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KR102205278B1 - 음이온성 약제를 제형화하는 방법 - Google Patents

음이온성 약제를 제형화하는 방법 Download PDF

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KR102205278B1 KR1020157029507A KR20157029507A KR102205278B1 KR 102205278 B1 KR102205278 B1 KR 102205278B1 KR 1020157029507 A KR1020157029507 A KR 1020157029507A KR 20157029507 A KR20157029507 A KR 20157029507A KR 102205278 B1 KR102205278 B1 KR 102205278B1
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Abstract

지질 함유 입자 내에 핵산과 같은 음이온성 약제를 포함하는 제형, 핵산과 같은 음이온성 약제를 포함하는 지질 함유 입자를 제형화하는 방법, 핵산과 같은 음이온성 약제를 포함하는 지질 함유 입자를 제조하는 방법, 본원에서 기술한 지질 함유 입자 내에 제형화된 음이온성 약제를 이를 필요로 하는 환자에 치료적 전달하는 방법.

Description

음이온성 약제를 제형화하는 방법{PROCESS FOR FORMULATING AN ANIONIC AGENT}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 2013년 3월 14일에 출원된 제목이 "음이온성 약제를 제형화하는 방법"인 미국 가출원 제61/784,810호의 우선권을 주장하며, 이 출원은 그 전체가 본원에 편입된다.
핵산 분자는 그것의 크기 및 친수성 때문에 세포막을 쉽게 가로지를 수 없다. 그러므로 전달은 핵산 치료학, 예를 들어, 안티센스 페이로드(antisense payloads) 및 RNAi 기술에 대한 주요 도전과제 중 하나였다. 전신 투여 후 RNase H 활성 또는 RNAi 활성을 촉발(trigger)시키기 위해, 핵산 분자를 함유하는 제형은 (1) 효소 및 비-효소적 분해로부터 페이로드를 보호하고 (2) 제형의 적당한 생체분포를 제공할 뿐만 아니라, (3) 제형의 세포 흡수 또는 내재화를 허용하고 (4) 핵산 페이로드의 세포의 세포질로의 전달도 촉진해야 한다. 상기 기준 1 및 2의 관점에서 우수한 많은 제형은 기준 3 및 4의 관점에서 부족하고, 따라서 많은 핵산 제형은 우수한 생체분포를 나타내지만 전신 전달 및 국소 전달의 부족으로 인하여 표적 유전자를 녹다운(knock down) 시키지 못한다.
많은 지질 기반 제형이 핵산 페이로드의 적어도 특정 유형의 포유류 세포(예: 포유류 간 세포)로의 세포내 전달을 이루는 것이 최근 증명되었지만, 지질, 페이로드 및 이러한 제형의 기타 성분을 조합하는 정확한 비율 및 방법은 핵산 페이로드의 성공적인 전달을 달성하는 정도에 크게 영향을 줄 수 있다. 따라서, 이러한 지질 기반 제형을 얻기 위해 이용하는 공정의 약간의 변화가 전달 효능의 극적이고 놀라운 차이를 만들어 낼 가능성이 있다. 이에, 핵산 페이로드의 지질 기반 제형을 얻는 공정을 최적화함으로써, 이러한 치료적 음이온성 약제의 세포로의 전달을 향상시킬 필요가 있다.
본 발명은 적어도 부분적으로, 음이온성 약제(anionic agent), 예로서 핵산과 같은 음이온성 치료제를 제형화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 양태에서, 음이온성 약제(예, 핵산 페이로드)를 포함하는 지질 함유 입자를 제조하는 공정을 확인하였고, 이는 성분 첨가의 순서 때문에 혼합 용액의 총 지질 용매 농도가 하락하기보다 시간에 따라 증가하거나 안정하게 유지되는 조건하에서 지질 착체를 음이온성 약제와 조합하여, 음이온성 약제의 세포내 전달의 개선된 효능 및 개선된 구조적 균질성을 보유하는 제형화 입자를 얻는 것을 포함한다. (이론에 의해 구속되는 것을 바라지는 않으나, 개선된 구조적 균질성은 혼합 공정 동안 지질 착체 용해의 감소로부터 발생하는 것으로 보이고, 이는 지질 착체와 음이온성 약제의 혼합 공정 동안 지질 용매 농도의 하락을 생성하는 공정과 비교된다.) 이론에 의해 구속되는 것을 바라지는 않으나, 본 발명의 방법의 적어도 한 장점은 이 방법이 다른 공정보다 규모조절가능(scalable)하여, 예컨대 임상 시험의 수행 및/또는 상업적 판매에 충분한 양으로 개선된 입자 형성/제형화를 가능케 한다는 것이다.
본 발명의 다른 양태에서, 용매(예, 에탄올 또는 알코올 또는 유기 용액 또는 이의 혼합물) 내 개별 지질 또는 스테롤이 보유하는 상대적으로 저용해도 한계를, 다른 지질(들) 및/또는 스테롤(들)을 용매에서(또는 선택적으로 단순히 니트(neat) 지질 오일 또는 지질 오일의 혼합물에서) 함께 혼합한 뒤 이 오일 또는 용매 내 다른 지질(들) 및/또는 스테롤(들)의 혼합물을 상대적으로 저용해도 지질 또는 스테롤에 첨가함으로써, 선택적으로는 이러한 지질 및/또는 스테롤 현탁액을 용매에 더 혼합함으로써, 실온에서 효과적으로 높일 수 있다는 놀라운 발견에 기초한 공정을 제공한다. 예컨대, 실온에서 에탄올 내 콜레스테롤의 용해도 한계는 다른 지질 및/또는 스테롤의 부재하에 약 10-11mg/ml로 관찰되었지만, 에탄올에서 본원에서 기술한 추가 지질의 사전 혼합 후 실온에서 이러한 에탄올 내 지질 현탁액의 콜레스테롤(분말로서)에의 첨가는 20mg/ml 이상의 콜레스테롤 수준을 용액에서 달성 가능케 하면서도, 이러한 용액의 총 지질 함량도 37mg/ml, 74mg/ml 또는 더 높은 수준으로 높일 수 있다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 따라서, 오일, 분말로서 그리고/또는 용매(들)에서 다른 지질(들), 스테롤(들) 및/또는 지질(들) 및/또는 스테롤(들)의 블렌드를 사전 혼합한 뒤 이러한 사전 혼합물을 원래의 용해도 한계 지질, 스테롤 및/또는 지질(들)의 블렌드에 첨가하여, 용매 내 원래의 지질의 용해도 한계를 효과적으로 높임으로써 용매(예, 알코올성 용매, 예, 에탄올)에 용해화될 수 있는 원래의 지질, 스테롤 및/또는 지질(들) 및/또는 스테롤(들)의 블렌드의 양을 높이는 공정을 제공한다. 어떤 관련 구체예에서, 본 발명은 오일, 분말로서 그리고/또는 용매(예, 에탄올)에서 상승된 농도의 지질 및/또는 스테롤 성분을 사전 혼합하고, 이 혼합물을 이러한 사전 혼합 지질(들) 및/또는 스테롤(들)의 부재하에 상대적으로 낮은 용매 내 용해도를 보유하는 지질 및/또는 스테롤에 첨가하고, 그리고 이 혼합물을 음이온성 약제 함유 수용액 또는 수현탁액과 조합하는 것(선택적으로, 이러한 음이온성 약제는 용매에 현탁된 지질의 첨가 전에 지질과 착화된다)을 포함하는 입자의 제조 공정을 제공한다. 이론에 의해 구속되는 것을 바라지는 않으나, 이렇게 상승된 농도에서 지질/스테롤의 고농도 용액을 제공하는 새로 발견한 능력은 이러한 지질/스테롤이 입자 제형화 공정 내에서 통상적으로 사용되는 농도와 비교하여 지질-음이온성 약제 입자 집단의 균질성을 향상시키는 것으로 여겨진다.
한 양태에서, 본 발명은 산성 수용액에서 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질(modified lipid)을 양이온성 지질과 착체가 형성되기에 충분한 양으로 조합하는 단계; 이 착체를 음이온성 약제와 조합하는 단계; 착체-음이온성 약제를 중성 수용액과 조합하여 착체-음이온성 약제 수현탁액을 형성하는 단계; 하나 이상의 구조적 지질(structural lipid), 스테롤, 양이온성 지질 또는 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질을 포함하는 용액 또는 현탁액을 형성하는 단계; 및 용액 또는 현탁액을 착체-음이온성 약제 수현탁액에 첨가하는 것 또는 용액 또는 현탁액과 착체-음이온성 약제 수용액을 관내(in-line) 혼합하는 것을 포함하는 방법에 의해 이 용액 또는 현탁액을 전 단계의 착체-음이온성 약제 수용액과 조합하는 단계를 포함하는, 음이온성 약제를 품은 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
어떤 구체예에서, 산성 수용액은 HCl을 포함한다. 선택적으로, 산성 수용액은 4 미만, 어떤 구체예에서는 2.3의 pH를 보유한다. 관련 구체예에서, 산성 수용액은 약 60mM HCl이다.
한 구체예에서, 산성 수용액에 존재하는 양이온성 지질은 양성자화 가능한(protonatable) 기를 보유한다. 선택적으로, 이 양이온성 지질은 4 내지 11의 pKa를 갖는다. 어떤 구체예에서, 이 양이온성 지질은 DODMA, DOTMA, 또는 표 1의 양이온성 지질이다.
어떤 구체예에서, 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질은 PEG-지질, 선택적으로는 DMPE-PEG, DSPE-PEG 또는 DSG-PEG이다. 관련 구체예에서, PEG는 PEG2k이다.
어떤 구체예에서, 변형된 지질-양이온성 지질 착체는 직경이 60 내지 75nm이다.
어떤 구체예에서, 음이온성 약제는 다중음이온성(polyanionic) 약제이다. 관련 구체예에서, 음이온성 약제는 핵산이다. 선택적으로, 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이중가닥 핵산이다. 어떤 구체예에서, 이중가닥 핵산은 작은 헤어핀(small hairpin) RNA(shRNA) 또는 siRNA이다. 관련 구체예에서, 이중가닥 핵산은 인간 다이서(Dicer)의 기질이고, 선택적으로는 DsiRNA이다.
어느 구체예에서, 중성 수용액은 물이다.
어떤 구체예에서, 하나 이상의 구조적 지질, 스테롤, 양이온성 지질 또는 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질을 포함하는 용액 또는 현탁액을 형성하는 것은 상기 하나 이상의 지질을 에탄올에 용해하는 것을 포함한다. 선택적으로, 이 용액 또는 현탁액의 형성은 지질 또는 스테롤을 100% 에탄올에 용해하는 것을 포함한다. 관련 구체예에서 구조적 지질은 DSPC, DPPC 또는 DOPC이다. 어떤 구체예에서, 스테롤은 콜레스테롤이다. 선택적으로, 양이온성 지질은 표 1로부터 선택된다.
어떤 구체예에서, 음이온성 약제를 품은 입자는 직경이 90 내지 110nm이다.
한 구체예에서, 음이온성 약제를 포함하는 입자는 10mg 이상의 음이온성 약제, 50mg 이상의 음이온성 약제, 100mg 이상의 음이온성 약제, 250mg 이상의 음이온성 약제, 500mg 이상의 음이온성 약제, 1g 이상의 음이온성 약제, 2g 이상의 음이온성 약제, 3g 이상의 음이온성 약제, 4g 이상의 음이온성 약제, 5g 이상의 음이온성 약제, 7.5g 이상의 음이온성 약제, 10g 이상의 음이온성 약제, 20g 이상의 음이온성 약제, 40g 이상의 음이온성 약제, 50g 이상의 음이온성 약제, 100g 이상의 음이온성 약제, 200g 이상의 음이온성 약제, 300g 이상의 음이온성 약제, 400g 이상의 음이온성 약제, 500g 이상의 음이온성 약제, 1kg 이상의 음이온성 약제, 2kg 이상의 음이온성 약제, 3kg 이상의 음이온성 약제, 4kg 이상의 음이온성 약제, 5kg 이상의 음이온성 약제 또는 10kg 이상의 음이온성 약제의 규모로 만들어진다.
또 하나의 구체예에서, 음이온성 약제를 품은 입자는 다음 성질들 중 하나 이상을 보유한다: 착체-음이온성 약제 수현탁액을 용매 기반 용액 또는 현탁액에 첨가하는 것을 포함하는 적절한 대조군 공정에 의해 형성되는 적절한 대조군 입자와 비교하여, 개선된 크기 및/또는 PDI, 입자가 투여된 개체에서 개선된 효능 또는 입자가 투여된 개체에서 개선된 내약성(tolerability).
추가 구체예에서, 본 방법은 음이온성 약제를 품은 입자를, 조합된 용액 내 에탄올의 농도를 10% 이하로 감소시키기에 충분한 부피의 물과 조합하는 것을 더 포함한다.
또 하나의 구체예에서, 본 방법은 조합된 용액에 접선 유동 여과(tangential flow filtration: TFF) 또는 투석 중 하나를 수행하는 것을 또한 포함한다. 선택적으로, 조합된 용액은 PBS에 대해 투석된다.
본 발명의 또 하나의 양태는 산성 수용액에서 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질을 양이온성 지질과 착체가 형성되기에 충분한 양으로 조합하는 단계; 이 착체를 음이온성 약제와 조합하는 단계; 이 착체-음이온성 약제를 중성 수용액과 조합하여 착체-음이온성 약제 수현탁액을 형성하는 단계; 구조적 지질, 스테롤, 양이온성 지질 또는 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질 중 하나 이상을 갖는 용액 또는 현탁액을 형성하는 단계; 및 이 용액 또는 현탁액을 착체-음이온성 약제 수현탁액에 첨가하는 단계를 포함하는, 음이온성 약제를 품은 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도를 증가시키는 방법으로서, 제2지질 또는 스테롤을 제1지질이 없는(free of) 용매와 조합하여 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액을 형성하는 단계; 및 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액을 제1지질 또는 스테롤과 조합하여 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액을 형성하되, 제2지질 또는 스테롤 존재하의 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도는 제2지질 또는 스테롤 부재하의 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도보다 높은 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도를 증가시키는 방법으로서, 용매 부재하에 제2지질 또는 스테롤을 제1지질 또는 스테롤과 조합하되, 제2지질 또는 스테롤 존재하의 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도는 제2지질 또는 스테롤 부재하의 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도보다 높은 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 제1지질 또는 스테롤은 스테롤이고, 선택적으로는 콜레스테롤, 콜레스타논, 콜레스테논, 코프로스타놀, 3β-[-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤) 또는 비스-구아니듐-트렌-콜레스테롤(BGTC)이다.
또 하나의 구체예에서, 제1지질 또는 스테롤은 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액 내에 10mg/ml 이상, 11mg/ml 이상, 12mg/ml 이상, 15mg/ml 이상, 20mg/ml 이상, 25mg/ml 이상, 30mg/ml 이상, 35mg/ml 이상, 37mg/ml 이상, 40mg/ml 이상, 45mg/ml 이상, 50mg/ml 이상, 55mg/ml 이상, 60mg/ml 이상, 65mg/ml 이상, 70mg/ml 이상, 74mg/ml 이상, 75mg/ml 이상, 80mg/ml 이상, 85mg/ml 이상, 90mg/ml 이상, 95mg/ml 이상, 100mg/ml 이상, 150mg/ml 이상, 200mg/ml 이상, 250mg/ml 이상, 500mg/ml 이상 또는 1g/ml 이상의 농도로 존재한다.
한 구체예에서, 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액의 총 지질 함량은 12mg/ml 이상, 15mg/ml 이상, 20mg/ml 이상, 25mg/ml 이상, 30mg/ml 이상, 35mg/ml 이상, 37mg/ml 이상, 40mg/ml 이상, 45mg/ml 이상, 50mg/ml 이상, 55mg/ml 이상, 60mg/ml 이상, 65mg/ml 이상, 70mg/ml 이상, 74mg/ml 이상, 75mg/ml 이상, 80mg/ml 이상, 85mg/ml 이상, 90mg/ml 이상, 95mg/ml 이상, 100mg/ml 이상, 150mg/ml 이상, 200mg/ml 이상, 250mg/ml 이상, 500mg/ml 이상 또는 1g/ml 이상이다.
한 구체예에서, 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액은 표 1 내지 4의 하나 이상의 추가 지질을 포함한다.
또 하나의 구체예에서, 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액은 구조적 지질, 스테롤, 양이온성 지질 또는 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 또 하나의 양태는 제1지질 또는 스테롤, 제2지질 또는 스테롤 및 소분자(small molecule)를 갖는 입자를 제조하는 방법으로서, 제2지질 또는 스테롤을 제1지질 또는 스테롤이 없는(free of) 용매와 조합하여 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액을 형성하는 단계; 및 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액을 제1지질 또는 스테롤과 조합하여 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액을 형성하되, 제2지질 또는 스테롤 존재하의 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도는 제2지질 또는 스테롤 부재하의 용매 내 상기 제1지질 또는 스테롤의 용해도보다 높은 단계, 다음으로 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 이 용액을 소분자와 조합하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 추가 양태는 제1지질 또는 스테롤, 제2지질 또는 스테롤 및 음이온성 약제를 갖는 입자를 제조하는 방법으로서, 제2지질 또는 스테롤을 제1지질 또는 스테롤이 없는(free of) 용매와 조합하여 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액을 형성하는 단계; 및 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액을 제1지질 또는 스테롤과 조합하여 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액을 형성하되, 제2지질 또는 스테롤 존재하의 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도는 제2지질 또는 스테롤 부재하의 용매 내 상기 제1지질 또는 스테롤의 용해도보다 높은 단계, 다음으로 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 이 용액을 음이온성 약제와 조합하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 제1지질 또는 스테롤, 제2지질 또는 스테롤 및 음이온성 약제를 갖는 입자를 제조하는 방법으로서, 산성 수용액에서 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질 및 양이온성 지질을 착체가 형성되기에 충분한 양으로 조합하는 단계; 이 착체를 음이온성 약제와 조합하는 단계; 중성 수용액을 착체-음이온성 약제와 조합하여 착체-음이온성 약제 수현탁액을 형성하는 단계; 제2지질 또는 스테롤을 제1지질 또는 스테롤이 없는(free of) 용매와 조합하여 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액을 형성하는 단계; 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액을 제1지질 또는 스테롤과 조합하여 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액을 형성하는 단계; 및 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액을 착체-음이온성 약제 수용액과 조합하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
어떤 구체예에서, 제2지질 또는 스테롤 존재하의 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도는 제2지질 또는 스테롤 부재하의 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도보다 높다.
한 구체예에서, 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액은 구조적 지질, 스테롤, 양이온성 지질 또는 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질 중 하나 이상을 포함한다.
또 하나의 구체예에서, 입자는 다음 성질들 중 하나 이상을 보유한다: 제2지질 또는 스테롤이 용매에 노출되기 전에 제1지질 또는 스테롤을 용매에 노출하는 것을 포함하는 적절한 대조군 공정에 의해 형성되는 적절한 대조군 입자와 비교하여, 개선된 크기 및/또는 PDI, 입자가 투여된 개체에서 개선된 효능 또는 입자가 투여된 개체에서 개선된 내약성 및/또는 감소된 독성.
어떤 구체예에서, 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액을 착체-음이온성 약제 수현탁액에 첨가하거나 또는 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액과 착체-음이온성 약제 수용액을 관내 혼합한다.
어떤 구체예에서, 제1지질 또는 스테롤을 제1지질 또는 스테롤의 용해도 한계 미만의 농도로 용매에 먼저 첨가하고 제2지질 또는 스테롤을 용액에 첨가한 다음 제1지질 또는 스테롤을 용액에 첨가함으로써, 제1지질 또는 스테롤이 그러한 제2지질 또는 스테롤 첨가 부재하의 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 원래의 용해도 한계를 초과하는 제2지질/스테롤 함유 용액 내 농도를 달성하도록 첨가되게 하여 용매 내 제1지질 또는 스테롤의 용해도를 효과적으로 올릴 수 있는 것도 고려된다.
한 양태에서, 본 발명은 다음 식:
Figure 112015099411745-pct00001
(I)로 표시되는 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 특징으로 하고, 여기서
각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이며, 여기서 R1 및 R2는 >CHNR3R4에 인접한 탄소 상에서 옥소로 치환되지 않고;
R3는 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이며;
R4는 -NR4aR4b로 치환되는 비치환 C1-6 알킬, -NR4aR4b로 더 치환되는 치환된 C1-6 알킬, 또는 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일이고, 여기서 각 R4a 및 R4b는, 독립적으로, H, C(=NH)NH2, 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이거나, 또는 R4a 및 R4b는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일을 형성하며; 여기서 R3 및 R4는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일을 형성할 수 있고,
여기서 R3 및 R4는 함께 조합되지 않고 임의로 치환된 이미다졸일 또는 임의로 치환된 벤즈이미다졸일 또는 임의로 치환된 석신이미딜을 형성하며; 여기서 한 개, 및 단지 한 개의, 일차 아민이 R3 또는 R4 상에 존재할 수 있거나 또는 어떤 일차 아민도 R3 또는 R4 상에 존재하지 않고; 여기서 R3 또는 R4는 둘 다 임의로 치환된 아마이드가 아니며;
여기서 R1 또는 R2가 포화된 C11 알킬 또는 포화된 C15 알킬일 때, R3는 H가 아니고; R1 또는 R2가 포화된 C16 알킬 또는 포화된 C17 알킬일 때, R1 및 R2는 하이드록시로 치환되지 않으며; R1 또는 R2가 포화된 C17 알킬일 때, R3 또는 R4는 하이드록시로 치환되지 않고; R1 또는 R2가 포화된 C18 알킬일 때, R4는 임의로 치환된 이미다졸일로 치환되지 않는다.
일부 구체예에서, R3는 -NR3aR3b로 치환된 C1-6 알킬이고, 여기서 각 R3a 및 R3b는, 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 특정 구체예에서, 각 R3a 및 R3b는 독립적으로 H 또는 C1-6 알킬이다.
일부 구체예에서, R4는 -NR4aR4b로 치환되는 비치환 C1-6 알킬이다. 특정 구체예에서, R4는 치환된 C1-6 알킬(예를 들어, 치환된 C1-3 알킬, 치환된 C1-2 알킬, 치환된 C1 알킬, 치환된 C2 알킬, 또는 치환된 C3 알킬), 또는 -NR4aR4b로 더 치환되는 C1-6 아미노알킬이다. 일부 구체예에서, R4는 옥소로 치환된 C1-6 알킬이고 -NR4aR4b로 더 치환된다. 일부 구체예에서, R4a 및 R4b는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일(예를 들어, 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 임의로 치환된 아제파닐, 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 또는 임의로 치환된 피라졸일)을 형성한다. 일부 구체예에서, 각 R4a 및 R4b는 독립적으로 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구체예에서, R4는 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일(예를 들어, 본원에 기술된 어떤 것)로 치환되는 비치환 C1-6 알킬이다. 일부 구체예에서, R4는 (예를 들어, 옥소로) 치환된 C1-6 알킬 또는 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일(예를 들어, 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 임의로 치환된 아제파닐, 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐, 또는 임의로 치환된 피리다지닐)로 더 치환되는 C1-6 아미노알킬이다.
일부 구체예에서, R3 및 R4는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일(예를 들어, 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 임의로 치환된 아제파닐, 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐 또는 임의로 치환된 피리다지닐)을 형성한다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112015099411745-pct00002
(IIa), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; 각 n1 및 n2는, 독립적으로, 0 내지 2의 정수이며(예를 들어, n1 및 n2는 둘 다 1이거나 또는 n1이 1이고 n2가 2임); R5는 H, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 및 임의로 치환된 헤테로사이클일(예를 들어, 비치환된 C1-6 알킬 또는 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐, 또는 임의로 치환된 피리다지닐로 치환된 C1-6 알킬)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 화합물은 L-2, L-5, L-6, L-22, L-23, L-24, L-25, L-26, L-28, L-29, L-45, 및 L-48, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112015099411745-pct00003
(IIb), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; 각 n1 및 n2는 독립적으로 0 내지 2의 정수이며(예를 들어, n1 및 n2는 둘 다 1이거나 또는 n1이 1이고 n2가 2임); 및 R5는 H, 임의로 치환된 C1-6 알킬, 및 임의로 치환된 헤테로사이클일(예를 들어, 비치환된 C1-6 알킬 또는 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐, 또는 임의로 치환된 피리다지닐로 치환된 C1-6 알킬)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 화합물은 L-27 및 L-47, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (I), (IIa) 및 (IIb))에 대한 일부 구체예에서, R5는 NR5aR5b로 치환된 C1-6 알킬이고, 여기서 각 R5a 및 R5b는, 독립적으로, H, 임의로 치환된 C1-6 알킬(예를 들어, 임의로 치환된 C1-6 알킬)이며, 여기서 R5a 및 R5b는 함께 조합되어 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일을 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, R5는 임의로 치환된 헤테로사이클일(예를 들어, 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 임의로 치환된 아제파닐, 임의로 치환된 피롤일, 임의로 치환된 이미다졸일, 임의로 치환된 피라졸일, 임의로 치환된 피리디닐, 임의로 치환된 피라지닐, 임의로 치환된 피리미디닐, 또는 임의로 치환된 피리다지닐)이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112015099411745-pct00004
(IIc), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; 각 n1 및 n2는 독립적으로 0 내지 2의 정수이다(예를 들어, n1 및 n2는 둘 다 1이거나 또는 n1이 1이고 n2가 2임). 일부 구체예에서, 화합물은 L-46, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112015099411745-pct00005
(IId), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이고; L1은 임의로 치환된 C1-6 알킬렌이고; 각 R5 및 R6는, 독립적으로, H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이거나, 또는 R5 및 R6는 조합되어 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일을 형성한다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112015099411745-pct00006
(IIe), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이며; L1은 임의로 치환된 C1-6 알킬렌이고; 각 R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이거나, 또는 R5 및 R6는 조합되어 임의로 치환된 C3-7 헤테로사이클일을 형성한다.
식 (IId) 또는 (IIe)의 일부 구체예에서, R5 및 R6는 조합되어 임의로 치환된 피롤리디닐, 임의로 치환된 이미다졸리디닐, 임의로 치환된 피라졸리디닐, 임의로 치환된 피페리디닐, 임의로 치환된 피페라지닐, 또는 임의로 치환된 아제파닐을 형성한다.
일부 구체예에서, 화합물은 L-1, L-3, L-4, L-7, L-9, L-10, L-11, L-12, L-15, L-16, L-17, L-18, L-19, L-30, L-31, L-32, L-33, L-34, L-42, L-43, 및 L-49, 또는 이것들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112015099411745-pct00007
(IIf) 또는
Figure 112015099411745-pct00008
(IIg), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이며; L1은 임의로 치환된 C1-6 알킬렌이고; 각 n3 및 n4는 독립적으로 0 내지 2의 정수이고; R5는 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다.
일부 구체예에서, 화합물은 L-14, L-21 및 L-36, 또는 이것들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIj), 예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIg))의 일부 구체예에서, R3는 -NR3aR3b로 치환된 C1-6 알킬이고, 여기서 각 R3a 및 R3b는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구체예에서, R3는 비치환된 C1-6 알킬이다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIj), 예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIg))의 일부 구체예에서, L1은 메틸, 에틸, 프로필, 또는 -NRLaRLb로 치환된 C1-6 알킬렌이고, 여기서 각 RLa 및 RLb는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112015099411745-pct00009
(IIh), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이며; L1은 임의로 치환된 C1-6 알킬렌이고; R5는 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다.
일부 구체예에서, L1은 4-위치에서 이미다졸일기에 연결된다.
일부 구체예에서, 화합물은 L-8, L-13, L-20, L-35, 및 L-44, 또는 이것들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 화합물은 식:
Figure 112015099411745-pct00010
(IIi) 또는
Figure 112015099411745-pct00011
(IIj), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이며; L1은 임의로 치환된 C1-6 알킬렌이고; 각 R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다.
일부 구체예에서, 화합물은 다음 식:
Figure 112015099411745-pct00012
(IIk), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 가지는데, 여기서 각 R1 및 R2는 독립적으로 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킬, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이고; R3는 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이며; 각 R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIk), 예를 들어, 식 (IIi) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, 각 R5 및 R6는 독립적으로 -NR5aR5b로 치환된 C1-6 알킬이고, 여기서 각 R5a 및 R5b는 독립적으로 H 또는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다.
일부 구체예에서, 화합물은 L-37, L-38, L-39, L-40, 및 L-41, 또는 이것들의 약학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (IId) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, L1은 임의로 치환된 C1-6 알킬렌이다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (I) 또는 (IIa) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, R3는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다. 일부 구체예에서, 각 R1 및 R2는 독립적으로 비치환된 C11-24 알켄일 또는 비치환된 C11-24 헤테로알켄일이고, 직선의 및 분지된 형태(예를 들어, 각 R1 및 R2는 독립적으로 하나 또는 그 이상의 이중 결합을 포함하는 비치환된 C11-24 알켄일 또는 비치환된 C11-24 헤테로알켄일)를 포함한다. 일부 구체예에서, R1 또는 R2 중 하나는 포화된 C11-24 알킬이 아니다. 일부 구체예에서, R1 및 R2는 둘 다 포화된 C11-24 알킬이 아니다. 일부 구체예에서, 각 R1 및 R2는 독립적으로 리놀레닐(C18:3), 리놀레닐옥시(C18:3), 리놀레노일(C18:3), 리놀레일(C18:2), 리놀레일옥시(C18:2), 리놀레오일(C18:2), 올레일(C18:1), 올레일옥시(18:1), 올레일옥시메틸렌(18:1), 올레오일(C18:1), 올레오일메틸렌(C18:1), 스테아릴(C18:0), 스테아릴옥시(C18:0), 스테아로일(C18:0), 팔미틸(C16:0), 팔미틸옥시(C16:0), 팔미토일(C16:0), 팔미토일메틸렌(C16:0), 미리스틸(C14:0), 미리스틸옥시(C14:0), 미리스토일(C14:0), 라우릴(C12:0), 라우릴옥시(C12:0) 및 라우로일(C12:0), 예를 들어, 리놀레일(C18:2) 또는 올레일(C18:1)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구체예에서, R1 및 R2는 같거나 또는 상이하다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (I) 또는 (IIa) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, R3 및 R4 둘 다는 아니지만, R3 또는 R4는 일차 아민으로 치환된다. 일부 구체예에서, R3 및 R4는 둘 다 일차 아민으로 치환되지 않는다.
본원에 기술된 어떤 식(예를 들어, 식 (I) 또는 (IIa) 내지 (IIk))의 일부 구체예에서, R3 및 R4는 그것들이 부착된 N과 함께, 표 2 및 3으로부터의 H-1 내지 H-52 중 하나의 헤드기(head group)를 포함한다. 일부 구체예에서, 각 R1 및 R2는 독립적으로, 리놀레닐(C18:3), 리놀레닐옥시(C18:3), 리놀레노일(C18:3), 리놀레일(C18:2), 리놀레일옥시(C18:2), 리놀레오일(C18:2), 올레일(C18:1), 올레일옥시(18:1), 올레일옥시메틸렌(18:1), 올레오일(C18:1), 올레오일메틸렌(C18:1), 스테아릴(C18:0), 스테아릴옥시(C18:0), 스테아로일(C18:0), 팔미틸(C16:0), 팔미틸옥시(C16:0), 팔미토일(C16:0), 팔미토일메틸렌(C16:0), 미리스틸(C14:0), 미리스틸옥시(C14:0), 미리스토일(C14:0), 라우릴(C12:0), 라우릴옥시(C12:0), 및 라우로일(C12:0)로 이루어진 군으로부터 선택되고, 예를 들어, 각 R1 및 R2는 독립적으로 리놀레일(C18:2) 또는 올레일(C18:1)이다.
다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 R1R2-CH-A를 포함하고, 여기서 R1 및 R2는 테일기(tail group) (예를 들어, 본원에, 예를 들어, 표 4에 기술된 어떤 것)이고 A는 헤드기(예를 들어, 본원에, 예를 들어, 표 2 및 3에 기술된 어떤 것)이다. 일부 구체예에서, 헤드기는 H-1 내지 H-52 중 하나, 예를 들어, H-2, H-5, H-6, H-19, H-26 또는 H-43(예를 들어, H-5 또는 H-43)이다.
다른 양태에서, 본 발명의 화합물은 표 1에 제공된 어떤 화합물, 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염이다.
한 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 어떤 화합물(예를 들어, 표 1에 제공된 하나 또는 그 이상의 화합물), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제형을 특징으로 한다.
일부 구체예에서, 제형은 2가지 또는 그 이상의 화합물, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7가지, 또는 그 이상의 화합물을 포함한다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 2개의 불포화된 지질 테일기(예를 들어, 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C11-24 알켄일, 임의로 치환된 C11-24 알킨일, 임의로 치환된 C11-24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C11-24 헤테로알킨일이다)를 포함한다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 지질 테일기를 포함하고, 여기서 이들 기는 -CHR3R4에 인접한 산소를 포함하지 않는다(예를 들어, 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C11-24 알킬, 임의로 치환된 C11-24 알켄일 또는 임의로 치환된 C11-24 알킨일임).
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 지질 테일기를 포함하고, 여기서 이들 기는 하나 또는 그 이상의 생분해성 기(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 에스터기)를 포함하지 않는다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 18개 이상의 탄소를 갖는 2개의 지질 테일기를 포함한다(예를 들어, 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C17-24 알켄일, 임의로 치환된 C15-24 알킨일, 임의로 치환된 C15-24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C15-24 헤테로알킨일이고; 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C16-24 알켄일, 임의로 치환된 C16-24 알킨일, 임의로 치환된 C16-24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C16-24 헤테로알킨일이고; 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C17-24 알켄일, 임의로 치환된 C17-24 알킨일, 임의로 치환된 C17-24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C17-24 헤테로알킨일이고; 또는 각 R1 및 R2는, 독립적으로, 임의로 치환된 C18-24 알켄일, 임의로 치환된 C18-24 알킨일, 임의로 치환된 C18-24 헤테로알켄일 또는 임의로 치환된 C18-24 헤테로알킨일이다).
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 유레아기를 함유하지 않는다(예를 들어, R3 또는 R4는 둘 다 임의로 치환된 아마이드가 아니다). 일부 구체예에서, 화합물은 카바밀기를 함유하지 않는다. 일부 구체예에서, 화합물은 하나 이상의 일차 아민기를 함유하지 않는다(예를 들어, 2개의 일차 아민기를 함유하지 않거나 또는 R1 내지 R6 중 하나 또는 그 이상에서, 예를 들어, R3 또는 R4에 어떤 일차 아민기를 함유하지 않음). 특정 구체예에서, 화합물은 단지 하나의 일차 아민을 포함하거나 또는 어떤 일차 아민도 포함하지 않는다(예를 들어, 단지 하나의 일차 아민이 하나 또는 그 이상의 R1내지 R6에, 예를 들어, R3 또는 R4에 존재하거나 또는 어떤 일차 아민도 존재하지 않는다).
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 하이드록시기를 함유하지 않는다(예를 들어, 어떤 R1 또는 R2는 둘 다 1, 2 또는 3개의 하이드록시기로 치환되지 않거나; 또는 어떤 R3 또는 R4는 둘 다 1, 2 또는 3개의 하이드록시기로 치환되지 않는다). 일부 구체예에서, R1 또는 R2가 포화된 C11-24 알킬기(예를 들어, 포화된 C15 알킬, 포화된 C16 알킬, 포화된 C17 알킬 또는 포화된 C18 알킬)일 때, R1 및/또는 R2는 1, 2 또는 3개의 하이드록시기로 치환되지 않는다. 일부 구체예에서, R1 또는 R2가 포화된 C11-24 알킬기(예를 들어, 포화된 C15 알킬, 포화된 C16 알킬, 포화된 C17 알킬 또는 포화된 C18 알킬)일 때, R3 및/또는 R4는 1, 2 또는 3개의 하이드록시기로 치환되지 않는다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 2개 이하의 아마이드기를 포함한다(예를 들어, 화합물의 헤드기에는 2개 이하 또는 1개의 아마이드기가 있다). 다른 구체예에서, 화합물은 하나 또는 그 이상의 R1 내지 6에서 0, 1 또는 2개의 아마이드기를 포함한다(예를 들어, R3 또는 R4에서 0, 1 또는 2개의 아마이드기). 또 다른 구체예에서, 화합물은 1개, 및 단지 1개의, 아마이드기를 포함할 수 있다(예를 들어, R3 또는 R4에서 1개, 및 단지 1개의 아마이드기를 포함할 수 있다). 추가의 구체예에서, 화합물은 1개, 및 단지 1개의 아마이드기를 포함하거나 또는 아마이드기를 포함하지 않는다(예를 들어, R3 또는 R4에서 1개, 및 단지 1개의 아마이드기를 포함하거나 또는 아마이드기를 포함하지 않는다).
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-아민 또는 N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-아민, 또는 그것의 염을 제외한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 화합물은 N-메틸-N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-아민 또는 N-메틸-N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-아민, 또는 그것의 염을 제외한다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28-트라이엔-19-아민, N-메틸-N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28-트라이엔-19-아민, N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z,31Z,34Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31,34-펜타엔-19-아민, N-메틸-N-(4-N',N'-다이메틸아미노)뷰타노일-(6Z,9Z,28Z,31Z,34Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31,34-펜타엔-19-아민, N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28-트라이엔-19-아민, N-메틸-N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28-트라이엔-19-아민, N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z,31Z,34Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31,34-펜타엔-19-아민, N-메틸-N-(3-N',N'-다이메틸아미노)프로파노일-(6Z,9Z,28Z,31Z,34Z)-헵타트라이아콘타-6,9,28,31,34-펜타엔-19-아민, 또는 이들의 염을 제외한다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((3-(다이메틸아미노)프로파노일)아미노)헵타데칸다이오에이트, 다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((4-(다이메틸아미노)뷰타노일)아미노)헵타데칸다이오에이트, 다이((Z)-논-2-엔-1-일) 9-((5-(다이메틸아미노)펜타노일)아미노)헵타데칸다이오에이트, 또는 이들의 염을 제외한다.
상기 양태 중 어떤 것에서든지, 본 발명의 화합물은 6.2 미만 및 6.5 이상의 pKa 값(예를 들어, 4.0 내지 6.2, 예컨대 4.0 내지 5.2, 4.0 내지 5.6, 또는 4.0 내지 5.8; 또는 6.5 내지 8.5, 예를 들면 6.5 내지 7.0, 6.5 내지 7.5, 또는 6.5 내지 8.0의 pKa 값)을 가진다. 특정 구체예에서, pKa 값은 약 5.0 내지 약 6.0(예를 들어, 5.0 내지 5.5, 5.0 내지 5.6, 5.0 내지 5.7, 5.0 내지 5.8, 5.0 내지 5.9, 5.0 내지 6.0, 5.2 내지 5.5, 5.2 내지 5.6, 5.2 내지 5.7, 5.2 내지 5.8, 5.2 내지 5.9, 5.2 내지 6.0, 5.4 내지 5.5, 5.4 내지 5.6, 5.4 내지 5.7, 5.4 내지 5.8, 5.4 내지 5.9, 5.4 내지 6.0, 5.6 내지 5.7, 5.6 내지 5.8, 5.6 내지 5.9 또는 5.6 내지 6.0)이다. pKa 값은 어떤 유용한 방법, 예를 들어, 2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산(TNS)의 형광의 측정, 제타 전위 측정, 등에 의해 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, pKa 값은 하전된 양이온성 지질의 농도 및 비하전된 지질의 농도의 비이다(예를 들어, 제자리 TNS 형광 적정에 의해 측정된 바와 같이, 여기서 pKa는 절반-최대 형광 강도에서의 pH로서 정의됨).
도 1은 본 발명의 음이온성 약제 포함 입자의 예시적 제조 공정을 도시한다. 공정의 수행은 산성 수용액(여기서는 pH 2.3의 60mM HCl)에 현탁된 지질 착체와 음이온성 약제(여기서는 물에 용해된 RNA)를 먼저 조합하고, 이 용액을 물로 희석한 다음, 용매(여기서는 에탄올)에 용해된 지질 용액을 착체-음이온성 약제 혼합물에 첨가함으로써 음이온성 약제를 포함하는 입자를 생성하는 것을 포함한다. 다음으로, 이렇게 형성된 입자를 추가 부피의 물에 희석하고 선택적으로는 여과 처리(여기서는 접선 유동 여과(TFF))하여 용매를 제거하고 사용 전에 입자를 농축시킨다.
도 2는 세 구분된 방법으로 제형화한 입자의 크기 측정 결과를 도시한다: 수성 지질-DsiRNA 착체를 에탄올에 용해된 추가 지질에 첨가하는 것을 포함하는 공정으로 제형화한 입자("2072" 공정, 제1유형, 위쪽 그래프); 에탄올에 용해된 추가 지질을 수성 지질-DsiRNA 착체에 첨가하는 것을 포함하는 공정으로 제형화한 입자("2072" 공정, 제2유형, 중간 그래프); 및 "2072"와 동일한 총 성분량 및 비율을 포함하지만, 구체적으로는 지질 함유 에탄올 용액에 콜레스테롤의 용해 전에 다수의 지질을 에탄올에 용해함으로써 에탄올 내 지질의 농축을 가능케 하는 단계를 특징으로 하는 공정으로 제형화한 입자 - 이러한 공정은 이러한 에탄올 용액 내에 이러한 지질의 현저한 농축을 가능케 하였다("2141 공정", 아래쪽 그래프).
도 3은 크기 배제 크로마토그래피("SEC")의 최초 수행 및 분획 2-5의 선택 후 "2072"(상부) 및 "2141" 입자 집단에 대해 수행한 입자 크기 측정 실험의 결과를 도시한다.
도 4는 "2072"(상부) 및 "2141"(하부) 공정으로 제조한 입자에 대한 퍼센트 부피 입자 크기 분석 결과를 도시한다.
도 5는 "2072" 및 "2141" 관련 공정 "2141", "2137" 및 "2144"를 비롯한 다양한 표시 공정으로 제형화한 HPRT1 표적화 DsiRNA를 품은 입자에 대해 관찰한 생체내(in vivo) 표적특이적 녹다운 결과를 도시한다. HPRT1 원시 데이터를 hSFRS9 수준에 대해 규격화(normalize)한 뒤 그래프로 그렸다.
도 6은 표시한 바와 같은 MYC 표적화 DsiRNA 페이로드를 각각 품은 "2072" 제조 입자 및 "2141" 제조 입자의 생체내 효능 및 내약성 프로파일을 도시한다.
도 7은 "2072" 제조 입자 및 "2141" 제조 입자의 개략적인 생체내 내약성(체중 및 간 중량)을 도시한다.
도 8은 "2072" 제조 입자 및 "2141" 제조 입자 모두에 대한 독성 마커 평가의 결과를 도시한다.
도 9는 실시예 6의 효능 시험의 결과를 도시한다.
본 발명은 음이온성 약제의 제형화 공정에 대한 것으로, 이의 수행은 포유류 세포 및/또는 포유류에 투여시 이러한 약제가 세포내 국소화(localization)를 달성할 가능성을 향상시킨다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에서 이용한 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 기술자가 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 다음 참고문헌은 본 발명에서 이용한 용어 중 다수의 일반적 정의를 기술자에게 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 및 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본 명세서에서, 하기 용어들은 달리 특정하지 않는 한 하기에 규정한 의미를 갖는다.
본원에 사용된, 용어 "약"은 언급된 값의 ±10%를 의미한다.
본원에 사용된, 용어 "산성 수용액"은 pH 1.0 내지 pH 6.9, 바람직하게는 pH 2.0 내지 pH 4.0의, 5 내지 200mM, 선택적으로는 20 내지 100mM 또는 40 내지 80mM의 몰 농도를 갖는 수용액을 의미하고자 한다. 산성 수용액은 염산, 시트르산, 아세트산 및 기타 산의 수용액으로부터 선택할 수 있다. 산성 수용액의 유형 및 pH는 그 용액에 현탁 또는 용해되는 지질 및/또는 음이온성 약제의 유형에 따라 변하게 된다.
"알켄일"은, 달리 명시되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 2 내지 24개의 탄소 원자의 1가 직쇄 또는 분지쇄 기를 의미한다. 알켄일기는 에텐일, 1-프로펜일, 2-프로펜일, 2-메틸-1-프로펜일, 1-뷰텐일, 2-뷰텐일, 올레일, 리놀레일, 리놀레닐 등에 의해 예시된다. 용어 "Cx-y 알켄일"은 x 내지 y개의 탄소를 갖는 알켄일기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 2, 3, 4, 5, 및 11이고; y에 대해서는 3, 4, 5, 6, 및 24이며; x 내지 y에 대해서는 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 14 내지 24, 16 내지 24, 18 내지 24, 10 내지 22, 11 내지 22, 12 내지 22, 14 내지 22, 16 내지 22, 18 내지 22, 10 내지 20, 11 내지 20, 12 내지 20, 14 내지 20, 16 내지 20, 또는 18 내지 20이다. 일부 구체예에서, 알켄일은 알킬기에 대해 본원에 한정된 1, 2, 3, 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 1 내지 24개의 탄소 원자의 1가 직쇄 또는 분지된 포화된 기를 의미한다. 알킬기는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-뷰틸, 이소-부틸, tert-부틸, 네오펜틸, 라우릴, 미리스틸, 팔미틸, 스테아릴 등에 의해 예시되고, (1) 알콕시; (2) 본원에서 규정된 것과 같은 아미노; (3) F, Cl, Br, 또는 I와 같은 할로; (4) (헤테로사이클일)옥시; (5) 헤테로사이클일; (6) 알킬; (7) 알켄일; (9) 알킨일; (10) 사이클로알킬; (11) 하이드록시; (12) 나이트로; 또는 (13) 옥소(예를 들어, 카복시알데하이드 또는 아실)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3개의 치환기, 또는 2 또는 그 이상의 탄소의 알킬기의 경우에는 4개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 일부 구체예에서, 이들 기는 각각 본원에 기술된 바와 같이 더 치환될 수 있다. 용어 "Cx-y 알킬"은 x 내지 y개의 탄소를 갖는 알킬기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 1, 2, 3, 4, 5, 및 11이고; y에 대해서는 2, 3, 4, 5, 6, 및 24이고; x 내지 y에 대해서는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 14 내지 24, 16 내지 24, 18 내지 24, 10 내지 22, 11 내지 22, 12 내지 22, 14 내지 22, 16 내지 22, 18 내지 22, 10 내지 20, 11 내지 20, 12 내지 20, 14 내지 20, 16 내지 20 또는 18 내지 20이다.
본원에 사용된 용어 "알킬렌" 및 접두사 "알크-"는, 2개의 수소 원자의 제거에 의해 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소로부터 유도된 다가(예를 들어, 2가) 탄화수소기를 나타낸다. 알킬렌기는 메틸렌, 에틸렌, 이소프로필렌 등에 의해 예시된다. 용어 "Cx-y 알킬렌"은 x 내지 y개의 탄소를 갖는 알킬렌기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 1, 2, 3, 4 및 5이고, y에 대한 예시적인 값은 2, 3, 4, 5 및 6이다. 일부 구체예에서, 알킬렌은 알킬기에 대해 본원에 기술된 바와 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"알킨일"은, 달리 명시되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 2 내지 24개의 탄소 원자의 1가 직쇄 또는 분지쇄 기를 의미한다. 알킨일기는 에틴일, 1-프로핀일 등에 의해 예시된다. 용어 "Cx-y 알킨일"을 x 내지 y개의 탄소를 갖는 알킨일기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 2, 3, 4, 5, 및 11이고; y에 대해서는 3, 4, 5, 6, 및 24이며; x 내지 y에 대해서는 2 내지 10, 2 내지 9, 2 내지 8, 2 내지 7, 2 내지 6, 2 내지 5, 2 내지 4, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 14 내지 24, 16 내지 24, 18 내지 24, 10 내지 22, 11 내지 22, 12 내지 22, 14 내지 22, 16 내지 22, 18 내지 22, 10 내지 20, 11 내지 20, 12 내지 20, 14 내지 20, 16 내지 20 또는 18 내지 20이다. 일부 구체예에서, 알킨일은 알킬기에 대해 본원에서 규정된 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"아마이드"는 카보닐기를 통해 모분자기에 부착된, 본원에서 규정되는 것과 같은 아민기를 의미한다.
본원에 사용된 "아미노"는 N(RN1)2를 의미하고, 여기서 각 RN1은 독립적으로 H, OH, NO2, N(RN2)2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, N-보호기, 알킬, 알켄일, 알킨일, 알콕시, 아릴, 알카릴, 사이클로알킬, 알크사이클로알킬, 헤테로사이클일(예를 들어, 헤테로아릴), 알크헤테로사이클일(예를 들어, 알크헤테로아릴)이거나, 또는 2개의 RN1이 조합되어 헤테로사이클일 또는 N-보호기를 형성하고, 여기서 각 RN2는, 독립적으로, H, 알킬 또는 아릴이다. 바람직한 구체예에서, 아미노는 NH2 또는 NHRN1이고, 여기서 RN1은 독립적으로 OH, NO2, NH2, NRN2 2, SO2ORN2, SO2RN2, SORN2, 알킬 또는 아릴이며, 각 RN2는 H, 알킬 또는 아릴일 수 있다. "일차 아민"은 구조 -NH2를 갖는 기를 의미한다.
본원에 사용된, 용어 "아미노알킬"은 본원에서 규정된 것과 같이, 아미노기에 의해 치환된, 본원에서 규정된 것과 같은 알킬기를 나타낸다. 알킬 및 아미노 각각은 각각의 기에 대해 본원에 기술된 것과 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
약제의 "충분한 양"은 이로운 또는 원하는 결과, 예컨대 임상적 결과를 이루기에 충분한 약제의 양을 의미하고, 이런 이유로, 충분한 양은 그것이 적용되는 상황에 따라 좌우된다. 예를 들어서, 표적 유전자의 발현 수준을 감소시키는 제형의 투여와 관련하여, 제형의 충분한 양은 제형의 투여 없이 얻어진 반응과 비교해 표적 유전자의 발현 수준의 감소를 달성하기에 충분한 양이다.
용어 "양친매성 지질"(amphipathic lipid)은 지질 물질의 소수성 부분은 소수성 상(phase)을 향하는 반면, 친수성 부분은 수상을 향하는 임의의 적합한 물질을 부분적으로는 지칭한다. 친수성 특성은 탄수화물, 포스페이트, 카르복실, 설페이토, 아미노, 설프히드릴, 니트로, 히드록실 및 기타 유사 기와 같은 극성 또는 하전 기의 존재로부터 유도된다. 소수성은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기 및 하나 이상의 방향족, 시클로지방족 또는 헤테로사이클 기(들)로 치환된 이들 기를 포함하나 이에 한정되지 않는 비극성 기의 포함에 의해 부여될 수 있다. 양친매성 화합물의 예는 인지질, 아미노지질 및 스핑고지질을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 인지질의 대표적 예는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 스핑고지질, 글리코스핑고지질 패밀리, 디아실글리세롤, 및 β-아실옥시산과 같은 인이 결여된 다른 화합물도 양친매성 지질로 지칭하는 군 내이다. 또한, 상술한 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤을 비롯한 다른 지질과 혼합될 수 있다.
본원에 사용된, 용어 "음이온성 약제"는 하나 이상의 음으로 하전된 원자를 포함하는 화학적 부분(chemical moiety)을 지칭하며, 선택적으로는 제형에 혼입될 수 있다(예컨대 페이로드로서). "다중음이온성 페이로드"(polyanionic payload)는 제형에 혼입될 수 있는 다중의 음으로 하전된 원자를 포함하는 화학적 부분을 뜻한다. 다중음이온성 페이로드의 예는 핵산, RNAi 약제, siRNA, dsRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA 및 안티센스 페이로드를 포함한다.
"음이온성 지질"은 생리학적 pH에서 순 음전하(net negative charge)를 갖는 어떤 지질 분자를 의미한다. 이 지질은 포스파티딜글리세롤, 카르디올리핀, 디아실포스파티딜세린, 디아실포스파티드산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-숙시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 라이실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레오일포스파티딜글리세롤(POPG), 및 기타 중성 지질에 결합된 음이온성 변형기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "안티센스 화합물" 또는 "안티센스 페이로드"는, 그 중에서도, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오타이드(DNA, DNA-유사, RNA, RNA-유사) 또는 안티센스 배향 올리고뉴클레오타이드, 안티센스 PNA, 라이보자임 및 외부의 가이드 서열(예를 들어, 문헌: Guerrier-Takada et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8468, 1997에 기술된, RNase P를 동원하는 서열)을 포함하는 특정 이중-가닥 또는 자체-혼성화 구성물을 포함한다. 안티센스 화합물은 다양한 수단에 의해 그것의 효과를 발휘할 수 있다. 그런 한 가지 수단은 진핵생물의 RNase H 또는 원핵생물의 RNase P와 같은 내인성 뉴클레아제의 안티센스-중재된 방향이다(Chiang et al., J. Biol. Chem. 1266:18162, 1991; Forster et al., Science, 249:783, 1990).
본원에 사용된 용어 "수용액"은 전체적으로 또는 부분적으로 물을 포함하는 조성물을 지칭한다.
용어 "암"은 이상 세포의 제어되지 않은 성장을 특징으로 하는 질병 부류의 임의의 종류를 지칭한다. 이 용어는 악성, 양성, 연조직, 또는 고형으로 특징지워지는지를 불문하고 모든 알려진 암 및 신생물성 증상, 그리고 전이 전(pre-metastatic) 및 전이 후(post-metastatic) 암을 비롯한 모든 단계 및 등급의 암을 포함한다. 다양한 유형의 암의 예는 간암, 폐암, 결장암, 직장암, 항문암, 담관암, 소장암, 위장(위)암, 식도암; 담낭암, 췌장암, 맹장암, 유방암, 난소암; 자궁암, 전립선암, 신장암(예, 신장세포암종), 중추신경계의 암, 교모세포종, 피부암, 림프종, 융모막암종, 두경부암, 골육종, 및 혈액암을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 간암의 구체적 유형의 비제한적 예는 간세포암종(HCC), 2차적 간암(예, 어떤 다른 비간암세포 유형의 전이로 유발), 및 간모세포종을 포함한다. 본원에 사용된 "종양"은 하나 이상의 암세포를 포함한다.
"양이온성 지질"은 생리학적 pH에서 순 양전하(net positive charge)를 갖는 임의의 지질 분자를 의미한다. 예시적인 양이온성 지질은 본원에, 예를 들어, 표 1에 기술된 임의의 것을 포함한다. 어떤 구체예에서, 양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 20몰% 내지 약 50몰% 또는 약 40몰%를 차지할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "카바밀"은 구조 -NRN1C(=O)OR 또는 -OC(=O)N(RN1)2를 갖는 카바메이트기를 말하고, 여기서 각 RN1의 의미는 본원에 제공된 "아미노"의 정의와 같으며, R은 본원에 규정된 것과 같이, 알킬, 사이클로알킬 , 알크사이클로알킬, 아릴, 알카릴, 헤테로사이클일(예를 들어, 헤테로아릴) 또는 알크헤테로사이클일(예를 들어, 알크헤테로아릴)이다.
본원에 사용된 용어 "카보닐"은 C(O)기를 나타내는데, 이것은 또한 C=O로서 표시될 수 있다.
"사이클로알킬"은 1가의 포화된 또는 부분적으로 불포화된 3- 내지 10-원 단일환형 또는 다환형(예를 들어, 이환형 또는 삼환형) 탄화수소 고리 시스템을 의미한다. 예를 들면 사이클로프로필, 사이클로뷰틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 및 사이클로헵틸을 포함한다.
"다이서-기질 RNA" 또는 "DsiRNA"는 유전자를 침묵시킬 수 있는 25-35개(예를 들어 25-27개, 예컨대 27개)의 뉴클레오타이드 이중-가닥 분자의 부류를 의미한다. 다른 RNAi 약제와 비교해 DsiRNA는 그것의 더 긴 길이로 인하여, 다이서의 기질과 비슷하다.
"이중-가닥 분자"는 RNA 간섭을 통해 유전자 생성물을 침묵시키기 위해 사용될 수 있는 이중-가닥 RNA:RNA 또는 RNA:DNA 분자를 의미한다.
"발현"은 본 분야에 공지된 방법에 의한 유전자 또는 폴리펩타이드의 검출을 의미한다. 예를 들어서, DNA 발현은 써던 블롯팅(Southern blotting) 또는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 자주 검출되고, RNA 발현은 노던 블롯팅(Northern blotting), RT-PCR, 유전자 배열 기술 또는 RNAse 보호 분석법에 의해 자주 검출된다. 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 일반적으로 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 면역블롯팅, 효소-결합 면역흡수 분석법(ELISA), 방사면역분석법(RIA), 면역침강법, 면역형광, 표면 플라즈몬 공명, 화학발광, 형광 분극, 인광, 면역조직화학적 분석, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간(MALDI-TOF) 질량분석법, 마이크로 세포계수법, 현미경관찰, 형광 활성화 세포 선별법(FACS), 및 유동세포계수법, 및 단백질의 특성, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만 다른 단백질 파트너와의 효소 활성 또는 상호작용을 토대로 한 분석법을 포함한다.
용어 "융합성"(fusogenic)은 본원에서 기술한 것과 같은 지질 입자가 세포의 막과 융합하는 능력을 지칭한다. 막은 형질막 또는 소기관, 예컨대 엔도솜, 핵 등을 둘러싼 막일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "할로"는 브로민, 염소, 아이오딘 또는 플루오린으로부터 선택된 할로겐을 나타낸다.
"헤테로알켄일"은 하나 또는 그 이상의 탄소 원자가 각각 O, N 또는 S에 의해 교체된 본원에서 규정된 것과 같은 알켄일기를 나타낸다. 예시적인 헤테로알켄일기는 옥소기로 치환된 및/또는 산소 원자를 통해 모분자기에 부착된, 본원에서 규정된 것과 같은 알켄일기를 포함한다. 일부 구체예에서, 헤테로알켄일기는 알킬기에 대해 본원에 기술된 것과 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
"헤테로알킬"은 하나 또는 그 이상의 구성성분 탄소 원자가 각각 O, N 또는 S에 의해 교체된 본원에서 규정된 것과 같은 알킬기를 의미한다. 예시적인 헤테로알킬기는 옥소기로 치환된 및/또는 산소 원자를 통해 모분자기에 부착된, 본원에 기술된 것과 같은 알킬기를 포함한다. 일부 구체예에서, 헤테로알킬기는 알킬기에 대해 본원에 기술된 것과 같이, 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "헤테로알킬렌"은 1 또는 2개의 구성 탄소 원자가 각각 O, N 또는 S에 의해 교체된 본원에서 규정된 것과 같은 알킬렌기를 말한다. 일부 구체예에서, 헤테로알킬렌기는 알킬렌기에 대해 본원에 기술된 것과 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다. 용어 "Cx-y 헤테로알킬렌"은 x 내지 y개의 탄소를 갖는 헤테로알킬렌기를 나타낸다. x에 대한 예시적인 값은 1, 2, 3, 4, 5 및 11이고; y에 대해서는 2, 3, 4, 5, 6 및 24이며; x 내지 y에 대해서는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 10 내지 24, 11 내지 24, 12 내지 24, 14 내지 24, 16 내지 24, 18 내지 24, 10 내지 22, 11 내지 22, 12 내지 22, 14 내지 22, 16 내지 22, 18 내지 22, 10 내지 20, 11 내지 20, 12 내지 20, 14 내지 20, 16 내지 20 또는 18 내지 20이다.
"헤테로알킨일"은 하나 또는 그 이상의 구성 탄소 원자가 각각 O, N 또는 S에 의해 교체된 본원에서 규정된 것과 같은 알킨일기를 의미한다. 예시적인 헤테로알킨일기는 옥소기로 치환된 및/또는 산소 원자를 통해 모분자기에 부착된, 본원에 기술된 것과 같은 알킨일기를 포함한다. 일부 구체예에서, 헤테로알킨일기는 알킬기에 대해 본원에 기술된 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 더 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"은 방향족인, 본원에서 규정된 것과 같은 헤테로사이클일의 하위집합을 나타낸다: 즉, 이것은 단일- 또는 다중환형 고리 시스템 내에 4n+2개의 파이(pi) 전자를 함유한다. 일부 구체예에서, 헤테로아릴은 헤테로사이클일기에 대해 정의된 것과 같이 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로사이클일"은, 달리 명시되지 않는 한, 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 함유하는 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-원 고리를 나타낸다. 헤테로사이클일은 포화되거나 또는 불포화될 수 있고 0 내지 3개의 불포화된 결합을 함유할 수 있다. 예를 들어서, 5-원 고리는 0 내지 2개의 이중 결합을 가지고, 6- 및 7-원 고리는 0 내지 3개의 이중 결합을 가진다. 특정 헤테로사이클일기는 2 내지 9개의 탄소 원자, 예를 들어, 3 내지 7개의 탄소 원자를 포함한다. 다른 이러한 기들은 12개까지의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 용어 "헤테로사이클일"은 또한 하나 또는 그 이상의 탄소 및/또는 헤테로원자가 단일환형 고리의 2개의 비-인접한 구성원과 연결된, 가교가 형성된 다중환형 구조를 갖는 헤테로환형 화합물, 예를 들어, 퀴뉴클리다이닐기를 나타낸다. 헤테로환형 기의 예는 아지리다이닐, 아제티다이닐, 피롤리닐, 피롤일, 피롤리다이닐, 피라졸일, 피라졸리닐, 피라졸리다이닐, 이미다졸일, 이미다졸리닐, 이미다졸리다이닐, 피리딜, 피리미디닐, 피페리디닐, 아제파닐, 피라지닐, 피페라지닐, 다이아제파닐, 모폴리닐, 테트라하이드로퓨라닐, 다이하이드로퓨라닐 등을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "(헤테로사이클일)옥시"는 산소 원자를 통해 모분자기에 부착된, 본원에서 규정된 것과 같은 헤테로사이클일기를 나타낸다. 일부 구체예에서, 헤테로사이클일기는 본원에서 규정된 것과 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "(헤테로사이클일)오일"은 카보닐기를 통해 모분자기에 부착된, 본원에서 규정된 것과 같은 헤테로사이클일기를 나타낸다. 일부 구체예에서, 헤테로사이클일기는 본원에서 규정된 것과 같은 1, 2, 3 또는 4개의 치환기로 치환될 수 있다.
"혼성화하다"는 엄격성(stringency)의 다양한 조건 하에서, 본원에서 규정된 것과 같이, 충분히 상보하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 그것의 부분들 사이에서 짝을 이루어 이중-가닥 분자를 형성하는 것을 의미한다(예를 들어, Wahl et al., Methods Enzymol. 152:399 (1987); Kimmel, Methods Enzymol. 152:507 (1987) 참조). 예를 들어서, 고엄격성 염 농도는 일반적으로 약 750 mM 미만의 NaCl 및 75 mM의 시트르산 3나트륨, 약 500 mM 미만의 NaCl 및 50 mM의 시트르산 3나트륨, 또는 약 250 mM 미만의 NaCl 및 25 mM 시트르산 3나트륨일 것이다. 저엄격성 혼성화는 유기 용매, 예를 들어, 폼아마이드의 부재하에 얻어질 수 있는 한편, 고엄격성 혼성화는 적어도 약 35% 폼아마이드 또는 적어도 약 50% 폼아마이드의 존재하에 얻어질 수 있다. 고엄격성 온도 조건은 일반적으로 적어도 약 30℃, 37℃ 또는 42℃의 온도를 포함할 것이다. 추가의 변수, 예컨대 혼성화 시간, 계면활성제, 예를 들어, 도데실 황산나트륨(SDS)의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 배제를 다양하게 다르게 하는 것은 당업자들에게 잘 알려져 있다. 다양한 수준의 엄격성은 필요에 따라 이들 다양한 조건들을 조합함으로써 달성된다. 한 구체예에서, 혼성화는 30℃에서 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산 3나트륨 및 1% SDS에서 일어날 것이다. 다른 구체예에서, 혼성화는 50℃ 또는 70℃에서 400 mM NaCl, 40 mM PIPES, 및 1 mM EDTA에서, pH 6.4에서 일어날 것이고, 12 내지 16시간 동안 혼성화된 후, 세척될 것이다. 추가의 바람직한 혼성화 조건은 70℃에서 1×SSC에서 또는 50℃에서 1×SSC, 50% 폼아마이드에서 혼성화된 후 70℃에서 0.3×SSC에서 세척되거나, 또는 70℃에서 4×SSC에서 또는 50℃에서 4×SSC, 50% 폼아마이드에서 혼성화된 후, 67℃에서 1×SSC에서 세척되는 것을 포함한다. 이들 조건에서 유용한 변동은 당업자들에게 쉽게 드러날 것이다. 그런 하나의 예시적인 변동은 생리학적 세포내 상태를 모방하도록 설계된 조건하에서의 혼성화를 평가하는 것을 포함하는데, 이때 양이온 및 음이온은 하기 비율: 양이온에 대해서, 10:160:2:26의 나트륨:칼륨:칼슘:마그네슘; 및 음이온에 대해서, 3:10:100:20:65의 염화물:중탄산염:인산염:황산염:글루콘산염으로 분류된다.
용어 "소수성 지질"은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소 기 및 하나 이상의 방향족, 사이클로지방족, 또는 헤테로사이클 기(들)로 선택적으로 치환된 이들 기를 포함하나 이에 한정되지는 않는 비극성 기를 갖는 화합물을 지칭한다. 적합한 예는 디아실글리세롤, 디알킬글리세롤, N-N-디알킬아미노, 1,2-디아실옥시-3-아미노프로판, 및 1,2-디알킬-3-아미노프로판을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "히드록시"는 -OH기를 나타낸다.
용어 "지질"은 지질 물질의 소수성 부분이 수상을 향하는 친수성 부분에 의해 수상/용액으로부터 차폐되도록 마이셀을 형성할 수 있거나, 지질 물질의 소수성 부분이 이중층을 향하는 한편 친수성 부분이 수상을 향하도록 이중층을 형성할 수 있는 임의의 지방산 유도체를 지칭한다. 친수성 특성은 포스페이토, 카르복실, 설페이토, 아미노, 설프히드릴, 니트로, 및 기타 유사 기의 존재로부터 유도된다. 소수성은 장쇄 포화 및 불포화 지방족 탄화수소기 및 하나 이상의 방향족, 시클로지방족 또는 헤테로사이클 기(들)로 치환된 이들 기를 포함하나 이에 한정되지 않는 기의 포함에 의해 부여될 수 있다. 바람직한 지질은 포스포글리세리드 및 스핑고지질이고, 이의 대표적 예는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 팔미토일올레오일 포스파티딜콜린, 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린 또는 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함할 수 있다. 스핑고지질 및 글리코스핑고지질 패밀리와 같은 인이 결여된 다른 화합물도 지질로 지칭하는 군 내이다. 또한, 상술한 양친매성 지질은 트리글리세리드 및 스테롤을 비롯한 다른 지질과 혼합될 수 있다.
용어 "지질 포합체"(lipid conjugate)는 포합 지질, 선택적으로는 지질 입자의 응집을 억제하는 것을 지칭한다. 이러한 지질 포합체는 예컨대 디알킬옥시프로필에 결합된 PEG(예, PEG-DAA 포합체), 디아실글리세롤에 결합된 PEG(예, PEG-DAG 포합체), 콜레스테롤에 결합된 PEG, 포스파티딜에탄올아민에 결합된 PEG, 및 세라미드에 포합된 PEG(예컨대 미국특허 5,885,613호 참조)와 같은 PEG-지질 포합체, 양이온성 PEG 지질, 폴리옥사졸린(POZ)-지질 포합체(예, POZ-DAA 포합체; 예컨대 2010. 1. 13. 출원된 미국 가출원번호 61/294,828 및 2010. 1. 14. 출원된 미국 가출원번호 61/295,140 참조), 폴리아미드 올리고머(예, ATTA-지질 포합체), 및 이들의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. POZ-지질 포합체의 추가예는 PCT 공개번호 WO 2010/006282에 기술되어 있다. PEG 또는 POZ는 지질에 직접 또는 링커 부분(linker moiety)을 통해 지질에 연결될 수 있다. 예컨대 에스테르 비함유 링커 부분 및 에스테르 함유 링커 부분을 비롯한 PEG 또는 POZ를 지질에 결합시키기에 적합한 임의의 링커 부분을 이용할 수 있다. 어떤 구체예에서, 아미드 또는 카바메이트와 같은 에스테르 비함유 링커 부분을 이용한다. 상기 특허문헌들 각각의 개시내용은 모든 목적에서 그 전체가 참조에 의해 본원에 편입된다. 입자의 응집을 억제하는 포합된 지질은 예컨대 폴리에틸렌글리콜(PEG)-지질일 수 있고, 이는 PEG-디아실글리세롤(DAG), PEG-디알킬옥시프로필(DAA), PEG-인지질, PEG-세라미드(Cer), 또는 이의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. PEG-DAA 포합체는 예컨대 PEG-디라우릴옥시프로필(Ci2), PEG-디미리스틸옥시프로필(Ci4), PEG-디팔미틸옥시프로필(Ci6), 또는 PEG-디스테아릴옥시프로필(Ci8)일 수 있다. 어떤 구체예에서, 입자의 응집을 방지하는 포합된 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 0몰% 내지 약 20몰% 또는 약 2몰%일 수 있다.
"지질 벡터"는 리포솜, 리포플렉스, 마이셀, 지질 나노입자, 코어-기초 입자, 형질주입 지질(들)과 조합된 RNA 결합제-RNA 응집체를 포함하는 입자, 또는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물을 포함하는 소포(vesicle)-기초 입자를 의미한다.
"링커"는 하나 또는 그 이상의 원자를 함유하는 임의로 치환된 다가(예를 들어 2가)기를 의미한다. 링커의 예를 들면 본원에 기술된 것과 같이, 임의로 치환된 알킬렌 및 헤테로알킬렌기를 포함한다.
본원에 사용된 "국소 전달"은 유기체 내 표적 부위에 간섭 RNA(예, DsiRNA)와 같은 활성 약제를 직접 전달하는 것을 지칭한다. 예컨대, 약제는 종양 또는 염증 부위와 같은 기타 표적 부위와 같은 질병 부위 또는 간, 심장, 췌장, 신장 등과 같은 표적 기관에 직접 주사에 의해 국소 전달할 수 있다.
용어 "포유류"는 인간, 마우스, 래트, 개, 고양이, 햄스터, 기니 피그, 토끼, 가축 등과 같은 임의의 포유류 종을 지칭한다.
"마이크로RNA(miRNA)"는 RNA 간섭을 통해 유전자 생성물을 침묵시키기 위해 사용될 수 있는 단일-가닥 RNA 분자를 의미한다.
용어 "변형된 지질"(modified lipid)은 예컨대 응집 및/또는 침전을 억제, 면역 반응을 억제 및/또는 생체내 순환에서 반감기를 개선하는 데 도움을 주도록 변형된 지질을 지칭한다. 본 발명의 어떤 양태에서, 변형된 지질은 중성 지질이다. 변형된 중성 지질은 폴리에틸렌글리콜 2000 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(PEG(2000) DSPE); PEG-DMG; PEG-DMPE; PEG-DPPE; PEG-DPG; PEG-DOPE; 또는 PEG-DOG와 같은 페길화(pegylated) 지질을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 "지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질"은 순환 반감기를 증가 및/또는 음이온성 약제-지질 입자의 표적 조직으로의 전달을 증가하는 수단을 제공하는 임의의 변형된 지질이다. 예시적인 이러한 변형된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG), PEG-세라미드, 또는 강글리오시드(예, GM1) 변형된 지질을 포함한다. 통상적으로, 입자 내 PEG, PEG-세라미드 또는 강글리오시드 변형된 지질의 농도는 약 1-15%가 될 것이다.
"조절하다"는 유전자의 발현, 또는 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위를 코드화하는 RNA 분자 또는 동등한 RNA 분자의 수준, 또는 하나 또는 그 이상의 단백질 또는 단백질 하위단위의 활성이 상향-조절되거나 또는 하향-조절됨으로써, 발현, 수준 또는 활성이 조절제의 부재하에 관찰했던 것보다 크거나 또는 적은 것을 의미한다. 예를 들어서, 용어 조절하다는 억제 또는 유전자 침묵을 포함할 수 있고, 유전자의 발현 수준 또는 RNA 분자, 또는 그것의 동등물의 수준은, 대조군과 비교하여, 적어도 10%(예를 들어, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%) 감소된다.
본원에 사용된 용어 "N-보호기"는 합성 과정 동안 바람직하지 않은 반응에 대해 아미노기를 보호하기 위해 의도된 그런 기들을 나타낸다. 흔히 사용된 N-보호기는 문헌: Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 3rd Edition (John Wiley & Sons, New York, 1999)에 개시되고, 이것은 참고자료로 본원에 포함된다. N-보호기로는 아실, 아릴오일 또는 카바밀기, 예컨대 포밀, 아세틸, 프로피오닐, 피발로일, t-부틸아세틸, 2-클로로아세틸, 2-브로모아세틸, 트라이플루오로아세틸, 트라이클로로아세틸, 프탈일, o-니트로페녹시아세틸, α-클로로부티릴, 벤조일, 4-클로로벤조일, 4-브로모벤조일, 4-니트로벤조일, 및 보호된 또는 비보호된 D, L 또는 D, L-아미노산, 예를 들면 알라닌, 루신, 페닐알라닌 등과 같은 키랄 보조물질; 설포닐-함유기, 예컨대 벤젠설포닐, p-톨루엔설포닐 등; 카바메이트 형성기, 예컨대 벤질옥시카보닐, p-클로로벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, p-나이트로벤질옥시카보닐, 2-나이트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, 3,4-다이메톡시벤질옥시카보닐, 3,5-다이메톡시벤질 옥시카보닐, 2,4-다이메톡시벤질옥시카보닐, 4-메톡시벤질옥시카보닐, 2-나이트로-4,5-다이메톡시벤질옥시카보닐, 3,4,5-트라이메톡시벤질옥시카보닐, 1-(p-바이페닐일)-1-메틸에톡시카보닐, α,α-다이메틸-3,5-다이메톡시벤질옥시카보닐, 벤즈하이드릴옥시 카보닐, t-뷰틸옥시카보닐, 다이아이소프로필메톡시카보닐, 아이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐, 메톡시카보닐, 알릴옥시카보닐, 2,2,2,-트라이클로로에톡시카보닐, 페녹시카보닐, 4-나이트로페녹시 카보닐, 플루오레닐-9-메톡시카보닐, 사이클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 사이클로헥실옥시카보닐, 페닐티오카보닐 등; 알카릴기, 예컨대 벤질, 트라이페닐메틸, 벤질옥시메틸 등; 및 실릴기, 예컨대 트라이메틸실릴 등이 있다. 바람직한 N-보호기는 포밀, 아세틸, 벤조일, 피발로일, t-뷰틸아세틸, 알라닐, 페닐설포닐, 벤질, t-부틸옥시카보닐(Boc), 및 벤질옥시카보닐(Cbz)이다.
본원에 사용된 용어 "유기 지질 용액"은 지질을 갖는 유기 용매를 전체적으로 또는 부분적으로 포함하는 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "옥소"는 =O를 나타낸다.
용어 "유레아"는 구조 NRN1C(=O)NRN1을 갖는 기를 말하고, 여기서 각 RN1의 의미는 본원에 제공된 "아미노"의 정의와 같다.
"중성 지질"은 선택된 pH에서 비하전된 또는 중성 양성이온성 형태로 존재하는 다수의 지질 종 중 임의의 것을 뜻한다. 생리학적 pH에서, 이러한 지질은 예컨대 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 세팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드, 및 디아실글리세롤을 포함한다.
용어 "비양이온성 지질"은 임의의 양친매성 지질은 물론 임의의 기타 중성 지질 또는 음이온성 지질을 지칭한다. 비양이온성 지질은 음이온성 지질 또는 중성 지질일 수 있고, 이는 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민(DSPE), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(SOPE), 콜레스테롤, 또는 이의 혼합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 어떤 구체예에서, 비양이온성 지질은 입자에 존재하는 총 지질의 약 5몰% 내지 약 90몰%, 약 10몰%, 또는 콜레스테롤이 포함되는 경우 약 58몰%일 수 있다. 어느 구체예에서, 핵산-지질 입자는 입자에 존재하는 총 지질의 예컨대 약 10몰% 내지 약 60몰% 또는 약 48몰%로 콜레스테롤을 더 포함한다.
"약학적 조성물"은 약학적으로 허용가능한 부형제로 제형되고, 포유동물에서 질환의 치료를 위한 치료 요법의 부분으로서 정부 관리 기관의 승인으로 제조되거나 또는 판매되는, 본원에 기술된 화합물을 함유하는 조성물을 의미한다. 약학적 조성물은, 예를 들어서, 경구 투여를 위해 단위 투약량 형태(예를 들어, 정제, 캡슐, 캐플렛(caplet), 젤캡(gelcap) 또는 시럽)로; 국소 투여를 위해(예를 들어, 크림, 겔, 로션 또는 연고로서); 정맥 내 투여를 위해(예를 들어, 미립자 색전이 없는 멸균 용액으로서 그리고 정맥 내 사용에 적합한 용매 시스템으로); 또는 본원에 기술된 어떤 다른 제형으로 제형될 수 있다.
"약학적으로 허용가능한 부형제"는 본원에 기술된 화합물 외에 어떤 성분(예를 들어서, 활성 화합물을 현탁하거나 또는 용해시킬 수 있는 비히클)을 의미하고 환자에게 비독성 및 비염증성인 성질을 가진다. 부형제는, 예를 들면 항점착제, 항산화제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕해제, 염료(색상), 유연제, 유화제, 충전제(희석제), 필름 형성제 또는 코팅제, 풍미제, 향, 활택제(흐름 향상제), 윤활제, 보존제, 인쇄 잉크, 흡착제, 현탁제 또는 분산제, 감미제, 및 수화용 물을 포함할 수 있다. 예시적인 부형제는 뷰틸화된 하이드록시톨루엔(BHT), 탄산칼슘, 인산칼슘(이염기성), 스테아르산칼슘, 크로스카멜로스, 교차결합된 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 스테아르산마그네슘, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미정질 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 전젤라틴화된 전분, 프로필 파라벤, 레틴일 팔미테이트, 쉘락, 이산화규소, 카복시메틸 셀룰로스 나트륨, 시트르산나트륨, 전분 글리콜산나트륨, 소비톨, 전분(옥수수), 스테아르산, 슈크로스, 탈크, 이산화티탄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C, 및 자일리톨을 포함하며, 이들로 제한되지 않는다.
"약학적으로 허용가능한 염"은 정상적인 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 사람 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이득/위험 비와 적합한 그런 염을 의미한다. 약학적으로 허용가능한 염은 본 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염은 다음 문헌들: Berge et al., J. Pharm. Sci. 66(1):1, 1977에 그리고 Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-VCH, 2008에 기술되어 있다. 염은 본 발명의 화합물의 최종 분리 및 정제하는 동안 제자리에서 또는 별도로 유리 염기 기를 적합한 유기산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 대표적인 산부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알지네이트, 아스코베이트, 아스파테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 뷰티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜테인프로피오네이트, 다이글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 퓨마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 브롬화수소산염, 염산염, 요오드화수소산염, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토바이오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메테인설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타트레이트, 싸이오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레르산 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 등, 및 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 등을 포함한다.
"RNA-결합제"는 핵산, 예를 들어, 치료 제형의 핵산 페이로드를 결합하거나 또는 혼성화할 수 있는 어떤 약제 또는 약제들의 조합을 의미한다. RNA-결합제는 본원에 기술된 어떤 지질(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 본원에 또는 표 1에 기술된 것들과 같은, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질들의 조합, 그뿐만 아니라 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질들 및 중성 지질 또는 PEG-지질 포합체와 같은, 어떤 다른 지질의 조합)을 포함한다. RNA-결합제는 제형 내에 어떤 유용한 구조, 예컨대, 내부 응집체를 형성할 수 있다.
"RNAi 약제"는 표적 핵산을 혼성화함으로써 유전자 침묵 효과를 발휘하는 어떤 약제 또는 화합물을 의미한다. RNAi 약제는 (예를 들어, 엄격한 조건하에서) 서열-특이적 RNAi를 중재할 수 있는 어떤 핵산 분자, 예를 들어서, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 이중-가닥 RNA(dsRNA), 마이크로RNA(miRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 짧은 간섭 올리고뉴클레오타이드, 짧은 간섭 핵산, 짧은 간섭 변형 올리고뉴클레오타이드, 화학적으로-변형된 siRNA, 전사후 유전자 침묵화 RNA(ptgsRNA) 및 다이서-기질 RNA(DsiRNA)를 포함한다.
"짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA"는 팽팽한 헤어핀 회전을 만들고 유전자를 침묵시킬 수 있는 RNA의 서열을 의미한다.
"센스 영역"은 다른 핵산의 안티센스 영역에 충분한 상보성을 갖는 본 발명의 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 또한, 본 발명의 핵산의 센스 영역은 표적 유전자 뉴클레오타이드 서열과 상동성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. "안티센스 영역"은 표적 유전자 뉴클레오타이드 서열에 충분한 상보성을 갖는 본 발명의 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.
본원에 기술한 것과 같은 핵산-지질 입자와 관계하여 "혈청 안정성"은 유리 DNA 또는 RNA를 유의적으로 열화시킬 혈청 또는 뉴클레아제 분석에 노출 후 입자가 유의적으로 열화되지 않음을 의미한다. 적합한 분석은 예컨대 표준 혈청 분석, DNAse 분석, 또는 RNAse 분석을 포함한다.
"침묵" 또는 "유전자 침묵"은 유전자의 발현 또는 하나 또는 그 이상의 단백질을 코드화하는 RNA 분자의 수준이 제어 조건하에서(예를 들어, RNAi 약제의 부재하에 또는 스크램블된(scrambled) 서열을 갖거나 또는 미스매치된 서열을 가지는 RNAi 분자와 같은 비활성 또는 감쇠된 분자의 존재하에) 관찰했던 것보다 낮은 수준으로 RNAi 약제의 존재하에 감소된다는 것을 의미한다. 유전자 침묵은 유전자 생성물 발현을 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%(즉, 완전 억제)만큼 감소시킬 수 있다.
"작은 억제 RNA", "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA"는 유전자를 침묵시킬 수 있는 10-40개(예를 들어 15-25개, 예컨대 21개)의 뉴클레오타이드 이중-가닥 분자의 부류를 의미한다. 가장 두드러지는 것은, siRNA는 RNA 간섭(RNAi) 경로에 전형적으로 포함되고 이것에 의해 siRNA는 특정 유전자 생성물의 발현을 간섭한다.
용어 "용해도"는 일정량의 용매에 용해하여 포화 용액을 형성하는 화합물(용질)의 양을 지칭한다. "용액"은 액체(용매)와 기체 또는 고체(용질)의 균질 혼합물을 지칭한다. 용액에서 용질 분자는 별개(discrete)이며 용매 분자와 혼합된다. 물질의 용해도는 온도에 따라 좌우된다. "수용해도"는 용매 물 내 용질의 용해도를 지칭한다.
"개체"는 인간 또는 비인간 동물(예, 포유류)을 의미한다.
"실질적인 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은, 각각, 참조 서열로서, 동일한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖거나 또는, 각각, 2개의 서열이 최적으로 정열될 때 참조 서열 내에 해당 위치에서 동일한 명시된 백분율의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 갖는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어서, 참조 서열에 "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 가진다. 폴리펩타이드에 대해, 비교 서열의 길이는 일반적으로 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 인접 아미노산, 보다 바람직하게는 적어도 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300 또는 350개의 인접 아미노산, 및 가장 바람직하게는 전체-길이 아미노산 서열일 것이다. 핵산에 대해, 비교 서열의 길이는 일반적으로 적어도 5개의 인접 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 인접 뉴클레오타이드, 및 가장 바람직하게는 전체-길이 뉴클레오타이드 서열일 것이다. 서열 동일성은 디폴트 설정에 대한 서열 분석 소프트웨어(예를 들어, 미국 위스콘신주 53705 메디슨시 유니버시티 애버뉴 1710에 소재한, University of Wisconsin Biotechnology Center, Genetics Computer Group의 Sequence Analysis Software Package)를 사용하여 측정될 수 있다. 그런 소프트웨어는 다양한 치환, 결실, 및 다른 변형에 대한 상동성의 정도를 지정함으로써 유사한 서열을 매칭할 수 있다.
"충분히 상보하는"은 표적 핵산으로서, 정확하게 상보하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖거나, 또는 2개의 서열이 최적으로 배열될 때 표적 핵산 내의 해당 위치에서 정확히 상보하는 명시된 백분율 또는 뉴클레오타이드를 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 예를 들어, 표적 핵산 서열에 "실질적으로 상보하는" 폴리뉴클레오타이드 서열은 표적 핵산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다. 10 내지 40개의 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 RNAi 약제에 대해, 충분히 상보하는 서열은 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 비-상보하는 뉴클레오타이드를 갖는 것들을 포함한다. 실제로, 예를 들어, DsiRNA 약제를 포함하는 특정 구체예에서, 활성 이중-가닥 RNAi 약제는 표적 핵산에 충분히 상보하는 15 내지 19개만큼 적은 연속하는 뉴클레오타이드의 가이드 가닥을 가질 수 있는 한편, 가이드 가닥의 나머지에 대해서는 표적 핵산과의 어떠한 정도의 상보성을 가져야 한다는 요건은 없다(하지만 특정 구체예에서, 가이드 가닥의 나머지는 표적화된 핵산(예를 들어, mRNA)과 부분적으로 또는 전체적으로 상보적일 수 있다).
본원에 사용된 "전신 전달"은 유기체 내에서 간섭 RNA(예, DsiRNA)와 같은 활성제의 넓은 생분포로 이어지는 지질 입자의 전달을 지칭한다. 어떤 투여 기술은 특정 약제의 전신 전달로 이어질 수 있지만 다른 것들에 대해서는 그렇지 않다. 전신 전달은 유용한, 바람직하게는 치료적 양의 약제가 신체의 대부분의 부분에 노출됨을 의미한다. 넓은 생분포를 얻는다는 것은 투여 부위에 원위인 질병 부위에 도달하기 전에 약제가 빠르게 열화되거나 제거되지(1차 통과(first pass) 장기(간, 폐 등)에 의해 또는 빠른 비특이적 세포 결합에 의해서와 같이) 않도록 하는 혈액 잔존시간을 일반적으로 요구한다. 지질 입자의 전신 전달은 본 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해서일 수 있고, 이는 예컨대 정맥내, 피하 및 복강내를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 지질 입자의 전신 전달은 정맥내 전달에 의한다.
"표적 핵산"은 그것의 발현 또는 활성이 조절될 수 있는 어떤 핵산 서열을 의미한다. 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 핵산은 표적 mRNA이다.
"형질주입 지질"은 핵산, 예를 들어, 핵산 페이로드를 전달할 수 있는 어떤 지질 또는 지질들의 조합을 의미한다(임의로, 핵산 페이로드는 RNA 결합제, 예컨대 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질과 결합됨). 형질주입 지질은 본원에 기술된 어떤 지질(예를 들어, 본원에 또는 표 1에 기술된 것들과 같은, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질들의 조합, 및 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질들 및 어떤 다른 지질 또는 약제, 예컨대 중성 지질, 음이온성 지질, PEG-지질 포합체 또는 스테롤 유도체의 조합)을 포함한다. 형질주입 지질 또는 이러한 형질주입 지질을 포함하는 조합은 제형 내부에 어떤 유용한 구조, 예컨대 외부의 응집체 표면을 형성할 수 있다.
본원에 사용되고, 본 분야에서도 이해되는 것과 같이, "치료"는 임상적인 결과와 같이 유익하거나 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근방법이다. 유익한 또는 원하는 결과는, 그것들에 한정되지는 않지만 하나 또는 그 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 호전; 질환, 장애 또는 상태의 정도의 감소; 질환, 장애 또는 상태의 상황의 안정화(즉, 악화되지 않음); 질환, 장애 또는 상태의 확산의 방지; 질환, 장애 또는 상태의 진행의 지연 또는 둔화; 질환, 장애 또는 상태의 호전 또는 경감; 및 검출가능하든지 또는 검출불가능하든지 차도(부분이든지 또는 전체이든지)를 포함할 수 있다. 질환, 장애 또는 상태를 "경감시키는 것"은 치료의 부재하의 정도 또는 시간 과정과 비교해, 질환, 장애 또는 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상적인 징후가 줄어들고 및/또는 진행의 시간 경과가 느려지거나 또는 길어지는 것을 의미한다. "암을 치료"하거나, "암을 예방"하거나, 또는 "암을 억제하는 것"은 종양의 크기 또는 암세포의 수의 감소를 야기하고, 종양의 크기의 증가 또는 암세포 증식을 늦추거나 또는 억제하며, 종양 또는 다른 암의 소멸과 그것의 재발 사이의 질환-없는 생존 시간을 증가시키고, 종양 또는 다른 암의 초기 또는 후속 발생의 가능성을 방지하거나 또는 감소시키며, 또는 종양 또는 다른 암과 관련된 부정적인 증상을 감소시키는 것을 의미한다. 바람직한 구체예에서, 치료에서 살아남는 종양 또는 암성 세포의 퍼센트는 어떤 표준 분석법을 사용하여 측정되는 것과 같이, 종양 또는 암성 세포의 초기 수보다 적어도 20, 40, 60, 80 또는 100% 낮다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물의 투여에 의해 유도된 종양 또는 암성 세포의 수의 감소는 비-종양 또는 비-암성 세포의 수의 감소보다 적어도 2, 5, 10, 20 또는 50배 높다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 표준 방법을 사용하여 측정되는 바와 같이, 종양의 크기 또는 암성 세포의 수에서 20, 40, 60, 80 또는 100%의 감소를 유발한다. 바람직하게는, 치료된 개체 중 적어도 20, 40, 60, 80, 90 또는 95%는 종양 또는 암의 모든 증거가 소멸되는 완전한 차도를 나타낸다. 바람직하게는, 종양 또는 암은 재발하지 않거나 또는 5, 10, 15 또는 20년 후에 재발한다. 개체에서 질환 또는 상태(예를 들어, 암)를 "예방학적으로 치료하는 것"은 질환 증상이 나타나기에 앞서 질환 또는 상태의 발달(즉, 발생률)의 위험을 감소시키거나 또는 심각성을 감소시키는 것을 의미한다. 예방 치료는 질환 또는 그것의 증상이 나타나는 것을 완전히 예방하거나 또는 감소시킬 수 있고 및/또는 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유의 관점에서 치료적일 수 있다. 예방 치료는 질환에 취약할 수 있지만 아직 질환에 걸린 것으로 진단받지 않은 개인에게서 질환 또는 상태가 발생하는 것을 감소시키거나 또는 방지하는(예를 들어, 암을 방지하는) 것을 포함할 수 있다.
음이온성 약제를 포함하는 입자의 조성물
일부 구체예에서, 본 발명의 입자는 양이온성 지질(예를 들어, DODMA, DOTMA, DPePC, DODAP 또는 DOTAP), 중성 지질(예를 들어, DSPC, POPC, DOPE 또는 SM), 그리고 임의로, 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤; 콜레스타논; 콜레스테논; 코프로스타놀; 3β-[-(N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤); 비스-구아니듐-트렌-콜레스테롤(BGTC); (2S,3S)-2-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)카보닐아미노)에틸 2,3,4,4-테트라하이드록시뷰타노에이트(DPC-1); (2S,3S)-((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4,4-테트라하이드록시뷰타노에이트(DPC-2); 비스((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4-트라이하이드록시펜탄다이오에이트(DPC-3); 또는 6-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)옥시도포스포릴옥시)-2,3,4,5-테트라하이드록시헥사노에이트(DPC-4))를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 입자는 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG-DMG, PEG-DMPE, PEG-DPPE, PEG-DPG, PEG-DOPE 또는 PEG-DOG)를 더 포함한다.
일부 구체예에서, 입자는 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물(예를 들어, 본원에, 예를 들어, 표 1에 기술된 하나 또는 그 이상의 어떤 화합물), 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 또는 본 발명의 하나 또는 그 이상의 화합물(예를 들어, 본원에, 예를 들어, 표 1에 기술된 하나 또는 그 이상의 어떤 화합물), 약 1 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함한다.
특정 구체예에서, 입자는 약 10 mol% 내지 약 80 mol%(예를 들어 약 40 mol% 내지 약 55 mol%, 예컨대 약 48 mol%)의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, 본원에 기술된 것과 같이 본 발명의 화합물 및/또는 다른 양이온성 지질), 약 1 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함한다. 일부 구체예에서, 입자는 약 10 mol% 내지 약 30 mol%(예를 들어, 약 22 mol%)의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물(예를 들어, L-6, L-30, 및/또는 본원에 기술된 어떤 것), 약 15 mol% 내지 약 35 mol%(예를 들어, 약 26 mol%)의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, DODMA 또는 본원에 기술된 어떤 것), 약 3 mol% 내지 약 9 mol%(예를 들어, 약 6 mol%)의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG-DSPE, PEG-DMPE, 및/또는 본원에 기술된 어떤 것), 약 10 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 14 mol%)의 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC 또는 본원에 기술된 어떤 것) 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어 약 29 mol% 내지 약 33 mol%, 예컨대 약 33 mol%)의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤, 그것의 유도체 또는 본원에 기술된 어떤 것)를 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 표 1의 화합물은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%, 예를 들어 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 25 mol%, 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 10 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 약 15 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 40 mol%, 약 20 mol% 내지 약 25 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 35 mol%, 약 20 mol% 내지 약 40 mol%, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%, 약 25 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol% 또는 약 35 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 21.0 mol%, 21.2 mol%, 21.4 mol%, 21.6 mol%, 21.8 mol%, 22 mol%, 25 mol%, 26 mol%, 26 mol%, 30 mol%, 35 mol% 또는 40 mol%)의 하나 또는 그 이상의 표 1의 화합물의 양으로 존재한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 표 1의 화합물은 약 10 mol% 내지 약 80 mol%, 예를 들어 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 25 mol%, 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 10 mol% 내지 약 35 mol%, 약 10 mol% 내지 약 40 mol%, 약 10 mol% 내지 약 45 mol%, 약 10 mol% 내지 약 50 mol%, 약 10 mol% 내지 약 55 mol%, 약 10 mol% 내지 약 60 mol%, 약 10 mol% 내지 약 65 mol%, 약 10 mol% 내지 약 70 mol%, 약 10 mol% 내지 약 75 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 약 15 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 40 mol%, 약 15 mol% 내지 약 45 mol%, 약 15 mol% 내지 약 50 mol%, 약 15 mol% 내지 약 55 mol%, 약 15 mol% 내지 약 60 mol%, 약 15 mol% 내지 약 65 mol%, 약 15 mol% 내지 약 70 mol%, 약 15 mol% 내지 약 75 mol%, 약 15 mol% 내지 약 80 mol%, 약 20 mol% 내지 약 25 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 35 mol%, 약 20 mol% 내지 약 40 mol%, 약 20 mol% 내지 약 45 mol%, 약 20 mol% 내지 약 50 mol%, 약 20 mol% 내지 약 55 mol%, 약 20 mol% 내지 약 60 mol%, 약 20 mol% 내지 약 65 mol%, 약 20 mol% 내지 약 70 mol%, 약 20 mol% 내지 약 75 mol%, 약 20 mol% 내지 약 80 mol%, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%, 약 25 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 약 25 mol% 내지 약 45 mol%, 약 25 mol% 내지 약 50 mol%, 약 25 mol% 내지 약 55 mol%, 약 25 mol% 내지 약 60 mol%, 약 25 mol% 내지 약 65 mol%, 약 25 mol% 내지 약 70 mol%, 약 25 mol% 내지 약 75 mol%, 약 25 mol% 내지 약 80 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 45 mol%, 약 30 mol% 내지 약 50 mol%, 약 30 mol% 내지 약 55 mol%, 약 30 mol% 내지 약 60 mol%, 약 30 mol% 내지 약 65 mol%, 약 30 mol% 내지 약 70 mol%, 약 30 mol% 내지 약 75 mol%, 약 30 mol% 내지 약 80 mol%, 약 35 mol% 내지 약 40 mol%, 약 35 mol% 내지 약 45 mol%, 약 35 mol% 내지 약 50 mol%, 약 35 mol% 내지 약 55 mol%, 약 35 mol% 내지 약 60 mol%, 약 35 mol% 내지 약 65 mol%, 약 35 mol% 내지 약 70 mol%, 약 35 mol% 내지 약 75 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 약 80 mol%, 약 40 mol% 내지 약 45 mol%, 약 40 mol% 내지 약 50 mol%, 약 40 mol% 내지 약 55 mol%, 약 40 mol% 내지 약 60 mol%, 약 40 mol% 내지 약 65 mol%, 약 40 mol% 내지 약 70 mol%, 약 40 mol% 내지 약 75 mol%, 약 40 mol% 내지 약 80 mol%, 약 45 mol% 내지 약 50 mol%, 약 45 mol% 내지 약 55 mol%, 약 45 mol% 내지 약 60 mol%, 약 45 mol% 내지 약 65 mol%, 약 45 mol% 내지 약 70 mol%, 약 45 mol% 내지 약 75 mol%, 또는 약 45 mol% 내지 약 80 mol%, 약 50 mol% 내지 약 55 mol%, 약 50 mol% 내지 약 60 mol%, 약 50 mol% 내지 약 65 mol%, 약 50 mol% 내지 약 70 mol%, 약 50 mol% 내지 약 75 mol% 또는 약 50 mol% 내지 약 80 mol%(예를 들어, 약 21.0 mol%, 21.2 mol%, 21.4 mol%, 21.6 mol%, 21.8 mol%, 22 mol%, 25 mol%, 26 mol%, 26 mol%, 30 mol%, 35 mol%, 40 mol%, 45 mol%, 48 mol%, 49 mol%, 50 mol%, 55 mol%, 60 mol%, 65 mol%, 70 mol% 또는 75 mol%)의 하나 또는 그 이상의 표 1의 화합물의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 양으로, 예를 들어, 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 25 mol%, 약 10 mol% 내지 약 30 mol%, 약 10 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 25 mol%, 약 15 mol% 내지 약 30 mol%, 약 15 mol% 내지 약 35 mol%, 약 15 mol% 내지 약 40 mol%, 약 20 mol% 내지 약 25 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 35 mol%, 약 20 mol% 내지 약 40 mol%, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%, 약 25 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 25.1 mol%, 25.2 mol%, 25.3 mol%, 25.4 mol%, 25.5 mol%, 25.6 mol%, 25.7 mol%, 25.8 mol%, 25.9 mol%, 26.0 mol%, 26.2 mol%, 26.4 mol%, 26.6 mol%, 26.8 mol% 또는 27 mol%)의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, DODMA 또는 표 1에서와 같이, 본원에 기술된 어떤 것)의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체는 약 1 mol% 내지 약 20 mol%의 양으로, 예를 들어, 약 1 mol% 내지 약 5 mol%, 약 1 mol% 내지 약 10 mol%, 약 1 mol% 내지 약 15 mol%, 약 2 mol% 내지 약 5 mol%, 약 2 mol% 내지 약 10 mol%, 약 2 mol% 내지 약 15 mol%, 약 2 mol% 내지 약 20 mol%, 약 5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 5 mol% 내지 약 15 mol%, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 2.5 mol%, 2.6 mol%, 2.7 mol%, 2.8 mol%, 2.9 mol%, 3 mol%, 3.5 mol%, 4 mol%, 4.3 mol%, 4.5 mol%, 4.7 mol%, 5 mol%, 5.3 mol%, 5.5 mol%, 5.7 mol%, 6 mol%, 6.5 mol%, 6.7 mol%, 7 mol%, 7.5 mol%, 8 mol%, 8.5 mol% 또는 9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG-DSPE, PEG-DMPE 및/또는 본원에 기술된 어떤 것)의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 중성 지질은 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 양으로, 예를 들어, 약 5 mol% 내지 약 10 mol%, 약 5 mol% 내지 약 15 mol%, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%, 약 7 mol% 내지 약 10 mol%, 약 7 mol% 내지 약 15 mol%, 약 7 mol% 내지 약 20 mol%, 약 10 mol% 내지 약 15 mol%, 약 10 mol% 내지 약 20 mol%, 약 15 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 13.0 mol%, 13.2 mol%, 13.4 mol%, 13.6 mol%, 13.8 mol%, 14 mol%, 14.1 mol%, 14.3 mol%, 14.5 mol%, 14.7 mol% 또는 14.9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC 또는 본원에 기술된 어떤 것)의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체는 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 양으로, 예를 들어, 약 20 mol% 내지 약 25 mol%, 약 20 mol% 내지 약 30 mol%, 약 20 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%, 약 25 mol% 내지 약 35 mol%, 약 25 mol% 내지 약 40 mol%, 약 30 mol% 내지 약 35 mol%, 약 30 mol% 내지 약 40 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 28.4 mol%, 28.6 mol%, 28.8 mol%, 29.0 mol%, 30 mol%, 31 mol%, 32 mol%, 33 mol%, 33.2 mol%, 33.4 mol%, 33.6 mol%, 33.8 mol%, 34 mol%, 34.4 mol%, 34.7 mol% 또는 34.9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤 또는 본원에 기술된 어떤 것)의 양으로 존재한다.
일부 구체예에서, 입자는 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제 및 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 포함하는 하나 또는 그 이상의 지질 입자를 포함하고, 여기서 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질 또는 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물 및 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질을 포함하고; 여기서 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함한다. 추가 제형 및 백분율은 본원에 기술된 바와 같다.
일부 구체예에서, 입자는 다중음이온성 페이로드 또는 안티센스 페이로드를 더 포함한다. 일부 구체예에서, 다중음이온성 페이로드는 RNAi 약제(예를 들어, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, ptgsRNA 또는 DsiRNA, 예를 들어, DsiRNA)이다. 일부 구체예에서, RNAi 약제는 10 내지 40개의 뉴클레오타이드의 길이, 예를 들어, 10 내지 15개의 뉴클레오타이드, 10 내지 20개의 뉴클레오타이드, 10 내지 25개의 뉴클레오타이드, 10 내지 30개의 뉴클레오타이드, 10 내지 35개의 뉴클레오타이드, 15 내지 20개의 뉴클레오타이드, 15 내지 25개의 뉴클레오타이드, 15 내지 30개의 뉴클레오타이드, 15 내지 35개의 뉴클레오타이드, 15 내지 40개의 뉴클레오타이드, 16 내지 20개의 뉴클레오타이드, 16 내지 25개의 뉴클레오타이드, 16 내지 30개의 뉴클레오타이드, 16 내지 35개의 뉴클레오타이드, 16 내지 40개의 뉴클레오타이드, 20 내지 25개의 뉴클레오타이드, 18 내지 20개의 뉴클레오타이드, 18 내지 25개의 뉴클레오타이드, 18 내지 30개의 뉴클레오타이드, 18 내지 35개의 뉴클레오타이드, 18 내지 40개의 뉴클레오타이드, 19 내지 20개의 뉴클레오타이드, 19 내지 25개의 뉴클레오타이드, 19 내지 30개의 뉴클레오타이드, 19 내지 35개의 뉴클레오타이드, 19 내지 40개의 뉴클레오타이드, 20 내지 30개의 뉴클레오타이드, 20 내지 35개의 뉴클레오타이드, 20 내지 40개의 뉴클레오타이드, 25 내지 30개의 뉴클레오타이드, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드, 25 내지 40개의 뉴클레오타이드, 30 내지 35개의 뉴클레오타이드, 30 내지 40개의 뉴클레오타이드, 또는 35 내지 40개의 뉴클레오타이드의 길이, 예를 들어, 25 내지 35개의 뉴클레오타이드의 길이, 예를 들어, 16 내지 30개의 뉴클레오타이드의 길이, 예를 들어, 19 내지 29 뉴클레오타이드의 길이를 가진다. 일부 구체예에서, 안티센스 페이로드는 8 내지 50 뉴클레오타이드의 길이(예를 들어, 8 내지 10개의 뉴클레오타이드, 8 내지 15개의 뉴클레오타이드, 8 내지 15개의 뉴클레오타이드, 8 내지 20개의 뉴클레오타이드, 8 내지 25개의 뉴클레오타이드, 8 내지 30개의 뉴클레오타이드, 8 내지 35개의 뉴클레오타이드, 8 내지 40개의 뉴클레오타이드, 또는 8 내지 45 뉴클레오타이드의 길이), 예를 들어, 14 내지 35개의 뉴클레오타이드의 길이(예를 들어, 14 내지 15개의 뉴클레오타이드, 14 내지 20개의 뉴클레오타이드, 14 내지 25개의 뉴클레오타이드 또는 14 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이), 예를 들어, 17 내지 24개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 17 내지 20 뉴클레오타이드 길이를 가진다.
일부 구체예에서, 입자는 입자에 존재하는 약 1:10(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비율의 다중음이온성 페이로드 대 전체 지질, 예를 들어, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:15(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:20(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:40(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:50(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:60(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:10(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:40(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:50(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:60(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:20(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:50(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:60(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:40(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:60(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:50(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:70(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:80(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 약 1:60(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비, 약 1:80(w/w) 내지 약 1:90(w/w)의 비, 약 1:80(w/w) 내지 약 1:95(w/w)의 비, 또는 약 1:80(w/w) 내지 약 1:100(w/w)의 비의 입자에 존재하는 다중음이온성 페이로드 대 전체 지질을 포함한다.
일부 구체예에서, 입자는 리포솜(예를 들어, 지질 나노입자), 리포플렉스 또는 마이셀을 포함한다.
한 양태에서, 본 발명의 공정은 본원에 기술된 어떤 화합물(예를 들어, 표 1에 제공된 하나 또는 그 이상의 화합물), 또는 그것의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 본원에 기술된 어떤 입자 또는 제형; 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 개체의 질환을 치료하는 또는 예방학적으로 치료하는 방법을 특징으로 하고, 그 방법은 개체에게 본원에 기술된 공정으로 만든 입자(예를 들어, 하기 실시예에서 설명하는 바와 같음), 본원에 기술된 어떤 제형, 또는 기술된 어떤 조성물을 질환(예를 들어, 간암 (예를 들어, 간세포암종, 간모세포종, 담관암종, 혈액육종 또는 혈액내피종), 폐암 (예를 들어, 소세포폐암, 비소세포폐암), 전립선암 또는 신경모세포종))을 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가로 종양 질환 및 관련 합병증, 이를테면 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 암종(예를 들어, 폐, 유방, 췌장, 결장, 간세포, 신장, 여성생식기, 전립선, 편평세포, 제자리 암종), 림프종(예를 들어, 조직구 림프종, 비-호지킨 림프종), MEN2 증후군, 신경섬유종증(시반세포 종양 포함), 골수이형성 증후군, 백혈병, 종양맥관형성, 갑상선, 간, 뼈, 피부, 뇌, 중추신경계, 췌장, 폐(예를 들어, 소세포폐암, 비소세포폐암), 유방, 결장, 방광, 전립선, 위장관, 자궁내막, 나팔관, 고환 및 난소의 암, 위장관 기질 종양(GIST), 전립선종, 비만세포종(개 비만세포종 포함), 급성 골수성 골수섬유증, 백혈병, 급성 림프성백혈병, 만성 골수성백혈병, 만성 림프성백혈병, 다발성 골수종, 악성 흑색종, 비만세포증, 신경교종, 악성 뇌교종, 성상세포종, 신경모세포종, 육종(예를 들어, 신경외배엽 기원의 육종 또는 평활근육종), 종양의 다른 조직으로의 전이, 및 화학요법-유발된 저산소증을 치료하거나 또는 예방학적으로 치료하는 방법을 특징으로 한다.
다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 표적 핵산의 발현을 조절하는 방법을 특징으로 하는데, 그 방법은 본원에 기술된 공정으로 만든 입자(예를 들어, 하기 실시예에서 설명하는 바와 같음), 본원에 기술된 어떤 제형, 또는 기술된 어떤 조성물을 표적 유전자(예를 들어, 본원에 기술된 어떤 것, 예를 들어 ABL1, AR, β-카테닌 (CTNNB1), BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA1, ERBA2, ERBB1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ETS1, ETS2, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MET, MDM2, MLL1, MLL2, MLL3, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TAL2, TCL3, TCL5, YES, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF1, NF2, RB1, TP53, WT1, ApoB100, CSN5, CDK6, ITGB1, TGFβ1, 사이클린 D1, 헵시딘, PCSK9, TTR, PLK1, 및 KIF1-결합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 표적 유전자)의 발현을 감소시키기에 충분한 양으로 개체에 투여하는 것을 포함한다(예를 들어, 여기서 방법은 개체에서 표적 유전자의 발현을 감소시키는 것을 포함함).
다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 입자/음이온성 약제의 투약량을 개체에게 1일에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1일에 1, 2, 3 또는 4회), 1주에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1주에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회) 또는 1달에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1달에 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 10회)의 투여를 특징으로 한다. 개체은 음이온성 약제의 투약량을 약 0.0001 내지 약 10 mg/kg, 예를 들어, 약 0.0001 내지 약 1 mg/kg, 약 0.0001 내지 약 5 mg/kg, 약 0.001 내지 약 1 mg/kg, 약 0.001 내지 약 5 mg/kg, 약 0.001 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 1 mg/kg, 약 0.01 내지 약 5 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 1 내지 약 5 mg/kg, 또는 약 1 내지 약 10 mg/kg의 범위로, 어떤 투약량 요법(예를 들어, 1일에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1일에 1, 2, 3 또는 4회), 1주에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1주에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회) 또는 1달에 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1달에 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 10회))으로 받을 수 있다.
개체은 본 발명의 공정으로 만든 입자의 투약량을 약 0.001 내지 약 200 mg/kg, 예를 들어, 약 0.001 내지 약 1 mg/kg, 약 0.001 내지 약 10 mg/kg, 약 0.001 내지 약 20 mg/kg, 약 0.001 내지 약 50 mg/kg, 약 0.001 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 내지 약 1 mg/kg, 약 0.01 내지 약 10 mg/kg, 약 0.01 내지 약 20 mg/kg, 약 0.01 내지 약 50 mg/kg, 약 0.01 내지 약 100 mg/kg, 약 0.01 내지 약 200 mg/kg, 약 0.1 내지 약 1 mg/kg, 약 0.1 내지 약 10 mg/kg, 약 0.1 내지 약 20 mg/kg, 약 0.1 내지 약 50 mg/kg, 약 0.1 내지 약 100 mg/kg, 약 0.1 내지 약 200 mg/kg, 약 1 내지 약 10 mg/kg, 약 1 내지 약 20 mg/kg, 약 1 내지 약 50 mg/kg, 약 1 내지 약 100 mg/kg, 약 1 내지 약 200 mg/kg, 약 10 내지 약 20 mg/kg, 약 10 내지 약 50 mg/kg, 약 10 내지 약 100 mg/kg, 약 10 내지 약 200 mg/kg, 약 20 내지 약 50 mg/kg, 약 20 내지 약 100 mg/kg, 또는 약 20 내지 약 200 mg/kg의 범위로, 어떤 투약량 요법(예를 들어, 1일에 1회 또는 그 이상 (예를 들어, 1일에 1, 2, 3 또는 4회), 1주에 1회 또는 그 이상 (예를 들어, 1주에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회) 또는 1달에 1회 또는 그 이상 (예를 들어, 1달에 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 10회))으로 받을 수 있다.
다른 양태로, 본 발명은 본 발명의 공정으로 만든 입자/약제를 특정 유형의 조직에 전달하는 방법을 특징으로 한다. 페이로드가 전달될 수 있는 특정 유형의 조직의 예는, 간, 췌장, 폐, 전립선, 콩팥, 골수, 비장, 흉선, 림프절, 뇌, 척수, 심장, 골격근, 피부, 구강 점막, 식도, 위, 회장, 소장, 결장, 방광, 자궁경부, 난소, 고환, 유선, 부신, 지방조직(흰색 및/또는 갈색), 혈액(예를 들어, 사람 조혈 전구세포, 사람 조혈 줄기 세포, CD34+ 세포, CD4+ 세포와 같은 조혈세포), 림프구, 및 다른 혈액 계통 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
아미노-아민 및 아미노-아마이드 지질
본 발명의 공정에서 이용하는 예시적 화합물을 표 1에 나타내었다.
Figure 112015099411745-pct00013
Figure 112015099411745-pct00014
Figure 112015099411745-pct00015
Figure 112015099411745-pct00016
Figure 112015099411745-pct00017
Figure 112015099411745-pct00018
본 발명의 공정의 어떤 화합물(예를 들어, 표 1에 제공된 것과 같은)은 본 분야에 확립된 것들과 유사한 공정에 의해, 예를 들면 반응식 1-4에 나타낸 반응 순서에 의해 제조될 수 있다. 이들 반응 순서, 또는 이들의 변형에 의해 제조된 예시적인 지질은, 도 1 내지 도 9 및 도 17에 제공된다.
반응식 1
Figure 112015099411745-pct00019
식 C1의 이차 아민은 환원성 아민화 조건하에서 케톤 A1을 처리함으로써 제조될 수 있는데, 여기서 R1 및 R2는 본원에 기술된 것과 같이, 일차 아민 B1을 포함하는 지질 테일기이고, R4는 본원에 기술된다. 환원성 아민화 조건은 적당한 용매에서, 케톤 A1 및 일차 아민 B1을 환원제, 예컨대 나트륨 사이아노보로하이드라이드 또는 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드와 조합하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, C1의 아미노-아민 지질은 더 산화되어 질소에 인접한 R3의 탄소 상에 옥소기를 갖는 해당 아미노-아마이드 지질을 형성한다. 다른 구체예에서, C1의 아미노-아민 지질은 R4의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 된다. 이 반응식을 사용하여 제조될 수 있는 예시적인 화합물은 표 1-4에 제공된다.
반응식 2
Figure 112015099411745-pct00020
식 E2의 삼차 아민은 환원성 아민화 조건하에서 케톤 A2를 처리함으로써 제조될 수 있는데, 여기서 각 R1 및 R2는 본원에 기술된 것과 같이 이차 아민 D2를 갖는, 본원에 기술된 지질 테일기이고, R3 및 R4는 본원에 기술된다. 환원성 아민화 조건은 적당한 용매에서, 케톤 A2 및 이차 아민 D2를 나트륨 사이아노보로하이드라이드 또는 나트륨 트라이아세톡시보로하이드라이드와 같은 환원제와 조합하는 것을 포함한다. D2의 일부 구체예에서, R3 및 R4는 결합하여 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 함유하는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고, 그 결과 생성된 삼차 아민 E2는 그런 R3 및 R4 기를 포함한다. 특정 구체예에서, E2의 아미노-아민 지질은 더 산화되어 질소에 인접한 R3 또는 R4의 탄소 상에서 옥소기를 갖는 해당 아미노-아마이드 지질이 형성된다. 다른 구체예에서, E2의 아미노-아민 지질은 R3 및/또는 R4의 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 된다.
반응식 3
Figure 112015099411745-pct00021
식 F3의 아민은 적당한 용매에서, 임의로, 고압하에서 케톤 A3, 암모니아, 2수소, 및 촉매를 조합함으로써 제조될 수 있다. 식 H3의 아미노-아마이드 지질은 적당한 용매에서 아민 F3를 활성화된 카복실산 G3와 조합함으로써 제조될 수 있는데, 여기서 LG는 이탈기이고 R4는 본원에 기술된다. 예시적인 LG는 할로(예를 들어, 염소, 브로민, 또는 아이오딘), 토실레이트, 및 트라이플레이트를 포함한다. I3의 아미노-아민 지질은 아마이드 H3를 환원제(예를 들어, 리튬 알루미늄 하이드라이드, 보레인-테트라하이드로퓨란 또는 보레인-다이메틸설파이드)와 조합함으로써 제조될 수 있다. 특정 구체예에서, H3의 아미노-아마이드 지질은 R4'의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 될 수 있다. 다른 구체예에서, I3의 아미노-아민 지질은 R4의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 될 수 있다.
반응식 4
Figure 112015099411745-pct00022
식 K4의 아미노-아마이드 지질은 적당한 용매에서 케톤 A4와 아민 J4를 조합함으로써 제조될 수 있는데, 여기서 LG는 이탈기이고 R1, R2, 및 R4는 본원에 기술된다. 예시적인 LG는 할로(예를 들어, 염소, 브로민, 또는 아이오딘), 토실레이트, 및 트라이플레이트를 포함한다. L4의 아미노-아민 지질은 아마이드 K4를 환원제(예를 들어, 리튬 알루미늄 하이드라이드, 보레인-테트라하이드로퓨란 또는 보레인-다이메틸설파이드)와 조합함으로써 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, K4의 아미노-아마이드 지질은 R4'의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 된다. 다른 구체예에서, L4의 아미노-아민 지질은 R4의 질소에서 또는 어떤 탄소 상에서 추가로 알킬화의 대상이 된다.
상기 반응식 중 어떤 것에서, R4는 본원에 기술된 것과 같이 임의로 치환된 헤테로사이클일, 임의로 치환된 -L1-NR5R6, 임의로 치환된 -C(O)-L1-NR5R6 또는 임의로 치환된 -L1-헤테로사이클일일 수 있다.
상기 반응식 중 어떤 것에서, 화합물은 추가로 알킬화되어 N 상에서 임의로 치환된 C1-6 알킬이 도입되어(즉, R3는 임의로 치환된 C1-6 알킬이다) 삼차 아민이 형성될 수 있다.
본원에서 기술된, 예를 들어 표 1에 도시된 것과 같은 지질 중 어떤 것이든지 상기에 제공된 합성 반응식을 적용하고, 필요에 따라 당업자에게 공지된 변형을 수행함으로써 제조될 수 있다.
지질 헤드기
본 발명의 공정에서 이용하는 화합물은 일반적으로 지질 헤드기, 헤드피스, 및 하나 또는 그 이상의 지질 테일기를 포함한다. 헤드피스, 예를 들어 >CH-는, 헤드기를 테일기(들)에 연결한다. 특정 구체예에서, 헤드기는 2가지 또는 그 이상의 질소 원자를 포함한다. 본원에서, 예를 들어 표 2 또는 3에 기술된 헤드기 중 어떤 것이든지 하나 또는 그 이상의 치환기(예를 들어, 알킬에 대해 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 치환기)로 임의로 치환될 수 있다.
아민기를 갖는 헤드기의 비-제한 목록을 표 2에 제공한다. 본원에 기술된 헤드기 중 어떤 것, 예를 들어 표 2의 헤드기 H-1 내지 H-39는 헤드피스 >CH-를 통해 본원에, 예를 들어 표 4에 기술된 테일기 중 어떤 것과 조합되어 본 발명의 화합물이 형성될 수 있다.
Figure 112015099411745-pct00023
Figure 112015099411745-pct00024
Figure 112015099411745-pct00025
아마이드기를 갖는 헤드기의 비-제한 목록을 표 3에 제공한다. 본원에 기술된 헤드기 중 어떤 것, 예를 들어 표 3의 헤드기 H-40 내지 H-52는 헤드피스 >CH-를 통해 본원에, 예를 들어 표 4에 기술된 테일기 중 어떤 것과 조합되어 본 발명의 공정에 이용하기 위한 화합물이 형성될 수 있다.
Figure 112015099411745-pct00026
지질 테일기
본원에 기술된 것과 같이, 본 발명의 공정에서 이용하는 화합물은 일반적으로 하나 또는 그 이상의 헤테로원자를 임의로 포함할 수 있는 하나 또는 그 이상의 테일기를 포함한다. 각 화합물에 대해, 테일기는 같거나 또는 상이할 수 있다. 본원에, 예를 들어 표 4에 기술된 테일기 중 어떤 것이든지 하나 또는 그 이상의 치환기(예를 들어, 알킬에 대해 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 치환기)로 임의로 치환될 수 있다.
예시적인 테일기는 탄소 또는 하나 또는 그 이상의 헤테로원자(예를 들어, O)를 갖는 포화된 및 불포화된 기, 예컨대 리놀레닐(C18:3), 리놀레닐옥시(C18:3), 리놀레노일(C18:3), 리놀레일(C18:2), 리놀레일옥시(C18:2) 및 리놀레오일(C18:2); 및 메틸렌에 의해 헤드피스에 연결된 본원에 기술된 어떤 헤테로원자 테일기, 예를 들어 리놀레닐옥시메틸렌(C18:3), 리놀레노일메틸렌(C18:3), 및 리놀레일옥시메틸렌(C18:2), 또는 리놀레오일메틸렌(C18:2)의 군으로부터 선택된 테일기를 포함한다. 지질 테일기의 추가의 비-제한 목록을 표 4에 제공한다.
Figure 112015099411745-pct00027
Figure 112015099411745-pct00028
조립된 나노입자에서 지질의 pKa 값의 측정
지질의 상이한 물리화학적 성질은 상이한 환경에 존재할 때 지질의 행동방식에 크게 영향을 미친다. 한 가지 이러한 중요한 특성은 지질의 이온화 상수(Ka)이다. 지질의 고유한 pKa는 어셈블링된 나노입자에 존재할 때 그것의 행동방식에 대한 정확하고 올바른 설명이 아닐 수 있다. 지질은 수성 환경에 존재할 때 높은 유전상수를 갖게 되는 환경을 경험하는 반면, 어셈블링된 나노입자/소포에서 그것은 낮은 유전상수를 제공하는 지질에 의해 둘러싸인다. 또한, 둘러싸는 지질, 콜레스테롤, 및 페길화된 지질은 모두 제형의 외관상 pKa에게 영향을 준다. 양이온성 지질과 핵산 사이의 상호작용의 성질은 정전기이고, 제형의 외관상 pKa는 나노입자에서 핵산의 캡슐화 및 또한 그것의 후속적인 세포 내 방출을 결정한다.
TNS 형광 방법이 사용되어 제형의 지질의 외관상 pKa를 결정할 수 있다. TNS(2-(p-톨루이디노)-6-나프탈렌 설폰산)은 네거티브로 하전된 형광 염료인데, 이것의 형광은 물의 존재하에서 퀀칭된다. TNS는 포지티브로 하전된 막으로 분배하고 이것은 물의 제거로 인하여 형광의 증가를 유발한다. 따라서 형광의 증가는 상이한 pH 환경에 존재할 때 양이온성 지질의 이온화를 추정하기 위해 사용될 수 있다. TNS를 사용하여 pKa를 측정하는 방법은 본 분야에 알려져 있다.
용해도 측정 방법
본 발명의 공정에서 이용하는 화합물은 물론, 본 발명의 공정에서 발생하는 입자 및 화합물은 특정 용매 내 용해도를 결정하기 위해 평가할 수 있다. 본 발명의 화합물은 본원에 기술한 임의의 지질 분자(예, 양이온성, 음이온성, 또는 중성 지질), 스테롤, 성분, 입자, 또는 이의 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
용해도는 임의의 유용한 방법 및/또는 임의의 유용한 측정기준에 의해 측정할 수 있다. 예시적 방법 및 측정기준은 고성능 액체 크로마토그래피(선택적으로는 증기화 광산란 검출기와 결합됨), 핵자기공명, 질량분광법, UV/VIS 분광법, 및 분배계수(Log P), 용해도(예, 용매 kg 당 용질 g, 용매 dL(100mL) 당 용질 g, 몰 농도, 몰랄 농도, 또는 몰 분율에 의해 측정), 임계 마이셀 농도, 평균 입자 크기, 입자의 크기 분포(예, 다분산 지수로 결정), 생성 용액의 균질성, 및 캡슐화 효능(예, 예컨대 본원에 기술한 임의의 것, 예컨대 DsiRNA와 같은 음이온성 약제의)과 같은 측정기준을 포함한다.
제형
입자를 합성하기 위한 본 발명의 공정에서 이용하는 화합물 및/또는 입자는 하나 또는 그 이상의 지질 분자(예를 들어, 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질)와 조합되어 제형이 제조될 수 있거나, 입자가 제형이 될 수 있다. 제형은 또한 하나 또는 그 이상의 성분(예를 들어, 스테롤 유도체, PEG-지질 포합체, 폴리아마이드-지질 포합체, 강글리오사이드, 항산화제, 계면활성제, 양친매성 약제, 또는 염) 및/또는 하나 또는 그 이상의 음이온성 약제(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 핵산 또는 RNAi 약제)를 포함할 수 있다. 핵산 약제를 통합하여 지질을 제형하는 방법은 예를 들어 참고문헌으로 본원에 포함된 다음 문헌들에 기술되어 있다: Judge et al., J. Clin. Invest. 119(3):661, 2009; Noble et al., Cancer Chem다른. Pharmacol. 64(4):741, 2009; Abrams et al., Mol. Ther. 18(1):171, 2009; Yagi et al., Cancer Res. 69(16):6531, 2009; Ko et al., J. Control. Release 133(2):132, 2009; Mangala et al., Methods Mol. Biol. 555:29, 2009 참조.
하나 이상의 지질 분자를 포함하는 제형
본 발명의 공정의 입자를 포함하는 제형은 본원에 기술된 것과 같이, 지질 분자들 (예컨대 본 발명의 화합물, 양이온성 지질(임의로 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 예컨대 본원에 기술된 것과 같은 본 발명의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질을 포함하거나 및/또는 임의로 본 분야에 알려져 있는 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질을 포함한다), 중성 지질, 음이온성 지질, 및 PEG-지질 포합체를 포함한다)의 어떤 유용한 조합, 이를테면 폴리펩타이드-지질 포합체와 지질 벡터의 형성 또는 안정성에 도움을 주는 다른 성분을 포함하는 어떤 유용한 조합을 포함할 수 있다. 당업자라면 특정 약제의 캡슐화, 지질 제형의 안정성, 확대된 반응 조건, 또는 어떤 다른 적절한 인자에 유리한 조합을 최적화하는 방법을 알 것이다. 본 발명의 공정의 입자를 포함하는 제형은 형성 또는 안정성에 도움을 주는 다른 성분을 포함할 수 있다.
제형에서 각 성분의 백분율은 균형을 이루어서 음이온성 약제를 캡슐화하고 그 약제를 세포에 형질주입할 수 있는 입자 또는 지질 벡터가 제조될 수 있다. 예시적인 제형은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 표 1의 화합물, 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질, 약 1 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체, 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질, 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체를 포함한다. 특정 구체예에서, 제형은 약 20 mol% 내지 약 25 mol%(예를 들어, 약 21.0 mol%, 21.2 mol%, 21.4 mol%, 21.6 mol%, 21.8 mol% 또는 22 mol%)의 하나 또는 그 이상의 표 1의 화합물, 약 25 mol% 내지 약 30 mol%(예를 들어, 약 25.1 mol%, 25.2 mol%, 25.3 mol%, 25.4 mol%, 25.5 mol%, 25.6 mol%, 25.7 mol%, 25.8 mol%, 25.9 mol%, 26.0 mol%, 26.2 mol%, 26.4 mol%, 26.6 mol%, 26.8 mol% 또는 27 mol%)의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, DODMA), 약 10 mol% 내지 약 15 mol%(예를 들어, 약 13.0 mol%, 13.2 mol%, 13.4 mol%, 13.6 mol%, 13.8 mol%, 14 mol%, 14.1 mol%, 14.3 mol%, 14.5 mol%, 14.7 mol% 또는 14.9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC), 약 2.5 mol% 내지 약 10 mol%(예를 들어, 약 2.5 mol%, 2.6 mol%, 2.7 mol%, 2.8 mol%, 2.9 mol%, 3 mol%, 3.5 mol%, 4 mol%, 4.3 mol%, 4.5 mol%, 4.7 mol%, 5 mol%, 5.3 mol%, 5.5 mol%, 5.7 mol%, 6 mol%, 6.5 mol%, 6.7 mol%, 7 mol%, 7.5 mol%, 8 mol%, 8.5 mol% 또는 9 mol%)의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, 약 2.8 mol%, 2.9 mol%, 3.0 mol%, 3.5 mol%, 3.7 mol%, 3.9 mol%, 4 mol%, 4.1 mol%, 4.3 mol%, 4.5 mol%, 4.7 mol%, 4.9 mol%, 5 mol%, 5.1 mol%, 5.3 mol%, 5.5 mol%, 5.7 mol%, 5.9 mol%, 6 mol%, 6.3 mol%, 6.5 mol%, 6.7 mol% 또는 7 mol%의 PEG2000-DSPE 및/또는 PEG2000-DMPE 및/또는 3 mol%, 3.5 mol%, 3.7 mol%, 3.9 mol%, 4 mol%, 4.1 mol%, 4.3 mol%, 4.5 mol%, 4.7 mol%, 4.9 mol%, 5 mol%, 5.1 mol%, 5.3 mol%, 5.5 mol%, 5.7 mol%, 5.9 mol%, 6 mol%, 6.3 mol%, 6.5 mol%, 6.7 mol% 또는 7 mol%의 PEG2000-DMG), 및 약 25 mol% 내지 약 35 mol%(예를 들어, 약 28.4 mol%, 28.6 mol%, 28.8 mol%, 29.0 mol%, 30 mol%, 31 mol%, 32 mol%, 33 mol%, 33.2 mol%, 33.4 mol%, 33.6 mol%, 33.8 mol%, 34 mol%, 34.4 mol%, 34.7 mol% 또는 34.9 mol%)의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤)를 포함한다.
제형은 어떤 유용한 양의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제형 중의 양이온성 지질의 함량은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 10 mol% 내지 15 mol%, 약 15 mol% 내지 20 mol%, 약 20 mol% 내지 25 mol%, 약 25 mol% 내지 30 mol%, 약 30 mol% 내지 35 mol%, 및 약 35 mol% 내지 40 mol%)이다. 특정 구체예에서, 혼합된 양이온성 지질(예를 들어, 10.8 mol%의 L-1 및 10.8 mol%의 L-2)이 사용된다.
일부 구체예에서, 제형은 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제 및 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 갖는 지질 입자를 포함하는데, 여기서 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 양이온성 지질(예를 들어, DODMA) 및 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG2000-DSPE와 같은 PEG-DSPE, 및/또는 PEG2000-DMPE와 같은 PEG-DMPE)를 포함하고; 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물(예를 들어, 표 1의 L-6, -30, 또는 어떤 것), 약 5 mol% 내지 약 20 mol%의 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC), 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG2000-DSPE와 같은 PEG-DSPE, 및/또는 PEG-DMPE, 예컨대 PEG2000-DMPE), 및 약 20 mol% 내지 약 40 mol%의 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤)를 포함한다.
지질 입자의 RNA-결합제(들)는 어떤 유용한 지질과 포합체의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 양이온성 지질(예를 들어, DODMA)의 함량은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 20 mol% 내지 40 mol%, 20 mol% 내지 35 mol%, 20 mol% 내지 30 mol%, 15 mol% 내지 40 mol%, 15 mol% 내지 35 mol%, 15 mol% 내지 25 mol%, 또는 15 mol% 내지 20 mol%)이다. 일부 구체예에서, PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG2000-DSPE와 같은 PEG-DSPE, 및/또는 PEG2000-DMPE와 같은 PEG-DMPE)는 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%(예를 들어, 약 0.5 mol% 내지 1 mol%, 0.5 mol% 내지 5 mol%, 0.5 mol% 내지 10 mol%, 1 mol% 내지 5 mol%, 또는 1 mol% 내지 10 mol%)이다.
지질 입자의 형질주입 지질(들)은 어떤 유용한 지질과 포합체의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 표 1의 화합물(예를 들어, 표 1의 L-6, -30, 또는 어떤 것)의 함량은 약 10 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 10 mol% 내지 20 mol%, 10 mol% 내지 30 mol%, 10 mol% 내지 35 mol%, 15 mol% 내지 20 mol%, 15 mol% 내지 25 mol%, 15 mol% 내지 30 mol%, 15 mol% 내지 35 mol%, 15 mol% 내지 40 mol%, 20 mol% 내지 25 mol%, 20 mol% 내지 30 mol%, 20 mol% 내지 35 mol%, 20 mol% 내지 40 mol%, 25 mol% 내지 30 mol%, 25 mol% 내지 35 mol%, 또는 25 mol% 내지 40 mol%)이다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 중성 지질(예를 들어, DSPC)의 함량은 약 5 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 5 mol% 내지 10 mol%, 5 mol% 내지 15 mol%, 7 mol% 내지 10 mol%, 7 mol% 내지 15 mol%, 7 mol% 내지 20 mol%, 10 mol% 내지 15 mol%, 또는 10 mol% 내지 20 mol%)이다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체(예를 들어, PEG2000-DSPE와 같은 PEG-DSPE 및/또는 PEG2000-DMPE와 같은 PEG-DMPE)의 함량은 약 0.5 mol% 내지 약 10 mol%(예를 들어, 약 0.5 mol% 내지 1 mol%, 0.5 mol% 내지 5 mol%, 0.5 mol% 내지 10 mol%, 1 mol% 내지 5 mol%, 또는 1 mol% 내지 10 mol%)이다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체(예를 들어, 콜레스테롤)의 함량은 약 20 mol% 내지 약 40 mol%(예를 들어, 약 20 mol% 내지 25 mol%, 20 mol% 내지 30 mol%, 20 mol% 내지 35 mol%, 20 mol% 내지 40 mol%, 25 mol% 내지 30 mol%, 25 mol% 내지 35 mol%, 또는 25 mol% 내지 40 mol%)이다.
다른 구체예에서, 표 1에서 선택되는 화합물은 RNA-결합제(들)의 제형에 사용된다(예를 들어, 약 25.9 mol%의 L-6, L-30, L-48 또는 L-49). 특정 구체예에서, RNA-결합제(들)의 제형에 사용된 표 1에서 선택되는 화합물은 형질주입 지질(들)의 제형에 사용된 화합물(선택적으로는 표 1의 것)과 상이하다(예를 들어, RNA-결합제로서 25.9 mol%의 L-48, 및 형질주입 지질로서 21.6 mol%의 L-30). 제형의 일부 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 내부 응집체를 형성하고, 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 외부, 응집체 표면을 형성한다. 특정 구체예에서, 외부 응집체 표면은 막, 지질 이중층, 및/또는 다중 라멜라(multilamellar)층이 아니다.
제형은 또한 어떤 유용한 양의 하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 제형 중의 PEG-지질 포합체의 함량은 약 1 mol% 내지 약 20 mol%(예를 들어, 약 1 mol% 내지 약 2 mol%, 약 2 mol% 내지 약 4 mol%, 약 2 mol% 내지 약 7 mol%, 약 4 mol% 내지 약 8 mol%, 약 8 mol% 내지 약 12 mol%, 약 12 mol% 내지 약 16 mol%, 또는 약 16 mol% 내지 약 20 mol%)이다. 다른 구체예에서, PEG-지질 포합체의 함량은 약 7 mol%, 6 mol%, 3.0 mol%, 또는 2.5 mol%이다. 게다가, PEG-지질 함량은 DSPC 또는 콜레스테롤, 또는 둘 다의 함량의 적당한 조정에 의해, 약 1 mol% 내지 약 20 mol%로 달라질 수 있다. PEG-지질은 C14:0(표 4에서와 같이, 예를 들면 PEG-DSPE 또는 PEG-DMPE 등), C16(PEG-DPPE, PEG-DPG 등), C18:0(PEG-DSPE, PEG-DSG 등), 또는 C18:1(PEG-DOPE, PEG-DOG, 등)을 사용함으로써 다양할 수 있다. 더욱이, 상이한 분자량 PEG 부분(PEG2000, PEG3400, PEG5000 등)이 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 혼합된 PEG-포합체가 본원에 기술된 바와 같이 사용된다. 특정 구체예에서, PEG2000-DSPE가 사용된다. 특정 구체예에서, PEG2000-DMPE가 사용된다.
RNAi 약제를 포함하는 제형
본 발명의 공정은 본원에 기술된 방법 중 어떤 것에 의해 RNAi 약제를 포함하는 제형 및/또는 입자를 제조하는 데 이용할 수 있다. 예를 들어 참고문헌으로 본원에 포함된 문헌들: Judge et al., J. Clin. Invest. 119(3):661, 2009; Noble et al., Cancer Chem다른. Pharmacol. 64(4):741, 2009; Abrams et al., Mol. Ther. 18(1):171, 2009; Yagi et al., Cancer Res. 69(16):6531, 2009; Ko et al., J. Control. Release 133(2):132, 2009; Mangala et al., Methods Mol. Biol. 555:29, 2009 참조.
입자 및/또는 제형은 RNAi 약제 및 지질 분자 및/또는 하나 또는 그 이상의 성분을 어떤 유용한 비로 포함할 수 있다. 예시적인 비는 약 1:10 내지 약 1:100(w/w)(예를 들어 약 1:10 내지 약 1:50, 예컨대 약 1:20)의 (w/w) 비의 RNAi 약제:전체 지질 비를 포함하는데, 여기서 전체 지질 비는 하나 또는 그 이상의 지질 분자(예를 들어, 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질)와 하나 또는 그 이상의 성분(예를 들어, 스테롤 유도체, PEG-지질 포합체, 폴리아마이드-지질 포합체, 강글리오사이드, 항산화제, 계면활성제, 양친매성 약제 또는 염)의 조합의 중량이다. 한 구체예에서, 지질 대 약물비(질량/질량 비)(예, 지질 대 dsRNA 비)는 약 1:1 내지 약 50:1, 약 1:1 내지 약 25:1, 약 3:1 내지 약 15:1, 약 4:1 내지 약 10:1, 약 5:1 내지 약 9:1, 또는 약 6:1 내지 약 9:1의 범위일 수 있다.
입자 및/또는 제형은 RNAi 약제를, 약 1 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위의 본원에 기술된 어떤 RNAi 약제의 용량으로 포함할 수 있다. 예시적인 용량은 입자 또는 제형 중의 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg 및 10 mg/kg의 RNAi 약제를 포함한다.
제형을 제조하는 방법
본 발명의 입자는 어떤 유용한 공정으로 조제될 수 있다. 하나의 예시적인 과정에서, 본 발명의 입자의 성분(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제, 형질주입 지질, 또는 본원에 기술된 어떤 지질)은 용매(예를 들어, 수성 용매, 비-수성 용매, 또는 이것들의 용매 혼합물)에 용해된다. 본 발명의 공정에 이용하기 위한 예시적인 FDA 승인 용매는 아세트산, 아세톤, 아세토니트릴, 아니솔, 벤젠, 1-부탄올, 2-부탄올, 부틸아세테이트, tert-부틸메틸에테르, 사염화탄소, 클로로벤젠, 클로로포름, 큐멘, 시클로헥산, 1,2-디클로로에탄, 1,1-디클로로에텐, 1,2-디클로로에텐, 디클로로메탄, 1,2-디메톡시에탄, n,n-디메틸아세트아미드, n,n-디메틸포름아미드, 디메틸설폭시드, 1,4-디옥산, 에탄올, 2-에톡시에탄올, 에틸아세테이트, 에틸렌글리콜, 에틸에테르, 에틸포르메이트, 포름아미드, 포름산, 헵탄, 헥산, 이소부틸아세테이트, 이소프로필아세테이트, 메탄올, 2-메톡시에탄올, 메틸아세테이트, 3-메틸-1-부탄올, 메틸부틸케톤, 메틸시클로헥산, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 2-메틸-1-프로판올, n-메틸피롤리돈, 니트로메탄, 펜탄, 1-펜탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 프로필아세테이트, 피리딘, 설폴란, 테트라히드로푸란, 테트랄린, 톨루엔, 1,1,1-트리클로로에탄, 1,1,2-트리클로로에텐, 자일렌 및 이들의 조합을 포함한다. 그 결과 생성된 지질 현탁액은 임의로 여과되고, 혼합되며(예를 들어, 배취 혼합, 인-라인 혼합, 및/또는 와류), 증발되고(예를 들어, 질소 또는 아르곤 스트림을 사용하여), 재현탁되며(예를 들어, 수성 용매, 비-수성 용매, 또는 이것들의 용매 혼합물에), 동결-융해되고, 압출되며, 및/또는 초음파처리될 수 있다. 더욱이, 지질 현탁액은 임의로 어떤 원하는 성분(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 RNAi 약제, RNA-결합제, 형질주입 지질, 및/또는 본원에 기술된 어떤 지질)을 첨가함으로써 임의로 가공처리되어 최종 현탁액이 제조될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 원하는 성분이 현탁액으로서 동일한 또는 상이한 용매에 제공될 수 있다. 예를 들어서, 지질 현탁액은 제1 용매 또는 용매 시스템(예를 들어 하나 또는 그 이상의 수성 또는 비-수성 용매(들), 예컨대 물, 물-HCl, 물-에탄올, 완충액(예를 들어 인산염 완충 식염수(PBS), 행크 평형 염 용액(HBSS), 둘베코 인산염-완충 식염수(DPBS), 얼스 평형 염 용액(EBSS), 탄산염, 락테이트, 아스코베이트, 및 시트레이트, 예컨대 5 mM, 10 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM 또는 150 mM), 생리학적 삼투질농도(osmolality) 용액(290 mOsm/kg, 예를 들어, 0.9% 식염수, 5% 덱스트로스, 및 10% 슈크로스), 식염수, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 아이소프로판올, n-뷰탄올, 아이소뷰탄올, tert-뷰탄올, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 클로로폼, 다이클로로메탄, 헥산, 사이클로헥산, 아세톤, 에터, 다이에틸 에터, 다이옥산, 아이소프로필 에터, 테트라하이드로퓨란, 또는 이들의 조합)으로 제공될 수 있고, 음이온성 약제(예, RNAi 약제)는 제2 용매 또는 용매 시스템, 예를 들어 하나 또는 그 이상의 수성 또는 비-수성 용매(들), 예를 들어 물, 물-HCl, 물-에탄올, 완충액(예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS), 행크 평형 염 용액(HBSS), 둘베코 인산염-완충 식염수(DPBS), 얼스 평형 염 용액(EBSS), 탄산염, 락테이트, 아스코베이트, 및 시트레이트, 예컨대 5 mM, 10 mM, 50 mM, 75 mM, 100 mM 또는 150 mM), 생리학적 삼투질농도 용액(290 mOsm/kg, 예를 들어, 0.9% 식염수, 5% 덱스트로스, 및 10% 슈크로스), 식염수, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 아이소프로판올, n-뷰탄올, 아이소뷰탄올, tert-뷰탄올, 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 클로로폼, 다이클로로메탄, 헥산, 사이클로헥산, 아세톤, 에터, 다이에틸 에터, 다이옥산, 아이소프로필 에터, 테트라하이드로퓨란, 또는 이들의 조합으로 제공될 수 있다. 수성 용매 및/또는 완충액의 예시적인 농도는 약 4% 내지 약 8%(예를 들어, 약 4% 내지 5%, 5% 내지 6%, 6% 내지 7% 또는 7% 내지 8%)의 에탄올, 약 10 mM 내지 약 100 mM(예를 들어, 약 10 mM 내지 30 mM, 30 mM 내지 50 mM, 50 mM 내지 70 mM, 70 mM 내지 90 mM 또는 90 mM 내지 100 mM)의 시트레이트를 포함한다. 용매 또는 용매 시스템 중 어떤 것은 하나 또는 그 이상의 안정제, 예컨대 항산화제, 염(예를 들어, 염화 나트륨), 시트르산, 아스코브산, 글리신, 시스테인, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 만니톨, 락토스, 트레할로스, 말토스, 글리세롤, 및/또는 글루코스를 포함할 수 있다. 추가 예에서, 하나 또는 그 이상의 음이온성 약제는 제1 용매 또는 용매 시스템을 사용하여 지질 현탁액에 도입된 다음 이어서 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 제2 용매 또는 용매 시스템에 첨가되는데, 여기서 제1 및 제2 용매 또는 용매 시스템은 같거나 또는 상이하다(예를 들어, 제1 용매 또는 용매 시스템은 본원에 기술된 어떤 것이고; 제2 용매 또는 용매 시스템은 본원에 기술된 어떤 것임). 특정 구체예에서, 제2 용매 또는 용매 시스템은 식염수, 완충액(예를 들어, 시트레이트 또는 PBS), 물, 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 수성 또는 비-수성 용매를 포함한다. 최종 현탁액은 임의로 분리되고(예를 들어, 초원심분리기에 의해), 혼합되며(예를 들어, 배취 혼합, 인-라인 혼합, 및/또는 와류), 재현탁되고(예를 들어, 하나 또는 그 이상의 용매 또는 완충액 시스템으로), 조정되며, 초음파처리되고, 동결-융해되며, 압출되고, 및/또는 정제될 수 있다.
양이온성 지질
하나 또는 그 이상의 양이온성 지질이 본 발명의 입자 및/또는 방법으로 제조한 제형에 포함될 수 있다. 표 1의 화합물 외에 사용되는 다른 양이온성 지질은, 참고자료로 본원에 포함된 문헌: Love et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 107(5):1864-1869 (2010)에 기술된 바와 같이, 염화 N,N-다이올레일-N,N-다이메틸암모늄(DODAC), 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트라이메틸암모늄 프로판(DOTMA), N,N-다이스테아릴-N,N-다이메틸암모늄(DDAB), 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판(DOTAP, 키랄 형태 R-DOTAP 및 S-DOTAP를 포함한다), N-(1-(2,3-다이올레일옥시)프로필)-N-2-(스퍼민카복스아미도)에틸-N,N-다이메틸암모늄(DOSPA), 다이옥타데실아미도글리실 카복시스퍼민(DOGS), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄 프로판(DODAP), N,N-다이메틸-(2,3-다이올레일옥시)프로필아민(DODMA), N-(1,2-다이미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸암모늄(DMRIE), 1,2-다이리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-다이리놀레닐옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLenDMA), 1,2-다이리놀레오일-3-다이메틸아미노프로판(DLinDAP), 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-2-DMAP), 1,2-다이리놀레일카바모일옥시-3-다이메틸아미노프로판(DLin-C-DAP), 1,2-다이리놀레일티오-3-다이메틸아미노프로판(DLin-S-DMA), 2,2-다이리놀레일-4-다이메틸아미노메틸-[1,3]-다이옥솔란(DLin-K-DMA), 2,2-다이리놀레일-4-(2-다이메틸아미노에틸)-[1,3]-다이옥솔란(DLin-KC2-DMA), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-O-에틸-3-포스포콜린(DPePC), 염화 다이스테아릴다이메틸암모늄(DSDMA), 1,2-다이라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(12:0 EPC, 예를 들어 또는 그것의 염화물 염), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(16:0 EPC, 예를 들어 또는 그것의 염화물 염), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(18:0 EPC, 예를 들어 또는 그것의 염화물 염), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린(18:1 EPC, 예를 들어 또는 그것의 염화물 염), 다이팔미토일 포스파티딜에탄올아미도스퍼민(DPPES), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아미도 L-리신(DPPEL), 염화 1-[2-(다이올레오일옥시)에틸]-2-올레일-3-(2-하이드록시에틸)이미다졸리늄(DOTIM), (1-메틸-4-(시스-9-다이올레일) 메틸-피리디늄-염화물)(SAINT), 및 C12-200을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
양이온성 지질은 상이한 키랄 형태(예를 들어, 본원에 기술된 어떤 양이온성 지질의 R 또는 S 형태) 또는 어떤 염 형태(예를 들어, 본원에 기술된 어떤 양이온성 지질의 염화물, 브롬화물, 트라이플루오로아세테이트 또는 메탄설포네이트 염)의 것들을 포함한다.
추가로, 양이온성 지질의 수많은 상용 약제가 제형에 포함될 수 있다. 이러한 상용 약제는 Invitrogen Corp.로 부터의 Lipofectamine™(DOSPA와 DOPE의 조합) 및 Lipofectin®(DOTMA와 DOPE의 조합); 및 Promega Corp.로부터의 Transfectam®(DOGS를 포함하는 조성물) 및 Transfast™을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
음이온성 지질
하나 또는 그 이상의 음이온성 지질이 본 발명의 제형 및 또는 방법의 입자에 포함될 수 있다. 그런 음이온성 지질은 포스파타이딜글리세롤(PGs), 카디올리핀(CLs), 다이아실포스파타이딜세린(PSs), 다이아실포스파타이트(PAs), 포스파타이딜이노시톨(PIs), N-아실포스파타이딜에탄올아민(NAPEs), N-석신일포스파타이딜에탄올아민, N-글루타릴포스파타이딜에탄올아민, 리실포스파타이딜글리세롤, 및 팔미토일올레오일포스파타이딜글리세롤(POPG), 및 상이한 키랄 형태(예를 들어, R 또는 S 형태), 염 형태(예를 들어, 염화물, 브롬화물, 트라이플루오로아세테이트 또는 메탄설포네이트 염), 및 이것들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
중성 지질
하나 또는 그 이상의 중성 지질이 본 발명의 제형 및 또는 방법의 입자에 포함될 수 있다. 이러한 중성 지질은 세라마이드, 스핑고미엘린(SM), 다이아실글리세롤(DAG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC, 키랄 형태 R-DSPC 및 S-DSPC를 포함한다), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이올레오일-글리세로-sn-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-다이엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE), 1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(SOPE), 1,2-다이리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 및 상이한 키랄 형태(예를 들어, R 또는 S 형태), 염 형태(예를 들어, 염화물, 브롬화물, 트라이플루오로아세테이트, 또는 메탄설포네이트 염), 및 이것들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 다른 다이아실-sn-글리세로-3-포스포콜린 및 다이아실-글리세로-sn-3-포스포에탄올아민 지질도 또한 본 발명의 지질 입자에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 제형 및/또는 입자에 존재하는 중성 지질 성분은 하나 또는 그 이상의 인지질을 포함한다. 추가의 구체예에서, 중성 지질 성분은 하나 또는 그 이상의 인지질 및 콜레스테롤의 혼합물을 포함한다. 일부 구체예에서, 제형 및/또는 입자에 사용하기 위한 중성 지질의 선택은 약동학 및/또는 약력학 특성, 예를 들면 혈류 중의 지질 입자 크기 및 안정성을 고려하여 안내된다.
스테롤 유도체
하나 또는 그 이상의 스테롤 유도체가 본 발명의 제형 및/또는 방법의 입자에 포함될 수 있다. 이론에 제한되길 원치 않지만, 스테롤 유도체는 제형/입자를 안정화하고 및/또는 형질주입을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 스테롤 유도체는 콜레스테롤, 콜레스탄올의 유도체(예를 들어, 콜레스탄올, 콜레스텐온 또는 코프로스탄올); 3β-[-(N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤, 예를 들어, 그것의 염산염); 비스-구아니듐-트렌-콜레스테롤(BGTC); (2S,3S)-2-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카히드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)카보닐아미노)에틸 2,3,4,4-테트라하이드록시부타노에이트(DPC-1); (2S,3S)-((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4,4-테트라하이드록시부타노에이트(DPC-2); 비스((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일) 2,3,4-트라이하이드록시펜테인다이오에이트(DPC-3); 및 6-(((3S,10R,13R,17R)-10,13-다이메틸-17-((R)-6-메틸헵탄-2-일)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-테트라데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3-일옥시)옥시도포스포릴옥시)-2,3,4,5-테트라하이드록시헥사노에이트(DPC-4)를 포함한다.
PEG-지질 포합체
하나 또는 그 이상의 PEG-지질 포합체가 본 발명의 제형 및/또는 방법의 입자에 포함될 수 있다. 이론에 제한되길 원치 않지만, PEG-지질 포합체는 지질 벡터의 응집을 감소시킬 수 있었다. PEG-지질 포합체는 미국 특허 제5,885,613호 및 미국 가 특허출원 제2003/0077829호에 기술되고, 이들은 참고자료로 본원에 포함된다.
제형 및/또는 입자에 포함될 수 있는 PEG-지질 포합체는 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DMPE)(예를 들어, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜-2000)(PEG-2000-DMPE)), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DPPE), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DSPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(카보닐-메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DOPE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DMG)(예를 들어, 1,2-다이미리스토일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-2000-DMG)), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DPG), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DSG), 1,2-다이올레오일-sn-글리세롤-3-(메톡시-폴리에틸렌 글리콜)(PEG-DOG), 3-N-[(ω-메톡시폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일]-1,2-다이미리스틸옥시-프로필아민(PEG-C-DMA), R-3-[(ω-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일)]-1,2-다이미리스틸옥시프로필-3-아민 (PEG-2000-C-DOMG) 및 PEG-세라마이드 포합체(예를 들어, 참고자료로 본원에 포함된 미국 특허 제5,820,873호에 기술된 PEG-CerC14 또는 PEG-CerC20)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가의 PEG-지질 포합체는 본원에 기술된 어떤 지질에 포합된 PEG, 예컨대 포스파타이딜에탄올아민 또는 세라마이드(참고자료로 본원에 포함된 미국 특허 제5,820,873호; 제5,534,499호; 및 제5,885,613호 참조), 및 본원에 기술된 어떤 PEG-지질 포합체의 염 형태(예를 들어, 나트륨, 암모늄 또는 트라이메틸암모늄 염)를 포함한다.
PEG-지질 포합체는 하나 또는 그 이상의 다양한 변형, 예컨대 본원에 기술된 어떤 지질 분자로 또는 상이한 분자량(예를 들어, 300 내지 5,000 달톤)의 PEG 부분으로의 치환을 포함할 수 있다. 예시적인 치환은 하나 또는 그 이상의 C14:0(표 4에서와 같이), C16(PEG-DPPE, PEG-DPG 등), C18:0(PEG-DSPE, PEG-DSG 등), 또는 C18:1(PEG-DOPE, PEG-DOG 등)을 폴리에틸렌글리콜 부분(예를 들어, PEG2000, PEG3400, PEG5000 등)과 조합하여 사용하여 PEG-지질 포합체(예를 들어, mPEG2000-DMG)를 형성하는 것을 포함한다. 다양한 분자량을 갖는 PEG 부분의 예는 PEG350, PEG550, PEG750, PEG1000, PEG2000, PEG3000, PEG3400, PEG4000 및 PEG5000을 포함한다.
예시적 지질
제형 및/또는 입자는 기술분야에서 인정되는 임의의 지질 또는 기타 연관 성분 중 하나 또는 조합을 포함할 수 있으며, 예컨대 미국특허 6,756,054; 5,976,567; 6,815,432; 6,858,225; 6,020,526; 6,638,529; 6,670,393; 6,034,135; 5,958,901; 6,172,049; 8,324,366; 8,158,601; 8,034,376; 8,329,070; 7,901,708; 8,283,333; 8,236,943; 8,188,263; 8,101,741; 8,058,069; 7,982,027; 7,803,397; 7,915,399; 7,807,815; 7,799,565; 7,745,651; 6,841,537; 6,410,328; 7,811,602; 7,244,448; 및 8,227,443는 물론 출원번호 US 2012/0294905; US 2012/0244207; US 2012/0046478; US 2012/0183602; US 2012/0128760; US 2012/0101148; US 2009/0163705; US 2012/0016006; US 2003/0077829; WO 2010/088537; WO 2010/036962; US 2012/0095075; US 2012/0058144; US 2012/0027796; US 2011/0311583; US 2012/0027803; WO 2010/048536; WO 2011/038031; WO 2009/132131; WO 2009/100351; WO 2004/064737; WO 2004/030634; WO 2011/071860; WO 2013/013017; WO 2013/013013; WO 2010/057217; WO 2010/036962; WO 2011/153493; WO 2011/075656; WO 2010/144740; WO 2009/086558; WO 2010/054405; WO 2010/054401; WO 2010/054384; US 2011/0086826; US 2012/0225434; US 2011/0117125; WO 2009/086558; US 2011/0256175; WO 2010/042877; US 2010/0041152; US 2009/0285878; WO 2009/108235; WO 2009/108235; US 2011/0216622; US 2004/0142025; WO 2004/002453; US 2012/0202871; US 2011/0076335; WO 2011/000106; WO 2011/000107; US 2011/0195127; WO 2011/000108; US 2011/0178155; WO 2009/129319; US 2012/0328668; US 2009/0270481; US 2007/0135372; WO 2007/051303; US 2012/0183581; US 2010/0130588; US 2009/0291131; WO 2009/127060; WO 2009/082817; US 2012/0058188; US 2011/0091525; US 2006/0240093; US 2005/0175682; US 2005/0064595; WO 2005/007196; WO 2005/026372; WO 2005/007196; US 2011/0224418; US 2008/0249046; US 2006/0051405; US 2006/0025366; WO 2006/007712; WO 2006/002538; WO 2006/007712; US 2011/0262527; US 2011/0060032; US 2006/0083780; US 2006/0008910; WO 2005/120152; WO 2005/121348; WO 2005/120152; US 2005/0118253; US 2013/0022649; WO 2011/066651; US 2012/0172411; US 2011/0313017; US 2011/0201667; WO 2011/011447; US 2011/0189300; US 2006/0134189; WO 2006/053430; US 2011/0177131; US 2007/0135370; WO 2007/048046; US 2011/0071208; US 2009/0149403; US 2008/0171716; WO 2008/019486; US 2007/0218122; WO 2007/056861; US 2007/0054873; US 2007/0042031; WO 2007/012191; WO 2002/088370; US 2003/0108886; WO 2002/088370; WO 2002/087541; WO 2011/038160; WO 2010/083615; WO 2011/141705; WO 2011/141704; WO 2012/000104; WO 2011/141703; WO 2010/105372; 및 WO 2006/074546에 기술된 것들을 포함한다.
다른 성분
제형 및/또는 입자는 지질 벡터를 안정화하고, 지질 벡터의 응집을 감소시키고, 및/또는 치료제(예를 들어, RNAi 약제)를 전달하는 데 도움을 주는 어떤 다른 성분을 포함할 수 있다. 예시적인 성분은 참고자료로 본원에 포함된, 미국 특허 제6,320,017호 및 제6,586,559호에 기술된 것들과 같은, ω-아미노 (올리고에틸렌글리콜) 알칸산 단량체에 기초한 폴리아마이드-지질 포합체(ATTA-지질); 강글리오사이드(예를 들어, 아시알로강글리오사이드 GM1 또는 GM2; 다이시알로강글리오사이드 GD1a, GD1a-NAcGal, GD1-b, GD2 또는 GD3; 글로보사이드, 모노시알로강글리오사이드 GM1, GM2 또는 GM3, 테트라시알로강글리오사이드 GQ1b, 및 트라이시알로강글리오사이드 GT1a 또는 GT1b); 항산화제(예를 들어, α-토코페롤 또는 β-하이드록시톨루이딘); 하나 또는 그 이상의 계면활성제(예를 들어, 소비탄 모노팔미테이트 또는 소비탄 모노팔미테이트, 유성 슈크로스 에스터, 폴리옥시에틸렌 소비탄 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 소비톨 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 알킬 에터, 폴리옥시에틸렌 스테롤 에터, 폴리옥시에틸렌-폴리프로폭시 알킬 에터, 블록 중합체 및 세틸 에터, 및 폴리옥시에틸렌 피마자 오일 또는 수소첨가된 피마자 오일 유도체 및 폴리글리세린 지방산 에스터, 예컨대 Pluronic®, Poloxamer®, Span®, Tween®, Polysorbate®, Tyloxapol®, Emulphor® 또는 Cremophor®(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜의 지방산 에스터를 포함하는 글리세롤-폴리에틸렌글리콜 리시놀리에이트의 주요 성분을 갖는 Cremophor® EL); 하나 또는 그 이상의 양친매성 제제(예를 들어, 식물성 오일, 예컨대 대두유, 홍화유, 올리브유, 참기름, 보라지유, 피마자유, 및 면실유; 미네랄 오일 및 수산 오일, 이러한 공급원으로부터 수소첨가된 및/또는 분별된 트라이글리세라이드; 중간 크기 사슬 트라이글리세라이드(MCT-오일, 예컨대 Miglyol®), 및 다양한 합성 또는 반합성 모노-, 다이- 또는 트라이글리세라이드, 예컨대 WO 92/05571에 개시된 규정된 비극성 지질, 및 아세틸화된 모노글리세라이드, 또는 지방산의 알킬 에스터, 예컨대 이소프로필 미리스트산, 에틸 올레산(EP 0 353 267 참조) 또는 지방산 알콜, 예컨대 올레일 알콜, 세틸 알콜); 및 본원에 기술된 어떤 염과 같은, 하나 또는 그 이상의 염을 포함한다. 전형적으로, 응집을 감소시키도록 선택된 지질 성분의 농도는 약 1 mol% 내지 15 mol%이다.
지질 벡터
본 발명의 제형 및/또는 방법의 입자는 하나 또는 그 이상의 표 1로부터 선택되는 화합물 및/또는 치료제(예를 들어, RNAi 약제와 같은 음이온성 약제)를 수송할 수 있는 어떤 지질-기초 조성물을 포함할 수 있다. 예시적인 지질-기초 조성물은 하나 또는 그 이상의 지질 분자(예를 들어, 표 1의 화합물, 양이온성 지질, 음이온성 지질 또는 중성 지질) 및/또는 하나 또는 그 이상의 성분(예를 들어, 스테롤 유도체 및/또는 PEG-지질 포합체)을 포함한다.
지질 벡터는 어떤 생체적합성 지질 또는 지질 벡터(예를 들어, 리포솜, 리포플렉스 및 마이셀)를 형성할 수 있는 지질들의 조합을 사용하여 형성될 수 있다. 치료제의 지질 벡터 안으로의 캡슐화는 약제를 손상 또는 분해로부터 보호하거나 또는 약제의 세포 안으로의 유입을 용이하게 할 수 있다. 전하 상호작용의 결과로서의 지질 벡터(예를 들어, 양이온성 지질 벡터 및 음이온성 세포막)는 세포막과 상호작용 및 융합하고, 그로써 약제를 세포질로 방출시킨다. 리포솜은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물, 지질 분자, 및/또는 성분을 포함하는 이중 층의 소포이다. 지질 나노입자는 크기가 약 1 nm 내지 약 1,000 nm의 범위에 있는 리포솜이다. 리포플렉스는 전체적으로 포지티브 전하를 리포솜에 부여하기 위해 양이온성 지질 분자로 형성된 리포솜이다. 마이셀은 지질 분자의 단일 층을 갖는 소포이다.
리포솜
특정 구체예에서, 지질 벡터는 리포솜이다. 전형적으로, 사용된 지질은 이중층을 형성할 수 있고 양이온성이다. 적합한 지질 분자의 부류는 인지질(예를 들어, 포스포타이딜콜린), 지방산, 당지질, 세라마이드, 글리세라이드 및 콜레스테롤, 또는 이것들의 어떤 조합을 포함한다. 대안으로 또는 그 외에, 지질 벡터는 중성 지질(예를 들어, 다이올레오일포스파타이딜 에탄올아민(DOPE))을 포함할 수 있다. 지질 벡터를 형성할 수 있는 다른 지질이 본 분야에 알려져 있고 본원에 기술된다.
본원에 사용되는 것과 같은 "지질 분자"는 소수성 헤드 부분 및 친수성 테일 부분을 갖는 분자이고, 리포솜을 형성할 수 있으며, 표 1의 화합물 또는 본원에 기술된 어떤 양이온성, 중성 또는 음이온성 지질을 포함한다. 지질 분자는 임의로 변형되어 친수성 중합체 기를 포함할 수 있다. 그러한 지질 분자의 예는 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2000-DSPE), 예를 들어, 그것의 암모늄 염 및 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌 글리콜)-2000](PEG2000-DSPE 카복시)을 포함한다.
지질 분자의 예는 천연 지질, 예컨대 카디올리핀(CL), 포스파티드산(PA), 포스파타이딜콜린(PC), 라이소포스파타이딜콜린(LPC), 포스파타이딜에탄올아민(PE), 포스파타이딜글리세롤(PG), 포스파타이딜이노시톨(PI) 및 포스파타이딜세린(PS); 지질 혼합물, 예컨대 레시틴; 스핑고지질, 예컨대 스핑고신, 세라마이드, 스핑고미엘린, 세레브로사이드, 설파타이드, 강글리오사이드 및 파이토스핑고신; 양이온성 지질, 예컨대 1,2-다이올레오일-3-트라이메틸암모늄-프로판(DOTAP), 1,2-다이올레오일-3-다이메틸암모늄-프로판(DODAP), 브롬화 다이메틸다이옥타데실 암모늄(DDAB), 3-β-[N-(N',N'-다이메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-Chol), 브롬화 N-[1-(2,3,-다이테트라데실옥시)프로필]-N,N-다이메틸-N-하이드록시에틸암모늄(DMRIE), 브롬화 N-[1-(2,3,-다이올레일옥시)프로필]-N,N-다이메틸-N-하이드록시 에틸암모늄(DORIE) 및 1,2-다이-O-옥타데세닐-3-트라이메틸암모늄 프로판(DOTMA); 포스파타이딜콜린, 예컨대 1,2-다이라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린, 1,2-다이라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 및 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세롤-3-포스포콜린(POPC); 포스포에탄올아민, 예컨대 2-다이뷰티릴-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DMPE), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPPE), 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE) 및 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(글루타릴); 포스파타이드산, 예컨대 다이세틸 포스페이트(DCP), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스페이트, 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스페이트 및 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스페이트; 포스파타이딜글리세롤, 예컨대 다이팔미토일 포스파타이딜글리세롤(DPPG), 다이올레오일 포스파타이딜글리세롤(DOPG), 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤) 및 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-(1'-rac-글리세롤); 포스파타이딜세린, 예컨대 1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린, 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 및 1,2-다이올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린; 카디올리핀, 예컨대 1',3'-비스[1,2-다이미리스토일-sn-글리세로-3-포스포]-sn-글리세롤; 및 PEG-지질 포합체, 예컨대 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-750], 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000], 1,2-다이팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000], 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] 및 1,2-다이스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카복시(폴리에틸렌 글리콜)-2000]을 포함한다.
표 1의 것과 같은 화합물은 상업적으로 구매가능한 지질 조성물을 포함하는, 어떤 유용한 지질 조성물과 조합될 수 있다. 그러한 조성물의 예는 Invitrogen Corp.로부터의 Lipofectamine™(DOSPA 및 DOPE의 조합) 및 Lipofectin®(DOTMA 및 DOPE의 조합); Promega Corp.로부터의 Transfectam®(DOGS를 포함하는 조성물) 및 Transfast™; Sigma-Aldrich Co.로부터의 NeuroPORTER™ 및 Escort™; Roche로부터의 FuGENE® 6; 및 Strategene으로부터의 LipoTAXI®를 포함한다. 공지된 지질 조성물은 문헌: Boado, Pharm. Res. 24:1772-1787 (2007)에 기술된 것과 같은, Trojan Horse Lipsome 기술을 포함한다.
리포솜은 또한 리포솜의 형성 또는 안정성에 도움을 주는 다른 성분을 포함할 수 있다. 그런 성분의 예는 콜레스테롤, 항산화제(예를 들어, α-토코페롤 또는 β-하이드록시톨루이딘), 계면활성제, 및 염을 포함한다.
리포솜은 예컨대 하나 또는 그 이상의 표 1의 화합물 및 리포솜의 형성 또는 안정성에 도움을 주는 다른 지질 성분을 포함하는, 지질 분자를 포함하는 어떤 유용한 조합일 수 있다. 당업자라면 특정 약제의 캡슐화, 리포솜의 안정성, 규모확대된 반응 조건, 또는 어떤 다른 적절한 인자에 유리한 조합을 최적화하는 방법을 알 것이다. 예시적인 조합은 문헌: Boado, Pharm. Res. 24:1772-1787 (2007)에 기술된다.
리포솜을 제조하는 것은 전형적으로 일반적인 2단계 공정을 통해 일어난다. 제1단계에서, 지질 및 지질 성분은 휘발성 유기 용매 또는 용매들의 혼합물에 혼합되어 균질한 지질의 혼합물이 보장된다. 용매의 예는 클로로폼, 메탄올, 사이클로헥산 및 t-뷰탄올을 포함한다. 그런 다음 용매는 제거되어 건조한 지질 혼합물이 필름, 분말 또는 펠릿으로 형성한다. 용매는 또한 어떤 공지된 분석 기술을 사용함으로써, 예컨대 질소, 회전 증발, 분무 건조, 동결건조 및 진공-건조를 사용함으로써, 어떤 공지된 분석 기술을 사용함으로써 제거될 수 있다.
제2단계에서, 건조한 지질 혼합물은 수성 용액으로 수화되어 리포솜이 형성된다. 약제가 수성 용액에 첨가될 수 있고, 그것은 캡슐화된 약제를 포함한 리포솜의 형성을 유발한다. 또는 달리, 리포솜이 수성 용액으로 먼저 형성된 다음 약제를 함유하는 다른 수성 용액에 노출된다. 약제의 캡슐화는 어떤 공지된 기술, 예컨대 반복적인 동결-해동 주기, 초음파처리 또는 혼합에 의해서 촉진될 수 있다. 이 접근방법의 추가의 예는 문헌: Boado, Pharm. Res. 24:1772-1787 (2007)에 기술된다. 또는 달리, 약제는 소수성 부분(예를 들어, 콜레스테롤)에 결합되어 친유성 유도체가 생성되고, 그 친유성 유도체는 다른 지질 분자와 함께 사용되어 리포솜이 형성된다.
제2단계 동안, 건조한 지질 혼합물은 폴리펩타이드-지질 포합체를 함유하거나 또는 함유하지 않을 수 있다. 공정은 다양한 추가 단계, 이를테면 지질 분자의 상전이 온도 이상으로 수성 용액을 가열한 후 그것을 건조한 지질 혼합물에 첨가하는 단계, 여기서 온도의 특정 범위는 약 40℃ 내지 약 70℃를 포함하고; 건조한 지질 혼합물과 수성 용액의 조합을 인큐베이션하는 단계, 여기서 특정 시간 범위는 약 30분 내지 약 2시간을 포함하고; 인큐베이션하는 동안 건조한 지질 혼합물과 수성 용액을 예컨대 와류 혼합, 진탕, 교반 또는 섞음에 의해 혼합하는 단계; 비전해질을 수성 용액에 첨가하여 생리학적 삼투질농도, 예컨대 0.9% 식염수, 5% 덱스트로스 및 10% 슈크로스 용액을 보장하는 단계; 예컨대 압출 또는 초음파처리에 의해 큰 다중층 소포를 파괴하는 단계; 및 사전-형성된 리포솜을 폴리펩타이드-지질 포합체와 함께 추가 인큐베이션하는 단계, 여기서 건조한 지질 혼합물은 지질 분자를 함유하지 않는, 다양한 추가 단계를 임의로 포함할 수 있다. 당업자는 이 수화 단계 동안 특정 온도 및 인큐베이션 시간을 확인하여 유도체화된 지질 분자의 리포솜 안으로의 통합을 보장하거나 또는 안정한 리포솜을 얻을 수 있을 것이다.
표 1의 것과 같은 지질 화합물을 리포솜을 형성하는 공정의 어떤 지점에서 첨가될 수 있다. 한 예에서, 화합물은 건조한 지질 혼합물이 형성되는 동안 지질 및 지질 성분에 첨가된다. 다른 예에서, 화합물은 지질 및 지질 성분을 함유하는 건조한 지질 혼합물로 사전-형성된 리포솜에 첨가된다. 또 다른 예에서, 마이셀은 화합물로 형성되고, 리포솜은 지질 및 지질 성분을 함유하는 건조한 지질 혼합물로 형성된 다음, 마이셀 및 리포솜이 함께 인큐베이션된다. 수성 용액은 약제 또는 리포솜을 안정화라기 위한 추가 성분, 예컨대 완충액, 염, 킬레이트화제, 식염수, 덱스트로스, 슈크로스, 등을 포함할 수 있다.
이 과정의 한 예에서, 지질 혼합물로 구성된 건조한 필름은 약제를 함유하는 수성 용액으로 수화된다. 이 혼합물은 먼저 50℃로 30분 동안 가열된 다음 실온으로 냉각된다. 그 다음, 혼합물은 폴리펩타이드-지질 포합체를 함유하는 건조한 필름상으로 이동된다. 혼합물은 그 다음 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션되어 폴리펩타이드-지질 포합체가 약제롤 함유하는 리포솜 안에 통합된다. 예를 들어, Zhang et al., J. Control. Release 112:229-239 (2006) 참조.
소포 구조를 갖는 지질 입자
특정 구체예에서, 지질 입자는 양이온성 지질(예를 들어, DODMA, DOTMA, 및/또는 아미노-아민 지질, 아미노-아마이드 지질, 또는 예컨대 표 1과 같은 다른 지질) 및 음이온성 약제(예, RNAi 약제), 또한 중성 또는 양친매성 지질, PEG-지질 포합체, 및 임의로 콜레스테롤을 포함한다.
하나 또는 그 이상의 RNA-결합제 및 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 갖는 지질 입자
지질 입자는 또한 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제와 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질을 갖는 것들을 포함한다. 한 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제는 내부 응집체를 형성하고, 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 외부의 응집체 표면을 형성한다. 특정 구체예에서, 외부의 응집체 표면은 막, 지질 이중층 및/또는 다중 라멜라층이 아니다. 특정 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제(예를 들어, 지질)는 전체 지질의 약 10-90%를 나타낸다. 다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제(예를 들어, 지질)은 전체 지질의 약 50%를 나타낸다. 다른 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제(예를 들어, 지질)는 전체 지질의 약 30%를 나타낸다. 특정 구체예에서, 지질 입자의 하나 또는 그 이상의 RNA-결합제를 갖는 핵산 페이로드의 복합체/응집체는 양이온성 지질(예를 들어, DODMA, DOTMA, 및/또는 예컨대 표 1의 아미노-아민 지질 또는 아미노-아마이드) 및 RNAi 약제를 포함하고, 지질 입자의 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 중성 또는 양친매성 지질, PEG-지질 포합체 및 임의로 콜레스테롤을 포함한다. 다른 구체예에서, 입자의 하나 또는 그 이상의 형질주입 지질은 양이온성 지질(예를 들어, DODMA, DOTMA, 아미노-아민 지질, 및/또는 아미노-아마이드 지질), 중성 지질, PEG-지질 포합체 및 임의로 콜레스테롤을 포함한다.
규모조절 가능한 입자 제조 공정
어떤 구체예에서, 본 발명은 기존에 실행된 공정에 비해 개선된 입자 제조 공정을 제공하고, 이러한 개선된 공정에 의해 예컨대, 지질 입자 및/또는 제형을 만드는 다른 공정에 비해 더 많은 양의 지질 입자를 입자 효능의 유의적인 손실이 거의 없거나 심지어 없이 제조할 수 있게 한다. 이론에 의해 구속되는 것을 바라지는 않으나, 본 발명의 공정은 대안적인 입자/형성 제조를 위한 공정을 이용하여 얻어지는 것보다 균질한 입자 크기 및 구조의 집단을 생성하도록 설계된다. 본 발명의 이러한 속성은 본원에 개시한 공정의 수행 동안 성분들의 첨가 순서에서 유래하는 것으로 여겨진다 - 구체적으로, 음이온성 약제 함유 착체가 수용액에 현탁되고 추가 지질이 에탄올과 같은 용매에 현탁된 경우, 음이온성 약제 착체를 함유하는 수용액에 에탄올 함유 지질 용액의 첨가는 에탄올 함유 지질 용액에 음이온성 약제 착체를 함유하는 수용액을 첨가하는 때보다 음이온성 약제 착체의 더 적은 파괴/해리를 가져온다. 후자의 첨가 순서를 수행하는 경우(에탄올에 수용액), 에탄올 함유 지질 수용액에 첨가되는 최초의 음이온성 약제 착체는 상승된 농도의 에탄올에 노출되고, 이는 에탄올 용액에의 수용액의 추가 첨가에 따라 시간이 경과하며 하락하여 결국 혼합 용액의 최종 에탄올 농도를 달성하게 된다. 이 최초의 음이온성 약제 착체의 일시적으로 고농도의 에탄올에의 노출이 이 착체에 파괴적이어서, 감소된 활성 및/또는 효력(potency)을 또한 보유하는 최종 입자 집단 내 입자 구조 및 크기의 더 큰 불균질성을 가져오는 것으로 생각된다. 대조적으로, 본 발명의 어떤 양태는 수용액에 현탁된 음이온성 약제 착체에 추가 지질을 함유하는 에탄올 용액이 첨가되도록 하는 첨가 순서일 때 음이온성 약제 착체가 처음에는 낮다가 점차 증가하는 농도의 에탄올에 노출되도록 하고, 이는 다시 감소된 입자 파괴 및/또는 해리 및 개선된 입자 집단 균질성, 효능 및/또는 효력을 가져오는 것에서의 개선된 입자 집단 구조 및 크기 균질성, 효능 및/또는 효력의 놀라운 확인에 관계된다.
예컨대 용매(예, 에탄올) 현탁 지질에 수성 착체의 첨가를 포함하는 방법들 및 본 발명의 개선된 방법들간 차이점은 작은 생산 규모에서는(예, 1mL의 물 부피에서 입자 내 1mg의 음이온성 약제의 제조) 소폭 그리고/또는 검출하기 어려울 수 있지만, 이러한 발명성 있는 차이점은 제조 규모가 증가하면 훨씬 더 뚜렷하고 명백해진다. 본 발명의 공정을 위한 예시적 입자 제조 규모는 소규모 제조(예, 입자 내 1mg의 음이온성 약제)뿐 아니라, 입자 내 10mg 이상의 음이온성 약제, 입자 내 50mg 이상의 음이온성 약제, 입자 내 100mg 이상의 음이온성 약제, 입자 내 250mg 이상의 음이온성 약제, 입자 내 500mg 이상의 음이온성 약제, 입자 내 1g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 2g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 3g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 4g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 5g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 7.5g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 10g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 20g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 40g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 50g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 100g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 200g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 300g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 400g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 500g 이상의 음이온성 약제, 입자 내 1kg 이상의 음이온성 약제, 입자 내 2kg 이상의 음이온성 약제, 입자 내 3kg 이상의 음이온성 약제, 입자 내 4kg 이상의 음이온성 약제, 입자 내 5kg 이상의 음이온성 약제 및 입자 내 10kg 이상의 음이온성 약제도 포함한다.
어떤 구체예에서, 본 발명의 개선된 공정의 입자는 용매(예, 에탄올) 용액에 수용액의 첨가를 포함하는 방법으로 제조한 대응 입자 집단보다 10% 이상 큰 총 효능(efficacy) 및/또는 효력(potency)(입자량 및/또는 부피 등 당)을 보유한다. 선택적으로, 본 발명의 개선된 공정의 입자는 용매(예, 에탄올) 용액에 수용액의 첨가를 포함하는 방법으로 제조한 대응 입자 집단보다 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 500% 이상, 또는 1000% 이상 큰 총 효능 및/또는 효력(입자량 및/또는 부피 등 당)을 보유한다. 관련 구체예에서, 본 발명의 개선된 공정의 입자는 음이온성 약제(예, RNAi 약제) 표적 유전자 발현을 용매(예, 에탄올) 용액에 수용액의 첨가를 포함하는 방법으로 제조한 대응 입자 집단보다 10% 이상 낮은 절대 수준으로 감소시킨다. 선택적으로, 본 발명의 개선된 공정의 입자는 음이온성 약제(예, RNAi 약제) 표적 유전자 발현을 용매(예, 에탄올) 용액에 수용액의 첨가를 포함하는 방법으로 제조한 대응 입자 집단보다 20% 이상 낮은 절대 수준, 30% 이상 낮은 절대 수준, 40% 이상 낮은 절대 수준, 50% 이상 낮은 절대 수준, 60% 이상 낮은 절대 수준, 70% 이상 낮은 절대 수준, 80% 이상 낮은 절대 수준, 90% 이상 낮은 절대 수준, 95% 이상 낮은 절대 수준, 또는 100% 낮은 절대 수준으로 감소시킨다. 이러한 차이점 또는 개선은 약 10mg 이상, 20mg 이상, 50mg 이상, 100mg 이상, 250mg 이상, 500mg 이상, 1g 이상, 2g 이상, 3g 이상, 4g 이상, 5g 이상, 7.5g 이상, 10g 이상, 20g 이상, 40g 이상, 50g 이상, 100g 이상, 200g 이상 또는 음이온성 약제, 300g 이상, 400g 이상, 500g 이상, 1kg 이상, 2kg 이상, 3kg 이상, 4kg 이상, 5kg 이상, 또는 10kg 이상의 수준과 같은 높은 수준의 입자 제조에서 흔히 가장 잘 관찰된다.
본 발명의 공정의 지질 입자는 약 30nm 내지 약 150nm, 약 40nm 내지 약 150nm, 약 50nm 내지 약 150nm, 약 60nm 내지 약 130nm, 약 70nm 내지 약 110nm, 약 70nm 내지 약 100nm, 약 80nm 내지 약 100nm, 약 90nm 내지 약 100nm, 약 70nm 내지 약 90nm, 약 80nm 내지 약 90nm, 약 70nm 내지 약 80nm, 또는 약 30nm, 35nm, 40nm, 45nm, 50nm, 55nm, 60nm, 65nm, 70nm, 75nm, 80nm, 85nm, 90nm, 95nm, 100nm, 105nm, 110nm, 115nm, 120nm, 125nm, 130nm, 135nm, 140nm, 145nm, 또는 150nm의 평균(mean) 직경을 통상적으로 가지며, 실질적으로 무독성이다. 또한, 핵산은 본 발명의 공정의 지질 입자에 존재시 뉴클레아제에 의한 열화에 수용액 내에서 내성이다. 핵산-지질 입자 및 특정 제조방법은 예컨대 미국특허공개 20040142025 및 20070042031에 개시되어 있고, 이의 개시내용은 모든 목적에서 그 전체가 참조에 의해 본원에 편입된다.
RNAi 약제
RNA 간섭(RNAi)은 특정 RNA 분자의 분해를 유발하거나 또는 특정 유전자의 전사를 방해함으로써 유전자 발현을 억제하는 메커니즘이다. 본질적으로, RNAi 표적은 자주 바이러스 및 트랜스포존(고유한 면역 반응의 형태)으로부터의 RNA 분자이지만, 이것은 발생 및 게놈 보존을 조절하는데 또한 역할을 한다. RNAi의 메커니즘에 대한 단서는 작은 간섭 RNA 가닥(siRNA)인데, 이것은 표적화된 메신저 RNA(mRNA) 분자에 대해 충분히 상보하는 뉴클레오타이드 서열을 가진다. siRNA는 RNAi 경로 내의 단백질을 표적화된 mRNA로 향하게 하고 그것들을 분해시키며, 그것들을 더 이상 단백질로 번역될 수 없는 더 작은 부분으로 파괴한다.
RNAi 경로는 긴 이중-가닥 RNA(dsRNA) 분자를, 전형적으로 길이가 약 21 내지 약 23개의 뉴클레오타이드이고 약 19개의 염기쌍 듀플렉스를 함유하는 siRNA 분자로 절단하는 효소 다이서(Dicer)에 의해 개시된다. 가이드 가닥으로서 공지된, 각 단편의 2개의 가닥 중 하나가 다음 단계로 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)에 통합되고, 상보하는 서열과 쌍을 이룬다. RISC는 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보하는 서열을 갖는 단일-가닥 RNA의 절단을 중재한다. 표적 RNA의 절단은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보하는 영역의 중간에서 일어난다. 이런 인식 사건의 결과는 전사-후 유전자 침묵이다. 이것은 가이드 가닥이 mRNA 분자와 특이적으로 쌍을 이룰 때 일어나고 RISC 복합체의 촉매 성분인 아고너트(Argonaute)에 의한 분해를 유도한다.
본 발명의 방법의 입자는 RNAi 약제와 같은 하나 또는 그 이상의 음이온성 약제를 세포에 시험관 내에서 또는 생체 내에서 (예를 들어, 개체의) 전달하기 위해 사용될 수 있다. RNAi 약제는 RNA:RNA 또는 RNA:DNA 가닥을 포함하는 상이한 타입의 이중-가닥 분자를 포함할 수 있다. 이들 약제는 듀플렉스(예를 들어, 3'-말단 상에 오버행(overhang)이 있거나 없는), 헤어핀 루프 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 단독으로 또는 다른 폴리뉴클레오타이드와 조합하여 형성할 수 있는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 발현 벡터를 포함하여, 다양한 구조로 세포에 도입될 수 있다. 예시적인 RNAi 약제는 본원에 기술된 siRNA, shRNA, DsiRNA 및 miRNA 약제를 포함한다. 일반적으로, 이들 약제는 길이가 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오타이드이고, 특정 RNAi 약제에 대한 바람직한 길이가 아래에서 기술된다.
RNAi 약제에 의한 기능적인 유전자 침묵은 표적화된 유전자 생성물의 완전한 억제를 반드시 포함하지는 않는다. 일부 경우에서, RNAi 약제에 의해 유발된 유전자 생성물 발현에서의 미미한 감소는 숙주 세포, 조직, 기관, 또는 동물에서 상당한 기능적인 또는 표현형 변화로 번역될 수 있다. 그러므로, 유전자 침묵은 기능적인 동등물인 것으로 이해되고, 침묵을 달성하기 위한 유전자 생성물 분해의 정도는 유전자 표적들 또는 숙주 세포 유형 사이에서 상이할 수 있다.
siRNA
작은 간섭 RNA(siRNA)는 일반적으로 3'-말단 상에서 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드 오버행을 가지거나 또는 어떤 오버행 없이 길이가 16 내지 30개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 18 내지 25개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 21개의 뉴클레오타이드)의 이중-가닥 RNA 분자이다. 숙련된 의사는 이 서열 길이를 다양하게 할 수 있다(예를 들어, 유전자 침묵의 전체 수준을 증가시키거나 또는 감소시키기 위해). 특정 구체예에서, 오버행은 3'-말단에서 UU 또는 dTdT이다. 일반적으로, siRNA 분자는 표적 DNA 분자의 한 가닥에 완전히 상보적인데, 왜냐하면 단일 염기쌍 미스매치조차도 침묵을 감소시키는 것으로 나타났기 때문이다. 다른 구체예에서, siRNA는 변형된 골격 조성물, 예컨대 2'-데옥시- 또는 2'-O-메틸 변형, 또는 본원에 기술된 어떤 변형을 가질 수 있다.
siRNA는 유전자 발현을 서열-특이적 방식으로 억제하거나 또는 하향-조절할 수 있는 핵산 분자를 말한다; 예를 들어서, Zamore et al., Cell 101:25 33 (2000); Bass, Nature 411:428-429 (2001); Elbashir et al., Nature 411:494-498 (2001); 및 PCT 공개 WO 00/44895호, WO 01/36646호, WO 99/32619호, WO 00/01846호, WO 01/29058호, WO 99/07409호 및 WO 00/44914호 참조. 유전자 침묵에 사용하기 위한 siRNA 분자의 제조 방법은 미국 특허 제7,078,196호에 기술되고, 이것은 참고자료로 본원에 포함된다.
shRNA
짧은 헤어핀 RNA(shRNA)는 헤어핀 루프 구조가 존재하는 단일-가닥 RNA 분자로, 같은 가닥 내에 상보하는 뉴클레오타이드를 허용하여 분자내 결합이 형성되게 한다. shRNA는 siRNA와 비교하여 뉴클레아제 분해에 대해 감소된 민감성을 나타낼 수 있다. 특정 구체예에서, shRNA는 길이가 19 내지 29개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 19 내지 21개의 뉴클레오타이드 또는 25 내지 29개의 뉴클레오타이드)의 줄기 길이를 가진다. 일부 구체예에서, 루프 크기는 길이가 4 내지 23개의 뉴클레오타이드이다. shRNA는 일반적으로 효능의 감소 없이, 하나 또는 그 이상의 미스매치, 예를 들어, shRNA 줄기의 2개의 가닥 사이의 G-U 미스매치를 함유할 수 있다.
DsiRNA
다이서-기질 RNA(DsiRNA)는 25 내지 35 뉴클레오타이드의 이중-가닥 RNA 약제이다. 이러한 길이의 약제는 RNA 간섭(RNAi) 경로의 다이서 효소에 의해 가공처리되는 것으로 여겨지는 반면, 25개의 뉴클레오타이드보다 짧은 약제는 일반적으로 다이서 생성물을 모방하고 다이서 가공처리를 모면한다. 일부 구체예에서, DsiRNA는 1 내지 4개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 1 또는 2개의 뉴클레오타이드)의 안티센스 또는 센스 가닥의 3'-말단에서 단일-가닥 뉴클레오타이드 오버행을 가진다.
DsiRNA 약제의 변형된 특정 구조는 참고자료로 본원에 포함된, 미국 특허 공개공보 제2007/0265220호에서와 같이, 문헌에 이미 기술되어 있다. 본 발명의 제형에 사용하기에 적합한 추가의 DsiRNA 구조 및 특이한 조성물은 미국 특허 출원 제12/586,283호; 미국 특허 공개공보 제2005/0244858호, 제2005/0277610호, 제2007/0265220호, 제2011/0021604호, 제2010/0173974호, 제2010/0184841호, 제2010/0249214호, 제2010/0331389호, 제2011/0003881호, 제2011/0059187호, 제2011/0111056호; 및 PCT 공개공보 WO 2010/080129호, WO 2010/093788호, WO 2010/115202호, WO 2010/115206호, WO 2010/141718호, WO 2010/141724호, WO 2010/141933호, WO 2011/072292호, WO 2011/075188호에 기술되고, 이것들은 참고자료로 본원에 포함된다. 일반적으로, DsiRNA 구성물은 19 내지 23량체 siRNA에 대해 기술된 것과 같은 고체상 올리고뉴클레오타이드 합성 방법을 사용하여 합성된다(미국 특허 제5,804,683호; 제5,831,071호; 제5,998,203호; 제6,117,657호; 제6,353,098호; 제6,362,323호; 제6,437,117호; 제6,469,158호; 제6,111,086호; 제6,008,400호; 및 제6,111,086호 참조).
miRNA
마이크로RNA(miRNA)는 길이가 17 내지 25개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 21 내지 23개의 뉴클레오타이드)인 단일-가닥 RNA 분자이다. 숙련된 의사는 유전자 침묵의 전체 수준을 증가시키거나 또는 감소시키기 위해 이 서열 길이를 다양하게 할 수 있다. 이들 약제는 표적 메신저 RNA 상에서 상보하는 서열을 결합시킴으로써 표적 유전자를 침묵시킨다. 본원에 사용된 것과 같이 용어 "miRNA 전구체"는, 제한 없이, 일차 RNA 전사물, pri-miRNA 및 pre-miRNA를 포함하는 것으로 사용된다. 본 발명의 "miRNA 페이로드"는 pri-miRNA, pre-miRNA, 및/또는 miRNA(또는 성숙한 miRNA)를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 siRNA(예를 들어, DsiRNA)는 miRNA 서열을 통합하는 가이드 가닥을 제공할 수 있거나, 또는 miRNA 서열에 대해 충분히 상동성이어서 상기 miRNA로서 기능할 수 있다(이러한 siRNA "miRNA 모방체" 제공함).
안티센스 화합물
예시적인 안티센스 화합물은 연속하는 뉴클레오사이드 길이 범위를 포함하고, 여기서 범위의 상부 단부는 50개의 뉴클레오사이드이고 범위의 하부 단부는 8개의 뉴클레오사이드이다. 특정 구체예에서, 범위의 상부 단부는 35개의 뉴클레오사이드이고 범위의 하부 단부는 14개의 뉴클레오사이드이다. 추가의 구체예에서, 범위의 상부 단부는 24개의 뉴클레오사이드이고 범위의 하부 단부는 17개의 뉴클레오사이드이다. 여전히 추가의 구체예에서, 안티센스 화합물은 20개의 연속하는 뉴클레오사이드이다. 당업자들은 본원에 개시된 바와 같이, 범위의 상부 단부가 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개의 연속하는 뉴클레오사이드를 포함하고 범위의 하부 단부가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 연속하는 뉴클레오사이드를 포함하는 것을 쉽게 인식할 것이다.
예시적인 안티센스 화합물은 표적 서열에 충분히 상보하는 적어도 8, 임의로 적어도 12, 임의로 적어도 15개의 연속하는 뉴클레오사이드의 신장부를 포함하여 전사, 번역을 간섭하고, 분해(임의로 뉴클레아제-중재된 분해)를 촉진하고 및/또는 달리 표적 서열의 기능을 파괴한다(예를 들어, 그렇지 않으면 기능적인 표적 서열의 기능, 예컨대 안티센스 화합물-중재된 메커니즘을 통해 프로모터, 인핸서 또는 다른 기능적인 핵산 표적 서열의 파괴를 간섭한다).
변형은 안티센스 화합물에 이루어질 수 있고 말단, 선택된 핵염기 위치, 당 위치 중 하나에 또는 뉴클레오사이드 내 연결 중 하나에 부착된 포합체기를 포함할 수 있다. 가능한 변형은, 2'-플루오린(2'-F), 2'-O메틸(2'-OMe), 2'-O-(2'-메톡시에틸)(2'-MOE) 고친화성 당 변형, 역 무염기 캡, 데옥시핵염기 및 바이사이클릭 핵염기 유사체, 예컨대 닫힌 핵산(LNA) 및 에틸렌-가교된 핵산(ENA)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
RNAi 약제의 제조 방법
RNAi 약제는 표적 핵산(예를 들어, 표적 유전자)에 대해 지시된 적어도 하나의 안티센스 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 안티센스 뉴클레오타이드는 선택된 표적 서열에 상보하는 DNA 또는 RNA의 단일 가닥이다. 안티센스 RNA의 경우에, 그것들은 그것에 결합함으로써 상보하는 RNA 가닥의 번역을 방지한다. 안티센스 DNA는 특이한 상보하는 (코딩 또는 비-코딩) RNA를 표적화하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 안티센스 뉴클레오타이드는 약 10 내지 약 40개의 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 30개의 뉴클레오타이드를 함유한다. 안티센스 뉴클레오타이드는 원하는 표적 유전자에 80%, 85%, 90%, 95%, 99%까지 또는 심지어 100% 상보할 수 있다.
안티센스 및 센스 뉴클레오타이드, 및 해당 듀플렉스 또는 헤어핀 루프를 제조하는 방법은 본 분야에 알려져 있고, 어떤 표적 핵산 서열을 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 제조하기 위해 쉽게 적용될 수 있다. 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 예컨대 표적 서열을 분석하고 이차 구조, Tm, 결합 에너지 및 상대적인 안정성을 측정함으로써, 표적 특이성을 최적화 하기 위해; 및/또는 이차 구조, 예컨대 이량체, 헤어핀 또는 숙주 세포에서 표적 mRNA에 대한 특잉한 결합을 감소시키거나 또는 금지시키는 다른 이차 구조의 형성을 감소시키기 위해 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, mRNA의 매우 바람직한 표적 영역은 AUG 번역 개시 코돈에서 또는 가까이에 있는 그런 영역들 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보하는 그런 서열들을 포함한다. 이들 이차 구조 분석 및 표적 부위 선택 고려사항은, 예를 들어서, v.4의 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어(Molecular Biology Insights) 및/또는 BLASTN 2.0.5 알고리즘 소프트웨어(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997)를 사용하여 수행될 수 있다. RNAi 약제를 제조하기 위한 비-제한 방법은 미국 특허 제5,804,683호; 제5,831,071호; 제5,998,203호; 제6,117,657호; 제6,353,098호; 제6,362,323호; 제6,437,117호; 제6,469,158호; 제6,111,086호; 제6,008,400호; 및 제6,111,086호에 기술되고, 이것들은 참고자료로 본원에 포함된다.
RNAi 약제는 예컨대 단일-가닥, 이중-가닥, 선형, 원형(예를 들어, 플라스미드), 구멍 뚫린 (nicked) 원형, 코일형, 슈퍼코일형, 연쇄체화된, 또는 하전된 것과 같이, 어떤 유용한 형태를 가질 수 있다. 추가로, 뉴클레오타이드는 5' 및 3' 센스 및 안티센스 가닥 말단 변형을 함유할 수 있고 블런트 또는 오버행 말단 뉴클레오타이드(예를 들어, 3'-말단에서의 UU 또는 TT), 또는 이것들의 조합을 가질 수 있다.
변형된 핵산, 이를테면 변형된 DNA 또는 RNA 분자는 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, RNAi 약제)에서 자연 발생 핵산 대신 사용될 수 있다. 변형된 핵산은 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드의 반감기, 안정성, 특이성, 전달, 용해도 및 뉴클레아제 내성을 개선시킬 수 있다. 예를 들어서, siRNA 약제는 상기 기술된 유익한 특성을 부여하는 뉴클레오타이드 유사체로 부분적으로 또는 전체적으로 구성될 수 있다. 문헌: Elmn et al.(Nucleic Acids Res. 33:439-447 (2005))에 기술된 바와 같이, 합성된 RNA-유사 뉴클레오타이드 유사체(예를 들어, 닫힌 핵산(LNA))는 표적 유전자 생성물에 대해 침묵 활성을 나타내는 siRNA 분자를 구성하기 위해 사용될 수 있다.
포스포다이에스터 결합의 비-가교 산소가 황에 의해 교체된, 포스포로싸이오에이트(PS) 골격 변형은, 뉴클레아제 분해에 대해 핵산 약물을 안정화시키기 위해 배치된 가장 최근의, 그리고 가장 통상적인 수단 중 하나이다. 일반적으로, PS 변형은 활성에 대해 큰 영향을 미치지 않으면서 두 개의 siRNA 가닥 모두에 대해 광범위하게 이루어질 수 있는 것으로 나타난다(Kurreck, Eur. J. Biochem. 270:1628-44 (2003)). 특정 구체예에서, PS 변형은 보통 3' 및 5' 단부에서 1개 또는 2개의 염기로 제한된다. 보라노포스페이트 링커는 낮은 독성을 가지면서 siRNA 활성을 향상시키기 위해 사용될 수 있다(Hall et al., Nucleic Acid Res. 32:5991-6000 (2004)). 올리고뉴클레오타이드 골격에 대한 다른 예시적인 변형은 메틸포스포네이트, 포스포로다이싸이오에이트, 포스포트라이에스터, 아미노알킬포스포트라이에스터, 알킬 포스포네이트(예를 들어, 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트(예를 들어, 3'-아미노 포스포라미데이트), 아미노알킬포스포라미데이트, 싸이오노포스포라미데이트, 싸이오노알킬포스포네이트, 싸이오노알킬포스포트라이에스터, 및 펩티드 결합에 의해 연결된 반복되는 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위를 갖는 단백질 뉴클레오타이드(PNA) 골격을 포함하고, 여기서 대표적인 PNA 화합물은 미국 특허 제5,539,082호, 제5,714,331호, 및 제5,719,262호, 및 Nielsen et al., Science 254:1497-1500 (1991)에 개시된 것들을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
골격에 대한 다른 변형은 인 원자를 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 내 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오사이드 내 연결, 또는 하나 또는 그 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로사이클릭 뉴클레오사이드 내 연결(예를 들어, 모폴리노 연결; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 폼아세틸 및 싸이오폼아세틸 골격; 메틸렌 폼아세틸 및 싸이오폼아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아마이드 골격; 아마이드 골격; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것들)로 교체하는 것들을 포함한다.
특정 변형된 핵염기, 예컨대 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린(예를 들어, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로핀일우라실, 5-프로핀일사이토신, 및 5-메틸사이토신)은 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화도를 증가시키는데 특히 유용하다. 예시적인 변형된 핵염기는 5-메틸사이토신 (5-me-C 또는 m5c); 5-하이드록시메틸 사이토신, 크산틴, 및 하이포크산틴; 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체; 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체; 2-싸이오유라실; 2-싸이오싸이민; 2-싸이오시토신; 5-할로우라실 및 사이토신; 5-프로핀일 우라실 및 사이토신; 6-아조 우라실, 사이토신, 및 싸이민; 5-우라실(슈도우라실); 4-싸이오우라실; 8-할로, 8-아미노, 8-싸이올, 8-싸이오알킬, 8-하이드록시, 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌; 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트라이플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 사이토신; 7-메틸구아닌; 7-메틸아데닌; 8-아자구아닌; 8- 아자아데닌; 7-데아자구아닌; 7-데아자아데닌; 3-데아자구아닌; 및 3- 데아자아데닌을 포함한다. 이들 변형된 핵염기는, 특정 구체예에서 다른 변형, 예컨대 본원에 기술된 어떤 당 변형과 조합될 수 있다.
변형된 올리고뉴클레오타이드는 또한 하나 또는 그 이상의 치환된 당 부분을 함유할 수 있는데, 여기서 변형은 리보스 고리의 어떤 반응성 부위(예를 들어, 리보스 고리의 2'-OH), 또는 하나 또는 그 이상의 보편적 염기에서 이루어질 수 있다. 예시적인 변형은 F, Br 또는 Cl과 같은 2'-할로; 2'-O-알킬, 2'- S-알킬, 또는 2'-N-알킬, 예컨대 2'-OMe; 2'-O-(알킬-O)n-알킬, 예컨대 2'-O-메톡시에틸(2'-O-MOE), 2'-O[(CH2)nO]mCH3, 2'-O(CH2)nOCH3, 2'-O(CH2)2ON(CH3)2O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, 2'-O(CH2)nONH2 및 2'-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10이고; 2'-O-알켄일, 2'-S-알켄일, 또는 2'-N-알켄일; 2'-O-알킨일, 2'-S-알킨일, 또는 2'-N-알킨일을 포함하며, 여기서 알킬, 알켄일 및 알킨일은 치환된 또는 비치환된 C1-10 알킬 또는 C2-10 알켄일 및 알킨일, 그뿐만 아니라 리보스의 2'와 4' 위치 사이의 가교 변형으로 닫힌 핵산(LNA)이 형성될 수 있다. 예시적인 보편적 염기는 1-β-D-리보퓨라노실-5-나이트로인돌 및 1-β-D-리보퓨라노실-3-나이트로피롤과 같이, 변형된 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 당 부분의 1' 위치에, 또는 뉴클레오타이드 당 부분 치환에서 동등한 위치에 위치된 헤테로사이클릭 부분을 포함한다.
특정 구체예에서, 변형의 기술된 형태 및/또는 변형 패턴을 포함하는 핵산이 사용될 수 있다. 핵산의 예시적인 변형 및 변형 패턴에 관련된 추가의 상세한 내용은, 예를 들어 적어도 하기 참고문헌에서 찾아볼 수 있다: US 2010/0240734; WO 2010/080129; WO 2010/033225; US 2011/0021604; WO 2011/075188; WO2011/072292; WO 2010/141724; WO 2010/141726; WO 2010/141933; WO 2010/115202;WO 2008/136902; WO/2011/109294; WO/2011/075188; PCT/US11/42810; PCT/US11/42820; 미국 출원 제61/435,304호; 미국 출원 제61/478,093호; 미국 출원 제61/497,387호; 미국 출원 제61/529,422호; 미국 특허 제7,893,245호; WO 2007/051303; 및 US 2010/0184209. 각 선행 문헌은 그것의 전체가 참고자료로 본원에 포함된다.
RNAi 유전자 표적
어떤 구체예에서, 본 발명은 RNAi 약제와 조합되어, 입자 또는 제형을 사용한 치료에 의해 질환에 걸린 조직 또는 기관에서 표적 유전자의 침묵을 특징으로 한다. 본 발명의 치료 능력은 질환 상태(예를 들어, 암)의 확립 또는 보존에 포함되는 것으로 공지되었거나 또는 여겨지는 특이하고 표적화된 유전자의 mRNA 분자가 RNAi 약제에 의해 분해될 때 실현된다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 RNAi 표적의 예는 발달상의 단백질, 예컨대 부착 분자, 사이클린 키나제 억제제, Wnt 계열 구성원, Pax 계열 구성원, Winged 나선 계열 구성원, Hox 계열 구성원, 사이토카인/림포카인 및 그것의 수용체, 성장/분화 인자 및 그것의 수용체, 신경전달물질 및 그것의 수용체; 발암유전자-코드화된 단백질(예를 들어, ABL1(UniProt Entry No. P00519, NCBI Gene ID: 25), AR(UniProt Entry No. P10275, NCBI Gene ID: 3647), β-카테닌(CTNNB1, UniProt Entry No. P35222, NCBI Gene ID: 1499), BCL1(UniProt Entry No. P24385, NCBI Gene ID: 595), BCL2(UniProt Entry No. P10415, NCBI Gene ID: 596), BCL6(UniProt Entry No. P41182), CBFA2(UniProt Entry No. Q01196, NCBI Gene ID: 861), CBL(UniProt Entry No. P22681, NCBI Gene ID: 687), CSF1R(UniProt Entry No. P07333, NCBI Gene ID: 1436), ERBA1(UniProt Entry No. P10827, NCBI Gene ID: 7067), ERBA2(UniProt Entry No. P10828, NCBI Gene ID: 7068), ERBB(UniProt Entry No. P00533, NCBI Gene ID: 1956), ERBB2(UniProt Entry No. P04626, NCBI Gene ID: 2064), ERBB3(UniProt Entry No. P21860, NCBI Gene ID: 190151), ERBB4(UniProt Entry No. Q15303, NCBI Gene ID: 600543), ETS1(UniProt Entry No. P14921, NCBI Gene ID: 2113), ETS2(UniProt Entry No. P15036, NCBI Gene ID: 2114), ETV6(UniProt Entry No. 41212, NCBI Gene ID: 2120), FGR(UniProt Entry No. P09769, NCBI Gene ID: 2268), FOS(UniProt Entry No. P0110, NCBI Gene ID: 2353), FYN(UniProt Entry No. P06241, NCBI Gene ID: 2534), HCR(UniProt Entry No. Q8TD31, NCBI Gene ID: 54535), HRAS(UniProt Entry No. P01112, NCBI Gene ID: 3265), JUN(UniProt Entry No. P05412, NCBI Gene ID: 3725), KRAS(UniProt Entry No. P01116, NCBI Gene ID: 3845), LCK(UniProt Entry No. P06239 NCBI Gene ID: 3932), LYN(UniProt Entry No. P07948, NCBI Gene ID: 4067), MDM2(UniProt Entry No. Q00987, NCBI Gene ID: 4193), MLL1(UniProt Entry No. Q03164, NCBI Gene ID: 4297), MLL2(UniProt Entry No. O14686, NCBI Gene ID: 8085), MLL3(UniProt Entry No. Q8NEZ4, NCBI Gene ID: 58508), MYB(UniProt Entry No. P10242, NCBI Gene ID: 4602), MYC(UniProt Entry No. P01106, NCBI Gene ID: 4609), MYCL1(UniProt Entry No. P12524, NCBI Gene ID: 4610), MYCN(UniProt Entry No. P04198, NCBI Gene ID: 4613), NRAS(UniProt Entry No. P01111, NCBI Gene ID: 4893), PIM1(UniProt Entry No. P11309, NCBI Gene ID: 5292), PML(UniProt Entry No. P29890, NCBI Gene ID: 5371), RET(UniProt Entry No. P07949, NCBI Gene ID: 5979), SRC(UniProt Entry No. P12931, NCBI Gene ID: 6714), TAL1(UniProt Entry No. P17542, NCBI Gene ID: 6886), TAL2(UniProt Entry No. Q16559, NCBI Gene ID: 6887), TCL3(UniProt Entry No. P31314, NCBI Gene ID: 3195), TCL5(UniProt Entry No. P17542, NCBI Gene ID: 6886), 및 YES(UniProt Entry No. P07947, NCBI Gene ID: 7525)); 종양 억제제 단백질(예를 들어, BRCA1(UniProt Entry No. P38398, NCBI Gene ID: 672), BRCA2(UniProt Entry No. P51587, NCBI Gene ID: 675), MADH4(UniProt Entry No. Q13485, NCBI Gene ID: 4089), MCC(UniProt Entry No. P23508, NCBI Gene ID: 4163), NF1(UniProt Entry No. P21359, NCBI Gene ID: 4763), NF2(UniProt Entry No. P35240, NCBI Gene ID: 4771), RB1(UniProt Entry No. P06400, NCBI Gene ID: 5925), TP53(UniProt Entry No. P04637, NCBI Gene ID: 7157), PLK1(UniProt Entry No. P53350, NCBI Gene ID: 9606), KIF1-결합 단백질(UniProt Entry No. Q96EK5, NCBI Gene ID: 9606) 및 WT1(UniProt Entry No. P19544, NCBI Gene ID: 4790)); 리포단백질(예를 들어, 아포리포단백질 B(ApoB100, UniProt Entry No. P04114, NCBI Gene ID: 338)); 효소(예를 들어, ACC 합성효소 및 산화효소, ACP 불포화효소 및 수산화효소, ADP-글루코스 파이로포릴라제, ATPase, 알콜 탈수소효소, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카탈라제, 셀룰라제, 칼콘 합성효소, 키티나제, 사이클로옥시게나제, 탈카복실화효소, 덱스트리나제, DNA 및 RNA 중합효소, 갈락토시다제, 글루카나제, 글루코스 산화효소, 과립-결합된 전분 합성효소, GTPase, 헬리카제, 허니셀룰라제, 인티그라제, 이눌리나제, 전환효소, 아이소머라제, 키나제(예를 들어, PLK1(UniProt Entry No. P53350, NCBI Gene ID: 9606)), 락타제, 라이가제(예를 들어, COP1로서도 알려져 있는 고리핑거- 및 WD 반복-함유 단백질 2(RFWD2)), 리파제, 리폭시게나제, 라이소자임, 노팔린 합성효소, 옥토핀 합성효소, 펙틴에스터제, 과산화효소, 포스파타제, 포스포리파제, 포스포릴라제, 파이타제, 식물 성장 조절제 합성효소, 폴리갈락투로나제, 단백질분해효소 및 펩티다제, 풀라나제, 재조합효소, 역전사효소, 리뷸로스-1,5-비스포스페이트 카복실라제 옥시게나제(RuBisCos), 토포아이소머라제, 전달 효소, 예컨대 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실전달효소 1(HPRT1) 및 자일라나제)를 포함한다.
간은 대사(예를 들어, 다양한 과콜레스테롤혈증의 리포단백질 대사) 및 순환 단백질(예를 들어, 혈우병의 응고 인자)의 분비에서 그것의 중심 역할을 부여한 핵산 치료를 위한 가장 중요한 표적 조직 중 하나이다. 또한, 만성 간염 및 간경변과 같은 후천적 장애는 통상적이고 폴리뉴클레오타이드-기초 간 치료에 의해 또한 잠재적으로 치료된다. 간에 의해 영향을 주거나 받는 수많은 질환 또는 상태는 간에서 유전자 발현의 녹다운(억제)을 통해 잠재적으로 치료된다. 예시적인 간 질환 및 상태는 다음을 포함한 목록으로부터 선택될 수 있다: 간암(간세포암종, HCC 포함), 바이러스 감염(간염 포함), 대사 장애(고지혈증 및 당뇨병 포함), 섬유증, 및 급성 간손상. 간 치료(예를 들어, 특히 HCC에 표적화된 치료 포함)를 위한 -및 임의로 다른 암을 포함하는 다른 표적, 질환 및/또는 장애를 해결하는 치료를 위한- 예시적인 분자 표적은, 다른 것들 중에서도 CSN5(UniProt Entry No. Q92905, NCBI Gene ID: 10987), CDK6(UniProt Entry No. Q00534, NCBI Gene ID: 1021), ITGB1(UniProt Entry No. P05556, NCBI Gene ID: 3688), MYC(UniProt Entry No. P01106, NCBI Gene ID: 4609), TGFβ1(UniProt Entry No. P01137, NCBI Gene ID: 7040), 사이클린 D1(UniProt Entry No. Q9H014, NCBI Gene ID: 595), 헵사이딘(UniProt Entry No. P81172, NCBI Gene ID: 57817), PCSK9(UniProt Entry No. Q8NBP7, NCBI Gene ID: 255738) 및 트랜스싸이레틴(TTR, UniProt Entry No. P02766, NCBI Gene ID: 7276)을 포함한다.
본 발명의 방법의 입자 및/또는 제형은 임의로 정상적인 조직(예를 들어, 정상적인 간 조직)에, 및 다양한 모델(예를 들어, 동소이식 간 모델, 피하 간 모델 등)에 대해 표적화될 수 있다.
본 발명의 공정의 입자에 대한 한 가지 예시적인 표적은 아포리포단백질 B(ApoB)이고, 이것은 다양한 부류의 리포단백질: 카일로미크론, 초저밀도 리포단백질(VLDL), 중간 밀도 리포단백질(IDL), 및 저밀도 리포단백질(LDL)에서 발견된다. ApoB는 ApoB/E 수용체에 의한 LDL 입자의 세포 결합 및 내재화를 위한 인식 신호로서 기능한다. 아포리포단백질 B-함유 리포단백질의 축적 또는 과잉은 죽상동맥경화증과 같은 지질-관련 장애를 가져올 수 있다. ApoB를 감소시키는 제형된 치료는 지질-관련 장애를 치료하기에 유용할 수 있다. 한 가지 핵산 기초 치료는 안티센스 치료의 형태로 마우스에서 생체 내 ApoB 수준을 감소시키고, 치료는 계속해서 혈청 콜레스테롤 및 트라이글리세라이드 수준(미국 공개공보 제2003/0215943호)을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 ApoB의 적당한 하향조절 및 지질-관련 장애를 치료하는 데 있어 표적으로서의 그것의 용도를 증명하였다.
본 발명의 공정의 입자에 대한 다른 예시적인 표적은 단백질 C이고, 이것은, 예를 들어, 혈우병의 치료에 대해 표적화될 수 있다.
지질과 DsiRNA의 혼합시에 지질-DsiRNA 나노입자가 통상적으로 자발적 형성되어 착체를 형성한다. 원하는 입자 크기 분포에 따라, 얻어지는 나노입자 혼합물을 예컨대 Lipex Extruder(Northern Lipids, Inc)와 같은 열배럴(thermobarrel) 압출기를 이용하여 폴리카보네이트 막(예, 100nm 컷오프(cut-off))을 통해 압출할 수 있다. 어떤 경우, 압출 단계를 생략할 수 있다. 이용하기 위한 입자의 추가 제조에서, 에탄올 제거 및 동시 완충제 교환은 예컨대 투석 또는 접선 유동 여과에 의해 달성할 수 있다. 예컨대 완충제는 약 pH 7, 예컨대 약 pH 6.9, 약 pH 7.0, 약 pH 7.1, 약 pH 7.2, 약 pH 7.3, 또는 약 pH 7.4에서의 포스페이트 완충 염수(PBS)로 교환할 수 있다.
입자의 제형은 육안 관찰로 통상적으로 특징지워진다. 이는 응집물 또는 침강물이 없는(free from) 흰 반투명 용액이어야 한다. 지질-나노입자의 입자 크기 및 입자 크기 분포는 예컨대 Malvern Zetasizer Nano ZS(미국 Malvern)를 이용하여 광산란으로 측정할 수 있다. 입자는 크기가 예컨대 40-100nm와 같이 약 20-300nm여야 한다. 입자 크기 분포는 단일 모드(unimodal)여야 한다. 제형 내 총 DsiRNA 농도는 물론 포획된(entrapped) 분획은 염료 배제 분석을 이용하여 산출한다. 제형화한 DsiRNA의 시료를 제형 파괴 계면활성제, 예컨대 0.5% Triton-X100의 존재 또는 부재하에 Ribogreen(Molecular Probes)과 같은 RNA-결합 염료와 함께 인큐베이션할 수 있다. 제형 내 총 DsiRNA는 표준 곡선에 상대적인 계면활성제를 함유하는 시료로부터의 신호에 의해 결정할 수 있다. 포획된 분획은 총 DsiRNA 함량에서 "유리" DsiRNA 함량(계면활성제 부재하의 신호로 측정)을 빼서 결정한다. 퍼센트 포획된 DsiRNA는 통상적으로 >85%이다. 어떤 제형에서, 입자 크기는 30nm 이상, 40nm 이상, 50nm 이상, 60nm 이상, 70nm 이상, 80nm 이상, 90nm 이상, 100nm 이상, 110nm 이상, 및 120nm 이상이다. 적합한 범위는 통상적으로 약 50nm 이상 내지 약 110nm 이상, 약 60nm 이상 내지 약 100nm 이상, 또는 약 80nm 이상 내지 약 90nm 이상이다.
치료제의 전달
본 발명의 공정의 입자 및/또는 제형은 치료제(예를 들어, 핵산 또는 RNAi 약제와 같은 음이온성 약제)를 세포에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 입자 및/또는 제형에 의해 전달된 약제는 유전자-침묵을 위해 (예를 들어, 개체에서 시험관 내 또는 생체 내에서) 또는 개체에서 질환(예를 들어, 암)를 치료하거나 또한 예방학적으로 치료하기 위해 사용될 수 있다.
치료제의 전달은 어떤 유용한 방법을 사용함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어서, 본 발명의 화합물을 함유하는 제형을 사용하는 전달은 동등한 용량의 대조군과 비교하여, 1) 표적 유전자의 녹다운 또는 2) 독성 또는 내성에 의해 평가될 수 있다. 이들 평가는 본 발명의 화합물(예를 들어, 식 (I) 또는 표 1의 어떤 화합물)과 조합하는 제형 중의 지질들, 예컨대 본원에 기술된 어떤 양이온성 지질(예를 들어, DOTAP, DODMA, DLinDMA, 및/또는 DLin-KC2-DMA)과의 어떤 유용한 조합으로 측정될 수 있다. 특정 구체예에서, 치료제의 전달의 개선은 본 발명의 화합물을 사용할 때 관찰되고, 여기서 개선은 대조군과 비교하여, 25% 이상(예를 들어, 전달에서 2배, 5배, 10배, 100배 또는 1000배 이상의 개선)이다.
RNAi 약제의 전달
RNAi 침묵은 광범위한 세포에서 사용될 수 있는데, 여기서 HeLa S3, COS7, 293, NIH/3T3, A549, HT-29, CHO-KI 및 MCF-7 셀라인은 어떤 수준의 siRNA 침묵에 민감하다. 더욱이, 포유동물 세포에서의 억제는 표적화된 유전자에 대해 특이성을 갖는 RNA 수준에서 일어날 수 있고, 여기서 RNA와 단백질 억제 사이의 강력한 상관관계가 관찰되었다. 따라서, 본 발명의 화합물, 및 이것의 제형은, 사용되어 RNAi 약제를 하나 또는 그 이상의 세포(예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내의)에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 RNAi 약제는 본원에 기술된 것과 같은 siRNA, shRNA, dsRNA, miRNA, 및 DsiRNA 약제를 포함한다.
시험관 내 표적 녹다운
RNAi 약제의 전달은 어떤 유용한 방법에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어서, 치료제를 포함하는 제형은 세포 인큐베이션 모델(예를 들어, HeLa 세포)에 시험관 내에서 형질주입될 수 있고, 여기서 종결 지점 측정은: (i) qPCR을 사용하는 mRNA 정량; (ii) 웨스턴 블롯을 사용하는 단백질 정량; (iii) 본 발명의 약제 및/또는 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질의 표지된 세포 내재화 중 하나 또는 그 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 흡수 또는 전달은 상기 언급된 종결 지점의 정도 및 기간 둘 다에 대해 평가될 수 있다. 전달에 앞서, 제형은 실온에서 약 30분 동안 세포 인큐베이션 배지로 희석될 수 있고, 최종 농도는 용량-반응 실험에서 치료제 또는 아미노-아민 또는 아미노-아마이드 양이온성 지질의 0 내지 50 nM로 다양할 수 있다. 시간-경과 실험에 대해, 용량-실험으로부터의 최적 농도는 다양한 인큐베이션 시간, 예를 들어, 30분 내지 7일 동안 연구될 수 있다.
음이온성 약제 및 지질 제형의 기능성은 또한 지질 화합물 및 치료제를 형광 태그로 구별하여 표지하고 형광 공유 국소화(colocalization) 연구를 수행함으로써 시험될 수 있다. 본 발명의 화합물의 음이온성 약제 및/또는 부착된 형광 표지를 전달하는 능력은 세포 내부의 전체 형광을 측정하고, 엔도솜 또는 리소좀 구획과 안정하게 결합되지 않은 형광을 측정하는 것 두 가지에 의해 평가될 수 있다(RNAi를 촉발하는 치료제는 기능하기 위해서 세포 내부에 도달할 뿐만 아니라, 세포의 세포질에도 도달하는 것이 필요하다). 형광 국소화의 성능 및 세포 추적 연구가 본 분야에 기술되어 있다(Lu, et al., Mol. Pharm. 6(3):763, 2009; McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106(15):6111, 2009).
특정 표적 세포 유형 및 표적 조직으로의 전달
본 발명의 공정으로 만든 입자는 치료제를 다양한 기관 및 조직에 전달하여 다양한 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 표적화된 조직 또는 기관은 간, 췌장, 폐, 전립선, 콩팥, 골수, 비장, 흉선, 림프절, 뇌, 척수, 심장, 골격근, 피부, 구강 점막, 식도, 위, 회장, 소장, 결장, 방광, 자궁경부, 난소, 고환, 유선, 부신, 지방조직(백색 및/또는 갈색), 혈액(예를 들어, 조혈세포, 예컨대 사람 조혈 전구세포, 사람 조혈 줄기 세포, CD34+ 세포, CD4+ 세포와 같은, 조혈세포), 림프구 및 다른 혈액 계통 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
암 치료
본 발명의 공정으로 만든 입자는 하나 또는 그 이상의 치료제(예를 들어, RNAi 약제)를 암에 걸렸거나 또는 암이 발생할 위험(예를 들어, 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 증가된 위험)이 있는 개체에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 암은 간암(예를 들어, 간세포암종, 간모세포종, 담관암종, 혈액육종 또는 혈액내피종) 또는 신경모세포종을 포함한다. 예시적인 종양 질환 및 관련 합병증은 암종(예를 들어, 폐, 유방, 췌장, 결장, 간세포, 신장, 여성생식기, 편평세포, 제자리 암종), 림프종(예를 들어, 조직구 림프종, 비-호지킨 림프종), MEN2 증후군, 신경섬유종증(시반세포 종양 포함), 골수이형성증후군, 백혈병, 종양맥관형성, 갑상선, 간, 뼈, 피부, 뇌, 중추신경계, 췌장, 폐(예를 들어, 소세포폐암, 비소세포폐암(NSCLC)), 유방, 결장, 방광, 전립선, 위장관, 자궁내막, 나팔관, 고환 및 난소의 암, 위장관기질종양(GIST), 전립선종, 비만세포종( 개 비만세포종 포함), 급성 골수성 골수섬유증, 백혈병, 급성 림프성백혈병, 만성 골수성백혈병, 만성 림프성백혈병, 다발성 골수종, 악성 흑색종, 비만세포증, 신경교종, 악성 뇌교종, 성상세포종, 신경모세포종, 육종(예를 들어, 신경외배엽 기원 또는 평활근육종의 육종), 종양의 다른 조직으로의 전이 및 화학요법-유발된 저산소증을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
투여 및 투약량
본 발명은 치료제(예를 들어, RNAi 약제)를 포함하는 제형과 같은 화합물을 함유하는 약학적 조성물, 또는 치료적으로 유효한 양의 조성물에 관련된다. 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기 위해 제형될 수 있다. 하나 또는 그 이상의 생리학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 또한 적당한 제형을 위한 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 제형은 미국 펜실베니아주, 필라델피아시에 소재한 Mack Publishing Company에서 발행한 Remingtons Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985에서 찾아볼 수 있다. 약물 전달 방법의 간단한 리뷰에 대해서는, 예를 들어 Langer, Science 249:1527-1533, 1990 참조.
약학적 조성물은 예방 및/또는 치료 처치를 위해 비경구, 비강 내, 국소, 경구, 또는 국소 투여, 예컨대 경피 수단에 의한 국소 투여를 위해 의도된다. 약학적 조성물은 비경구로(예를 들어, 정맥 내, 근육 내 또는 피하 주사에 의해), 또는 경구 섭취에 의해, 또는 혈관 또는 암 상태에 의해 영향을 받은 영역에서 국소 적용 또는 관절 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여의 추가 경로는 혈관 내, 동맥 내, 종양 내, 복강 내, 뇌실 또는 심실 내(intraventricular), 경막 내, 및 비강, 눈에, 공막 내, 안와, 직장, 국소, 또는 에어로졸 흡입 투여를 포함한다. 지속성 방출 투여는 또한 데포 주사 또는 분해성 이식물 또는 성분과 같은 수단에 의해 본 발명에 특별하게 포함된다. 따라서, 본 발명은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체, 예를 들어, 물, 완충수, 식염수, PBS 등에 용해되거나 또는 현탁되어 있는 상기 언급된 약제를 포함하는 비경구 투여를 위한 조성물을 제공한다. 조성물은 생리학적 조건에 근접하게 위해 필요한 약학적으로 허용가능한 보조물질, 예컨대 pH 조정 및 완충제, 긴장 조정제, 습윤제, 계면활성제 등을 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 경구 전달을 위한 조성물을 제공하는데, 이것은 정제, 캡슐 등의 제형에 대해 결합제 또는 충전제와 같은 비활성 성분을 함유할 수 있다. 더욱이, 본 발명은 국소 투여를 위한 조성물을 제공하는데, 이것은 크림, 연고 등의 제형을 위한 용매 또는 유화제와 같은 비활성 성분을 함유할 수 있다.
이들 조성물은 종래의 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 또는 멸균 여과될 수 있다. 그 결과 생성되는 수성 용액은 있는 그대로 사용하기 위해 포장되거나, 또는 동결건조되고, 동결건조된 약제는 투여에 앞서 멸균 수성 담체와 조합될 수 있다. 약제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 및 가장 바람직하게는 7 내지 8, 예컨대 7 내지 7.5일 것이다. 그 결과의 고체 형태의 조성물은 다중 단일 용량 단위로 포장될 수 있고, 각각은 고정된 양의 상기 언급된 약제 또는 약제들을, 예컨대 정제 또는 캡슐의 밀봉된 포장으로와 같이 함유할 수 있다. 고체 형태의 조성물은 또한 신축가능한 양이 담길 수 있는 용기에, 예컨대 국소로 적용가능한 크림 또는 연고를 위해 고안된, 짤 수 있는 튜브에 포장될 수 있다.
유효한 양을 함유하는 조성물은 예방 또는 치료 처치를 위해 투여될 수 있다. 예방 적용에서, 조성물은 종양 또는 암의 발생에 대해 임상적으로 측정된 소인을 나타내거나 또는 민감성이 증가되어 있는 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 환자(예를 들어, 사람)에게 임상적인 질환 또는 종양형성의 개시를 지연시키거나, 감소시키거나, 또는 바람직하게는 방지하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 치료 적용에서, 조성물은 이미 암에 걸려 있는 환자(예를 들어, 사람)에게 상태의 증상 및 그것의 합병증을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 이 목적을 달성하기에 충분한 양은 "치료적으로 유효한 용량", 즉 질환 또는 의학적 상태와 관련된 일부 증상을 실질적으로 개선하기에 충분한 화합물의 양으로서 정의된다. 예를 들어서, 암의 치료에서, 질환 또는 상태의 어떤 증상을 감소시키거나, 방지하거나, 지연시키거나, 억압하거나, 또는 저지하는 약제 또는 화합물이 치료적으로 유효할 것이다. 치료적으로 유효한 양의 약제 또는 화합물은 질환 또는 상태를 치료하기 위해 필요할 뿐만 아니라 질환 또는 상태에 대한 치료를 제공하게 되어 질환 또는 상태의 발병이 지연되거나, 방해되거나, 또는 방지되고, 또는 질환 또는 상태의 증상이 호전되거나, 또는 질환 또는 상태에 대한 용어가 변화되거나 또는, 예를 들어 덜 심각하거나 또는 개인의 회복이 가속화된다.
이런 용도에 유효한 양은 질환 또는 상태의 심각성 및 환자의 체중 및 일반적인 상태에 좌우될 수 있지만, 일반적으로 환자당 용량당 약 0.5 mg 내지 약 3000 mg의 약제 또는 약제들의 범위일 수 있다. 초기 투여 및 추가 투여에 적합한 체계는 초기 투여에 이어서 반복된 용량을 하나 또는 그 이상의 시간, 일, 주 또는 달 간격으로 계속해서 투여하는 것이 전형적이다. 본 발명의 조성물에 존재하는 약제의 유효한 총량은 포유동물에게 단일 용량으로서, 볼루스(bolus)로서 또는 비교적 짧은 기간의 시간에 걸친 주입에 의해 투여될 수 있거나, 또는 분별된 치료 프로토콜을 사용하여 투여될 수 있고, 여기서 다중 용량은 더 연장된 기간의 시간에 걸쳐 (예를 들어 매 4-6, 8-12, 14-16 또는 18-24시간, 또는 매 2-4일, 1-2주, 1달 1회의 용량) 투여된다. 또는 달리, 혈액 중에 치료적으로 유효한 농도를 유지하기에 충분한 연속적인 정맥 내 주입이 고려된다.
본 발명의 조성물 내에 존재하고 포유동물(예를 들어 사람)에 적용되는 본 발명의 방법에 사용된 하나 또는 그 이상의 약제의 치료적으로 유효한 양은 통상적으로-숙련된 당업자에 의해 포유동물의 연령, 체중, 및 상태의 개별적인 차이를 고려함으로써 결정될 수 있다. 본 발명의 약제는 개체(예를 들어 사람과 같은 포유동물)에게 유효한 양으로 투여되는데, 이것은 치료된 개체에서 바람직한 결과(예를 들어, 암 또는 신경퇴행성 장애의 둔화 또는 차도)를 생성하는 양이다. 이러한 치료적으로 유효한 양은 당업자들에 의해 경험적으로 결정될 수 있다.
환자는 또한 약제를 1주 1회 또는 그 이상(예를 들어, 1주에 2, 3, 4, 5, 6 또는 7회 또는 그 이상) 용량당 약 0.1 내지 3,000 mg, 1주에 용량당 0.1 내지 2,500(예를 들어, 2,000, 1,500, 1,000, 500, 100, 10, 1, 0.5 또는 0.1) mg의 범위로 받을 수 있다. 환자는 또한 조성물의 약제를 2 또는 3주당 1회 용량당 0.1 내지 3,000 mg의 범위로 받을 수 있다.
투여될 제형 및 약제(예를 들어, DsiRNA)의 양(용량)은 경험적으로 결정될 수 있다. 특정 구체예에서, 유전자 발현의 유효한 녹다운은 0.0001 내지 10 mg/kg 동물 체중의 핵산 약제 및 0.001-200 mg/kg 동물 체중의 전달 제형을 사용하여 관찰된다. 마우스에서 예시적인 양은 0.1-5 mg/kg의 핵산 약제 및 0.7-100 mg/kg의 전달 제형이다. 임의로, 약 1-50 mg/kg의 전달 제형이 투여된다. 약제(예를 들어, DsiRNA)의 양은 그것이 전형적으로 더 큰 용량에서는 독성이 아니기 때문에 쉽게 증가된다.
특정 구체예에서, 용량은 일, 주, 또는 더 긴 기간(예를 들어, 1 내지 28일 또는 그 이상)에 걸쳐 매일, 또는 단지 1회, 또는, 예를 들어, 급성 대 만성 징후 등에 따라, 다른 간격으로, 투여될 수 있다.
유효한 양을 포함하는 본 발명의 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 선택된 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 용량 및 투여 스케줄은 환자의 질환 또는 상태의 심각성에 기초하여 결정되고 조정될 수 있는데, 이것은 임상의 또는 당업자에 의해 흔히 실시된 방법에 따른 치료의 전 과정 동안 모니터링될 수 있다.
본 발명의 화합물 및 제형은 종래의 처치 또는 치료 방법과 조합되어 사용될 수 있거나 또는 종래의 처치 또는 치료 방법과 별도로 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 제형이 다른 약제와의 조합 치료로 투여될 때, 그것들은 개체에 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또는 달리, 본 발명에 따르는 약학적 조성물은 본원에 기술된 것과 같이, 약학적으로 허용가능한 부형제, 및 본 분야에 공지된 또 다른 치료 또는 예방 약제와 결합된 본 발명의 화합물 또는 제형의 조합을 포함한다.
제형된 약제들은 키트로서 함께 포장될 수 있다. 그것의 비-제한적인 예는, 예를 들어 2가지 알약, 알약 및 분말, 좌약 및 바이알 중의 액체, 2가지 국소 크림 등을 함유하는 키트를 포함한다. 키트는 분말 형태를 복원하기 위한 바이알, 주사용 주사기, 맞춤용 정맥 내 전달 시스템, 흡입기 등과 같이 환자에게 단위 용량의 투여에 도움을 주는 선택적인 구성요소를 포함할 수 있다. 추가로, 단위 용량 키트는 조성물의 제형 및 투여를 위한 설명서를 함유할 수 있다. 키트는 한 명의 환자를 위한 단일 용도로, 특정 환자를 위한 다중 용도로(일정한 용량으로 또는 개별적인 화합물은 치료가 진행되면서 효능이 다양할 수 있는 경우) 제조될 수 있거나; 또는 키트는 다수의 환자에게 투여하기에 적합한 다중 용량을 함유할 수 있다("벌크 포장"). 키트 구성요소는 상자, 블리스터 팩, 병, 튜브 등으로 조립될 수 있다.
실시예
실시예 1: 음이온성 약제 함유 입자의 제조 공정(공정 2141)
HPRT1 & MYC DsiRNA
양이온성 지질(DODMA), 중성 지질(DSPC), PEG-지질 포합체(PEG-DMPE 및 PEG-DMG), 및 콜레스테롤과 함께 하기 구조 중 하나를 가지는 RNAi 약제(HPRT1 또는 MYC를 위한 DsiRNA)로 하기와 같이 입자를 제조하였다:
Figure 112015099411745-pct00029
여기서 대문자 글자는 RNA 뉴클레오타이드를 나타내고, 밑줄친 대문자 글자는 2'-O-메틸-RNA 뉴클레오타이드를 나타내며, 그리고 소문자 글자는 DNA 뉴클레오타이드를 나타낸다. 서열번호 2, 4, 6 및 8은 아래에서 상보성 3'-5' 방향으로 나타내었지만, 본 출원에서 제공하는 서열목록에서 이는 하기 표 11의 서열의 목록에 도시된 바와 같이 요구되는 5'-3' 방향으로 제시하였음을 주목하기 바란다.
DsiRNA 가닥의 제조: 올리고뉴클레오타이드 합성 및 정제
표준 방법(미국 아이오와주의 코랄빌시에 소재한, Integrated DNA Technologies)에 따라 개별 RNA 가닥을 합성하고 HPLC 정제하였다. 예를 들어서, RNA 올리고뉴클레오타이드를 고체상 포스포라미다이트 화학을 사용하여 합성하고, 탈보호한 후, 표준 기술을 사용하여 NAP-5 칼럼(미국 뉴저지주의 피스타카웨이시에 소재한, Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 탈염하였다(Damha and Olgivie, Methods Mol. Biol. 20:81, 1993; Wincott et al., Nucleic Acid Res. 23: 2677, 1995). 올리고머를 15분 단계-선형 구배를 사용하여 Amersham Source 15Q 칼럼(1.0 cm × 25 cm; 미국 뉴저지주의 피스타카웨이시에 소재한, Amersham Pharmacia Biotech) 상에서 이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(IE-HPLC)를 사용하여 정제하였다. 구배는 90:10 완충액 A:B 내지 52:48 완충액 A:B였고, 여기서 완충액 A는 100 mM Tris pH 8.5이고 완충액 B는 100 mM Tris pH 8.5, 1M NaCl이다. 샘플을 260 nm에서 모니터링하고, 전체-길이 올리고뉴클레오타이드 종에 대해 해당하는 피크들을 수집하고, 모아서 NAP-5 칼럼 상에서 탈염하고, 동결건조하였다.
각 올리고머의 순도를 Beckman PACE 5000(미국 캘리포니아주 풀러톤시에 소재한, Beckman Coulter, Inc.) 상에서 모세관 전기영동(CE)에 의해 측정하였다. CE 모세관은 내부 직경이 100 ㎛이고 ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter)을 함유하였다. 전형적으로, 약 0.6 nmole의 올리고뉴클레오타이드를 모세관에 주입하고, 444 V/cm의 전기장에서 작동시키고, 260 nm에서의 UV 흡광도에 의해 검출하였다. 변성 Tris-보레이트-7 M-유레아 작동 완충액을 Beckman-Coulter로부터 구매하였다. 하기 기술된 실험에 사용하기 위해 CE에 의해 평가되는 바 적어도 90% 순수한 올리고리보뉴클레오타이드를 얻었다. 화합물 동일성을 제조사의 권고된 프로토콜을 따라 Voyager DETM Biospectometry Workstation(미국 캘리포니아주 포스터시에 소재한, Applied Biosystems) 상에서 매트릭스-보조 레이저 탈착 이온화 비행시간(MALDI-TOF) 질량분석법에 의해 확인하였다. 모든 올리고머의 상대 분자 질량을 얻었고, 그것은 자주 예상된 분자 질량의 0.2% 내에 있었다.
DsiRNA 듀플렉스의 제조
단일-가닥 RNA(ssRNA) 올리고머를 100 mM 칼륨 아세테이트, 30 mM HEPES, pH 7.5로 구성된 듀플렉스 완충액 중에, 예를 들어 100 μM 농도로 재현탁하였다. 상보하는 센스 및 안티센스 가닥을 동등한 몰량으로 혼합하여, 예를 들어, 50 μM 듀플렉스의 최종 용액을 수득하였다. 샘플을 100℃로 5분 동안 RNA 완충액(IDT)에서 가열하고 실온으로 냉각되도록 놓아둔 후 사용하였다. 이중-가닥 RNA(dsRNA) 올리고머를 -20℃에서 보관하였다. 단일-가닥 RNA 올리고머를 동결건조된 상태로 또는 -80℃에서 뉴클레아제가 없는 물에 보관하였다.
입자의 제조
(a) 12.5mL의 물에 용해된 24mg/mL의 항-HPRT1 DsiRNA와 (b) 60mM HCl(pH=2.3)에 표 5의 성분을 포함하는 37.5mL의 지질 현탁액을 조합하여 DsiRNA-지질 착체을 먼저 제조하였다.
DsiRNA-지질 착체를 형성하는 데 이용한 수성 지질의 조성
DODMA DMPE-PEG2000
MW(Da) 620.90 2693.30
mol% 90.04 9.96
wt% 67.58 32.42
Mol(mmol) 2.14 0.24
Wt(mg) 1330.71 638.31
표 5의 상기 성분을 10-12주기 동안 100nm 막을 통해 압출한 뒤, 입자 크기 및 다분산지수(PDI)를 평가하였고, 이는 각각 80.76nm 및 0.058이었다. DsiRNA와 최초 지질 현탁액을 조합한 후, 100mL의 물을 첨가하여 얻어진 150mL의 DsiRNA-지질 착체에 대해 2.8의 최종 pH가 얻어졌다(도 1 참조). 다음으로, DsiRNA-지질 착체을 혼합 용기에 넣은 후, 100% 에탄올에 용해된 100mL의 추가 지질 용액(37mg/mL의 총 지질 함량 보유)을 수성 DsiRNA-지질 착체 현탁액에 첨가하였다.
DsiRNA-지질 착체에 첨가된 EtOH 용해된 지질의 조성
DSPC CHOL 표 1의 L-30 DSPE-PEG2k
MW(Da) 790.16 386.4 613.05 2805.50
mol% 19.38 46.44 30.32 3.87
wt% 24.43 28.63 29.65 17.30
Mol(mmol) 1.143 2.739 1.788 0.228
Wt(mg) 903.15 1058.35 1096.13 639.65
추가 지질과 DsiRNA-지질 착체의 혼합을 완료한 다음, 500mL의 물을 입자에 첨가하였고, 이는 혼합 현탁액의 에탄올 농도를 14.3% 에탄올로 더 감소시켰다(선택적으로, 다양한 부피의 에탄올을 이 단계에서 첨가할 수 있다. 예컨대, 180mL의 물은 에탄올 농도를 25%로, 1.75L의 물은 에탄올 농도를 8%로, 3.75L의 물은 에탄올 농도를 4% 등으로). 다음으로, 이 혼합 현탁액을 접선 유동 여과(tangential flow filtration(TFF)) 처리하여 약 150mL의 농축 부피를 얻었다. 다음으로, 이 현탁액을 600mL의 PBS로 정용여과(diafiltrate)한 뒤, 50mL의 PBS로 2회 린스하여 200mL의 전체 부피를 얻었다.
다음으로, 입자 크기(93.11nm), 다분산지수(PDI=0.106) 및 농도를 측정하였다. 농도에 대해, DsiRNA-지질 착체는 1.3mg/mL로 측정되었고, 캡슐화(encapsulation) 효율은 95.44%로 관찰되었으며 전체 부피는 220mL였으며, 이는 시료의 최종 농도를 1mg/mL로 만들기 위해 52.96mL의 PBS의 첨가가 필요함을 의미하였다. 주목할 것은, 이 입자 함유 시료의 최종 에탄올 농도가 0.15% 미만이었다는 점이다. 실시예 1에서 예증한 공정은 본 명세서에서 일반적으로 "2141 공정"으로 지칭하고, 후술하는 실시예 2에서의 "2072 공정"과 구분된다.
실시예 2: 실시예 1의 2141 공정과 대비한 2072 공정
상기 공정과 유사하지만 에탄올 내 추가 지질의 농도가 상술한 공정("2072 공정"이라 칭함)에 비해 감소된 점에서만 상기 공정과 구분되는 공정에 대해 형성된 입자의 성질을 먼저 조사하였다. 이 실시예의 공정과 관련하여, 이 실시예에서 결과를 기술한 "2072 공정" 및 상기 실시예 1에서 설명한 "2141 공정"에서의 입자의 제형화 동안 이용한 지질의 비율 및 총량은 동일하였다. "2141 공정"과 "2072 공정"간의 유일한 차이점은 공정의 에탄올 용액 성분 내 추가 지질에서 이용한 지질의 농도에서 발견할 수 있고, 이는 하기 실시예에서 기술한 바와 같이 "2072 공정"에 비해 "2141 공정"에서 높았다.
DsiRNA-지질 착체의 에탄올 내 추가 지질에의 첨가를 포함하는 "2072 공정" 및 에탄올 내 추가 지질의 DsiRNA-지질 착체에의 첨가를 포함하는 "2141 공정" 모두에 의해 제조된 입자의 물성을 평가 및 비교하였다. 도 2의 위쪽 2개의 그래프는 DsiRNA-지질 착체와 에탄올 내 추가 지질의 첨가 순서를 바꾸면(2141 공정과 2072 공정의 비교), 반대 공정으로 얻어지는 입자의 평균 입자 크기 및 크기 분포 모두에 극적이고도 놀라운 차이를 만들어 냄을 보여 준다. 구체적으로, 입자의 100mg 배치(batch)(DsiRNA 함량=100mg)를 DsiRNA-지질 착체를 에탄올 내 추가 지질에 첨가하는 "2072 공정"으로 만든 경우 얻어지는 입자는 152.6nm의 평균 크기를 보유한 반면, 이 입자 집단의 불균질성은 높아서 이 조제물에 대해 관찰된 PDI 값은 0.265로 나타났다. 대조적으로, 더 큰 입자의 300mg 배치(DsiRNA 함량=100mg)를 에탄올 내 추가 지질을 DsiRNA-지질 착체 현탁액에 첨가하는 것을 포함하는 공정으로 만든 경우("2141 공정"), 평균 입자 크기는 98.85로 줄어들고 입자 집단의 크기 분포도 극적으로 더 균질한 것(PDI=0.127)이 밝혀졌다.
이 결과는 첨가 순서의 변동 시행이 입자 크기와 균질성에 극적이고 유리하고도 놀라운 방식으로 영향을 줌을 예증하였다. 하기 실시예에서 예증되는 바와 같이, 이러한 입자 집단의 더 작은 평균 입자 크기와 감소된 불균질성은 개체에 투여시 입자 집단의 개선된 효능(녹다운 및 표현형 영향) 및 개선된 내약성/감소된 독성 모두와 연관되었다.
실시예 3: 에탄올 내 추가 지질의 농도 상승은 입자 성질을 개선하였음
도 1에 개념적으로 예시되고 본 명세서에서 "2141"로 지칭되기도 하는 상술한 공정은 DsiRNA-지질 착체 및 에탄올 내 추가 지질의 첨가 순서에서 다른 시험 공정과 구분되었을 뿐 아니라, 에탄올 용액 내 추가 지질에 용해화된 지질 및 스테롤의 농도에 의해서도 다른 공정과 구분되었다. 구체적으로, "2072 공정"에서, 콜레스테롤은 에탄올 내 콜레스테롤의 용해도 한계에 근접하는 에탄올 내 대략 10-11mg/mL의 농도로 용매에 첨가하였다. 다음으로, 추가 지질을 이 에탄올 내 콜레스테롤 혼합물에 첨가하여 "에탄올 내 추가 지질" 성분을 생성하였고, 대략 20mg/ml의 총 지질이라는 "에탄올 내 추가 지질" 용액에 존재할 수 있는 총 지질의 양에 한계가 있었다. 대조적으로, 본 발명의 "2141 공정"에서, 표 1의 L-30, DSPC 및 DSPE-PEG2k를 상기 표 6에 나타낸 양으로 에탄올 100mL에서 조합하였다. 다음으로, 이 에탄올 용액을 분말로서의 콜레스테롤에 대략 11mg/ml의 콜레스테롤 농도로 첨가하였지만, 이 "에탄올 내 추가 지질" 용액의 총 지질 함량은 응집 또는 기타 악영향의 부재하에 37mg/ml의 총 지질 함량을 달성한 특징이 있었다(실제로, 에탄올 내 대략 21mg/ml의 콜레스테롤(에탄올 내 콜레스테롤 단독의 용해도를 극적으로 초과하는 수준) 및 74mg/ml의 총 지질을 보유하는 이 "에탄올 내 추가 지질"의 추가 배치 또한 성공적으로 제조되었다).
본 발명의 공정이 "에탄올 내 추가 지질" 용액의 총 지질 함량을 "2072" 및 유사 공정에 이용되는 대략 20mg/ml 이하의 수준을 넘어 "2141 공정"/입자의 경우 대략 34mg/ml로 끌어올리는 효과는 예측되지 않은 극적인 것이었다: "2141 공정"으로 제조한 입자는 "2072 공정"으로 제조한 입자보다 개선된 크기 및 다분산성을 보유하였다; 또한 "2141" 입자는 "2072 공정"으로 제조한 입자보다 우수한 표적특이적 녹다운을 입증하였고, "2072 공정"으로 제조한 대응 입자보다 간암의 Hep3B 마우스 모델에서의 종양 부피 감소에서 개선된 효능을 나타냈고, 마우스에서 훨씬 우수한 내약성을 가졌다.
도 2의 아래쪽 2개 그래프는 "2072 공정"(제형화 공정 동안 20mg/ml 이하의 에탄올 내 추가 지질의 총 농도가 특징)을 이용하여 제조한 입자에 비해 "2141 공정"(제형화 공정 동안 에탄올 내 추가 지질의 상승한 농도가 특징)을 이용하여 제조한 입자의 집단에 대해 관찰된 개선된 크기 및 다분산성 값을 보여 준다. 구체적으로, "2141 공정"은 0.072의 PDI 관찰값을 갖는 95.07nm의 평균 크기를 보유하는 입자를 생성한 데 비해, "2072 공정"으로 제조한 대응 입자는 98.85nm의 평균 크기 및 0.127의 PDI 관찰값을 나타냈다. 따라서, 두 입자 집단의 물성의 이 개략적인 평가에 의해, "2141 공정"으로 제조한 입자는 "2072 공정"으로 제조한 대응 입자보다 약간 더 밀집되고(compact) 상당히 더 균질한 것으로 관찰되었다.
"2141" 제조 및 "2072" 제조 입자의 물성의 추가 평가는 두 입자 집단간에 훨씬 더 극적인 차이점을 밝혀 주었다. 두 입자 집단을 크기 배제 크로마토그래피("SEC") 처리하여 신호 강도를 검사한 결과, "2141" 제조 입자의 균질성이 특히 인상적이었다. 도 3에 도시한 바와 같이, "2072" 제조 입자 집단의 SEC 분획 2-5는 입자 집단의 상당한 불균질성을 나타냈다 - 구체적으로, 도 3의 위쪽 그래프의 "2072" 입자 집단은 주 피크보다 더 작은 입자의 상당한 소 피크를 나타내었고, 이는 마이셀(micelle) 부스러기에 해당하는 것으로 보인다; 대조적으로, 아래쪽 그래프의 "2141" 제조 입자는 이와 같은 소 피크를 보여 주지 않았고 "2141" 제조 입자는 더 꽉 뭉쳐 있었다. 따라서, "2141 공정"으로 만든 입자는 "2072 공정"으로 제조한 입자에 비해 더 일관성 있는 크기 및 더 적은 마이셀 부스러기를 보유하였다. 이 효과는 전술한 바와 같이 "2141" 제조 및 "2072" 제조 입자의 조성이 동일하기 때문에 특히 주목할 만한 것이었다.
"2072" 제조 입자에 비한 "2141" 제조 입자의 추가 검사는 "2072" 제조 입자 집단의 불균질성에 비한 "2141" 제조 입자 집단의 상대적 균질성을 더 정의하였다. 세파로스(Sepharose) 4B 컬럼, 30mL 상에서의 LNP 내 1.0mg/mL의 DsiRNA 1.0mL를 이용하여 퍼센트 부피 분석을 수행하였고, 입자를 % 부피로 측정하였고, 각 분획에 대한 RNA 함량을 평균 입자 크기로 평가하였다(Malvern). 도 4에 도시된 바와 같이, 퍼센트 부피 분석을 "2072" 및 "2141" 제조 입자 모두에 대해 수행하였을 때, "2072" 제조 입자(도 4, 위쪽 그래프)는 명백히 마이셀 부스러기에 해당하는 입자 집단 내 21-32nm의 다수 분획(57%)을 보유하는 것으로 관찰된 반면, "2072" 제조 입자 집단의 36%만이 DsiRNA 함유 입자로 평가되는 79-106nm 입자에 해당하였다. 대조적으로, 퍼센트 부피로 평가한 "2141" 제조 입자는 현저히 균질하였다 - 입자 집단의 98% 초과가 DsiRNA 함유 입자에 해당하는 51-78nm 영역에서 확인되었다. 따라서, "2141" 공정은 DsiRNA 페이로드의 적정 크기 입자로의 거의 완전한 혼입을 일으킨 반면, "2072" 공정은 이러한 엄격한 분석하에서 입자 집단 내에 상당한 양의 마이셀 부스러기를 축적한 것으로 관찰되었다.
실시예 4: 향상된 표적특이적 녹다운, 개선된 표현형 활성을 나타내고 양호한 내약성인 "2141 공정" 제조 입자
"2141" 제조 입자의 효능을 일련의 실험들에서 생체내(in vivo) 평가하였다. 먼저, 상술한 바와 같이 항-HPRT1 페이로드 DsiRNA를 품은 "2141" 제형화 입자의 마우스 종양에서의 표적특이적 녹다운 효능을 검사하였다(이러한 실험에서, Hep3B 종양을 갖는 마우스에 5mg/kg의 입자를 투여하였고(도 5에 표시된 바와 같이 "2141" 또는 기타), HPRT1의 간 종양 녹다운을 투여 후 48시간에서 평가하였다 N=7/군). 도 5에 도시된 바와 같이, "2141 공정"으로 만든 입자("2137" 및 "2144" 입자와도 함께 하며, 이들 세 군간에는 성분 지질의 비율만이 다름)는 마우스 종양에서 HPRT1의 대략 80% 녹다운을 생성하였다. 이 결과는 마우스 종양에서 표적화된 HPRT1 전사(transcript)의 대략 70% 녹다운을 일으킨 "2072 공정"으로 만든 입자에 대해 관찰된 것보다 상당히 양호하였다. 따라서, 공정의 "에탄올 내 추가 지질" 성분 내에 존재하는 지질의 상승된 농도에서만 "2072 공정"과 구분되는 "2141 공정"이 생체내 표적화된 전사(여기서는 HPRT1)의 표적특이적 녹다운에 더 효과적인 입자 집단을 생성하였다. 이론에 구속되는 것을 바라지는 않으나, 이 현저한 개선의 적어도 일부는 "2141 공정"을 통해 얻어진 입자의 극적으로 개선된 균질성에 기인한 것일 수 있다.
"2072" 제형화 입자에 비한 "2141" 제형화 입자의 생체내 표현형 효능도 검사하였다. 이러한 실험들에서, 두 MYC 표적화 DsiRNA("MYC-622" 및 "MYC-1711")를 "2141 공정" 또는 "2072 공정"을 이용하여 제형화하였다. 다음으로, 이들 MYC 표적화 DsiRNA를 함유하는 입자를 Hep3B 종양을 품은 마우스에 투여하고 효능을 평가하였다(마우스에 1주 3회(TIW)x2를 도 6에 나타낸 농도로 투여하였고, 최종 용량의 투여 후 48시간에서 종양 중량을 평가하였다). 선행 실험에서, MYC-622 및 MYC-1711 페이로드 모두는 비슷한 효능을 보유하는 것으로 관찰되었다(데이터 미도시). 도 6에 도시된 바와 같이, "2141 공정"에 의한 입자 내에 제형화된 MYC-1711 DsiRNA 페이로드는 MYC-622 DsiRNA를 품은 "2072" 제형화 입자에 비해 생체내 Hep3B 종양 부피를 감소시키는 데 대략 4-5배 더 큰 효력(투여량 수준에 척도를 맞춘 효능)을 나타냈다. 구체적으로, 3mg/kg 또는 5mg/kg으로 투여한 MYC-1711 페이로드를 품은 "2141" 제형화 입자는 각각 73% 및 77%의 종양 크기 감소를 나타냈다. 이 감소 수준은 "2072 공정"으로 제조한 MYC 표적화 페이로드를 품은 입자에 대해 관찰된 어느 것보다도 상당히 컸으며, 항-MYC 페이로드를 갖는 "2141" 제형화 입자 1mg/kg 미만의 투여량도 상당한 종양 크기 감소를 나타냈다(0.3mg/kg의 경우 대략 28% 감소 및 0.5mg/kg의 경우 대략 47% 감소). 각 제형의 내약성도 다음 독성 마커를 검사하여 평가하였다: ALK Phos, ALT, AST, ALB 및 총 빌리루빈. 도 6의 아래 표에 도시된 바와 같이, "2072 공정"으로 제조한 입자는 "2171 공정"으로 제조한 입자에 대해 관찰된 것보다 훨씬 더 크게 이러한 독성 마커의 수준을 상승시켰다.
"2141 공정" 또는 "2072 공정"으로 제조한 입자의 내약성을 평가하기 위해 추가 분석을 수행하였고, 이러한 분석 모두는 "2141 공정"으로 제조한 입자의 향상된 내약성/독성의 결여를 강조하였다. 제형이 마우스에서 잘 수용되지 않을 때, 마우스는 그러한 제형의 투여 후에 종종 체중 감소를 보인다. 반면, 이러한 마우스에서 간 중량은 종종 증가한다. 도 7에 도시된 바와 같이, "2072" 및 "2141" 제조 입자의 개략적인 내약성을 이러한 입자의 마우스에의 10mg/kg 투여(1주 2회(BIW)x2, 총 4회 투약, n=15/군)의 체중 및 간 중량에 대한 영향 평가를 통해 비교하였다. 이들 공정 각각으로 제형화한 입자간에 현저한 차이가 관찰되었는데, "2072" 제형화 입자는 체중("2072" 제형화 입자의 투여는 거의 20%의 체중 감소를 생성) 및 간 중량("2072" 제형화 입자를 투여한 마우스에 대해 대략 50%의 간 중량 증가가 관찰됨) 모두에 극적인 영향을 나타내었다. 대조적으로, "2141" 제형화 입자를 투여한 마우스의 경우에는 체중에 대한 유의적인 영향이 관찰되지 않았고, "2141" 제형화 입자는 아주 소폭의(대략 10-20%) 간 중량 증가만을 유발하였고, 검사한 두 "2141" 조제물 중 하나에서만 관찰된 효과였다. 따라서, "2141" 제조 입자는 제형화 내약성의 개략적인 평가에 기초하여 생체내에서 현저하게 우수한 내약성을 가졌다.
"2141" 제형화 입자의 이러한 내약성/독성 결과는 10mg/kg 투여(1주 2회x2, 총 4회 투약, n=15/군)로 "2072" 및 "2141" 제형화 입자를 투여한 마우스에서 다음 독성 마커의 평가에 의해 더 강화되었다: ALT, AST, 빌리루빈, CPK, 알칼리성 포스파타아제 및 알부민. 도 8에 도시한 바와 같이, "2072" 제형화 입자의 반복 투약은 이들 마커 각각에서 제형화 독성을 시사하는 변화를 유발하였다: ALT, AST, 빌리루빈, CPK 및 알칼리성 포스파타아제 수준은 모두 상당히 상승한 한편, 알부민 수준은 상당히 감소하였다. 완전히 대조적으로, "2141" 제형화 입자는 검사한 독성 마커에서 이러한 극적인 변화를 보이지 않았다: "2141" 제형화 입자 중 어느 것도 병행하는 PBS 처리 동물과 비교하여 이러한 독성 마커의 유의적 변화를 보이지 않았다. 따라서, "2141 공정"(제형화 공정 동안 에탄올 내 추가 지질의 상승된 농도가 특징)은 제형화 공정 동안 에탄올 내 추가 지질의 상승된 농도의 이용을 특징으로 하지 않는 방법으로 제조한 대응 입자보다 개선된 물성(크기, PDI 등)을 보유할 뿐 아니라 생체내에서 더 효능이 있음은 물론 내약성이 우수한 입자를 생성하였다.
실시예 5: 음이온성 약제 함유 입자를 제조하는 공정 및 제형화
음이온성 약제를 보유하는 입자의 제조에 이용하기 위한 지질 조성물을 실시예 1(2141 공정)에 대해 상술한 바와 같이 그리고 도 1에 도시한 공정에 따라 일반적으로 제형화하였다. 공정은 DODMA, DL-048, DL-049, DL-033과 같은 양이온성 지질, 및 지질-음이온성 약제 입자 제형화 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질(modified lipid), 예컨대 DMPE-PEG2k, DMG-PEG2k, 및 DSPE-PEG2k와 같은 PEG-지질 포합체를 포함하는 코어 지질을 포함하는 제1지질 현탁액을 제조하는 것을 포함한다. 코어 지질을 산성 수용액에서 혼합하여 지질 착체를 형성한다.
제2(추가)지질 용액을 용매, 예컨대 에탄올, 바람직하게는 100% 에탄올 내에 제조한다. 표 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 제2지질 용액은 구조적 지질, 스테롤, 양이온성 지질 및 변형된 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 함유한다. 예는 DDPC, DSPC, MSPC, POPC, Lyso PC, POGP, 콜레스테롤, DL-033, DL-036, DMPD-PEG2k, DSPE-PEG2k 및 DSG-PEG2k 등을 포함한다. 제형화에 이용한 화합물의 화합물 약칭을 하기 표 9에 정의하였다.
코어 제1지질 조성물 및 제2추가 지질 조성물을 제조하기 위한 구체적인 예시적 지질 조합을 표 7 및 8에 열거하였고, 실시예 1에 대해 상술한 바와 같이 제조하여 구체적 성질을 시험하였다. 실시예 1에 대해 기술한 바와 같이, 음이온성 약제 페이로드를 함유하는 입자를 제조하는 바람직한 방법은 산성 수용액, 바람직하게는 HCl 수용액에서 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질 및 양이온성 지질(예컨대, 표 7 및 8에 나타낸 코어 양이온성 지질)을 착체가 형성되기에 충분한 양으로 조합하는 단계를 포함한다. 다음으로, 지질 착체를 핵산 분자와 같은 음이온성 약제와 조합하여 착체-음이온성 약제를 형성할 수 있고, 중성 수용액과 조합하여 착체-음이온성 약제 수현탁액을 형성할 수 있다.
추가 지질이 조합되어 구조적(structural) 지질, 스테롤, 양이온성 지질 및 변형된 지질로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 추가 지질 용액 또는 현탁액을 형성한다. 바람직한 구체예에서, 추가 지질은 에탄올, 바람직하게는 100% 에탄올과 같은 용매 내에서 조합되고, 바람직하게는 표 7 및 8에 나타낸 외피(Envelope) 지질 중 하나 이상을 포함한다. 추가 외피 지질의 용액 또는 현탁액을 착체-음이온성 약제에 바람직하게 첨가하여 음이온성 약제를 포함하는 입자를 생성한다.
표 7 및 8에 기술한 제형화를 이용하여 항원성 약제(antigentic agent)를 함유하는 입자를 제조하였고, 제형화 각각은 실시예 1 및 2에 기술한 2072 공정으로 만든 입자에 비해 2141 공정으로 제조한 입자에 대해 기술한 개선된 특성을 갖는 입자를 제공하였다. 개선된 특성은 균질성, 균일성, 페이로드 및 치료 효능을 포함하였다.
표 10에 나타낸 바와 같이, 입자는 2072 공정으로 제조한 입자에 비해 다음 특성 및/또는 마커 중 하나 이상으로 측정되는 개선된 특성을 가진다: 평균 입자 크기, 다분산 지수(PDI), 퍼센트 페이로드, 예컨대 입자 내의 및/또는 표적 세포에 전달되는 핵산, 질병 마커 알칼리성 포스파타아제, CPK, ALT, AST, 알부민, 총 빌리루빈, HPRT1, 예컨대 페이로드 및 그 표적을 대표하는 진단 분석에서 측정된 체중 또는 간 중량 변화. 하기 표 10을 참조.
Figure 112015099411745-pct00030
Figure 112015099411745-pct00031
Figure 112015099411745-pct00032
Figure 112015099411745-pct00033
실시예 6: 간 중심 제형화: HAO1 녹다운
추가 지질-핵산 제형을 2041 공정에 따라 실시예 1에 대해 기술한 바와 같이 제조하고 치료 입자의 효과적 생성을 시험하였고, HAO1 유전자 및 단백질 녹다운에 충분한 최소 투여량 및 빈도를 결정하였다. HAO를 표적화하는 DsiRNA를 하기 표 11에 나타낸 구체적 제형에 따라 외피코어(EnCore) 지질 입자 내에 제형화하였고, 실시예 1, 2141 공정에 대해 기술한 바와 같이 제조하였다. 2401 및 2373 제형은 동일한 지질 및 핵산 약제의 조합을 함유하였지만, 2401 공정이 외피 지질 용액 또는 현탁액과 착체-음이온성 약제 수현탁액의 관내(in-line) 혼합을 포함한 반면, 2373 공정은 일괄(batch) 혼합을 이용한 점에서 차이가 있었다.
입자를 암컷 마우스에 정맥내 주사하였고, 투약 후 24 및 168시간에서 동물들을 희생시켰다. 히드록시산 산화제 1(HAO1) 유전자 및 단백질 발현의 분석을 위해 혈장 및 간조직 시료를 채취하였다. 표적화 DsiRNA는 각각 서열번호 7 및 8의 다음 서열을 갖는 RNAi 약제(MAO1의 경우 DsiRNA)였다. 안티센스 서열번호 8을 아래에서 3'-5' 방향으로 나타내었지만, 서열목록에서 모든 서열은 5'-3' 방향으로 제시하였음을 주목하기 바란다.
Figure 112015099411745-pct00034
이 연구에서, 외피 지질로서의 POPG로 제조한 입자의 효능을 DPPC와 비교하였다. 입자는 0.5% 내지 3%의 다양한 양의 POPG를 함유한 반면, 외피 지질 콜레스테롤 및 DL-036 및 코어 지질 DL-048 및 DMG-PEG2k를 포함한 다른 성분들은 모든 제형을 통해 일정하였다. 하기 표 10 참조.
입자를 실시예 1 및 5에 대해 상술한 바와 같이, 하기 표 11에 기술한 구체적 제형 및 세포 표적 MAO1과 간섭하도록 설계된 서열번호 7 및 8로부터 형성된 DsiRNA를 이용하여 제조하였다.
이 연구를 위해, 마우스 FVII DsiRNA 페이로드를 함유하는 제형을 CB57-BL6 암컷 마우스에 도 9에 나타낸 바와 같이 10ug/kg(원), 25ug/kg(다이아몬드), 또는 50ug/kg(정사각형)으로 정맥내 주사하였다. 감소 FVII 단백질 이용 활성 분석에 액세스하기 위해 투약 후 24시간에서 혈청 시료를 채취하였다. PBS를 음성 대조군으로 포함시켰다. 다양한 외피코어 제형을 표 11 및 도 9에 나타낸 바와 같이 개별 4자리 숫자로 표시하였다. 다양한 지질 조성물을 도면의 아래에 표시한 바와 같은 각 제형에 대해 이용하였다.
지질 입자를 통해 간섭성 치료 분자를 받는 마우스 내 VII 인자(Factor VII)의 존재를 분석함으로써 입자의 개선된 효능을 시험하였다. 분석은 VII 인자의 기질인 인간 X 인자의 Xa 인자로의 변환을 측정하였는데, 이 반응은 발색성 기질인 sXa-11에 작용하여 405nm에서 측정되는 색상을 생성한다. 데이터를 표 11 및 도 9에 도시하였다.
Figure 112015099411745-pct00035
다른 구체예
본 발명이 특정 구체예와 관련하여 기술되었지만, 추가로 변형될 수 있고, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따라 본 발명의 어떤 변동, 용도, 또는 적용을 포함하도록 의도되며, 본 발명이 속하는 기술분야 내에서 공지된 또는 관용적인 실시범주 내에서 본 개시내용으로부터 벗어난 그런 이탈 내용을 포함하는 것으로 의도되고, 지금까지 설명된 본질적인 특징에 적용될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
모든 공개공보, 특허 및 특허 출원은 그것들의 전체 내용이 각각의 개별적인 공개공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 및 개별적으로 참조로써 포함되는 것과 같은 정도로 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시한 서열의 목록:
Figure 112015099411745-pct00036
* 여기서 대문자 글자는 RNA 뉴클레오타이드를 나타내고, 밑줄친 대문자 글자는 2'-O-메틸-RNA 뉴클레오타이드를 나타내며, 그리고 소문자 글자는 DNA 뉴클레오타이드를 나타낸다.
<110> Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Brown, Bob Dale Ying, Bo <120> PROCESS FOR FORMULATING AN ANIONIC AGENT <130> 3904/1123WO <150> 61/784,810 <151> 2013-03-14 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 1 gccagacuuu guuggauuug aaatt 25 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 aauuucaaau ccaacaaagu cuggcuu 27 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 aggaacuaug accucgacua cgact 25 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 agucguaguc gaggucauag uuccugu 27 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 agcuuuuuug cccugcguga ccaga 25 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 6 ucuggucacg cagggcaaaa aagcucc 27 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 auauuuuccc aucuguauua uuutt 25 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 guuauaaaag gguagacaua auaaaaa 27

Claims (56)

  1. 음이온성 약제(anionic agent)를 포함하는 입자를 제조하는 방법으로서,
    (a) 산성 수용액에서 (i) 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질(modified lipid) 및 (ii) 양이온성 지질을 착체가 형성되기에 충분한 양으로 조합하는 단계로서, 상기 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-, PEG-세라미드-, 또는 강글리오시드-변형된 지질인 단계;
    (b) (a) 단계의 착체를 음이온성 약제와 조합하는 단계;
    (c) 중성 수용액을 (b) 단계의 착체-음이온성 약제와 조합하여 착체-음이온성 약제 수현탁액을 형성하는 단계;
    (d) 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질, 중성 지질, 스테롤 및 양이온성 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질 및 알코올을 포함하는 용액 또는 현탁액을 형성하는 단계로서, 상기 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-, PEG-세라미드-, 또는 강글리오시드-변형된 지질인 단계; 및
    (e) (d) 단계의 용액 또는 현탁액을 (c) 단계의 착체-음이온성 약제 수현탁액에 첨가하여, 착체-음이온성 약제가 (d) 단계의 용액 또는 현탁액으로부터의 초기 낮은 농도의 알코올에 노출되도록 하고, (d) 단계의 용액을 (c) 단계의 착체-음이온성 약제 수현탁액에 추가로 첨가함에 따라 알코올 농도를 점차 증가시키는 단계
    에 의해, 음이온성 약제를 포함하는 입자를 제조하는 것을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, (a) 단계의 상기 산성 수용액은 HCl을 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, (a) 단계의 상기 산성 수용액은 4 미만의 pH를 보유하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, (a) 단계의 상기 산성 수용액은 60mM HCl인 방법.
  5. 제1항에 있어서, (a) 단계의 상기 양이온성 지질은 양성자화 가능한(protonatable) 기를 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, (a) 단계의 상기 양이온성 지질은 4 내지 11의 pKa를 갖는 방법.
  7. 제1항에 있어서, (a) 단계의 상기 양이온성 지질은 DODMA, DOTMA 및 L-1 내지 L-49로 이루어진 군에서 선택된 양이온성 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
    Figure 112020073549789-pct00048

    Figure 112020073549789-pct00049

    Figure 112020073549789-pct00050

    Figure 112020073549789-pct00051

    Figure 112020073549789-pct00052

    Figure 112020073549789-pct00053
  8. 제1항에 있어서, (a) 단계 또는 (d) 단계의 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 상기 변형된 지질은 PEG-지질인 방법.
  9. 제1항에 있어서, (a) 단계 또는 (d) 단계의 상기 변형된 지질은 DMPE-PEG, DSPE-PEG 및 DSG-PEG로 이루어진 군으로부터 선택되는 PEG-지질인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 PEG는 PEG2k인 방법.
  11. 제1항에 있어서, (a) 단계의 착체는 직경이 60 내지 75nm인 방법.
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  17. 제1항에 있어서, (c) 단계의 상기 중성 수용액은 물인 방법.
  18. 제1항에 있어서, (d) 단계의 상기 용액 또는 현탁액을 형성하는 것은 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질, 중성 지질, 스테롤 및 양이온성 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 상기 하나 이상의 지질을 에탄올에 용해하는 것을 포함하고, 상기 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-, PEG-세라미드-, 또는 강글리오시드-변형된 지질인 방법.
  19. 제18항에 있어서, (d) 단계의 상기 용액 또는 현탁액을 형성하는 것은 100% 에탄올에 용해하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제1항에 있어서, (d) 단계의 상기 중성 지질은 DSPC, DPPC 및 DOPC로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 스테롤은 콜레스테롤인 방법.
  22. 제1항에 있어서, (d) 단계의 상기 양이온성 지질은 L-1 내지 L-49로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
    Figure 112020073549789-pct00054

    Figure 112020073549789-pct00055

    Figure 112020073549789-pct00056

    Figure 112020073549789-pct00057

    Figure 112020073549789-pct00058

    Figure 112020073549789-pct00059
  23. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 약제를 포함하는 입자는 직경이 90 내지 110nm인 방법.
  24. 삭제
  25. 제1항에 있어서, 상기 음이온성 약제를 포함하는 입자는, (c) 단계의 착체-음이온성 약제 수현탁액을 (d) 단계의 용액 또는 현탁액에 첨가하는 것에 의해 (d) 단계의 용액 또는 현탁액과 (c) 단계의 착체-음이온성 약제 수용액을 조합하는 것을 포함하는 적절한 대조군 공정에 의해 형성되는 적절한 대조군 입자와 비교하여, 개선된 크기 또는 PDI, 상기 입자가 투여된 개체에서 개선된 효능 및 상기 입자가 투여된 개체에서 개선된 내약성(tolerability)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 성질을 보유하는 방법.
  26. 제1항에 있어서, 다음 단계를 더 포함하는 방법:
    (f) 상기 음이온성 약제를 포함하는 입자를, 조합된 용액 내 에탄올의 농도를 10% 이하로 감소시키기에 충분한 부피의 물과 조합하는 단계.
  27. 제26항에 있어서, 다음 단계를 더 포함하는 방법:
    (g) 상기 조합된 용액에 접선 유동 여과(tangential flow filtration: TFF) 및 투석으로 이루어진 군으로부터 선택되는 공정을 수행하는 단계.
  28. 삭제
  29. 제1항에 있어서, (d) 단계의 용액 또는 현탁액을 (c) 단계의 착체-음이온성 약제 수용액에 첨가하는 단계는 관내(in-line) 혼합에 의해 이루어지는 것인 방법.
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  44. 제1지질 또는 스테롤, 제2지질 또는 스테롤 및 음이온성 약제를 포함하는 입자를 제조하는 방법으로서,
    (a) 산성 수용액에서 (i) 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질 및 (ii) 양이온성 지질을 착체가 형성되기에 충분한 양으로 조합하는 단계로서, 상기 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질은 폴리에틸렌글리콜(PEG)-, PEG-세라미드-, 또는 강글리오시드-변형된 지질인 단계;
    (b) (a) 단계의 착체를 음이온성 약제와 조합하는 단계;
    (c) 중성 수용액을 (b) 단계의 착체-음이온성 약제와 조합하여 착체-음이온성 약제 수현탁액을 형성하는 단계;
    (d) 제2지질 또는 스테롤을 알코올을 포함하는 용매와 조합하여 상기 용매 내 제2지질 또는 스테롤 용액을 형성하는 단계로서, 상기 용매는 상기 제1지질 또는 스테롤이 없는(free of) 것인 단계; 및
    (e) 상기 용매 내 상기 제2지질 또는 스테롤 용액을 상기 제1지질 또는 스테롤과 조합하여 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액을 형성하는 단계,
    (f) (e) 단계의 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액과 (c) 단계의 착체-음이온성 약제 수현탁액을 조합하여, 착체-음이온성 약제가 용매로부터의 초기 낮은 농도의 알코올에 노출되도록 하고, (e) 단계의 용액을 (c) 단계의 착체-음이온성 약제 수현탁액에 추가로 첨가함에 따라 알코올 농도를 점차 증가시키는 단계에 의해,
    제1지질 또는 스테롤, 제2지질 또는 스테롤 및 음이온성 약제를 포함하는 입자를 제조하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, (e) 단계에서 상기 제2지질 또는 스테롤 존재하의 상기 용매 내 상기 제1지질 또는 스테롤의 용해도는 상기 제2지질 또는 스테롤 부재하의 상기 용매 내 상기 제1지질 또는 스테롤의 용해도보다 높은 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액은 지질-음이온성 약제 입자 형성 동안 입자 응집을 방지하는 변형된 지질, 중성 지질, 스테롤 및 양이온성 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 지질을 포함하는 방법.
  47. 제44항에 있어서, 상기 입자는, 상기 제2지질 또는 스테롤이 상기 용매에 노출되기 전에 상기 제1지질 또는 스테롤을 상기 용매에 노출하는 것을 포함하는 적절한 대조군 공정에 의해 형성되는 적절한 대조군 입자와 비교하여, 개선된 크기 또는 PDI, 상기 입자가 투여된 개체에서 개선된 효능 및 상기 입자가 투여된 개체에서 개선된 내약성으로 이루어진 군으로부터 선택되는 성질을 보유하는 방법.
  48. 제1항 또는 제44항에 있어서, 상기 음이온성 약제는 핵산인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이중가닥 핵산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 이중가닥 핵산은 작은 헤어핀 RNA(shRNA) 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 이중가닥 핵산은 인간 다이서의 기질인 방법.
  52. 제44항에 있어서, (f) 단계는 (d) 단계의 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액을 (c) 단계의 착체-음이온성 약제 수현탁액에 첨가하는 것 및 (d) 단계의 제2지질 또는 스테롤 및 제1지질 또는 스테롤의 용액과 (c) 단계의 착체-음이온성 약제 수용액을 관내 혼합하는 것으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 수행되는 방법.
  53. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 지질은 중성 지질, 스테롤, 양이온성 지질 및 변형된 지질을 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 중성 지질은 DSPC, DPPC 및 DOPC로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, (a) 단계 또는 (d) 단계의 양이온성 지질은 하기 화학식을 갖는 것인 방법:
    Figure 112020126536403-pct00046

    (상기 화학식에서,
    각 R1 및 R2는 독립적으로, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 알킬, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 알켄일, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 알킨일, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 헤테로알킬, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 헤테로알킨일이고;
    각 n1 및 n2는 독립적으로 0 내지 2의 정수이며;
    R5는 H, 치환기로 치환되거나 비치환된 C1-6 알킬, 및 치환기로 치환되거나 비치환된 3-원 내지 8-원의 헤테로사이클일로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    단, R1, R2, 및 R5에 있어서, 상기 치환기는 각각 독립적으로, 아미노기, 할로기, (3-원 내지 8-원의 헤테로사이클일)옥시기, 3-원 내지 8-원의 헤테로사이클일기, C1-24 알킬기, C2-24 알켄일기, C2-24 알킨일기, 3-원 내지 10-원의 사이클로알킬기, 하이드록시기, 나이트로기, 및 옥소기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이며,
    상기 헤테로 원자는 각각 독립적으로, O, N 및 S로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이다).
  56. 제53항 또는 제54항에 있어서, (a) 단계 또는 (d) 단계의 양이온성 지질은 하기 화학식을 갖는 것인 방법:
    Figure 112020126536403-pct00047

    (상기 화학식에서,
    각 R1 및 R2는 독립적으로, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 알킬, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 알켄일, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 알킨일, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 헤테로알킬, 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 헤테로알켄일, 또는 치환기로 치환되거나 비치환된 C11-24 헤테로알킨일이고;
    R3는 H 또는 치환기로 치환되거나 비치환된 C1-6 알킬이며;
    L1은 치환기로 치환되거나 비치환된 C1-6 알킬렌이고;
    각 R5 및 R6는 독립적으로 H 또는 치환기로 치환되거나 비치환된 C1-6 알킬이거나, 또는 R5 및 R6는 조합되어 치환기로 치환되거나 비치환된 C3-7 헤테로사이클일을 형성하며,
    단, R1, R2, R3, R5, R6, 및 L1에 있어서, 상기 치환기는 각각 독립적으로, 아미노기, 할로기, (3-원 내지 8-원의 헤테로사이클일)옥시기, 3-원 내지 8-원의 헤테로사이클일기, C1-24 알킬기, C2-24 알켄일기, C2-24 알킨일기, 3-원 내지 10-원의 사이클로알킬기, 하이드록시기, 나이트로기, 및 옥소기로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이며,
    상기 헤테로 원자는 각각 독립적으로, O, N 및 S로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상이다).
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