KR102026764B1 - 안토시아닌 생합성을 증진시키기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 붉은 무로부터 분리한 RsTT8 및 RsMYB1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환시킨 식물체의 안토시아닌 생합성 증가 효과에 관한 것으로, 안토시아닌 생합성과 관련된 RsTT8 및 RsMYB1이 공동 발현되도록 형질전환시킨 형질전환 식물체에서 안토시아닌의 축적량이 증가하였으므로, 이를 안토시아닌의 생합성 및 생산에 이용할 수 있다.

Description

안토시아닌 생합성을 증진시키기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도{Recombinant vectors for enhancing anthocyanin biosysthesis and thereof uses}

식물의 본 발명은 안토시아닌 생합성을 증진시키기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것이다.

안토시아닌은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합 상태에 의해 자색, 청색, 적색 등의 색상을 나타내는 식물성 천연 색소이다. 최근 안토시아닌의 다양한 생리활성작용이 보고되고 있다. 예컨대, 노화억제작용, 항균작용, 돌연변이 억제작용, 콜레스테롤 저하작용, 시력개선효과, 혈관보호기능, 항궤양 기능, 항산화 기능 등이 규명되었다. 특히 항산화 활성 면에서 천연 항산화제인 토코페롤보다 5-7배의 강한 항산화 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 안토시아닌은 항산화 효과 및 천연색소물질로의 안전한 사용이 가능하여, 청량음료, 잼, 시력보호용 음료수, 사탕 등의 가공식품 생산과 향장공업, 염료공업, 의약품 개발 등에 활용되고 있다. 최근에는 발암성 및 간 독성이 우려되는 합성 착색료를 대신할 수 있는 안전한 천연 착색료로 주목을 받아 식품 영양학적인 면과 더불어 시각적 신선감 및 즐거움을 줄 수 있는 유용성분으로 평가되고 있다. 이러한 안토시아닌은 다양한 식물 종에 폭넓게 존재하며, 흔히 식물체의 꽃, 과실, 줄기, 잎, 뿌리 등에 함유되어 있다. 포도, 딸기, 올리브, 적양배추, 가지, 장미 등의 식물체로부터 안토시아닌을 추출하여 여러 가지 원료로 사용되고 있다.

한편, 식물에서의 안토시아닌 생합성은 식물 자체가 가지고 있는 유전적 요인과 이것이 잘 발현되도록 하는 환경요인의 상호작용에 의해 조절된다(비특허문헌 1). 즉 안토시아닌 생합성 관련 유전자들은 광도, 광질, 일장, 온도, 수분, 화학물질, 기타 요인들에 의해 자극을 받아 발현되는데(비특허문헌 2 및 비특허문헌 3), 일단 조절 유전자가 발현이 되면 생합성 과정에 관련된 여러 가지 효소가 생성되어 이들의 작용에 의해 안토시아닌이 만들어진다. 일반적으로 안토시아닌 생합성을 조절하는 유전자로는 R2R3 MYB 타입 유전자와 bHLH 타입 유전자가 밝혀져 있다. 이들 유전자들은 식물체의 다양한 조직-꽃, 잎, 과실 등-에서 단독 또는 서로 중합체를 형성하여 유전자의 발현을 조절하고 있는 것으로 알려져 있다. 안토시아닌 생합성 전사 조절자인 MYB 전사인자(transcription factor)를 암호화하는 MYB 유전자는 단일 또는 복수의 불완전한 반복으로 구성되는 구조적으로 보존된 DNA 결합 도메인이 특징인 전사인자 클래스를 가지며, R2R3 전사인자는 두 개의 반복 클래스의 DNA 결합 도메인을 가지고 있다. 옥수수(Zea mays), 페투니아 히브리다(Petunia hybrida), 토마토 등에서 MYB 유전자가 안토시아닌 생합성에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 상기 MYB 유전자는 안토시아닌 생합성 이외에도 페닐프로파노이드 대사(phenyl propanoid metabolism), 발달(development), 신호 전달(signal transduction), 식물병 저항성(plant disease resistant), 세포 분열(cell division) 등에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 최근 토마토에서 MYB 유전자 군의 하나인 ANT1 유전자가 분리되었으며, 상기 ANT1 유전자를 과발현시킨 형질전환 토마토에서 자주빛을 띠는 안토시아닌이 축적됨이 보고되었다(비특허문헌 4). 또한, 아라비돕시스(Arabidopsis thaliana)에서도 MYB 전사인자를 암호화하는 유전자들이 분리된 바 있다(특허문헌 1).

전사인자(transcription factors, TFs)는 대사 경로의 억제물질 또는 활성제로서의 활성을 갖는 조절 단백질이다. 따라서 TFs는 식물 내에서 전체적인 대사 경로의 조작을 위한 강력한 도구로써 사용될 수 있다. 많은 MYB TFs는 상기 안토시아닌 및 축합형 탄닌 생합성 둘 다를 포함하는 페닐프로파노이드 경로에서의 중요한 조절제이다. 포도(Vitis vinifera)에서의 다른 MYB TFs[CT 생합성의 조절과 관련이 있는 포도(VvMYBPA1) 버드풋 트레포일(Birdsfoot trefoil) 및 유채(Brassica napus)(BnTT2)]가 최근에 보고되었다.

이에, 식물체 내의 안토시아닌 생합성을 증진시키기 위한 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

미국특허 제6,573,432호

The Plant Cell, 7: 1071-1083 Plant Physiol. 92: 1191-1195 Planta, 194: 541-549 Helena Mathew et al., The Plant Cell, 15:1689-1703, 2003

본 발명의 목적은 RsTT8 및 RsMYB1을 포함하는 식물의 안토시아닌 생합성을 증진시키기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 식물의 안토시아닌 함량을 증가시킬 수 있는 작물을 개발하기 위해 연구하던 중, 붉은 무로부터 분리한 RsTT8 및 RsMYB1 유전자가 공동 발현됨에 따라 식물의 안토시아닌 생합성이 증진되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

구체적으로, 본 발명은 SEQ ID NO: 1의 염기서열로 이루어지는 RsTT8 유전자 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 이루어지는 RsMYB1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 “RsTT8 유전자” 및 “RsMYB1 유전자”는 붉은 무(Raphanus sativus L)로부터 유래된 유전자일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 염기서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 RsTT8 유전자는 SEQ ID NO: 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 RsMYB1 유전자도 SEQ ID NO: 2의 염기서열을 적용하는 것을 제외하고는 상기 RsTT8과 동일하게 변이체를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 안토시아닌 생합성 증진을 위한 용도로 사용될 수 있다. 상기 벡터는 제초제 저항성 Bar 유전자가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한, 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것일 수 있다.

본 발명에서, 상기 RsTT8 유전자 및 RsMYB1 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 “벡터”는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 “재조합 발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자로, 예컨대 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 섹물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스 또는 다른 벡터를 의미한다. 진핵세포에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 세포 또는 진핵세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 재조합 벡터가 발현 벡터이고, 원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 없는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예컨대, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pH79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예컨대, λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예컨대 SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 발현 벡터가 진핵세포를 숙주로 이용하는 경우, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예컨대 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예컨대 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예컨대 엠피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 테트라사이클린 및 바스타 제초제에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명은 RsTT8 유전자 및 RsMYB1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 RsTT8 유전자 및 RsMYB1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 생합성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 RsTT8 유전자 및 RsMYB1 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 RsTT8 유전자 및 RsMYB1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 안토시아닌 생합성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 RsTT8 및 RsMYB1 유전자는 위에서 기술한 모든 내용을 그대로 적용시킬 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

상기 식물체는 RsTT8 유전자 및 RsMYB1 유전자의 공동 발현에 의해 안토시아닌 함량이 식물체 전체에서 증가한 것일 수 있다. 또한, 안토시아닌 함량이 꽃 조직 및 종자에서 증가한 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터를 진핵세포에 형질전환시키는 경우, 숙주세포로서 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대 CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주), 식물세포 및 식물체 등이 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 숙주세포는 식물체일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 벡터는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate), 글루포시네이트암모늄(glufosinate ammonium) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. “프로모터”란 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며, 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. “식물 프로모터”는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. “구성적(constitutive) 프로모터”는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 상기에서 세포는 효모, 식물 세포와 같은 진핵세포 또는 대장균과 같은 원핵세포일 수 있다. 바람직하게는 박테리아(bacteria) 일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대장균 또는 아그로박테리움 속 미생물이다. 상기 본 발명에 따른 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하는 공지된 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 아그로박테리움 매개 형질전환법(Agrobacterium-mediated transformation), 입자 총 충격법(particle gun bombardment or microparticle bombardment), 실리콘 탄화물 위스커 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 폴리에틸렌글리콜에 의한 침전법 (polyethylenglycol-mediated uptake) 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 아그로박테리움 매개 형질전환법을 사용할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명에 따른 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 대두, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수로 이루어진 군에서 선택된 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근으로 이루어진 군에서 선택된 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채로 이루어진 군에서 선택된 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나로 이루어진 군에서 선택된 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립으로 이루어진 군에서 선택된 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스로 이루어진 군에서 선택된 사료작물류일 수 있다.

본 발명의 RsTT8 및 RsMYB1 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 식물체는 모든 조직에서 안토시아닌 색소 생합성이 유의적으로 증가하므로, 이를 지속적이고 안정적인 안토시아닌 생산 및 공급에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따르면 RsTT8 및 RsMYB1 유전자가 포함된 벡터로 형질전환된 식물체는 모든 조직에서 안토시아닌의 색소 축적이 증가하였으므로, 본 발명의 안토시아닌 생합성이 증가한 형질전환체를 이용하면 안토시아닌의 지속적인 생산 및 공급이 가능하다.

도 1의 A는 붉은 무로부터 분리된 bHLH 유전자인 RsTT8의 유전 계통도를 나타낸 것이며, B는 RsTT8 유전자의 도메인을 분석한 결과이다.
도 2의 A는 RsTT8 유전자의 세포 내 위치 확인을 위한 운반체의 모식도를 나타낸 것이며, B는 RsTT8 단백질의 세포 내 위치를 확인한 것이다.
도 3의 A는 다른 표현형을 지닌 3품종의 무 표현형(잎 및 뿌리)을 나타낸 것이며, B는 무의 잎, 뿌리 육질 및 표피에서의 안토시아닌 함량을 비교한 그래프이다.
도 4의 A는 3가지 무 품종의 잎 조직에서의 안토시아닌 생합성 유전자의 발현을 분석한 그래프이며, B는 3가지 무 품종의 뿌리 육질에서의 안토시아닌 생합성 유전자의 발현을 분석한 그래프이고, C는 3가지 무 품종의 뿌리 표피에서의 안토시아닌 생합성 유전자의 발현을 분석한 그래프이다.
도 5의 A는 담배 잎에서 RsTT8을 임시 발현시켜 관찰한 것이며, B는 담배 잎의 안토시아닌 함량을 분석한 결과이고, C는 담배 잎의 안토시아닌 발현 양상을 분석한 결과이다.
도 6의 A는 RsTT8 단백질의 상호결합을 확인하기 위한 운반체의 모식도를 나타낸 것이며, B는 Y2H 분석을 통한 RsMYB1과 RsTT8의 단백질-단백질 상호결합을 나타낸 것이다.
도 7의 A는 RsTT8과 RsMYB1의 안토시아닌 생합성 조절 기작을 알아보기 위한 운반체 모식도를 나타낸 것이며, B는 프로모터의 활성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8의 A는 RsTT8의 PA 생성 기능을 확인한 것이며, B는 RsTT8의 안토시아닌 생성 기능을 확인한 것이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 붉은 무 유래 안토시아닌 생합성 전사인자 선발 및 구조분석

1-1. 붉은 무로부터 bHLH 유전자 분리 및 유전자 염기서열 분석

붉은 무의 안토시아닌 생합성에 대한 조절 기전을 규명하기 위해 BHLH-TYPE TF 유전자를 동정하기 위해서 5’- AND 3’-RACE-PCR을 실시하였고, 완전장(full length) TT8 유전자를 확보하기 위해서 RsTT8-F/R를 사용하여 PCR을 실시하였다. 이때 사용한 프라이머의 서열은 아래 표 1과 같다.

서열번호	명칭	서열(5‘-3’ 방향)
SEQ ID NO: 3	5‘ RACE-TT8-R1	CCGCCTTCCTCCATTAGATTCATCATGTCC
SEQ ID NO: 4	5‘ RACE-TT8-R2	GCTCTTCGTTGATGGAGTGTTCAAAAAGAGCAGG
SEQ ID NO: 5	3‘ RACE-TT8-F1	GGCGGTGGTGCAATCTGTGGGGTGGACTTATAG
SEQ ID NO: 6	3‘ RACE-TT8-F2	GGAAGCGAGGGCTTGCACAGCACTGT
SEQ ID NO: 7	RsTT8-F	CACCATGGATGAATCAAGTATTATACCGGTATGG
SEQ ID NO: 8	RsTT8-R	CTAGAGTTTATTTTGAGATATGATTTGATGG

그 결과, 519 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화하는 1,560bp의 open reading frame이 동정되었다(GenBank accession number KY651179). RsTT8의 구조는 bHLH-type의 전사인자 형질과 잘 보존되어 있다. 유전적 계통도에서 다양한 식물 종으로부터 bHLH IIIf 단백질은 도 1의 A에 기술된 바와 같이 TT8 계통군과 GL3 계통군 두 개의 계통군으로 분류된다. RsTT8은 AN1(페튜니아), Intensifier(옥수수), 그리고 TT8(애기장대)을 포함하는 TT8 계통군에 속한다. GL3 계통군은 JAF13(페튜니아), R(옥수수), GL3/EGL3(애기장대)를 포함하고 있다. bHLH 그룹의 IIIf 단백질은 각 계통군 전사인자의 독특한 역할 또는 부분적으로 중복되는 기능을 수행한다. 예를 들면, AtTT8과 AtGL3은 각각 PA 생합성과 trichome을 형성하는 기능을 가지고 있는 반면에 그들은 안토시아닌 생합성을 조절하는데 관여하는 부분적으로 중복되는 기능을 지니는 것으로 보고되고 있다.

도 1의 B에서 보는 것과 같이, bHLH IIIf 단백질은 MYB interacting region(MIR, 하늘색), WD40 interaction domain(노란색), basic helix-loop-helix(bHLH) domain(분홍색), 그리고 C-terminal aspartokinase, chorismate mutasem TyrA(ACT)-like domain(회색)으로 이루어진 도메인들이 잘 보존되어 있다. N-terminal 부위의 MIR은 전사인자 복합체를 형성하는 MYB과 결합에 관여한다고 알려져 있다. WD40 단백질 또는 RNA polymerase와 결합하는 것으로 여겨지는 산성 아미노산이 풍부한 서열은 MIR과 bHLH 도메인 사이에 위치하고 있다. bHLH 도메인은 DNA 결합에 관여하는 60개의 아미노산 서열로 구성되어 있다. bHLH와 ACT-like domain을 포함하는 C-terminal 부분은 다른 bHLH 단백질과의 homo- 또는 heterodimer를 형성하는데 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

<실시예 2> RsTT8 단백질의 전사인자로의 기능 구명을 위한 세포 내 위치 확인

RsTT8 단백질의 전사인자로의 역할을 증명하기 위해서 애기장대 잎 protoplast에서 RsTT8의 subcellular localization을 시행하였다. p326-GFP 운반체를 이용하여 RsTT8 유전자를 아래 표 2의 프라이머로 증폭하고 infusion을 수행함으로써 p326-RsTT8:GFP 운반체를 제작하였다.

서열번호	명칭	서열(5‘-3’ 방향)
SEQ ID NO: 9	p326-RsTT8-F	CACGGGGGACTCTAGAATGGATGAATCAAGTATTATAC
SEQ ID NO: 10	p326-RsTT8-R	CCATGGATCCTCTAGAGAGTTTATTTTGAGATATGATTT

핵으로의 적중을 확인하기 위해서 Red 형광을 융합한 SV40 large T antigen에서 유래된 nuclear localized signal(NLS) peptide는 양성 대조구로 이용되었다.

도 2의 B에서 보는 것과 같이 RsTT8-GFP의 GFP 형광은 세포의 핵에 위치하는 반면, GFP 대조구는 애기장대의 잎 protoplast에서 세포질 전체에 분포한다. 이 결과는 RsTT8이 핵에 위치하는 단백질이며, 전사인자로 추정되는 역할과 일치함을 증명하였다.

< 실시예 3> 안토시아닌 함량 및 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 양상 분석

3-1. 무 품종별 안토시아닌 함량 및 안토시아닌 생합성 유전자 발현 분석

안토시아닌 생합성을 조절하는 기작을 밝히기 위하여 본 실시예에서는 다음과 같은 특성을 보이는 3가지 무 품종을 사용하였다.

N 무 품종의 경우, 잎은 녹색이며 뿌리에서는 하얀색 육질과 표피를 지니고 있고, C 무 품종의 경우 잎은 녹색이며 뿌리에서는 적색 육질, 하얀색 표피를 가지고 있고, D 무 품종은 잎은 적색이며 뿌리에서는 하얀색 육질, 적색 표피를 가지고 있다(도 3의 A).

육안으로 보는 것과 같이, 잎 조직에서는 D 무 품종이 높은 안토시아닌 함량을 나타내는 것을 확인할 수 있었고, 뿌리의 육질 부위에서는 C 무 품종이, 뿌리의 표피에서는 D 무 품종이 높은 안토시아닌 함량을 나타내었다. 상기 결과는 잎, 뿌리의 육질 및 뿌리의 표피에서의 안토시아닌 함량의 차이가 세 가지 다른 품종의 무의 색깔 차이를 나타내는 원인이 되는 것을 나타낸다.

3-2. 무 조직별 안토시아닌 함량 및 안토시아닌 생합성 유전자의 발현 분석

안토시아닌 생합성을 조절하는 3개의 전사인자(bLHH-type의 RsTT8, R2R3-MYB-type의 RsMYB1, WDR class의 RsTTG1)와 6종의 안토시아닌 생합성 유전자의 발현을 서로 다른 3품종의 잎, 육질, 표피에서 분석하여 도 4에 나타내었다.

그 결과, 잎에서 모든 구조 유전자의 전사 수준이 D, C, N 순으로 높게 나타났으며, 특히 RsTT8과 RsMYB1의 전사 수준은 적색(D)에서 녹색(C, N)과 비교하여 높게 나타났다(도 4의 A). 녹색(C, N) 잎보다 적색(D)에서만 높게 검출된 유전자 발현 패턴은 모든 여섯 가지 구조 유전자와 정확히 일치하였다. 특히, 녹색(C, N) 보다 적색(D) 잎에서 높았던 RsMYB1과 RsTT8의 발현 수준은 두 LBGs(RsDFR, RsANS)의 발현 수준과 유사한 수준이었다. 과육에서, 흰색(D, N)과 비교하여 적색(C)의 RsTT8과 RsMYB1의 발현은 높게 나타났으며, 나머지 생합성 구조 유전자의 발현도 높게 나타났다(도 4의 B). 흥미롭게도, 세 가지 품종 중 흰색(D)의 RsMYB1과 RsTTG1의 발현이 가장 높았으나, RsPAL을 제외한 세 개의 EBSs와 두 개의 LBGs 유전자의 전사 수준은 흰색(D)이 적색(C) 보다 낮게 나타났다(도 4의 B). 표피에서는, 흰색(N) 품종이 가장 낮은 RsTT8과 RsMYB1의 발현을 나타냈으며, 이는 RsCHS와 두 개의 LBG 발현과 일치하였다. 적색 표피를 나타내는 D 무 품종에서만 RsTT8과 RsMYB1의 전사 양상이 모든 여섯 가지 구조 유전자의 전사 양상과 상당히 일치하였다(도 4의 C). 다만, 흰색 과피(C)에서는 RsMYB1의 전사 수준이 높았으나, RsTT8의 발현은 상당히 낮았다. RsTT8의 발현 양상과 같이 두 개의 EBG(RsCHS와 RsF3H)와 두 개의 LBGs의 전사 수준은 흰색 과피(C)에서 거의 측정되지 않았다. 다른 흰색 과피(N)에서는 두 개의 LBGs의 발현 양상이 RsTT8과 RsMYB1의 발현 양상과 유사하게 나타났다.

모든 유전자의 발현을 비교했을 때, RsCHS, RsDFR, RsANS와 RsMYB1과 RsTT8의 발현 수준은 조직에 상관없이 안토시아닌 함량과 상당히 연관이 있음을 알 수 있었다(도 3 및 4 참조).

< 실시예 4> RsTT8 유전자 기능 검정

담배 식물에서 안토시아닌 생합성에 대한 RsTT8과 RsMYB1 기능의 역할을 확인하기 위해, RsMYB1(MYB)과 RsTT8(bHLH)을 포함한 2개의 다른 전사인자의 아그로 박테리움 균주로 일시적인 발현 검정을 수행하였다(도 5의 A). Mock의 결과와 유사하게(도 5A의 1), 담배 잎에서 RsTT8(도 5A의 2) 하나로는 안토시아닌 축적이 되지 않았다. 반면에 RsMYB1의 단독발현과 RsMYB1과 RsTT8와 동시발현한 결과 성공적으로 적색 색소가 나타났다(도 5A의 3과 4). 모든 적색 색소 축적은 agroinfiltration후 2일 만에 나타났으며, 7일째까지 점차적으로 증가했다.

agroinfiltration 후 5일째 잎 조각으로부터 안토시아닌을 추출하여 함량을 분석하였다. 안토시아닌 함량은 mock(1)과 RsTT8(2), RsMYB1(3)과 RsTT8, RsMYB1(4) 순서로 측정하였다(도 5B). 이 결과를 통해 RsTT8과 RsMYB1의 동시 발현이 RsMYB1 유전자 단독 발현과 비교하여 안토시아닌을 8배 이상 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 상기 결과는 RsTT8은 RsMYB1과 함께 안토시아닌 합성을 조절하는 MBW complex의 필수적인 구성요인임을 나타낸다. 안토시아닌 생합성 유전자들의 발현과 안토시아닌 생성과의 관계를 분석하기 위해서, agroinfiltration 한 담배 잎 조각에서 NtPAL, Nt4CL, NtCHS, NtCHI, NtF3H, NtF3’H, NtFLS, NtDFR, NtANS 과NtUFGT 를 포함한 10개의 구조유전자의 발현이 qPCR을 수행하여 확인하였다(도 5C). 도 5C에 따르면, RsTT8의 단독 발현은 mock과 유사하게 모든 안토시아닌 생합성 유전자 발현을 유도하지 못하였다. 그러나 RsMYB1의 단독 발현은 NtPAL, Nt4CL, NtFLS를 제외한 대부분의 안토시아닌 생합성 유전자의 발현을 증가시켰다. 이러한 발현 증가는 네 개의 EBGs(NtCHS, NtCHI, NtF3H, NtF3’H)와 세 LBGs(NtDFR, NtANS, NtUFGT)에서 나타났다. RsTT8과 RsMYB1이 동시에 발현되었을 때, 4종의 EBGs와 모든 세 개의 LBGs RsMYB1 단독 발현과 같은 양상으로 증가하였다. 흥미롭게도, bHLH 전사인자인 NtAN2의 전사 수준은 오직 RsTT8와 RsMYB1이 동시에 발현됐을 때 높게 나타났다. 이러한 결과는 유전자의 발현 증가와 안토시아닌 함량의 증가가 일치됨을 보여준다. 결과를 종합해 볼 때, 담배에서 RsTT8은 RsMYB1과 함께 안토시아닌 생합성을 증가시키는 중요한 전사인자임을 알 수 있었다.

< 실시예 5> RsTT8 및 RsMYB1의 단백질-단백질 상호결합 확인

MYB-bHLH-WDR 복합체는 안토시아닌 생합성 경로에 관련된 효소를 암호화하는 유전자를 조절하는 것으로 알려져 있다. RsMYB1과 RsTT8 사이의 상호작용을 알아보기 위하여, RsTT8 전체를 포함한 벡터와 각각 RsTT8L, RsTT8M, RsTT8N, RsTT8C로 디자인된 절단된 RsTT8 유전자를 bait 운반체를 구축하였고(도 6A), RsMYB1 단백질은 prey 운반체를 구축하여 Y2H 실험을 실시하였다(도 6B).

Bait 운반체 및 Prey 운반체를 구축하기 위해서, 각각의 운반체는 괄호안에 표기한 프라이머를 이용하여 증폭하였고, RsTT8L (pBD-RsTT8-F/pBD-RsTT8-R), RsTT8M(pBD-RsTT8-F/pBD-RsTT8M-R),RsTT8N(pBD-RsTT8-F/pBD-RsTT8N-R), RsTT8C(pBD-RsTT8C-F/pBD-RsTT8-R),RsMYB1(pAD-RsMYB1-F/pAD-RsMYB1-R), 각각의 프라이머는 아래 표 3과 같으며, 이를 사용하여 pGBKT7 운반체 및 pGADT7 운반체에 각각 infusion 방법으로 도입하였다.

서열번호	명칭	서열(5‘-3’ 방향)
SEQ ID NO: 11	pBD-RsTT8-F	CATGGAGGCCGAATTCATGGATGAATCAAGTATTATAC
SEQ ID NO: 12	pBD-RsTT8-R	GGATCCCCGGGAATTCGAGTTTATTTTGAGATAT
SEQ ID NO: 13	pBD-RsTT8M-R	GGATCCCCGGGAATTCGAAGAAACTCTTCATGTGTTCAAC
SEQ ID NO: 14	pBD-RsTT8N-R	GGATCCCCGGGAATTCAGGAACTCTCAAGATCATGTGTTTG
SEQ ID NO: 15	pBD-RsTT8C-F	CATGGAGGCCGAATTCCATGAAGAAGACGAAGAAGTAG
SEQ ID NO: 16	pAD-RsMYB1-F	GGAGGCCAGTGAATTCATGGAGGGTTCGTCCAAAGGG
SEQ ID NO: 17	pAD-RsMYB1-R	CACCCGGGTGGAATTCTTACACAGTCTCTCCATCTAACAGG

그 결과, RsMYB1과 C-terminal이 절단된 RsTT8(RsTT8M, RsTT8N)는 10 mM 3AT가 포함된 선택적 배지(HisLeuTrp)에서 자랐으며, 강하게 단백질-단백질 상호작용을 하는 것을 나타낸다(도 6B). 그러나, RsMYB1과 C-terminal이 포함된 RsTT8(RsTT8L과 RsTT8C)의 효소 콜로니는 10 mM 3AT가 포함된 선택적 배지(HisLeuTrp)에서 단백질-단백질 상호작용을 하지 않는 것으로 나타났다. 이 결과는 N-terminal의 MIR 영역이 RsTT8과 RsMYB1의 복합체 형성에 중요하며 안토시아닌 생합성을 위한 MBW 복합체의 구성 요소임을 의미하는 것으로 판단하였다.

<실시예 6> RsTT8 및 RsMYB1의 안토시아닌 생합성 조절 기작 연구

안토시아닌 생합성은 안토시아닌 생합성 관련 전사인자들(MBW)의 안토시아닌 생합성 유전자의 프로모터를 활성화시킴에 의해 증진되는 것으로 알려져 있다. 7-bp MYB-recognizing element(MRE)와 6-bp bHLH-recognizing element(BRE)는 일반적으로 안토시아닌 생합성 유전자의 프로모터 근처 부위에 존재하며, bHLH와 MYB전사인자의 표적으로 여겨지고 있다. 본 실시예에서, 담배 일시 검정법과 Y2H에서 RsMYB1과 RsTT8이 안토시아닌 생합성의 조절에 관여함을 보였다. RsMYB1과 RsTT8의 안토시아닌 생합성 유전자의 활성화 능력에 대한 통찰력을 얻기 위해 무의 안토시아닌 축적 조직에서 높은 전사 수준을 보였던 RsCHS와 RsDFR의 프로모터를 활용하여 담배 잎에서 프로모터 활성 일시검정 수행하였다.

아래 표 4의 프라이머를 이용하여 pTr-pRsCHS:GUS 운반체, pBAR-pRsCHS 운반체, pTr-pRsDFR:GUS 운반체, 및 pBAR-pRsDFR 운반체를 제작하였다. 제작된 pBAR-pRsCHS 운반체와 pBAR-pRsDFR 운반체를 아그로박테리움 GV3101에 Freeze-thaw 방법을 통하여 형질전환을 실시하여 argoinfiltration 분석을 실시하였다.

서열번호	명칭	서열(5‘-3’ 방향)
SEQ ID NO: 18	pRsCHS-F	GAACCCCACCTTAAAAACTTCTTA
SEQ ID NO: 19	pRsCHS-R	ATTAAACCAACTAGGTTTTCACTAG
SEQ ID NO: 20	pTr-pRsCHS::GUS-F	GGCCAGTGCCAAGCTTGAACCCCACCTTAAAAACTTCTTA
SEQ ID NO: 21	pTr-pRsCHS::GUS-R	GACCACCCGGGGATCCATTAAACCAACTAGGTTTTCACTAG
SEQ ID NO: 22	pBAR-pRsCHS-F	CCGACGTCGCATGCCTGCAGGAACCCCACCTTAAAAACTTCTTA
SEQ ID NO: 23	pBAR-Nos-R	CTAAGCTTGCATGCCTGCAGGAATTCCCGATCTAGTAA CATAG
SEQ ID NO: 24	pRsDFR-F	TATATCACCTACGAAAAATCTAAACTTTTA
SEQ ID NO: 25	pRsDFR-R	TTTTGTGTGTGTTGAAAAGATGGA
SEQ ID NO: 26	pTr-pRsDFR::GUS-F	GGCCAGTGCCAAGCTTTATATCACCTACGAAAAATCTAAAC
SEQ ID NO: 27	pTr-pRsDFR::GUS-R	GACCACCCGGGGATCCTTTTGTGTGTGTTGAAAAGATGGA
SEQ ID NO: 28	pBAR-pRsDFR-F	CCGACGTCGCATGCCTGCAGTATATCACCTACGAAAAATCTAAAC
SEQ ID NO: 29	pBAR-Nos-R	CTAAGCTTGCATGCCTGCAGGAATTCCCGATCTAGTAACATAG

RsDFR 유전자의 프로모터를 증폭 분리된 RsCHS 와 RsDFR 프로모터는 많은 MREs 와 BREs를 지니고 있다. 담배 agroinfiltration 분석을 실시하여 RsMYB1과 RsTT8이 RsCHS 와 RsDFR 유전자의 프로모터를 활성화 시킬 수 있는지 확인하였다. bHLH 조절자인 RsTT8과 MYB 조절자인 RsMYB1은 GUS reporter 유전자의 발현을 유도하는 표적 프로모터(RsCHS와 RsDFR)가 포함된 pTr-GUS 구조에 개별적으로 또는 공동으로 agroinfiltration을 실시하였다.

도 7에서 보는 바와 같이, RsTT8 단독은 RsCHS와 RsDFR의 프로모터를 활성화 시키지 못했으며, RsMYB1은 RsCHS 발현을 활성화하지는 못하였으나 RsDFR의 발현은 대조구와 비교하여 활성화 시켰다. RsTT8과 RsMYB1의 동시 발현은 RsCHS와 RSDFR의 프로모터 활성을 각각 2.5배, 18배 증가시켰다. 종합해보면, RsCHS와 RsDFR의 발현은 bHLH 단백질 RsTT8의 존재하에 RsMYB1에 의해 활성화될 수 있다. 이상의 결과로 안토시아닌 생합성 유전자 RsCHS와 RsDFR의 발현은 RsTT8과 RsMYB1에 의해서 유도되는 것임을 확인하였다.

<실시예 7> PA와 안토시아닌 생합성에 대한 RsTT8 기능 분석

플라보노이드 생합성 경로의 효과는 애기장대 tt8 -1 돌연변이(SALK_030966)에 RsTT8 유전자를 도입하여 확인하였다. tt8 -1 돌연변이(SALK_030966)을 TAIR에서 분양받아 homo 돌연변이체를 선발하여 형질전환을 위해 토양에 파종하여 생육시켰다. Floral dipping method를 통해서 tt8 -1 돌연변이체에 RsTT8 유전자를 도입하였다. 형질전환후 종자를 수확하고, 수확한 종자를 토양에 파종하여 0.3% basta를 처리하여 형질전환된 개체를 확보하였다.

tt8 -1 돌연변이는 PA가 결핍하게 되어 종자가 노란색을 나타내며, 줄기와 rosette 잎의 교차부위에 안토시아닌이 축적되지 않는다(도 8A). 제초제 저항성을 가진 18개의 독립적인 T₁으로부터 유래한 T₂ 종자는 야생형 애기장대 종자와 같은 갈색 종자를 생산하였다. 식물 성장 단계에서 T₃ 애기장대 형질전환체는 줄기와 rosette 잎 사이의 교차부위에서 적색을 나타나며, 이는 tt8 -1의 돌연변이형에서 RsTT8 유전자를 도입함으로써 보완되었음을 알 수 있다.

RsTT8 발현에 의한 안토시아닌 축적 효과를 알기 위하여 우리는 대조구, tt8 -1, 형질전환 식물체들 전체 잎으로부터 안토시아닌 색소를 추출하였다(도 8B).

대조구와 비교하여, 안토시아닌 함량은 tt8 -1 돌연변이체의 경우 대조구에 비해서 90% 이상 감소되었으나, 형질전환 애기장대 식물체는 대조구와 동일한 수준으로 안토시아닌 함량을 지니는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 RsTT8이 종자의 PA 합성과 잎과 줄기의 안토시아닌 축적에 기능함을 증명하였다.

<110> Republic of Korea <120> Recombinant vectors for enhancing anthocyanin biosysthesis and thereof uses <130> P17R12C1076 <160> 31 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1560 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsTT8 gene sequence <400> 1 atggatgaat caagtattat accggtatgg aaagtgatcg gagctgagga aaaagagatt 60 caagggctac ttaaggcggt ggtgcaatct gtggggtgga cttatagtct cttctggcaa 120 ctttgtcctc aacgaaggaa attggtgtgg agtagtggat tctacaacgg tgcaataaag 180 actagaaaga caactcagcc ggcggaaata acggctgaag aggctgcgtt ggagagaagc 240 caacagctca tggagcttta ccagacgctt tttgccggag aatcatcgat ggaagcgagg 300 gcttgcacag cactgtcgcc tgaggatttg acggacactg aatggtttta tgtgctgtgt 360 ctcacttact cttttgaacc tccttctggg atgccaggaa aggcgtatgc gaggaggaag 420 caagtatgga tgagtggtgt aaatgaggtt gacagtaaaa tcttctctag ggctatttct 480 gcaaagagtg ccaaaattca gacagtggtt tgcattcccg tgcttgatgg cgttttggaa 540 ataggcacaa cgaacaaggt caaagaaaat gaagagtttg ttgaacacat gaagagtttc 600 ttccaaaacc acccgaagtc aaacacgaag cctgctcttt ttgaacactc catcaacgaa 660 gagcatgaag aagacgaaga agtagaagaa atgacaatgt cagaggagat aagacttggt 720 tctcctgatg acgatgacgt ctccaatcaa aatctactct ctgatttcca tatagaagca 780 cccagtagtt tagatacaca aatggacatg atgaatctaa tggaggaagg cggaaattat 840 tctcagacag tatcaacact tctcatgtca caactcccca atcttctttc agattcagtt 900 tccacatctt cttacgttca atcatcgttt gtctcgtgga gggttgagaa tgtcaaagag 960 catcagcaat atcaacgaga ggagaaagcg tcgtcgtcat cctcgtcgca atggatgctc 1020 aaacacatga tcttgagagt tcctttactc catgaaaaca ctaaaaacaa gagggtgccg 1080 cgggaagagc tcaaccatgt ggtggccgag cgacgcagaa gagagaagct taacgagaga 1140 ttcataacgt tgagatcatt ggttccattt gtgaccaaga tggataaagt ctcgatcctt 1200 ggagacacca ttgattacgt aaaccatctt tgtaagagga tccatgagct ggaatctact 1260 catcacgagc caaaccaaaa gcggatgcgt atcggtaagg gaagaacgtg ggaagaggtg 1320 gaggtttcca ttatagagag cgatgttttg ttagagatga gatgcgagta ccgagatggt 1380 ttattgctca acattcttca ggtacttaag gagctgggta tagagaccac tgcagttcac 1440 accgccgtga acgaccatga ttttgaggca gagataaggg cgaaagtgag agggaagaaa 1500 ccaaccattg ctgaggttaa aatagccatc catcaaatca tatctcaaaa taaactctag 1560 1560 <210> 2 <211> 747 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1 gene sequence <400> 2 atggagggtt cgtccaaagg gctgagaaaa ggtgcatgga ctgctgaaga agataatctc 60 ttgaggcaat gcattgataa gtatggagaa gggaaatggc accaagttcc tttaagagct 120 gggctgaatc ggtgcaggaa gagttgtaga ctaagatggt tgaactattt gaagccaagt 180 atcaagagag ggaaacttaa ctctgatgaa gttgatcttc ttgttcgcct tcataaactt 240 ttgggaaaca ggtggtcttt aattgctggt agattacccg gtcggactgc caatgatgtc 300 aaaaattact ggaacaccca tttgagtaag aaacatgaac caggttgcaa gacccagatg 360 aaaaaagaaa agagaaacat tccttgctct cctactacac tagcccaaaa aatcgacgtt 420 ttcaaacctc gacctcgatc cttcaccgtt aacaacggct gcagccatat tattggcatg 480 ccaaaacctg acgttgttcc tctatgcctt cgatccaaca acaccaaaaa tgtttgtgaa 540 agtattgcta catgtaacaa agatgacgat aaatctgagc ttgatagtaa tttgatggat 600 ggtcagaata tgtggtggga gggtttgcta aatgaaaacc cagatccagc tgcactcttt 660 ccagaagcta cagcaacaga aaaaggcgca acctccgcat ttgacgttga gcaactttgg 720 agcctgttag atggagagac tgtgtaa 747 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'RACE-TT8-R1 <400> 3 ccgccttcct ccattagatt catcatgtcc 30 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'RACE-TT8-R2 <400> 4 gctcttcgtt gatggagtgt tcaaaaagag cagg 34 <210> 5 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'RACE-TT8-F1 <400> 5 ggcggtggtg caatctgtgg ggtggactta tag 33 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'RACE-TT8-F2 <400> 6 ggaagcgagg gcttgcacag cactgt 26 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsTT8-F <400> 7 caccatggat gaatcaagta ttataccggt atgg 34 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RsTT8-R <400> 8 ctagagttta ttttgagata tgatttgatg g 31 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p326-RsTT8-F <400> 9 cacgggggac tctagaatgg atgaatcaag tattatac 38 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> p326-RsTT8-R <400> 10 ccatggatcc tctagagagt ttattttgag atatgattt 39 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBD-RsTT8-F <400> 11 catggaggcc gaattcatgg atgaatcaag tattatac 38 <210> 12 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBD-RsTT8-R <400> 12 ggatccccgg gaattcgagt ttattttgag atat 34 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBD-RsTT8M-R <400> 13 ggatccccgg gaattcgaag aaactcttca tgtgttcaac 40 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBD-RsTT8N-R <400> 14 ggatccccgg gaattcagga actctcaaga tcatgtgttt g 41 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBD-RsTT8C-F <400> 15 catggaggcc gaattccatg aagaagacga agaagtag 38 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAD-RsMYB1-F <400> 16 ggaggccagt gaattcatgg agggttcgtc caaaggg 37 <210> 17 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pAD-RsMYB1-R <400> 17 cacccgggtg gaattcttac acagtctctc catctaacag g 41 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRsCHS-F <400> 18 gaaccccacc ttaaaaactt ctta 24 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRsCHS-R <400> 19 attaaaccaa ctaggttttc actag 25 <210> 20 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTr-pRsCHS::GUS-F <400> 20 ggccagtgcc aagcttgaac cccaccttaa aaacttctta 40 <210> 21 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTr-pRsCHS::GUS-R <400> 21 gaccacccgg ggatccatta aaccaactag gttttcacta g 41 <210> 22 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBAR-pRsCHS-F <400> 22 ccgacgtcgc atgcctgcag gaaccccacc ttaaaaactt ctta 44 <210> 23 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBAR-Nos-R <400> 23 ctaagcttgc atgcctgcag gaattcccga tctagtaaca tag 43 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRsDFR-F <400> 24 tatatcacct acgaaaaatc taaactttta 30 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pRsDFR-R <400> 25 ttttgtgtgt gttgaaaaga tgga 24 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTr-pRsDFR::GUS-F <400> 26 ggccagtgcc aagctttata tcacctacga aaaatctaaa c 41 <210> 27 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pTr-pRsDFR::GUS-R <400> 27 gaccacccgg ggatcctttt gtgtgtgttg aaaagatgga 40 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBAR-pRsDFR-F <400> 28 ccgacgtcgc atgcctgcag tatatcacct acgaaaaatc taaac 45 <210> 29 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pBAR-Nos-R <400> 29 ctaagcttgc atgcctgcag gaattcccga tctagtaaca tag 43 <210> 30 <211> 519 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RsTT8 protein sequence <400> 30 Met Asp Glu Ser Ser Ile Ile Pro Val Trp Lys Val Ile Gly Ala Glu 1 5 10 15 Glu Lys Glu Ile Gln Gly Leu Leu Lys Ala Val Val Gln Ser Val Gly 20 25 30 Trp Thr Tyr Ser Leu Phe Trp Gln Leu Cys Pro Gln Arg Arg Lys Leu 35 40 45 Val Trp Ser Ser Gly Phe Tyr Asn Gly Ala Ile Lys Thr Arg Lys Thr 50 55 60 Thr Gln Pro Ala Glu Ile Thr Ala Glu Glu Ala Ala Leu Glu Arg Ser 65 70 75 80 Gln Gln Leu Met Glu Leu Tyr Gln Thr Leu Phe Ala Gly Glu Ser Ser 85 90 95 Met Glu Ala Arg Ala Cys Thr Ala Leu Ser Pro Glu Asp Leu Thr Asp 100 105 110 Thr Glu Trp Phe Tyr Val Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Phe Glu Pro Pro 115 120 125 Ser Gly Met Pro Gly Lys Ala Tyr Ala Arg Arg Lys Gln Val Trp Met 130 135 140 Ser Gly Val Asn Glu Val Asp Ser Lys Ile Phe Ser Arg Ala Ile Ser 145 150 155 160 Ala Lys Ser Ala Lys Ile Gln Thr Val Val Cys Ile Pro Val Leu Asp 165 170 175 Gly Val Leu Glu Ile Gly Thr Thr Asn Lys Val Lys Glu Asn Glu Glu 180 185 190 Phe Val Glu His Met Lys Ser Phe Phe Gln Asn His Pro Lys Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Pro Ala Leu Phe Glu His Ser Ile Asn Glu Glu His Glu Glu 210 215 220 Asp Glu Glu Val Glu Glu Met Thr Met Ser Glu Glu Ile Arg Leu Gly 225 230 235 240 Ser Pro Asp Asp Asp Asp Val Ser Asn Gln Asn Leu Leu Ser Asp Phe 245 250 255 His Ile Glu Ala Pro Ser Ser Leu Asp Thr Gln Met Asp Met Met Asn 260 265 270 Leu Met Glu Glu Gly Gly Asn Tyr Ser Gln Thr Val Ser Thr Leu Leu 275 280 285 Met Ser Gln Leu Pro Asn Leu Leu Ser Asp Ser Val Ser Thr Ser Ser 290 295 300 Tyr Val Gln Ser Ser Phe Val Ser Trp Arg Val Glu Asn Val Lys Glu 305 310 315 320 His Gln Gln Tyr Gln Arg Glu Glu Lys Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser 325 330 335 Gln Trp Met Leu Lys His Met Ile Leu Arg Val Pro Leu Leu His Glu 340 345 350 Asn Thr Lys Asn Lys Arg Val Pro Arg Glu Glu Leu Asn His Val Val 355 360 365 Ala Glu Arg Arg Arg Arg Glu Lys Leu Asn Glu Arg Phe Ile Thr Leu 370 375 380 Arg Ser Leu Val Pro Phe Val Thr Lys Met Asp Lys Val Ser Ile Leu 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ile Asp Tyr Val Asn His Leu Cys Lys Arg Ile His Glu 405 410 415 Leu Glu Ser Thr His His Glu Pro Asn Gln Lys Arg Met Arg Ile Gly 420 425 430 Lys Gly Arg Thr Trp Glu Glu Val Glu Val Ser Ile Ile Glu Ser Asp 435 440 445 Val Leu Leu Glu Met Arg Cys Glu Tyr Arg Asp Gly Leu Leu Leu Asn 450 455 460 Ile Leu Gln Val Leu Lys Glu Leu Gly Ile Glu Thr Thr Ala Val His 465 470 475 480 Thr Ala Val Asn Asp His Asp Phe Glu Ala Glu Ile Arg Ala Lys Val 485 490 495 Arg Gly Lys Lys Pro Thr Ile Ala Glu Val Lys Ile Ala Ile His Gln 500 505 510 Ile Ile Ser Gln Asn Lys Leu 515 <210> 31 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RsMYB1 protein sequence <400> 31 Met Glu Gly Ser Ser Lys Gly Leu Arg Lys Gly Ala Trp Thr Ala Glu 1 5 10 15 Glu Asp Asn Leu Leu Arg Gln Cys Ile Asp Lys Tyr Gly Glu Gly Lys 20 25 30 Trp His Gln Val Pro Leu Arg Ala Gly Leu Asn Arg Cys Arg Lys Ser 35 40 45 Cys Arg Leu Arg Trp Leu Asn Tyr Leu Lys Pro Ser Ile Lys Arg Gly 50 55 60 Lys Leu Asn Ser Asp Glu Val Asp Leu Leu Val Arg Leu His Lys Leu 65 70 75 80 Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu Pro Gly Arg Thr 85 90 95 Ala Asn Asp Val Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu Ser Lys Lys His 100 105 110 Glu Pro Gly Cys Lys Thr Gln Met Lys Lys Glu Lys Arg Asn Ile Pro 115 120 125 Cys Ser Pro Thr Thr Leu Ala Gln Lys Ile Asp Val Phe Lys Pro Arg 130 135 140 Pro Arg Ser Phe Thr Val Asn Asn Gly Cys Ser His Ile Ile Gly Met 145 150 155 160 Pro Lys Pro Asp Val Val Pro Leu Cys Leu Arg Ser Asn Asn Thr Lys 165 170 175 Asn Val Cys Glu Ser Ile Ala Thr Cys Asn Lys Asp Asp Asp Lys Ser 180 185 190 Glu Leu Asp Ser Asn Leu Met Asp Gly Gln Asn Met Trp Trp Glu Gly 195 200 205 Leu Leu Asn Glu Asn Pro Asp Pro Ala Ala Leu Phe Pro Glu Ala Thr 210 215 220 Ala Thr Glu Lys Gly Ala Thr Ser Ala Phe Asp Val Glu Gln Leu Trp 225 230 235 240 Ser Leu Leu Asp Gly Glu Thr Val 245

Claims (9)

1. SEQ ID NO: 1의 염기서열로 이루어지는 RsTT8 유전자; 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 이루어지는 RsMYB1 유전자;를 포함하는 식물의 안토시아닌 생합성을 증가시키기 위한 재조합 벡터.
2. 제1항의 재조합 벡터로 형질전환된 안토시아닌 생합성이 증가된 형질전환체.
3. SEQ ID NO: 1의 염기서열로 이루어지는 RsTT8 유전자; 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 이루어지는 RsMYB1 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 상기 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 이루어지는 유전자들을 과발현시키는 단계를 포함하는 식물의 안토시아닌 생합성을 증가시키는 방법.
4. SEQ ID NO: 1의 염기서열로 이루어지는 RsTT8 유전자; 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 이루어지는 RsMYB1 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 상기 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 이루어지는 유전자들을 과발현시키는 단계를 포함하는 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법.
5. 제4항의 방법에 따라 제조된 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체.
6. 제5항에 있어서,
   상기 식물체는 애기장대(Arabidopsis thaliana), 담배(Nicotiana tabacum) 또는 붉은 무(Raphanus sativus L)인 형질전환 식물체.
7. 제5항 또는 제6항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
8. 제5항 또는 제6항의 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 추출하는 단계를 포함하는 안토시아닌 생합성이 증진된 형질전환 식물체로부터 안토시아닌을 생산하는 방법.
9. SEQ ID NO: 1의 염기서열로 이루어지는 RsTT8 유전자; 및 SEQ ID NO: 2의 염기서열로 이루어지는 RsMYB1 유전자;를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 안토시아닌 생합성 증진용 조성물.

Images