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KR102003239B1 - 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR102003239B1
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Abstract

본 발명은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 생체안정성이 뛰어나고 간특이성 및 간암세포 및 간전이 암세포에서 발현되는 CD44 수용체 표적성을 가지고 있어 siRNA를 이용한 간암치료제로 사용될 수 있는 장점이 있다.
상세하게는 상기 나노전달체는 타우로콜린산(TCA)-히알루론산(HA) 결합체를 포함하고 있어서 경구투여 후 위장관을 안전하게 통과하고 소장말단의 ABST를 통하여 흡수되므로 장간순환을 통해 간으로 이동하는 장점이 있으며; 타우로콜린산 -히알루론산 결합체에 포함되어 있는 HA에 의하여 간암세포 또는 간전이 암세포에서 발현되는 CD44 수용체에 대한 표적성을 가지고 있어 간암을 치료할 수 있는 장점이 있고; 독성이 없는 핵단백질인 프로타민 단백질을 사용하여 siRNA-프로타민 단백질 복합체를 제조하므로 세포 흡수시 세포독성이 없고 엔도솜 탈출이 원활히 일어나 siRNA에 의한 유전자침묵(gene silencing) 치료효과가 뛰어난 장점이 있다.

Description

경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법{Liver Cancer Targeted siRNA Nano-transporter System For Oral Administration And Manufacturing Method Thereof}
본 발명은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
간세포 암종(hepatocellular carcinoma; HCC)은 간에서 흔히 발생하는 원발성 간암으로, 매년 발병률이 증가하는 추세이며, 5년 관찰 생존율이 10% 미만이다. 또한 간은 간문맥을 통해 악성종양의 전이가 쉽게 일어나는 기관으로, 대장암과 췌장암으로부터의 전이가 많이 일어난다. 대장암 환자의 50%이상에서 간전이(colorectal liver metastasis)가 발생하며 이들에 대한 치료 후 5년 관찰 생존율은 25~51%이다. 간암 및 간전이 암을 치료하기 위한 주된 치료법으로는 간 절제술이 있으나 대부분의 환자들은 간 절제술이 불가능하여 방사선 및 호르몬 요법, 화학요법, 유전자 치료법 등을 시행한다. 유전자 치료법으로는 RNA 간섭 (RNA interference; RNAi)현상을 이용하는 방법이 있는데 이는 우리 몸의 유전물질을 조절하여 질병을 치료하는 메커니즘으로, 선택적으로 유전자 발현을 억제하여 암을 치료할 수 있다. 특히 소량의 siRNA를 이용한 RNA간섭은 넓은 범위의 암 관련 유전자를 침묵시키는 가장 효과적이고 간단한 방법이다.
그러나 siRNA는 생체 내 안정성이 매우 떨어지기 때문에 간세포 내 전달 및 흡수에 어려움이 있으며 간세포 내로 siRNA의 전달 및 흡수가 되더라도 리소좀에 의해 분해되므로 siRNA의 RNAi 유전자침묵(gene silencing) 효과를 이용한 치료에 한계가 있다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
1. 미국출원특허 US 2009-0234271 2. 미국출원특허 US 2014-0294752
1. Varshosaz, J. & Farzan, M. Nanoparticles for targeted delivery of therapeutics and small interfering RNAs in hepatocellular carcinoma. World J. Gastroenterol. 21, 1202212041 (2015). 2. Schroeder, A. et al. Treating metastatic cancer with nanotechnology. Nat. Rev. Cancer 12, 3950 (2011). 3. Helling, T. S. & Martin, M. Cause of Death from Liver Metastases in Colorectal Cancer. Ann. Surg. Oncol. 21, 501506 (2014). 4. Dominska, M. & Dykxhoorn, D. M. Breaking down the barriers: siRNA delivery and endosome escape. J. Cell Sci. 123, 11839 (2010). 5. Kafil, V. & Omidi, Y. Cytotoxic impacts of linear and branched polyethylenimine nanostructures in A431 cells. BioImpacts 1, 2330 (2011). 6. Scheicher, B., Schachner-Nedherer, A. L. & Zimmer, A. Protamine-oligonucleotide-nanoparticles: Recent advances in drug delivery and drug targeting. Eur. J. Pharm. Sci. 75, 5459 (2015). 7. Ahmad, A. et al. Novel endosomolytic peptides for enhancing gene delivery in nanoparticles. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 1848, 544553 (2015). 8. Page, D. T. & Cudmore, S. Innovations in oral gene delivery: Challenges and potentials. Drug Discov. Today 6, 92101 (2001). 9. Necas, J., Bartosikova, L., Brauner, P. & Kolar, J. Hyaluronic acid (hyaluronan): A review. Vet. Med. (Praha). 53, 397411 (2008). 10. Dawson, P. a, Lan, T. & Rao, A. Bile acid transporters. J. Lipid Res. 50, 234057 (2009). 11. Balakrishnan, A. & Polli, J. E. Apical sodium dependent bile acid transporter (ASBT, SLC10A2): A potential prodrug target. Mol. Pharm. 3, 223230 (2006). 12. Enhsen, A., Kramer, W. & Wess, G. Bile acids in drug discovery. Drug Discov. Today 3, 409418 (1998). 13. Khatun, Z., Nurunnabi, M., Reeck, G. R., Cho, K. J. & Lee, Y. K. Oral delivery of taurocholic acid linked heparin-docetaxel conjugates for cancer therapy. J. Control. Release 170, 7482 (2013). 14. Nichifor, M. & Carpov, A. Bile acids covalently bound to polysaccharides 1. Esters of bile acids with dextran. Eur. Polym. J. 35, 21252129 (1999). 15. Yoo, H. & Mok, H. Evaluation of multimeric siRNA conjugates for efficient protamine-based delivery into breast cancer cells. Arch. Pharm. Res. 38, 129136 (2015). 16. Mo, R., Jiang, T., DiSanto, R., Tai, W. & Gu, Z. ATP-triggered anticancer drug delivery. Nat. Commun. 5, 110 (2014). 17. Son, G. M. et al. Self-assembled polymeric micelles based on hyaluronic acid-g-poly(D,L-lactide-co-glycolide) copolymer for tumor targeting. Int. J. Mol. Sci. 15, 1605716068 (2014). 18. Wang, C. et al. Evaluation of CD44 and CD133 as cancer stem cell markers for colorectal cancer. Oncol. Rep. 28, 13011308 (2012).
본 발명자들은 종래의 RNAi 유전자침묵을 이용한 간암치료제의 문제점을 해결하기 위해, 핵단백질의 일종인 프로타민 단백질을 siRNA와 정전기적 인력으로 결합시켜 siRNA의 세포내 안정성을 향상시키고 이를 천연고분자인 히알루론산 (hyaluronic acid, HA)과 담즙산의 일종인 타우로콜린산(taurocholic acid, TCA)의 결합체로 코팅하여 경구투여가 가능하며 간암세포에 표적성이 있는 siRNA 나노전달체를 완성하였다.
본 발명의 목적은 siRNA - 프로타민 단백질 복합체; 및 (b) HA - TCA 결합체;를 포함하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 약제학적 유효량을 포함하는 간암치료용 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 제공한다.
(a) siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체; 및
(b) 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체는 직경이 100nm 이하이며 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체는 상기 siRNA와 상기 프로타민 단백질이 1:20 - 1:50 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, siRNA : 프로타민 단백질)로 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체는 음전하의 특성을 가지며 1:10 - 1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산 : 타우로콜린산)로 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 내부에 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체가 위치하고 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체의 표면에 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체가 코팅된 것을 특징으로 하며 상기 코팅은 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체와 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체가 1:30 - 1:50 범위의 첨가몰비(siRNA - 프로타민 단백질 복합체 : 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체)로 혼합하여 제조된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 음전하 특성을 가지며 직경이 250nm이하이고 상기 siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체의 봉입률이 90% 이상이며 간암세포 또는 간전이 암세포에 발현되는 히알루론산 수용체(CD44 receptor)에 표적성을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 약제학적 유효량을 포함하는 간암치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 제조방법을 제공한다.
(a) siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체를 제조하는 단계;
(b) 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체와 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체를 혼합하여 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 제조하는 단계.
본 발명은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 다음의 효과가 있다.
1) 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 생체안정성이 뛰어나고 간특이성 및 간암세포 및 간전이 암세포에서 발현되는 CD44 수용체 표적성을 가지고 있어 siRNA를 이용한 간암치료제로 사용될 수 있는 장점이 있다.
2) 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 타우로콜린산(TCA)-히알루론산(HA) 결합체를 포함하고 있어서 경구투여 후 위장관을 안전하게 통과하고 소장말단의 ABST를 통하여 흡수되어 장간순환을 통해 간으로 이동하는 장점이 있다.
3) 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 타우로콜린산(TCA)-히알루론산(HA) 결합체에 포함되어 있는 HA에 의하여 간암세포 또는 간전이 암세포에서 발현되는 CD44 수용체에 대한 표적성을 가지고 있어 siRNA를 이용한 간암치료제로 사용될 수 있는 효과가 있다.
4) 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 독성이 없는 핵단백질인 프로타민 단백질을 사용하여 siRNA-프로타민 단백질 복합체를 제조하므로 세포독성이 없고 엔도솜 탈출이 원활히 일어나 siRNA에 의한 유전자침묵(gene silencing) 치료효과가 뛰어난 장점이 있다.
도 1은 TCA, TCA-NPC 및 TCA-NH2에 대한 수소핵자기공명스펙트럼을 보여준다.
도 2는 HA와 TCA의 결합을 확인할 수 있는 수소핵자기공명스펙트럼을 보여준다. 패널 A)는 TCA, TCA-NPC 및 TCA-NH2의 합성과정, TCA-NH2와 HA와의 합성을 통한 HA-TCA 결합체의 제조과정을 화학식으로 보여주며 패널 B)는 HA-TCA 결합체의 수소핵자기공명 스펙트럼을 보여준다.
도 3은 프로타민 단백질이 siRNA를 봉입한 결과를 보여준다.
도 4는 siRNA-프로타민 단백질 복합체의 첨가몰비에 따른 나노입자(siRNA-프로타민 단백질 복합체)의 크기 및 제타포텐셜(zeta potential) 분석결과를 보여준다.
도 5는 siRNA-프로타민 단백질 복합체의 TEM 이미지를 보여준다.
도 6은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 TEM 이미지를 보여준다.
도 7은 pH 및 처리시간에 따른 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 크기 안정성 분석 결과를 보여준다.
도 8은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 혈액내 안정성을 보여준다.
도 9는 free siRNA와 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체에 대한 RNase 보호분석법 수행결과를 보여준다.
도 10은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 독성을 확인한 결과를 보여준다.
도 11는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 담즙산 수용체에 의한 세포 흡수를 확인결과를 보여준다.
도 12는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 CD44 수용체의 HA에 의한 세포흡수율 및 CLSM 이미지 분석 결과를 보여준다. 패널 A)는 MDA-MB-231 cell의 CLSM image (scale bar = 20 μm)를 보여주며 패널 B)는 세포흡수 강도를 보여주며 패널 C)는 HepG2 cell의 CLSM 이미지(scale bar = 20 μm)를 보여준다.
도 13은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체에 의해 세포내로 전달된 siRNA가 엔도솜으로부터 탈출하여 세포질에 존재하는 것을 확인한 결과를 보여준다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체; 및 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체;를 포함하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 제공한다.
본 발명의 siRNA는 유전자 침묵(gene silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 상기 siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹-다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자 치료 방법으로 제공될 수 있다. 본 발명의 siRNA는, 자기-상보성 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되므로 전체적으로는 스템-앤드-루프(stem-and-loop) 구조를 형성할 수 있다. 상기 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성 siRNA 분자를 생성할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 siRNA는 20 - 24mer일 수 있다.
본 발명의 프로타민 단백질은 핵단백질의 하나로 양전하를 띠는 단백질을 의미한다. 상기 핵단백질은 핵산과 결합하여 핵산을 안정화시키는 기능이 있다. 현재 가장 흔히 사용되는 siRNA의 안정화 물질은 양전하를 띠는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)이나 체내 독성이 있어 사용에 제한이 있는 단점이 있다. 이에 반하여 본 발명의 프로타민 단백질은 세포독성이 없으며 음전하를 띠는 세포막(엔도솜의 막)으로의 투과와 siRNA의 엔도솜 탈출(endosomal escape)을 증진시켜 siRNA가 안전하게 세포질로 방출될 수 있도록 하는 장점이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 프로타민 단백질은 프로타민 P1(protamine P1), 프로타민 1(protamine 1) 및 프로타민 2(protamine 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 두 가지 이상의 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 siRNA - 프로타민 단백질 복합체 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체는 상기 siRNA 와 상기 프로타민 단백질이 1:20 - 1:70 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, siRNA : 프로타민 단백질)로 혼합되어 제조되며 100nm이하의 크기를 가지고 있고 양전하 특성을 보이는 특징이 있다.
상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체의 직경이 100nm를 초과하면 하기 HA-TCA 결합체의 코팅으로 제조된 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 크기가 250nm를 초과하여 나노입자로서의 장점이 사라질 수 있으므로 이를 고려하여 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체의 직경이 100nm이하가 되도록 제조하는 것이 바람직하다. 또한 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체의 전하특성이 음전하를 띠게 되면 음전하를 띠는 HA-TCA 결합체와의 결합(코팅)이 어려운 단점이 있으므로 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체가 양전하를 띠도록 제조하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 siRNA - 프로타민 단백질 복합체는 1:1 - 1:70 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, siRNA : 프로타민 단백질)로 혼합되어 제조될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 siRNA - 프로타민 단백질 복합체는 1:10 - 1:40 범위의 첨가몰비로 혼합되어 제조될 수 있으며 보다 바람직하게는 1:20 범위의 첨가몰비로 혼합되어 제조될 수 있다.
상기 siRNA : 프로타민 단백질 첨가몰비가 1:1 미만이면 siRNA - 프로타민 단백질 복합체의 전하가 음전하를 가질 수 있으며 1:70을 초과하면 siRNA - 프로타민 단백질 복합체의 직경이 100nm를 초과하거나 독성이 있을 수 있다.
본 발명의 히알루론산(hyaluronic acid)은 아미노산과 우론산으로 이루어지는 복잡한 다당류의 하나로 세포독성이 없는 천연고분자물질이며 체내 안정성이 뛰어나고 상기 히알루론산을 흡수할 수 있는 다양한 수용체가 존재하는 장점이 있다. 체내에 존재하는 히알루론산 수용체 중 CD44 수용체는 대부분의 암세포에 과발현되는 수용체로서 암을 선택적으로 표적하는 치료제의 타겟으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 간암세포 또는 간전이 암세포에 발현되는 히알루론산 수용체(CD44 receptor)에 표적성을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 타우로콜린산은 담즙산의 일종으로 체내에서 분비되어 소화과정 중 지질 또는 비타민의 흡수를 돕는 물질로 알려져 있으며 장간 순환을 통해 90%이상 재흡수되는 특징이 있다. 상기 타우로콜린산은 소화과정에서 소장 말단에서 ASBT (Apical Sodium dependent Bile acid Transporter)에 의하여 대부분이 흡수된다. 따라서 타우로콜린산을 히알루론산에 결합하여 나노전달체를 제조하면 소장에서의 경구 흡수율을 향상시킬 수 있으며 장간 순환을 통한 간전달성이 향상되는 장점이 있다(도 14 참조).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체를 제공한다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 본 발명의 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1 - 1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산 : 타우로콜린산)로 혼합되어 제조되며 음전하를 띠는 특징이 있다.
상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체가 양전하의 특성을 띠면 양전하의 특성을 가지는 siRNA-프로타민 단백질 결합체와 결합할 수 없는 단점이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1 - 1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산 : 타우로콜린산)로 혼합하여 제조할 수 있다. 바람직하게는 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1 - 1:50 범위의 첨가몰비로 혼합하여 제조할 수 있으며 보다 바람직하게는 1:10 범위의 첨가몰비로 혼합하여 제조할 수 있다.
상기 히알루론산과 타우로콜린산을 1:1 범위 미만의 첨가몰비로 혼합하여 제조하면 siRNA-프로타민 단백질 복합체를 코팅하는데 효율적이지 않으며 상기 히알루론산과 타우로콜린산을 1:100 범위를 초과한 첨가몰비로 혼합하여 제조하면 결합비율이 유사한 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체만이 만들어지므로 경제적으로 효율적이지 않다.
본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 상기 siRNA-프로타민 단백질 복합체가 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체에 의해 코팅된 형태를 가진다.
상세하게는 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 내부에 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체가 위치하고 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체의 표면에 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체가 코팅된 형태를 가지며 음전하의 특성을 가지고 나노전달체의 직경이 250nm 이하이며 상기 siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체의 봉입률이 90% 이상인 특징이 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 코팅은 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체와 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체가 1:10 - 1:80 범위의 첨가몰비(siRNA - 프로타민 단백질 복합체 : 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체)로 혼합하여 수행할 수 있다. 바람직하게는 상기 코팅은 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체와 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체가 1:20 - 1:60 범위의 첨가몰비로 혼합하여 수행할 수 있으며 보다 바람직하게는 1:40 범위의 첨가몰비로 혼합하여 수행할 수 있다. 상기 코팅이 1:10 범위의 첨가몰비(siRNA - 프로타민 단백질 복합체 : 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체) 미만으로 혼합하여 수행되면 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 생체안정성 및 간암표적성이 저하되며 상기 코팅이 1:80 범위의 첨가몰비를 초과하여 수행되면 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 직경이 250nm를 초과하여 나노입자로서의 장점이 사라질 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 약제학적 유효량을 포함하는 간암치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 약제학적 유효량은 핵산 전달체의 간질환 치료를 위해 효과적이며 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001 - 1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구용으로 투여되며 상기 조성물에 포함되는 활성성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정하며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 제조방법을 제공한다.
(a) siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체를 제조하는 단계;
(b) 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체와 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체를 혼합하여 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 제조하는 단계.
보다 상세하게는 다음의 단계를 통해 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체가 제조될 수 있다.
(a) siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체를 제조하는 단계
(1) 프로타민 설페이트(protamine sulfate)를 0.1% 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC) 처리 용액에 용해시켜 프로타민 수용액을 제조하는 단계;
(2) siRNA 수용액을 상기 프로타민 수용액에 1:1의 부피비로 첨가하고 혼합하여 siRNA - 프로타민 수용액을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 siRNA - 프로타민 수용액을 상온에서 30분간 안정화시키는 단계.
(b) 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체를 제조하는 단계
(1) 타우로콜린산(taucholic acid, TCA)을 디메틸폼아마이드 (dimethylformamide, DMF)에 용해시키고 상온에서 5분 동안 교반하여 TCA 용액을 제조하는 단계;
(2) 상기 TCA 용액에 4-니트로페닐 클로로포르메이트(4-Nitrophenyl chloroformate , 4-NPC)을 첨가하고 혼합하여 TCA-NPC 용액을 제조하는 단계;
(3) 상기 TCA-NPC 용액에 트리에틸렌아민(Triethylamine, TEA)을 첨가하여 TCA-NPC-TEA 반응용액을 제조하고 상온에서 6시간동안 반응시켜 TCA-NPC 복합체를 제조하는 단계;
(4) 상기 TCA-NPC 복합체가 포함된 TCA-NPC-TEA 반응용액을 원심분리하여 TCA-NPC 복합체 펠릿만을 수득하는 단계;
(5) 상기 TCA-NPC 복합체 펠릿을 증류수 - 에틸아세테이트(ethyl acetate) 혼합액으로 액-액 분리하여 TCA-NPC 복합체가 포함된 증류수층만을 수득하는 단계;
(6) 상기 TCA-NPC가 포함된 증류수를 회전증발 및 동결건조하여 TCA-NPC 복합체 분말을 수득하는 단계;
(7) 상기 TCA-NPC 복합체 분말을 50℃에서 DMF에 용해시켜 TCA-NPC 복합체 용액을 제조하는 단계;
(8) 상기 TCA-NPC 복합체 용액을 50℃로 조절한 후 4-메틸모르포린(4-methylmorpholine)을 첨가하고 1시간동안 교반한 후 에틸렌디아민(ethylenediamine)을 첨가하고 상온에서 16시간 동안 반응시켜 TCA-NH2 결정을 수득하는 단계;
(9) 히알루론산(hyaluronic acid, HA)를 증류수에 녹인 후 카보디이미디히드로클로라이드(carbodiimidehydrochloride, EDC)을 첨가하여 HA를 활성화 시키는 단계;
(10) 상기 활성화된 HA 용액에 N-히드록시숙시니미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 첨가하고 상온에서 10분간 교반하여 HA-NHS 용액을 제조하는 단계;
(11) 상기 TCA-NH2 결정을 용해시킨 TCA-NH2 수용액과 상기 HA-NHS 용액을 혼합하고 24시간동안 교반하여 HA-TAC 용액을 제조하는 단계; 및
(12) 상기 HA-TCA 용액을 증류수로 투석한 후 상기 투석이 끝난 HA-TCA 용액을 동결건조하여 HA-TCA 분말을 수득하는 단계;
(c) 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체와 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체를 혼합하여 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 제조하는 단계
(1) 상기 HA-TCA 분말을 0.1% 디에틸피로카보네이트(diethylpyrocarbonate, DEPC) 처리 용액에 용해시켜 HA-TCA 용액을 제조하는 단계;
(2) 상기 HA-TCA 용액과 상기 안정화된 siRNA - 프로타민 수용액을 혼합하여 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 제조하는 단계; 및
(3) 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체가 포함된 용액을 상온에서 30분간 안정화시킨 후 동결건조하여 간암표적성 siRNA 나노전달체 분말을 제조하는 단계.
실시예
1. 실험방법
1) siRNA -프로타민 단백질 복합체의 제조
양전하를 띠는 프로타민 설페이트(protamine sulfate)는 0.1% DEPC 처리 용액에 용해시키고 음전하를 띠는 0.1 nmol siRNA를 1:1 부피비로 첨가한 후 혼합하였다. 상기 siRNA-프로타민 설페이트 혼합용액은 30분간 상온에서 안정화시켰다. 상기 반응은 siRNA와 프로타민 단백질이 1:1, 1:10, 1:20 또는 1:50의 첨가몰비(feed mole ratio, siRNA : 프로타민 단백질)가 되도록 혼합되어 수행되었다. 상기 siRNA는 5’-GUCCAGUUUCCCAGGAAUCCU None-3’(염기수: 22 mer)을 사용하였다.
2) 히알루론산-타우로콜린산 결합체의 제조
(1) 활성화 타우로콜린산의 합성
활성화 타우로콜린산(taurocholic acid, TCA)의 합성을 위해 1mol의 TCA를 디메틸폼아마이드(dimethylformamide, DMF)에 용해 시킨 후 TCA 용액을 0-4 ℃의 온도범위로 조절한 후 5 mol의 4-니트로페닐 클로로포르메이트(4-Nitrophenyl chloroformate, 4-NPC)를 첨가하였다. 상기 4-NPC을 모두 용해시킨 후 용액의 색이 노란색으로 변할 때까지 6 mol의 트리에틸렌아민(Triethylamine, TEA)을 한 방울씩 천천히 첨가하고 1시 간동안 혼합하여 TCA-NPC-TEA 반응용액을 제조였다. 상기 제조한 TCA-NPC-TEA 반응용액을 상온에서 6시간 동안 교반시켜 TCA-NPC 복합체를 제조하였다. 상기 반응이 완료된 TCA-NPC-TEA 반응용액을 4500rpm의 속도로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤 TCA-NPC 복합체 펠릿을 수득하였다. 상기 수득된 TCA-NPC 복합체 펠릿은 증류수와 에틸아세테이트(ethyl acetate)가 1:1 부피비로 혼합된 수용액을 이용하여 TCA-NPC 복합체 펠릿을 포함한 용액의 노란색이 사라질 때까지 액-액 추출을 수행함으로서 불순물을 제거하였다. TCA-NPC 복합체는 수용성으로 추출 후 얻어진 증류수 층에 존재한다. 상기 TCA-NPC 복합체가 포함된 증류수층은 회전증발을 이용해 유기용매를 제거한 뒤 동결건조를 수행하여 파우더 형태의 TCA-NPC 복합체를 수득하였다. 상기 수득된 TCA-NPC 복합체 분말을 DMF에 완전히 용해시킨 후 상기 TCA-NPC 복합체 용액의 온도를 50℃로 조절하였다. 상기 온도가 50℃로 조절된 TCA-NPC 복합체 용액에 2mol의 4-메틸모르포린(4-methylmorpholine, 4-MMP)을 첨가하고 동일 온도 분위기에서 1시간 동안 교반한 후 25mol의 에틸렌디아민(ethylenediamine, EDA)을 한 방울씩 떨어트려 천천히 반응시켰다. 상기 반응은 상온에서 16시간 동안 수행하였으며 반응이 완료된 용액은 TCA-NH2 결정을 얻기 위하여 아세톤을 첨가하여 TCA-NH2 결정을 침전시켰다. 상기 침전된 TCA-NH2 결정은 12000 rpm의 속도로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 후 TCA-NH2 결정을 수득하였으며 상기 수득된 TCA-NH2 결정은 증류수에 다시 녹여 동결 건조하여 분말의 형태로 수득하였다. 상기 동결건조를 통해 수득한 TCA-NH2 결정은 4℃ 냉장고에 보관하였다.
(2) 활성화 타우로콜린산의 확인
상기 과정을 통해 제조한 활성화 TCA(TCA-NH2)를 D2O 용매 (10 mg/ml)에 용해시킨 후 수소핵자기공명(1H-NMR)을 수행하여 TCA-NH2의 화학구조를 분석함으로서 TCA-NH2가 성공적으로 합성되었음을 확인하였다. 또한 TCA-NH2의 아민화 정도를 확인하기 위하여 아민기의 정량방법인 TNBSA(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid) assay를 수행하였다.
(3) 히알루론산(hyaluronic acid)과 타우로콜린산의 결합체 제조
1 mol의 히알루론산(hyaluronic acid, HA)를 증류수에 완전히 용해시켜 HA 용액을 제조하고 상기 HA용액의 온도를 0-4℃로 조절하였다. 상기 HA 용액에 12 mol의 카보디이미디히드로클로라이드(carbodiimidehydrochloride, EDC)를 첨가하고 상온에서 5분 동안 교반하여 활성화 HA를 제조하였다. 상기 활성화된 HA를 포함하는 용액에 12mol의 N-히드록시숙시니미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)를 넣어주고 10분 동안 교반시켜 HA-NHS 용액을 제조하였다. 상기 HA-NHS 용액에 상기 제조한 TCA-NH2 10 mol이 포함된 TCA-NH2 용액을 첨가하여 HA-TCA 반응용액을 제조한 후 24시간 동안 상온에서 교반하여 HA-TCA 결합체를 합성하였다. 상기 HA-TCA 결합체의 합성은 HA와 TCA의 첨가몰비(feed mole ratio)가 1:10, 1:50 및 1:100이 되도록 수행하였다. HA-TCA 합성반응이 완료된 HA-TCA 반응용액은 증류수에서 막여과(membrane filter MWCO: 1000 Da)를 이용하여 24시간동안 투석하였다. 상기 투석이 끝난 HA-TCA 반응용액은 동결건조를 수행하여 HA-TCA 분말을 수득하였다. 상기 수득한 얻어진 HA-TCA 분말은 4℃ 냉장고에 보관하였다.
(4) HA-TCA 결합체의 확인
상기 합성된 HA-TCA 결합체를 D2O 용매(10 mg/ml)에 용해시켜 수소핵자기공명(1H-NMR)을 수행하여 화학구조를 분석하였다. 또한 HA와 TCA의 결합비율은 황산법(sulfuric acid method)를 통해 확인하였다. 상기 황산법은 HA 및 HA-TCA (60 mg/ml)를 증류수에 용해시켜 황산과 혼합하여 황산반응용액을 제조한 후 상기 용액을 80℃에서 3분간 처리하고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용해 420 nm에서의 흡광도를 측정하는 방법으로 수행하였다.
3) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 제조
상기 안정화시킨 siRNA-프로타민 설페이트 혼합용액과 0.1% DEPC 처리 용액에 용해시킨 HA-TCA 결합체를 혼합하고 상온에서 30분간 안정화시켰다. 상기 siRNA-프로타민 설페이트 혼합용액은 siRNA와 프로타민 단백질의 첨가몰비가 1:1, 1:10, 1:20 또는 1:50인 조건에서 제조된 siRNA-프로타민 단백질 복합체 중 하나를 포함된 용액을 사용하였으며 상기 HA-TCA 결합체는 HA와 TCA의 첨가몰비가 1:10, 1:50 또는 1:100인 조건에서 제조된 HA-TCA 결합체 중 하나를 사용하였다.
4) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 특성분석
(1) siRNA와 프로타민 단백질의 결합 확인
siRNA와 프로타민 단백질의 결합확인은 1% 아가로스 겔 (agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 측정하였다. siRNA는 0.5 μg/ml의 에티듐브로마이드(ethidium bromide, Etbr)을 이용해 염색하였으며, 1x TBE buffer를 이용해 80Volt 조건에서 20분 동안 전기영동을 수행하였다.
(2) 나노입자의 물리적 특성 및 siRNA의 봉입확인
상기 제조된 siRNA/프로타민 단백질(sRP) 복합체와 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체(siRNA/protamine/HA-TCA 나노전달체, HTsRP-NCs)에 대하여 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)을 이용하여 나노입자의 크기(size)를 측정하였으며; 제타콤팩드(Zeta compact)를 이용하여 제타포텐셜(zeta potential) 측정하였다. 또한 나노입자의 크기 및 모양을 투과 전자현미경(transmission electron microscope, TEM) 이미지를 통해 측정하였다. HTsRP-NCs 의 경우 TEM 이미지 측정 시, 우라닐아세테이트(uranyl acetate)로 염색 처리 후 측정하였다. 상기 나노입자들의 siRNA의 봉입률은 전기영동 후 Etbr에 의한 siRNA의 표지방법을 이용해 봉입되지 않은 잔여 siRNA의 양을 마이크로플레이트 리더를 이용하여 300 nm에서의 흡광도를 측정하여 산출하였다.
(3) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 안정성 확인
경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체에 봉입된 siRNA의 안정성을 확인하기 위하여 크기(size) 안정성 및 혈청(serum) 안정성 및 RNase 보호성(protection)을 확인하였다. 상기 크기 안정성에 대한 평가는 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 다양한 pH (pH 1.2, 5.6, 7.4)의 조건의 용액과 혼합한 후 시간에 따른 나노전달체의 크기변화를 측정하는 방법으로 수행하였다. 상기 혈청안정성은 free siRNA와 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 50% serum이 함유된 용액에서 37℃의 온도조건으로 24시간 동안 처리를 한 후 전기영동을 수행하여 확인하였다. 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 RNase 보호성은 RNase 보호분석법(RNase protection assay)을 이용하였으며 37℃에서 12시간 동안 0.005 μg/μl의 RNase을 처리한 후 RNase에 의한 siRNA의 분해정도를 평가하여 수행하였다.
(4) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 세포독성분석
경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 독성을 평가하기 위하여 MDCK 세포에서 MTT proliferation assay을 수행하였다. 96-well plate에 MDCK 세포를 1 x 104의 농도로 seeding한 후, 24시간 동안 37℃, 5% CO2 분위기에서 인큐베이션 하였다. 상기 배양된 MDCK 세포에 다양한 농도의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 첨가한 후 배지를 제거하고 MTT solution (5 mg/ml)을 넣어준 후 4시간 동안 인큐베이션 하였다. 인큐베이션 후 DMSO를 추가로 넣어 주어 590 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
(5) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 세포흡수 실험
경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 CD44 수용체 매개 및 담즙산 수용체에 의한 세포흡수정도를 평가하기 위하여 MDA-MB-231, HepG2, MDCK 및 MDCK-ASBT 세포를 이용하여 실험을 수행하였다. MDA-MB-231, MDCK, MDCK-ASBT 세포는 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지에서 배양하였으며, HepG2 세포는 20% FBS가 포함된 MEM 배지 (25 nM MES, 25 nM HEPES)에서 배양하였다. 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 세포흡수 여부는 레이저현미경(confocal laser scanning microscope, CLSM) 이미지 분석과 형광측정을 통하여 수행하였다. 이를 위하여 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 Rhodamine B가 결합된 Proamine (Rhod-Prot)을 이용하여 제조하였다.
(6) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 엔도솜 탈출(endosomal escape) 확인
경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 엔도솜 탈출분석은 FAM-siRNA (green), Lysotracker (deep red)을 CLSM으로 촬영한 이미지를 분석하여 수행하였다. 이를 위하여 HepG2 세포를 96-well plate에서 1 x 104 cell/well의 농도로 seeding한 후 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양한 HepG2 세포에 100 nM FAM-siRNA가 봉입된 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 투여한 후 0.5시간, 2시간, 또는 4시간 동안 배양하였다. 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체가 투여하여 배양한 HepG2 세포에 25 nM의 Lysotracker를 20분 동안 처리하고 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 세포를 고정 시킨 후 CLSM 이미지를 분석하였다.
2. 실험결과
1) HA- TCA 결합체의 제조
HA와 TCA를 결합하기 위해 먼저 TCA를 활성화시켜 NH2 기를 형성하였다. TCA의 활성 확인은 수소핵자기공명법과 TNBSA assay를 통해 확인하였다.
도 1은 TCA, TCA-NPC 및 TCA-NH2에 대한 수소핵자기공명스펙트럼을 보여준다. 상기 도 1의 스펙트럼에는 8ppm에서 확인되는 NH2 피크(peak)와 0.5~1.5ppm에서 확인되는 TCA moiety의 양성자 피크가 확인되며 이를 통하여 TCA-NH2가 성공적으로 합성되었음을 확인하였다.
도 2는 HA와 TCA의 결합을 확인할 수 있는 수소핵자기공명스펙트럼을 보여준다. HA-TCA 결합체는 TCA의 NH2기와 HA의 활성화된 COOH기가 아마이드 결합을 통해 합성된 것이 확인되었다. 도 2의 수소핵자기공명스펙트럼에서는 2ppm에서 확인되는 HA의 N-Acetyl-D-Glucosamine의 -NH기 피크(스펙트럼에서 2로 표시)를 기준으로 8ppm에서 확인되는 TCA의 NH2기와 HA의 활성화된 COOH기에 의한 아마이드 결합의 피크(스펙트럼에서 1로 표시) 및 0.5~1.5 ppm 부근에서 확인되는 TCA moiety의 피크가 확인되었다.
표 1은 HA-TCA 결합체의 황산법(sulfuric acid method) 분석결과를 보여준다.
시료명 첨가몰비
(Feed mole ratio, HA : TCA)		 결합몰비
(Binding mole ratio)
HA-TCA 10 1 : 10 8.6
HA-TCA 50 1 : 50 9.6
HA-TCA 100 1 : 100 13.3
표 1에는 활성화된 HA와 활성화된 TCA의 첨가몰비(feed mole ratio)를 1:10, 1:50 및 1:100으로 조절하여 제조한 HA-TCA 결합체의 HA-TCA 결합몰비(binding mole ratio)를 보여준다. HA와 TCA의 첨가몰비(HA:TCA)를 1:10, 1:50, 1:100으로 증가시킨 경우 HA와 TCA의 결합몰비는 각각 8.6, 9.6, 13.3으로 점차 증가한 것이 확인 되었다. 상기 실험결과, HA-TCA 결합체의 HA-TCA 결합몰비는 첨가몰비의 증가에 비해 큰 차이가 없으므로 가장 효율적으로 결합하는 첨가몰비 1:10 조건에서 제조된 HA-TCA 결합체(결합몰비 HA : TCA = 1 : 8.6)를 선택하여 siRNA/프로타민 단백질 복합체의 코팅에 이용하였다.
2) siRNA-프로타민 단백질 복합체의 제조
siRNA-프로타민 단백질 복합체의 제조는 양전하의 프로타민 설페이트(Protamine sulfate)와 음전하의 siRNA를 혼합하여 정전기적 상호작용에 따라 나노입자 형태의 siRNA-프로타민 단백질 복합체를 형성한다. 형성된 siRNA-프로타민 단백질 복합체는 안정화를 위해 30분간 상온에서 배양하였으며 프로타민 설페이트와 siRNA의 혼합을 위한 용매는 siRNA의 분해를 방지하기 위해 DEPC 처리된 RNase-free 용매를 사용하였다. 프로타민 설페이트는 아르기닌(arginine)이 풍부한 양전하를 띠는 펩타이드로, 종래의 siRNA 전달체인 PEI와 비교하여 독성이 없으며, 음전하의 세포 표면의 투과를 증진시킬 수 있는 장점이 있다.
도 3은 프로타민 단백질이 siRNA를 봉입한 결과를 보여준다. 프로타민 단백질의 siRNA 봉입결과를 확인하기 위하여 siRNA와 프로타민 설페이트의 첨가몰비(feed mole ratio)에 따라 제조된 siRNA-프로타민 단백질 복합체의 전기영동상 밴드의 이동정도를 확인하였다. 첨가몰비(siRNA : 프로타민 단백질) 1:1의 조건에서 제조된 siRNA-프로타민 단백질 복합체의 경우 siRNA와 프로타민 단백질간의 정전기전 인력(charge-charge interaction)이 약하여 전기영동 상에서 siRNA가 방출되는 것이 확인되었으나 첨가몰비(siRNA : 프로타민 단백질) 1:5, 1:10, 1:20, 1:50의 조건에서 제조된 siRNA-프로타민 단백질 복합체의 경우 siRNA와 프로타민 단백질간의 정전기전 인력이 증가하여 전기영동 상에서 siRNA가 방출되지 않는 것이 확인되었다. 따라서 siRNA의 봉입율은 프로타민 단백질의 첨가량에 비례하여 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 또한 siRNA-프로타민 단백질 복합체의 크기(size)는 프로타민 단백질의 첨가량이 증가할수록 감소하였으며 siRNA-프로타민 단백질 복합체의 제타포텐셜(zeta potential)은 이와 반대로 프로타민 단백질의 첨가량이 증가할수록 positive value가 증가하는 것을 확인하였다. 이는 양전하를 띠는 프로타민 단백질의 영향으로 프로타민 단백질의 첨가량이 증가할수록 siRNA와 강하게 반응하여 더욱 안정한 나노입자 형태를 형성한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 제조하기 위해서는 siRNA-프로타민 단백질 복합체가 양전하를 띠고 있어 음전하를 띠고 있는 HA-TCA 결합체와 결합할 수 있어야 하며 결합시 증가할 수 있는 나노전달체의 크기를 고려하여 100 nm이하의 크기를 가지는 것이 바람직하다 .
상기 제조한 siRNA-프로타민 단백질 복합체에 대하여 TEM 이미지분석과 DLS 크기분석 및 제타포텐셜 분석을 수행한 결과(도 4 참조), 첨가몰비 1:20 및 1:50으로 제조한 siRNA-프로타민 단백질 복합체가 100 nm이하의 크기로 분포하였으며 양전하를 띠고 있는 것이 확인되었다. 그 중 1:20 첨가비율로 제조한 siRNA-프로타민 단백질 복합체를 HA-TCA 결합체 코팅을 위해 사용하였다.
3) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 제조
경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 양전하의 siRNA-프로타민 단백질 복합체와 음전하를 띠는 HA-TCA 결합체의 첨가몰비(feed mole ratio)에 따라 제조하였다. 표 2는 HA-TCA 결합체의 첨가량이 증가함에 따른 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체(HTsRP)의 크기와 제타포텐셜(zeta potential) 및 siRNA 봉입율(%)을 보여준다. 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 크기는 HA-TCA 결합체의 첨가량에 비례하여 증가한 것이 확인되었으며 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 제타포텐셜은 음전하(negative charge)로 확인되었다. 또한 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 siRNA 봉입율은 모든 비율에서 90%이상을 보이는 것이 확인되었다.
시료 첨가몰비
(feed mole ratio, nmol)		 크기
(diameter, nm)		 제타포텐셜 [mV] 봉입률 (%)
siRNA-프로타민 단백질 복합체 HA-TCA 결합체
HTsRP 2 1 2.0 138 ± 5 -5.88 ± 0.6 97.0
HTsRP 10 1 10.0 208 ± 2.5 -12.1 ± 0.2 96.5
HTsRP 20 1 20.0 237 ± 13 -16.0 ± 0.2 95.1
HTsRP 40 1 40.0 246 ± 6 -19.5 ± 0.1 92.4
* siRNA-프로타민 단백질 복합체는 1:20의 첨가몰비(siRNA : 프로타민 단백질)로 혼합하여 제조한 것임
상기 결과는 HA-TCA 결합체가 양전하를 띠는 siRNA-프로타민 단백질 복합체와 강하게 반응하여 siRNA-프로타민 단백질 복합체의 표면에 코팅되므로 siRNA를 안전하게 보호해주는 역할을 할 수 있다는 것을 의미한다.
경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 제조에 사용된 HA-TCA 결합체의 첨가몰비는 HA 수용체인 CD44와 담즙산(bile acid) 수용체를 효과적으로 타켓팅 할 수 있는 1:40을 선택하였다. 도 6은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 TEM 이미지를 보여준다. 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 siRNA는 우라닐아세테이트(uranyl acetate)로 염색하여 확인하였으며 나노전달체의 크기 또한 250 nm로 DLS로 측정한 크기 값과 일치하는 것을 확인하였다.
4) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 체내 안정성 평가
경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 siRNA 안정성을 확인하기 위해 pH에 따른 크기변화 측정, 체내 혈청 안정성 평가 및 RNase 보호성 평가를 수행하였다. 먼저 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 이용한 siRNA의 경구 투여를 위해 체내의 위장관 및 혈액의 pH에 따른 안정성을 평가하였다. 이를 위하여 실험군으로서 위장관과 혈액의 pH인 pH 1.2, pH 5.6, pH 7.4을 사용하였으며 대조군으로서 RNase inhibitor인 DEPC를 처리한 용액을 사용하였다(도 7참조). 상기 조건에서 12시간동안 처리한 후 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 크기를 측정한 결과 전달체 크기의 변화는 거의 없었으며 이는 siRNA 나노전달체가 강산성의 위산과 소장 및 혈액에서 모두 안정하다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 위장관에서 분해되지 않고 일정크기를 어느 정도 유지하면서 소장으로 이동하고 흡수되어 혈액으로 이동할 수 있다는 것을 의미한다.
도 8은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 혈액내 안정성을 보여준다. 이를 위하여 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 24시간동안 50% 혈청(serum)을 처리하고 이에 따른 siRNA 분해정도를 전기영동을 통해 확인하였다. 대조군인 Free siRNA의 경우 2시간 안에 모든 siRNA가 혈청에 의해 분해되는 반면에 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 경우 24시간 동안 혈청에서 처리함에도 불구하고 siRNA가 혈청에 의해 분해되지 않는 것이 확인되었다.
경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체가 RNA를 분해하는 효소인 RNase에 분해되는지 여부를 확인하기 위해 RNase 보호분석법(RNase protection assay)를 수행하였다. 도 9는 free siRNA와 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체에 대한 RNase 보호분석법 수행결과를 보여준다. 실험결과 free siRNA는 0.5시간 만에 RNase에 의해 분해되었으나, 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체에 봉입된 siRNA는 1시간 이상 RNase에 의해 분해되지 않는 것을 확인하였으며 추가적인 실험을 통해 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체에 봉입된 siRNA가 12시간이상 RNase에 의해 분해되지 않는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 위장관 및 혈액 내에서 안정하므로 siRNA를 target-site까지 전달할 수 있다는 것을 의미한다.
5) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 확인
도 10은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 독성을 확인한 결과를 보여준다. 실험결과, 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 배양한 MDCK 세포에 처리한 결과 상기 세포 생존율이 80%이상의 값을 보였다.
도 11은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 담즙산 수용체에 의한 세포 흡수를 확인결과를 보여준다. TCA는 담즙산의 일종으로 담즙산 수용체에 의한 장간순환이 가능한 물질로 약물의 체순환(systemic circulation)을 증가시키며, 소장 말단 부분에서의 ASBT (Apical Sodium Dependent Bile Acid Transporter)에 의해 경구흡수를 증진시키는 장점이 있다. MDCK-ASBT세포는 ASBT가 수용체가 과발현된 세포로 MDCK 세포를 대조군으로 사용하였으며 시간에 따른 세포흡수는 Rhodamine B가 결합된 프로타민 단백질의 형과을 측정하여 분석하였다. 실험결과 ASBT가 발현되지 않은 MDCK세포에서는 siRNA-프로타민 단백질 복합체, siRNA-프로타민 단백질 복합체+HA 전달체 및 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체(siRNA-프로타민 단백질 복합체+HA+TCA)의 세포 흡수 정도가 큰 차이가 없었으나, MDCK-ASBT세포에서는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체가 다른 샘플군보다 확연이 높은 것을 확인하였으며 시간이 경과할수록 더욱더 증가하는 것을 확인하였다(도 11 참조). 또한 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체가 MDCK-ASBT세포의 ASBT 수용체에 의해 흡수되었는지를 확인하기 위하여 TCA를 고농도로 전처리한 후 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 흡수를 확인한 결과 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 MDCK-ASBT세포흡수가 확연히 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 따라서 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 세포독성이 매우 낮으며 소장말단을 통해 장간 순환으로 진입하는 것으로 확인되었다.
6) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 세포독성 및 간암표적성 확인
HA는 체내에 여러 HA 수용체가 있으며, CD44 수용체의 경우 대부분의 암세포에서 과발현되어 있어 약물을 전달할 때 암세포 표적이 용이하다. 도 12는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 CD44 수용체의 HA에 의한 세포흡수율 및 CLSM이미지 분석 결과를 보여준다. 실험에 사용한 세포주(cell line)는 CD44 positive cell인 MDA-MB-231 세포 및 HepG2 세포를 사용하였다. 대조군으로서 프로타민 단백질만을 사용한 경우와 실험군으로서 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 사용한 경우 간암표적성 siRNA 나노전달체가 프로타민에 비하여 월등히 높은 흡수율을 보였으며 HA를 고농도로 전처리하여 CD44 수용체를 block 시킨 후 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 흡수율을 확인하는 방법으로 HA에 특이적인 세포흡수정도를 확인한 결과 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 흡수율이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다. 본 실험에 사용한 MDA-MB-231 세포는 CD44 수용체의 높은 발현에 의해 주로 HA의 흡수실험에 많이 쓰이는 세포주이며 HepG2 세포의 경우 원발성 간암세포로 CD44 수용체가 발현되는 것으로 알려져 있다. 또한 간전이 암세포인 HCT-116 세포 또한 CD44 수용체가 16.4% 정도 발현되는 특성을 가지고 있다. 따라서 HA 특이적으로 세포에 흡수되는 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 원발성 간암 또는 간전이 암 모두에 적용되어 siRNA를 이용한 간암표적형 치료제로서 사용 될 수 있다.
7) 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 엔도솜 탈출 확인
엔도솜 탈출(endosomal escape)은 효율적인 siRNA의 세포전달에 있어 매우 중요한 문제이다. 세포내로 진입한 siRNA는 리소좀에 의해 분해되는데 이를 예방하고 siRNA가 RNAi 메커니즘에 참여하여 기능을 발현하기 위해서는 반드시 엔도솜을 탈출하여 세포질에 발산되는 siRNA의 양이 충분해야 한다.
도 13은 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체에 의헤 세포내로 전달된 siRNA가 엔도솜으로부터 탈출하여 세포질에 존재하는 것을 확인한 결과를 보여준다. 본 발명의 프로타민 단백질은 핵단백질 특성을 가지고 있어 siRNA의 엔도솜 탈출을 향상시키는 장점이 있다. 이를 확인하기 위하여 FAM-siRNA (green), Lysotracker (red)에 대한 CLSM 이미지 분석을 통해 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 siRNA(또는 siRNA-프로타민 단백질 복합체)에 대한 시간에 따른 엔도솜 탈출정도를 확인하였다. 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체를 HepG2 세포에 처리하고 0.5시간, 2시간, 4시간 후 HepG2 세포에 대해 FAM-siRNA (green), Lysotracker (red)에 대한 CLSM 이미지를 분석하여 siRNA의 세포 흡수 과정을 확인하였다. 처리 후 0.5시간 동안 배양한 경우 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체가 엔도솜(endosome)을 형성하여 세포질 내로 흡수된 것을 확인하였으며, 처리 후 2시간동안 배양한 경우 흡수된 간암표적성 siRNA 나노전달체에 봉입된 대부분의 siRNA가 성공적으로 엔도솜을 탈출하여 세포질 내로 방출된 것이 확인되었다. 처리 후 4시간 동안 배양한 경우 대부분의 siRNA가 유전자침묵(gene silencing) 작용을 수행하여 작은 분자로 쪼개진 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 세포내로 흡수된 후 성공적으로 엔도솜을 탈출하여 세포질내로 방출되는 것이 확인되었다. 정리하면 상기결과는 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체가 간암 세포인 HepG2 세포와 접촉하여 엔도솜을 형성하므로 성공적으로 세포내 흡수가 이루어졌으며 대부분의 siRNA가 리소좀에서 분해되지 않고 프로타민 단백질의 핵단백질 기능에 의하여 세포질 내로 성공적인 엔도솜 탈출이 일어난 것을 시사하며, 세포질 내로 방출된 siRNA 또한 안정적으로 RNAi에 의해 gene silencing이 일어나므로 간암치료에 효과적일 것으로 판단된다.
3. 결론
본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 다음의 효과가 있다.
1) 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 생체안정성이 뛰어나고 간(liver) 및 CD44 수용체 표적성을 가지고 있어 siRNA를 이용한 간암치료제로 사용될 수 있는 장점이 있다.
2) 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 타우로콜린산(TCA)-히알루론산(HA) 결합체를 포함하고 있어서 경구투여 후 위장관을 안전하게 통과하고 소장말단의 ABST를 통하여 흡수되어 장간순환을 통해 간으로 이동하는 장점이 있다.
3) 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 타우로콜린산(TCA)-히알루론산(HA) 결합체에 포함되어 있는 HA에 의하여 간암세포 또는 간전이 암세포에서 발현되는 CD44 수용체에 대한 표적성을 가지고 있어 siRNA를 이용한 간암 및 간 전이암 치료제로 사용할 수 있는 효과가 있다.
4) 본 발명의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 독성이 없는 핵단백질인 프로타민 단백질을 사용하여 siRNA-프로타민 단백질 복합체를 제조하므로 세포독성이 없고 엔도솜 탈출이 원활히 일어나 siRNA에 의한 유전자침묵(gene silencing) 치료효과가 뛰어난 장점이 있다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

Claims (14)

  1. (a) siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체; 및
    (b) 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체;
    를 포함하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체에 있어서,
    상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 내부에 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체가 위치하고 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체의 표면에 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체가 코팅된 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체는 양전하 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체는 직경이 50 - 100nm이하인 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체는 상기 siRNA 와 상기 프로타민 단백질이 1:10 - 1:70 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, siRNA : 프로타민 단백질)로 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 siRNA는 염기수가 20 - 24mer인 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 프로타민 단백질은 프로타민 P1(protamine P1), 프로타민 1(protamine 1) 및 프로타민 2(protamine 2)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 두 가지 이상의 단백질인 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체는 음전하 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체는 히알루론산과 타우로콜린산이 1:1 - 1:100 범위의 첨가몰비(feed mole ratio, 히알루론산 : 타우로린산)로 혼합되어 제조되는 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 코팅은 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체와 상기 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체가 1:10 - 1:80 범위의 첨가몰비(siRNA - 프로타민 단백질 복합체 : 히알루론산 - 타우로콜린산 결합체)로 혼합하여 제조된 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 음전하 특성을 가지며 직경이 208 - 250nm이고 상기 siRNA - 프로타민 단백질 복합체의 봉입률이 90 - 96.5%인 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체는 간암세포 또는 간전이 암세포에 발현되는 히알루론산 수용체(CD44 receptor)에 표적성을 가지는 것을 특징으로 하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체
  13. 제 1 항 내지 제 8항 및 제 10항 내지 제 12 항 중 어느 한 항의 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 약제학적 유효량을 포함하는 간암치료용 약제학적 조성물
  14. (a) siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체 수용액을 제조하는 단계;
    (b) 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체 분말을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체 분말을 용해시켜 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체 용액을 제조한 후 상기 siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체 수용액과 혼합하여 상기 siRNA - 프로타민(protamine) 단백질 복합체를 상기 히알루론산(hyaluronic acid) - 타우로콜린산(taurocholic acid) 결합체로 코팅하는 단계;
    를 포함하는 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체의 제조방법
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한국고분자학회 춘계학술대회 연구논문 초록집, Vishnu Revuri, 2016. 4.
한국고분자학회 춘계학술대회 연구논문 초록집, 현은주, 2016.4.

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