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KR102103319B1 - 면역반응 발생 요법으로 치료하기 위해 암환자들의 선택, 및 선택해제를 위한 질량-스펙트럼법 - Google Patents

면역반응 발생 요법으로 치료하기 위해 암환자들의 선택, 및 선택해제를 위한 질량-스펙트럼법 Download PDF

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KR102103319B1
KR102103319B1 KR1020157001998A KR20157001998A KR102103319B1 KR 102103319 B1 KR102103319 B1 KR 102103319B1 KR 1020157001998 A KR1020157001998 A KR 1020157001998A KR 20157001998 A KR20157001998 A KR 20157001998A KR 102103319 B1 KR102103319 B1 KR 102103319B1
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뢰더 하인리치
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바이오디식스, 인크.
글로브이뮨
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Abstract

암환자가 변이된 Ras-기반 암에 대한 효모-기반 면역요법일 수 있는 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻을 수 있을 것 같거나 얻을 것 같지 않은지의 여부를 치료 전에 예측하기 위한 방법 및 시스템. 그 방법은 혈액-유래 환자 시료의 질량 분광분석법 및 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻거나 얻지 않았던 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼의 학습집단을 이용하는 분류기로 구성된 컴퓨터를 사용한다. 또한, 본원에 기재된 예측성 질량 스펙트럼법에 따른 시험에 의해 선택된 환자에게 변이된 Ras-기반 암에 대한 효모-기반 면역요법일 수 있는 효모-기반 면역반응 발생 요법을 투여하는 단계를 포함하는 암환자의 치료 방법이 개시되어 있고, 여기서 스펙트럼에 대한 등급 표지는 환자가 효모-기반 면역요법으로부터 이득을 얻을 것 같다는 것을 나타낸다.

Description

면역반응 발생 요법으로 치료하기 위해 암환자들의 선택, 및 선택해제를 위한 질량-스펙트럼법{MASS-SPECTRAL METHOD FOR SELECTION, AND DE-SELECTION, OF CANCER PATIENTS FOR TREATMENT WITH IMMUNE RESPONSE GENERATING THERAPIES}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. §119(e) 하에 2012년 6월 26일에 출원된 미국 가출원 제 61/664,308호 및 2012년 6월 26일에 출원된 미국 가출원 제 61/664,329호를 우선권 주장한다. 미국 가출원 제 61/664,308호 및 미국 가출원 제 61/664,329호 각각의 전체 개시가 참조로서 본원에 포함된다.
공동 연구 계약에 대한 진술
본 발명은 2012년 2월 22일에 실행된 공동 연구 계약의 당사자에 의하여 또는 이를 대신하여 행해졌다. 상기 공동 연구 계약의 당사자들은: 바이오디식스사(Biodesix, Inc.) 및 글로브이뮨사(GlobeImmune, Inc.)이다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web에 의한 텍스트 파일로서 전자 제출되는 서열 목록을 포함한다. "12-621-PRO_ST25"로 명명되는 상기 테스트 파일은 19KB 크기를 가지며, 2013년 3월 15일에 기록되었다. 상기 텍스트 파일에 포함되는 정보는 37 CFR § 1.52(e)(5)에 따라 그 전체로서 본원에 참조로 원용된다.
본 발명은 일반적으로 암환자들의 치료를 안내하기 위한 방법의 분야에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 하나의 양상에서, 본 발명은 치료를 시작하기에 앞서 치료를 발생시키는 면역반응 발생 요법(예를 들면, 세포 면역요법 제제와 같은)의 투여를 단독으로 또는 표준 항암제 및/또는 암 치료용 디른 치료 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같은 환자 부류의 구성원인지의 여부를 예측하는 방법에 관한 것이다. 또한, 면역반응 발생 요법, 및/또는 표준 화학요법 제제에 면역반응 발생 요법의 추가로 이득을 얻을 것 같지 않은 환자를 확인하는 방법이 개시되어 있다. 본 개시물의 방법들은 환자의 혈액-유래 시료로부터 수득된 질량 스펙트럼 데이터, 질량 스펙트럼 데이터에 대해 작동하는 분류기로서 구성된 컴퓨터 및 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼 포함하는 학습집단을 사용한다.
암은 모든 무질서한 세포 성장을 포함하는 다양한 질병의 광범위한 군이다. 암에서, 세포가 비조절적으로 분열하고 성장하여, 악성 종양을 형성하고, 신체의 가까운 부분을 침습한다. 또한, 암은 림프 시스템 또는 혈류를 통해 신체의 보다 먼 부분까지 퍼질 수 있다. 국립 암 연구소(NCI)에 의한 이러한 통계자료를 추적하면, 2012년 미국에서 암의 신규한 예상 건수는 1,638,910(비흑색종 피부암을 포함하지 않는다)이고, 미국에서 암으로 인한 1년당 사망자수는 577,190(http://cancer.gov/cancertopics/cancerlibrary/what-is-cancer)으로 예측된다. 암에 대한 관리 및 치료 옵션이 존재한다. 일차 옵션들은 수술(예를 들면, 종양의 외과적 절제술), 화학요법, 방사선요법, 표적 암 치료요법(예를 들면, 종양 성장 및 진행에 포함되는 분자를 특정 목적하는 저분자 의약품 또는 단일클론 항체 요법들), 및 완화 의료, 또는 그 일부 병용(본 명세서 전체에서 "항암 요법"이라고 한다)을 포함한다.
암에 대한 추가적인 요법은 전체에서 "면역요법(immune therapies)" 또는 "면역요법(immunotherapies)"(일반적으로 "면역반응 발생 요법"이라고도 할 수 있다)이라고 하는 면역반응을 유도, 촉진 또는 억제하기 위한 치료 전략을 포함한다. 최근, 면역요법은 진행성 또는 전이성 고형 종양의 치료에 더 관련되고 있다. 암에 사용되는 면역요법은 일반적으로 환자 자신의 면역반응을 증대 또는 자극하도록 고안되어 암 세포를 더 잘 제어 또는 제거하고, 그 밖의 치료 예컨대 화학요법, 수술, 방사선요법 및 표적 암 요법의 사용을 추가로 지지한다. 종양학에서 사용되는 이러한 면역요법의 일부 예로서는:(1) 진행성 거세 저항성 전립선암에 사용되는 항원에 대하여 세포독성 반응을 활성시키는 PROVENGE®(Dendreon),(2) 세포독성 반응을 활성화하는 T세포를 암에 입양 전달(adoptive transfer);(3) 종양 항원을 인지하도록 고안된 T세포 수용체를 넣은 바이러스를 도입함으로써 유전학적으로 조작된 T세포;(4) 이식된 방사선조사성 동종이형 췌장암 세포로 이루어져 잠재적인 항종양 활성을 갖는 뮤린 알파-1,3-갈락토오스전달효소를 발현하는 암 백신, 알젠판투셀-L(Algenpantucel-L);(5) 바이러스벡터-기반 면역요법; 및 (6) 효모-기반 면역요법을 포함한다.
또한, 효모-기반 면역요법은 TARMOGEN®(콜로라도 루이빌의 글로브이뮨사) 기술이라고도 하고, 일반적으로 하나 이상의 이종 표적 항원을 세포외(그 표면에), 세포내(내부 또는 세포질) 또는 세포외와 세포내 모두에 발현하는 효모 전달체를 말한다. 효모-기반 면역요법 기술이 일반적으로 기재되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제 5,830,463호 참조). 또한, 어떤 효모-기반 면역요법 조성물, 및 이의 형성 방법과 일반적인 사용 방법은, 예를 들면 미국 특허 제 5,830,463호, 미국 특허 제 7,083,787호, 미국 특허 제 7,736,642호, 문헌[Stubbs 외., Nat. Med. 7:625-629(2001)], [Lu 외., Cancer Research 64:5084-5088(2004)], 및 [Bernstein 외., Vaccine 2008 Jan 24;26(4):509-21]에 상세하게 기재되어 있고, 그 전체가 참고로 본 명세서에 각각 포함된다. 암에 대한 효모-기반 면역요법은, 예를 들면 미국 특허 제 7,465,454호, 미국 특허 제 7,563,447호, 미국 특허 제 8,067,559호, 미국 특허 제 8,153,136호, 미국 특허 공개 제 2009-0098154호, 및 PCT 공개 제 WO 07/133835호에 기재되어 있고, 그 전체가 참고로 본 명세서에 각각 포함된다.
효모-기반 면역요법은 그 밖의 면역요법에 비해 특이한 능력을 가져서, 이들 중 많은 것들이 독성 문제를 갖는 외인성 애주번트, 사이토카인, 또는 다른 면역자극 분자의 사용없이, 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 포함하는, CD4-의존성 TH17 및 TH1 T세포 반응 및 항원-특이적 CD8+T세포 반응을 포함하는, 표적 항원에 대한 광범위한 후천적 면역반응뿐만 아니라, 선천적 면역반응을 유도한다. 또한, 효모-기반 면역요법 조성물은 조절 T세포(Treg) 수 및/또는 기능성을 저해함으로써, 예를 들면, 정상적으로 종양의 존재에 의해 억제될 작동 T세포 반응을 향상시킨다. 게다가, 항체 반응을 발생함으로써 면역화하는 면역요법 조성물에 비해, 효모-기반 면역요법에 의해 유발되는 항원-특이적이고, 광범위하며, 강력한 세포성 면역반응은 그렇지 않으면 심지어 억제 환경일 수 있음에도 불구하고 종양 세포를 표적화할 때 특히 효과적이라고 여겨진다. 이러한 종류의 면역요법은 적절한 면역원을 제시하는 항원 제시 세포의 자연적 능력을 활용하므로, 효과적인 효모-기반 면역요법을 생산하도록 표적 항원의 CTL 에피토프 또는 MHC 클래스 II 에피토프의 정확한 정체를 알 필요가 없고, 면역요법을 생산하도록 환자로부터 임의의 면역세포를 분리할 필요도 없다. 사실상, 다중 CD4+ 및 CD8+ T세포 에피토프는 단일 효모-기반 면역요법 조성물 내에 표적화될 수 있고, 따라서 추정 T세포 에피토프 또는 T세포 수용체를 확인하기 위한 알고리즘 및 복잡한 식의 사용은 생략한다.
현재 글로브이뮨사의 임상 개발에서 "GI-4000"로 알려진 TARMOGEN® 제품 후보를 포함하는 효모-기반 면역요법 제품의 하나의 시리즈가 환자의 종양에서 발현되는 변이된 Ras 단백질에 대한 면역반응을 자극하도록 개발되고 있다. "Ras"는 인간 세포를 포함하는 세포 내부에서 발견되는 관련된 단백질군에 부여된 명명이다. 모든 Ras 단백질군의 일원은 스몰 GTPase라고 하는 단백질 종류에 속하고, 세포 내에 신호 전달하는 것을 포함한다(세포 신호 전달). Ras 돌연변이는 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암, 자궁내막암 및 난소암뿐만 아니라 흑색종 및 다발성 골수종을 포함하는 다양한 종양의 종류에 걸쳐 미국에서 매년 대략 180,000가지의 새로운 암의 경우에서 발견된다. 연구에서 Ras 돌연변이에 의한 종양이 일반적으로 종래의 화학요법뿐만 아니라 표적화된 제제에 정상 Ras에 의한 종양보다 덜 민감하다는 것을 보여준다. 일부 암, 예컨대 NSCLC 또는 대장암에 대하여, 표피 성장 인자 수용체, 또는 EGFR을 표적화하는 요법은 임상 결과를 개선시킨다. 그러나, 종양에서 Ras 돌연변이의 존재는 대장암에서의 EGFR 표적 요법을 사용함에도 불구하고 나쁜 예후와 연관된다. 유사하게, 그 밖의 연구는 Ras-변이된 대장 종양을 지닌 환자가 동일한 요법으로 치료시 생존율을 개선하는, 정상 Ras를 지닌 환자에 비해 세툭시맵(cetuximab) 요법, 또 다른 EGFR 표적 제제로 이득을 얻지 못한다는 것을 보여주고 있다. 그 결과, Ras-돌연변이를 지닌 환자는 할 수 있는 효과적인 치료 선택이 더 적다. 변이된 Ras가 종양 성장에 미치는 역할 때문에 Ras 돌연변이를 포함하는 세포의 목적되는 감소는 많은 인간 암을 지닌 환자에 대해 개선된 임상 결과를 야기할 수 있다. 그러나, 현재 말기 임상시험에서 변이된 Ras를 표적화하는 요법이 없다.
면역요법 분야에서의 진보가 느렸지만, 최근 임상 성공이 암에서의 치료 양상으로서 이 접근법의 잠재성을 강하게 지원해왔다. 그러나, 암의 면역계 치료로 임상 이득을 얻을 환자를 확인하고, 치료 전에 임상 반응군 및 비반응군을 확인하는 바이오마커를 규정하는 것이 이 분야에서 필요하다. 면역요법 마커의 예로서는 CD54 발현 및 인터루킨 12p70 생성을 포함하지만, 그것들이 완전히 검증되지는 않았다. 또한, 여러 세포성 면역 마커 검출법(사이토카인 유세포분석기, MHC 사량체, 및 효소-결합 면역흡착 점적(ELISPOT))을 사용한다. 면역요법으로 얻는 이득을 예측하는 검출법이 재현가능하고 비교가능한 결과들을 생성하도록 표준화될 필요가 있다는 것을 주목하는 것은 중요하다. 이것은 이 분야에서 행하지 않고 있다.
치료 전에 정해진 암환자가 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 다른 항암제 치료와의 병용하여 이득을 얻을 지 여부, 또는 이러한 치료가 정해진 암환자에게 이득이 될 것 같지 않은지의 여부를 결정하기 위해 실용적이고 유용한 실험이 본 기술분야에서 필요로 하는 것이다. 본 발명이 이 필요성을 충족한다.
특정종류의 약으로 이득을 얻는 암환자를 예측할 수 있는 능력과 관련되어 관심있는 다른 종래기술은 미국 특허 제 7,736,905호, 제 7,858,390호; 제 7,858,389호, 제 7,867,775호, 제 8,024,282호; 제 7,906,342호 및 제 7,879,620호, 및 2012년 1월 24일에 출원된, 계류중인 미국 특허 출원 번호 제 13/356,730호, 및 2011년 2월 22일에 출원되고 미국 2011/0208433로 공개된 미국 특허 출원 번호 제 12/932,295호를 포함하고, 모두 바이오디식스사에 양도된 것이다. '905 특허 및 2011년 2월 22일에 출원된 미국 특허 출원 번호 제 12/932,295호는 본 명세서에 참조로서 포함된다. 다른 것들 중에서 '905 특허는 NSCLC 암환자들이 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 표적하는 약으로 이득을 얻을 것 같은지 여부를 결정하기 위한 질량 분광분석 근거한 테스트를 기재하고 있다. 이 실험은 "베리스트래트(VeriStrat)"로서 그 시판 버전에 공지되어 있고, 하기 논의에서 "베리스트래트"에 대한 언급을 '905 특허에 기재된 실험을 참조하여 이해할 것이다.
본 발명은 일반적으로 암환자들의 치료를 안내하기 위한 방법의 분야에 관한 것이다. 하나의 양상에서는, 암환자들의 이러한 치료는 암에 대한 면역요법이고, 하나의 양상에서는, 치료는 암에 대한 효모-기반 면역요법이며, 또 다른 양상에서는, 치료는 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법이다(즉, 적어도 일부 종양이 변이된 Ras 단백질에 대해 양성인 양은 ras 핵산 서열에서 돌연변이를 검출함으로써 전형적으로 검출된다). 하나의 양상에서, 치료는 변이된 Ras-양성 췌장암에 대한 효모-기반 면역요법이다.
더욱 상세하게는, 하나의 양상에서, 본 발명은 치료를 시작하기 전에 암환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법(예를 들면, 세포 면역요법 제제로서)의 투여를 단독으로 또는 표준 항암제에 의한 치료 및/또는 암 치료용 디른 치료 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같은 환자 부류의 구성원인지 여부를 예측하는 방법에 관한 것이다. 또한, 효모-기반 면역요법, 및/또는 표준 화학요법 제제로 면역요법의 추가에 반응할 것 같지 않은 환자를 확인하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 효모-기반 면역요법, 및/또는 표준 화학요법 제제로 효모-기반 면역요법 및/또는 암에 대한 다른 치료(예를 들면, 외과적 절제술)에 덜 반응할 것 같거나, 또는 반응할 것 같지 않은 환자를 확인하는 방법들이 개시되어 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 치료를 시작하기 전에 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법의 투여를 단독으로 또는 표준 항암제 및/또는 암 치료용 디른 치료 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같은 환자 부류의 구성원인지 여부를 예측하는 방법에 관한 것이다. 또한, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법, 및/또는 변이된 Ras-양성암에 대한 표준 화학요법 제제로 효모-기반 면역요법의 추가 및/또는 암에 대한 디른 치료(예를 들면, 외과적 절제술)에 덜 반응할 것 같거나, 또는 반응할 것 같지 않은 환자를 확인하는 방법들을 개시하고 있다. 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암은 췌장암이다. 일례로서, 이 명세서는 젬시타빈(gemcitabine)의 투여와 병용하여 변이된 Ras를 목적하는 효모-기반 면역요법의 투여로 췌장암 환자들이 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하기 위한 방법을 기재하고 있다(예를 들면, GI-4000로서 공지된 제품의 시리즈가 본 명세서에 보다 상세하게 기재된다).
본 개시물의 방법은 환자의 혈액-유래 시료로부터 수득된 질량 스펙트럼 데이터, 데이터, 질량 스펙트럼 데이터에 대해 작동하는 분류기로서 구성된 컴퓨터, 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단을 사용한다.
본 출원인들은 치료 전에 암환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여 이득을 얻거나 또는 얻지 않을 것 같은지 여부를 예측하는 방법을 발견하였다. 혈액-유래 시료를(예를 들면, 혈청, 혈장) 사용하여 면역계의 마커를 순환시키는 안목을 부여함으로써 면역요법으로 전체적인 감수성을 계측할 가능성을 증가시키기 때문에 중요하다. 또한, 방법은 환자 시료의 복잡한, 시간 소비성 검출법을 수행하거나 환자 시료로부터 종양 시료를 수득할 필요 없이 혈액-유래 시료로부터 간단한 질량 분광분석 시험을 통해 빠르게 행해질 수 있다. 특히, 출원인들은 전처리로 수득된 시료로부터 그 시험의 검증을 입증하였다. 따라서, 시험을 실용적인 실행하여 환자로부터의 전처리 시료들을 사용하고 환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법으로 이득을 얻거나 또는 얻지 않을 것 같은지 여부를 예측하는 것이다.
본 개시물의 방법은 질량 분광계(예를 들면, MALDI TOF 기기) 및 분류기로서 기능하도록 구성되는 범용 컴퓨터의 도움으로 수행될 수 있는 실용적인, 유용한 시험의 형태를 취한다.
하나의 양상에서, 암환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하는 방법은:
(a) 환자의 혈액-유래 시료를 수득하는 단계;
(b) 시료에 대해 질량-분광광도를 행하고 시료로부터 질량 스펙트럼을 수득하는 단계;
(c) 프로그래밍된 컴퓨터에서, 질량 스펙트럼에 대한 소정의 전처리 단계들 중 하나 이상을 수행하고, 전처리 단계를 수행한 후에 소정의 m/z 범위에 걸쳐서 질량 스펙트럼에서 선별된 피쳐의 적분된 세기값을 수득하며, 또한 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단과 적분된 세기값을 비교하여 등급 표지로 질량 스펙트럼을 분류하는 단계를 포함하여 기재되어 있다. 등급 표지는 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 다른 항암 요법과 병용하여 환자가 이득을 얻거나 또는 얻지 않을 것 같은지 여부를 예측한다. 예를 들면, 등급 표지는 "슬로우" 또는 "퀵"의 형태를 취할 수 있고, "슬로우"는 환자가 이득을 얻을 것 같고 재발 시간 또는 암의 질병 진행이 상대적으로 느리다는 것을 나타내는 반면, "퀵"은 환자가 이득을 얻을 것 같지 않고 재발 시간 또는 질병 진행이 상대적으로 짧다는 것을 나타낼 수 있다. 물론, 다른 동등한 등급 표지, 예컨대 "유익", "무익", "좋음", "나쁨" 등을 사용할 수 있다.
하나의 양상에서, 암환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법의 투여를 단독으로 또는 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하는 방법은:
(a) 환자의 혈액-유래 시료를 수득하여 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 다른 항암 요법과 병용하여 처리하는 단계;
(b) 시료에 대해 질량-분광광도를 행하고 시료로부터 질량 스펙트럼을 수득하는 단계;
(c) 프로그래밍된 컴퓨터에서, 질량 스펙트럼에 대한 소정의 전처리 단계들 중 하나 이상을 수행하고, 전처리 단계를 수행한 후에 소정의 m/z 범위에 걸쳐서 질량 스펙트럼에서 선별된 피쳐의 적분된 세기값을 수득하며, 또한 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 그들의 치료 전에 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단과 적분된 세기값을 비교하여 등급 표지로 질량 스펙트럼을 분류하는 단계를 포함하여 기재되어 있다. 등급 표지는 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻거나 또는 얻지 않을 것 같은지 여부를 예측한다. 예를 들면, 등급 표지는 "슬로우" 또는 "퀵"의 형태를 취할 수 있고, "슬로우"는 환자가 이득을 얻을 것 같고 재발 시간 또는 암의 질병 진행이 상대적으로 느리다는 것을 나타내는 반면, "퀵"은 환자가 이득을 얻을 것 같지 않고 재발 시간 또는 질병 진행이 상대적으로 짧다는 것을 나타낼 수 있다. 상기한 대로, 다른 동등한 등급 표지, 예컨대 "유익", "무익", "좋음", "나쁨" 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 특이적 일 실시형태에서, 시험을 수행하기 위한 암환자는 췌장암 환자이다. 본 실시형태에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000(이하에 상세히 기재한다) 또는 이의 등가물의 형태를 취할 수 있다. 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 환자에게 투여된다. 본 발명의 본 실시형태의 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암은 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암(CRC), 자궁내막암, 난소암, 흑색종 및 다발성 골수종을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
하나의 양상에서, 상기 또는 본원에 기재된 예측하는 임의의 방법은 예를 들면, 비소세포성 폐암(NSCLC) 환자 및 대장암(CRC) 환자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 암환자들에게 단독으로 또는 다른 표준 항암 제제에 애주번트로서 적용가능하다고 여겨지고, 따라서 본 개시물에서 분류에 유용한 질량 스펙트럼 피쳐는 2011년 2월 22일에 출원된 미국 특허 출원 번호 제 12/932,295호 및 바이오디식스사의 이전에 인용된 특허에 설명된 대로 다른 것들 중에서도 세포성 염증 반응의 조절 및 광범위한 종양 유형을 통해 예측하는 것과 연관된다고 여겨진다.
상기 또는 본원에 기재된 임의의 방법에서 사용된 학습집단은 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 다른 항암요법과 병용하여 이득을 얻은, 및 이득을 얻지 않은 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼의 형태인 것이 바람직하다. 분류에 사용되는 환자의 스펙트럼에서 피쳐(m/z 범위)는 학습집단을 형성하는 환자의 질량 스펙트럼의 분석으로부터 측정 및 선택될 수 있다. 표피 성장 인자 수용체 억제자(EGFR-Is)로부터 NSCLC 환자 유익을 예측하는 전체적으로 상이한 문맥에서 발달된 것이고, 미국 특허 제 7,736,905호에서 사용되고 본원에서 표 3 및 표 4에 나열된 피쳐 중 하나 이상은 종양에 염증성 반응 및 면역학적 숙주에 관련될 수 있으므로 즉각적인 방법을 사용하기 위한 피쳐의 적합한 집합이라고 추측하였다(미국 특허 출원 공개 2011/0208433 참조). (분류에 사용되는 정확한 피쳐 값은 '905 특허 및 이하 표 1 내지 표 4에서 상술한 목록에서 다양할 수 있고, 예를 들면, 시료 유형이 상당히 상이하기 때문에 스펙트럼의 전처리 중에 수행되는 스펙트럼 정렬(shift)에 의존한다) '905 특허에서 사용된 학습집단과 달리(EGFR 표적화 약에 반응했거나 하지 않았던 NSCLC 환자로부터의 스펙트럼), 본 발명에서 사용된 학습집단은 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 다른 항암요법과 병용하여 유익을 얻은, 및 얻지 않은 환자의 시료로부터의 스펙트럼을 사용한다. 본 출원에서의 시료 유형은 '905 특허에 기재되어 있는 혈청 및 혈장과 상이하다는 것을 주목한다. 그러나, 이하 설명된 대로, 본원에 부여된 학습집단 예를 형성하는 스펙트럼의 측정으로부터 분류에 사용될 수 있는 스펙트럼에서의 다른 피쳐이다.
본 개시물의 다른 양상에서, 암환자 치료 방법은: 상기 또는 본원에 기재된 임의의 예측 방법에 따라 시험을 행하는 단계를 포함하고, 스펙트럼에 대한 등급 표지이 환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법으로 이득을 얻을 것 같은 것을 나타내면 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 환자에게 투여한다.
하나의 양상에서, 환자는 추가적으로 암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 처리 이전에, 동시에, 또는 이후에, 하나 이상의 추가적인 항암요법으로 처리된다, 일 실시형태에서, 추가적인 항암요법은 수술(예를 들면, 종양의 외과적 절제술), 화학요법, 방사선요법, 표적 암요법(예를 들면, 특이적 표적 분자들이 종양 성장 및 진행에 포함되는 저분자 의약품 또는 단일클론 항체 요법), 및 완화 의료, 또는 그의 임의의 병용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시물의 또 다른 양상에서, 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 암환자 치료 방법을 기재한다: 스펙트럼에 대한 등급 표지이 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 환자가 이득을 얻을 것 같다고 나타내는 상기 또는 본원에 기재된 임의의 예측 방법에 따라 시험에 의해 선택된 암환자에게 암에 대한 효모-기반 면역요법을 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 양상에서, 환자는 암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 처리 이전에, 동시에, 또는 이후에, 추가적으로 하나 이상의 추가적인 항암요법으로 처리된다. 일 실시형태에서, 추가적인 항암요법은 수술(예를 들면, 종양의 외과적 절제술), 화학요법, 방사선요법, 표적 암요법(예를 들면, 특이적 표적 분자들이 종양 성장 및 진행에 포함되는 저분자 의약품 또는 단일클론 항체 요법), 및 완화 의료, 또는 그의 임의의 병용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시물의 또 다른 양상에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 암환자를 치료하는 방법을 기재한다: 상기 또는 본원에 기재된 임의의 예측 방법에 따라 시험을 행하는 단계를 포함하고, 스펙트럼에 대한 등급 표지는 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같다고 나타낸다. 본 발명의 이러한 양상에서, 환자는 변이된 Ras가 환자로부터 적어도 일부 종양 세포에서 확인되는 암을 가진다. 하나의 양상에서, 환자는 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 처리 이전에, 동시에, 또는 이후에, 추가적으로 하나 이상의 추가적인 항암요법으로 처리된다. 일 실시형태에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000으로 공지된 효모-기반 면역요법 제품의 시리즈, 또는 이의 등가물에서의 산물이다. 본 발명의 이러한 실시형태의 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암은 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암(CRC), 자궁내막암, 난소암, 흑색종 및 다발성 골수종을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 암은 췌장암이다. 일 실시형태에서, 추가적인 항암요법은 수술(예를 들면, 종양의 외과적 절제술), 화학요법, 방사선요법, 표적 암요법(예를 들면, 특이적 표적 분자들이 종양 성장 및 진행에 포함되는 저분자 의약품 또는 단일클론 항체 요법), 및 완화 의료, 또는 그의 임의의 병용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 환자는 췌장암 환자이고, 그 요법은 GI-4000으로 공지된 효모-기반 면역요법 제품의 시리즈, 또는 이의 등가물에서의 산물(이하에 상세히 기재한다)을 단독으로 또는 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 포함한다. 하나의 양상에서, 암환자의 종양은 효모-기반 면역요법 조성물에 의한 치료 이전에 외과적으로 절제되어 있다.
본 개시물의 또 다른 양상에서, 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 암환자 치료 방법을 기재하고, 상기 또는 본원에 기재된 임의의 예측 방법에 따라 시험에 의해 선택된 암환자에게 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 스펙트럼에 대한 등급 표지는 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같다고 나타낸다. 본 발명의 이러한 양상에서, 환자는 변이된 Ras가 환자로부터의 종양 세포에서 확인되는 암을 가진다. 하나의 양상에서, 환자는 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 처리 이전에, 동시에, 또는 이후에, 추가적으로 하나 이상의 추가적인 항암요법으로 처리된다. 일 실시형태에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000으로 공지된 효모-기반 면역요법 제품의 시리즈, 또는 이의 등가물에서의 산물이다. 본 발명의 이러한 실시형태의 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암은 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암(CRC), 자궁내막암, 난소암, 흑색종 및 다발성 골수종을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 암은 췌장암이다. 일 실시형태에서, 추가적인 항암요법은 수술(예를 들면, 종양의 외과적 절제술 종양), 화학요법, 방사선요법, 표적 암요법(예를 들면, 특이적 표적 분자들이 종양 성장 및 진행에 포함되는 저분자 의약품 또는 단일클론 항체 요법), 및 완화 의료, 또는 그의 임의의 병용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 환자에게 투여된다. 일 실시형태에서, 환자는 췌장암 환자이고, 그 요법은 GI-4000으로 공지된 효모-기반 면역요법 제품의 시리즈, 또는 이의 등가물에서의 산물을 단독으로 또는 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 포함한다. 하나의 양상에서, 암환자의 종양은 효모-기반 면역요법 조성물에 의한 치료 이전에 외과적으로 절제되어 있다.
효모-기반 면역요법을 사용하여 암을 가진 환자를 치료하는 방법의 임의의 양상에서, 효모-기반 면역요법은 환자의 종양과 관련되거나 또는 그에 의해 발현된 적어도 하나의 암 항원을 발현하고 있는 열-불활성된 재조합 전효모를 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 효모는 사카로마이세스를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 효모의 속일 수 있다. 하나의 양상에서, 효모는 사카로마이세스 세레비제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 효모의 종일 수 있다.
다른 양상에서, 시스템은 암환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하기 위해 개시되고 있다. 시스템은 암환자의 혈액-유래 시료로부터 생성되는 질량 분광계를 포함한다. 또한, 시스템은 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼의 학습집단을 저장하는 기계-판독가능한 메모리를 포함한다. 학습집단은 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 이득을 얻지 못한 다수의 환자 유래 등급-표지된 스펙트럼 및 세포 면역요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 이득을 얻은 다수의 환자 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함한다. 시스템은 질량 스펙트럼에 대한 등급 표지를 생성하여, 질량 스펙트럼에 대해 동작하고 학습집단을 사용하여 질량 스펙트럼을 분류하도록 구성되는 컴퓨터 시스템을 추가로 포함하고, 여기서 등급 표지는 환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 이득을 얻을 것 같은지의 여부를 예측하도록 사용된다.
또 다른 양상에서, 시스템은 암환자가 암에 대한 효모-기반 면역요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암요법에 의한 처리와 함께하여 이득을 얻을 것 같은지의 여부를 예측하기 위해 기재하고 있다. 시스템은 암환자의 혈액-유래 시료로부터 질량 스펙트럼을 생성하는 질량 분광계를 포함한다. 또한, 시스템은 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼의 학습집단을 저장하는 기계-판독가능한 메모리를 포함한다. 학습집단은 암에 대한 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 또 다른 항암요법에 의한 처리와 함께 이득을 얻지 못한 다수의 환자 유래 등급-표지된 스펙트럼 및 암에 대한 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 또 다른 항암요법에 의한 처리와 함께 이득을 얻은 다수의 환자 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함한다. 시스템은 추가로 유익 또는 무익의 상태를 나타내는 질량 스펙트럼에 대한 등급 표지를 생성하여, 질량 스펙트럼에 대해 동작하고 학습집단을 사용하여 질량 스펙트럼을 분류하도록 구성되는 컴퓨터 시스템을 포함하고, 여기서 등급 표지는 환자가 암에 대한 효모-기반 면역요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암요법에 의한 처리와 함께 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하는데 사용된다.
또 다른 양상에서, 시스템은 암환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암요법에 대한 처리와 함께 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하기 위해 개시된다. 시스템은 암환자로부터의 혈액-유래 시료로 질량 스펙트럼을 생성하는 질량 분광계를 포함한다. 또한, 시스템은 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼의 학습집단을 저장하는 기계 판독가능한 메모리를 포함한다. 학습집단은 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이익을 얻지 못한 다수의 환자 유래 등급-표지된 스펙트럼 및 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이익을 얻은 다수의 환자 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단으로서, 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함한다. 시스템은 질량 스펙트럼에 대한 등급 표지를 생성하여, 질량 스펙트럼에 대해 동작하고 학습집단을 사용하여 질량 스펙트럼을 분류하도록 구성되는 컴퓨터 시스템을 추가로 포함하고, 여기서 등급 표지는 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법에 의한 처리와 함께 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하는데 사용된다. 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000으로 공지된 제품의 시리즈 내에 산물이다. 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암은 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암(CRC), 자궁내막암, 난소암, 흑색종 및 다발성 골수종으로부터 선택된다. 하나의 양상에서, 암은 췌장암이다.
하기 상세한 설명은 첨부된 도면을 참조할 것이고, 실시예를 통해 제공되지만, 이에 한정되는 것은 아니다:
도 1은 GI-4000로 알려진 변이된 Ras-양성암을 목적하는 글로브이뮨사의 효모-기반 면역요법 제품 시리즈를 사용하여 췌장암에 2상 임상시험의 고안을 보여주는 계략적인 도면이다.
도 2a-도 2b는 췌장암의 치료에서 GI-4000 및 젬시타빈의 병용하여 이득을 얻을 것 같은 환자를 확인하기 위해 본 개시물의 질량 분광분석법의 능력을 나타내는 무재발 생존율(RFS) 및 전체 생존율(OS)의 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 도표이다.
도 3a-도 3f는 K-최근린 분류 알고리즘에서 사용된 K의 상이한 값에 대하여 췌장암의 치료시 GI-4000 및 젬시타빈의 연구에서 치료 상지 및 대조 상지(Control arm) 둘다에서의 환자에 대한 RFS 및 OS의 여러 쌍의 카플란-마이어 플롯이다. 도 3a-도 3b에서는, K의 값은 1이고, 도 3c 및 도 3d에서는 K의 값이 3이며 도 3e 및 도 3f에서는 K의 값이 5였다. 도표는 치료 상지(젬시타빈 및 GI-4000 모두로 치료된 환자)에서, 하지 않았던 그것으로부터 유익을 얻었던 환자를 분리하기 위한 본 출원인의 분류기의 능력을 보여주고, 게다가 치료 상지에서 일부 환자는 대조 상지에서 일부 환자보다 더 나빴다. 그러므로, 도표는 면역반응 발생 요법에 의한 치료로 이득을 얻을 것 같은 그 환자들뿐만 아니라 면역반응 발생 요법에 의한 치료로 이득을 얻을 것 같지 않은 환자들도 예측하는 본 출원인의 질량 스펙트럼법의 능력을 증명한다.
도 4a-도 4h는 2012년 5월 29일에 출원되고, 내용이 본원에 참조로 포함된 미국 가출원 제61/652,394호에 기재된 기술을 사용하여, 혈액-유래 시료의 질량 분광분석의 "심층 MALDI"법에 의한 150,000회 조사를 사용하여 수득된 스펙트럼에 의거한 분류기에 의해 규성된 대로 GI-4000 및 젬시타빈 연구에서 RFS 및 OS의 카플란-마이어 플롯의 집합이다. 도 4a-4b, 도 4c-4d, 도 4e-4f, 및 도 4g-4h는 개별적으로 분류를 위해 사용된 질량 스펙트럼에서 피크의 상이한 집합에 의거하여 4개의 상이한 분류기로부터 RFS 및 OS에 대한 도표를 각각 나타낸다.
도 5는 췌장암/GI-4000 및 젬시타빈 연구에 사용되는 분류기 검증을 위한 교차검증 공정의 순서도이다.
도 6은 도 3e-도 3f의 "희석-및-발사(dilute-and-shoot)" 분류기의 교차-검증 분석의 RFS에 대한 "퀵"군 및 "슬로우"군 간의 위험비의 분포의 도표이다.
도 7a는 GI-4000 및 젬시타빈 연구시 교차-검증 분석의 시험집단에서 "퀵"군 및 "슬로우"군에서 평균 RFS의 분포의 도표이다. 도 7b는 GI-4000 및 젬시타빈 연구시 교차-검증 분석의 시험집단에서 "퀵"군 및 "슬로우"군 간의 평균에서의 차이의 분포의 도표이다. 도표는 둘다 도 3e-도 3f의 "희석-및-발사" 분류기를 사용한다.
도 8은 도 3e-도 3f의 "희석-및-발사"의 교차-검증 분석에서 대조 상지 및 시험집단에서 분류기의 "퀵"군 및 "슬로우"군의 평균의 분포의 도표이다.
도 9는 도 3e-도 3f의 "희석-및-발사" 분류기의 교차-검증 분석에서 "슬로우"군에 대해 시험집단 및 대조 상지 간에 평균에서의 차이의 분포의 도표이다.
도 10a는 도 3e-도 3f의 "희석-및-발사"의 교차-검증 분석에서 분류기에 사용되는 K의 상이한 값에 대한 대조 상지에서 슬로우 대 퀵 분류의 비율의 분포의 도표이다. 도 10b는 K-최근린 분류기에 사용되는 K의 다양한 값에 대해 교차 검증 분석에 사용된 시험집단에 대한 위험비의 도표이다.
도 11은 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 다른 항암 제제와 병용하여 유익, 또는 무익인 암환자를 예측하기 위한 시험 방법의 순서도이다.
도 12는 혈액-유래 환자 시료의 시험을 수행하고 환자가 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 이득을 얻을 것 같은지 여부를 에측하기 위한 시스템의 도면이다.
도 13a-도 13l은 2012년 5월 29일에 출원되고, 내용이 본원에 참조로 포함된 계류중인 미국 가출원 61/652,394의 기술을 사용하여, 500,000회 조사를 사용하는 심층 MALDI법으로부터 수득된 스펙트럼에 의거하여 분류기에 의해 규정된 대로 GI-4000 및 젬시타빈 연구시 RFS 및 OS의 카플란-마이어 플롯의 집합들이다. 도 13a-도 13b, 도 13c-도 13d, 도 13e-도 13f, 도 13g-도 13h, 도 13i-도 13j, 및 도 13k-도13l은 개별적으로 분류를 위해 사용된 질량 스펙트럼에서 피크 또는 피쳐의 상이한 집합에 의거하여 6개의 상이한 분류기로부터 RFS 및 OS에 대한 도표를 각각 나타낸다.
도 14는 150,000회 조사를 사용한 심층 MALDI법으로부터 수득된 스펙트럼을 사용하여 개발된 도 4a-도 4h의 분류기에 대해 교차-검증 분석으로부터 RFS에 대한 "퀵"군 및 "슬로우"군 간의 위험비의 분포의 도표이다.
도 15는 500,000회 조사를 사용한 심층 MALDI법으로부터 수득된 스펙트럼을 사용하여 개발된 도 13a-도 13l의 분류기에 대해 교차-검증 분석으로부터 RFS에 대한 "퀵"군 및 "슬로우"군 간의 위험비의 분포의 도표이다.
도 16a-도 16c는 선택된 질량/전하 범위(m/z 비율 7,000 내지 8,000)에서 동일한 시료의 3개 MALDI 질량 스펙트럼의 도면이고, 조사수가 증가하는 상태에서 검출가능한 피크 함량에서의 증가를 나타낸다. 도 16a의 스펙트럼은 2,000회 조사의 결과이고, 도 16b의 스펙트럼은 100,000회 조사의 결과이며, 도 16c의 스펙트럼은 500,000회 조사의 결과이었다. 도 16b 및 도 16c의 스펙트럼을 본원 방법으로 인한, 도 16a의 스펙트럼에 제시되지 않았던, 근본적으로 노이즈로 나타나는 시료에 대해 풍부한 스펙트럼 정보를 어떻게 시현하는지를 주목하라.
도 16d 및 도 16e는 본원의 심층 MALDI법에서 수득된 스펙트럼의 거대한 동적 범위를 보여주는 질량 스펙트럼의 다른 예이다. 도 16d에서, m/z 범위 7140~7890Da에서 스펙트럼의 일부는 풍부한 대략 500,000회 조사에서 수득되는 스펙트럼 정보를 보여주는 도 16d의 삽입에서 확대되어 보여준다. 도 16e에서, 스펙트럼은 추가적인 스펙트럼 정보 및 m/z의 영역 약 9520에서 피크를 나타내기 위해 확대된 Y축의 삽입에서 보여주고, 여기서 심층 MALDI법에 의해 시현되지만, 전형적인 ~1,000회 조사 스펙트럼에서 가시적이지 않다.
도 17a는 384개 시료 점적 또는 직사각형 어레이에 배열된 "점적"을 포함하는 MALDI-TOF 표적 플레이트의 평면도이다. 점적은 열 번호 1 . . . 24 및 행 A . . . P에 의해 확인된다. 예를 들면, 상단좌측 점적은 A1으로서 확인된다. 도 17b는 X/Y 위치 좌표 및 점적의 중앙에 원점(0,0)을 갖는 5X5 직사각형 격자로 나누어지게 나타내는 개별적인 시료 점적 P1의 확대도면이다. 직사각형 격자 및 위치 좌표는 자동 래스터 주사 접근법에서 사용되어 본 명세서에 자세히 기재한 대로 점적에서 100,000회 조사 이상으로부터 스펙트럼을 획득한다.
도 18은 도 17a의 MALDI 플레이트에서 단일 점적에 고착된 생물학적 시료/매트릭스 혼합물의 사진이다. 이상적으로, 점적은 도 18에 나타내는 바와 같이 점적 내에 균일한, 균질 결정화된 시료를 포함한다.
도 19는 도 18의 점적으로부터 100,000회 조사 이상을 얻는데 사용하기 위한 가능한 래스터 스캔 패턴의 도면이다. 점적은 복수회, 예를 들면, 25회 래스터 스캔된다. 도 19에 나타내는 각각의 심볼 세트(symbol set)(삼각형, 정사각형, X, 등)는 점적이 단일 래스터 스캔에서 스캔되는(조사) 개별적인, 별개의 X/Y 위치의 세트를 묘사한다. 각각의 위치에서, 점적을 다중 조사, 예를 들면, 700 또는 800회 조사로 처리할 수 있다.
도 20은 도 18의 시료 점적에 대한 도 19의 래스터 스캔 패턴의 중첩을 나타내는 도면이다.
도 21은 예를 들면, 도 17b 또는 도 20의 래스터 스캔에서 위치/래스터당 800회 레이저 조사로부터 축적된 스펙트럼을 합하기 위한 명령을 보여주는 MALDI-TOF 기기 사용자 인터페이스에서의 스크린샷이다.
도 22는 공간적으로 균일 방법으로 시료/매트릭스 혼합물이 결정화할 수 없는 영역을 보여주는 시료 점적의 일부의 사진이다.
도 23은 기기에서 카메라에 의해 캡처된 점적의 일부의 화상 및 점적의 자동화된 래스터 스캔을 위해 점적의 군을 선택을 보여주는 MALDI-TOF 기기 사용자 인터페이스로부터의 스크린샷이다.
도 24는 다른 패턴에서 파이어링하기 위한 스펙트럼의 평가, 스펙트럼의 축적, 및 점적 쪽으로 레이저의 이동을 위한 툴을 나타내는 MALDI-TOF 기기 사용자 인터페이스로부터의 또 다른 스크린샷이다.
도 25는 데이터 획득 중에 일시적 스펙트럼을 수용 또는 거부하기 위한 평가 페이지의 스크린샷이다.
도 26은 배경 피크를 제거하기 위한 예외 리스트를 나타내는 스크린샷이다.
본 명세서에 면역반응 발생 요법에 대한 예측 검사, 관련된 분류기 및 시스템 및 이들 시험, 분류기 및 시스템에 의해 확인된 환자의 치료를 기재하고 있다.
특히, 치료를 발생시키는 효모-기반 면역반응의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암 요법와의 병용하여 암환자가 이득을 얻을 수 있을 것 같거나 얻을 것 같지 않은지의 여부를 치료 전에 예측하기 위한 방법을 본 명세서에서 기재하고 있다. 또한, 암환자가 췌장암을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 변이된 Ras-양성암(예를 들면, 본원에 기재된 GI-4000)에 대한 효모-기반 면역요법의 투여로 이득을 얻을 수 있을 것 같거나 얻을 것 같지 않은지의 여부를 치료 전에 예측하기 위한 방법을 본 명세서에서 기재하고 있다. 본 발명의 방법들은 전처리로 수득된 혈액-유래 시료(예를 들면, 혈청 또는 혈장)의 질량 분광분석 및 질량 분광분석에 의해 시현된 시료에서의 단백체 특징에 의거한 분류에 의거한 것이다. 혈액-유래 시료의 사용은 면역계의 순환성 마커로의 자각을 부여함으로써 면역요법으로 전체적인 감수성을 측정하는 가능성을 증가시키기 때문에 중요하다. 또한, 그 방법들은 복잡하고 시간 소모성 검출법을 환자 시료로 수행하거나 환자로부터 종양 시료를 수득할 필요없이 혈액-유래 시료로부터 간단한 질량 분광분석 시험을 통해 빠르게 행해질 수 있다. 이 시험들은 환자가 이득을 얻을 것이라 예측되면 환자가 개선된 결과를 가질 것이라는 신뢰를 가지고 진행하고, 반면에 환자가 이득을 얻을 것 같지 않을 것이라 사전에 예측되면 환자가 이득을 얻을 것 같은 다른 치료들을 통해 환자를 이끌거나, 또는 디른 치료 옵션들을 고려할 수 있다는 점에서 유용하다.
또한, 상기 또는 본원에서 기재된, 암에 대한 면역반응 발생 요법으로 이득을 얻도록 예측하는 임의의 방법에 따라 환자를 방법 또는 시험에 의해 우선 선택하여, 암에 대한 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 환자를 치료하기 위한 방법을 본 명세서에 기재하고 있다(예를 들면, 시험 또는 방법에서 발생된 스펙트럼에 대한 등급 표지는 환자가 암에 대한 면역반응 발생 요법으로 이득을 얻을 것 같다는 것을 나타낸다).
또한, 상기 또는 본원에 기재된 예측하는 방법 또는 임의의 방법들에 따른 시험에 의해 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같은 환자를 우선 선택하여, 변이된 Ras-양성암(예를 들면, 본원에 기재된 GI-4000)에 대해 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 환자를 치료하기 위한 방법을 본원에 기재하고 있다(예를 들면, 시험 또는 방법에서 발생되는 스펙트럼에 대한 등급 표지는 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같다는 것을 나타낸다). 본 발명의 이러한 임의의 치료 방법들에서, 그 방법들은 효모-기반 면역반응 발생 요법(변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다)을, 암 항원을 발현하는 암을 지니고, 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 예측하는 임의의 방법들에 따라 수행되는 시험에 의해 조성물의 투여로 이득을 얻을 것 같기 때문에 확인되거나 선택되는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
GI-4000-02를 설명하는 작용예: 췌장암에 GI-4000 및 젬시타빈에 대한 2b기 임상시험
GI-4000-02는 R0 또는 R1 절제된 췌장암을 지닌 환자에서 GI-4000+젬시타빈 또는 위약+젬시타빈의 2b기 완전 등록된 무작위, 이중맹검, 위약-제어된, 다병원, 애주번트 임상시험이다(도 1 참조). R0 절제는 수술한도에서의 미시적 잔류 환부의 부재에 의해 규정된다. R1 절제는 수술한도에서의 미시적 잔류 환부의 존재에 의해 규정된다. R0 및 R1 환자들은 상이한 예측된 생존율을 갖고, R0 환자들이 평균에서 더 오래 산다. 이 임상시험에서, 스크리닝 기간 동안에 각각의 대상체로부터 종양조직의 시료를 수득하고, Ras 돌연변이의 존재에 대해 종양을 평가하였다. 대상체가 산물-관련 돌연변이를 지니면, 대상체의 종양에서 특이적 Ras 돌연변이와 필적하는 GI-4000 효모-기반 면역요법 제품을 투여하였다(GI-4000 시리즈는 이하에 상세하게 기재되어 있다).
연구 집단은 미국에 39개 센터 및 5개의 국제 센서에 등록된 Ras 돌연변이성 절제된 췌장암을 지닌 176개 대상체들로 이루어졌다. 절제 후에, 대상체들을 절제 상태에 의해 2군으로 앞으로 계층화하고, R1군 및 R0군 모두가 1대1 비율로 2개의 치료군으로 무작위 할당되어 GI-4000+젬시타빈 또는 위약+젬시타빈의 40Y.U.("Y.U."는 "효모 단위(Yeast Unit)" 또는 "효모 세포 당량"이다; 1Y.U.=10백만 효모 세포)를 제공한다. 39개 R1 대상체들을 등록하고, 이들 중 19개는 GI-4000+젬시타빈군에 할당하고 20개는 위약+젬시타빈군에 할당하였다. 137개 R0 대상체들을 등록하고, 이들 중 69개는 GI-4000+젬시타빈군에 할당하고 68개는 위약+젬시타빈군에 할당하였다. GI-4000의 40Y.U. 투여량을 4개 별개의 10Y.U. 피하주사로 각각의 상지와 하지에 투여하였다. 대상체들에게 절제와 젬시타빈 요법의 개시 사이에 GI-4000 또는 위약의 주 3회 투여량을 부여하였다. 모든 대상체들은 절제 후에 6~8주 시작시 젬시타빈을 6개월 주기까지 투여되었다. GI-4000 또는 위약의 월간 투여량을 젬시타빈의 각 주기 후에 월간 젬시타빈 치료에서 예정된 중단과 일치하도록 부여하였다. GI-4000 또는 위약의 월간 투여는 대상체들이 연구를 중단하거나 질병 재발을 경험 또는 사망할 때까지 계속되었다. 결과에 영향을 미친다고 보여주고 있는 다음의 예후 인자들을 포함하는 수많은 질병-특이적 기준선 특성을 평가하였다:(a) 림프절 상태를 췌장암 세포의 미시적 증거의 존재 또는 부재에 의해 규정하였다. 양성 노드는 나쁜 예후 지표가 고려되었다;(b) 성능 상태는 환자의 일반적인 건강을 반영하는, 0이 가장 바람직한 상태이고 4가 가장 덜 바람직한 상태인 5점 척도(0, 1, 2, 3, 4)로 이루어지고;(c) CA19-9는 종양 부하의 측정으로 이용되는 췌장암 세포의 혈중 바이오마커이다. 보다 높은 CA19-9 수준은 보다 나쁜 임상 결과들과 연관되고;(d) 보다 큰 크기를 가진 수센티미터의 종양 크기는 일반적으로 보다 나쁜 결과와 연관되고; 또한 (e) 종양 단계는 단계 I을 거쳐 단계 IV의 범위이고 일차 종양 크기, 국소 침습의 정도, 국소 림프절의 관련 정도 및 일차 종양에서 암의 전신 확산을 포함하는 표준화된 점수 체계에 의거하여 규정된다.
이 임상시험에 대한 1차 종점은 무재발 생존이었다. 2차 종점들은 전체 생존, 면역반응 및 질병 부하의 바이오마커들, 예컨대 CA19-9를 포함하였다. 지금까지, 애주번트 젬시타빈과 병용하는 GI-4000은 Ras-돌연변이 양성 R1 췌장암 대상체에서 생존에 대한 임상적으로 중요한 효과의 증거를 보여주었다:(a) 평균전체생존(평균 OS)에서 2.6개월 개선(14.6개월과 비교하여 17.2개월); 18% 상대적 개선;(b) 평균전체생존에서 GI-4000 면역 반응군에 대해 5.0개월 개선(14.6개월과 비교하여 19.6개월); 34% 상대적 개선;(c) 1년 생존에서 16% 우세(72% vs. 56%); 30% 상대적 개선; 및(d) 평균 RFS에서 1개월 개선(GI-4000/젬시타빈에 대해 9.6개월 vs. 8.5개월); 13% 상대적 우세를 포함한다. 또한, GI-4000는 면역원성이고 R1 대상체에서 좋은 내성이 있었다:(a) GI-4000/gem 상지에서 7/15(47%) vs. 위약/gem 상지에서 1/12(8%)가 Ras 돌연변이 특이적 T세포 반응을 하고;(b) GI-4000은 중요한 신규 독성의 증거 없이 지금까지 좋은 내성을 지녔다. 추가적인 결과들은 이하에 상세하게 기재될 본 발명의 예측성 질량 스펙트럼법의 개발 후에 관찰되었다.
예측성 질량 스펙트럼법
본 개시물의 질량-스펙트럼법의 예는 상기한 GI-4000+젬시타빈 췌장암 2b기 임상시험에서 시료의 연구와 함께 이하 상세하게 기재될 것이다. GI-4000+젬시타빈의 병용을 받은, 전부는 아닌 일부 환자들은 젬시타빈 및 위약를 받은 그 환자들에 비해 RFS 및 OS에서 상당한 개선을 경험하였다. 분류기는 환자가 이득을 얻을 것 같거나(하기 논의에서 "슬로우"), 또는 반대로 이득을 얻을 것 같지 않은(하기 논의에서 "퀵") 환자 부류의 구성원인지 여부를 치료 전에 예측하도록 개발되었다. 도 2a~도 2b는 단백체 특징에 양성인 환자의 무재발 생존(RFS) 및 전체 생존(OS)의 카플란-마이어 플롯이고, GI-4000을 젬시타빈과 병용하여 이득을 얻을 거 같다고 나타낸다. 도 2a는 후기 재발("슬로우") 단백체 특징을 가지고 대상체를 위한 치료군(GI-4000 vs. 위약)에 의한 RFS를 나타내는 반면, 도 2b는 후기 재발 단백질체 특징을 가지고 치료군에 의한 OS를 나타낸다. 도표는 췌장암의 치료에서 GI-4000 및 젬시타빈의 병용하여 이득을 얻을 것 같은 환자를 확인하는, 이 개시의 질량 분광분석법의 능력을 도시한다. 추가로, GI-4000 및 젬시타빈의 병용하여 이득을 얻거나 얻지 못한 치료 상지에서 환자를 확인하기 위한 본원의 방법의 능력을 나타내는 본원의 연구로부터의 카플란-마이어 플롯은 하기 도 3 및 도 4와 함께 논의될 것이다.
본원의 연구에서, 질량 스펙트럼의 생성에 적합한 시료들은 상기에 상세히 기재된 GI-4000-02에 등록된 90명 환자로부터 입수할 수 있었다. 시료들은 혈액으로부터 유래되었고, 이 특별한 경우에는 사전 밀도-기반 분리 방법에 의해 전혈로부터 수득된 혈장이었다. 전혈(나트륨 헤파린 글래스 튜브에)은 글로브이뮨 연구소에서 임상시험 장소로부터 당일배달에 의해 실온에서 취득되고, 수집 30시간 내에 처리되었다. 말초혈액 단핵 세포들(PBMCs)을 분리하기 위해, 혈액을 Dulbecco의 인산염완충식염수(D-PBS; Gibco/InVitrogen 카탈로그 # 14190-250)에 의해 대략 1:1로 희석하여, LeucosepTM 튜브(Greiner)에서 피콜-하이팩 밀도구배로 층화시키고, 1000xg로 10분간 주변온도에서 원심분리하였다. 세포들을 밀도구배로부터 수집하기 전에, D-PBS에 의해 1:1로 희석된 혈장을 흡인 제거하고, -80℃에서 동결시켰다. 본 발명의 질량스펙트럼법으로 사용하기 전에, 시료들은 해동되고, 정제되고 나서, 사용 전에 한번 재동결시켰다.
스펙트럼은 표준 희석-및-발사(DNS)법 및 "심층MALDI"법을 사용하여 시료로부터 발생되고, 이는 2012년 5월 29일에 출원된 계류중인 미국 가출원 번호 제 61/652,394호에 기재되어 있고 본 명세서에서 참조로서 포함하고 하기 더 상세하게 기재된다.
본원은 희석-및-발사 스펙트럼에 대한 바이오디식스사의 미국 특허 제 7,736,905호 및 사전에 인용된 특허 문헌에 기재된 바와 같은 베리스트래트(VeriStrat) 검사를 수행하지만, 분류기가 유용한 정보를 산출하지 못한다는 것을 발견하였다. 극소수의 베리스트래트 나쁨 시료들을 확인하고, 치료 상지에서 베리스트래트 좋음과 나쁨 환자 간에 유의차가 없음을 발견하였다.
그러므로, 신규한 학습집단으로 된 신규한 분류기는 규정되는 것이 필요하다. 본원은 암이 존재시 숙주의 면역 및 염증성 반응과 관련된 것(미국 특허 출원 공개 2011/0208433 참조)이라고 믿었기 때문에 베리스트래트 피쳐들이 유용할 것이라고 추측하였다. 실로, 베리스트래트 검사(이하 표 3 및 표 4 참조)에서 사용된 스펙트럼에서의 질량 스펙트럼 피쳐들은 췌장암 연구에서의 분류에 사용될 수 있다는 것을 발견하였고, 단, 분류기 학습집단을 적절히 규정하고 스펙트럼 전처리 절차를 이하 기재된 바와 같이 바꿨다. 이러한 분류기 설계 및 학습집단의 발견은 다음 섹션에 기재될 것이다.
분류기 설계
GI-4000 치료에 대한 보다 좋고 보다 나쁜 예후를 가진 환자로 나누는 분류기를 고안하기 위한 개시점은 보다 좋고 보다 나쁜 무재발 생존율(RFS)을 가진 환자의 학습집단을 정의하기 위한 것이다. RFS의 시간의 분포에 의거하여, 빠른 재발("퀵")인 환자들을 276일 전에 재발하는 환자로 정의하고, 느린 재발("슬로우")인 환자들을 500일 전에 재발건이 없는 환자로 정의하기로 결정하였다. 이는 "퀵"군에 20명의 환자들 및 "슬로우"군에 14명의 환자들의 학습집단을 중간 RFS 시간을 가진 9명의 환자들과 함께 부여하였다.(여담: 사실상 276일 전에 RFS건을 가진 21명 환자들이 있었지만, 이들 환자들 중 한명에 대한 스펙트럼을 프로젝트 시작할 때 잃어버려서, 이 환자는 초기에 "희석-및-발사" 및 150,000회 조사 심층 MALDI 분석에 대한 학습집단에 포함되지 않았고, 분류기가 전체 집단에 적용되었을 때에만 사용되었다. 500,000회 조사 심층 MALDI 분석에 대하여, 이 환자는 학습집단에 포함되고, 긴 재발 시간을 가진 한 환자는 이 환자의 혈장 시료가 치료 동안에 치료 중에 취해졌다고 결정되었기 때문에 제외되었다.) "슬로우"군 및 "퀵"군을 정의하거나 또는 사망까지 퀵 및 슬로우 시간에 의해 그들을 정의하기 위해 상이한 마감 포인트를 취함으로써 유사한 결과를 생성하는 것이 가능할 수 있다.
"퀵"군 및 "슬로우"군의 학습집단을 규정하여, 비교되는 질량 스펙트럼은 배경 제거, 일부 이온 전류 표준화, 및 스펙트럼 정렬을 포함하는 미국 특허 제 7,736,905호의 방법을 사용하여 전처리되었다. 전처리의 상세는 희석-및-발사 스펙트럼 및 심층 MALDI 스펙트럼에 대해 상이하지만, 일반적인 절차는 유사하다. 우선, 배경을 추정하고 이를 스펙트럼으로부터 제거한다. 스펙트럼은 일부 이온 전류로 표준화된다. 일부 이온 전류를 계산하는데 사용되는 영역은 질량 스펙트럼에서 강력하고 가장 변하기 쉬운 피크를 제외하는 한 다양한 방법으로 선택될 수 있다. 결과가 이하에 주어진 희석-및-발사 분류기의 예에서, 일부 이온 전류 계산 및 표준화를 위해 사용된 영역은 3kDa-11.4kDa, 13kDa-15kDa 및 16.1kDa-30kDa이었지만, 그 밖의 선택을 할 수 있다. 예를 들면, 500,000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼-기반 분류기들에 대하여 일부 이온 전류 표준화를 위해 사용되는 영역은 4.9kDa-6.54kDa, 12kDa-13.5kDa 및 18kDa-27kDa이었다. 스펙트럼에서의 노이즈를 추정한다. 일반 피크를 스펙트럼에서 검출하면, 스펙트럼은 정렬점의 집단을 사용하여 정렬될 수 있다. 정렬점의 집단은 정렬되기 위해 대부분의 스펙트럼에 공통된 스펙트럼들에서 검출되는 피크들의 아집합을 선택함으로써 편집될 수 있거나, 이전 경험으로부터 대부분 스펙트럼에 존재하는 것으로 알려진 피크로부터 사전에 선택될 수 있다. 이하 나타내어지는 희석-및-발사 분류기의 경우에서, 다음의 정렬 포인트들을 이전 경험으로부터 선택하였다. 이들은 다음의 m/z 위치에서 피크였다: 6434.5, 6632.1, 11686.9, 12864.8, 15131.1, 15871.5, 및 28102.5. 시료들로부터 질량 스펙트럼 데이터를 수득하기 위한 심층 MALDI 방법(하기 설명을 참조)을 사용하면, 스펙트럼에서 그 밖의 피쳐들은 일부 이온 전류 표준화 및 스펙트럼 정렬을 위해 사용될 수 있고 심층 MALDI 스펙트럼에 보다 적합한 배경 제거를 위한 전처리 방법을 사용할 수 있다는 것은 주목할만 하다. 예를 들면, 이하에 제시된 500,000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼-기반 분류기에서, 다음의 정렬 포인트들을 사용하였다: 3315, 4153, 4457, 4710, 4855, 5289, 6431, 6629, 6835, 7561, 7931, 8202, 8807, 8912, 9707, 12856, 13735, 14031, 14134, 15117, 15856, 17366, 21046, 27890, 28019, 28067, 및 28228. 그러나, 그 밖의 정렬 포인트의 수 및 위치를 선택하는 것은 스펙트럼 획득의 방법 모두에 가능하다는 것을 주목해야 한다.
스펙트럼을 전처리하는 것은 또 다른 것과 비교할 수 있는 것들을 만들고, 따라서 그것들은 외부적 고찰로부터 규정된 피쳐들에 의거하여 분류기를 만드는데 사용될 수 있거나, 또는 스펙트럼의 집합을 비교하여 집합 간에 차등을 두고 나타내어지는 피쳐를 결정할 수 있고, 따라서 이들 피쳐의 아집합을 선택할 수 있고, 분류기는 이 피쳐 집단을 사용하여 형성하였다. 이하 나타내어지는 결과를 갖는 분류기들 중 하나는 외부적 고찰로부터 결정된 피쳐들을 사용하여 구성되었다.
베리스트래트 분류기에 사용되는 질량 스펙트럼 피쳐(이하 표 3 및 표 4 참조)가 종양의 존재시 숙주 반응과 연관된 염증성 과정들과 연관성이 있고(본 명세서에 참조로 포함된, 2011년 2월 22일에 출원된 본원의 종래 미국 특허 출원 번호 제 12/932,295호 참조) 이는 종양에 면역계의 반응과 관련된다고 여겨지기 때문에, GI-4000 처리 후에 환자의 재발 시간으로부터 규정된 스펙트럼의 신규한 표준집합을 가지고 8개 베리스트래트 특징를 사용하도록 시도하는 것이 흥미로운 것이었다. 결과는 이하 기재된 도 3에 나타내어진다. 그러나, 다른 분류기들은 그것들의 비교 중에 두개의 표준집합군 간에 구별하는 것으로 피쳐를 사용하여 구성될 수 있다. 희석-및-발사 스펙트럼에 대해 이들 피쳐는 다음 중 하나 이상을 포함한다:
[표 1]
Figure 112015007613434-pct00001
표 1의 피쳐 중 하나 이상이 분류기에서의 사용을 위해 표 2, 표 3 및 표 5에서의 피쳐와 병용될 수 있다.
150,000회 조사 "심층 MALDI" 스펙트럼에 관하여, 분류에 유용한 피쳐는 다음을 포함한다:
[표 2]
Figure 112015007613434-pct00002
Figure 112015007613434-pct00003
500,000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼에 관하여, 분류에 유용한 피쳐는 다음을 포함한다:
[표 5]
Figure 112015007613434-pct00004
Figure 112015007613434-pct00005
Figure 112015007613434-pct00006
스펙트럼 표준화의 개선은 피크를 구별하여 더 추가적으로 시현할 수 있으므로 상기 목록은 철저하다고 여겨지지 않는다는 것을 주목한다. 재차, 정확한 m/z 위치를 전처리 동안에 스펙트럼 정렬에 따른 약간의 변화로 처리한다.
A. 희석-및-발사 스펙트럼-기반 분류기
도 3a~도 3f의 도표는 표준집합("슬로우"=500일 전에 재발건이 없음, "퀵"=276일 전에 재발)을 위한 "슬로우" 및 "퀵" 정의, 베리스트래트 특징 정의(표 3 및 표 4), 및 희석-및-발사 전처리된 스펙트럼을 사용하여 만든 분류기의 성능을 나타낸다. 분류기는 위약(대조군) 상지로부터 GI-4000(처리) 상지의 스펙트럼 및 46개의 스펙트럼 모두에 적용되었다 분류기는 K-최근린 분류 알고리즘(미국 특허 제 7,736,905호 참조)에 의거한 스펙트럼에 대한 퀵 또는 슬로우의 등급 표지를 생성하였고, 도 3a-도 3b는 K=1에 의한 분류를 나타내고, 도 3c-도 3d는 K=3에 의한 분류를 나타내고 도 3e 및 도 3f는 K=5에 의한 분류를 나타낸다.
도 3a~도 3f에 나타내는 이들 결과로부터, 치료 상지(GI-4000 +젬시타빈)를 2개 군 "퀵" 및 "슬로우"로 분리하는 것은 가능하다는 것을 알고, 여기서 "퀵"군은 RFS와 OS 면에서 "슬로우"군보다 현저하게 나쁜 결과를 갖는다. 반대로, 대조 상지(젬시타빈+위약)는 "퀵"군 및 "슬로우"군 모두에서 유사한 RFS를 가진다. "슬로우"군에서 GI-4000을 위하여 RFS의 치료 유익이 존재한다. OS에서 처리 효과의 경우에는 판독하는 것이 어렵고 "슬로우"군에서 GI-4000의 첨가로부터 치료 유익이 재발 후 받는 치료에 의해 희석될 수 있다. 또한, OS의 분석은 집단 중 38%에서 사건을 검열함으로써 복잡하게 된다.
'퀵' 환자들이 GI-4000 및 젬시타빈으로부터 치료로 이득을 얻지 못했다는 것을 나타내는 대조 상지보다 '퀵' 치료 상지가 적다는 것을 주목한다. 그러므로, 분류기는 면역반응을 자극하는 치료로부터 이득을 얻을 것 같지 않은 그 환자들을 예측하는 능력을 제공한다.
B. 150,000회 조사 심층 MALDI 기재 분류기
상기 규정된 바와 같이, 전처리된 심층 MALDI 스펙트럼(하기 설명 참조) 및 학습집단군들 "퀵" 및 "슬로우"의 비교로부터 선별된 피쳐에 의거하는 분류기의 성능은 도 4a 및 도 4b에 나타내고, 도 4a은 대조 상지가 아닌 치료 상지의 RFS에서 퀵 및 슬로우 환자를 분류하는 분류기의 능력을 나타내고, 도 4b는 대조 상지가 아닌 치료 상지의 OS에서 퀵 및 슬로우 환자를 분류하는 분류기의 능력을 나타낸다. 분류기에서 사용되는 피쳐는 표 4의 8개 피쳐를 근사하여 선택되었다. 중요한 분리는 RFS 및 OS 둘다에 대해 대조 상지가 아닌 치료 상지에서 "퀵"군과 "슬로우"군 사이에서 관찰되었다. 현저하게 다른 것은 아니지만, "슬로우"군은 보다 위약인 대조 상지에 비해 GI-4000 치료에 대하여 좋은 결과, 특히 RFS의 경향을 보여준다.
도 4c-도 4d, 도 4e-도 4f, 및 도 4g-도 4h는 시료 및 상기 표 2에 나열된 심층 MALDI에 대한 77개 피쳐의 아집합의 심층 MALDI 질량 분광분석법을 사용하여 3개의 추가적인 분류기에 대해 RFS 및 OS의 카플란-마이어 플롯이다. 3개의 모든 분류기는 276일 전인 재발 시간을 가진 환자의 20개의 스펙트럼("퀵") 및 500일 전인 재발 시간을 가진 환자의 14개의 스펙트럼("슬로우")의 표준집단, 심층 MALDI 스펙트럼에 최적화된 동일한 전처리, 및 K-최근린 분류 알고리즘에서의 K=5를 사용하였다.
도 4c 및 도 4d의 분류기는 상기 77개의 후보자 피쳐 목록으로부터 표 2의 피쳐의 아집합을 사용하였다. p값에 의해 77개 피쳐를 저장하였고 그 상대적인 발현차이를 기술하는 최저 p값으로 20개 피쳐를 사용하였다.
Figure 112015007613434-pct00007
도 4e 및 도 4f는 제 3 심층 MALDI 분류기에 대한 RFS 및 OS의 카플란-마이어 플롯을 나타낸다. 그 예에서는 베리스트래트 피쳐(표 3 및 표 4)의 영역에 있거나 그들과 강력히 연관성이 있는 스펙트럼(표 2) 목록으로부터 피쳐를 사용하였다.
Figure 112015007613434-pct00008
제 4 심층 MALDI 분류기에 대한 결과는 도 4g-도 4h에 나타낸다. 이 분류기에 대해, 군 간의 발현 레벨이 도 4e-도 4f의 분류기에서의 것들에 반대로 연관되고, 베리스트래트 피쳐에 관련되지 않은 피쳐(표 2)의 아집합을 사용하였다.
Figure 112015007613434-pct00009
도 4a-도 4h의 심층 MALDI 분류기는 대조 상지에서의 적거나 없는 분리를 보이는 반면 치료 상지에서 퀵 및 슬로우 환자를 명확히 분리하고, 따라서 도 3a~도 3f의 "희석 및 발사" 분류기와 유사하게 수행한다는 것을 주목한다.
도 3a~도 3f 및 도 4a-도 4h의 결과를 설명할 때, 상기 결과가 분류기의 표준집단이 분석에 사용되기 때문에 "퀵" 및 "슬로우" 간의 분리에서 과대평가하는 경향이 있다는 것을 주목해야 한다. 불행히도, 검증집단은 독립적인 방법으로 분류기 성능을 시험하는 것으로 아직 이용할 수 없었다. 그러므로, 분류기 성능을 대체적으로 평가하기 위해서, 교차-검증 분석을 이하 "분류기의 교차검증" 섹션에서 기재한 바와 같이 실시하였다.
C. 500,000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼-기반 분류기
또한, 대조 상지가 아닌 치료 상지에서 RFS에서 완전히 "퀵" 및 "슬로우" 환자를 분류할 수 있는 분류기는 500,000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼을 사용하여 구성될 수 있다. 심층 MALDI 스펙트럼은 이 섹션에 제시된 모든 분류기에 대해 동일하게 전처리되고, 이들 분류기에 대한 학습집단이 재차 앞에 규정된 "퀵" 및 "슬로우" 재발군이었다. 이 심층 MALDI 분석시, 업데이트된 생존 데이터가 입수가능하고, 따라서 이들 분류기의 성능 분석은 섹선A 및 섹션B에 제시된 것들과 관련되는 업데이트된 데이터를 사용하였다. 각 분류기에서 사용되는 구별된 피쳐의 집단은 상기 표 5에서 97개의 피쳐의 아집합이었다. K-최근린 분류 알고리즘을 위해 선택된 K 근접이 각 분류기에 대해 최적화되었다. 도 13a-도 13l은 500, 000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼 및 표 5에 나열된 97개의 피쳐의 아집합을 사용하여 형성된 분류기 6개의 성능을 보여주는 RFS 및 OS의 카플란-마이어 플롯이다.
도 13a 및 도 13b의 분류기는 표 5의 목록으로부터 42개 피쳐의 아집합을 사용하였다. 그들은 베리스트래트 피쳐의 m/z 영역에 포함된 피쳐(표 3 및 4) 및 또한 학습집단에서 '슬로우' 및 '퀵'군 간에 구별하기 위한 적은 단변량 p값에 의거하여 선택된 추가적인 피쳐를 둘다 포함하도록 선택되었다. 이 분류기에 대해, K=3을 최적화하기 위해 발견하였고 사용된 피쳐의 중앙(m/z)이 표 6의 첫번째 열에 나열된다.
[표 6]
Figure 112015007613434-pct00010
Figure 112015007613434-pct00011
도 13c 및 도 13d의 분류기는 표 5에 목록에서 32개 피쳐의 아집합을 사용하였고(부여된 피쳐 m/z의 중앙), 학습집단에서 '슬로우'군 및 '퀵'군 간에 구별하기 위한 단변량 p값 및 '슬로우'군 및 '퀵'군 사이의 피쳐값의 진폭의 비율에 의거하여 선택되었다. 이 분류기는 K=3 및 표 6의 두번째 열에 나열된 피쳐를 사용하였다. 19개 피쳐는 이 분류기 및 종래의 것에 통상적이지만, 이 분류기도 종래 분류기에서 사용되지 않는 13개 피쳐를 포함하지만, 카플란-마이어 플롯 면에서 유사한 성능을 부여한다.
도 13e 및 도 13f의 분류기는 종래의 분류기과 유사한 기준을 사용하여 개발되었고 K=5를 사용하였다. 사용된 피쳐는 표 6의 세번째 열에 나열되었다. 분류기는 도 13a 및 도 13b의 분류기와 마찬가지로 그 25개 피쳐 중 23개를 가지고 도 13c 및 도 13d의 분류기와 마찬가지로 절반을 초과하여 가진다. 분류기에 대해 선택되는 피쳐에서의 유사성에도 불구하고, 카플란-마이어 플롯에서의 성능은 GI-4000으로부터 치료 효과의 예측보다 결과가 더 좋게 전조된다는 것을 나타낼 것이다.
도 13g 및 도 13h의 분류기는 표 6의 4번째 열에 나열된 도 13e 및 도 13f의 분류기의 13개의 피쳐 아집합 및 K=5를 사용하였고; 카플란-마이어 플롯은 처음 2개의 심층 MALDI 분류기(도 13a-도 13d)와 보다 유사한 성능을 나타낸다.
도 13i 및 도 13j의 분류기는 표 3의 베리스트래트 피쳐의 m/z 영역에 피쳐가 사용하지 않고 구성되었다. 그러나, 카플란-마이어 플롯 면에서 베리스트래트 피쳐의 m/z 영역으로부터 피쳐를 포함하는 분류기와 유사한 성능을 가진다고 볼 수 있다. 사용되는 피쳐는 표 6의 다섯번째 열 및 이 분류기 K=7에 나열되어 있다.
도 13k 및 도 13l의 분류기는 표 6의 마지막 열에 나열된 8개 피쳐 및 K=3만을 사용한다. 피쳐 8개 중 4개는 그 밖의 임의의 분류기에 사용되지 않았다. 여전히, 카플란-마이어 플롯에 의해 평가된 바와 같은 성능은 현저하게 시험된 다른 분류기와 상이하지 않다.
또한, 이들 대부분의 심층 MALDI 분류기는 치료 상지에서 '퀵' 및 '슬로우' 분류된 환자를 명확히 분리하지만, 대조 상지에서는 분리를 나타내지 않고, 따라서 "희석-및-발사" 분류기 및 더 적은 조사를 가진 심층 MALDI에 의거하는 것들과 유사하게 수행한다는 것을 주목한다.
분류기의 교차검증
A. 일반적인 제형 및 "희석-및-발사" 분류기로의 그 응용
도 3a~도 3f에 나타내고 이하 기재된 "희석 및 발사" 분류기의 교차검증는 도 5에 개요설명된 절차에 따라 행해졌다.
도 5의 절차에서, 단계 100에서 분류를 위해 사용되는 피쳐(피크 또는 m/z 범위) 및 전처리 단계(배경 제거, 표준화 및 정렬)를 고정하였다. 그후, 단계 102, 104, 105 및 106을 루프 108로 나타내어지는 반복적인 방법으로 수행하였다. 단계 102에서, 분류기 성능을 시험하기 위해 배제되도록 10개 스펙트럼을 무작위로 선택하였다. 단계 104에서, 스펙트럼의 표준집단은 재발(TTR) 기준, 즉 276일 전에 재발로서 규정된 "퀵" 및 상기와 같이 규정된 "슬로우"(500일 전에 재발 없음)와 동일한 시간을 사용하여 나머지 34개 스펙트럼으로부터 선택되었다. 단계 105에서, K 최근린 분류 알고리즘에서의 K의 값을 선택하였다. 단계 106에서, 분류기 성능을 위험비(HR) 및 스펙트럼의 "시험집단"에 대한 평균 면에서 평가하였다. 스펙트럼의 시험집단은 표준집단에 포함되지 않는 치료 상지에서의 스펙트럼(단계 104), 즉 단계 102에서 생략된 10개 스펙트럼+276일~500일 사이에 TTR에 의한 환자로부터 임의의 다른 스펙트럼이다. 공정을 수차례 반복하였다(108)(본 실시예에서 70번).
도 5의 절차가 특별한 연구를 고찰 하에서 부여하면서 표준집단 및 시험집단의 적절한 선택에 의해 일반적으로 적용 가능하다는 것을 인식할 것이다.
도 5의 이 교차검증는 다음의 방법으로 성능을 과소평가하면서 분류기의 성능에 보다 낮은 결합을 제공하는 경향이 있을 것이다:
1. 교차검증 분류기의 표준집단은 본래의 분류기의 그것보다 작고, 성능에 영향을 줄 수 있다.
2. 전에 10개의 중간 재발 스펙트럼보다 큰 반면, 표준집단에 포함되는 시료의 시험집단은 여전히 작다. 이것은 산정된 통계에서 큰 가변성을 초래할 수 있고, 일부 경우에서, 군 크기가 매우 작을 때, 이들 통계가 무의미할 수 있다.
3. 시험집단이 전체로서 치료 상지 집단을 대표한다. 중간 재발 시간을 가진 환자의 비율을 보다 많이 포함한다. 이 불균형은 어려운 시험집단(예를 들면, 대조 상지) 외에 다른 군과 시험집단 결과를 비교하게 한다.
이들 제한에도 불구하고, 분류기의 교차-검증 분석은 "퀵"군 및 "슬로우"군의 정의를 사용하여 형성되고, 베리스트래트 피쳐는 일부 유용한 자각을 산출하였다. 도 6은 대조 상지, 전체 치료 상지, 및 시험집단(분류기 표준집단을 제외한 치료 상지)에 대한 교차-검증 분석에서의 70개 구현화에 대하여 산정된 "퀵"군 및 "슬로우"군 간의 위험비의 분포를 보여준다. 모든 분류기가 대조 상지에 대해 1에 가까운 HR을 생성하지만, 시험집단에 대한 평균 HR은 전체 치료 상지에 대한 그것보다 가까운 3.1이었다.
도 7a 및 도 7b는 교차-검증 분석으로 시험집단에서 "퀵"군 및 "슬로우"군의 평균 RFS의 분포를 보여준다. 도 7a에서, "슬로우"군에 대한 평균은 약 382일 중간이지만, "퀵"군에 대한 평균은 약 274일 중간이다. 도 7b는 시험집단에서 "퀵"군 및 "슬로우"군 간에 평균에서 차이의 분포를 보여준다. 평균들 간의 차이는 약 111일 중간, "퀵" 군보다 "슬로우"군에 대해 더 적은 평균을 나타내는 매우 적은 구현화에 의한 임상적으로 유의적 차이이다. 시험집단 및 대조 상지의 비교는 2개의 군 간에 재발 시간의 분포에서 불균형에 의해 복잡해지지만, 대조군 및 시험집단 내에서 "퀵"군 및 "슬로우"군에서 평균의 관찰은 "슬로우" 시험집단이 주로 "퀵" 및 "슬로우" 대조군의 상기한 것들에 놓여있고, 차례로 "퀵" 시험집단의 상기한 것이 놓여있다는 것을 보여준다. 교차-검증 분석에서 대조 상지 및 시험집단에 "퀵"군 및 "슬로우"군의 평균 분포의 도표인 도 8을 참조한다.
또한, "슬로우"군에 대한 시험집단 및 대조 상지 간에 평균에서 분포의 차이는 거의 모든 구현화에서, 집단에서의 불균형에도 불구하고 시험집단에 대한 평균 RFS를 대조 상지의 그것보다 큰 것을 나타낸다. "슬로우"군에 대한 시험집단 및 대조 상지 간에 평균에서 차이의 분포의 도표인 도 9를 참조한다. 평균 RFS에서의 평균 차이는 약 60일의 재차 중요한 임상 차이가 있었다.
OS에 대한 교차-검증 분석은 초기에 입수된 임상 데이터에서 전체 집단의 삼분의 일을 넘어서 검열된 데이터를 가짐으로써 방해되었다.
교차-검증 분석의 또 다른 결과는 K-최근린 분류기에 사용된 K의 선택에 대해 슬로우 대 퀵 분류의 비율의 의존성의 확인이었다. K-최근린 분류기에 사용된 K의 선택에 대해 분류기에 사용된 K의 상이한 값에 대한 대조 상지에서 슬로우 대 퀵 분류의 비율의 분포의 도표인 도 10a를 참조한다. 도 10b는 다양한 K값에 대하여 교차검증 분석의 시험집단에 대해 산정된 위험비의 분포의 도표이다. 교차검증를 행하였을 때, 각각의 70번 반복에서 3, 5, 또는 7의 K를 선택하였다(도 5, 단계 105). 대략 각각의 1/3을 가져서, 분포 K=3, 5, 및 7의 각각에서 적어도 20으로 평가한다. 또한, K=1에 대해 발생된 것을 참조하기 위해, K=1을 사용하는 교차검증의 19회 반복을 재차 행하였다. 슬로우 대 퀵의 위험비는 K=5에 대한 시험집단에서 가장 큰 것으로 밝혀졌다. 또한, 도 10b는 교차-검증 분석의 모두 70회 반복으로 대조 상지에 대해 수득된 위험비의 분포의 도표이다. 도 10b는 K의 값이 대조 상지 내에서 몇으로 사용되는지 많은 차이가 나타나지 않고, 분포가 꽤 좁다는 것을 나타낸다. 도 10b는 도 10a과 함께 고려될 때, K의 다중 선택이 K-최근린 분류 알고리즘에서 가능하지만, K=5가 아마 바람직한 선택이라는 것을 나타낸다.
B. 150,000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼-기반 분류기의 교차검증
이전에 제시된 150,000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼-기반 분류기 4개로 동일한 교차검증 방법의 적용은 GI-4000의 추가로부터 상대적인 치료 유익을 예측하는 능력 면에서 이들 중 2개가 우수한 성능을 가졌다는 것을 보여준다. 도 14는 대조 상지 및 교차검증의 시험집단 모두에서 도 4a-도 4h로부터 4개의 분류기로 RFS에 대해 '퀵' 및 '슬로우'로서 분류된 환자들 간에 위험비의 분포를 보여준다. 도 4c-도 4f에서 분류기에 대해 관찰된 평균 위험비가 시험집단 및 대조 상지에서 유사한 반면, 그 밖의 2개 분류기에 대해 관찰된 것들은 대조 상지에서보다 시험집단에서 더 많아서, 대조 상지보다 치료 상지에서 RFS에서의 '퀵'군 및 '슬로우'군 간에 더 많은 분리를 나타내는 카플란-마이어 플롯으로부터 성능 평가를 지원하고, 젬시타빈 조절 요법에 GI-4000의 추가에 대해 분류기의 예측력을 제원한다.
C. 500,000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼-기반 분류기의 교차검증
또한, 동일한 교차검증법은 앞서 제시된 500,000회 조사 심층 MALDI 스펙트럼-기반 분류기 6개에 적용되고, 도 13a-도 13m에서 평가되었다. 대조 상지 및 교차검증의 시험집단 둘다에서 각각의 분류기에 대한 위험비의 분포를 도 15에 나타낸다. 이것은 전체 치료 및 대조 상지를 보여주는 카플란-마이어 플롯의 성능에서의 명확한 차이가 교차검증법에 의해 평가될 때에 항상 유지되지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, 추가적인 증거는 교차검증에서조차도 유사한 성능 특징을 갖는 상이한 피쳐 집합을 사용하여, 매우 상이한 분류기를 구성하는 것이 가능하다.
학습집단이 "퀵" 및 "슬로우" 부류들의 구성원의 수가 불균등할 수 있다는 것을 주목한다. 불균등한 군 크기의 의문을 다루기 위해, 본원이 선택한 상대적인 참조군 크기는 부분적으로 치료 상지에 가진 재발 시간의 분포의 결과이었다. 많은 환자가 계획된 MRI/CT 평가와 일치하기 때문에 250일과 275일 사이의 재발 시간을 갖게 되었다. 따라서, 그 시간들 간에 군을 분리하기 위한 적정한 장소일 것 같지 않았다. 그러나, 더 큰 조기 재발군을 취하는 것이 더 낫다고 결정하였고. 따라서 이 군에서 더 많이 갖는 것이 바람직하였다. K-최근린 분류 알고리즘은 표준집단에서 상이한 군 크기를 고려하도록 조정될 수 있고, 따라서 원론적으로 학습집단에서 불균등 군 크기를 갖을 문제가 없다.
실용적인, 유용한 시험
본 개시물 전체에 걸쳐 주목하는 바와 같이, 실용적이고 유용한 시험이 본 개시물의 발견에 따른다. 하나의 양상에서는, 본 발명의 시험 방법은 특정 암환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 그 밖의 요법과 병용하여 이득을 얻거나 또는 얻지 않을 것 같은 암환자들군의 구성원인지 여부를 확인하는 것이다. 또 다른 양상에서는, 본 발명의 시험 방법은 특정 암환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법의 투여, 예컨대 GI-4000, 단독으로 또는 그 밖의 요법과 병용하여 이득을 얻거나 또는 얻지 않을 것 같은 암환자들군의 구성원인지 여부를 확인하는 것이다.
하나의 실시예에서의 방법은: a) 환자로부터 혈액-유래 시료를 수득하는 단계; b) 질량 분광계의 도움으로 혈액계 시료의 질량-스펙트럼을 수득하는 단계; c) 프로그래밍된 컴퓨터에서, 질량 스펙트럼에 대한 소정의 전처리 단계들을 수행하고, 전처리 단계를 수행한 후에 소정의 m/z 범위에 걸쳐서 스펙트럼에서 선별된 피쳐의 적분된 세기값을 수득하며, 또한 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단과 적분된 세기값을 비교하여 등급 표지로 질량 스펙트럼을 분류하는 단계를 포함한다. 스펙트럼에 할당된 등급 표지는 환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 그 밖의 요법에 추가하는 형태로 치료로부터 이득을 얻거나 또는 얻지 않을 것 같은지의 여부를 예측하는데 사용된다.
다른 실시예에서의 방법은: a) 환자로부터 혈액-유래 시료를 수득하는 단계; b) 질량 분광계의 도움으로 혈액계 시료의 질량-스펙트럼을 수득하는 단계; c) 프로그래밍된 컴퓨터에서, 질량 스펙트럼에 대한 소정의 전처리 단계들을 수행하고, 전처리 단계를 수행한 후에 소정의 m/z 범위에 걸쳐서 스펙트럼에서 선별된 피쳐의 적분된 세기값을 수득하며, 또한 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단과 적분된 세기값을 비교하여 등급 표지로 질량 스펙트럼을 분류하는 단계를 포함한다. 스펙트럼에 할당된 등급 표지는 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법의 투여를 단독으로 또는 그 밖의 요법에 추가하는 형태로 치료로부터 이득을 얻거나 또는 얻지 않을 것 같은지의 여부를 예측하는데 사용된다.
상기 시험은 도 11에 공정 300으로서 순서도 형태로 도시되어 있다.
단계 302에서, 혈액-유래 시료는 환자로부터 수득된다. 본 실시예에서의 시료는 시료에 대한 일부 처리 단계 후의 혈장이다(예를 들면, 종래의 밀도-분리법에 의해 전혈로부터 수득된 혈장). 일 실시형태에서, 혈액-유래 시료는 3개의 분취량으로 분리되고, 질량 분광분석 및 다음 단계 304, 306(하위단계 308, 310 및 312를 포함한다), 314, 316 및 318을 각각의 분취량에 대해 독립적으로 수행한다. 분취량의 수는 다양할 수 있고, 예를 들면, 4, 5 또는 10 분취량일 수 있고, 각 분취량을 다음 처리 단계들로 처리한다.
단계 304에서, 시료(분취량)를 질량 분광분석법으로 처리한다. 바람직한 질량 분광분석법은 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) 비행시간(TOF) 질량 분광분석이지만, 2012년 5월 29일에 출원된 계류중인 미국 특허 가출원 61/652,394에 개시되고 그 내용이 본 명세서에 참조로 포함되어 있는(하기 설명 참조) 질량 분광분석의 소위 "심층 MALDI"법을 포함하는 그 밖의 방법도 가능하다. 질량 분광분석은 본 기술분야의 종래 기술과 같이, 다수의 질량/전하(m/z)값에서 세기값들을 나타내는 측정점으로 이루어진 질량 스펙트럼을 생성한다. 일 실시형태에서, 시료들을 해동하고, 1500rpm에서 5분간 4섭씨온도에서 원심분리한다. 추가로, 시료들을 밀리큐(MilliQ) 수에서 1:10, 또는 1:5로 희석시킬 수 있다. 희석된 시료들을 MALDI 플레이트 상의 임의로 할당된 위치에 삼중으로 점적할 수 있다(즉, 본 기술분야에 공지된 바와 같이 상이한 세 개의 MALDI 표적 또는 "점적" 위에). 희석된 시료 0.75㎕를 MALDI 플레이트 상에 점적한 후에, 35mg/ml 시나피닉산(50% 아세토니트릴 및 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) 중)의 0.75㎕를 첨가하고 상하로 5회 피펫팅함으로써 혼합시킬 수 있다. 플레이트는 실온에서 건조될 수 있다. 다른 기술 및 절차가 본 발명의 원리에 따라 시료를 제조하고 가공하기 위해 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
질량 스펙트럼은 스펙트럼이 자동 또는 수동 수집되는 보이저(Voyager) DE-PRO 또는 DE-STR MALDI TOF 질량 분광계를 이용하여 선형 모드로 양성 이온에 대해 수득될 수 있다(물론, 그 밖의 MALDI TOF 기기, 예를 들면, 브루커사의 기기를 사용할 수 있다). 75개 또는 100개 스펙트럼은 각 시료 견본에 대한 2,000개 스펙트럼의 평균을 생성하기 위해 각 MALDI 점적 내에 7개 또는 5개 위치로부터 수집된다. 스펙트럼은 단백질 표준(인슐린(소과), 티오레독신(대장균(E.coli)) 및 아포마이글로빈(말과))의 혼합물을 사용하여 외부적으로 보정된다.
심층 MALDI법은 하기 설명을 참조하여 하나의 MALDI 플레이트 점적 또는 여러 MALDI 플레이트 점적을 걸쳐서 단계 304에서 사용될 수 있다는 것을 주목한다.
단계 306에서, 단계 304에서 수득된 스펙트럼은 하나 이상의 전처리 단계들로 처리한다. 전처리 단계 306은 단계 304에서 수득된 질량 스펙트럼 데이터 상에서 동작하는 소프트웨어 지시를 이용한 범용 컴퓨터에서 실행된다. 전처리 단계 306은 배경 제거(단계 308), 표준화(단계 310) 및 정렬(단계 312)을 포함한다. 배경 제거의 단계는 스펙트럼에서 배경의 확고한, 비대칭 추정치를 생성하는 것을 포함하는 것이 바람직하고 스펙트럼으로부터 배경을 삭제한다. 단계 308은 본원에 참조로서 포함된 미국 특허 제 7,736,905호에 기재된 배경 제거 기술을 이용한다. 표준화 단계 310은 배경 제거된 스펙트럼의 표준화를 포함한다. 표준화는 미국 특허 7,736,905호에 기재된 바와 같이 일부 이온 전류 표준화, 또는 전체 이온 전류 표준화의 형태를 취할 수 있다. 단계 312는 미국 7,736,905호에 개시된 대로 표준화되고, 배경 제거된 스펙트럼을 소정의 질량 규모로 정렬하며, 이것은 분류기에 의해 사용된 학습집단에서 스펙트럼의 측정으로부터 수득될 수 있다. 또한, 전처리 단계는 GI-4000+젬시타빈 임상 연구의 상기 논의에서 약간 상세하게 기재되어 있다. 그러나, 전처리의 세부사항, 예를 들면, 일부 이온 전류 표준화 및 정렬을 위해 사용된 피쳐 또는 스펙트럼 영역이 다양할 수 있다.
일단 전처리 단계(306)가 수행되면, 공정(300)은 소정의 m/z 범위에 걸쳐 스펙트럼에서 적분된 세기를 수득하는 단계 314에 이른다. 표준화되고 배경 제거된 세기 값은 이들 m/z 범위에 걸쳐 적분할 수 있다. 이 적분된 값(즉, 상응하는 소정의 m/z 범위 내에서 세기의 합)은 피쳐로 할당될 수 있다. 소정의 m/z 범위는 이러한 m/z 위치에서 피크 폭에 상응하는 폭을 갖는 상응하는 피쳐의 평균 m/z 위치 주위에서 간격으로서 정의될 수 있다. 또한, 이 단계는 미국 특허 제 7,736,905호에 추가로 상세하게 개시되어 있다.
단계 314에서, 가능한 일 실시형태에서, 스펙트럼에서 세기의 적분된 값은 하기 m/z 범위 중 하나 이상에서 수득된다:
[표 3]
5732 내지 5795
5811 내지 5875
6398 내지 6469
11376 내지 11515
11459 내지 11599
11614 내지 11756
11687 내지 11831
11830 내지 11976
12375 내지 12529
12502 내지 12656
23183 내지 23525
23279 내지 23622 및
65902 내지 67502.
일 실시형태에서, 값들은 하기 표 4에 나열된 피크에 중심이 있거나 피크를 포함하는 m/z 범위 중 8개 이하에서 수득된다. 이들 피크의 의의, 및 발견의 방법은 내용이 본 명세서에서 참조로서 포함되는 미국 특허 제 7,736,905호, 및 2011년 2월 22일에 출원되고 미국 2011/0208433으로 공개된 미국출원번호 제 12/932,295호에 설명되어 있다. 실제는 표 3 및 표 4에서의 상기 폭들(범위들) 또는 피크 위치가 예를 들면, 스펙트럼 정렬을 어떻게 수행하는지에서의 변형 때문에 약간 다를 수 있다. "심층 MALDI" 기술(하기 설명 참조)을 사용하여 많은 피쳐들이 분류를 위해 사용될 수 있는 스펙트럼에서 시현되는 것을 추가로 주목하고 있다. 희석 및 발사 질량 분광분석에 대해, 표 1의 피크들 중 하나 이상이 표 1 및 표 3과 표 4의 피쳐들의 분류, 또는 병용을 위해 사용될 수 있다. 표 2, 표 5 및 표 6 및 상기한 도 4a-도 4h의 예를 참조하여 "심층 MALDI" 기술을 사용하여 많은 피쳐들이 분류에 사용될 수 있는 병용을 스펙트럼에서 시현되는 것을 추가로 주목하고 있다.
단계 316에서, 단계 314에서 수득된 값은 예시된 실시형태에서 K-최근린(KNN) 분류기인 분류기에 공급된다. 분류기는 다수의 다른 환자로부터의 등급 표지된 스펙트럼의 학습집단을 사용한다. 학습집단은 면역반응 발생 요법, 예컨대 단독으로 또는 다른 항암 치료와 병용하여 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법일 수 있는 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻거나 얻지 못한 않은 환자 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함할 것이다. 예를 들면, 상기 작용예에 기재된 GI-4000 연구에서 학습집단은 "퀵" 및 "슬로우" 재발시간 집단에 있는 등급-표지된 스펙트럼을 포함하였다. 이러한 스펙트럼에 할당된 등급 표지는 "퀵", "슬로우", 또는 이의 등가물, 예컨대 "유익", "비반응군", "좋음", "나쁨", 등의 형태로 취할 수 있다. 314에서의 값 및 학습집단에 KNN 분류 알고리즘의 적용은 근본적으로 미국 특허 제 7,736,905호에 설명된 바와 같이 다차원 피쳐 공간에서 적분된 세기값과 소정의 스펙트럼 피쳐의 비교로부터 거리 연산 및 다수결 알고리즘(majority vote algorithm)이다. 확률적 KNN 분류기, 서포트 벡터 머신, 또는 그 밖의 분류기를 포함하는 다른 분류기들을 사용할 수 있다.
단계 318에서, 분류기는 스펙트럼에 대한 표지, 예를 들면, "퀵" 또는 "슬로우"을 생성한다. 그 방법은 단일 분취량에 의해, 또는 3개 분취량으로 분리된 시료에 의해 수행될 수 있고, 여기서 단계 304-318이 주어진 환자 시료(또는 많은 분취량을 사용하는 것은 무엇이든)로부터 3개 분리 분취량에 대해 병렬로 수행된다. 단계 320에서, 점검은 모든 분취량이 동일한 등급 표지를 생성하는지 여부를 결정하게 한다. 아니라면, 불확실한(또는 불확적한) 결과가 단계 322에서 반복된다. 모든 분취량이 동일한 표지를 생성하면, 표지를 단계 324에 나타내는 대로 보고한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 대로, 단계 324에서 보고된 등급 표지는 환자의 치료를 안내하는데 사용된다. 예를 들면, 분류 단계에 따라 "퀵"으로 표지링된 그 췌장암환자들은 면역반응 발생 요법, 예컨대 암에 대한 효모-기반 면역요법으로부터 치료로 이득을 얻을 것 같지 않다고 예측되고, 여기서 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 젬시타빈을 포함하는 다른 항암 제제와 병용일 수 있다. 다른 실시예로서, 분류 후에 췌장암환자의 스펙트럼에 대한 등급 표지이 시험에 따라 "슬로우"로 확인되면, 환자는 면역반응 발생 요법, 예컨대 암에 대한 효모-기반 면역요법으로부터 이득을 얻을 것 같다고 예측되고, 여기서 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 젬시타빈과 병용일 수 있고, 환자는 면역반응 발생 요법, 예컨대 암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 투여로 처리되도록 진행되고, 여기서 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 젬시타빈과 병용일 수 있다.
단계 306, 314, 316 및 318이 전형적으로 전처리 단계 306을 암호화, 단계 314에서 적분된 세기값의 수득, 단계 316에서 KNN 분류 알고리즘의 적용 및 단계 318에서 등급 표지의 생성하는 소프트웨어를 사용하는 프로그래밍된 범용 컴퓨터에서 수행된다고 이해될 것이다. 단계 316에 사용된 등급 표지된 스펙트럼의 학습집단은 컴퓨터 내의 메모리 또는 컴퓨터에 접근가능한 메모리에 저장된다.
그 방법 및 프로그래밍된 컴퓨터는 유리하게 미국 특허 제 7,736,905호에 기재된 바와 같이 실내시험 처리 센터에서 실행될 수 있다.
[표 4]: 분류에 사용된 피크.
Figure 112015007613434-pct00012
주석: 표 4에서 확인되는 피크들의 m/z값들은 학습집단 및 전처리에서 시험 스펙트럼을 정렬시에 사용되는 모든 스펙트럼을 정렬하는데 사용되는 스펙트럼 정렬 공정에 따른 더 높은 또는 더 적은 m/z값들에서 약간 변화하는 것으로 처리될 수 있다.
도 12는 본 개시물의 방법을 실시하는데 사용될 수 있는 실내시험 처리 시스템(400)의 계략적인 블록다이어그램이다. 시스템(400)은 다수의 환자 시료에 대해, 예를 들면, 시험 서비스 제공자 사업에서 실내시험 처리 센터로서 기능하는 연구소에서 실행될 수 있다. 시스템(400)은 다른 처리 단계의 수행 후에 전혈, 혈장, 혈청, 또는 혈장, 예를 들면 종래 밀도-기반 분리법에 의해 전혈로부터 수득된 혈장일 수 있는 혈액-유래 시료(402)를 수용한다. 시료를 희석하고 MALDI-TOF 플레이트(404)의 하나 이상의 점적 상에 상기한 절차를 사용하여 정제하고나서 MALDI-TOF 질량 분광계(406) 내에 삽입한다. 질량 분광계는 종래와 마찬가지로 데이터 쌍들(m/z 위치, 세기)의 형태로 질량 스펙트럼(408)을 생성한다. 그후, 질량 스펙트럼 데이터는 데이터베이스 또는 기계 판독가능한 메모리(410)에서 디지털형태로 저장된다. 메모리(410)는 예를 들면, 근거리통신망을 통해 범용 컴퓨터(414)에 접근가능한 것이고, 상세가 중요한 것은 아니다. 메모리(410)는 학습집단(412)의 등급-표지된 스펙트럼을 추가로 저장한다. 컴퓨터(410)는 스펙트럼(408)에 대한 전처리 단계를 수행하기 위해(배경 제거, 표준화 및 정렬) 소프트웨어 지시 및 전처리 후에 스펙트럼에 관하여 분류 알고리즘(예를 들면, K-최근린)을 실시하고 학습집단 데이터(412)를 사용하기 위한 코드를 실행하고, 한다. 그후, 컴퓨터는 도 11에서 설명한 대로, 스펙트럼(408)에 대한 등급 표지를 생성하고, 본 명세서에 기재된 치료를 안내하는데 사용된다.
시험 시스템(400)은 컴퓨터 통신망(422)을 통해 원격의 MALDI-TOF 기기(420)로부터 질량 스펙트럼 데이터를 수용하고 도 11의 단계 304-324를 수행할 수 있다. MALDI-TOF 기기는 원격의 진료소, 병원 또는 연구소와 어울릴 수 있고, 분류 컴퓨터(414)를 실행하고 있는 실체와 연계할 수 있거나 할 수 없지만, 표준화 및 재현성을 정상적으로 보장하도록 분류 및 등급 표지의 생성을 수행하는 동일한 실체는 또한 환자 시료의 질량 분광분석을 수행할 것이다.
질량 스펙트럼을 수득하기 위한 "심층 MALDI"법
MALDI(매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화) TOF(비행시간) 질량 분광분석에서, 시료/매트릭스 혼합물은 MALDI 플레이트로서 공지된 금속 플레이트 상에 규정된 위치(본 명세서에서 "점적", 또는 "시료 점적")에 배치된다. 레이저빔을 매우 짧은 순간동안 점적의 위치 상에 지향시켜("조사(shot)"로 공지됨), 시료의 분자 또는 다른 성분의 탈착 및 이온화를 야기한다. 시료 성분은 이온 검출기로 "비행"한다. 기기는 질량 스펙트럼의 형태로 시료 내 성분(분자)의 질량 대 전하비(m/z) 및 상대 강도를 측정한다.
일반적으로, MALDI-TOF 측정에서, MALDI 플레이트 상에 각각의 점적에 적용되는 수백회 조사가 있고, 얻어진 스펙트럼(조사당 하나)을 합하거나 평균화하여 각각의 점적에 대한 전체 질량 스펙트럼을 생성한다.
적어도 복잡한 생물학적 시료, 예컨대 혈청 및 혈장의 MALDI-TOF 질량 분광분석의 분야에서 종래의 지식은 시료에 대략 1,000회 조사를 초과하여 행할 필요가 없다는 것이고, 그렇지 않으면 단백질 함량이 격감되고, 기기에서의 레이저 및 검출기가 과도하게 마모되고, 또한 추가적인 조사가 시료에 관한 추가적인 정보의 중요한 양을 시현할 수 없다는 것이다. 그러므로, 예를 들면, 바이오마커 개발 연구시 복잡한 생물학적 시료로부터 질량 분광분석 데이터를 얻을 때, 시료 점적당 500-1000회 조사를 사용하는 것이 일반적이다.
최근의 탐색적 연구에서, 본원은 동일한 MALDI 점적 또는 동일한 시료의 다양한 점적으로부터 축적된 스펙트럼의 조합으로부터 많은(20,000회를 초과하고, 일반적으로 100,000회 내지 500,000회) 조사를 수집 및 평균화하는 것이 노이즈 대 신호의 상대 수준에서 감소를 초래한다는 것, 및 복잡한 생물학적 시료의 질량 분광분석으로부터 추가적인 스펙트럼 정보의 중요한 양을 시현한다는 것을 발견하였다. 또한, MALDI TOF MS를 사용하는 다양한 표준 패러다임이 분명히 잘못됨을 나타낸다. 첫째, 점적 상의 단백질 함량이 완전히 격감되기 전에 단일 점적 상에 수십만회 조사를 수행하는 것이 가능하다. 둘째, 많은 조사의 평균화를 통한 노이즈의 감소는 이전의 비가시적 피크(즉, 1,000회 조사에서 명백하지 않은 피크)의 출현을 초래한다. 셋째, 이전의 가시적 피크는 더 명확해지고, 피크 ㅓ강도의 보다 신뢰할만한 측정하는 것 및 시료를 매우 많은 조사(1,000회를 훨씬 초과하는)로 처리할 때 시료 간의 비교하는 것을 가능하게 한다.
예로서는, MALDI-TOF 질량 분광에서 복잡한 생물학적 시료, 예컨대 혈액계 시료를 단일 점적 상에 매우 많은 조사(>20,000 및 심지어 100,000 또는 500,000회 조사)로 처리하는 것은 노이즈 수준에서의 감소 및 종래의 비가시적 피크(즉, 피크가 2,000회 조사에서 명백하지 않음)의 시현을 초래한다는 것을 발견하였다. 또한, 이것은 시료 중의 단백질 함량의 소모 없이 행해질 수 있다. 추가적으로, 종래의 가시적 피크는 보다 잘 규정되어지고, 시료 간의 더 신뢰할만한 비교를 가능하게 한다. 혈액계 시료의 표준 스펙트럼에서(~1,000회 조사), 일반적으로 60-80 피크가 가시적인 반면, 200,000회 조사에 의해 일반적으로 ~200-220 피크가 가시적이고, 500,000회 조사에 의해 일반적으로 ~450-480 피크가 가시적이고, 2,800,000회 조사에 의해 일반적으로 ~760 피크가 가시적이다. 여기서 보고된 피크의 수는 MALDI-TOF 기기 설정에 관한 것이고, 이들의 수는 기기 설정에 따른 대강의 지침일 뿐이고; 또한 특정 피크 검출 알고리즘(및 물론 실제 시료)에서 더 많은 또는 더 적은 피크가 가시적일 것이라고 이해될 수 있다. 또한, 이하 논의된 도 16a~도 16d에서 나타내는 바와 같이, 피크의 양 및 강도(존재율과 관련됨)의 수량화도 적어도 일부 측정 하에서 더 양호할 수 있다는 것에 주목해야 한다.
예를 들면, 200,000회 조사에서 시현된 피크는 혈청 시료에 극미량 존재하는 무손상(비분해된) 단백질에 상응하는 것으로 여겨진다. 본 명세서에서 기재되고, 본 명세서에서 "심층MALDI" 접근법(즉, 동일 점적 또는 다중 점적의 조합으로부터 점적당 20,000회 초과 조사, 바람직하게는 대략 250,000회 내지 750,000회 조사 이상)이라고 하는 기술을 사용하여, 매우 많은 단백질, 및 가능한대로 혈청 시료에 존재하는 모든 단백질의 적어도 절반이 반정량적이고 재현가능한 방식으로 검출될 수 있다고 여겨진다. 반정량적인 방식으로의 검출이란 강도(피크 높이, 피크 아래의 영역)의 측정이 시료내 단백질의 절대 존재율 또는 농도와 관련된 것을 의미한다. 재현가능한 방식으로의 검출이란 동일한 시료를 수회 측정할 수 있고, 일부 허용가능한 변동계수 내에서 동일한 결과를 얻는 것을 의미한다.
단일 MALDI 점적으로부터 20,000회 초과 조사를 얻는 것은 근대 MALDI-TOF 기계의 파라미터를 초월할 수 있는 것이지만; 이 한계를 회피하여 여러 작용 방법을 본 명세서에 기재한다. 이상적으로, MALDI-TOF 기기를 본 명세서에 기재된 "심층MALDI" 접근법에 부응하도록 고안하고, 이러한 기계를 위한 자동화된 래스터 스캔 특징 및 단일 점적 상에 훨씬 더 많은 조사를 수행하는 능력을 포함하는 여러 구체적인 제안을 하기 설명에 제공한다.
MALDI 시료 점적으로부터 수십만의 많은 조사를 사용하는 가장 긴급한 사안은 통상의 점적 제조에서 조합된 스펙트럼에서의 신호에 주로 기여하도록 점적 내에서 일부 조사 위치들만 충분한 이온 전류를 산출한다는 것이다. MALDI 플레이트 상에 부여된 점적 내의 높은 이온 산출 위치를 시각적으로 선택하는 노동 집약적인 수동 공정을 사용하여 초기 결과를 얻었고, 이 접근법으로 진행하는 것이 가능한 반면, 레이저 조사에 대한 위치를 선택하는 공정의 자동화가 가능하고, 본 발명의 높은 처리량(throughput) 실행에 바람직하다(그렇지 않으면 너무 많은 레이저 조사이 낭비되지 않고 레이저 라이프타임이 상당히 저하하지 않기 때문). 대체적인 접근법은 대부분 무작위로 선택된 위치가 높은 이온 전류를 산출하는 그런 방법으로 MALDI 점적의 질을 개선하는 것이다. 두 접근법은 심층MALDI 스펙트럼의 생성에 유용하다.
스펙트럼 획득의 자동화를 위한 여러 방법은 본 명세서의 이 섹션에 기재되어 있다. 획득의 자동화는 래스터 방식으로 점적의 레이저 스캔의 최적 이동 패턴을 규정하는 것을 포함할 수 있고, 별개의 X/Y 좌표에 다중 래스터 스캔에 대해 지정된 시퀀스의 생성이 점적 내에 위치하여 하나 이상의 점적으로부터 바람직하게는 750,000회 또는 3,000,000회 조사를 야기한다. 예를 들면, 각 4개의 시료 점적당 250,000회 조사로부터 획득된 스펙트럼을 1,000,000회 조사 스펙트럼으로 조합시킬 수 있다. 이전에 언급한 바와 같이, 동일한 시료를 포함하는 다중 점적에 대해 수집된 수십만회 조사 내지 백만회 조사를 함께 평균화하여 하나의 스펙트럼을 생성할 수 있다. 하나의 자동화 방법은 시료 점적의 비근접한 X/Y 래스터 스캔에 대한 래스터 파일의 생성을 포함한다. 또 다른 방법은 점적을 하위-점적의 격자(예를 들면, 3X3 또는 5X5 격자)로 분할하는 것 및 하위-점적의 별개의 X/Y 좌표 위치에서 래스터 스캔에 대해 래스터 파일을 생성하는 것을 포함한다. 스펙트럼 획득(다중 조사)을 위한 비교적 높은 농도의 시료 재료를 포함하는 관심 영역들 및/또는 단백질 농도가 비교적 낮은 그 영역들을 동정하는 화상 분석 기술을 사용하고, 비교적 높은 단백질 농도를 갖는 영역에서 스펙트럼 획득을 수행하는 또 다른 방법을 개시한다.
MALDI 플레이트("점적")에 시료 적용의 공정을 최적화하여 시료/매트릭스의 균일, 균질 결정체를 단일 점적 내에 생성하는 것을 이하에 기재하고 있다. 이 공정은 자동화된 방법을 사용하여 MALDI 플레이트 상에 단일 점적으로부터 수십만회 조사를 획득할 수 있게 하다.
본 개시물의 이 발견 및 방법은 많은 응용이 있고, 예를 들면, 바이오마커 발견 효과에서 바이오마커 발견, 시험 개발, 물질 시험, 기존 시험들의 확인, 및 가설 설정을 포함한다. 그 방법들은 본 명세서 내에 기재된 종래의 시험에 적용가능하다는 것을 특히 눈여겨본다. 현재 방법론과 비교하여, 그 방법들은 높은 처리량 방식으로 복잡한 시료 내 훨씬 많은 단백질의 양을 재현으로 수량화하는 그 능력에 의해 질량 분광분석 연구에서 "희석 및 발사(dilute and shoot)" 방법의 가능성을 추가로 향상시킨다.
본 명세서의 이 섹션에서 사용되는 용어는 하기와 같다:
1. 용어 "일시적 스펙트럼(transient spectrum)"은 MALDI 점적에서의 단일 위치 또는 x/y 지점(각각의 패킷은, 예를 들면 100, 500, 800회 조사, 등의 규정된 수의 조사로 이루어짐)에 지향된 레이저 조사의 단일 패킷으로부터 획득되는 스펙트럼을 의미한다.
2. 용어 "위치 스펙트럼(location spectrum)"은 레이저가 MALDI 점적에서의 동일한 위치에서 x회 발사되는 동안 하나 이상의 일시적 스펙트럼의 누적 합계를 의미한다.
3. 용어 "점적 스펙트럼(spot spectrum)"은 단일 MALDI 점적 전체에 걸쳐서 발사하는 중에 획득되는 모든 위치 스펙트럼의 합계를 의미한다. 점적 스펙트럼은 위치 스펙트럼을 합하는 합계 연산만을 사용하여 얻어지거나 위치 스펙트럼에서 정렬을 실시한 후의 합계 연산 및/또는 표준화 연산(예를 들면, 총 이온 전류 표준화)을 사용하여 얻어질 수 있다. 점적 스펙트럼은 일반적으로 MALDI 점적에 대해 100,000~500,000회 조사로부터 얻어질 수 있다. 점적 스펙트럼을 얻기 위한 다른 옵션이 가능하고, a) 위치 스펙트럼에 대해 배경 제거 및 표준화를 수행하고 나서 합하기; b) 위치 스펙트럼에 대해 배경 제거 및 정렬을 수행하고 나서 합하기; c) 위치 스펙트럼에 대해 배경 제거, 정렬, 및 표준화를 수행하고 나서 합하기를 포함한다. 위치 스펙트럼의 총 이온 전류 표준화(상세는 미국특허 7,736,905호 참조)에 의해 가장 좋은 동적 범위를 달성하고; 점적 스펙트럼에서 임의의 배경 제거를 행할 수 있다는 것을 발견하였다.
4. 용어 "조사 위치(shot location)"는 레이저빔이 발사하기 위해 MALDI 점적을 가로막는 부여된 위치를 의미한다. MALDI 점적당 200,000회 또는 500,000회 조사를 얻기 위해서 레이저빔을 다수(예를 들면, 수백)의 개별적인 조사 위치에 예를 들면, 수동적으로, 또는 보다 바람직하게는 점적 위로 레이저빔의 래스터 스캔을 사용하는 자동화된 방식으로 MALDI 점적 위로 지향시킨다. 이하 설명하는 바와 같이, 일반적으로 바로 인접한 점적 위치에 연속적으로 발사하는 것은 바람직하지 않기 때문에 래스터 패턴 디자인이 중요하다. 따라서, 래스터 패턴 디자인은 일부 공간적으로 분리된 조사 위치를 연속적으로 선택하고, 공간적으로 변화된 방법으로 전반적인 MALDI 점적에 걸쳐 스캔을 반복하여 점적에서 바로 인접한 위치의 순차적인 발사를 피한다.
5. 용어 "일시적 스펙트럼 여과(transient spectrum filtering)"는 일시적 스펙트럼을 수용 또는 거부하는데 사용되는 여과 또는 선택 공정을 의미한다. 예로서, 일시적 스펙트럼 여과에서, 소정의 m/z 범위 내에서 일시적 스펙트럼이 피크의 최소 수(예를 들면, 5)를 수용하기 위해서는 일시적 스펙트럼 내에 존재해야 하고, 일시적 스펙트럼에서 신호 대 노이즈비는 지정된 역치보다 높아야 한다. 또한, 예컨대 스펙트럼의 총 이온 전류이 어떤 규정된 역치를 초월할 필요가 있거나, 이하 설명하는 바와 같이 예외 리스트(exclusion lists) 또는 포함 리스트(inclusion lists)를 사용함으로써 다른 여과 기준을 사용할 수 있다. 스펙트럼 여과는 전체에서 일시적 스펙트럼을 수용 또는 거부한다.
6. 본 명세에서 사용되는 바와 같이, 용어 "복잡한 생물학적 시료"은 존재율이 큰 동적 범위, 일반적으로 수십배의 크기에 걸쳐 분포되어 있는 수백 또는 수천의 피분석물, 예를 들면, 무손상 단백질을 포함하는 시료로 규정된다. 이러한 복잡한 생물학적 시료의 예로서는 혈액 또는 그 성분(혈청 또는 혈장), 림프액, 생식관액, 뇌척수액, 및 발현된 전립선 혈청을 포함한다. 또한, 이러한 복잡한 생물학적 시료는 환경 시료 또는 식품 시료로 이루어질 수 있다.
"심층 MALDI"법에서 시현된 스펙트럼 정보의 일례를 도 16a-도 16e에 보여준다. 도 16a~도 16c는 조사의 증가하는 수로 인해 검출가능한 피크 함량에서의 증가를 나타내는 동일한 시료(혈청)의 3개 스펙트럼을 나타내는 선택된 질량/전하 범위(m/z비 7,000 내지 8,000)의 도표이다. 도 16a의 스펙트럼은 2,000회 조사로부터 야기되고, 도 16b의 스펙트럼은 100,000회 조사로부터 야기되고, 도 16c의 스펙트럼은 500,000회 조사로부터 야기되었다. 특히 어떻게 도 16a의 스펙트럼이 본질적으로 노이즈로서 나타나고, 관심있는 인식가능한 스펙트럼 정보를 거의 적게 또는 전혀 나타나지 않는지를 주목한다. 도 16a를 도 16b와 비교하면, 도 16b의 스펙트럼(100,000회 조사로부터 얻은 스펙트럼)이 많은 개별적인 피크, 예를 들면, 도 16a의 스펙트럼에 존재하지 않는 10개에서 동적되는 피크를 포함한다. 도 16c의 스펙트럼에서, 다른 스펙트럼에서 보여지지 않거나 저면 스펙트럼에서 노이즈로서 간주될 수 있는 스펙트럼에서 보여지는 많은 피크가 있다. 도 16c 및 도 16b를 도 16a와 비교하면, 풍부한 스펙트럼 정보가 100,000회 조사 및 도 16a의 스펙트럼(2,000회 조사)에 존재하지 않는 500,000회 조사에서 시현되고, 노이즈 수준이 도 16b 및 도 16c에 도시된 바와 같이 심층MALDI 방법에 의해 감소되는 것이 명백하다.
도 16b 및 도 16c의 스펙트럼은 특정될 수 있고 피크 강도를 존재율에 관련하도록 할 수 있는 동적 범위로 스펙트럼의 민감도를 증가시킨다. 부여된 농도에서 분자의 존재에 대해 복잡한 생물학적 시료를 분석하도록 피크 강도를 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 이 방법에서는 시료에서 관심분자(공지된 질량)를 규정하고, 목적하는 존재율 수준(몰농도, 또는 ppm)으로 시료를 노핑하며, MALDI 플레이트에 적용하며; 분자가 특정 존재율(강도)에서 스펙트럼(공지된 m/z 지점에서의 피크)에 확실히 존재할 때까지 플레이트(예를 들면, 100,000 초과) 상에 많은 조사를 수행하고, 조사("x")의 수를 기록할 수 있다. "기준 스펙트럼"이라는 것을 생성시키는 이 절차는 본 기술분야에 숙련된 자에게 명백할 수 있도록 전형적인 정성분석 및 표준화 방법으로 처리하여 신뢰도를 확보할 수 있다. 따라서, 검사를 위한 관심 시료는 MALDI-TOF 및 x수의 조사로 처리될 수 있다. 얻어진 스펙트럼이 관심분자에 상응하는 공지된 지점에서의 피크의 강도가 기준 스펙트럼에서 피크의 강도보다 더 적었다는 것을 시현하면, 시료에서 관심분자의 농도가 기준 스펙트럼의 생성에 사용되는 시료에서 분자의 농도보다 더 적다. 이 접근법은 동시에 다중 분석을 위해 사용될 수 있다. 또한, 다중 참조 스펙트럼은 x회 조사에서 공지된 농도의 범위를 넘어 관심분자를 위해 얻어질 수 있고, 시험 스펙트럼(test spectrum)은 참조 스펙트럼과 비교하여 시험 시료에서 관심분자의 대략적인 농도를 결정할 수 있다. 이 방법은 많은 목적, 예를 들면, 운동선수 등을 위한 약물 검사, 대사산물 농도의 검사, 환경 시료 검사 등을 위해 사용될 수 있다. 관심분자는 대략 1K달톤 내지 50K달톤의 질량 범위 내에서 단백질, 예를 들면, 대사산물, 암항원(CA) 125, 전립선-특이 항원(PSA), C-반응성 단백질 등일 수 있다.
도 16d는 심층MALDI 접근법에서 시현되는 스펙트럼에서 거대한 동적 범위의 도면이다. 도 16d의 삽입도는 스펙트럼을 나타내는 m/z 범위 7140kDa~7890kDa 내에 스펙트럼의 일부 및 약 ~500,000회 조사에서 얻어지는 다수의 피크(10)이다. 배경 견적(background estimate)(단속선)은 스펙트럼에 중첩되고, 배경 공제 스펙트럼(background subtracted spectrum)을 생성하도록 공제될 수 있다. 삽입도에서의 스펙트럼 및 특히 많은 피크(10)가 도 16d의 주요 일부에서 가시적이지 않다는 것을 주목한다. 도 16e에서, 스펙트럼은 전형적 ~1,000회 조사 스펙트럼에서 가시적이지 않지만 심층MALDI 방법에 의해 시현되는 9520 주변 m/z의 영역에서 피크에 대한 추가적인 스펙트럼 정보 및 특히 강도 정보를 나타내기 위해 증폭된 Y축으로 삽입도에 나타낸다.
도 16a는 직사각형 어레이에 배열된 384 시료 점적 또는 "점적"을 포함하는 MALDI-TOF 표적 플레이트의 평면도이다. 점적은 열번호 1 . . . 24 및 행 A . . . P에 의해 동정되고, 예를 들면, 좌측상단 점적을 A1으로서 동정한다. 도 16b는 X/Y 위치 좌표 및 점적의 중앙에서의 원점(0,0)을 갖는 5X5 직사각형 격자로 분활되어 나타내는 개별적인 시료 점적 P1의 확대도이다. 직사각형 격자 및 위치 좌표는 자동화된 래스터 스캔 접근법에서 사용되어 본 명세서에 상세히 기재되는 바와 같이 점적으로부터 100,000회 조사 이상으로부터 스펙트럼을 획득한다.
많은 조사(>20,000)의 자동화된 생성은 절대적으로 필수적인 것은 아니고, 일반적으로 입수가능한 MALDI-TOF 기기에서의 기존의 특징을 사용할 수 있다는 것을 처음에 주목하였다. 일반적으로, 종래의 심층MALDI 기술에서, 레이저 조사에 노출되었을 때 높은 단백질 산출을 생성하는 MALDI 점적 상에 위치를 선택하는 것이 중요하다. 기존의 질량 분광 기기에서 표준 소프트웨어는 규칙적인 미리 규정된 경로, 즉 정사각형 패턴, 육각형 패턴, 나선형 패턴(점적의 중앙으로부터)을 사용하여 점적 위로 이동을 가능하게 한다. MALDI 플레이트 상에 조사 위치는 브루커사제의 기존의 MALDI-TOF 기기에서 FlexControlTM(브루커(Bruker)) 질량 분광 제어 소프트웨어의 일부인 "티칭(teaching)"이라고 하는 공정에서 규정된다(본 명세서에서 브루커사제 기기의 특징을 가끔 언급하지만, 본 발명의 방법은 물론 임의의 특정 기기 또는 특정 제조자의 기기에 한정되는 것은 아니다.)
점적 내에 고르게 분배된 시료/매트릭스 혼합물을 포함하는 MALDI 점적의 예는 도 18에 나타내어진다. 브루커사제 질량 분광 기기는 MALDI 점적의 영역을 보고; 수동 선택에서 밝은 위치(30)를 골라서 레이저를 조준할 수 있는 내부설비된 카메라를 포함한다. 어두운 위치(32)를 피할 수 있다. 가끔 밝은 위치는 양호한 산출을 생성하지 않고, 염 결정체의 존재에 관련될 수 있다. 발사 공정 동안에, 점적 내의 영역은 격감될 수 있고; 따라서 어두운 영역(적은 산출로 격감된 영역)은 피할 필요가 있다. 수동 접근법은 발사 과정 동안에 점적의 화상을 획득하고 표시하는 것을 계속할 수 있다.
사전 실험의 진행에서, 더욱더 조사를 사용함에 따라 양호한 위치를 찾는 것이 점점 어려워진다는 것을 발견하였다. 또한, 이 효과는 예를 들면, 전반 백만회 조사를 한 후에 후반 백만회 조사를 추가하여 동일 점적을 반복적으로 사용할 때 나타났다. 제 2 운행이 기대한만큼 질량 스펙트럼에서 노이즈 수준의 감소가 야기되는 것은 아니다. 실제로, 얻어진 평균화된 스펙트럼은 너무 많이 비어있는 위치로부터 조사를 평균화하는 것에서 아마 발생하여 전반적인 질이 나쁠 수 있다. 이것은 일시적 스펙트럼 여과를 사용하지 않고 눈만을 사용하여 조사 위치를 선택하고 및 스펙트럼을 수용 또는 거부하면 조기 위치를 향하여 획득 성향(bias)에서 초래될 수 있고, 이러한 성향은 제어될 필요가 있다. 자동화된 래스터 스캔 및 위치 스펙트럼 여과를 사용하면 이 성향이 제거된다.
그러나, 처리량을 증가시키기 위해, 위치 선택의 공정을 자동화하고 부여된 점적으로부터 많은 수의 조사를 얻는 것이 바람직하다. 여러 방법을 하기 섹션에서 기재한다. 이하 기재된 방법은 혈청의 3마이크로리터의 시료 요구조건에 의해 MALDI 플레이트에서 3개 점적(점적당 250,000회 조사) 상에 위치된 시료로부터 750,000회 조사를 13-15분 내에 획득할 수 있다.
스펙트럼 수집의 자동화
점적당 100,000 또는 500,000회 조사를 산출하도록 다중 조사를 위해 MALDI 플레이트 상에 부여된 점적 내의 위치를 시각적으로 선택하는 노동 집약적인 수동 공정을 사용하여 결과를 얻었고, 이 접근법으로 진행하는 것이 가능한 반면, 레이저 조사에 대해 위치를 선택하는 공정의 자동화가 가능하고, 여러 방법을 이 명세서에 기재한다. 획득의 자동화는 래스터 방식으로 점적의 레이저 스캔의 최적 이동 패턴을 규정하는 것을 포함할 수 있고, 별개의 X/Y에서 다중 래스터 스캔에 대한 시퀀스의 생성이 점적 내에 위치하여 시료 점적으로부터 예를 들면, 100,000, 250,000 또는 500,000회 조사를 야기한다. 하나의 자동화 방법은 시료 점적의 비근접한 X/Y 래스터 스캔에 대한 래스터 파일의 생성을 포함한다. 일반적으로 바로 인접한 점적 위치에 연속적으로 발사하는 것은 바람직하지 않기 때문에 래스터 패턴 디자인이 중요하다. 따라서 래스터 패턴 디자인은 일부 공간적으로 분리된 조사 위치를 연속적으로 선택하고, 공간적으로 변화된 방법으로 전반적인 MALDI 점적에 걸쳐 스캔을 반복하여 점적에서 바로 인접한 위치의 순차적인 발사를 피하고, 신규한 조사 위치를 선택한다.
또 다른 방법은 점적을 하위-점적의 격자(예를 들면, 3X3 또는 5X5 격자)로 분할하는 것(도 17b 참조) 및 하위-점적의 별개의 X/Y 위치에서 래스터 스캔에 대해 래스터 스캔 파일을 생성하는 것을 포함한다.
스펙트럼 획득(다중 조사)을 위한 비교적 높은 농도의 시료 재료를 포함하는 관심의 영역들 및/또는 시료(예를 들면, 단백질) 농도가 비교적 낮은 그 영역들을 동정하는 화상 분석 기술을 사용하고, 비교적 낮은 시료(예를 들면, 단백질) 농도의 영역에서 스펙트럼 획득을 피하는 또 다른 방법을 개시한다.
A. 비근접한 X-Y 좌표의 래스터 스캔
점적으로부터 많은 조사를 얻는 공정의 자동화의 한 방법은 시료 점적의 비근접한 X/Y 래스터 스캔에 대한 래스터 파일의 생성을 포함한다. 이것을 도 19 및 도 20과 함께 기재할 것이다.
도 19는 도 18의 점적(14)으로부터 100,000회 조사 이상을 얻을 시 사용하기 위한 래스터 스캔 패턴(500)의 도면이다. 점적(14)을 순차적인 방식으로 복수회, 예를 들면, 25회 래스터 스캔한다. 도 19에 보여지는 심볼 세트(502)는 단일 래스터 스캔에서 점적을 스캔하는(점적) 개별적인, 별개의 X/Y 위치를 묘사한다. 중앙(지점 0,0)에 원점을 갖는 도면에 보여지는 좌표 시스템에 따라 X/Y 위치를 규정한다. 스캔 중에, 레이저를 각 위치에 지향시킬 때, 저 위치에서의 시료를 매우 많은 조사, 예를 들면, 지점/위치당 700 또는 800회 조사로 처리할 수 있다. 각각의 래스터 스캔은 점적 내의 개별적인, 별개의 위치에 발사하는 것을 포함한다는 것을 도 19에서 보여지는 패턴으로부터 주목할 것이다. 개별적인 래스터 스캔을 연속적으로 시행함으로써 점적에서 바로 인접한 위치에서 발사하는 것을 피한다. 도 20은 도 18의 점적 위에 도 19의 래스터 패턴의 중첩을 나타낸다.
도 19에서 보여지는 바와 같이 래스터 스캔을 위해 비근접한 X/Y 좌표를 가지고 25 래스터 파일의 생성을 위한 절차는 2012년 5월 29일 출원된 미국 가출원 61/652,394의 부록에 기재되어 있고, 관심있는 독자는 그 명세서를 추가로 참조한다.
B. 점적을 하위-점적으로 나누도록 격자의 사용 및 하위-점적의 래스터 스캔
이 방법의 목적은 데이터 획득 중에 "허용가능한" 스펙트럼을 초래하는 시료 점적(즉 점적 A1, 점적 A2 등) 상에 위치/래스터를 수동적으로 선택하는 공정을 자동화하는 것이고, 수십만 스펙트럼을 합계 버퍼(sum buffer)에 추가할 때까지 이것을 하는 것이다. 수십만 스펙트럼 합계/평균화는 신호 대 노이즈비를 증가시키므로, 이전에 기재된 바와 같이 현저히 더 많은 피크의 검출을 가능하게 한다.
상기한 비근접한 래스터 스캔의 경우에서와 같이, 이 섹션에 기술된 것처럼 격자의 사용은 시료/매트릭스 혼합물을 도 18에 나타내는 바와 같이 대체로 고르고 균질하게 전반적인 점적에 걸쳐 분비할 때 잘 작동한다. 현재 이를 달성하기 위한 바람직한 방법을 희석-및-발사 혈청 및 시나피닉산(매트릭스)에 대하여 이 명세서 후반에 기재한다. 그러므로, 심지어 이 분포 때문에, 스펙트럼을 시료 점적 상에 사실상 모든 위치/래스터로부터 획득할 수 있고, "허용가능한" 스펙트럼을 위해 모든 위치/래스터의 선구적 평가에 대한 필요성을 제거한다.
시료 점적에 대한 수십만 스펙트럼을 수집하는 것은 점적(14)을 하위-점적 또는 격자 요소(18)로 세분하고, 시료 점적을 덮은 격자(도 17b)를 규정하고, 스펙트럼의 원하는 수를 합계 버퍼에 추가할 때까지 각각의 하위-점적(18) 내에 각각의 위치/격자점/래스터로부터 스펙트럼의 규정된 수를 수집함으로써 달성될 수 있다. 브루커 소프트웨어의 이전 버전은 자동모드에서 시료 점적당 최대 20,000 전체 스펙트럼의 합계만을 가능하게 하였다(도 21).
이런 한계를 면하기 위해, 각각의 시료 점적을 스물다섯 8×8 격자 또는 하위-점적(18)(도 17b)으로 분할하는 5×5 격자 영역(도 17b, 16)을 처음으로 규정하였다. 분리된 래스터 파일을 각각의 격자 또는 하위-점적(18)에 대해 생성한다. 기기는 20,000 스펙트럼을(스펙트럼)합계 버퍼에 추가할 때까지 격자(18) 내에 각각의 위치/래스터에서 800 스펙트럼(조사)을 획득하도록 지시되었다. 그때에, 자동화 방법 1은 다음 격자 또는 하위-점적(18)으로 이동하고 다음 래스터 파일을 사용하도록 기기에 지시하고, 또 다른 20,000 스펙트럼을 생성할 것이다. 실제로, 하나는 25 래스터 파일, 각각의 하위-점적(18)에 대한 하나, 방법 내에서 제공되는 평가 기준에 따라 데이터를 획득하는 독립된 autoExecuteTM(브루커) 방법에 부착되는 각각을 고안한다.
이 절차는 촬상 응용 예컨대 flexImagingTM(브루커)를 사용해야 하는 것 없이 브루커의 flexcontrolTM 소프트웨어 툴을 각각 사용한 20,000회 조사의 묶음에서 500,000회 조사 스펙트럼(격자x25격자당 20,000회 조사 스펙트럼)의 획득을 허용한다. 이 절차의 결과는 20,000회 조사 스펙트럼으로 구성된 하나의 합쳐진 스펙트럼을 각각 포함하는 하나의 시료 점적을 위한 25 스펙트럼 파일이다. 따라서, 이들 25 스펙트럼 파일을 합쳐서, 예를 들면, 도 16c, 도 16d 및 도 16e에 나타내어진 바와 같이 500,000회 조사로부터 얻어진 MALDI 플레이트 상에 단일 점적을 위한 전체 스펙트럼을 생성할 수 있다.
Flexcontrol TM(브루커)의 가장 최신 버전은 500,000회 조사만큼으로부터 합쳐진 스펙트럼을 축적하도록 한다. 예를 들면, 도 21에서 autoExecuteTM(브루커) 메소드 편집은 800회 조사 단계(위치/래스터당 800회 조사)에서 20,000회 조사의 합계를 허용한다.
그러나, 그것이 시료 점적당 하나의 합쳐진 스펙트럼(x 일시적 스펙트럼의 합)만을 수집할 수 있다. 단일 시료 점적으로부터 합쳐진 스펙트럼의 여러 묶음을 획득하기 위해, 기존의 기존의 MS 기기에서 소프트웨어 특징을 조정해야 했다. 이들 조정에 의해, 격자, 예컨대 상기한 것을 형성하고 각각의 일시적 또는 위치 스펙트럼을 개별적으로 저장하는 하나 또는 여러 래스터로부터 스펙트럼을 획득할 수 있다. 예를 들면, 합계 버퍼에 추가해야 하지 않고 도17b에서의 격자 또는 하위-점적(18)에서 각각의 래스터(x,y 지점)에서 획득된 각각의 800회 조사 위치 스펙트럼을 수집하고 저장하도록 기기에 지시할 수 있다. 동일한 공정을 시료 점적 A1, A2, A3 등 내에서 모든 하위-점적에 대해 반복한다(예를 들면 800회 조사 스펙트럼을 시료 점적당 250 래스터=시료 점적당 200,000회 조사로부터 획득할 수 있다). 위치 스펙트럼은 autoExecute TM(브루커)에서 스펙트럼 여과를 적용하거나 또는 하지 않고 획득될 수 있다.
C. 화상 분석
스펙트럼 획득의 자동화에 대한 하나의 옵션은 특히 시료가 별개의 영역에 집중되어 있는 것 대신에 점적 위로 공간적으로 고르게 분배되지 않은 상황에서 높은 단백질 산출량/높은 시료 농도로 점적 상에 공간적 위치를 동정하는 화상 공정 기술이다. 하나의 가능한 실시형태에서, 기기에 포함된 카메라는 트레이닝 점적(training spot)의 광학상을 획득하는데 사용된다. 그리고나서, 질량 스펙트럼은 트레이닝 점적에 대해 래스터의 위치로부터 획득된다. 얻어진 질량 스펙트럼은 점적의 광학상과 조합하여 사용되어, 광학상으로부터, 부여된 시료 제조로부터 제조된 추가적인 점적의 높은 산출 위치를 검출하도록 분류 기법을 생성한다. 그후, 이 분류는 실제 시료 점적에 적용될 수 있다. 이것은 명확한 해결인 반면, 카메라 화상으로부터 레이저 조사 위치까지 카메라 이송(feed), 및 위치의 반복가능한 눈금을 캡처하는 사안에 부닥쳤다.
대체적인 방법은 질량 스펙트럼 촬상 접근법의 형태로 직접적으로 질량 분광기를 사용하여 점적을 측정하는 것이다. 방안은 사전의 스캔을 우선 운행하고, 점적 상에 미세한 스케일(정사각형) 패턴의 각각의 위치에서 적은 조사(12개)를 발사하는 것이다. 이들 래스터 위치에 대해 각각 스펙트럼을 수집하고, 총 이온 전류, 또는 m/z가 일부 소정의 범위 내인 이온 전류를 각각의 위치에 대해 기록할 것이다. 신규한 래스터 파일을 사전의 스캔 운행으로부터 N 가장 높은 강도 위치에 의거하여 생성할 것이고, 질량 스펙트럼의 마지막 획득에 사용된다. 이 접근법은 실현가능한 해결책으로서 브루커 FlexImagingTM 소프트웨어를 활용하여, 질량 분광 촬상 운행에서 다중 스펙트럼을 생성한다. 소프트웨어는 이들 스펙트럼을 분석하고, 마지막 래스터 스캔 패턴을 생성한다. 이 방법이 매트릭스로서 시나피닉산을 사용하는 표준 희석 및 발사 공정에 유용할 수 있을 것이지만, 다른 매트릭스들 및 미리 분획된 시료 세트들(예를 들면, CLCCA, Leszyk, J.D. 신규한 MALDI 매트릭스 4-클로로-a-시아노신남산의 평가, J. Biomolecular Techniques, 21:81-91(2010) 참조), 및 NOG 침전과 같은 다른 방법들(문헌[Zhang N. 등, 단백질 분해에 대한 통상의 계면활성제의 효과들 및 2층 시료 제조를 사용하여 분해된 펩티드의 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광 분석. Rapid Commun. Mass Spectrom. 18:889-896(2004)])에 대해 차선일 수 있다. 이 대체적인 방법의 중요한 양성은 너무 큰 파일을 생성하지 않기 위해서 MS 촬상 부분에서 획득 설정을 발견하는 것이다. 표준 획득 파일은 대략 1메가바이트이고, 400×400 래스터 스캔(400 위치, 위치당 400회 조사)에 대해 16,000 스펙트럼이 발생된다. 이들 스펙트럼에 대한 필요조건은 전혀 부담되지 않고, 총 이온 전류를 추정하는 것만 필요하기 때문에, 낮은 해상도 설정으로 운용할 수 있다. 원자 스펙트럼 획득 설정으로부터 사용가능한 위치의 목록을 직접적으로 얻는 것, 즉 성공하거나 실패한 획득의 목록을 얻는 것이 가능할 것이다. 본원의 측정으로부터, 일부 MS 촬상 패키지로서 질량 여과를 사용하여 특정 기준을 통과하는 위치(파일 목록을 통해 인지됨)의 목록을 발생하는 것이 가능할 수 있다는 것을 나타낸다. 이것은 원본 작업흐름의 생성에 매우 유용할 것이지만, 반수동 공정을 회피하도록 특정 소프트웨어를 통해 최적화할 필요가 있을 것이다.
도 22는 매트릭스로서 CLCCA를 사용하여 MALDI 점적의 영역을 보여주고, 여기서 높은 산출 영역이 선형구조로 이루어지고 낮은 산출 영역은 어두운 영역으로서 보여진다. 이들 경우에 대해서, 도 20에 나타내는 바와 같이, 매트릭스 시료가 매우 고르게 결정화되는 화상 분석 접근법이 가장 합리적으로 보인다. 화상 분석은 비교적 높은 산출 영역(120, 122)을 동정한다. 비교적 낮은 산출 영역, 예컨대 하단좌측에 영역(124) 및 매트릭스 영역(126)을 화상 분석 소프트웨어에 의해 동정하고 발사 중에 무시한다.
점적 상에서 높은 및 낮은 산출 영역을 동정하기 위한 화상 분석 소프트웨어는 다양한 형태를 가질 수 있고, 본 기술분야에 숙련된 자에 의해 개발될 수 있다. 예를 들면, 점적의 흑백 화상(도 19)은 0은 흑색이고(신호 없음) 255는 백색인(포화된) 8비트의 양자화값을 각각 갖는 다수의 픽셀로 이루어진다. 여과는 픽셀값이 "높은 산출"로서 동정되는 바람직하게는 100초과인 픽셀을 동정함으로써 비교적 높은 산출의 영역을 동정하는데 사용되고, 픽셀값이 비교적 "낮은 산출"로서 동정되는 40 미만인 픽셀을 동정하는데 사용될 수 있다. 그후, 상응하는 픽셀이 100 이상의 값을 갖는 그 시료 점적의 영역들에 스캔을 진행한다. 또한, 픽셀값이 240-255인 점적 위치를 여과하는 것이 가능할 수 있는데, 이러한 영역은 염 결정체 또는 낮은 산출을 야기하는 다른 특성을 갖도록 결정될 수 있기 때문이다. 도 22에 재차 나타내는 바와 같이, 결정구조(120, 122)에 대한 픽셀은 픽셀값이 100-240의 범위 내이므로, 흑색 영역(124 및 126)이 없어도 스캔될 수 있다. 또한, 형태론적 공정 기술은 구조, 예컨대 도 22의 결정체(120)를 동정하는데 사용될 수 있다. 화상 분석 소프트웨어는 형태론적 공정 및 여과를 모두 포함하여 스캔하는 영역을 결정할 수 있다. 추가적으로, 점적은 스캔 과정 동안에 변화할 수 있고(시료의 소모로 인해), 화상 공정은 스캔 동안에 운행되어 점적 및 발사 중에 회피되는 낮은 시료 농도의 그 위치들로부터 100,000회 조사 이상을 생성하는 과정을 거쳐 발사를 최적화할 수 있다.
도 23은 기기 워크스테이션(130)의 표시를 보여주고, 점적(14), 이 경우에서 플레이트의 점적 F17의 화상(132)을 포함하는 MALDI-TOF 기기로부터의 스크린샷이다. 점적 F17이 14°에서 나타내어지는 상태에서 플레이트의 레이아웃은 12°에서 나타내어진다. 상기한 화상 분석 방법을 사용하여 자동모드로 운행되기 위해 점적(134)(D9 내지 F20)의 군을 선택한다.
도 24는 기기로부터의 또 다른 스크린샷이다. 흐름 기기는 사용자가 일시적 스펙트럼(평가 탭을 사용하는)을 수용 또는 거부하도록 평가 영역을 설정하고, 얼마나 많은 스펙트럼을 점적당 축적(축적 탭을 사용하는)에 설정하며, 레이저가 특정 패턴(보여지는 "이동(movement)" 탭을 사용하는)에서 발사될 수 있도록 점적을 가로질러 "이동(move)"하도록 한다. 옵션은 패턴, 예를 들면, 육각형 또는 나선형에서 무작위적 보행(walk) 또는 이동을 포함한다. 또한, 소프트웨어는 사용자가 레이저의 발사를 지속하고, 획득하며, 스펙트럼이 750 조사 위치로부터 수집되는 동안에 이러한 파라미터에 따라 총 스펙트럼에 추가하고 나서, 다음 조사 위치로 이동하도록 한다. 사용자는 조사 위치를 실패한 점적로 여겨지기 전에 시도의 수를 설정할 수 있다. 낮은 신출의 적당한 영역을 동정하고, 회피된 그들 영역에 발사하는 화상 분석 방법은 그들 실패한 판단을 상당히 감소 또는 제거에 도움을 준다.
도 25는 150에 나타내는 바와 같이, 일시적 스펙트럼을 수용 또는 거부하기 위한 질량 범위를 선택하는 평가 페이지(evaluation page)를 나타낸다. 획득 중에, 소정의 범위-이 경우에서는 5,000 내지 18,000Da 내에서 일시적 스펙트럼이 피크를 갖지 않으면, 그는 역치 설정을 통과하고 나서(해상도, 신호 강도 또는 다른 요소들에 의거하여), 제거될 것이다. 즉, 일시적 스펙트럼은 위치 스펙트럼(모든 회 조사로부터의 스펙트럼을 합한다)을 형성하기 위해 합계 버퍼에 추가되지 않을 것이다.
도 26은 평가에 포함되는 원치 않는 특정 피크가 있으면 예외 리스트를 만들고 이들 피크를 "배경 피크(background peaks)"로서 태크를 붙일 수 있는 평가 페이지를 나타낸다. 소프트웨어는 배경 피크를 규정하는 매트릭스에 대한 소정의 "제어 리스트(control lists)"를 갖는다. 그것이 피크 리스트를 불러올 수 있다.
다중 점적으로부터 스펙트럼의 수집
일반적으로, 다중 점적으로부터 스펙트럼을 조합하는 것에 심층MALDI 기술을 확장할 수 있다. 예를 들면, 표준 MALDI 플레이트 상에 각각의 점적 A1, A2, A3, A4 및 A5으로부터 시료의 500,000회 조사를 얻을 수 있고(도 17a 참조), 얻어진 스펙트럼을 2,500,000 스펙트럼(조사)의 합으로 이루어진 하나의 전체 스펙트럼으로 조합(합)할 수 있다. 선험적으로, 다중 점적으로부터 스펙트럼을 조합할 수 없어서 극대로 많은 조사, 즉, 1억회 조사를 각각 초래할 수 있는 100점적x1백만회 조사에 도달할 수 있다고 여겨질 이유가 없다. 이 절차, 예를 들면, 레이저가 너무 빈번히 실패할 수 있는 것에 실질적 한계가 있을 수 있다.
심층 MALDI에서 다중 점적으로부터의 스펙트럼의 수집의 실시예
이 방법의 일 실시예에서, 이전에 기재된 기술을 사용하는 다중 점적을 스캔하기 위해 수동 또는 자동으로 발생된 래스터를 사용하여, MALDI 플레이트 상에 동일한 혈청의 다중 점적에서 5백만회 조사로부터 스펙트럼을 수집하는 것이 가능하다. 이 방법에서, MALDI 플레이트 상에 단일 시료의 균질 점적을 재현으로 얻는 것이 바람직하다. 단일 시료 이는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
1. MALDI 표적 플레이트 상의 희석된 혈청을 점적하기.
절차:
HPLC등급수와 혈청을 1:10 희석하고, 와류발생시킨다. 0.5ml 미량원심관 튜브에서 매트릭스(50%ACN/0.1%TFA 중의 시나피닉산 20mg/ml)와 시료를 1:1(v/v) 혼합하고 와류발생시킨다. MALDI 표적에 하나 이상의 점적 상에 매트릭스/시료 혼합물의 4㎕를 점적한다.
MALDI 플레이트에서 36개 점적(위치)을 이 실시예에 사용하였다:
튜브 1: MALDI 플레이트의 위치 E13, E14, 및 E15에 점적(도 2A 참조)
튜브 2: 위치 E16, E17, 및 E18에 점적
튜브 3: 위치 E19, E20, 및 E21에 점적
튜브 4: 위치 E22, E23, 및 E24에 점적
튜브 5: 위치 F1, F2, 및 F3에 점적
튜브 6: 위치 F4, F5, 및 F6 에 점적
튜브 7: 위치 F7, F8, 및 F9에 점적
튜브 8: 위치 F10, F11, 및 F12에 점적
튜브 9: 위치 F13, F14, 및 F15에 점적
튜브 10: 위치 F16, F17, 및 F18에 점적
튜브 11: 위치 F19, F20, 및 F21에 점적
튜브 12: 위치 F22, F23, 및 F24에 점적
시료 점적 E13 내지 F18(튜브 1-10)은 동일한 피펫팁을 3회 사용하여(각 튜브에 15㎕ 중 3x4㎕) 와류발생시킨 후 직접적으로 적용되는 반면에; 마지막 6개 시료 점적 F19-F24(튜브 11 및 튜브 12)는 점적E13-F18에서와 같이 적용되지만, 플레이트 상에서 상하로 피펫팅하였다.
MALDI 플레이트 상의 점적은 벤치-탑에 표적 플레이트를 배치함으로써 주위 온도에서 건조시켰다.
결과:
점적 E13 내지 F17(플레이트 상에서의 추가로 혼합없이 플레이트에 직접적으로 적용함)에 대해 각 튜브로부터 제 3 점적은 제 1 점적 2개보다 더 명확히 균질하였다. 균질성은 시각적으로 평가되었다: 튜브 4로부터 3개의 점적 중 제 2 점적인 E23의 예외로 제 3 점적이 가장 균질하고, 제 2 점적이 2번째로 균질하고, 제 1 점적이 가장 덜 균질하였지만, 제 2 점적보다 더욱 각각의 튜브로부터 제 3 점적할 것 같았다.
튜브에서 보텍스함으로써 혼합되고, 플레이트 상에서 상하로 피펫팅한 시료 점적 F18, F19, F20, F21, F23 및 F24는 꽤 유사하고, E13~F17 세트에서 제 3 점적과 동일한 균일 외형을 갖는다. F22는 E23과 동일해보였다.
2. 5백만회 조사로부터 스펙트럼의 획득
점적당 대략 312,500회 조사로부터의 질량 스펙트럼 데이터는 상기 절차를 수행한 후 16개의 MALDI 점적으로부터 얻어졌다:
E15, E18, E21, E23, E24, F3, F6, F9, F12, F15, F18, F19, F20, F21, F23 및 F24.
상기에 기재된 바와 같이 제기된 래스터 스캔 파일을 사용하여, 각각의 점적으로부터 스펙트럼을 더하여 대략 5,000,000회 조사로부터 얻어진 시료의 전체 스펙트럼을 생성하였다.
MALDI 플레이트에 시료 적용의 최적화(점적)
MALDI 플레이트에의 시료 적용을 최적화하여 MALDI 플레이트 상에 각각의 시료 점적에 결정화된 시료의 균질성 및 고른 분포를 제공하고, 도 15에 실시예를 나타낸다. 여러 실험들을 이하 기재된 바와 같이 수행하여 MALDI 플레이트 상에 점적에 시료 혼합물을 제공하기 위해 최적의 절차를 발견하였다("점적"). 이들 실험을 이 섹션에 기재한다.
처음에, 혈청으로 여러 상이한 제조물을 제조하였다. 매트릭스의 2㎕를 다르게 명시되지 않는 한, 점적하였다. 희석된 시료 및 매트릭스 매체를 다르게 명시되지 않는 한, 시료 제조 튜브에서 혼합하였다. 시료 제조 튜브 중에서 다중 분취량을 취하는 것은 결정화에 영향을 미치기 때문에 다르게 특정되지 않는 한, 단일 제조 튜브로부터 1점적을 초과하여 점적하지 않았다.
균질 점적을 생성하는 강철 바닥 플레이트 실험을 행하였다. 절차는 이하와 같다:
1. 시료를 1:10(시료 2㎕+물 18㎕) 희석하고 나서, 50%ACN/0.1%TFA 중의 매트릭스(시나피닉산 25mg/ml)와 1:1(v/v)로 혼합하고, 매트릭스의 2㎕를 점적하였다. 이 절차는 양호한, 균질 결정체를 생성하지 못하였다.
2. 매트릭스 팁을 프라이밍하였다. 매트릭스의 2㎕를 점적팁 내로 피펫팅하고 30초간 정치시켰다. 시료를 1:10(시료 2㎕+물 18㎕)로 희석하고 나서, 50%ACN/0.1%TFA 중의 매트릭스(시나피닉산 25mg/ml)와 1:1(v/v) 혼합하였다. 피펫팁으로부터 과도한 매트릭스를 토출하였다. 시료 매트릭스 혼합물에 피펫팁을 배치하고 3회 상하로 피펫팅하였다. 팁을 교환하지 않고 시료 매트릭스 혼합물의 2㎕를 점적하였다. 이 절차는 균질하고 양호한 결정체를 형성하였다. 이것은 강철 바닥 플레이트이기 때문에 시료 매트릭스 혼합물은 연마된 강철 플레이트 상에서 만큼 퍼지지 않는다. 피펫팁에 잔존하는 건조된 결정체는 추가적인 결정체 형성을 위한 시드로서 작용함으로써 결정화를 개선할 수 있다.
3. 결정화에 대한 온도의 효과를 연구하였다. 시료를 1:10(시료 2㎕+물 18㎕)로 희석하고 나서, 50%ACN/0.1%TFA 중의 매트릭스(시나피닉산 25mg/ml)과 1:1(v/v)로 혼합하였다. 시료를 37℃ 수조에서 5분간 둔다. 수조로부터 시료를 제거하고 즉시 점적하였다. 이 절차는 양호하고, 균질한 결정체를 생성하지 못하였다.
4. 상기 실험 2를 반복했지만, 2㎕ 대신에 시료 혼합물의 4㎕를 점적하였다. 이 절차는 균질하고 양호한 결정체를 형성하였다. 4㎕를 점적하는 것은 점적 지름을 완전히 덮었고, 양호한 결정체 및 데이터를 생성한다. 이것이 현재 최적이라 여겨지는 절차이다.
여기서 점적을 위한 절차는 실시예의 방법에 의해 제공되지만, 한정되는 것은 아니며, 개시된 방법으로부터의 변형도 물론 가능하다. 예를 들면, 튜브에서 매트릭스 및 시료 재료를 혼합할 수 있고 점적 전에 수분간 정치시킨다. 더욱 균질한 결정체를 얻을수록 동일한 피펫팁을 사용하여 동일한 튜브로부터 점적을 더욱 형성한다는 것을 주목하였다. 예를 들면, 동일한 팁을 사용하여 동일한 튜브로부터 10개 점적을 점적하고 마지막 5개 정도 점적에서만 데이터를 수집할 수 있거나; 또는 대체적으로 MALDI 플레이트 상에서 점적을 개시하기 전에 튜브로부터 첫 5개 분취량 4㎕를 폐기할 수 있다.
또한, 1에서의 절차를 따르지만 동일한 피펫팁을 사용하여 연마된 강철 표적 플레이트 상에 동일한 시료 튜브를 10회(점적당 2.5㎕) 점적하는 것은 유사한 결과(스펙트럼 질)를 산출한다는 것도 발견하였다.
추가적인 고찰
기술적 재현성
기술적 재현성 연구를 행하여 예를 들면, 매일 100개씩 묶음으로 1,000개 기술적인 복제물을 운영할 수 있다. 특히, 보다 균일한 이온-전류 산출, 예를 들면 시료 희석에서의 변화를 산출하는 제조 방법이 있는지 여부를 봐서 시료(점적) 제조(플레이트 상에서 또는 밖에서)에 대한 의존성을 연구할 수 있다. 또한, 높은-산출 위치의 수가 점적으로부터 점적으로 얼마나 변화하는지, 및 여기서 변화를 얼마나 최소화하는지를 모니터링할 수 있다. 높은 수준의 과립상태에서 모든 획득 및 제조를 모니터링 및 로깅(logging)하는 것을 양호하게 실시한다.
시료 대 시료 재현성
시료 대 시료 재현성의 유사 사안을 시료 대 시료 변화에 대하여 연구할 수 있다. 신규한 현상이 발생할 수 있다: 일부 시료가 단백질 풍부하고, 보다 높은-산출 위치에 의해 점적이 초래될 수 있다. 시료 특성(광학밀도 및 색상)의 일부 방식으로부터 측정값을 얻고, 시료 획득 디바이스(예를 들면, 혈청에 대해)를 표준화하여 보다 재현가능한 절차를 생성하는 것이 가능할 수 있다. 가능한한 대부분의 변화를 다루려는 시도뿐만 아니라 이질적인 원료를 가지고 병용된 시료 세트를 사용할 수 있다. 이러한 세트는 공지된 시료 수집 및 조건에 따라 기존의 세트를 연구하고, 매칭하는 것으로부터 얻어질 수 있고, 기존의 시료 데이터베이스를 잘 사용한다.
민감도
스펙트럼에서 피크를 더 관찰하는 것은 우리가 이 방법에서 볼 수 있는 존재율 범위가 무엇인지, 및 실제적으로 가시적인 단백질 종류가 무엇인지 의문이 야기된다. 이는 복잡한 시료의 MALDI MS에서 '이온 억제(ion suppression)'로 인해 더 낮은 존재율 이온을 관찰할 수 없는 '종래의 지식', 및 더 풍부한 단백질로부터 이온이 덜 풍부한 단백질로부터 이온 신호를 억제하므로, 검출불가능한 덜 풍부한 단백질을 형성하는 견해를 다룬다. 이 견해는 단지 더 낮은 존재율 이온의 관찰 부족에 의거한 것을 나타낸다. 사실, 피크 함량에서의 증가에 대한 본원의 관찰(예를 들면, 도 16c 참조)은 이 해석에 관해 몇몇 의문을 제기한다. 오히려, MALDI MS의(반)분량적 특성((semi)quantitative nature)을 진정으로 취해야 하는 것을 나타낸다. 단백질 존재율이 수십배의 크기로 폭넓은 범위에 걸쳐 있음에 동의하면, 상응하는 질량 스펙트럼이 피크 높이(또는 피크 하의 영역)에서의 거대한 차이를 나타냄으로써 이 행동을 모방할 수 있다. 이온화되지 않았기 때문이 아니고, 낮은 존재율 단백질에 상응하는 피크의 진폭이 매우 낮을 수 있기 때문에 MALDI 스펙트럼에서 낮은 존재율 단백질을 관찰할 것으로 기대될 수 없다. 큰 피크에 집중하도록 질량 분석에서의 통상의 실행이기 때문에, 및 낮은 존재율 피크가 수십배의 크기로 작아질 수 있기 때문에, 이들 피크는 전에 관찰되지 않았다는 것은 놀랍지도 않다. 이것은 이온 억제와 같은 현상이 발생하지 않는다거나, 이온화 개연성이 역할을 하지 않는다고 말하지 않지만, 이들 현상이 전반적으로 낮은-존재율 단백질로부터 유래하는 피크를 억제하지 않고, 스펙트럼의 낮은 세기 영역에서 낮은 존재율 단백질 피크를 찾으면 그들은 실제로 관찰가능하게 된다고 말한다. 그러므로, 혈청 프로테옴의 현저한 백분율을 다루는 추구는 질량 스펙트럼의 동적 범위를 확장하기 위한 추구로서 여겨질 수 있다. 임의의 다른 반대되는 근거되는 기술과 마찬가지로, 이 문제에 대한 간단한 해결책은 검출된 이온의 수(비행시간 저장소(비행시간 bin)당)를 증가시킴으로써 통계를 증가시키는 것이다.
종래의 지식과 반대로 운행하는 이 간단한 해석에서 더 신뢰를 얻기 위해서, 질량 스펙트럼의 동적 범위를 확립하고 그것을 단백질의 존재율에 연결하기를 원할 수 있다. 이것은 민감도 곡선(m/z의 식으로서)을 확립하는 것뿐만 아니라, ELISA와 같은 직교(orthogonal) 기술을 통해 일부 피크에 상응하는 단백질의 동정 및 이들 단백질의 상당한 존재율 측정을 통하여 분석 화학 포인트의 관점으로부터 행해져야 한다.
미리-분획된 시료를 사용
본 개시물의 방법은 시료를 분획하기 위해 침전 방법, 예를 들면 NOG 침전, 탈지(de-lipidifying), 및 다른 등등과 병용하여 사용될 수 있다. 또한, 방법은 CLCCA와 같은 다른 매트릭스를 가지고 사용될 수 있다. 또한, 이들 방법들은 심층MALDI 접근법으로부터 이익을 크게 얻을 수 있는 것이 적당하다. 시료 미리-분획을 사용하는 사전의 데이터가 실로 다른 피크를 본 것을 나타내지만, 피크 함량이 최적은 아니다. 이것은 하나의 목적이 높은 존재율 단백질을 제거함에 따라 기대될 수 있다.
예전에는 소모 및/또는 질량 여과를 사용하도록 시도하여 알부민 및 헤모글로빈과 같은 원치 않는 단백질의 함량을 감소시켰지만, 이들 방법 중 아무것도 전체 제거로 이어지지 않았고, 이들 피크의 나머지는 여전히 가시적이었다. 격감되거나 질량 여과된 시료에 대해 본 명세서에서 기재된 심층MALDI 접근법을 사용하는 것은 큰 피크를 감소하는 것이 더 낮은 존재율 단백질을 관찰할 필요가 있는 동적 범위를 감소시킬 것이기 때문에 더 나은 결과를 산출할 수 있다.
스펙트럼 획득 설정의 합리적 선택을 획득하다
AutoExecuteTM(브루커) 메소드에서, 외부적으로 규정된 역치보다 큰 총 이온 전류를 갖는 그 일시적 스펙트럼들(조사의 <xx>수로부터 발생함)만을 추가하길 원하는 경우에는 어떤 기준을 통과하는 일시적 스펙트럼만을 수집하기 위해서 여과 설정을 규정하는 것이 가능하다. 이것은 간단한 방법으로 가능할 것 같지 보이지 않지만, 유사한 목적에 사용될 수 있는 공정 방법 탭에 여과 기준이 있다. 또는, 이 목적을 위해 조율할 수 있는 피크 평가 방법에서 파라미터가 있을 수 있다. 이것은 조사의 수를 감소하지 않을 것이지만, 조기 조사를 향하여 조사 성향의 문제, 즉 노이즈만으로 이루어진 일과성(transients)을 획득하지 않는 것을 극복할 수 있다. 위치 스펙트럼을 생성하도록 일시적 스펙트럼을 합할 시 자동화된 여과 연산의 사용은 성향의 문제를 회피한다.
점적 크기를 증가시킨다
레이저 조명(illumination)의 크기뿐만 아니라 전-래스터링 단계(pre-rastering 단계)를 위한 최소 격자 크기에서 발생되는 한계에서, 표준 점적에 대해 충분한 이온-산출에 의한 조사 위치가 충분하지 않다는 것이 당연하다. 이것을 다루는 간단한 방법은 점적 크기를 증가시키는 것일 수 있다. FlexImagingTM(브루커) 소프트웨어는 매우 용이하게 이것을 지원할 수 있다. 또한, 이 목적에 적합할 수 있는 MS 촬상 응용에 사용되는 직사각형 점적 영역의 옵션이 있다. 더 큰 점적을 사용하는 것의 추가적인 유익은 유사하게 많은 적절한 조사 위치에 위치할 수 있는지 및 점적으로부터 점적까지 유사한 질의 스펙트럼을 발생하는지 여부를 우려하지 않아도 된다. 시료 볼륨은 사안을 제시하기 위해 나타내지 않는다. 더 큰 점적이 가능하면, 동일한 획득을 위해 많은 수의 조사에 필요할 수 있는 다중 점적을 다룰 수 있는 실행계획을 감소시킬 수 있다.
"심층MALDI" 방법론에 대한 다른 추가적인 고찰은 2012년 5월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 제 61/652,394호에 기재되어 있고, 관심있는 독자는 그 명세서를 참조한다.
본 발명의 효모-기반 면역요법 및 치료 방법
본 개시물의 일 실시형태는 암을 가진 환자에서 종양 세포에 의해 발현되는 암 항원에 대한 치료상 면역반응들을 자극하도록 고안된 효모-기반 면역요법 조성물의 사용을 지향한다. 그 방법은 암 항원을 발현하고, 본 발명 본원에 기재된 바와 같이 임의의 질량 스펙트럼 예측 방법에 따라 수행된 시험에 의해 조성물의 투여로 유익을 얻을 것 같음에 따라 확인 또는 선택되는 암을 가진 대상체에 암(즉, 암 항원을 포함함)에 대해 효모-기반 면역요법 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
보다 상세하게는 하나의 양상에서, 암에 대한 효모-기반 면역요법에 의해 암환자를 치료하는 방법을 기재하고 있다. 방법은:(a) 본 명세서에 기재된 임의의 예측 방법에 따르거나, 및 스펙트럼에 대한 등급 표지이 환자가 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같다는 것을 나타내면 시험을 행하는 단계, 및(b) 암에 대한 효모-기반 면역요법을 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 양상에서, 환자는 추가적으로 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 치료 이전에, 동시에, 또는 이후에, 하나 이상의 추가적인 항암 요법에 의해 처리된다. 일 실시형태에서, 추가적인 항암 요법은 수술(예를 들면, 종양의 외과적 절제술), 화학요법, 방사선요법, 표적화 암 요법(예를 들면, 특이적 표적 분자들이 종양 성장 및 진행에 포함되는 저분자 의약품 또는 단일클론 항체 요법), 및 완화 의료, 또는 그의 임의의 병용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 양상에서, 본 개시물는 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 암환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은 본 발명 본원에 기재된 바와 같이 임의의 예측 방법에 따라 시험에 의해 선택된 암환자에게 암에 대한 효모-기반 면역요법을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 스펙트럼에 대한 등급 표지는 환자가 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같다는 것을 나타낸다. 하나의 양상에서, 환자는 추가적으로 암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 치료 이전에, 동시에, 또는 이후에, 하나 이상의 추가적인 항암 요법으로 처리된다. 일 실시형태에서, 추가적인 항암 요법은 수술(예를 들면, 종양의 외과적 절제술), 화학요법, 방사선요법, 표적화 암 요법(예를 들면, 특이적 표적 분자들이 종양 성장 및 진행에 포함되는 저분자 의약품 또는 단일클론 항체 요법), 및 완화 의료, 또는 그의 임의의 병용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시물의 또 다른 양상에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 암환자를 치료하는 방법을 기재하고 있다. 이 방법은:(a) 상기 기재된 임의의 예측 방법에 따르거나, 및 스펙트럼에 대한 등급 표지이 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같다는 것을 나타내면 시험을 행하는 단계,(b) 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 양상에서, 환자는 추가적으로 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 치료 이전에, 동시에, 또는 이후에, 하나 이상의 추가적인 항암 요법에 의해 처리된다. 일 실시형태에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000으로 공지된 효모-기반 면역요법 제품의 시리즈, 또는 이의 등가물에서의 산물이다. 본 발명의 이 실시형태의 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암은 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암(CRC), 자궁내막암, 난소암, 흑색종 및 다발성 골수종을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 암은 췌장암이다. 일 실시형태에서, 추가적인 항암 요법은 수술(예를 들면, 종양의 외과적 절제술), 화학요법, 방사선요법, 표적화 암 요법(예를 들면, 특이적 표적 분자들이 종양 성장 및 진행에 포함되는 저분자 의약품 또는 단일클론 항체 요법), 및 완화 의료, 또는 그의 임의의 병용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 환자에게 투여한다. 일 실시형태에서, 환자는 췌장암 환자이고 그 요법은 GI-4000으로 공지된 효모-기반 면역요법 제품의 시리즈, 또는 이의 등가물에서의 산물을 단독으로 또는 젬시타빈과 병용하여 포함한다. 하나의 양상에서, 암환자의 종양은 효모-기반 면역요법 조성물에 의한 치료 이전에 외과적으로 절제되어 있다.
본 개시물의 또 다른 양상에서, 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 암환자를 치료하는 방법을 기재한다. 그 방법은 본 발명 본원에 기재된 바와 같이 임의의 예측 방법에 따라 시험에 의해 선택된 암환자에게 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 투여하는 단계를 포함하고 여기서 스펙트럼에 대한 등급 표지는 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같다고 나타낸다.
하나의 양상에서, 환자는 추가적으로 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 치료 이전에, 동시에, 또는 이후에, 하나 이상의 추가적인 항암 요법으로 처리된다. 일 실시형태에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000으로 공지된 효모-기반 면역요법 제품의 시리즈, 또는 이의 등가물에서의 산물, 또는 이의 등가물이다. 본 발명의 이 실시형태의 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암은 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암(CRC), 자궁내막암, 난소암, 흑색종 및 다발성 골수종을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 암은 췌장암이다. 일 실시형태에서, 추가적인 항암 요법은 수술(예를 들면, 종양의 외과적 절제술), 화학요법, 방사선요법, 표적화 암 요법(예를 들면, 특이적 표적 분자들이 종양 성장 및 진행에 포함되는 저분자 의약품 또는 단일클론 항체 요법), 및 완화 의료, 또는 그의 임의의 병용을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 환자에게 투여한다. 일 실시형태에서, 환자는 췌장암 환자이고 요법은 GI-4000으로 공지된 효모-기반 면역요법 제품의 시리즈, 또는 이의 등가물에서의 산물을 단독으로 또는 젬시타빈과 병용하여 포함한다. 하나의 양상에서, 암환자의 종양은 효모-기반 면역요법 조성물에 의한 치료 이전에 외과적으로 절제되어 있다.
본 개시물는 용어 "효모-기반 면역요법"을 사용하고, 관용구는 "효모-기반 면역요법 조성물", "효모-기반 면역요법 제품", "효모-기반 면역요법 조성물", "효모-기반 조성물", "효모-기반 면역요법", "효모-기반 백신", 또는 이들 관용구의 파생어들로 변환가능하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 대로, 효모-기반 면역요법 조성물는 대상체에게 질병 또는 조건을 표적화하는 효모 전달체 성분 및 항원 성분을 포함하는 조성물을 의미한다(즉, 암에 대한 효모-기반 면역요법 조성물은 환자에서 암을 표적화하는 효모 전달체 성분 및 암 항원 성분을 포함한다). 본 발명에 유용한 변이된 Ras 항원을 포함하는 효모-기반 면역요법 조성물은 환자에서 변이된 Ras-양성 종양을 표적화한다. 이 조성물은 "효모-Ras 면역요법 조성물", 또는 "Ras 항원을 발현하는 효모-기반 면역요법 조성물", 또는 "변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법"이라고 할 수 있다. 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 "GI-4000"으로 공지된 효모-기반 면역요법 제품의 시리즈을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
효모 전달체과 함께, 효모-기반 면역요법 제품에 포함된 암 항원들(예를 들면, 변이된 Ras 항원)은 가장 일반적으로 효모 전달체(예를 들면, 효모 사이토플라스트, 효모 고스트, 또는 효모막 추출물 또는 그 파편에 추가적으로 임의로 처리할 수 있는 무손상 효모 또는 효모 스페로플라스트에 의한)에 의해 재조합 단백질로서 발현되지만, 본 발명의 실시형태 이러한 하나 이상의 암 항원을 효모 전달체 내에 부하하거나 또는 그렇지않으면, 효모 전달체과 복합체화, 부착, 혼합 또는 투여되어 본 발명에 유용한 조성물을 형성한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 본 발명의 하나 이상의 효모-기반 면역요법 조성물에 유용한 항원은 임의의 암 또는 종양-관련 항원을 포함한다. 하나의 양상에서, 항원은 종양발현전 또는 과다형성 상태와 연관된 항원을 포함한다. 또한, 항원은 또는 암의 원인물질과 연관될 수 있다. 이러한 항원은 종양-특이항원, 종양-관련 항원(TAA) 또는 조직-특이항원, 그 에피토프, 또는 그 에피토프 작용제일 수 있다. 암 항원은 흑색종, 편평세포암종, 유방암, 머리 및 목 상피성암종, 갑상선 상피성암종, 연조직육종, 골육종, 고환암, 전립선암, 난소암, 방광암, 피부암, 뇌암, 혈관육종(angiosarcomas), 혈관육종(hemangiosarcomas), 비만세포 종양, 백혈병, 림프종, 원발성 간암, 폐암, 췌장암, 위장암(대장암 포함), 신장세포 상피성암종, 조혈 종양(hematopoietic neoplasias) 및 그 전이성 암을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 종양 또는 암으로부터의 항원을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
적합한 암 항원은 변이된 Ras 종양단백질(예를 들면, 미국 특허 제 7,465,454 및 7,563,447 참조), 암종배아 항원(CEA) 및 그 에피토프, 예컨대 CAP-1, CAP-1-6D(GenBank Accession No. M29540 또는 Zaremba 외., 1997, Cancer Research 57:4570-4577), MART-1(Kawakami 외, J. Exp. Med. 180:347-352, 1994), MAGE-1(미국 특허 제 5,750,395), MAGE-3, GAGE(미국 특허 제 5,648,226), GP-100(Kawakami 외., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 91:6458-6462, 1992), MUC-1(예를 들면, Jerome 외., J. Immunol., 151:1654-1662(1993)), MUC-2, 정상 및 변이된 p53 종양단백질(Hollstein 외 Nucleic Acids Res. 22:3551-3555, 1994), PSMA(전립선 특이 막 항원; Israeli 외., 암 Res. 53:227-230, 1993), 티로시나아제(Kwon 외 PNAS 84:7473-7477, 1987), TRP-1(gp75)(Cohen 외 Nucleic Acid Res. 18:2807-2808, 1990; 미국 특허 제 5,840,839호), NY-ESO-1(Chen 외 PNAS 94: 1914-1918, 1997), TRP-2(Jackson 외., EMBOJ, 11:527-535, 1992), TAG72, KSA, CA-125, PSA(전립선 특이항원; Xue 외., The Prostate, 30:73-78(1997)), HER-2/neu/c-erb/B2,(미국 특허 제 5,550,214호), EGFR(표피 성장 인자 수용체; Harris 외., Breast Cancer Res. Treat, 29:1-2(1994)), hTERT, p73, B-RAF(B-Raf 원발암유전자 세린/트레오닌-단백질 키나아제; Sithanandam 외.,(1990), 종양유전자 5(12):1775?80), 선종성 결장폴립증(APC), Myc, von Hippel-Lindau 단백질(VHL), Rb-1, Rb-2, 안드로겐 수용체(AR), Smad4, MDR1(또한 P-글리코단백질로 공지된), Flt-3, BRCA-1(유방암 1; 미국 특허 제 5,747,282), BRCA-2(유방암 2; 미국 특허 제 5,747,282)), Bcr-Abl, pax3-fkhr, ews-fli-1, 단미증(GenBank Accession Nos. NP_003172.1 또는 NM_003181.2; Edwards 외., 1996, Genome Res. 6:226-233), HERV-H(인간 내인성 레트로바이러스 H), HERV-K(인간 내인성 레트로바이러스 K), TWIST(GenBank Accession Nos. NM_000474 및 NP_000465), Mesothelin(Kojima 외., 1995, J. Biol. Chem. 270(37):21984?90; Chang 및 Pastan, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93(1):136?40), NGEP(New Gene Expressed in Prostate; Bera 외., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(9):3059-3064; Cereda 외., 2010, Cancer Immunol. Immunother. 59(1):63-71; GenBank Accession Nos. AAT40139 또는 AAT40140), 이러한 항원 및 조직 특이항원의 변형, 이러한 항원의 스플라이싱 변이체, 및/또는 이러한 항원의 에피토프 작용제를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 그 밖의 암 항원은 본 기술분야에 공지되어 있다. 또한, 다른 암 항원은 본 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 미국 특허 제 4,514,506에 기재된 것들에 의해 확인, 분리 및 복제될 수 있다. 또한, 암 항원은 하나 이상의 성장 인자 및 각각의 스플라이싱 변이체를 포함한다.
본 발명의 하나의 양상에서, 암 항원은 암종배아 항원(CEA), 그 에피토프를 포함하거나 함유하는 폴리펩티드, 예컨대 CAP-1, CAP-1-6D(GenBank Accession No. M29540 또는 Zaremba 외., 1997, 암 Research 57:4570-4577), 변형된 CEA, CEA의 스플라이싱 변이체, 이러한 CEA 단백질의 에피토프 작용제, 및/또는 CEA의 적어도 하나의 면역원 도메인 또는 그 작용제 에피토프를 포함하는 융합 단백질이다. 하나의 양상에서, CEA는 2007년 3월 1일에 공개된 미국 특허 공개 제 2007_0048860호에서 SEQ ID NO:46에 의해 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 변형된 CEA에 상응하는 변형된 CEA이고, 그 공개문에서 SEQ ID NO:45의 핵산서열에 의해 암호화된다.
본 발명의 하나의 양상에서, 효모-기반 면역요법 조성물은 인간 단미증을 표적화한다. 단미증을 표적화하는 단미증 항원 및 효모-기반 면역요법 조성물은 2012년 9월 20일에 공개된 PCT 공개 제 2012/125998호에 기재되어 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 효모-기반 면역요법 조성물은 뮤신-1(MUC-1)을 표적화한다. MUC-1 항원 및 MUC-1을 표적화하는 효모-기반 면역요법 조성물은 2013년 2월 21일에 공개된 PCT 공개 제 2013/025972호에 기재되어 있다.
본 발명의 하나의 양상에서, 효모-기반 면역요법 조성물은 변이된 Ras-양성암을 표적화한다. ras는 여러 돌연변이는 특정 위치에서 발생되는 것으로 알려져 있고 암의 하나 이상의 종류의 발달과 연관되는 종양유전자이다. 그러므로, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법 제품은 특정 암에 변이된 것으로 알려진 아미노산 잔기를 포함하는 Ras의 적어도 하나의 면역원 도메인을 포함한다. 이러한 암은 췌장암, NSCLC, 대장, 자궁내막암 및 난소암뿐만 아니라, 흑색종 및 다발성 골수종을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법 제품은 2개, 3개 이상의 Ras의 면역원 도메인을 포함하고, 여기에 각 도메인은 Ras 단백질에서 발생하는 여러 또는 모든 공지된 돌연변이를 아우르기 위해, 특정 암에서 발생하는 것으로 알려진 하나 이상의 상이한 Ras 돌연변이를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 하나의 양상에서, 효모-기반 면역요법 조성물에 사용되는 Ras 항원은 야생형 Ras 단백질과 관련된 아미노산 위치 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 및/또는 78을 포함하는 야생형 Ras 단백질 중 적어도 5-9개의 인접한 아미노산 잔기를 포함하고, 여기서 위치 12, 13, 59, 61, 73, 74, 75, 76, 77 및/또는 78에서의 아미노산 잔기는 야생형 Ras 단백질에 대해 돌연변이 된다. 하나의 양상에서, 암 항원은:(a) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 4-20 또는 적어도 위치 8-16로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 12에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질;(b) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 5-21 또는 적어도 위치 9-17로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 13에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질;(c) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 51-67 또는 적어도 위치 55-63으로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 59에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질;(d) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 53-69 또는 적어도 위치 57-65로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 61에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질;(e) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 65-81 또는 적어도 위치 69-77로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 73에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질;(f) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 66-82 또는 적어도 위치 70-78로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 74에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질;(g) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 67-83 또는 적어도 위치 71-79로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 75에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질;(h) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 69-84 또는 적어도 위치 73-81로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 77에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질;(i) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 70-85 또는 적어도 위치 74-82로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 78에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질; 및/또는(j) 야생형 Ras 단백질의 적어도 위치 68-84 또는 적어도 위치 72-80으로부터, 야생형 Ras 단백질에 대한 위치 76에서의 아미노산 잔기가 변이된 것을 제외하고 포함하는 단백질을 포함한다. It is noted that 이들 위치는 일반적으로 K-Ras, N-Ras 및 H-Ras 단백질에, 및 인간과 마우스 서열뿐만 아니라, 다른 등등에 상응하고, 이는 인간과 마우스 서열은 Ras 단백질의 이들 영역에서 동일하기 때문 및 K-Ras, H-Ras 및 N-Ras가 Ras 단백질의 이들 영역에서 동일하기 때문이다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 용어 "GI-4000"은 일반적으로 효모-기반 면역요법 조성물의 시리즈(TARMOGEN® 제품)를 의미하고, 여기서 각 효모-기반 면역요법 조성물은 목적하는 Ras 돌연변이가 인간 암에서 발견되는 하나 이상의 Ras 돌연변이를 발현한다. 이러한 돌연변이는 종양의 발달과 연관된다. 임상에서 사용되고 본원의 실시예에 기재되는 바와 같이 GI-4000은 현재 각각 GI-4014, GI-4015, GI-4016 및 GI-4020으로 표시되는 4개의 효모-기반 면역요법 제품 버전 시리즈로 이루어진다. 각 버전은 열-불활성화, 완전한(무손상) 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) 효모이고, 3개 Ras 돌연변이(하나는 고유한 Ras 단백질에 대해 위치 12에 돌연변이 및 다른 2개는 고유한 Ras 단백질에 대해 위치 61에 돌연변이)의 독특한 조합을 포함하는 융합 단백질을 재조합적으로 발현한 것이고, 인간 암에서 관찰되는 가장 통상적인 Ras 돌연변이 중 7개(4개의 상이한 위치 12 돌연변이 및 3개의 상이한 위치 61 돌연변이)를 전체에서 표적화한다. GI-4000 임상 연구에서, 각 환자의 종양을 서열화하여 환자의 종양에 포함되는 특이적 Ras 돌연변이를 확인하고나서, 확인된 변이된 단백질을 포함하는, 상응하는 효모-Ras 면역요법 제품을 투여한다. GI-4000 시리즈에서의 각 제품은 제조되고, 분리하여 넣어 보관된다.
더욱 상세하게는, 현재 임상에 사용되는 GI-4000 제품의 시리즈(각각 GI-4014, GI-4015, GI-4016 및 GI-4020으로 표시된다)에서 효모-기반 면역요법 조성물에 의해 발현되는 각 융합 단백질은 일반적으로 다음의 전체 구조, N- 내지 C-말단을 갖는 아미노산 서열을 갖는다:(1) 2개의 아미노산 N-말단 펩티드 서열(M-V),(2) 고유한 Ras 단백질의 위치 61에 상응하는 단일 아미노산 치환을 갖는 Ras의 위치 56-67에 상응하는 아미노산 서열, 및(3) 고유한 Ras 단백질의 위치 12 및 61에 각각 상응하는 2개의 단일 아미노산 치환을 갖는 Ras의 위치 2-165에 상응하는 아미노산 서열. 각 융합 단백질에 3개 아미노산 치환의 특이적 조합은 하나의 융합 단백질을 다른 것과 구별한다. 변이된 Ras-양성암을 표적화하는 효모-기반 면역요법 제품 내에 면역원 도메인의 다른 구조체 및 조직체가 가능하고, 예를 들면, 미국 특허 제 7,465,454에 상세히 기재되어 있다.
GI-4014를 암호화하는 구성체에 대한 뉴클레오티드 및 번역된 아미노산 서열은 서열번호:1 및 2로 각각 나타내어진다. GI-4014는 다음의 Ras 돌연변이: Q61L-G12V-Q61R을 포함한다. GI-4015를 암호화하는 구성체에 대한 뉴클레오티드 및 번역된 아미노산 서열은 서열번호:3 및 4로 각각 나타내어진다. GI-4015는 다음의 Ras 돌연변이: Q61L-G12C-Q61R을 포함한다. GI-4016을 암호화하는 구성체에 대한 뉴클레오티드 및 번역된 아미노산 서열은 서열번호:5 및 6으로 각각 나타내어진다. GI-4016은 다음의 Ras 돌연변이: Q61L-G12D-Q61R을 포함한다. GI-4020을 암호화하는 구성체에 대한 뉴클레오티드 및 번역된 아미노산 서열은 서열번호:7 및 8로 각각 나타내어진다. GI-4020은 다음의 Ras 돌연변이: Q61L-G12R-Q61H를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기한 임의의 Ras 항원의 상동을 사용하는 것을 포함한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 Ras 항원 중 어느 하나의 아미노산 서열에 동일한 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인 아미노산 서열을 갖는 Ras 항원의 사용을 포함하고, 여기서 단백질 또는 융합 단백질의 최대한의 길이에 걸쳐, 또는 융합 단밸질의 부분을 형성하는 융합 단백질 또는 규정된 단백질 또는 그 도메인에서 규정된 분절에 대해(면역원 도메인 또는 기능적 도메인(즉, 적어도 하나의 생물학적 활성에 의한 도메인)) 특이적 서열 식별자에 의해 참조되는 임의의 Ras 항원을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 대로, 별도로 명시되지 않는 한, 백분율(%) 동일성에 대한 언급은 다음을 사용하여 수행되는 상동성 평가를 의미한다:(1) 표준 디폴트 파라미터로 아미노산 검색에 대하여 blastp 및 핵산 검색에 대하여 blastn을 이용하는 BLAST 2.0 Basic BLAST 상동성 검색, 여기서 쿼리 서열은(본원에 참조로 그 전체로서 포함되는, Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J.(1997) "Gapped BLAST And PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs." Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에 기재된 바와 같이) 디폴트에 의하여 낮은 복잡성 영역에 대하여 필터링됨;(2) 2개의 BLAST 정렬(예를 들어, 이하 기재하는 파라미터를 이용); 및/또는(3) 표준 디폴트 파라미터로 PSI-BLAST(위치-특이적 반복된 BLAST).
본 발명에서 사용되는 임의의 효모-기반 면역요법 조성물에서, 효모 전달체에 관련된 다음의 양상은 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따르면, 효모 전달체는 본 발명에서 유용한 치료학적 조성물에서 항원, 그 면역원 도메인 또는 그 에피토프와 접합하여 사용될 수 있는 임의의 효모 세포(예를 들면, 완전한 또는 무손상 세포) 또는(후술하는) 그 유도체이다. 그러므로 효모 전달체는 살아있는 무손상(완전한) 효모 미생물(즉, 세포벽을 포함한 그것의 모든 성분을 가진 효모 세포), 사멸된(죽은) 또는 불활성된 무손상 효모 미생물, 또는 무손상/완전한 효모의 유도체를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다: 효모 스페로플라스트(즉, 세포벽이 결핍된 효모 세포), 효모 사이토플라스트(즉, 세포벽과 핵이 결핍된 효모 세포), 효모 고스트(즉, 세포벽, 핵 및 사이토플라즘이 결핍된 세포), 아세포 효모막 추출물 또는 그 파편(또한 효모 막 입자 및 앞서 아세포 효모 입자로서 언급된), 임의의 다른 효모 입자, 또는 효모 세포벽 제조물을 포함한다. 이들 효모 전달체는 예를 들면, 미국 특허 제 5,830,463, 미국 특허 제 7,083,787, 및 미국 특허 제 7,736,642에 상세히 기재되어 있고, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
임의의 효모 균주를 사용하여 본 발명에 유용한 효모-기반 면역요법 제품을 생산할 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 효모 균주의 속은 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(Candida), 크립토코커스(Cryptococcus), 한세뉼라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피치아(Pichia), 로도토룰라(Rhodotorula), 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 및 야로이야(Yarrowia)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 사용될 수 있는 효모 균주의 종은 사카로마이세스 세레비제, 사카로마이세스 칼스버겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 케플리(Candida kefyr), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 크립토코커스 라우렌티(Cryptococcus laurentii), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 한세뉼라 아노말라(Hansenula anomala), 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 프라길리스(Kluyveromyces fragilis), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마르시아누스 var. 락티스(Kluyveromyces marxianus var. lactis), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 로도토룰라 루브라(Rhodotorula rubra), 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 및 야로이야 리포리티카(Yarrowia lipolytica)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 수많은 이들 종들은 상기 종들 내에 포함되는 것으로 의도되는 다양한 아종, 형, 아형, 등을 포함하는 것으로 인식된다.
본 발명에 유용한 효모-기반 면역요법 제품을 생산하는 방법은 예를 들면 미국 특허 제 5,830,463, 미국 특허 제 7,083,787, 및 미국 특허 제 7,736,642에 앞서 기재되어 있고, 그 개시 내용은 본 명세서에 참조로 포함된다. 일반적으로, 본 발명에 유용한 효모-기반 면역요법 제품은 사멸 또는 불활성화되어 있다. 효모의 사멸 또는 불활성화는 본 기술분야에 공지된 임의의 다양한 적합한 방법에 의해 성취될 수 있다. 예를 들면, 효모의 열 불활성화는 효모를 불활성화시키는 표준 방법이고, 당업자는 본 기술분야에 공지된 표준 방법에 의해 표적 항원의 구조적 변화를 모니터링할 수 있다. 대안적으로, 화학적, 전기적, 방사성 또는 UV 방법과 같은, 효모를 불활성화시키는 다른 방법을 사용할 수 있다.
효모 전달체는 당업계에 공지된 수많은 기술을 사용하여, 대상체에 투여하도록 제조물을 포함하여 본 발명의 효모-기반 면역요법 조성물 또는 산물로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 효모 전달체는 동결건조에 의해 건조될 수 있다. 또한, 효모 전달체를 포함하는 제형은 베이킹 또는 양조 작업에 사용되는 효모에 대하여 행하여지는 것과 같이, 효모를 케이크 또는 정제로 패킹함으로써 제조될 수 있다. 또한, 효모 전달체는 숙주 또는 숙주 세포에 의하여 허용되는 등장 완충액과 같은 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합될 수 있다. 그러한 부형제의 예는 물, 인신염완충식염수, 링거액, 덱스트로오스 용액, 행크 용액 및 다른 생리학적으로 밸런스된 수성 염 용액들을 포함한다. 불휘발유, 참기름, 에틸 올레이트, 또는 트리글리세라이드와 같은 비수성 전달체 또한 사용할 수 있다. 다른 유용한 제제들은 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 소르비톨, 글리세롤 또는 덱스트란과 같은, 점도 개선제를 함유하는 현탁액을 포함한다. 부형제는 또한 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질과 같은, 소량의 첨가제를 함유할 수 있다. 표준 제형은 현탁액 또는 주사용 용액으로서 적합한 액체 내 채취될 수 있는 주사가능한 액체 또는 고체일 수 있다. 따라서, 비-액체 제형 내에, 부형제는 예를 들어 덱트스로오스, 인간 혈청 알부민, 및/또는 투여 전에 멸균수 또는 인산염완충식염수가 첨가되는 방부제를 포함할 수 있다. 조성물은 인간 대상체에게 투여하기 적합하도록 제제화될 수 있다(예를 들면, 제조 조건은 인간이 사용하기에 적합해야하고, 조성물을 마무리하고 및/또는 투여용 면역요법의 투여량을 제조하는데 사용되는 임의의 부형제 또는 제형은 인간이 사용하기에 적합해야한다). 본 발명의 하나의 양상에서, 효모-기반 면역요법 조성물은 예컨대 비경구적 방식(예를 들면, 피하, 복막내, 근육내, 또는 내피 주입, 또는 또 다른 적합한 비경구적 방식에 의해)에 의해 환자 또는 대상체의 주입에 의해 투여하기 위해 제제화된다.
치료 방법은 대상체 또는 개체에게 효모-기반 면역요법 조성물의 전달(투여, 면역화)을 포함한다. 투여 공정은 체외 또는 체내로 수행될 수 있지만, 일반적으로 체내로 수행된다. 효모-기반 면역요법 조성물의 투여는 표적 부위(예를 들면, 종양의 근처)의 위치에 체계적, 점막적 및/또는 근위적으로 할 수 있다. 투여의 적합한 방식은 예방 또는 치료되는 암 종류 및/또는 목적하는 세포 집단 또는 조직에 따라 본 기술분야에 당업자에게 명확할 것이다. 투여의 다양한 허용가능한 방법은 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 결절 내 투여, 관상내(intracoronary) 투여, 동맥내 투여(예를 들면, 경동맥 내로), 피하 투여, 경필 전달, 기관내 투여, 관절내 투여, 심실내 투여, 흡입(예를 들면, 에어로졸), 두개내, 척수내, 안구내, 귀내, 비강내, 구강내, 폐 투여, 카테터 함침, 및 조직내로 직접 주입을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 양상에서, 투여의 방식은: 정맥내, 복막내, 피하내, 내피, 결절내 투여, 근육내 투여, 경피, 흡입, 비강내, 귀내, 안구내, 관절내, 두개내, 및 척수내를 포함한다. 비경구 전달은 내피, 근육내, 복막내, 흉막내, 폐내, 정맥내, 피하, 동맥 카테터 및 정맥 카테터 방식을 포함한다. 귀 전달은 점이제를 포함할 수 있고, 비강내 전달은 점비약 또는 비강내 주입을 포함할 수 있고, 안구내 전달은 점안약을 포함할 수 있다. 또한 에어로졸(흡입) 전달은 당업계에 표준 방법을 이용하여 수행될 수 있다(예를 들면, Stribling 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992 참조). 하나의 양상에서, 본 발명의 효모-기반 면역요법 조성물은 피하 투여된다. 하나의 양상에서, 본 발명의 효모-기반 면역요법 조성물은 종양 환경 내로 직접 투여된다.
일반적으로, 효모-기반 면역요법 조성물의 적합한 1회 투여량은 적합한 시간 기간에 걸쳐 1 회 이상 투여될 때, 효모 전달체 및 암 항원을 환자 신체의 소정의 세포 유형, 조직, 또는 영역에 하나 이상의 암 항원 또는 에피토프에 대한 항원-특이적 면역반응을 유발하기에 효과적인 양으로 효과적으로 제공할 수 있는 투여량이다. 예를 들면, 일 실시형태에서, 본 발명에 유용한 효모-기반 면역요법의 1회 투여량은 조성물이 투여되는 유기체의 체중 킬로그램 당 약 1x105 내지 약 5x107 효모 세포 당량이다. 하나의 양상에서, 본 발명에 유용한 효모-기반 면역요법의 1회 투여량은 임의의 중간 투여량을 포함하여, 0.1x106 세포의 증가분으로(즉, 1.1x106, 1.2x106, 1.3x106...), 투여량당(즉, 유기체당) 약 0.1Y.U.(1x106 세포) 내지 약 100Y.U.(1x109 세포)이다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, 용어 "Y.U."는 "효모 단위" 또는 1Y.U.=10백만 효모 세포인 "효모 세포 당량"이다. 일 실시형태에서, 투여량은 1Y.U~40Y.U.인 투여량, 1Y.U.~50Y.U.인 투여량, 1Y.U.~60Y.U.인 투여량, 1Y.U.~70Y.U.인 투여량, 또는 1Y.U.~80Y.U.인 투여량을 포함하고, 하나의 양상에서, 10Y.U. 내지 40Y.U., 50Y.U., 60Y.U., 70Y.U., 또는 80Y.U.을 포함한다. 일 실시형태에서, 투여량은 개체 상에 다른 부위에, 그러나 동일 투여 기간 동안 투여된다. 예를 들면, 10Y.U. 투여량은 하나의 투여 기간 동안 개체 상에 네개의 상이한 부위에 주입함으로써 40Y.U. 투여량이 투여될 수 있거나 또는 5Y.U. 투여량은 개체 상에 네개의 상이한 부위에 주입함으로써 또는 10Y.U. 투여량은 하나의 투여 기간 동안 개체 상에 두개의 상이한 부위에 주입함으로써 20Y.U. 투여량이 투여될 수 있다. 본 발명은 1회 투여량을 형성하기 위한 개체 상에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 상이한 부위에서 효모-기반 면역요법 조성물의 양(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20Y.U. 또는 그 이상)의 투여를 포함한다.
예를 들어, 항원에 대한 면역반응이 약해질 때 또는 특정 항원 또는 항원(들)에 대한 면역반응을 제공하거나 기억 반응을 유도하기 위하여 필요로 될 때, 효모-기반 면역요법 조성물을 "접종"("부스터" 또는 "부스트")하게 된다. 접종은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주 간격으로, 또는 매월, 두 달에 한번, 분기별, 매년, 본래 투여 후 수년으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 투여 스케쥴은 1회 투여량이 수주 내지 수개월 내지 수년의 시간 기간에 걸쳐 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 그 이상의 횟수로 투여되는 것이다. 일 실시형태에서, 투여량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 용량으로 동안 매주 투여된 후, 원하는 치료적 결과를 달성하는데 요구되는 대로 매월 투여된다. 추가적인 투여량은 환자의 종양이 재발하면, 또는 환자가 완화되는 것으로 간주된 후에 투여될 수 있다.
하나의 양상에서, 개체는 암의 치료(항암 요법)에 유용한 적어도 하나의 다른 치료 화합물 또는 치료 프로토콜로 추가적으로 처리된다. 암 치료에 유용한 추가적인 제제, 조성물 또는 프로토콜(예를 들어, 치료 프로토콜)은 화학요법, 종양의 수술적 절제, 방사선요법, 동종이형 또는 자가조직 줄기 세포 이식, 사이토카인 요법, 입양 T세포 전송, 및/또는 제 2 면역요법 조성물의 투여(예를 들면, 추가적인 효모-기반 면역요법, 재조합 바이러스-기반 면역요법(바이러스벡터), 사이토카인 요법, 면역자극요법(면역자극하는 특성을 가진 화학요법을 포함), DNA 백신, 및 다른 면역요법 조성물 및/또는 표적화 암 요법(예를 들면, 아로마타아제 억제제, 티로신 키나아제 억제제, 세린/트레오닌 키나아제 억제제, 히스톤 디아세틸라아제(HDAC) 억제제, 레티노이드 수용체 활성화제, 세포사멸 자극제, 혈관형성 억제제, 폴리(ADP-리보오스) 폴리머라아제(PARP) 억제제, 또는 면역자극제를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 종양 성장 및 진행에 수반되는 특이적 표적 분자들, 저분자 의약품, 생물제제, 또는 단일클론 항체 요법)을 포함한다. 이들 중 임의의 추가적인 치료제 및/또는 치료 프로코톨을 본 발명의 면역요법 조성물 이전에, 동시에, 교대로, 이후에 또는 다른 시간 지점에 투여할 수 있다. 예를 들면, 화학요법 또는 표적화 암 요법과 병용하여 개체에 제공될 때, 면역요법 조성물의 효능을 최대화하기 위하여, 화학요법 또는 표적화 암 요법을 투여한 사이의 "휴약기" 동안 효모-기반 면역요법 조성물을 투여하는 것이 바람직할 것이다. 종양의 외과적 절제는 효모-기반 면역요법 조성물의 투여에 종종 선행할 수 있으나, 효모-기반 면역요법 조성물의 투여 동안 또는 이후에 추가적 또는 1차 수술이 발생할 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재되는 본 발명의 치료 방법에 대한 임의의 실시형태에서, 하나의 양상에서, 개체가 암을 가질 때, 개체는 다른 암 요법으로 처리 중이거나 처리되었다. 이러한 요법은 화학요법, 방사선 요법, 표적화 암 요법, 종양의 외과적 절제술, 줄기 세포 전송, 사이토카인 요법, 입양 T세포 전송, 및/또는 제 2 면역요법 조성물 투여를 포함하지만 이에 한정되지 않고, 본원에 앞서 기재되는 임의의 치료 화합물 또는 제제의 사용 또는 임의의 치료 프로토콜을 포함할 수 있다. 제 2 면역요법 조성물의 투여의 경우에서, 이러한 조성물은 추가적 효모-기반 면역요법, 재조합 바이러스-기반 면역요법(바이러스 벡터), 면역자극 요법(면역자극 특성을 가지는 화학요법을 포함), DNA 백신, 및 다른 면역요법 조성물을 포함할 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 대로, 암을 "치료" 또는 이의 치환(예를 들면, "암에 대하여 치료되는" 등)은, 일단 암이 발생하였으면(예를 들면, 개체 내에 암이 진단 또는 감지되었으면), 그 처리의 적어도 하나의 치료적 목적으로(이 처리 부재시와 비교하여), 본 발명의 효모-기반 면역요법 조성물을 투여하는 것을 의미한다: 종양 부하에의 감소, 종양 성장의 억제, 개체의 무재발 생존율 증가, 개체의 전체 생존율 증가, 전이성 암의 개시 또는 발달을 지연, 억제, 저지 또는 예방(예컨대, 종양 이동 및/또는 원발성 암 외부의 조직의 종양 침습 및/또는 암의 전이성 진행과 관련되는 다른 과정들을 지연, 억제, 저지 또는 예방함에 의해), 암 진행의 지연 또는 저지, 종양에 대한 면역반응 개선, 종양 항원에 대한 장기간 메모리 면역반응 개선, 및/또는 개선된 개체의 일반적 건강을 포함한다. 암으로부터 "예방" 또는 "보호", 또는 이의 치환(예를 들어, "암의 예방" 등)은, 암이 발생하기 전에, 또는 특정 단계 암 또는 암 내 종양 항원 발현이 일어나기 전에 그 처리의 적어도 하나의 목적으로(그 처리 부재시와 비교하여), 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 일반적으로 의미한다: 암 개시 또는 발달을 예방 또는 지연을 포함하거나, 또는 그 처리 후에 암이 발생한다면, 적어도 암의 심각성 감소(예를 들면, 종양 성장 수준 감소, 암 진행 저지, 암에 대한 면역반응 개선, 전이성 과정 억제) 또는 개체 내 결과 개선(예를 들면, 무재발 생존율 및/또는 전체 생존율 향상)을 포함한다.
본 발명의 치료 방법에서, 효모-기반 면역요법 조성물 및 다른 항암 요법은 임의의 척추 동물을 포함하는 임의의 동물, 및 특히 제한 없이 영장류, 설치류, 가축 및 애완동물을 포함하는 척추동물 강, 포유류의 멤버에 투여될 수 있다. "개체"는 제한 없이 인간을 포함하는 포유류와 같은 척추동물이다. 용어 "개체"는 용어 "동물", "대상체" 또는 "환자"와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 본원에 사용되는 용어 "항원"은: 단백질의 임의의 부분(예를 들어, 펩티드, 부분 단백질, 전장 단백질), 여기서 단백질은 자연 발생 또는 합성적으로 유도된 것을 의미하고, 세포성 조성물(전세포, 세포 용해물 또는 파괴된 세포)을 의미하고, 유기체(전유기체, 용해물 또는 파괴된 세포)을 의미하고, 또는 탄수화물 또는 다른 분자 또는 그의 일부를 의미한다. 항원은 면역계의 요소(예를 들어, T세포, 항체)에 의해 마주치는 동일 또는 유사 항원에 대하여 항원-특이적 면역반응(예를 들어, 체액성 및/또는 세포-중재 면역반응)을 유발할 수 있다.
항원은 단일 에피토프, 단일 면역원 도메인과 같이 작거나 보다 클 수 있고, 다중 에피토프 또는 면역원 도메인을 포함할 수 있다. 이와 같이, 항원의 크기는 약 8-12개 아미노산(즉, 펩티드)만큼 작을 수 있고, 전장 단백질, 멀티머, 융합 단백질, 키메릭 단백질, 전세포, 전미생물, 또는 이의 일부(예를 들면, 미생물 추출물 또는 전세포의 용해물)과 같이 클 수도 있다. 또한, 항원은 탄수화물을 포함할 수 있고, 이는 효모 전달체 내로 또는 본 발명의 조성물 내로 적재될 수 있다. 일부 실시형태에서(예를 들어, 항원이 효모 전달체에 의하여 재조합 핵산 분자로부터 발현될 때), 항원은 전세포 또는 미생물이기보다는 단백질, 융합 단백질, 키메릭 단백질, 또는 이의 단편인 것으로 인식될 것이다.
항원이 효모 내 발현되도록 할 때, 항원은 재조합에 의하여 발현될 수 있는 최소 크기이고, 전형적으로 적어도 25 또는 그보다 큰 아미노산 길이, 또는 적어도 26 또는 그보다 큰, 적어도 27 또는 그보다 큰, 적어도 28 또는 그보다 큰, 적어도 29 또는 그보다 큰, 적어도 30 또는 그보다 큰, 적어도 31 또는 그보다 큰, 적어도 32 또는 그보다 큰, 적어도 33 또는 그보다 큰, 적어도 34 또는 그보다 큰, 적어도 35 또는 그보다 큰, 적어도 36 또는 그보다 큰, 적어도 37 또는 그보다 큰, 적어도 38 또는 그보다 큰, 적어도 39 또는 그보다 큰, 적어도 40 또는 그보다 큰, 적어도 41 또는 그보다 큰, 적어도 42 또는 그보다 큰, 적어도 43 또는 그보다 큰, 적어도 44 또는 그보다 큰, 적어도 45 또는 그보다 큰, 적어도 46 또는 그보다 큰, 적어도 47 또는 그보다 큰, 적어도 48 또는 그보다 큰, 적어도 49 또는 그보다 큰, 또는 적어도 50 또는 그보다 큰 아미노산 길이이거나, 또는 적어도 25-50 또는 그보다 큰 아미노산 길이, 또는 적어도 30-50 또는 그보다 큰 아미노산 길이, 또는 적어도 35-50 또는 그보다 큰 아미노산 길이, 적어도 40-50 또는 그보다 큰 아미노산 길이, 또는 적어도 45-50 또는 그보다 큰 아미노산 길이이다. 더 작은 단백질이 발현될 수 있고 현저히 더 큰 단백질(예를 들어, 수백 아미노산 길이 또는 심지어 수천 아미노산 길이)이 발현될 수 있다. 하나의 양상에서, N- 및/또는 C-말단으로부터 하나 이상의 아미노산을 결여하는 전장 단백질, 또는 그 구조적 또는 기능적 도메인, 또는 그 면역원 도메인이 발현될 수 있다(N- 및/또는 C-말단으로부터 약 1 내지 약 20 아미노산을 결여하는). 또한, 융합 단백질 및 키메릭 단백질은 본 발명에서 발현될 수 있는 항원이다. "표적 항원"은 본 발명의 면역요법 조성물에 의하여 특이적으로 표적화되는 항원이다(즉, 면역반응의 유발이 요구되는 항원). 예를 들면, "Ras 항원"은 그 항원의 표적화가 또한 종양에 의해 발현된 상응하는 Ras 단백질을 표적화하도록, 적어도 하나의 Ras 단백질로부터 유도, 설계, 또는 생산되는 항원이다.
"암 항원"은 그 항원의 표적화가 또한 암을 표적화하도록, 종양 세포에 의하여 발현되는 항원과 같은 암과 관련되는 적어도 하나의 항원을 포함하는 항원이다. 암 항원은 하나 이상의 종양-관련 단백질을 포함하는, 하나 이상의 단백질로부터 하나 이상의 항원을 포함할 수 있다. "변이된 Ras 항원"은 특히 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 Ras 항원을 의미한다. 본 발명에서 사용되는, 이러한 돌연변이는 종양의 Ras 단백질에서 발견되는 돌연변이와 상응하고, 종양의 발달 및/또는 종양의 진행과 연관된다.
면역반응의 자극을 언급할 때, 용어 "면역원"은 용어 "항원"의 아집합이며, 따라서, 일부 경우에는, 용어 "항원"과 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 대로, 면역원은 개체에 면역원의 투여가 그 개체의 면역계가 마주치는 동일 또는 유사 항원에 대한 항원-특이적 면역반응을 증가시키도록, 체액성 및/또는 세포-중재 면역반응을 유발하는(즉, 면역원성이다) 항원을 기재한다. 일 실시형태에서, 효모-기반 면역요법 조성물에 포함되는 면역원은 CD4+ T세포 반응(예를 들면, TH1, TH2 및/또는 TH17) 및/또는 CD8+ T세포 반응(예를 들면, CTL 반응)을 포함하는, 세포-중재 면역 반응을 유발한다.
소정의 항원의 "면역원 도메인"은 동물에 투여될 때 면역원으로 작용하는 적어도 하나의 에피토프를 함유하는 항원의 단편 또는 에피토프(예를 들면, 펩티드 단편 또는 서브유닛 또는 항체 에피토프 또는 다른 구조적 에피토프)일 수 있다. 따라서, 면역원 도메인은 단일 아미노산보다 크고, 적어도 면역원으로 작용할 수 있는 적어도 하나의 에피토프를 함유하기에 충분한 크기이다. 예를 들어, 단일 단백질은 복수의 상이한 면역원성 도메인들을 함유할 수 있다. 면역원성 도메인은 구조적 도메인이 고려되는 경우, 체액성 면역반응의 경우와 같이, 단백질 내 선형 서열일 필요는 없다.
본원에서 에피토프는 면역계의 적절한 공자극 신호 및/또는 활성화된 세포의 맥락에서 면역계에 제공될 때 면역반응을 유발하기에 충분한 소정의 항원 내 단일 면역원성 부위로서 정의된다. 즉, 에피토프는 면역계의 성분에 의하여 실제로 인지되는 항원의 일부이며, 또한 항원성 결정 요인으로도 언급될 수 있다. 당업자는 T세포 에피토프가 B세포 또는 항체 에피토프와 크기 및 조성에 있어서 다르며, MHC 클래스 I 경로를 통하여 제시되는 에피토프는 MHC 클래스 II 경로를 통하여 제시되는 에피토프로부터의 크기 및 구조적 특성과 다름을 인식할 것이다. 예를 들어, MHC 클래스 I 분자에 의하여 제시되는 T세포 에피토프는 전형적으로 8 내지 11 아미노산 길이인 반면, MHC 클래스 II 분자에 의하여 제시되는 에피토프는 길이가 덜 제한되고 8 아미노산에서부터 25 아미노산 이하 또는 그보다 길 수 있다. 또한, T세포 에피토프는 그 에피토프에 의하여 결합되는 특정 MHC 분자에 따라 구조적 특성을 예측하였다. 에피토프는 선형 서열 에피토프 또는 구조적 에피토프(보존된 결합 영역)일 수 있다. 대부분의 항체는 구조적 에피토프를 인지한다.
본 발명의 실시형태가 상세하게 기재되었으나, 이들 실시형태에 대한 변경 및 각색이 당업자에게 일어날 것임이 분명한다. 그러나, 이러한 변형 및 각색은 이하의 모범적 청구범위에 기재하는 바와 같은 본 발명의 범위 내임이 분명히 이해되어야 한다.
<110> Biodesix, Inc. GlobeImmune, Inc. Roder, Joanna Roder, Heinrich <120> Mass-Spectral Method for Selection, and De-Selection, of Cancer Patients for Treatment With Immune Response Generating Therapies <130> 12-621-PRO <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 537 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> CDS <222> (1)..(537) <400> 1 atg gtc ctc gac aca gca ggt ttg gag gag tac agt gca atg act gag 48 Met Val Leu Asp Thr Ala Gly Leu Glu Glu Tyr Ser Ala Met Thr Glu 1 5 10 15 tat aaa ctt gtg gtg gtt gga gct gtt ggc gta ggc aag agc gcc ttg 96 Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu 20 25 30 acg ata cag cta att cag aat cac ttt gtg gat gag tac gac cct acg 144 Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr Asp Pro Thr 35 40 45 ata gag gac tcc tac agg aaa caa gta gta att gat gga gaa acc tgt 192 Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly Glu Thr Cys 50 55 60 ctc ttg gat att ctc gac aca gca ggt cga gag gag tac agt gca atg 240 Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala 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Claims (75)

  1. (a) 환자의 혈액-유래 시료를 수득하는 단계;
    (b) 시료에 질량-분광광도를 수행하고 시료로부터 질량 스펙트럼을 수득하는 단계;
    (c) 프로그래밍된 컴퓨터에서, 질량 스펙트럼에 대한 소정의 전처리 단계들 중 하나 이상을 수행하고, 전처리 단계를 수행한 후에 소정의 m/z 범위에 걸쳐서 질량 스펙트럼에서 선별된 피쳐의 적분된 세기값을 수득하며, 또한 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단과 적분된 세기값을 비교하여 유익 또는 무익의 상태를 나타내는 등급 표지로 질량 스펙트럼을 분류하는 단계를 포함하고;
    여기서 등급 표지는 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 다른 항암 요법과 병용하여 환자가 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하는 암환자가 암에 대해 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같은지의 여부를 예측하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    효모-기반 면역요법은 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 포함하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000 또는 이의 등가물을 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    변이된 Ras-양성암 요법에 대한 효모-기반 면역요법은 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 환자에게 투여되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    암환자는 췌장암환자를 포함하는 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    암환자는 췌장암환자를 포함하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    학습집단은 효모-기반 면역반응 발생 요법 또는 면역요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 유익을 수득하고 유익을 수득하지 못한 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    선별된 피쳐들은 표 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6에 나열된 하나 이상의 피쳐를 포함하는 방법.
  9. (a) 환자의 혈액-유래 시료를 수득하는 단계;
    (b) 시료에 대해 질량-분광광도를 행하고 시료로부터 질량 스펙트럼을 수득하는 단계;
    (c) 프로그래밍된 컴퓨터에서, 질량 스펙트럼에 대한 소정의 전처리 단계들 중 하나 이상을 수행하고, 전처리 단계를 수행한 후에 소정의 m/z 범위에 걸쳐서 질량 스펙트럼에서 선별된 피쳐의 적분된 세기값을 수득하며, 또한 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단과 적분된 세기값을 비교하여 유익 또는 무익의 상태를 나타내는 등급 표지로 질량 스펙트럼을 분류하는 단계를 포함하고;
    여기서 등급 표지는 환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같지 않은지의 여부를 예측하는 암환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같지 않은지의 여부를 예측하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    암에 대한 효모-기반 면역요법은 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 포함하는 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000 또는 이의 등가물을 포함하는 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    환자가 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 변이된 Ras-양성암 요법에 대한 효모-기반 면역요법의 투여로 이득을 얻을 것 같지 않은 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    암환자는 췌장암환자를 포함하는 방법.
  14. 제 9 항에 있어서,
    학습집단은 면역요법 또는 면역요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용으로 유익을 수득하고 유익을 수득하지 못한 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 방법.
  15. 제 9 항에 있어서,
    선별된 피쳐들은 표 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6에 나열된 하나 이상의 피쳐를 포함하는 방법.
  16. 암환자의 혈액-유래 시료로부터 질량 스펙트럼을 생성하는 질량 분광계;
    다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼의 학습집단을 저장하는 기계 판독가능한 메모리로서, 학습집단은 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻지 못한 다수의 환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하고, 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 이득을 얻은 다수의 환자들로부터 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 기계 판독가능한 메모리; 및
    등급 표지는 환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하는 유익 또는 무익의 상태를 나타내는, 질량 스펙트럼에 대한 등급 표지를 생성하여, 질량 스펙트럼에 대해 동작하고 학습집단을 사용하여 질량 스펙트럼을 분류하도록 구성되는 컴퓨터 시스템을
    조합하여 포함하는 암환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같은지 여부를 예측하기 위한 시스템.
  17. 제 16 항에 있어서,
    등급 표지는 환자가 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법의 투여로 이득을 얻을 것 같은지의 여부를 예측하는 시스템.
  18. 제 16 항에 있어서,
    변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000 또는 이의 등가물을 포함하는 시스템.
  19. 제 16 항에 있어서,
    등급 표지는 환자에게 GI-4000 및 젬시타빈을 투여하여 환자가 이득을 얻을 것 같은지의 여부를 예측하는 시스템.
  20. 제 16 항에 있어서,
    암환자는 췌장암환자를 포함하는 시스템.
  21. 제 16 항에 있어서,
    컴퓨터는 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 나열된 피쳐 중 하나 이상을 포함하는 m/z 범위에서 스펙트럼에서의 피쳐의 적분된 세기값을 수득하도록 구성되는 시스템.
  22. 암환자로부터의 혈액-유래 시료로 질량 스펙트럼을 생성하는 질량 분광계;
    다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼의 학습집단을 저장하는 기계 판독가능한 메모리로서, 학습집단은 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이익을 얻지 못한 다수의 환자 유래 등급-표지된 스펙트럼 및 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 이익을 얻은 다수의 환자 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 기계 판독가능한 메모리; 및
    유익 또는 무익의 상태를 나타내는 질량 스펙트럼에 대한 등급 표지를 생성하여, 질량 스펙트럼에 대해 동작하고 학습집단을 사용하여 질량 스펙트럼을 분류하도록 구성되며, 등급 표지는 환자가 효모-기반 면역요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 제제와 병용하여 이득을 얻을 것 같지 않은지의 여부를 예측하는 컴퓨터 시스템을
    조합하여 포함하는 암환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같지 않은지의 여부를 예측하기 위한 시스템.
  23. 제 22 항에 있어서,
    암에 대한 효모-기반 면역요법은 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법을 포함하는 시스템.
  24. 제 23 항에 있어서,
    변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 GI-4000 또는 이의 등가물을 포함하는 시스템.
  25. 제 24 항에 있어서,
    등급 표지는 환자가 GI-4000 및 젬시타빈의 투여로 이득을 얻을 것 같지 않은지의 여부를 예측하는 시스템.
  26. 제 24 항에 있어서,
    암환자는 췌장암환자를 포함하는 시스템.
  27. 제 22 항에 있어서,
    컴퓨터는 표 1, 2, 3, 4, 5 또는 6에 나열된 피쳐 중 하나 이상을 포함하는 m/z 범위에서 스펙트럼에서의 피쳐의 적분된 세기값을 수득하도록 구성되는 시스템.
  28. 제 1 항에 있어서,
    시료에 대한 질량 분광분석을 행하는 단계는 MALDI TOF 질량 분광분석을 행하는 단계를 포함하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    MALDI-TOF 질량 분광분석은 혈액-유래 시료를 20,000회 초과의 레이저 조사로 처리하는 심층 MALDI 질량 분광분석을 행하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제 1 항에 있어서,
    혈액-유래 시료를 20,000회 초과의 레이저 조사로 처리하는 심층 MALDI 질량 분광분석에 의해 수득되는 각각의 질량 스펙트럼으로서, 소정의 m/z 영역은 암환자들의 혈액-유래 시료로 다수의 질량 스펙트럼을 측정하여 수득되는 방법.
  31. 제 16 항에 있어서,
    질량 분광계는 혈액-유래 시료를 20,000회 초과의 레이저 조사로 처리함으로써 스펙트럼을 수득하도록 구성되는 MALDI-TOF 질량 분광계를 포함하는 시스템.
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 등급 표지는 유익 또는 무익 상태를 나타내고, 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻지 못한 다수의 암환자로부터의 등급-표지된 질량 스펙트럼 및 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻은 다수의 암환자들 유래 등급-표지된 질량 스펙트럼을 포함하고, 다수의 암환자들 유래 등급-표지된 질량 스펙트럼을 포함하는 분류기에 대한 학습집단의 형태로 데이터를 저장하는 비일시적인 컴퓨터-판독가능한 매체 및
    상기 학습집단을 사용하여 암환자의 스펙트럼을 분류하도록 분류기로 구성되는 범용 컴퓨터를 포함하는 질량 스펙트럼을 분리하기 위한 시스템.
  38. 제 37 항에 있어서,
    컴퓨터는 K 최근린 분류기를 실행하는 시스템.
  39. a) 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 처리 후에 수득되는 다수의 환자 시료에 대해 질량 분광분석을 수행하고 상응하는 질량 스펙트럼의 집합을 생성하는 단계;
    b) 단계 a)에서의 시료는 환자가 치료로 이득을 얻은지 또는 아닌지 여부에 상응하는 2개 군 내에 수득되는 것으로부터 환자를 분리함으로써 분류기에 대한 학습집단을 생성하고 각각의 스펙트럼에 유익 또는 무익의 상태를 나타내는 등급 표지를 할당하는 단계;
    c) 2개 군에서의 환자의 스펙트럼 특징에서 구분되는 피쳐를 확인하도록 2개 군으로부터의 스펙트럼을 분석하는 단계; 및
    d) 이러한 구분되는 피쳐의 능력을 시험하여 등급 표지된 스펙트럼 및 단계 c)에서 확인된 구분되는 피쳐를 사용하여 분류 알고리즘을 치료를 위해 투여된 다른 환자로부터 스펙트럼의 시험집단에 적용하는 처리로부터 환자 유익을 예측하여 분류 알고리즘의 성능을 평가하는 단계를 포함하는, 암환자가 효모-기반 면역반응 발생 요법을 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 이득을 얻을 것 같은지 여부를 치료 전에 예측하기 위한 분류기를 생성하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서,
    2개 군의 환자에서의 스펙트럼의 상이한 구분되는 피쳐를 사용하여 단계 b), c) 및 d)를 반복하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제 39 항에 있어서,
    분류 알고리즘은 K-최근린 알고리즘을 포함하는 방법.
  42. 제 39 항에 있어서,
    단계 a)의 질량 분광분석은 시료를 20,000회 초과의 레이저 조사로 처리하는 MALDI-TOF 질량 분광계에서 심층 MALDI 질량 분광분석을 포함하는 방법.
  43. 제 39 항에 있어서,
    구분되는 피쳐들은 표 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6에 나열된 하나 이상의 피쳐를 포함하는 방법.
  44. 제 39 항에 있어서,
    학습집단에서의 스펙트럼에서 피쳐에 의거하여 스펙트럼의 일부 이온 전류 표준화를 수행하는 단계를 더 포함하는 방법.
  45. 제 39 항에 있어서,
    등급 표지는 학습집단에서 환자에 대한 임상데이터의 측정에 의해 결정되는 방법.
  46. 암환자에게 암에 대한 효모-기반 면역요법을 위해 환자의 암으로부터 하나 이상의 암 항원을 발현하고 있는 열-불활성 재조합 전효모를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물로서,
    여기서 환자는 질량 분광분석 및 분류 시험에 의해 선택되고, 시험은
    (a) 환자로부터의 혈액-유래 시료에 대해 질량-분광광도를 행하고 시료로부터 질량 스펙트럼을 수득하는 단계;
    (b) 프로그래밍된 컴퓨터에서, 질량 스펙트럼에 대한 소정의 전처리 단계들을 수행하고, 전처리 단계를 수행한 후에 소정의 m/z 범위에 걸쳐서 질량 스펙트럼에서 선별된 피쳐의 적분된 세기값을 수득하며, 또한 효모-기반 면역요법으로 처리된 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단과 적분된 세기값을 비교하여 유익 또는 무익의 상태를 나타내는 등급 표지로 질량 스펙트럼을 분류하는 단계를 포함하는 단계를 포함하고,
    여기서 질량 스펙트럼에 대한 등급 표지는 환자가 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같은 것을 나타내는, 암 치료용 약학 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서,
    환자는 추가적으로 암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 처리 이전에, 동시에, 또는 이후에 하나 이상의 추가적인 항암 요법에 의해 치료되는 암 치료용 약학 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서,
    추가적인 항암 요법은 수술, 화학요법, 방사선요법, 표적화 암 요법, 완화 의료, 또는 이의 임의의 병용으로부터 선택되는 암 치료용 약학 조성물.
  49. 삭제
  50. 제 46 항에 있어서,
    효모는 사카로마이세스 세레비시애인 암 치료용 약학 조성물.
  51. 제 46 항에 있어서,
    환자는 변이된 Ras-양성암을 갖고, 여기서 환자는 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 투여되는 암 치료용 약학 조성물.
  52. 제 51 항에 있어서,
    환자는 추가적으로 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 처리 이전에, 동시에, 또는 이후에 하나 이상의 추가적인 항암 요법에 의해 치료되는 암 치료용 약학 조성물.
  53. 제 52 항에 있어서,
    추가적인 항암 요법은 수술, 화학요법, 방사선요법, 표적화 암 요법, 완화 의료, 또는 이의 임의의 병용으로부터 선택되는 암 치료용 약학 조성물.
  54. 제 51 항에 있어서,
    변이된 Ras-양성암은 췌장암, 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암(CRC), 자궁내막암, 난소암, 흑색종 또는 다발성 골수종으로부터 선택되는 암 치료용 약학 조성물.
  55. 제 51 항에 있어서,
    변이된 Ras-양성암은 췌장암인 암 치료용 약학 조성물.
  56. 제 51 항에 있어서,
    변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 변이된 Ras 항원을 발현하고 있는 열-불활성 재조합 전효모인 암 치료용 약학 조성물.
  57. 제 55 항에 있어서,
    변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법은 효모-기반 면역요법 제품의 GI-4000 시리즈 또는 이의 등가물에서 산물인 암 치료용 약학 조성물.
  58. 제 57 항에 있어서,
    산물은 GI-4014, GI-4015, GI-4016 또는 GI-4020로부터 선택되는 암 치료용 약학 조성물.
  59. 제 51 항에 있어서,
    효모-기반 면역요법은 젬시타빈 또는 이의 등가물과 병용하여 투여되는 암 치료용 약학 조성물.
  60. 제 51 항에 있어서,
    암환자의 종양은 효모-기반 면역요법으로 치료 전에 외과적으로 절제되어 있는 암 치료용 약학 조성물.
  61. 제 46 항에 있어서,
    학습집단은 효모-기반 면역반응 발생 요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 유익을 수득하고 유익을 수득하지 못한 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  62. 제 46 항에 있어서,
    소정의 피쳐들은 표 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6에 나열된 하나 이상의 피쳐를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  63. 제 46 항에 있어서,
    시료에 대해 행해진 질량 분광분석은 MALDI-TOF 질량 분광분석을 행하는 것을 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  64. 제 63 항에 있어서,
    MALDI-TOF 질량 분광분석은 혈액-유래 시료를 20,000회 초과의 레이저 조사로 처리하는 심층 MALDI 질량 분광분석을 행하는 단계를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  65. 제 46 항에 있어서,
    소정의 m/z 영역은 이러한 암환자들의 혈액-유래 시료가 20,000회 초과의 레이저 조사로 처리되는 심층 MALDI 질량 분광분석에 의해 수득되는 암환자들의 다수의 질량 스펙트럼의 측정으로부터 수득되는 암 치료용 약학 조성물.
  66. a) 암환자로부터 혈액-유래 시료에 질량-분광광도를 행하고 시료로부터 질량 스펙트럼을 수득하는 단계;
    b) 프로그래밍된 컴퓨터에서, 하나 이상의 질량 스펙트럼에 대한 소정의 전처리 단계들 중 하나 이상을 수행하고, 전처리 단계를 수행한 후에 소정의 m/z 범위에 걸쳐서 질량 스펙트럼에서 선별된 피쳐의 적분된 세기값을 수득하며, 또한 효모-기반 면역요법으로 처리된 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 학습집단과 적분된 세기값을 비교하여 등급 표지로 질량 스펙트럼을 분류하는 단계;
    c) 질량 스펙트럼에 대한 등급 표지이 환자가 암에 대한 효모-기반 면역요법으로 이득을 얻을 것 같다는 것을 나타낼 때 암에 대한 효모-기반 면역요법을 암환자에게 투여하는 단계를 포함하는 효모-기반 면역요법을 위해 환자의 암으로부터 하나 이상의 암 항원을 발현하고 있는 열-불활성 재조합 전효모를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  67. 제 66 항에 있어서,
    환자는 추가적으로 암에 대한 효모-기반 면역요법에 의한 처리 이전에, 동시에, 또는 이후에 하나 이상의 추가적인 항암 요법에 의해 처리되는 암 치료용 약학 조성물.
  68. 제 66 항에 있어서,
    효모-기반 면역요법은 환자의 암으로부터 하나 이상의 암 항원을 발현하고 있는 사카로마이세스 세레비시애로부터의 열-불활성 재조합 전효모인 암 치료용 약학 조성물.
  69. 제 66 항에 있어서,
    환자는 변이된 Ras-양성암을 갖고, 여기서 환자는 변이된 Ras-양성암에 대한 효모-기반 면역요법으로 투여되는 암 치료용 약학 조성물.
  70. 제 69 항에 있어서,
    산물은 GI-4014, GI-4015, GI-4016 또는 GI-4020로부터 선택되는 암 치료용 약학 조성물.
  71. 제 66 항에 있어서,
    학습집단은 효모-기반 면역요법의 투여를 단독으로 또는 또 다른 항암 요법과 병용하여 유익을 수득하고 유익을 수득하지 못한 다른 암환자들 유래 등급-표지된 스펙트럼을 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  72. 제 66 항에 있어서,
    소정의 피쳐들은 표 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6에 나열된 하나 이상의 피쳐를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  73. 제 66 항에 있어서,
    시료에 대해 행해진 질량 분광분석은 MALDI-TOF 질량 분광분석을 행하는 것을 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  74. 제 73 항에 있어서,
    MALDI-TOF 질량 분광분석은 혈액-유래 시료를 20,000회 초과의 레이저 조사로 처리하는 다중 조사 질량 분광분석을 행하는 단계를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
  75. 제 66 항에 있어서,
    소정의 m/z 영역은 다수의 질량 스펙트럼에 의해 수득되는 암환자들의 다수의 질량 스펙트럼을 측정하여 수득되고, 여기서 이러한 암환자들의 혈액-유래 시료를 20,000회 초과의 레이저 조사로 처리하는 암 치료용 약학 조성물.
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