KR102238718B1 - 폴리알킬렌 산화물 발레르산염 헤모글로빈 접합체 - Google Patents

Abstract

요약
본 발명은 전반적으로, 헤모글로빈의 일차 아민과 N 말단 발린에 숙신이미딜-발레르산염 활성화된 폴리에틸렌 글리콜의 접합에 의해 만들어진 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 접합된 헤모글로빈에 관계한다.

Description

폴리알킬렌 산화물 발레르산염 헤모글로빈 접합체{POLYALKYLENE OXIDE VALERATE HEMOGLOBIN CONJUGATES}

발명의 분야

본 발명은 일반적으로, 폴리알킬렌 산화물 (PAO) 헤모글로빈 접합체에 관계한다. 더욱 특정하게는, 본 발명은 향상된 안정성을 갖는 PAO 헤모글로빈 접합체, 이런 접합체를 내포하는 제약학적 조성물, 그리고 이들 접합체를 합성하고 이용하기 위한 방법에 관계한다.

발명의 배경

헤모글로빈-기초된 산소 담체 ("HBOC")는 헴에 의한 산화질소 (NO) 스캐빈징에 기인된 혈관수축과 오랫동안 연관되었다. 산소 치료제 (때때로, "산소-운반 혈장 증량제"로서 지칭됨), 예를 들면, 안정된 헤모글로빈 (Hb)으로서 유용한 산소 담체는 제한된 효능을 갖는 것으로 나타났는데, 그 이유는 이들이 산화질소를 스캐빈징하고, 혈관수축과 고혈압을 유발하기 때문이다. 혈관수축을 유발하는 이들 산소 운반 용액의 성향은 동물과 인간에서 고혈압으로서 현성할 수 있다. 비록 HBOC의 혈관수축 효과의 근원적인 기전이 충분히 이해된 것은 아니지만, 헴 철은 강력한 혈관확장제인 내인성 NO와 급속히 및 비가역적으로 합동하고, 따라서 혈관수축을 유발할 수 있는 것으로 제안되었다.

부분적으로 이들 혈관수축 효과 때문에, 비록 변형된 무세포 Hb를 포함하는 산물이 가장 유망하긴 하지만, 현재까지 어떤 산소 담체도 산소 치료적 작용제 (OTA)로서 완전하게 성공적이지는 못하였다. 비스-디브로모살리실-푸마르산염을 갖는 α-사슬 사이에 교차연결된 인간 Hb (ααHb)가 모델 적혈구 대용품으로서 미 육군에 의해 개발되었지만, 이것은 폐와 전신 혈관 저항에서 심각한 증가를 전시한 후에 포기되었다 (Hess, J. et al., 1991, Blood 78:356A). 이러한 산물의 상업적인 이형 역시, 실망스러운 3 단계 임상 시험 후에 포기되었다 (Winslow, R. M., 2000, Vox Sang 79:1-20).

Hb의 NO 결합 활성을 극복하려는 시도에서 2가지 분자 접근법이 진행되었다. 첫 번째 접근법은 감소된 NO-결합 친화성을 갖는 재조합 헤모글로빈을 창출하는 시도에서 원위 헴 주머니의 특정 부위 돌연변이유발을 이용하였다 (Eich, R.F. et al., 1996, Biochem. 35:6976-83). 두 번째 접근법은 화학적 변형 접근법을 이용하였는데, 여기서 Hb의 크기는 혈관 공간으로부터 간질성 공간 내로 Hb의 혈관외유출을 감소시키거나 또는 가능하면 완전하게 저해하는 시도에서 올리고머화를 통해 증강되었다 (Hess, J.R. et al., 1978, J. Appl. Physiol. 74:1769-78; Muldoon, S.M. et al., 1996, J. Lab. Clin. Med. 128:579-83; Macdonald, V.W. et al., 1994, Biotechnology 22:565-75; Furchgott, R., 1984, Ann. Rev. Pharmacol. 24:175-97; 그리고 Kilbourne, R. et al., 1994, Biochem. Biophys. Res. Commun. 199:155-62).

실제로, NO에 대한 감소된 연관 결합 비율을 갖는 재조합 Hb가 생산되었는데, 이것은 최고 부하 쥐 실험에서 덜 고혈압성이다 (Doherty, D.H. et al. 1998, Nature Biotechnology 16:672-676 및 Lemon, D.D. et al.1996, Biotech 24:378). 하지만, 연구는 NO 결합이 Hb의 혈관활성에 대한 유일한 설명이 아닐 수도 있다는 것을 암시한다. 일정한 큰 Hb 분자, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)로 변형된 것들은 비록 그들의 NO 연관률이 심하게 고혈압성 ααHb의 것들과 동일하지만, 혈관수축이 사실상 없는 것으로 밝혀졌다 (Rohlfs, R.J. et al.1998, J Biol. Chem. 273:12128-12134). 게다가, PEG-Hb는 출혈에 앞서 교환 수혈로서 제공될 때 출혈의 결과를 예방하는데 월등히 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Winslow, R.M. et al. 1998, J. Appl. Physiol. 85:993-1003).

Hb에 PEG의 접합은 이의 항원성을 감소시키고 이의 순환 반감기를 연장한다. 하지만, PEG 접합 반응은 Hb 사합체의 αβ-이합체 아단위의 해리를 유발하여, 40,000 달톤 ("Da") 아래의 Hb 단위체 단위의 PEG-접합체를 받는 교환-수혈된 쥐에서 육안적 혈색소뇨증을 야기하는 것으로 보고되었다 (Iwashita and Ajisaka Organ-Directed Toxicity: Chem. Indicies Mech., Proc. Symp., Brown et al. 1981, Eds. Pergamon, Oxford, England pgs 97-101). 84,000 달톤보다 큰 분자량을 갖는 폴리알킬렌 산화물 ("PAO") 접합된 Hb가 Enzon, Inc. (U.S. 특허 번호 5,650,388)에 의해 제조되었는데, 이것은 α와 ε-아미노 기에서 Hb에 연결된 PEG-5,000 사슬의 약 10개 사본을 운반하였다. 이러한 정도의 치환은 포유동물에서 혈색소뇨증과 연관된 임상적으로 유의미한 신독성을 방지하는 것으로 설명되었다. 하지만, 이러한 접합 반응은 비균질성 접합체 개체군을 유발하고, 그리고 칼럼 크로마토그래피에 의해 제거되어야만 하는 다른 바람직하지 않은 반응물질을 내포하였다.

PEG 접합은 전형적으로, 활성화된 PEG 모이어티와 생체분자의 표면 상에서 기능기의 반응을 통해 수행된다. 가장 흔한 기능기는 리신의 아미노 기, 히스티딘 잔기의 이미다졸 기, 그리고 단백질의 N 말단; 시스테인 잔기의 티올 기; 그리고 세린, 트레오닌과 티로신 잔기의 히드록실 기 및 단백질의 C 말단이다. PEG는 통상적으로, 히드록실 말단을 온화한 수성 환경에서 이들 기능기와 반응할 수 있는 반응성 모이어티로 전환함으로써 활성화된다. 치료적 생물약제의 접합에 이용된 가장 흔한 단일기능성 PEG 중에서 한 가지는 메톡시-PEG ("mPEG-OH")인데, 이것은 단지 하나의 기능기 (즉, 히드록실)를 갖고, 따라서 이중기능성 PEG와 연관되는 교차연결과 응집 문제를 최소화한다. 하지만, mPEG-OH는 종종, 고분자량 이중기능성 PEG (즉, "PEG 디올")로 오염되는데, 이것은 생산 공정으로 인해 높게는 10 내지 15% 범위에서 변할 수 있다 (Dust J.M. et al. 1990, Macromolecule 23:3742-3746). 이러한 이중기능성 PEG 디올은 원하는 단일기능성 PEG의 크기의 거의 2배이다. 오염 문제는 PEG의 분자량이 증가함에 따라서 더욱 악화된다. mPEG-OH의 순도는 특히, 페길화된 생체치료제의 생산에 결정적인데, 그 이유는 FDA가 최종 약물 산물의 생산 과정과 품질에서 높은 수준의 재현성을 요구하기 때문이다.

PAO에 Hb의 접합은 산소화된 상태와 탈산소화된 상태 둘 모두에서 수행되었다. U.S. 특허 번호 6,844,317은 결과의 PEG-Hb 접합체의 산소 친화성을 증강하기 위해 접합에 앞서 Hb를 대기와 평형시킴으로써, 산소화된 또는 "R" 상태에서 Hb를 접합하는 것을 설명한다. 다른 것들은 산소 친화성을 축소하고 구조적 안정성을 증가시켜, Hb가 화학적 변형, 정용여과 및/또는 무균 여과와 저온살균의 물리적 스트레스를 견뎌낼 수 있게 하기 위해 접합에 앞서 탈산소화 단계를 설명한다 (U.S. 특허 번호 5,234,903). Hb의 분자내 교차연결을 위해, 변형에 앞서 Hb를 탈산소화하는 것이 α-사슬의 리신 99를 교차연결 시약에 노출하는데 필요할 수도 있는 것으로 제안된다 (U.S. 특허 번호 5,234,903).

PEG와의 접합에 앞서 2-이미노티올란으로 Hb 티올화의 동역학이 Acharya 등 (U.S. 특허 번호 7,501,499)에 의해 조사되었다. 이미노티올란의 농도를, 사합체마다 평균 5개의 외인성 티올을 도입하는 10-배로부터 30-배로 증가시키는 것은 Hb 상에서 외인성 티올의 숫자를 거의 배증하는 것으로 관찰되었다. 하지만, PEG 접합 후에 목격된 크기 증강은 심지어 2배 숫자의 티올에서도 단지 최저이었다. 이것은 20-배 몰 과잉의 말레이미딜 PEG-5000의 존재에서 접합 반응이 덜 반응성 티올로 Hb의 표면을 덮고, 더욱 반응성 티올로 Hb의 추가 변형을 저항하는 입체 간섭을 유발한다는 것을 제안하였다. 결과적으로, 변형된 Hb의 원하는 정도의 접합 (즉, Hb 분자당 6+1 PEG)을 달성하기 위해, Acharya 등은 Hb를 8-15 몰 과잉의 이미노티올란으로 티올화시키고, 그리고 이후, 티올화된 Hb를 16-30 배 몰 과잉의 말레이미딜 PEG-5000과 반응시켰다. 하지만, 대규모 생산에서 이들 높은 몰 과잉 반응물질 농도는 HBOC를 제조하기 위한 비용을 유의미하게 증가시키고 최종 산물의 이질성을 증가시킨다. 게다가, 이런 높은 몰 과잉의 말레이미딜 PEG-5000은 또한, 더욱 많은 숫자의 원치 않는 부반응물질의 생산으로 더욱 비균질성 산물을 유발한다.

이전 연구에서, 표면 변형된 헤모글로빈의 분자 크기는 신장에 의한 소실을 방지하고 원하는 순환 반감기를 달성할 만큼 충분히 커야 하는 것으로 관찰되었다. Blumenstein, J. 등은 이것이 84,000 달톤 ("Da")의 분자량에서, 또는 그 초과에서 달성될 수 있다는 것을 결정하였다 ("Blood Substitutes and Plasma Expanders," Alan R. Liss, editors, New York, N.Y., pages 205-212 (1978)). 상기 연구에서, 이들 저자는 변하는 분자량의 덱스트란을 Hb에 접합하였다. 이들은 Hb (64,000 Da의 분자량을 가짐)와 덱스트란 (20,000 Da의 분자량을 가짐)의 접합체가 "순환으로부터 천천히 및 신장을 통해 무시될 정도로 소실된다"는 것을 보고하였다. 게다가, 분자량을 84,000 Da 초과로 증가시키는 것은 이들 소실 곡선을 유의미하게 변경하지 않는 것으로 관찰되었다. 분자내 교차연결은 사합체성 헤모글로빈 단위의 아단위를 화학적으로 결합하여 신장에 의해 성급하게 배설되는 이합체의 형성을 예방한다 (가령, U.S. 특허 번호 5,296,465를 참조한다).

폴리알킬렌 산화물을 헤모글로빈에 결합하기 위해, 중합체의 말단 단부-기가 먼저 "활성화되어" (즉, 반응성 기능기로 전환됨), "활성화된 폴리알킬렌 산화물"을 형성해야 한다. 과거에, PEG-OH가 PEG-할로겐화물, 메실레이트 또는 토실레이트를 제조하는데 이용되었는데, 이것은 이후, 수성 암모니아 (Hoffmann 반응), 아지드화나트륨 또는 칼륨 프탈이미드 (Gabriel 시약)으로 친핵성 이동 반응을 수행함으로써 PEG-아민으로 전환되었다. PEG-할로겐화물과 암모니아의 반응은 PEG-아민 ("PEG-NH₂")을 직접적으로 형성하는데 (참조: Zalipsky et al. Eur. Polym. J. 1983, 19:1177-1183), 이것은 이후, 일부 생물학적으로 활성 화합물에서 발견된 -COOH 기에 접합에 이용될 수 있었다.

더욱 최근에, PEG-NH₂가 중간물질로서 이용되었고 -COOH 이외의 기에 결합하도록 더욱 기능화될 수 있다. 예로서, PEG-NH₂는 술피드릴-활성화 기, 예를 들면, 말레이미드를 내포하도록 변형될 수 있다. U.S. 특허 6,828,401에서 개시된 반응에서, mPEG-말레이미드 (즉, 말레이미드가 부가된 메톡시-PEG, 또는 mPEG)는 mPEG-OH를 디클로로메탄 (유기 용매)에서 p-톨루엔술포닐 염화물 (토실화 작용제) 및 트리에틸렌아민 ("TEA", 염기 촉매제)와 반응시켜 mPEG-토실레이트를 생산함으로써 제조된다. 이러한 화합물은 이후, 28% 수성 암모니아와 반응되고, 이것은 이후, N, N-디메틸아세트아미드 ("DMAC")와 N-시클로헥실피롤리디논 ("CHP")의 유기 용매의 혼합물에서 말레산 무수물과 반응되어 말레암산 화합물을 생산한다. 이러한 화합물은 이후, 디클로로메탄과 디메틸 포름아미드 ("DMF")의 유기 용매 혼합물에서, 염기 촉매제, 예를 들면, 디에틸아닐린 ("DEA") 또는 디이소프로필에틸아민 ("DIEA")의 존재에서 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세트산염과 반응되어 mPEG-말레이미드를 생산한다. 하지만, 활성화된 PEG를 획득하기 위한 이러한 다단계, 다중시약 방법은 번거롭고 시간 소모적이다.

특정한 조건 하에 헤모글로빈의 아민 기에 결합하는 숙신이미딜-발레르산염 활성화된 PEG (SVA-PEG)를 이용하여 안정된, 균질한 PEG-헤모글로빈 접합체를 형성함으로써 PEG-헤모글로빈 접합체를 제조하기 위한 방법이 본원에서 개시된다.

발명의 요약

본 발명의 한 양상은 37 ℃와 pH 7.4에서 계측될 때 약 2 내지 약 30 mmHg 범위에서 변하는 P50을 갖는 PAO 헤모글로빈 접합체에 관계한다. PAO는 헤모글로빈 분자 상에서 아미노산 측쇄의 아미노 반응성 모이어티를 통해 공유 부착된다. 아미노 반응성 모이어티는 -C(O)-(CH₂)_p-에 의해 PAO에 연결되고, 여기서 p는 1 내지 약 20의 정수이다. 헤모글로빈은 임의선택적으로 분자내-교차연결된다.

본 발명의 다른 양상은 다음의 구조를 갖는 PAO 헤모글로빈 접합체에 관계하고

여기서 Hb는 헤모글로빈이고, L은 링커 -C(O)-(CH₂)_p-이고, N은 헤모글로빈의 아미노 기이고, X는 말단기이고, m은 헤모글로빈에 접합된 활성화된-PEG 중합체의 평균 숫자이고, n은 약 2,000 내지 약 20,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 숫자이고, 그리고

p는 1 내지 20의 정수이다.

본 발명의 또 다른 양상은 헤모글로빈을 최소한 하나의 PAO 중합체와 반응시키는 것을 포함하는 과정에 의해 제조된 PAO 헤모글로빈 접합체에 관계한다. PAO 중합체는 다음 구조를 갖는다:

여기서 R은 아미노 반응성 모이어티이고, L은 링커 -C(O)-(CH₂)_p-이고, X는 말단기이고, n은 약 2,000 내지 약 20,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 숫자이고, 그리고 p는 1 내지 20의 정수이다.

본 발명의 또 다른 양상은 상기 헤모글로빈 접합체 중에서 한 가지 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물에 관계한다. 조성물은 급성 간부전, 베타 지중해빈혈, 화상, 만성 결정적 하지 허혈, 이산화탄소 또는 시안화물 중독, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 울혈성 심부전, 저산소증, 말라리아, 장기 허혈, 말초 혈관 질환, 포르피린증, 임신 동안 전자간증, 패혈증, 겸상 적혈구병, 망막 질환, 안구내 질환, 고환 꼬임, 외상, 쇼크, 외상성 뇌 손상, 궤양, 혈관경축, 또는 이들의 조합의 치료에서 이용될 수 있다. 조성물은 또한, 혈관형성술에 대한 보조약으로서, 성형 수술에 대한 보조약으로서, 또는 심실 보조 기구를 이식하는데 있어서 보조약으로서; 혈액 대체제, 심장보호제, 냉동보존제, 혈액투석 보조약, 종양학 작용제, 장기 보존제, 성능 증강 작용제, 수술 보조약, 또는 상처 치유 작용제로서; 영상에서; 폐 기능을 향상시키기 위해; 또는 이들의 조합을 위해 이용될 수 있다. 조성물은 또한, 손상, 용혈성 빈혈, 감염성 빈혈, 세균 감염, 인자 IV 단편화, 과다비장화와 비장비대, 가금류에서 출혈성 증후군, 저형성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 특발성 면역 용혈 상태, 철 결핍, 동종면역 용혈성 빈혈, 미세혈관병증 용혈성 빈혈, 기생증, 또는 외과적-마취 유도된 뇌 손상, 또는 이들의 조합으로 인한 혈액의 상실의 수의학적 치료를 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양상은 이런 헤모글로빈 접합체 또는 제약학적 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하는 치료의 방법에 관계한다. 상기 방법은 앞서 설명된 질환 중에서 임의의 한 가지 또는 그 이상의 치료를 위한 것이다.

본 발명의 다른 양상은 산소, 산화질소, 일산화탄소 또는 이들의 혼합물을 조직에 전달하고, 그리고 미세혈관계에서 아질산염을 산화질소 (NO)로 환원시키는 방법에 관계한다. 상기 방법은 앞서 설명된 바와 같은 헤모글로빈 접합체 또는 제약학적 조성물 중에서 한 가지를 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함한다. 투여 이후에, 헤모글로빈 내에 비리간드 헴은 미세혈관계에서 아질산염을 산화질소로 전환한다.

본 발명의 또 다른 양상은 헤모글로빈을 다음 구조를 갖는 PAO 중합체와 반응시키는 것을 포함하는 헤모글로빈 접합체를 제조하기 위한 방법에 관계한다:

여기서 R은 아미노 반응성 모이어티이고, L은 링커 -C(O)-(CH₂)_p-이고, X는 말단기이고, n은 약 2,000 내지 약 20,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 숫자이고, 그리고 p는 1 내지 20의 정수이다.

다른 목적과 특질은 부분적으로 명백하고, 그리고 부분적으로 아래에 지적될 것이다.

도면의 간단한 설명
도면 1은 메톡시 PEG 숙신이미딜 발레르산염 (mPEG-SVA)을 출발 물질로서 이용하여 아민 페길화된 헤모글로빈을 제조하기 위한 예시적인 방법의 흐름도를 묘사하고, 여기서 R₁, R₂와 R₃은 헤모글로빈 주요 사슬의 부분이다.
도면 2는 (1) p-니트로페닐 탄산염-PEG (NPC-PEG), (2) 숙신이미딜탄산염-PEG (SC-PEG), (3) 말레이미드-PEG (Mal-PEG), 그리고 (4) 숙신이미딜 발레르산염-PEG (SVA-PEG)에 대한 화학적 구조와 결합 길이를 묘사하고, 여기서 화살표는 활성 기로부터 PEG 중추의 거리를 보여준다.
도면 3은 Mal-PEG (위쪽), SVA-PEG (중앙)와 SC-PEG (아래쪽)에 대한, 헤모글로빈을 갖는 연쇄 및 PEG 중추 사이에 거리를 묘사한다.
도면 4는 MP4 (적색)와 버팀질-없는 헤모글로빈 (SFH) (녹색)과 비교하여, SVA-PEG-Hb (청색)의 비-해리 조건 하에 크기-배제 크로마토그램 (LC)이다.
도면 5는 40 ℃에서 최대 1 개월 동안 가속된 보관 조건 하에 MP4CO (위쪽)와 비교하여, SVA-PEG-Hb (SP4CO, 아래쪽)의 높은-염, 해리 조건 (0.9M MgCl₂) 하에 크기-배제 크로마토그램 (LC)이다.
도면 6은 32 ℃에서 9 일 동안 가속된 보관 조건 하에 NPC-PEG-Hb (NP4CO, 위쪽)와 비교하여, SVA-PEG-Hb (SP4CO, 아래쪽)의 높은-염, 해리 조건 하에 LC이다.
상응하는 참고 문자는 도면 전역에서 상응하는 부분을 지시한다.

바람직한 구체예의 설명

본 발명의 폴리알킬렌 산화물 헤모글로빈 접합체, 그리고 이들의 제약학적 조성물은 해리 조건 하에 LC에 의해 관찰된 더욱 높은 분자량 성분의 형성에 대항하여 또는 헤모글로빈으로부터 PAO의 분리에 대항하여 장기와 단기 보관 안정성에 대하여 공지된 산소 또는 비산소화된 헤모글로빈 치료제와 비교하여 증강된 안정성을 전시한다. 이들은 또한, 공지된 산소 또는 비산소화된 헤모글로빈 치료제보다 더욱 균질하다. 이들 접합체는 또한, 공지된 헤모글로빈 치료제를 만드는데 필요한 반응 시간과 비교하여 짧은 반응 시간에서 온화한 조건 하에 단순한, 일-단계 반응을 통해 만들어질 수 있다.

임의의 특정 이론에 한정됨 없이, 헤모글로빈과 PAO 사이에 발레르산염 링커는 증강된 안정성을 유발하는 것으로 생각된다. 발레르산염 링커의 결과로서 PAO 및 헤모글로빈 분자에 연쇄 사이에 거리는 다른 통상적인 링커, 예를 들면, p-니트로페닐 탄산염-PEG (NPC-PEG), 숙신이미딜탄산염-PEG (SC-PEG), 그리고 말레이미드-PEG (MalPEG)의 것보다 크다. 헤모글로빈 연쇄로부터 PAO까지 약 8.8 옹스트롬의 이러한 더욱 큰 이격은 PAO-헤모글로빈 결합을 안정시키는 것으로 보인다.

본 발명은 37 ℃와 pH 7.4에서 계측될 때 약 2 내지 약 30 mmHg 범위에서 변하는 P50을 갖는 PAO 헤모글로빈 접합체에 관계한다. PAO는 헤모글로빈 분자 상에서 아미노산 측쇄에 아미노 반응성 모이어티를 통해 공유 부착된다. 아미노 반응성 모이어티는 -C(O)-(CH₂)_p-에 의해 PAO에 연결되고, 여기서 p는 1 내지 약 20, 바람직하게는 1 내지 약 12, 더욱 바람직하게는 1 내지 약 8, 2 내지 약 6의 정수이고, 그리고 가장 바람직하게는 p는 4이다.

헤모글로빈은 임의선택적으로 분자내-교차연결된다. 더욱 특정하게는, 헤모글로빈은 당분야에서 공지된 전통적인 방법에 의해 β,β-분자내에-교차연결되거나 또는 α,α-분자내에-교차연결될 수 있다.

헤모글로빈이 β,β-분자내에-교차연결될 때, PAO 헤모글로빈 접합체의 P50은 바람직하게는 약 2 내지 15 mm Hg, 더욱 바람직하게는 약 2 내지 10 mm Hg, 그리고 가장 바람직하게는 약 7 mm Hg이다.

헤모글로빈이 α,α-분자내에-교차연결될 때, PAO 헤모글로빈 접합체의 P50은 바람직하게는 약 20 내지 30 mm Hg이다.

더욱 특정하게는, PAO 헤모글로빈 접합체는 다음 구조를 갖는다:

여기서 Hb는 헤모글로빈이고, N은 헤모글로빈의 아미노 기이고, L은 링커 -C(O)-(CH₂)_p-이고, X는 말단기이고, m은 헤모글로빈에 접합된 활성화된-PEG 중합체의 평균 숫자이고, n은 약 2,000 내지 약 20,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 숫자이고, 그리고 p는 1 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, 평균 분자량은 약 3,000 내지 약 10,000 달톤, 더욱 바람직하게는 약 4,000 내지 약 6,000 달톤, 그리고 가장 바람직하게는 약 5,000 달톤이다. 바람직하게는, m, 헤모글로빈에 접합된 활성화된-PEG 중합체의 숫자는 평균적으로, 헤모글로빈 사합체마다 약 6 내지 약 10의 범위에서 변하고, 그리고 바람직하게는 약 7 또는 8이다. 링커 -C(O)-(CH₂)_p-에서 에틸렌 단위 p의 숫자는 바람직하게는 1 내지 약 12, 더욱 바람직하게는 1 내지 약 8, 2 내지 약 6의 정수이고, 그리고 가장 바람직하게는 p는 4이다. 바람직한 PAO 헤모글로빈 접합체는 다음 구조를 갖는다:

여기서 Hb, N, X, m, 그리고 n은 상기 규정된 바와 같다.

본 발명의 PAO 헤모글로빈 접합체는 헤모글로빈을 최소한 하나의 PAO 중합체와 반응시키는 것을 포함하는 과정에 의해 제조될 수 있다. PAO 중합체는 다음 구조를 갖는다:

여기서 R은 아미노 반응성 모이어티이고, L은 링커 -C(O)-(CH₂)_p-이고, X는 말단기이고, n은 약 2,000 내지 약 20,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 숫자이고, 그리고 p는 1 내지 20의 정수이다. 바람직하게는, 평균 분자량은 약 3,000 내지 약 10,000 달톤, 더욱 바람직하게는 약 4,000 내지 약 6,000 달톤, 그리고 가장 바람직하게는 약 5,000 달톤이다. 링커 -C(O)-(CH₂)_p-에서 에틸렌 단위 p의 숫자는 바람직하게는 1 내지 약 12, 더욱 바람직하게는 1 내지 약 8, 2 내지 약 6의 정수이고, 그리고 가장 바람직하게는 p는 4이다. 바람직한 PAO 중합체는 다음 구조를 갖는다:

여기서 R, X, 그리고 n은 상기 규정된 바와 같다.

X는 PAO의 말단기이고, 그리고 히드록시, 아릴옥시, 예를 들면, 벤질옥시, 또는 C₁-C₂₀ 알콕시, 더욱 바람직하게는 C₁-C₁₀ 알콕시 기, 그리고 훨씬 바람직하게는 C₁-C₅ 알콕시 기, 예를 들면, 메톡시 또는 에톡시일 수 있다. 바람직하게는, X는 메톡시이다.

R은 헤모글로빈의 아미노 잔기와 반응할 임의의 아미노 반응성 모이어티, 예를 들면, 숙신이미딜 또는 p-니트로페닐일 수 있다. 바람직하게는, R은 숙신이미딜이다.

다양한 Hb가 본 발명에서 활용될 수 있다. Hb는 동물 공급원, 예를 들면, 인간, 소, 돼지, 또는 말 헤모글로빈으로부터 획득될 수 있다. 인간 Hb가 바람직하다. Hb는 자연 공급원으로부터 획득될 수 있거나 또는 재조합일 수 있다 (가령, 공지된 재조합 방법에 의해 생산된 바와 같이).

본 발명의 헤모글로빈은 약 2 내지 약 20 mmHg, 바람직하게는 약 2 내지 약 10 mmHg, 그리고 더욱 바람직하게는 7 mmHg 범위에서 변하는 높은 산소 친화성을 가질 수 있다.

헤모글로빈은 이합체로의 분리를 예방하고 신장에 의해 소실되는 것을 방지하여 순환 반감기를 연장하기 위해 분자내에 교차연결될 수 있다. Hb를 분자내에 교차연결하기 위한 다양한 방법이 당분야에서 공지된다. 화학적 교차연결 시약은 글루타르알데히드 (U.S. 특허 번호 7,005,414), 폴리알데히드 (U.S. 특허 번호 4,857,636), 디아스프린 (U.S. 특허 번호 4,529,719), 피리독실-5'-인산염 (U.S. 특허 번호 4,529,719) 트리메소일트리스 (메틸 인산염) (U.S. 특허 번호 5,250,665), 디알킨 (아지드 링커를 갖는 헤모글로빈과의 반응을 위해 Foot et al., Chem. Commun. 2009, 7315-7317; Yang et al., Chem. Commun. 2010, 46: 7557-7559를 참조한다)을 포함하고, 그리고 헤모글로빈은 재조합 방법을 통해 교차연결될 수 있다.

Β,β-DBBF 교차연결된 Hb는 Walder, Biochem, 1979: Vol 18 (20): 4265-70에 의해 기존에 설명된 바와 같이, 비스(3,5-디브로모살리실) 푸마르산염 (DBBF)으로 농축 적혈구로부터 제조된 버팀질-없는 헤모글로빈의 반응에 의해 제조될 수 있다. 예로서, 붕산염 완충액 (pH ~8.5)에서 산소화된 SFH는 약 2-8 ℃에서 약 16 시간 동안 2-배 몰 과잉의 DBBF와 반응될 수 있다.

본 발명의 헤모글로빈을 접합하는데 이용을 위한 폴리에틸렌 산화물에는 폴리에틸렌 산화물, 폴리프로필렌 산화물 및 폴리에틸렌/폴리프로필렌 산화물 공중합체가 포함되지만 이들에 한정되지 않는다. PAO는 약 2,000 내지 약 20,000 달톤, 바람직하게는 약 3,000 내지 약 10,000 달톤, 더욱 바람직하게는 4,000 내지 약 6,000 달톤, 그리고 가장 바람직하게는 약 5,000 달톤의 분자량을 갖는다. Hb의 표면을 변형하는데 현재 이용되는 가장 흔한 PAO는 약학적 허용가능성 및 상업적인 이용가능성으로 인해 PEG이다. PEG는 Hb에 접합된 PEG 분자의 숫자와 크기에 기초된 원하는 분자량을 달성하기 위해, 분자 내에 에틸렌 산화물 (즉, -CH₂CH₂O-)의 반복 아단위의 숫자에 기초된 다양한 분자량에서 가용하다.

PAO 중합체의 말단 단부 기 중에서 한쪽 또는 양쪽이 반응성 기능기로 전환된다 ("활성화된다"). 예로서, PEG-OH가 PEG-할로겐화물, 메실레이트 또는 토실레이트를 제조하는데 이용되었고, 이것은 이후, 수성 암모니아 (Zalipsky, S. et al., 1983, Eur. Polym. J. 19:1177-1183), 아지드화나트륨 또는 칼륨 프탈이미드로 친핵성 이동 반응을 수행함으로써 PEG-아민 ("PEG-NH₂")으로 전환된다. 활성화된 PEG는 이후, PEG 아민 기 (-"NH₂")와 헴 단백질의 카르복실 기 ("-COOH")의 상호작용을 통해 헴 단백질에 접합될 수 있다.

다른 분자의 부가에 의한 단백질의 변형을 허용하는 기능기를 내포하는 다수의 분자는 상업적으로 가용하다. 이들 분자, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 거기에 하나 또는 그 이상의 기능기를 부가함으로써 그들의 말단에서 통상적으로 활성화된다. 본원에서 이용된 바와 같이, PAO는 이것이 숙신이미딜 기, 또는 "숙신이미드"를 내포하도록 변형함으로써 활성화된다. 숙신이미드는 화학식 C₄H₅NO₂를 갖는 환상 이미드인데, 이것은 단백질의 서열 내에서 리신과 말단 발린에서 유리 아민과 반응성이다. 대조적으로, 말레이미드는 화학식 H₂C₂(CO)₂NH의 환상 불포화된 이미드인데, 이것은 시스테인 잔기에서 유리 술피드릴과 반응성이고, 그리고 정도가 덜하긴 하지만, 리신과 히스티딘 잔기에서 유리 아민과 또한 반응할 수 있다. 이들 숙신이미드는 발레르산염의 활성 에스테르로부터 안정된 이탈 기를 형성하고, 반면 이들 말레이미드는 술피드릴 기와 직접적으로 반응하여 공유 결합을 형성한다.

활성화된 PAO는 아민 반응성 모이어티를 PAO에 연결하는 스페이서를 포함한다. 스페이서는 바람직하게는, 이가 발레르산염 이온이다. 이런 활성화된 PAO는 상업적으로 가용하고, 그리고 예로서, 메톡시폴리 (에틸렌 글리콜) 숙신이미딜 발레르산염 (mPEG-SVA) ((Laysan Bio, Inc., Arab, AL)을 포함한다. 이런 기능적 PEG는 공지된 방법을 이용하여, 헤모글로빈의 표면 아미노산 측쇄, 예를 들면, 리신 잔기 또는 말단 발린 잔기에 접합될 수 있다.

PAO에 접합을 위한 아민 반응성 화학을 이용하여 변형될 수 있는 인간 Hb의 아미노산 잔기 측쇄의 무제한적 실례는 아래 표 1에서 제공된다:

[표 1]

변형의 아민 반응성 화학과 잠재적 부위

PAO-Hb의 분자량은 접합 반응에 의해 조절될 수 있다. 접합 과정을 위해 반응물질의 몰 비율을 증가시키는 것은 일반적으로, Hb에 결합된 PEG 분자의 숫자를 증가시킨다. 바람직하게는, Hb에 비하여 약 8-배 내지 약 20-배 몰 과잉의 활성화된 PAO가 접합 반응에서 이용된다. 더욱 바람직하게는, Hb에 비하여 10-배 몰 과잉의 활성화된 PAO, 예를 들면, mPEG-SVA가 이용된다.

헤모글로빈은 헤모글로빈이 Hb-PAO 접합체의 산소 친화성을 증가시키기 위해 산소화된 상태에 있을 때, 활성화된 폴리알킬렌 산화물로 접합된다.

헤모글로빈은 또한, 이것이 산소화된 상태에서 접합된 것에 비하여 산소 친화성을 낮추기 위해 탈산소화된 상태에 있을 때, 활성화된 폴리알킬렌 산화물로 접합될 수 있다.

SVA-페길화된 헤모글로빈은 상대적으로 짧은 반응 시간에서 일-단계 mPEG-SVA 접합 반응을 이용하여 제조될 수 있다. 한 구체예에서, 출발 물질, mPEG-SVA와 헤모글로빈은 약 7 내지 약 8.5의 pH에서 약 5 내지 약 15 ℃의 온도에서 약 1 내지 약 2 시간 동안 반응된다. PAO 중합체는 헤모글로빈 농도에 비하여 약 8-배 내지 약 20-배 몰 과잉, 바람직하게는 10-배의 농도에서 존재한다.

mPEG-Mal을 이용한 헤모글로빈의 페길화와 비교하여, 다음의 이점이 달성된다: 1) mPEG-Mal과 헤모글로빈의 반응의 부위의 숫자를 증가시키기 위한 별개의 티올화 반응이 필요하지 않다; 2) 결과의 접합체가 더욱 균질하고, 이것은 더욱 안정된 아미드 연쇄 및/또는 잔류 이미노티올란으로부터 불순물의 결여로부터 발생하는 것으로 생각된다; 3) 반응이 더욱 효율적이고, 따라서 반응 시간을 감소시킨다; 4) 헤모글로빈 내에 선천적 β93 시스테인 모이어티가 보존되고, 이것은 차례로, 헴 안정성을 증강한다; 5) 그리고, 발레르산염 연쇄가 더욱 안정되고, 이것은 숙신이미드 기와 PEG 중합체 사이의 거리에서 3.5 옹스트롬에서 8.8 옹스트롬으로 증가로부터 발생하는 것으로 생각된다.

본 발명의 헤모글로빈 접합체는 산소화된 또는 탈산소화된 형태일 수 있거나, CO 또는 NO에 리간드화될 수 있거나, 또는 이들 4가지 형태 중에서 2가지 또는 그 이상을 포함하는 혼합물일 수 있다. HbO₂는 비산소화된 헤모글로빈을 공기, 순수한 O₂ 가스 또는 O₂ / 질소 가스 혼합물로 평형시킴으로써 제조된다.

탈산소화는 당분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 한 가지 단순한 방법은 헤모글로빈 용액을 불활성 가스, 예를 들면, 질소, 아르곤 또는 헬륨에 노출시키는 것이다. 탈산소화가 상대적으로 균질하다는 것을 확실하게 하기 위해, Hb 용액은 이러한 과정에서 순환된다. 원하는 수준을 획득하기 위해 탈산소화를 모니터링하는 것은 Co-산소측정기 682 (Instrument Laboratories)를 이용함으로써 수행될 수 있다. 부분적인 재산소화가 요망되면, 탈산소화된 Hb는 산소 또는 산소를 내포하는 가스 혼합물, 예를 들면, 공기에 노출될 수 있다.

분자 산소를 다른 가스로 대체하는 가스 교환은 가스-투과막, 예를 들면, 폴리프로필렌 또는 셀룰로오스 아세트산염 막을 통해 달성될 수 있다. 가령, 공개된 U.S. 특허 출원 번호 2006/0234915를 참조한다. 이들 막을 활용하는 상업적으로 가용한 가스-교환 장치는 Hoechst-Celanese (Dallas, TX)로부터 Celgard^TM 폴리프로필렌 미소다공성 중공 섬유 장치 또는 American Laboratory (East Lyme, CT)로부터 Cell-Pharm^TM 중공 섬유 산소공급기를 포함한다. Hoechst-Celanese Celgard^TM 장치에서, 산소화된 Hb는 수성 Hb 용액을 10-100 ml/분/ft²에서 폴리프로필렌 미소다공성 속이 빈 필터를 통해 통과시킴으로써 탈산소화되고, 이때 상기 시스템은 5-20 psi에서 질소로 일소된다. Hb는 일반적으로, 데옥시Hb의 원하는 백분율을 달성하기 위해 약 5 내지 30 분 동안 순환된다. 탈산소화된 Hb를 생산하기 위한 다른 방법은 Hb 용액을 화학적 환원제, 예를 들면, 아스코르브산나트륨, 나트륨 이티온산염 및 아황산수소나트륨에 노출하는 것을 포함한다. Hb는 환원제 농도, 반응 시간과 온도를 조정함으로써 부분적으로 탈산소화된다. 대안으로, 환원제가 Hb를 실제적으로 탈산소화하는데 이용될 수 있고, 그리고 이후, 부분적으로 탈산소화된 산물을 형성하기 위해 산소가 재도입될 수 있다. 예로서, Hb는 항산화제를 첨가하기에 앞서 약 1 시간 동안 100 mM 농도의 아황산수소나트륨에 노출될 수 있다.

Hb는 O₂를 CO로 단순히 대체함으로써, 산소혈색소를 형성하기 위한 임의의 공지된 방법을 이용하여 CO에 리간드화될 수 있다. 이것은 일반적으로, 헤모글로빈이 O₂ 대신에 CO로 리간드화되도록, CO의 공급원을 헤모글로빈의 용액에 도입하는 것을 수반한다 (K. D. Vandegriff, et al., Biochem. J. 382:183-189 (2004)). 헤모글로빈이 산소에서보다 CO에 대해 더욱 높은 친화성을 갖기 때문에, 헤모글로빈을 먼저 탈산소화하는 것이 필요하지 않다. 따라서, CO-Hb 복합체를 형성하는 가장 편의한 방식은 100% 가스성 CO를 헤모글로빈의 용액에 도입하는 것이다.

HbNO는 탈산소화된 헤모글로빈을 산화질소 가스와 반응시킴으로써, 또는 NO가 CO를 교체하도록 CO-Hb를 NO 가스에 노출함으로써 제조될 수 있다. HbNO는 또한, 탈산소화된 헤모글로빈을 작은 NO-공여자 분자, 예를 들면, PROLI NONOate™ (즉, 1-(히드록시-NNO-아족시)-L-프롤린, 이나트륨 염; Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan)과 반응시킴으로써 만들어질 수 있다. NO, 유리 라디칼이 글로빈 사슬 내에 아미노산 측기에 결합되는 헤모글로빈은 본원에서 규정된 바와 같은 NO-Hb 복합체가 아닌 것으로 유의되어야 하는데, 그 이유는 이런 화합물이 산소 대신에, 헴 주머니 내에 리간드로서 이원자 (비이온성) NO를 내포하지 않기 때문이다. 예로서, 선천적 헤모글로빈이 이것이 유리 술피드릴 기에 결합하도록 유발하는 조건 하에 NO 공여자에 노출될 때, 니트로실헤모글로빈이 형성된다 (U.S. 특허 번호 6,627,738). 이런 니트로실헤모글로빈은 산소를 여전히 운반하고, 반면 본 발명의 NO-Hb 복합체는 그렇지 않다. 게다가, 변형된 헤모글로빈이 앞서 설명된 바와 같은 술피드릴 모이어티에 관계하는 반응에 의해 형성될 때, 이들 모이어티는 NO 결합에 더 이상 가용하지 않다.

본 발명의 PAO-Hb 접합체는 비경구 투여를 위한 제약학적으로 허용되는 담체, 예를 들면, 수성 희석제에서 PAO-Hb 접합체를 포함하는 제약학적 조성물로서 조제될 수 있다. 담체에서 PAO-Hb 접합체의 농도는 적용에 따라 변할 수 있다. 바람직하게는, PAO-Hb 접합체 농도는 약 0.1 g/dl 내지 약 10 g/dl, 더욱 바람직하게는 약 2.0 g/dl 내지 약 8.0 g/dl, 그리고 가장 바람직하게는 약 4.0 내지 약 6.0 g/dl 범위에서 변한다. 헤모글로빈의 적절한 농도의 선별은 최종 헤모글로빈 산물의 콜로이드성 삼투성 (온코틱) 성질에 의존한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 전혈과 비교하여 정상-온코틱 또는 혈장과 비교하여 과다온코틱이다. 헤모글로빈 농도는 각 징조에 대한 원하는 콜로이드 삼투압을 획득하기 위해 조정될 수 있다.

조성물이 비경구제로서 조제될 때, 용액은 일반적으로, 전혈과 등삼투압인 생리학적으로 양립성 전해질 담체를 포함하고, 이것은 헤모글로빈의 가역성 산소-, CO- 또는 NO-운반과 전달 성질을 유지시킨다.

제약학적으로 허용되는 담체는 수성 희석제일 수 있다. 수성 희석제는 콜로이드의 수성 용액 또는 비-산소 운반 성분의 수성 용액, 예를 들면, 단백질, 예를 들면, 알부민의 수성 용액, 당단백질의 수성 용액, 다당류의 수성 용액, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 수성 희석제는 수성 무세포 용액을 포함할 수 있다.

적합한 수성 희석제에는 생리 식염수, 식염수-글루코오스 혼합물, 링거액, 젖산 링거액, Locke-링거액, Krebs-링거액, Hartmann의 균형 식염수, 헤파린화된 구연산나트륨-구연산-덱스트로스 용액, 아세트산염 용액, 복수 전해질 용액 (가령, Baxter International, Deerfield, IL로부터 Plasma Lyte® 또는 Plasma Lyte-A®), 락토비오네이트 용액, 그리고 중합성 혈장 대용제, 예를 들면, 폴리에틸렌 산화물, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 에틸렌 산화물-프로필렌 글리콜 응축물, 또는 이들의 조합이 포함되지만 이들에 한정되지 않는다.

조성물은 제약학적으로-허용되는 충전제, 염, 그리고 당분야에서 널리 공지된 다른 물질을 부가적으로 포함할 수 있고, 이들의 선별은 약형, 치료되는 질환, 당업자의 결정에 따라 달성되는 특정 목적 및 이런 첨가제의 성질에 의존한다. 예로서, 조성물은 생리학적 완충액, 탄수화물 (가령, 글루코오스, 만니톨, 또는 소르비톨), 알코올 또는 다가알코올, 제약학적으로 허용되는 염 (가령, 나트륨 또는 칼륨 염화물), 계면활성제 (가령, 폴리소르베이트 80), 항산화제, 항세균제, 콜로이드 삼투압 작용제 (가령, 알부민 또는 폴리에틸렌 글리콜) 또는 환원제 (가령, 아스코르빈산, 글루타티온, 또는 N-아세틸 시스테인)을 포함할 수 있다.

이들 제약학적 조성물은 최소한 약 2 센티푸아즈 (cP)의 점성을 갖는다. 더욱 특정하게는, 점성은 약 2 내지 약 5 cP, 그리고 특히 약 2.5 내지 약 4.5 cP 범위에서 변한다.

투여 시에 합병증을 방지하기 위해, 제약학적 조성물은 높은 순도를 갖는다, 다시 말하면, 버팀질, 인지질, 그리고 발열원이 없고, LAL (리뮬러스 유주세포 용해물) 검사에 의해 계측될 때 0.25 EU/ml 이내의 내독소 수준을 갖고, 그리고 8%보다 적은 메트헤모글로빈을 갖는다.

제약학적 조성물은 비경구, 예를 들면, 피하, 정맥내, 또는 근육내 주사에 의해, 또는 큰 부피 비경구 용액으로서 투여될 수 있다. 조성물은 또한, 위관영양에 의해 투여될 수 있다.

치료적 작용제로서 헤모글로빈 접합체의 전형적인 분량은 환자 체중의 킬로그램당 약 1 내지 약 15,000 밀리그램의 헤모글로빈일 수 있다. 예로서, 산소 치료제로서 이용될 때, 용량은 100 내지 7500 mg/kg 환자 체중, 더욱 바람직하게는 500 내지 5000 mg/kg 체중, 그리고 가장 바람직하게는 700 내지 3000 mg/kg 체중 범위에서 변할 것이다. 따라서, 인간 환자에 대한 전형적인 분량은 1 그램 내지 1000 그램 초과일 수도 있다. 각 약형의 개별 분량에서 내포된 활성 성분의 단위 함량은 그 자체로 효과량을 구성할 필요가 없는 것으로 인지될 것인데, 그 이유는 필요한 효과량이 다수의 개별 분량의 투여에 의해 도달될 수도 있기 때문이다. 용량의 선별은 활용된 약형, 치료된 질환, 그리고 당업자의 결정에 따라 달성되는 특정 목적에 의존한다.

PAO-Hb 접합체와 제약학적 조성물은 산소, CO 및/또는 NO를 개체에 전달하는데 이용될 수 있다. 산소, 산화질소, 일산화탄소 또는 이들의 혼합물을 조직에 전달하고 아질산염을 환원시켜 미세혈관계에서 추가의 내인성 산화질소 (NO)를 생산하는 방법은 헤모글로빈 접합체 또는 상기 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 투여 이후에, 헤모글로빈은 비리간드화되고 미세혈관계에서 아질산염을 산화질소로 전환한다.

본 발명의 헤모글로빈 접합체와 조성물은 다음과 같이 이용될 수 있다: 급성 간부전, 베타 지중해빈혈, 화상, 만성 결정적 하지 허혈, 이산화탄소 또는 시안화물 중독, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD) (가령, 급성 악화), 울혈성 심부전 (가령, 급성 심부전, 만성 심부전), 저산소증 (가령, 폐부종, 감압병을 비롯한 고지 이용), 말라리아 (가령, 대뇌 말라리아 (팔시파룸 폐쇄성 이벤트), 장기 허혈 (가령, 급성 장 허혈 (염전), 급성 장 허혈 (색전증), 심장성 쇼크, 급성 혈관 장기 허혈, 뇌졸중 (CAT 스캔 이전), 뇌졸중 (CAT 스캔 이후), 심근 경색 / 심각한 심장 허혈), 말초 혈관 질환, 포르피린증, 임신 동안 전자간증, 패혈증, 겸상 적혈구병 (가령, 뇌졸중/일과성 허혈 발작, 비장 격리, 간 격리, 지속발기증), 망막 질환 / 안구내 질환 (가령, 망막 중심 동맥 폐색, 중심 정맥 폐색), 고환 꼬임, 외상 / 쇼크 (가령, 외상성 출혈성 쇼크, 비외상성 출혈성 쇼크, 입원전 / 필드 이용 (군용 / 응급), 외상성 뇌 손상 / 모구), 궤양, 또는 혈관경축을 치료하기 위해; 혈관형성술에 대한 보조약으로서, 성형 수술에 대한 보조약 (피부판)으로서 (가령, 급성 치료, 만성 치료), 또는 심실 보조 기구를 이식하는데 있어서 보조약으로서; 혈액 대체제 (가령, 급성 혈액 상실, 여호와의 증인, 교차적합이 어려운 환자, 희귀한 혈액형, 겸상 골수무형성 위기, 겸상 적혈구성 빈혈 수술전후 관리, 급성 용혈성 빈혈 (자가면역), 급성 용혈성 빈혈 (독소), 또는 다른 난치성 빈혈), 심장보호제, 냉동보존제, 혈액투석 보조약, 종양학 작용제 (가령, 방사선요법 또는 화학요법, 고형 종양에 대한 보조약), 장기 보존제 (가령, 탈체, 공여자에서, 수용자에서), 성능 증강 작용제 (가령, 민간 / 운동, 군용), 수술 보조약 (가령, 심폐 우회로 (주요), 심폐 우회로 (조정), 폐 허혈, 수술전 조건화, 파열된 대동맥류, 흉부대동맥 (절개 또는 동맥류)의 대체)으로서, 또는 상처 치유 작용제로서; 영상 (x-선 또는 자기 공명 영상법 (MRI))에서; 폐 기능 (가령, 급성 폐 손상, 만성 폐 손상, 일시적인 바이러스성 폐렴, 신생아 곤란 증후군)을 향상시키기 위해; 또는 이들의 조합. 이런 이용은 치료가 필요한 개체에 상기 접합체 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

게다가, 본 발명의 헤모글로빈과 조성물은 비외상성 출혈성 쇼크, 입원전 세팅 외상, 외상성 출혈성 쇼크, 급성 폐 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 고형 종양 암, 장기 분해 (탈체), 장기 분해 (수용자에서), 심각한 패혈증 / 패혈성 쇼크, 심근 경색 / 심장 허혈, 심장성 쇼크, 급성 심부전, 폐색전증, 수술에 의한 다양한 장애 (가령, 혈관형성술에 대한 보조약, 흉부 대동맥 수복에 대한 보조약, 심폐 우회로에 대한 보조약, 심폐 우회로에 대한 충진액), 또는 이들의 조합을 치료하는데 이용될 수 있다.

본 발명의 헤모글로빈과 조성물이 유용한 다양한 임상적 세팅은 다음을 포함한다:

외상. 전혈의 급성 상실은 피부와 소화관을 비롯한 낮은 우선권 장기로부터 멀리 혈액의 우회와 함께, 혈액의 상실된 부피를 대체하기 위한 간질성 공간과 세포내 공간으로부터 유체 이동을 유발할 수 있다. 장기로부터 멀리 혈액의 우회는 이들 장기에서 O₂ 수준을 감소시키고 때때로 제거하고, 그리고 진행성 조직 폐사를 유발한다. 주요한 목적은 영향을 받은 조직에 산소를 공급하는 것이다. 이러한 외상은 입원전 세팅에 있을 수 있거나 또는 외상성 출혈성 쇼크 또는 외상성 뇌 손상을 유발할 수 있다.

허혈. 접합체 및 이들의 조성물은 또한, 산소, CO, 및/또는 NO를 적혈구 또는 많은 다른 산소 치료제가 침투할 수 없는 구역으로 전달하는데 이용될 수 있다. 이들 구역은 적혈구 흐름에 폐색의 하류에 위치되는 임의의 조직 구역, 예를 들면, 혈전, 겸상 적혈구 폐색, 동맥 폐색, 혈관형성술 풍선, 외과 기구의 하류 구역, 그리고 산소 기아로 고통받고 있거나 또는 저산소인 임의의 조직을 포함할 수 있다. 예로서, 뇌졸중, 신생 뇌졸중, 일과성 허혈 발작, 기절 심근과 동면, 급성 또는 불안정 협심증, 신생 협심증, 경색, 기타 등등을 비롯한 모든 유형의 조직 허혈이 치료될 수 있다. 특히, 허혈을 유발하는 장애는 급성 심부전, 심장성 쇼크, 심근 경색 / 심장 허혈, 뇌졸중, 폐색전증, 비외상성 출혈성 쇼크, 또는 뇌혈관 외상을 포함한다.

혈액희석. 본 출원에서, 치료제는 제거된 자가 혈액의 O₂ 수준을 대체 (또는 교체)하기 위해 투여된다. 이것은 수술 동안과 후에 필요한 수혈을 위한 제거된 자가 혈액의 이용을 허용한다. 수술전 혈액 제거를 필요로 하는 이와 같은 한 가지 수술은 심폐 우회로 시술일 것이다.

패혈증 / 패혈성 쇼크. 패혈증에서, 일부 환자는 대량 유체 요법 및 혈관수축신경 작용제로 치료에도 불구하고 고혈압이 될 수 있다. 이러한 사례에서, 산화질소 (NO)의 과다생산은 낮아진 혈압을 유발한다. 이런 이유로, 헤모글로빈은 이들 환자의 치료를 위한 바람직한 작용제인데, 그 이유는 헤모글로빈이 높은 결합력으로 NO에 결합하기 때문이다.

저산소혈증. 환자가 폐렴 또는 췌장염에 의해 유발된 급성 폐 손상을 가질 때, 저산소혈증이 관찰될 수 있고, 그리고 영향을 받은 조직에 산소를 공급하기 위해 본 발명의 헤모글로빈 또는 조성물을 제공함으로써 경감될 수 있다.

암. 고형 종양 덩어리의 저산소 내부 코어에 O₂의 전달은 방사선요법과 화학요법에 대한 이의 감수성을 증가시킨다. 종양의 미세혈관계가 다른 조직의 미세혈관계와 다르기 때문에, O₂ 수준을 증가시키는 것을 통한 감작화는 O₂가 저산소 코어 내에 양하되는 것을 필요로 한다. 다시 말하면, P50은 O₂의 초기 양하를 예방하여 O₂ 수준을 증가시키고, 차후 방사선과 화학요법 치료에 종양의 최적 감작화를 담보하기 위해 매우 낮아야 한다.

수술. 본 발명의 헤모글로빈과 조성물은 다양한 외과 시술 동안 이용될 수 있다. 예로서, 이들은 혈관형성술, 흉부 대동맥 수복, 심폐 우회로 시술에 대한 보조약으로서 또는 심폐 충진액으로서 이용될 수 있다.

장기 관류. 장기가 탈체에서 또는 장기 기증 수용자에서 유지되는 시간 동안, O₂ 함량을 유지하는 것은 구조적 완전성과 세포 완전성을 보존하고 경색 형성을 최소화하는데 도움을 준다. 이들 헤모글로빈과 조성물은 이런 장기에 대한 산소 요건을 지속할 수 있다.

이들 헤모글로빈과 이들의 조성물은 또한, 비-인간, 예를 들면, 가축 (가령, 가축과 반려 동물, 예를 들면, 개, 고양이, 말, 조류, 파충류)에서 이용될 수 있다. 본 발명은 손상, 용혈성 빈혈 등으로 인한 혈액의 상실을 겪는 가축과 야생 동물의 응급 치료에서 유용성을 발견하는 것으로 예기된다. 수의학적 용도는 손상, 용혈성 빈혈, 감염성 빈혈, 세균 감염, 인자 IV 단편화, 과다비장화와 비장비대, 가금류에서 출혈성 증후군, 저형성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 특발성 면역 용혈 상태, 철 결핍, 동종면역 용혈성 빈혈, 미세혈관병증 용혈성 빈혈, 기생증, 또는 외과적-마취 유도된 뇌 손상으로 인한 혈액의 상실의 치료를 포함한다.

정의

단수 용어 ("one," "a" 또는 "an")가 본 발명에서 이용될 때, 이들은 달리 지시되지 않으면, "최소한 하나" 또는 "하나 또는 그 이상"을 의미한다.

본원에서 이용된 바와 같은 "활성화된 폴리알킬렌 산화물" 또는 "활성화된 PAO"는 최소한 하나의 기능기를 갖는 PAO 분자를 지칭한다. 기능기는 PAO로 접합되는 분자 상에서 유리 아민, 술피드릴 또는 카르복실 기와 상호작용하는 반응성 모이어티이다. 예로서, 유리 술피드릴과 반응하는 이와 같은 한 가지 기능기는 말레이미드 기이다. 유리 아민과 반응하는 기능기는 숙신이미드 기이다.

"탈산소혈색소" 또는 "비리간드 헤모글로빈"은 어떤 외인성 리간드도 헴에 결합되지 않은 임의의 헤모글로빈을 의미한다.

"헤모글로빈" 또는 "Hb"는 일반적으로, 산소를 운반하는 헴 단백질을 지칭한다. 인간에서, Hb의 각 분자는 4개의 아단위, 2 α-사슬 아단위 및 2 β-사슬 아단위를 갖고, 이들은 사합체성 구조에서 배열된다. 각 아단위는 또한, 1개의 헴 기를 내포하고, 이것은 제일철 (Fe²⁺)에서 리간드 O₂, NO 또는 CO에 결합하는 철-내포 중심이다. 따라서, 각 Hb 분자는 최대 4개의 리간드 분자에 결합하여, 각각 HbO₂, HbNO, 또는 HbCO 리간드화된 화합물을 만들 수 있다. 추가적으로, 헤모글로빈은 O₂, NO와 CO의 혼합물로 리간드화될 수 있다.

"헤모글로빈 기초된 산소 담체" (HBOCs)는 산소를 운반할 뿐만 아니라, 다른 분자 가스, 예를 들면, 일산화탄소와 산화질소를 운반하는데 유용한 헤모글로빈을 지칭한다.

"높은 산소 친화성"은 버팀질 없음-헤모글로빈 (SFH)의 것보다 큰 산소 친화성을 전시하도록 변형된 헤모글로빈을 지칭한다. 따라서, "높은 산소 친화성" Hb는 37 ℃와 pH 7.4에서 계측될 때 15 mmHg의 P50을 갖는 SFH의 것보다 적은 P50을 갖는다.

"리간드화된 헤모글로빈"은 외인성 리간드가 헴에 결합되는 헤모글로빈을 의미한다. 통상적인 바람직한 리간드는 산소, 일산화탄소, 그리고 산화질소를 포함한다.

"MalPEG"는 말레이미딜 폴리에틸렌 글리콜을 지칭하고, 그리고 링커를 거쳐 폴리에틸렌 글리콜에 부착된 말레이미딜 모이어티를 포함한다.

"MalPEG-Hb"는 말레이미딜-활성화된 PEG가 접합된 Hb를 지칭한다. 접합은 MalPEG를 Hb 상에서 티올 기 (및 정도가 덜하긴 하지만, 아미노 기)와 반응시켜 MalPEG-Hb를 형성함으로써 수행된다. 티올 기는 Hb의 아미노산 서열 내에 존재하는 시스테인 잔기, 예를 들면, βCys 93에서 2개의 내재성 티올에서 발견되고, 그리고 또한, 티올 기를 내포하도록 표면 아미노 기를 변형함으로써 도입될 수 있다. MP4 (Sangart, Inc.)로서 알려져 있는 예시적인 MalPEG-Hb는 다음의 화학식을 갖는다:

여기서 Hb는 헤모글로빈이고; S는 헤모글로빈 상에서 티올 기이고; n은 5,000-달톤 폴리알킬렌 산화물 중합체의 옥시에틸렌 단위의 숫자이고; 그리고 m은 헤모글로빈에 접합된 말레이미딜-활성화된 폴리알킬렌 산화물 중합체의 평균 숫자이고 7-8이다.

"메트헤모글로빈" 또는 "metHb"는 제이철 상태에서 철을 내포하는 Hb의 산화된 형태를 지칭한다. MetHb는 산소 또는 CO 담체로서 기능하지 않는다. 본원에서 이용된 바와 같은 용어 "메트헤모글로빈 %"는 전체 Hb에 대한 산화된 Hb의 백분율을 지칭한다.

"메톡시-PEG" 또는 "mPEG-OH"는 히드록실 말단의 수소가 메틸 (-CH₃) 기로 대체되는 PEG를 지칭한다.

"변형된 헤모글로빈" 또는 "변형된 Hb"는 Hb가 더 이상 "선천적" 상태에 있지 않도록, 화학 반응, 예를 들면, 분자내와 분자간 교차연결, 중합화, 접합, 및/또는 재조합 기술에 의해 변경된 Hb를 지칭한다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "헤모글로빈" 또는 "Hb"는 달리 지시되지 않으면, 선천적인 변형되지 않은 Hb와 변형된 Hb 둘 모두를 지칭한다.

"아질산염 환원효소 활성" 또는 "NRA"는 아질산염을 산화질소로 환원시키는 헤모글로빈 또는 헤모글로빈-기초된 단백질의 능력이다. "최대 아질산염 환원효소 활성"은 헤모글로빈 또는 헤모글로빈-기초된 단백질이 아질산염을 산화질소로 환원시킬 수 있는 최고 비율이다. "초기 아질산염 환원효소 활성"는 아질산염이 완전히 탈산소화된 단백질에 첨가될 때, 헤모글로빈 또는 헤모글로빈-기초된 단백질이 아질산염을 산화질소로 환원시키는 초기 비율이다.

용어 "비산소화된"은 헴 단백질 또는 헤모글로빈이 비-리간드화된, 탈산소화된 상태에 있거나, 또는 이것이 O₂ 이외의 가스, 예를 들면, NO 또는 CO로 리간드화된다는 것을 의미한다.

"산소 친화성"은 산소 담체, 예를 들면, Hb가 분자 산소에 결합하는 결합력을 지칭한다. 이러한 특징은 산소 평형 곡선에 의해 규정되는데, 이것은 Hb 분자의 포화도를 산소의 분압 (x축)에서 산소 (y축)와 관련시킨다. 이러한 곡선의 위치는 "P₅₀" 값에 의해 표시되는데, 이것은 산소 담체가 산소로 절반-포화되고, 그리고 산소 친화성에 역으로 관련되는 산소의 분압이다. 따라서, P₅₀이 더욱 낮을수록, 산소 친화성이 더욱 높다. 전혈 (및 전혈의 성분, 예를 들면, 적혈구와 Hb)의 산소 친화성은 당분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 계측될 수 있다. (가령, Winslow, R.M. et al., J. Biol. Chem. 1977, 252:2331-37을 참조한다). 산소 친화성은 또한, 상업적으로 가용한 HEMOX^TM 분석기 (TCS Scientific Corporation, New Hope, PA)를 이용하여 결정될 수 있다. (가령, Vandegriff and Shrager in "Methods in Enzymology" (Everse et al., eds.) 232:460 (1994)); 그리고 Vandegriff, et al., Anal. Biochem. 256(1): 107-116 (1998)을 참조한다).

본원에서 이용된 바와 같은 용어 "산소 치료적 작용제"는 치료가 필요한 세포/조직/장기에 결합하고 분자 산소를 이들에 운반할 수 있는 헴 단백질을 지칭한다. CO- 또는 NO-리간드화된 헴 단백질의 형태에서 투여될 때, 일단 CO 또는 NO가 헴 모이어티로부터 방출되면, 헴 기는 이후, 분자 산소에 자유롭게 결합하고 이를 운반한다.

"폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"는 일반 화학식 H(OCH₂CH₂)_n OH의 중합체를 지칭하고, 여기서 "n"은 4보다 크거나 또는 이와 동등하고, 바람직하게는 약 45 내지 약 500, 더욱 바람직하게는 약 70 내지 약 250, 그리고 가장 바람직하게는 약 90 내지 약 140, 또는 약 115이다. 중합체는 치환되거나 또는 치환되지 않을 수 있고, 그리고 말단 히드록시 기는 상이한 전통적인 말단기, 예를 들면, 메톡시 또는 카르복시로 대체될 수 있다. PEG는 많은 공급원 (가령, Carbowax^TM(Dow Chemical, Midland, MI), Poly-G® (Arch Chemicals, Norwalk, CT) 및 Solbase)으로부터 상업적으로 가용하다.

"폴리에틸렌 글리콜-접합된 헤모글로빈," "PEG-Hb 접합체" 또는 "PEG-Hb"는 최소한 하나의 PEG가 공유 부착되는 Hb를 지칭한다.

"용액"은 액체 혼합물을 지칭하고, 그리고 용어 "수성 용액"은 일부 물을 내포하고, 그리고 물과 함께 다중성분 용액을 형성하는 하나 또는 그 이상의 다른 액체 물질을 또한 내포할 수 있는 용액을 지칭한다.

"버팀질-없는 헤모글로빈" 또는 "SFH"는 적혈구 막이 제거된 Hb를 지칭한다.

"표면-변형된 헤모글로빈"은 화학적 기, 통상적으로 중합체, 예를 들면, 덱스트란 또는 폴리알킬렌 산화물이 부착된 헤모글로빈을 지칭한다. 용어 "표면-변형된 산소화된 헤모글로빈"은 표면 변형될 때, "R" 상태에 있는 Hb를 지칭한다.

"종점 활성"은 헴 단백질 또는 헤모글로빈의 반응성 기와 반응할 수 있는 모이어티로 기능화되는 PAO의 백분율의 표시이다. "100% 종점 활성"은 접합 반응에서 이용된 몰 과잉의 PAO가 모든 PAO가 헴 단백질 또는 헤모글로빈의 반응성 기와 반응할 수 있는 모이어티를 갖는다는 기초에서 표현된다는 것을 지시한다. 예로서, 가용한 Mal-PEG가 80%의 PEG가 Mal로 기능화되도록 80% 종점 활성을 갖고, 그리고 Mal-PEG가 헤모글로빈에 비하여 20-배 몰 과잉에서 이용되면, 이러한 몰 비율은 100% 종점 활성에 기초하여 헤모글로빈에 비하여 16-배 몰 과잉의 Mal-PEG로서 표현될 수 있다.

"티올화"는 분자 상에서 술피드릴 기의 숫자를 증가시키는 과정을 지칭한다. 예로서, 단백질을 2-이미노티올란 ("2-IT")과 반응시키는 것은 단백질의 표면 상에서 유리 아민을 술피드릴 기로 전환한다. 이들 술피드릴 기는 이후, 티올 반응성 모이어티, 예를 들면, 말레이미드와의 반응에 가용하다.

"비리간드 헤모글로빈"은 분자 가스, 예를 들면, 산소, 일산화탄소 또는 산화질소에 리간드화되지 않는 최소한 하나의 헴 모이어티를 내포하는 임의의 헤모글로빈을 지칭한다. 따라서, 헤모글로빈은 헴 모이어티의 단지 하나만 분자 가스에 리간드화되지 않는 경우에도 "비리간드"인 것으로 고려된다.

본원에서 이용된 바와 같은 용어 "SVA-PEG-Hb"는 mPEG-SVA가 접합된 Hb를 지칭한다.

본 발명이 상세하게 설명되었기 때문에, 변형과 변이가 첨부된 청구항에서 규정된 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 가능하다는 것은 명백할 것이다.

실시예

다음의 무제한적 실시예는 본 발명을 더욱 예증하기 위해 제공된다.

실시예 1 - SVA-PEG-Hb의 제조

농축 적혈구 ("RBCs")는 상업적인 공급원, 예를 들면, 지역 Blood Bank, New York Blood Center, 또는 American Red Cross로부터 입수된다. 물질은 수집의 시점으로부터 45 일 이내에 획득된다. 모든 단위는 이용에 앞서, 바이러스 감염에 대해 선별검사되고 핵산 시험에 종속된다. 비-백혈구고갈된 모아진 단위는 백혈구를 제거하는 막 여과에 의해 백혈구고갈된다. 농축 RBC는 무균 도관 내로 모아지고 추가 처리 때까지 2-15 ℃에서 보관된다. 부피는 기록되고, 그리고 Hb 농도는 상업적으로 가용한 co-산소측정기, 또는 다른 당분야에서 인정된 방법을 이용하여 결정된다.

RBC는 0.45-μm 접선 유동 여과를 이용하여 6 부피의 0.9% 염화나트륨으로 세척되고, 그 이후에 염의 농도를 감소시킴으로써 세포 용해가 이어졌다. Hb 추출은 동일한 막을 이용하여 수행된다. 세포 세척액은 알부민에 대한 분광측량 검정에 의해 혈장 성분의 제거를 실증하기 위해 분석된다. 용해물은 Hb를 정제하기 위해 차가운 상태에서 0.16-μm 막을 통해 처리된다. 정제된 Hb는 무균 탈발열원화된 도관에서 수집되고, 그리고 이후 바이러스를 제거하기 위해 한외여과된다. 용매/세정제 처리, 나노여과, 그리고 음이온 Q 막 정제를 비롯한 추가 바이러스-감소 단계가 수행될 수 있다. 이러한 과정에서 모든 단계는 2 내지 15 ℃에서 수행된다.

용해물로부터 Hb는 30-kD 막을 이용하여, 링거 젖산염 ("RL"), 또는 인산염 완충된 식염수 ("PBS", pH 7.4) 내로 교환된다. Hb는 1.1-1.5 mM (사합체에서)로 농축된다. 10 내지 12 부피의 RL 또는 PBS가 용매 교환을 위해 이용된다. 이러한 과정은 2 내지 15 ℃에서 수행된다. RL 또는 PBS에서 제조된 용액의 pH는 티올화에 앞서 8.0으로 조정된다. Hb는 0.45 또는 0.2-μm 일회용 필터 캡슐을 통해 무균 여과되고, 그리고 화학적 변형 반응이 수행되기 전에 4 ± 2 ℃에서 보관된다.

PEG 접합: mPEG-SVA (Laysan Bio, Inc., Arab, AL)는 시작 사합체성 Hb 농도에 비하여 100% 종점 활성에 기초된 10-배 몰 과잉의 mPEG-SVA를 이용하여 SFH에 접합되었다. Hb는 먼저, Hb에 산소를 공급하기 위해 대기와 평형하도록 허용되었다. RL (pH 7.0-8.5), PBS, 또는 임의의 유사한 완충액에서 대략 1 mM Hb는 동일한 완충액에서 10 mM mPEG-SVA와 합동되었다. 이러한 혼합물은 10 + 5 ℃에서 약 2 시간 동안 연속적으로 교반되었다.

결과의 PEG-Hb 접합체는 반응하지 않은 시약을 제거하기 위해 70-kD 막 (즉, <10 디아볼륨 여과)을 통해 처리되었다. 이러한 과정은 540 nm와 217 nm에서 크기-배제 액체 크로마토그래피 ("LC")에 의해 모니터링되었다. 농도는 4 g/dl Hb로 조정되었고, 그리고 pH는 6.0 내지 7.8, 또는 7.0 ± 1.0의 범위로 조정되었다.

PEG-Hb 접합체는 0.2-μm 무균 일회용 캡슐을 이용하여 무균 여과되었고 4 + 2 ℃에서 무균 탈발열원화된 도관 내로 수집되었다. PEG-Hb 접합체는 RL에서 4.4 g/dL로 희석되고, 그리고 pH가 7.4 + 0.2로 조정되고, 그리고 이후 무균 여과되고 (0.2 μm) 내독소 없는 무균 용기 내로 분취되었다.

최종 페길화된 헤모글로빈 접합체 ("SVA-PEG-Hb" 또는 "SP4")는 표 1에서 도시된 성질을 갖는다:

[표 1]

PEG-ββ-Hb의 성질

SVA-PEG- Hb의 구조는 표준 방법을 통해 더욱 확증되었다.

실시예 2 - SVA-PEG-Hb의 안정성 시험

실시예 1의 SVA-PEG-Hb는 MalPEG-Hb (MP4로서 알려져 있음) 및 SFH와 비교하여, 비-분리 크기 배제 크로마토그래피 (LC)를 통해 분석되었다. 이들 결과는 도면 4에서 묘사된다. 이러한 도면은 SVA-PEG-Hb가 MP4보다 더욱 균질한 산물이라는 것을 암시한다.

도면 5는 40 ℃에서 최대 1 개월 동안 가속된 보관 조건 하에 CO에 리간드화된 MP4 (MP4CO, 위쪽)의 형태와 비교하여, CO에 리간드화된 SVA-PEG-Hb (SP4CO, 아래쪽)의 높은-염, 해리 조건 (0.9M MgCl₂) 하에 LC 분석이다. 이러한 크로마토그램은 SP4CO가 이런 가속된 안정성 시험에서, MP4CO보다 더욱 큰 안정성을 유지한다는 것을 보여준다.

도면 6은 32 ℃에서 9 일 동안 가속된 보관 조건 하에 CO에 리간드화된 NPC-PEG-Hb (NP4CO, 위쪽)와 비교하여, CO에 리간드화된 SVA-PEG-Hb (SP4CO, 아래쪽)의 높은-염, 해리 조건 (0.9M MgCl₂) 하에 LC 분석이다. 이러한 크로마토그램은 SP4CO가 이런 가속된 안정성 시험에서, NP4CO보다 더욱 큰 안정성을 유지한다는 것을 보여준다. 왼쪽-이동 피크를 보여주는 크로마토그램은 높은-염, 해리 조건 하에 LC에 의해, SP4CO와 비교하여 NP4CO에 대해 관찰된 더욱 높은 분자량 성분의 형성을 증명한다.

본 발명의 원소 또는 이들의 바람직한 구체예(들)를 소개할 때, 단수 관사 ("a", "an", "the")와 "상기"는 이들 원소 중에서 하나 또는 그 이상이 있다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하는", "내포하는" 및 "갖는"은 포괄적인 것으로 의도되고, 그리고 열거된 원소 이외에 추가 원소가 있을 수 있다는 것을 의미한다.

상기에 비추어, 본 발명의 여러 목적이 달성되고 다른 유리한 결과가 획득된다는 것은 명백할 것이다.

상기 조성물과 방법에서 다양한 변화가 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있기 때문에, 상기 설명에서 내포되고 첨부 도면에서 도시된 모든 물질은 제한하는 의미가 아닌 예시적인 것으로 해석되어야 하는 것으로 의도된다.

Claims (94)

1. 다음 구조를 가지며, 37 ℃ 및 pH 7.4에서 계측될 때 2 내지 10 mmHg 범위에서 변하는 P50을 갖는 폴리알킬렌 산화물 (PAO) 헤모글로빈 사합체 접합체.
   

   

   
   여기서:
   Hb는 헤모글로빈 사합체이고,
   N은 헤모글로빈의 아미노 기이고,
   L은 링커 -C(O)-(CH₂)_p- 이고,
   X는 말단기이고,
   PAO는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이고,
   m은 헤모글로빈 사합체에 접합된 활성화된-PEG 중합체의 평균 숫자이며, 6 내지 10이고,
   n은 4,000 내지 6,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 PEG의 옥시에틸렌 단위의 평균 숫자이고,
   p는 4 내지 6의 정수이고,
   헤모글로빈 사합체는 β,β-분자내에-교차연결되어 있다.
2. 제1항에 있어서, 헤모글로빈 사합체를 최소한 하나의 PAO 중합체와 반응시키는 것을 포함하는 과정에 의해 제조되며, PAO 중합체는 다음 구조를 갖는 것인 헤모글로빈 사합체 접합체:
   

   

   
   여기서 R은 아미노 반응성 모이어티이다.
3. 제2항에 있어서, R이 숙신이미딜 또는 p-니트로페닐인 헤모글로빈 사합체 접합체.
4. 제1항에 있어서, X가 히드록시, 아릴옥시, 또는 C₁-C₂₀ 알콕시인 헤모글로빈 사합체 접합체.
5. 제1항에 있어서, 비스(3,5-디브로모살리실) 푸마르산염이 헤모글로빈 사합체의 2개 β82 리신 잔기에서 교차연결된 것인 헤모글로빈 사합체 접합체.
6. 제1항에 있어서, 콜로이드 삼투압이 최소한 50 mmHg이거나; 또는 산소, 일산화탄소 또는 산화질소에 리간드화된, 헤모글로빈 사합체 접합체.
7. 제1항에 있어서, p가 4이고, X가 메톡시이고, m이 평균적으로 사합체마다 약 8 내지 약 9개 PAO 분자이고, P50이 약 7 mmHg이고, PAO가 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이고, PEG가 약 5,000 달톤의 평균 분자량을 갖는 것인 헤모글로빈 사합체 접합체.
8. 제7항에 있어서, PEG의 아미노 반응성 모이어티가 헤모글로빈 α-아단위 또는 β-아단위의 말단 발린 잔기의 α-아미노 모이어티에 접합되거나; 또는 PEG의 아미노 반응성 모이어티가 헤모글로빈 α-아단위 또는 β-아단위의 리신 잔기의 ε-아미노 모이어티에 접합되고, 임의선택적으로 여기서 리신 잔기가 임의선택적으로 리신-7, 리신-11, 리신-16, 리신-40, 리신-56, 리신-60, 리신-61, 리신-90, 리신-99, 리신-127, 리신-139, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 인간 헤모글로빈 α-아단위의 리신 잔기이거나; 또는 리신 잔기가 리신-8, 리신-17, 리신-59, 리신-61, 리신-65, 리신-66, 리신-82, 리신-95, 리신-120, 리신-132, 리신-144, 그리고 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 인간 헤모글로빈 β-아단위의 리신 잔기인 헤모글로빈 사합체 접합체.
9. 제1항에 있어서, PEG가 메톡시PEG-숙신이미딜 발레르산염 (mPEG-SVA)인 헤모글로빈 사합체 접합체.
10. 제1항에 있어서, N-에틸 말레이미드가 헤모글로빈 사합체의 β93 시스테인 잔기에 접합된 것인 헤모글로빈 사합체 접합체.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 헤모글로빈 사합체 접합체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 하기를 위한 의약의 제조에 이용하기 위한 제약학적 조성물:
    급성 간부전, 베타 지중해빈혈, 화상, 만성 결정적 하지 허혈, 이산화탄소 또는 시안화물 중독, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 울혈성 심부전, 저산소증, 말라리아, 장기 허혈 (임의선택적으로, 급성 장 허혈 (염전), 급성 장 허혈 (색전증), 심장성 쇼크, 급성 혈관 장기 허혈, 뇌졸중, 심근 경색, 또는 심각한 심장 허혈을 포함함), 말초 혈관 질환, 포르피린증, 임신 동안 전자간증, 패혈증, 겸상 적혈구병, 망막 질환, 안구내 질환, 고환 꼬임, 외상, 쇼크, 외상성 뇌 손상, 궤양, 혈관경축, 또는 이들의 조합의 치료;
    비외상성 출혈성 쇼크, 입원전 세팅 외상, 외상성 출혈성 쇼크, 급성 폐 손상, 성인 호흡 곤란 증후군, 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 고형 종양 암, 장기 분해 (탈체), 장기 분해 (수용자에서), 심각한 패혈증, 패혈성 쇼크, 심근 경색, 심장 허혈, 심장성 쇼크, 급성 심부전, 폐색전증, 또는 이들의 조합의 치료;
    혈관형성술에 대한 보조약으로서, 성형 수술에 대한 보조약으로서, 또는 심실 보조 기구를 이식하는데 있어서 보조약으로서; 혈액 대체제, 심장보호제, 냉동보존제, 혈액투석 보조약, 종양학 작용제, 장기 보존제, 성능 증강 작용제, 수술 보조약, 또는 상처 치유 작용제로서; 영상에서; 폐 기능을 향상시키기 위해; 또는 이들의 조합으로 이용;
    산소, 산화질소, 일산화탄소 또는 이들의 혼합물을 조직에 전달;
    미세혈관계에서 아질산염을 산화질소 (NO)로 환원; 또는
    손상, 용혈성 빈혈, 감염성 빈혈, 세균 감염, 인자 IV 단편화, 과다비장화와 비장비대, 가금류에서 출혈성 증후군, 저형성 빈혈, 재생불량성 빈혈, 특발성 면역 용혈 상태, 철 결핍, 동종면역 용혈성 빈혈, 미세혈관병증 용혈성 빈혈, 기생증, 또는 외과적-마취 유도된 뇌 손상으로 인한 혈액의 상실의 수의학적 치료.
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