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KR102276424B1 - 로-키나제 저해제를 포함하는 세포의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

로-키나제 저해제를 포함하는 세포의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도 Download PDF

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KR102276424B1
KR102276424B1 KR1020140134481A KR20140134481A KR102276424B1 KR 102276424 B1 KR102276424 B1 KR 102276424B1 KR 1020140134481 A KR1020140134481 A KR 1020140134481A KR 20140134481 A KR20140134481 A KR 20140134481A KR 102276424 B1 KR102276424 B1 KR 102276424B1
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Abstract

세포의 노화를 감소시키기 위한 조성물, 포유동물에서 세포의 노화를 감소시키는 방법, 및 포유동물에서 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하는 방법을 제공한다.

Description

로-키나제 저해제를 포함하는 세포의 노화를 감소시키기 위한 조성물 및 그의 용도{Composition for reducing cell senescence comprising Rho-kinse inhibitor and use thereof}
세포의 노화를 감소시키기 위한 조성물, 포유동물에서 세포의 노화를 감소시키는 방법, 및 포유동물에서 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.
노화는 세포 분열 (cellular division)의 영구적 정지 (permanent halt)로서 정의될 수 있다. 복제 노화 (replicative senescence) 또는 세포 노화 (cellular senescence)는 세포 수준에서 에이징 (aging)을 위한 모델로서 관찰되었다. 세포가 연속으로 배양되는 경우, 많은 회수의 분열을 하지만, 에이징에 따라 세포는 더 이상 분열할 수 없다. 노화된 세포는 실제로 프로그램된 세포사 (programmed cell death)에 저항성이며 일부 노화된 세포는 수년 동안 비증식 상태 (nondividing state)로 유지되었다.
로-키나제 (Rho-kinase)는 세린-트레오닌 키나제의 AGC (PKA/PKG/PKC) 패밀리에 속하는 키나제이다. ROCK들 (ROCK1 및 ROCK2)은 포유동물, zebrafish, Xenopus 등에 존재한다. 인간 ROCK1은 분자량 150 kDa이며 작은 GTPase RhoA의 주요 하류 효과기 (effector)이다. 포유동물 ROCK은 키나제 도메인, 코일된-코일 영역 (coiled-coil region) 및, RhoA-GTP가 존재하지 않는 경우, 자기억제적 세포내 접힘 (autoinhibitory intramolecular fold)에 의한 ROCK들의 키나제 활성을 감소시키는 Pleckstrin homology (PH) 도메인으로 구성된다.
상기한 선행기술에 의하더라도, 세포의 노화를 감소시키는 조성물 및 방법이 요구되고 있다.
일 양상은 세포의 노화를 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
다른 양상은 포유동물에서 세포의 노화를 감소시키는 방법을 제공한다.
다른 양상은 포유동물에서 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 로-키나제 저해제 (Rho-kinase inhibitor)를 유효성분으로 포함하는, 세포의 노화를 감소시키기 위한 조성물을 제공한다.
로-키나제 (Rho-kinase) (이하 "로-연관 단백질 키나제 (Rho-associated protein kinase: ROCK)"라고도 한다)는 세린-트레오닌 키나제의 AGC (PKA/PKG/PKC) 패밀리에 속하는 키나제이다. ROCK들 (ROCK1 및 ROCK2)은 포유동물, zebrafish, Xenopus 등에 존재한다. 인간 ROCK1은 분자량 150 kDa이며 작은 GTPase RhoA의 주요 하류 효과기 (effector)이다. 포유동물 ROCK은 키나제 도메인, 코일된-코일 영역 (coiled-coil region) 및, RhoA-GTP가 존재하지 않는 경우, 자기억제적 세포내 접힘 (autoinhibitory intramolecular fold)에 의한 ROCK들의 키나제 활성을 감소시키는 Pleckstrin homology (PH) 도메인으로 구성된다.
상기 로-키나제 저해제는 Y-27632 ((1R,4R)-4-((R)-1-aminoethyl)-N-(pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide), SR3677 (N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamide], Fasudil (5-(1,4-diazepane-1-sulfonyl)isoquinoline), 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 입체이성질체, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 세포의 노화를 감소시키는 것은 세포의 노화를 지연 또는 방지하거나, 노화된 세포 (senescent cell)를 그 보다 젊은 세포 (young cell)로 전환시키는 것을 포함한다.
상기 조성물에 있어서, 세포의 노화를 감소시키는 것은 세포의 증식능을 증가시키는 것, 리포푸신 축적을 감소시키는 것, β-갈락토시다제 활성을 감소시키는것, 미토콘드리아 활성 산소 종을 감소시키는 것, 미토콘드리아 막 전위를 높이는 것, 및 세포의 G0 및/또는 G1기의 기간을 감소시키는 것 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포는 myoblast를 포함한 근육세포, 섬유아세포 (fibroblast), 조기노화세포 (cell from a subject suffering Hutchinson-Gilford progeria syndrome), 또는 신경세포일 수 있다.
상기 조성물은 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하기 위한 것일 수 있다. 상기 세포 노화와 연관된 증상은 피부주름, 상처 재생 저하, 근감소증, 조기노화증 (Hutchinson-Gilford progeria syndrome), 또는 그 조합인 것일 수 있다. 상기 세포 노화와 연관된 증상은 리포푸신의 축적과 연관된 증상인 것일 수 있다. 상기 리포푸신의 축적과 연관된 증상은 신경 세로이드 리포푸신증 (neuronal ceroid lipofuscinoses: NCL), 나이 관련 황반변성 (Age-related macular degeneration), 신경근섬유의 엉킴 (neurofibrillary tangles), 심장의 갈색위축 (Brown atrophy of the heart), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 루게릭 병 (amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 말단 비대증 (acromegaly), 탈신경 위축증 (denervation atrophy), 지질 축적 근질환 (lipid myopathy), 만성 폐쇄성 폐 질환 (chronic obstructive pulmonary disease: COPD)인 것일 수 있다. 또한, 상기 세포의 노화와 연관된 증상은 미토콘드리아 활성 산소 종의 증가, 미토콘드리아 막 전위의 감소 또는 이들의 조합과 같은 미토콘드리아 손상에 의하여 야기되는 질환일 수 있다. 또한, 상기 세포의 노화와 연관된 증상은 세포 내 β-갈락토시다제 활성의 증가에 의하여 야기되는 것일 수 있다.
상기 로-키나제 저해제는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. 상기 염은 약학 분야, 예를 들면 세포의 노화와 연관된 질환 분야에서 사용되는 통상의 산 부가염, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 설팜산, 인산 또는 질산과 같은 무기산으로부터 유도된 염 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 시트르산, 말레산, 말론산, 메탄술폰산, 타르타르산, 말산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 옥살산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한, 상기 염은 통상의 금속 염 형태, 예를 들면 리튬, 소듐, 칼륨, 마그네슘, 또는 칼슘과 같은 금속으로부터 유도된 염을 포함한다. 상기 산 부가염 또는 금속염은 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 로-키나제 저해제는 또한 그의 용매화합물 (solvate)의 형태일 수 있다. "용매화물"이란 하나 이상의 용질 분자, 즉 로-키나제 저해제 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 하나 이상의 용매 분자에 의해 형성되는 복합체 또는 집합체를 의미한다. 용매화물은 예를 들면 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세트산과 형성된 복합체 또는 집합체일 수 있다.
상기 로-키나제 저해제는 또한 그의 입체이성질체의 형태일 수 있다. 상기 입체이성질체는 거울상 이성질체 (enantiomer) 및 부분입체이성질체 (diastereomer)와 같은 모든 입체이성질체를 포함한다. 상기 화합물은 입체이성질체의 순수 형태 (stereoisomerically pure form) 또는 하나 이상의 입체이성질체의 혼합물, 예를 들면 라세미 혼합물일 수 있다. 특정 입체이성질체의 분리는 당해 분야에 공지된 통상의 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다.
상기 조성물에 있어서, 상기 세포는 사람을 포함한 포유동물의 세포일 수 있다. 상기 포유동물은 세포의 노화와 연관된 질병을 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은, 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분의 적용을 돕기 위하여 활성 성분과 조합되어 사용되는 물질, 일반적으로 불활성 물질을 나타낸다. 상기 담체는 통상적인 약제학적으로 허용가능한 부형제, 첨가제 또는 희석제를 포함한다. 상기 담체는 예를 들면 충전제 (filler), 결합제 (binder), 붕해제 (disintergrant), 버퍼, 보존제, 항산화제, 활택제, 향미제, 점증제 (thickener), 발색제 (coloring agent), 유화제, 현탁화제, 안정화제, 및 등장화제로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 조성물은, 상기 로-키나제 저해제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 "치료학적 유효량"으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물에 있어서, "치료학적 유효량"은 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 치료 효과를 나타내기에 충분한 양을 의미한다. 용어 "치료"는 개체, 예를 들면 사람을 포함한 포유동물에서 질환 또는 의학적 증상, 예를 들면 세포의 노화와 연관된 질병을 치료함을 의미하고, 이는 다음을 포함한다: (a) 질환 또는 의학적 증상의 발생을 예방, 즉, 환자의 예방적 치료; (b) 질환 또는 의학적 증상의 완화, 즉, 환자에서 질환 또는 의학적 증상의 제거 또는 회복 야기; (c) 질환 또는 의학적 증상의 억제, 즉, 개체에서 질환 또는 의학적 증상의 진행을 늦춤 또는 정지; 또는 (d) 개체에서 질환 또는 의학적 증상을 경감. 상기 "유효량"은 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 "유효량"은 0.01mg 내지 10,000mg, 0.1mg 내지 1000mg, 1mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 1000mg, 0.01mg 내지 100mg, 0.01mg 내지 10mg, 또는 0.01mg 내지 1mg일 수 있다.
상기 조성물은 경구 투여하거나, 정맥내, 복강내, 피하, 직장 및 국소투여를 포함한 비경구로 투여될 수 있다. 따라서, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 수성액제 또는 현탁제 등의 다양한 형태로 제제화될 수 있다. 경구용 정제의 경우 락토즈, 옥수수 전분 등의 부형제 및 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제가 통상 가해질 수 있다. 경구투여용 캡슐제의 경우, 락토즈 및/또는 건조 옥수수 전분이 희석제로서 사용될 수 있다. 경구용 수성 현탁제가 필요할 경우, 활성성분을 유화제 및/또는 현탁화제와 결합시킬 수 있다. 필요할 경우, 특정 감미제 및/또는향미제를 가할 수 있다. 신경내, 근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 투여의 경우, 활성성분의 멸균 용액이 통상 제조되며, 용액의 pH를 적합하게 조절하고 완충시켜야 한다. 정맥내 투여의 경우, 용질의 총 농도는 제제에 등장성이 부여되도록 조절되어야 한다. 상기 조성물은 pH가 7.4인 염수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 수용액제의 형태일 수 있다. 상기 용액은 국소 주사 (local bolus injection)로 환자의 근육내 또는 신경내 혈류에 도입될 수 있다.
본 명세서에 있어서, "세포의 노화 (senescence of a cell)"는 표준 세포 (reference cell)에 비하여 세포의 증식능의 감소, 리포푸신 축적, β-갈락토시다제 활성 증가, 미토콘드리아 활성 산소 종 증가, 미토콘드리아 막 전위 감소, 및 세포의 G0 및/또는 G1기의 기간의 감소 중 하나 이상을 포함하거나, 그를 야기하는 과정을 나타낸다. "젊은 세포 (young cell)"란 표준 세포 (reference cell)에 비하여 세포의 증식능의 증가, 리포푸신 축적 감소, β-갈락토시다제 활성 감소, 미토콘드리아 활성 산소 종 감소, 미토콘드리아 막 전위 증가, 및 세포의 G0 및/또는 G1기의 기간의 증가 중 하나 이상을 포함하는 것을 나타낸다.
상기 조성물은 세포의 노화와 연관 질환을 치료하기 위한 하나 이상의 다른 치료제와 함께 조합될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 세포의 노화와 연관 질환을 치료하기 위한 다른 활성 성분을 포함하지 않고, 로-키나제 저해제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 유효량의 로-키나제 저해제를 포유동물에게 투여하여, 세포의 노화를 감소시키는 단계:를 포함하는, 포유동물에서 세포의 노화를 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 "로-키나제 저해제", "세포의 노화를 감소시키는 것" 및 "포유동물"에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 유효량은 세포의 노화를 갖는 개체에 투여되는 경우, "세포의 노화를 감소시키기에 충분한 양"을 의미한다. 상기 투여는 상기한 "로-키나제 저해제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물"을 포함하는 상기한 바와 같은 조성물을 투여하는 것일 수 있다.
다른 양상은 유효량의 로-키나제 저해제를 포유동물에게 투여하여, 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하는 단계:를 포함하는, 포유동물에서 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 "로-키나제 저해제", "세포의 노화와 연관된 증상" 및 "포유동물"에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 유효량은 세포의 노화와 연관된 증상을 갖는 개체에 투여되는 경우, "세포의 노화와 연관된 증상을 치료하기에 충분한 양"을 의미한다. 상기 투여는 상기한 "로-키나제 저해제 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물"을 포함하는 상기한 바와 같은 조성물을 투여하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 당업자는 투여시 투여경로는 환자의 상태에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 투여는 경구, 비경구, 또는 국부 투여일 수 있다. 상기 투여는 노화 세포를 포함하는 조직에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다. 상기 투여는 피부 조직, 근육 조직, 또는 신경 조직에 국소적으로 투여하는 것일 수 있다.
상기 방법에 있어서, 투여량은 전술한 바와 같이 환자의 상태, 투여 경로, 주치의의 판단 등과 같은 다양한 인자들에 따라서 다양해진다. 효과적인 투여량은 체외실험 또는 동물 모델 시험에서 얻어진 용량-반응곡선으로부터 추정할 수 있다. 투여되는 조성물에 존재하는 본 발명의 화합물의 비율 및 농도는 화학적 특성, 투여 경로, 치료적 투여량 등에 따라 결정될 수 있다. 상기 투여량은 개체에게 약 1 μg/kg 내지 약 1 g/kg per day, 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 500 mg/kg per day의 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 용량은 개체의 나이, 체중, 감수성, 또는 증상에 따라 변경될 수 있다.
일 양상에 따른 로-키나제 저해제, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 포함하는 조성물은 세포의 노화를 감소시키는데 사용될 수 있다.
다른 양상에 따른 포유동물에서 세포의 노화를 감소시키는 방법에 의하면, 포유동물에서 세포의 노화를 효율적으로 감소시킬 수 있다.
다른 양상에 따른 포유동물에서 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하는 방법에 의하여, 포유동물에서 세포의 노화와 연관된 증상을 효율적으로 치료할 수 있다.
도 1은 로-키나제 저해제, Y27632, Fasudil 및 SR3477의 농도에 따른 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 로-키나제 저해제, Y27632 (5 uM), Fasudil (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 노화 섬유아세포 (37세대 세포)를 배양한 경우 세포수를 나타낸 도면이다.
도 3은 로-키나제 저해제, Y27632 (5uM)의 존재하에서 노화된 섬유아세포 (37세대 세포)의 세포 형태를 나타낸 도면이다.
도 4는 로-키나제 저해제, Y27632 및 Fasudil 존재가 노화된 섬유아세포 (37세대 세포)의 세포 주기에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.
도 5는 로-키나제 저해제, Y27632 (5 uM), Fasudil (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 섬유아세포 (37세대 세포)를 아가 함유 배지에서 배양한 결과를 나타낸다.
도 6 내지 8은 로-키나제 저해제, Y27632 (5 uM), Fasudil (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 섬유아세포 (37세대 세포)의 SA-β-galactosidase 활성 (a 및 b) 및 상기 활성을 보이는 세포의 비율 (c)를 나타낸 도면이다.
도 9는 로-키나제 저해제, Y27632 (5 uM), Fasudil (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 섬유아세포 (37세대 세포)의 세포 중의 리포푸신의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 10는 로-키나제 저해제, Y27632 (5 uM), Fasudil (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 섬유아세포 (37세대 세포)에 대한 활성산소종을 측정한 결과를 나타낸다.
도 11은 로-키나제 저해제, Y27632 (5 uM), Fasudil (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 섬유아세포 (37세대 세포)에 대한 미토콘드리아 활성 전위를 측정한 결과를 나타낸다.
도 12는 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 섬유아세포 (38세대 세포)에 대한 DNA 손상 정도를 DNA 코멧 어세이 (comet assay)를 통해서 측정한 결과이다.
도 13은 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 근모세포 (myoblast) (11 세대 세포)에 대한 세포 형태 변화를 나타낸 도면이다.
도 14는 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 근모세포 (11 세대 세포)의, 세포 중의 리포푸신의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 15는 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 근모세포 (11 세대 세포)에 대한 활성산소종을 측정한 결과를 나타낸다.
도 16은 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 근모세포 (11 세대 세포)에 대한 미토콘드리아 활성 전위를 측정한 결과를 나타낸다.
도 17은 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 조기노화 섬유아세포 (progera fibroblast) (17세대 세포)에 대한 세포 형태 변화를 나타낸 도면이다.
도 18은 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 조기노화 섬유아세포 (17세대 세포)의, 세포 중의 리포푸신의 양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 19는 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 조기노화 섬유아세포 (17세대 세포)에 대한 활성산소종을 측정한 결과를 나타낸다.
도 20은 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 조기노화 섬유아세포 (17세대 세포)에 대한 미토콘드리아 활성 전위를 측정한 결과를 나타낸다.
도 21은 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 조기노화 섬유아세포 (17세대 세포)에 대한 DNA 손상 정도를 DNA 코멧 어세이(comet assay)를 통해서 측정한 결과이다.
도 22는 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 조기노화 섬유아세포 (17세대 세포)의 SA-β-galactosidase 활성 및 상기 활성을 보이는 세포의 비율을 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 :
(1) Y27632 , Fasudil , 및 SR3677 이 노화된 섬유아세포 (37세대 세포)의 세포 증식에 미치는 영향
섬유아세포 (fibroblast) 세포주를 10% FBS (fetal bovine serum)와 100 unit/ml 페니실린, 및 100 ug/ml 스트렙토마이신 (두 항생제는 Gibro-BRL, Grand Island, NY로부터 구입)이 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에 넣고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 섬유아세포 세포주 (M11 strain)는 11 살 남자 아이의 음경 포피로부터 유래된 세포주이다. 계대 배양은 세포가 플레이트에 85% 정도 밀집 (confluency)이 되었을 때 실시하였다. 초기 계대 배양은 세포를 1:4로 분할하여 배양하고, 후기 계대 배양은 세포를 1:2로 분할하여 배양한다. 세포 배가 시간이 14일이 되었을 때, 세포를 노화 섬유아세포라고 여긴다 (35 내지 37 세대 세포).
로-키나제 저해제 Y-27632 (Selleckchem, S1049, 50 mg 2HCl 염 형태), FASUDIL (Selleckchem, S1573, 500mg HCl 염 형태), 및 SR3677 (Synkinase, SYN1083, 10mg)를 처리할 때 가장 적합한 농도를 정하기 위해서, 6-웰 플레이트의 각 웰에 2,000 cells/well의 농도로 노화 섬유아세포 (37세대 세포)를 접종하고, 각각의 웰에 Y-27632 (1 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 30 uM), FASUDIL (1 uM, 5 uM, 10 uM, 20 uM, 30 uM), SR3677 (0.01 uM, 0.05 uM, 0.1 uM, 0.5 uM, 1 uM) 농도로 처리하였다. 또한, 음성 대조군으로서 DMSO를 사용한 것을 제외하고 동일하게 하였다. 4일에 한 번씩 약물이 포함된 배지를 갈아 주었고, 약물을 넣어 준 4주 후, 0.05% 크리스탈 바이올렛 염색약 (Crystal violet)으로 생성된 콜로니를 염색해 주었다.
도 1은 로-키나제 저해제, Y27632, Fasudil 및 SR3477의 농도에 따른 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 1의 A는 Y-27632의 농도에 따른 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다. 도 1의 A에서 Y-27632는 5 uM, 10 uM 및 20 uM 농도에서 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 가장 잘 시켰고, 30 uM 농도에서는 독성효과를 보여 오히려 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 감소시켰다. 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 잘 시키는 농도 5 uM, 10 uM 및 20 uM 중, 가장 낮은 농도인 5 uM을 선택하였고, 이후 실험에 사용하였다. 도 1의 A에서, 대조군에서 DMSO는 0.05 (v/v)%로 배지 중에 포함되었다.
도 1의 B는 FASUDIL의 농도에 따른 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다. 도 1의 B에서 FASUDIL은 5 uM 농도에서 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 가장 잘 시켰고, 10 uM, 20 uM, 및 30 uM 농도에서는 독성효과를 보여 오히려 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 감소시켰다. 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 잘 시키는 농도로서 5 uM 을 선택하였고, 이후 실험에 사용하였다. 도 1의 B에서, 대조군에서 DMSO는 0.05 (v/v)%로 배지 중에 포함되었다.
도 1의 C는 SR3677의 농도에 따른 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다. 도 1의 C에서 SR3677은 0.5 uM 농도에서 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 가장 잘 시켰고, 1 uM 농도에서는 독성효과를 보여 오히려 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 감소시켰다. 세포 증식과 세포 콜로니 형성을 잘 시키는 농도로서 0.5 uM 을 선택하였고, 이후 실험에 사용하였다. 도 1의 C에서, 대조군에서 DMSO는 0.05 (v/v)%로 배지 중에 포함되었다.
도 1에서 측정한 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM)의 최적 농도에서 세포 증식을 얼마나 유도하는지 정량적으로 측정하기 위해서, 96-웰 플레이트의 각 웰에 2,000 cells/well의 농도로 접종하였다. 그 후, 각 웰에 Y-27632, FASUDIL, 및 SR3677을 각각 5 uM, 5 uM, 0.5 uM 농도로 첨가하고, 동일한 조건에서 배양하였다. 또한, 음성 대조군으로서 DMSO를 사용한 것을 제외하고 동일하게 하였다. 96-웰 플레이트에 분주된 세포 수의 변화를 측정하기 위해서 배양 중 시간 (4, 8, 12, 16일)이 지남에 따라 세포 수를 헤마토미터 (Haematometer)를 사용하여 세었다.
도 2는 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677 존재하에서 노화 섬유아세포 (37세대 세포)를 배양한 경우 세포 수를 나타낸 도면이다. 도 2에서, Y-27632, FASUDIL 및 SR3677은 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 첨가하여, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 4일마다 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 농도의 새로운 배지를 첨가하였다. 도 2에서, 각 배수 (n=12)로 실험하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 화합물의 존재하에서 16일 동안 배양한 경우, 대조군 (DMSO 존재)에 비하여, 세포 수가 유의하게 증가하였다. 도 2에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05). 도 2에서, 대조군에서 DMSO는 0.05 (v/v)%로 배지 중에 포함되었다.
또한, 노화 섬유아세포 (37세대 세포)를 상기한 바와 같은 동일한 배지 및 조건에서 DMSO (0.05 (v/v)%) 및 Y-27632 (5 uM) 존재하에서 배양한 후 세포 형태를 현미경 기기를 사용하여 촬영하였다. 도 3은 노화 섬유아세포 (37세대 세포)를 Y-27632 존재하에서 4주간 배양한 후의 세포 형태를 나타낸 도면이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군 (DMSO)(a)에 비하여 Y-27632 존재하에서 세포 (b)는 그 수가 많고 젊은세포의 형태인 방추형상을 취하고 있다 (Scale bar 20 um).
노화 섬유아세포 (37세대 세포)를 Y-27632 (A), FASUDIL (B) 및 SR3677 (C)은 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 첨가하여 4주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지는 4일마다 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM) 가 포함된 배지로 교체하였다. 세포주기는 MuseTM Cell Cycle Kit(MERCK Millipore, MCH100106)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 측정하였다. MuseTM Cell Analyzer (MERCK Millipore)를 이용하여 488nm 파장의 광을 조사하고 520nm 파장에서 나오는 방사광을 측정하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 대조군은 0.05 (v/v)% DMSO를 첨가한 것을 제외하고 동일하게 실험하였다.
도 4는 Y-27632 및 FASUDIL 존재가 세포 주기에 미치는 영향을 나타낸 도면이다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632 및 FASUDIL의 존재하에서 G0/G1기의 세포 수가 적고, S 및 G2/M 기의 세포가 더 많았다. 이는 Y-27632 및 FASUDIL가 존재하는 경우, 세포 주기가 증식가능한 S 및 G2/M 기로 변화하여 세포의 증식능이 증가한다는 것을 나타낸다.
또한, 상기 배양에 의하여 증식된 세포가 암과 같은 비정상적 세포 증식을 하는지를 확인하기 위해 소프트 아가 에세이(Soft agar assay)를 수행하였다. 먼저, 10% FBS가 들어 있는 DMEM 배지와 1.6 % 아가(agar)를 1:1로 섞어 0.8 % 아가 조성이 되게 6-웰 플레이트에 깔아 준 후, 2,500 개의 세포를 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM) 가 포함된 배지에 넣고, 이 배지와 0.8 % 아가를 섞어 준 후 최후 아가의 농도를 0.4 %가 되도록 한 후 0.8 % 아가 위에 깔아 주었다. 4주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였으며, 아가가 마르는 것을 방지하기 위해 4일마다 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM)가 포함된 배지를 첨가해 주었다. 대조군으로서 Human Embryonic Kidney 293T 세포주 (ATCC® CRL-11268™)를 사용하였다. 또한, 음성 대조군으로서 DMSO 0.05 (v/v)%를 사용한 것을 제외하고 동일하게 하였다.
도 5는 로-키나제 저해제의 존재하에서 배양된 세포를 아가 함유 배지에서 배양한 결과를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 암 세포인 293T 세포의 경우 콜로니를 형성하였으나, 나머지 세포는 콜로니를 형성하지 않았다. 도 5의 a에서 생긴 콜로니 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a1을 임의로 선택하였고, a1에서 확대하여 보여 주었다. a1에서 생긴 콜로니 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a2를 임의로 선택하였고, a2에서 확대하여 보여 주었다 (Scale bar 20 um). 도 5에서, Fibroblast 37은 37 세대 계대 배양된 섬유아세포를 나타낸다.
(2) Y-27632, FASUDIL , 및 SR3677 이 노화된 섬유아세포 (37세대 세포)의 젊은 세포로의 회복에 미치는 영향
또한, 상기 배양에 의하여 증식된 세포에 β-갈락토시다아제 염색 키트 (Cell Signaling Technology, #9860, Beverly, MA)를 이용하여, 로-키나제 저해제의 노화 관련 β-갈락토시다아제 (senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal) 발현에 미치는 영향을 확인해보았다. 제조사의 프로토콜에 따라 pH 6.0의 X-gal 발색 기질 (chromogenic substrate)을 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시켰다.
도 6, 도 7 및 도 8은 각각 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 세포의 SA-β-galactosidase 활성 (a, b) 및 상기 활성을 보이는 세포의 비율 (c)를 나타낸 도면이다. 도 6에서, a, a1, 및 a2, b, b1, 및 b2는 각각 음성 대조군으로서 DMSO를 사용한 것과 Y-27632 (5 uM)를 처리한 것을 나타내었다. a에서 염색된 세포 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a1을 임의로 선택하였고, a1에서 확대하여 보여 주었다. a1에서 생긴 콜로니 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a2를 임의로 선택하였고, a2에서 확대하여 보여 주었다 (Scale bar 20 um).
도 6, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 화합물의 존재하는 경우 대조군 (DMSO 0.05 (v/v)% 처리)에 비하여, β-갈락토시다아제가 발현되는 세포 수가 유의하게 감소하였다. 도 6, 도 7 및 도 8에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05).
또한, 배양된 세포의 리포푸신의 양을 측정하였다. Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 존재하에서 노화 세포 (Passage 37)를 3 주간 4주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지는 4일마다 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM)가 포함된 새 배지로 교체하였다. 리포푸신은 자가형광 (autofluorescence)을 발하는 특징을 지니기에, FACSCaliber (Beckton Dickinson)를 이용하여 488nm 파장의 광을 조사하고 520nm 파장에서 나오는 방사광을 측정하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 도 9는 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677의 존재하에서 배양한 경우, 세포 중의 리포푸신을 측정한 그래프이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 존재하는 경우, 세포에서 리포푸신이 현저하게 감소하였다. 도 9에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05).
또한, 미토콘드리아의 손상 여부는 잘 알려진 방법인 활성 산소종 (reactive oxygen species: ROS) 및 미토콘드리아 막 전위 (mitochondrial membrane potential)의 측정을 통해 확인하였다.
ROS는 0.2 μM MitoSOX (Invitrogen, M3608)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 측정하였다. FACSCaliber (Beckton Dickinson)를 이용하여 520nm 파장의 광을 조사하고 580nm 파장에서 나오는 방사광을 측정하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 도 10에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 존재하는 경우, 세포에서 활성 산소종 (reactive oxygen species: ROS)이 현저하게 감소하였다. 도 10에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05).
미토콘드리아 막 전위는 MitoProbeTM JC-1 Assay kit for Flow Cytometry (Life technologies: T3168)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 측정하였다. JC-1은 미토콘드리아 내에 전위-의존적으로 축적되며, 이 축적은 녹색 (약 529 nm)으로부터 적색 (약 590 nm)로의 형광 방출 전이 (fluorescence emission shift)에 의하여 나타내어진다. 결과적으로, 미토콘드리아 탈분극 (mitochondrial depolarization)은 적색/녹색 형광 강도 비의 감소에 의하여 나타내어진다. FACSCaliber (Beckton Dickinson)를 이용하여 488nm 여기광 (excitation)과 530/30nm 및 585/42nm 밴드-패스 방출광 필터 (filters)를 사용하여 유세포분석기 상에서 분석하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 도 11은 배양된 세포의 미토콘드리아 활성 전위를 측정한 결과를 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677의 존재하에서 활성 전위는 현저하게 증가하였다. 도 11에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05). 도 11에 있어서, 세로축은 미토콘드리아 막 전위를 나타낸다. MMP는 Mitochondria membrane potential을 나타낸다.
도 10 및 11에 의하면, Y-27632, FASUDIL 및 SR3677의 존재하에서 미토콘드리아 활성이 증가한 것을 알 수 있다.
노화세포 내의 DNA 손상이 로-키나제 저해제의 존재하에서 얼마나 회복되는지 알아보기 위해서 DNA 코멧 어세이 (comet assay)를 실시하였다. 이 방법은 자외선 조사로 DNA 절단 부분을 검출하는 방법으로 이루어진다. 이 방법은 겔 전기 영동법에 기반을 둔다. 전기 영동 과정에서 손상을 입은 DNA는 그렇지 않은 DNA 보다 더 먼 거리를 이동하며 코멧-코리라는 모양으로 변한다. 그 후 슬라이드를 사이버 그린 (SYBR Green)으로 염색하여 형광 현미경으로 DNA 파편의 tail 길이를 측정하여 DNA의 손상 정도를 확인하였다.
도 12는 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 섬유아세포 (38세대 세포)에 대한 DNA 손상 정도를 DNA 코멧 어세이 (comet assay)를 통해서 측정한 결과이다. 도 12에서, 노화 세포 (passage 38)에 Y-27632 (A), FASUDIL (B) 및 SR3677 (C)은 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 첨가하여 4주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 4일마다 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 농도의 새로운 배지를 첨가하였다. 또한, 음성 대조군으로서 아무것도 처리하지 않은 군과 DMSO 0.05 (v/v)%를 사용한 군을 사용하였고, 모든 조건을 동일하게 하였다. 젊은 세포로서 배가 시간이 4 ~ 5일인 17세대 세포를 사용하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 젊은 세포에서는 Tail Moment가 짧았으나, 노화된 세포의 음성 대조군에서는 Tail Moment가 증가하여, 세포가 노화되면서 DNA 손상이 증가한 것을 확인할 수 있다. Commet assay에 있어서, Tail Moment는 tail 길이와 상기 tail에 있는 총 DNA의 분획 (fraction)의 곱으로서 정의된다. 즉, tail이 전기영동 겔 상에서 끌려서 이루는 길이를 나타낸다. Tail이 짧으면 짧을수록 DNA 손상은 적다는 것을 뜻한다. 하지만 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 존재하는 경우, 세포에서 DNA 손상이 현저하게 회복하여 젊은 세포 수준이 되었다. 도 12에서, **는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.01). 도 12에서, "Fibroblast p17"과 "Fibroblast p38"은 "섬유아세포 17세대" 및 "섬유아세포 38세대"를 나타낸다.
(3) Y-27632, FASUDIL , 및 SR3677 의 노화된 근모세포 회복
근모세포 (Human Skeletal Muscle Myoblasts, Lonza CC-2580 LOT:0000387550) 세포주를 SkGM™-2 SingleQuots™ Kit (Lonza CC-3244)이 포함된 SkBM™-2 Basal Medium (Lonza CC-3246)을 이용하여, Collagen Type I이 코팅된 플레이트 (Greiner Bio One, 658950)에 넣고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 계대 배양은 세포가 플레이트에 85% 정도 밀집했을 때 실시하였다. 조기 계대 배양은 세포를 1:4로 분할하여 배양하고, 후기 계대 배양은 세포를 1:2로 분할하여 배양하였다. 세포 배가 시간이 14일이 되었을 때, 세포를 노화세포라고 여긴다 (10 ~ 12 세대 세포).
Collagen Type I이 코팅된 6-웰 플레이트 (Greiner Bio One, 657950)의 각 웰에 2,000 cells/well의 농도로 노화세포를 접종하고, 로-키나제 저해제 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 존재하에서, 노화된 근모세포 (11 세대 세포)를 4주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지는 4일마다 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM) 가 포함된 배지로 교체하였다. 또한, 음성 대조군으로서 DMSO (0.05 (v/v)%)를 사용한 것을 제외하고 동일하게 하였다.
도 13은 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 근모세포 (myoblast) (11 세대 세포)에 대한 세포 형태 변화를 나타낸 도면이다.
도 13에서, 로-키나제 저해제 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 존재하에서 배양한 후 세포 형태를 현미경 기기를 사용하여 촬영하였다. a에서 생긴 세포 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a1을 임의로 선택하였고, a1에서 확대하여 보여 주었다. a1에서 생긴 세포 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a2를 임의로 선택하였고, a2에서 확대하여 보여 주었다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군 (DMSO)에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677 존재하에서 세포는 그 수가 많고 젊은 세포의 형태인 방추형상을 취하고 있다 (Scale bar 20 um).
또한, 배양된 세포의 리포푸신의 양을 측정하였다. Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 존재하에서 노화된 근모세포 (11 세대 세포)를 4 주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지는 4일마다 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM) 가 포함된 배지로 교체하였다. 리포푸신은 자가형광 (autofluorescence)을 발하는 특징을 지니기에, FACSCaliber (Beckton Dickinson)를 이용하여 488nm 파장의 광을 조사하고 520nm 파장에서 나오는 방사광을 측정하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 도 14는 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677의 존재하에서 배양한 경우, 세포 중의 리포푸신을 측정한 그래프이다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 존재하는 경우, 세포에서 리포푸신이 현저하게 감소하였다. 도 14에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05).
또한, 미토콘드리아의 손상 여부는 잘 알려진 방법인 활성 산소종 (reactive oxygen species: ROS) 및 미토콘드리아 막 전위 (mitochondrial membrane potential)의 측정을 통해 확인하였다.
ROS는 0.2 μM MitoSOX (Invitrogen, M3608)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 측정하였다. FACSCaliber (Beckton Dickinson)를 이용하여 520nm 파장의 광을 조사하고 580nm 파장에서 나오는 방사광을 측정하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.
도 15는 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 근모세포 (11 세대 세포)에 대한 활성산소종을 측정한 결과를 나타낸다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 존재하는 경우, 세포에서 활성 산소종 (reactive oxygen species: ROS)이 현저하게 감소하였다. 도 15에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05).
미토콘드리아 막 전위는 MitoProbeTM JC-1 Assay kit for Flow Cytometry (Life technologies: T3168)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 측정하였다. JC-1은 미토콘드리아 내에 전위-의존적으로 축적되며, 이 축적은 녹색 (약 529 nm)으로부터 적색 (약 590 nm)로의 형광 방출 전이 (fluorescence emission shift)에 의하여 나타내어진다. 결과적으로, 미토콘드리아 탈분극 (mitochondrial depolarization)은 적색/녹색 형광 강도 비의 감소에 의하여 나타내어진다. FACSCaliber (Beckton Dickinson)를 이용하여 488nm 여기광 (excitation)과 530/30nm 및 585/42nm 밴드-패스 방출광 필터 (filters)를 사용하여 유세포분석기 상에서 분석하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다.
도 16은 배양된 세포의 미토콘드리아 활성 전위를 측정한 결과를 나타낸다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677의 존재하에서 활성전위는 현저하게 증가하였다. 도 16에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05). 도 15 및 16에 의하면, Y-27632, FASUDIL 및 SR3677의 존재하에서 미토콘드리아 활성이 증가한 것을 알 수 있다.
(4) Y-27632, FASUDIL , 및 SR3677 의 노화된 조기 노화세포 회복
조기노화 섬유아세포 (Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome Skin Fibrobalsts, Coriell Cell Repositories, AG03198 B)를 10% FBS (fetal bovine serum)와 100 unit/ml penicillin, 및 100 ug/ml streptomycin (all antibiotics from Gibco-BRL, Grand Island, NY)가 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 넣고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 조기노화 섬유아세포의 계대 배양은 세포가 플레이트에 85% 정도 밀집했을 때 실시하였다. 조기 계대 배양은 세포를 1:4로 분할하여 배양하고, 후기 계대 배양은 세포를 1:2로 분할하여 배양한다. 세포 배가 시간이 14일이 되었을 때, 세포를 노화된 조기노화 섬유아세포 라고 여긴다 (16 ∼17세대 세포).
6-웰 플레이트의 각 웰에 2,000 cells/well의 농도로 노화된 조기노화 섬유아세포 (17세대 세포)를 접종하고, 로-키나제 저해제 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 존재하에서, 4주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지는 4일마다 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM)가 포함된 배지로 교체하였다. 또한, 음성 대조군으로서 DMSO (0.05 (v/v)%)를 사용한 것을 제외하고 동일하게 하였다.
도 17은 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 조기노화 섬유아세포 (progeria fibroblast) (17세대 세포)에 대한 세포 형태 변화를 나타낸 도면이다. 도 17에서, "Progeria Fibroblast p17" 및 "Progeria Fibroblast p11"은 "조로증 (progeria) 섬유아세포 17세대" 및 "조로증 (progeria) 섬유아세포 11세대"를 나타낸다.
도 17에서, 로-키나제 저해제 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 존재하에서 배양한 후 세포 형태를 현미경기기를 사용하여 촬영하였다. 그림 a에서 생긴 세포 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a1을 임의로 선택하였고, a1에서 확대하여 보여 주었다. 그림 a1에서 생긴 세포 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a2를 임의로 선택하였고, a2에서 확대하여 보여 주었다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 대조군 (DMSO)에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677 존재하에서 세포는 그 수가 많고 젊은 세포의 형태인 방추형상을 취하고 있다 (Scale bar 20 um).
또한, 배양된 세포의 리포푸신의 양을 측정하였다. Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 존재하에서 노화된 조기노화 섬유아세포 (17세대 세포)를 4 주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 배지는 4일마다 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM)가 포함된 배지로 교체하였다. 리포푸신은 자가형광 (autofluorescence)을 발하는 특징을 지니기에, FACSCaliber (Beckton Dickinson)를 이용하여 488nm 파장의 광을 조사하고 520nm 파장에서 나오는 방사광을 측정하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 도 18는 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677의 존재하에서 배양한 경우, 세포 중의 리포푸신을 측정한 그래프이다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 존재하는 경우, 세포에서 리포푸신이 현저하게 감소하였다. 도 18에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05).
또한, 미토콘드리아의 손상 여부는 잘 알려진 방법인 활성 산소종 (reactive oxygen species: ROS) 및 미토콘드리아 막 전위 (mitochondrial membrane potential)의 측정을 통해 확인하였다.
ROS는 0.2 μM MitoSOX (Invitrogen, M3608)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 측정하였다. FACSCaliber (Beckton Dickinson)를 이용하여 520nm 파장의 광을 조사하고 580nm 파장에서 나오는 방사광을 측정하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 도 19는 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 조기노화 섬유아세포 (17세대 세포)에 대한 활성산소종을 측정한 결과를 나타낸다. 도 19에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 존재하는 경우, 세포에서 활성 산소종 (reactive oxygen species: ROS)이 현저하게 감소하였다. 도 19에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05).
미토콘드리아 막 전위는 MitoProbeTM JC-1 Assay kit for Flow Cytometry (Life technologies: T3168)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 측정하였다. JC-1은 미토콘드리아 내에 전위-의존적으로 축적되며, 이 축적은 녹색 (약 529 nm)으로부터 적색 (약 590 nm)로의 형광 방출 전이 (fluorescence emission shift)에 의하여 나타내어진다. 결과적으로, 미토콘드리아 탈분극 (mitochondrial depolarization)은 적색/녹색 형광 강도 비의 감소에 의하여 나타내어진다. FACSCaliber (Beckton Dickinson)를 이용하여 488nm 여기광 (excitation)과 530/30nm 및 585/42nm 밴드-패스 방출광 필터 (filters)를 사용하여 유세포분석기 상에서 분석하였다. 결과는 Cell Quest 3.2 software (Beckton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 도 20은 배양된 세포의 미토콘드리아 활성 전위를 측정한 결과를 나타낸다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677의 존재하에서 활성전위는 현저하게 증가하였다. 도 20에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05). 도 19 및 20에 의하면, Y-27632, FASUDIL 및 SR3677의 존재하에서 미토콘드리아 활성이 증가한 것을 알 수 있다.
노화된 조기노화 섬유아세포내의 DNA 손상이 로-키나제 저해제의 존재하에서 얼마나 회복되는지 알아보기 위해서 DNA 코멧 어세이 (comet assay)를 실시하였다. 이 방법은 자외선 조사로 DNA 절단 부분을 검출하는 방법으로 이루어진다. 이 방법은 겔 전기 영동법에 기반을 둔다. 전기 영동과정에서 손상을 입은 DNA는 그렇지 않은 DNA 보다 더 먼 거리를 이동하며 코멧-코리라는 모양으로 변한다. 그 후 슬라이드를 사이버 그린 (SYBR Green)으로 염색해서 형광 현미경으로 DNA 파편의 tail 길이를 측정하여 DNA의 손상 정도를 확인하였다.
도 21은 로-키나제 저해제, Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM) 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 조기노화 섬유아세포 (17세대 세포)에 대한 DNA 손상 정도를 DNA 코멧 어세이 (comet assay)를 통해서 측정한 결과이다. 도 21에서, 노화된 조기노화 섬유아세포 (17세대)에 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677은 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 첨가하여 4주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 4일마다 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 농도의 새로운 배지를 첨가하였다. 젊은 세포로서 배가 시간이 6 ~ 7일인 11세대 세포를 사용하였다. 또한, 음성 대조군으로서 DMSO를 사용한 군을 사용하였고, 모든 조건을 동일하게 하였다. 도 21에 나타낸 바와 같이, 젊은 세포에서는 Tail Moment가 짧았으나 노화된 세포의 음성 대조군 (DMSO 처리 그룹)에서는 Tail Moment가 증가하여, 세포가 노화되면서 DNA 손상이 증가한 것을 확인할 수 있다. 하지만 DMSO 대조군에 비하여 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677가 존재하는 경우, 세포에서 DNA 손상이 현저하게 줄어드는 것을 확인하였다. 도 21에서, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05).
또한, 상기 배양에 의하여 증식된 세포에 β-갈락토시다아제 염색 키트 (Cell Signaling Technology, #9860, Beverly, MA)를 이용하여, 로-키나제 저해제의 노화 관련 β-갈락토시다아제 (senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal) 발현에 미치는 영향을 확인해보았다. 제조사의 프로토콜에 따라 pH 6.0의 X-gal 발색 기질 (chromogenic substrate)을 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션시켰다.
도 22은 각각 Y-27632 (5 uM), FASUDIL (5 uM), 및 SR3677 (0.5 uM) 존재하에서 배양된 세포의 SA-β-galactosidase 활성 (a, b, c, d, e) 및 상기 활성을 보이는 세포의 비율 (f)를 나타낸 도면이다. 도 22에서, 노화된 조기노화 섬유아세포 (17세대)에 Y-27632, FASUDIL 및 SR3677은 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 첨가하여 4주간 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 4일마다 각각 5 uM, 5 uM, 및 0.5 uM 농도의 새로운 배지를 첨가하였다. 젊은 세포로서 배가 시간이 6 ~ 7일인 11세대 세포를 사용하였다. 또한, 음성 대조군으로서 DMSO를 사용한 군을 사용하였고, 모든 조건을 동일하게 하였다. 그림 a에서 염색된 세포 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a1을 임의로 선택하였고, a1에서 확대하여 보여 주었다. 그림 a1에서 생긴 염색된 세포 부분을 잘 보여주기 위해서 점선으로 된 사각형 부분 a2를 임의로 선택하였고, a2에서 확대하여 보여 주었다 (Scale bar 20 um). 도 22에 나타낸 바와 같이, 젊은 세포에서는 β-갈락토시다아제가 발현되는 세포 수가 아주 적으나, 노화된 세포의 음성 대조군 (DMSO 처리 그룹)에서는 β-갈락토시다아제가 발현되는 세포 수가 유의하게 증가하였다. 상기 화합물의 존재하는 경우 대조군 (DMSO 처리)에 비하여, β-갈락토시다아제가 발현되는 세포 수가 유의하게 감소하였다. 도 22, *는 통계적으로 유의함을 나타낸다 (p<0.05).

Claims (20)

  1. 로-키나제 저해제 (Rho-kinase inhibitor)를 유효성분으로 포함하는, 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 상기 로-키나제 저해제는 Y-27632((1R,4R)-4-((R)-1-aminoethyl)-N-(pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide), SR3677(N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamide], Fasudil (5-(1,4-diazepane-1-sulfonyl)isoquinoline), 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 입체이성질체, 또는 그 조합이고, 상기 세포 노화와 연관된 증상은 조기노화증 (Hutchinson-Gilford progeria syndrome)인 것인 조성물.
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  10. 유효량의 로-키나제 저해제를 포유동물에게 투여하여, 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하는 단계:를 포함하는, 포유동물에서 세포의 노화와 연관된 증상을 치료하는 방법으로서, 상기 로-키나제 저해제는 Y-27632 ((1R,4R)-4-((R)-1-aminoethyl)-N-(pyridin-4-yl)cyclohexanecarboxamide), SR3677 (N-[2-[2-(dimethylamino)ethoxy]-4-(1H-pyrazol-4-yl)phenyl]-2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-2-carboxamide], Fasudil (5-(1,4-diazepane-1-sulfonyl)isoquinoline), 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 입체이성질체, 또는 그 조합이고, 상기 세포 노화와 연관된 증상은 조기노화증 (Hutchinson-Gilford progeria syndrome)이고, 상기 포유동물은 사람이 아닌 포유동물인 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 투여는 노화 세포를 포함하는 조직에 국소적으로 투여하는 것인 방법.
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