KR102025079B1

KR102025079B1 - 고병원성 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출방법

Info

Publication number: KR102025079B1
Application number: KR1020190042914A
Authority: KR
Inventors: 황지연; 서정수; 권문경; 황성돈; 정지민; 지보영; 박정우; 이언화
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2019-04-12
Filing date: 2019-04-12
Publication date: 2019-09-25
Anticipated expiration: 2039-04-12

Abstract

본 발명은 VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물 및 이를 이용한 VHSV의 검출방법에 관한 것이다.

Description

고병원성 바이러스성출혈성패혈증 바이러스 검출용 조성물 및 이를 이용한 바이러스성출혈성패혈증 바이러스의 검출방법{Composition for Detecting High Pathogenic Viral Hemorrhagic Septicemia Virus and Method for Detecting High Pathogenic Viral Hemorrhagic Septicemia Virus Using the Same}

본 발명은 고병원성 VHSV(바이러스성출혈성패혈증 바이러스) 검출용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물 및 이를 이용한 VHSV의 검출방법에 관한 것이다.

국내 넙치 양식장에서 발생하는 상존 바이러스 질병인 VHS는 폐사율이 높은 고병원성 바이러스와 폐사율이 낮은 저병원성 바이러스가 혼재되어 있으나, VHS 확정 진단시 고병원성과 저병원성에 상관없이 일률적으로 방역조치가 이루어지고 있어 고병원성을 보일 때만 방역조치가 필요한 실정이다.

바이러스성출혈성패혈증 바이러스인, VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)는 RNA virus로서 family rhabdoviridae에 속하는 바이러스임. VHSV는 1980년대 중반까지 서유럽의 담수어에서만 발견되었는데 (Wolf, 1988) 이후 Pacific salmon에서 검출되었다가 (Winton et al., Am Fish Soc Fish Health News, 17: 2-3, 1989; Batts et al., Dis Aquat Org, 17: 61-71, 1993), 지금은 거의 전 세계에 걸쳐 다양한 어종에 감염하여 많은 피해를 주는 것으로 보고된다 (Meyers & Winton, Ann Rev Fish Dis, 5:3-24, 1995; Gagne et al., J Fish Dis 30: 213-223, 2007; Kent et al., J Aquat Anim Health, 10:211-219, 1998).

Rhabdovirus는 총알 모양의 구조를 지닌 바이러스로서 (-)sense single-stranded RNA를 게놈을 지니고 있으며 polymerase (L), glycoprotein (G), nucleoprotein (N), phosphoprotein (P), 그리고 matrix protein (M) 등과 같은 단백질을 암호하고 있으며, 사람을 포함한 포유류, 어류, 곤충 그리고 식물 등에 감염하여 병을 유발한다.

이중 Genus Novirhabdovirus에 속하는 바이러스들인 IHNV(infectious hematopoietic necrosis virus), VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus) 등은 다른 속에 속하는 rhabdovirus들과 달리 non virion 단백질(NV)을 추가로 지니고 있으며, 어류에 감염하여 대량폐사를 유발하는 것으로 알려져 있다.

VHSV 감염에 의한 피해를 줄이기 위해서는 효과적인 백신이 필요한데, 아직까지 상용화 가능한 백신은 개발되어 있지 않은 상태이다. 따라서, VHSV에 대한 가장 좋은 대처 방안은 VHSV 확산을 방지하고, VHS 발생시 조기에 정확하게 진단하여 신속한 방역조치를 취하는 것이 유일한 방법이다.

우리나라 양식장에는 이미 VHSV가 유입되어 있으며, 대부분의 넙치 양식장에 상존하고 있다. 양식장에 상존하고 있는 VHSV에는 높은 폐사를 유발하는 고병원성 바이러스와 폐사를 유발하지 않거나 매우 낮은 폐사를 보이는 저병원성 바이러스가 존재한다. 양식장의 피해를 효율적으로 줄이기 위해서는 고병원성 VHSV에 대해서 적절한 방역조치를 취할 필요가 있다. 그러나 현재 VHSV 검출에 사용하는 PCR법, 그리고 OIE에서 제시하는 VHSV 표준검출방법인 세포배양법의 경우, 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV을 구별하여 진단할 수 없다.

따라서 효율적인 진단 및 방역조치가 이루어지기 위해서는 VHSV의 병원성을 결정하는 위험인자를 찾아내어 이를 바탕으로 고병원성 VHSV만을 진단하는 방법을 찾는 것이 필요한 상황이다.

이에, 본 발명자들은 고병원성 VHSV를 선별적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 저병원성을 나타내는 VHSV와 고병원성을 나타내는 VHSV에 대하여 전체 게놈 시퀀싱을 수행하여, 고병원성 바이러스에서만 특이적으로 P 유전자에서 변이가 존재하는 것을 확인하고, 이를 타겟팅할 경우 고병원성 VHSV를 효율적으로 검출할 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 고병원성 VHSV를 검출하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 고병원성 VHSV를 진단하기 위한 조성물을 이용한 고병원성 VHSV의 검출방법에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 고병원성 VHSV 검출용 조성물을 포함하는, 고병원성 VHSV 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, VHSV 함유 샘플에서, VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 VHSV의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 양식장에 상존하는 VHSV가 양식어류의 높은 폐사를 유발하는 고병원성 바이러스인지 폐사를 나타내지 않는 저병원성 바이러스인지 효과적으로 판단하여, 고병원성 VHSV에 대해서 적절한 방역조치를 취하여, 양식사업의 피해를 줄일 수 있다.

도 1은 VHSV 바이러스가 속하는 Rhabdovirus의 게놈 구조 및 바이러스 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 20개 VHSV strains의 게놈에서 점돌연변이된 부위의 빈도를 나타낸 것이다.
도 3은 20개 VHSV strains의 게놈서열 전체를 기반으로한 계통유전학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 20개 VHSV strains의 단백질 N, M, G, NV 및 L의 아미노산 서열을 기반으로 한 계통수를 나타낸 것이다.
도 5는 20개 VHSV strains의 단백질 P의 아미노산 서열을 기반으로 한 계통수를 나타낸 것이다.
도 6은 20개 VHSV strains의 단백질 P의 아미노산 서열을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 20개 VHSV strains의 단백질 P, G 및 L의 아미노산 서열 변이를 고변원성바이러스(붉은색) 및 저병원성 바이러스(하늘색) 별로 나타낸 것이다.
도 8은 HINAE 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(CPE, A) 및 바이러스 성장(B)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 BF-2 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(CPE, A) 및 바이러스 성장(B)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 FHM 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(CPE, A) 및 바이러스 성장(B)을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에서 제작한 재조합 VHSV를 도시한 것이다.
도 12는 14℃ 및 20℃에서 HINAE 세포에서 배양된 재조합 VHSV의 성장을 나타낸 것이다.
도 13은 저병원성 VHSV를 검출하는 PCR 프라이머 세트 VHSV-LV와 고병원성 VHSV를 검출하는 PCR primer set VHSV-HV를 사용하여 세포에 감염된 저병원성 VHSV strain #5와 고병원성 VHSV strain #19을 PCR로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 저병원성 VHSV를 검출하는 Real-time qPCR primer set VHSV-qLV와 고병원성 VHSV를 검출하는 Real-time qPCR primer set VHSV-qHV를 사용하여 세포에 감염된 저병원성 VHSV strain #5와 고병원성 VHSV strain #19을 Real-time qPCR로 검출한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서는 우리나라 넙치 양식에서 높은 폐사율을 나타내는 원인 바이러스인 바이러스성출혈성패혈증 바이러스(VHSV; Viral hemorrhagic septicemia virus)에 대하여, 고병원성을 나타내는 유전적 마커를 찾고자 하였으며, 수산과학원 방역과에서 보관중인 20종의 VHSV를 EPC 세포주에 접종하여, 20종 VHSV의 병원성 정도를 확인하였으며, 20종 VHSV에 대하여 전체 게놈 시퀀싱을 실시하고, 병원성과 유전적 변이의 상관관계를 분석하였다.

그 결과, VHSV의 P 유전자의 변이가 고병원성 나타내는 데에 관련이 있다는 것을 확인하였다. VHSV의 N, M, G, NV, 및 L 유전자의 변이는 전반적으로 병원성과 연관성이 없음이 확인되었지만, 약하게라도 병원성과 연관성을 보이는 부위가 있는지 확인하기 위하여 20 VHSV strain들의 N, M, G, NV, 및 L 단백질 아미노산 서열을 비교분석하였으며, N, M 및 NV의 아미노산 서열 변이들은 병원성과 전혀 연관성이 없음이 확인되었고, G 및 L의 경우 특정 부위의 아미노산 잔기 변이와 병원성과 어느 정도 연관성이 있을 가능성이 있음이 확인되었다. 상기 변이들을 포함하는 재조합 VHSV를 제작하여 넙치유래 세포인 HINAE에 감염하여 세포독성을 확인한 결과, 단백질 P의 55번째 아미노산 서열의 변이만을 재조합 VHSV에서 높은 병원성을 나타내는 것 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 VHSV 검출용 조성물의 검체는 어류의 혈액, 어류의 조직, 양어장 수 및 해수로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 단백질 P의 아미노산 서열은 서열번호 1에 나타내었으며, 단백질 G 및 단백질 L의 아미노산 서열은 각각 서열번호 2 및 서열번호 3에 나타내었다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제는 상기 단백질의 변이 부위에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브, 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하여 증폭시키는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV의 P 55번째 아미노산 잔기에 발생한 변이를 Real-time qPCR을 사용하여 선택적으로 검출하기 위하여 고병원성 VHSV P 55번째 proline 아미노산 잔기를 암호화하는 염기서열을 지니는 Real-time qPCR 프라이머 VHSV-qHV(서열번호 22 및 23)와 저병원성 VHSV 55번째 leucine 아미노산 잔기를 암호화 하는 염기서열을 지니는 Real-time qPCR 프라이머 VHSV-qLV(서열번호 20 및 21)를 제작하고, 고병원성 VHSV strain #19 혹은 저병원성 VHSV strain #5가 접종된 HINAE 세포의 RNA를 상기 프라이머를 이용하여 Real-time qPCR을 수행한 결과, 저병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-qLV 프라이머를 사용한 Real-time qPCR을 사용한 경우, 고병원성 VHSV strain #19의 P는 검출되지 않았으며 저병원성 VHSV strain #5 만 검출되었고, 고병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-qHV 프라이머를 사용한 Real-time qPCR의 경우, 저병원성 VHSV strain #5의 P는 검출되지 않았으며 고병원성 VHSV strain #19만 검출되는 것을 확인하였다.

본 발명에 "항체"는 항원과 특이적으로 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신으로 변이된 변이 단백질 P에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 변이 단백질 P의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J Mol Biol, 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 항체를 이용한 바이오마커의 검출방법으로는 방사성 면역분석, 면역조직화학 분석, 계내 (in situ) 혼성화 분석, 경쟁적-결합 분석, 웨스턴 블롯 (western blot) 분석, ELISA 분석, 및 유동 세포 측정 분석, 예를 들어 종양-연관 대식세포의 M2대 M1 표현형 결정을 위한 2색 FACS 분석을 포함한다 (Mantovani et al, (2002) TRENDS in Immunology 23:549-555).

본 발명에서 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991)"Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thyminesubstituted

polyamide" Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al, Nature 355(6360):5646(1992);Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine" J Mol Med 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library" Proc Natl Acad Sci USA 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.

유전적 분석에 기초하여 본 발명을 실시하는 경우, 상기 변이 단백질 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 이용된다. 본 발명에서 프라이머를 이용하는 경우에는, 유전자 증폭 반응을 실시하여 상기 변이 부위를 검출한다.

본 발명에 이용되는 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B.D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시되어 있다.

다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우" 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함한다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+ 와 같은 조인자, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 소망하는 증폭 정도가 달성될 수 있을 정도로 반응 혼합물에 제공하는 것이 요청된다. 증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.

본 발명에서 어닐링 또는 혼성화는 타겟 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 사이에 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격조건 하에서 실시된다. 어닐링을 위한 엄격조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다.

본 명세서에 기술된 용어 "증폭 반응"은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 다양한 증폭 반응들이 당업계에 보고되어 있으며, 이는 중합효소 연쇄반응(이하 PCR이라 한다)(미국 특허 제4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159호), 역전사-중합효소 연쇄반응(이하 RT-PCR로 표기한다)(Sambrook 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)), Miller, H. I.(WO 89/06700) 및 Davey, C. 등 (EP 329,822)의 방법, 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR)(17, 18), Gap-LCR(WO 90/01069), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction; EP 439,182), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA)(19) (WO 88/10315), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995), 타깃 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences)(미국 특허 제6,410,276호), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR)(미국 특허 제4,437,975호), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR)(미국 특허 제5,413,909호 및 제5,861,245호), 핵산염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA)(미국 특허 제5,130,238호, 제5,409,818호, 제5,554,517호, 및 제6,063,603호), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 및 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

사용 가능한 다른 증폭 방법들은 미국특허 제5,242,794, 5,494,810, 4,988,617호 및 미국 특허 제09/854,317호에 기술되어 있다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에서, 증폭 과정은 미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 개시된 PCR (polymerase chain reaction)에 따라 실시된다.

PCR은 가장 잘 알려진 핵산 증폭 방법으로, 그의 많은 변형과 응용들이 개발되어 있다. 예를 들어, PCR의 특이성 또는 민감성을 증진시키기 위해 전통적인 PCR 절차를 변형시켜 터치다운(touchdown) PCR, 핫 스타트(hot start) PCR, 네스티드(nested) PCR 및 부스터(booster) PCR이 개발되었다. 또한, 실시간(real-time) PCR, qPCR, 분별 디스플레이 PCR(differential display PCR: DD-PCR), cDNA 말단의 신속 증폭(rapid amplification of cDNA ends: RACE), 멀티플렉스 PCR, 인버스 중합효소 연쇄반응(inverse polymerase chain reaction: IPCR), 벡토레트(vectorette) PCR, TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)및 멀티플렉스 PCR이 특정한 응용을 위해 개발되었다. PCR에 대한 자세한 내용은 McPherson, M.J., 및 Moller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)에 기재되어 있으며, 그의 교시사항은 본 명세서에 참조로 삽입된다. 본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소)하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머쌍은 주형인 표적 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다.

다른 관점에서 본 발명은 상기 고병원성 VHSV 검출용 조성물을 포함하는, 고병원성 VHSV 검출용 키트에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 VHSV 함유 샘플에서, VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 VHSV의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열의 검출은 상기 단백질의 변이 부위에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브, 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하여 증폭시키는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 제제를 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: VHSV의 병원성 확인

우리나라 양식 넙치에서 분리하여, 수산과학원 방역과에서 보관중인 VHSV strain 20주를 대상으로 병원성 위험도를 확인하였다(도 1).

각 VHSV strain들을 EPC 세포주(ATCC® CRL2872^TM)에 접종하여 3일간 배양 후 배양액을 수득하였다. 배양액을 원심분리 후 상등액을 취하여 바이러스를 수득하여 -80^oC에 보관하였다. 수득된 20 strain의 VHSV 각각을 플라크 어세이법을 사용하여 titer를 결정하였다.

본 발명에서 사용흔 VHSV starains

번호	VHSV strain	분리지역
1	VHS2005	제주
2	VHS2007	제주
3	VHS2016-2	남태수산
4	VHS2016-1	영림수산
5	VHS2015-5	해광수산
6	VHS2015-2	세현수산
7	VHS2014-2	해룡수산
8	VHS2014-5	대포수산
9	VHS2014-4	유라수산
10	VHS2013-1	대천수산2
11	VHS2013-9	대경수산2
12	VHS2013-4	동서수산
13	VHS2013-3	제남수산
14	VHS2013-2	대경수산1
15	VHS2012-11	제이제이수산
16	VHS2012-10	한동수산
17	VHS2012-9	한라수산
18	VHS2012-7	동양수산
19	VHS2012-6	명진수산
20	VHS2012-5	대천수산1

VHS 발병 경력이 없는 넙치 양식장에서 약 13~20g 넙치를 확보하여 병원성 실험에 사용하였다. 각 VHSV strain당 넙치 20마리를 사용하였다. 넙치의 복강에 바이러스 용액 0.1ml(1 x 10⁴ TCID₅₀ 혹은 PFU VHSV)를 주사 후 11~13^oC에서 20일간 배양하며 폐사율 분석하였다.

총 3-5회에 걸쳐 병원성 실험을 수행하였으며, 1회의 병원성 실험에서는 각 그룹당 10마리의 넙치를 사용하였으며, 나머지 4회 병원성 실험에서는 각 그룹 당 20마리의 넙치를 사용하였다. 그리고 처음 3회 실험의 경우 13 g ~ 16.6 g 의 넙치를 사용하였고, 마지막 2회의 실험에서는 16 g ~ 20 g 의 넙치를 사용하였다. 실험용 넙치 복강에 1 x 10⁴ TCID₅₀/fish 의 VHSV를 감염시킨 후 20일 동안의 누적 폐사율을 분석하였다. 총 3-5회의 병원성 실험결과 얻어진 20 VHSV strain들의 누적 폐사율 평균값은 표 2에 나타내었다.

VHSV strain들의 넙치에서의 병원성 실험 결과

번호	병원성 실험 회수	실험 개체수	평균 누적 폐사율
1	3	50	0
2	3	50	0
5	5	90	31.25
15	5	90	50
18	5	90	52.5
7	5	90	53.75
3	5	90	56.25
20	5	90	57.5
16	5	90	60
17	5	90	62.5
6	5	90	62.5
10	5	90	65
13	5	90	67.5
14	5	90	70
11	5	90	70
8	5	90	70
4	5	90	71.5
12	5	90	72.5
19	5	90	73.75
9	5	90	75

위 병원성 실험 결과를 바탕으로 병원성이 낮은 VHSV strain #5와 #20, 그리고 병원성이 높은 VHSV strain #8과 #19를 선정하여 바이러스 특성 분석을 수행하였다.

실시예 2: VHS 병원성과 유전자 변이의 상관관계 분석

실시예 1에서 사용한 20 VHSV strain들의 병원성이 VHSV의 게놈 염기서열 변화와 연관성이 있는지 확인하기 위하여 20 VHSV strain들의 전체 게놈 서열을 분석하였다. 20 VHSV strain들의 전체 게놈은 N(1,215 nt), P(669 nt), M(606 nt), G(1,524 nt), NV(369 nt) 및 L(5,955 nt)를 포함하는 단백질을 암호화하는 부위(coding region) 및 단백질을 암호화하지 않는 부위(non-coding region)인 NC1(166 nt), NC2(105 nt), NC3(117 nt), NC4(89 nt), NC5(74 nt), NC6(126 nt), NC7(153 nt) 등에 존재하는 변이를 관찰한 결과 부위별로 변이의 차이는 있었지만 전 부위에 걸쳐 2.41% ~ 11.76%의 변이가 관찰되었다 (도 2).

또한 20 VHSV strain들의 게놈서열로부터 각 VHSV strain들의 게놈에 암호화되어 있는 단백질들의 아미노산 서열을 확인하였다. 확인된 20 VHSV strain들의 게놈서열 및 아미노산 서열들을 바탕으로 계통수(phylogenetic tree)를 만들어 병원성과 게놈서열 변화와의 연관성을 분석하였다.

VHSV 게놈서열을 바탕으로 계통수를 그린 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 저병원성 VHSV strain들(1, 2, 3, 5, 7, 15, 18, 20)이 유전자 변이가 유사한, 하나의 그룹에 포함되었으며, 반면에 고병원성 VHSV strain들(4, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19)은 저병원성 VHSV strain들과는 다른 그룹에 포함되는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 VHSV strain들의 병원성과 유전자 변이가 연관성 있다는 것을 확인할 수 있었다.

다음으로, VHSV genome이 암호화 하고 있는 유전자들인 N, P, M, G, NV, 및 L 들중 어느 유전자의 변이가 병원성과 연관성이 있는지 확인하기 위하여 이 유전자들이 암호화하고 있는 단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 계통수를 그렸다. 그 결과 N, M, G, NV, 및 L의 아미노산 서열을 바탕으로 만든 계통수의 경우 고병원성 VHSV strain들과 저병원성 VHSV strain들이 서로 다른 그룹들로 분리되지 않고 섞여서 존재하는 반면, P의 아미노산 서열을 바탕으로 만든 계통수의 경우 고병원성 VHSV strain들과 저병원성 VHSV strain들이 서로 다른 그룹들에 분리되어 있음이 학인 되었다. 이상의 결과로부터 VHSV의 N, P, M, G, NV, 및 L 유전자들 중에 N, M, G, NV, 및 L 유전자의 변이는 병원성과 연관성이 없고 P 유전자의 변이는 병원성과 연관성이 있을 가능성이 있는 것을 알 수 있다.

실시예 3: VHSV의 병원성 관련 변이 확인

실시예 2의 결과를 통하여, VHSV의 P 단백질의 아미노산 변이가 병원성과 연관성이 있다는 것을 확인하였으며, VHSV P의 아미노산 서열 중 어느 부위의 변이가 병원성과 연관성이 있는 지를 확인하기 위하여 20 VHSV strain들의 P 단백질 아미노산 서열을 비교 분석하였다.

그 결과, VHSV P 아미노산 서열 중 55번째 잔기의 변이가 VHSV 병원성과 연관성을 보임이 확인되었다. 즉 고병원성을 보이는 모든 VHSV strain들(4, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19)이 55번째 아미노산 잔기에 leucine(L)을 지니는 반면, 저병원성을 보이는 모든 VHSV strain들(1, 2, 3, 5, 7, 15, 18, 20)은 55번째 아미노산 잔기에 proline(P)을 지니고 있는 것이 확인되었다. 이 결과로부터 VHSV의 병원성은 P 단백질의 55번째 아미노산 잔기의 변이에 의하여 결정될 가능성이 높음을 알 수 있었다.

Phylogenetic tree 분석 결과 N, M, G, NV, 및 L 유전자의 변이는 전반적으로 병원성과 연관성이 없음이 확인되었지만, 약하게라도 병원성과 연관성을 보이는 부위가 있는지 확인하기 위하여 20 VHSV strain들의 N, M, G, NV, 및 L 단백질 아미노산 서열을 비교분석하였다.

그 결과 N, M 및 NV의 아미노산 서열 변이들은 병원성과 전혀 연관성이 없음이 확인되었다. 반면에 G 및 L의 경우 특정 부위의 아미노산 잔기 변이와 병원성과 어느 정도 연관성이 있을 가능성이 있음이 확인되었다. G의 경우, 고병원성을 지니는 모든 고병원성 VHSV strain들((4, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19)은 71번째 아미노산 잔기로서 isoleucine(I)을 지니는 반면 대부분 저병원성 VHSV strain들(1, 2, 3, 5, 15, 18, 20)은 threonine(T)를 지니고 있음이 확인 되었다. 그리고 L의 경우 고병원성을 지니는 모든 고병원성 VHSV strain들(4, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 19)은 1,079 번째 아미노산 잔기로서 arginine(R)을 지니는 반면 대부분 저병원성 VHSV strain들(1, 2, 3, 5, 15, 18, 20)은 glutamine(Q)를 지니고 있음이 확인 되었다.

위 결과들을 종합하면 VHSV 병원성을 결정하는 위험요소 결정 인자로서 가장 가능성 높은 것으로는 P 단백질의 55번째 잔기의 변이이며, 이 외에 G 단백질의 71번째 잔기, 그리고 L 단백질의 1,079번째 잔기의 변이도 위험요소 결정 인자로 작용할 가능성이 있다.

실시예 4: VHSV의 병원성에 따른 어류세포주에서의 VHS 성장률 비교

이전의 연구 결과, IFN system이 정상적으로 작동하는 세포주를 사용하였을 때, 병원성이 높은 바이러스들은 세포에서 잘 자라는 반면, 병원성이 낮은 바이러스는 성장 속도가 떨어진다는 보고들이 있다(O’'Farrell. et al., J Virol 76:8040, 2002).

본 실시예에서는 실시예 3에서 확인된, VHSV P 단백질의 변이가 실제 VHSV의 병원성을 결정하는 인자인지를 확인하기 위하여 VHSV 병원성과 비례하여 바이러스를 성장시키는 세포주를 확보하고자 하였다. 특히 20 VHSV strain들이 넙치에서 분리된 바이러스들로서 넙치에 감염하여 폐사를 유발하는 특성을 고려하였을 때, 넙치에서 유래된 세포주에서 VHSV가 병원성에 비례하여 성장 속도가 다름이 확인되면 이 세포주를 병원성 결정인자 확인 실험에 사용할 수 있을 것으로 판단되어, 넙치에서 유래된 세포주인 HINAE 세포를 사용하여 고병원성 및 저병원성 VHSV strain의 성장을 분석하였다.

먼저 HINAE 세포주(CVCL_R908)에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 그리고 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 moi=0.1, moi=1 및 moi=10로 접종한 다음 14℃에서 배양하면서 세포독성(cytopathic effect, CPE)과 바이러스의 성장을 분석하였다.

그 결과, 고병원성 VHSV strain들과 저병원성 VHSV strain들 사이에 CPE 및 바이러스 성장에 유의성 있는 차이가 관찰되지 않았다.

고병원성 VHSV strain과 저병원성 VHSV strain 사이에 IFN에 대한 반응이 다른지를 확인하기 위하여 IFN inducer로 알려진 poly I:C를 처리한 HINAE 세포에 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV를 moi=0.1 접종하고 14℃에서 배양하면서 CPE를 관찰하였다.

그 결과, poly I:C를 바이러스 감염 전, 감염과 동시, 혹은 감염 후에 처리한 모든 실험에서 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV 사이에 유의성 있는 CPE 차이가 관찰되지 않았다.

숙주세포의 인터페론 등의 활성이 고병원성 및 저병원성 VHSV 성장 조절에 중요한 역할을 하는 경우 14℃는 넙치에서 유래된 HINAE 세포의 정상적인 생리 활성에 적합하지 않을 수 있다. 따라서 넙치 세포의 생리 활성이 활발할 것으로 예상되는 20℃에서 바이러스 성장 실험을 수행하였다. 즉, HINAE 세포주를 사용하여 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 그리고 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 moi=0.1 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(cytopathic effect, CPE)과 바이러스의 성장을 분석하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와같이, 저병원성 VHSV strain에 비하여 고병원성 VHSV strain이 HINAE 세포에 더 심한 CPE를 유도하였으며 더 빠른 성장 속도를 보였다.

HINAE 이외에 다른 세포주에서도 고병원성 VHSV strain과 저병원성 VHSV strain의 성장에 차이가 있는 지를 확인하기 의하여 FHM(fathead minnow)(ATCC® CCL-42^TM), BF-2(bluegill fry) (ATCC® CCL-91^TM)등의 세포에 고병원성 VHSV strain #8과 #19, 그리고 저병원성 VHSV strain #5와 #20을 각각 moi=0.1 접종한 다음 20℃에서 배양하면서 세포독성(cytopathic effect, CPE)과 바이러스의 성장을 분석하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, BF-2 세포에서는 고병원성과 저병원성 VHSV strain들 사이에 바이러스 성장에서 큰 차이를 보이지 않았지만, 도 10에 나타난 바와 같이, FHM 세포에서는 고병원성 VHSV strain이 HINAE 세포에서보다 더 심한 CPE를 유도하였으며 더 빠른 성장 속도를 보였다.

이와 같은 결과로부터 20℃에서 배양하면, 넙치에서 유래된 HINAE 세포 이외에도 FHM을 사용하여도 고병원성과 저병원성 VHSV strain들 사이에 성장의 차이를 관찰할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5: 병원성 결정 유전자를 포함하는 재조합 VHSV 합성

실시예 2에서 VHSV의 병원성을 결정하는 인자일 것으로 예상되는 P 단백질의 55번째 아미노산 잔기 변이, G 단백질의 71번째 아미노산 잔기 변이 및 L 단백질의 1,079번째 잔기 변이에 대하여, 실제 이들 부위의 변이가 VHSV 병원성을 결정하는 인자인지를 확인하기 위하여 이 부위가 다른 재조합 VHSV를 제조하였다.

저병원성 VHSV의 유전자 특성을 지니는 VHSV 전체 게놈의 pVHSV-wild를 주형으로 하여서 P gene, G gene 및 L gene의 병원성 결정인자로 예상되는 변이 부분의 핵산을 차례로 변이시켜 재조합 VHSV를 생산하였다. 변이는 SDM (Site-Directed Mutagenesis)방법으로 사용하였으며, Pfu Turbo™ DNA polymerase (2.5 U/μl QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit)를 사용하여 PCR을 진행하였다. PCR에 사용된 프라이머와 조건은 표 3 및 표 4에 나타내었다.

프라이머		서열번호	서열(5′-3′)
P55-L SDM	F	4	CAAGCCCCAAGAAGAAATCCACTCTGACAACGCTCGAGGAGATCATTG
P55-L SDM	R	5	CAATGATCTCCTCGAGCGTTGTCAGAGTGGATTTCTTCTTGGGGCTTG
G71-I SDM	F	6	GTCCCCATGAGTTCGAGGACATAAACAAGGGCTTGGTCTCTGTCCCAG
G71-I SDM	R	7	CTGGGACAGAGACCAAGCCCTTGTTTATGTCCTCGAACTCATGGGGAC
L1079-R SDM	F	8	GAAACACTCTGGTCGTGCTCAACCCGACAGGCCAAAAAACTCAGGG
L1079-R SDM	R	9	CCCTGAGTTTTTTGGCCTGTCGGGTTGAGCACGACCAGAGTGTTTC

PCR 스텝	온도	반응시간	사이클
Pre-denaturation	95℃	3 min	1
Denaturation	95℃	30 sec	12
Annealing	55℃	1 min
Extension	68℃	14 min
Final extension	72℃	7 min	1

PCR 정제를 수행한 후 DpnI 37℃, 2 시간 동안 반응시키고, E. coli DH5α에 형질전환하여, 클론을 선별하여 Exprep Plasmid SV mini (GeneAll)를 이용하여 플라스미드를 분리하였다.

제작된 pVHSV 변이 벡터는 T7 RNA 폴리머레이즈 발현 EPC 세포(ATCC® CRL2872^TM)가 80% 자랐을 때 pVHSV 변이체(2μg), helper 플라스미드 N(500ng), P(300ng) 및 L(200ng)를 첨가하여 FuGENE HD transfection reagent (Promega)를 사용하여 트랜스펙션하였다.

12시간 배양 후 15℃로 옮겨서 CPE가 보일 때까지 배양하고, 이후 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 바이러스 상층액을 수거하였으며, 수거한 바이러스 상층액을 EPC 세포에 접종하여 2번의 계대를 더 진행하여 최종 바이러스를 수득하였다. 수득된 바이러스는 -80℃에 보관하고 사용하였다.

재조합 바이러스를 확인하기 위하여, 바이러스를 접종한 각각의 세포 펠렛으로부터 RiboEX(GeneAll), Hybrid-R kit(GeneAll)을 사용하여 RNA 추출하였다. 추출된 RNA로부터 promega cDNA synthesis kit로 cDNA를 합성하였다. Hipi taq을 사용하여 cDNA로부터 PCR을 진행하였으며, 사용된 프라이머와 PCR 조건은 표 5 및 표 6에 나타내었다.

	프라이머		서열 번호	서열(5′-3′)
P55	NP realtime	F	10	CGATGACGACTACCCAGGGGAC
P55	VHSV2690R	R	11	TAAGTCACACTCCCATGTCT
G71	SEQ2401	F	12	CCAGGTCGATAAGATCTGCATG
G71	VG-realtime-790R	R	13	CGGTCTTGATCCATTCTGTCC
L1079	SEQ8176	F	14	CCTCATCTCAAGACGTCTCAGTTG
L1079	VHSL_SEQ_4490_Re	R	15	TGTCATTCTCCCCGAGTCCATTCT
	VHSL_SEQ_4490_Re	R	15	TGTCATTCTCCCCGAGTCCATTCT

PCR Step	온도	반은시간	사이클
Pre-denaturation	95℃	3 min	1
Denaturation	95℃	30 sec	30
Annealing	60℃	30 min
Extension	72℃	1 min
Final extension	72℃	7 min	1

PCR 산물은 정제하여하여 T-vector에 라이게이션하였고 플라스미드로 분리한 후, 시퀀싱하여 확인하였다.

이와 같은 방법을 사용하여 rVHSV-P (P의 55번 아미노산 잔기만 변형), rVHSV-PG (P의 55번 아미노산 잔기 + G의 71번 아미노산 잔기 변형), rVHSV-PGL (P의 55번 아미노산 잔기 + G의 71번 아미노산 잔기 변형 + L의 1079번 아미노산 잔기 변형)의 염기서열을 확인한 결과 p55, G71, L1079 들이 순차적으로 변이되어 있는 것을 확인하였으므로, 최종적으로 도 11에 나타난 바와 같이 재조합 VHSV(VHSV-5,VHSV-19, rVHSV, rVHSV-P, rVHSV-PG 및 rVHSV-PGL)를 수득하였다.

실시예 6: 고병원성 재조합 VHSV의 성장조절기능 분석

실시예 5에서 제조한 재조합 VHSV를 사용하여 P, G, L 유전자에 발생한 변이가 VHSV 성장에 영향을 주는 지 분석하였다.

넙치 유래 세포주인 HINAE 세포주에 rVHSV, rVHSV-P, rVHSV-PG 및 rVHSV-PGL의 재조합 바이러스들을 MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 다음 14℃와 20℃에 배양하면서 세포독성(cytopathic effect, CPE)과 바이러스의 성장을 분석하였다.

먼저 세포독성 실험 결과, MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 경우 모두, 그리고 14℃와 20℃에서 배양한 모든 경우에 있어서, rVHSV에 감염된 세포보다 rVHSV-P, rVHSV-PG, rVHSV-PGL 감염된 세포에서 세포 독성이 빨리 관찰되었으며, 세포 독성의 정도도 더 심하게 진행되었다. 그러나 rVHSV-P, rVHSV-PG, rVHSV-PGL 사이에서는 MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 경우 모두, 그리고 14℃(표 7)와 20℃(표 8)에서 배양한 모든 경우에 있어서, 세포 독성의 진행속도 및 독성의 정도 모두 거의 차이를 발견할 수 없었다.

-, CPE 0%; +, 20%; ++, 40%; +++, 50%; ++++, 60%; +++++, 80%; ++++++, 100%

-,, CPE 0%; +, 20%; ++, 40%; +++, 50%; ++++, 60%; +++++, 80%; ++++++, 100%

다음으로 일정 시간 간격으로 세포 배양액을 취한 후 배양액에 있는 감염성 있는 바이러스 titer를 플라그 어세이(plaque assay)를 사용하여 분석하였다.

그 결과, MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 경우 모두, 그리고 14℃와 20℃에서 배양한 모든 경우에 있어서, rVHSV보다 rVHSV-P, rVHSV-PG, rVHSV-PGL들이 더 빨리 자라는 것이 확인되었으나, rVHSV-P, rVHSV-PG, rVHSV-PGL 사이에서는 MOI=0.1 및 MOI=0.01로 접종한 경우 모두, 그리고 14℃와 20℃에서 배양한 모든 경우에 있어서, 바이러스 성장의 차이를 발견할 수 없었다.

이상의 결과를 종합하면, VHSV P의 55번 아미노산 잔기의 변이가 VHSV의 세포독성 및 바이러스 성장을 결정하는 인자임을 확인할 수 있었다.

실시예 7: 고병원성 VHSV의 P 55번 아미노산 잔기의 변이 특이적인 프라이머를 이용한 고병원성 VHSV 검출

고병원성 VHSV과 저병원성 VHSV의 P 55번째 아미노산 잔기에 발생한 변이를 PCR을 사용하여 선택적으로 검출하기 위하여 고병원성 VHSV P 55번째 proline 아미노산 잔기를 암호화하는 염기서열을 지니는 PCR 프라이머 VHSV-HV(high virulence, 서열번호 18 및 19)와 저병원성 VHSV 55번째 leucine 아미노산 잔기를 암호화 하는 염기서열을 지니는 PCR 프라이머 VHSV-LV(low virulence, 서열번호 16 및 17)를 제작하였다(표 9).

HINAE 세포에 고병원성 VHSV strain #19 혹은 저병원성 VHSV strain #5를 MOI=0.1로 접종하였다. 14^oC에서 24시간 배양한 후 RNA를 추출한 다음 표 10에서와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 산물을 아가로즈 겔에 전기영동하여 증폭산물을 확인하였다.

프라이머		서열번호	서열(5′-3′)
VHSV-LV	F	16	CCCAAGAAGAAATCCACTCC
VHSV-LV	R	17	GGCAGCTGTGGTTAGTCCTC
VHSV-HV	F	18	CCCAAGAAGAAATCCACTCT
VHSV-HV	R	19	GGCAGCTGTGGTTAGTCCTC

PCR 스텝	온도	반응시간	사이클
Pre-denaturation	95℃	5 min	1
Denaturation	94℃	30 sec	28
Annealing	59℃	30 sec
Extension	72℃	30 sec
Final extension	72℃	5 min	1

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 저병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-LV 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과, 고병원성 VHSV strain #19의 P는 검출되지 않았으며 저병원성 VHSV strain #5 만 검출되었다. 반면, 고병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-HV 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 결과, 저병원성 VHSV strain #5의 P는 검출되지 않았으며 고병원성 VHSV strain #19만 검출되었다.

다음으로 고병원성 VHSV와 저병원성 VHSV의 P 55번째 아미노산 잔기에 발생한 변이를 Real-time qPCR을 사용하여 선택적으로 검출하기 위하여 고병원성 VHSV P 55번째 proline 아미노산 잔기를 암호화하는 염기서열을 지니는 Real-time qPCR 프라이머 VHSV-qHV(서열번호 22 및 23)와 저병원성 VHSV 55번째 leucine 아미노산 잔기를 암호화 하는 염기서열을 지니는 Real-time qPCR 프라이머 VHSV-qLV(서열번호 20 및 21)를 제작하였다(표 11).

HINAE 세포에 고병원성 VHSV strain #19 혹은 저병원성 VHSV strain #5를 MOI=0.1로 접종하고, 14^oC에서 24시간 배양한 후 RNA를 추출하고, 표 12에 기재된 조건으로 Real-time qPCR을 수행하였다.

그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 저병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-qLV 프라이머를 사용한 Real-time qPCR을 사용한 경우, 고병원성 VHSV strain #19의 P는 검출되지 않았으며 저병원성 VHSV strain #5 만 검출되었다. 반면에 고병원성 VHSV P를 검출하는 VHSV-qHV 프라이머를 사용한 Real-time qPCR의 경우, 저병원성 VHSV strain #5의 P는 검출되지 않았으며 고병원성 VHSV strain #19만 검출되었다.

프라이머		서열번호	서열(5′-3′)
VHSV-qLV	F	20	CCCAAGAAGAAATCCACTCC
VHSV-qLV	R	21	TGTCCGAGGGCCTTCGTGGC
VHSV-qHV	F	22	CCCAAGAAGAAATCCACTCT
VHSV-qHV	R	23	TGTCCGAGGGCCTTCGTGGC

PCR 스텝	온도	반응시간	사이클
Pre-denaturation	94℃	10 min	1
Denaturation	94℃	15 sec	45
Annealing/Extension	60℃	60 sec	45

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> National Institute of Fisheries Sceince <120> Composition for Detecting High Pathogenic Viral Hemorrhagic Septicemia Virus and Method for Detecting High Pathogenic Viral Hemorrhagic Septicemia Virus Using the Same <130> P19-B017 <160> 23 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 222 <212> PRT <213> VHSV P protein <400> 1 Met Thr Asp Ile Glu Met Ser Glu Ser Leu Val Leu Ser His Gly Ser 1 5 10 15 Leu Ala Asp Leu Asp Arg Arg Leu Asp Asn Ala Pro Lys Asp Thr Arg 20 25 30 Ser Ala Leu Phe Ser Ser Ser Pro Gly Ser Ser Lys Gln Lys Pro Ser 35 40 45 Pro Lys Lys Lys Ser Thr Pro Thr Thr Leu Glu Glu Ile Ile Gly His 50 55 60 Phe Val Pro Glu Asp Leu Gln Leu Asp Ala Thr Lys Ala Leu Gly Gln 65 70 75 80 Leu Leu Arg Arg Ile Lys Leu Ser His Gln Glu Glu Leu Thr Gln His 85 90 95 Leu Glu Lys Val Asn Gly Glu Asn Arg Ala Lys Met Gly Ala Leu Leu 100 105 110 Glu Ser Gln Lys Glu Asn Gly Lys Lys Thr Asp Asn Ile Leu Ser Ile 115 120 125 Leu Ile Ser Met Arg Gly Glu Gly Ala Glu Asn Ala Ser Lys Lys Pro 130 135 140 Lys Val Leu Asp Gly Asp Gln Val Arg Asn Glu Arg Ala Leu Gly Phe 145 150 155 160 Asn Arg Gly Leu Thr Thr Ala Ala Ile Ala Met Lys Lys Phe Lys Leu 165 170 175 Glu Asp Pro Leu Val Leu Cys Lys Gly Ser Val Lys Arg Ala Ala Leu 180 185 190 Ser Ala Met Glu Lys Glu Glu Tyr Asp Gly Glu Arg Glu Thr Tyr Ser 195 200 205 Met Val Ser Lys Ala Ile Lys Ala Glu Leu Asp Lys Leu Glu 210 215 220 <210> 2 <211> 507 <212> PRT <213> VHSV G protein <400> 2 Met Glu Trp Asn Thr Phe Phe Leu Val Ile Leu Val Ile Ile Ile Lys 1 5 10 15 Ser Thr Thr Ser Gln Ile Thr Gln Arg Pro Pro Val Glu Asn Ile Ser 20 25 30 Thr Tyr His Val Asp Trp Asp Thr Pro Leu Tyr Thr His Pro Ser Asn 35 40 45 Cys Arg Lys Asn Ser Phe Val Pro Ile Arg Pro Asp Gln Leu Arg Cys 50 55 60 Pro His Glu Phe Glu Asp Ile Asn Lys Gly Leu Val Ser Val Pro Ala 65 70 75 80 Gln Ile Ile His Leu Pro Leu Ser Val Thr Ser Val Ser Ala Val Ala 85 90 95 Asn Gly His Tyr Leu His Arg Val Thr Tyr Arg Val Thr Cys Ser Thr 100 105 110 Asn Phe Phe Gly Gly Gln Thr Ile Glu Lys Thr Ile Leu Glu Ala Lys 115 120 125 Leu Ser Arg Gln Glu Ala Ile Asn Glu Ala Gly Lys Asp His Glu Tyr 130 135 140 Pro Phe Phe Pro Glu Pro Ser Cys Ile Trp Met Lys Asp Asn Val His 145 150 155 160 Lys Asp Ile Thr His Tyr Tyr Lys Thr Pro Lys Thr Val Ser Ile Asp 165 170 175 Leu Tyr Ser Arg Lys Phe Leu Asn Pro Asp Phe Ile Glu Gly Val Cys 180 185 190 Thr Thr Ser Pro Cys Pro Thr His Trp Gln Gly Val Tyr Trp Ile Gly 195 200 205 Ala Thr Pro Gln Ala His Cys Pro Thr Ser Glu Thr Leu Lys Gly His 210 215 220 Leu Phe Thr Arg Thr His Asp His Arg Val Val Lys Ala Ile Val Ala 225 230 235 240 Gly His His Pro Trp Gly Leu Thr Met Ala Cys Lys Val Thr Phe Cys 245 250 255 Gly Thr Glu Trp Ile Lys Thr Asp Leu Gly Asp Leu Ile Gln Val Thr 260 265 270 Gly Gln Gly Gly Ala Asn Lys Leu Ser Pro Lys Lys Cys Val Asn Thr 275 280 285 Asp Val Gln Met Arg Gly Ala Thr Asp Asp Phe Ser Tyr Leu Asn His 290 295 300 Leu Ile Thr Asn Met Ala Gln Arg Thr Glu Cys Leu Asp Ala His Ser 305 310 315 320 Asp Ile Thr Ala Ser Gly Lys Ile Ser Pro Phe Leu Leu Ser Lys Phe 325 330 335 Arg Pro Ser His Pro Gly Pro Gly Lys Ala His Tyr Leu Leu Asp Gly 340 345 350 Gln Ile Met Arg Gly Glu Cys Asp Tyr Glu Ala Val Val Ser Ile Asn 355 360 365 Tyr Asn Ser Ala Gln Tyr Lys Thr Val Asn Asn Ile Trp Lys Ser Trp 370 375 380 Asn Arg Ile Asp Asn Asn Thr Asp Gly Tyr Asp Gly Met Ile Phe Gly 385 390 395 400 Asp Lys Leu Ile Ile Pro Asp Ile Glu Lys Tyr Gln Ser Ile Tyr Asp 405 410 415 Ser Gly Met Leu Val Gln Arg Asn Leu Val Glu Ile Pro His Pro Ser 420 425 430 Ile Val Phe Val Ser Asn Thr Ser Asp Leu Ser Thr Asn Tyr Ile His 435 440 445 Thr Asn Leu Ile Pro Ser Asp Trp Ser Phe Asn Trp Ser Leu Trp Pro 450 455 460 Ser Leu Ser Gly Met Gly Val Val Gly Gly Ala Phe Leu Leu Leu Val 465 470 475 480 Leu Cys Cys Cys Cys Arg Ala Ser Pro Pro Pro Pro Ser Tyr Gly Ile 485 490 495 Pro Met Gln Gln Phe Ser Arg Ser Gln Met Val 500 505 <210> 3 <211> 1984 <212> PRT <213> VHSV L protein <400> 3 Met Glu Met Phe Glu Leu Asp Arg Glu Val His Gln Glu Arg Leu Pro 1 5 10 15 Ser Glu Cys Ser Leu Asn Ser Pro Leu Asn Leu Ser Leu Ser Leu Gln 20 25 30 Leu Phe Gly Arg Leu Thr Pro Lys Thr Glu His Ile Arg Tyr Gln Ala 35 40 45 Gly Arg Ile Lys Arg Trp Leu Thr Lys Gln Tyr Gln Ile Val His Leu 50 55 60 Lys Glu Leu Glu Ile Asp Ser Thr Arg Ile Gln Gly Tyr Leu Ile Pro 65 70 75 80 His Leu Leu Lys Thr Gln Ser Ser Glu Leu Gly Ser Ser Val Met Lys 85 90 95 Asn Trp Gly Met Val Ser Lys Tyr Tyr Leu Ser Leu Gly Tyr Thr Leu 100 105 110 Pro Pro Lys Asp Lys Phe Asp Phe Arg Glu Val Ala Pro Tyr Trp Asn 115 120 125 Leu Ala Ser Gln Leu Arg Glu Val Thr Leu Glu Ser Gln Lys Val Asp 130 135 140 Val Arg Gly Lys Gly Lys Arg Lys Leu Tyr Gln Val Glu Asp Val Glu 145 150 155 160 Phe Glu Phe Lys Glu Glu Val Val Val Ile Arg Ala Gly Pro Asn Gly 165 170 175 Leu Leu Asn Glu Phe Leu Gly Gly Lys Thr Leu Gly Ala Ile Thr Tyr 180 185 190 Val Glu Tyr Leu Ala Leu Phe Lys Ile Ile Asn Gln Arg Ala Gln Ala 195 200 205 Leu Leu Leu Thr Ala Ile Cys Gln Thr Leu Glu Pro Asp Leu Val Pro 210 215 220 Pro Cys Gly Gly Ile Leu Ser Val Tyr Ala Glu Val Asp Ser Val Leu 225 230 235 240 Arg Arg Ala Gly Gln Ser Ala Ile Asp Leu Leu Lys Leu Trp Glu Pro 245 250 255 Leu Val Leu Thr Lys Leu Gly Asp Val Leu Gly Asp Arg Phe Gly Leu 260 265 270 Glu Asp Asp Phe Lys Glu Thr Ile Arg Gly Glu Ala Asn Lys Leu Ala 275 280 285 Lys Lys Leu His Val Thr Arg Ser Tyr Glu Arg Met Met Lys Thr Leu 290 295 300 Glu Gln Glu Thr Arg Ala Gln Ala Leu Phe Gln Tyr Phe Gly Leu Phe 305 310 315 320 Lys His Phe Ala Tyr Pro Arg Val Tyr Ser Arg Glu Thr Ile Glu Ala 325 330 335 Ile Gln Glu Val Ser Asp Lys Pro Ser Asp Ser Ser Pro Leu Asn Tyr 340 345 350 Leu Ser Asp Gln Cys Lys Ile Arg Glu Glu Phe Tyr Ile Arg Tyr Thr 355 360 365 Arg Ala Tyr His Arg Ala Pro Thr Met Asn Leu Gly Gln Leu Gly Gln 370 375 380 Gly Ser Tyr Leu Arg Gln Val Leu Glu Ala Gly Lys Ile Pro Asn Thr 385 390 395 400 Lys Asn Ala Leu Tyr Ser Leu Leu Glu Trp Phe Phe Val Arg Phe Glu 405 410 415 Lys Ser Ile Glu Trp Pro Leu Ser Asp Thr Leu Ser Thr Phe Leu Ser 420 425 430 Asp Lys Ala Ile Thr Gln Asn Arg Asp Ile Trp Tyr Asp Gly Gly Ser 435 440 445 Ser Gly Arg Asp Thr Thr Glu Lys Arg Leu Leu Leu Lys Phe Ile Lys 450 455 460 Glu Asn Glu Asp Ser Val Glu Lys Val Ile Leu Lys Ala Asp Glu Ile 465 470 475 480 Tyr Asp Thr Lys Thr Asp Gln Ile Ile Ala Leu Lys Val Lys Glu Met 485 490 495 Glu Leu Lys Ile Lys Gly Arg Gly Phe Gly Leu Met Ala Phe Lys Pro 500 505 510 Arg Leu Leu Gln Val Leu Arg Glu Ser Ile Ala Lys Lys Thr Ser Lys 515 520 525 Leu Phe Pro Glu Ile Thr Met Thr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Lys Lys 530 535 540 Lys Lys Phe Gln Leu Ser Arg Lys Ser Asp Asp Arg Arg Gly Tyr Ile 545 550 555 560 His Ile Ser Lys Ser Leu Asp Ile Asn Lys Phe Cys Thr Ser Gln Arg 565 570 575 Gln Phe Asn Ser Leu Ala Val Phe Gln Ser Leu Asp Glu Leu Leu Gly 580 585 590 Thr Asp Gln Leu Phe Thr Arg Val His Glu Ile Phe Glu Lys Thr Trp 595 600 605 Ile Val Asp Gly Ser Ala Ser Asp Pro Pro Asp Leu Val Thr Phe Lys 610 615 620 Ala Arg Tyr Glu Glu Ala Leu Ala Leu Gly Ile Glu Ala Pro His Val 625 630 635 640 Trp Ala Asp Gly Ala Phe Ser Gly Leu Met Gly Gly 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Thr Asn Pro 850 855 860 Glu Lys Arg Thr Leu Glu Leu Leu Leu Val Ser Ser Leu Phe Gly Ser 865 870 875 880 Ala Leu Gly Met Leu Pro Phe Pro Thr Pro Ile Asp Leu Glu Lys Arg 885 890 895 Gly Val Gly Asp Tyr Ile Thr His Arg Leu Ser Ile Val Lys Met Ala 900 905 910 Leu Val Ser Lys Lys Leu Pro Asn Arg Met Val Lys Met Ile Val Ser 915 920 925 Thr Met Asn Leu Pro Leu Ser Arg Glu Gln Asp Leu Thr Lys Leu Phe 930 935 940 Asp Ser Pro Phe Ser Leu Asn Leu Ala Thr Glu Glu Asp Ala Ala Ser 945 950 955 960 Val Ile Lys Arg Leu Ala Arg Gly Thr Leu Arg Gly Leu Asp Ile Lys 965 970 975 Asn Lys Lys Leu Ala Asp His Ile Ala Thr Met Asp Gln Gly Ile Thr 980 985 990 Gln Ile Asp Asp Ala Leu Ala Ser Ala Asp Thr Ile Asn Pro Arg Ile 995 1000 1005 Ala Tyr Gln Ile Arg Asn Ile Thr Asp Gln Lys Glu Ser Glu Met Phe 1010 1015 1020 Val Thr Lys Phe Ala Thr Ala Lys Thr Met Arg Met Val Ala Leu Ser 1025 1030 1035 1040 Ser Ser Gln Asp Val Ser Val Val Gly Leu Leu Asn Lys Arg Ser Gln 1045 1050 1055 Ala Lys Glu Ile Tyr Thr Ile Trp Arg Thr Gln Arg Lys Glu Gly Thr 1060 1065 1070 Leu Trp Ser Cys Ser Thr Gln Gln Ala Lys Lys Leu Arg Asp Gln Ser 1075 1080 1085 Trp Gly Lys Asn Ile Ile Gly Val Thr Ser Pro Ser Pro Leu Glu Ala 1090 1095 1100 Thr Ser Phe Lys Leu Ile Asp Pro Ile Ser Trp Glu Glu Glu Lys Glu 1105 1110 1115 1120 Ala His Gln Phe Thr Ile His Tyr Tyr Leu Ser Lys Pro Ser Leu Ser 1125 1130 1135 Ser Lys Thr Ala His Thr Thr Arg Gly Pro Leu Val Pro Tyr Phe Gly 1140 1145 1150 Thr Gln Thr Lys Pro Leu Ile Ala Lys Ala Tyr Met Glu Leu Lys Gly 1155 1160 1165 Asn Pro Arg Thr Asn Lys Ala Leu Gln Leu Leu Ser Met Arg Glu Thr 1170 1175 1180 Met Ile Lys Ala Gly Ser Asn Leu Asp Lys Leu Leu Leu Ser Leu Cys 1185 1190 1195 1200 Ser Asn Ala Leu Asp Ile Asp Val Asn Ser Leu Pro Ser Leu Gln Ala 1205 1210 1215 Gln Glu Glu Ala Ser Ala Gly Glu Gly Ile Arg Gly Gly Ile Lys Glu 1220 1225 1230 Ser Met Ser Pro Val Gly Pro Asp Asn Leu Tyr Thr His Ile Thr His 1235 1240 1245 Lys Val Phe Glu Arg Gln Trp Leu Ser Glu Phe His Val Asn Ile Ala 1250 1255 1260 Asp Phe Ile Ile Trp Gly Ile Thr Lys Thr Arg Gln His Leu Gln Val 1265 1270 1275 1280 His Thr Asp Leu Gly Gly Ser Leu Pro Ile Cys Val Pro Ala Cys Thr 1285 1290 1295 Glu Cys Tyr Arg Glu Lys Glu Arg Val Phe Leu Asp Ile Pro Arg Glu 1300 1305 1310 Thr Gly Trp Val Ser Thr Ser Thr Thr Ser Asp Lys Ala Gln Thr Tyr 1315 1320 1325 Phe Ser Thr Trp Cys Asp Leu Pro Arg Val Ser Thr Leu Pro Ser Leu 1330 1335 1340 Asp Gln Glu Asp Ala Thr Arg Leu Met Gly Arg Ser Met Ala Ile Gln 1345 1350 1355 1360 Lys Ser Thr Pro Gly Glu Ser Ile Thr Lys Phe Tyr Ser Thr Ala Pro 1365 1370 1375 Asp Thr His Arg Leu Leu His Pro Val Asp Leu Val Leu Gly Tyr Ala 1380 1385 1390 Glu Gly Thr Ile Phe Ser Tyr Met Lys Ser Gln His Asn Ile His Gly 1395 1400 1405 Ser Leu Tyr His Pro His Ile Glu Glu Ile Glu Pro Ala Leu Glu Lys 1410 1415 1420 Tyr Val Ile Asp Thr Lys Thr Ser His Thr Lys His Leu Gly Tyr Leu 1425 1430 1435 1440 Phe Gln Asp Glu Asp Ser Leu Gln Glu Leu Leu Glu Thr Gly Leu Thr 1445 1450 1455 Pro Tyr Ile Pro Arg Ser Ile Pro Leu Thr Ile Thr Glu Leu Thr Ser 1460 1465 1470 Ala Cys Cys Met Thr Leu Ala Lys Ala Ile Ser Ile Ile Leu Arg Thr 1475 1480 1485 Gly Val Thr Ile Pro Leu Met Pro Glu Asn Gly Leu Gly Glu Asn Asp 1490 1495 1500 Ile Gln Val Ala Arg Leu Thr Ala Asn Ser Phe Ser Arg Leu Met Pro 1505 1510 1515 1520 Arg Gly Arg Ile Gln Leu Val Tyr Leu Asp Cys Asp Leu Thr Pro Gln 1525 1530 1535 Met Thr Ala Trp Val Pro Thr Ser Gln Pro Ser Val Leu Gly Ser Ile 1540 1545 1550 Asn Phe His Ile Glu Gly Ile Ala Ile Ser Leu Thr Ala Thr Glu Met 1555 1560 1565 Arg Val Gly Gln Glu Ser Trp Glu Glu Arg Lys Trp Thr Cys Ser Asn 1570 1575 1580 Asn Arg His Ile Ile Ala Lys Gly Val Lys Thr Lys Ser Leu Phe Ile 1585 1590 1595 1600 His Gln Ser Val Pro Glu Ile Ile Thr His Pro Pro Asp Leu Ile Val 1605 1610 1615 Val Ile Gly Gly Gly Leu Gly Gly Cys Val Val Pro Tyr Leu Gln Lys 1620 1625 1630 Trp Arg Asp Pro Gln Val Ile Phe Cys Thr Leu Phe Asp Glu Arg Glu 1635 1640 1645 Arg Ile Ser Glu Asp Gly Asp Leu Ile Ile Pro Pro Glu Leu Leu Val 1650 1655 1660 Arg Gly Leu Ala Gly Arg Met Val Glu Lys Glu Leu Leu Glu Ala Glu 1665 1670 1675 1680 Met Cys Asp Ile Thr Val Lys Gly Asn Arg Asp Leu Leu Ile Lys Val 1685 1690 1695 Val Gln Lys Trp Val Gln Pro Asn Glu His Val Leu Leu Ile Asp Glu 1700 1705 1710 Ile Glu Asn Arg Gly Asp Gln Glu Ser Val Leu Gln Ser Ser Ile Ser 1715 1720 1725 Glu Leu Leu Thr Arg Met Asp Ser Val Cys Asn Leu Thr Ser Val His 1730 1735 1740 Thr Ile Arg Glu Thr Gly Pro Arg Gln Phe Ala Gln Arg Val Asn Thr 1745 1750 1755 1760 Ile Arg Arg Gly Arg Lys Thr Ala Thr Leu His Trp Asn Gln Tyr Asn 1765 1770 1775 Arg Arg Asp Gln Val Glu Ala Leu Leu Leu Val Glu Ser His Thr Arg 1780 1785 1790 Lys Thr Glu Leu His Val Thr Ser Ser Val Val Gln Ala Ala Phe Arg 1795 1800 1805 Lys Ile Asp Glu Lys Leu Glu Ser Glu Ser Arg Leu Glu His Ser Lys 1810 1815 1820 Trp Ser Leu Pro Glu Leu Pro Pro Arg Glu Lys Asp Ile Leu Leu Gly 1825 1830 1835 1840 Tyr Val Ala Ser Val Phe Leu Lys Leu Gly Leu Val Val Thr Asp Arg 1845 1850 1855 His Met Ser Ala Ala Ala Leu Ile Thr Leu Leu Glu Glu Ala Gly Pro 1860 1865 1870 Lys Met Ile Ser Trp Asp Lys Lys Met Glu His Arg Ser Trp Ala Ser 1875 1880 1885 Pro Asp Ala Ile Thr Glu Lys Gly Ile Thr Gln Asp Gln Ile Phe Ser 1890 1895 1900 Leu Leu Cys Phe Ala Trp Ala Leu Arg Gly Leu Lys Ser Gly Asp Trp 1905 1910 1915 1920 Glu His Asp Ala Asp Ala Ile Ile Leu Gln Asp Val His Ile Val Thr 1925 1930 1935 Gly Pro Arg Leu Cys Gln Met Gly Glu Ser Pro Lys Lys Thr Phe Ala 1940 1945 1950 Ser Phe Arg Leu His Asn Thr Lys Lys Ala Glu Asp Leu Lys Gly Tyr 1955 1960 1965 Leu Gly Ala Leu Leu His Leu Glu Ser Phe Phe Pro Phe Gly Glu Gln 1970 1975 1980 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caagccccaa gaagaaatcc actctgacaa cgctcgagga gatcattg 48 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 caatgatctc ctcgagcgtt gtcagagtgg atttcttctt ggggcttg 48 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtccccatga gttcgaggac ataaacaagg gcttggtctc tgtcccag 48 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctgggacaga gaccaagccc ttgtttatgt cctcgaactc atggggac 48 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaaacactct ggtcgtgctc aacccgacag gccaaaaaac tcaggg 46 <210> 9 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccctgagttt tttggcctgt cgggttgagc acgaccagag tgtttc 46 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgatgacgac tacccagggg ac 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 taagtcacac tcccatgtct 20 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ccaggtcgat aagatctgca tg 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cggtcttgat ccattctgtc c 21 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cctcatctca agacgtctca gttg 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tgtcattctc cccgagtcca ttct 24 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cccaagaaga aatccactcc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggcagctgtg gttagtcctc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 cccaagaaga aatccactct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ggcagctgtg gttagtcctc 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cccaagaaga aatccactcc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tgtccgaggg ccttcgtggc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 cccaagaaga aatccactct 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tgtccgaggg ccttcgtggc 20

Claims

VHSV(Viral hemorrhagic septicemia virus)의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제를 포함하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 VHSV 검출용 조성물의 검체는 어류의 혈액, 어류의 조직, 양어장 수 및 해수로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 고병원성 VHSV 검출용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출할 수 있는 제제는 상기 단백질의 변이 부위에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브 및 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하여 증폭시키는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 VHSV 검출용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 고병원성 VHSV 검출용 조성물을 포함하는, 고병원성 VHSV 검출용 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는 고병원성 VHSV 검출용 키트.
VHSV 함유 샘플에서, VHSV의 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열을 검출하는 단계를 포함하는 고병원성 VHSV의 검출방법.
제6항에 있어서, 상기 샘플은 어류의 혈액, 양어장 수 및 해수로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 단백질 P의 아미노산 서열에서 55번째 서열이 류신(L)으로 변이된 서열의 검출은 상기 단백질의 변이 부위에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer), 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브 및 단백질 P의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산에 특이적으로 결합하여 증폭시키는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.