KR101815105B1 - 멀티플렉스 pcr-기반된 차세대 시퀀싱을 이용한 한타바이러스 전장 유전체 서열 획득 방법 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 멀티플렉스 PCR-기반된 차세대 시퀀싱을 이용한 한타바이러스 전장 유전체 서열 획득 방법 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 목적 바이러스의 일부 게놈 서열을 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍들을 포함하는 멀티플렉스 프라이머 세트로 이루어진 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 이용하고, 이에 따라 시료 내 목적 바이러스의 존재 유무를 간편하고 빠르게 확인할 수 있다. 또한, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트에 포함된 프라이머 쌍들에 의해 얻어지는 100 내지 200 bp 길이의 서열 단편들에서 5'-to-3' 방향으로 서로 인접하는 2개의 단편들은 중첩 서열(overlapping sequence)을 포함한다. 이에 따라, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀에 의해 증폭되는 단편들을 모두 취합하여 5'-to-3' 방향으로 서로 중첩/연결시키는 경우 목적 바이러스의 전장 게놈 서열을 용이하게 획득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 목적 바이러스(예컨대, 한타바이러스)의 전장 게놈 서열을 높은 분포도(high-depth coverage)로 매우 정확하고 신속하게 얻을 수 있게 해주며, 이를 통해 한타바이러스 유발 질환의 진단에 보다 효과적으로 적용할 수 있다.
Description
본 발명은 차세대 시퀀싱(Next-Generation Sequencing, 이하 NGS)을 이용하여 신증후출혈열(유행성출혈열) 의심 환자 시료로부터 병원체인 한타바이러스 감염 유무를 진단하는 방법으로 한타바이러스 게놈 서열 확인 및 전체 염기서열 정보 획득에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 한타바이러스의 게놈 서열을 결정하기 위한 시료 전처리 과정에서 한타바이러스 특이적인 멀티플렉스 프라이머 유전자 증폭기법을 이용하여 시료의 초기 농도를 증가시킨 후 NGS를 사용하여 한타바이러스의 전장 게놈 서열을 확보하는 기술에 관한 것이다.
생명체를 구성하는 유전자의 염기서열의 순서를 확정하는 기술은 크게 1세대 Sanger 방식과 NGS로 나뉜다. 상기 1세대 방법은 1977년경에 개발된 생거 방식(Sanger sequencing)으로도 불리우며, 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, 이하 PCR)을 진행하는 과정에서 디-데옥시뉴클레오타이드 트리포스페이트(ddNTPs)를 사용하여 DNA 가닥의 합성이 중단되는 체인-종결 원리를 응용하여 증폭된 DNA 단편들(fragments)을 모아 염기서열의 순서를 확정하는 방식이다. 이 방법은 정확도는 높지만, 서열 확정에 시간이 많이 걸리며, 속도가 느리고, 고비용이라는 문제점들을 가지고 있다.
NGS 기술은 2000년대 초반에 완성된 인간 게놈 프로젝트(Human Genome Project)의 영향으로 저비용, 고속, 대용량 염기서열 확정 기술이 요구됨에 따라 2006년과 2007년에 각각 일루미나(Ilumina)와 로슈(Roche) 사에서 NGS 기술을 이용한 제품들이 시장에 출시되면서 각광을 받기 시작하였다. 마이크로 또는 나노기술을 이용하여 시료의 길이를 줄이고, 수백만 개의 시료 단편들을 병렬로 분석할 수 있는 장점을 가지고 있다. NGS 기술의 기본원리는 DNA 서열에 대한 증폭을 하고 서열 확정 과정에서 형광을 카메라로 찍어 이미지 처리를 하는 과정을 거쳐 염기서열의 순서를 밝혀내는 것이다. PCR 증폭 방식에 따라서 일루미나 사의 기종들은 고체-상 증폭(solid-phase amplification)을 사용하는데 반해 로슈(Roche, 454) 사와 라이프 테크놀로지스(Life Technologies) 사의 기종들은 에멀전 PCR(emulsion PCR, emPCR) 방식으로 제작되었다.
또한, NGS 기술에는 다양한 회사의 플랫폼들이 존재한다. 본 발명에서 사용한 NGS 장비는 일루미나 사에서 개발된 MiSeq이다. MiSeq은 소형 NGS 장비로 특징은 기존 대용량 시퀀서인 HiSeq의 기법인 DNA 서열을 다른 회사들(로슈, AB)에서 나온 플랫폼처럼 용액 안에서 증폭시키는 것이 아니라 판 위에 고정시킨 후에 판 위에서 구부러지면서 서열이 증폭되어 서열 집단을 형성하는 것이 특징이다. 그렇게 형성된 클러스터라는 집단은 집단 별로 시퀀싱이 이루어져 각 판독물(reads)의 염기서열 정보로 전환되고 분석과정에 넘어간다. MiSeq 장비는 HiSeq의 방법을 유지하면서 소형화에 성공하여, 장비 크기와 가격을 줄이고 작업을 더 빠르고 간편하게 만들었다는 점이다. MiSeq은 2 x 150 bp에서 최대 24시간 이내 3.7-4.6 Gb의 생체 정보 데이터를 생산할 수 있다.
현재 NGS는 인간의 전장 게놈 서열(Whole Genome Sequence, 이하 WGS), 엑솜(Exome-seq), RNA 연구(RNA-seq), 후성 유전체(Epigenomics) 연구, 등에 널리 활용되고 있다. NGS에 기반한 게놈 분석은 연구 대상 별로 분류할 경우 46%가 인간을 대상으로 하는 연구이며, 동물(25%), 식물(12%), 미생물(2%) 순으로 순위를 정할 수가 있다. 특히, 바이러스 분야는 NGS를 활용하는데 있어 초기 단계에 불과한 실정이다. 그 이유로는 미생물의 경우 유전자가 상대적으로 잘 보존되어 있는 서열들이 많이 존재하지만, 바이러스의 경우 개별 바이러스마다 염기서열(sequences)들이 다르며 유전자 변이가 매우 빈번하게 일어나기 때문에 NGS를 이용한 바이러스 분야 연구는 진척이 더디게 이루어지고 있다.
바이러스들 가운데 특히, 한타바이러스와 같은 RNA-바이러스의 경우 감염 초기의 시료 농도가 매우 낮다는 문제점이 NGS를 이용하여 바이러스의 WGS를 밝혀내는데 있어 가장 큰 걸림돌로 작용하고 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 검출/진단 및 전장 게놈 서열(whole genome sequence, WGS)의 획득이 어려운 목적 바이러스(예컨대, 한타바이러스)를 용이하게 검출하고 전장 게놈 서열을 신속하게 확인할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 레퍼런스 게놈 서열을 참조하여 목적 바이러스의 전장 게놈 서열을 검출하고 확인하기 위한 다수의 멀티플렉스 프라이머 세트(구체적으로는, 100 내지 200 bp 길이의 목적 바이러스 게놈 서열 단편들을 증폭하는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는 세트)를 포함하는 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 고안/제조하여 시료(예를 들어, 혈액, 혈청, 소변, 등)로부터 얻어진 mRNA 또는 이로부터 제조된 cDNA를 템플레이트로 이용한 멀티플렉스 PCR(polymerase chain reaction)을 실시하고 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS)에 의해 확인하여 높은 정확도, 민감도 및 신뢰도를 가진 목적 바이러스의 확인 방법을 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 시료 내 목적 바이러스(virus of interest)의 전장 게놈 서열 확인 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은 시료 내 한타바이러스 진단 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 한타바이러스 유발 질환 검출용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료 내 목적 바이러스(virus of interest)의 전장 게놈 서열 확인 방법을 제공한다:
(a) 서로 다른 100 내지 200 bp 길이의 목적 바이러스 게놈 서열 단편들을 증폭하는 다수의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍들로 이루어진 서로 다른 멀티플렉스 프라이머 세트들을 포함하는 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 제조하는 단계;
상기 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트에 의해 증폭되는 목적 바이러스 게놈 서열 단편들은 1 내지 2 kb의 목적 바이러스 게놈 서열을 포괄하며, 상기 단편들에서 5'-to-3' 방향으로 서로 인접하는 2개의 단편들은 중첩 서열(overlapping sequence)을 포함하고, 상기 중첩 서열은 40 내지 60 bp의 길이로 선행하는 단편의 3'-말단 및 후행하는 단편의 5'-말단에 공통적으로 존재하며;
상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀에 의해 증폭되는 모든 단편들을 5'-to-3' 방향으로 서로 중첩하는 경우 목적 바이러스의 전장 게놈 서열을 포함하는 것인 단계;
(b) 시료에서 상기 제조된 프라이머 세트 풀을 이용하여 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, mPCR)을 실시하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 mPCR 산물들을 포함하는 게놈 서열 라이브러리를 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS)으로 분석하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 포함하는 시료 내 한타바이러스 진단 키트로서, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀은 서열번호 1 내지 서열번호 472로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하고, 상기 프라이머 쌍은 한타바이러스 L, M 및 S 분절 내 게놈 서열을 증폭하는 것인 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 포함하는 한타바이러스 유발 질환 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 검출/진단 및 전장 게놈 서열의 획득이 어려운 목적 바이러스(예컨대, 한타바이러스)를 용이하게 검출하고 전장 게놈 서열을 신속하게 확인할 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 레퍼런스 게놈 서열을 참조하여 목적 바이러스의 전장 게놈 서열을 검출하고 확인하기 위한 다수의 멀티플렉스 프라이머 세트(구체적으로는, 100 내지 200 bp 길이의 목적 바이러스 게놈 서열 단편들을 증폭하는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는 세트)를 포함하는 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 고안/제조하여 시료(예를 들어, 혈액, 혈청, 소변, 등)로부터 얻어진 mRNA 또는 이로부터 제조된 cDNA를 템플레이트로 이용한 멀티플렉스 PCR(polymerase chain reaction)을 실시하고 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS)에 의해 확인하여 높은 정확도, 민감도 및 신뢰도를 가진 목적 바이러스의 확인 방법을 개발하였다.
본 발명은 레퍼런스 게놈 서열에 기반하여 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 고안/제조하여 목적 바이러스(예컨대, 한타바이러스) 또는 이의 전장 게놈 서열을 확인하는 방법에 관한 것으로서, 상기 목적 바이러스를 검출하고 이의 단편 게놈 서열 확인이 아니라 전장 게놈 서열을 한번에 신속하게 획득할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트 풀은 서로 다른 다수의 멀티플렉스 프라이머 세트들로 이루어지며, 상기 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트는 목적 바이러스의 일부 게놈 서열을 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍들을 포함한다(단계 (a)). 구체적으로는, 상기 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트 내 프라이머 쌍은 100 내지 200 bp 길이의 서열 단편을 증폭하도록 설계되고, 상기 증폭될 단편들에 있어서 5'-to-3' 방향으로 서로 인접하는 2개의 단편들은 중첩 서열(overlapping sequence)을 포함한다. 상기 중첩 서열은 상기 증폭될 단편의 올리고뉴클레오타이드 서열 중 일부에 대한 상보적인 서열을 의미하고, 이는 상기 인접하는 2개의 단편들의 서열을 순차적으로 어셈블리할 수 있도록 디자인된다. 보다 구체적으로는, 상기 중첩 서열은 5'-to-3' 방향에서 첫 번째 증폭 단편의 3'-말단과 두 번째 증폭 단편의 5'-말단에 공통적으로 존재한다. 따라서, 상기 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트에 의해 증폭되는 100 내지 200 bp 길이의 서열 단편들을 연결하는 경우 목적 바이러스의 일부 게놈 서열을 정확하고 신속하게 확보할 수 있다. 구체적으로, 상기 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트는 목적 바이러스 게놈 서열 중 1 내지 2 kb 게놈 서열을 확인할 수 있도록 고안된다(참고: 도 1 및 도 2).
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 멀티플랙스 프라이머 세트는 서로 다른 100 내지 200 bp 길이의 목적 바이러스 게놈 서열 단편들을 증폭하는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍들을 포함하며, 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트는 목적 바이러스 게놈 서열 중 1 내지 2 kb 게놈 서열을 검출하는데 이용된다(참고: 도 3 내지 도 5).
본 발명에서, 서로 다른 복수의 멀티플렉스 프라이머 세트를 포함하는 본 발명의 멀티플렉스 프라이머 세트 풀은 목적 바이러스의 전장 게놈 서열을 포괄하도록 설계/고안됨으로써, 개별 멀티플렉스 프라이머 세트에 의해 증폭되는 단편들을 모두 취합하여 5'-to-3' 방향으로 서로 중첩/연결시키는 경우 목적 바이러스의 전장 게놈 서열을 획득할 수 있다.
이후, 본 발명은 상기 제조된 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 이용하여 시료에서 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, mPCR)을 실시한다(단계 (b)).
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 따라 실시된다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 프라이머 쌍은 유전자 증폭 반응(amplification reactions)에 이용된다.
PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR, 등이 개발되었다. 또한, 멀티플렉스 PCR, 실-시간(real-time) PCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR 및 TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR) 등이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 명세서에 기재된 용어 "증폭 반응"은 타겟 게놈 서열(또는 핵산 분자)을 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(PCR)(미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 및 제4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR)(Sambrook 등, Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등(EP 329,822)의 방법, 멀티플렉스 PCR(McPherson and Moller, 2000), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA; WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication; WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences; 미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR; 미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA; 미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호) 및 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794호, 제5,494,810호, 제4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 보다 좋게는, 상기 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR 방법에 따라 실시된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프라이머(primer)"는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(템플레이트, 주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 구체적으로는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정된다. 상기 용어 "어닐링(annealing)" 또는 "프라이밍(priming)"은 템플레이트(예컨대, 게놈 서열 또는 핵산 분자)에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.
본 발명의 방법을 프라이머를 이용하여 실시하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 분석 대상(예컨대, 목적 바이러스를 포함하는 시료)에서 목적 바이러스(구체적으로는, 한타바이러스) 및 이의 전장 게놈 서열을 동시에 검출/확인할 수 있다. 따라서, 본 발명은 시료 내 목적 바이러스에서 얻어진 총 RNA로부터 합성된 cDNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시한다. mRNA를 얻기 위하여, 시료에서 총 RNA를 분리한다. 총 RNA를 분리하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Sambrook, J. et al ., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al ., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al ., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al ., Anal . Biochem . 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 총 RNA를 분리할 수 있다. 이어, 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하고, 이 cDNA를 증폭한다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명에서 이용될 수 있는 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직(예컨대, 폐, 콩팥, 뇌, 등)으로서, 이로부터 얻어지는 총 RNA, 또는 이로부터 얻어지는 mRNA 또는 cDNA를 포함한다.
본 발명에 이용되는 프라이머는 템플레이트의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 핵산이 상보적인 염기 서열들의 페어링(pairing)에 의하여 이합체 구조(duplex structure)를 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 단일 가닥 핵산 서열 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 반응 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다. 상기 용어 "어닐링"과 "혼성화"는 차이가 없으며, 본 명세서에서 혼용된다.
다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 구체적으로는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermus antranikianii , Thermus caldophilus , Thermus chliarophilus, Thermus flavus , Thermus igniterrae , Thermus lacteus , Thermus oshimai , Thermus ruber, Thermus rubens , Thermus scotoductus , Thermus silvanus , Thermus species Z05 , Thermus species sps 17, Thermus thermophilus , Thermotoga maritima , Thermotoga neapolitana 및 Thermosipho africanus의 DNA 중합효소를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공할 수도 있다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2 +와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 소망된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
본 발명에 있어서 어닐링은 타겟 뉴클레오타이드 서열(즉, 목적 바이러스의 게놈 서열)과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.
또한, 본 발명의 방법은 시료 내 목적 바이러스의 존재 유무를 보다 정확하고 확인하기 위해 상기 단계 (a)에서 제조되는 첫 번째 멀티플렉스 프라이머 세트 풀과 상이한 프라이머 쌍으로 구성된 멀티플렉스 프라이머 세트들을 포함하는 두 번째 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 동일한 방식으로 제조하여 증폭 및 확인(예컨대, 차세대 시퀀싱)할 수 있다. 즉, 염기서열 구조상의 특이점으로 인해 증폭되지 않는 부위의 존재 가능성을 고려하여 두 번째 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 제조하고 이를 이용하여 본 발명의 방법을 실시함으로써 목적 바이러스의 검출 특이성 및 정확성을 현저하게 증가시켰다(참고: 도 1 및 도 3). 상기 첫 번째 멀티플렉스 프라이머 세트 풀과 동일한 방식으로 제조된 두 번째 멀티플렉스 프라이머 세트 풀은 상기 첫 번째 멀티플렉스 프라이머 세트 풀과 다른 서열의 멀티플렉스 프라이머 세트들로 이루어진다(참고: 도 1 내 세트 2).
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 방법은 단계 (a)에서 제조된 멀티플렉스 프라이머 세트 풀과 상이한 프라이머 쌍으로 구성된 멀티플렉스 프라이머 세트들을 포함하는 두 번째 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 제조하여 멀티플렉스 PCR을 실시하는 단계를 추가적으로 포함한다(단계 (b-1); 도 3).
또한, 본 발명은 상기 1차 PCR 증폭 산물을 템플레이트로 이용하는 2차 PCR 증폭 반응을 실시하여 목적 바이러스의 검출 및 이의 전장 게놈 서열의 획득을 반복적으로 확인할 수 있다(참고: 도 5).
마지막으로, 본 발명은 상술한 대로 증폭된 게놈 서열 단편의 증폭 산물(예컨대, 한타바이러스의 L, M 또는 S 분절에 대한 증폭 단편들)을 적합한 방법으로 분석하여 목적 바이러스의 게놈 서열을 검출한다(단계 (c)). 예를 들어, 상술한 증폭 반응 결과물을 젤 전기영동을 하고, 그 결과 형성되는 밴드를 관찰 및 분석하여 이의 존재 유무를 확인한 후, 차세대 시퀀싱(예컨대, NGS 장비)을 통해 목적 바이러스의 게놈 서열을 간편하고 신속하게 확인할 수 있다(참고: 도 6 내지 도 8).
이에 따라, 본 발명은 상술한 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 포함하는 시료 내 한타바이러스 진단 키트 또한 제공한다. 본 발명의 진단 키트는 상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀(세트 1 또는 세트 2)은 서열번호 1 내지 서열번호 472로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하며, 상기 프라이머 쌍은 한타바이러스 L, M 및 S 분절 내 게놈 서열을 증폭한다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀에서 한타바이러스(구체적으로는, A.a_10-434주)의 L 분절은 서열번호 1 내지 130으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍 또는 서열번호 131 내지 260으로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하고; 한타바이러스(구체적으로는, A.a_10-434주)의 M 분절은 서열번호 261 내지 332로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍 또는 서열번호 333 내지 404로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하며; 한타바이러스(구체적으로는, A.a_10-434주)의 S 분절은 서열번호 405 내지 438로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍 또는 서열번호 439 내지 472로 이루어진 군으로부터 선택되는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 이용하여 증폭한다.
또한, 본 발명은 상술한 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 포함하는 한타바이러스 유발 질환 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법 및 키트는 전장 게놈 서열이 공지된 바이러스라면 어떠한 것에도 적용할 수 있으며, 예를 들어 한타바이러스를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 방법은 레퍼런스 전장 게놈 서열이 공지된 한타바이러스(즉, 종래 또는 신규 한타바이러스)를 진단하고 이의 전장 게놈 서열을 획득하는 방법으로서, 이는 종래 기술로는 큰 제약을 가졌던 한타바이러스에 대한 정확도, 민감도, 신뢰도 및 전장 게놈 서열(WGS) 획득을 매우 용이하게 한다. 본 발명에서 제조된 멀티플렉스 프라이머 세트를 이용하는 경우, 매우 높은 정확도, 민감도 및 신뢰도로 한타바이러스의 검출 및 이의 전장 게놈 서열을 결정할 수 있었다(참고: 도 8).
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 목적 바이러스는 한타바이러스이고, 보다 구체적으로는 한탄 바이러스(HTNV), 서울 바이러스(SEOV), 도브라바 바이러스(Dobrava virus, DOBV), 푸물라 바이러스(PUUV), 신 놈브레 바이러스(Sin Nombre virus, SNV), 블랙 크릭 카날 바이러스(Black Creek Canal virus, BCCV), 베이요 바이러스(Bayou virus, BAYV), 뉴욕 바이러스(NYV), 안데스 바이러스(ANDV) 및 라구나 네그라 바이러스(Laguna Negra virus, LNV)일 수 있고, 보다 더 구체적으로는 한탄 바이러스이다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 검출 가능한 한타바이러스 유발 질환은 신증후 출혈열(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS), 한타바이러스 심폐증후군(Hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS), 유행성 신염(Nephropathia epidemica), 서울 바이러스에 의해 야기되는 출혈열, 발한병(Sweating sickness), 크림-콩고 출혈열(Crimean-Congo hemorrhagic fever, CCHF), 라크로세 뇌염(La Crosse encephalitis), 플레보토무스열(Phlebotomus fever) 및 리프트계곡열(Rift Valley fever)을 포함하며, 보다 더 구체적으로는 신증후 출혈열(HFRS) 및 한타바이러스 심폐증후군(HCPS)을 포함한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 멀티플렉스 PCR-기반된 차세대 시퀀싱을 이용한 한타바이러스 전장 유전체 서열 획득 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 목적 바이러스의 일부 게놈 서열을 증폭할 수 있는 정방향 및 역방향 프라이머 쌍들을 포함하는 멀티플렉스 프라이머 세트로 이루어진 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 이용하고, 이에 따라 시료 내 목적 바이러스의 존재 유무를 간편하고 빠르게 확인할 수 있다.
(c) 또한, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트에 포함된 프라이머 쌍들에 의해 얻어지는 100 내지 200 bp 길이의 서열 단편들에서 5'-to-3' 방향으로 서로 인접하는 2개의 단편들은 중첩 서열(overlapping sequence)을 포함한다. 이에 따라, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀에 의해 증폭되는 단편들을 모두 취합하여 5'-to-3' 방향으로 서로 중첩/연결시키는 경우 목적 바이러스의 전장 게놈 서열을 용이하게 획득할 수 있다.
(d) 따라서, 본 발명의 방법, 키트 및 조성물은 목적 바이러스(예컨대, 한타바이러스)의 전장 게놈 서열을 높은 분포도(high-depth coverage)로 매우 정확하고 신속하게 얻을 수 있게 해주며, 이를 통해 한타바이러스 유발 질환의 진단에 보다 효과적으로 적용할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 한타바이러스 전체 게놈 서열을 한타바이러스 특이적으로 증폭하기 위한 멀티플렉스 프라이머(Multiplex primer) 설계도이다. 크게 멀티플렉스 프라이머 세트 1과 세트 2의 두 종류를 설계하였다. 멀티플렉스 프라이머 세트 1은 한타바이러스 L, M, S 각각의 분절(segment)에서 150 bp의 길이 단위로 유전자가 증폭될 수 있도록 프라이머 쌍들을 설계하였다. 염기서열 가운데 구조상의 특이점으로 인해 증폭되지 않을 수도 있는 가능성을 고려하여 프라이머 사이에 50 bp 정도 상호 겹치는 중첩 부위(overlapping region)를 선정하였다. 또한, 일부 유전자 구간에서 각각의 프라이머로 증폭이 되지 않거나, 염기서열이 제대로 읽히지 않을 경우를 고려하고 검출 특이도를 높이기 위해 세트 1에서 25 bp 떨어진 부위에서부터 같은 방법으로 멀티플렉스 프라이머 세트 2를 설계하였다. 그리고 각 세트에는 각각의 분절 말단(conserved region)에 특이적으로 결합하는 프라이머 OSM55(5'-TAGTAGTAGACTCC-3'; 서열번호 473)가 포함되도록 하였다.
도 2는 도 1에서 설계한 멀티플렉스 프라이머 세트 1(또는 세트 2)을 이용하여 PCR을 수행하였을 때 예상되는 생성물의 크기를 도식화한 것이다. 도 2에서 표기한 A 또는 B처럼 길이가 약 150 bp의 PCR 생성물 뿐만 아니라 C처럼 A의 역방향 프라이머에서 약 100 bp 떨어진 역방향 프라이머와 결합하여 생성되는 약 250 bp 생성물이 만들어 질수 있다. 같은 방식으로 100 bp 마다 생성물의 크기가 커지면서 전체 생성물의 모양은 마치 사다리 모양과 같이 나타날 것으로 예상된다. 즉, 150 bp에서 1 kbp 사이에 다양한 크기의 생성물들이 나올 수 있다. 또한, PCR에서 사용한 템플레이트 DNA 양이나 상태에 따라 중합 연쇄 반응 생성물이 사다리 모양으로 보이지 않고 진하거나 또는 흐린(smear) 모양으로 나타날 수 있다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 제작된 도 1의 멀티플렉스 프라이머를 사용한 실험으로, 두 종류의 분리주(isolate strains)에서 한타바이러스 L, M 또는 S 분절 각각에 해당되는 멀티플렉스 프라이머 세트 1과 세트 2를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행한 결과(1st PCR 산물)를 보여준다. 반응산물의 모습이 도 2에서 예상한 것처럼 사다리 모양으로 나왔음을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명의 방법에 의해 설계 및 제조된 도 1의 멀티플렉스 프라이머 세트를 사용한 PCR 실험으로, 다섯 종의 간 조직(Lung tissue)에서 한타바이러스 L, M 또는 S 분절 각각에 대한 멀티플렉스 프라이머 세트 1을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과(1st PCR 산물)를 보여준다.
도 5는 본 발명에 의해 설계 및 제작된 도 1의 멀티플렉스 프라이머를 사용한 실험으로, 15종의 환자 시료(patient sample)에서 한타바이러스 L, M 또는 S 분절에 해당되는 멀티플렉스 프라이머 세트 1을 사용하여 PCR을 수행한 결과물을 적당한 양으로 희석하여, 추가적으로 2차 PCR을 수행한 결과(2nd PCR 산물)를 보여준다.
도 6은 멀티플렉스 기반된 NGS 결과의 정확성, 상동성을 비교하기 위해 컨센서스 PCR과 SISPA-NGS를 비교해서 분석한 결과, 컨센서스 PCR을 기준으로 했을 때 SISPA-NGS에 비해 멀티플렉스 기반된 NGS의 상동성이 높은 것을 확인할 수 있었다(가로축, 레퍼런스 대상; 및 세로, 목적 시료).
도 7은 바이러스의 전장 게놈 서열(WGS)을 획득하는데 있어 일반적으로 사용되고 있는 SISPA(Sequence Independent, Single Primer Amplification; Molecular and Cellular Probes Volume 5, Issue 6, December 1991, Pages 473?481) 방법으로 시료를 전 처리한 후에 NGS 장비인 MiSeq으로 반응을 수행한 결과물인 FASTQ 파일을 한타바이러스의 레퍼런스 게놈 서열을 이용하여 각각의 L, M 또는 S 분절 서열에 맵핑(mapping)한 도면이다. 도 7에서 보듯이 각각의 분절에서 말단 부위에서 분포도가 다른 지역에 비해 낮게 나타났으며, 특히 다른 분절에 비해 길이가 긴 L 분절의 경우 갭이 발생하는 단점을 확인할 수 있다.
도 8은 본 발명을 통해 설계 및 제작된 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 이용하여 시료를 전 처리한 뒤 NGS 장비인 MiSeq으로 반응을 수행한 결과물인 FASTQ 파일을 한타바이러스의 레퍼런스 게놈 서열을 이용하여 각각의 L, M 또는 S 분절 서열에 맵핑한 도면이다. 도 8에서 보듯이 각각의 분절에 전반적인 분포도가 높고 고르게 나타났으며, 갭이 전혀 발생하지 않아 한타바이러스의 전장 게놈 서열을 한 번에 획득할 수 있음을 알 수 있다.
도 2는 도 1에서 설계한 멀티플렉스 프라이머 세트 1(또는 세트 2)을 이용하여 PCR을 수행하였을 때 예상되는 생성물의 크기를 도식화한 것이다. 도 2에서 표기한 A 또는 B처럼 길이가 약 150 bp의 PCR 생성물 뿐만 아니라 C처럼 A의 역방향 프라이머에서 약 100 bp 떨어진 역방향 프라이머와 결합하여 생성되는 약 250 bp 생성물이 만들어 질수 있다. 같은 방식으로 100 bp 마다 생성물의 크기가 커지면서 전체 생성물의 모양은 마치 사다리 모양과 같이 나타날 것으로 예상된다. 즉, 150 bp에서 1 kbp 사이에 다양한 크기의 생성물들이 나올 수 있다. 또한, PCR에서 사용한 템플레이트 DNA 양이나 상태에 따라 중합 연쇄 반응 생성물이 사다리 모양으로 보이지 않고 진하거나 또는 흐린(smear) 모양으로 나타날 수 있다.
도 3은 본 발명의 방법에 의해 제작된 도 1의 멀티플렉스 프라이머를 사용한 실험으로, 두 종류의 분리주(isolate strains)에서 한타바이러스 L, M 또는 S 분절 각각에 해당되는 멀티플렉스 프라이머 세트 1과 세트 2를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행한 결과(1st PCR 산물)를 보여준다. 반응산물의 모습이 도 2에서 예상한 것처럼 사다리 모양으로 나왔음을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명의 방법에 의해 설계 및 제조된 도 1의 멀티플렉스 프라이머 세트를 사용한 PCR 실험으로, 다섯 종의 간 조직(Lung tissue)에서 한타바이러스 L, M 또는 S 분절 각각에 대한 멀티플렉스 프라이머 세트 1을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과(1st PCR 산물)를 보여준다.
도 5는 본 발명에 의해 설계 및 제작된 도 1의 멀티플렉스 프라이머를 사용한 실험으로, 15종의 환자 시료(patient sample)에서 한타바이러스 L, M 또는 S 분절에 해당되는 멀티플렉스 프라이머 세트 1을 사용하여 PCR을 수행한 결과물을 적당한 양으로 희석하여, 추가적으로 2차 PCR을 수행한 결과(2nd PCR 산물)를 보여준다.
도 6은 멀티플렉스 기반된 NGS 결과의 정확성, 상동성을 비교하기 위해 컨센서스 PCR과 SISPA-NGS를 비교해서 분석한 결과, 컨센서스 PCR을 기준으로 했을 때 SISPA-NGS에 비해 멀티플렉스 기반된 NGS의 상동성이 높은 것을 확인할 수 있었다(가로축, 레퍼런스 대상; 및 세로, 목적 시료).
도 7은 바이러스의 전장 게놈 서열(WGS)을 획득하는데 있어 일반적으로 사용되고 있는 SISPA(Sequence Independent, Single Primer Amplification; Molecular and Cellular Probes Volume 5, Issue 6, December 1991, Pages 473?481) 방법으로 시료를 전 처리한 후에 NGS 장비인 MiSeq으로 반응을 수행한 결과물인 FASTQ 파일을 한타바이러스의 레퍼런스 게놈 서열을 이용하여 각각의 L, M 또는 S 분절 서열에 맵핑(mapping)한 도면이다. 도 7에서 보듯이 각각의 분절에서 말단 부위에서 분포도가 다른 지역에 비해 낮게 나타났으며, 특히 다른 분절에 비해 길이가 긴 L 분절의 경우 갭이 발생하는 단점을 확인할 수 있다.
도 8은 본 발명을 통해 설계 및 제작된 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 이용하여 시료를 전 처리한 뒤 NGS 장비인 MiSeq으로 반응을 수행한 결과물인 FASTQ 파일을 한타바이러스의 레퍼런스 게놈 서열을 이용하여 각각의 L, M 또는 S 분절 서열에 맵핑한 도면이다. 도 8에서 보듯이 각각의 분절에 전반적인 분포도가 높고 고르게 나타났으며, 갭이 전혀 발생하지 않아 한타바이러스의 전장 게놈 서열을 한 번에 획득할 수 있음을 알 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
1. 한타바이러스 전체 유전체 검출을 위한 멀티플렉스
프라이머의
설계 및 제작
한타바이러스를 동시에 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 설계하고 제작하기 위해 한타바이러스 패밀리(family)에 속하는 한탄바이러스(Hantaan virus) 균주(strain) A.a_10-434주의 전장 유전체 서열을 레퍼런스 게놈 서열(Reference Genome Sequence; 자체적으로 보유하고 있는 A.a_10-434주 서열)로 사용하였다.
도 1은 본 발명에서 사용한 한타바이러스 전체 게놈 서열을 한타바이러스 특이적인 조각으로 증폭하기 위한 멀티플렉스 프라이머(Multiplex primer) 설계도이다. 크게 멀티플렉스 프라이머 세트 1과 세트 2의 두 종류를 설계하였다. 멀티플렉스 프라이머 세트 1은 한타바이러스 L, M 또는 S 분절(segment) 각각에서 150 bp의 길이 단위로 유전자가 증폭될 수 있도록 프라이머를 설계하였다. 염기서열 가운데 구조 상의 특이점으로 인해 증폭되지 않을 수도 있는 가능성을 고려하여 프라이머 사이에 50 bp 정도 상호 겹치는 부위를 선정하였다. 또한, 일부 유전자 구간에서 각각의 프라이머로 증폭이 되지 않거나, 염기서열이 제대로 읽히지 않을 경우를 고려하고 검출 특이도를 높이기 위해 세트 1에서 25 bp 떨어진 부위에서부터 같은 방법으로 멀티플렉스 프라이머 세트 2를 설계하였다. 그리고, 각 세트에는 각각의 분절 말단에 특이적인 프라이머 OSM55가 포함되도록 하였다. 본 발명에서 제작한 한타바이러스 L, M 및 S 분절의 멀티플렉스 프라이머 세트 1 및 세트 2의 프라이머 서열을 각각 하기 표 1 및 표 2, 표 3 및 표 4, 그리고 표 5 및 표 6에 기재하였다.
도 2는 도 1에서 설계한 멀티플렉스 프라이머 세트 1(또는 세트 2) 이용하여 PCR을 수행하였을 때 예상되는 생성물의 크기를 도식화한 것이다. 도 2에서 표기한 A, B처럼 길이가 약 150 bp의 PCR 생성물 뿐만 아니라 C처럼 A의 역방향 프라이머에서 약 100 bp 떨어진 역방향 프라이머와 결합하여 생성되는 약 250 bp 생성물이 만들어질 수 있다. 같은 방식으로 100 bp 마다 생성물의 크기가 커지면서 전체 생성물의 모양은 마치 사다리 모양과 같이 나타날 것으로 예상된다. 즉, 150 bp에서 1 kbp 사이에 다양한 크기의 생성물이 나올 수 있다. 또한, PCR에서 사용한 템플레이트 DNA 양이나 상태에 따라 중합연쇄 반응 생성물이 사다리 모양으로 보이지 않고 진하게 또는 흐리게 퍼진(smear) 모양으로 나올 수 있다.
| L 분절 확인용 멀티플렉스 프라이머 서열 세트 1 | |
| OligoID | 서열 (5' -> 3') |
| HNL01F | TAGTAGTAGACTCCGGAAGT |
| HNL02F | GTAGAGTGTATAGATTATCT |
| HNL03F | AGGCAATAGGGAAAGTACTA |
| HNL04F | CAAGGCCTTTTTCAAGATGA |
| HNL05F | AGAGAAAAGAAGCTTAAATA |
| HNL06F | CATTTAATGTAGTGGCAGTT |
| HNL07F | AGCTGAGATAAGTTACGTTA |
| HNL08F | AGCCAGCCATATTACATACC |
| HNL09F | GAAATTTTTCATTTTTTGAA |
| HNL10F | TAGAAACTTCTTACTAATAC |
| HNL11F | CTGAACTTAATTCCAGATAC |
| HNL12F | CACGAATACAATTTAAACAG |
| HNL13F | ACTCAATAATCATAAAAGTG |
| HNL14F | AAAATATTGTCTGATTTAGA |
| HNL15F | TTCAGAATGAGACCCAGAAG |
| HNL16F | TCATTCAGGATTAAAAAGAT |
| HNL17F | GGTTCCTTTATTAGGTTCAT |
| HNL18F | GGGTATCCAAAGTCATGAGC |
| HNL19F | TACAGAAGACCAAGGGCAGT |
| HNL20F | ATTTTTGACAATCTACGTTA |
| HNL21F | CATTAGAGGTATATATATAT |
| HNL22F | AACAGTGGACCAGTCGACTG |
| HNL23F | ACCTGTTTCTTTTTATTTGA |
| HNL24F | AGGAAGAAAAGTATGGGGAA |
| HNL25F | TGCTGTTGAGTTGGCAGCAA |
| HNL26F | TTTAGCCAAACAAGAAATAT |
| HNL27F | ATTTATCAAATTCAAGACAT |
| HNL28F | AGAGGCAGATAGGGGCTTTT |
| HNL29F | GAGTACATATCATATGGAGG |
| HNL30F | GTAATCATAAATTCATTAGG |
| HNL31F | TACCTCCATGCTACATAATG |
| HNL32F | AAACTAAGGAACTATATTGA |
| HNL33F | ACTGGCTGCAGGGTAACTTA |
| HNL34F | TTGCTTTTTTGAGTTTGCAC |
| HNL35F | CAACAGATTCAAGCAGGCCA |
| HNL36F | TTAAGATCTCACCAAAGAAA |
| HNL37F | ACTCTTAGGTTCTCTGTCAG |
| HNL38F | CCTCAGGTTGCACAACTAGC |
| HNL39F | AAGTTAAGCATGCTGATACA |
| HNL40F | ATTAAAGCGCGCACTTCTAG |
| HNL41F | TTTCAACATGAGAGGTTAGG |
| HNL42F | CAAAATTTTTAGAGTTATGG |
| HNL43F | TGACCCAAGTATTGTTACAG |
| HNL44F | GAATGGGTTACCTTCAGGGA |
| HNL45F | GTTGTACATTTTCTAAAGAG |
| HNL46F | AACATTCACAGTCAGAGAAA |
| HNL47F | CTGGATACAGCCAAGTTCCC |
| HNL48F | TTATGAAAAGAATTGCACCT |
| HNL49F | CTGGCTGAAATCAATGTCAC |
| HNL50F | CAACAGAAAGACTTAGCTGC |
| HNL51F | TCGAGGATAAGACCTTTTCA |
| HNL52F | TATAAAGGGTGATTATTCAG |
| HNL53F | ACAAAGCTTTATGAAGGAGA |
| HNL54F | CATCAATTACACAGAAGCAT |
| HNL55F | AGTACGGCACATGGTATTGT |
| HNL56F | CTTAGAACCACACAGGCAAT |
| HNL57F | TATTAGCTCATGCGTTTCAT |
| HNL58F | AAATCCCATCATTTCATCTG |
| HNL59F | ATATCTGTTGATCTCTTTAT |
| HNL60F | GTACTGTGAGTTCAATGTCA |
| HNL61F | TGTGGATTTTGAGAATATAG |
| HNL62F | GAATCAAAGAAAATGAGGGG |
| HNL63F | CTGTTAATATTATCTTAATG |
| HNL64F | GAGCATTGTCCGAGGATGGG |
| HNL65F | GATGTCATTCCTGATTCATT |
| HNL01R | ATGTCATGTCTCACGGCGTA |
| HNL02R | TATAATGTTTGAAGGGACCC |
| HNL03R | TTGTTCCATTAATTTTATAA |
| HNL04R | TCTTGTTCAATATAAGCTAA |
| HNL05R | TTGTGTAGTAATATTGGAGC |
| HNL06R | CTCTCTCCTCAGTTCTGATC |
| HNL07R | GCTCCTATCGGTTCCATCCC |
| HNL08R | AAAGCACTCGAACACTGCTG |
| HNL09R | CAGGTTTGTAAGATGTGATT |
| HNL10R | GCCATGTCATGGATCAGGTA |
| HNL11R | AAATGTTCCTGGCTCTCTTA |
| HNL12R | GACTCTCTATTTGCGCACCA |
| HNL13R | TCTTGAGTTGATGGCTCAGT |
| HNL14R | TGTTGTCTTTTTCAACACAT |
| HNL15R | TATTGTATGAGTGTAAGGAC |
| HNL16R | ACTAAACCAGGTCCTATCCT |
| HNL17R | ATTTAATGCTAGCAGCCTAT |
| HNL18R | ACACAGATCTAATTGCATAT |
| HNL19R | GAGTATAATGATGTCACTGC |
| HNL20R | AAGTGCAACTAACAAGCTTT |
| HNL21R | TAAATGAAGGGTAAACTCCA |
| HNL22R | TCTTCATTCATATTTCCATG |
| HNL23R | CCACATCATATATCCATTTT |
| HNL24R | ACTTTGTAGCCAGGACTTTA |
| HNL25R | TGAACCTGTCCTGACATACC |
| HNL26R | CTCCTCATATAATTTTAAGA |
| HNL27R | GCCTGCATCTAGTAGGAAGT |
| HNL28R | GCCCCTTGGATTGCAAGAAT |
| HNL29R | TGCACTAACATACATGAGTT |
| HNL30R | CACAGTTCTTTAGCTTATTG |
| HNL31R | TTGATGTGTGGGTCAAGGCT |
| HNL32R | TGCAACACCGAAAAGCGAAG |
| HNL33R | CATAAATGAATAATGCATCG |
| HNL34R | ATCTCTGTATTTACACTAAA |
| HNL35R | AAATTCAGCATTTGTCGGGG |
| HNL36R | AATCGTCAAAATAACCTAAA |
| HNL37R | CTTTCAACTTTACTGGTGCA |
| HNL38R | CATTGCACCATTTCCTCCCA |
| HNL39R | GCATTGATTTCTGTCTCTTG |
| HNL40R | CACTGTACTTTCCCAATAAA |
| HNL41R | AATATAATCATAAGTTACAT |
| HNL42R | GGAGCTGCAAGGGTGACTGC |
| HNL43R | TCTGCAAAACTGTTAGCAGC |
| HNL44R | AATTCCATTCAAGAAATCTT |
| HNL45R | CAGGAATACTATTTTGTATG |
| HNL46R | ATTGTCTTTAAGTCAACAGA |
| HNL47R | TACCCTTGATTTAGAAGATT |
| HNL48R | TATGAGGCTTCACTCTTATA |
| HNL49R | CATCTCCAAATTTCTATGCA |
| HNL50R | CCCAACCCTACAGAACCGAT |
| HNL51R | ATGCTCGCCTGTTGGCTTGT |
| HNL52R | TCAAGACCAAAATTGAATGT |
| HNL53R | CGAAACCTCATCCATCATGA |
| HNL54R | TCCCCCATTCAAATCCAGAC |
| HNL55R | TCCTTTATTGTAATCATAAA |
| HNL56R | TACTGTTTGATACCTAATAT |
| HNL57R | GAAGATTCTTCATAAAATTC |
| HNL58R | GGGTTAATCAGCTTAAGTAA |
| HNL59R | TAAGCTCATTTCTTCAGACC |
| HNL60R | GTAGGAAATGTTCAATATCT |
| HNL61R | AGTCTGACAGGCTCAAGTAT |
| HNL62R | CAAATTAAATGTTTTAGAGA |
| HNL63R | GATTTTCAAACTGATCAATA |
| HNL64R | AACAGTACCATGGTATGCCT |
| HNL65R | TTAGTAGTAGGTATGCTCCG |
| L 분절 확인용 멀티플렉스 프라이머 서열 세트 2 | |
| OligoID | 서열 (5' -> 3') |
| HNL01F | TAGTAGTAGACTCCGGAAGT |
| HNL02F | GTAGAGTGTATAGATTATCT |
| HNL03F | AGGCAATAGGGAAAGTACTA |
| HNL04F | CAAGGCCTTTTTCAAGATGA |
| HNL05F | AGAGAAAAGAAGCTTAAATA |
| HNL06F | CATTTAATGTAGTGGCAGTT |
| HNL07F | AGCTGAGATAAGTTACGTTA |
| HNL08F | AGCCAGCCATATTACATACC |
| HNL09F | GAAATTTTTCATTTTTTGAA |
| HNL10F | TAGAAACTTCTTACTAATAC |
| HNL11F | CTGAACTTAATTCCAGATAC |
| HNL12F | CACGAATACAATTTAAACAG |
| HNL13F | ACTCAATAATCATAAAAGTG |
| HNL14F | AAAATATTGTCTGATTTAGA |
| HNL15F | TTCAGAATGAGACCCAGAAG |
| HNL16F | TCATTCAGGATTAAAAAGAT |
| HNL17F | GGTTCCTTTATTAGGTTCAT |
| HNL18F | GGGTATCCAAAGTCATGAGC |
| HNL19F | TACAGAAGACCAAGGGCAGT |
| HNL20F | ATTTTTGACAATCTACGTTA |
| HNL21F | CATTAGAGGTATATATATAT |
| HNL22F | AACAGTGGACCAGTCGACTG |
| HNL23F | ACCTGTTTCTTTTTATTTGA |
| HNL24F | AGGAAGAAAAGTATGGGGAA |
| HNL25F | TGCTGTTGAGTTGGCAGCAA |
| HNL26F | TTTAGCCAAACAAGAAATAT |
| HNL27F | ATTTATCAAATTCAAGACAT |
| HNL28F | AGAGGCAGATAGGGGCTTTT |
| HNL29F | GAGTACATATCATATGGAGG |
| HNL30F | GTAATCATAAATTCATTAGG |
| HNL31F | TACCTCCATGCTACATAATG |
| HNL32F | AAACTAAGGAACTATATTGA |
| HNL33F | ACTGGCTGCAGGGTAACTTA |
| HNL34F | TTGCTTTTTTGAGTTTGCAC |
| HNL35F | CAACAGATTCAAGCAGGCCA |
| HNL36F | TTAAGATCTCACCAAAGAAA |
| HNL37F | ACTCTTAGGTTCTCTGTCAG |
| HNL38F | CCTCAGGTTGCACAACTAGC |
| HNL39F | AAGTTAAGCATGCTGATACA |
| HNL40F | ATTAAAGCGCGCACTTCTAG |
| HNL41F | TTTCAACATGAGAGGTTAGG |
| HNL42F | CAAAATTTTTAGAGTTATGG |
| HNL43F | TGACCCAAGTATTGTTACAG |
| HNL44F | GAATGGGTTACCTTCAGGGA |
| HNL45F | GTTGTACATTTTCTAAAGAG |
| HNL46F | AACATTCACAGTCAGAGAAA |
| HNL47F | CTGGATACAGCCAAGTTCCC |
| HNL48F | TTATGAAAAGAATTGCACCT |
| HNL49F | CTGGCTGAAATCAATGTCAC |
| HNL50F | CAACAGAAAGACTTAGCTGC |
| HNL51F | TCGAGGATAAGACCTTTTCA |
| HNL52F | TATAAAGGGTGATTATTCAG |
| HNL53F | ACAAAGCTTTATGAAGGAGA |
| HNL54F | CATCAATTACACAGAAGCAT |
| HNL55F | AGTACGGCACATGGTATTGT |
| HNL56F | CTTAGAACCACACAGGCAAT |
| HNL57F | TATTAGCTCATGCGTTTCAT |
| HNL58F | AAATCCCATCATTTCATCTG |
| HNL59F | ATATCTGTTGATCTCTTTAT |
| HNL60F | GTACTGTGAGTTCAATGTCA |
| HNL61F | TGTGGATTTTGAGAATATAG |
| HNL62F | GAATCAAAGAAAATGAGGGG |
| HNL63F | CTGTTAATATTATCTTAATG |
| HNL64F | GAGCATTGTCCGAGGATGGG |
| HNL65F | GATGTCATTCCTGATTCATT |
| HNL01R | ATGTCATGTCTCACGGCGTA |
| HNL02R | TATAATGTTTGAAGGGACCC |
| HNL03R | TTGTTCCATTAATTTTATAA |
| HNL04R | TCTTGTTCAATATAAGCTAA |
| HNL05R | TTGTGTAGTAATATTGGAGC |
| HNL06R | CTCTCTCCTCAGTTCTGATC |
| HNL07R | GCTCCTATCGGTTCCATCCC |
| HNL08R | AAAGCACTCGAACACTGCTG |
| HNL09R | CAGGTTTGTAAGATGTGATT |
| HNL10R | GCCATGTCATGGATCAGGTA |
| HNL11R | AAATGTTCCTGGCTCTCTTA |
| HNL12R | GACTCTCTATTTGCGCACCA |
| HNL13R | TCTTGAGTTGATGGCTCAGT |
| HNL14R | TGTTGTCTTTTTCAACACAT |
| HNL15R | TATTGTATGAGTGTAAGGAC |
| HNL16R | ACTAAACCAGGTCCTATCCT |
| HNL17R | ATTTAATGCTAGCAGCCTAT |
| HNL18R | ACACAGATCTAATTGCATAT |
| HNL19R | GAGTATAATGATGTCACTGC |
| HNL20R | AAGTGCAACTAACAAGCTTT |
| HNL21R | TAAATGAAGGGTAAACTCCA |
| HNL22R | TCTTCATTCATATTTCCATG |
| HNL23R | CCACATCATATATCCATTTT |
| HNL24R | ACTTTGTAGCCAGGACTTTA |
| HNL25R | TGAACCTGTCCTGACATACC |
| HNL26R | CTCCTCATATAATTTTAAGA |
| HNL27R | GCCTGCATCTAGTAGGAAGT |
| HNL28R | GCCCCTTGGATTGCAAGAAT |
| HNL29R | TGCACTAACATACATGAGTT |
| HNL30R | CACAGTTCTTTAGCTTATTG |
| HNL31R | TTGATGTGTGGGTCAAGGCT |
| HNL32R | TGCAACACCGAAAAGCGAAG |
| HNL33R | CATAAATGAATAATGCATCG |
| HNL34R | ATCTCTGTATTTACACTAAA |
| HNL35R | AAATTCAGCATTTGTCGGGG |
| HNL36R | AATCGTCAAAATAACCTAAA |
| HNL37R | CTTTCAACTTTACTGGTGCA |
| HNL38R | CATTGCACCATTTCCTCCCA |
| HNL39R | GCATTGATTTCTGTCTCTTG |
| HNL40R | CACTGTACTTTCCCAATAAA |
| HNL41R | AATATAATCATAAGTTACAT |
| HNL42R | GGAGCTGCAAGGGTGACTGC |
| HNL43R | TCTGCAAAACTGTTAGCAGC |
| HNL44R | AATTCCATTCAAGAAATCTT |
| HNL45R | CAGGAATACTATTTTGTATG |
| HNL46R | ATTGTCTTTAAGTCAACAGA |
| HNL47R | TACCCTTGATTTAGAAGATT |
| HNL48R | TATGAGGCTTCACTCTTATA |
| HNL49R | CATCTCCAAATTTCTATGCA |
| HNL50R | CCCAACCCTACAGAACCGAT |
| HNL51R | ATGCTCGCCTGTTGGCTTGT |
| HNL52R | TCAAGACCAAAATTGAATGT |
| HNL53R | CGAAACCTCATCCATCATGA |
| HNL54R | TCCCCCATTCAAATCCAGAC |
| HNL55R | TCCTTTATTGTAATCATAAA |
| HNL56R | TACTGTTTGATACCTAATAT |
| HNL57R | GAAGATTCTTCATAAAATTC |
| HNL58R | GGGTTAATCAGCTTAAGTAA |
| HNL59R | TAAGCTCATTTCTTCAGACC |
| HNL60R | GTAGGAAATGTTCAATATCT |
| HNL61R | AGTCTGACAGGCTCAAGTAT |
| HNL62R | CAAATTAAATGTTTTAGAGA |
| HNL63R | GATTTTCAAACTGATCAATA |
| HNL64R | AACAGTACCATGGTATGCCT |
| HNL65R | TTAGTAGTAGGTATGCTCCG |
| 한타바이러스 M 분절 확인용 멀티플렉스 프라이머 서열 세트 1 | |
| OligoID | Seq (5' -> 3') |
| HNM01F | TAGTAGTAGACTCCGCAAAATAAAG |
| HNM02F | AATGTCTATGACATGAAAAT |
| HNM03F | CAGCACAGCTGGTGCCTGAG |
| HNM04F | TCAGTCACAGTCTAGCCAAA |
| HNM05F | CGCAGTAGAAAATCAATAAC |
| HNM06F | TGAAAAGCTGTTTGATTGCA |
| HNM07F | CCCAGATCAGAGTGTGGTCA |
| HNM08F | AAAATTTTTGAACAGGTTAA |
| HNM09F | CACCAATTTATGTTCCAACA |
| HNM10F | AGAAACTGCAACTTACTCTA |
| HNM11F | TCTTATTCTTCCCTTAGTAT |
| HNM12F | GTGCCATACCACTCATGTGG |
| HNM13F | ATCATGTGAGGCCTTTTCTG |
| HNM14F | AATTTTGTATGTCAGCGAGT |
| HNM15F | ACACTATAACAAGCTTATTT |
| HNM16F | GCTTGTTACATTCTGTTTTG |
| HNM17F | CAAGAAAACAGGTTAAAATC |
| HNM18F | CCTATAAAGAGTTGAAGGCA |
| HNM19F | TTACAAAGTATGCCAAGTTA |
| HNM20F | TTTAGATACAAAAGTAGGTG |
| HNM21F | CTCCTGTCTGGAATGACAAT |
| HNM22F | CCGTAGGAAGCTAACAAACC |
| HNM23F | CACTGGTTTGATGGTCGTCT |
| HNM24F | AAAGGGATTACCAATATGAG |
| HNM25F | GAAACCAGTTGGCAGTGCTT |
| HNM26F | AATGACTGTTTTGTATCTAG |
| HNM27F | GTGGCGGTCTAATATTTAAA |
| HNM28F | GTTCCCAGGTAGTTTCAGGA |
| HNM29F | ATTGATTCCTTTCAATCTTT |
| HNM30F | TCTTAGTAACAAAAGACATC |
| HNM31F | AGGGTTTACATTAACATGTC |
| HNM32F | GTAACATTAACAAGAGGACA |
| HNM33F | TTGGACTCCATGCTGCTGCA |
| HNM34F | AAAATGTTGGTTTGTTAAAT |
| HNM35F | GTTTTACTGAGCATTCTCTG |
| HNM36F | TTTTTATATTCCAGTATAAT |
| HNM01R | TCCCCGAAGCTTACTGTGTG |
| HNM02R | TGATTGGTGATTATCCATGC |
| HNM03R | CAACTTCAGTAGACACTGTC |
| HNM04R | TAAGTACTATTGCATGATAG |
| HNM05R | ATAAACTACCTGTACTCTGT |
| HNM06R | CGATATCAAAGATCCCATGC |
| HNM07R | GTATCATTGCATGTTGATTC |
| HNM08R | GAATGCTTCCATGGATCTGA |
| HNM09R | GAGGAACTTTTGCATTGGCA |
| HNM10R | ACATGTTTGGCTTCTGTTGA |
| HNM11R | ATAATATCCAGGTAAATCAA |
| HNM12R | TGGGGGAGGTTATGTTGAAA |
| HNM13R | CCATTGCAGTACACAACGAT |
| HNM14R | AATAGAGTGTGCTACCCCAG |
| HNM15R | TAAATGTGATTGCTGGTATA |
| HNM16R | TCAAACTCTTCCTTTATCTT |
| HNM17R | GCATTGAGACTGGGGGCATG |
| HNM18R | TTTTCTTTAGATCATCCCTG |
| HNM19R | AGAAGAAATATCCACATTGT |
| HNM20R | GTGCATAGGAACAGAACCCA |
| HNM21R | GTAGATCAATGGATTGTGCT |
| HNM22R | CCATAACAGTGAAAGGATGT |
| HNM23R | ACAATCTGATGGATTACAAC |
| HNM24R | TCCTGCTATACCTTATTGTG |
| HNM25R | ATTGTACCAATTATACAGAC |
| HNM26R | GCCAAATTGACATGTGGATG |
| HNM27R | AAATAGGAGTAGTAGCAAAG |
| HNM28R | TCATCAGTAAAGTGCATAGT |
| HNM29R | GCAAGGATTTTCACCAAGGT |
| HNM30R | AAAAGGTAGGACATTCTGTT |
| HNM31R | CCACCTTTTCCTGACACCTT |
| HNM32R | AGAAATCCCATTGACCTTGT |
| HNM33R | CACTGAATATCCCTGAAATC |
| HNM34R | AGCTATGACTTTTTATGCTT |
| HNM35R | GCTACTATTTTTTTTTAGTG |
| HNM36R | TAGTAGTAGACTCCGCAAAATGTTA |
| 한타바이러스 M 분절 확인용 멀티플렉스 프라이머 서열 세트 2 | |
| OligoID | Seq (5' -> 3') |
| HNM01F | TAGTAGTAGACTCCGCAAAATAAAG |
| HNM02F | AATGTCTATGACATGAAAAT |
| HNM03F | CAGCACAGCTGGTGCCTGAG |
| HNM04F | TCAGTCACAGTCTAGCCAAA |
| HNM05F | CGCAGTAGAAAATCAATAAC |
| HNM06F | TGAAAAGCTGTTTGATTGCA |
| HNM07F | CCCAGATCAGAGTGTGGTCA |
| HNM08F | AAAATTTTTGAACAGGTTAA |
| HNM09F | CACCAATTTATGTTCCAACA |
| HNM10F | AGAAACTGCAACTTACTCTA |
| HNM11F | TCTTATTCTTCCCTTAGTAT |
| HNM12F | GTGCCATACCACTCATGTGG |
| HNM13F | ATCATGTGAGGCCTTTTCTG |
| HNM14F | AATTTTGTATGTCAGCGAGT |
| HNM15F | ACACTATAACAAGCTTATTT |
| HNM16F | GCTTGTTACATTCTGTTTTG |
| HNM17F | CAAGAAAACAGGTTAAAATC |
| HNM18F | CCTATAAAGAGTTGAAGGCA |
| HNM19F | TTACAAAGTATGCCAAGTTA |
| HNM20F | TTTAGATACAAAAGTAGGTG |
| HNM21F | CTCCTGTCTGGAATGACAAT |
| HNM22F | CCGTAGGAAGCTAACAAACC |
| HNM23F | CACTGGTTTGATGGTCGTCT |
| HNM24F | AAAGGGATTACCAATATGAG |
| HNM25F | GAAACCAGTTGGCAGTGCTT |
| HNM26F | AATGACTGTTTTGTATCTAG |
| HNM27F | GTGGCGGTCTAATATTTAAA |
| HNM28F | GTTCCCAGGTAGTTTCAGGA |
| HNM29F | ATTGATTCCTTTCAATCTTT |
| HNM30F | TCTTAGTAACAAAAGACATC |
| HNM31F | AGGGTTTACATTAACATGTC |
| HNM32F | GTAACATTAACAAGAGGACA |
| HNM33F | TTGGACTCCATGCTGCTGCA |
| HNM34F | AAAATGTTGGTTTGTTAAAT |
| HNM35F | GTTTTACTGAGCATTCTCTG |
| HNM36F | TTTTTATATTCCAGTATAAT |
| HNM01R | TCCCCGAAGCTTACTGTGTG |
| HNM02R | TGATTGGTGATTATCCATGC |
| HNM03R | CAACTTCAGTAGACACTGTC |
| HNM04R | TAAGTACTATTGCATGATAG |
| HNM05R | ATAAACTACCTGTACTCTGT |
| HNM06R | CGATATCAAAGATCCCATGC |
| HNM07R | GTATCATTGCATGTTGATTC |
| HNM08R | GAATGCTTCCATGGATCTGA |
| HNM09R | GAGGAACTTTTGCATTGGCA |
| HNM10R | ACATGTTTGGCTTCTGTTGA |
| HNM11R | ATAATATCCAGGTAAATCAA |
| HNM12R | TGGGGGAGGTTATGTTGAAA |
| HNM13R | CCATTGCAGTACACAACGAT |
| HNM14R | AATAGAGTGTGCTACCCCAG |
| HNM15R | TAAATGTGATTGCTGGTATA |
| HNM16R | TCAAACTCTTCCTTTATCTT |
| HNM17R | GCATTGAGACTGGGGGCATG |
| HNM18R | TTTTCTTTAGATCATCCCTG |
| HNM19R | AGAAGAAATATCCACATTGT |
| HNM20R | GTGCATAGGAACAGAACCCA |
| HNM21R | GTAGATCAATGGATTGTGCT |
| HNM22R | CCATAACAGTGAAAGGATGT |
| HNM23R | ACAATCTGATGGATTACAAC |
| HNM24R | TCCTGCTATACCTTATTGTG |
| HNM25R | ATTGTACCAATTATACAGAC |
| HNM26R | GCCAAATTGACATGTGGATG |
| HNM27R | AAATAGGAGTAGTAGCAAAG |
| HNM28R | TCATCAGTAAAGTGCATAGT |
| HNM29R | GCAAGGATTTTCACCAAGGT |
| HNM30R | AAAAGGTAGGACATTCTGTT |
| HNM31R | CCACCTTTTCCTGACACCTT |
| HNM32R | AGAAATCCCATTGACCTTGT |
| HNM33R | CACTGAATATCCCTGAAATC |
| HNM34R | AGCTATGACTTTTTATGCTT |
| HNM35R | GCTACTATTTTTTTTTAGTG |
| HNM36R | TAGTAGTAGACTCCGCAAAATGTTA |
| 한타바이러스 S 분절 확인용 멀티플렉스 프라이머 서열 세트 1 | |
| OligoID | Seq (5' -> 3') |
| HNS01F | TAGTAGTAGGCTCCCTAAAG |
| HNS02F | GGCAGAAGGTAAGGGATGCA |
| HNS03F | GGCAAAGATTGATGAGTTAA |
| HNS04F | CATCTGAAAGAGAGATCAAT |
| HNS05F | TTGTTGTCTATCTTACATCC |
| HNS06F | TCGGATTCGATTTAAGGATG |
| HNS07F | AAGGCAGAAGAGATTACACC |
| HNS08F | TGATTGGTTTCCTGGCATTG |
| HNS09F | CCTTGGTGGTCCTGCAACAA |
| HNS10F | GAAGCAGCTGGCTGTAGCAT |
| HNS11F | TAGCAGGTATTGCTGAGCTT |
| HNS12F | GCGAAAGAAATCATCATTCT |
| HNS13F | GGAAAGGAGGCTGTGGACAA |
| HNS14F | CCAACCAAGAGCCTTTAAAA |
| HNS15F | TTATCAGGGGAATCAGTATA |
| HNS16F | AGGCTGCCTTAAGTAGCCTT |
| HNS17F | TACTAACAACAACACTCTAC |
| HNS01R | CTCATCTGGATCCTTTCCAT |
| HNS02R | CAGTTGCAATCCTATCTGCC |
| HNS03R | TTTAAATCCAGCACATTACC |
| HNS04R | TAGAGCTTTCAGAAGTATCG |
| HNS05R | GGATACCGTTAACGTCCTCG |
| HNS06R | AGTCCACAGACTGCTGTTCT |
| HNS07R | TTGTTCAATACGATCACTCC |
| HNS08R | CCACTTGCCGCTGCCGTAAG |
| HNS09R | ATTGATGATGGTGACTCAAT |
| HNS10R | CATGTCCTGCAGGATGGAAA |
| HNS11R | TTGATTGTGTCCTTCTGAGA |
| HNS12R | TCAGGATCCATATCATCCCC |
| HNS13R | TAAAAGGATTAATACATTCA |
| HNS14R | TTCCCACCCATAAATGTTCC |
| HNS15R | AAATGAAATCTACATCCATA |
| HNS16R | GTAGTTAAGTTGAGGTAGTT |
| HNS17R | GTAGTAGTTTTGCTCCCTAA |
| 한타바이러스 S 분절 확인용 멀티플렉스 프라이머 서열 세트 2 | |
| OligoID | Seq (5' -> 3') |
| HN2S01F | CTAGAACAACGATGGCAACT |
| HN2S02F | ACAGTATGGAAAGGATCCAG |
| HN2S03F | CAGCTGGCAGATAGGATTGC |
| HN2S04F | GTTATGGTAATGTGCTGGAT |
| HN2S05F | TGTCCCGATACTTCTGAAAG |
| HN2S06F | TCGTTCGAGGACGTTAACGG |
| HN2S07F | GATATAGAACAGCAGTCTGT |
| HN2S08F | GGATTGGAGTGATCGTATTG |
| HN2S09F | GACTACTTACGGCAGCGGCA |
| HN2S10F | AGGACATTGAGTCACCATCA |
| HN2S11F | ATTTTTTTCCATCCTGCAGG |
| HN2S12F | TCTTATCTCAGAAGGACACA |
| HN2S13F | ACTTAGGGGATGATATGGAT |
| HN2S14F | ATCAATGAATGTATTAATCC |
| HN2S15F | GCAAGGGAACATTTATGGGT |
| HN2S16F | GTATATATGGATGTAGATTT |
| HN2S17F | CACAAAACTACCTCAACTTA |
| HN2S01R | GGTCTGTTAATGCTCTCTTG |
| HN2S02R | TCTTGTTCCTTCCCAAGGTT |
| HN2S03R | TGTGGGTTCATCAATATCCA |
| HN2S04R | GCCTCCCCCTTGTTGTCAAC |
| HN2S05R | GACACATAAAGATGTTTTGG |
| HN2S06R | CCGTGCCTTGATCTGTGCAG |
| HN2S07R | GGAGCTTGCAAGGTTCGCTT |
| HN2S08R | TCTTTTGTCTCCATATTGCC |
| HN2S09R | GTCTGGTGCTCCAGCAAATA |
| HN2S10R | TCTTAGATGCCATGATTGTA |
| HN2S11R | ATCCTTTGGTCCAGTTGTAT |
| HN2S12R | CAAGCTCTGTGCAAGTGTTC |
| HN2S13R | GATTCAGTAGTATATGATAA |
| HN2S14R | TAACTGACCCACCCCTGAGT |
| HN2S15R | AAGAAAGCAAGATTAGTTAA |
| HN2S16R | GACAATCAAGGAGCAATCAA |
| HN2S17R | GTAGTAGTTTTGCTCCCTAA |
2. 환자 시료로부터 한타바이러스 확인을 위한 멀티플렉스
프라이머
중합 연쇄 반응
2-1. 시료 확보 및
RNA
추출
신증후출혈열(HFRS) 의심 환자로부터 혈청 시료를 확보하였다. 상기 확보된 혈청 시료로부터 TRIzol(Invitrogen)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다.
2-2.
cDNA
합성
분리된 총 RNA 1 μg을 한타바이러스 게놈 말단 염기서열 특이적인 OSM55 프라이머 2 μl, M-MLV 역전사효소 100 유니트, 1X RT 완충액(Promega) 0.5 mM, RNase 억제제 20 유니트와 최종 볼륨 20 μl로 혼합시켰다. 상기 혼합물을 37℃에서 10분 동안 반응시키고, 42℃에서 50분 동안 반응시킨 후, 94℃에서 3분 동안 반응하여 cDNA를 합성하였다.
2-3. 멀티플렉스 1차
PCR
반응 및 확인
상기 얻어진 템플레이트 cDNA 3.0 μl와 한타바이러스 멀티플렉스 PCR을 위하여 제작된 멀티플렉스 프라이머 세트(각각의 프라이머 농도, 1 pM) 1.0 μl, 2X Uh-완충액 12.5 μl, Uh-Taq(2.5 유니트) 0.8 μl, 그리고 분자-등급 물을 혼합하여 25 μl의 반응액을 제조한 후 1차 PCR을 ABI veriti 96 웰 유전자 증폭기(Thermal Cycler)에서 실시하였다. 1차 PCR 반응 조건은 95℃에서 15분 동안 초기 변성시킨 후, 95℃에서 20초 동안 변성하는 단계, 50℃에서 40초 동안 어닐링하는 단계 및 72℃에서 1분 동안 연장하는 단계를 포함하는 40 사이클(증폭 단계)을 수행하고 72℃에서 3분 동안 추가 연장(최종 연장 단계)하였다(표 7). 상기 1차 PCR을 통해 증폭된 핵산 증폭 산물을 3％의 아가로오스 겔(Agrarose gel; Cat 11 685 678 001, Roche, German) 상에서 전기영동하였다. 그 결과, 표준 마커를 기준으로 하여 목표로 하는 검출 유전자의 증폭 유무를 확인하였다.
| PCR 반응액 조성 | PCR 반응 조건 | |||
| 온도 | 시간 | 사이클 | ||
|
템플레이트
( cDNA 희석액 ) |
3.0 μl | 95℃ | 15분 | 1 (변성 단계) |
|
프라이머
혼합물
(각 1 pM ) |
1.0 μl | 95℃ | 20초 | 40 (증폭 단계) |
| 2x Uh - 완충액 | 12.5 μl | 50℃ | 40초 | |
|
Uh
-
Taq
(2.5 유니트 ) |
0.8 μl | 72℃ | 1분 | |
| 물 | 7.7 μl | 72℃ | 3분 | 1 (최종 연장 단계) |
| 합 | 25.0 μl | 10℃ | 계속 유지 | |
도 3은 본 발명에 의해 제작된 도 1의 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 이용한 실험 결과로서, 2종의 분리주(isolate strains)에서 한타바이러스 L, M 또는 S 분절의 멀티플렉스 프라이머 세트 1과 세트 2를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과(1st PCR 산물)를 보여준다. 반응 산물의 아가로오스 겔 상에서의 모습이 도 2에서 예시된 대로 사다리 모양으로 확인되었다.
도 4는 본 발명의 방법에 의해 설계 및 제조된 도 1의 멀티플렉스 프라이머 세트를 사용한 PCR 실험으로서, 다섯 종의 간 조직(Lung tissue)에서 한타바이러스 L, M 또는 S 분절의 멀티플렉스 프라이머 세트 1을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과(1st PCR 산물)를 보여준다.
2-4. 멀티플렉스 2차
PCR
반응 및 확인
멀티플렉스 프라이머 세트를 사용하여 수행한 1차 PCR 생성물 1.0 μl을 템플레이트로 사용하여 한타바이러스 제작된 멀티플렉스 프라이머 세트(각각의 프라이머 농도 1 pM) 1.0 μl, 2X Uh 완충액 12.5 μl, Uh-Taq(2.5 유니트) 0.8 μl, 그리고 분자-등급 물을 혼합하여 25 μl의 반응액을 제조한 후 ABI veriti 96 웰 유전자 증폭기(Thermal Cycler)에서 2차 PCR을 실시하였다. 2차 PCR 반응 조건은 95℃에서 15분 동안 초기 변성시킨 후, 95℃에서 20초 동안 변성하는 단계, 50℃에서 40초 동안 어닐링하는 단계 및 72℃에서 1분 동안 연장하는 단계를 포함하는 25 사이클(증폭 단계)을 수행하고 72℃에서 3분 동안 추가 연장(최종 연장 단계)하였다(표 8). 상기 2차 PCR을 통해 증폭된 핵산 증폭 산물을 3％의 아가로오스 겔 상에서 전기영동하였다. 그 결과, 표준 마커를 기준으로 하여 목표로 하는 검출 유전자의 증폭 유무를 확인하였다.
| PCR 반응액 조성 | PCR 반응 조건 | |||
| 온도 | 시간 | 사이클 | ||
|
템플레이트
(1차 PCR 산물) |
1.0 μl | 95℃ | 15분 | 1 (변성 단계) |
|
프라이머
혼합물
(각 1 pM ) |
1.0 μl | 95℃ | 20초 | 40 (증폭 단계) |
| 2x Uh - 완충액 | 12.5 μl | 50℃ | 40초 | |
|
Uh
-
Taq
(2.5 유니트 ) |
0.8 μl | 72℃ | 1분 | |
| 물 | 9.7 μl | 72℃ | 3분 | 1 (최종 연장 단계) |
| 합 | 25.0 μl | 10℃ | 계속 유지 | |
도 5는 본 발명에서 설계 및 제작된 도 1의 멀티플렉스 프라이머를 사용한 실험 결과로서, 15종의 환자 샘플(patient sample)에서 한타바이러스 L, M 및 S 분절에 대한 프라이머 세트 1을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과물을 적당한 양으로 희석하여, 추가적으로 2차 PCR을 수행한 결과(2nd PCR 산물)를 보여준다.
2-5. 한타바이러스 전장 유전체 서열 확정을 위한 시료 전처리 및
NGS
수행
멀티플렉스 2차 PCR 생성물을 코바리스 집중된-초음파분쇄기(Covaris Focused-Ultrasonicator)를 이용하여 분편화한다. 분편화된 PCR 시료는 자성 비드(Illumina, USA)를 이용하여 정화(clean up)한 후, 말단 수리 반응(End repair reaction)은 말단 수선 혼합물(End repari mix)(Illumina, USA) 40 μl를 이용하여 30℃에서 30분 동안 실시하였다. 이후 자성 비드를 통해 원하지 않는 큰 크기 및 작은 DNA 단편들을 모두 제거하였다. 크기 선택된 PCR 시료는 A-테일링 혼합물(tailing mix)(Illumina, USA) 12.5 μl를 이용하여 37℃에서 30분, 70℃에서 5분, 4℃에서 5분으로 이루어진 1사이클로 반응시켰다. 상기와 같이 처리된 PCR 시료는 일루미나 완충액 2.5 μl, 라이게이션 혼합물(Illumina, USA) 2.5 μl, 정해진 특정 DNA 어댑터 2.5 μl를 이용하여 30℃에서 10분 동안 라이게이션 반응을 실시하였다. 10분 후에는 정지 용액 5 μl를 넣고 상기 반응을 정지시켰다. 두 번의 정화 과정을 거친 시료는 PCR 프라이머 칵테일 5 μl와 증진된 PCR 혼합물 20 μl를 넣고 중합효소 연쇄반응 통해 상기 시료의 양을 증폭시켰다. 상기 반응 조건은 95℃에서 3분 동안 초기 변성시킨 후, 98℃에서 20초 동안 변성하는 단계, 60℃에서 15초 동안 어닐링하는 단계 및 72℃에서 30초 동안 연장하는 단계를 포함하는 8사이클(증폭 단계)을 수행하고 72℃에서 5분 동안 추가 연장(최종 연장 단계)하였다. 상기 반응 종류 후, 한 번의 정화 과정을 거치고 특질 조절(Quality control)을 통해 NGS 장비에 러닝(running) 준비를 한다. 바이오-분석기 및 RT-qPCR을 통해 시료의 농도와 질을 확인한 후, 일루미나 MiSeq 장비를 이용하여 NGS 반응을 실시하였다.
도 6은 멀티플렉스 기반된 NGS 결과의 정확성 및 상동성을 비교하기 위해 컨센서스(Consensus) PCR과 SISPA-NGS를 비교해서 분석한 결과로서, 컨센서스 PCR을 기준으로 했을 때 SISPA-NGS에 비해 본 발명을 통해 개발한 멀티플렉스 PCR 기반의 NGS가 상동성이 높은 것을 확인할 수 있었다.
도 7은 바이러스의 전장 게놈 서열(WGS)을 획득하는데 있어 일반적으로 사용되고 있는 SISPA(Sequence Independent, Single Primer Amplification; Molecular and Cellular Probes, Volume 5, Issue 6, December 1991, Pages 473?481) 방법으로 시료를 전 처리한 후에 NGS 장비인 MiSeq로 반응을 수행한 결과물인 FASTQ 파일을 한타바이러스의 레퍼런스 게놈 서열을 이용하여 L, M 및 S 분절 서열에 각각 맵핑한 도면이다. 도 7에서 확인할 수 있듯이, 각각의 분절에서 말단 부위에서 분포도(coverage)가 낮게 나타났으며, 특히 다른 분절에 비해 길이가 긴 L 분절의 경우 갭이 발생하는 단점이 있음을 알 수 있다.
도 8은 본 발명을 통해 설계 및 제작된 멀티플렉스 프라이머 세트를 이용하여 시료를 전 처리한 뒤 NGS 장비인 MiSeq로 반응을 수행한 결과물인 FASTQ 파일을 한타바이러스의 레퍼런스 게놈 서열을 이용하여 L, M 및 S 분절 서열에 각각 맵핑한 도면이다. 도 8에서 볼 수 있듯이, 각각의 분절에 전반적인 분포도가 높고 고르게 나타났으며, 갭이 전혀 발생하지 않아 한타바이러스의 전장 유전체 서열을 한 번에 획득할 수 있음을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 일 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Multiplex PCR-based Next-Generation Sequencing and Uses Thereof
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<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL01F
<400> 1
tagtagtaga ctccggaagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL02F
<400> 2
gtagagtgta tagattatct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL03F
<400> 3
aggcaatagg gaaagtacta 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL04F
<400> 4
caaggccttt ttcaagatga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL05F
<400> 5
agagaaaaga agcttaaata 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL06F
<400> 6
catttaatgt agtggcagtt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL07F
<400> 7
agctgagata agttacgtta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL08F
<400> 8
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL09F
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gaaatttttc attttttgaa 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL10F
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tagaaacttc ttactaatac 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL12F
<400> 12
cacgaataca atttaaacag 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL13F
<400> 13
actcaataat cataaaagtg 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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aaaatattgt ctgatttaga 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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ttcagaatga gacccagaag 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL16F
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tcattcagga ttaaaaagat 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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ggttccttta ttaggttcat 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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gggtatccaa agtcatgagc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tacagaagac caagggcagt 20
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<211> 20
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<220>
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atttttgaca atctacgtta 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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cattagaggt atatatatat 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL22F
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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acctgtttct ttttatttga 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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tgctgttgag ttggcagcaa 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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tttagccaaa caagaaatat 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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atttatcaaa ttcaagacat 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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gagtacatat catatggagg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL30F
<400> 30
gtaatcataa attcattagg 20
<210> 31
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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tacctccatg ctacataatg 20
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<213> Artificial Sequence
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aaactaagga actatattga 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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actggctgca gggtaactta 20
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<213> Artificial Sequence
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ttgctttttt gagtttgcac 20
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<213> Artificial Sequence
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caacagattc aagcaggcca 20
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
<220>
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actcttaggt tctctgtcag 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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cctcaggttg cacaactagc 20
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tttcaacatg agaggttagg 20
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caaaattttt agagttatgg 20
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tgacccaagt attgttacag 20
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<211> 20
<212> DNA
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<220>
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gaatgggtta ccttcaggga 20
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gttgtacatt ttctaaagag 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL50F
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caacagaaag acttagctgc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL51F
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tcgaggataa gaccttttca 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> HNL52F
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tataaagggt gattattcag 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL53F
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acaaagcttt atgaaggaga 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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catcaattac acagaagcat 20
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HNL55F
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agtacggcac atggtattgt 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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cttagaacca cacaggcaat 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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aaatcccatc atttcatctg 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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atatctgttg atctctttat 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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gtactgtgag ttcaatgtca 20
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<223> HN2S03R
<400> 458
tgtgggttca tcaatatcca 20
<210> 459
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S04R
<400> 459
gcctccccct tgttgtcaac 20
<210> 460
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S05R
<400> 460
gacacataaa gatgttttgg 20
<210> 461
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S06R
<400> 461
ccgtgccttg atctgtgcag 20
<210> 462
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S07R
<400> 462
ggagcttgca aggttcgctt 20
<210> 463
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S08R
<400> 463
tcttttgtct ccatattgcc 20
<210> 464
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S09R
<400> 464
gtctggtgct ccagcaaata 20
<210> 465
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S10R
<400> 465
tcttagatgc catgattgta 20
<210> 466
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S11R
<400> 466
atcctttggt ccagttgtat 20
<210> 467
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S12R
<400> 467
caagctctgt gcaagtgttc 20
<210> 468
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S13R
<400> 468
gattcagtag tatatgataa 20
<210> 469
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S14R
<400> 469
taactgaccc acccctgagt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S15R
<400> 470
aagaaagcaa gattagttaa 20
<210> 471
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S16R
<400> 471
gacaatcaag gagcaatcaa 20
<210> 472
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> HN2S17R
<400> 472
gtagtagttt tgctccctaa 20
<210> 473
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OSM55
<400> 473
tagtagtaga ctcc 14
Claims (13)
- 시료 내 한탄바이러스(Hantaan virus, HTNV)의 전장 게놈 서열(Whole genome sequences) 확인 방법으로서, 상기 방법은:
(a) 서로 다른 100 내지 200 bp 길이의 한탄바이러스(HTNV)의 게놈 서열 단편들을 증폭하는 다수의 정방향 및 역방향 프라이머 쌍들로 이루어진 서로 다른 멀티플렉스 프라이머 세트들을 포함하는 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 제조하는 단계로서, 상기 하나의 멀티플렉스 프라이머 세트에 의해 증폭되는 한탄바이러스(HTNV) 게놈 서열 단편들은 한탄바이러스(HTNV) 게놈 중 1 내지 2kb 서열을 포괄하며, 상기 단편들에서 5'-to-3' 방향으로 서로 인접하는 2개의 단편들은 중첩 서열(overlapping sequence)을 포함하고, 상기 중첩 서열은 40 내지 60 bp의 길이로 선행하는 단편의 3'-말단 및 후행하는 단편의 5'-말단에 공통적으로 존재하며, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀에 의해 증폭되는 모든 단편들을 5'-to-3' 방향으로 서로 중첩하는 경우 한탄바이러스(HTNV)의 전장 게놈 서열을 포함하는 것인 단계;
(b) 한탄바이러스(HTNV) 감염 시료에서 상기 제조된 프라이머 세트 풀을 이용하여 차세대 시퀀싱(next generation sequencing)을 사용하기 위한 시료 전처리(sample pre-processing) 과정의 일부로 멀티플렉스 중합효소 연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction, mPCR)을 실시하는 단계; 및
(c) 상기 증폭된 mPCR 산물들을 포함하는 한탄바이러스(HTNV) 서열 라이브러리를 차세대 시퀀싱(next generation sequencing, NGS)으로 분석하는 단계
를 포함하고,
상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀은 서열번호 1 내지 서열번호 472로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 방법은
단계 (b) 후에, 단계 (a)에서 제조된 멀티플렉스 프라이머 세트 풀과 상이한 프라이머 쌍으로 구성된 멀티플렉스 프라이머 세트들을 포함하는 두 번째 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 제조하여 mPCR을 실시하는 단계(b-1)를 추가적으로 포함하는 것인 방법. - 제1항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 얻는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시료는 RNA 또는 cDNA인 것인 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 방법은 한탄바이러스(HTNV)의 L, M 또는 S 분절(segment)을 확인하는 것인 방법.
- 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 포함하는 시료 내 한탄바이러스(HTNV) 진단 키트로서, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀은 서열번호 1 내지 서열번호 472로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하고 상기 프라이머 쌍은 한타바이러스 L, M 및 S 분절 내 게놈 서열을 증폭하는 것인 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 얻는 것인 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 시료는 RNA 또는 cDNA인 것인 키트.
- 제8항에 있어서, 상기 키트는 PCR에 따라 실시되는 것인 키트.
- 멀티플렉스 프라이머 세트 풀을 포함하는 한탄바이러스(HTNV) 유발 질환 검출용 조성물로서, 상기 멀티플렉스 프라이머 세트 풀은 서열번호 1 내지 서열번호 472로 이루어진 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 쌍을 포함하고 상기 프라이머 쌍은 한타바이러스 L, M 및 S 분절 내 게놈 서열을 증폭하는 것인 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 한탄바이러스(HTNV) 유발 질환은 신증후 출혈열(hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS) 또는 한타바이러스 심폐증후군(Hantavirus cardiopulmonary syndrome, HCPS)인 것인 조성물.
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