KR102075596B1

KR102075596B1 - 덱스트란 또는 폴록사머를 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102075596B1
Application number: KR1020170165271A
Authority: KR
Inventors: 이일훈; 박유신
Original assignee: 이일훈; 박유신
Priority date: 2017-12-04
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2020-02-10
Anticipated expiration: 2037-12-04
Also published as: KR20190065771A; US20240075056A1; JP7674103B2; CN111491640A; JP2023089978A; US11801260B2; EP3725318A4; EP4588514A3; CN120478395A; WO2019112291A1; CN111491640B; JP2021505680A; US11278565B2; EP3725318C0; EP4588514A2; US20200368269A1; EP3725318B1; US20220233581A1; EP3725318A1

Abstract

본 발명은 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물을 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물 또는 상기 조성물에 줄기세포를 더 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 완충 효과, 코팅 효과 또는 항염 효과에 의하여 관절 또는 결체조직의 손상부에 오래 머무르며 충격을 완화하고 손상부 특이적으로 손상부를 감싸주거나 유착된 부위의 염증을 줄일 수 있으므로, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

덱스트란 또는 폴록사머를 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물{Compositions for treating joint or connective tissue disease comprising dextran or poloxamer}

본 발명은 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물을 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물 또는 상기 조성물에 줄기세포를 더 포함하는 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

관절은 뼈와 뼈가 만나는 부위로서, 뼈와 뼈 사이가 부드럽게 운동할 수 있도록 연골, 관절낭, 활막, 인대, 힘줄, 근육 등으로 구성되어 있으며, 움직임에 따라 발생하는 충격을 흡수하는 역할을 한다. 관절염은 여러 가지 원인에 의해 관절에 염증 등을 동반한 기능 이상이 생긴 것으로, 이러한 관절 질환은 자가면역이 원인인 것으로 이해되는 만성 관절 류마티스, 세균감염에 의한 감염성 관절염, 여러 원인으로 인하여 관절 연골이나 뼈에 변성이나 파괴가 일어나는 골 관절염, 가용성 대사산물이 관절주변의 결합조직 내에 결정으로 침착되는 결정성 관절염 등으로 크게 구분될 수 있다.

결체조직(connective tissue)은 결합조직이라고도 하며, 동물에 있어 조직 사이를 결합하여 기관을 형성하는 조직으로, 예를 들면 추간원판, 피부, 힘줄, 인대 등을 들 수 있다.

관절염 치료에 사용되는 약물은 염증의 감소, 질병 진행의 지연, 요산 등 대사성 산물 농도의 감소라는 주된 작용기전을 근거로 대별할 수 있는데, 많은 관절염 치료 약물들이 염증을 감소시키는 작용을 한다. 염증은 통증, 부종, 열감, 발적, 경직 등을 일으키는 병적 과정이며, 염증을 신속히 완화시키는 약물에는 아스피린을 비롯한 비스테로이드성 항염제와 코티손을 비롯한 스테로이드성 항염제가 있다. 그러나 이러한 소염 및 항염제 등은 질환의 치료보다는 통증을 완화하는 것이 주작용이며 약물을 장기간 복용시에는 여러 합병증이 많이 발생한다. 특히, 스테로이드성 항염제는 질환의 원인 치료와는 무관하고 강하고 일시적인 항염 작용으로 인하여 단순히 통증을 일시적으로 감소시켜 관절을 과잉 사용하도록 유도할 소지가 있으며, 이는 관절을 파괴하고 장애를 악화시키는 요인이 되기 때문에 사용에 주의를 요한다.

따라서 관절염 등의 관절손상에 사용되는 종래의 치료법은 한정적인 유효성을 갖고, 명백한 유독성 부작용을 수반하며, 장기간 지속적으로 사용할 수 없어 그 유효성이 제한되므로, 기존의 치료법이 갖는 단점을 극복한 새로운 신규 치료법 내지는 치료제가 절실히 요구되고 있는 실정이다

한편, 덱스트란은 다당류의 하나로 D-글루코스의 중합체를 지칭하는 것으로, 녹말이나 글리코겐과 유사한 구조를 가지고 있으며, D-글루코스가 α-1,6 결합으로 곧은 사슬 모양으로 이어지고 군데군데에 α-1,4 결합이 분지되어 있다. 이것은 녹말이나 글리코겐이 α-1,4 결합을 하고 있고, 분지점이 α-1,6 결합인 것과 대조적이다. 이 밖에 α-1,2 결합과 α-1,3 결합의 존재도 알려져 있으나, 그 양과 종류는 덱스트란의 기원에 따라 다르다. 고분자량의 덱스트란은 체내에서 알러지 반응을 자주 일으키는 것으로 알려져 있다. 덱스트란은 혈액증량제, 혈액응고방지제(유착방지제), 가교된 덱스트란(cross linked dextran)을 이용한 필러 등으로 사용되어 왔으나, 관절 질환이나 결체조직 질환의 치료제로 사용된 것으로 보고된 바는 없다. 폴록사머는 비이온성 계면 활성제를 지칭하고, 계면 활성제 외에 유화제, 안정화제, 용해보조제 등으로도 사용하는 것으로 알려져 있다.

현재 관절 질환 또는 결체조직 질환에 대한 종래 치료법이 갖는 한계점인 한정적인 유효성, 명백한 유독성 부작용, 지속성의 부재에 따라 새로운 치료법 또는 치료제가 필요하며, 특히 체내에 투여할 경우 알러지 반응을 일으키지 않는 덱스트란 또는 폴록사머, 특히 저분자량의 덱스트란 또는 폴록사머를 이용한 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료에 대한 연구는 알려진 바가 없는 실정이다.

이에 본 발명자들은 관절 또는 결체조직의 치료를 위한 연구를 수행한 결과, 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물이 알러지 반응을 일으키지 않으며 관절 및 결체조직 손상부에 대한 완충 효과, 보존 효과 또는 항염 효과에 의해 관절 및 결체조직을 보호하는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 줄기세포; 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 줄기세포; 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 덱스트란(dextran) 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 줄기세포; 덱스트란(dextran) 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 완충 효과, 코팅 효과 또는 항염 효과에 의하여 관절 또는 결체조직의 손상부에 오래 머무르며 충격을 완화하고 손상부 특이적으로 손상부를 감싸주거나 유착된 부위의 염증을 줄일 수 있으므로, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 정상 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리 24시간 후 연골세포의 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 음성 대조군(nc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 2는 정상 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리 48시간 후 연골세포의 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 음성 대조군(nc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 3은 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리 24시간 후 연골세포의 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 4는 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리 48시간 후 연골세포의 세포 증식능을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 5는 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 MMP-3 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 6은 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 MMP-13 유전자의 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 7은 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 IL-10/IL-6 유전자 발현 비를 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 8은 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 2형 콜라겐 생성량을 확인한 결과를 나타낸 도이다(*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).
도 9는 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델의 연골세포에 대한 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이들의 혼합물 처리에 따른 아그리칸 생성량을 확인한 결과를 나타낸 도이다 (*/**/***는 각각 염증유발 양성 대조군(pc) 대비 p<0.05/p<0.01/p<0.001 의 유의도를 나타낸다).

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명은 덱스트란(dextran), 폴록사머(poloxamer) 또는 이의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “덱스트란(dextran)”은 다당류의 하나인 D-글루코스의 중합체를 의미한다. 덱스트란은 녹말이나 글리코겐과 유사한 구조를 가지고 있으며, D-글루코스가 α-1,6 결합으로 곧은 사슬 모양으로 이어지고 군데군데에 α-1,4 결합이 분지되어 있다. 덱스트란은 혈액 증량제, 혈액 응고 방지제로 사용할 수 있으며, 목적에 따라 덱스트란의 분자량을 달리하여 사용할 수 있다. 본 발명에서, 상기 덱스트란은 500 내지 10,000Da의 분자량을 가질 수 있으며, 바람직하게는 500 내지 8,000Da, 더욱 바람직하게는 1,000 내지 5,000Da의 분자량일 수 있다. 덱스트란은 분자량에 따라 분자량이 1,000Da인 경우 '덱스트란 1', 5,000Da 인 경우 '덱스트란 5', 분자량이 10,000Da 인 경우 '덱스트란 10' 등과 같이 명명하여 사용한다.

일반적으로, 8,000Da 이상의 덱스트란은 인체에 투여되어 알러지 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히 상기 알러지 반응으로 항원-항체 면역 반응이 원인이 되어 발생하는 급격한 전신 반응인 아나필락시스(anaphylaxis)가 발생할 수 있는데, 이는 상당히 위험할 수 있다. 그러나, 본 발명에 따른 저분자량의 덱스트란, 바람직하게는 1,000Da 내지 5,000Da 의 덱스트란을 사용하면 알러지 반응을 최소화 할 수 있는 장점이 있으며, 공지된 물질(예를 들어 히알루론산)에 비해서 체내에서 분해되는 속도가 느리므로 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료 효과가 오래 유지될 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 저분자량의 덱스트란은 8,000Da 이상의 덱스트란에 비하여 알러지 반응이 없을 뿐만 아니라, 작용시간의 시작점(onset)이 빠르며, 넓은 범위에 분포하도록 퍼질 수 있는 특징이 있다.

본 발명은 바람직한 예시로, 덱스트란 1, 덱스트란 5 를 이용한 실시예를 제공한다. 이들은 덱스트란 1 및 덱스트란 5의 조합으로 사용될 수 있으며, 폴록사머 188과의 조합으로도 사용될 수 있다.

본 발명에서, 상기 덱스트란의 농도는 용매 100cc 중 질량(g) 농도(w/v)의 백분율로서 나타내며, 예컨대 덱스트란 1은 단일 유효성분으로 조성물에 포함되는 경우, 2 내지 40 (w/v)% 의 농도로 포함될 수 있고, 덱스트란 5가 단일 유효성분으로 조성물에 포함되는 경우, 덱스트란 5는 2 내지 30 (w/v)% 의 농도로 포함될 수 있다.

또한 덱스트란이 덱스트란 1 또는 5 의 혼합물, 덱스트란과 폴록사머의 혼합물로 조성물에 포함되는 경우, 덱스트란의 농도는 혼합 대상에 따라 상이하게 될 수 있다. 예컨대 덱스트란 5 및 덱스트란 1의 혼합물이 조성물에 포함되는 경우, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40 (w/v) %, 상기 덱스트란 1의 농도는 2.5 내지 40 (w/v) % 또는 덱스트란 5의 농도는 4 내지 40 (w/v) %, 덱스트란 1의 농도는 5 내지 40 (w/v) % 일 수 있다.

덱스트란이 조성물에 고농도로 존재하게 되는 경우, 다당류의 수분을 함유하는 특성상 점도가 지나치게 증가하여 성상을 만들기 어려운 단점이 있으므로 덱스트란은 일반적으로 5% 이하의 농도로 사용되어 왔다. 그러나, 본 발명의 조성물 내에 덱스트란은 분자량에 따라 최소 2 내지 최대 40 (w/v)% 농도로 포함되므로, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료 효과가 최대화될 수 있다. 이와 같은 덱스트란의 용해도를 높이거나 안정화시키기 위해서, 본 발명의 조성물은 추가적으로 첨가물을 더 포함할 수 있으며, 상기 첨가물은 솔비톨, 자일리톨, 에리스리톨, 락티톨, 만니톨 및 말티톨 및 이들의 혼합물을 포함하는 당알콜류, 또는 에리트로오스(erythrose), 에리트루로오스(erythrulose), 트레오스(threose), 아라비노오스(arabinose), 리보오스(ribose), 리불로오스(ribulose), 목당, 자일룰로오스(xylulose), 릭소오스(lyxose), 알로오스(allose), 알트로오스(altrose), 프시코오스(psicose), 갈락토오스(galactose), 굴로오스(gulose), 이도오스(idose), 만노오스(mannose), 소르보오스(sorbose), 탈로오스(talose), 타가토오스(tagatose), 세도헵툴로오스(sedoheptulose), 만노헵툴로오스(mannoheptulose) 및 이들의 혼합물을 포함하는 단당류, 또는 CaCl₂를 포함하는 2가 양이온을 포함할 수 있다.

본 발명에서 “폴록사머(poloxamer)"는 소수성의 프로필렌옥사이드를 중심으로 양 끝에 친수성의 에틸렌옥사이드가 결합된 비이온성의 트리블록공중합체로서, 온도 민감성의 특징을 가지고 있어 농도와 온도에 따라 졸(Sol)과 젤(Gel)의 변환이 가능하고 폴리옥시프로필렌 및 폴리옥시에틸렌의 비율에 따라 폴록사머의 성질이 달라진다. 폴록사머는 계면 활성제 외에 유화제, 안정화제, 용해보조제 등으로도 사용한다.

본 발명에서 상기 폴록사머는 100 내지 20,000Da의 평균 분자량을 가질 수 있다.

상기 폴록사머는 폴록사머 101， 폴록사머 105, 폴록사머 105 벤조에이트， 폴록사머 108, 폴록사머 122, 폴록사머 123, 폴록사머 124, 폴록사머 181, 폴록사머 182, 폴록사머 182 디벤조에이트, 폴록사머 183, 폴록사머 184, 폴록사머 185, 폴록사머 188, 폴록사머 212, 폴록사머 215, 폴록사머 217, 폴록사머 231, 폴록사머 234, 폴록사머 235, 폴록사머 237, 폴록사머 238, 폴록사머 282, 폴록사머 284, 폴록사머 288, 폴록사머 331, 폴록사머 333, 폴록사머 334, 폴록사머 335, 폴록사머 338, 폴록사머 401, 폴록사머 402, 폴록사머 403 및 폴록사머 407로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 폴록사머 188을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 폴록사머의 농도는 용매 100cc 중 질량(g) 농도(w/v)의 백분율로서, 1 내지 50 (w/v)%의 농도, 2 내지 30 (w/v)%의 농도로 조성물에 포함되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 예컨대 폴록사머 188은 조성물 내 단독 유효성분으로 포함되는 경우 1 내지 15 (w/v)% 또는 1 내지 10 (w/v)% 농도로 조성물에 포함될 수 있다.

이와 같은 폴록사머의 용해도를 높이거나 안정화시키기 위해서, 본 발명의 조성물은 추가적으로 당알콜류, 단당류, 2가 양이온과 같은 첨가물을 더 포함할 수 있으며, 별도의 첨가물 없이 멸균수 또는 생리 식염수가 조성물에 포함될 수도 있다.

본 발명에서 상기 약학적 조성물은 덱스트란 및 폴록사머의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히 폴록사머 188을 덱스트란과 혼합하여 사용하는 경우, 덱스트란 1 또는 덱스트란 5 와 혼합하여 사용할 수 있으며, 예컨대 덱스트란 5와 혼합하는 경우, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40 (w/v)%, 상기 폴록사머 188의 농도는 1 내지 20 (w/v)% 일 수 있고, 또는 덱스트란 5의 농도가 4 내지 40 (w/v)%, 폴록사머 188의 농도가 2 내지 10 (w/v)%일 수 있다.

또한 예컨대 덱스트란 1과 혼합하는 경우, 상기 덱스트란 1 의 농도는 2.5 내지 40 (w/v) %, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 5 (w/v)% 일 수 있거나, 덱스트란 1의 농도가 45 내지 55 (w/v)%, 폴록사머 188의 농도가 1 내지 2 (w/v)%일 수 있다.

폴록사머 188은 고농도, 예컨대 25(w/v)%을 초과하여 조성물 내에 포함되는 경우 독성을 나타낼 수 있으며, 덱스트란과 혼합하는 경우 농도를 적절하게 조절하여 사용할 수 있다.

일 실시예로서, 본 발명의 약학적 조성물 내 덱스트란:폴록사머는 예를 들면 (w/v)% 비율로서 5:0.05, 5:0.5, 5:5, 5:10, 5:20, 5:30, 5:40, 5:50, 5:100, 5: 150, 5:200, 10:0.1. 10:1, 10:10, 10:20, 10:30, 10:40, 10:50, 10: 100, 10: 150, 10:300, 10:400, 50: 0.5, 50:1, 50:5, 50:10, 50:20, 50:30, 50:40, 50:50으로 포함될 수 있으며, 예컨대 1:0.01 내지 1:40, 예시적인 조합으로 폴록사머 188 1(w/v)% 와 덱스트란 1 40(w/v)%를 혼합하는 경우 1:40, 폴록사머 188 20(w/v)% 와 덱스트란 5 2(w/v)%를 혼합하는 경우 1:0.1인 비를 반영하여 1:0.1 내지 1:40 으로 포함될 수 있다. 여기서 상기 덱스트란의 평균 분자량은 1,000Da 또는 5,000Da일 수 있으며, 상기 폴록사머의 평균 분자량은 8,500Da인, 폴록사머 188을 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 일 실시예로서 덱스트란 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는 경우, 각각의 성분은 1:1의 부피비로 혼합하여 조성물에 포함될 수 있다.

또한 본 발명의 일 실시예로서, 본 발명의 약학적 조성물은 덱스트란 1 및 덱스트란 5 의 혼합물을 포함하며, 약학적 조성물 내 덱스트란 1 : 덱스트란 5는 예를 들면 (w/v)% 비율로서 5:0.05, 5:0.5, 5:5, 5:10, 5:20, 5:30, 5:40, 5:50, 5:100, 10:0.1. 10:1, 10:10, 10:20, 10:30, 10:40, 10:50, 10: 100, 10: 150, 10:200, 50:0.5, 50:1, 50:5, 50:10, 50:20, 50:30, 50:40, 50:50, 50:1000 으로 포함될 수 있으며, 예컨대 1:0.01 내지 1:20, 예시적인 조합으로 덱스트란 1 2.5(w/v)% 와 덱스트란 5 40(w/v)% 를 혼합하는 경우 1:16, 덱스트란 1 40 (w/v)% 와 덱스트란 5 2(w/v)% 를 혼합하는 경우 1:0.05 인 비를 반영하여 1:0.05 내지 1:16로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물이 덱스트란 및 폴록사머의 혼합물을 포함하는 경우, 폴록사머의 소수성 성분이 덱스트란 또는 병용 약물의 용해도를 증진시킬 수 있으며 폴록사머의 친수성 성분인 PEG(polyethylene glycol)는 세포막을 보존하고 유착을 방지하여 조직을 보존할 수 있다. 다만, 폴록사머는 체액에 의해 쉽게 희석될 수 있으며, 체액에 쉽게 흡수될 수 있는 단점이 있으므로, 덱스트란과의 혼합으로 체내 안정성을 증가시킬 수 있다. 따라서 덱스트란 및 폴록사머의 혼합물의 경우, 덱스트란 단독 또는 폴록사머 단독을 포함하는 경우에 비하여 점성이 오래 유지되어 손상된 관절 또는 결체조직 부위를 감싸줄 수 있으며, 조직의 병리적인 유착을 막아 마찰력에 의한 염증성 소견이 감소함으로써 영양물질의 공급이 원활해지고 조직의 재생이 증진되는 효과가 있다. 상기 효과는 덱스트란 및 폴록사머 혼합물의 완충 효과(cushion effect) 또는 코팅 효과(coating effect) 또는 항염 효과(anti-inflammatory effect)에 의하여 유도될 수 있다.

본 발명에 있어서, “완충 효과 (cushion effect)” 란, 투여된 부위, 예컨대 관절에서 마찰을 줄임으로써 가해지는 충격을 완충하는 쿠션과 같은 역할을 하는 효과를 의미하며, “코팅 효과(coating effect)” 는 뻑뻑해진 부위, 예컨대 관절 안의 손상된 연골 조직을 빠른 속도로 덮어 코팅함으로써 무릎 관절을 편하게 움직일 수 있게 하는 효과를 의미한다. 이들 효과에 의하여 손상된 관절 부위의 염증 반응이 감소할 수 있다.

그러므로, 완충 효과와 코팅 효과 또는 항염 효과를 유도하는 본 발명의 조성물은 재생 또는 손상된 조직을 개선하기에 적합하므로 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물의 상기와 같은 효과는 현재 관절 질환 치료를 위해서 사용되고 있는 줄기세포 치료제와 유사한 효과이며, 고도의 기술력 및 비용이 요구되는 줄기세포 치료제와 비교하여 경쟁력을 가질 수 있다.

본 발명에서 용어 "줄기세포"는, 자기복제능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.

본 발명의 줄기세포는 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 또는 양막상피세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방(또는 지방 조직세포), 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반(또는 태반 조직세포), 뇨 등으로부터 유래된 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 줄기세포는 줄기세포 또는 이의 농축액, 줄기세포 배양액 또는 이의 농축액, 줄기세포의 배양 분비물 또는 이의 농축액, 또는 이들의 배합물일 수 있다.

상기 조성물 내의 덱스트란 또는 폴록사머는 줄기세포를 관절 또는 결체조직의 손상된 병변부로 특이적으로 운반하는 역할을 할 수 있으며, 또한 줄기세포가 운반된 병변부에 정착하여 손상된 조직의 재생을 유도하는 것을 상승시키는 효과가 있다.

따라서, 본 발명의 조성물이 줄기세포를 포함하는 경우, 손상된 조직 특이적으로 줄기세포를 운반 및 부착시킴으로써 관절 질환 또는 결체조직 질환을 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명에서 "예방"은 조성물의 투여에 의해 관절 질환 또는 결체조직 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 "치료"는 조성물의 투여에 의해 관절 질환 또는 결체조직 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화 시킬 수 있다. 또한, 상기 제제는 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형제, 비히클, 방부제, 또는 결합제 등과 조합하여, 약학적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 용액 상태 또는 분말 상태일 수 있으며, 상기 약학적 조성물이 분말 상태인 경우, 투여 직전에 용매에 용해하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 약물의 제조시 발생할 수 있는 여러 가지 상황을 고려하여 가장 적합한 방식으로 제조될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여형태는 특별히 한정되지 않지만, 경구투여, 주사, 수액에 의한 투여 등의 일반적인 투여 경로를 거칠 수 있다.

경구투여의 경우에는, 상기 조성을 갖는 조성물로서, 또는 의약상 허용되는 담체, 부형제(excipient)와 함께 정제, 알약, 캡슐, 겔, 시럽 등의 제제로서 이용해도 된다. 다만, 정제나 산제 등의 고형제로는 흡수에 시간이 걸리는 경우가 많으므로 액제 등에 의한 경구투여가 바람직하다. 그 경우에는 적당한 첨가물, 예를 들면 염화나트륨 등의 염류, 완충제, 킬레이트제 등과 함께 수용액으로서 투여하는 것이 바람직하다.

경구로 이용될 수 있는 제약학적 조성물은 젤라틴으로 만들어진 푸쉬-피트(push-fit) 캡슐과 젤라틴과 글리세롤 또는 솔비톨과 같은 가소제로 만들어진 연성 캡슐을 포함한다. 푸쉬-피트 캡슐에는 활성 성분과 락토오즈와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 활석 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 또는 선택적으로 안정화제를 포함할 수 있다. 연성 캡슐에는 활성화합물을 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 액체에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.

또한, 관절 질환 또는 결체조직을 표적으로 하는 특이 항체로 피복된 리포좀과 같은 표적 약물 수송 시스템으로 약물을 투여할 수 있다. 리포좀은 병이 있는 조직에 선택적으로 취해질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 국부투여용 제제로 투여되는 경우, 적당한 완충제, 등장제 등을 첨가하고 멸균증류수에 용해한 것을 이용하여, 개체의 관절강, 결체조직, 정맥내, 피하, 피내, 관절내 또는 근육 등으로 직접 주입하거나 피부에 도포하거나 패취(patch) 형태일 수 있다.

상기 개체는 인간, 개, 고양이, 돼지, 말, 소, 양, 쥐, 및 원숭이를 포함한 포유동물로부터 선택되는 어느 하나, 바람직하게는 인간일 수 있다.

본 발명에서 용어 "관절내"는 본 발명의 약학적 조성물로의 관절의 경피 주사를 말한다.

본 발명에서 용어 "국부 투여"는 염증이 있는 관절 내에 또는 그 부근에 대한 경피 주사를 말한다. 그러므로 국부 투여 주사는 표피, 진피, 근육 또는 임의의 심부 기관에 관련된 것이다.

국부 투여에 대한 주요 이점은 손상된 영역에 대한 진통 효과를 선택적으로 제한한다는 것이다. 게다가, 국부 투여는 전신 방출이 거의 없이 또는 아주 없이 높은 국부 농도 수준을 가능하게 한다.

상기 약학적 조성물은 안정화제, 예를 들면, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아검, 인산칼슘, 알기네이트, 트라가칸트, 규산칼슘, 폴리비닐피롤리돈 및 셀룰로오즈를 추가로 포함할 수 있다. 당해 조성물은 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트 및 광유; 습윤제; 유화제 및 현탁화제; 보존제, 예를 들면, 티머로살, 벤질 알콜, 파라벤, 메틸- 또는 프로필하이드록시벤조에이트; 항산화제, 예를 들면, 아스코르브산, 디하이드로퀴논, 부틸화된 하이드록시톨루엔 및 디티오트레이톨; 및 완충제, 예를 들면, 일염기성 인산나트륨, 이염기성 인산나트륨, 나트륨 벤조에이트, 칼륨 벤조에이트, 나트륨 시트레이트, 나트륨 아세테이트 및 나트륨 타르트레이트; 킬레이트제, 예를 들면, 에틸렌디아민테트라아세트산; 및 등장성 조절제, 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로즈를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 마취제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 마취제에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아메토카인(테트라카인), 리그노카인(리도카인), 자이실로카인, 부피바카인, 프릴로카인, 로피바카인, 벤조카인, 메피보카인, 코카인 및 이들의 배합물이 포함된다.

상기 약학적 조성물은 항균제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항균제에는, 이로써 제한되는 것은 아니지만, 아만파딘 하이드로클로라이드, 아만파딘 설페이트, 아미카신, 아미카신 설페이트, 아모글리코사이드, 아목시실린, 암피실린, 암사마이신, 바시트라신, 베타-락탐, 칸디시딘, 카프레오마이신, 카베니실린, 세팔렉신, 세팔로리딘, 세팔로틴, 세파졸린, 세파피린, 세프라딘, 세팔로글리신, 칠롬페니콜, 클로르헥시딘, 클로스헥시딘 글루코네이트, 클로르헥시딘 하이드로클로라이드, 클로록신, 클로르퀴르알돌, 클로르테트라사이클린, 클로르테트라사이클린 하이드로클로라이드, 시프로플록사신, 시르쿨린, 클린다마이신, 클린다마이신 하이드로클로라이드, 클로트리마졸, 클록사실린, 데메클로사이클린, 디클로스사실린, 디요오도하이드록시퀸, 독시사이클린, 에탐부톨, 에탐부톨 하이드로클로라이드, 에리트로마이신, 에리트로마이신 에스톨레이트, 에르흐마이신 스테아레이트, 파르네솔, 플록사실린, 젠타마이신, 젠타마이신 설페이트, 그라미시딘, 지세오풀빈, 할로프로긴, 할로퀴놀, 헥사클로로펜, 이미노사이클린, 요오도클로르하이드록시퀸, 카나마이신, 카나마이신 설페이트, 린코마이신, 리네오마이신, 리네오마이신 하이드로클로라이드, 마크롤리드, 메클로사이클린, 메타사이클린, 메타사이클린 하이드로클로라이드, 메테닌, 메테나민 히푸레이트, 메테나민 만델레이트, 메티실린, 메토니다졸, 미코나졸, 미코나졸 하이드로클로라이드, 미노사이클린, 미노사이클린 하이드로클로라이드, 무피로신, 나프실린, 네오마이신, 네오마이신 설페이트, 네티미신, 네틸미신 설페이트, 니트로푸라존, 노르플록사신, 니스타틴, 옥토피록스, 올레안도마이신, 오르세팔로스포린, 옥사실린, 옥시테아클린, 옥시테트라사이클린 하이드로클로라이드, 파라클로로메타 자일레놀, 파로모마이신, 파로모마이신 설페이트, 페니실린, 페니실린 G, 페니실린 V, 펜타미딘, 펜타미딘 하이드로클로라이드, 페네티실린, 폴리믹신,퀴놀론, 스트렙토마이신 설페이트, 테트라사이클린, 토브라마이신, 톨나프테이트, 트리클로산, 트리팜핀, 리파마이신, 롤리테트라사이클린, 은 염, 스펙티노마이신, 스피라마이신, 스트룹토마이신, 설폰아미드, 테트라사이클린류, 테트라사이클린, 토브라마이신, 토브라마이신 설페이트, 트리클로카본, 트리클로산, 트리메토프림-설파메톡사졸, 틸로신, 반코마이신 및 이로트리신이 포함된다.

상기 약제학적 조성물은 소염제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 소염제는 비스테로이드성, 스테로이드성 또는 이들의 배합물일 수 있다. 비스테로이드성 소염제의 비제한적 예는 옥시캄, 예를 들면, 피록시캄, 이속시캄, 테녹시캄, 수독시캄; 살리실레이트, 예를 들면, 아스피린, 디살시드, 베노릴레이트, 트리리세이트, 사파프린, 솔프린, 디플루니살 및 펜도살; 아세트산 유도체, 예를 들면, 디클로페낙, 펜클로페낙, 인도메타신, 술린닥, 톨메틴, 이소세팍, 푸로페낙, 티오피낙, 지도메타신, 아세마타신, 펜티아작, 조메피락, 클린다낙, 옥세피낙, 펠비낙 및 케토롤락; 페나메이트, 예를 들면, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 니플룸산 및 톨페남산; 프로피온산 유도체, 예를 들면, 이부프로펜, 나프록센, 베녹사프로펜, 플루르비프로펜, 케토프로펜, 페노프로펜, 펜부펜, 인도프롭펜, 피르프로펜, 카르프로펜, 옥사프로진, 프라노프로펜, 미로프로펜, 티옥사프로펜, 수프로펜, 알미노프로펜 및 티아프로페닉; 피라졸, 예를 들면, 페닐부타존, 옥시펜부타존, 페프라존, 아자프로파존 및 트리메타존을 포함한다. 이들 비스테로이드성 소염제의 추출물이 또한 사용될 수 있다.

상기 스테로이드성 소염제의 비제한적 예에는 코르티코스테로이드, 예를 들면, 하이드로코르티손, 하이드록시-트리암시놀론, 알파-메틸 덱사메타손, 덱사메타손-포스페이트, 베클로메타손 디프로피오네이트, 클로베타솔 발레레이트, 데소니드, 데스옥시메타손, 데스옥시코르티코스테론 아세테이트, 덱사메타손, 디클로리손, 디플로라손 디아세테이트, 디플루코르톨론 발레레이트, 플루아드레놀론, 플루클로롤론 아세토니드, 플루드로코르티손, 플루메타손 피발레이트, 플루오시놀론 아세토니드, 플루오시노니드, 플루코르틴 부틸에스테르, 플루오코르톨론, 플루프레드니덴(플루프레드닐리덴) 아세테이트, 플루란드레놀론, 할시노니드, 하이드로코르티손 아세테이트, 하이드로코르티손 부티레이트, 메틸프로드니솔론, 트리암시놀론 아세토니드, 코르티손, 코르토독손,플루세토니드, 플루드로코리손, 디플루오로손 디아세테이트, 플루라드레놀론, 플루드로코르티손, 디플루로손 디아세테이트, 플루라드레놀론 아세토니드, 메드리손, 암시나펠, 암시나피드, 베타메타손 및 이의 에스테르의 밸런스(balance), 클로로프레드니손, 클로르프레드니손 아세테이트, 클로코르텔론, 클레시놀론, 디클로리손, 디플루르프레드네이트, 플루클로로니드, 플루니솔리드, 플루오로메탈론, 플루페롤론, 플루프레드니솔론, 하이드로코르티손 발레레이트, 하이드로코르티손 사이클로펜틸프로피오네이트, 하이드로코르타메이트, 메프레드니손, 파라메타손, 프레드니솔론, 프레드니손, 베클로메타손 디프로피오네이트, 트리암시놀론 및 이의 추출물이 포함된다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 용어 "약제학적으로 유효한 양"은 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 덱스트란, 폴록사머, 또는 이의 혼합물의 용량은 넓은 범위로 변하며 각각의 특별한 경우의 개별적인 요구 조건에 따라 결정된다.

본 발명의 약학적 조성물은 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료를 위한 공지의 약제와 병용하여 투여할 수 있으며, 상기 치료제와 함께 동시에 또는 순차적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 1회 또는 수회로 나누어 바람직한 투여 간격, 예컨대 1주일 간격으로 투여할 수 있다.

또한 필요에 따라 본 발명의 조성물은 활성성분을 포함하는 하나 이상의 단위약형을 포함하는 포장 또는 투여장치에 제공될 수 있다. 제약학적 수용가능한 담체내에 조성된 본 발명의 화합물로 구성된 조성물은 적절히 제조되어 적정 용기내에 위치시키고, 지시된 조건의 치료용임을 알린다. 레벨에 표시된 적절한 지시에는 관절 질환의 치료 및 결체조직 질환의 치료를 포함한다.

본 발명에 따르면, 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물을 포함하는 약학적 조성물은 관절 질환 또는 결체조직 질환을 겪는 개체에서 장기간 지속되는 통증의 경감을 유도한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물을 사용하는 경우 주요 약물 부작용을 피하고, 너무 침습적인 기술을 사용하지 않으면서도 급성뿐 아니라 만성 관절 질환 또는 결체조직 질환의 치료 및/또는 예방을 가능하게 한다.

본 발명에서 “결체조직(connective tissue)"은 결조직 또는 결합조직이라고도 알려져 있고, 동물 조직에 널리 분포하고 세포, 장기, 기관 등을 결합, 보호, 충전하는 역할을 하는 조직을 지칭하며, 섬유성 결합조직, 아교질조직, 세망(細網)조직으로 분류되지만 섬유성 결합조직이 그 대부분을 차지한다.

본 발명에서, “관절 질환” 또는 “결체조직 질환”이 발생하는 원인은 외상성, 감염성, 염증성, 퇴행성으로 크게 분류될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물 또는 치료제는 관절에 손상을 가져오는 모든 원인에 의한 관절 질환 및 결체조직 질환에 사용될 수 있지만, 본 발명의 조성물이 효과적으로 사용될 것으로 예상되는 관절 질환은 골관절염, 바람직하게는 반복적인 마찰력과 그로 인해 발생하는 퇴행성 골관절염, 외상성 관절염, 류마티스 관절염, 슬개대퇴 증후군, 만성 염증 또는 관절증을 포함한다. 또한 본 발명의 조성물이 효과적으로 사용될 것으로 예상되는 결체조직 질환은 추간판, 인대, 힘줄, 피부, 건 등이 물리적인 손상이나 반복적인 마찰에 따른 퇴행성 변화로 인하여 콜라겐 또는 수분의 손실이 생긴 경우의 결체조직 질환을 포함한다.

본 발명에서는, 세포 독성을 나타내지 않으면서 항염 효과를 효과적으로 나타내고, 연골기질을 파괴하는 단백질인 MMP-3, MMP-13 유전자 발현을 억제하고, 연골 보호작용으로 2형 콜라겐의 합성을 촉진하고, 아그리칸의 생성량을 증가시키는 효과를 달성할 수 있는 바람직한 예시를 다음과 같이 제공할 수 있다.

본 발명의 일 예는 덱스트란 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

상기 덱스트란은 덱스트란 1 로 조성물에 단일 유효성분으로 포함되며, 덱스트란 1의 농도는 2 내지 40 (w/v)% 일 수 있다.

상기 덱스트란은 덱스트란 5 로 조성물에 단일 유효성분으로 포함되며, 덱스트란 5의 농도는 2 내지 30 (w/v)% 일 수 있다.

또한 상기 폴록사머는 조성물에 단일 유효성분으로 포함되며, 폴록사머의 농도는 1 내지 15 (w/v)% 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 덱스트란(dextran) 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종은 1:1 의 부피비로 혼합되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 예에서, 상기 혼합물은 덱스트란 5 및 폴록사머의 혼합물이며, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40 (w/v)%, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 20 (w/v)% 일 수 있다.

또한 상기 혼합물은 덱스트란 5 및 덱스트란 1의 혼합물이며, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40 (w/v) %, 상기 덱스트란 1의 농도는 2.5 내지 40 (w/v) % 일 수 있다.

또한 상기 혼합물은 덱스트란 1 및 폴록사머의 혼합물이며, 상기 덱스트란 1 의 농도는 2.5 내지 40 (w/v) %, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 5 (w/v)% 일 수 있다.

또한 상기 혼합물은 덱스트란 1 및 폴록사머의 혼합물이며, 상기 덱스트란 1의 농도는 45 내지 55 (w/v) %, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 2 (w/v)% 일 수 있다.

또한 본 발명의 일 예는 줄기세포; 덱스트란(dextran) 1, 덱스트란 5 및 폴록사머(poloxamer) 188 로 이루어진 군에서 선택된 2종의 혼합물을 포함하는, 관절 질환 또는 결체조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

재료 및 방법

본원 발명에서는 덱스트란 1 (Dextran 1 (EP grade, Pharmacosmos), 덱스트란 5 (Dextran 5, pharmaceutical quality, Pharmacosmos), 폴록사머 188 (Poloxamer 188, cell culture grade, 시그마-알드리치) 을 이용하여 실험을 수행하였다. 또한 관절염 유도를 위하여 rhIL-1α (recombinant human IL-1α, Lot No. 200-01A) 을 PEPROTECH에서 구입하여 사용하였으며, 양성대조물질로 인도메타신(Indomethacin, 시그마-알드리치, Lot No. 53-86-1), 히알루론산나트륨(sodium hyaluronate 25 mg/2.5 mL, 아라간주, 동광제약, 전문의약품)을 이용하였다.

실시예 1. 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물의 제조 및 실험 준비

1.1 세포의 분리 배양

3 주령 수컷 SD 랫트의 뒷다리 관절을 멸균 상태에서 분리한 후, 관절을 구성하는 연골조직만을 모아 단일 세포화하여 일차 랫트 연골세포(Chondrocytes)를 분리하여 사용하였다. 초대 배양한 세포가 안정되면 시험에 사용하였으며, 한 번 초대 배양할 때 최소 6 마리 이상에서 분리하였다. 안정화된 연골세포를 특정하기 위하여 RNA 분리 후 연골세포 표지 인자인 2형 콜라겐이나 SOX9 유전자의 발현 정도를 실시간 RT-PCR을 이용해 확인한 후에 시험에 사용하였다.

1.2 세포 배양 방법

1.1에서 분리된 세포는 온도 37 ℃, 습도 95 %, CO₂ 5 %로 설정된 배양기에서 배양하였으며, 배양실 온도 및 습도는 8 시간 단위로 확인하였다. 배지로는 10% 우태아혈청, 2 mL L-글루타민, 50 U/mL 페니실린, 50 μg/mL 스트렙토마이신이 보충된 Minimum Essential Medium (MEM) 배지를 이용하였다. 배양 기간 동안 세포 수를 관찰 후 90 % 이상 증식되었을 때 Detached solution (0.25 (w/v)% Trypsin, 0.53 mM EDTA solution (3 mL))으로 세포를 분리하고 125 X g, 10분간 원심분리하여 세포를 분리하였으며, 이하 실험에 사용하였다.

1.3 시험군의 구성 및 제조

시험군은 rhIL-1α 5 ng/mL로 골관절염을 유발시킨 모델에 정상대조군(NC), 염증유발대조군(PC), 시험물질(단일물 또는 혼합물) 농도별로 처리하는 것으로 구성하였으며, 양성대조군인 인도메타신(IM) 또는 히알루론산나트륨(HN) 처리군은 단일 농도로 구성하였다. 시험군은 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

D=덱스트란1, T=덱스트란5, P=폴록사머188, NC=정상군, PC=염증유발물질(rhIL-1α)투여군, HN=히알루론산나트륨, IM=인도메타신, D+P=덱스트란1과 폴록사머188 혼합물, D+T=덱스트란1과 덱스트란5 혼합물, P+T=폴록사머188과 덱스트란5 혼합물.

본 발명에서 사용된 성분의 농도는 다음과 같은 표기방법에 따라 표기하였다: D10= 덱스트란1의 10(w/v)% 용액, P10= 폴록사머 188의 10(w/v)% 용액, T10= 덱스트란5의 10(w/v)% 용액

본 발명에 사용된 시험물질은 다음과 같은 방법을 이용하여 조제하였다: 세포 배양액에 녹는 최대 농도를 반영하여 덱스트란 1 (D)은 1~50(w/v)%, 덱스트란 5 (T)는 1~40(w/v)%, 폴록사머 188 (P)는 1~35(w/v)%의 범위 안에서 단일물을 조제하였다. 혼합물을 조제하는 경우에는 두 종류의 단일물을 각각 1 : 1 (v : v) 부피비로 혼합하여 조제하였다.

세포배양을 위해 조제한 배지인 complete media (10 % fetal bovine serum, 2 mL L-glutamine, 50 U/mL penicilin, 50 ug/mL streptomycin 등이 모두 함유된 Minimum Essential Medium (MEM) 배지))에 덱스트란 1, 5 및 폴록사머 188을 각각 투여 농도(w/v)에 맞게 완전히 용해시켰다. 시험물질을 complete media에 완전히 용해시켜 균질화하기 위하여 서늘한 온도에서, 특히 폴록사머 188의 경우에는 찬 온도에서, 멸균 스패출러, 막대기, magnetic bar 등으로 천천히 교반하거나 거품이 생기지 않을 정도로 짧게 수 차례 진탕하여 부유물 없이 완전히 투명하게 될 때까지 용해시켰다. 시험물질이 완전히 용해된 후에는 0.22 μm pore size syringe filter로 여과한 후 밀봉하여 냉장 보관하였다.

보다 구체적으로 단일물 조제는 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

덱스트란 1 의 5% 단일물('D5') 제조

덱스트란 1의 5% 시험용액을 조제하는 경우, 덱스트란 1을 5g으로 분취하고 complete media에 완전히 용해시켜 100 mL로 총량을 맞추어 D5 (w/v)% 시험용액을 조제하였다. 이와 같이 0.05 g/mL의 농도로 용해된 시험물질을 0.22 μm pore size syringe filter 를 이용해 여과하여 냉장보관 후 사용하였다.

덱스트란 1의 5%와 폴록사머 188의 10%의 혼합물('D5+P10') 제조

D5와 P10을 각각 조제하고 0.22 μm pore size syringe filter로 여과하여 냉장 보관한 후, 각각 용량을 1 : 1 (v : v) 비율로 혼합하여 저속으로 거품이 나지 않도록 진탕한 후 사용하였다.

비교예 : 인도메타신 처리군 ( IM ) 제조

인도메타신은 5 mM의 농도로 DMSO에 완전히 용해 시킨 후 complete media로 희석하여 0.22 μm pore size syringe filter로 여과한 후 세포에 처리될 때 최종 농도가 5 μM 이 되도록 조정하였다.

비교예 : 히알루론산 나트륨 처리군 ( HN ) 제조

히알루론산나트륨은 아라간주 (히알루론산나트륨 25 mg/2.5 mL, 1회용 멸균 주사기에 담겨있는 약제형태)에 complete media를 흡입하여 히알루론산나트륨 25 mg/3 mL (=히알루론산나트륨 8.33 mg/mL)으로 희석한 후 즉시 사용하였다.

1.4 투여 방법 설정

랫트에서 분리한 초대배양 연골세포의 경우 doubling time이 약 24 시간이므로 증식 및 안정화가 적정할 때 시험물질을 처리하였다. 48 well 또는 24 well plate에 연골세포를 배양한 후 각 시험물질을 1회 투여하되, 관절염 유도를 위한 rhIL-1α 처리 1 시간 전에 각 시험물질의 농도 별로 총 배양액 용량의 20%(v/v)가 되도록 시험용액을 투여하였다. rhIL-1α 처리 24 시간 후 배양액을 채취하여 분석 실험을 진행하였다. 단, 연골세포에 대한 시험물질의 독성 또는 증식능을 확인할 때에는 rhIL-1α를 처리하지 않고 시험물질만을 처리하였다.

1.5 통계학적 분석

모든 실험결과는 정상대조군(NC) 또는 염증유발 양성 대조군(PC)과 student T-test로 p<0.05 수준에서 비교 분석하여 유의성을 표시하였다.

실시예 2. 세포 독성 분석

시험물질 처리에 따라 연골세포의 증식능이 변화하는지 여부를 확인하여 세포 독성 분석을 수행하였다. 세포증식능 평가는 rhIL-1α를 처리하지 않은 미처리 연골세포와 rhIL-1α를 처리하여 염증을 유발한 연골세포에서 모두 수행하였으며, 각각의 시험물질을 랫트 연골세포에 처리한 뒤 24시간 및 48 시간 배양한 후에 MTT 분석 (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue; Sigma, M5655)을 진행하였다. 염증유발물질인 rhIL-1α로 유도한 관절염 in-vitro 모델에서의 시험물질의 세포증식능 평가에서는 rhIL-1α 처리 1 시간 전에 각각의 시험물질을 랫트 연골세포에 처리하고 24시간 및 48 시간 배양한 후 MTT 분석 (Thiazolyl Blue Tetrazolium Blue; Sigma, M5655)을 진행하였으며, 그 결과를 도 1 내지 도 4 에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 염증을 유발하지 않은 랫트 무릎관절 연골세포에서 덱스트란1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 또는 이의 혼합물의 세포 증식율을 24시간 동안 관찰한 결과, 대부분의 덱스트란 1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 및 이의 혼합물이 세포에 독성을 나타내지 않으면서 세포 증식을 돕는다는 것을 확인하였다. 다만 단일 처리군 중 폴록사머 188 처리군의 경우, 폴록사머 188 25(w/v)%(P25), 35(w/v)% (P35) 농도로 24시간 배양 시 일부 세포증식능의 감소가 대조약물(시판약물)인 히알루론산나트륨(HN) 투여군보다도 낮게 나타나 단일 투여에 적합하지 않은 것으로 나타났다. 또한 이들의 혼합물에서도 24 시간 배양 시 일부 세포증식능의 감소가 나타나 이를 통해 폴록사머 188의 경우, 이를 고농도로 처리하는 경우에 세포 독성을 유발할 수 있다는 가능성을 확인하였다. 또한 혼합물 중에서는 D50+P35, P5+T40, P25+T40, P35+T40 실험군에서 세포증식능의 감소가 대조약물(시판약물)인 히알루론산나트륨(HN) 투여군보다도 낮게 나타났다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 염증을 유발하지 않은 랫트 무릎관절 연골세포에서 덱스트란, 폴록사머 또는 이의 혼합물의 세포 증식율을 48 시간 동안 관찰한 결과에서도 24시간 배양과 유사한 결과를 확인하였다.

이러한 결과를 통해, 정상 무릎 관절 연골세포에 대한 처리 시, 덱스트란 1(D) 를 50%까지 농도를 증가시키거나, 덱스트란 5 (T) 를 40%까지 농도를 증가시켜도 연골세포의 증식이 시판약물 대비 억제되지 않는 반면, 폴록사머 188의 경우 25% 이상의 농도에서는 연골 세포에 독성을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 또한 혼합물로 구성하는 경우 폴록사머 188단독과 비교하여 세포 증식능이 일부 개선되기는 하나, 독성을 유발하지 않기 위해서는 폴록사머 188은 10(w/v)% 농도 이하로 혼합되는 것이 바람직함을 확인하였다.

도 3 및 도 4에서는 rhIL-1α 처리에 따른 골관절염 in vitro 모델에서의 실험군 처리에 따른 세포 증식율을 각각 24시간, 48시간 동안 관찰한 결과를 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 골관절염 모델에서도 폴록사머 188 은 농도가 높아지는 경우 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났으며, 덱스트란 1 및 덱스트란 5는 농도가 높아지더라도 세포증식을 억제하지 않는 것으로 나타났다. 폴록사머 188의 경우, P10 단독 처리군에서는 세포 증식 억제가 확인되었으나, 이를 D5, D50, T4, T40 등과 혼합하여 사용하는 경우에는 세포 증식효과가 나타나는 바, 덱스트란과 혼합 처리시에는 폴록사머 188 의 1% 내지 10(w/v)% 를 사용할 수 있음을 확인하였다.

도 4에서도 24시간 배양과 동일한 결과를 확인할 수 있었으며, P10 처리군의 세포증식능은 덱스트란 1 또는 덱스트란 5와의 혼합을 통해 증가한다는 사실을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 종합하여, 덱스트란 1 및 덱스트란 5는 정상 및 염증 유발세포에서 대부분 세포 독성을 유발하지 않음을 확인하였다. 반면 폴록사머 188은 농도가 높아짐에 따라 단일 물질로 처리하는 경우 정상세포 및 염증 유발 세포에서 모두 세포 증식능 억제를 유발할 수 있는 것으로 나타났으나, 폴록사머 188을 1 내지 10(w/v)% 로 덱스트란 1 또는 덱스트란 5 와 혼합 투여하는 경우, 세포독성 없이 이용 가능함을 확인하였다.

실시예 3. 실시간 RT- PCR 을 통한 MMP -3, MMP -13 유전자 발현 변화 확인

골관절염 평가를 위한 지표 물질들의 유전자 발현을 통해 골관절염 치료 효과를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. MMP-3, MMP-13은 연골기질을 파괴하는 단백질이므로, 염증 자극을 통해 유도될 수 있는 상기 유전자 발현량의 증가를 효과적으로 억제할 수 있다면, 연골 보호 효과가 우수한 것으로 평가할 수 있다.

덱스트란 1은 2.5 내지 50 (w/v)%, 덱스트란 5는 2 내지 40(w/v)%으로, 폴록사머 188은 1 내지 20(w/v)% 로 변화시키며 단일 투여 또는 혼합투여를 수행하고 이에 따른 MMP-3, MMP-13 의 발현 변화를 확인하였다. 구체적으로 각각의 시험물질을 rhIL-1α 처리 1시간 전에 랫트 연골세포에 처리한 뒤 24 시간 배양하였다. 배양 세포의 상층액을 제거한 뒤, 인산완충용액 (PBS)을 이용하여 세포를 세척하였다. 세척된 세포로부터 RNA를 분리하고 (GeneAll hybrid-R RNA purification kit; GeneAll, 3033522), 분리한 RNA를 nanodrop (Take3 Multi-Volume plate, BioTeK, Instruments, VT, USA)을 이용하여 정량한 뒤, 각 실험군별로 동일한 농도로 희석하였다. 동량으로 희석된 RNA를 PCR을 이용하여 cDNA로 합성하였으며 (ReverTra AceR qPCR RT Master Mix with gDNA Remover, Toyobo, FSQ-301). 합성된 cDNA를 이용, Real time RT-PCR을 통해 96 well plate에서 MMP-3, MMP-13의 유전자 발현을 확인하였다 (n=3).

실험에 사용된 프라이머의 구성은 하기 표 2에 나타내었고, 대조군으로는 하우스키핑 유전자인 GAPDH를 사용하였다.

[표 2]

해당 프라이머, SyBr green (SYBR Premix Ex Taq, Takara, RR420A) 그리고 주형을 혼합한 뒤, 실시간 RT-PCR (CFX 96 touch, Bio rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 intercalating 법에 의한 실시간 RT-PCR을 수행하였다. Ct값을 검량선에 적용하여 얻어지는 정량결과(유전자 발현량)는 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 정량결과로 나눈 값으로 표시하였다.

3.1 MMP-3 발현 변화 확인

덱스트란 1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 단일 또는 이의 혼합물 처리에 따른 MMP-3의 발현 결과를 표 3a 내지 표 3b 및 도 5에 나타내었다.

[표 3a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 MMP-3 유전자 발현량

[표 3b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 MMP-3 유전자 발현량

상기 표 3a 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 덱스트란 1 (D) 는 2.5 내지 40(w/v)% 에서 염증 유발 양성 대조군 대비 유의적인 MMP-3 감소 효과를 나타내었으며, 덱스트란 5 (T) 는 2 내지 20 (w/v)% 에서 유의적인 MMP-3 감소 효과를 나타내었다. 한편 폴로사머 188(P) 는 실험한 모든 군인 1 내지 20(w/v)%에서 감소 효과를 나타내었다.

표 3b 및 도 5에 나타낸 바와 같이 혼합물 실험군에서는 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%와 폴록사머 188 (P) 2 내지 10(w/v)%, 덱스트란 (T) 4% 및 40(w/v)% 모든 실험군에서 유의적인 효과를 확인하였으나, 덱스트란 1 (D)을 50(w/v)%까지 고농도로 처리한 군에서는 P2 와의 혼합에서만 유의적인 감소 효과를 확인하였다. 따라서 덱스트란 1을 덱스트란 5 또는 폴록사머 188과 혼합하는 경우, 농도를 50(w/v)%미만으로 혼합하는 것이 바람직함을 확인하였다. 폴록사머 188은 단독 처리 및 혼합 처리군에서 MMP-3 감소 효과를 대부분 유의적으로 나타내었으나, 실시예 2에서 확인한 바에 따라 폴록사머의 농도는 10(w/v)% 이하 인 것이 바람직하며, 이에 해당되는 P2, P5, P10은 덱스트란 1 및 덱스트란 5와의 조합에서도 유의적인 MMP-3 억제 효과를 유도할 수 있음을 확인하였다.

3.2 MMP -13 발현 변화 확인

덱스트란 1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 단일 또는 이의 혼합물 처리에 따른 MMP-13의 발현 결과를 표 4a 내지 표 4b 및 도 6에 나타내었다.

[표 4a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 MMP-13 유전자 발현량

[표 4b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 MMP-13 유전자 발현량

상기 표 4a 내지 표 4b, 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 단일물 실험군에서 덱스트란 1 (D) 은 2.5 내지 25(w/v)% 에서 유의적인 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 나타내었으며, D40인 40(w/v)%에서는 유의하지는 않았으나 MMP-13 유전자 증가가 억제되었고, D50인 50(w/v)%에서는 오히려 MMP-13 수준이 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 특성은 덱스트란 1 (D) 의 혼합물에서도 유사하게 나타났다. 따라서, 덱스트란 1(D)는 2.5 내지 40(w/v)%가 가장 바람직한 농도 범위인 것을 확인하였으며, 이는 MMP-3 유전자 발현량 결과와도 일치하는 결과이다. 덱스트란 5 (T) 는 단독 투여시 2 내지 40(w/v)%에서 유의적인 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 나타내었으며, 덱스트란 5 (T) 4 및 40(w/v)%은 덱스트란 1 (D) 5(w/v)% 및 폴록사머 188 (P) 2 및 10(w/v)% 와의 혼합에서도 유의적인 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 나타내었다.

폴록사머 188의 경우, 단독 실험군에서 5 내지 20(w/v)%에서 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 나타내었으나, 덱스트란과 혼합물로 투여하는 경우 2(w/v)% 역시 효과를 나타낼 수 있는 것으로 확인하였다. 실시예 2에서의 세포 독성 실험 결과를 고려하면, 폴록사머 188(P)의 농도는 혼합 투여 시 2 내지 10(w/v)% 인 것이 바람직한 것으로 확인하였다. 이에 해당되는 P2, P10은 덱스트란 1 및 덱스트란 5와의 조합에서도 덱스트란 1 (D) 50(w/v)%의 조합을 제외하고는 모두 유의적인 MMP-13 유전자 증가 억제 효과를 유도하였다.

실시예 4. IL-10/IL-6 발현 비를 통한 항염 효과 확인

실시예 3과 유사한 방법으로 24h 동안 염증유발물질인 rhIL-1α 와 시험물질(단일물, 이들의 혼합물)을 함께 처리시 IL-10/IL-6 발현 비를 확인하여 실험군의 항염 효과를 확인하였다. IL-10/IL-6 발현 비가 증가할수록 항염 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있다.

실험에 사용된 프라이머의 구성은 하기 표 5 에 나타내었으며, 대조군으로는 하우스키핑 유전자인 GAPDH를 사용하였다. 결과를 표 6a 내지 표 6b, 및 도 7 에 나타내었다.

[표 5]

해당 프라이머, SyBr green (SYBR Premix Ex Taq, Takara, RR420A) 그리고 주형을 혼합한 뒤, Real time RT-PCR (CFX 96 touch, Bio rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 intercalating 법에 의한 Real Time RT-PCR을 수행하였다. Ct값을 검량선에 적용하여 얻어지는 정량결과(유전자 발현량)는 하우스키핑 유전자인 GAPDH의 정량결과로 나눈 값으로 표시하였다.

[표 6a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 IL-10 / IL-6 유전자 발현 비

[표 6b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 IL-10 / IL-6 유전자 발현 비

표 6a 및 도 7 에 나타낸 바와 같이, 단일군 처리 실험인 덱스트란 1 (D)을 단독으로 처리한 군에서는 50(w/v)% 처리군을 제외하고는 IL-10/IL-6 발현비의 증가가 뚜렷하게 확인되지 않았으나, 폴록사머 188 (P) 1 내지 20 (w/v)% 처리군, 덱스트란 5 (T) 2 내지 20 (w/v)% 군에서는 유의적인 증가효과가 확인되었다.

표 6b 및 도 7 에 나타낸 바와 같이, 혼합물 처리 실험인 덱스트란 1(D)의 혼합물 투여군 모두에서 유의적인 IL-10/IL-6 발현비의 증가 효과가 나타났으며, 폴록사머 188 (P) 및 덱스트란 5 (T) 와의 혼합 투여군에서도 모두 유의적인 증가가 나타나 혼합물에서의 항염효능이 탁월함을 확인하였다.

덱스트란 1 의 50(w/v)% 투여군에서 비록 IL-10/IL-6 발현비의 증가가 유의적이긴 하였으나 그 증가량이 두각을 나타내지 않았음을 고려하면, 골관절염 모델에서의 IL-10/IL-6 발현비 증가, 즉 항염 효과는 덱스트란 1 (D)의 농도를 증가시키는 것보다는 폴록사머 188 (P) 또는 덱스트란 5 (T)와의 혼합으로 투여하는 것이 바람직하다는 것을 나타낸다. 특히 항염 효과는 덱스트란 1 (D) 5 및 50 (w/v)%, 덱스트란 5 (T) 4 및 40(w/v)%, 폴록사머 188 (P) 2 및 10(w/v)%의 단독 투여군과 비교하여 이들의 혼합물 투여군이 대부분 현저하게 우수한 것으로 나타났으므로, 이를 통해 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5 (T), 폴록사머 188 (P) 혼합 투여의 우수성을 확인할 수 있다.

실시예 5. 골관절염 모델에서의 2형 콜라겐(Type II Collagen) 및 아그리칸 (Aggrecan) 의 생성량 증가 확인

골관절염 평가를 위한 지표 물질 중 2형 콜라겐과 아그리칸 단백질 생성량을 확인하기 위하여 rhIL-1α를 처리하기 1시간 전에 각각의 시험물질을 연골세포에 처리한 뒤 24 시간 동안 배양하였다. 2형 콜라겐과 아그리칸은 연골기질 조성물이므로, 이의 생성량이 증가되면 연골 기질 보호 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있다.

여기서 세포 상층액(배양액)을 회수하여 13,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상층액 만을 분석에 사용하였다. 원심분리된 세포 상층액을 이용하여 Aggrecan ELISA Kit (Rat Aggrecan ELISA Kit, Mybiosource, MBS261073)와 type II Collagen (Type II Collagen detection Kit, Multi-Species, Chondrex, 6018) 제품의 manual을 참조한 분석을 진행하였다. 정확한 분석을 위하여 전파장대의 ELISA reader (EPOCH 2 microplate reader, BioTek, Instruments, VT, USA)를 이용하여 각각 450nm와 490nm에서 흡광도를 측정한 후 검량선에 따라 2형 콜라겐과 아그리칸의 함량(ng/mL)을 정량하였다.

5.1 2형 콜라겐의 생성량 확인

덱스트란 1 (D), 덱스트란 5 (T), 폴록사머 188 (P) 단일 또는 이의 혼합물 처리에 따른 2형 콜라겐의 생성량 결과를 표 7a 내지 표 7b 및 도 8에 나타내었다.

[표 7a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 Type II Collagen 생성량

[표 7b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 Type II Collagen 생성량

상기 표 7a 내지 표 7b, 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 덱스트란 1 (D) 5 내지 25(w/v)%, 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)% 단독 투여군에서 염증유발 양성 대조군(PC) 대비 2형 콜라겐 합성 증가가 관찰되었다. 한편 덱스트란 1 (D) 50(w/v)% 은 단독 및 덱스트란 5 (T), 폴록사머 188 (P)과의 혼합 투여군 모두에서 염증유발 양성 대조군(PC) 대비 2형 콜라겐 합성 증가를 유도하지는 못한 것으로 나타났다. 이는, 실시예 3 에서 확인한 바와 같이 덱스트란 1 (D) 50(w/v)% 단독으로는 MMP-3, MMP-13 의 발현 증가를 억제하는 효과를 나타내지 않고 오직 폴록사머 188 (P) 2 내지 10(w/v)% 과의 혼합에서만 MMP-3, MMP-13 의 발현 증가를 억제할 수 있음을 고려하면, 덱스트란 1 (D)은 40(w/v)% 이하로 단독 또는 혼합 사용하는 것이 바람직하다는 것을 보여주는 결과이다. 특히, 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%와 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)%와 혼합 투여 시에 염증유발 양성 대조군(PC) 대비 2형 콜라겐 합성이 유의하게 증가하였다.

폴록사머 188(P)의 경우 2(w/v)% 처리군을 제외한 10(w/v)%, 20(w/v)% 단독 처리군에서 모두 2형 콜라겐 합성 증가 효과가 관찰되지 않았으며, 농도를 증가시킬수록 2형 콜라겐 합성은 더욱 감소함을 확인하였다. 그러나 폴록사머 188 (P) 2 또는10(w/v)% 를 덱스트란 1 (D) 5(w/v)% 또는 덱스트란 5 (T) 40(w/v)% 와 혼합하여 투여하는 경우에는 2형 콜라겐 합성 증가 효과가 유의하게 나타났다. 이러한 결과는 골관절염의 2형 콜라겐 합성에 있어서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T)를 단독으로 처리 가능하나, 폴록사머 188 (P)은 2(w/v)%를 제외하고는 단독처리는 적합하지 않고, 폴록사머 188(P)과 덱스트란 1 (D) 또는 덱스트란 5 (T)의 혼합 투여가 2형 콜라겐 합성을 효과적으로 유도할 수 있음을 나타낸다.

앞서 실시예 4에서는 단독 투여와 비교하여 폴록사머 188과 덱스트란 1 또는 덱스트란 5의 혼합 투여가 IL-10/IL-6 의 유전자 발현 비율을 현저하게 증가시킬 수 있음을 확인하였으므로, 이와 같은 결과를 종합하면, 골관절염에서의 염증 반응을 완화시키는 것과 동시에 콜라겐 합성을 촉진하기 위해서는 덱스트란 1, 덱스트란 5 또는 폴록사머 188 의 혼합물을 투여하는 것이 바람직한 것을 확인하였다.

5.2 아그리칸 함량 정량 결과 확인

덱스트란 1, 덱스트란 5, 폴록사머 188 단일 또는 이의 혼합물 처리에 따른 아그리칸 생성량 결과를 표 8a 내지 표 8b, 및 도 9에 나타내었다.

[표 8a]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T), 폴록사머 188(P) 단일물의 아그리칸 생성량

[표 8b]

RhIL-1α을 24h 처리한 연골세포에서 덱스트란 1 (D), 덱스트란 5(T) 또는 폴록사머 188(P) 혼합물의 아그리칸 생성량

상기 표 8a 및 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 덱스트란 1 (D) 5 내지 25(w/v)%, 덱스트란 5 (T) 4(w/v)%, 폴록사머 188 (P) 2 내지 10(w/v)% 단독 처리군에서 아그리칸 생성량이 염증유발 양성 대조군(PC)과 비교하여 유의하게 증가함을 확인하였다. 한편 덱스트란 1 (D) 50(w/v)%, 폴록사머 188 (P) 20(w/v)%, 덱스트란 5 (T) 20 내지 40(w/v)% 단독 투여군은 아그리칸 생성 증가를 유도하지 못한 것으로 확인하였다.

표 8b 및 도 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혼합 투여군 중에서는 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%와 폴록사머 188 (P) 2(w/v)%, 또는 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)% 의 혼합 투여군에서 아그리칸 생성량이 염증유발 양성 대조군(PC)과 비교하여 유의하게 증가하였고, 덱스트란 1 (D) 50(w/v)% 와는 폴록사머 188 (P) 2(w/v)%와의 혼합투여군에서만 아그리칸 생성량이 유의하게 증가하였다. 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)% 와 폴록사머 188(P) 2 내지 10(w/v)% 간의 혼합 투여군에서도 염증유발 양성 대조군(PC)과 비교하여 아그리칸 생성량이 유의하게 증가함을 확인하였다. 특히, 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%와 폴록사머 188 (P) 2(w/v)%는 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)%와의 혼합 투여시 단일투여에 비해 유의하게 아그리칸 생성량이 증가함을 확인하였다.

앞서 실시예 5.1에서 확인한 2형 콜라겐 합성의 결과를 함께 고려하는 경우, 골관절염 모델에서 2형 콜라겐 합성을 증가시키고 아그리칸의 생성을 증가시키기 위해서는 덱스트란 1 (D) 5 내지 25(w/v)%, 덱스트란 5 (T) 4(w/v)%, 또는 폴록사머 188 (P) 2(w/v)%를 단독 투여하거나, 덱스트란 1 (D) 5(w/v)% 를 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)%와 혼합 투여하거나, 덱스트란 1 (D) 5(w/v)%을 폴록사머 188 (P) 2 (w/v)%와 혼합 투여하는 경우가 바람직한 것으로 확인되었다. 또한 덱스트란 5 (T) 4 내지 40(w/v)% 은 덱스트란 1 (D) 5(w/v)% 와의 조합에서, 특히 덱스트란 5 40(w/v)% 의 경우 폴록사머 188 (P) 2 내지 10(w/v)% 과의 조합에서 2형 콜라겐 합성과 아그리칸의 생성을 유의하게 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

상기와 같은 결과를 종합하면 골관절염 치료에 있어서, 덱스트란 1, 덱스트란 5 및 폴록사머 188를 사용할 수 있으나, 이들의 단독 또는 모든 조합이 골관절염에 치료 효과를 나타내는 것은 아니며, 덱스트란 1, 덱스트란 5 및 폴록사머 188의 농도 조합에 따라 독성 및 효과가 상이하게 나타날 수 있으므로 이의 적절한 조합을 도출하는 것이 중요하다는 것을 확인할 수 있다.

Claims

유효성분으로 평균 분자량 5000Da 의 덱스트란 5 를 2 내지 30 (w/v)% 농도로 포함하고, 평균 분자량 8000Da 이상의 덱스트란을 미포함하는, 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
평균 분자량 5000Da 의 덱스트란 5 및 폴록사머의 혼합물을 유효성분으로 포함하고, 평균 분자량 8000Da 이상의 덱스트란을 미포함하며, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40 (w/v)%, 상기 폴록사머의 농도는 1 내지 20 (w/v)%인, 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
평균 분자량 1000Da인 덱스트란 1 및 평균 분자량 5000Da 인 덱스트란 5 의 혼합물을 유효성분으로 포함하고, 평균 분자량 8000Da 이상의 덱스트란을 미포함하며, 상기 덱스트란 5의 농도는 2 내지 40(w/v)%, 상기 덱스트란 1의 농도는 2.5 내지 40(w/v)% 인, 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
줄기세포;
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 퇴행성 관절 질환 또는 추간판, 인대, 피부, 건의 퇴행성 변화에 의한 퇴행성 결체 조직 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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