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KR102246285B1 - 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 - Google Patents

단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 Download PDF

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KR102246285B1
KR102246285B1 KR1020197022368A KR20197022368A KR102246285B1 KR 102246285 B1 KR102246285 B1 KR 102246285B1 KR 1020197022368 A KR1020197022368 A KR 1020197022368A KR 20197022368 A KR20197022368 A KR 20197022368A KR 102246285 B1 KR102246285 B1 KR 102246285B1
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KR
South Korea
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fluorescent
nucleotide
emission
wavelength
intensity
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로버트 랑글루아
존 비에셀리
샤오하이 리우
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일루미나, 인코포레이티드
일루미나 케임브리지 리미티드
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Abstract

폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템이 개시된다. 시스템은 미리 결정된 파장에서 광을 발생시키도록 구성된 광원, 예를 들면, 레이저 또는 LED를 포함할 수 있다. 시스템의 검출기는 제1 파장 및 제2 파장에서 형광성 방출을 검출할 수 있다. 시스템의 프로세서는 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되지 않는 경우, 뉴클레오타이드를 제1 유형으로 식별하고; 광의 제1 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제2 유형으로 식별하고; 광의 제2 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제3 유형으로 식별하고; 광의 제1 파장 및 제2 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제4 유형으로 식별한다.

Description

단일 광원, 2-광학 채널 서열분석
관련 출원
본 출원은 2017년 3월 7일자로 출원 미국 가특허 출원 제62/468242호에 대한 우선권을 주장한다. 이러한 관련 출원의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함된다.
분야
본 개시내용은 일반적으로 DNA 서열분석(sequencing)의 분야에 관한 것이고, 더 특히 단일 광원 및 적어도 2개의 염료, 예를 들면, 2개의 형광성 표지를 사용하는 DNA 서열분석을 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
기존의 DNA 서열분석 시스템 및 방법은 2개 이상의 광원을 사용하여 형광성 표지와 접합된 다이옥시리보핵산 유사체를 여기시킨다. 그러나, 작동 동안, 광원은 높은 전력 소비를 갖고, 소멸될 필요성이 있는 상당한 양의 열을 발생시킬 수 있다. 하나의 광원에 의해 충분히 여기될 수 있는 형광성 표지는 이에 의해 각각의 표지가 다른 표지와 겹치는 파장에서 발광하는 누화의 대상이 될 수 있다. 보정되지 않는 경우, 이러한 누화는 서열분석 작동 동안 정확한 뉴클레오타이드 염기를 적절하게 확정(calling)할 수 있는 DNA 서열분석 시스템에 있어서 이를 어렵게 만들 수 있다.
폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 시스템 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 하나의 예에서, 시스템은 광, 예를 들면, 미리 결정된 파장에서의 광을 발생시키도록 구성된 단일 광원, 예를 들면, 레이저 또는 발광 다이오드; 뉴클레오타이드에 부착된 형광단에 부착된 형광단으로부터 형광성 방출을 검출하도록 구성된 적어도 하나의 검출기로서, 적어도 하나의 검출기가 제1 파장 및 제2 파장에서 형광성 방출을 검출하도록 구성되는, 검출기; 하기 단계를 포함하는 방법을 수행하는 명령어를 실행하도록 구성된 프로세서를 포함한다: 광원으로부터 뉴클레오타이드 상에 광을 발생시키는 단계; 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되지 않는 경우, 뉴클레오타이드를 제1 유형으로 식별(identifying)하는 단계; 광의 제1 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제2 유형으로 식별하는 단계; 광의 제2 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제3 유형으로 식별하는 단계; 및 광의 제1 파장 및 제2 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제4 유형으로 식별하는 단계.
또 다른 예는 광원을 사용하여 뉴클레오타이드에 부착된 형광단 상에 광을 발생시키는 단계; 적어도 하나의 검출기를 사용하여 제1 파장 및 제2 파장에서 뉴클레오타이드에 부착된 형광단으로부터 형광성 방출을 검출하는 단계; 및 뉴클레오타이드를 식별하는 단계로서, 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되지 않는 경우, 뉴클레오타이드를 제1 유형으로 식별하는 단계; 광의 제1 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제2 유형으로 식별하는 단계; 광의 제2 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제3 유형으로 식별하는 단계; 및 광의 제1 파장 및 제2 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제4 유형으로 식별하는 단계를 포함하는 단계를 포함하는 컴퓨터 실행 방법이다.
또 다른 예에서, 시스템은 광을 발생시키도록 구성된 단일 광원; 뉴클레오타이드에 부착된 상이한 형광단으로부터 4개의 실질적으로 상이한 형광성 방출을 검출하도록 구성된 적어도 하나의 검출기; 명령어를 실행하도록 구성된 프로세서를 포함하되, 상기 명령어는, 광원으로부터 뉴클레오타이드 상에 광을 발생시키는 단계; 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되지 않는 경우, 뉴클레오타이드를 제1 유형으로 식별하는 단계; 광의 제1 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제2 유형으로 식별하는 단계; 광의 제2 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제3 유형으로 식별하는 단계; 및 광의 제1 파장 및 제2 파장에서 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 뉴클레오타이드를 제4 유형으로 식별하는 단계를 포함하는 방법을 수행하며, 여기서 제1 형광성 방출, 제2 형광성 방출, 제3 형광성 방출, 및 제4 형광성 방출은 실질적으로 상이한 파장을 갖는다.
도 1은 예시적인 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석기를 도시한 개략적 설명도이다.
도 2는 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 수행하기 위한 예시적인 컴퓨터 시스템의 기능적 블록 선도를 도시한다.
도 3은 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 사용하는 합성에 의한 예시적인 서열분석 방법의 흐름도이다.
도 4는 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 위한 염기 확정을 수행하는 예시적인 방법의 흐름도이다.
도 5는 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 수행하는 예시적인 방법의 흐름도이다.
도 6은 핵산 클러스터의 개요 및 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 사용하는 이들의 서열분석을 도시한다.
도 7A 내지 도 7D는 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 위한 색 보정 및 위상 보정을 도시한 개략적 플롯이다.
하기 상세한 설명에서, 이의 부분을 형성하는 첨부된 도면을 참조한다. 도면에서, 맥락이 달리 지시하지 않는 한, 단순한 기호는 전형적으로 유사한 구성원을 식별한다. 상세한 설명, 도면, 및 청구항에 기재된 예시적인 실시형태는 제한되는 것을 의미하지 않는다. 다른 실시형태가 사용될 수 있으며, 본 명세서에 제시된 주제의 취지 또는 범위를 벗어나지 않고, 다른 변화가 만들어질 수 있다. 본 개시내용의 측면은 본 명세서에 일반적으로 기재되고 도면에 설명된 바와 같이 광범위하게 다양한 상이한 구성으로 배열되고, 치환되고, 조합되고, 분리되고, 디자인될 수 있고, 이들 모두는 본 명세서에 명백하게 고려되는 것으로 용이하게 이해될 것이다.
본 발명의 실시형태는 단일 광원 및 오직 2개의 상이한 광학 채널을 사용하여 모두 4개의 뉴클레오타이드 염기를 식별할 수 있는 차세대 뉴클레오타이드 서열분석 시스템에 관한 것이다. 서열분석 시스템은 합성 방법에 의한 서열분석을 사용할 수 있다. 각각의 서열분석 주기 동안, 4개의 뉴클레오타이드 유사체는 서열분석되는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 성장 프라이머로 도입될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 4개의 뉴클레오타이드 유사체는 임의의 형광성 염료와 접합되지 않는 데옥시구아노신 트라이포스페이트(dGTP) 유사체, 제1 형광성 염료와 접합된 데옥시티미딘 트라이포스페이트(dTTP) 유사체, 제2 형광성 염료와 접합된 데옥시시티딘 트라이포스페이트(dCTP) 유사체, 및 두 형광성 염료(또는 2개의 dATP 유사체의 혼합물로서, 제1 형광성 염료를 갖는 하나의 dATP 유사체 및 제2 형광성 염료를 갖는 또 다른 dATP 유사체의 혼합물)와 접합된 데옥시아데노신 트라이포스페이트(dATP) 유사체를 포함할 수 있다. 4개의 뉴클레오타이드 유사체에 접합된 형광성 염료는 오직 예시적인 것이고, 제한되는 것을 의도하지 않는다. 예를 들면, dTTP 유사체는 임의의 형광성 염료와 접합되지 않을 수 있고, dCTP 유사체는 제1 형광성 염료와 접합될 수 있고, dATP 유사체는 제2 형광성 염료와 접합될 수 있고, dGTP 유사체는 두 형광성 염료(또는 2개의 dGTP 유사체의 혼합물로서, 제1 형광성 염료를 갖는 하나의 dGTP 유사체 및 제2 형광성 염료를 갖는 또 다른 dGTP 유사체의 혼합물)와 접합될 수 있다. 또 다른 예로서, dCTP 유사체는 임의의 형광성 염료와 접합되지 않을 수 있고, dATP 유사체는 제1 형광성 염료와 접합될 수 있고, dTTP 유사체는 제2 형광성 염료와 접합될 수 있고, dGTP 유사체는 두 형광성 염료(또는 2개의 dGTP 유사체의 혼합물로서, 제1 형광성 염료를 갖는 하나의 dGTP 유사체 및 제2 형광성 염료를 갖는 또 다른 dGTP 유사체의 혼합물)와 접합될 수 있다. 또 다른 예로서, 임의의 형광성 염료와 접합되지 않는 뉴클레오타이드 유사체는 dGTP, dTTP, dCTP, 또는 dATP일 수 있다. 제1 형광성 염료 또는 제2 형광성 염료와 접합된 뉴클레오타이드 유사체는 dGTP, dTTP, dCTP, 또는 dATP일 수 있다. 두 형광성 염료와 접합된 뉴클레오타이드 유사체는 dGTP, dTTP, dCTP, 또는 dATP일 수 있다. dGTP, dTTP, dCTP, 또는 dATP 유사체는 2개의 유사체의 혼합물로서, 제1 형광성 염료를 갖는 하나의 유사체 및 제2 형광성 염료를 갖는 또 다른 유사체의 혼합물을 포함할 수 있다.
광원(예를 들면, 레이저 또는 발광 다이오드)은 2개의 형광성 염료를 여기시킬 수 있다. 제1 형광성 염료는 제1 파장에서 형광을 내고, 제1 형광성 이미지에서 캡처될 수 있다. 제2 형광성 염료는 제2 파장에서 형광을 내고, 제2 형광성 이미지에서 캡처될 수 있다. 캡처된 형광성 방출의 강도는 2개의 형광성 이미지로부터 추출된다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개의 형광성 염료는 누화의 대상이 될 수 있고, dTTP 유사체 및 dCTP 유사체의 형광성 방출은 형광성 이미지 둘 다에서 캡처될 수 있다. 따라서, 추출된 강도는, 예를 들면, 색 보정에 의해 보정될 필요가 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개의 형광성 염료는 큰 스토크스 이동을 가질 수 있고, 형광성 방출은 최소의 누화를 갖거나 누화를 가지지 않을 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 2개의 형광성 염료 중 하나는 정상 스토크스 이동 염료일 수 있고, 다른 형광성 염료는 긴 스토크스 이동 염료일 수 있다. 정상 스토크스 이동 염료의 비제한적인 예는 알렉사(Alexa) 488 또는 이의 염료 유사체(예를 들면, 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제8,754,244호에 개시된 3,6-비스(에틸아미노)-2,7-다이메틸-[2-카복실레이토-5-(3-카복시프로필옥시)페닐]크산틸륨 베타인(염료 I-3), 및 3,6-비스(에틸아미노)-2,7-다이메틸-[2-카복실레이토-4-(3-카복시프로필옥시)페닐]크산틸륨 베타인(염료 I-4))을 포함한다. 정상 스토크스 이동 염료는 488의 파장을 갖는 레이저 또는 발광 다이오드(LED) 광원에 의해 여기될 수 있고, 520㎚에서 방출 피크를 가질 수 있다. 긴 스토크스 이동 염료는 PCT 특허 출원 제PCT/GB2016/051474호(전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)에서의 염료 NR520LS일 수 있다. 긴 스토크스 이동 염료는 590㎚에서 방출 피크를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개의 형광성 염료는 Cy3(약 575㎚에서 방출 피크를 가짐) 및 형광 공명 에너지 전이(FRET) 쌍 염료 Cy3-Cy5(670㎚에서 방출 피크를 가짐)일 수 있다.
색 보정은 각각의 형광성 이미지 내의 강도의 기저 분포의 성질을 사용하여 추출된 강도를 컨디셔닝하기 위하여 색 행렬을 사용할 수 있다. 색 행렬은 위치(x i , y i )에서 제1 형광성 이미지로부터 추출된 강도 대 제2 형광성 이미지에서 상응하는 위치로부터 추출된 강도의 플롯팅에 의해 추정될 수 있다. x i 및 y i 는 각각 제2 형광성 이미지 및 제1 형광성 이미지에서 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드의 위치 i로부터 추출된 강도를 나타낸다. 위치(x i , y i )에서 플롯팅된 강도는 극좌표(r i , θ i )로 전환되고, 각도 θ i 의 반경 가중된 히스토그램은 컴퓨터로 처리된다. 반경 가중된 히스토그램에서 2개의 국소 최대값, θ1 및 θ2는 색 행렬을 추정하는데 사용될 수 있다. 색 행렬은
Figure 112019077901794-pct00001
일 수 있다.
위치(x i , y i )에서 플롯팅된 강도에 색 행렬의 역을 적용한 후, 도입된 뉴클레오타이드의 염기가 결정될 수 있다. 예를 들면, 형광성 방출이 검출되지 않는 경우, 도입된 뉴클레오타이드는 dGTP 유사체일 수 있다. 형광성 방출이 제2 형광성 이미지에서 검출되고 제1 형광성 이미지에서는 검출되지 않는 경우, 도입된 뉴클레오타이드는 dTTP 유사체일 수 있다. 형광성 방출이 제1 형광성 이미지에서 검출되고 제1 형광성 이미지에서는 검출되지 않는 경우, 도입된 뉴클레오타이드는 dCTP 유사체일 수 있다. 형광성 방출이 두 형광성 이미지에서 검출되는 경우, 도입된 뉴클레오타이드는 dATP 유사체일 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 개시내용이 속한 분야의 숙련가에게 흔하게 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들면, 문헌[Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons(New York, NY 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press(Cold Spring Harbor, NY 1989)]을 참조한다. 본 개시내용의 목적을 위하여, 다음 용어가 하기 정의된다.
단일-광원, 2-광학 채널 서열분석기
단일 광원(예를 들면, 레이저 또는 LED)을 사용하는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템 및 방법이 본 명세서에 개시된다. 하나의 실시형태에 있어서, 폴리뉴클레오타이드를 서열분석하는데 사용되는 적어도 2개의 염료가 있다. 도 1은 예시적인 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)의 개략적 설명이다. 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)은 2개의 염료, 예를 들면, 제1 형광성 표지 및 제2 형광성 표지를 기반으로 한 서열분석 방법을 사용하도록 구성될 수 있다. 사용되는 서열분석 방법의 비제한적인 예는 합성에 의한 서열분석 및 헬리스코프(Heliscope) 단일 분자 서열분석을 포함할 수 있다. 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)은 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)의 부분인 유체 시스템(104)에 의해 공급된 서열분석 시약을 사용하는 미가공 서열분석 데이터를 발생시키도록 구성된 광학 시스템(102)을 포함할 수 있다. 미가공 서열분석 데이터는 광학 시스템(102)에 의해 캡처된 형광성 이미지를 포함할 수 있다. 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)의 부분인 컴퓨터 시스템(106)은 통신 채널(108A 및 108B)을 통해 광학 시스템(102) 및 유체 시스템(104)을 제어하도록 구성될 수 있다. 예를 들면, 광학 시스템(102)의 컴퓨터 인터페이스(110)는 통신 채널(108A)을 통해 컴퓨터 시스템(106)과 통신하도록 구성될 수 있다.
서열분석 반응 동안, 유체 시스템(104)은 마운팅 스테이지(mounting stage)(116) 위에 위치한 플로우셀(flowcell)(114)로 그리고 그로부터 하나 이상의 시약 튜브(112)를 통해 시약의 흐름을 지시할 수 있다. 시약은, 예를 들면, 형광성 표지화된 뉴클레오타이드, 버퍼, 효소, 및 절단 시약일 수 있다. 플로우셀(114)은 적어도 하나의 유체 채널을 포함할 수 있다. 플로우셀(114)은 패턴화된 어레이 플로우셀 또는 무작위 어레이 플로우셀일 수 있다. 플로우셀(114)은 적어도 하나의 유체 채널에서 서열분석되는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드의 다중 클러스터를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드의 길이는, 예를 들면, 200개의 염기 내지 1000개의 염기 범위로 다양할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 플로우셀(114)의 하나 이상의 유체 채널에 부착될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 플로우셀(114)은 복수의 비드를 포함할 수 있고, 여기서 각각의 비드는 서열분석되는 폴리뉴클레오타이드의 다중 카피를 포함할 수 있다. 마운팅 스테이지(116)는 광학 시스템(102)의 다른 구성원에 관하여 플로우셀(114)의 적절한 정렬 및 이동을 허용하도록 구성될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 마운팅 스테이지(116)는 플로우셀(114)을 렌즈(118)와 정렬하는데 사용될 수 있다.
광학 시스템(102)은 미리 결정된 파장, 예를 들면, 532㎚에서 광을 발생시키도록 구성된 단일 광원(120), 예를 들면, 단일 레이저 또는 단일 LED원을 포함할 수 있다. 광원(120)에 의해 발생된 광은 플로우셀(114)에서 형광성 표지를 여기시키는 광섬유 케이블(122)을 통해 통과할 수 있다. 초점조절기(124) 상에 삽입된 렌즈(118)는 z축을 따라 이동할 수 있다. 초점이 맞춰진 형광성 방출은 검출기(126), 예를 들면, 전하 결합 소자(CCD) 센서 또는 상보형 금속 산화물 반도체(CMOS) 센서에 의해 검출될 수 있다.
광학 시스템(102)의 필터 어셈블리(128)는 플로우셀(114)에서 형광성 표지의 형광성 방출을 필터링하도록 구성될 수 있다. 필터 어셈블리(128)는 제1 필터 및 제2 필터를 포함할 수 있다. 각각의 필터는 시스템에서 사용 중인 형광성 분자의 유형에 따라 롱패스 필터, 숏패스 필터, 또는 대역통과 필터일 수 있다. 제1 필터는 검출기(126)에 의해 제1 형광성 표지의 형광성 방출을 검출하도록 구성될 수 있다. 제2 필터는 검출기(126)에 의해 제2 형광성 표지의 형광성 방출을 검출하도록 구성될 수 있다. 필터 어셈블리(128)에서 2개의 필터와 함께, 검출기(126)는 광의 2개의 상이한 파장을 검출할 수 있다. 광의 2개의 파장은 동일한 형광성 표지 또는 상이한 형광성 표지로부터일 수 있다. 광의 2개의 파장은, 예를 들면, 적어도 20㎚ 떨어져 있을 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 광학 시스템(102)은 형광성 방출을 나누도록 구성된 이색성을 포함할 수 있다. 광학 시스템(102)은 2개의 검출기, 즉, 제1 파장에서 형광성 방출을 검출하기 위한 제1 필터와 결합된 제1 검출기 및 제2 파장에서 형광성 방출을 검출하기 위한 제2 필터와 결합된 제2 검출기를 포함할 수 있다. 형광성 방출을 이색성으로 나눈 후, 광학 시스템(102)은 상이한 필터에 결합된 2개의 검출기를 사용하여 2개의 파장에서 동시에(또는 가까운 시간에) 형광성 방출을 검출할 수 있다. 이러한 구성은 이미지화 처리의 속도를 증가시킬 수 있다. 따라서, 다중 플로우셀은 동시에 처리될 수 있고, 뉴클레오타이드 유사체는 하나 이상의 다른 플로우셀의 폴리뉴클레오타이드 클러스터로 도입되는 동안, 하나의 플로우셀은 이미지화를 겪는다.
사용시, 서열분석되는 폴리뉴클레오타이드를 갖는 샘플을 플로우셀(114)에 로딩하고, 마운팅 스테이지(116)에 놓는다. 그 다음, 컴퓨터 시스템(106)은 유체 시스템(104)을 활성화시켜 서열분석 사이클을 시작한다. 서열분석 반응 동안, 컴퓨터 시스템(106)은 통신 인터페이스(108B)를 통해 유체 시스템(104)이 시약, 예를 들면, 뉴클레오타이드 유사체를 플로우셀(114)에 공급하도록 지시한다. 통신 인터페이스(108A) 및 컴퓨터 인터페이스(110)를 통해, 컴퓨터 시스템(106)은 미리 결정된 파장의 광을 발생시키고 서열분석되는 폴리뉴클레오타이드에 혼성화된 성장하는 프라이머로 도입된 뉴클레오타이드 유사체 상에서 빛나기 위하여 광학 시스템(102)의 광원(120)을 제어하도록 구성된다. 컴퓨터 시스템(106)은 형광성 이미지에서 뉴클레오타이드 유사체의 방출 스펙트럼을 캡처하기 위하여 광학 시스템(102)의 검출기(126)를 제어한다. 컴퓨터 시스템(106)은 검출기(126)로부터 형광성 이미지를 수신하고, 수신된 형광성 이미지를 처리하여 서열분석되는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정한다.
광원 및 필터
단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)은 충분히 겹치지 않는 방출 스펙트럼을 갖는 2개의 형광성 표지를 여기시킬 수 있는 하나의 광원, 예를 들면, 레이저 또는 LED를 사용할 수 있다. 광원(120)에 의해 발생된 광의 파장은, 예를 들면, 400㎚ 내지 800㎚ 범위로 다양할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 광원(120)에 의해 발생된 광의 파장은 약 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800㎚, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 수 또는 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 광원(120)에 의해 발생된 광의 파장은 적어도, 또는 최대로, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 또는 800㎚일 수 있다.
필터 어셈블리(128)를 갖는 검출기(126)는 약 2개의 상이한 파장, 예를 들면, 제1 파장 및 제2 파장의 광을 검출하도록 구성될 수 있다. 제1 파장 및 제2 파장은, 예를 들면, 10㎚ 내지 100㎚ 범위로 서로 떨어져 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1 파장 및 제2 파장은 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100㎚, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 수 또는 범위만큼 떨어져 있을 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 제1 파장 및 제2 파장은 적어도, 또는 최대로, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100㎚만큼 떨어져 있을 수 있다.
필터 어셈블리(128)에서 필터의 수는 1 내지 10 범위로 다양할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 필터 어셈블리(128)에서 필터의 수는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 필터 어셈블리(128)에서 필터의 수는 적어도, 또는 최대로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10일 수 있다.
필터는 대역통과 필터일 수 있고, 400㎚ 내지 800㎚ 범위의 다양한 파장의 피크 투과율을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 피크 투과율은 약 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800㎚, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 수 또는 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 피크 투과율은 적어도, 또는 최대로, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 또는 800㎚일 수 있다. 필터의 너비는, 예를 들면, 1㎚ 내지 50㎚ 범위로 다양할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 필터의 너비는 약, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50㎚, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 수 또는 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 필터의 너비는 적어도, 또는 최대로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 또는 50㎚일 수 있다.
형광성 표지
본 명세서에 개시된 시스템 및 방법에 의해 사용되는 형광성 표지는 상이한 피크 흡수 파장, 예를 들면, 400㎚ 내지 800㎚ 범위를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 형광성 표지의 피크 흡수 파장은 약, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800㎚, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 수 또는 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 형광성 표지의 피크 흡수 파장은 적어도, 또는 최대로, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 또는 800㎚일 수 있다.
형광성 표지는, 예를 들면, 400㎚ 내지 800㎚ 범위의 상이한 피크 방출 파장을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 형광성 표지의 피크 방출 파장은 약, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800㎚, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 수 또는 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 형광성 표지의 피크 방출 파장은 적어도, 또는 최대로, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 또는 800㎚일 수 있다.
형광성 표지는, 예를 들면, 10㎚ 내지 200㎚ 범위의 상이한 스토크스 이동을 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 스토크스 이동은 약, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200㎚, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 수 또는 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 스토크스 이동은 적어도, 또는 최대로, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200㎚일 수 있다.
본 명세서에 개시된 시스템 및 방법은 형광성 표지, 예를 들면, 제1 형광성 표지 및 제2 형광성 표지를 사용할 수 있고, 겹침 방출 스펙트럼을 가질 수 있고, 누화의 대상이 될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개의 형광성 표지의 피크 방출 파장은, 예를 들면, 10㎚ 내지 200㎚ 범위로 다양할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개의 형광성 표지의 피크 방출 파장은 약, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200㎚, 또는 이들 값 중 임의의 둘 사이의 수 또는 범위일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개의 형광성 표지의 피크 방출 파장은 적어도, 또는 최대로, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 200㎚일 수 있다. 필터 어셈블리(128)에서 하나의 필터를 갖는 검출기(126)는 제1 형광성 표지의 형광성 방출을 검출할 수 있다. 필터 어셈블리(128)에서 또 다른 필터를 갖는 검출기(126)는 제2 형광성 표지의 형광성 방출을 검출할 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 2개의 형광성 염료 중 하나는 정상 스토크스 이동 염료일 수 있고, 다른 형광성 염료는 긴 스토크스 이동 염료일 수 있다. 정상 스토크스 이동 염료의 비제한적인 예는 알렉사 488 또는 이의 염료 유사체(예를 들면, 미국 특허 제8,754,244호에서 3,6-비스(에틸아미노)-2,7-다이메틸-[2-카복실레이토-5-(3-카복시프로필옥시)페닐]크산틸륨 베타인(염료 I-3), 및 3,6-비스(에틸아미노)-2,7-다이메틸-[2-카복실레이토-4-(3-카복시프로필옥시)페닐]크산틸륨 베타인(염료 I-4))을 포함한다. 정상 스토크스 이동 염료는 488㎚의 파장을 갖는 레이저 또는 LED 광원에 의해 여기될 수 있고, 520㎚에서 방출 피크를 가질 수 있다. 긴 스토크스 이동 염료는 미국 특허 출원 제PCT/GB2016/051474호에서 염료 NR520LS일 수 있다. 긴 스토크스 이동 염료는 590㎚에서 방출 피크를 가질 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 2개의 형광성 염료는 Cy3(약 575㎚에서 방출 피크를 가짐) 및 형광 공명 에너지 전이(FRET) 쌍 염료 Cy3-Cy5(670㎚에서 방출 피크를 가짐)일 수 있다.
Figure 112019077901794-pct00002
컴퓨터 시스템
단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)의 컴퓨터 시스템(106)은 상기 논의된 바와 같은 광학 시스템(102) 및 유체 시스템(104)을 제어하도록 구성될 수 있다. 많은 구성이 컴퓨터 시스템(106)을 위하여 가능하고, 하나의 실시형태는 도 2에 도시된다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 컴퓨터 시스템(106)은 메모리(204), 저장소(206), 및 통신 인터페이스(208)와 전기 통신하는 프로세서(202)를 포함할 수 있다.
프로세서(202)는 서열분석 반응 동안 플로우셀(114)에 시약을 공급하는 유체 시스템(104)을 유발하는 명령어를 실행하도록 구성될 수 있다. 프로세서(202)는 미리 결정된 파장에서 광을 발생시키기 위하여 광학 시스템(102)의 광원(120)을 제어하는 명령어를 실행할 수 있다. 프로세서(202)는 광학 시스템(102)의 검출기(126)를 제어하고 검출기(126)로부터 데이터를 수신하는 명령어를 실행할 수 있다. 프로세서(202)는 검출기(126)로부터 수신된 데이터, 예를 들면, 형광성 이미지를 처리하고 검출기(126)로부터 수신된 데이터를 기반으로 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 명령어를 실행할 수 있다.
메모리(204)는 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)이 전원이 켜진 경우, 컴퓨터 시스템(106)의 기능을 수행하는 프로세서(202)를 구성하기 위하여 명령어를 저장하도록 구성될 수 있다. 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)이 전원이 꺼진 경우, 저장소(206)는 컴퓨터 시스템(106)의 기능을 수행하는 프로세서(202)를 구성하기 위하여 명령어를 저장할 수 있다. 통신 인터페이스(208)는 컴퓨터 시스템(106), 광학 시스템(102), 및 유체 시스템(104) 사이의 통신을 촉진하도록 구성될 수 있다.
컴퓨터 시스템(106)은 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)의 서열분석 결과를 표시하는 디스플레이 장치(도시 생략)와 통신하도록 구성된 사용자 인터페이스(210)를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스(210)는 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)의 사용자로부터의 입력을 수신하도록 구성될 수 있다. 컴퓨터 시스템(106)의 광학 시스템 인터페이스(212) 및 유체 시스템 인터페이스(214)는 도 1에 도시된 통신 링크(108A 및 108B)를 통해 광학 시스템(102) 및 유체 시스템(104)을 제어하도록 구성될 수 있다. 예를 들면, 광학 시스템 인터페이스(212)는 통신 링크(108A)를 통해 광학 시스템(102)의 컴퓨터 인터페이스(110)와 통신할 수 있다.
컴퓨터 시스템(106)은 검출기(126)로부터 수신된 데이터를 사용하는 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하도록 구성된 핵산 염기 결정기(216)를 포함할 수 있다. 핵산 염기 결정기(216)는 주형 발생기(218), 위치 등록기(220), 강도 추출기(222), 강도 보정기(224), 염기 확정기(base caller)(226), 및 품질 점수 결정기(228) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 주형 발생기(218)는 검출기(126)에 의해 캡처된 형광성 이미지를 사용하여 플로우셀(114)에서 폴리뉴클레오타이드 클러스터의 위치의 주형을 발생시키도록 구성될 수 있다. 위치 등록기(220)는 주형 발생기(218)에 의해 발생된 위치 주형을 기반으로 한 검출기(126)에 의해 캡처된 형광성 이미지에서 플로우셀(114)에서 폴리뉴클레오타이드 클러스터의 위치를 등록하도록 구성될 수 있다. 강도 추출기(222)는 추출된 강도를 발생시키기 위한 형광성 이미지로부터 형광성 방출의 강도를 추출하도록 구성될 수 있다. 강도 보정기(224)는, 예를 들면, 보정된 강도를 발생시키기 위하여 추출된 강도를 색 보정함으로써, 형광성 표지 사이의 누화를 감소시키거나 제거하도록 구성될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 강도 보정기(224)는 추출된 강도를 위상 보정하거나 사전 위상 보정할 수 있다. 염기 확정기(226)는 보정된 강도로부터 폴리뉴클레오타이드의 염기를 결정하도록 구성될 수 있다. 염기 확정기(226)에 의해 결정된 폴리뉴클레오타이드의 염기는 품질 점수 결정기(228)에 의해 결정된 품질 점수와 연관될 수 있다.
합성에 의한 서열분석
도 3은 서열분석 시스템(100)을 사용하는 합성에 의한 서열분석을 위한 예시적인 방법(300)의 흐름도이다. 방법(300)은 블록(305)에서 시작한 후, 단편화된 폴리뉴클레오타이드 단편(예를 들면, 단편화된 단일- 또는 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드 단편)을 포함하는 플로우셀(114)은 블록(310)에서 수신된다. 단편화된 폴리뉴클레오타이드 단편은 다이옥시리보핵산(DNA) 샘플로부터 발생될 수 있다. DNA 샘플은 다양한 공급원, 예를 들면, 생물학적 샘플, 세포 샘플, 환경 샘플, 또는 이의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있다. DNA 샘플은 환자로부터의 하나 이상의 생물학적 유체, 조직, 및 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, DNA 샘플은 혈액, 소변, 뇌척수액, 흉수, 양수, 정액, 타액, 골수, 생검 샘플, 또는 이의 임의의 조합으로부터 채취하거나 이를 포함할 수 있다.
DNA 샘플은 흥미 있는 세포로부터의 DNA를 포함할 수 있다. 흥미 있는 세포는 다양할 수 있고, 몇몇 실시형태에 잇어서, 악성 표현형을 발현할 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 흥미 있는 세포는 종양 세포 골수 세포, 암 세포, 줄기 세포 내피 세포, 바이러스 감염된 병원성 세포, 기생충 유기체 세포 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
단편화된 폴리뉴클레오타이드 단편의 길이는 200개의 염기 내지 1000개의 염기 범위일 수 있다. 단편화된 폴리뉴클레오타이드 단편을 포함하는 플로우셀(114)이 블록(310)에서 수신되면, 프로세스(300)는 폴리뉴클레오타이드 단편이 플로우셀, 예를 들면, 플로우셀(114)의 하나 이상의 채널의 내부 표면에 부착된 폴리뉴클레오타이드 단편의 클러스터로 브릿지 증폭되는 블록(320)으로 이동한다. 플로우셀의 하나 이상의 채널의 내부 표면은 2개의 프라이머, 예를 들면, 제1 프라이머 유형(P1) 및 제2 프라이머 유형(P2)을 포함할 수 있고, DNA 단편은 잘 알려진 방법에 의해 증폭될 수 있다.
플로우셀(114) 내에 클러스터를 발생시킨 후, 프로세스(300)은 합성 과정에 의한 서열분석을 시작할 수 있다. 합성 과정에 의한 서열분석은 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 단편의 클러스터의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 서열 5'-P1-F-A2R-3'을 갖는 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 단편의 클러스터의 서열을 결정하기 위하여, 서열 A2R에 상보적인 서열 A2F를 갖는 프라이머는 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드를 형성하는 DNA 폴리머라제에 의한 0, 1, 또는 2개의 표지를 갖는 뉴클레오타이드 유사체와 함께 블록(325)에서 첨가되고 확장될 수 있다.
각각의 서열분석 주기 동안, 4개의 뉴클레오타이드 유사체는 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드 상에 첨가되고 도입될 수 있다. 4개의 뉴클레오타이드 유사체는 상이한 변형을 가질 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오타이드의 제1 유형은 임의의 형광성 표지와 접합되지 않은 데옥시구아노신 트라이포스페이트(dGTP)의 유사체일 수 있다. 뉴클레오타이드의 제2 유형은 링커를 통해 형광성 표지의 제1 유형과 접합된 데옥시티미딘 트라이포스페이트(dTTP)의 유사체일 수 있다. 뉴클레오타이드의 제3 유형은 링커를 통해 제2 유형 형광성 표지와 접합된 데옥시시티딘 트라이포스페이트(dCTP)의 유사체일 수 있다. 뉴클레오타이드의 제4 유형은 하나 이상의 링커를 통해 형광성 표지의 제1 유형 및 형광성 표지의 제2 유형 둘 다와 접합된 데옥시아데노신 트라이포스페이트(dATP)의 유사체일 수 있다. 링커는 하나 이상의 절단기를 포함할 수 있다. 후속적인 서열분석 주기 전에, 형광성 표지는 뉴클레오타이드 유사체로부터 제거될 수 있다. 예를 들면, 형광성 표지를 뉴클레오타이드 유사체에 부착하는 링커는 예를 들면, 동일한 탄소 상의 아자이드 및/또는 알콕시기를 포함할 수 있고, 이로써 링커는 포스핀 시약에 의해 각각의 도입 주기 후 절단될 수 있고, 따라서 형광성 표지를 후속적인 서열분석 주기로부터 방출한다.
뉴클레오타이드 트라이포스페이트는 각각의 주기에서 서열분석이 제어되고 더 이상 단일 뉴클레오타이드 유사체가 각각의 확장되는 프라이머-폴리뉴클레오타이드 상에 첨가될 수 있도록 3' 위치에서 역으로 차단될 수 있다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 유사체의 3' 리보스 위치는 포스핀 시약에 의한 절단에 의해 제거될 수 있는 알콕시 및 아자이도 작용기 둘 다를 포함할 수 있고, 따라서 추가로 확장될 수 있는 뉴클레오타이드를 생성한다. 뉴클레오타이드 유사체의 도입 후, 유체 시스템(104)은 임의의 도입되지 않은 뉴클레오사이드 유사체 및 효소를 제거하기 위하여 플로우셀(114)의 하나 이상의 채널을 세척할 수 있다. 후속적인 서열분석 주기 전에, 역 3' 블록은 또 다른 뉴클레오타이드 유사체가 각각의 확장되는 프라이머-폴리뉴클레오타이드 상에 첨가될 수 있도록 제거될 수 있다.
블록(330)에서, 단일 광원, 예를 들면, 레이저(120) 또는 LED원은 미리 결정된 파장에서 2개의 형광성 표지를 여기시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 단일 레이저 또는 LED원은 비-조정 가능할 수 있다. 블록(335)에서, 형광성 표지로부터의 신호는 검출될 수 있다. 형광성 표지의 검출은, 예를 들면, 2개의 필터를 사용하는 검출기(126)에 의해 제1 파장 및 제2 파장에서 2개의 형광성 이미지에서 형광성 방출을 캡처하는 것을 포함할 수 있다. 제1 형광성 표지의 형광성 방출은 제1 파장에서 또는 근처에서 있을 수 있고, 제2 형광성 표지의 형광성 방출은 제2 파장에서 또는 그 근처에서 있을 수 있다. 형광성 이미지는 후속 처리 오프라인을 위하여 저장될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 형광성 이미지는 실시간으로 각각의 클러스터에서 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하도록 처리될 수 있다.
예를 들면, 신호의 품질 또는 염기의 예정된 수 후를 기반으로 더 많은 뉴클레오타이드를 검출하는지 여부는 결정 블록(340)에서 결정될 수 있다. 더 많은 뉴클레오타이드가 검출되는 경우, 다음 서열분석 주기의 뉴클레오타이드 결정은 프라이머-폴리뉴클레오타이드를 확장하기 위하여 0, 1, 또는 2개의 표지를 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 갖는 블록(325)에서 다시 출발하여 수행될 수 있다. 다음 서열분석 주기 전에, 형광성 표지는 도입된 뉴클레오타이드 유사체로부터 제거될 수 있고, 역 3' 블록은 제거되어 또 다른 뉴클레오타이드 유사체가 각각의 확장되는 프라이머-폴리뉴클레오타이드에 첨가될 수 있다.
오프라인 형광성 이미지화 처리에서, 결정 블록(340)에서 검출되는 추가의 뉴클레오타이드가 없는 경우, 검출되는 형광성 신호를 포함하는 형광성 이미지는 블록(345)에서 처리될 수 있고, 도입된 뉴클레오타이드의 염기는 결정될 수 있다. 결정된 각각의 뉴클레오타이드 염기에 있어서, 품질 관리는 블록(350)에서 결정될 수 있다. 모든 형광성 이미지가 처리된 후, 프로세스(300)은 블록(355)에서 종료될 수 있다.
염기 확정
염기 확정은 미국 특허 제8,965,076호에 기재되어 있고, 이의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참조로서 포함된다. 간략하게, 염기 확정은 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 또는 아데닌(A)인 것으로 서열분석되는 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드의 클러스터로 도입된 뉴클레오타이드의 염기를 결정하는 과정을 지칭할 수 있다. 도 4는 서열분석 시스템(100)을 사용하여 염기 확정을 수행하는 예시적인 방법(400)의 흐름도이다. 도 3에 도시된 블록(345)에서 처리 검출된 신호는 방법(400)의 염기 확정을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 블록(405)에서 시작한 후, 미리 결정된 파장의 광은 광원을 사용하여 발생될 수 있고, 블록(410)에서 뉴클레오타이드 유사체 상에 빛날 수 있다. 예를 들면, 컴퓨터 시스템(106)은, 이의 광학 시스템 인터페이스(212) 및 통신 채널(108A)을 통해, 미리 결정된 파장에서 광을 발생시키는 광원(120)을 유발할 수 있다.
광원-발생된 광은 플로우셀, 예를 들면, 플로우셀(114)의 하나 이상의 채널의 내부 표면 상에 부착된 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드로 도입된 뉴클레오타이드 유사체 상에서 빛날 수 있다. 프라이머-폴리뉴클레오타이드는 서열분석 프라이머에 혼성화된 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드 단편의 클러스터를 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 각각 0, 1, 또는 2개의 형광성 표지를 포함할 수 있다. 2개의 형광성 표지는 제1 형광성 표지 및 제2 형광성 표지일 수 있다. 형광성 표지는, 광원-발생된 광에 의해 여기된 후, 형광성 방출을 방출할 수 있다. 예를 들면, 제1 형광성 표지는, 예를 들면, 제1 형광성 이미지에서 캡처될 수 있는 제1 파장에서 형광성 방출을 생성할 수 있다. 제2 형광성 표지는, 예를 들면, 제2 형광성 이미지에서 캡처될 수 있는 제2 파장에서 형광성 방출을 생성할 수 있다.
뉴클레오타이드 유사체는 뉴클레오타이드의 제1 유형, 뉴클레오타이드의 제2 유형, 뉴클레오타이드의 제3 유형, 및 뉴클레오타이드의 제4 유형을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 제1 유형, 예를 들면, 데옥시구아노신 트라이포스페이트(dGTP)의 유사체는 제1 형광성 표지 또는 제2 형광성 표지에 접합되지 않는다. 뉴클레오타이드의 제2 유형, 예를 들면, 데옥시티미딘 트라이포스페이트(dTTP)의 유사체는 형광성 표지의 제1 유형과 접합될 수 있고, 형광성 표지의 제2 유형과 접합되지 않는다. 뉴클레오타이드의 제3 유형, 예를 들면, 데옥시시티딘 트라이포스페이트(dCTP)의 유사체는 제2 유형 형광성 표지와 접합될 수 있고, 형광성 표지의 제1 유형과 접합되지 않는다. 뉴클레오타이드의 제4 유형, 예를 들면, 데옥시아데노신 트라이포스페이트(dATP)의 유사체는 형광성 표지의 제1 유형 및 형광성 표지의 제2 유형 둘 다와 접합될 수 있다.
블록(415)에서, 제1 파장 및 제2 파장에서 뉴클레오타이드 유사체의 형광성 방출은 적어도 하나의 검출기를 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들면, 검출기(126)는 2개의 형광성 이미지, 즉, 제1 파장에서 제1 형광성 이미지 및 제2 파장에서 제2 형광성 이미지를 캡처할 수 있다. 2개의 형광성 이미지를 광학 시스템(102)으로부터 수신한 후, 핵산 염기 결정기(216)는 2개의 형광성 이미지에서 형광성 방출의 존재 또는 부재를 결정할 수 있다.
뉴클레오타이드의 제1 유형이 제1 형광성 표지 또는 제2 형광성 표지에 접합되지 않기 때문에, 뉴클레오타이드의 제1 유형은 제1 파장 또는 제2 파장에서 형광성 방출을 생성하지 않거나 최소의 형광성 방출을 생성할 수 있다. 결정 블록(420)에서, 형광성 방출이 검출되지 않는 경우, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 제1 유형, 예를 들면, dGTP인 것으로 결정될 수 있다. 임의의 또는 최소한 보다 많은 형광성 방출이 검출되는 경우, 방법(400)은 결정 블록(425)으로 진행될 수 있다.
뉴클레오타이드의 제2 유형이 형광성 표지의 제1 유형과 접합되고, 형광성 표지의 제2 유형과 접합되지 않기 때문에, 뉴클레오타이드의 제2 유형은 제1 파장에서 형광성 방출을 생성할 수 있고, 제2 파장에서 형광성 방출을 생성하지 않거나 최소의 형광성 방출을 생성할 수 있다. 결정 블록(425)에서, 제2 파장에서 형광성 방출이 제2 형광성 이미지에서 검출되지 않는 경우, 결정 블록(420)으로부터, 제1 파장에서 형광성 방출이 제1 형광성 이미지에서 검출되는 경우, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 제2 유형, 예를 들면, dTTP인 것으로 결정될 수 있다. 형광성 방출이 제2 파장에서 검출되는 경우, 방법(400)은 결정 블록(430)으로 진행될 수 있다.
뉴클레오타이드의 제3 유형이 제2 유형 형광성 표지와 접합하고, 형광성 표지의 제1 유형과 접합하지 않기 때문에, 뉴클레오타이드의 제3 유형은 제2 파장에서 형광성 방출을 생성할 수 있고, 제1 파장에서 형광성 방출을 생성하지 않거나 최소한의 형광성 방출을 생성할 수 있다. 결정 블록(430)에서, 제1 파장에서 형광성 방출이 제1 형광성 이미지에서 검출되지 않는 경우, 결정 블록(425)으로부터, 제2 파장에서 형광성 방출이 제2 형광성 이미지에서 검출되는 경우, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 제3 유형, 예를 들면, dCTP인 것으로 결정될 수 있다.
뉴클레오타이드의 제4 유형이 형광성 표지의 제1 유형 및 형광성 표지의 제2 유형 둘 다와 접합하기 때문에, 뉴클레오타이드의 제4 유형은 제1 파장 또는 제2 파장에서 형광성 방출을 생성할 수 있다. 결정 블록(430)에서, 형광성 방출이 제1 형광성 이미지에서 제1 파장에서 검출되고, 결정 블록(425)으로부터, 형광성 방출은 제2 형광성 이미지에서 제2 파장에서 검출되는 경우, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 제4 유형, 예를 들면, dATP인 것으로 결정될 수 있다.
플로우셀(114)은 서열분석되는 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드의 클러스터를 포함할 수 있다. 결정 블록(435)에서, 정해진 서열분석 주기 동안 처리되는 형광성 방출을 갖는 적어도 하나 이상의 클러스터가 존재하는 경우, 방법(400)은 블록(415)에서 계속될 수 있다. 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드의 클러스터가 더 이상 처리되지 않는 경우, 방법(400)은 블록(440)에서 종료될 수 있다.
단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 위한 작업흐름
주기 1: 주형 발생, 위치 등록, 및 강도 추출
도 5는 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 수행하기 위한 예시적인 방법(500)의 흐름도이다. 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석 시스템(100)은 방법(500)을 수행할 수 있다. 블록(505)에서 시작한 후, 광원은 블록(510)에서 뉴클레오타이드 상에 미리 결정된 파장에서 광을 발생시킬 수 있다. 블록(515)에서, 제1 파장에서 제1 형광성 표지 및 제2 파장에서 제2 형광성 표지로부터 형광성 방출은, 예를 들면, 제1 형광성 이미지 및 제2 형광성 이미지를 발생시키는 적어도 하나의 검출기를 사용하여 검출될 수 있다. 형광성 방출의 검출은 형광성 방출의 강도를 결정하는 것을 포함할 수 있다. 2개의 형광성 이미지를 수신한 후, 위치 주형은 블록(520)에서, 예를 들면, 주형 발생기(218)에 의해 발생될 수 있다.
위치 주형의 발생은 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드의 클러스터의 위치를 결정하기 위하여 제1 서열분석 주기 동안 필요할 수 있다. 도 6은 핵산 클러스터의 개요 및 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 사용하는 이들의 서열분석을 도시한다. 제1 서열분석 주기 동안, 클러스터의 위치는 알려지지 않는다. 플로우셀은 4개의 클러스터, 즉, 클러스터 1 내지 4를 포함할 수 있다. 제1 서열분석 주기 동안, 주형 발생기(218)는 플로우셀에서 클러스터 1, 2 및 4의 존재를 결정할 수 있다.
제1 서열분석 주기 동안, 제1 서열분석 주기에 상응하는 제1 상태(606)에서 플로우셀의 제1 형광성 이미지(602) 및 제2 형광성 이미지(604)가 발생될 수 있다. 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드의 클러스터로 도입된 뉴클레오타이드 유사체는 다양할 수 있다. 예를 들면, 클러스터 1로 도입된 뉴클레오타이드는 형광성 표지의 제1 유형 및 형광성 표지의 제2 유형 둘 다에 접합된 데옥시아데노신 트라이포스페이트(dATP)의 유사체일 수 있다. 제1 형광성 이미지(602)는 dATP 유사체 상의 형광성 표지의 제1 유형의 형광성 방출을 캡처할 수 있다. 제2 형광성 이미지(604)는 dATP 유사체 상의 형광성 표지의 제2 유형의 형광성 방출을 캡처할 수 있다. 주형 발생기(218)는 제1 형광성 이미지(602) 또는 제2 형광성 이미지(604)로부터 특정한 클러스터 1 위치에서 클러스터 1의 존재를 결정할 수 있다.
클러스터 2에 도입된 뉴클레오타이드는 제2 유형 형광성 표지에 접합되고 형광성 표지의 제1 유형에 접합되지 않은 데옥시시티딘 트라이포스페이트(dCTP)의 유사체일 수 있다. 제2 형광성 이미지는 dCTP 유사체 상의 형광성 표지의 제2 유형의 형광성 방출을 캡처할 수 있다. 제1 형광성 표지 및 제2 형광성 표지가 누화의 대상이 되는 경우, 클러스터 2는 제1 형광성 이미지 상의 일부 형광성 방출을 가질 수 있다. 주형 발생기(218)는 제2 형광성 이미지(604)로부터 특정한 클러스터 2 위치에서 클러스터 2의 존재를 결정할 수 있다.
클러스터 3으로 도입된 뉴클레오타이드는 제1 형광성 표지 또는 제2 형광성 표지에 접합되지 않은 데옥시구아노신 트라이포스페이트(dGTP)의 유사체일 수 있다. 따라서 제1 형광성 이미지(602) 및 제2 형광성 이미지(604)는 클러스터 3으로부터의 형광성 방출을 갖지 않거나 최소로 갖는다. 주형 발생기(218)는 제1 형광성 이미지(602) 및 제2 형광성 이미지(604)로부터 특정한 클러스터 3 위치에서 클러스터 3의 존재를 결정하는데 사용될 수 없다.
클러스터 4로 도입된 뉴클레오타이드는 형광성 표지의 제1 유형와 접합되고 형광성 표지의 제2 유형과 접합되지 않은 데옥시티미딘 트라이포스페이트(dTTP)의 유사체일 수 있다. 제1 형광성 이미지(602)는 dTTP 유사체 상의 형광성 표지의 제1 유형의 형광성 방출을 캡처할 수 있다. 제1 형광성 표지 및 제2 형광성 표지가 누화의 대상이 되는 경우, 클러스터 4는 제2 형광성 이미지(604) 상의 일부 형광성 방출을 가질 수 있다. 주형 발생기(218)는 제1 형광성 이미지로부터 특정한 클러스터 4 위치에서 클러스터 4의 존재를 결정할 수 있다.
주형 발생기(218)는 제1 서열분석 주기에서 제1 형광성 이미지(602) 및 제2 형광성 이미지(604)를 기반으로 한 클러스터 1, 2, 및 4의 위치 주형을 발생시킬 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 위치 주형의 발생은 제1 형광성 표지와 제2 형광성 표지 사이의 누화를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 형광성 표지의 방출이 제1 형광성 이미지(602) 및 제2 형광성 이미지(604) 둘 다에서 캡처될 수 있기 때문에, 누화는 유리하게는, 특히 낮은 다양성 맥락에서, 이미지 등록을 더 강력하게 만들 수 있다.
주기 2: 주형 발생 및 위치 등록
단일-가닥 폴리뉴클레오타이드의 클러스터의 위치를 결정하기 위하여, 무작위 플로우셀이 사용되는 경우, 위치 주형의 발생은 제2 서열분석 주기 동안 필요할 수 있다. 제1 서열분석 주기 후, 클러스터 3의 위치는 알려지지 않을 수 있다. 제2 서열분석 주기 동안 클러스터 3으로 도입된 뉴클레오타이드는 제1 유형 형광성 표지와 접합되고 형광성 표지의 제2 유형과 접합되지 않은 데옥시시티딘 트라이포스페이트(dTTP)의 유사체일 수 있다. 제1 형광성 이미지(612)는 dTTP 유사체 상의 형광성 표지의 제1 유형의 형광성 방출을 캡처할 수 있다. 제2 서열분석 주기 동안, 주형 발생기(218)는 제1 형광성 이미지(612)로부터 특정한 클러스터 3 위치에서 클러스터 3의 존재를 결정할 수 있다. 패턴화된 플로우셀이 사용되는 경우, 주형 발생은 미국 특허 출원 제14/530,299호에 기재되었고, 이의 내용은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
위치 등록 및 강도 추출
도 5에 관하여, 블록(525)에서, 위치 주형에서 클러스터 위치는 제1 서열분석 주기 및 후속적인 서열분석 주기를 위하여 캡처된 형광성 이미지에 등록될 수 있다. 등록된 위치, 예를 들면, 위치 1, 2, 및 4에서 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드의 클러스터의 형광성 강도는 블록(530)에서 추출될 수 있다. 추출된 강도는 보정된 강도를 발생시키기 위하여 535에서 보정될 수 있다. 예를 들면, 강도 보정기(224)에 의해 보정 추출된 강도는 블록(540)에서 공간 정규화, 블록(545)에서 색 보정, 또는 블록(550)에서 위상 보정 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
공간 정규화, 색 보정, 및 위상 보정
공간 정규화는 서열분석 주기의 상이한 형광성 이미지에서 형광성 방출의 강도를 정규화하여 공간 정규화된 강도를 발생시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 각각의 서열분석 주기에서, 제1 형광성 이미지 및 제2 형광성 이미지의 강도의 5% 및 95%는 0 및 1로 정규화될 수 있다. 서열분석 주기가 색인된 판독 내에 있는 경우, 비-색인된 판독의 마지막 주기로부터의 95th 백분위수는 정규화를 위하여 사용될 수 있다. 공간 정규화는 주기 의존적 강도 변동을 감소시킬 수 있다.
도 7A 내지 도 7D는 단일 광원, 2-광학 채널 서열분석을 위한 색 보정 및 위상 보정을 도시한 개략적 플롯이다. 도 7A는 제1 형광성 이미지로부터 추출된 강도 또는 공간 정규화된 강도 대 제1 형광성 표지와 제2 형광성 표지 사이의 누화가 있는 위치(x i , y i )에서 제2 형광성 이미지에서 상응하는 위치로부터 추출된 강도의 산점도이다. x i 는 제2 형광성 이미지에서 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드의 클러스터 i의 공간 정규화된 강도를 나타낸다. y i 는 제1 형광성 이미지에서 성장하는 프라이머-폴리뉴클레오타이드의 클러스터 i의 공간 정규화된 강도를 나타낸다. dGTP 유사체가 제1 형광성 표지 또는 제2 형광성 표지를 포함하지 않기 때문에, 이는 제1 형광성 이미지 또는 제2 형광성 이미지에서 형광성을 갖지 않는다. 따라서 dGTP 유사체의 개체수는 산점도의 위치(0, 0)에 있다. dTTP 유사체가 제1 형광성 표지를 포함하기 때문에, 제1 형광성 이미지에서 형광성 방출을 갖고 제2 형광성 이미지에서 형광성 방출을 갖지 않는다. 따라서 dTTP 유사체의 개체수는 산점도의 위치(0, 1)에 있다. dCTP 유사체가 제2 형광성 표지를 포함하기 때문에, 이는 제2 형광성 이미지에서 형광성 방출을 갖고 제1 형광성 이미지에서 형광성 방출을 갖지 않는다. 따라서 dCTP 유사체의 개체수는 산점도의 위치(1, 0)에 있다. dATP 유사체가 제1 형광성 표지 및 제2 형광성 표지를 포함하기 때문에, 이는 제1 형광성 이미지 및 제2 형광성 이미지에서 형광성 방출을 갖는다. 제1 형광성 표지와 제2 형광성 표지 사이에 누화가 없기 때문에, dATP 유사체의 개체수는 산점도의 위치(1, 1)에 있다.
도 7B는 2개의 형광성 표지가 겹침 방출 스펙트럼을 갖고 누화의 대상이 되는 경우, 산점도의 도식적인 도면을 나타낸다. 제1 형광성 표지 및 제2 형광성 표지가 누화의 대상이 되기 때문에, dTTP 유사체는 제1 형광성 이미지에서 더 강한 방출 및 제2 형광성 이미지에서 더 약한 방출을 갖는다. 따라서, dTTP 유사체의 개체수로부터의 형광성 방출에 상응하는 클라우드는 위치 주변(0, 1), 예를 들면, (0.2, 0.8)에 있다. dCTP 유사체는 제2 형광성 이미지에서 더 강한 방출 및 제1 형광성 이미지에서 더 약한 방출을 갖는다. 따라서 dCTP 유사체의 개체수로부터의 형광성 방출에 상응하는 클라우드는 위치 주변(1, 0), 예를 들면, (0.8, 0.2)에 있다. dATP 유사체의 개체수로부터의 형광성 방출에 상응하는 클라우드는 위치 주변(1, 1), 예를 들면, (0.9, 0.9)에 있다.
제1 형광성 표지와 제2 형광성 표지 사이의 누화를 감소시키거나 제거하기 위하여, 추출된 강도 또는 공간 정규화된 강도는 545에서 색 보정될 수 있다. 색 보정은 각각의 형광성 이미지 내에 강도의 기저 분포의 성질을 사용하여 추출된 강도를 컨디셔닝하는데 색 행렬을 사용할 수 있다.
2-채널 색 행렬은, 예를 들면, 제1 채널 및 제2 채널을 캡처하는 2개의 채널 사이의 누화를 보정하는데 사용되는 2x2 행렬일 수 있다. 제1 채널은 서열분석 주기에서 제1 형광성 이미지 및 제2 형광성 이미지를 캡처할 수 있다. 예를 들면, 제1 형광성 이미지에 상응하는 제1 채널에서 클러스터가 빛이 나는 경우, 일부 방출은 또한 제2 형광성 이미지에 상응하는 제2 채널 중에 수집된다.　색 보정은 누화를 감소시키거나 제거할 수 있는 행렬 보정된 강도를 발생시키는데 2-채널 색 행렬을 사용하는 것을 포함할 수 있다. 색 행렬은 또한 색 채널 사이의 전체 강도에서 임의의 차이를 균형 맞출 수 있다. 색 행렬 M:
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은 형광성 표지 k에 의해 형광성 방출을 캡처하는 채널 j에서 관찰된 강도의 양을 지시하는 누화 계수 Mj,k를 갖는다. 예를 들면, M1,1은 제1 형광성 표지(즉, 형광성 표지 1)에 의한 형광성 방출을 캡처하는 제1 형광성 이미지(즉, 채널 1)에서 관찰된 강도의 양을 지시한다. 예를 들면, M1,2는, 제1 형광성 표지와 제2 형광성 표지 사이의 겹침 방출 스펙트럼 때문에, 제2 형광성 표지(즉, 형광성 표지 2)에 의한 형광성 방출을 캡처하는 제1 형광성 이미지(즉, 채널 1)에서 관찰된 강도의 양을 지시한다.
색 행렬은 초기 서열분석 주기, 예를 들면, 서열분석 주기 1-10의 구성 가능한 세트에 대하여 수집된 클러스터 강도를 기반으로 추정될 수 있다. 이러한 색 행렬은 주기 의존적인 상대적인 강도에 대한 정규화와 함께 서열분석 주기의 나머지에 대하여 사용될 수 있다.
색 행렬은 이들이 겹침 방출 스펙트럼을 갖기 때문에 채널의 쌍 사이의 누화를 추정하는데 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 색 행렬의 추정은 위치(a i, 채널 2 , a i, 채널 1 )에서 플롯팅된 강도를 극좌표로 전환하는 것을 포함할 수 있고, 여기서 i는 클러스터 수를 나타내고, a i, 채널 1 은 제1 채널에서 ith 클러스터의 강도를 나타내고, a i, 채널 2 는 제2 채널에서 ith 클러스터의 강도를 나타낸다. 색 행렬의 추정은 위치(a i, 채널 2 , a i, 채널 1 )에서 플롯팅된 강도로부터 범위 [0, 90]에서 각도 θ i 의 반경 가중된 히스토그램을 컴퓨터 처리하는 것을 포함할 수 있다. 제2 형광성 이미지에서 a i, 채널 2 의 강도 및 제1 형광성 이미지에서 a i, 채널 1 강도를 갖는 클러스터 i에 있어서, 규모 r i 은 강도 a i, 채널 1 및 a i, 채널 2 , 예를 들면, (a i, 채널 1 2 + a i, 채널 2 2)1/2을 기반으로 할 수 있다. 각도 θ i 는 tan-1(a i, 채널 1 / a i, 채널 2 )일 수 있다. 도 7C는 2개의 형광성 표지가 겹침 방출 스펙트럼을 갖고, 누화의 대상이 되는 경우, 반경 가중된 히스토그램의 개략적 도면을 도시한다. 도 7B에서 위치(a i, 채널 1 , a i, 채널 2 )에서 강도는 도 7C에서 반경 가중된 각도 히스토그램으로 전환될 수 있다. 단일 광원, 2 채널 서열분석에 있어서, 반경 가중된 히스토그램은 도 7B에서 각각 dTTP 유사체, dATP 유사체, 및 dCTP 유사체의 클라우드에 상응하는 3개의 피크를 포함한다. dATP 유사체의 클라우드에 상응하는 중심은 약 45°의 각도에 있다.
색 행렬의 추정은 반경 가중된 히스토그램에서 2개의 외부 국소 최대값, θ1 및 θ2를 식별하는 것을 포함할 수 있다. 누화를 갖지 않는 채널에 있어서, θ1은 0°이고, θ2는 90°이다. 행렬에서 누화 계수 M1,2는, 예를 들면, tan(θ1)일 수 있다. 행렬에서 누화 계수 M2,1은, 예를 들면, tan(90-θ2)일 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 불충분한 수의 클러스터가 4개의 뉴클레오타이드 중 하나에 의해 확정될 수 있는 경우, 색 행렬 추정은 이상적이지 않을 수 있고, 식별 행렬이 대신에 사용될 수 있다. 행렬의 대각선 원소는 1일 수 있고, 색 행렬은,
Figure 112019077901794-pct00004
일 수 있다.
색 행렬은 1의 결정 요인을 갖도록 정규화될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 초기 서열분석 주기의 색 행렬은 후속적인 서열분석 주기를 위하여 사용될 수 있다. 보정된 강도는 색 보정된 강도를 발생시키기 위한 색 행렬의 역에 도 7B에서 플롯팅된 강도를 곱하여 계산될 수 있다. 도 7D는 색 보정 후, 도 7B에서 강도의 산점도의 개략적 도면을 도시한다. 보정된 강도와 함께, dGTP, dTTP, dCTP, 및 dATP에 상응하는 개별적인 클러스터가 더 잘 분리될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 형광성 이미지는 타일로 나뉠 수 있고, 색 행렬은 각각의 타일에 대하여 추정될 수 있다. 몇몇 실시형태에 있어서, 색 행렬은 서열분석 주기의 수의 강도를 사용하여 추정될 수 있다. 도 7B 및 도 7D에서 형광성 방출의 클라우드의 크기 및 형상은 오직 예시를 위한 것이다. 예를 들면, 도 7D에서 색 보정 후, dATP 유사체의 개체수에 상응하는 클라우드는 도 7B에서 색 보정 전에 dATP 유사체의 개체수에 상응하는 클라우드보다 더 클 수 있다.
도 5에 관하여, 색 보정된 강도는 블록(550)에서 위상 보정될 수 있다. 합성 과정에 의한 서열분석 동안, 프라이머-폴리뉴클레오타이드의 클러스터에서 각각의 프라이머 또는 확장된 프라이머는 주기당 1개의 염기만큼 확장될 수 있다. 가닥의 적은 비율은 염기 뒤에 떨어지거나(위상) 또는 염기 앞으로 달리는(사전 위상) 최근 서열분석 주기를 갖는 위상이 될 수 있다. 서열분석의 각각의 주기에 있어서, 위상 보정은 데이터 품질, 예를 들면, 위상 행렬을 결정하고 위상 행렬을 추출된 강도에 적용함으로써 데이터 품질을 최대화하기 위하여 계산될 수 있다.
염기 확정
블록(555)에서, 성장하는 프라이머-뉴클레오타이드의 클러스터로 도입된 뉴클레오타이드의 염기는, 예를 들면, 염기 확정기(226)에 의해 결정될 수 있다. 품질 점수는 각각의 확정된 염기에 대하여 결정될 수 있다. 도 6에 관하여, 제1 서열분석 주기에서, 클러스터 1이 제1 형광성 이미지 및 제2 형광성 이미지 둘 다에서 형광성 방출을 갖기 때문에, 도입된 뉴클레오타이드는 dATP 유사체이다. 클러스터 2가 오직 제2 형광성 이미지에서만 형광성 방출을 갖기 때문에, 도입된 뉴클레오타이드는 dCTP 유사체이다. 클러스터 4가 오직 제1 형광성 이미지에서만 형광성 방출을 갖기 때문에, 도입된 뉴클레오타이드는 dTTP 유사체이다.
제2 서열분석 주기에서, 클러스터 1-4로 도입된 뉴클레오타이드는 각각 dGTP, dCTP, dTTP, 및 dATP일 수 있다. 클러스터 3의 존재를 결정한 후, 제1 서열분석 주기 동안 클러스터 3에 도입된 뉴클레오타이드는 제1 형광성 이미지 또는 제2 형광성 이미지에서 형광성 방출을 갖지 않는 dGTP일 수 있다. 제3 서열분석 주기 후, 클러스터 1-4는 각각 AGT, CCA, GTA, 및 TAG의 뉴클레오타이드 서열을 갖도록 결정될 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 블록(555)에서 염기 확정은 블록(535)으로부터 보정된 강도를 기반으로 할 수 있다. 도 7D에서 산점도에 대한 뉴클레오타이드와 개체수 사이의 관련성은 하기와 같이 정의될 수 있다: 제1 채널에서 꺼져 있고 제2 채널에서 꺼져 있는 경우, 도입된 뉴클레오타이드는 dGTP 유사체이고; 개체수가 제2 채널에서 꺼져 있고 제1 채널에서 켜져 있는 경우, 도입된 뉴클레오타이드는 dTTP 유사체이고; 개체수가 제2 채널에서 켜져 있고 제1 채널에서 꺼져 있는 경우, 도입된 뉴클레오타이드는 dCTP 유사체이고; 개체수가 제1 채널에서 켜져 있고 제2 채널에서 켜져 있는 경우, 뉴클레오타이드 도입된 염기 확정은 dATP 유사체이다.
염기 확정은 보정된 강도를 제5 및 제95 백분위수에 의해 (0, 1)로 정규화하는 것을 포함할 수 있다. 4개의 가우시안 분포에 있어서, 각각의 dGTP, dTTP, dCTP, 및 dATP 중 하나는 기대값 최대화 알고리즘을 통해 보정되고 정규화된 강도의 데이터에 맞춰질 수 있다. 기대값 최대화 알고리즘은 데이터에 가장 잘 맞는 평균 및 분포를 결정할 수 있다. 가우시안 분포를 계산한 후, 각각의 개체수에 있어서, 각각의 가우시안에 속한 개체수의 가능성이 계산될 수 있다. 염기 확정은 특정한 가우시안에 속한 개체수의 가장 큰 가능성을 기반으로 할 수 있다. 낮은 다양성 샘플에 있어서, 기대값 최대화 알고리즘은 과다적합 데이터를 피하기 위하여 공분산 행렬을 식별하는데 사용될 수 있다. 서브샘플링 표적은 정확도를 위하여 데이터의 샘플에 더 큰 양으로 생성되지 않을 수 있다.
몇몇 실시형태에 있어서, 개체수는 채스티티(chastity) 행렬에 의해 여과될 수 있다. 채스티티 행렬은, 예를 들면, D1/(D1 + D2)일 수 있다. D1은 가장 가까운 가우시안 평균에 대한 거리일 수 있고, D2는 다음으로 가장 가까운 거리에 대한 거리일 수 있다. 거리는, 예를 들면, 각각의 가우시안 중심 및 고려 중인 점에 의해 정의된 선을 따른 분포의 너비를 고려할 수 있는 마할라노비스(Mahalanobis) 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
블록(560)에서, 하나 이상의 품질 행렬은 블록(565)에서 방법이 종료하기 전에 결정될 수 있다. 서열분석 품질 행렬은 라이브러리 제조, 염기 확정, 판독 정렬, 및 변이체 확정을 포함하는 이러한 과정에서 각각의 단계의 정확도에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다. 프레드(Phred) 품질 점수(Q 점수)에 의해 측정된 염기 확정 정확도는 서열분석 플랫폼의 정확도를 측정하는데 사용될 수 있다. 이는 정해진 염기가 서열분석기에 의해 부정확하게 확정될 확률을 지시할 수 있다. Q 점수는 - 10 log10 P일 수 있고, 여기서 P는 염기 확정 오류 확률이다.
클러스터 스케일링
몇몇 실시형태에 있어서, 보정 강도는 클러스터 스케일링을 포함할 수 있다. 클러스터는 다양한 밝기를 가질 수 있다. 예를 들면, 일부 클러스터는 밝을 수 있고, 일부 클러스터는 어두울 수 있다. 클러스터 밝기는 샘플의 단편 길이 분포에 의해 유발될 수 있다. 클러스터 개체수의 다양한 밝기는 염기 확정 산점도에서 '켜진' 개체수를 연장하는 효과를 가질 수 있다. 개체수 강도 변동을 감소시키기 위하여 처음 10 주기에 이의 평균 강도에 의해 각각의 클러스터의 강도를 정규화하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 처음 10 주기에, 모든 비-구아닌(G) 염기 확정에 있어서, 2개의 반경이 계산될 수 있다: 기원으로부터의 개체수 강도의 거리, 및 기원으로부터의 상응한 가우시안 평균의 거리. 클러스터 스케일링은, 예를 들면, 처음 10 주기 동안 평균화된 이들 2개의 반경의 비의 평균으로의 정규화를 포함할 수 있다. 모든 클러스터 강도는 위상 보정 및 염기 확정이 수행되기 전에 이러한 스케일링 인자에 의해 정규화될 수 있다. 클러스터 스케일링은 유리하게는, 예를 들면, 긴 단편 길이 분포를 갖는 샘플에 있어서, 처리량을 증가시키고 오류율을 감소시킬 수 있다.
단일-광원, 다중-광학 채널 서열분석기
폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템 또는 방법의 실시형태가 본 명세서에 개시된다. 하나의 실시형태에 있어서, 시스템은 광, 예를 들면, 미리 결정된 파장에서의 광을 발생시키도록 구성된 단일 광원, 예를 들면, 레이저 또는 LED 광원을 포함하거나 이와 통신한다. 시스템은 뉴클레오타이드에 부착된 상이한 형광단으로부터의 4개의 실질적으로 상이한 형광성 방출을 검출하도록 구성된 적어도 하나의 검출기를 포함할 수 있거나 이와 통신한다. 시스템은 광원이 뉴클레오타이드 상에 광을 발생하도록 유발할 수 있다. 뉴클레오타이드는 제1 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 제1 유형으로 식별될 수 있다. 뉴클레오타이드는 제2 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 제2 유형으로 식별될 수 있다. 뉴클레오타이드는 제3 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 제3 유형으로 식별될 수 있다. 뉴클레오타이드는 제4 형광성 방출이 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 제4 유형으로 식별될 수 있다. 제1 형광성 방출, 제2 형광성 방출, 제3 형광성 방출, 및 제4 형광성 방출 중 적어도 2종이 실질적으로 상이한 파장을 가질 수 있다.
뉴클레오타이드의 상이한 유형은 상이한 형광단에 부착될 수 있거나 형광단에 부착되지 않을 수 있다. 예를 들면, 제1 유형의 뉴클레오타이드는 단일 광원에 의해 여기될 수 있는 형광단에 부착되지 않을 수 있고, 제1 형광성 방출은 방출을 포함하지 않는다. 또 다른 예에서, 제1 유형의 뉴클레오타이드는 2개의 상이한 형광단에 부착될 수 있고, 제1 형광성 방출은 2개의 상이한 형광단으로부터의 방출을 포함한다.
또 다른 예에서, 제1 형광성 방출은 제1 유형의 제1 뉴클레오타이드에 부착된 제1 형광단으로부터 유래되고, 제2 형광성 방출은 제2 유형의 제2 뉴클레오타이드에 부착된 제2 형광단으로부터 유래되고, 제3 형광성 방출은 제3 유형의 제3 뉴클레오타이드에 부착된 제3 형광단으로부터의 것이고, 제4 형광성 방출은 제4 유형의 제4 뉴클레오타이드에 부착된 제4 형광단으로부터의 것이다. 4개의 형광단은 광원을 사용하여 여기될 수 있다. 하나의 실시에 있어서, 모든 4개의 제1 형광단, 제2 형광단, 제3 형광단, 및 제4 형광단은 상이하다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열은 4개의 상이한 파장에서 4개의 염료에 의한 방출을 기반으로 결정될 수 있다. 또 다른 실시에 있어서, 제1 형광단, 제2 형광단, 제3 형광단, 및 제4 형광단 중 3개는 상이하다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열은 3개의 상이한 파장에서 3개의 염료에 의한 방출을 기반으로 결정될 수 있다. 또 다른 실시에 있어서, 제1 형광단, 제2 형광단, 제3 형광단, 및 제4 형광단 중 2개는 동일하다. 예를 들면, 뉴클레오타이드 서열은 2개의 상이한 파장에서 2개의 염료에 의한 방출을 기반으로 결정될 수 있다.
서열분석 방법
본 명세서에 기재된 방법은 다양한 핵산 서열분석 기술과 함께 사용될 수 있다. 특히 적용 가능한 기술은 이들의 상대적인 위치가 변하지 않도록 핵산이 어레이에서 고정된 위치에 부착되고 어레이가 반복적으로 이미지화되는 것이다. 이미지가 상이한 색 채널에서 수득되는 실시형태는, 예를 들면, 하나의 뉴클레오타이드 염기 유형을 또 다른 것과 구별하는데 사용되는 상이한 표지와 동시에 특히 적용 가능하다. 몇몇 실시형태에 있어서, 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 과정은 자동화된 과정일 수 있다. 바람직한 실시형태는 합성에-의한-서열분석(sequencing-by-synthesis: "SBS") 기술을 포함한다.
"합성에-의한-서열분석("SBS") 기술"은 일반적으로 주형 가닥에 대하여 뉴클레오타이드의 반복 첨가를 통해 발생기 핵산 가닥의 효소적 연장을 포함한다. SBS의 전통적인 방법에서, 단일 뉴클레오타이드 단량체는 각각의 전달에서 폴리머라제의 존재하에 표적 뉴클레오타이드에 제공될 수 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 방법에서, 뉴클레오타이드 단량체의 하나 이상의 유형은 전달에서 폴리머라제의 존재하에 표적 핵산에 제공될 수 있다.
용어
적어도 몇몇 상기 기재된 실시형태에 있어서, 실시형태에서 사용된 하나 이상의 요소는, 이러한 대체가 달리 기술적으로 실현 가능하지 않는 한, 또 다른 실시형태에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 당업자는 다양한 다른 생략, 첨가 및 변형이 청구된 주제의 범위를 벗어나지 않고 상기 기재된 방법 및 구조에 대하여 만들어질 수 있다는 것을 인식할 것이다. 모든 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구항에 의해 정의된 바와 같이 주제의 범위 내에 속하는 것으로 의도된다.
본 명세서에서 실질적으로 임의의 복수형 및/또는 단수형 용어의 사용에 관하여, 당업자는, 맥락 및/또는 적용에 적절하다면, 복수형에서 단수형으로 및/또는 단수형에서 복수형으로 번역할 수 있다. 다양한 단수형/복수형 치환은 명확함을 구하기 위하여 본 명세서에 명백하게 기재될 수 있다.
당업자라면, 일반적으로 본 명세서 및 특히 첨부된 청구항(예를 들면, 첨부된 청구항의 본체)에서 사용되는 용어는 일반적으로 "개방형" 종결로서 의도되는(예를 들면, 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이에 한정되지 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "포함하지만 이에 한정되지 않는다" 등으로 해석되어야 하는) 것을 이해할 것이다. 당업자들은 도입된 청구항 기재의 특정한 수가 의도되는 경우, 이러한 의도는 청구항에서 명백하게 기재될 것이고, 이러한 기재가 없는 경우, 이러한 의도는 존재하지 않는다는 것을 추가로 이해할 것이다. 예를 들면, 이해를 돕기 위하여, 하기 첨부된 청구항은 청구항 기재를 소개하는 도입구 "적어도 하나" 및 "하나 이상"의 사용을 포함할 수 있다. 그러나, 이러한 구의 사용은, 심지어 동일한 청구항이 도입구 "하나 이상" 또는 "적어도 하나" 및 단수 표현을 포함하는 경우에도(예를 들면, 단수표현은 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"의 의미로 해석되야 함), 단수 표현에 의한 청구항 기재의 소개가 이러한 소개된 청구항 기재를 포함하는 임의의 특정한 청구항을 오직 하나의 이러한 기재를 포함하는 실시형태로 한정하는 것을 암시하는 것으로 해석되어서는 안되고; 청구항 기재를 소개하는데 사용되는 정관사의 사용에 대하여도 마찬가지이다. 추가로, 심지어 소개된 청구항 기재의 특정한 수가 명백하게 기재되는 경우에도, 당업자는 이러한 기재가 적어도 기재된 수를 의미하는 것으로 해석되어야 하는 것을 인식할 것이다(예를 들면, 다른 수식어 없이 "2개의 기재"의 기본적인 기재는 적어도 2개의 기재, 또는 2개의 기재를 의미함). 추가로, "A, B, 및 C 등 중 적어도 하나"과 유사한 관례가 사용되는 예에서, 일반적으로 이러한 구조는 당업자가 관례를 이해할 것을 의도한다(예를 들면, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함할 것이지만 이에 한정되지 않는다). "A, B, 및 C 등 중 적어도 하나"과 유사한 관례가 사용되는 예에서, 일반적으로 이러한 구조는 당업자가 관례를 이해할 것을 의도한다(예를 들면, "A, B, 및 C 중 적어도 하나를 갖는 시스템"은 A 단독, B 단독, C 단독, A 및 B 함께, A 및 C 함께, B 및 C 함께, 및/또는 A, B, 및 C 함께 등을 갖는 시스템을 포함할 것이지만 이에 한정되지 않는다). 당업자는 설명, 청구항, 또는 도면에서 사실상 2개 이상의 대안적인 용어를 나타내는 임의의 이접적 접속사 단어 및/또는 구는 용어 중 하나, 용어 중 어느 쪽, 또는 용어 둘 다를 포함하는 가능성을 고려하는 것으로 이해되어야 한다는 것이 추가로 이해할 것이다. 예를 들면, 구 "A 또는 B"는 "A" 또는 "B" 또는 "A 및 B"의 가능성을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
추가로, 본 개시내용의 특징 또는 측면이 마쿠쉬 그룹의 면에서 기재되는 경우, 당업라면 본 개시내용이 또한 이로써 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별적인 일원 또는 일원의 하위 그룹의 면에서 기재된다는 것을 인식할 것이다.
당업자가 이해할 것인 바와 같이, 임의의 그리고 모든 목적을 위하여, 예를 들면, 기재된 설명을 제공하는 면에서, 본 명세서에 개시된 모든 범위는 또한 임의의 그리고 모든 가능한 하위범위 및 이의 하위범위의 조합을 포함한다. 임의의 열거된 범위는 동일한 범위를 적어도 절반, 1/3, 1/4, 1/5, 1/10 등으로 나누는 것을 충분히 기재하고 가능하게 함에 따라 용이하게 인식될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 명세서에 논의된 각각의 범위는 상부 1/3, 중간 1/3 및 하부 1/3으로 용이하게 나뉠 수 있다. 또한 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, "이하", "적어도", "초과", "미만" 등과 같은 모든 언어는 상기 기재된 수를 포함하고, 논의된 바와 같은 하위범위로 후속적으로 나뉠 수 있는 범위를 지칭한다. 최종적으로, 당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 범위는 각각의 개별적인 일원을 포함한다. 따라서, 예를 들면, 1 내지 3개의 물품을 갖는 군은 1, 2, 또는 3개 물품을 갖는 군을 지칭한다. 유사하게, 1 내지 5개의 물품을 갖는 군은 1, 2, 3, 4 또는 5개의 물품을 갖는 군 등을 지칭한다.
다양한 측면 및 실시형태가 본 명세서에 기재되었지만, 다른 측면 및 실시형태가 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서에 개시된 다양한 측면 및 실시형태는 설명의 목적을 위한 것이고 제한되는 것을 의도하지 않으며, 진정한 범위 및 취지는 하기 청구항에 의해 지시된다.

Claims (44)

  1. 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템으로서,
    형광성 광의 방출을 자극하도록 구성된 단일 광원;
    뉴클레오타이드에 부착된 형광단으로부터의 형광성 방출을 검출하도록 구성된 적어도 하나의 검출기로서, 제1 파장 및 제2 파장에서 상기 형광성 방출을 검출하도록 구성되는, 상기 적어도 하나의 검출기; 및
    명령어를 실행하도록 구성된 프로세서를 포함하되, 상기 명령어는,
    상기 광원으로부터의 광을 뉴클레오타이드 상에 발생시키는 단계;
    상기 적어도 하나의 검출기로부터 둘 이상의 상기 형광성 방출의 둘 이상의 강도를 수신하는 단계;
    상기 둘 이상의 강도를 색 보정하여 색 보정된 강도를 발생시키는 단계;
    형광성 방출이 상기 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되지 않는 경우, 상기 뉴클레오타이드를 제1 유형으로 식별(identifying)하는 단계;
    광의 상기 제1 파장에서 색 보정된 강도를 갖는 형광성 방출이 상기 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 상기 뉴클레오타이드를 제2 유형으로 식별하는 단계;
    광의 상기 제2 파장에서 색 보정된 강도를 갖는 형광성 방출이 상기 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 상기 뉴클레오타이드를 제3 유형으로 식별하는 단계; 및
    광의 상기 제1 파장 및 상기 제2 파장에서 색 보정된 강도를 갖는 형광성 방출이 상기 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 상기 뉴클레오타이드를 제4 유형으로 식별하는 단계
    를 포함하는 방법을 수행하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 둘 이상의 강도를 색 보정하는 것이 색 행렬을 추정하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 상기 색 행렬을 추정하는 것이,
    2 채널에서 관찰된 강도의 산점도로부터 반경 가중된 각진 히스토그램을 생성시키는 것; 및
    상기 반경 가중된 각진 히스토그램에서 2개의 외부 국소 최대값 θ1 및 θ2의 각도를 추정하는 것을 포함하고,
    상기 색 행렬이
    Figure 112019077901794-pct00005
    인, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 상기 시스템이 적어도 하나의 유체 채널을 갖는 플로우셀(flowcell)을 위한 마운팅 스테이지(mounting stage)를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 상기 광원이 레이저이고, 상기 레이저에 의해 발생된 광의 미리 결정된 파장이 400㎚ 내지 800㎚인, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 상기 광원이 발광 다이오드이고, 상기 발광 다이오드에 의해 발생된 광의 미리 결정된 파장이 400㎚ 내지 800㎚인, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1 파장과 상기 제2 파장이 서로 적어도 10㎚만큼 떨어져 있는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제1 파장과 상기 제2 파장이 서로 최대로 100㎚만큼 떨어져 있는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템.
  12. 제1항에 있어서, 상기 프로세서가 상기 형광성 방출에서 상기 제1 파장과 상기 제2 파장 사이의 누화를 식별하도록 더 구성되는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는 시스템.
  13. 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법으로서,
    광원을 사용하여 뉴클레오타이드에 부착된 형광단 상에 형광성 광 방출을 발생시키는 단계;
    적어도 하나의 검출기를 사용하여 제1 파장 및 제2 파장에서 상기 뉴클레오타이드에 부착된 상기 형광단으로부터 상기 형광성 광 방출의 강도를 검출하는 단계;
    상기 형광성 방출의 강도를 색 보정하여 색 보정된 강도를 발생시키는 단계;
    및
    상기 뉴클레오타이드를 식별하는 단계를 포함하되, 상기 뉴클레오타이드를 식별하는 단계는,
    형광성 방출이 상기 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되지 않는 경우, 상기 뉴클레오타이드를 제1 유형으로 식별하는 단계;
    광의 상기 제1 파장에서 색 보정된 강도를 갖는 형광성 방출이 상기 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 상기 뉴클레오타이드를 제2 유형으로 식별하는 단계;
    광의 상기 제2 파장에서 색 보정된 강도를 갖는 형광성 방출이 상기 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 상기 뉴클레오타이드를 제3 유형으로 식별하는 단계; 및
    광의 상기 제1 파장 및 상기 제2 파장에서 색 보정된 강도를 갖는 형광성 방출이 상기 적어도 하나의 검출기에 의해 검출되는 경우, 상기 뉴클레오타이드를 제4 유형으로 식별하는 단계를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서, 상기 광원이 레이저이고, 상기 레이저에 의해 발생된 광의 미리 결정된 파장이 450㎚ 내지 490㎚인, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 광원이 발광 다이오드이고, 상기 발광 다이오드에 의해 발생된 광의 미리 결정된 파장이 450㎚ 내지 490㎚인, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 제1 파장과 상기 제2 파장이 서로 적어도 20㎚만큼 떨어져 있는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 제1 파장과 상기 제2 파장이 서로 최대로 200㎚만큼 떨어져 있는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 형광단은 제1 형광성 표지 또는 제2 형광성 표지를 포함하고,
    형광성 광 방출의 강도를 검출하는 것이 제1 형광성 이미지 및 제2 형광성 이미지를 수신하는 것을 포함하고, 상기 제1 형광성 이미지가 상기 제1 파장에서 포착되며, 상기 제2 형광성 이미지가 상기 제2 파장에서 포착되는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제1 형광성 표지가 알렉사 488, 3,6-비스(에틸아미노)-2,7-다이메틸-[2-카복실레이토-5-(3-카복시프로필옥시)페닐]크산틸륨 베타인(염료 I-3), 또는 3,6-비스(에틸아미노)-2,7-다이메틸-[2-카복실레이토-4-(3-카복시프로필옥시)페닐]크산틸륨 베타인(염료 I-4)을 포함하고, 상기 제2 형광성 표지가 염료 NR520LS를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 제1 형광성 표지가 Cy3 염료를 포함하고, 상기 제2 형광성 표지가 Cy3-Cy5 염료 쌍을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  22. 제19항에 있어서, 상기 강도를 색 보정하기 전에,
    상기 제1 및 제2 형광성 이미지로부터 상기 형광단으로부터 상기 제1 파장 및 제2 파장에서 형광성 광 방출의 강도를 추출하는 단계를 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 제1 및 제2 형광성 이미지로부터 강도를 추출하기 전에,
    위치 주형을 발생시키는 단계; 및
    상기 위치 주형 내 위치를 상기 제1 및 제2 형광성 이미지에 등록시키는 단계를 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 제1 및 제2 형광성 이미지로부터 강도를 추출한 후 상기 강도를 색 보정하기 전에,
    상기 강도를 공간 정규화하는 것; 및
    상기 강도를 위상 보정하는 것을 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 강도를 위상 보정하는 것이,
    위상 행렬을 결정하는 것; 및
    상기 위상 행렬을 상기 강도에 적용하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  26. 제23항에 있어서, 상기 위치 주형을 발생시키는 것은 상기 제1 및 제2 형광성 이미지에서 상기 제1 형광성 표지와 상기 제2 형광성 표지 사이의 누화를 검출하는 것을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  27. 제19항에 있어서, 상기 제1 형광성 표지 및 상기 제2 형광성 표지가 누화의 대상이 되는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  28. 제19항에 있어서, 상기 제1 유형의 뉴클레오타이드가 상기 제1 형광성 표지 또는 상기 제2 형광성 표지에 접합되지 않고, 상기 제2 유형의 뉴클레오타이드가 상기 제1 형광성 표지에 접합되고, 상기 제3 유형의 뉴클레오타이드가 상기 제2 형광성 표지에 접합되고, 상기 제4 유형의 뉴클레오타이드가 상기 제1 형광성 표지 및 상기 제2 형광성 표지 중 하나에 접합되어 있는, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
  29. 제13항에 있어서, 상기 제1 유형의 뉴클레오타이드가 dGTP의 유사체이고, 상기 제2 유형의 뉴클레오타이드가 dTTP의 유사체이고, 상기 제3 유형의 뉴클레오타이드가 dCTP의 유사체이고, 상기 제4 유형의 뉴클레오타이드 트라이포스페이트가 dATP의 유사체인, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하기 위한 컴퓨터 실행 방법.
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  43. 제4항에 있어서, 상기 강도를 색 보정하는 단계는
    역 색 행렬(inverse color matrix)을 얻기 위하여 상기 색 행렬을 반전시키는 단계; 및
    상기 색 보정된 강도를 포함하는 벡터를 생성하기 위해 상기 역 색 행렬을 둘 이상의 강도를 포함하는 벡터와 곱하는 단계를 더 포함하는, 시스템.
  44. 제5항에 있어서, 상기 반경 가중된 각진 히스토그램은 3 개의 최대값을 갖는, 시스템.
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