KR102134954B1

KR102134954B1 - CEACAM6 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 포함하는 선암 치료제

Info

Publication number: KR102134954B1
Application number: KR1020180002350A
Authority: KR
Inventors: 이옥준; 손승명
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-01-08
Filing date: 2018-01-08
Publication date: 2020-07-16
Anticipated expiration: 2038-01-08
Also published as: KR20190084517A

Abstract

본 발명은 CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 발현 억제를 위한 siRNA 및 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)를 포함하는 siRNA 전달 복합체에 관한 것으로, 본 발명의 siRNA 전달 복합체를 이용하면 산성 미세환경의 종양세포에서 CEACAM6를 효과적으로 억제하므로 선암 치료제로 유용하게 이용할 수 있다.

Description

CEACAM6 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 포함하는 선암 치료제{siRNA for inhibiting CEACAM6 expression and therapeutic agent for adenocarcinoma comprising thereof}

본 발명은 CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 발현 억제를 위한 siRNA 및 이를 포함하는 선암 치료제에 관한 것이다.

암은 선진국에 있어서 사망률의 주요 원인이다. 암치료의 목적으로 많은 화학요법제가 과거 50년간에 개발되었다. 화학요법제의 대부분은 알킬화제, 대사길항제, 안트라사이클린(anthracycline), 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제 및 항종양제로 분류할 수 있다. 이들 약제 모두가 세포분열 또는 DNA의 합성에 영향을 미쳐 어떠한 형태로 기능하는 메커니즘을 통해 치료효과를 초래한다.

선암(adenocarcinoma)은 특히 선(gland)을 구성하고 있는 세포에서 발생하는 암으로서 위 ·장 ·기관지 ·자궁(체부) ·담낭 등의 점막을 비롯하여, 전립선·난소 ·갑상선 ·이자의 선 조직이나 배설관에서 발생한다. 암 중에서 가장 많이 발생하는 위암의 대부분이 선암을 나타내지만, 자궁경부암의 대부분은 편평상피암이고 선암은 드물다. 양성인 선종과 비슷하며 악성을 나타내는 것도 있는데 이것은 특히 악성선종이라 한다.

이러한 선암종이 진행됨에 따라 암의 단계를 확인할 수 있으며 수술, 화학요법 및 방사선을 이용하여 치료를 하게 된다.

종래의 화학요법제 대신에 최근 들어 암세포에 특이적으로 발현하는 분자를 표적으로 하는 분자 표적약의 개발이 진행되고 있다. 이러한 분자 표적약의 등장에 의해 종래의 화학요법제에 고유의 부작용이 회피되어 암환자의 삶의 질(QOL)에 기여하는 암치료가 가능해져 있다. 이러한 분자 표적약에는 저분자(small molecule)의 약제 외에 항체 등의 고분자의 약제도 포함되며, 치료 항체는 생체내에 선천적으로 존재하는 분자로 생체에 미치는 독성이 낮다는 이점 외에, 이펙터 기능을 매개로 한 작용 메커니즘에 의해 표적 세포를 특이적으로 상해하여 치료효과를 발휘하는 이점도 갖기 때문에, 최근 많은 치료 항체가 시판되고 있으나 아직까지 암 종류에 따라 고형암 표적 치료제는 시도된 바 없다.

(0001) 대한민국 공개 특허 KR10-2017-0128567 (0002) 대한민국 공개 특허 KR10-2009-0111299

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명은 CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하며, 서열번호 1로 표기되는 염기서열 및 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)을 포함하는 것인 siRNA 전달 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하며, 서열번호 1로 표기되는 염기서열 및 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)을 포함하는 것인 siRNA 전달 복합체를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 시스테인(Cys)을 포함하는 PNA 올리고머를 m-크레졸 용액을 사용하여 레진(resin)으로부터 절단하는 단계;

TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamine)를 서열번호 1로 표시되는 PNA의 아미노산 (N) 말단에만 결합하여 역상 고속 액체 크로마토 그래피(RP-HPLC) 및 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)에 의해 합성된 PNA 올리고머를 정제하는 단계; 및

PNA 올리고머의 C-말단에 서열번호 3으로 표시되는 PHIP 서열을 상기 PNA 올리고머의 C-말단과 이황화 결합을 형성시키는 단계를 포함하는 CEACAM6 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 전달 복합체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA 전달 복합체를 포함하는 선암(adenocarcinoma)을 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 CEACAM6 유전자의 발현을 억제하는 siRNA 전달 복합체는 CEACAM6를 조절하는 siRNA를 산성 미세환경을 이용한 pHLIP로 정밀 주입하는 표적치료제로서 정상 조직에 일어나는 부작용을 최소화하면서 선암을 예방 및 치료하는데 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 폐 선암에서 CEACAM6 발현의 Kaplan-Meier 생존 분석결과를 나타낸 그래프이다(log-rank test, P = 0.0262).
도 2는 비표적 siRNA, GAPDH siRNA 및 4가지 siCEACAM6 서열로 형질 감염된 A549 세포주에서 CEACAM6 mRNA 발현양을 RT-PCR 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 PNA(siCEACAM6)와 pHLIP의 반응 혼합물(pHLIP-PNA)을 HPLC를 사용하여 정제한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 pH 6.2에서 pHLIP-siCEACAM6(100, 250, 500nM) 및 pHLIP-scr과 48 시간 동안 배양한 A549 세포의 웨스턴 블럿 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 pH 7.4(청색) 또는 6.2(적색)에서 48시간 동안 pHLIP-siCEACAM6 및 pHLIP-scr(500nM)으로 배양된 A549 세포의 유동 세포 계측 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 중성 및 산성 pH 값에서 A549 세포 생존 능력에 대한 CEACAM6 억제 효과를 나타낸 그래프이다: ANOVA로 수행된 통계 분석 및 데이터는 평균 ± S.D; n = 3인 화합물; *** P <0.001.
도 7은 (왼쪽)~44.8 mm³ A549 종양이 있는 누드 마우스에게 pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴을 정맥 주사하고 종양 부피를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다: Student 's t-test로 수행된 통계 분석 및 데이터는 평균 ± S.D로 표시됨 n = 5 인 경우; *** P <0.001.
(오른쪽)pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴 주입 3주 후 마우스의 폐 종양을 나타낸 사진이다.
도 8은 pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴이 처리된 폐 종양에서 Ki-67의 세포수를 정량화한 그래프이다: Error bars are SD(n = 5 tumors per group).
도 9는 pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴이 처리된 폐 종양에서 아폽토시스 세포(CC3)의 세포수를 정량화한 그래프이다: Error bars are SD(n = 5 tumors per group).
도 10은 부형제(vehicle), pHLIP-scr, pHLIP-siCEACAM6 및 시스플라틴으로 처리된 마우스의 폐 종양에 대한 조직학 및 면역 조직 화학 염색한 것을 확인한 사진이다.
도 11은 pHLIP-siCEACAM6(4 mg/kg)으로 처리된 마우스의 폐 종양을 공초점 현미경으로 찍은 사진이다: PNA-TAMRA(적색), 핵(파란색).
도 12A는 siCEACAM6와 cisplatin 병용 요법의 병용 치료한 실험적 설계한 것을 나타낸 모식도이다.
도 12B는 ~44.8 mm³ A549 종양이 있는 마우스에게 지시된 시간(화살표)에 pHLIP-siCEACAM6 또는 시스플라틴을 정맥 내 주사하여 종양 체적을 측정한 것을 나타낸 그래프이다: Student 's t-test로 수행된 통계 분석 및 데이터는 평균 ± S.D로 표시됩니다. n = 5인 경우; ** P <0.01, *** P <0.001.
도 13은 부형제(vehicle), pHLIP-siCEACAM6, 시스플라틴 및 pHLIP-siCEACAM6와 시스플라틴 병용처리한 폐 종양에서 Ki-67의 세포수를 정량화한 그래프이다: Error bars are SD(n = 5 tumors per group).
도 14는 부형제(vehicle), pHLIP-siCEACAM6, 시스플라틴 및 pHLIP-siCEACAM6와 시스플라틴 병용처리한 폐 종양에서 아폽토시스 세포(CC3)의 세포수를 정량화한 그래프이다: Error bars are SD(n = 5 tumors per group).
도 15는 부형제(vehicle), pHLIP-siCEACAM6, 시스플라틴 및 pHLIP-siCEACAM6와 시스플라틴 병용처리한 마우스의 폐 종양을 공초점 현미경으로 찍은 사진이다: PNA-TAMRA(적색), 핵(파란색).
도 16은 본 발명에서 제작한 pHLIP-scr 및 pHLIP-siCEACAM6에 대한 구조를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이에 본 발명자들은 선암에서 과발현하는 CEACAM6를 억제하기 위하여 산성환경에서만 작용하는 펩티드벡터(pHLIP)와 CEACAM6에 대한 siRNA(siCEACAM6)를 peptide nucleic acid(PNA) 형태로 제작한 것을 연결하여 새로운 siRNA 전달 복합체를 제조하여 종양 특이 산성 미세환경을 표적으로 펩티드에 연결된 siRNA(siCEACAM6)가 암 세포막을 통과하게 하였으므로 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 siRNA(small-interfereing RNA) 전달 복합체로서, 하기의 구조식을 갖고, CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하며, 하기 구조식은 서열번호 1로 표기되는 염기서열 및 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)을 포함하는 것인 siRNA 전달 복합체를 제공한다.

[구조식 1]

본 발명의 일실시예에서, 상기 서열번호 1로 표기되는 염기서열은 서열번호 2로 CEACAM6 유전자의 siRNA를 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 제작한 것이다(도 16 참조).

본 발명의 일실시예에서, 상기 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)는 서열번호 3으로 표시되는 암의 산성환경에서 선택적으로 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터인 것이다.

본 발명의 "pHLIP"는 암의 산성 미세환경을 이용한 펩티드 벡터(peptide vector)이다. 암세포는 생존을 위해 정상세포보다 많은 양의 포도당을 소모하며, 산소 농도에 관계없이 대부분을 젖산으로 대사하며 이렇게 형성된 젖산과 수소 이온은 암세포 밖으로 배출되어 종양의 세포외 환경은 산성화가 된다. 암 산성환경에서 선택적으로 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터(low pH-induced transmembrane structure, pHLIP)가 Reshetnyak 등에 의해 개발되었고, 이를 이용해 분자량이 작은 물질을 세포 내부로 주입할 수 있으며, 펩티드 벡터는 산성 환경에서만 세포막을 통과하며 안정적인 나선구조를 형성하여 시린지 역할을 하게 된다. 펩티드 벡터의 C 말단에 운반 물질을 연결하면 세포질 내에서 이황화결합이 풀리며 작용하므로 본 발명에서는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 PNA 올리고머의 C 말단과 연결하였다.

본 발명의 "CEACAM6"는 CEA family에 속하는 당단백질로 대부분의 선암에서 과발현되며, 정상세포에서는 매우 낮게 발현된다.

본 발명의 "PNA(peptide nucleic acid)"는 펩디드유사인 백본(backbone) 곁사슬에 핵산염기가 결합한 구조를 갖춘 DNA 또는 RNA와 결합할 수 있는 중성인 유전자제어분자이고, PNA/DNA 2중사슬 쪽이 DNA/DNA 결합보다 열안정성이 크며, DNA 2중사슬에 대해 어느 쪽 사슬 염기배열의 일부와 상보적인 염기를 갖춘 PNA분자는 DNA 2중 사슬에 대해 강제적으로 2중 사슬을 풀어 기의 한쪽과 DNA-PNA 2중 사슬을 외가닥으로 하는 강력한 결합능력을 갖고 있다. PNA를 제작하기 위하여, 고상 합성(Solid Phase Synthesis) 방법 등을 사용한 커플링-캡핑-디프로텍팅(Coupling-Capping-Deprotecting)를 이용하여 원하는 염기서열을 갖도록 제조할 수 있다. 상기 PNA의 염기서열의 길이는 크게 제한되지는 않으나, 약 5 내지 30개, 바람직하게는 약 10 내지 20개의 염기서열을 갖는 것이 바람직하다.

아울러 PNA로 제작하면 극성을 띠지 않아 안정적이고 생체 내에서 쉽게 분해되지 않으며 표적 DNA 혹은 RNA와 매우 강하게 결합하는 특징으로 인해 세포 내부로 주입하기 적합하므로 본 발명에서는 pHLIP를 통해 주입할 물질로 siRNA를 PNA 형태로 제작하였다.

상기 구조식 1의 "AEEEA"는 친수성 링커(hydrophilic linker)의 역할을 위해 PNA 서열의 앞과 뒤에 추가하였다.

또한, 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 시스테인(Cys)을 포함하는 PNA 올리고머를 m-크레졸 용액을 사용하여 레진(resin)으로부터 절단하는 단계;

TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamine)를 서열번호 1로 표시되는 PNA의 아미노산 (N) 말단에만 결합하여 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)에 의해 합성된 PNA 올리고머를 정제하는 단계; 및

또한, 본 발명은 하기의 siRNA 전달 복합체를 포함하는 선암(adenocarcinoma)을 예방 및 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.

[구조식 1]

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 선암(adenocarcinoma)은 폐 선암, 위 선암, 대장암, 자궁경부선암 및 췌장암으로 이루어진 군 중 하나 이상의 선암을 예방 및 치료할 수 있으며, 보다 바람직하게는 폐 선암을 예방 및 치료할 수 있다.

또한, 본 발명의 siRNA 전달 복합체에 시스플라틴과 같은 물질을 병용 요법(combination therapy)과 같이 상승적인 효과를 거둘 수 있다.

본 발명의 조성물에는 상기의 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 유효성분과 양립 가능하여야 하며, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 한 성분 또는 둘 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있고, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있다. 특히, 동결건조(lyophilized)된 형태의 제형으로 제제화하여 제공하는 것이 바람직하다. 동결건조 제형 제조를 위해서 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 알려져 있는 방법이 사용될 수 있으며, 동결건조를 위한 안정화제가 추가될 수도 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한방법으로 또는 레밍톤 약학 과학(Remington's pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질병에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분 등의 함량 및 투여방법은 통상의 환자의 증후와 질병의 심각도에 기초하여 본 기술분야의 통상의 전문가가 결정할 수 있다. 또한 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 주사제, 연고제, 시럽제 등의 다양한 형태로 제제화 할 수 있으며 단위-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀봉된 앰플 및 병 등으로 제공될 수도 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 구강, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여시간, 방법, 배설율 또는 질병의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 본 기술분야의 통상의 전문가가 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 임상 투여를 위해 공지의 기술을 이용하여 본 발명의 조성물을 적합한 제형으로 제제화할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 siRNA 전달 복합체를 폐 선암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 폐 선암의 예방 및 치료방법을 제공한다.

이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시에는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.

< 실시예 1> 실험재료 및 방법

<1-1> PNA- pHLIP의 합성

PANAGENE(Daejeon, Korea)로부터 모든 PNA 올리고머(siCEACAM6, TAMRA-ooo-GATCACAGTCTCTGGAAGT-ooo-Cys; scrambled siRNA(scr), TAMRA-ooo-TGGTTTACATGTCGACTAA-ooo-Cys)를 구매하였다. -ooo- (11-amino-3,6,9-trioxaundecanoic acid, 친수성 링커) 및 시스테인을 포함하는 PNA 올리고머 서열은 BAG PNA 단량체를 갖는 자동 합성기를 사용하여 고상 합성을 통해 합성되었었다(PANAGENE의 PNA 올리고머 합성 기술 이용). 올리고머는 m-크레졸 : TFA(1 : 4) cocktail 용액을 사용하여 레진(resin)으로부터 절단되었다. 단일 이성질체인 5-carboxytetramethylrhodamine(TAMRA)은 PNA의 아미노산 (N) 말단에만 결합되었다. 역상 고속 액체 크로마토 그래피(RP-HPLC) 및 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)에 의해 PNA 올리고머를 정제하였다. 2 개의 PNA 올리고머는 각각 79℃ 및 75℃의 용융 온도(Tm)를 갖는다. pHLIP-PNA 구조물을 생성하기 위해, 다음의 PHIP 서열이 합성되었다: AAEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLDLVDADEGTCG(서열번호 3). PNA 올리고머의 C- 말단을 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 pHLIP와 접합시켰다. pHLIP-PNA 구조를 합성하기 위하여, pHLIP 및 PNA(펩타이드: PNA 1.5:1)를 어두운 곳에서 DMF/Tris(pH 7.5)의 혼합물에서 밤새 반응시켰다. 결합한 후, pH-LIP-PNA를 RP-HPLC로 정제하고 MALDI-TOF를 특정하였다. 13,700 M^-1cm^-1 (A), 6,600 M^-1cm^-1 (C), 11,700 M^-1cm^-1 (G), 8,800 M^-1cm^-1 (T), 200 M^-1cm^-1(F, Phenylalanine) and 32,300 M^-1cm^-1(TAMRA)의 순으로 건조시킨 다음 동결 건조시켰다(도 16).

<1-2> 세포 배양

인간 폐암 세포주(A549)는 American Type으로부터 구입하였다. 배양물에 L- 글루타민(2 mM), 페니실린(100 U/ml), 스트렙토 마이신(100 g/ml) 및 10% FBS를 포함하는 RPMI을 넣고 37℃로 5% CO₂에서 유지시켰다. 모든 pH 조절 세포 배양 실험에서, 세포를 HEPES 또는 pH 6.2와 MES로 pH 7.4로 완충된 RPMI 중의 10% FBS와 함께 배양하였다.

<1-3> CEACAM6 siRNA 형질전환

siRNA 이중 가닥은 Dharmacon Research, Inc(Lafayette, CO)에서 구입하였다. 저해의 특이성을 확인하기 위해 대조군인 비표적 siRNA를 음성 대조군으로 사용하였다.

CEACAM6 siRNA 실험에 사용된 siRNA 서열은 다음과 같습니다:

대조군(Negative control): UGGUUUACAUGUCGACUAA(서열번호 7)

Seq #1: GAUCACAGUCUCUGGAAGU(서열번호 2),

Seq #2: GAACAUGGCUAAAUACAAU(서열번호 4),

Seq #3: GAGGGUAACUUAACAGAGU(서열번호 5),

Seq #4: CUACAUACUCCAACUGAAA(서열번호 6).

인간 폐암 세포주(A549)는 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine RNAiMax (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 10 nM siRNA 이중 가닥으로 형질 감염시켰다. 48시간 후, 실시간 RT-PCR에 의해 CEACAM6 유전자가 억제된 것을 확인하였다.

<1-4> Quantitative real-time RT- PCR

TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 총 RNA를 분리하고 iScript^TM cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다. 정량 실시간 RT-PCR(qRT-PCR)은 iQ SYBR Green supermix (Bio-Rad)를 사용하여 수행하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다: GAPDH (forward, 5'-CCTGCACCACCAACTGCTTA-3'(서열번호 8), reverse, 5'-GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT(서열번호 9)); CEACAM6(forward, 5'-GACAGTTCCATGTATACCCG-3'(서열번호 10), reverse, 5'-ACAGCATCCTTGTCCTCC-3'(서열번호 11)). 열 사이클링(Thermal cycling) 및 형광 검출은 S1000 Thermal cycler 실시간 PCR 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 수행되었다. 반응은 다음 열 조건을 사용하여 CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad)에서 실행하였다 : 95℃에서 3분간의 초기 변성 단계 및 40 사이클의 변성 95℃에서 10초 및 어닐링/신장(extension) 55℃에 30초. 상대적 유전자 발현 수준은 GAPDH 발현에 대한 비율로 평가하였다.

<1-4> 웨스턴 블랏

인간 폐암 세포주(A549)를 MES로 HEPES 또는 pH 6.2로 pH 7.4로 완충된 RPMI 중의 1% FBS와 배양하고, 반응 완충액에 48시간 동안 현탁시킨 pHLIP-PNA로 처리하였다. 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)로 전기영동으로 분리하고 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유로 블로킹한 다음 마우스 anti-CEACAM6 모노클로 날 항체(9A6, Santa Cruz Biotechnology Inc.) 또는 마우스 항-GAPDH 모노클로 날 항체(6C5, Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 loading control로 배양하였다. 단백질 복합체는 향상된 화학 발광 시약(Thermo Fisher Scientific)으로 검출되었다.

<1-5> 유동세포 분석

유동 세포 계측법을 위해, 인간 폐암 세포주(A549)는 HEPES 또는 pH 6.2와 MES로 pH 7.4에서 완충된 RPMI 중의 10% FBS로 배양하고, 48시간 동안 반응 완충액에 현탁된 pHLIP-PNA로 처리하였다. 세포를 세척하여 유리된 pHLIP-PNA를 제거한 후, 500㎕ PBS(pH 7.4)에 다시 현탁하고 유세포 분석기(Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석하였다.

<1-6> 세포 생존율 분석

인간 폐암 세포주(A549)에 대한 CEACAM6 억제 효과를 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 분석법(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)을 사용하였다. 인간 폐암 세포주(A549)(5 x 10⁴cells/ml)를 96- 웰 플레이트에서 0, 100, 250, 500 또는 1,000 nM의 투여량으로 pHLIP-siCEACAM6으로 48시간 동안 처리하고, pHLIP-scr을 대조군으로 사용하였다. 지시된 pH에서 모든 처리를 수행하였다. 48시간 후에, CCK-8 분석(Dojindo, Kumamoto, Japan)을 사용하여 세포 성장의 정도를 평가하였다. CCK-8 용액(10㎕)을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 450nm에서의 흡광도를 다중선 판독기(Lambda Bio-20, Beckman)로 측정하였다. 세포 생존력은 대조군 세포의 백분율로 표시하였다.

<1-7> 생체 내 종양 이종 이식 실험

모든 동물 실험은 한국 생명 공학 연구원 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받은 프로토콜에 따라 수행되었다. 5주령의 BALB/c athymic nude mice(5 마리 마우스 1.2 x 10⁷ cells/mouse)의 오른쪽 측면에 인간 폐암 세포주(A549)를 주사하였다. 종양 성장은 캘리퍼스로 길이(L), 폭(W) 및 높이(H)를 측정하고 식 V =(L × W × H) × 0.5를 사용하여 측정하였다. 종양 형성시(∼44.8 mm³), 마우스에게 pHLIP-PNA을 근육내(i.v.) 및 시스플라틴을 정맥내(i.p.) 주입하였다,

<1-7> 공초점 레이저 현미경(Confocal microscopy)

획득한 종양 조직의 공초점(confocal) 준비를 위해 종양을 OCT에서 플래시 동결시킨 다음 2μm 절편으로 자른다. 조직 절편을 차가운 아세톤으로 고정시키고, PBS로 세척하고, 과산화수소와 반응시켜 내인성 퍼록시다아제를 비활성화시키고, PBS로 세척하였다. DAPI를 첨가하여 세포핵을 염색하였다. 모든 세척은 표면 결합 된 pHLIP를 세척하기 위해 pH 7.4의 PBS를 사용하여 수행하였다. confocalmicroscope(Zeiss LSM 710 META, Jena, Germany)를 사용하여 이미지를 수집하고 Zensoftware(버전 8.0, Zeiss, Jena, Germany)를 사용하여 처리하였다.

<1-8> 조직학 및 기타 분석 기술

생쥐는 이산화탄소 질식시켜 죽였다. 염색은 포르말린 고정하고, 파라핀으로 고정된 종양 절편(두께 4㎛)에서 수행하였다. 면역염색은 BenchMark XT 자동 염색기(Ventana MedicalSystems Inc., Tucson, AZ, USA)를 사용하였다. anti-cleaved caspase 3(1:100, BioCare Medical) 및 anti-cleaved caspase 3 항체(9A6, 1:4000, Santa Cruz Biotechnology Inc., 미국 텍사스 달라스 소재) Ki67(1: 100, VP-K452, 벡터 실험실)를 사용하였다. 종양 부위 당 양성 세포의 수를 정량화하였다.

<1-9> 암 유전체 지도( TCGA ) 분석

폐 선암 515명의 환자의 임상 병리학 적 보고서와 결합 된 다차원 게놈 데이터를 포함하는 TCGA data set(http://tcga-data.nci.nih.gov/)는 cBioPortal 도구(http://www.cbioportal.org)를 통해 분석되었다. CEACAM6의 mRNA 발현 분석을 위해 TCGA의 폐 선암종 환자의 RNA 서열 데이터를 사용하였다. 단일 변량 생존 분석을 위해 alog-rank test를 사용하여 Kaplan-Meier plots을 폐암 선암 환자의 전체 생존 데이터를 사용하여 나타내었다.

<1-10> 통계 분석

세포 생존률 분석에서 세 그룹의 비교를 위해 양방향 분산 분석(ANOVA)을 수행하였다. 동물 실험을 위해서, 각 그룹에 대한 마우스 및 종양 무게를 Student t-test를 사용하여 비교하였다. Student t-test를 이용하여 각 군의 면역 염색 결과를 비교하였다. Kaplan-Meier 방법을 이용하여 생존 곡선을 추정하고 log rank test를 사용하여 비교하였다. P 값 ≤ 0.05는 통계적으로 유의하다고 판단하였다. 모든 통계 테스트는 양면 분석되었으며 SPSS 통계 패키지, 버전 18.0 (IBM, NY, USA)을 사용하여 수행되었다.

< 실시예 2> 실험 결과

<2-1> TCGA 데이터 분석 결과

cBioPortal tool(http://www.cbioportal.org)로 분석 한 515명의 폐 선암 환자의 TCGA data set에 따르면, 515명의 환자 중 50명이 CEACAM6 mRNA 과발현을 보였다. Kaplan-Meier 생존 분석에서 높은 수준의 CEACAM6 mRNA 발현은 전체 생존율이 낮았다(P = 0.0262)(도 1).

<2-2> pHLIP -PNA siCEACAM6의 활성 분석 결과

pHLIP-PNA siCEACAM6를 제작하기 위하여 CEACMA6 발현의 효율적인 4개의 siRNA 서열을 스크리닝하였다. 인간 폐암 세포주(A549)는 실시예 1-3에 기재된 바와 같이 비표적 siRNA, GAPDH siRNA 및 4가지 siCEACAM6 서열로 형질전환시켰다. 모든 4개의 서열은 비표적 siRNA(도 2)와 비교하여 10 nM 농도에서 트랜스펙션 후 48시간 후에 유사한 수준에서 CEACAM6 mRNA 발현을 억제하는 것으로 확인하였으며, siCEACAM6 서열 #1을 pHLIP로 테더링하기 위해 선택하였다.

pHLIP-PNA siCEACAM6 구조는 PNA 올리고머의 카르복시(C)-말단을 pHLIP와 결합시켜 합성하였으며, 대조군으로서 pHLIP-scr을 사용하였다. PHLIP-PNA는 PNA에 부착된 TAMRA 표지로 변형되었다. pHLIP-PNA의 제조는 RP-HPLC 및 질량 분광법에 의해 입증하였다(도 3).

또한, pHLIP-PNA 접합체가 인간 폐암 세포주(A549)에 siCEACAM6을 전달하고 CEACAM6 단백질을 감소시킬 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 인간 폐암 세포주 (A549)를 pH 6.2에서 pHLIP-siCEACAM6(100, 250, 500nM) 및 pHLIP-scr과 함께 48시간 동안 배양하였다. 웨스턴 블랏 분석은 낮은 pH에서 pHLIP-siCEACAM6을 과발현하는 인간 폐암 세포주(A549)가 pHCE-siCEACAM6의 투여량에 따라 내인성(endogenous) CEACAM6의 단백질 발현 수준이 유의하게 낮으므로 siCEACAM6의 세포 내 전달 및 활성을 억제하였다(도 4).

또한, 인간 폐암 세포주(A549) 연관성을 중성 및 산성 pH 값에서 유동 세포 계측법으로 측정한 결과, 인간 폐암 세포주(A549)를 pH 7.4 또는 6.2에서 48 시간 동안 pHLIP-siCEACAM6 및 pHLIP-scr(500nM)과 함께 배양하였다. pHLIP-siCEACAM6 인간 폐암 세포주(A549)는 낮은 pH에서 관찰되었다. 부착된 PNA 서열은 pHLIP-PNA 구조물의 결합에 거의 영향을 미치지 않았다(도 5).

또한, 중성 및 산성 pH 값에서 세포 생존능 분석을 수행한 결과, pHLIP-siCEACAM6에 의한 CEACAM6의 저해는 투여량에 따라 pH 6.2에서 인간 폐암 세포주 (A549)의 생존력을 감소시켰고(도 6), 이 결과를 통하여 PNA에 대한 pHLIP 펩타이드의 연결이 CEACAM6 mRNA를 표적으로하고, 전달된 siRNA에 의한 CEACAM6 단백질의 발현을 억제함을 알 수 있었다.

<2-3> CEACAM6의 발현억제 동물 모델에서 폐 종양 억제 분석 결과

siCEACAM6이 생체 내에서 CEACAM6 발현은 억제할 수 있는지 분석하였다. 생체 내 분석을 위해, BALB/c 누드 마우스에 1.2×10⁷A549 세포를 피하 주사하였다. 종양이 시작된 지 2주 후에, pHLIP-siCEACAM6와 음성 대조군으로서 생리 식염수를 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. pHLIP-siCEACAM6 투여의 최적 양을 확인하기 위해, 3주간의 치료 기간 동안 두 그룹의 마우스(n = 5 mice/group)에게 1일 2 회 투여량 (2mg/kg 및 4mg/kg)을 주입하였다. 또한, 시스플라틴은 폐암 치료의 중추이기 때문에, 시스플라틴 처리 마우스는 양성 대조군으로 사용되었다. 시스플라틴 2mg/kg을 주 2회 또는 3회 복강 내 투여하였다.

또한, 폐 종양 발생에 대한 pHLIP-siCEACAM6 전달의 영향을 평가하기 위해, 종양 성장은 2 또는 3일마다 조사하였다. pHLIP-siCEACAM6 치료는 pHLIP-scr(pHLIP-siCEACAM6 2 mg/kg: 23.0%, pHLIP-siCEACAM6 4 mg/kg: 35.5%, 모든 P <0.001)로 치료 한 대조 마우스에 비해 종양 성장을 유의하게 억제하였다.

부형제(vehicle)와 비교하여 시스플라틴 치료군에서도 종양 성장의 유의한 감소가 관찰되었다(시스플라틴 2 회/주: 35.0%, 시스플라틴 3회/주: 46.7%, 모두 P <0.001)(도 7).

또한, 종양 퇴행의 메커니즘을 더 연구하기 위해, 폐 종양을 수확하고 증식 및 세포 사멸 표지로 염색하였다. pHLIP-scr 군과 비교하여, pHLIP-siCEACAM6으로 처리한 종양의 증식이 감소된 것을 확인하였다(pHLIP-scr: 21%, pHLIP-siCEACAM6: 15%, P = 0.004)(도 8).

시스플라틴 처리는 또한 증식의 감소를 가져왔다(vehicle 27%, 시스플라틴 11%, P <0.001)(도 9)

이러한 데이터는 종양에서의 CEACAM6의 생체 내 침묵이 증식 억제를 유도한다는 것을 나타낸다. 세포사멸(apoptosis)의 표지자인 cleaved caspase 3(CC3) 염색은 pHLIP-siCEACAM6 군에서만 증가였으므로 siCEACAM6이 폐 종양 성장을 억제한 것을 확인했다(P = 0.025)(도 8, 도 9 및 도 10).

또한, 생체 내 폐 선암에서 siCEACAM6을 전달하는 pHLIP-siCEACAM6의 능력을 조사한 결과, 종양 조직은 공 초점 영상 분석을 위해 분리되었다.

TAMRA로 표지된 pHLIP-siCEACAM6에서, 강한 형광 신호가 pHLIP-siCEACAM6 처리된 동물의 종양 세포 표면에서 관찰되었으며, 이것은 생체 내 siCEACAM6의 효율적인 세포 내 전달하는 것을 나타낸다(도 11).

<2-4> s iCEACAM6과 시스플라틴 동시 처리에 따른 폐 종양 억제 분석 결과

화학 요법과 CEACAM6 표적화가 항종양 효과를 향상시킬 수 있는지 분석하기 위하여, 1.2 × 10⁷ A549 세포를 피하 주사한 다음 2주 후에 마우스를 무작위로 선택하였다(n = 5 mice/group): (i) vehicle, (ii) pHLIP-siCEACAM6, (iii) 시스플라틴 및 (iv) pHLIP-siCEACAM6 + 시스플라틴.

iCEACAM6과 시스플라틴을 병행하여 치료를 위해 각각 pHLIP-siCEACAM6을 2 mg/kg로 최적용량을 결정하였다. 세포주 주사 2주 후에 pHLIP-siCEACAM6을 꼬리 정맥을 통해 마우스에 2회 주사하고, 시스플라틴을 3주간의 치료 기간동안 1주일에 2 회 주사하였다(도 12A).

종양의 부피는 2 또는 3일마다 측정되었으며, 3주간의 전신 치료 후, vehicle과 비교하여 pHLIP-siCEACAM6 치료군의 마우스는 체적이 21.8% 감소했다(P = 0.004). 시스플라틴 치료로 종양 감소의 29.9%(P <0.001)를 보였다. pHLIP-siCEACAM6과 시스플라틴을 동시에 처리한 군은 종양 부피의 47%의 성장 감소를 확인했다(P <0.001)(도 12B). siCEACAM6s는 원발성 종양에 현저한 치료 활성을 나타내었고 세포 독성 화학 요법으로 효과가 증진되었다.

siCEACAM6 처리의 생물학적 효과를 더 평가하기 위해, 증식 및 세포사멸에 대한 종양 샘플을 염색한 결과, siCEACAM6과 시스플라틴을 병용 투여한 종양에서 siCEACAM6 (P= 0.121) 또는 시스플라틴 단독(P= 0.271)(siCEACAM6: 19.8%, 시스플라틴: 18.4, pHLIP-siCEACAM6: 16.6%)에 비해 세포 증식은 유의하게 감소하지 않았다. 그러나 병용 치료된 종양은 siCEACAM6(P= 0.022) 또는 시스플라틴 단독 (P= 0.016)과 비교하여 CC3 양성 세포 수가 증가했다(도 13, 14 및 15).

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> siRNA for inhibiting CEACAM6 expression and therapeutic agent for adenocarcinoma comprising thereof <130> PN1711-425 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Converting CEACAM6 siRNA to PNA <400> 1 gatcacagtc tctggaagt 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA <400> 2 gaucacaguc ucuggaagu 19 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pHLIP(low pH-induced transmembrane structure) <400> 3 Ala Ala Glu Gln Asn Pro Ile Tyr Trp Ala Arg Tyr Ala Asp Trp Leu 1 5 10 15 Phe Thr Thr Pro Leu Leu Leu Leu Asp Leu Asp Leu Val Asp Ala Asp 20 25 30 Glu Gly Thr Cys Gly 35 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA #2 <400> 4 gaacauggcu aaauacaau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA #3 <400> 5 gaggguaacu uaacagagu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA #4 <400> 6 cuacauacuc caacugaaa 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 siRNA Negative control <400> 7 ugguuuacau gucgacuaa 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 8 cctgcaccac caactgctta 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 9 gtcttctggg tggcagtgat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 forward primer <400> 10 gacagttcca tgtatacccg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CEACAM6 reverse primer <400> 11 acagcatcct tgtcctcc 18

Claims

CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하는 하기 구조식의 siRNA(small-interfereing RNA) 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 폐 선암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서,
하기 구조식의 siRNA 전달 복합체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PNA(peptide nucleic acid) 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)가 포함되고,
상기 pHLIP는 산성 환경에서 선택적으로 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터이고,
상기 siRNA 전달 복합체는 선암에서 과발현하는 CEACAM6를 억제하기 위하여 산성환경에서만 작용하는 펩티드벡터(pHLIP)와 CEACAM6에 대한 siRNA(siCEACAM6)를 peptide nucleic acid(PNA) 형태로 제작한 것을 연결한 siRNA 전달 복합체이고, 종양 특이 산성 미세환경을 표적으로 펩티드에 연결된 siRNA(siCEACAM6)가 암 세포막을 통과하고,
상기 서열번호 1로 표기되는 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 CEACAM6 유전자의 siRNA를 PNA(peptide nucleic acid) 형태로 제작한 것이고,
siRNA 전달 복합체는 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 시스테인(Cys)을 포함하는 PNA 올리고머를 m-크레졸 용액을 사용하여 레진(resin)으로부터 절단하고, TAMRA(5-carboxytetramethylrhodamine)를 서열번호 1로 표시되는 PNA의 아미노산 (N) 말단에만 결합하여 역상 고속 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 및 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight)에 의해 합성된 PNA 올리고머를 정제하고, PNA 올리고머의 C-말단에 서열번호 3으로 표시되는 pHLIP 서열을 상기 PNA 올리고머의 C-말단과 이황화 결합을 형성하도록 반응시켜 제조된 것이고,
상기 siRNA 전달 복합체는 siRNA가 10nM 농도에서 트랜스펙션 48시간 후에 폐선암에서 과발현 하는 CEACAM6 mRNA 발현을 억제하고, 폐 선암 세포에서 세포증식능(Ki-67 index)을 낮추고 세포사(cleaved caspase 3)를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 폐 선암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물:

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CEACAM6(Carcinoembryonic antigen-related cel l adhesion molecule 6) 유전자의 발현을 억제하는 하기 구조식의 s iRNA(small-interfereing RNA) 전달 복합체, 및 시스플라틴을 유효성 분으로 포함하는 폐 선암의 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서,
하기 구조식의 siRNA 전달 복합체는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 PNA(peptide nucleic acid) 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 pHLIP(low pH-induced transmembrane structure)가 포함된 것을 특징으로 하는 폐 선암의 예 방 및 치료용 약제학적 조성물:
제 2 항에 있어서,
상기 pHLIP는 산성 환경에서 선택적으로 나노시린지(nanosyringe) 기능을 하는 펩티드 벡터인 것을 특징으로 하는 조성물.
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