁 조직으로부터 각각 mRNA를 분리하여 RNA-Seq을 이용하여 SNP 마커를 발굴하였다. 이후 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하여 산자수 연관 유전자에 대해서 PCR-RFLP 실험을 통해 SNP의 유전자형을 분석하고 산자수를 나타내는 4가지 형질 (평균 총산자, 평균 실산자, 총산자에 따른 육종가, 실산자에 따른 육종가)과의 연관성을 통계 분석하여 최종적으로 돼지 산자수 연관 유전자의 SNP를 발굴하였다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 517번째 염기가 G 또는 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 517번째 염기를 포함하는 5 내지 2422개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 SNP 마커가 제공된다.

본 발명의 돼지 산자수 연관 유전자의 SNP 마커는 exon 상에 변이가 존재한다. 일반적으로 exon상 SNP가 존재하여 변이가 일어나면 아미노산의 변화를 유도하여 단백질의 구조가 차이 나는 직접적인 영향을 초래한다. 산자수 연관 유전자 SNP 5는 exon상에 위치하는 SNP 중에서도 염기서열 변이가 stop codon으로 변이되어 단백질의 길이가 짧아지는 기형의 단백질이 합성 되므로 단백질의 기능을 무력화시키는 역할을 담당하게 된다. 이들 변이는 돼지에게 다산성 형질에 크게 영향을 미칠 것으로 예상된다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 돼지의 산자수 예측용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물이 제공된다.

본 발명에 있어서, "SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제"란, 상기와 같은 유전자의 변이 부위, 즉 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있다면 특별한 제한이 있는 것은 아니며, 공지의 수단을 이용할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니나, SNP 마커를 증폭 및 PCR-RFLP 방법을 통해 판독하여 돼지의 유두수를 예측할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 SNP 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 및 PCR-RFLP 방법에 이용되는 제한효소를 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 제한효소 Bsr I를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 돼지의 산자수 예측용 SNP 마커 조성물을 포함하는 마이크로어레이가 제공된다.

본 발명에 있어서, 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 마이크로어레이가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 프로브 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, 상기 SNP를 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다. 한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 돼지의 산자수 예측용 SNP 마커 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트가 제공된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키트는 상기 돼지의 산자수 예측용 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 키트는 상기 서열번호 1의 SNP 마커 증폭용 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드 또는 그들과 혼성화하는 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 포함하는 키트가 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 키트는 본 발명의 마이크로어레이 이외에 진단 대상으로부터 해당 SNP를 포함하는 DNA를 분리 및 증폭하는데 사용되는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 적절한 프라이머 세트는 표 4의 서열번호 2 및 3으로 표시되는 프라이머 세트를 이용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 중합 반응에 필요한 시약, 예컨대 dNTP, 각종의 중합효소 및 발색제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 또한, 각 유전자형을 분석하기 위하여 표 4에 제시한 SNP 특이적 제한 효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 피검체의 DNA로부터 상기 SNP 마커가 포함된 폴리뉴클레오티드를 증폭하고, 상기 증폭된 SNP 마커를 판독하여 돼지의 다산 개체를 선발하는 방법이 제공된다.

상기 증폭된 SNP 마커를 판독하는 방법은 서열 분석, 마이크로어레이(microarray)에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR(allele specific PCR), 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(dynamic allelespecifichybridization, DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼(Applied Biosystems), 질량 분석법(예를 들면, Sequenom의 MassARRAY 시스템), 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템(BioRad), CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 상기 방법들 또는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 이용 가능한 다른 방법에 의해, 상기 SNP 마커에서의 하나 이상의 대립유전자를 확인할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, i) 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계; ii) 서열번호 1의 염기변이 부위, 또는 이 부위 염기와 염기쌍을 이루는 상보사슬에서의 염기부위를 포함하는 DNA를 증폭시키는 단계; iii) 얻어진 DNA 증폭산물에 제한효소를 처리하는 단계; 및 iv) PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형) 분석법으로 SNP 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 다산 개체 선발 방법이 제공된다.

본 발명은 돼지의 genomic DNA를 대상으로 PCR-RFLP 분석 방법을 이용하는 최첨단 분자육종 기술로서 본 발명에서 이용한 PCR-RFLP 분석 기법은 신속하고 간편하며 정확성이 높아 선발의 효율성과 실용성을 극대화할 수 있을 뿐만 아니라 다수의 시료를 대상으로 DNA marker 유전자형을 보다 간편하고 신속하며, 정확하게 판정할 수 있는 장점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계는 당업계에 알려진 방법을 통하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 혈액 혹은 조직 및 세포에서 DNA를 직접적으로 정제하여 PCR 등의 방법으로 해당 유전자를 포함하는 합성물을 증폭하고 이를 분리함으로써 이루어질 수 있다. 이때 DNA는 게놈 DNA 뿐만 아니라 mRNA로부터 합성한 cDNA도 포함하는 의미이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 DNA를 증폭시키는 단계는, 서열번호 1의 SNP 마커 증폭용 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 1의 염기변이 부위의 염기서열에 따른 유전자형을 분석하기 위한 제한효소 Bsr I를 이용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PCR-RFLP 분석법으로 분석한 결과 SNP 유전자형 GG, GA 및 AA 중 GG 유전자형을 나타내는 경우 다산 개체라고 예측할 수 있다.

본 발명에 있어, 다산 개체는 돼지 평균 총산자, 평균 실산자, 총산자에 따른 육종가, 실산자에 따른 육종가가 평균 개체 보다 높은 개체를 의미한다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 방법은 산자수 예측을 위해 피검체로부터 얻은 DNA 시료를 주형으로 하고, 상기 서열번호 1의 SNP 마커를 포함하는 유전자 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고, 상기 PCR 반응물을 시퀀싱(sequencing)하여 상기 염기변이 부위의 염기서열을 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 방법은 상기 피검체로부터 얻은 SNP를 포함하는 핵산 시료를 상기 마이크로어레이에 혼성화시키는 단계 및 상기 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 돼지 대립형질 특이적 혼성화 과정을 포함할 수 있다. 상기 대립형질 특이적(allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 즉, 일련번호 1의 각 SNP 서열 중의 다형성 부위의 염기가 식별될 수 있도록 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

본 발명에 있어서 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프라이머일 수 있는데, 여기서 프라이머(primer)란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.

상기 프라이머는 단일염기다형성 부위를 포함하여 표적 DNA에 혼성화할 수도 있으며, 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 본 발명에서 프로브(probe)란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이러한 프로브에는 Nielsen 등, Science 254, 1497-1500 (1991)에 기재된 펩티드 핵산을 포함한다. 본 발명의 프로브는 대립형질 특이적 프로브로서, 같은 종의 두 구성원으로부터 유래한 핵산 단편 중에 다형성 부위가 존재하여, 한 구성원으로부터 유래한 DNA 단편에는 혼성화하나, 다른 구성원으로부터 유래한 단편에는 혼성화하지 않는다. 이 경우 혼성화 조건은 대립형질 간의 혼성화 강도에 있어서 유의한 차이를 보여, 대립형질 중 하나에만 혼성화하도록 충분히 엄격해야 한다. 본 발명의 상기 프로브는 대립형질을 검출하기 위한 진단방법 등에 사용될 수 있다. 상기 진단 방법에는 서던 블롯팅 등과 같은 핵산의 혼성화에 근거한 검출방법들이 포함되며, 마이크로어레이를 이용한 방법에서 마이크로어레이의 기판에 미리 결합된 형태로 제공될 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 산자수와 SNP 유전자형과의 연관성 분석

(단계 1) 실험동물 준비

실험동물은 다산종돈 (전북 남원시 운봉읍 가산리 64-2, 대표 박화춘)에서 동일한 환경에서 사육된 버크셔 종돈을 사용하였다. 먼저 산자수가 많은 돼지 3두와 산자수가 적은 돼지 3두를 도축 후 얻은 자궁조직으로부터 SNP를 분석하기 위해 RNA를 분리하였다. 이후 확보한 SNP의 산자수 연관성을 검증하기 위하여 버크셔 150두의 혈액을 EDTA가 함유된 튜브에 채취하였다.

(단계 2) 산자수 연관 형질 평가 모형

총산자수와 실산자수 = 전체평균 + 산차 + 분만주차 + 영구환경효과 + 개체효과 + 오차

번식형질들에 대한 개체의 육종가를 추정하기 위한 다형질 평가모형은 다음과 같다.

위에서,

번째 번식형질 (총산자수, 실산자수의 관측치),

번째 형질의 전체 평균,

번째 번식형질의

번째 산차의 고정효과,

번째 형질의

번째 분만주차의 고정효과,

번째 형질의

번째 개체의 육종가,

번째 형질의

번째 개체의 영구환경효과,

번째 형질의 임의오차이다.

,

,

,

개체들 간의 상가적 유전 혈연관계를 나타내는 혈연계수행렬이며,

단위행렬이다.

(단계 3) 돼지로부터 gDNA의 분리

채취한 혈액은 위저드 게놈 DNA정제 키트 (Wizard genomic DNA purification kit, promega, USA)를 이용하여 gDNA를 분리하였다. 키트에서 제공되는 실험 방법과 동일하게 진행하였다.

(단계 4) RNA-Seq을 통한 돼지 SNP 확인

RNA는 TRI-reagent (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)시약을 이용하여 분리하였다. RNA의 품질은 Agilent 2100 Bioanalyzzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 확인 하였고 모든 RNA는 RNA integrity number value인 RIN값이 7이상 28S:18S 비율이 1.0이상으로 측정 되었다. 검증에 통과한 RNA를 이용하여 RNA-Seq을 수행하였고 (테라젠 (주)), 전사체상에서 산자수가 많고 적은 두 개의 그룹에서 차이가 나타나는 SNP들을 분석 하였다.

(단계 5) gDNA에서 산자수 연관 유전자의 SNP의 유전자형 확인

RNA-Seq결과에서 확보한 유전자들의 SNP를 분석하기 위해서 다산 종돈의 돼지 150마리로부터 혈액을 분리하여 gDNA를 추출하였다. 표 4에 제시된 프라이머 세트로 증폭하는 과정을 거치고 이후 증폭된 산물을 수거 및 정제하여 표 4에 제시된 각 산자수 연관 유전자의 SNP 유전자형에 대한 특이적 제한 효소로 절단하여 agarose 겔 전기영동을 수행한다. 확보된 제한 효소 절단 단편들의 뉴클레오타이드 서열 크기를 판독하여 각 SNP에 대한 유전자형을 분석하였다.

상기 DACT3 유전자를 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트로 증폭한 PCR 증폭 산물은 388bp의 전체길이를 갖으며, Bsr I 제한효소에 의해 절단된 PCR 산물은 각 226bp 및 162bp의 길이를 갖는다(도 2 및 표 4 참조). 따라서, DACT3 유전자에는 상기와 같이 대립인자가 존재하며, 각 유전자형을 PCR-RFLP 방법을 통해 판독할 수 있었다.

(단계 6) 산자수 연관 유전자의 SNP 유전자형과 번식능력에 대한 통계분석

이용된 버크셔 돼지 150두의 번식능력 (총산자수, 실산자수, 총산자수에 대한 육종가, 실산자수에 대한 육종가)과 산자수 연관 유전자의 SNP 유전자형의 연관성을 확인하기 위하여 통계분석을 하였다.

Anova test 를 이용하여 유전자형 3 그룹간 분석을 실시하였고 사후 검증으로 Duncan test를 이용하여 연관성을 확인하였고 p-value 0.05 이하인 값을 유의한 수준으로 보았으며 각 p값은 표 2에 표기한 바와 같고 그 값이 낮을수록 유의성이 큰 것을 의미한다.

표 1은 본 발명에 의한 산자수 연관 유전자의 SNP에 대한 서열 정보를 나타낸다.

SNP Number	Accession number	Gene name	locus	SNP position
1	XM_003355955	DACT3	Chr6_NC_010448.3	cDNA 96, genomic 375

표 2는 산자수 연관 유전자의 SNP의 genotype과 번식 능력에 대한 1차 통계분석 결과를 나타낸다.

DACT3	GA (7)	GG (125)	p-value
평균총산자	6.719	8.756	0.0129
평균실산자	6.157	7.755	0.0264
육종가 (총산자)	-0.640	0.167	0.0089
육종가 (실산자)	-0.389	0.189	0.0133

표 3은 산자수 연관 유전자의 SNP의 genotype과 번식 능력에 대한 2차 통계분석 결과를 나타낸다.

DACT3	GA (7)	GG (129)	p- value
평균총산자	6.533	8.768	0.0030
평균실산자	5.914	7.800	0.0039
육종가 ( 총산자 )	-0.660	0.199	0.0050
육종가 ( 실산자 )	-0.406	0.219	0.0064

표 4는 산자수 연관 유전자의 SNP 위치를 포함하는 산물을 증폭하기 위해 사용된 프라이머 서열, 유전자형을 분석하기 위해 사용된 제한효소, 그에 따른 유전자형을 나타낸다.

SNP Number	Accession number (Gene name)	Primer sequence	Enzyme	PCR size	Genotype size
1	XM_003355955 (NAT9)	F: GGCGCCTATGCAGATGAGAC (서열번호 2) R: GGCCCCTCACCAGCTGCTCT (서열번호 3)	Bsr I	388 bp	GG: 226+162bp
					GA: 226+162+388bp
					AA: 388bp

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Gyeongnam national university of science and technology <120> SNP markers of DACT3 gene for prediction of pigs litter size and methods for selection of fecund pigs using the same <130> NPF30226 <160> 3 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 2422 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 cggggacccg ggagatacgg accaataaca ttggaacaag ggcggacttg tttcattgtg 60 acgtgtgggg gcgtggccag ggccctatgg caggcgagag gcggggcgtg gcgaggcgag 120 gtggccggta agccgagcga gtaggcagct gcgagcatac gttgcgttga ggggcgcggg 180 tgcacagccg agtatcttcg taaagggagg gtaccggcca ataggcgatg gttgctctgt 240 cgccgggggc gtggccatgc agataaggcg cgggtgggcg gcccaatgga cgggcgccta 300 tgcagatgag acggtgacag ccgggccagc gggcgggcgg gcgggctgtt ggggcgggga 360 ggtgggaccg ggagaggggt ggccgcgggg cccggccggg ctggggcggg gggccgcagc 420 catgatccgg gccttctcgt tcccggtgag ccccgaacgg ggtcggctgc ggggctggct 480 ggagggcagc ctggccgggc tctgcgagtt acactggctc cgggagaggc aggagtaccg 540 cgtgcagcag gcgctgcggc tggcccagcc cggaatgggg ggcgccgagg ccgaggacga 600 ggaggacgcc gacgaggacg aagatgcggc ggcggcgcgc cgggctgcag cagccctgga 660 agagcagctg gaggccttac ccgggctcat ctgggacctg ggccagcagc tgggagacct 720 gagcctggag tctgggggcc tggagcagga gagcgggcgc agctcaggct tctatgaaga 780 ccccagctcc acaggaggtc cagactcacc accttcgacc ttctgtgggg acagtggctt 840 ctccggatct ggctcctatg gacgcctggg tccctctgaa ccccggggca tctatgccag 900 tgagaggccc aagtctctag gagacgccag tcccagcgca cccgaggcgg tgggccctcg 960 ggcggccgtg ccgcggtcct tctcggcgcc ctacccatcg gcagcggggt ctgcgggccc 1020 ggaggcctgc tcctccgccg agcggcgggc ccgcgcgggg cctttcctga cgcccagccc 1080 cctgcacgcc gtggccctgc gcagcccgcg gccttgcggc cgcccgcccc ccgactcgcc 1140 ggatgcggcg ggcgcggggc ggcccctgga cggctacatc tcggcgctcc tgcgcaggcg 1200 ccgccgccgg ggggcgggcc agccccggac aagtcccggg ggcgcggacg ggggcccgcg 1260 gcgccagaac agcgtgcgcc agcggcctcc cgacgcgtcc ccgccccccg gaggcgcgcg 1320 gcccgcgccc gagcccccgg tggagcgcgc ggggggccgt cccgccagcc cggccccctt 1380 gggccgcgcg tgggcctcac cgtgggagtc ggaggcggcc cccgaactcg ccgcgccgcc 1440 cgttgtcccc tcgccccctg acagcccggc ggagggtcgc ctggtgaagg cgcagtacat 1500 cccgggagca caggccgcca cccgcggcct ccccggccgc gcggcgcgcc gcaaaccgcc 1560 cccactgacc cggggccgca gtgtggagca gtccccacct cgggagcgtc cccgggctgc 1620 gggccgccgc ggacgcatga ccgagagctc gggccgccgg ggctcaccca gggctcgcaa 1680 ggcctcgcgc tcccagtcgg agaccagcct tctgggccgc gccacagcgg ttcctcccgg 1740 cccccccaag taccctacag ccgaacgaga agaccctcgg ccgccgcggc cccgccgcgg 1800 tccagctccc acgctcgcgg cccaggccgc agggtcctgc cgccgctggc gctccaccgc 1860 tgaaatcgac gctgccgatg gtcgccgagg ccggccccgc ggccctgccg cccgaggccc 1920 ggggcccggc ccatccccgt cagctcctca gcgccgtctg ctctacggct gcgcgggcag 1980 cgactcagag tgctcggccg ggcgcctggg gcccctcgga cgccggggcc cgaccggcgg 2040 tgtcggcggc ggctacgggg agagtgaatc gagcgccagc gagggggagt cgcctgcctt 2100 cagctccgca tccagcgact ctgatggcag cggtggcctc gtgtggccgc agcagctggt 2160 ggcagccacc gcggcctccg ggccagtggg tggtgcaggt ggaggggcgc ccgcgggccc 2220 cgccaaagtc tttgtgaaga tcaaggcttc ccacgcgctc aagaagaaga tactgcgttt 2280 ccgttcgggt tctctcaagg tcatgactac agtggccaca cacatggagg ttcccaggct 2340 aggggtccaa tcagagctac agctgccggc ctacaccaca gccacagcaa caccagatcc 2400 aagccgcatc tgcgatctac ac 2422 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 ggcgcctatg cagatgagac 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 ggcccctcac cagctgctct 20

Claims (11)

1. 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 517번째 염기가 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 517번째 염기를 포함하는 5 내지 2422개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물.
2. 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에서 517번째 염기는 G 또는 A이고, 상기 서열번호 1의 내부의 염기서열로써 517번째 염기를 포함하는 5 내지 2422개의 연속적인 염기로 구성되는 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물.
4. 제2항에 있어서, 제한효소 Bsr I를 포함하는 돼지의 산자수 예측용 조성물.
5. 제2항 또는 제3항에 기재된 돼지의 산자수 예측용 조성물을 포함하는 마이크로어레이.
6. 제2항 또는 제3항에 기재된 돼지의 산자수 예측용 조성물을 포함하는 돼지의 산자수 예측용 키트.
7. 피검체의 DNA로부터 제1항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 증폭하고, 상기 증폭된 폴리뉴클레오티드를 판독하여 돼지의 다산 개체를 선발하는 방법.
8. i) 피검체로부터 DNA를 추출하는 단계;
   ii) 서열번호 1의 517번째 염기변이 부위, 또는 이 부위 염기와 염기쌍을 이루는 상보사슬에서의 염기부위를 포함하는 DNA를 증폭시키는 단계;
   iii) 얻어진 DNA 증폭산물에 제한효소 Bsr I를 처리하는 단계; 및
   iv) PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism; 제한효소절편다형) 분석법으로 SNP 유전자형을 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 돼지의 다산 개체 선발 방법.
9. 제8항에 있어서,
   상기 DNA를 증폭시키는 단계는,
   서열번호 1의 SNP 마커 증폭용 서열번호 2 및 3의 프라이머 세트를 이용하는 돼지의 다산 개체 선발 방법.
10. 삭제
11. 제8항에 있어서,
    상기 PCR-RFLP 분석법으로 분석한 결과 SNP 유전자형 GG, AG 및 AA 중 GG 유전자형을 나타내는 경우 다산 개체라고 예측하는 돼지의 다산 개체 선발 방법.

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