KR101975610B1

KR101975610B1 - Ｃｙａａ 운반 폴리펩티드（들） 및 치료학적 및 예방학적 면역 반응 둘 다를 유도하기 위한 용도

Info

Publication number: KR101975610B1
Application number: KR1020137022115A
Authority: KR
Inventors: 미쉘 에스퀘레; 마리 모모트; 안느 구비에; 욜랜드 미세리
Original assignee: 장띠셀
Priority date: 2011-01-24
Filing date: 2012-01-24
Publication date: 2019-05-07
Anticipated expiration: 2032-01-24
Also published as: US20140037670A1; EP2667890A1; CA2825470A1; EP2478915A1; JP2016208979A; RU2013136148A; JP2014506562A; US9902947B2; CN103476424A; MX2013008606A; AU2012210612A1; BR112013018742A2; RU2668795C2; WO2012101112A1; ES2748381T3; EP2667890B1; AU2012210612B2; JP6014604B2; KR20140034147A; MX361230B

Abstract

본 발명은, CyaA-운반 폴리펩티드(들)에 기초한, 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프(epitope)의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방에 사용하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 면역 반응은 상기 숙주 내로 상기 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 투여한 후 얻어지며, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다.

Description

ＣＹＡＡ 운반 폴리펩티드（들） 및 치료학적 및 예방학적 면역 반응 둘 다를 유도하기 위한 용도{CYAA-CARRIED POLYPEPTIDE(S) AND USE TO INDUCE BOTH THERAPEUTIC AND PROPHYLACTIC IMMUNE RESPONSES}

본 발명은, CyaA-운반 폴리펩티드(들)에 기초한, 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프(epitope)의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방에 사용하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 면역 반응은 상기 숙주 내로 상기 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 투여한 후 얻어지며, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은, CyaA-운반 폴리펩티드(들)에 기초한, (ⅰ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, (ⅱ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 면역 반응은 상기 숙주 내로 상기 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 투여한 후 얻어지며, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다.

백일해의 원인이 되는 병원체인 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis)에 의해 생성되는 핵심적인 독소들 중 하나는, 이의 아데닐산 시클라아제(CyaA)이다. 쥐과 모델을 사용하여, 폐 콜로니화의 초기 단계 중의 박테리아가 CyaA를 필요로 하는 것이 관찰되었다(Goodwin and Weiss 1990). CyaA는 세포 시토졸(cytosol) 내로 이의 촉매 도매인을 전용 방식으로 전달함으로써 진핵 세포 침입의 독특한 메커니즘을 보인다(Simsova, Sebo et al. 2004). 백신 벡터로 사용되는 무독화 및 재조합된 CyaA는 예를 들어 수지상 세포 또는 랑게르한스 세포와 같은 CD11b/CD18 발현 항원 제시 세포(APC)를 타게팅하는 정교한 능력을 보인다(Guermonprez et al. 2001). 이러한 상주 APC는 피내 면역화 방법 이후 항원 특이적 T-세포 반응의 개시에서의 핵심적인 선천 세포(innate cell)이다(Merad, Ginhoux et al. 2008). CD11b⁺ APC에 대한 특이적 결합 후에, 바이러스 또는 종양 항원을 운반하는 CyaA는 전용 방식으로 이의 항원 카고(cargo)를 전달할 수 있다(Preville, Ladant et al. 2005). 이 독특한 기술을 기초로 하여, 본 출원인은 HPV 감염 환자를 치료하기 위한 임상 단계 2가 백신: 프로세빅스(ProCervix)를 개발하였다. 프로세빅스는 2 개의 상이한 CyaA 백신들: HPV16 E7 단백질을 내포하는 하나의 백신과 HPV18 E7 단백질을 운반하는 다른 백신과의 혼합물로 제조된 2가 치료 백신이다.

실제로 인유두종 바이러스(HPV) 감염은 일반적으로 오래 지속되고, 면역이 약화된 숙주 면역 반응은, 특히 HPV18 및 HPV16과 같은 고위험 HPV로 자궁경부암의 발생을 일으킬 수 있다. HPV의 E7 종양단백질은 바이러스의 복제 주기 내내 발현되고, 이렇게 하여 이들은 T-세포 매개 면역 요법에 선택된 표적이 된다(Iwasaki 2010). 바이러스 캡시드 단백질에 대한 B-세포 매개 면역은 HPV 감염에 대항하는 예방적 보호에 충분함이 확인되었다(Stanley 2010). 그러나, 선천 및 T-세포 매개 면역은 상기 바이러스로 이미 감염된 환자들을 치료하는 데 결정적이다(Frazer 2009). 게다가, 사용 가능한 HPV 예방 백신은 이미 HPV-감염된 환자를 치료하고 상기 질병을 치료하기에 효과적이지 않으므로, 따라서 HPV 항원에 대한 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 치료 백신을 개발하는 것의 중요성이 강조된다(Trimble and Frazer 2009).

예방 백신은 B-세포 매개 면역의 발생에 기초한다. 대조적으로, 치료 백신은 만성 감염(바이러스, 박테리아 등)의 또는 암의 효과적인 치료를 위한 강하고 견실한(robust) 전염증성 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 반응을 발달시키는 것을 목표로 한다(Bachmann and Jennings 2010). 많은 연구들은 마우스 모델 및 인간 환자 둘 다에서 항원 특이적 T 세포 면역의 유발이 질병 세포, 즉 감염된 세포 또는 종양 세포에 대한 보호와 관련될 수 있음을 기술하였다(Pulendran, Li et al. 2010; Sallusto, Lanzavecchia et al. 2010). 종양 함유 마우스에서의 치료 백신접종 후 유도된 CD8⁺ T 세포 반응의 정량적 및 정성적 양태를 측정함으로써, 치료학적 결과, 즉 개별 동물에서 종양의 진행(progression) 또는 퇴축(regression)을 예측하는 것이 가능하다(Rosato, Zoso et al. 2006). 질병 세포의 완전한 제거를 유도하는 성공적인 치료 백신 접종 후에, 이 면역요법의 주요한 양태는 2차 병원체 감염에 대해 환자를 보호하기 위한 장기 메모리 T 림프구를 생성하는 이의 잠재력일 것이다. 메모리 T 림프구는 두 가지 주된 세포 하위 집합(subset): T_EM(이펙터(Effector) 메모리) 및 T_CM(센트럴(Central) 메모리)으로 분류될 수 있다. T_EM은 병원체의 제거와 들어맞는 면역 반응의 클론성 수축 단계에 이어 생성되는 첫번째 메모리 T 세포이다. T_EM은 CD62L^- CCR7^- 이고 우선적으로 피부, 내장 및 폐와 같이 숙주를 위한 방어의 제1선을 제공하는 말초 조직에 존재한다(Woodland and Kohlmeier 2009). 시간이 흐르면서, T_EM은 계속하여 T_CM 표현형: CD62L⁺ CCR7⁺으로 분화한다. 이들 T 림프구는 우선적으로 2차 림프 기관에 국한된다(Kaech, Hemby et al. 2002; Ahmed, Bevan et al. 2009). 그럼에도 불구하고 T_EM 및 T_CM 둘 다는 혈액순환(circulation)에서 발견된다. CD8 메모리 반응 효능의 결정적인 양태는, 감염의 확산 및 이로 인한 관련 질병의 발생을 방지하기 위해, CD8⁺ 메모리 T 림프구가 동일한 병원체에 의한 새로운 감염에서 용해 가능성을 얻어 감염된 세포를 제거하는 속도이다. 항원 특이적 CD8⁺ T-세포 반응의 발달을 통한 림프구성 맥락수막염바이러스(LCMV) 급성 감염을 제거할 수 있는 마우스는 또한 감염된 세포를 신속하게 제거시킬 수 있는 메모리 CD8⁺ T-세포를 발달시킨다는 것이 확인되었다(Barber et al., 2003).

이러한 지식에 기초하여, 본 발명자들은 T 세포 매개 면역 반응을 일으키는 치료 백신 접종 방법을 연장시켜, 벡터화된 에피토프를 포함하는 디자인된 다가 면역원성(immunogenic) 조성물에서 활성 성분의 투여를 조합하는 방법으로 병리학적 질환(들)의 치료학적 및 예방학적 치료법의 새로운 개념을 창안하였다.

특히, 본 발명자들은, 단일 환자에서, 진단된 병리에 대항하는 면역 치료법을 유발시키기에 적합하며, 동시에 상기 치료된 병리와 관련되지 않은 항원 또는 에피토프에 대항하는 견실한 예방학적 반응을 증가시키고, 임의로 상기 치료된 병리의 재발에 대항하는 보호 및 방지 반응을 증가시키는 다가 치료 백신을 디자인하였다.

실제로, CyaA계 다가 치료 방법의 사용은, 결정된 감염 또는 암을 치료하고 가능한 한 근절하는 CyaA-운반 폴리펩티드(들)의 잠재력을 강조하며, 동시에 동일한 환자에게 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 표적 에피토프에 대한 예방적 보호가 추구되는 상기 에피토프에 대한 강한 면역 반응, 바람직하게는 보호성 T-세포 메모리 반응, 및 임의로 상기 결정된 감염 또는 암의 재발에 대항하는 보호 및 방지 반응을 제공한다.

도 1. B. 페르투시스, B. 파라페르투시스(B. parapertussis) 및 B. 브론키셉티카(B. Bronchiseptica)의 아데닐산 시클라아제(CyaA)의 단백질 서열(서열 번호: 1~3), 및 B. 페르투시스, B. 파라페르투시스 및 B. 브론키셉티카의 CyaA의 뉴클레오티드 서열(서열 번호: 4~6).
도 2. B. 페르투시스, B. 파라페르투시스 및 B. 브론키셉티카의 CyaA 단백질의 단백질 정렬.
도 3. 관련 제한 부위 및 삽입된 서열이 (a) CyaA-HPV16E7_D30-42에 대해 및 (b) CyaA-HPV18E7_D32-42에 대해 기재된 pkTRACE5의 개략도.
도 4. (a) 관련 제한 부위 및 삽입된 서열이 CyaA-CysOVA에 대해 기재된 pTRACE5의 개략도; (b) 관련 제한 부위 및 삽입된 서열이 CyaA-MAGEA3_{97-178/190-295}에 대해 기재된 pkTRACE5의 개략도. ^*MAGE-A3_190-295는 MAGE A3의 잔기 242~295에 융합된 잔기 190~221를 나타낸다. 숫자 97, 178, 190, 221, 242 및 295는 MAGE-A3 서열 전체의 아미노산 잔기의 위치를 기재한다; (c) CyaA-MAGEA3 벡터의 단백질 서열(서열 번호: 7). MAGEA3 서열은 밑줄이 그어져 있다. 제한 부위는 굵게 표시하였다: Nhel(AS), Kpnl(GT), Agel(TG) 및 Spel(TS).
도 5. 11일째에 보조제가 첨가된 프로세빅스로 치료 백신을 접종하는 것은 진행된 고형 TC-1-유도 종양을 근절시켰다. 관찰이 끝날 즈음에: PBS + 알다라(Aldara)^TM로 백신 접종된 마우스의 군은 3/10의 종양이 퇴축한 마우스를 나타내었고(도 5a의 A), 프로세빅스 8㎍ 단독으로 백신 접종된 바우스의 군은 0/10의 종양이 퇴축한 마우스를 나타내었다(도 5a의 B). 알다라^TM(외용 이미퀴모드(Imiquimod))로(도 5b의 C) 또는 Poly-ICLC로(도 5b의 D) 보조제가 첨가된 프로세빅스는 7/10의 종양이 퇴축한 마우스를 나타내었다.
도 6. 보조제가 첨가된 프로세빅스로 치료 백신을 접종하는 것은 50일째에 마우스의 높은 생존율 및 높은 종양 제거율 둘 다를 유도하였다. 50일째에, 프로세빅스 + 알다라^TM 또는 프로세빅스 + Poly-ICLC로 백신 접종된 마우스는 종양을 나타내지 않았다(A). 50일째의 생존율에 관하여: 11일째에 각각 프로세빅스 + 알다라^TM 및 프로세빅스 + Poly-ICLC를 접종한 마우스의 100% 및 70%는 생존하였다(B).
도 7. 보조제가 첨가된 프로세빅스로 치료 백신 접종된 후 60일째에 무종양 마우스는 기능성 HPV16 E7_49-57 및 HPV18 E7_As43-49 특이적 메모리 CD8⁺ T 세포를 나타내었다. 60일째에 상이한 군들 내의 무종양 마우스에 CFSE^hi HPV16_E749-57 펄스형(pulsed) 표적 세포, CFSEⁱⁿ 비펄스형(unpulsed) 표적 세포 및 CFSE^lo HPV18 E7_As43-49 펄스형 표적 세포를 1 : 1 : 1 비율로 정맥 주사하였다. 하룻밤 후에, 마우스를 안락사시키고, 비장을 수집하여 FACS 분석으로 항원 특이적 생체 내(in vivo) 세포 독성을 측정하였다. 각각의 점은 개별 마우스로부터 얻은 결과를 나타내며; 흰색 원은 HPV18 E7_AS43-49 펄스형 표적 세포의 사멸 비율을 나타내고 검은 원은 HPV16 E7_49-57 펄스형 표적 세포의 사멸 비율을 나타낸다. 선은 마우스 군에 대한 평균값을 나타낸다.
도 8. 백신 접종의 일반적 계획(D는 일(day)를 의미함); 표는 세포 접종 및 백신 접종의 특성 및 부위를 요약하였다(/: 접종 없음).
도 9. HPV16 E7 항원을 내포하는 알다라^TM-보조제가 첨가된 CyaA-2가 백신으로 치료 백신을 접종하는 것은 TC-1 유도 고형 종양을 제거시켰다. 종양 TC1 세포의 부피(㎣)를 10 개의 마우스 군으로 우측부(right flank)에서 0일째(D0)부터 100일째(D-100)까지 추적하였다. 제1 군의 마우스를 플라시보(placebo)로 백신 접종시키며, 제2 군의 마우스를 플라시보 + 알다라^TM로 백신 접종시키고, 제3 군의 마우스를 알다라^TM-보조제가 첨가된 CyaA-MAGEA3_{97-178/190-295}/CyaA-HPV16 E7로 백신 접종시키며, 제4 군의 마우스를 알다라^TM-보조제가 첨가된 CyaA-cysOVA/CyaA-HPV16 E7로 백신 접종시키고, 제5 군 및 제6 군의 마우스를 알다라^TM-보조제가 첨가된 프로세빅스로 백신 접종시켰다. 각 그래프 우측의 숫자는 각 군의 각 마우스에 부여된 숫자에 상응한다.
도 10. CyaA계 2가 백신 접종으로 TC1 유도된 종양에 대해 치료된 마우스를 항원 특이적 방식으로 또 다른 비관련 종양 공격으로부터 보호하였다. 종양성 B16 MAGE A3 세포(도 10a의 a 및 도 10b의 c) 또는 종양성 EG7-OVA 세포(도 10a의 b 및 도 10b의 d)의 부피를, 60일째에 TC1 공격에서 살아남은 마우스의 좌측부(left flank)에서, 60일째(D60)부터 100일째(D-100)까지 추적하였다. 각 그래프 우측의 숫자는 TC1 공격에서 각 마우스에 사전 부여된 숫자에 상응한다.

본 발명은, (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발의 방지에 사용하기 위한 방법에 관한 것이다. 면역 반응은, (ⅰ) 상기 진단된 병리학적 질환(들)을 치료하기 위해 활성 성분(들)로 디자인된 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 그리고 (ⅱ) 상기 제2의 결정된 질환(들)의 발병(onset) 또는 발생을 방지하기 위해 활성 성분(들)로 디자인된 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발을 방지하기 위해 상기 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써 얻어지고, 상기 면역 반응은 상기 숙주 내로 상기 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 투여한 후 얻어지며, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방은 관찰되지 않는다. 상기 방법들은 하기를 포함한다:

(1) 활성 성분으로의 벡터-운반 폴리펩티드(들)로서, 폴리펩티드(들)를 운반하는 상기 벡터는 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하기에 적합한 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되는 벡터-운반 폴리펩티드(들);

(2) 약학적으로 허용 가능한 운반체(vehicle) 또는 제제(formulation)와 조합하여 (1)에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 포함하는 조성물을 비롯한, 이러한 활성 성분을 포함하거나 함유하는 조성물; 및

(3) 에피토프의 제1 군을 함유하는 제1 벡터-운반 폴리펩티드(들) 및 에피토프의 제2 군을 함유하는 제2 별개의 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 포함하는 조성물.

따라서, 제1 실시양태에서 본 발명은 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 관한 것으로서, 폴리펩티드(들)를 운반하는 상기 벡터는 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하기에 적합한 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되며, 상기 벡터-운반 폴리펩티드(들)는, (ⅰ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 상기 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 것이고, 상기 면역 반응은 상기 숙주 내로 상기 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 투여한 후 얻어지며, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방은 관찰되지 않는다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용 가능한 운반체와의 조합인 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 포함하는 조성물에 관한 것으로서, 폴리펩티드(들)를 운반하는 상기 벡터는 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하기에 적합한 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되며, 상기 조성물은, (ⅰ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 상기 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 것이고, 상기 면역 반응은 상기 숙주 내로 상기 조성물을 투여한 후 얻어지며, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 조성물의 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방은 관찰되지 않는다.

본 발명은 또한, 임의로 약학적으로 허용 가능한 운반체와의 조합인,

(a) 제1 벡터-운반 폴리펩티드(들)로서, 폴리펩티드(들)를 운반하는 상기 제1 벡터는 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하기에 적합한 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되고, 에피토프의 제1 군이 상기 제1 벡터의 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 제1 벡터-운반 폴리펩티드(들);

(b) 제2 별개의 벡터-운반 폴리펩티드(들)로서, 폴리펩티드(들)를 운반하는 상기 제2 벡터는 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하기에 적합한 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되고, 에피토프의 제2 군이 상기 제2 벡터의 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 제2 벡터-운반 폴리펩티드(들); 및

(c) 임의로, (a) 및 (b)에 기재된 것들과 분명히 다른 1 이상의 추가 벡터-운반 폴리펩티드(들)

를 포함하는 조성물에 관한 것으로서,

상기 추가 벡터-운반 폴리펩티드(들)는, (ⅰ) 에피토프의 제1 군에 연관된 병리학에 대한 조합(combined) 면역 치료법에, 그리고 (ⅱ) 에피토프의 제2 군에 연관된 면역예방 치료법에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 것이고, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 조성물의 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방은 관찰되지 않는 추가 벡터-운반 폴리펩티드(들).

특정 실시양태에서, (a), (b) 및 (c)를 지닌 상기 조성물은, (ⅰ) 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 상기 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 것이고, 상기 면역 반응은 상기 숙주 내로 상기 조성물을 투여한 후 얻어진다.

용어 "CyaA"는 보르데텔라 종의 아데닐산 시클라아제(또는 아데닐시클라아제), 특히 보르데텔라 페르투시스, 보르데텔라 파라페르투시스 또는 보르데텔라 브론키셉티카로부터의 CyaA를 의미한다. 보르데텔라 페르투시스의 아데닐산 시클라아제 단백질은 1706 잔기(서열 번호: 1)의 독소이며, 400 아미노산 잔기의 N-말단 촉매 도메인 및 1306 잔기의 C-말단부를 포함한다. C-말단부는 표적 세포막에 독소를 결합시키고 후속적으로 표적 세포 시토졸 내로 촉매 작용 부분을 전달하는 원인이 된다. 보르데텔라 페르투시스 CyaA의 서열을 도 1에 제공하였다. B. 파라페르투시스 및 B. 브론키셉티카의 CyaA 단백질은 1740 개의 아미노 산을 가지고, 이들 각각의 서열(서열 번호: 2 및 서열 번호: 3)을 도 1에 개시하였다.

표현 "CyaA 단편"은 CyaA 단백질의 일부를 의미하며, 임의로 전체 길이 CyaA 단백질의 C-말단부 전부 또는 일부를 포괄하고, 제공된 상기 단편은 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시할 수 있으며, 즉, 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프에 대한 특이적 면역 반응의 유도를 일으키거나 상기 반응을 유리하게 할 수 있다. 특히, 상기 CyaA 단편은 CD11b 발현 세포에 특이적으로 결합하여 임의로 세포 시토졸 내로 상기 폴리펩티드(들)를 전달할 수 있다. 상기 단편은 절단된(truncated) CyaA 단백질(N-말단 및/또는 C-말단 단부(extremities)로부터의 결실) 또는 아미노산 잔기(들)의 내부 결실을 지니는 전체 길이 단백질을 포괄한다. 따라서, 본 발명에 따른 CyaA 단백질의 특정 단편은 B. 페르투시스 CyaA 단백질의 아미노산 잔기 372~1706으로 구성된다(첫 371 개의 잔기의 절단). 또 다른 특정 단편은 아미노산 잔기 225~234가 결실됨으로써 잔기 1~224 및 235~1706으로 구성되는 CyaA 단편(내부 결실)을 제공하는 것인 B. 페르투시스 CyaA 단백질이다. 용어 "특이적으로(specifically)"는, 본 발명의 범위 내에서, 벡터 분자로 사용되는 경우 아데닐산 시클라아제 또는 이의 단편이 우선적으로 CD11b 발현 세포로 향함으로써 다른 세포들(CD11b를 발현하지 않음)에 대한 선택적인 방식으로 상기 세포의 표면에서 또는 상기 세포 내에서 폴리펩티드(들)를 표적화시키는 방법을 제공하는 것을 의미한다.

용어 "CyaA"는 또한, 무독화된 또는 비독성인 생성물 또는 효소(침습성 및 세포 독성) 활성이 결여된 생성물이 생성되도록, 바람직하게는 1 이상의 아미노산 치환(들), 아미노산(들)의 내부 삽입 또는 아미노산(들)의 내부 결실에 의해 수식되는 CyaA 단백질 또는 이의 단편을 포괄한다. 따라서, 이러한 CyaA 단백질(또는 이의 단편)은 촉매 작용 활성이 없지만, 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하는 능력 및, 임의로 CD11b/CD18 수용체에의 특이적 결합 및/또는 원래의 CyaA 단백질의 촉매 도메인의 전위 과정은 영향을 받지 않는다. 주지된 비독성 CyaA 단백질의 일례는 디펩티드 Leu-Gln이 잔기 Asp188과 Ile189 사이(촉매 부위의 필수 부분)의 프레임으로(in frame) 삽입되는 보르데텔라 페르투시스 CyaA이다. 상기 CyaA 단백질(또는 이의 단편)의 독성 또는 효소 활성의 결여는 문헌[Ladant et al.(1992)]에 개시된 바와 같이 분석될 수 있다. CD11b/CD18 세포를 표적화하는 CyaA 단백질(또는 이의 단편)의 능력은 특히 EP03291486에 또는 WO02/22169에 개시된 방법에 따라 분석될 수 있다. 더 나아가, 표적 세포의 시토졸 내로 항원 폴리펩티드를 전위시키는 CyaA 단백질(또는 이의 단편)의 능력은 WO02/22169에 기술된 방법을 적용하여 분석될 수 있다.

추가 특정 실시양태에서, 용어 "CyaA"는 또한 1 개 이상의 이의 잔기, 특히 2 개의 내부 리신 잔기(리신 860 및 983)의 번역 후 수식에 의해, 예를 들어 번역 후 팔미토일화(palmitoyation)에 의해 수식된 CyaA 단백질(또는 이의 단편)을 포괄한다. 이러한 번역 후 수식(들)은 cyaA 및 cyaC 유전자의 공발현(co-expression)으로 얻을 수 있다. 따라서, 벡터-운반 폴리펩티드(들) 내의, CyaA 단백질 또는 이의 단편은 세포 내, 특히 재조합 세포 내 cyaA 및 cyaC 유전자 둘 다의 공발현의 결과인 CyaA 단백질 또는 이의 단편일 수 있다.

본 출원에 사용된 용어 "벡터" 또는 "벡터 분자"는, 본원에 기술된 바와 같이, 수식되거나 수식되지 않은, 전체 길이 CyaA 단백질, 또는 이의 단편을 포괄한다.

"CD11b 발현 세포"는, 이의 표면에 CD11b/CD18 수용체를 발현하는 세포를 의미한다(CD11b+). 특히, 이러한 세포는 과립구/호중구, 대식세포, NK 세포, T CD8⁺의 하위 집합, B 세포의 하위 집합, 랑게르한스 세포, 수지상 세포 및 골수성 수지상 세포이다.

표현 "벡터-운반 폴리펩티드(들)"는, CyaA 단백질(또는 이의 단편)이 CyaA과 이종인, 특히 본원에 정의된 바와 같은 CyaA 단편이 아니고, 특히 CyaA와 면역학적으로 교차반응하지 않는 1 이상의 폴리펩티드를 운반하는 것을 의미한다. 표현 "1 이상의"는 1 개의 폴리펩티드 또는 그 이상의, 특히 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 폴리펩티드(들), 바람직하게는 1, 2 또는 3 개의 폴리펩티드(들)를 의미한다.

용어 "운반( carries )"은 본 발명에 따른 CyaA 단백질 또는 이의 단편 및 폴리펩티드(들)와 연관된 다양한 구조를 포괄한다. 이러한 구조는 하기의 결과로서 얻을 수 있다:

- 본 발명에 따른 1 이상의 폴리펩티드(들)와 CyaA 또는 이의 단편과의 화학적 커플링. 폴리펩티드를 CyaA 또는 이의 단편과 화학적으로 커플링시키는 방법은 당해 분야에 주지되어 있고, 예를 들어, 바람직하게는 N-피리딜 술포닐-활성화된 술프히드릴을 사용함으로써 이황화 결합(들)을 포함한다. 천연 CyaA 단백질이 이의 1차 서열에 시스테인 잔기를 포함하지 않기 때문에, 시스테인 잔기는 CyaA 단백질 내로, 특히 이의 촉매 도메인에, 바람직하게는 하기 정의된 바와 같은 허용 부위 내로(예컨대 위치 235) 또는 CyaA 단부 중 하나에 유전자적으로 도입된다; 및

- 1 이상의 폴리펩티드(들)와 CyaA 또는 이의 단편과의 유전자 연결 또는 유전자 융합. 상기 유전자 연결 또는 융합은 CyaA 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산 내로 프레임으로(즉, CyaA 단백질의 프레임워크(framework) 시프트(shifting) 없이), 바람직하게는 CyaA 단백질의 촉매 도메인 영역 내로, 본 발명에 따른 1 이상의 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산의 유전자적으로 삽입시켜, 재조합 단백질을 생성하는 것을 포함한다. 따라서, 1 이상의 폴리펩티드(들)는 CyaA 단백질의 임의 허용 부위로 삽입될 수 있다(WO 93/21324 참조). 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "허용 부위"는 폴리펩티드(들)가 아데닐산 시클라아제의 소정의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 주지 않고, 즉 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드를 제시하는 CyaA의 능력에 영향을 주지 않으며, 특히 CD11b/CD18 수용체로의 특이적 결합에 영향을 주지 않고 임의로 표적 세포의 시토졸 내로 폴리펩티드(들)의 전위 과정에 영향을 주지 않고 삽입될 수 있는 부위에 관한 것이다. 보르데텔라 페르투시스 아데닐산 시클라아제의 허용 부위는, 잔기 107-108(Gly-His), 132-133(Met-Ala), 137-138(Val-Ala), 224-225(Arg-Ala), 228-229(Glu-Ala), 232-233(Gly-Leu), 235-236(Arg-Glu), 317-318(Ser-Ala) 및 335-336(Gly-Gln)를 포함하나 이에 제한되지 않는다(Sebo et al., 1985; Glaser et al., 1988). 다른 보르데텔라 종에 대하여, 상응하는 허용 부위는 서열의 비교 및 상응하는 잔기의 결정에 의해 정의될 수 있다(도 2). 또 다른 실시양태에 따라, 유전자 연결은 또한 CyaA 단백질 또는 이의 단편의 1 개의 및/또는 다른 단부들에서 1 이상의 폴리펩티드(들)를 암호화하는 핵산의 융합을 포함한다.

CyaA 단백질(또는 이의 단편)이 1 개 이상의 폴리펩티드를 운반하는 경우, 이 폴리펩티드들은 모두 화학적 커플링에 의해 운반되거나, 모두 유전자 연결에 의해 운반되거나(바람직하게는 모든 유전자적으로 삽입됨), 또는 이들 중 하나(이상)이 화학적 커플링에 의해 운반되면서 다른 것(들)은 유전자 연결에 의해 운반될 수 있다. 특정 실시양태에서, 모든 폴리펩티드가 CyaA 내로, 바람직하게는 CyaA의 허용 부위 내로 유전저적으로 삽입되는 경우, 폴리펩티드는 상이한 부위 내로, 바람직하게는 상이한 허용 부위 내로 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 모든 폴리펩티드가 CyaA 내로, 바람직하게는 CyaA의 허용 부위 내로 유전저적으로 삽입되는 경우, 폴리펩티드는 동일한 부위 내로, 바람직하게는 동일한 허용 부위 내로 삽입된다.

용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 연쇄(concatenation)를 의미하며, 이것은 9 개 이상의 아미노산 잔기이고 특히 길이가 9~500 개의 잔기, 9~200, 9~100, 9~50 개의 잔기, 또는 30 또는 50 내지 500 또는 200 개의 잔기, 또는 100~500 또는 100~200 개의 잔기이다. 본 발명의 범위 내에서, 용어 "폴리펩티드"는, 벡터 분자에 의해 운반되는 경우, 상기 폴리펩티드에 함유된 에피토프(들)에 대한 면역 반응, 특히 T 세포 면역 반응을 유발할 수 있는 폴리펩티드를 의미한다. 벡터 분자(들)에 함유된 폴리펩티드(들)는 종양 항원으로부터 유래한, 즉, 종양에 의해 또는 암 세포에 의해 발현된 펩티드일 수 있고, 종양은 자가(self)이거나 병원체에 의해 유발된 것이거나, 종양 항원은 자가(특히 인간 기원) 또는 종양을 유발하는 병원체로부터일 수 있다.

용어 "종양 항원"은 하기 종양 항원의 군들을 포괄하고, 본 발명의 벡터 분자(들)에 함유된 폴리펩티드(들)는 하기 군들 중 1 이상에서 선택될 수 있다: (a) 종양태아성 종양 항원, (b) 종양바이러스 종양 항원, (c) 정상 조직의 넓은 범위에서 발현되고 종양에서 과발현되는, 과발현된/축적된 종양 항원, (d) 많은 종양에서 발현되지만 정상 조직에서는 발현되지 않는, 공유(shared) 종양-특이적 항원 또는 암-고환 항원(BAGE 과(family), GAGE 과, MAGE 과, SAGE 과 및 XAGE 과 포함), (e) 계통이 예정된(lineage-restricted) 종양 항원, (f) 편재하여 발현되는 유전자들의 점 돌연변이로부터 유래하는, 돌연변이 종양 항원; 및 (g) 종양의 기원인 정상 조직에서 발현되지만 종양-특이적이지 않은, 분화 종양 항원.

특정 실시양태에서, 1 이상의 폴리펩티드가 면역치료학적 반응의 유도를 위한 단일 벡터 분자에 또는 면역예방학적 반응의 유도를 위한 단일 벡터 분자에 사용되는 경우, 모든 폴리펩티드는 종양 항원으로부터 유래한다.

또 다른 실시양태에서, 벡터 분자(들)에 함유된 폴리펩티드(들)는 또한 또는 대안적으로 병원체 항원으로부터, 즉 감염된 포유류 숙주의 병원체에 의해 생성되고, 상기 감염된 포유류 숙주의 세포에서 아마도 가공되는 항원 또는 상기 병원체의 성분인 항원으로부터 유래할 수 있다. 병원체 항원의 예로는 박테리아 항원, 바이러스 항원, 진균 항원 또는 기생생물 항원이 있다. 이러한 실시예들에서, 특정 실시양태로서, 종양 형성을 일으키는 병원체(발암병원체)와 종양 형성을 일으키지 않는 병원체를 구별할 수 있다. 병원체의 예로는 세포내 병원체, 특히 이들의 숙주에서 T-세포 면역 반응(들)을 유발하는 병원체가 있다. 따라서, 폴리펩티드(들)는 클라미디아(Chlamydia), 말라리아 원충(Plasmodium), 레슈마니아(Leishmania), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), HIV, HPV, HBV, HCV, 아데노바이러스, EBV, 헤르페스 바이러스, HTLV.1 바이러스 및 CMV로부터 유래할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 벡터 분자(들)에 함유된 폴리펩티드(들)는 병원체의 표면 단백질(예컨대 HIV의 외피 단백질)로부터 유래하거나 감염된 세포의 기구(machinery)와 상호작용하는 폴리펩티드(예컨대 HPV의 E6 또는 E7)로부터 유래할 수 있다.

특정 실시양태에서, 단일 벡터 분자에 또는 벡터들의 조합에 1 개 이상의 폴리펩티드가 사용되는 경우, 모든 폴리펩티드는 병원체, 아마도 별개의 병원체, 속 또는 종의 항원으로부터 유래한다.

특정 실시양태에서, 벡터 분자(들)에 함유된 폴리펩티드는 전부 박테리아 항원으로부터 유래하거나, 전부 바이러스 항원으로부터 유래하거나, 전부 진균 항원으로부터 유래하거나, 전부 기생생물 항원으로부터 유래한다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 벡터 분자(들)에 함유된 별개의 폴리펩티드는 박테리아 항원, 바이러스 항원, 진균 항원 또는 기생생물 항원으로부터 독립적으로 유래한다. 또 다른 실시양태에서, 단일 벡터 분자에서 또는 벡터들의 조합에서 폴리펩티드는 종양으로부터 유래하고 병원체로부터 유래한다.

벡터 분자에 의해 운반되는 폴리펩티드에 대한, 표현 "유래하는(derived from)"은 전체 길이 항원 단백질, 또는 이 항원 단백질의 단편, 또는, 단편 또는 합성, 비천연 폴리펩티드가 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 경우 이 단편 또는 폴리펩티드에 함유된 항원 결정기에 대한 면역 반응, 특히 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 경우, 합성, 비천연 폴리펩티드가 서로 융합된 항원 단백질의 여러 부분으로 구성되는 에피토프(들)를 운반하거나 서로 융합된 여러 단백질들의 하나의 또는 여러 부분들로 구성되는 합성, 비천연 폴리펩티드를 의미한다. 상기 정의에 따라, 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 폴리펩티드(들)는 독특한 에피토프이거나 이를 포함하며, 또는 에피토프의 군이거나 이를 포함한다. 표현 "에피토프의 군"은 1 개 이상의 에피토프, 즉, 1 개의 에피토프 또는 그 이상의, 특히 10~500 개의 에피토프, 50~200 개의 에피토프 및 80~150 개의 에피토프를 포괄한다. 특정 실시양태에서, 표현 "에피토프의 군"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 에피토프를 의미한다. 특정 실시양태에서, 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 폴리펩티드(들)는 폴리에피토프, 즉, 2 개 이상의 에피토프, 특히 2 개 이상의 T-세포 에피토프를 지닌 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 본 발명 내의 에피토프는, 선형 또는 입체구조적(conformational)이며, 바람직하게는 선형이고, 세포-매개 면역 반응, 특히 T 세포 면역 반응의 유도를 일으키는 임의 아미노산 서열이다. 따라서, 본원에 기술된 벡터-운반 폴리펩티드(들)의 에피토프는 숙주의 APC(항원 제시 세포)에 의해 가공된 것들, 특히 클래스 Ⅰ MHC(주조직적합복합체) 분자와 관련되어 인식되는 T 에피토프, 예컨대 표적 세포가 CD8⁺ T 림프구인 에피토프 또는 클래스 Ⅱ MHC 분자와 관련되어 인식되는 T 에피토프, 예컨대 표적 세포가 CD4⁺ T 림프구인 것들을 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드(들)는 또한 체액성 반응을 일으키는 B 에피토프(들)를 함유한다. 특정 실시양태에서, 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 폴리펩티드(들)는 여러 상이하거나 여러 동일한 에피토프로 구성되거나 이를 포함한다.

본 발명에 따라, 벡터-운반 폴리펩티드(들)는 에피토프의 2 이상의 상이한 군들을 함유하며, 즉, 에피토프의 군 하나는 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법을 가능하게 하는 T 세포 면역 반응를 유도할 수 있고, 반면 에피토프의 제2 군은 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방을 가능하게 하는 T 세포 메모리 면역 반응을 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 에피토프의 제1 군은, 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법을 제공하는 T 세포 반응에 추가로, 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지를 가능하게 하기 위한 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 임의로 유도할 수 있다.

본 발명에 따라, 상기 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 상기 에피토프의 제2 군이 부재하는 경우, 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방은 관찰되지 않는다. 이는 본원에 정의된 바와 같은 에피토프의 제2 군이 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방을 얻는데 필수적임을 의미한다.

특정 실시양태에서, [벡터-운반 폴리펩티드(들) 내의] 에피토프의 제2 군은 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방을 얻기에 필수적이고 충분하며; 이 실시양태에서, 유도된 면역 반응에서의 에피토프의 제2 군 단독의 기여는, 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방을 얻기에 충분하다. 다시 말해서, 상기 에피토프의 제2 군의 투여와 상기 예방학적 반응 사이에는 인과관계가 존재한다.

또 다른 실시양태에서, [벡터-운반 폴리펩티드(들) 내의] 에피토프의 제2 군은 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방을 얻기에 충분하지만, 제1 군의 기여에는 충분하지 않거나 이익을 얻지 못하며, 이는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방이 에피토프의 제2 군에 대해 유도된 면역 반응과 에피토프의 제1 군에 대해 유도된 면역 반응 사이의 시너지를 통해 얻어진다는 것을 의미한다. 후자의 경우, 에피토프의 두 군 모두의 기여는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방을 얻기에 필수적이다.

제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방에 에피토프의 제2 군의 필수적인 기여는, 2 개의 하기 포유동물 군에서, 특히 2 개의 하기 마우스 군에서, 상기 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들)의 투여의 효과를 비교함으로써 명백해질 수 있다[용어 예방은 하기 정의됨]: (1) 본원에 정의된 바와 같이 에피토프의 제2 군을 갖지 않는 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들)가 투여된 포유동물 및 (2) 본원에 정의된 바와 같이 에피토프의 제2 군을 갖는 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들)가 투여된 포유동물.

"상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다"는 표현으로 이해되는 바와 같이, 본원에 정의된 바와 같은 에피토프의 제1 군(즉, 단독으로)은 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방을 얻기 위해 충분하다는 것이 제외된다.

따라서, 특정 실시양태에서, 에피토프의 제1 군의 아미노산 서열(또는 이 에피토프의 제1 군으로 구성되는 폴리펩티드(들))은 에피토프의 제2 군의 아미노산 서열(또는 이 에피토프의 제2 군으로 구성되는 폴리펩티드(들))과 상이하다. 용어 "상이한"은 두 서열들이 모두 폴리펩티드의 서열의 전체 길이에 대해 계산하여 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상 차이가 있는 것을 의미한다(예를 들어 니들만 및 운쉬(Needleman and Wunsch) 알고리즘으로 계산된 전역 정렬(global alignment)). 상기 "상이한 서열"의 대안적 정의에서 또는 특정 실시양태에서, 제1 군의 에피토프의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상은 제2 군의 에피토프의 서열과 상이한 서열을 가진다. 추가 특정 실시양태에서, 에피토프의 제1 군 및 제2 군(또는 에피토프의 제1 군으로 구성된 폴리펩티드(들) 및 에피토프의 제2 군으로 구성된 폴리펩티드(들))은 공통된 에피토프 서열을 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 에피토프의 제1 군에 대해 얻어진 T-세포 면역 반응은 에피토프의 제1 군에 관련된 병리학적 질환(들)에 효과적이고 에피토프의 제2 군에 관련된 병리학적 질환(들)에 효과적이지 않거나 특이적으로 효과적이지 않다. 그런 이유로, 특정 실시양태에서, 에피토프의 군에 대해 얻어지는 T-세포 면역 반응은 이 군에 대해 특이적이며, 즉, 이 에프토프의 군에 대한 면역반응을 일으키는 T 세포는 에피토프의 다른 군을 인식하지 않는다.

특정 실시양태에서, 폴리펩티드(들)는 HPV 균주, 특히 α-유두종 바이러스, β-유두종 바이러스, γ-유두종 바이러스, δ-유두종 바이러스, ε-유두종 바이러스, ζ-유두종 바이러스, η-유두종 바이러스, θ-유두종 바이러스, ι-유두종 바이러스, κ-유두종 바이러스, λ-유두종 바이러스, μ-유두종 바이러스, ν-유두종 바이러스, ξ-유두종 바이러스, ο-유두종 바이러스 및 π-유두종 바이러스 속 중에서 선택된 HPV 균주로부터의 1 이상의 에피토프를 함유한다. 특정 실시양태에서, 인간 향성(tropism)을 갖는 유두종 바이러스, 예컨대 α-유두종 바이러스, β-유두종 바이러스, γ-유두종 바이러스, μ-유두종 바이러스 또는 ν-유두종 바이러스 속으로부터의 균주가 바람직하다. 더욱 특정한 실시양태에서, 폴리펩티드(들)는 α-유두종 바이러스 속으로부터의 HPV 균주, 특히 α-유두종 바이러스 속의 HPV 종 7 및 9으로부터의 균주로부터의 1 이상의 에피토프를 함유한다(de Villiers et al. Virology 2004). 따라서, 폴리펩티드(들)는 HPV16, HPV18, HPV31, HPV33, HPV35, HPV45, HPV52 또는 HPV58와 같은 HPV 고 발암 기준종(type species)으로부터의 1 이상의 에피토프를 함유한다. 이러한 기준종들 중에서, HPV 18 및 HPV 16은 특히 중요하다. 한 가지 실시양태에서, 본원에 기술된 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 폴리펩티드는 상이한 HPV 균주 또는 상기 개시된 것들 중에 선택된 상이한 HPV 기준종으로부터 유래한다. 또 다른 특정 실시양태에서, 그리고 어떠한 HPV 균주 또는 HPV 기준종이더라도, 폴리펩티드는 L1, L2, E1, E2, E4, E5, E6 또는 E7 단백질로부터 유래하며, 특히 HPV 균주 또는 HPV 기준종의 E6 또는 E7 단백질로부터의 에피토프를 갖는 폴리펩티드가 중요하다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 폴리펩티드는 동일한 HPV 단백질로부터 유래하나 상기 개시된 것들 중에 선택된 상이한 HPV 균주 또는 상이한 HPV 기준종으로부터 유래한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, HPV16의 E6 또는 E7 단백질 및 HPV18의 E6 또는 E7 단백질은 폴리펩티드의 디자인에 사용되며, 더욱 바람직하게는 HPV16 및 HPV18 HPV 기준종의 E7 단백질이 사용된다. 본 발명의 특정 실시양태에 따라, 벡터 분자는, 바람직하게는 유전적 삽입으로, 여러 폴리펩티드를 운반하며, 이들 각각은 2 이상의 별개의 HPV 균주 또는 2 개의 별개의 HPV 기준종의 1 개의 또는 여러 HPV 단백질의 1 개의 또는 여러 에피토프를 함유하거나 이로 구성된다. 따라서, 특정 실시양태는 HPV16 및 HPV18 HPV 기준종 둘 다로부터의 E6 또는 E7 단백질로부터 유래한 에피토프를 포괄하는 하나의 폴리펩티드 또는 여러 폴리펩티드를 운반하는 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되는 벡터-운반 폴리펩티드이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 HPV16으로부터의 E6 또는 E7 단백질로부터 유래한 에피토프를 포괄하는 하나의 폴리펩티드 또는 여러 폴리펩티드를 운반하는 제1 벡터 분자(에피토프의 제1 군을 지니는 제1 벡터-운반 폴리펩티드) 및 HPV18로부터의 E6 또는 E7 단백질로부터 유래한 에피토프를 포괄하는 하나의 폴리펩티드 또는 여러 폴리펩티드를 운반하는 별개의 벡터 분자(에피토프의 제2 군을 지니는 별개의 벡터-운반 폴리펩티드)를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 여러 폴리펩티드가 단일 벡터 분자에 의해 운반되는 경우, 이 폴리펩티드들은 벡터 분자의 상이한 부위들, 특히 허용 부의에 삽입된 동일한 단백질, 예를 들어 E7 또는 E6 단백질의 상이한 단편들로 구성될 수 있다.

따라서, 본 발명의 범위 내에 사용된 조성물은 이의 폴리펩티드(들)가 HPV16의 E7 단백질로부터 유래하는 벡터-운반 폴리펩티드(들) 및 이의 폴리펩티드(들)가 HPV18의 E7 단백질로부터 유래하는 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 포함한다. 이러한 조성물의 예는 하기를 포함한다:

(a) HPV16의 E7의 잔기 1~29로 구성되는 단편 또는 잔기 1~29를 포함하는 단편인 제1 폴리펩티드를 운반하고 HPV16의 E7 단백질의 잔기 43~98로 구성되는 단편 또는 잔기 43~98를 포함하는 단편인 제2 폴리펩티드를 운반하는 제1 벡터 분자. 바람직한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 HPV16-E7의 첫 29 개의 아미노산 잔기이고 CyaA의 코돈 319과 320 사이에 삽입되며, 제2 폴리펩티드는 HPV16-E7의 잔기 43~98로 구성되고 CyaA의 코돈 224와 235 사이에 삽입된다(pKTRACE5-HPV16E7_Δ3O-42 벡터에 예시됨); 및

(b) HPV18의 E7의 잔기 1~31로 구성되는 단편 또는 HPV18의 E7의 잔기 1~31를 포함하는 단편인 제1 폴리펩티드 및 HPV18의 E7의 잔기 43~105로 구성되는 단편 또는 HPV18의 E7의 잔기 43~105 를 포함하는 단편인 제2 폴리펩티드를 운반하는 별개의 벡터 분자. 바람직한 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 HPV18-E7의 첫 31 개의 아미노산 잔기이고 CyaA의 코돈 319와 320 사이에 삽입되며, 제2 폴리펩티드는 HPV18-E7의 잔기 43~105로 구성되고 CyaA의 코돈 224와 235 사이에 삽입된다(pKTRACE5-HPV18E7_Δ32-42 벡터에 예시됨).

또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드(들)는 MAGE A3 종양 항원으로부터 유래한 1 이상의 에피토프, 예컨대 MAGE A3의 잔기 97~178로 구성되는 폴리펩티드(서열 번호: 8), 또는 예컨대 MAGE A3의 잔기 242~295에 융합된 잔기 190~221로 구성되는 폴리펩티드(서열 번호: 9)를 함유한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들)(또는 이에 함유된 조성물)는 CyaA 단백질, 바람직하게는 B. 페르투시스 CyaA로 구성되며, MAGE A3로부터 유래한 이의 2 개의 폴리펩티드는 2 개의 상이한 부위들에 삽입된다. 이러한 벡터-운반 폴리펩티드(들)는 B. 페르투시스 CyaA로 구성되며, 여기서 (1) MAGE A3의 잔기 97~178로 구성되는 제1 폴리펩티드는 CyaA의 코돈 319와 320 사이에 삽입되고 (2) MAGE A3의 잔기 242~295에 융합된 잔기 190~221로 구성되는 제2 폴리펩티드는 CyaA의 코돈 234와 235 사이에 삽입된다. CyaA-MAGE A3 벡터의 특정 실시예는 도 4c에 제공되어 있다(서열 번호: 7).

이와 같이 또는 조성물인, 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들)는, 동일한 포유류 숙주에서, 특히 인간 숙주에서 (ⅰ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써의, 상기 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법, 그리고 (ⅱ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써의, 제2의 결정된 질환(들)의 예방, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써의, 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지를 얻기 위해 사용되며, 상기 면역 반응은 상기 숙주 내로 상기 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 투여한 후 얻어지며, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방은 관찰되지 않는다. 본 발명의 실시양태에 따라, 본원에 정의된 바와 같은, 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 폴리펩티드(들)는, 추구된 에피토프의 군에 따라 선택되고 하기 두 개의 군에 따라 분류될 수 있다:

- 에피토프의 제1 군은 특정 병원체에 의해 감염된 포유류 숙주의 면역계에 제시되거나 발현되는 것으로 알려진 항원으로부터 유래한 폴리펩티드(들)에 관한 것이며, 이는 특정 종양을 발생시키거나 제1의 결정된 병리학적 질환(들)을 제시하고, 상기 포유류 숙주는 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 투여 전에 상기 특정 감염, 상기 특정 종양 또는 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)으로 진단되며; 및

- 에피토프의 제2 군은 또 다른 특정 병원체에 의해 감염된 포유류 숙주의 면역계에 제시하거나 발현되는 것으로 알려진 항원으로부터 유래한 폴리펩티드(들)에 관한 것이며, 이는 또 다른 특정 종류의 종양을 발생시키거나 제2의 결정된 병리학적 질환(들)을 제시하며, 상기 포유류 숙주는 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 투여 전에 상기 또 다른 특정 병원체에 의해 감염되지 않았거나 감염된 적이 없으며, 상기 또 다른 특정 종류의 종양이 발생하지 않았거나, 상기 제2의 결정된 병리학적 질환(들)을 제시한 적이 없다.

본 발명은 하기 관찰들로부터 기반한다:

(ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법은 벡터 분자에 의해 운반되는 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써 얻을 수 있고;

(ⅱ) 동일한 포유류 숙주에서의 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방은 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써 얻을 수 있으며; 및

(ⅲ) 임의로, 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지는 벡터 분자에 의해 운반되는 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 상기 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써 얻을 수 있고;

상기 에피토프의 제2 군은 동일한 벡터 분자에 의해 운반되거나, 별개의 벡터 분자에 의해 운반되고, 제1 벡터 분자와 동시에 및 이에 따라 동일한 조성물로 투여된다.

따라서, 본원에 정의된 바와 같은 또는 조성물로의 벡터 분자, 또는 본원에 정의된 바와 같은 조성물의 벡터 분자는 제1 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 이상의, 바람직하게는 1 개의 폴리펩티드 및 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 이상의 폴리펩티드를 운반한다. 다른 실시양태들에서, 본원에 정의된 바와 같은 또는 조성물로의 벡터 분자, 또는 본원에 정의된 바와 같은 조성물의 벡터 분자는 하기를 운반한다: (a) 제1 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 개의 폴리펩티드 및 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 이상의 폴리펩티드, (b) 제1 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 개의 폴리펩티드 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 폴리펩티드 중에서 선택된 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 이상의 폴리펩티드, (c) 2 또는 3 개의 폴리펩티드 중에서 선택된 제1 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 개 이상의 폴리펩티드 및 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 이상의 폴리펩티드 및 (d) 2 또는 3 개의 폴리펩티드 중에서 선택된 제1 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 이상의 폴리펩티드 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 개의 폴리펩티드 중에서 선택된 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 이상의 폴리펩티드.

1 개의 벡터-운반 폴리펩티드(들)가 이와 같이 또는 조성물로 사용되는 경우, 상기 벡터는 제1 군의 에피토프(들) 및 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 개의 폴리펩티드를 운반할 수 있으며, 즉, 상기 에피토프의 제2 군은 에피토프의 제1 군과 동일한 폴리펩티드에 함유된다.

또 다른 실시양태에서, 상기 및 에피토프의 제1 군 및 제2 군은 상이한 폴리펩티드에 함유된다. 제1 군의 에피토프(들)를 포함하는 폴리펩티드 및 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 폴리펩티드는 동일한 벡터 분자에 의해 운반될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 군의 에피토프(들)를 포함하는 폴리펩티드 및 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 폴리펩티드는 상이한 벡터 분자에 의해 운반되고 동일한 조성물에 포함될 수 있다. 제1 및 제2, 별개의, 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 함유하는 조성물이 사용되는 경우, 제1 벡터 분자는 제1 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 이상의 폴리펩티드를 운반하며, 이는 최소 제1 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 개의 폴리펩티드가 상기 제1 벡터 분자에 의해 운반됨을 의미한다. 동일한 조성물에서, 제2 벡터 분자는 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 이상의 폴리펩티드를 운반하며, 이는 최소 제2 군의 에피토프(들)를 포함하는 1 개의 폴리펩티드가 상기 제2 별개의 벡터 분자에 의해 운반됨을 의미한다. 마지막으로, 상기 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 군이 어느 것이든지, 임의 1개의 또는 그 이상(예, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6)의 벡터-운반 폴리펩티드(들)는 또한 상기 조성물에 포함될 수 있다.

"면역 반응"은, 세포-매개 면역 반응, 특히 T-세포 매개 면역 반응을 의미한다. 특정 실시양태에서, 상기 T-세포 매개 면역 반응은 세포-매개 세포 독성 면역 반응 CTL, 특히 CD8⁺ 면역 반응이다. 종양 항원으로부터 유래한 폴리펩티드(들)의 경우, 면역 반응은 바람직하게는 종양-특이적 세포 독성 림프구를 수반하는 종양-특이적 세포 독성 면역 반응이다. 특정 실시양태에서, 상기 T-세포 매개 면역 반응은 CD4⁺ 면역 반응, 특히 T-헬퍼 면역 반응이다. 특정 실시양태에서, 본원에 정의된 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 투여에 이은, 면역 반응, 특히 제2 군의 에피토프에 대해 유도된 면역 반응(들)(본원에 정의된 바와 같음)은 메모리 T 세포 면역 반응이다. 표현 "면역 반응"은 또한, 상기 정의된 바와 같은 세포-매개 면역 반응에 더하여, 체액성 면역 반응(항체의 생산)을 포괄할 수 있다. 본 출원 내에서 논의된 면역 반응은, 숙주 내로의, 이와 같은 또는 조성물로의 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들)의 투여 후에 얻어진다.

표현 "면역치료법"은, 특히 본원에 정의된 바와 같은 투여된 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T-세포 면역 반응을 유도함으로써, 포유류 숙주에서 진단된 (제1의) 결정된 병리학적 질환(들)의 치료를 의미한다. 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 사용은 이를 필요로 하는, 병원체에 감염되거나 종양과 같은 병리학적 상태를 앓는 것으로 진단받은 포유류 숙주의 임상 상태(들)를 향상시키는 것을 목표로 하거나, 질병의 발병 인자(causative agent) 또는 유기체의 제거, 또는 상기 인자 또는 유기체를 감소시키는 것을 목표로 한다. 병원체 감염의 상황에서, 면역치료법은 이 병원체의 감염 부위에서 또는 복제 부위에서 병원체 로드(load)의, 특히 숙주의 플라즈마에서의 또는 점막에서의 현저한 감소를 일으키며, 측정될 때 검출될 수 있는 것보다 적은, 또는 종양이 존재하는 경우 종양의 발생 또는 크기를 감소시키는 병원체 로드, 예컨대 플라즈마 로드를 일으킬 수 있다.

표현 "면역예방" 또는 "예방"은 특히 본원에 정의된 바와 같은 투여된 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)의 노출, 감염, 발병 또는 발생 또는 이의 질병 또는 임상 결과를 방지하거나 이로부터 보호하는 반응을 의미한다. 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 사용은 추후(future) 감염, 추후 악성 증상 또는 질병에 대한 예방학적 면역 반응을 일으키고, 이에 따라 상기 포유류 숙주에서의 병리학적 상태의 발생을 방지한다.

예방을 부여하는 반응의 효능은 병리학적 상태의 검출 마커로 분석될 수 있다. 특정 실시양태에서, 효능 기준은 통계적 적합성에 도달하기 위해 선택된다.

표현 "재발 방지"는 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 투여에 이어 사전 진단되고 치료된 제1의 결정된 병리학적 질환(들), 질환들의 신규 추후 노출, 신규 추후 감염, 신규 추후 발병 또는 신규 추후 발생을 방지하는 면역 반응의 유도를 의미한다.

표현 "포유류 숙주"는 모든 포유동물, 특히 영장류 및 인간(예, 환자)을 포괄한다.

본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 투여(들)에 이은, 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응 및 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응 둘 다 그리고 임의로 상기 에피토프의 제1 군에 대한 반응은, 특정 시간 구간(window of time) 내로, 동일한 포유류 숙주에서 유도된다고 이해된다. 따라서, 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 1 회 이상의 투여는 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응 및 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 면역 반응 및 임의로 상기 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응의 유도를 일으키며, 이는 면역 반응들 중 하나에 또는 둘 다에서 수반되는 T-세포가 투여 후 수년째에 여전히 증거될 수 있음에도 불구하고, 투여 후 1 개월 내지 12 개월 또는 그 이상(특히 2, 3, 6, 9 또는 12 개월째)에 증거되고/되거나 측정될 수 있다. 표현 "1회 이상의 투여" 또는 "1회 투여"는 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물이 포유류 숙주, 특히 환자 내로, 1회 또는 그 이상으로, 바람직하게는 1회 또는 2회 투여된다는 것을 의미한다. 각 투여는 1 이상의 벡터-운반 폴리펩티드(들)로 구성되며, 이는 상기 에피토프의 제2 군의 1 이상의 에피토프를 지니는, 1 이상의 벡터 분자(들)에 의해 운반되는 1 이상의 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군 및 에피토프의 제2 군이, 동시에 포유류 숙주에 투여되게 한다. 적절한 경우, 제2 및 가능한 이후의 투여(프라임-부스트(prime-boost))는 폴리펩티드(들)에 대하여 제1 투여와 동일한 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 동일한 조성물로 수행된다. 하기 기록된 실험은 면역치료법 및 예방, 및 임의로 재발 방지가 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 단일 투여에 이어 얻어질 수 있음을 보인다.

특정 실시양태에서, 본 발명은, (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된, 병원체 감염에 기인한, 특히 박테리아 또는 바이러스 감염에 기인한 제1의 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) 상이한 병원체에 의한 감염에 기인한, 특히 상이한 박테리아 또는 상이한 바이러스(또는 이의 상이한 균주)에 의한 감염에 기인한 제2의 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물에 관한 것으로, 상기 상이한 병원체(예, 상이한 박테리아 또는 상이한 바이러스)에 연관된 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다. 상이한 바이러스 균주, 특별히 상이한 HPV 균주 또는 상이한 HPV 기준종에 기인한 병리학적 질환(들)의 특정 경우에서, 본 발명은, (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된, 제1 바이러스, 제1 HPV 균주 또는 제1 HPV 기준주(type strain)에 의한 감염에 기인한 제1의 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) 제2 상이한 바이러스, 제2 상이한 HPV 균주 또는 제2 상이한 HPV 기준주에 의한 감염에 기인한 제2의 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물에 관한 것으로, 상기 제2 상이한 바이러스, 제2 상이한 HPV 균주 또는 제2 상이한 HPV 기준주에 연관된 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명은, HPV16의 E7 단백질로부터 유래한 폴리펩티드 및 HPV18의 E7 단백질로부터 유래한 폴리펩티드를 포함하는, (1) (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된, HPV16에 의한 감염에 기인한 제1의 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) HPV18에 의한 감염에 기인한 제2의 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물에 관한 것으로, HPV18의 E7 단백질로부터 유래한 폴리펩티드가 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않거나; 또는 (2) (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된, HPV18에 의한 감염에 기인한 제1의 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) HPV16에 의한 감염에 기인한 제2의 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물에 관한 것으로, HPV16의 E7 단백질로부터 유래한 폴리펩티드가 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다.

특정 실시양태에서, 본 발명은, (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된, 제1 종양 세포에 기인한 제1의 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) 제2 종양 세포의 기원 및/또는 조직학(histology)이 제1 종양 세포와 상이한 제2 종양 세포에 기인한 제2의 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물에 관한 것으로, 제2 종양 세포에 연결된 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다.

특정 실시양태에서, 본 발명은, (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된, 병원체 감염에 기인한, 특히 박테리아 또는 바이러스 감염에 기인한 제1의 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) 종양 세포의 발생에 기인한 제2의 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물에 관한 것으로, 상기 종양 세포에 연결된 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다.

특정 실시양태에서, 본 발명은, (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된, 종양 세포의 발생에 기인한 제1의 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) 병원체 감염에 기인한, 특히 박테리아 또는 바이러스 감염에 기인한 제2의 병리학적 질환(들)에 대한 예방에, 그리고 (ⅲ) 임의로 상기 제1의 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 사용하기 위한 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물에 관한 것으로, 상기 상이한 병원체(예, 상이한 박테리아 또는 상이한 바이러스)에 연결된 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않는다.

본 발명은 또한 동일한 포유류 숙주에서, (ⅰ) 특히 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법과 (ⅱ) 특히 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방 둘 다를 얻기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않으며, 상기 방법은 하기를 상기 포유류 숙주에게 1회 이상 투여하는 것을 포함한다:

(1) 벡터-운반 폴리펩티드(들)로서, 폴리펩티드(들)를 운반하는 상기 벡터는 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하기에 적합한 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되며, 상기 에피토프의 제1 군 및 에피토프의 제2 군은 상기 벡터에 의해 운반되는 1 이상의 폴리펩티드(들)에 함유되고, 상기 에피토프의 제2 군의 1 이상의 에피토프는 에피토프의 제1 군의 에피토프와 상이한 벡터-운반 폴리펩티드(들);

(2) 약학적으로 허용 가능한 운반체와 조합하여 (1)에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 포함하는 조성물; 또는

(3) 조성물로서, (a) 폴리펩티드(들)를 운반하는 제1 상기 벡터는 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하기에 적합한 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되고, 상기 에피토프의 제1 군은 상기 제1 벡터에 의해 운반되는 1 이상의 폴리펩티드(들)에 함유되는 제1 벡터-운반 폴리펩티드(들) 및 (b) 폴리펩티드(들)를 운반하는 상기 제2 벡터 분자는 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하기에 적합한 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되고, 상기 에피토프의 제2 군은 상기 제2 벡터에 의해 운반되는 1 이상의 폴리펩티드(들)에 함유되는 제2, 별개의, 벡터-운반 폴리펩티드(들)를 포함하는 조성물.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 또한 동일한 포유류 숙주에서 (ⅰ) 특히 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써의, 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법, 그리고 (ⅱ) 특히 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써의, 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방, 그리고 (ⅲ) 임의로, 특히 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써의, 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지를 얻는 방법에 관한 것으로, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 벡터-운반 폴리펩티드(들)에 함유되지 않은 경우에는 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 상기 예방이 관찰되지 않으며, 상기 방법은 하기를 상기 환자에게 1회 이상 투여하는 것을 포함한다:

본원에 정의된 조성물은, 특정 실시양태에서, 약학적으로 허용 가능한 운반체 또는 제제, 또는, 완충제, 염수(saline), 인산 완충 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 물, 에탄올 등 및 이의 조합 중에서 선택된 생리학적으로 허용 가능한 희석제를 포함할 수 있다.

더 나아가, 면역치료법 및 예방을 얻기 위한 수단으로서 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은 1 이상의 면역부활제(immunopotentiator), 예컨대 1 개 이상의 보조제, 바람직하게는 1 개의 보조제, 및/또는 계면활성제 및/또는 면역 조절 물질(예컨대 사이토카인(cytokine) 또는 케모카인(chemokine))과 조합되거나 혼합될 수 있거나, 또는 면역치료법 및 예방을 얻기 위한 수단으로서 본원에 정의된 바와 같은 조성물은, 1 이상의 면역부활제, 예컨대 1 개 이상의 보조제, 바람직하게는 1 개의 보조제, 및/또는 계면활성제 및/또는 면역 조절 물질(예컨대 사이토카인 또는 케모카인)을 추가로 포함할 수 있다.

다양한 보조제가 당해 분야에 공지되어 있으며 CFA(Complete Freund's adjuvant), IFA(Incomplete Freund's adjuvant), 몬타나이드 ISA(incompletre seppic adjuvant), 무라밀 펩티드, 예컨대 무라밀 디펩티드(MDP) MDP-Lys(L18)(N^α-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-N^ｅ스테오로일-L-리신), 황산 아연, 콜로이드성 수산화 철, 인산 칼슘 또는 염화 칼슘, CPG ODN(CpG oligodeoxynucleotides), 예컨대 CPG ODN 1826 및 CPG ODN 2007, 물에 5% 스쿠알렌(squalene)(w/v), 0.5% 트윈(Tween)® 80 (w/v) 및 0.5% 스팬(Span)(w/v)을 함유하는 수중유 에멀션 안정화된 세제인 MF59, TLR4 리간드(예컨대 MPL, GLA) TLR3 리간드(예컨대 힐토놀(Hiltonol)®), 폴리사카라이드(예컨대 이눌린) 및 리포좀(예컨대 양이온성 리포좀, ISCOM)을 포함한다.

특정 실시양태에서, 1 이상의 보조제는 T-세포 면역 반응, 특히 T-세포 메모리 반응을 활성화시키는 능력을 갖는 분자 중에서 선택된다. 바람직한 보조제는 면역 세포(예컨대 APC) 내로 TLR(Toll like receptor) 3, 4, 7, 8 및/또는 9에 부착되는 것이거나 이에 대한 아고니스트(agonist)이다. 특정 실시양태에서, 보조제는 TLR 리간드, 특히 클래스 3의 TLR 리간드, 예컨대 Poly-ICLC, 클래스 4의 TLR 리간드, 클래스 9의 TLR 리간드, 예컨대 CpG, 및 클래스 7/8의 TLR 리간드, 예컨대 이미퀴모드로 구성되는 군으로부터 선택된 TLR 리간드이다. 보조제의 예로는 5% 이미퀴모드(알다라^TM)를 함유하는 크림으로 판매되는 이미퀴모드 및 힐토놀®로 Oncovir사(Inc, 미국 워싱턴주 소재)가 판매하는 Poly-ICLC가 있다.

"조합(combined)"은, 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물 및 면역부활제가 둘 다, 바람직하게는 동일한 접촉 부위에서, 상이한 횟수로 및/또는 상이한 투여 방식으로 숙주와 접촉하게 되는 것을 의미힌다. 특정 실시양태에서, 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은 숙주 내로 주사되고 면역부활제(예컨대 보조제)는 숙주에게 국부적으로, 예를 들어 피부로(cutaneously)(피부 상으로) 도포된다. 예를 들어, 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은 숙주 내로 주사되고 면역부활제(예컨대 보조제)는 주사에 이어 주사 부위에서 숙주의 피부 상으로 도포된다. 대조적으로, "혼합(mixed)"은 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물 및 면역부활제가 투여시 동일한 제제에 존재함을 의미한다.

본 출원에서, 면역부활제(예컨대 보조제)가 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물과 혼합되거나 조합되는 경우, 적어도 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물이 숙주 내로 투여될 때마다 면역부활제가 사용된다는 것은 주목할만하다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은 2회 투여되고, 면역부활제는 각 투여일에 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 투여 부위에 (혼합되거나 조합되어, 바람직하게는 피부로) 도포된다. 또 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은 2회 투여되고, 면역부활제는 각 투여일에 및 각 투여일 다음날에 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 투여 부위에 (혼합되거나 조합되어, 바람직하게는 피부로) 도포된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은 2회 투여되고, 보조제(바람직하게는 이미퀴모드, 예컨대 알다라^TM)는 각 투여일에 및 각 투여일 다음날에 본 발명의 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물의 투여 부위에 피부로 도포된다.

면역치료법 및 예방 및 임의로 재발 방지를 얻기 위한 방법으로 본원에 정의된 바와 같은 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 본원에 정의된 바와 같은 조성물은, 투여 요법(administration regimens)으로, 병원체 감염, 종양 세포 또는 상기 감염 또는 종양에 관련된 병리학적 질환(들)을 치료하기에 적합한 다른 활성 화합물, 예컨대 항종양 또는 항바이러스 활성 화합물과 추가로 조합되거나 혼합될 수 있다.

본원에 정의된 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은 상이한 경로들을 통해 환자에게 주사될 수 있다: 피하(s.c), 피내(i.d.), 근육내(i.m.) 또는 정맥(i.v.) 주사, 경구 투여 및 점막 투여, 특히 경비 투여 또는 흡입. 특정 실시양태에서, 본원에 정의된 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은 피내로 투여된다.

특정 실시양태에서, 1 이상의 면역부활제와 혼합되거나 조합되거나 혼합 및 조합되지 않은, 본원에 정의된 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은, 투여 경로에 관계 없이, 포유류 숙주에서 진단된 (제1의) 결정된 병리학적 질환(들)에 독립적인 부위에, 즉, 종양에 대해서는 종양 발생 부위가 아닌 다른 부위에(예를 들어 점막이 아닌 부위), 그리고 병원체에 대해서는 병원체 복제 부위가 아닌 부위에 투여된다.

본원에 정의된 벡터-운반 폴리펩티드(들) 또는 조성물은 고체 형태(카세제(cachet), 분말, 연질캡슐(gelule), 알약(pill), 좌약(suppository), 급속 방출 정제(tablet), 위내성(gastro-resistant) 정제, 지연 방출 정제), 분말 형태, 바람직하게는 주사 전에 예를 들어 희석제(들)로 복원될(reconstituted) 필요가 있는, 동결 건조 후의 형태(동결 건조된 형태 또는 동결 건조된 분말 형태), 또는 액체 형태, 예컨대 주사용 용액 또는 주사용 현탁액일 수 있다.

투여되는 벡터-운반 폴리펩티드(들)의 양(용량)은, 환자의 상태, 개개인의 면역계의 상태, 투여 경로 및 숙주의 크기를 고려하는 것을 비롯하여, 치료될 대상에 따른다. 종래 용량의 범위는 1~1200 ㎍, 100~1000 ㎍, 200~1000 ㎍, 500~1000 ㎍이다. 구체적인 용량은 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 및 1000 ㎍로 구성되는 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에서, 종래 용량의 범위는 1~100 ㎍, 1~50 ㎍ 및 1~10 ㎍의 벡터-운반 폴리펩티드(들)가다. 이 실시예들은 상황에 따라 숙련자에 의해 변경될 수 있다.

각 구체적인 실시양태는 임의 특정 실시양태와 조합될 수 있다.

[ 실시예 ]

A. 물질 및 방법

마우스

6주령 암컷 C57BL/6 마우스(H-2^b)를 Charles River Laboratories에서 구입하였다. 마우스를 무병원체 환경에서 무제한으로 물과 사료를 급여하며 사육하였다. 동물이 연관된 절차 및 이들의 보육은 국내 및 국제 법규 및 정책을 준수하고 지역 윤리 위원회에 의해 검토된 장띠셀사(Genticel)의 지침을 따랐다.

종양 세포주

HPV16 E6 및 E7 발암유전자를 지닌 C57BL/6 1차 마우스 폐 세포의 형질전환으로 TC-1(조직 배양 번호 1) 종양 세포(Lin, Guarnieri et al. 1996)을 제조하고 인간 c-Ha-Ras 발암유전자를 활성화시켰다. 이 실험에 사용된 세포는 ATCC로부터 얻었다. TC1 세포를 각 실험 전에 해동시키고 이후 배양하여 최소 주사 전 10일 동안 실험관 내에서(in vitro) 확장시켰다.

EG7, OVA-감염된 EL4 림프종 쥐과 세포주(C57BL/6 유전적 배경)을 사용하여 오브알부민(Ovalbumin) 단백질을 발현하는 고형 종양을 유도하였다. 이 모델은 널리 기술되며 암의 쥐과 종양 모델로 사용된다(Schreiber, Deyev et al. 2009). EG7 세포를 각 실험 전에 해동시키고 이후 배양하여 최소 주사 전 10일 동안 실험관 내에서 확장시켰다.

종양 세포 접종

0일째에, C57BL/6 마우스에 측부의 피하 경로를 통해 100 ㎕의 PBS 1X로 희석된 TC-1 세포(HPV_TUR008에 대해 마우스당 0.5 x 10⁶ 세포, 다른 연구들에 대해 마우스당 1 x 10⁶ 세포)를 주사하였다. 일부 실시양태에서 마우스에 측부의 피하 경로를 통해 100 ㎕의 PBS 1X로 희석된 EG7 세포를 60일째에 주사하였다.

벡터 제조

- 재조합 CyaA-HPV16E7_Δ30-42(C16-1) 및 CyaA-HPV18E7_Δ32-42(C18-1)의 구축 및 정제(도 3a 및 3b)는 이미 EP1576967B1에 기술되어 있다. CyaA-HPV16E7_Δ30-42(C16-1) 및 CyaA-HPV18E7_Δ32-42(C18-1)의 두 최종 벌크(final bulk)를 장띠셀사에서 1 : 1 비율로 혼합하여 이후 분취량이 -80℃로 저장되는 프로세빅스를 제조하였다.

- CyaA-CysOVA는 오브알부민(OVA) 단백질의 OVA₂₅₇ _-264 (SIINFEKL) H-2^b 제한된 에피토프를 내포한다. 이것은 장띠셀사에서 정제된 BTpr_103, 배치(batch) HPV043_Cova_PB_8M로 코딩된다. 이 CyaA-CysOVA의 배치는 장띠셀사에서 마우스 내 이의 면역원성을 특징으로 한다(내적 결과)(도 4).

- CyaA-MAGEA3₉₇ _-178/190-295 벡터(도 4c 및 서열 번호: 7)는 두 폴리펩티드를 포괄한다:

(1) B. 페르투시스 CyaA의 잔기 319와 320 사이에 삽입된 MAGE A3_97-178에피토프 : LGDNQIMPKAGLLIIVLAIIAREGDCAPEEKIPKKLLTQHFVQENYLEYRQVPGSDPACYEFLWGPRALV ETSYVKVLHHMVKISG(서열 번호: 8); 및

(2) CyaA의 잔기 224와 235 사이에 삽입된, MAGE A3 서열의 잔기 242-295에 융합된 잔기 190-221에 상응하는 MAGE-A3_190-295* 에피토프 : TFPDLESEFQAALSRKVAELVH FLLLKYRAREPVTKAEMLGSVVGN WQYFFPVIFSKASSSLQLVFGIELMEVDPIGHLYIF(서열 번호: 9).

백신 투여

11일째에, 종양 측정 후, 고형 종양을 검출할 수 있는 마우스에 귀 진피 내로 피내(id) 주사로 백신을 접종하였다(두 귀 모두 주사함). 일부 실시양태에서, 마우스에 TC-1 종양 세포 접종 후 11일째 및 39일째에 2가 백신 접종을 하였다. 프로세빅스에 관하여, 마우스에 5㎍의 CyaA-HPV16E7_Δ30-42 및 5㎍의 CyaA-HPV18E7_Δ32-42를 투여하였다.

보조제 분자

알다라^TM는 예를 들어 APC와 같은 면역 세포 내로 TLR7에 우선 결합함으로써 선천성 면역을 활성화시키는 분자의 약학적 제제이다. 이 활성 분자는 작은 합성 화합물인 이미퀴모드이다. 알다라^TM는 250 mg 1회용 패킷 내 5% 이미퀴모드(12.5 mg의 활성 이미퀴모드)를 함유하는 크림으로 시판된다. 프로세빅스 마우스 백신 접종에 대한 보조제 효과를 보조제를 유도하는 용량은 예방 접종(immunisation) 부위당 25 mg의 알다라^TM로 각각 주사 부위당 1.25 mg의 활성 이미퀴모드이다(한 마우스당 50 mg). 알다라^TM의 국부(피부) 도포는 예방 접종일에 및 예방 접종 후 24시간에 이루어진다. 귀 피부에 도포하기 위한 25 mg의 알다라^TM를 각각 함유하는 개별 튜브를 제조하였다(한 마우스당 2 튜브). (개별 마우스의 각 귀에 상응하는) 각 프로세빅스 주사 부위에 도포된 알다라^TM 크림의 실제량을 정확히 평가하기 위해; 각 에펜도르프 튜브를 그 안에 크림을 넣기 전과 후에 무게를 측정했다. 귀 피부에 알다라^TM 크림을 도포한 후, 에펜도르프 튜브의 무게를 재평가하여 피부 내로 문질러진 크림의 양을 근사적으로 계산하였다. 각 튜브에, 크림 함량 전부를 15초 이상 및 완전한 피부 침투까지 문질렀다.

2 mg/mL 유백색 살균 용액의 1 mL를 함유하는 바이알로, Poly-ICLC(TLR3 아고니스트)를 Oncovir사(Inc, 미국 워싱턴주 소재)로부터 구입하였다. Poly-ICLC를 원래의 수용체(recipient)에 그대로 두고 +4℃에 보관하였다. 주사용 Poly-ICLC는 1.5 mg/mL 폴리-L-리신으로 안정화된 2 mg/mL의 poly-IC 및 0.9% 염화나트륨 용액 중 5 mg/mL 나트륨 카복시메틸셀룰로오스를 함유하고 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.6-7.8으로 조정하였다.

종양 측정

상이한 매개변수들을 사용하여 마우스 내의 종양 발생을 평가하였다:

- 종양 크기: 종양을 종양세포 접종 후 5일로부터 시작하여 60일째까지 주당 2회씩 캘리퍼(calliper)를 사용하여 수공으로 측정하였다. 종양 부피는 이후 하기와 같이 계산하였다: 부피 = (길이 x 너비²)/2;

- 마우스 생존: 윤리적 이유로, 비정상적으로 중요한 (한계 크기: 2000 ㎣) 및/또는 괴저성 종양이 발생하거나, 손상된 이동성을 유도된 종양을 지니는 마우스는 안락사된다; 그리고

- 무종양 마우스의 수: 이 정보는 치료 백신 접종이 완전 종양 퇴축(촉진 가능한(palpable) 종양의 부재)을 유도하는 경우를 나타낸다.

CD8 T 세포 메모리 세포 독성 반응의 측정

생체 내 CD8⁺ T 세포의 세포 독성을 측정하는 방법은 광범위하게 기술되어 있다(Barchet, Oehen et al. 2000; Ingulli 2007). 간단히, 무경험(naive) 마우스로부터의 동종동계(syngeneic) 비장세포를 CFSE(카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르, Molecular Probes Invitrogen사제)의 상이한 농도들로 표지하고 관련 H-2^b 제한된 펩티드로 실험관 내 펄스시커거나 비펄스화되게 하였다. 펩티드-펄스형 및 비펄스형 표적 세포 개체군(population) 둘 다를 동종동계 백신 접종된 숙주 내로 정맥을 통해 양자적으로(adoptively) 이동시키고 펩티드-펄스형 표적의 손실은 비장 내로 유세포분석기(flow cytometry)(BD FACSCalibur)를 사용하여 측정하였다. 사멸 비율은 비펄스형 세포에 대한 펄스형 표적 세포의 백분율의 비율 감소로부터 추정하여, 초기 비율로 보정하였다(하기 참조). 세포 제조를 상이한 표적 세포들의 CFSE 로딩을 체크하기 위해 주사 전에 유세포분석기로 분석하고 생체 내 사멸의 계산을 위하 기준값(reference value)(각 세포 개체군의 실제 백분율)을 얻었다. 세 표적 세포 개체군을 이후 각 백신 접종된 마우스에 1 : 1 : 1 비율로 정맥 내 주사하였다. 생체 내 사멸 비율을 하기 식으로 다른 곳에서 기술된 바와 같이 계산하였다(Barber, Wherry et al. 2003)

사멸 비율 = 100 - ([(% 백신 접종되어 펄스화된 펩티드 / % 백신 접종되어 비펄스화된 펩티드) / (% 주사 전 펄스화된 펩티드 / % 주사 전 비펄스화된 펩티드))x100)

IFN -γ ELISpot ( enzyme - linked - immunospot ) 분석

특이적 CD8⁺ T 세포를 생성하는 HPV16 E7₄₉ _-57 및 HPV18 E7_AS43 _-49 IFN-γ의 빈도를 IFN-γ ELISpot 분석으로 생체 외(ex-vivo) 재자극된 비장 세포에서 평가하였다:

- ELISpot을 풀을 형성한(pooled) 비장에서가 아닌 개별 마우스에서 수행하였다.

- 마우스는 동종동계 CFSE-로딩된 표적 비장세포의 정맥 내 투입(infusion) 전날 받았다(생체 내 사멸 분석 때문, 하기 참조).

간략하게는, 백신 접종된 마우스로부터 얻은 총 비장세포를 하기 기술된 바와 같은 각 펩티드의 1 ㎍/ml으로 37℃, 5% CO₂에서 20시간 동안 비자극하거나 재자극시켰다:

- 1 x10⁶ 세포 / HPV16 E7₄₉ _-57 펩티드(H-2^b 제한된 관련 에피토프)를 지닌 웰(well).

- 1 x 10⁶ 세포 / OVA₂₅₇ _-264(H-2^b 제한된 비관련 에피토프)를 지닌 웰.

- 0.25 x 10⁶ 세포 / HPV18E7_AS43 _-49(H-2^b 제한된 관련 에피토프)를 지닌 웰.

IFN-γ 분비를 스트렙타비딘-AKP을 사용하는 BCIP/NBT로 밝혀진 샌드위치계 ELISpot으로 모니터링하였다. 데이터를 Bioreader 5000-Pro S(Biosys사제)로 분석하였다.

치료학적/ 예방학적 백신 접종

하기 상세히 기술된 치료 계획은 도 8에 요약되어 있다.

0일째, 마우스의 두 군(제1 군 및 제2 군)을 TC-1 세포(마우스당 1x10⁶ 세포)로 우측부로 접종하였다. 이후, 마우스에 2회의 백신을, 첫번째는 11일째에 및 두번째는 39일째에, 플라시보(PBS 1X + 요소)(제1 군)로 또는 플라시보 + 알다라^TM(제2 군)로 접종하였다. 제1 군 및 제2 군은 음성 대조군이다.

0일째에, 마우스의 4개의 군(제3 군~제6 군)을 TC-1 세포(마우스당 1x10⁶ 세포)로 우측부로 접종하였다(제3 군~제6 군); 이후, 마우스에 2회의 백신을, 첫번째는 11일째에 및 두번째는 39일째에, 알다라^TM의 존재 하에 CyaA-MAGEA3₉₇ _-178/190-295/CyaA-HPV16 E7(5 ㎍의 각 CyaA계 벡터)로(제3 군), 알다라^TM의 존재 하에 CyaA-cysOVA/CyaA-HPV16 E7(5 ㎍의 각 CyaA계 벡터)(제4 군)로 또는 알다라^TM-보조제가 첨가된 프로세빅스(제5 군 및 제6 군, TC-1 종양 제거에 대한 양성 대조군으로서)로 접종하였다. 이 마우스들의 우측부를 100일째까지 모니터링하였다(도 9). 60일째에, 생존한 마우스를 제2 종양 세포주로, MAGE A3 단백질을 발현하는 B16-종양 세포(제3 군 및 제5 군) 또는 EG7 종양 세포(오브알부민 단백질을 발현하는 악성 동종동계 세포)(제4 군 및 제6 군)로 접종하였다. 이 마우스들의 좌측부를 100일째까지 모니터링하였다.

사용하는 경우, 알다라^TM를 백신 접종일 및 백신 접종 다음날(즉 12일째 및 40일째)에, 백신 접종 부위에 국부적으로(피부로) 도포하였다.

B. 결과

프로세빅스로 백신 접종된 HPV16 E7 발현 고형 종양을 갖는 마우스는 높은 종양 퇴축율 및 향상된 생존을 나타내었다

PBS로 11일째에 백신 접종되고 알다라^TM 도포를 받은 마우스는 50일째 전에 종양이 완전히 제거된 10 마리 중 2 마리 마우스를 제외하고는 종양 성장의 억제를 나타내지 않았다(도 5a의 A 및 도 6a의 A). 4 마리 마우스는 50일째에 이 군에서 생존하였다(도 6a의 B; 종양 크기 모니터링 종료). PBS 단독으로 처리된 군은 이 연구에 포함되지 않았고 따라서 종양에 대한 마우스의 자연적 반응과 비교하여 알다라^TM의 영향에 대한 분명한 개념을 가지는 것은 어렵다. 그러나, 알다라^TM 단독으로 관찰된 효과가 알다라^TM-보조제가 첨가된 프로세빅스로 관찰된 것에 비해 훨씬 약하다는 것은 분명하다(이후 참조). 이것은, 대개 선천 면역 활성화 때문이며 염증 작용을 일으키는(전염증성 사이토카인 등(Schon and Schon 2008)), 알다라^TM가 종양 진행에 어느 정도의 방관자 효과(bystander effect)를 가질 수 있는 경우일지라도, 고형 HPV-유도된 종양의 치료와 같은 이 치료 계획으로 단독으로 사용될만큼 강하지 않다는 것을 나타낸다.

11일째에 보조제가 첨가되지 않은 프로세빅스로 백신 접종된 마우스는 또한 50일째에 무종양 마우스가 없는 중요한 종양 결과물을 나타낸다(도 5a의 B 및 도 6a의 A). 2 마리 마우스만이 이 군에서 50일째에 생존하였다(도 6a의 B). 국부 이미퀴모드(알다라^TM)로 보조제가 첨가된 프로세빅스로 치료 백신을 접종하는 것은 높은 생존율(도 6a의 B)을 야기하는 현저한 종양 퇴축(도 5b의 D) 및 이 연구의 종료시 무종양 마우스의 대다수를 유도하였다(도 6a의 A). 알다라^TM-보조제가 첨가된 프로세빅스 군에 대하여, 본 발명자들은 10 마리 중 3 마리 마우스에서 분명한 대조군의 기간 후 종양 탈출(escape)을 관찰하였다(50 ㎣ 미만으로 감소된 크기). 상기 탈출은 50일째까지 중요한 성장과 함께 30일째와 40일째 사이에서 발생하였다. 이 현상은 종양에 의해 발생된 탈출 매커니즘 때문일 수 있고 이 경우 치료 계획 개선을 위해 고려되어어야 하지만, 상기 TC-1 세포에 대해 기술된 바와 같이 종양 세포의 표면에서 MHC-클래스 Ⅰ 분자의 손실 때문일 가능성이 높다(Zwaveling, Ferreira Mota et al. 2002). Poly-ICLC-보조제가 첨가된 프로세빅스로 치료 백신을 접종하는 것은 종양 퇴축 및 생존율의 비교할만한 결과를 제공하였다(도 5b의 C 및 도 6). 이 결과들은 HPV16 E7 발현 고형 종양를 가진 마우스에 Poly-ICLC 또는 국부 이미퀴모드(알다라^TM)로 보조제가 첨가된 프로세빅스로 치료 백신을 접종하는 것이 강한 치료적 효과를 일으킴을 나타내었다.

프로세빅스 치료 백신 접종은 HPV16 E7 및 HVP18 E7 특이적 기능성 메모리 CTL 둘 다의 발생을 촉진한다

Rafi Ahmed 및 그의 동료들은, LCMV로 급성 바이러스 감염된 쥐과 모델 에서, 메모리 CD8⁺ T 세포가 생체 내 급속 용해 가능성을 나타낼 수 있음을 기술하였다(Barber, Wherry et al. 2003). 상기 관찰들에 근거하여, 본 발명자들은 TC-1-유도된 고형 종양이 완전히 제거된 마우스가 11일째의 프로세빅스의 투여에 이어 종양의 근절 후 기능성 항원 특이적 메모리 CD8⁺ T 세포를 나타내는지를 조사하기로 하였다.

상기 목적을 위하여, TC-1 세포 접종 후 60일째에, 하기 2 가지 H-2^b 제한된 에피토프: HPV16 E7₄₉ _-57 및 HPV18 E7_AS43 _-49에 대한 메모리 CD8⁺ T 세포의 생체 내 세포 독성(물질 및 방법 부문에서 상기 기술된 바와 같이)과 동시에 측정하기 위해, 각 군에 남은 무종양 마우스를 CFSE-로딩된 동종동계 비장세포와 함께 양자적으로 이동시켰다. 알다라^TM로 보조제가 첨가되거나 Poly-ICLC로 보조제가 첨가된 프로세빅스로 백신 접종된 마우스의 군들에서, 5 마리의 무종양 마우스(군에서 무작위로 선택함)를 생체 내 사멸 분석을 수행하기 위해 선택하였다. 모두 종양이 완전히 근절된 모든 시험된 마우스에서, 본 발명자들은 HPV16 E7₄₉ _-57-펄스형 표적 세포에 대한 강한 세포 독성을 검출하였다(도 7). 군들 사이의 상이한 점은 관찰되지 않았다. 알다라^TM와 함께 플라시보로 백신 접종된 군에서의 HPV16E7-특이적 세포 독성 반응의 검출은 2 마리 무종양 마우스의 상기 시험에서의 사용 때문이다(모든 다른 마우스들은 60일째에 종양 결과물로 인해 죽었다). 이 데이터는 상기 2 마리 마우스가 TC-1 유도된 고형 종양를 제거하기에 충분히 강한 HPV16 E7 특이적 면역 반응을 발생시킬 수 있음을 나타내었다. 흥미롭게도 오직 보조제가 첨가된 프로세빅스로 백신 접종된 마우스는 또한 HPV18E7-펄스형 표적 세포를 나타내었다. 이 데이터는 TC-1 세포가 HPV18 항원을 발현하지 않기 때문에 더욱 유용하며, 따라서 보고된 HPV18-특이적 세포 독성은 오직 백신-유도된 메모리 T 세포 때문임을 나타낸다. 사실상, HPV18E7-펄스형 표적 세포에 대한 생체 내 세포 독성은 알다라^TM만으로 치료된 마우스에서 관찰되지 않았다(도 7).

종합하여, 본 발명자들의 데이터는, 오직 한 번의 주사만으로 HPV16 E7 및 HPV18 E7 항원 둘 다에 대한 기능성 CD8-의존적 메모리 반응을 유도하는 프로세빅스의 정교한 효능을 나타낸다. 1가 프로세빅스 백신 접종은, 백신 접종된 마우스에게 HPV16 E7을 발현하는 동종동계 그래프트된(grafted) 세포로의 2차 공격에 대한 장기적 보호와 동시에 HPV18 E7 발현 동종동계 그래프트된 세포(종양에 의해 발현되지 않고 CyaA-HPV18E7_Δ32-42 벡터에 의해서만 전달되는 항원)로의 새로운 공격에 대한 보호 둘 다를 부여하는, 항원 특이적 메모리 CD8⁺ T 림프구의 풀의 분화를 유도할 수 있다.

2가 CyaA-HPV16E7_Δ30-42 / CyaA-MAGE A3 치료 백신 접종은 HPV16 E7 발현 고형 종양의 근절 및 MAGE-A3 유도된-종양의 발생에 대한 보호를 제공한다

경피성 보조제로서 CyaA-HPV16E7 _Δ _30-42/CyaA-MAGE A3 + 알다라로 백신 접종된 마우스(제3 군) 및 알다라-보조제가 첨가된 프로세빅스로 백신 접종된 마우스(제5 군 및 제6 군)는 40일 내로 TC1-유도된 고형 종양이 제거되었다: 제3 군에서 10 마리 중 9 마리의 마우스(도 9b의 c); 제5 군에서 10 마리 중 8 마리의 마우스, 및 제6 군에서 10 마리 중 9 마리의 마우스(도 9c의 e 및 도 9c의 f). 종양의 강한 제거를 100일째까지 확증하였다. 대조적으로, 음성 대조군으로서, 보조제와 함께 또는 보조제 없이(각각 제1 군 및 제2 군) 플라시보로 백신 접종된 마우스는 TC1-유도된 고형 종양이 발생하였다: 제1 군에서 9/10 마우스(도 9a의 a) 및 제2 군에서 8/10 마우스(도 9a의 b).

60일째에, 제3 군 및 제5 군으로부터 생존한 마우스에, MAGE A3 단백질을 발현하는 B16-종양 세포로 이들의 좌측부에 접종하였다. 알다라^TM의 존재 하에 CyaA-HPV16E7 _Δ _30-42/CyaA-MAGE A3로 백신 접종되고 TC1-유도된 종양이 제거된 마우스는 공격 후 B16-MAGEA3 종양 발생을 나타내지 않았으며(9 마리 중 0 마리 마우스가 B16-MAGEA3 종양을 발생시킴; 도 10a의 a), 이는 이 마우스들이 B16-MAGE A3-유도된 고형 종양으로의 공격에 대해 보호됨을 나타내었다.

대조적으로, 알다라^TM-보조제가 첨가된 프로세빅스로 백신 접종되고 TC1-유도된 종양이 제거된 마우스는 B16-MAGEA3 종양이 발생하였으며(8 마리 중 6 마리 마우스가 B16-MAGEA3 종양을 발생시킴; 도 10b의 c), 이는 프로세빅스(HPV16E7/HPV18E7)가 B16-MAGEA3 종양 세포에 의한 공격에 대한 보호성 메모리 T-세포 면역을 수여하지 않음을 나타내었다. 따라서, 제3 군 마우스에서 관찰된 MAGE A3-유도된 종양의 발생에 대한 보호는 CyaA-MAGEA3으로 백신 접종된 마우스에서 MAGE A3-특이적 T-세포 매개 메모리 반응의 유도의 결과로 달성되며, 반면 제5 군 마우스에서 유도된 T-세포 매개 메모리 반응은 B16-MAGEA3 종양 세포의 특성에 대해 비관련된 항원(HPV18 E7)에 대해 상승되었다.

결론적으로, 이 실험들은, TC-1 세포를 근절하고(HPV18E7-특이적 면역 반응), B16-MAGEA3 종양 세포의 발생을 방지하는(MAGE A3-특이적 T 세포 매개 메모리 반응) 둘 다를 위해, 1회 투여에 이어 2가 CyaA가 사용될 수 있음을 나타내었다. 더 나아가, 60일 후에 얻어진 결과는 B16-MAGEA3 종양 세포에 대해 얻어진 예방적 효과가 TC-1 세포에 대해 얻어진 치료적 효과를 손상시키지 않음을 나타내었다(100일째까지의 TC1 세포의 근절; 도 9b의 c).

2가 CyaA-HPV16E7_Δ30-42 / CyaA-cysOVA 치료 백신 접종은 HPV16 E7 발현 고형 종양의 근절 및 EG7-0VA 유도된-종양의 발생에 대한 보호를 제공한다

경피성 보조제로서 알다라^TM의 존재 하에 CyaA-HPV16E7 _Δ _30-42/ CyaA-CysOVA로 백신 접종된 마우스(제4 군) 및 알다라-보조제가 첨가된 프로세빅스로 백신 접종된 마우스(제5 군 및 제6 군)는 40일 내로 TC1-유도된 고형 종양이 제거되었다: 제4 군에서 10 마리 중 9 마리의 마우스(도 9b의 d) 및 제5 군에서 10 마리 중 8 마리의 마우스 및 제6 군에서 10 마리 중 9 마리의 마우스(도 9c의 e 및 도 9c의 f). 종양의 강한 제거를 100일째까지 확증하였다. 대조적으로, 음성 대조군으로서, 보조제와 함께 또는 보조제 없이(각각 제1 군 및 제2 군) 플라시보로 백신 접종된 마우스는 TC1-유도된 고형 종양이 발생하였다: 제1 군에서 9/10 마우스(도 9a의 a) 및 제2 군에서 8/10 마우스(도 9a의 b).

60일째에, 제4 군 및 제6 군으로부터 생존한 마우스에, EG7-OVA 종양 세포(오브알부민 단백질을 발현하는 악성 동종동계 세포)로 이들의 좌측부에 접종하였다. 제6 군에서, 마우스 6004는 60일 후에 종양이 발생하였고(도 9c의 f), 이로써 종양이 발생하지 않은 다른 9 마리 마우스들처럼 상기 마우스에 EG7-OVA 종양 세포로 접종하였다. 알다라^TM의 존재 하에 CyaA-HPV16E7 _Δ _30-42/CyaA-CysOVA로 백신 접종되고 TC1-유도된 종양이 제거된 마우스는 공격 후 EG7-OVA 종양 발생을 나타내지 않았으며(9 마리 중 0 마리 마우스가 EG7-OVA 종양을 발생시킴; 도 10a의 b), 이는 이 마우스들이 EG7-OVA 종양 세포로의 공격에 대해 보호됨을 나타내었다. 대조적으로, 알다라^TM-보조제가 첨가된 프로세빅스로 백신 접종되고 TC1-유도된 종양이 제거된 마우스는 EG7-OVA 종양이 발생하였으며(10 마리 중 8 마리 마우스가 EG7-OVA 종양을 발생시킴; 도 10b의 d), 이는 프로세빅스(HPV16E7/HPV18E7)가 EG7-OVA 종양 세포에 의한 공격에 대한 보호성 메모리 T-세포 면역을 수여하지 않음을 나타내었다. 따라서, 제4 군에서 관찰된 EG7-OVA-유도된 고형 종양의 발생에 대한 보호는 CyaA-HPV16E7 _Δ _30-42/CyaA-CysOVA로 백신 접종된 마우스에서 OVA-특이적 T-세포 매개 메모리 반응의 유도의 결과로 달성되며, 반면 제6 군 마우스에서 유도된 T-세포 매개 메모리 반응은 EG7-OVA 종양의 특성에 대해 비관련된 항원(HPV18 E7)에 대해 상승되었다.

결론적으로, 이 실험들은, TC-1 세포를 근절하고(HPV18E7-특이적 면역 반응), EG7-OVA-유도된 고형 종양의 발생을 방지하는 둘 다를 위해, 1회 투여에 이어 2가 CyaA가 사용될 수 있음을 나타내었다. 더 나아가, 60일 후에 얻어진 결과는 EG7-OVA 종양 세포에 대해 얻어진 예방적 효과가 TC-1 세포에 대해 얻어진 치료적 효과를 손상시키지 않음을 나타내었다(100일째까지의 TC1 세포의 근절; 도 9b의 d).

C. 결론

2가 프로세빅스 치료 백신 접종으로 본 출원에 도입된 신규 개념은, 한편으로는 예를 들어 감염을 근절하여 HPV16 감염 환자를 치료하는 것이며, 다른 한편으로는 HPV16 E7 및 HPV18 E7 항원 둘 다에 대한 T-세포 매개 메모리 반응을 제공함으로써 프로세빅스-백신 접종된 환자에게 HPV16으로의 가능한 재감염에 대한 및 또한 HPV18로의 이후 감염에 대한 장기적 보호를 수립하는 것이다.

이것은 한편으로는 HPV16 감염 마우스를 치료(TC1 세포의 근절)하기 위해, 및 다른 한편으로는 각각 B16-MAGE A3 종양 또는 EG7-OVA 종양의 발생에 대한 보호를 제공하기 위해 상기 나타낸 다른 2가지 2가 백신 접종(CyaA-HPV16E7 _Δ _30-42/CyaA-MAGE A3 및 CyaA-HPV16E7 _Δ _30-42/CyaA-CysOVA)으로 확인되었다.

자궁 암종[TC-1 종양 세포(Lin, Guarnieri et al. 1996; Zwaveling, Ferreira Mota et al. 2002)]의 전임상 쥐과 모델을 사용하여, 보조제 분자[알다라^TM(Johnston and Bystryn 2006; Heib, Becker et al. 2007; Schon and Schon 2008) 또는 Poly-ICLC(Longhi, Trumpfheller et al. 2009)와 같은 TLR 아고니스트]에 조합된 프로세빅스로 고형 HPV16 E7 발현 종양을 가진 마우스에 치료 백신을 접종하는 것이 효과적인 종양 퇴축을 일으킴을 나타내었다.

더 나아가, 백신-유도된 종양 제거는 종양이 완전히 근절된 마우스에서 지속성 HPV16 E7-특이적 CTL 메모리 반응의 존재와 연관될 수 있음을 나타내었다. 예상 밖으로, 이 무종양 마우스들에서, 프로세빅스 치료 백신 접종이 동시에, 기능성 HPV18 E7-특이적 CTL 메모리 반응을 발생시킴이 또한 증거되었다. HPV16 E7 및 HPV18 E7 메모리 CTL 둘 다는 생체 내 용해 가능성을 보였다.

CyaA-운반 폴리펩티드(들)가 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법을 발생시킬 수 있게 하면서 상기 포유류 숙주에서 에피토프의 제2 군에 대한 방지성 T-세포 메모리 반응(들)(예방 면역 반응)을 발생시킬 수 있다는 관찰은 놀라운 것이다. 실제로, APC로의 접근, APC에 의한 처리 및 제시 및 사이토카인의 가용성에 대하여, 상이한 에피토프들 사이에 경쟁이 존재한다는 것은 주지되어 있다. 이 현상은 도미넌트(dominant) 및 서브도미넌트(subdominant) 에피토프의 계층 구조를 일으키고, T-세포 면역 반응을 활성화시키고 다른 T-세포 면역 반응(들)을 억제할 수 있게 한다. 이 현상은 (1 또는 몇 개의 제1 군의 에피토프가 숙주 면역계에 이미 제시되었기 때문에) 에피토프의 제1 군을 인식하는 T 세포가 벡터-운반 폴리펩티드의 투여 전에 환자 내에 이미 존재하는 반면에, 천연 T 세포가 에피토프의 제2 군에 관해 활성화되어야 하는 현 상황에서 예상된다. 흥미롭게도, 예상했던 것과 대조적으로, 본 발명은 CyaA-운반 폴리펩티드에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 방지성 면역 반응이 에피토프의 제1 군에 대한 치료학적 면역 반응에 비해 불선호(disfavour)되는 것으로 관찰되지 않음을 나타내었다. 이 결과는 에피토프의 제1 군에 대해 유도된 면역 반응과 에피토프의 제2 군에 대해 유도된 면역 반응 사이에 경쟁이 관찰되지 않음을 의미한다. 따라서, 본 발명자들은 CyaA-운반 폴리펩티드(들)가 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법 내에서의 T 세포 면역 반응을 유도하고, 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방 내에서 T 세포 메모리 면역 반응을 유도하기에 충분히 효과적임을 나타내었다.

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SEQUENCE LISTING <110> GENTICEL <120> CYAA-CARRIED POLYPEPTIDE(S) AND USE TO INDUCE BOTH THERAPEUTIC AND PROPHYLACTIC IMMUNE RESPONSES. <130> B09250A - AD/LV/KN <140> PCT/EP XXXXXX <141> 2012-01-24 <150> EP 11305069.4 <151> 2011-01-24 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1706 <212> PRT <213> Bordetella pertussis / CyaA <400> 1 Met Gln Gln Ser His Gln Ala Gly Tyr Ala Asn Ala Ala Asp Arg Glu 1 5 10 15 Ser Gly Ile Pro Ala Ala Val Leu Asp Gly Ile Lys Ala Val Ala Lys 20 25 30 Glu Lys Asn Ala Thr Leu Met Phe Arg Leu Val Asn Pro His Ser Thr 35 40 45 Ser Leu Ile Ala Glu Gly Val Ala Thr Lys Gly Leu Gly Val His Ala 50 55 60 Lys Ser Ser Asp Trp Gly Leu Gln Ala Gly Tyr Ile Pro Val Asn Pro 65 70 75 80 Asn Leu Ser Lys Leu Phe Gly Arg Ala Pro Glu Val Ile Ala Arg Ala 85 90 95 Asp Asn Asp Val Asn Ser Ser Leu Ala His Gly His Thr Ala Val Asp 100 105 110 Leu Thr Leu Ser Lys Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Arg Gln Ala Gly Leu 115 120 125 Val Thr Gly Met Ala Asp Gly Val Val Ala Ser Asn His Ala Gly Tyr 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Ala Gly Met Ser 705 710 715 720 Leu Thr Asp Asp Ala Pro Ala Gly Gln Lys Ala Ala Ala Gly Ala Glu 725 730 735 Ile Ala Leu Gln Leu Thr Gly Gly Thr Val Glu Leu Ala Ser Ser Ile 740 745 750 Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Val Thr Ser Gly Leu Gln Val 755 760 765 Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ala Ala Ala Gly Ala Leu Ala Ala Ala Leu 770 775 780 Ser Pro Met Glu Ile Tyr Gly Leu Val Gln Gln Ser His Tyr Ala Asp 785 790 795 800 Gln Leu Asp Lys Leu Ala Gln Glu Ser Ser Ala Tyr Gly Tyr Glu Gly 805 810 815 Asp Ala Leu Leu Ala Gln Leu Tyr Arg Asp Lys Thr Ala Ala Glu Gly 820 825 830 Ala Val Ala Gly Val Ser Ala Val Leu Ser Thr Val Gly Ala Ala Val 835 840 845 Ser Ile Ala Ala Ala Ala Ser Val Val Gly Ala Pro Val Ala Val Val 850 855 860 Thr Ser Leu Leu Thr Gly Ala Leu Asn Gly Ile Leu Arg Gly Val Gln 865 870 875 880 Gln Pro Ile Ile Glu Lys Leu Ala Asn Asp Tyr Ala Arg Lys Ile Asp 885 890 895 Glu Leu Gly Gly Pro Gln Ala Tyr Phe Glu Lys Asn Leu Gln Ala Arg 900 905 910 His Glu Gln Leu Ala Asn Ser Asp Gly Leu Arg Lys Met Leu Ala Asp 915 920 925 Leu Gln Ala Gly Trp Asn Ala Ser Ser Val Ile Gly Val Gln Thr Thr 930 935 940 Glu Ile Ser Lys Ser Ala Leu Glu Leu Ala Ala Ile Thr Gly Asn Ala 945 950 955 960 Asp Asn Leu Lys Ser Val Asp Val Phe Val Asp Arg Phe Val Gln Gly 965 970 975 Glu Arg Val Ala Gly Gln Pro Val Val Leu Asp Val Ala Ala Gly Gly 980 985 990 Ile Asp Ile Ala Ser Arg Lys Gly Glu Arg Pro Ala Leu Thr Phe Ile 995 1000 1005 Thr Pro Leu Ala Ala Pro Gly Glu Glu Gln Arg Arg Arg Thr Lys 1010 1015 1020 Thr Gly Lys Ser Glu Phe Thr Thr Phe Val Glu Ile Val Gly Lys 1025 1030 1035 Gln Asp Arg Trp Arg Ile Arg Asp Gly Ala Ala Asp Thr Thr Ile 1040 1045 1050 Asp Leu Ala Lys Val Val Ser Gln Leu Val Asp Ala Asn Gly Val 1055 1060 1065 Leu Lys His Ser Ile Lys Leu Asp Val Ile Gly Gly Asp Gly Asp 1070 1075 1080 Asp Val Val Leu Ala Asn Ala Ser Arg Ile His Tyr Asp Gly Gly 1085 1090 1095 Ala Gly Thr Asn Thr Val Ser Tyr Ala Ala Leu Gly Arg Gln Asp 1100 1105 1110 Ser Ile Thr Val Ser Ala Asp Gly Glu Arg Phe Asn Val Arg Lys 1115 1120 1125 Gln Leu Asn Asn Ala Asn Val Tyr Arg Glu Gly Val Ala Thr Gln 1130 1135 1140 Thr Thr Ala Tyr Gly Lys Arg Thr Glu Asn Val Gln Tyr Arg His 1145 1150 1155 Val Glu Leu Ala Arg Val Gly Gln Leu Val Glu Val Asp Thr Leu 1160 1165 1170 Glu His Val Gln His Ile Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asp Ser Ile 1175 1180 1185 Thr Gly Asn Ala His Asp Asn Phe Leu Ala Gly Gly Ser Gly Asp 1190 1195 1200 Asp Arg Leu Asp Gly Gly Ala Gly Asn Asp Thr Leu Val Gly Gly 1205 1210 1215 Glu Gly Gln Asn Thr Val Ile Gly Gly Ala Gly Asp Asp Val Phe 1220 1225 1230 Leu Gln Asp Leu Gly Val Trp Ser Asn Gln Leu Asp Gly Gly Ala 1235 1240 1245 Gly Val Asp Thr Val Lys Tyr Asn Val His Gln Pro Ser Glu Glu 1250 1255 1260 Arg Leu Glu Arg Met Gly Asp Thr Gly Ile His Ala Asp Leu Gln 1265 1270 1275 Lys Gly Thr Val Glu Lys Trp Pro Ala Leu Asn Leu Phe Ser Val 1280 1285 1290 Asp His Val Lys Asn Ile Glu Asn Leu His Gly Ser Arg Leu Asn 1295 1300 1305 Asp Arg Ile Ala Gly Asp Asp Gln Asp Asn Glu Leu Trp Gly His 1310 1315 1320 Asp Gly Asn Asp Thr Ile Arg Gly Arg Gly Gly Asp Asp Ile Leu 1325 1330 1335 Arg Gly Gly Leu Gly Leu Asp Thr Leu Tyr Gly Glu Asp Gly Asn 1340 1345 1350 Asp Ile Phe Leu Gln Asp Asp Glu Thr Val Ser Asp Asp Ile Asp 1355 1360 1365 Gly Gly Ala Gly Leu Asp Thr Val Asp Tyr Ser Ala Met Ile His 1370 1375 1380 Pro Gly Arg Ile Val Ala Pro His Glu Tyr Gly Phe Gly Ile Glu 1385 1390 1395 Ala Asp Leu Ser Arg Glu Trp Val Arg Lys Ala Ser Ala Leu Gly 1400 1405 1410 Val Asp Tyr Tyr Asp Asn Val Arg Asn Val Glu Asn Val Ile Gly 1415 1420 1425 Thr Ser Met Lys Asp Val Leu Ile Gly Asp Ala Gln Ala Asn Thr 1430 1435 1440 Leu Met Gly Gln Gly Gly Asp Asp Thr Val Arg Gly Gly Asp Gly 1445 1450 1455 Asp Asp Leu Leu Phe Gly Gly Asp Gly Asn Asp Met Leu Tyr Gly 1460 1465 1470 Asp Ala Gly Asn Asp Thr Leu Tyr Gly Gly Leu Gly Asp Asp Thr 1475 1480 1485 Leu Glu Gly Gly Ala Gly Asn Asp Trp Phe Gly Gln Thr Gln Ala 1490 1495 1500 Arg Glu His Asp Val Leu Arg Gly Gly Asp Gly Val Asp Thr Val 1505 1510 1515 Asp Tyr Ser Gln Thr Gly Ala His Ala Gly Ile Ala Ala Gly Arg 1520 1525 1530 Ile Gly Leu Gly Ile Leu Ala Asp Leu Gly Ala Gly Arg Val Asp 1535 1540 1545 Lys Leu Gly Glu Ala Gly Ser Ser Ala Tyr Asp Thr Val Ser Gly 1550 1555 1560 Ile Glu Asn Val Val Gly Thr Glu Leu Ala Asp Arg Ile Thr Gly 1565 1570 1575 Asp Ala Gln Ala Asn Val Leu Arg Gly Ala Gly Gly Ala Asp Val 1580 1585 1590 Leu Ala Gly Gly Glu Gly Asp Asp Val Leu Leu Gly Gly Asp Gly 1595 1600 1605 Asp Asp Gln Leu Ser Gly Asp Ala Gly Arg Asp Arg Leu Tyr Gly 1610 1615 1620 Glu Ala Gly Asp Asp Trp Phe Phe Gln Asp Ala Ala Asn Ala Gly 1625 1630 1635 Asn Leu Leu Asp Gly Gly Asp Gly Arg Asp Thr Val Asp Phe Ser 1640 1645 1650 Gly Pro Gly Arg Gly Leu Asp Ala Gly Ala Lys Gly Val Phe Leu 1655 1660 1665 Ser Leu Gly Lys Gly Phe Ala Ser Leu Met Asp Glu Pro Glu Thr 1670 1675 1680 Ser Asn Val Leu Arg Asn Ile Glu Asn Ala Val Gly Ser Ala Arg 1685 1690 1695 Asp Asp Val Leu Ile Gly Asp Ala Gly Ala Asn Val Leu Asn Gly 1700 1705 1710 Leu Ala Gly Asn Asp Val Leu Ser Gly Gly Ala Gly Asp Asp Val 1715 1720 1725 Leu Leu Gly Asp Glu Gly Ser Asp Leu Leu Ser Gly Asp Ala Gly 1730 1735 1740 Asn Asp Asp Leu Phe Gly Gly Gln Gly Asp Asp Thr Tyr Leu Phe 1745 1750 1755 Gly Val Gly Tyr Gly His Asp Thr Ile Tyr Glu Ser Gly Gly Gly 1760 1765 1770 His Asp Thr Ile Arg Ile Asn Ala Gly Ala Asp Gln Leu Trp Phe 1775 1780 1785 Ala Arg Gln Gly Asn Asp Leu Glu Ile Arg Ile Leu Gly Thr Asp 1790 1795 1800 Asp Ala Leu Thr Val His Asp Trp Tyr Arg Asp Ala Asp His Arg 1805 1810 1815 Val Glu Ile Ile His Ala Ala Asn Gln Ala Val Asp Gln Ala Gly 1820 1825 1830 Ile Glu Lys Leu Val Glu Ala Met Ala Gln Tyr Pro Asp Pro Gly 1835 1840 1845 Ala Ala Ala Ala Ala Pro Pro Ala Ala Arg Val Pro Asp Thr Leu 1850 1855 1860 Met Gln Ser Leu Ala Val Asn Trp Arg 1865 1870 <210> 8 <211> 86 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MAGE A3 97-178 <400> 8 Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val 1 5 10 15 Leu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile 20 25 30 Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu 35 40 45 Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu Trp 50 55 60 Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His His 65 70 75 80 Met Val Lys Ile Ser Gly 85 <210> 9 <211> 82 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> MAGE A3 190-295* <400> 9 Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys 1 5 10 15 Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu 20 25 30 Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln 35 40 45 Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu 50 55 60 Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 65 70 75 80 Ile Phe

Claims

폴리펩티드(들)를 운반하는 벡터(들)의 조성물로서, 상기 벡터는 포유류 숙주의 면역계에 상기 폴리펩티드(들)를 제시하기에 적합한 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 보르데텔라 파라페르투시스(Bordetella parapertussis) 또는 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica) 중에서 선택된 보르데텔라 종의 CyaA 단백질 또는 이의 단편으로 구성되며, 상기 조성물은,
(ⅰ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 면역 반응을 유도함으로써, 상기 포유류 숙주에서 진단된 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고
(ⅱ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제2 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 동일한 포유류 숙주에서 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방에 사용하기 위한 것이고,
상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)은, (a) HPV16 또는 HPV18 중에서 선택된 제1의 HPV 균주에 의한 감염에 기인한 것이거나, 또는 (b) 종양 발현 MAGE-A3 항원과 관련된 것이고,
상기 에피토프의 제1 군은 HPV16 또는 HPV18 중에서 선택된 HPV 기준종(type species)의 E7 항원 또는 각각 MAGE-A3 항원으로부터 유래한 것이며,
상기 제1의 결정된 병리학적 질환이 (a)에 기재된 바와 같이 제1의 HPV 균주에 의한 감염에 기인한 것인 경우, 상기 제2의 결정된 병리학적 질환은 상기 제1의 HPV 균주와 상이하도록 HPV16 또는 HPV18 중에서 선택되는 제2의 HPV 균주에 의한 감염에 기인한 것이거나 또는 상기 제2의 결정된 병리학적 질환은 종양 발현 MAGE-A3 항원과 관련된 것이며,
상기 에피토프의 제2 군은 HPV16 또는 HPV18 중에서 선택된 HPV 기준종의 E7 항원 또는 각각 MAGE-A3 항원으로부터 유래한 것이고,
상기 면역 반응은 상기 숙주 내로 상기 폴리펩티드(들)를 운반하는 벡터(들)를 투여한 후 얻어지며, 상기 에피토프의 제2 군이 상기 투여된 폴리펩티드(들)를 운반하는 벡터(들)에 함유되지 않은 경우에는 상기 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방은 관찰되지 않는 것인 조성물.
제1항에 있어서, (ⅲ) 상기 폴리펩티드(들)에 함유된 에피토프의 제1 군에 대한 T 세포 메모리 면역 반응을 유도함으로써, 상기 제1의 결정된 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 추가로 사용하기 위한 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 에피토프의 제2 군은 에피토프의 제1 군을 포함하는 폴리펩티드에 함유되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 에피토프의 제1 군 및 제2 군은 상이한 폴리펩티드들에 함유되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하나의 벡터 분자가 모든 폴리펩티드를 운반하는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 운반체(vehicle) 또는 제제(formulation)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제6항에 있어서, 2 이상의, 폴리펩티드(들)를 운반하는 벡터(들)를 포함하고, 여기서 에피토프의 제1 군은 제1 폴리펩티드(들) 운반 벡터에 함유되고 에피토프의 제2 군은 별개의 폴리펩티드(들) 운반 벡터에 함유되는 것인 조성물.
제7항에 있어서, 상기 에피토프의 제1 군은 상기 제1 폴리펩티드(들) 운반 벡터에 의해 운반되는 별개의 폴리펩티드에 함유되고/되거나, 상기 에피토프의 제2 군은 상기 별개의 폴리펩티드(들) 운반 벡터에 의해 운반되는 별개의 폴리펩티드에 함유되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CyaA 단편은 CD11b 발현 세포에 특이적으로 결합하여 세포 시토졸(cytosol) 내로 상기 폴리펩티드(들)를 전달할 수 있는 것인 조성물.
제9항에 있어서, 상기 CyaA 단편은 잔기 1~224 및 235~1706으로 구성되는 B. 페르투시스 CyaA 단편인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 CyaA 단백질 또는 CyaA 단편은 무독화되거나, 비독성이거나, 효소 활성이 결여된 것인 조성물.
제11항에 있어서, 상기 CyaA 단편은 디펩티드 Leu-Gln이 잔기 188과 189 사이의 프레임으로(in frame) 삽입된 B. 페르투시스 CyaA인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1 이상의 상기 폴리펩티드(들)가 유전자 융합의 결과로서 상기 CyaA 단백질 또는 CyaA 단편에 의해 운반되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 모든 폴리펩티드(들)가 유전자 융합의 결과로서 상기 CyaA 단백질 또는 CyaA 단편에 의해 운반되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1 이상의 상기 폴리펩티드(들)가 CyaA의 허용 부위 내로 유전자적으로 삽입되는 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 모든 폴리펩티드(들)가 CyaA의 허용 부위 내로 유전자적으로 삽입되는 것인 조성물.
제16항에 있어서, 상기 에피토프의 제1 군은 HPV16으로부터의 E7 단백질의 항원 단편으로 구성되고, 에피토프의 제2 군은 HPV18로부터의 E7 단백질의 항원 단편으로 구성되는 것인 조성물.
제17항에 있어서,
(a) CyaA의 코돈 319와 320 사이에 삽입된 HPV16-E7의 첫 29 개의 아미노산 잔기, 및 CyaA의 코돈 224와 235 사이에 삽입된 HPV16-E7의 잔기 43~98로 구성되는 제1 폴리펩티드(들) 운반 벡터; 및
(b) CyaA의 코돈 319와 320 사이에 삽입된 HPV18-E7의 첫 31 개의 아미노산 잔기, 및 CyaA의 코돈 224와 235 사이에 삽입된 HPV18-E7의 잔기 43~105로 구성되는 별개의 폴리펩티드(들) 운반 벡터
를 포함하는 조성물.
제14항에 있어서, 1 이상의 상기 폴리펩티드(들)가 MAGE A3 종양 항원으로부터 유래하는 것인 조성물.
제19항에 있어서, 상기 벡터(들)는 B. 페르투시스 CyaA로 구성되며,
(1) MAGE A3의 잔기 97~178로 구성되는 제1 폴리펩티드가 CyaA의 코돈 319와 320 사이에 삽입되고;
(2) MAGE A3의 잔기 242~295에 융합된 잔기 190~221로 구성되는 제2 폴리펩티드가 CyaA의 코돈 224와 235 사이에 삽입되는 것인,
조성물.
제17항에 있어서,
(1) (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된, HPV16에 의한 감염에 기인한 제1의 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) HPV18에 의한 감염에 기인한 제2의 병리학적 질환(들)에 대한 예방에 사용하기 위한 것으로, HPV18의 E7 단백질로부터 유래하는 폴리펩티드가 상기 투여된 폴리펩티드(들)를 운반하는 벡터(들)에 함유되지 않은 경우에는 상기 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방이 관찰되지 않거나; 또는
(2) (ⅰ) 포유류 숙주에서 진단된, HPV18에 의한 감염에 기인한 제1의 병리학적 질환(들)의 면역치료법에, 그리고 (ⅱ) HPV16에 의한 감염에 기인한 제2의 병리학적 질환(들)에 대한 예방에 사용하기 위한 것으로, HPV16의 E7 단백질로부터 유래하는 폴리펩티드가 상기 투여된 폴리펩티드(들)를 운반하는 벡터(들)에 함유되지 않은 경우에는 상기 제2의 결정된 병리학적 질환(들)에 대한 예방이 관찰되지 않는 것인
조성물.
제21항에 있어서, 상기 제1의 병리학적 질환(들)의 재발 방지에 추가로 사용하기 위한 것인 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 1 이상의 보조제(adjuvant)를 추가로 포함하는 조성물.