KR102135679B1 - 생분해성 폴리머를 포함하는 표적 친화성 물질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

표적 친화성 물질 및 이의 용도를 제공한다. 이에 의하면, 비특이적 흡착에 의한 영향을 최소화하면서 생물학적 시료로부터 온전한 표적을 직접 분리 또는 검출하고, 표적의 하위집단을 분리 또는 검출할 수 있다. 또한, 동일한 시료를 반복 사용할 수 있으므로 정확도가 높은 분석 결과를 얻을 수 있다.

Description

생분해성 폴리머를 포함하는 표적 친화성 물질 및 이의 용도{Target affinity material including a biodegradable polymer and use thereof}

생분해성 폴리머를 포함하는 표적 친화성 물질 및 그의 용도에 관한 것이다.

질병의 진단을 위해, 암을 포함한 특정 질병과 관련성이 있는 소포를 분리하고, 소포에 존재하는 단백질과 특정 마이크로RNA의 프로파일을 분석하는 것이 필요하다.

소포의 하위집단(subpopulation)을 분리 또는 검출하기 위하여, 형광 활성 세포 분류(Fluorescence activated cell sorting: FACS) 방법을 사용하여 소포의 하위집단을 분석하는 경우, 세포의 손실, 비특이적 결합, 실험의 복잡성뿐만 아니라, 시료의 준비 단계가 필요하여 시료가 왜곡될 수 있다. 또한, 1회의 실험에 최대 4종의 항체를 사용할 수 있으나, 2종 이상의 항체를 사용하면 정확도가 떨어져 사용할 수 있는 항체의 종류가 한정되는 문제점이 있다. 아울러 FACS 방법은 균질성(homogeneity)이 떨어질 수 있다.

한편, 면역친화성 비드를 사용하여 소포를 분리하고 소포의 마이크로RNA를 분석하는 경우, 소포를 용해시키는 과정에서 소포의 단백질 또는 마이크로RNA가 비드에 비특이적으로 흡착하여 후속 실험에 영향을 미칠 수 있다.

따라서, 단백질 또는 마이크로RNA가 면역친화성 비드에 비특이적으로 흡착하는 것을 억제하여 후속 실험에 미치는 영향을 최소화할 필요가 있다.

표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질 및 고체 입자가 포함된 생분해성 폴리머를 포함하는 표적 친화성 물질을 제공한다.

상기 표적 친화성 물질을 사용하여 생물학적 시료로부터 표적을 분리하는 방법을 제공한다.

상기 표적 친화성 물질을 사용하여 생물학적 시료로부터 표적의 하위집단을 분리하는 방법을 제공한다.

표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질 및 고체 입자가 포함된 생분해성 폴리머를 포함하는 표적 친화성 물질이 제공된다.

표적은 검출하고자 하는 물질을 말한다. 표적은 예를 들면 소포, 세포, 단백질, 지질, 당, 또는 이들의 조합일 수 있다.

소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포를 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클(circulating microvesicle) 또는 마이크로입자(microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀(exosome), 엑토좀(쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicle: SMV)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic bleb), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 ㎚ 내지 100 ㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 ㎚ 내지 1,000 ㎚의 큰 막성 베지클일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 ㎚ 내지 5,000 ㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.

세포는 예를 들면, 암 세포일 수 있다. 암은 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종, 피부암, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 세포는 순환 종양 세포(Circulating Tumor cell: CTC) 또는 암 줄기 세포(Cancer stem cell: CSC)일 수 있다.

단백질은 소포 또는 세포의 표면 단백질일 수 있다. 지질은 소포 또는 세포의 막 지질일 수 있다. 당(sugar)은 소포 또는 세포의 막에 존재하는 지질 또는 표면 단백질에 접합된 당일 수 있다.

용어 "표적에 특이적으로 결합할 수 있는 물질"은 용어 "리간드(ligand)"와 상호 교환적으로 사용될 수 있다. 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 물질은 단백질에 특이적으로 결합하는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 당, 당단백질, 항원, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 호르몬, 신경전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린(pleckstrin) 상동성 도메인을 포함하는 단백질, 콜레스테롤-결합 단백질, 또는 이들의 조합일 수 있다. 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 것으로, 예를 들면 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab', 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 면역글로불린-결합 단백질을 매개로 생분해성 폴리머에 결합할 수 있다. 면역글로불린-결합 단백질은 단백질 G, 단백질 A, 단백질 A/G, 단백질 L, 또는 이들의 조합일 수 있다.

고체 입자는 구형, 다각면체, 플레이트, 선형, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 고체 입자는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 자성 입자, 또는 이들의 조합일 수 있다.

생분해성 폴리머는 친수성 폴리머일 수 있다. 친수성 폴리머인 경우 단백질 등에 의한 비특이적 결합을 감소시킬 수 있다.

생분해성 폴리머는 히알루론산(hyaluronic acid: HA), 콜라겐(collagen), 키틴(chitin), 키토산(chitosan), 헤파린(heparin), 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다. 생분해성 폴리머의 모노머는 히알루론산, 콜라겐, 키틴, 키토산, 헤파린, 또는 이들의 조합일 수 있다. 히알루론산은 글리코사미노글리칸 중 하나로서, D-글루쿠론산(glucuronic acid)과 D-N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine)으로 이루어진 중합체이다. 콜라겐은 단백질로서, 동물에서 세포외 기질의 주성분이고, 피부, 힘줄, 연골 등에 다량 함유되어 있다. 콜라겐은 약 28 종의 유형이 있다. 키틴은 당의 아미노 유도체로 이루어진 다당류로서 N-아세틸글루코사민이 β-1,4 결합으로 중합된 것을 말한다. 키토산은 키틴이 인체에 쉽게 흡수되도록 탈아세틸화시킨 물질이다. 헤파린은 황산기를 갖는 글루코사미노글리칸(glucosaminoglycan)이고, 대부분의 황산기 및 카르복시기가 음전하를 갖고, 항응고제로서 널리 사용된다.

생분해성 폴리머는 효소에 의해 분해될 수 있는 것일 수 있다. 상기 효소는 히알루로니다제(hyaluronidase), 콜라게나제(collagenase), 키티나제(chitinase), 헤파리나제(heparinase), 또는 이들의 조합일 수 있다. 히알루로니다제는 히알루론산을 가수분해하는 효소로서 탄수화물이나 글리코시드에 작용하여 글리코시드 결합을 가수분해하는 탄수화물 효소(carbohydrase)이다. 히알루로니다제는 뮤시나제(mucinase)라고도 한다. 콜라게나제는 콜라겐을 분해하는 단백질 가수분해 효소이다. Pro-X-Gly-Pro-Y라는 구조의 글리신과 프롤린 사이의 결합을 가수분해한다. 키티나제는 키틴의 글리코시드 결합을 가수분해하는 효소이다. 헤파리나제는 엔도형 헤파린 분해 효소를 말한다. 헤파리나제는 헤파리나제 I, 헤파리나제 II, 또는 헤파리나제 III일 수 있다.

표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질 및 고체 입자는 생분해성 폴리머의 상이한 영역에 결합하는 것일 수 있다. 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질은 생분해성 폴리머에 결합하고, 고체 입자도 생분해성 폴리머에 결합할 수 있다.

표적 친화성 물질은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 말한다. 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 표적 친화성 물질은 면역친화성(immunoaffinity) 물질로도 불릴 수 있다.

표적을 포함하는 생물학적 시료와 표적 친화성 물질을 인큐베이션하여 생물학적 시료 중 표적과 표적 친화성 물질의 복합체를 형성하는 단계로서,

상기 표적 친화성 물질은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질 및 고체 입자가 포함된 생분해성 폴리머를 포함하는 것인 단계;

상기 생물학적 시료로부터 상기 복합체를 분리하는 단계; 및

분리된 복합체와 생분해성 폴리머를 분해하는 물질을 인큐베이션하여 복합체로부터 표적을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 표적을 분리하는 방법이 제공된다.

표적, 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질 고체 입자, 생분해성 폴리머, 및 표적 친화성 물질은 전술한 바와 같다.

상기 방법은 표적을 포함하는 생물학적 시료와 표적 친화성 물질을 인큐베이션하여 생물학적 시료 중 표적과 표적 친화성 물질의 복합체를 형성하는 단계를 포함한다.

생물학적 시료는 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 또는 이들의 조합일 수 있다.

인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 인큐베이션은 예를 들면 0℃ 내지 상온에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 반응물을 회전, 볼텍싱, 교반, 또는 이들의 조합을 수행하면서 인큐베이션할 수 있다.

생물학적 시료 중 표적과 표적 친화성 물질의 복합체는 표적과 표적 친화성 물질의 특이적 결합에 의해 형성되는 것일 수 있다.

상기 방법은 생물학적 시료로부터 복합체를 분리하는 단계를 포함한다.

생물학적 시료로부터 복합체를 분리하는 단계는 당업자에게 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 분리는 원심분리, 여과, 세척, 투석, 친화성 크로마토그래피, 자성 분리, 밀도구배법, 자유유동전기이동법, 또는 이들의 조합을 수행될 수 있다.

상기 방법은 분리된 복합체와 생분해성 폴리머를 분해하는 물질을 인큐베이션하여 복합체로부터 표적을 분리하는 단계를 포함한다.

생분해성 폴리머를 분해하는 물질은 효소일 수 있다. 예를 들면, 상기 효소는 히알루로니다제(hyaluronidase), 콜라게나제(collagenase), 키티나제(chitinase), 헤파리나제(heparinase), 또는 이들의 조합일 수 있다. 히알루로니다제, 콜라게나제, 키티나제, 및 헤파리나제는 전술한 바와 같다.

복합체로부터 표적을 분리하는 단계는 당업자에게 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 분리는 원심분리, 여과, 세척, 투석, 친화성 크로마토그래피, 자성 분리, 밀도구배법, 자유유동전기이동법, 또는 이들의 조합을 수행될 수 있다.

상기 방법은 분리된 표적을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 검출은 당업자에게 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 검출은 면역블로팅, 면역침강, 크로마토그래피, 질량 분석, 단백질 어레이, PCR(polymerase chain reaction), RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction), 마이크로어레이, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다.

표적을 포함하는 생물학적 시료와 표적 친화성 물질을 인큐베이션하여 생물학적 시료 중 표적과 표적 친화성 물질의 복합체를 형성하는 단계로서,

상기 표적 친화성 물질은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 제1 물질 및 고체 입자가 포함된 생분해성 폴리머를 포함하는 것인 단계;

상기 생물학적 시료로부터 상기 복합체를 분리하는 단계;

분리된 복합체와 생분해성 폴리머를 분해하는 물질을 인큐베이션하여 복합체로부터 표적을 분리하는 단계; 및

분리된 표적과 상기 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 제2 물질을 인큐베이션하여 제2 물질에 특이적으로 결합하는 표적의 하위집단(subpopulation)을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 표적의 하위집단을 분리하는 방법이 제공된다.

상기 방법은 표적을 포함하는 생물학적 시료와 표적 친화성 물질을 인큐베이션하여 생물학적 시료 중 표적과 표적 친화성 물질의 복합체를 형성하는 단계를 포함한다.

상기 표적 친화성 물질은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 제1 물질 및 고체 입자가 포함된 생분해성 폴리머일 수 있다. 표적, 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 고체 입자, 생분해성 폴리머, 및 복합체는 전술한 바와 같다.

상기 방법은 생물학적 시료로부터 복합체를 분리하는 단계를 포함한다. 생물학적 시료 및 분리는 전술한 바와 같다.

상기 방법은 분리된 복합체와 생분해성 폴리머를 분해하는 물질을 인큐베이션하여 복합체로부터 표적을 분리하는 단계를 포함한다. 생분해성 폴리머를 분해하는 물질, 인큐베이션, 및 분리는 전술한 바와 같다.

상기 방법은 분리된 표적과 상기 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 제2 물질을 인큐베이션하여 제2 물질에 특이적으로 결합하는 표적의 하위집단(subpopulation)을 분리하는 단계를 포함한다. 인큐베이션 및 분리는 전술한 바와 같다.

제1 물질 및 제2 물질은 표적의 상이한 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 제1 물질과 제2 물질은 상이한 항원 또는 상이한 에피토프에 특이적으로 결합하는 상이한 항체일 수 있다.

상기 방법은 분리된 표적의 하위집단을 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 검출은 전술한 바와 같다.

표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질 및 고체 입자가 포함된 생분해성 폴리머를 포함하는 표적 친화성 물질을 포함하는 하나 이상의 표적을 분리하기 위한 조성물 또는 키트가 제공된다.

표적, 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 고체 입자, 생분해성 폴리머, 및 표적 친화성 물질은 전술한 바와 같다.

상기 조성물 또는 키트는 생분해성 폴리머를 분해할 수 있는 효소를 더 포함할 수 있다. 효소는 예를 들면, 히알루로니다제(hyaluronidase), 콜라게나제(collagenase), 키티나제(chitinase), 헤파리나제(heparinase), 또는 이들의 조합일 수 있다. 히알루로니다제, 콜라게나제, 키티나제, 및 헤파리나제는 전술한 바와 같다.

생분해성 폴리머를 활성화시키는 단계;

활성화된 생분해성 폴리머와 고체 입자를 결합시키는 단계; 및

고체 입자가 결합된 생분해성 폴리머와 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질을 결합시키는 단계를 포함하는 표적 친화성 물질을 제조하는 방법이 제공된다.

생분해성 폴리머, 고체 입자, 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 및 표적 친화성 물질은 전술한 바와 같다.

상기 방법은 생분해성 폴리머를 활성화시키는 단계를 포함한다.

활성화는 작용기의 커플링 반응에 의해 기능기가 결합되는 것일 수 있다. 커플링 반응은 커플링 시약에 의한 것일 수 있다. 커플링 시약은 예를 들면, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC) 또는 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)일 수 있다.

상기 방법은 활성화된 생분해성 폴리머와 고체 입자를 결합시키는 단계를 포함한다.

고체 입자는 활성화된 생분해성 폴리머와 결합할 수 있는 기능기를 포함할 수 있다. 상기 기능기는 예를 들면 아민기일 수 있다.

상기 방법은 고체 입자가 결합된 생분해성 폴리머와 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질을 결합시키는 단계를 포함한다. 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 물질이 항체인 경우, 고체 입자가 결합된 생분해성 폴리머와 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질을 결합시키는 단계는 고체 입자가 결합된 생분해성 폴리머와 면역글로불린-결합 단백질을 결합시키는 단계, 및 고체 입자와 면역글로불린-결합 단백질이 결합된 생분해성 폴리머와 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 면역글로불린-결합 단백질은 전술한 바와 같다.

일 구체예에 따른, 표적 친화성 물질 및 이의 용도에 의하면, 비특이적 흡착에 의한 영향을 최소화하면서 생물학적 시료로부터 온전한 표적을 직접 분리 또는 검출하고, 표적의 하위집단을 분리 또는 검출할 수 있다. 또한, 동일한 시료를 반복 사용할 수 있으므로 정확도가 높은 분석 결과를 얻을 수 있다.

도 1a는 생분해성 폴리머를 포함하는 면역친화성 물질 및 이의 제조하는 방법의 모식도이고, 도 1b는 면역친화성 물질을 이용한 표적을 분리하는 방법을 나타내는 모식도이고, 도 1c는 면역친화성 물질을 이용한 표적의 하위 집단을 분리하는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 일 구체예에 따라 제조된 면역친화성 비드를 2차 항체를 사용하여 면역블로팅한 결과를 나타내는 그래프이다(1: 조건 1, 2: 조건 2, 3: 조건 3).
도 3은 일 구체예에 따라 제조된 히알루론산 및 항체가 도입된 면역친화성 비드 또는 항체가 코팅된 자성 비드를 이용하여 마이크로베지클을 분리하고 분리된 마이크로베지클을 면역블로팅하여 얻은 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 일 구체예에 따라 제조된 항체는 포함하지 않고 히알루론산이 도입된 비드를 이용하여 마이크로베지클을 분리하고 분리된 마이크로베지클을 면역블로팅하여 얻은 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4b는 일 구체예에 따라 제조된 히알루론산과 항체가 도입된 면역친화성 비드를 이용하여 분리된 마이크로베지클을 면역블로팅하여 얻은 결과(1차 검출), 및 히알루로니다제의 첨가 없이 자석으로 비드를 분리하고 남은 상층액을 면역블로팅하여 얻은 결과(2차 검출)를 나타내는 그래프이다.
도 5는 일 구체예에 따라 제조된 면역친화성 비드를 사용한 마이크로베지클를 1차 검출하고 히알루로니다제 처리한 후 마이크로베지클을 2차 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 히알루론산 및 항체가 도입된 면역친화성 비드의 준비

면역친화성 비드를 여러 조건으로 제조하고, 항체가 도입되는 정도를 비교하여 면역친화성 비드가 제조되는 수준을 확인하였다.

10 ㎎/㎖의 히알루론산(Sigma), 25.4 ㎎/㎖의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC)(Sigma), 17.9 ㎎/㎖의 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)(Sigma), 및 1 ㎖의 PBS(pH 6.8)를 혼합하고, 4℃에서 12 시간 동안 인큐베이션하여 히알루론산을 활성화시켰다.

조건 1에서, 48 ㎕의 활성화된 히알루론산과 100 ㎕의 Dynabeads® M-270 Amine(Invitrogen)을 혼합하고 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 3 ㎕의 단백질 G(10 ㎎/㎖)(Sigma), 75 ㎎/㎖의 EDC(Sigma), 75 ㎎/㎖의 설포-NHS(sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide)(Sigma), 및 500 ㎕의 PBS(phosphate buffered saline)(pH 6.8)를 혼합하고 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물에 160 ㎕의 항-CD9 항체(500 ㎎/㎖)(R&D systems)를 혼합하고 상온에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다.

조건 2에서, 48 ㎕의 활성화된 히알루론산과 3 ㎕의 단백질 G(10 ㎎/㎖)(Sigma)를 혼합하고, 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 100 ㎕의 Dynabeads® M-270 Amine(Invitrogen), 75 ㎎/㎖의 EDC(Sigma), 75 ㎎/㎖의 설포-NHS(Sigma), 및 500 ㎕의 PBS(pH 6.8)를 혼합하고 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물에 160 ㎕의 항-CD9 항체(500 ㎎/㎖)(R&D systems)를 혼합하고 상온에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다.

조건 3에서, 48 ㎕의 활성화된 히알루론산, 3 ㎕의 단백질 G(10 ㎎/㎖)(Sigma), 및 100 ㎕의 Dynabeads® M-270 Amine(Invitrogen)를 혼합하고, 상온에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물에 160 ㎕의 항-CD9 항체(500 ㎎/㎖)(R&D systems)를 혼합하고 상온에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다.

항-CD9 항체가 도입된 정도 및 교차 결합의 정도를 확인하기 위해, 제조된 면역친화성 비드를 2차 항체(BioRad)를 사용하여 면역블로팅을 하고, 얻어진 밴드 강도를 정량한 결과를 도 2에 나타내었다(1: 조건 1, 2: 조건 2, 3: 조건 3). 또한, 면역친화성 비드의 제조 조건 및 이에 따라 면역친화성 비드가 제조되는 수준을 표 1에 나타내었다.

제조 조건		면역친화성 비드의 제조
조건 1	활성화된 히알루론산 + 아민 비드, 그후 단백질 G	높음
조건 2	활성화된 히알루론산 + 단백질 G, 그후 아민 비드	중간
조건 3	활성화된 히알루론산 + 아민 비드 + 단백질 G	낮음

도 2 및 표 1에 나타난 바와 같이, 활성화된 히알루론산에 아민 비드를 결합시킨 다음 단백질 G를 결합시키는 제조 방법이 항체가 비드에 잘 도입됨을 확인하였다.

실시예 2. 히알루론산 및 항체가 도입된 면역친화성 비드를 사용하여 혈액 내 마이크로베지클의 검출

실시예 1에 기재된 조건 1의 방법에 따라 제조된 히알루론산 및 항-CD9 항체가 도입된 면역친화성 비드를 사용하여 혈액 내 마이크로베지클을 검출하고 캡쳐 효율을 비교하였다.

건강한 사람의 혈액을 채혈하고 채혈된 혈액을 원심분리하여 혈장을 수득하였다.

0.3 ㎖의 혈장과 30 ㎕의 히알루론산 및 항-CD9 항체가 도입된 면역친화성 비드를 혼합하고, 혼합물을 상온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 PBS로 세척하여 마이크로베지클을 분리하였다.

한편, 기존 방법으로 마이크로베지클을 검출하기 위하여, 자성 비드(Invitrogen)에 항-CD9 항체(R&D systems)로 코팅하였다. 0.3 ㎖의 혈장과 항-CD9 항체가 코팅된 자성 비드를 혼합하고 상온에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 PBS로 세척하여 마이크로베지클을 분리하였다.

분리된 마이크로베지클, LDX 샘플 버퍼(Sigma), 및 환원제(Invitrogen)를 혼합하고 상온에서 인큐베이션하여 마이크로베지클의 단백질을 변성 및 환원시켰다. 용해된 마이크로베지클을 항-인테그린 β1 항체(Abcam)를 이용하여 면역블로팅을 하고, 얻어진 인테그린 β1의 밴드 강도를 도 3에 나타내었다(1: 히알루론산 및 항-CD9 항체가 도입된 면역친화성 비드, 2: 항-CD9 항체가 코팅된 자성 비드).

도 3에 나타난 바와 같이, 히알루론산 및 항체가 도입된 면역친화성 비드의 마이크로베지클 캡쳐 효율은 항체가 코팅된 자성 비드의 마이크로베지클 캡쳐 효율과 유사함을 확인하였다.

실시예 3. 히알루론산이 도입된 비드의 비특이적 흡착에 의한 마이크로베지클의 검출

항체는 포함하지 않고 히알루론산이 도입된 비드가 마이크로베지클에 비특이적으로 흡착하는지 여부를 확인하였다.

실시예 1에 기재된 방법에 따라 제조된 활성화된 48 ㎕의 히알루론산과 100 ㎕의 Dynabeads® M-270 Amine(Invitrogen)을 혼합하고 상온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 제조된 비드를 PBS로 세척하였다. 세척된 30 ㎕의 비드와 0.3 ㎖의 혈장을 혼합하고 상온에서 4 시간 동안 인큐베이션하여 히알루론산이 도입된 비드와 혈장 내 마이크로베지클을 결합시켰다. 반응물을 PBS로 세척하고, 반응물에 LDX 샘플 버퍼(Sigma) 및 환원제(Invitrogen)를 첨가하였다. 반응물을 항-인테그린 β1 항체(Abcam)를 이용하여 면역블로팅을 하고, 얻어진 인테그린 β1의 밴드 강도를 도 4a에 나타내었다(1 내지 4: 항체는 포함하지 않고 히알루론산이 도입된 비드).

도 4a에 나타난 바와 같이, 마이크로베지클의 마커인 인테그린 β1은 거의 검출되지 않았다. 따라서, 마이크로베지클은 히알루론산이 도입된 비드에 비특이적으로 흡착되지 않음을 확인하였다.

한편, 실시예 1에 기재된 조건 1의 방법에 따라 제조된 히알루론산 및 항-CD9 항체가 도입된 면역친화성 비드, 또는 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조된 항-CD9 항체가 코팅된 자성 비드를 준비하였다. 준비된 비드와 30 ㎕의 혈장을 혼합하고, 반응물을 상온에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 10 ㎕의 반응물에 LDX 샘플 버퍼(Sigma) 및 환원제(Invitrogen)를 첨가하였다. 항-인테그린 β1 항체(Abcam)를 이용하여 면역블로팅하여 혈장 중 마이크로베지클을 1차 검출하였다. 10 ㎕의 반응물은 히알루로니다제를 처리하지 않고 자석으로 비드를 분리하였다. 남은 상층액을 항-인테그린 β1 항체(Abcam)를 이용하여 면역블로팅하여 마이크로베지클을 2차 검출하였다. 얻어진 인테그린 β1의 밴드 강도를 도 4b에 나타내었다(1: 항-CD9 항체가 코팅된 자성 비드에 의한 1차 검출, 2: 히알루론산 및 항-CD9 항체이 도입된 면역친화성 비드에 의한 1차 검출, 3: 항-CD9 항체가 코팅된 자성 비드 및 히알루로니다제 미처리에 의한 2차 검출, 4: 히알루론산 및 항-CD9 항체가 도입된 면역친화성 비드, 및 히알루로니다제를 미처리에 의한 2차 검출).

도 4b에 나타난 바와 같이, 마이크로베지클을 면역친화성 비드 또는 자성 비드로 캡쳐한 후 히알루로니다제를 처리하지 않은 경우 상층액은 마이크로베지클이 검출되지 않았다. 따라서, 히알루로니다제를 처리하여 얻은 검출 밴드가 면역친화성 비드에 대한 마이크로베지클의 비특이적 흡착으로부터 기인하지 않는 것임을 확인하였다.

실시예 4. 히알루론산이 도입된 면역친화성 비드를 사용한 마이크로베지클의 1차 검출 및 히알루로니다제 처리 후 마이크로베지클의 2차 검출

실시예 1에 기재된 조건 1의 방법에 따라 제조된 히알루론산 및 항-CD9 항체가 도입된 면역친화성 비드 또는 실시예 2에 기재된 방법에 따라 제조된 항-CD9 항체가 코팅된 자성 비드를 제조하였다.

30 ㎕의 히알루론산 및 항-CD9 항체가 도입된 면역친화성 비드와 0.3 ㎖의 혈장을 혼합하고, 반응물을 상온에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물을 PBS로 세척하여 마이크로베지클을 분리하였다. 분리된 마이크로베지클을 포함하는 반응물에 LDX 샘플 버퍼(Sigma) 및 환원제(Invitrogen)를 첨가하였다. 항-인테그린 β1 항체(Abcam)를 이용하여 면역블로팅하여 혈액 중 마이크로베지클을 1차 검출하였다.

분리된 마이크로베지클을 포함하는 300 ㎕의 반응물과 100 유닛(unit)의 히알루로니다제(Sigma)를 혼합하고, 상온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 반응물과 항-CD9 항체가 코팅된 자성 비드를 혼합하고 상온에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 반응물에 LDX 샘플 버퍼(Sigma) 및 환원제(Invitrogen)를 첨가하였다. 항-인테그린 β1 항체(Abcam)를 이용하여 면역블로팅하여 마이크로베지클을 2차 검출하였다.

마이크로베지클을 1차 검출 및 2차 검출한 결과를 도 5에 나타내었다(1 및 2: 항-CD9 항체 및 히알루론산이 도입된 면역친화성 비드를 이용한 마이크로베지클의 1차 검출, 3 및 4: 히알루로니다제를 처리한 후 항-CD9 항체가 도입된 자성 비드를 이용한 마이크로베지클의 2차 검출).

도 5에 나타난 바와 같이, 히알로론산이 도입된 면역친화성 비드에 의하여 검출된 마이크로베지클이 히알루로니다제로 처리한 후 재검출되는 것을 확인하였다.

Claims (20)

1. 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질 및 고체 입자가 포함된 생분해성 폴리머를 포함하는 표적 친화성 물질을 포함하는 하나 이상의 표적을 분리하기 위한 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질 및 고체 입자는 생분해성 폴리머의 상이한 영역에 결합하는 것인 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질은 단백질에 특이적으로 결합하는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 당, 당단백질, 항원, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성 도메인을 포함하는 단백질, 콜레스테롤-결합 단백질, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 면역글로불린-결합 단백질을 매개로 생분해성 폴리머에 결합한 것인 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 고체 입자는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 자성 입자, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 생분해성 폴리머는 친수성 것인 조성물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 생분해성 폴리머는 히알루론산, 콜라겐, 키틴, 키토산, 헤파린, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 생분해성 폴리머는 효소에 의해 분해될 수 있는 것인 조성물.
9. 청구항 8에 있어서, 상기 효소는 히알루로니다제(hyaluronidase), 콜라게나제(collagenase), 키티나제(chitinase), 헤파리나제(heparinase), 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
10. 표적을 포함하는 생물학적 시료와 표적 친화성 물질을 인큐베이션하여 생물학적 시료 중 표적과 표적 친화성 물질의 복합체를 형성하는 단계로서,
    상기 표적 친화성 물질은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질 및 고체 입자가 포함된 생분해성 폴리머를 포함하는 것인 단계;
    상기 생물학적 시료로부터 상기 복합체를 분리하는 단계; 및
    분리된 복합체와 생분해성 폴리머를 분해하는 물질을 인큐베이션하여 복합체로부터 표적을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 표적을 분리하는 방법.
11. 청구항 10에 있어서, 상기 생물학적 시료는 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
12. 청구항 10에 있어서, 상기 표적은 소포, 세포, 단백질, 지질, 당, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
13. 청구항 10에 있어서, 상기 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 물질은 단백질에 특이적으로 결합하는 물질, 효소의 기질, 조효소, 조절 인자, 수용체와 특이적으로 결합하는 물질, 렉틴, 당, 당단백질, 항원, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 호르몬, 신경 전달물질, 인지질-결합 단백질, 플렉스트린 상동성 도메인을 포함하는 단백질, 콜레스테롤-결합 단백질, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
14. 청구항 10에 있어서, 상기 생분해성 폴리머를 분해하는 물질은 효소인 것인 방법.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 효소는 히알루로니다제(hyaluronidase), 콜라게나제(collagenase), 키티나제(chitinase), 헤파리나제(heparinase), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
16. 청구항 10에 있어서, 상기 생물학적 시료로부터 복합체를 분리하는 단계 또는 상기 복합체로부터 표적을 분리하는 단계는 원심분리, 여과, 세척, 투석, 친화성 크로마토그래피, 자성 분리, 밀도구배법, 자유유동전기이동법, 또는 이들의 조합을 수행하는 것인 방법.
17. 청구항 10에 있어서, 분리된 표적을 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
18. 표적을 포함하는 생물학적 시료와 표적 친화성 물질을 인큐베이션하여 생물학적 시료 중 표적과 표적 친화성 물질의 복합체를 형성하는 단계로서,
    상기 표적 친화성 물질은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 제1 물질 및 고체 입자가 포함된 생분해성 폴리머를 포함하는 것인 단계;
    상기 생물학적 시료로부터 상기 복합체를 분리하는 단계;
    분리된 복합체와 생분해성 폴리머를 분해하는 물질을 인큐베이션하여 복합체로부터 표적을 분리하는 단계; 및
    분리된 표적과 상기 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이상의 제2 물질을 인큐베이션하여 제2 물질에 특이적으로 결합하는 표적의 하위집단(subpopulation)을 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 표적의 하위집단을 분리하는 방법.
19. 청구항 18에 있어서, 상기 제1 물질 또는 제2 물질은 표적의 상이한 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 것인 방법.
20. 청구항 18에 있어서, 분리된 표적의 하위집단을 검출하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.

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