KR101931420B1

KR101931420B1 - 세포의 분화 상태의 평가 방법

Info

Publication number: KR101931420B1
Application number: KR1020167031400A
Authority: KR
Inventors: 다카시 스즈키; 노리오 나카츠지; 히로후미 스에모리; 신이치로 추마
Original assignee: 가부시키가이샤 시마즈세이사쿠쇼
Priority date: 2014-05-01
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2018-12-20
Anticipated expiration: 2035-04-21
Also published as: US11022600B2; CN106460028A; KR20160143804A; EP3138922A4; US20170052171A1; EP3138922B1; JP6332440B2; JP2018121659A; JPWO2015166845A1; AU2015254267A1; SG11201609091YA; AU2015254267B2; JP6536711B2; CN106460028B; WO2015166845A1; EP3138922A1

Abstract

본 발명에서는, 분화 상태가 미지인 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화 유도를 행한 세포를 피검 세포로 하고, 당해 피검 세포의 배양 접시와 분화 상태가 기지인 대조 세포의 배양 접시로부터 배양 상청을 회수하여 LC-MS 또는 GC-MS에 의한 분석을 하고, 당해 분석의 결과 구해진, 상기 피검 세포의 배양 상청과 대조 세포의 배양 상청에 있어서의 푸트레신, 키뉴레닌, 시스타티오닌, 아스코르브산, 리보플라빈, 피루브산, 세린, 시스테인, 트레온산, 시트르산, 및 오로트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물의 존재량에 기초하여 당해 피검 세포의 분화 상태를 평가한다.

Description

세포의 분화 상태의 평가 방법{METHOD FOR EVALUATING STATE OF DIFFERENTIATION OF CELLS}

본 발명은 세포의 분화 상태를 평가하기 위한 방법에 관한 것이다.

종래, 세포의 분화 상태를 평가하기 위해서는, 면역 염색을 이용한 방법(예를 들어 특허문헌 1을 참조)이나 마커 유전자의 발현 레벨을 정량하는 방법(예를 들어 특허문헌 2를 참조)이 널리 사용되고 있다.

면역 염색을 이용한 방법에서는, 먼저 평가 대상으로 하는 세포, 예를 들어 다능성 줄기세포를 파라포름알데히드 등으로 고정화한 뒤에 항원-항체 반응을 행한다. 여기서, 다능성 줄기세포가 미분화 상태인지 여부를 판정하기 위한 항체로서는, SSEA-4나 TRA1-60이 널리 사용되고 있다(예를 들어 특허문헌 1을 참조). 계속해서, 상기 항체에 결합하는 2차 항체를 세포에 첨가하고, 그 후, 미리 상기 2차 항체에 부여해 둔 형광 표지 등을 검출한다. 이에 의해, 세포 상에 상기 항체에 대한 항원이 존재하는지 여부, 즉 당해 세포가 미분화 상태인지 여부를 평가할 수 있다.

또한, 마커 유전자의 발현 레벨의 정량에 의한 방법에서는, 예를 들어 다능성 줄기세포로부터 mRNA를 추출하고, 이것을 역전사 효소에 의해 cDNA로 변환한 후, PCR(Polymerase Chain Reaction, 폴리메라아제 연쇄 반응)에 의해 마커 유전자를 증폭한다. 이때, 다능성 줄기세포의 미분화성을 평가하기 위한 마커 유전자로서는, NANOG이나 POU5F1(OCT3/4)이 널리 사용된다(예를 들어 비특허문헌 1을 참조). 이 PCR 산물을 전기 영동이나 리얼타임 PCR 장치로 검출함으로써 상기 세포에 있어서의 마커 유전자의 발현량을 확인하고, 그 결과로부터 당해 세포가 미분화 상태인지 여부를 평가한다.

일본 특허 공개 제2004-313184호 공보 일본 특허 공개 제2006-042663호 공보

네이쳐 바이오테크놀로지(Nature Biotechnology), 2007, 제25권, pp.803-816

그러나, 상기 종래의 평가 방법에서는, 모두 세포에 대하여 침습적인 처리를 행할 필요가 있다. 그로 인해, 분화 상태의 평가를 행한 후에, 당해 평가에 제공한 세포를 다른 목적으로 이용, 예를 들어 재생 의료용의 세포원으로 할 수가 없었다. 또한, 동일 샘플(즉 동일 배양 접시 중의 세포)에 대해서, 시간 경과에 수반하는 변화를 평가하는 것은 불가능하여, 분화 상태의 경시적인 변화를 평가하기 위해서는 복수의 배양 접시에서 병행하여 배양을 행하는 등, 번잡한 작업이 필요하였다.

본 발명은 상기 점을 감안하여 이루어진 것이며, 그 목적으로 하는 점은, 세포의 분화 상태를 비칩습적으로 평가하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 예의 검토를 거듭한 결과, 세포의 분화 상태에 따라 배양 상청 중에 있어서의 푸트레신, 키뉴레닌, 시스타티오닌, 아스코르브산, 리보플라빈, 피루브산, 세린, 시스테인, 트레온산, 시트르산, 및 오로트산의 존재량이 상이함을 알아내어, 본원 발명에 이르렀다.

즉, 상기 과제를 해결하기 위하여 이루어진 본 발명에 따른 세포 분화 상태의 평가 방법은, 분화 상태가 미지인 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화 유도를 행한 세포를 피검 세포로 하고, 당해 피검 세포의 배양 상청에 있어서의 소정 물질의 존재량에 기초하여 당해 피검 세포의 분화 상태를 평가하는 방법으로서,

상기 소정 물질이, 푸트레신, 키뉴레닌, 시스타티오닌, 아스코르브산, 리보플라빈, 피루브산, 세린, 시스테인, 트레온산, 시트르산, 및 오로트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물인 것을 특징으로 하고 있다.

상기 본 발명에 따른 세포 분화 상태의 평가 방법은, 예를 들어, 상기 피검 세포의 배양 상청에 있어서의 상기 소정 물질의 존재량과, 분화 상태가 기지인 대조 세포의 배양 상청에 있어서의 상기 소정 물질의 존재량을 비교함으로써, 상기 피검 세포의 분화 상태를 평가하는 것으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 세포 분화 상태의 평가 방법은, 상기 줄기세포가 ES 세포(Embryonic Stem cells, 배성 줄기세포)나 iPS 세포(Induced Pluripotent Stem cells, 인공다능성 줄기세포) 등의 다능성 줄기세포인 것으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 세포 분화 상태의 평가 방법은, 상기 배양 상청 중의 상기 소정 물질의 존재량을 질량 분석법에 의해 정량하는 것으로 할 수 있다.

상기 본 발명에 따른 세포 분화 상태의 평가 방법에 의하면, 종래와 같이 세포를 파괴할 필요가 없고, 비칩습적으로 세포의 분화 상태를 평가할 수 있다. 이에 의해, 분화 상태의 평가 후에, 피검 세포를 재생 의료용의 세포원 등으로서 이용하는 것이 가능하게 된다. 또한, 분화 상태의 경시적인 변화를 평가하는 경우에도, 종래와 같이 복수의 배양 접시에서 병행하여 배양을 행한다고 하는 번잡한 작업을 행할 필요가 없고, 동일 배양 접시 중의 세포를 대상으로 하여 용이하게 시간 경과에 수반하는 분화 상태의 변화를 평가하는 것이 가능하게 된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 있어서의 세포 분화 상태의 평가 방법을 설명하는 모식도.
도 2는 상기 실시예에 있어서 배양 상청의 GC-MS 분석에 의해 구해진 각 물질의 존재량의 경시 변화를 나타내는 그래프.
도 3은 상기 실시예에 있어서 배양 상청의 LC-MS 분석에 의해 구해진 각 물질의 존재량의 경시 변화를 나타내는 그래프.
도 4는 DMEM/F12의 구성 성분을 나타내는 표.
도 5는 mTeSR1의 구성 성분을 나타내는 표의 전반 부분.
도 6은 mTeSR1의 구성 성분을 나타내는 표의 후반 부분.

본 발명에 따른 세포 분화 상태의 평가 방법은, 푸트레신, 키뉴레닌, 시스타티오닌, 아스코르브산, 리보플라빈, 피루브산, 세린, 시스테인, 트레온산, 시트르산, 및 오로트산으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나의 화합물을 바이오마커로 하고, 피검 세포의 배양 상청에 있어서의 상기 바이오마커의 존재량에 기초하여 당해 피검 세포의 분화 상태를 평가하는 것이다.

상기 피검 세포로서는 줄기세포, 전형적으로는 ES 세포나 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포를 사용할 수 있다. 또한 상기 줄기세포로부터 분화 유도를 행한 세포도 피검 세포로서 사용할 수 있다. 또한, 이러한 피검 세포의 배양에 사용하는 배지로서는, 줄기세포의 배양에 일반적으로 사용되는 배지, 예를 들어 DMEM/F12나, 당해 DMEM/F12를 주성분으로 하는 배지(예를 들어 mTeSR1 등)를 사용할 수 있다. 도 4에 DMEM/F12의 구성 성분을 나타낸다.

배양 상청에 있어서의 상기 바이오마커의 존재량을 측정하는 방법으로서는, 질량 분석법에 의한 정량 분석, 특히 액체 크로마토그래프 질량 분석 장치(LC-MS)나, 가스 크로마토그래프 질량 분석 장치(GC-MS)를 사용한 정량 분석을 적합하게 이용할 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 각 바이오마커를 특이적으로 발색 또는 발광시키는 시약 등을 배양 상청에 첨가하고, 당해 발색 또는 발광의 강도에 기초하여 바이오마커의 존재량을 구하도록 해도 된다.

실시예

이하, 본 발명의 방법에 의한 세포의 분화 상태 평가의 일 실시예에 대하여 설명한다. 도 1은 본 실시예에 의한 세포 분화 상태의 평가 방법의 실시 수순을 도시하는 모식도이다.

본 실시예에서는, 2종류의 인간 ES 세포주 KhES-1 및 KhES-3을 사용하였다. 또한, 각 ES 세포주에 분화 유도 자극을 부여한 것을 피검 세포로 하고, 동 ES 세포주의 미분화 상태를 유지한 것을 대조 세포로 하였다. 이하, 본 실시예에 있어서의 세포 배양부터 배양 상청의 분석까지의 수순에 대하여 설명한다.

[대조 세포의 배양 및 배양 상청의 회수]

바이오코트 마트리겔(등록 상표, 코닝 인터내셔널 가부시키가이샤)이 코팅된 4개의 배양 접시(직경 60mm)에 상기 KhES-1주를 이어 심어서 배양을 행했다(도 1에서는 간략화를 위해 배양 접시 1개만을 나타내었다). 배지로서는 mTeSR1(modified Tenneille Serum Replacer 1)을 사용하고, 매일 배지의 교환을 행하였다. mTeSR1의 구성 성분을 도 5 및 도 6에 도시하었다. 마찬가지로 KhES-3주에 대해서도 4개의 배양 접시에 이어 심어서 배양을 행하였다. 세포의 이어 심기(계대)를 행한 날을 0일째로 하여 콘플루언트(confluent)에 도달할 때까지 배양을 계속하고, 각 날의 배지 교환 시에 배양 접시로부터 회수한 배양 상청을 질량 분석용의 샘플로 하였다. 또한, 배양 0일째에 대해서는, mTeSR1 그 자체를 질량 분석용 샘플로 하였다.

[피검 세포의 배양 및 배양 상청의 회수]

마트리겔이 코팅된 4개의 배양 접시(직경 60mm)에 상기 KhES-1주를 이어 심어서 배양을 행했다(도 1에서는 간략화를 위해 배양 접시 1개만을 나타내었다). 배지로서는 mTeSR1을 사용하여, 매일 배지의 교환을 행하여 콘플루언트에 도달할 때까지 배양을 계속하였다. 마찬가지로 KhES-3주에 대해서도 4개의 배양 접시에 이어 심어서 배양을 행하였다. 계대를 행한 날을 0일째로 하고, 2일째부터는 상기 배지 교환 시에, 레티노산을 최종 농도 0.1μM이 되도록 첨가한 mTeSR1로 교환함으로써, 분화 유도 자극을 행하였다. 각 날의 배지 교환 시에 배양 접시로부터 회수한 배양 상청을 질량 분석용의 샘플로 하고, 배양 0일째에 대해서는, mTeSR1 그 자체를 질량 분석용 샘플로 하였다.

[샘플의 전처리]

상기 샘플에 각각 내부 표준 물질로서 이소프로필말산을 첨가하고, 추출 용액(메탄올:클로로포름:물=2.5:1:1)으로 처리하여 제단백을 행하였다. 추출 후의 상청을 회수하고, 건조시켰다.

[GC-MS에 의한 분석]

상술한 전처리를 행한 각 샘플을 메톡시아민염산염을 포함하는 피리딘 용액 중에서 인큐베이트함으로써, 샘플 중의 화합물의 메톡심화를 행하였다. 또한, 각 샘플에 MSTFA(N-메틸-N-트리메틸실릴트리플루오로아세트아미드)를 첨가함으로써 샘플 중의 화합물을 트리메틸실릴화하였다. 그리고, 이들의 유도체화 처리를 실시한 샘플을 GC-MS에 의한 분석에 제공하였다. 분석 결과의 해석에는, 시마즈 세이사꾸쇼 제조의 「GCMS 대사 성분 데이터베이스 Ver. 2」을 사용하였다. 당해 데이터베이스는 상기와 마찬가지의 유도체화 처리를 실시한 여러가지 화합물 표준품을 GC-MS로 분석한 데이터가 집약된 것이다. 화합물의 동정은, 상기 데이터베이스에서 설정된 유지 지표(유지 시간을 상대화한 수치)와 샘플 중의 유도체화 화합물의 유지 지표와의 차가 ±5 이내인지 여부, 및 상기 데이터베이스에서 설정된 정량 이온 및 확인 이온의 양자가 샘플 중의 유도체화 화합물에 대하여 검출되어 있는지 여부를 지표로 행하였다. 한편, 화합물의 정량은, 상기 데이터베이스에서 설정된 조건에 따라, 샘플 중의 각 유도체화 화합물에 특징적인 이온에 관한 매스 크로마토그램의 면적을 산출하는 방법에 의해 실시하였다.

[LC-MS에 의한 분석]

상술한 전처리를 행한 각 샘플에 적당량의 초순수(Milli-Q(등록 상표)수, 메르크 가부시키가이샤)를 첨가하여 용해시키고, LC-MS에 의한 분석에 제공하였다. LC-MS 분석에서는, 각 샘플 중의 화합물을 역상 분리 칼럼을 사용한 구배 용출에 의해 시간적으로 분리한 후, 다중 반응 모니터링(MRM, Multiple Reaction Monitoring) 모드에 의한 질량 분석을 하였다. MRM 모드에서의 분석 조건의 설정은, 화합물 표준품을 사용하여 실시하였다. 화합물의 동정은, 표준품의 유지 시간과 샘플 중의 화합물의 유지 시간의 차가 ± 0.1분 이내인지 여부를 기준으로 행하였다. 또한, 화합물의 정량은, 샘플 중의 각 화합물에 특징적인 이온에 대하여 매스 크로마토그램의 면적을 산출하는 방법에 의해 실시하였다.

배양 최종일에 회수된 배양 상청(즉 콘플루언트에 달한 배양 접시로부터 채취된 배양 상청)에 대해서, 상기 GC-MS 분석 및 LC-MS 분석을 행함으로써 구해진 각 화합물의 정량값(면적값)을 상기 내부 표준 물질의 정량값(면적값)으로 제산한 값을 산출하고, 이것을 배양 상청 중에 있어서의 각 화합물의 존재량의 지표값으로 하였다. 그리고, 대조 세포와 피검 세포 각각에 관하여, 상기 4개의 배양 접시로부터 회수한 배양 상청을 각각 GC-MS 및 LC-MS로 분석한 결과로부터 얻어진 상기 지표값의 평균을 취하고, 당해 지표값의 평균값을 사용하여 대조 세포와 피검 세포에 있어서의 각 화합물의 존재량을 비교하였다. 구체적으로는, 대조 세포에 대하여 구해진 상기 지표값의 평균값을 A, 피검 세포에 대하여 구해진 상기 지표값의 평균값을 B라 했을 때, A/B, 또는 B/A가 1.2 이상이며, 또한 스튜던트의 t검정에서 P<0.05인 때, 그 화합물의 존재량에는 대조 세포의 배양 상청과 피검 세포의 배양 상청 사이에 유의차가 있다고 판정하였다.

이상에 의해, 대조 세포의 배양 상청 중과 피검 세포의 배양 상청 중에 존재량에 유의차가 있다고 판정된 화합물을 이하의 표 1 내지 표 4에 나타내었다. 또한, 표 중의 「E」는 10의 멱승을 의미하고, 예를 들어 「1.326E-02」은 「1.326×10^-2」을 의미하고 있다.

이하의 표 1 및 표 2는, 대조 세포의 배양 상청 중의 존재량이 피검 세포의 배양 상청 중의 존재량보다 많은 것이 확인된 화합물을 나타내고 있다. 표 1은 KhES-1주에 있어서의 결과이며, 표 2는 KhES-3주에 있어서의 결과이다. 또한, 이 표 중에 있어서의 「변동값」이란, 상기 A/B, 즉 「피검 세포에 있어서의 상기 지표값의 평균값」에 대한 「대조 세포에 있어서의 상기 지표값의 평균값」의 비를 의미하고 있다.

이하의 표 3 및 표 4는, 피검 세포의 배양 상청 중의 존재량이 대조 세포의 배양 상청 중의 존재량보다 많은 것이 확인된 화합물을 나타내고 있다. 표 3은 KhES-1주에 있어서의 결과이며, 표 4는 KhES-3주에 있어서의 결과이다. 또한, 이 표 중에 있어서의 「변동값」이란, 상기 B/A, 즉 「대조 세포에 있어서의 상기 지표값의 평균값」에 대한 「피검 세포에 있어서의 상기 지표값의 평균값」의 비를 의미하고 있다.

이상에 의해, 표 1 내지 표 4에 기재된 각 화합물은, 분화 유도에 의해 세포에 있어서의 대사량 및/또는 세포 밖으로의 분비량이 변화하는 것으로서, 세포의 분화 상태를 평가하기 위한 바이오마커로서 이용할 수 있음을 알 수 있다. 즉, 예를 들어 미분화 상태를 유지하고 있는지 여부가 불분명한 줄기세포를 피검 세포, 미분화 상태인 것이 명확한 줄기세포를 대조 세포로 하고, 표 1 및 표 2에 기재된 화합물 중 어느 하나에 대하여 「피검 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」에 대한 「대조 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」의 비를 구하고, 그 값이 미리 정한 역치 이상인 경우에, 상기 피검 세포는 미분화 상태가 아니라고 판정할 수 있다. 또는, 표 3, 4에 기재된 화합물 중 어느 하나에 대하여 「대조 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」에 대한 「피검 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」의 비를 구하고, 그 값이 미리 정한 역치 이상인 경우에, 상기 피검 세포는 미분화 상태가 아니라고 판정할 수도 있다.

또한, 상기와는 반대로, 분화되어 있는 것이 명확한 세포를 대조 세포로 하고, 표 1 및 표 2에 기재된 화합물 중 어느 하나에 대하여 「대조 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」에 대한 「피검 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」의 비를 구하고, 그 값이 미리 정한 역치 이상인 경우에, 상기 피검 세포는 미분화 상태라고 판정하도록 해도 된다. 또는, 표 3, 4에 기재된 화합물 중 어느 하나에 대하여 「피검 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」에 대한 「대조 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」의 비를 구하고, 그 값이 미리 정한 역치 이상인 경우에, 상기 피검 세포는 미분화 상태라고 판정할 수도 있다.

또한, 예를 들어 미분화 상태의 세포가 잔존하고 있는지 여부가 불분명한 줄기세포 유래의 분화 유도 세포를 피검 세포, 미분화인 것이 명확한 세포를 대조 세포로 하고, 표 1 및 표 2에 기재된 화합물 중 어느 하나에 대하여 「대조 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」에 대한 「피검 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」의 비를 구하고, 그 값이 미리 정한 역치 이상인 경우에, 상기 피검 세포는 미분화 상태의 세포가 혼재하고 있다고 판정할 수 있다. 또는, 표 3, 4에 기재된 화합물 중 어느 하나에 대하여 「피검 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」에 대한 「대조 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」의 비를 구하고, 그 값이 미리 정한 역치 이상인 경우에, 상기 피검 세포는 미분화 상태의 세포가 혼재하고 있다고 판정할 수도 있다.

또한, 예를 들어 상기한 바와 마찬가지로 미분화 상태의 세포가 잔존하고 있는지 여부가 불분명한 줄기세포 유래의 분화 유도 세포를 피검 세포로 하고, 대조 세포로서는 상기와는 반대로, 분화된 것이 명확한 세포를 사용하여, 표 1 및 표 2에 기재된 화합물 중 어느 하나에 대하여 「대조 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」에 대한 「피검 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」의 비를 구하고, 그 값이 미리 정한 역치 이상인 경우에, 상기 피검 세포는 미분화 상태의 세포가 혼재하고 있다고 판정할 수 있다. 또는, 표 3, 4에 기재된 화합물 중 어느 하나에 대하여 「피검 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」에 대한 「대조 세포의 배양 상청 중에 있어서의 존재량」의 비를 구하고, 그 값이 미리 정한 역치 이상인 경우에, 상기 피검 세포는 미분화 상태의 세포가 혼재하고 있다고 판정할 수도 있다. 또한, 상기 어느 방법에 의한 판정을 행하는 경우에 있어서도, 대조 세포의 배양 상청 중에 있어서의 화합물의 존재량에 대해서는, 피검 세포와 동일한 시간에 측정할 필요는 없고, 미리 측정한 데이터를 사용해도 된다.

또한, 상기 표 1 내지 표 4에 기재된 화합물 중, 피검 세포의 상청 중에서의 존재량에 비하여 대조 세포의 배양 상청 중에서의 존재량이 많은 푸트레신, 시스타티오닌, 키뉴레닌, 및 아스코르브산에 있어서, 변동값이 3.00 이상이라고 하는 존재량의 큰 변화가 확인되었다(표 1 및 표 2를 참조). 따라서, 이들 화합물은, 피검 세포가 미분화 상태인 것을 나타내는, 또는 피검 세포 중에 미분화 상태의 세포가 혼재하는 것을 나타내는 바이오마커로서 특히 바람직하게 이용할 수 있다고 생각된다.

또한, KhES-1주의 배양 0일째 내지 6일째의 배양 상청에 있어서의 상기 바이오마커의 존재량의 변화를 도 2 및 도 3에 도시한다. 또한, 도 2는 GC-MS 분석에 의한 결과이며, 도 3은 LC-MS 분석에 의한 결과이다. 이들 도면으로부터 명백해진 바와 같이, 배양 개시 직후에는 피검 세포와 대조 세포에서 상기 바이오마커 화합물의 존재량에 차이는 없지만, 시간이 경과함에 따라서 피검 세포와 대조 세포 사이에 각 바이오마커 화합물의 존재량의 차가 벌어져 가는 것이 확인되었다. 또한, 도 2 및 도 3에서는, KhES-1주에 관한 결과를 나타냈지만, KhES-3주에 대해서도 마찬가지의 변화를 나타내는 것이 확인되었다.

Claims

분화 상태가 미지인 다능성 줄기세포 또는 다능성 줄기세포로부터 분화 유도를 행한 세포를 피검 세포로 하고, 당해 피검 세포의 배양 상청에 있어서의 키뉴레닌의 존재량에 기초하여 당해 피검 세포의 분화 상태를 평가하는 방법으로서,
상기 피검 세포의 배양 상청에 있어서의 키뉴레닌의 존재량과, 분화 상태가 기지이고 다능성 줄기세포인 대조 세포의 배양 상청에 있어서의 키뉴레닌의 존재량을 비교함으로써, 상기 피검 세포의 분화 상태를 평가하는 것을 특징으로 하는 세포 분화 상태의 평가 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 대조 세포로서 분화되어 있는 것이 명확한 다능성 줄기세포를 사용하여, 상기 대조 세포의 배양 상청에 있어서의 키뉴레닌의 존재량에 대한 상기 피검 세포의 배양 상청에 있어서의 키뉴레닌의 존재량의 비가 미리 정한 역치 이상일 경우에, 상기 분화 상태가 미지인 다능성 줄기세포는 미분화 상태라고, 또는 상기 다능성 줄기세포로부터 분화 유도를 행한 세포에는 미분화 상태의 세포가 혼재하고 있다고 판정하는 것을 특징으로 하는 세포 분화 상태의 평가 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 대조 세포로서 미분화인 것이 명확한 다능성 줄기세포를 사용하여, 상기 대조 세포의 배양 상청에 있어서의 키뉴레닌의 존재량에 대한 상기 피검 세포의 배양 상청에 있어서의 키뉴레닌의 존재량의 비가 미리 정한 역치 이상일 경우에, 상기 분화 상태가 미지인 다능성 줄기세포는 미분화 상태라고, 또는 상기 다능성 줄기세포로부터 분화 유도를 행한 세포에는 미분화 상태의 세포가 혼재하고 있다고 판정하는 것을 특징으로 하는 세포 분화 상태의 평가 방법.
삭제
삭제
제1항, 제3항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 상청 중의 상기 키뉴레닌의 존재량을 질량 분석법에 의해 정량하는 것을 특징으로 하는 세포 분화 상태의 평가 방법.
삭제