KR102041381B1 - 능동적인 면역치료법을 이용한 비-소세포성 폐암의 치료 - Google Patents

Abstract

본 명세서는 예를 들어 비-소세포성 폐암(NSCLC)과 같은 암으로 고통 받는 환자들을 치료하기 위한, 신규한 면역요법적 치료 용법이다. 이 용법은 사전에 화학방사능 요법을 받은 환자에 대한 인간 텔로머레이즈로부터 유래한 펩티드 및 GM-CSF의 병합치료를 수반한다.

Description

능동적인 면역치료법을 이용한 비-소세포성 폐암의 치료{TREATMENT OF NON-SMALL CELL LUNG CARCINOMA BY ACTIVE IMMUNOTHERAPY}

본 발명은 항암 치료 및 면역학 분야에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 능동적 면역치료법을 이용한 암 치료, 즉 다시 말해 인간 텔로머레이즈의 촉매 작용 부분(catalytic subunit)에서 유래된 펩티드를 사용한 능동적 면역화에 의해 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)을 치료하는 방법에 관한 것이다.

폐암은 전세계적으로 남녀 모두에게서 암 사망의 주요한 원인이 되고 있다. 그 중 약 80%가 비-소세포성 폐암(NSCLC)으로, 대부분의 대상 환자가 수술로 치료가 불가능한 3기 또는 4기인 질환이다. 전이성 질환(4기)은 나쁜 예후, 즉 1%의 5년 생존율을 나타낸다. 3기 환자 치료의 성공여부는 국소적 질환 및 잠재적 전이를 모두 조절할 수 있느냐에 달려있다. 질환이 적절한 방사선 선량(radiation volume) 영역, 즉 1-3A기내에 포함될 수 있는 경우, 치료 방법으로서 치료 목적의 방사능 요법(=60 Gy)이 선택이 된다. 그러나, 방사능 요법만으로 치료받은 3기 환자들의 5년 생존율은 5% 미만이다. 또한 이 중 약 3분의 1의 환자들은 국소적으로 재발하고, 다른 3분의 1의 환자들은 원격 전이(distant metastases)로 이행하고, 나머지 3분의 1은 두 가지 모두를 나타낸다. 복합적인 치료에 대한 여러 가지 접근들이 연구되어 왔다. 이에는 유도 화학요법 및 화학-방사능 병용 요법뿐 아니라 통합 화학요법(consolidation chemotherapy)이 포함된다. 그러나 현재까지 진전은 제한적이었다. 대부분의 환자들은 질환의 재발로 사망하게 되며, 새로운 치료 전략이 요구된다.

최근 폐암에 대한 백신의 개발이 보다 주목을 받고 있다. 현재 서로 다른 백신 전략을 시도하는, NSCLC 환자들에 대한 수 개의 대규모 3상 임상실험이 진행 중이다.

효소 텔로머레이즈는 NSCLC 포함하는 대부분의 인간 암에서 발현되고, 이는 범용 암 백신들에 대한 매력적인 타깃으로 고려된다. 텔로머릭 DNA는 염색체의 안정성을 부여하며, 정상적인 체강 세포들은 제한된 횟수의 세포분열만 할 수 있는데, 이는 매 체세포분열마다 텔로미어가 짧아지기 때문이다. 종양 세포는 새로운 텔로미어 소단위를 합성하는 텔로머레이즈를 발현함으로써 이러한 생체 시계를 회피한다.

펩티드 GV1001(서열번호 1)은 hTERT (human telomerase reverse transcriptase, 인간 텔로머레이즈 역전사효소)의 활성화 부위에서 유래된 16개의 아미노산으로 구성된다. 이와 관련하여 2개의 GV1001 임상 실험이 보고되었다. GV1001 펩티드는 DP, DQ 및 DR 보조 좌위들(subloci)에 의해 코드화(encoding) 되는 다양한 HLA class II (Human leukocyte antigen class II) 분자들에 의해 인식된다. 이러한 가리지 않는 HLA-결합 프로파일은 GV1001이 일반적인 환자 군에서 적용 가능한 백신일지도 모른다는 것과 각각의 개인간에 T-도우미 (T-helper) 반응을 널리 이끌어낼 수도 있다는 것을 제시한다. 이에 더하여, GV1001은 좁은 범위의 HLA class I 항원 결정기(epitope)를 포함하는데, 이는 CD8+ 세포독성 T 세포의 채택을 가능하게 한다.

이전에 이루어진 NSCLC 백신 임상 실험에서, 26 명의 사전 치료가 많이 수행되고, 진행된 질환(대부분 4기)을 가진 환자들에게 텔로머레이즈 펩티드 I540과 GV1001로 백신 접종이 이루어졌다. 화학 또는 방사능 요법은 수반되지 않았다. 백신-특이성 T세포의 반응은, 치료와 관련된 어떠한 심각한 부작용이 없는 가운데, GV1001에 대하여 13명의 환자에게서, I540에 대하여 2 명의 환자에게서 관찰되었다.

본 발명의 실시예의 목적은 NSCLC에 의해 고통 받는 환자들을 위한 신규 치료 용법을 제공하는 것이다.

종래의 치료법과 암 백신들을 조합한 것에 대하여 관심이 증가하고 있다. 화학 요법이 면역반응을 저해한다고 여기는 기존 우려들은 가능한 시너지 효과들에 관한 고려들로 보강되었다.

많은 경우에, 대부분의 종양 세포들은 종래 치료법에 의해 제거된다. 그러나 종양은 결국 재발한다. 암 백신은 이와 다른 기전을 통하여 작동하고, 화학- 및 방사능 요법에 저항성을 가지는 암세포들에 대하여 효과적일 수 있다. 게다가, 화학-방사능요법은 면역 반응을 저지하기 보다 오히려 증가시킬 수도 있다. 첫째로, 조직 손상은 "위험신호"를 유도하고, 이는 전-염증성(pro-inflammatory) 미세환경을 제공하게 된다. 둘째로, 방사능에 의해 유도되는 유전자 산물이 종양을 T-세포 공격에 더 민감하게 만든다고 제시하는 증거들이 있다. 셋째로, 폐 종양들은 숙주(host)의 면역 반응을 방해하는 것으로 여겨지는 조절 T-세포들을 정박(harbor)시키며, 여러 연구들은 화학요법이 조절 T-세포들 및 골수-유래 억제 세포(myeloid-derived suppressor cells, MSDC)를 억제할 수도 있음을 제시한다.

마지막으로, 본 발명에서 치료 용법으로 적용된 (아래 참조), 도세탁셀 (docetaxel)은 잠정적으로 다른 기전을 통하여 백신 반응을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 텔로머레이즈 펩티드 GV1001(EARPALLTSRLRFIPK, 서열번호 1)로 3기 NSCLC 환자들에게서 진행한 백신 2상 임상실험 데이터에 기초한다. 본 연구는 화학-방사능요법 직후의 GV1001 백신 접종에 대해 평가되었다.

상세하게는, NSCLC 환자들의 GV1001 백신 접종을 연구한 2상 임상 실험 결과를 제공하였다. 임상 실험 연구는 23명의 환자들을 포함하였으며 치료와 관련된 어떠한 중대 유해 사례(serious adverse effect)도 나타내지 않았다. 본 연구는 한 프로토콜당 80%의 면역 반응을 보여주었다. 이러한 반응율은 텔로머레이즈-기초 접근법들을 연구한 것들을 포함한 대부분의 암 백신 임상 실험과 비교할 때, 상당한 것이다. 게다가, 본 연구는 내구적인 GV1001-특이적 T 세포 기억 반응의 생성에 대하여도 나타내었다.

다양한 접근, 장기적 데이터의 가능성 및 면역반응과 임상 결과 간의 관련성들은 특히 흥미롭다.

만약 약물 용법과의 병용적인 적용이 되면, 암 백신이 가장 효과적일 수 있다는 것을 제시하는 이론적 논쟁들이 많은 반면에, 어떻게 이러한 양상들이 상호 작용하는가에 대한 임상 실험 데이터는 희박하다. 흥미롭게도, 본 발명에서 진행된 임상 실험에서의 면역 반응자들의 빈도가, 단일요법으로 백신 접종을 연구한 본 발명자들의 3개의 진행중인 GV1001 임상 실험 보다 우수하였다. 이 발견은 화학-방사능요법을 적용하는 것이 면역화를 저지하지 않으며, 아마도 면역 반응을 좋게 하는데 기여했을지도 모른다는 것을 제안한다.

대부분의 백신들이 HLA-class I 에 부합하는 항원 결정기를 나타내는 반면에, HLA II(HLA class II)에 부합하는 길이가 긴 펩티드인 GV1001은, 본 발견에 따르면, 특히 병용적인 프로토콜에 적합할 수도 있다. 긴 펩티드는 CD4+ T-도우미 세포들에 의해 채택되는데, 이는 다른 면역 세포들과 광범위하게 상호 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 방사능에 조사된 종양 조직에서, GV1001-특이적 T-도우미 세포들은 세포 자살성(apoptotic) 종양 세포들에서 오는 항원들을 표시하는 항원 표시 세포(Antigen presenting cell, APC)들을 모집하고 항원 결정기들의 분산을 유도한다.

본 발명의 발명자들은 GV1001 임상 실험에서 장기 생존자들에게서 진행되는 연구에 대해 이러한 화제들을 다루며 실제적으로 GV1001 외부의 hTERT 항원 결정기들에 대응하는 반응을 밝힌다. NSCLC 환자들을 대상으로 한 새로운 1/2상의 임상 실험에서, 우리는 화학- 또는 방사능요법을 병용하여 이들 신규한 hTERT 펩티드를 이용한 백신 접종을 계획한다.

암 백신 반응의 장기적 발달에 대한 것과 어떻게 백신 부양(boosting) 스케쥴을 설계할 것인가에 대해 알려진 것은 제한적이다. 본 발명에 제시된 GV1001 임상 실험에서, 몇몇 대상들은 첫 번째 백신 접종 후에는 음성으로 테스트되었지만, 부양 접종 수 개월 후에는 T 세포 반응이 탐지 가능하게 발달되었다. 이와 같이, 우리는 부양 백신 접종에 의해서 T-세포 반응이 강화되는 것으로 보이는 GV1001 및 다른 백신들의 기존 연구들을 찾았다. 이러한 연구들은 연장된 기간 동안 반복된 백신 접종이 보다 높은 면역 반응율과 보다 오래가는 반응을 가져다 준다고 제안하였다. 얼마나 오랫동안 부양 백신 접종을 계속해야 하는 것인지에 대한 의문은 여전히 밝혀져야 할 것으로 남아있다.

그러나, 본 발명의 발명자들은 최후 백신 접종 후 43개월까지 얻은 샘플을 통하여 6-12개월 동안 면역화된 환자들이 GV1001반응을 유지하는 것을 입증하였다. 마지막 연구는 GV1001-백신 접종이 오래가는 T 세포 기억을 제공할 수도 있음을 제안하였다. 이러한 백신 접종을 고려하면, 후속 샘플들에서 왕성한 반응이 없는 환자에게만 부양 접종(booster injection)을 제공하는 것이 필요한 것일 수도 있다.

장기 생존자의 사이토카인 반응 분석에서 높은 레벨의 주요 Th1 (T-helper 1) 반응기 사이토카인들인 인터페론-감마(Interferon γ, INFγ)와 TNFα(Tumor necrosis factor alpha), 그리고 낮은 레벨의 IL-4(interleukin-4) 및 IL-10(interleukin-10)이 나타났다. 이 사이토카인 패턴들은 면역성과 T 세포들간의 바람직한 조화를 제시할 수도 있다. 만약 이러한 반응들이, 보통의 백신 임상 실험에서, IFNγ, IL-4 및/또는 IL-10에 대해서만 분석되었다면, 그들은 "Th1"로 쉽게 지정되었을 것이다. 따라서, 본 발명의 발명자들이 상당한 레벨의 주요 Th2(T-helper 2) 사이토카인들인 IL-5(interleukin-5) 및 IL-13(interleukin-13)을 검출한 점에 주목할 수 있다. 그 후의 관찰은 백신 임상 실험의 사이토카인 프로파일이 자주 Th1/Th2 산정(delineation)을 따르지 않는다는 다른 선행 연구들에서 밝혀진 것들과 일치한다. 이는 강력한 면역 활성에의 반응에 대하여 Th2 사이토카인들이 발생할 수 있음을 제안하는 것이다. 본 발명의 발명자들에 의해 장기 생존자들이 관찰되었고, 넓은 범위의 Th1/Th2 사이토카인들은 다기능 (polyfunctional) 반응을 가리킬 수도 있다. 여러 연구들, 특히 감염성 질병에 대한 것들은 다기능 사이토카인 프로파일들이 보호적 면역과 관련되어 있음을 제안하고 있다.

이전의 화학요법 없이 진행된 GV1001 임상 실험들에서, 면역 반응자들의 빈도는 DTH(Delayed-type hypersensitivity, 지연형 과민증) 기록 또는 T-세포 어세이를 통해 평가된 것과 비슷하다. 대조적으로, 대부분의 본 발명에서 제시된, 화학요법 직후에 백신 접종된 임상 실험의 대상들은 DTH 음성이었다. 이러한 관찰은 GV1001 반응에 있어 화학 요법의 가능한 면역 조절효과를 암시한다.

텔로머레이즈는 정상 줄기세포에 의해 발현된다. 아래에 언급된 예시의 임상 실험에서 화학-방사능요법 직후에 GV1001 백신 접종이 시작되었을 때, 줄기세포와 관련된 독성이 구현되지 않았음이 주목할 만하다. 장기적 안전성을 고려하여, 우리는 2년 이상 독성이 감지되지 않은 19개의 연구 대상을 모니터하였다(표 2 참조).

또한, 관련 연구(아래의 본 예시의 끝부분 참조)에서 환자들의 장기적인 데이터는 부양 면역화 및 8년을 넘어선 지속적인 면역 반응들이 효과적(well tolerated) 이었음을 제시하였다. 골수 샘플들의 지속적인 모니터링과 말초 혈액 계수(counts)에서 어떠한 독성도 발견되지 않았다. 우리는 또한 수년 동안 GV1001로 백신 접종이 된 흑색종 및 대장암 환자들의 유지되는 혈액 계수를 관찰하였다. 모두에게서, 우리의 데이터는 GV1001 백신 접종의 약한 독성 프로파일을 제시하였다.

NSCLC 임상 실험의 대부분의 환자들은 그들의 면역 반응에도 불구하고 진행되는 질환을 경험하였다. 이러한 관찰은 진행성 NSCLC의 공격적인 본성을 반영한다. 다른 한편, 우리는 몇몇 대상들에게서 오래가는 종양 반응을 관찰하였고 거의 모든 장기 생존자들이 면역 반응자에 속한다는 것을 알아내었다.

우리는 GV1001 백신 접종이 NSCLC 환자를 높은 비율로 면역화 한다고 결론지었다. 높은 면역 반응 비율은 고무적이고 그리고 백신이 사전 HLA (Human leukocyte antigen) 구분 없이 일반적인 환자 집단에 적용 가능한 것을 나타낸다. 게다가, 골수 기능이 위태롭지 않는 동안, 텔로머라제 항원에 대한 장기 T 세포 기억을 유도한다. 백신 과 화학- 또는 방사능 요법이 결합된 개념을 수반하는 2상 임상실험에서 높은 면역 반응율과 낮은 독성이 관찰되었다. 이는 다른 암 백신들과 GV1001 양쪽의 임상학적 개발에 모두 흥미롭다. 중요하게도, 본 연구는 또한 임상 실험적 효과의 단서(signs) 또한 제공한다.

진행성 질환 NSCLC 환자들에게서 일련의 임상 1/2상 실험(수반되는 화학- 또는 방사능 요법을 받은 적이 없는 환자들에게 수행됨)은 면역 반응 과 생존 사이의 강한 관련성을 보여주었다. 우리는 결과가 GV1001의 NSCLC에 대한 연구를 더 보증한다고 생각한다. 높은 면역 반응율, 낮은 독성 그리고 임상적인 활성에 대한 단서들은 더 크게 무작위화된 임상을 지휘하는 것에 대한 기초를 제공한다. 이러한 맥락에서 날짜로 1000일 넘게 생존한 12/13 환자들이 면역 반응자들인 것은 흥미롭다. 관찰된 관련성은 무작위화된 임상 실험에서 NSCLC에 대한 GV1001의 평가가 보증된다는 것을 제안한다. 췌장암에서, GV1001 3상 임상 실험은 현재 진행 중이다.

이런 이유로 2상 임상 실험으로부터 얻은 상기 참조된 결과들에 기초하여, 본 발명은 인간 환자의 암을 치료하는 방법을 개시하고, 상기 방법은 효과적인 양의 EARPALLTSRLRFIPK (서열번호 1) 펩티드 및 면역학적 애쥬번트를 투여하는 것을 포함하며, 상기 환자들은 방사능 요법을 적용 받고 선택적으로 화학적 요법도 적용 받으며, 상기 환자들은 치료 시작 전 4 내지 28일 간의 방사능요법을 적용 받는 것을 포함한다.

본 명세서에 명백히 제시된 것에 따르면, 이러한 결합 요법이 NSCLC 환자들에게 유망한 것으로 보여 왔지만 많은 수의 다른 암 종류들로 고통 받으며 방사능요법 또는 화학 요법으로 치료되고 있는 환자에게 있어서 서열번호 1이 이로운 항암 면역을 유도하는 잠재성을 가진다고 여겨진다는 것이다. 여기서 언급한 것에 따르면, 최근에 공격적인 세포증식억제성/세포독성 약 및/또는 방사능요법으로 치료를 받은 환자들의 질환 진행에서도 눈에 띄게 면역 반응이 증가하는 것이 가능한 것으로 나타났다.

이런 이유로 본 발명에 따르면, 서열번호 1은, 화학요법 및/또는 방사능 요법이 질환과 싸우는데 쓰인다면, 모든 암 종류는 아니지만 대부분에서, 화학요법 및/또는 방사능요법과 관련되는 병용 치료에 유용할 것이다. 문제의 환자들이 화학요법을 진행해왔거나 진행 중이면서, 서열번호 1로 치료를 시작하기 전에 4 내지 28일 동안 방사능 요법을 받은 적이 있는 경우가 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 치료되는 암은 비-소세포성 폐암(NSCLC)이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 서열번호 1은 피내 투여되지만 다른 간편한 투여 경로가 적용될 수도 있다. 예를 들어, 서열번호 1은 피하 투여되거나, 또는 통상적으로 사용되는 다른 비경구 투여 경로, 예를 들어 복강 내 또는 근육 내 경로를 통할 수 있다.

선호되는 투여 위치는 하복부이나, 투여 위치는 편리하고 알맞게 변경될 수 있다. 이는 투여 위치가 사지(limbs) 또는 등쪽일 수 있음을 의미한다.

보통 면역 애쥬번트는 서열번호 1과 동일한 부위에 투여된다. 여기서 "동일한 부위"는 인체에서 같은 부위 및 같은 종류의 투여를 모두 의미한다. 따라서 만약 서열번호 1이 하복부에 피내 투여 된다면, 애쥬번트 또한 하복부에 피내 투여된다.

본 발명의 실시예에 따르면, 면역학적 애쥬번트는 일반적으로 서열번호 1 투여 직전, 예를 들어 1-30, 2-29, 3-28, 4-27, 5-26, 6-25, 7-26, 8-25, 9-24 분 사이, 서열번호 1 투여 이전에 투여된다. 바람직하게는 애쥬번트는 서열번호 1 투여 10-15분전에 투여된다.

서열번호 1의 투여량은 반드시 효과적이어야 하며, 이는 최소 10nmol의 투여량, 예를 들어 최소 50nmol, 또는 200, 또는 250nmol 이어야 한다. 다른 한편, 투여되는 양은 보통 최대 2000nmol, 예를 들어 최대 1500nmol, 최대 1000nmol, 또는 최대 800nmol, 예를 들어 최대 500nmol 이다. 특별히 바람직한 실시예에 따르면 그 양은 약 300nmol이다.

애쥬번트는 어떠한 편리한 면역학적 애쥬번트도 될 수 있으나, 특별히 면역자극성 애쥬번트가 적절하다. 적절한 면역학적 애쥬번트의 예들은 WO 98/20027에 언급되어 있다. 특히 면역학적으로 흥미로운 애쥬번트는 과립구 대식세포 콜로니 자극인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)이며 이 애쥬번트는 본 발명의 한 실시예에서 1회 투여당 75μg의 양으로 투여되었으나, 특정 인체 부위 및 특정 경로를 통하여 주입될 때 GM-CSF의 효능성에 따라 실험된 것으로 결정된 것에 따라 투여량은 높거나 낮아질 수 있다.

상기 언급된 바에 따르면, 본 발명에 의해 치료된 환자들은 이전에 화학요법 및 방사능요법에 의해 치료받은 적이 있었다. NSCLCL의 치료에 대한 어떠한 화학요법적인 용법도 사용될 수 있지만, 본 발명의 실시예에서는, 도세탁셀로 치료받은 뒤 서열번호 1로 면역화 되었을 때, 상세하게는 20 mg/m² (m² 표시는 치료받은 개인의 체표면적을 의미함)로 도세탁셀을 투여 받은 후에 유익한 효과가 관찰 되었다.

또한 방사능요법적 치료 용법은 NSCLC 치료에서 어떠한 편리한 용법도 될 수 있으나, 본 발명의 실시예에서는, 2Gy x 30의 3D 방사능요법으로 구성된 방사능 요법 후의 결과가 아래와 같이 보고되었다.

본 발명의 방법은 효과적인 면역 반응을 유도하기 위하여 면역화 1 이후에 반복적인 면역화를 수반한다. 이 면역화 계획(scheme)은 환자들이 같은 투여량의 서열번호 1 및 면역학적 애쥬번트를 그 뒤에 같은 경로를 통하여 첫 번째 면역화를 위해 투여 받고, 다음의 계획: 처음 투여 후에 1주일 동안 두 번, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 14, 18, 22주 차에 한번, 6개월째에 한번 그리고 9개월째에 한번 투여에 따르는 것을 수반하는 아래의 실시예를 따른다. 그러나, 이러한 면역 계획은 최적화 될 수 있고, 실시예에서 보여주었듯이, 후속의 또는 부양하는 면역화의 숫자가 감소될 수 있는 가능성이 있으며 - 숙련된 면역학자가 더 최적화된 면역화 계획으로부터 결정을 내릴 수 있다. 대체적으로, 환자 개인의 면역학적 상태가 모니터링 되며, 이 모니터링의 결과에 기초하여 면역화 프로토콜이 각 환자에 따라 개별적으로 조정될 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서 및 청구항에 개시된 방법을 위해 사용되는 GV1001(서열번호 1)을 말한다. 나아가 본 발명은 또한 본 발명의 명세서 및 청구항에 개시된 방법에 따른 NSCLC의 치료를 위한 약학적인 조성물의 준비를 위한 서열번호 1의 사용을 말한다.

[용어의 정의]

"GV1001"은 펩티드 EARPALLTSRLRFIPK(서열번호 1)을 말하며, 이는 인간 텔로머레이즈 단백질(hTERT)의 아미노산 서열로부터 유래된 것이다.

"방사능 요법"은 일반적으로 이온화된 방사능의 사용으로 종양을 치료하는 것을 말하며, 이는 국소적 또는 전신에(systemically) 적용될 수 있다. 정확한 종류의 효과적인 방사능 요법은 암 종류별로 다르고 일반적으로 당업자에게 잘 알려진 것이다.

"화학요법"은 일반적으로 다양한 세포독성 또는 세포증식억제성 약으로 암환자를 치료하는데 사용되었다. 즉 본 발명의 명세서에서, 화학요법은 예를 들어 아래의 약물 그룹을 사용하는 항암 치료법을 나타낸다:

항-대사물질(anti-metabolites)(L01B) 은 퓨린(purine)들 (예를 들어 아자티오프린(azathioprine) 및 머캅토퓨린(mercaptopurine)) 또는 피리미딘(pyrimidine)들을 모방하며, 이들은 DNA 의 빌딩블록이다. 항-대사물질들은 이러한 물질들이 세포 주기의 "S"기 동안 DNA 안에 포함되는 것을 방해하고 정상 발달 및 분열을 막는다. 이들은 또한 RNA 합성에도 영향을 미친다.

식물성 알칼로이드(alkaloid) 및 터르페노이드(terpenoid) (L01C). 이러한 알칼로이드들은 마이크로튜불(microtubule)의 기능을 방해한다. 주된 예는 빈카(vinca) 알칼로이드와 탁센(taxene)들이다.빈카 알칼로이드(L01CA)는 마다가스카 페리윙클(Madagscar periwinkle), 카타란투스 로져스(Catharanthus roseus) (빈카 로제아(Vinca rosea)로 공식적으로 알려진)로부터 유래되고, 그리고

빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈오렐빈(vinorelbine), 빈데신(vindesine)을 포함한다.

포도필로톡신(Podophyllotoxin)(L01CB) 은 식물유래 화합물로, 소화를 돕는 다고 알려져있으며, 에토포사이드(etoposide) 및 테니포사이드(teniposide)의 2가지 서로 다른 세포증식억제제를 생산하는데 사용된다. 이들은 세포가 G1기(DNA 복제 시작기)로 진입하는 것과 DNA의 복제(S기)를 방지한다.

탁센(Taxane)(L01CD)은 천연 생산물인 파클리탁셀(paclitaxel), 원래는 탁솔(Taxol)로 알려진 것에서 유래되고, 첫 번째로 태평양 주목나무(Pacific Yew tree) 껍질에서 유래된 것이다. 도세탁셀(Docetaxel)은 파클리탁셀의 반-합성 아날로그이다. 탁센은 마이크로튜불의 안정성을 강화하여 세포 주기의 진행성(anaphase) 동안 염색체들이 분리되는 것을 막는다.

토포이소머레이즈 저해제(Topoisomerase inhibitiors) (L01CB 및 L01XX). 이들은 타입 I 토포이소머레이즈 저해제, 예를 들어 캄토테신(camptothecin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 그리고 타입 II 저해제, 예를 들어 암사크린(amsacrine), 에토포사이드(etoposide), 에토포사이드 인산염(etoposide phosphate), 테니포사이드(teniposide)를 포함한다.

세포독성 항생제(cytotoxic antibiotics) (L01D) 는 악티모마이신(actinomycin) (L01DA01), 안트라사이클린(anthracycline)들 예를 들어 도부록신(doxorubicin) (L01DB01), 다우노루비신(daunorubicin) (L01DB02), 발루비신(valrubicin), 이다루비신(idarubicin), 에피루비신(epirubicin) (L01DB03), 그리고 다른 세포독성 항생제, 예를 들어 블레오마이신(bleomycin )(L01DC01), 플리카마이신(plicamycin) (L01DC02), 미토마이신(mitomycin) (L01DC03)을 포함한다.

"면역학적 애쥬번트"는 그것의 통상적인 의미를 가진다: 물질 또는 조성물이, 개인에게 투여될 때, 항원에 대한 특이적 면역반응의 유도/유발을 돕는 -것을 말한다. 본 발명에서 바람직한 애쥬번트는 GM-CSF이다.

도 1는 GV1001-특이적인 T세포 반응들을 나타내는 그래프이다.
PBMC(peripheral blood mononuclear cell, 말초 혈액 단핵구 세포)는 치료요법 시작 전, 6주차, 10주차 및 매 백신이 투여된 직후에 각각 얻었다. PBMC는 체외에서 한 번 자극되었고, 방사능 노출된 PBMC ± 펩티드 GV1001에 대항하는 증식 실험에 사용되었다. 컬럼들은 평균적인 SI값(stimulatory index, 자극 색인)을 나타낸다(GV1001가 있을 때 반응과 없을 때 반응으로 나뉨). 만약 기록된 SI값이 각 차트의 상한 값을 초과 하게 되면, 정확한 SI값은 컬럼들의 최고 끝부분에 표시된다. 다이아그램은 모든 평가 가능한 환자들의 백신 접종 전-, 후-의 T세포 반응들을 나타낸다. 각 개별 환자들에서, 가장 높은 SI값을 가지는 시간 점(time point)이 표시된다. SI값>2인 반응들은 GV1001 특이적이라고 여겨졌다.
도 2는 GV1001-특이적인 T세포 반응들을 나타내는 그래프이다.
PBMC는 치료요법 시작 전, 6주차, 10주차 및 매 백신이 투여된 직후에 각각 얻었다. PBMC는 체외에서 한 번 자극되었고, 방사능 노출된 PBMCs ± GV1001에 대항하는 증식 실험에 사용되었다. 컬럼들은 평균 cpm(counter per minute, 분당 계수)값 또는 SI값을 나타낸다(GV1001가 있을 때 반응과 없을 때 반응으로 나뉨). 만약 기록된 cpm값 또는 SI값이 각 차트의 상한 값을 초과하게 되면, 정확한 cpm값 또는 SI값은 컬럼들의 최고 끝 부분에 표시된다. B 및 C는 장기 T세포 기억을 나타낸다. 다이아그램은 후속 샘플들로부터 기록된 T세포 반응의 발달을 보여준다. D-F는 샘플들이 PBMC 분리 이전에(*표시) 하룻밤 동안 저장된 것이 대부분 음성으로 실험된 것을 보여주며, 이는 새롭게 분리되어 양성으로 실험된 샘플에서 조차도 똑같이 나타났다. G는 도착 하자마자 분리된 또는 하룻밤 동안 저장된 PBMC 샘플들의 병렬 실험을 도시한다.
도 3은 환자들의 생존을 나타내는 그래프이다.
PFS(progression-free survival, 무진행 생존)값은 카플란-메이어(Kaplan-Meier)분석에 의해 분석되었다. 면역 반응자들은 비-면역 반응자들과 비교되었다. PFS값은 본 명세서에 개시된 프로토콜에서 임상 종료 점으로 정의되었는데, 이는 진행 이후 표준 치료가 OS(3기 환자들)에 영향을 주는 것으로 보이기 때문이다. 플롯은 GV1001 T-세포 반응이 있는 환자 또는 없는 환자들에 대한 연구에서 PFS값을 보여준다. 면역 반응자들에 대해서는 관찰된 PFS값이 연장된다.

[준비물 및 방법]

환자들과 연구 프로토콜

2상 임상 실험의 일차적인 목적은 면역학적 반응이다. 독성과 진행 시간은 이차적인 목적이다. 수술이 불가능한 NSCLC 3기 A/B인 23명의 대상은 2006년 11월에서 2008년 7월 사이에 노르웨이에 있는 3개의 다른 센터에서 등록되었다. 20명의 환자들은 노르웨이 라디움 병원(Radium Hospital), 4개의 세인트 올라프 병원(St. Olav? Hospital) 및 7개의 크리스탄샌드(Kristansand)에 있는 노르웨이 남부 병원(Southern Hospital)에서 등록되었다. 임상 실험은 노르웨이 의약청(Norway Medicines Agency), 지역 사회 의료 윤리 연구모임(Regional committee for Medical Research Ethics) 및 병원 심의 위원회(Hospital Review Board)에 의해 승인되었다. 이는 헬싱키 세계 의료 협회선언(the World Medical Association Declaration of Helsinki)을 준수하였다. 모든 환자로부터 서명동의안을 받았다.

연구 집단은 지난 4주 동안, 20mg/m²의 도세탁셀 과 2Gy x 30의 3차원(3D) 방사능 요법으로 치료받았다. 전이성 질환인 대상은 이전 연구에서 흉부(thorax) 및 상복부(upper abdomen) CT 스캔 과 뇌의 전자기공명(MRI) 스캔에 기초하여 제외되었다. 적격 기준은 Eastern Oncology Group (ECOG) 성능(performance) 상태(status) 0-2, 나이= 18세, 백혈구수치 = 1.5 x 10⁹/L; 혈소판수치 = 100 x 10⁹/L, 헤모글로빈수치 = 9g/dL (= 5.6 mmol/L); 크레아티닌(creatinine)수치 = 140 μmol/l (1.6 mg/dl), 빌리루빈(bilirubin) = 20% 정상 상한 이상, ASAT(aspartate amino transferase) 및 ALAT(alanine amino transferase) = 1.5, 정상 알부민(albumin)의 상한 = 2.5 g/L 을 포함하였다. 제외되는 기준은 이전에 악성 종양 경력이 있는 경우, 치유 가능하게 치료된 기저세포 또는 피부 비늘 세포 암종(squamous cell carcinoma) 또는 자궁암 IB기는 제외하고, 항생제 치료를 요하는 활성화된 감염 또는 유의한 심장병 또는 다른 의학적 병증, 예를 들어 심각한 출혈성 심부전증, 가변성 협심증, 심각한 부정맥, 아나필락시스 같은 백신에 대한 심각한 부정적인 반응이 있는 경우를 포함하였다. 자가면역 질환 또는 B, C형 간염 또는 HIV 감염에서 양성인 환자들도 본 연구에서 제외되었다.

실험 설계

본 연구의 배후 전략은 NSCLC 3기 환자를 대상으로 하는 3상 임상 실험을 조성하기 위한 것이며, 다양한 치료전략 안에서 백신을 평가하는 것이다. GV1001의 투여량은 NSCLC 및 췌장암에서 투여량-점증 임상 실험을 한 우리의 이전 실험의 데이터에 기초한다. 화학방사능적 요법은 수술 불가능한 NSCLC 3기에 대한 2006년 기관 표준 치료에 해당하였다. 20명의 평가 가능한 환자들을 포함하기 위한 우리의 결정은 주 연구 목적: 화학적 요법과 GV1001을 함께 사용한 치료법이 실현 가능한가 그리고 면역화를 얻어낼 수도 있는가를 보여주는 것, 안전성 자료를 제공하는 것 그리고 PFS 및 면역 반응율에 대한 추산을 얻어내는 것에 기초하였다. 주어진 샘플 크기에서, 면역 반응을 보인 대상 그리고 중대 유해 사례(SAE)의 숫자는 이항분포를 따를 것이다. 통계적인 계산은 n=20 및 나타난 이항분포에 기초하였다. 임상 1/2상 연구에서 관찰된 실제 반응 비율 54%를 가정하면, 5 또는 그 이상의 면역 반응자가 검출될 확률은 99.8%이다. 실제 SAE 빈도 10%를 가정하면, 1 또는 그 이상의 SAE를 검출할 확률은 87,8%이다.

치료

임상 실험에서, GV1001 백신 접종은 마지막 방사능 요법 치료 후 4일부터 4주 내에 시작되었다. 면역화는 1주차(월요일, 수요일 및 금요일) 그리고 2, 3, 4, 6, 8 및 10주차 각각에 한번씩 주어졌다. 부양 면역화는 14, 18, 22주차, 6개월차 및 9개월차에 각각 주어졌다. GV1001(0.20ml 살린(saline) 내의 300nmol 펩티드)은 피내(intradermally, i.d.)투여로 하복부에 주사되었다. GM-CSF(75μg Leukine; Bayer, Oslo Norway)는 같은 부위에 GV1001보다 10-15분 먼저 주사되었다.

펩티드

백신 펩티드 GV1001은 hTERT의 611-626번의 16개 아미노산 잔기에 해당한다(EARPALLTSRLRFIPK; 서열번호 1). GV1001은 Pharmexa (HØsholm, Denmark)에서 제공받았다. 제조공정은 GMP를 준수하였다. RAS-펩티드508(KRAS 52-70, Q61H; Norsk Hydro, Norway)는 T-세포 어세이의 음성 컨트롤로 제공되었다.

T-세포 배양 및 어세이

말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)는 치료요법 시작 전, 6, 10주차 및 매 백신 접종 직후에 얻었다. PBMC는 분리되어 이전에 기재된 바와 같이 냉동되었다. 해동된 PBMC는 이전에 언급한 바와 같이, T-세포 어세이 이전에 백신 펩티드로 체외에서 한번 자극되었다. 이러한 초기 자극 후, PBMC는 7-10일 동안 GV1001(25μmol/L)와 함께, 그리고 3일차부터는 추가된 IL-2(10U/ml)와 함께 배양되었다.

T-세포 증식 어세이(³H Thymidine)는 이전에 언급한 바와 같이 필수적으로 행해졌다. 전- 그리고 후- 접종 샘플은 펩티드에 대한 반응을 위하여 병행 분석 되었다. 방사능이 조사된 자가유래의 PBMC는 항원 표시 세포(APC)로 사용되었다. 스타필로코칼 엔테로톡신 C (Staphylococcal enterotoxin, SEC)에 의한 자극은 양성 컨트롤 및 면역성의 척도(immunocompetence)로 사용되었다. 모든 환자들은 SEC에 대하여 반응하였다. T-세포 배양은 3회 테스트 되었다. SEM은 보통 10%이하였다. 무관한 펩티드(K-RAS 508) 자극 이후 증식 정도 측정은 일반적으로 펩티드가 없는 컨트롤과 뚜렷한 다른 점이 없었다. 자극 지표(stimulatory index, SI; 항원 없는 반응과 나뉜 항원 반응)가 2보다 높을 때 T-세포 반응은 항원-특이적이라고 여겨졌다.

바이오플랙스(Bioplex) 사이토카인 분석은 T-세포 자극 48시간 후 채집된 상층액에서 행해졌고, 제조사의 프로토콜에 따랐다(Bio-Rad Laboratories). 상층액은 2회/3회 분석되었고, 각 유사점들은 T-세포 자극과 바이오플랙스 어세이를 통하여 계속 분리된 채 유지 되었다.

지연형 과민증

지연형 과민증(DTH) 피부 테스트는 베이스라인, 2, 3, 4, 6, 10주차 및 백신 접종 후에서 수행되었다. DTH 테스팅 동안, 0.10ml 살린 내 60nmol GV1001은 백신 접종한 부위와 분리된 부위에 GM-CSF 없이 피내로 주사되었다. 환자들은 투여 후 48시간 DTH 피부 반응을 등록하였다. 양성적인 DTH 테스트는 평균 직경= 5 mm 인 홍반/경화로 정의되었다.

임상 평가

유해한 약물 반응 및 ECOG 수행 상태는 각각의 방문 시 마다 평가되었다. 혈액 스크리닝 과 일반적인 건강 진단은 백신 접종 시작(1주차), 2, 3, 4, 6, 8, 10 및 이 후의 매 접종마다 수행되었다. CT스캔은 백신 접종 시적 전, 및 14주차, 이 후 매 3개월마다 수행 되었다.

무진행 생존은 CTN-2006 프로토콜에서 주된 임상적 종료시점으로 정의되었는데, 왜냐하면 전반적인 생존이 진행 후 표준 치료에 의해 영향을 받는 경향이 있기 때문이었다. 방사성 섬유증은 일반적으로 종양과 확실하게 구분하기 힘들다. 백신 접종의 시작점에서, 독자생존 가능한 종양 조직을 포함 하거나 혹은 하지 않는 화학-방사선요법 이후 환자들은 잔류 CT 병소를 가진다. 따라서 완료 반응, 부분 반응 및 안정된 질환의 시기는 적당하지 않았다. 진행성 질환은 CT스캔, 기관지경 검사 및/또는 조직검사에 의해 판명되는 새로운 또는 진행중인 병소로 정의된다.

통계

PFS(무진행 생존)는 백신 접종 시작점부터 계산되었다. PFS를 고려하여, 카플란-메이어/로그-순위(Kaplan-Meyer/log-rank) 분석은 면역 반응자 대 비-면역 반응자를 비교하는 것으로부터 적용되었다. 면역 반응이 독립적인 진단 요소를 나타냈는지를 평가하기 위해서, 진입 분석과 함께하는 콕스(Cox) 퇴행이 수행되었다. 대상자들은 3A 또는 3B기로 판명되었다.

[결과]

환자 특성 및 치료 엄수

환자 특성 및 치료 세부사항은 표 1에 제시되어 있다. 2007년 말, Bayer은 액상 GM-CSF(Leukine)을 시장에서 철수하였다. 이것은 동결 건조 제품이 전달될 때까지 갑작스런 부족을 일으켰다. 따라서 라듐호스피탈렛 (Radiumhospitalet) 에서는 2명의 환자 중 한 명이 GV1001 주사를 면역학적 애쥬번트 GM-CSF없이 맞았다. 세인트 올라프 병원에서는, 2명의 다른 환자들이 각각 2회(8 및 10주차)에 결합된 백신 접종을 받지 못했다. 패널을 모니터링한 본 연구는 2번 백신 접종에서 GM-CSF를 맞지 못한 환자들(203번 및 204번)을 교체하였고 그리고 프로토콜 분석에서 배제하였다. 110번 환자 또한 프로토콜에 대하여 평가 가능하지 않았다, 왜냐하면 그녀는 8주차에 오른쪽 폐의 종양 및 병의 진행으로 인해 철수되었기 때문이다.

안전성

안전한 집단은 적어도 한번 이상 백신 접종(n=23)을 받은 모든 환자들을 포함한다. 총합 323회 백신 투여량이 투여되었다(환자당 8-21회 투여량). 6명의 환자에게서 일곱 번의 중대 유해 사례(SAE)가 보고되었다. 그러나 조직 검사와 함께 행해진 기관지경 검사는 누공이 종양 재발 때문이었던 것을 보여주었다.

면역 반응

GV1001-특이적 T 세포 반응은, 백신 접종 전 샘플에서 아무 환자에게서도 나타나지 않은 것과 비교하여, 백신 접종 후 16명의 환자에게서 나타났다(도 1 참조). 양성적인 DTH 반응은 오직 한 명의 환자에게서만 관찰되었다. 3명의 대상은 프로토콜에 따라 평가 가능하지 않았다(상기 참조). 면역학적 반응율은 치료 목적 분석법(Intention to treat, ITT)에 의해서는 70% 그리고 프로토콜에 의해서는 80%로 나타났다.

지속 가능한 임상적 효과를 얻기 위해서는, T 세포 기억의 발달이 요구 되는 듯 하다. 우리는 따라서 부양 백신을 제공하였고 면역 반응의 장기적 발달을 모니터 하였다. 15/16 면역 반응자들에게서 후속 샘플들이 얻어졌다. 결과는 13/15 대상에서 오래가는 GV1001-특이적 T 세포 반응이 나타났고, 최대 91주까지 관찰 기간을 두었다(표 2 및 도 2a-b 참조).

다른 센터와 비교하여, 우리는 라듐호스피탈렛, 오슬로 (Radiumhospitalet Oslo)의 9/12 환자들(프로토콜 당 9/11), 트론하임 (Trondheim) 세인트 올라프 병원 1/4 환자들(프로토콜 당 1/2) 및 크리스탄샌드 (Kristiansand)의 6/7환자들의 GV1001-특이적 T 세포 반응을 기록하였다. 트론하임 및 크리스탄샌드에서 얻은 샘플들은 오슬로로 T세포 분석을 하기 위해 보내었다. 처음 샘플들의 일부는 PBMC 분리에 앞서 하룻밤 저장되었다. 하룻밤 저장된 샘플들은 음성적 결과만을 주었다. 우리는 그리하여 같은 환자들에게서 얻은 차후의 샘플들은 도착 즉시 분리하기로 결정하였다. 흥미롭게도, 대부분의 이전 음성 환자들이 양성으로 테스트 되었다. 게다가, 후에 같은 환자들에게서 얻은 샘플들을 하룻밤 저장하자 다시 음성으로 테스트 되었다(도 2c-e참조). 우리는 또한 테스트된 샘플들을 같은 날 또는 하룻밤 동시에 저장하였고 신선하게 저장된 샘플들의 반응이 명백하게 강하다는 것을 관찰하였다(도 2f참조). 이러한 관찰들은 T 세포 분석의 다중심 임상을 관리하는 것의 어려움을 보여 주였고 그리고 T 세포 데이터가 만약 분석이 최적화되어 다루어지지 않은 샘플로 수행된다면 잘못된 결과를 가지고 올 수도 있음을 제시하였다.

임상적 반응

표 2는 진행 없는 생존(PFS), 전반적인 생존 및 재발 지점을 보여준다. PFS는 프토토콜에 따른 임상적인 종료 지점이며 3달 간격의 CT 스캔으로 평가되었다. 날짜에 대하여, 종양 진행은 ITT 집단(중앙 PFS값 357일)의 17/23 환자들에서 기록되어왔다. 재발의 징후가 없는 6명당 5명의 환자들은 면역 반응자들이다. 참여한 모든 환자들을 고려하였을 때, 면역 반응자들은 비-면역 반응자들에 비하여, 371일 대 182일의 평균값으로, 증가된 PFS를 기록하였다(도 3 참조).

SEQUENCE LISTING <110> GEMVAX AS <120> TREATMENT OF NON-SMALL CELL LUNG CARCINOMA BY ACTIVE IMMUNOTHERAPY <130> PCTEP2012054272 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile Pro Lys 1 5 10 15

Claims (14)

1. 서열번호 1로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 환자 치료용 조성물로서,
   상기 환자는 이전에 암을 치료하기 위하여 방사능요법 및 화학요법을 모두 받은 적이 있는 환자이며,
   상기 서열번호 1로 이루어지는 펩티드를 유효성분으로 포함하는 암 환자 치료용 조성물은, 마지막 방사능요법 치료 후 4일 내지 4주 이내에 투여를 시작하는 것이며,
   상기 펩티드 투여는 1주차에 3회, 그리고 2, 3, 4, 6, 8 및 10주차 각각에 한번씩 투여하고, 그 이후 14, 18, 22주차, 6개월차 및 9개월차에 각각 투여하는 것이며,
   상기 화학요법은 탁센(Taxane)을 투여하는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 환자는 상기 서열번호 1에 의한 치료 개시 이전에 방사능요법을 4 내지 28일간 받은 적이 있는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 암은 비-소세포성 폐암(NSCLCL)인 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 피내 투여되는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
5. 제4항에 있어서, 상기 조성물은 하복부에 투여되는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 면역학적 어쥬번트를 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 면역학적 애쥬번트는 상기 조성물의 투여 10 내지 15 분전에 투여되는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
8. 제6항에 있어서, 상기 면역학적 애쥬번트는 75 ㎍의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
9. 제6항에 있어서, 상기 면역학적 애쥬번트는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)인 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
10. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1로 이루어지는 펩티드는 10 nmol 내지 2000 nmol의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 화학요법은 도세탁셀을 투여하는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 도세탁셀은 주당 20 mg/m²로 투여되는 것을 특징으로 하는 암 환자 치료용 조성물.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 조성물 및 면역학적 애쥬번트를 포함하는 암 환자 치료용 키트.
14. 제13항에 있어서, 상기 키트는 상기 조성물 및 면역학적 애쥬번트의 투여용량 및 투여방법에 대한 설명서를 더 포함하는 것인 암 환자 치료용 키트.

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