KR102315849B1 - Detection method using step-wise on/off detection of biological targets, detection system and its manufacturing method - Google Patents
Detection method using step-wise on/off detection of biological targets, detection system and its manufacturing method Download PDFInfo
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Abstract
Description
본 발명은, 계단식 온-오프 검출을 이용하는 생물학적 표적 물질의 검출 방법, 검출 시스템 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for detecting a biological target using stepwise on-off detection, a detection system, and a method for manufacturing the same.
핵산을 이용한 생물학적 물질의 검출 기술은 매우 높은 특이성을 보인다. 이와 같은 기술에서는 표적과 상보적인 핵산 프로브가 기질에 고정되어 있는데, 이 표적이 프로브와 서열 특이적인 결합을 함을 이용한다. 그러나 검출 결과의 가시화를 위해서는 표적에 표지를 하는 전처리 과정을 거쳐야 하며, 이 과정은 많은 시간과 비용이 필요하다.The detection technology of a biological material using a nucleic acid shows a very high specificity. In this technique, a nucleic acid probe complementary to a target is immobilized on a substrate, and the target uses sequence-specific binding to the probe. However, in order to visualize the detection result, a pretreatment process of labeling the target is required, and this process requires a lot of time and money.
전처리 과정을 해결하기 위한 하나의 방법으로, 분자 비콘(Molecular Beacon, MB)을 이용할 수 있다. 분자 비콘이란 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 단일 가닥의 DNA 프로브 양 끝에 형광단과 소광제가 각각 있는 것이다. 표적 물질의 결합 여부에 따라서, DNA 프로브는 헤어진 구조를 유지하거나 헤어핀 구조를 열어서 선형 구조를 형성하게 되며 각각 OFF 또는 ON 상태의 형광신호를 갖는다.As one method for solving the pretreatment process, a molecular beacon (MB) may be used. A molecular beacon is a single-stranded DNA probe that has a fluorophore and a quencher at both ends that can form a hairpin structure. Depending on whether the target material is bound or not, the DNA probe maintains a separated structure or opens a hairpin structure to form a linear structure, and has an OFF or ON fluorescence signal, respectively.
분자 비콘의 검출 강도 증강을 위해 블록 공중합체를 도입하였다. 분자 비콘을 소수성 고분자에 묶음으로써 DNA 프로브의 기능성은 그대로 보존함과 동시에 크기와 형태 조절이가능하고 표면에 DNA 프로브가 기능화 된 마이셀을 형성할 수 있었다. 이러한 경우, 표면에 부착된 각 분자 비콘에는 형광단과 소광제가 각각 1개씩 존재하므로 형광신호의 세기가 표면의 분자 비콘 수에 따라 선형적으로 증가한다(도 2). A block copolymer was introduced to enhance the detection intensity of molecular beacons. By tying the molecular beacon to a hydrophobic polymer, it was possible to form micelles with functionalized DNA probes on the surface, while preserving the functionality of the DNA probe as it is, and controlling its size and shape. In this case, since one fluorophore and one quencher are present in each molecular beacon attached to the surface, the intensity of the fluorescence signal increases linearly according to the number of molecular beacons on the surface (FIG. 2).
Sanjay 와 Fred 가 저서한 논문에서 단일가닥 DNA의 양 끝에 형광단과 소광제를 달고 있는 헤어핀 형태의 DNA 탐침을 지칭하였다(Sanjay., Fred., Nat. Biotechnol., 1996).In a paper by Sanjay and Fred, a hairpin-type DNA probe with a fluorophore and a quencher attached to both ends of single-stranded DNA was referred to (Sanjay., Fred., Nat. Biotechnol., 1996).
Hadjinicolaou et al.이 저서한 논문에서는 B. anthracis와 B. cereus 군의 다른 구성원들을 분자 수준에서 검출하고 분리하는 MB-PCR 분석을 보고하였다 (Hadjinicolaou et al., Journal of Microbiological Methods, 2009).A paper by Hadjinicolaou et al. reported MB-PCR analysis to detect and isolate B. anthracis and other members of the B. cereus family at the molecular level (Hadjinicolaou et al., Journal of Microbiological Methods, 2009).
Varma-Basil et al.이 저서한 논문에서는 4 개의 박테리아 생물 테러 작용제를 동시에 검출하기 위해 MB와 Q-PCR을 결합하였다(Varma-Basil et al., Clin Chem., 2004).In a paper by Varma-Basil et al., MB and Q-PCR were combined to detect four bacterial bioterrorism agents simultaneously (Varma-Basil et al., Clin Chem., 2004).
Tao et al.이 저서한 논문에서는 DNA블록이 MB로 이루어진 블록 공중합체를 합성하여 타겟 분자를 검출하였다(Tao et al., Angew. Chem. Int., 2013).In a paper written by Tao et al., a target molecule was detected by synthesizing a block copolymer in which the DNA block was composed of MB (Tao et al., Angew. Chem. Int., 2013).
이에, 본 발명자들은 상기의 목적을 달성하기 위하여 예의 노력한 결과, 표적 물질의 농도에 따라 계단식의 검출 형태를 띠는 검출 시스템을 제작하여 분석하였으며, 특히 본 발명에서 제시하는 검출 시스템은 표적 물질을 빠르고 명확하게 검출하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors have made and analyzed a detection system having a stepwise detection form according to the concentration of the target material as a result of earnest efforts to achieve the above object. It was confirmed that it was clearly detected and the present invention was completed.
본 발명은 상기 언급한 문제점을 해결하기 위해서, 소광제를 갖는 프로브로 기능화되고, 형광단이 로딩된 중합체 입자를 포함하는 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체를 포함하는 검출 시스템을 이용하여, 생물 표적을 높은 특이성과 조절 가능한 민감도로 검출하고, 정성 및 정량 분석에 활용할 수 있는, 표적 물질의 검출 방법에 관한 것이다. In order to solve the above-mentioned problems, the present invention uses a detection system comprising a probe-polymer particle complex having a hairpin structure including polymer particles loaded with a fluorophore and functionalized with a probe having a quencher, It relates to a method for detecting a target substance, which can be used for qualitative and quantitative analysis by detecting with high specificity and tunable sensitivity.
본 발명은, 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체를 포함하는 검출 시스템을 제공하는 것이다.The present invention provides a detection system comprising a probe-polymer particle complex having a hairpin structure.
본 발명은, 본 발명에 의한 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체를 포함하는 검출 시스템의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for manufacturing a detection system comprising the probe-polymer particle complex having a hairpin structure according to the present invention.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 것들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 분야 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the problems to be solved by the present invention are not limited to those mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.
본 발명의 일 실시예에 따라, 검출 시스템과 표적 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 형광 세기를 측정하는 단계;를 포함하고, 상기 검출 시스템은, 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체;를 포함하고, 상기 중합체 입자의 적어도 일부분에 상기 헤어핀 구조의 프로브가 결합되고, 나머지 중 적어도 일부분에 형광단이 로딩되고, 상기 헤어핀 구조의 프로브의 하나의 말단에 소광제가 결합되고, 나머지 말단은 상기 중합체 입자에 결합된 것인, 표적 물질의 검출 방법에 관한 것이다. According to an embodiment of the present invention, the method comprising: contacting a detection system with a sample including a target material; and measuring the fluorescence intensity, wherein the detection system includes a hairpin-structured probe-polymer particle complex, wherein the hairpin-structured probe is coupled to at least a portion of the polymer particle, and at least a portion of the remainder. A fluorophore is loaded on the probe, a quencher is bound to one end of the hairpin-structured probe, and the other end is bound to the polymer particle.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 형광 세기를 측정하는 단계는, 상기 표적 물질의 농도에 따라 형광 세기가 온 또는 오프 상태를 갖는 계단식 검출 프로필을 제공하는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the measuring of the fluorescence intensity may include providing a step-wise detection profile in which the fluorescence intensity is turned on or off according to the concentration of the target material.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 표적 물질의 검출 방법은, 상기 검출 시스템 내의 상기 소광제와 상기 형광단의 농도비를 조절하여 검출 한계를 조절하는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, in the method of detecting the target material, the detection limit may be adjusted by adjusting a concentration ratio of the quencher and the fluorophore in the detection system.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 검출 방법은, 표적 물질에 대한 정성 및 정량 분석을 하는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the detection method may be to perform qualitative and quantitative analysis of the target material.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 중합체 입자는, 1 nm 내지 100 nm의 크기를 갖는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the polymer particles may have a size of 1 nm to 100 nm.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 중합체 입자는, 폴리스티렌 입자, 가교된 중합체 중심 블록을 갖는 블록 공중합체 마이셀 입자 또는 이 둘을 포함하는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the polymer particles may include polystyrene particles, block copolymer micellar particles having a crosslinked polymer central block, or both.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 마이셀 입자는, 프로브-b-소수성 고분자, 카르복실기가 기능화된 친수성 고분자-b-소수성 고분자 또는 이 둘을 포함할 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the micellar particles may include a probe-b-hydrophobic polymer, a hydrophilic polymer functionalized with a carboxyl group-b-hydrophobic polymer, or both.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 헤어핀 구조의 프로브는, 상기 헤어핀 구조를 유지하는 선에서 특이성을 가지지 않는 DNA 서열을 포함하고, 상기 헤어핀 구조의 프로브는, 상기 헤어핀 구조 내 적어도 일부분에 표적 물질과 상보적인 가닥이 삽입된 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the probe of the hairpin structure includes a DNA sequence that does not have specificity in a line maintaining the structure of the hairpin, and the probe of the hairpin structure includes a target substance in at least a portion of the hairpin structure. and the complementary strand may be inserted.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 상보적인 가닥은, 상기 헤어핀 구조 중 줄기 부분, 고리 부분 또는 이 둘에 삽입된 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the complementary strand may be inserted into a stem portion, a ring portion, or both of the hairpin structure.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 헤어핀 구조의 프로브의 말단 중 적어도 하나는, 꼬리를 가지지 않거나; 1개 이상; 또는 3개 이상의 아데노신 꼬리를 가지며, 상기 소광제는, 상기 아데노신 꼬리 중 적어도 하나에 결합된 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, at least one of the ends of the hairpin structure probe does not have a tail; 1 or more; Or having three or more adenosine tails, the quencher may be bound to at least one of the adenosine tails.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 형광단은, 상기 소광제가 흡수하는 영역의 파장대를 방출하는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the fluorophore may emit a wavelength band of a region absorbed by the quencher.
본 발명의 일 실시예에 따라, 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체; 를 포함하고, 상기 중합체 입자의 적어도 일부분에 헤어핀 구조의 프로브가 결합되고, 나머지 중 적어도 일부분에 형광단이 로딩되고, 상기 헤어핀 구조의 하나의 말단에 소광제가 결합되고, 나머지 말단은 상기 중합체 입자에 결합된 것인, 표적 물질의 검출을 위한, 검출 시스템에 관한 것이다. According to an embodiment of the present invention, a probe-polymer particle complex having a hairpin structure; Including, a probe having a hairpin structure is bound to at least a portion of the polymer particle, a fluorophore is loaded in at least a portion of the remainder, a quencher is bound to one end of the hairpin structure, and the other end is to the polymer particle. It relates to a detection system for the detection of a target substance, which is bound.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 검출 시스템 중 상기 소광제와 상기 형광단은 동일하거나 또는 상이한 농도로 포함되는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the quencher and the fluorophore in the detection system may be included in the same or different concentrations.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 소광제 대 상기 형광단의 농도비는, 1 :
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 소광제는, 상기 검출 시스템 중 0.033 nM 내지 3.3 nM의 농도로 포함되는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the quencher may be included in a concentration of 0.033 nM to 3.3 nM in the detection system.
본 발명의 일 실시예에 따라, 하나의 말단에 소광제가 결합되고 나머지 말단에 아민기로 기능화된 헤어핀 구조의 프로브를 준비하는 단계; 헤어핀 구조의 프로브와 중합체 입자를 결합시키는 단계; 및 상기 헤어핀 구조의 프로브가 결합된 중합체 입자에 형광물질을 로딩하는 단계; 를 포함하는, 검출 시스템의 제조방법에 관한 것이다. According to an embodiment of the present invention, preparing a probe having a hairpin structure in which a quencher is bound to one end and functionalized with an amine group at the other end; binding the probe having a hairpin structure to the polymer particle; and loading a fluorescent material onto the polymer particles to which the hairpin-structured probe is bound. It relates to a method of manufacturing a detection system comprising a.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 헤어핀 구조의 프로브의 아민기가 상기 중합체 입자에 결합하는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the amine group of the probe having the hairpin structure may be bound to the polymer particle.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 중합체 입자에 형광물질을 로딩하는 단계는, 상기 헤어핀 구조의 프로브가 결합된 중합체 입자와 형광단 용액을 혼합하고 형광단 용매를 증발시키는 것일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the loading of the fluorescent material onto the polymer particles may include mixing the hairpin-structured probe-coupled polymer particles with a fluorophore solution and evaporating the fluorophore solvent.
본 발명은, 높은 특이성과 조절 가능한 민감도를 갖는 생물 표적의 검출 방법을 제공하고, 이를 이용하여 계단식의 검출 형태를 띠어 생물학적 오염원을 빠르고 명확하게 검출할 수 있다. The present invention provides a method for detecting a biological target having high specificity and tunable sensitivity, and using the method, a biological contaminant can be quickly and clearly detected in a stepwise detection form.
본 발명은, 기존의 분자 비콘을 이용한 검출 시스템을 대체할 수 있는 새로운 검출 시스템을 제공하고, 이를 이용하여 생물학적 오염원의 농도에 따라 계단식의 검출 형태를 띠어, 임계 농도보다 적은 양의 시료와 많은 양의 샘플을 빠르고 명확하게 구분할 수 있다. The present invention provides a new detection system that can replace the existing detection system using a molecular beacon, and uses it to take a stepwise detection form according to the concentration of a biological contaminant. samples can be quickly and clearly identified.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 검출 시스템을 이용한 표적 물질의 검출 방법에 의해 획득 가능한 표적 물질의 존재 여부를 판단할 수 있는 계단식 온-오프 (ON-OFF) 검출 프로필을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 기술 분야에서 알려진 분자 비콘을 이용한 표적 물질의 검출 방법에서 표적 물질의 농도에 따라 형광 신호 세기가 선형적으로 증가하는 검출 프로필을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 검출 시스템을 이용한 표적 물질의 검출 방법에서 표적 물질의 농도에 따라 형광 신호 세기가 계단식으로 증가하는 검출 프로필을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 검출 시스템에 의한 표적 물질의 검출 프로필을 나타낸 것으로, 표적 물질의 농도에 따라 형광 신호 세기가 계단식으로 증가하는 것을 확인할 수 있다.
도 5은, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 검출 시스템에 의한 형광단과 소광제의 농도를 조절하여 검출 한계의 조정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 검출 시스템의 제조방법에 대한 공정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 일 실시예에 따라 본 발명의 실시예 1에서 제조된 검출 시스템을 이용한 표적 물질의 검출 프로필에서 표적 물질의 농도에 따라 형광 신호 세기를 측정하여 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명의 실시예 2에서 제조된 검출 시스템을 이용한 표적 물질의 검출 프로필에서 표적 물질의 농도에 따라 형광 신호 세기를 측정하여 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명의 실시예 3에서 제조된 검출 시스템을 이용한 표적 물질의 검출 프로필에서 표적 물질의 농도에 따라 형광 신호 세기를 측정하여 나타낸 것이다. 1 is a step-by-step on-off (ON-OFF) detection for determining the presence or absence of a target material obtainable by a method for detecting a target material using a detection system according to the present invention, according to an embodiment of the present invention; The profile is shown as an example.
FIG. 2 exemplarily illustrates a detection profile in which the intensity of a fluorescence signal linearly increases according to the concentration of a target material in a method for detecting a target material using a molecular beacon known in the art.
3 exemplarily illustrates a detection profile in which the intensity of a fluorescence signal increases in a stepwise manner according to a concentration of a target material in a method for detecting a target material using a detection system according to the present invention, according to an embodiment of the present invention.
4 shows a detection profile of a target material by the detection system according to the present invention according to an embodiment of the present invention, and it can be seen that the intensity of the fluorescence signal increases in a stepwise manner according to the concentration of the target material.
5 exemplarily shows the adjustment of the detection limit by adjusting the concentrations of the fluorophore and the quencher by the detection system according to the present invention, according to an embodiment of the present invention.
6 exemplarily shows a process for a method of manufacturing a detection system according to the present invention, according to an embodiment of the present invention.
FIG. 7 is a diagram illustrating the measurement of fluorescence signal intensity according to the concentration of the target material in the detection profile of the target material using the detection system prepared in Example 1 of the present invention according to an exemplary embodiment of the present invention.
FIG. 8 is a diagram illustrating the measurement of fluorescence signal intensity according to the concentration of the target material in the detection profile of the target material using the detection system prepared in Example 2 of the present invention, according to an embodiment of the present invention.
FIG. 9 shows the measurement of fluorescence signal intensity according to the concentration of the target substance in the detection profile of the target substance using the detection system prepared in Example 3 of the present invention, according to an embodiment of the present invention.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. In describing the present invention, if it is determined that a detailed description of a related known function or configuration may unnecessarily obscure the gist of the present invention, the detailed description thereof will be omitted. In addition, the terms used in this specification are terms used to properly express the preferred embodiment of the present invention, which may vary according to the intention of the user or operator or customs in the field to which the present invention belongs. Accordingly, definitions of these terms should be made based on the content throughout this specification. Like reference numerals in each figure indicate like elements.
명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.Throughout the specification, when a member is said to be located “on” another member, this includes not only a case in which a member is in contact with another member but also a case in which another member is present between the two members.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.Throughout the specification, when a part "includes" a certain component, it means that other components may be further included, rather than excluding other components.
이하, 본 발명의 표적 물질의 검출 방법, 검출 시스템 및 상기 검출 시스템의 제조방법에 대하여 실시예 및 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본 발명이 이러한 실시예 및 도면에 제한되는 것은 아니다.Hereinafter, a method for detecting a target substance, a detection system, and a method for manufacturing the detection system of the present invention will be described in detail with reference to Examples and drawings. However, the present invention is not limited to these examples and drawings.
본 발명은, 표적 물질의 검출 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 검출 방법은, 검출 시스템과 표적 물질을 포함하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 형광 세기를 측정하는 단계; 를 포함할 수 있다. 즉, 본 발명은, 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체를 포함하는 검출 시스템을 이용하여 표적 물질을 검출하는 것으로, 계단식의 검출 형태를 띠어 생물학적 오염원을 빠르고 명확하게 검출할 수 있고, 높은 특이성과 조절 가능한 민감도로 생물 표적을 검출할 수 있다. The present invention relates to a method for detecting a target material, and according to an embodiment of the present invention, the detection method includes contacting a detection system with a sample including a target material; and measuring the fluorescence intensity; may include. That is, the present invention detects a target material using a detection system including a probe-polymer particle complex having a hairpin structure, and can quickly and clearly detect a biological contaminant in a step-wise detection form, with high specificity and control Biological targets can be detected with as much sensitivity as possible.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체는, 중합체 입자의 적어도 일부분에 헤어핀 구조의 프로브가 결합되고, 나머지 중 적어도 일부분에 형광단이 로딩된 것일 수 있다. 상기 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체는, 형광단과 소광제의 농도가 사실상 독립적으로 분리되어 있다는 점에서 기존의 형광단과 소광제가 서로 묶여있는 분자 비콘과는 구조 디자인에서 근본적으로 상이하고, 형광단에 대한 소광제의 농도를 조절하여 검출 한계를 조정할 수 있다. 또한, 표적 물질의 농도에 따라 형광 신호 세기의 개형이 선형적인 분자 비콘과 달리, 표적 물질의 농도에 따라 형광 신호의 세기가 새로운 계단식 검출 프로필을 제공하고, 이는 ON-OFF 방식으로 표적 물질을 신속하게 정확하게 감지할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the hairpin-structured probe-polymer particle complex may be one in which a hairpin-structured probe is bound to at least a portion of a polymer particle and a fluorophore is loaded in at least a portion of the rest. The hairpin-structured probe-polymer particle complex is fundamentally different from a molecular beacon in which a conventional fluorophore and a quencher are bound to each other in that the concentrations of the fluorophore and the quencher are virtually independently separated in structural design, and The detection limit can be adjusted by adjusting the concentration of the quencher for In addition, unlike molecular beacons, in which the change of the intensity of the fluorescence signal is linear according to the concentration of the target substance, the intensity of the fluorescence signal according to the concentration of the target substance provides a new stepwise detection profile, which rapidly detects the target substance in an ON-OFF method. can be detected accurately.
예를 들어, 도 1을 살펴보면, 표적 물질의 농도에 따라 검출 시스템의 형광 세기가 임계 농도를 기준으로 ON-OFF 방식을 나타낼 수 있다. 반면에, 도 2를 살펴보면, DNA프로브의 양말단에 각각 형광단 및 소광제가 서로 묶여있는 분자 비콘은 선형적인 검출 프로필을 나타내고 있음을 확인할 수 있다. For example, referring to FIG. 1 , depending on the concentration of the target material, the fluorescence intensity of the detection system may represent an ON-OFF method based on a critical concentration. On the other hand, referring to FIG. 2 , it can be seen that molecular beacons in which a fluorophore and a quencher are bound to each other at both ends of the DNA probe exhibit a linear detection profile.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 헤어핀 구조의 프로브는, 하나의 말단에 소광제가 결합되고, 나머지 말단은 상기 중합체 입자에 결합된 변형된 헤어핀 구조이며, 이는 소광제로 기능화된 중합체 입자를 형성하는 것이다. According to an embodiment of the present invention, the hairpin-structured probe has a modified hairpin structure having one end bound to a quencher and the other end bound to the polymer particle, which forms polymer particles functionalized with a quencher. will be.
상기 헤어핀 구조의 프로브는, 상기 헤어핀 구조를 유지하는 선에서 특이성을 가지지 않는 DNA 서열을 포함하고, 상기 헤어핀 구조 내 적어도 일부분에 표적 물질과 상보적인 가닥이 삽입된 것일 수 있다. The probe having the hairpin structure may include a DNA sequence that does not have specificity in a line maintaining the hairpin structure, and a strand complementary to a target material is inserted into at least a portion of the hairpin structure.
상기 상보적인 가닥은, 상기 헤어핀 구조 중 줄기 부분, 고리 부분 또는 이 둘에 삽입되며, 바람직하게는 고리 부분에 삽입될 수 있다. 상기 상보적인 가닥과 표적 물질이 결합할 경우에 헤어핀 구조의 구조적 변화를 야기시키고 소광제에 의해 중합체 입자에 로딩된 형광단의 형광 신호(예를 들어, 형광 세기)의 변화를 일으키고, 새로운 계단식 검출 프로필에 따라 표적 물질을 검출할 수 있다. The complementary strand is inserted into the stem portion, the ring portion, or both of the hairpin structure, preferably inserted into the ring portion. When the complementary strand and the target material bind, it causes a structural change of the hairpin structure and causes a change in the fluorescence signal (eg, fluorescence intensity) of the fluorophore loaded onto the polymer particle by the quencher, and new stepwise detection A target substance can be detected according to the profile.
예를 들어, 도 3을 살펴보면, 표적 물질 (Target DNA)이 부재한 경우, 헤어핀 DNA와 소광제 (Hairpin DNA with quencher, HQ)가 닫힌 상태가 된다. 이러한 닫힌 상태에서는 소광제가 중합체 입자 표면의 형광단에 아주 근접하게 위치하여 발광을 억제하므로 형광 신호가 검출되지 않는 ‘OFF 상태’가 된다. 이와 달리, 표적 물질이 존재하는 경우, 헤어핀 DNA의 고리 부분에 표적 물질이 상보적으로 결합하여 구조 변화를 야기한다. 따라서 헤어핀 구조가 열린 상태가 되어 소광제가 중합체 입자 상의 형광단으로부터 멀리 위치하여 발광을 억제하지 못하므로 형광 신호가 검출되는 ‘ON 상태’가 된다. For example, referring to FIG. 3 , when the target material (Target DNA) is absent, the hairpin DNA and the quencher (Hairpin DNA with quencher, HQ) are in a closed state. In this closed state, the quencher is placed in close proximity to the fluorophore on the surface of the polymer particle to suppress luminescence, resulting in an “OFF state” in which no fluorescence signal is detected. On the other hand, when the target substance is present, the target substance complementarily binds to the ring portion of the hairpin DNA to cause a structural change. Therefore, the hairpin structure is in an open state and the quencher is located far from the fluorophore on the polymer particle and cannot suppress luminescence, resulting in an 'ON state' in which the fluorescence signal is detected.
상기 소광제는, 본 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것으로, 상기 형광원의 발광을 효과적으로 억제할 수 있는 것이라면 제한 없이 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 소광제는, 댑실(dabsyl)계열 물질; QSY-35, QSY-7, QSY-9, QSY-21 등의 QSY 계열 물질; BHQ-1(2,5-di-tert-butylhydroquinone-1), BHQ-2, BHQ-3 등의 BHQ 계열 물질; 및 시안 형광 단백질(Cyan fluorescent protein, CFP), 황색 형광 단백질(Yellow fluorescent protein, YFP), 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP) 등의 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. The quenching agent, which is commonly used in the technical field of the present invention, may be applied without limitation as long as it can effectively suppress the emission of the fluorescence source. For example, the matting agent, dabsyl (dabsyl) series material; QSY family materials such as QSY-35, QSY-7, QSY-9, QSY-21; BHQ-based substances such as BHQ-1 (2,5-di-tert-butylhydroquinone-1), BHQ-2, and BHQ-3; and a fluorescence resonance energy transfer (FRET) material such as cyan fluorescent protein (CFP), yellow fluorescent protein (YFP), and green fluorescent protein (GFP). It may include one or more selected from the group.
상기 소광제는, 상기 헤어핀 구조의 프로브의 말단 중 하나에 결합되고, 단일 또는 복수개의 소광제가 적용될 수 있다. 상기 헤어핀 구조의 프로브의 말단 중 하나는, 적어도 꼬리를 가지지 않거나; 1개 이상; 또는 3개 이상의 아데노신 꼬리를 가지며, 상기 소광제는, 헤어핀 구조를 유지하는 선에서 상기 아데노신 꼬리 중 적어도 하나에 결합될 수 있다. 바람직하게는 3개, 6개 또는 9개의 아데노신 꼬리를 가지며, 이러한 꼬리 전체에 동일하거나 또는 상이한 소광제가 결합될 수 있다. 즉, 이러한 소광제의 구성에 의해서 형광단의 형광신호 세기의 조절, 예를 들어, 형광신호 세기를 효과적으로 억제하여 표적 물질의 검출 민감도 및 정확도를 향상시킬 수 있다. The quencher is bound to one of the ends of the probe of the hairpin structure, and a single or a plurality of quenchers may be applied. at least one of the ends of the hairpin-structured probe has no tail; 1 or more; or three or more adenosine tails, and the quencher may be bound to at least one of the adenosine tails in a line that maintains the hairpin structure. It preferably has 3, 6 or 9 adenosine tails, all of which may be bound by the same or different quenchers. That is, the control of the fluorescence signal intensity of the fluorophore, for example, the fluorescence signal intensity, can be effectively suppressed by the configuration of the quencher, thereby improving the detection sensitivity and accuracy of the target material.
상기 소광제는, 상기 검출 시스템 중 0.033 nM 내지 3.3 nM의 농도로 포함될 수 있다. 상기 농도 범위 내에 포함되면 형광신호 세기를 효과적으로 억제할 수 있어 바람직하다.The quencher may be included in a concentration of 0.033 nM to 3.3 nM in the detection system. When included in the concentration range, it is preferable to effectively suppress the intensity of the fluorescence signal.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 중합체 입자는, 다공성, 비다공성 또는 이 둘의 입자를 포함할 수 있고, 헤어핀 구조의 프로브와 결합이 가능한 폴리머, 블럭공중합체라면 제한 없이 적용될 수 있고, 예를 들어, 폴리스티렌, 나일론, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리아크릴아미드 등이고, 추가적으로 세파로스, 아가로스, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 또는 덱스트란, 실리카, 유리, 금속 등이 더 포함될 수 있다. 또한, 상기 중합체 입자는, 가교된 중심 블럭을 갖는 블록공중합체 마이셀 입자 또는 비드 형상일 수 있다. 예를 들어, 상기 마이셀은, 프로브-b-소수성 고분자, 카르복실기가 기능화된 친수성 고분자-b-소수성 고분자(단 소수성 고분자는 마이셀 형성 후 가교되어 입자 형태를 나타낼 수 있다.) 등일 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the polymer particles may include porous, non-porous, or both particles, and any polymer or block copolymer capable of binding to a hairpin-structured probe may be applied without limitation, e.g. For example, polystyrene, nylon, polytetrafluoroethylene, polyacrylamide, etc., and additionally sepharose, agarose, cellulose, cellulose derivatives, or dextran, silica, glass, metal, etc. may be further included. In addition, the polymer particles may be in the form of a block copolymer micelle particle or bead shape having a cross-linked central block. For example, the micelles may be probe-b-hydrophobic polymers, hydrophilic polymers-b-hydrophobic polymers functionalized with carboxyl groups (provided that the hydrophobic polymers are crosslinked after formation of micelles to represent particle shapes), and the like.
상기 중합체 입자는, 1 nm 이상; 10 nm 이상; 50 nm 이상; 또는 1 nm 내지 100 nm의 크기를 갖는 것일 수 있다. The polymer particle is 1 nm or more; more than 10 nm; 50 nm or more; Or it may have a size of 1 nm to 100 nm.
상기 형광단은, 상기 소광제가 흡수하는 영역의 파장대를 방출하는 것이며, 본 발명의 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것이라면 제한 없이 적용될 수 있고, 예를 들어, 7-히드록시쿠마린, 4-메틸-7-히드록시쿠마린 등의 쿠마린(Coumarin) 계열; ROX, TET, Texas Red, 플루오레세인(Fluorescein), 테트라메틸로다민, Rhodamine, Rhodamine Green, Rhodamine Red, 6-CarboxyRhodamine 등의 잔텐(Xanthene) 계열; Cy3, Cy5 등의 시아닌(Cyanine) 계열; Bodipy FL, Bodipy 530, Bodipy R6G, Bodipy TMR 등의 보디피(Bodipy) 계열; Alexa Fluor 488,Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 532 등의 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 계열; DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800 등의 다이라이트 플루오르(DyLight Fluor)계열; TRITC, TAMRA, 로다민 팔로이딘(Rhodamine Phalloidin), 로다민(Rhodamine), 로다민 그린(Rhodamine Green), 로다민 레드(Rhodamine Red) 및 6-카르복실 로다민(6-CarboxyRhodamine 6G)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는 소수성 형광단이며, 예를 들어, TAMRA일 수 있다. The fluorophore is to emit a wavelength band of a region absorbed by the quencher, and may be applied without limitation as long as it is commonly used in the technical field of the present invention, for example, 7-hydroxycoumarin, 4-methyl-7 -Coumarin series such as hydroxycoumarin; Xanthene series such as ROX, TET, Texas Red, Fluorescein, tetramethylrhodamine, Rhodamine, Rhodamine Green, Rhodamine Red, 6-CarboxyRhodamine; Cy3, Cy5, etc. cyanine (Cyanine) series; Bodipy series such as Bodipy FL, Bodipy 530, Bodipy R6G, and Bodipy TMR; Alexa Fluor series such as Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 532; DyLight Fluor series such as DyLight 405, DyLight 488, DyLight 549, DyLight 594, DyLight 633, DyLight 649, DyLight 680, DyLight 750, DyLight 800; Group consisting of TRITC, TAMRA, Rhodamine Phalloidin, Rhodamine, Rhodamine Green, Rhodamine Red and 6-CarboxyRhodamine 6G It may include one or more selected from. Preferably it is a hydrophobic fluorophore, for example, it may be TAMRA.
상기 형광단은, 상기 중합체 입자의 표면, 기공 또는 이 둘에 로딩된 것이며, 이는 흡착, 함침, 표면 결합 등에 의해 로딩될 수 있다. 상기 형광단은, 상기 중합체 입자에 대해
상기 검출 시스템 중 상기 소광제와 상기 형광단은 동일하거나 또는 상이한 농도로 포함될 수 있고, 예를 들어, 상기 소광제 대 상기 형광단의 농도비는, 1 :
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 형광 세기를 측정하는 단계는, 상기 표적 물질의 농도에 따라 형광 세기가 온 또는 오프 상태를 갖는 계단식 검출 프로필을 제공할 수 있고, 형광 세기는 본 발명의 기술 분야에서 알려진 방식을 이용할 수 있으며, 본 명세서에는 구체적으로 언급하지 않는다. According to an embodiment of the present invention, the step of measuring the fluorescence intensity may provide a stepwise detection profile in which the fluorescence intensity is on or off according to the concentration of the target material, and the fluorescence intensity is the technique of the present invention. A method known in the art may be used, and it is not specifically mentioned herein.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 표적 물질의 검출 방법은, 상기 검출 시스템 내의 상기 소광제와 상기 형광단의 농도비를 조절하여 검출 한계를 조절할 수 있다. 상기 검출 방법은, 표적 물질에 대한 정성 및 정량 분석을 할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, in the method for detecting the target material, the detection limit may be adjusted by adjusting a concentration ratio of the quencher and the fluorophore in the detection system. The detection method may perform qualitative and quantitative analysis of the target material.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 분석 대상인 표적 물질은 생체 분자로 한다. 상기 생체 분자의 경우, 특이적인 결합 (specific binding) 특성을 나타낸다. 상기 표적 물질의 검출을 위한 시료는, 세포 용해액(cell lysate), 환자의 혈액 시료, 조직 시료 등과 같은 모든 형태의 시료 속에 단독으로, 혼합물로 또는 다른 여러 표적 물질과 함께 포함될 수 있다.According to an embodiment of the present invention, the target material to be analyzed is a biomolecule. In the case of the biomolecule, it exhibits specific binding properties. The sample for detecting the target substance may be included alone, in a mixture, or together with various other target substances in all types of samples such as cell lysate, a patient's blood sample, a tissue sample, and the like.
본 발명은, 본 발명에 의한 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체를 포함하는 검출 시스템에 관한 것으로, 소광제와 형광단이 분리된 구조로 디자인되어 새로운 계단식 검출 프로필에 의해 표적 물질을 검출할 수 있다. 또한, 생물학적 표적 물질의 계단식 온-오프 검출 프로필을 제공할 수 있다. The present invention relates to a detection system comprising a hairpin-structured probe-polymer particle complex according to the present invention, which is designed to have a structure in which a quencher and a fluorophore are separated, so that a target substance can be detected by a novel stepwise detection profile. . In addition, it is possible to provide a cascaded on-off detection profile of a biological target material.
상기 검출 시스템은, 다양한 농도의 표적 물질을 검출하는데 이용되고, 형광단과 소광제가 분리되어 있기 때문에, 이들의 농도 비에 따라 검출 한계를 이동시킬 수 있고, 신속하고 정확한 검출과 정성 및 정량 분석에 활용할 수 있다. The detection system is used to detect various concentrations of target substances, and since the fluorophore and the quencher are separated, the detection limit can be shifted according to their concentration ratio, and it can be used for rapid and accurate detection and qualitative and quantitative analysis. can
즉, 계단식의 검출 형태를 띠는 검출 시스템은, 임계 농도를 기준으로 농도가 더 높은지 낮은지를 빠르게 판단하고자 할 때, 계단식의 검출 형태를 띠는 검출 시스템의 신호 유무를 바탕으로 즉시 확인하는데 유용할 수 있다. That is, a detection system having a stepwise detection form is useful for immediately checking based on the presence or absence of a signal from a detection system having a stepwise detection form when it is desired to quickly determine whether the concentration is higher or lower based on the threshold concentration. can
예를 들어, 도 4를 살펴보면, 다양한 농도의 표적 물질의 검출과 계단식 검출 프로필을 형성할 수 있다. 도 5를 살펴보면, 형광단과 소광제의 농도 비에 따라 검출 한계를 이동시킬 수 있고, 계단식 검출 프로필을 형성할 수 있다.For example, referring to FIG. 4 , detection of various concentrations of target substances and stepwise detection profiles may be formed. Referring to FIG. 5 , the detection limit can be shifted according to the concentration ratio of the fluorophore and the quencher, and a stepwise detection profile can be formed.
상기 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체는, 상기 중합체 입자의 적어도 일부분에 헤어핀 구조의 프로브가 결합되고, 나머지 중 적어도 일부분에 형광단이 로딩되고, 상기 헤어핀 구조의 하나의 말단에 소광제가 결합되고, 나머지 말단은 상기 중합체 입자에 결합되어 상기 중합체 입자를 기능화한 것이다. 상기 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체의 구성 및 기능은, 상기 검출 방법에서 제시한 바와 같다. In the hairpin-structured probe-polymer particle complex, a hairpin-structured probe is bound to at least a portion of the polymer particle, a fluorophore is loaded on at least a portion of the remainder, and a quencher is bound to one end of the hairpin structure, The other end is bound to the polymer particle to functionalize the polymer particle. The composition and function of the probe-polymer particle complex having the hairpin structure are the same as those presented in the detection method.
본 발명은, 본 발명에 의한 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체를 포함하는 검출 시스템의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method for manufacturing a detection system comprising the probe-polymer particle complex having a hairpin structure according to the present invention.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 제조방법은, 하나의 말단에 소광제가 결합되고 나머지 말단에 아민기로 기능화된 헤어핀 구조의 프로브를 준비하는 단계; 헤어핀 구조의 프로브와 중합체 입자를 결합시키는 단계; 및 헤어핀 구조의 프로브가 결합된 중합체 입자에 형광물질을 로딩하는 단계; 를 포함할 수 있다. According to an embodiment of the present invention, the preparation method comprises the steps of: preparing a probe having a hairpin structure in which a quencher is bound to one end and functionalized with an amine group at the other end; binding the probe having a hairpin structure to the polymer particle; and loading a fluorescent material onto the polymer particles to which the hairpin-structured probe is bound; may include.
상기 헤어핀 구조의 프로브와 중합체 입자를 결합시키는 단계는, 상기 헤어핀 구조의 프로브의 아민기를 상기 중합체 입자의 표면에 결합시키는 것으로, 카르복실기를 포함하고 있는 중합체 입자와 양 말단에 아민기와 소광제를 각각 가지고 있는 프로브를 반응시킬 수 있다. 예를 들어, 카르복실기를 가지고 있는 중합체 입자를 PBS (Phosphate-buffered saline)를 넣어 희석시키며, 이때 1.0 % (w/v) 이상; 2.0 % (w/v) 이상; 또는 2.5% (w/v) 내지 3.0 % (w/v)의 농도로 상기 중합체 입자를 희석시키고, 다음으로, 상기 희석액에 EDC(1-ethyl-3(-3-dimethylaminopropyl) carbomiimide hydrochloride) 및 NHS(N-hydroxysuccinimide)을 첨가한 후, 상온에서 1시간 이상 교반하여 카르복실기를 활성화할 수 있다. 양 말단에 아민기와 소광제를 각각 가지며 헤어핀 구조를 형성할 수 있는 DNA를 첨가하고, 빛을 차단시킨 환경의 상온에서 10 시간 이상; 또한, 20 시간 이상 교반할 수 있다. 이 과정에서 펩타이드 결합(Peptide Bond)가 형성되어 중합체 입자에 헤어핀 구조의 프로브가 공유 결합된다. 원심분리기를 이용하여 상층액을 제거한 후, 형성된 펠릿을 PBS 용액에 재분산하고, 입자 농도를 측정하여 일정한 농도로 유지된 헤어핀 소광제가 결합된 폴리스티렌 입자를 획득할 수 있다. The step of binding the hairpin-structured probe and the polymer particle comprises bonding the amine group of the hairpin-structured probe to the surface of the polymer particle, and each of the polymer particle including a carboxyl group and an amine group and a quencher at both ends. probes can be reacted. For example, the polymer particles having a carboxyl group are diluted with PBS (Phosphate-buffered saline), in which case 1.0% (w/v) or more; 2.0% (w/v) or more; Alternatively, the polymer particles are diluted to a concentration of 2.5% (w/v) to 3.0% (w/v), and then, EDC (1-ethyl-3 (-3-dimethylaminopropyl) carbomiimide hydrochloride) and NHS in the dilution solution After (N-hydroxysuccinimide) is added, the carboxyl group can be activated by stirring at room temperature for at least 1 hour. DNA having an amine group and a quencher at both ends and capable of forming a hairpin structure is added, and at room temperature in a light-blocked environment for at least 10 hours; Moreover, it can stir for 20 hours or more. In this process, a peptide bond is formed, and the probe having a hairpin structure is covalently bonded to the polymer particle. After removing the supernatant using a centrifuge, the formed pellet is redispersed in a PBS solution, and the particle concentration is measured to obtain polystyrene particles bound with a hairpin matting agent maintained at a constant concentration.
상기 헤어핀 구조의 프로브가 결합된 중합체 입자에 형광물질을 로딩하는 단계는, 상기 상기 헤어핀 구조의 프로브가 결합된 중합체 입자에 형광단 용액을 첨가하고 혼합하는 중 및/또는 이후에 용액의 용매를 증발시키고, 빛을 차단된 환경 및 상온에서 1 시간 이상; 5 시간 이상; 또는 15 시간 이상 교반할 수 있다. In the step of loading the fluorescent material onto the polymer particles to which the hairpin-structured probe is bound, the solvent of the solution is evaporated during and/or after adding and mixing the fluorophore solution to the polymeric particles to which the hairpin-structured probe is bound. in an environment protected from light and at room temperature for at least 1 hour; more than 5 hours; Alternatively, the mixture may be stirred for at least 15 hours.
이하 본 발명의 실시예에서 보다 상세하게 설명되며, 이는 본 발명의 구체적 이해에 도움을 주기위한 것이며 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the embodiments of the present invention will be described in more detail, which is intended to help a specific understanding of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.
실시예 1Example 1
헤어핀 구조에 세 개의 아닐린 꼬리를 가진 후 BHQ-2 소광제가 달려있는 DNA를 기능화한 80nm 크기의 폴리스티렌 입자를 기반으로 표적 물질 검출Target substance detection based on 80 nm-sized polystyrene particles functionalized with DNA with BHQ-2 quencher attached after having three aniline tails in a hairpin structure
(1) 검출 시스템의 제조(1) Preparation of detection system
표면에 카르복실기가 있는 폴리스티렌 입자 (Carboxyl-polystyrene Particles, 2.5% w/v) 100uL에 PBS 용액을 900uL를 첨가해 희석한다. 1mg의 EDC, 1.5mg의 NHS를 희석시킨 폴리스티렌 입자 용액에 첨가한 후, 상온에서 1시간가량 교반한다. 이전의 검출 방식에서 이용된 헤어핀 구조의 양 끝에 아민기와 소광제가 달려있는 DNA를 대신하여, 헤어핀 구조의 한 쪽 끝에는 아민기, 반대쪽 끝에는 세 개의 아닐린 꼬리를 가진 후 소광제가 달려있는 DNA(100uM)를 준비한다. 10uL의 DNA(100uM)를 이 혼합물에 첨가한 후, 빛을 차단시킨 상온의 환경에서 24시간이상 교반한다. 원심분리기를 이용하여 상층액을 제거하고, 형성된 펠릿을 PBS 용액에 재분산한다. 이 헤어핀 소광제가 결합된 폴리스티렌 입자 농도를 측정하여 일정한 입자 농도가 될 수 있도록 한다. Dilute by adding 900uL of PBS solution to 100uL of polystyrene particles with carboxyl groups on the surface (Carboxyl-polystyrene Particles, 2.5% w/v). After adding 1 mg of EDC and 1.5 mg of NHS to the diluted polystyrene particle solution, the mixture is stirred at room temperature for about 1 hour. Instead of DNA having an amine group and a quencher attached to both ends of the hairpin structure used in the previous detection method, DNA having an amine group at one end and three aniline tails at the other end of the hairpin structure and a quencher attached (100uM) Prepare. After adding 10 uL of DNA (100 uM) to this mixture, the mixture is stirred for 24 hours or more in an environment at room temperature where light is blocked. Remove the supernatant using a centrifuge, and redisperse the formed pellet in PBS solution. The hairpin matting agent bound polystyrene particle concentration is measured to ensure a constant particle concentration.
헤어핀 소광제가 결합된 폴리스티렌 입자에 소수성 형광단(즉, TAMRA)을 로딩한다. 아세톤에 녹인 형광단 용액을 같은 양만큼 앞의 입자에 첨가한 후, 아세톤을 증발시킨다. 빛을 차단시키고 16시간이상 상온에서 교반한다. 원심분리기를 이용하여 로딩되지 못한 형광단이 있는 상층액을 제거하고, 형성된 펠릿을 PBS 용액에 재분산하여 헤어핀 구조의 말단에 소광제가 있는 DNA가 결합된 폴리스티렌 입자로 이루어진 검출 시스템을 준비한다.A hydrophobic fluorophore (ie, TAMRA) is loaded onto the polystyrene particles bound to the hairpin quencher. An equal amount of the fluorophore solution dissolved in acetone is added to the preceding particles, and then the acetone is evaporated. Block the light and stir at room temperature for at least 16 hours. Remove the supernatant containing the unloaded fluorophore using a centrifuge, and redisperse the formed pellet in PBS solution to prepare a detection system composed of polystyrene particles having a quencher-bound DNA at the end of the hairpin structure.
(2) 표적 물질의 검출 (2) detection of target substances
상기 검출 시스템을 이용하여 다양한 농도의 표적 물질을 검출 한 결과, 아래의 계단식 검출 프로필이 관찰되었다. 그 결과는 도 7에 나타내었다. 도 7에서 표적 물질의 농도가 임계 농도 미만의 경우에는 낮은 형광신호 세기가 보였으며, 임계 농도를 초과하는 경우에는 높은 형광신호 세기가 보였다. As a result of detecting various concentrations of target substances using the above detection system, the following stepwise detection profile was observed. The results are shown in FIG. 7 . 7 , when the concentration of the target material was less than the critical concentration, a low fluorescence signal intensity was observed, and when the concentration of the target material exceeded the critical concentration, a high fluorescence signal intensity was seen.
실시예 2Example 2
헤어핀 구조에 여섯 개의 아닐린 꼬리를 가진 후 BHQ-2 소광제가 달려있는 DNA를 기능화한 80nm 크기의 폴리스티렌 입자를 기반으로 표적 물질 검출Target substance detection based on 80nm-sized polystyrene particles functionalized with DNA with BHQ-2 quencher attached after having six aniline tails in a hairpin structure
(1) 검출 시스템의 제조(1) Preparation of detection system
100uL의 카르복실 폴리스티렌 입자(Carboxyl-polystyrene Particles, 2.5% w/v)에 900uL의 PBS 용액을 첨가하여 희석한다. EDC 1mg과 1.5mg의 NHS를 앞의 희석한 폴리스티렌 입자 용액에 첨가하고, 1시간가량 상온에서 교반한다. 실시예 2의 검출 시스템에서는 헤어핀 구조의 한 쪽 끝에는 아민기, 반대쪽 끝에는 여섯 개의 아닐린 꼬리를 가진 후 소광제가 달려있는 DNA(100uM)를 이용한다. 이 DNA(100uM)을 10uL 첨가한 후, 상온의 환경에서 24시간이상 빛을 차단시키고 교반한다. 그 후, 펠릿이 형성될 때까지 원심분리기를 이용하여 분리한다. 상층액을 제거하고, 형성된 펠릿은 PBS 용액에 재분산한다. 이 헤어핀 소광제가 결합된 폴리스티렌 입자 농도를 측정하여 입자 농도가 일정하게 유지될 수 있도록 한다. Dilute by adding 900 uL of PBS solution to 100 uL of carboxyl polystyrene particles (Carboxyl-polystyrene Particles, 2.5% w/v). 1mg of EDC and 1.5mg of NHS are added to the previously diluted polystyrene particle solution, and the mixture is stirred at room temperature for about 1 hour. In the detection system of Example 2, DNA (100 uM) having an amine group at one end of the hairpin structure and six aniline tails at the other end and a quencher attached thereto is used. After adding 10 uL of this DNA (100 uM), block light for at least 24 hours at room temperature and stir. Thereafter, it is separated using a centrifuge until a pellet is formed. The supernatant is removed and the formed pellet is redispersed in PBS solution. The hairpin matting agent-bound polystyrene particle concentration is measured to ensure that the particle concentration is kept constant.
소수성 형광단(즉, TAMRA)을 헤어핀 소광제가 결합된 폴리스티렌 입자에 로딩한다. 소수성 형광단을 아세톤에 녹인 후, 같은 양만큼 앞의 폴리스티렌 입자 용액에 첨가한다. 이후, 아세톤을 증발시키고 빛이 차단된 상온의 환경에서 16시간이상 교반하여 형광단을 입자에 로딩한다. 입자에 로딩되지 않은 형광단을 원심분리기를 이용하여 제거하고, 형성된 펠릿은 PBS 용액에 재분산한다. 헤어핀 구조에 여섯개의 아닐린 꼬리를 가진 후 소광제가 있는 DNA가 결합된 폴리스티렌 입자로 이루어진 검출 시스템을 준비하였다. A hydrophobic fluorophore (ie, TAMRA) is loaded onto the polystyrene particles to which the hairpin quencher is bound. After dissolving the hydrophobic fluorophore in acetone, the same amount is added to the polystyrene particle solution above. Thereafter, the fluorophore is loaded onto the particles by evaporating acetone and stirring for at least 16 hours in an environment at room temperature where light is blocked. Fluorophores not loaded on the particles are removed using a centrifuge, and the formed pellet is redispersed in PBS solution. A detection system consisting of polystyrene particles bound to DNA with a quencher after having six aniline tails in a hairpin structure was prepared.
(2) 표적 물질의 검출 (2) detection of target substances
상기 검출 시스템을 이용하여 다양한 농도의 표적 물질을 검출한 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 도 7에 나타낸 검출 시스템과 유사한 계단식 검출 프로필이 관찰된다. The results of detecting various concentrations of target substances using the detection system are shown in FIG. 8 . A stepwise detection profile similar to the detection system shown in FIG. 7 is observed in FIG. 8 .
실시예 3Example 3
헤어핀 구조에 아홉 개의 아닐린 꼬리를 가진 후 BHQ-2 소광제가 달려있는 DNA를 기능화한 80nm 크기의 폴리스티렌 입자를 기반으로 표적 물질 검출Target substance detection based on 80nm-sized polystyrene particles functionalized with DNA with a BHQ-2 quencher attached to a hairpin structure with nine aniline tails
(1) 검출 시스템의 제조(1) Preparation of detection system
카르복실기가 있는 폴리스티렌 입자 (Carboxyl-polystyrene Particles, 2.5% w/v) 100uL를 900uL의 PBS 용액를 첨가하여 희석한다. 희석한 폴리스티렌 입자 용액에 EDC 1mg과 1.5mg의 NHS를 첨가한다. 이 혼합물을 상온에서 1시간 교반한다. 앞의 희석한 폴리스티렌 입자 용액에 첨가하고 1시간가량 상온에서 교반한다. Dilute 100uL of polystyrene particles having a carboxyl group (Carboxyl-polystyrene Particles, 2.5% w/v) by adding 900uL of PBS solution. Add 1 mg of EDC and 1.5 mg of NHS to the diluted polystyrene particle solution. The mixture is stirred at room temperature for 1 hour. It is added to the previously diluted polystyrene particle solution and stirred at room temperature for about 1 hour.
실시예 3의 검출 시스템에서는 헤어핀 구조의 한 쪽 끝에는 아민기, 반대쪽 끝에는 아홉 개의 아닐린 꼬리를 가진 후 소광제가 달려있는 DNA(100uM)를 이용한다. 이 DNA(100uM)를 앞의 입자 혼합 용액에 10uL 첨가한 후, 24시간이상 상온에서 빛을 차단시키고 교반한다. 원심분리기를 이용하여 펠릿을 침전시키고, 상층액을 제거한다. 형성된 펠릿은 PBS에 재분산시킨 후, 폴리스티렌 입자 농도를 측정한다. 헤어핀 소광제가 결합된 폴리스티렌 입자를 그 후, 펠릿이 형성될 때까지 원심분리기를 이용하여 분리한다. 상층액을 제거하고, 형성된 펠릿은 PBS 용액에 재분산한다. 입자 농도를 로 만들어 헤어핀 소광제가 결합된 폴리스타이렌 입자 용액을 얻었다.In the detection system of Example 3, DNA (100 uM) having an amine group at one end of the hairpin structure and nine aniline tails at the other end, followed by a quencher is used. After adding 10 uL of this DNA (100 uM) to the above particle mixture solution, block light at room temperature for 24 hours or more and stir. The pellet is precipitated using a centrifuge, and the supernatant is removed. The formed pellet is redispersed in PBS, and then the polystyrene particle concentration is measured. The polystyrene particles bound with the hairpin matting agent are then separated using a centrifuge until pellets are formed. The supernatant is removed and the formed pellet is redispersed in PBS solution. A polystyrene particle solution to which the hairpin matting agent is bound was obtained by making the particle concentration of .
헤어핀 구조에 여섯개의 아닐린 꼬리를 가진 후 소광제가 있는 DNA가 결합된 폴리스티렌 입자로 이루어진 검출 시스템을 준비하였다. A detection system consisting of polystyrene particles bound to DNA with a quencher after having six aniline tails in a hairpin structure was prepared.
이렇게 얻은 폴리스티렌 입자에 소수성 형광단(즉, TAMRA)이 로딩된다. 아세톤에 소수성 형광단을 녹인 용액을 앞서 준비한 입자 용액에 같은 부피만큼 첨가한다. 아세톤을 증발시킨 후, 빛을 차단하면서 16시간이상 교반하여 형광단을 입자에 로딩한다. 원심분리기를 이용하여 로딩되지 않은 형광단을 제거한다. 형성된 펠릿은 PBS 용액에 재분산하여 헤어핀 구조에 아홉개의 아닐린 꼬리를 가진 후 소광제가 있는 DNA가 결합된 폴리스티렌 입자로 이루어진 검출 시스템이 준비되었다.The polystyrene particles thus obtained are loaded with a hydrophobic fluorophore (ie, TAMRA). An equal volume of a solution of a hydrophobic fluorophore in acetone is added to the previously prepared particle solution. After evaporating the acetone, the fluorophore is loaded onto the particles by stirring for at least 16 hours while blocking light. Remove the unloaded fluorophore using a centrifuge. The formed pellet was redispersed in PBS solution to have nine aniline tails in a hairpin structure, and then a detection system consisting of DNA-conjugated polystyrene particles with a quencher was prepared.
(2) 표적 물질의 검출 (2) detection of target substances
상기 검출 시스템을 이용하여 다양한 농도의 표적 물질을 검출한 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 도 7 및 도 8의 결과와 유사하게 계단식 검출 프로필이 관찰된 것을 확인할 수 있다.The results of detecting various concentrations of target substances using the detection system are shown in FIG. 9 . In FIG. 9 , it can be seen that a stepwise detection profile was observed similarly to the results of FIGS. 7 and 8 .
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다. 그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.As described above, although the embodiments have been described with reference to the limited embodiments and drawings, various modifications and variations are possible from the above description by those skilled in the art. For example, even if the described techniques are performed in an order different from the described method, and/or the described components are combined or combined in a different form from the described method, or replaced or substituted by other components or equivalents Appropriate results can be achieved. Therefore, other implementations, other embodiments, and equivalents to the claims are also within the scope of the following claims.
Claims (17)
형광 세기를 측정하는 단계;
를 포함하고,
상기 검출 시스템은, 헤어핀 구조의 프로브-중합체 입자 복합체;를 포함하고,
상기 중합체 입자의 적어도 일부분에 상기 헤어핀 구조의 프로브가 결합되고, 나머지 중 적어도 일부분에 형광단이 로딩되고,
상기 헤어핀 구조의 프로브의 하나의 말단에 소광제가 결합되고, 나머지 말단은 상기 중합체 입자에 결합되고,
상기 형광 세기를 측정하는 단계는, 상기 표적 물질의 농도에 따라 형광 세기가 온 또는 오프 상태를 갖는 계단식 검출 프로필을 제공하고,
표적 물질의 검출 방법은, 상기 검출 시스템 내의 상기 소광제와 상기 형광단의 농도비를 조절하여 검출 한계를 조절하는 것인,
표적 물질의 검출 방법.
contacting the detection system with a sample containing a target material; and
measuring the fluorescence intensity;
including,
The detection system includes a probe-polymer particle complex having a hairpin structure,
The hairpin-structured probe is bound to at least a portion of the polymer particle, and a fluorophore is loaded onto at least a portion of the remainder;
A quencher is bound to one end of the probe of the hairpin structure, and the other end is bound to the polymer particle,
The step of measuring the fluorescence intensity provides a step-wise detection profile in which the fluorescence intensity is turned on or off according to the concentration of the target material,
The detection method of the target substance is to adjust the detection limit by adjusting the concentration ratio of the quencher and the fluorophore in the detection system,
A method for detecting a target substance.
상기 검출 방법은, 표적 물질에 대한 정성 및 정량 분석을 하는 것인,
표적 물질의 검출 방법.
According to claim 1,
The detection method is to perform qualitative and quantitative analysis of the target material,
A method for detecting a target substance.
상기 중합체 입자는, 1 nm 내지 100 nm의 크기를 갖는 것인,
표적 물질의 검출 방법.
According to claim 1,
The polymer particles will have a size of 1 nm to 100 nm,
A method for detecting a target substance.
상기 중합체 입자는, 폴리스티렌 입자, 가교된 중합체 중심 블록을 갖는 블록 공중합체 마이셀 입자 또는 이 둘을 포함하고,
상기 마이셀 입자는, 프로브-b-소수성 고분자, 카르복실기가 기능화된 친수성 고분자-b-소수성 고분자 또는 이 둘을 포함할 수 있는 것인,
표적 물질의 검출 방법.
According to claim 1,
The polymer particles include polystyrene particles, block copolymer micellar particles having crosslinked polymeric central blocks, or both;
The micelle particles, the probe-b- hydrophobic polymer, the carboxyl group-functionalized hydrophilic polymer-b- hydrophobic polymer, or which may include both,
A method for detecting a target substance.
상기 헤어핀 구조의 프로브는, 상기 헤어핀 구조를 유지하는 선에서 특이성을 가지지 않는 DNA 서열을 포함하고,
상기 헤어핀 구조의 프로브는, 상기 헤어핀 구조 내 적어도 일부분에 표적 물질과 상보적인 가닥이 삽입된 것인,
표적 물질의 검출 방법.
According to claim 1,
The probe of the hairpin structure includes a DNA sequence that does not have specificity in a line maintaining the hairpin structure,
In the hairpin structure probe, a strand complementary to a target material is inserted into at least a portion of the hairpin structure.
A method for detecting a target substance.
상기 상보적인 가닥은, 상기 헤어핀 구조 중 줄기 부분, 고리 부분 또는 이 둘에 삽입된 것인,
표적 물질의 검출 방법.
8. The method of claim 7,
The complementary strand is inserted into the stem portion, the ring portion, or both of the hairpin structure,
A method for detecting a target substance.
상기 헤어핀 구조의 프로브의 말단 중 적어도 하나는, 꼬리를 가지지 않거나; 1개 이상; 또는 3개 이상의 아데노신 꼬리를 가지며,
상기 소광제는, 상기 아데노신 꼬리 중 적어도 하나에 결합된 것인,
표적 물질의 검출 방법.
According to claim 1,
At least one of the ends of the hairpin-structured probe has no tail; 1 or more; or 3 or more adenosine tails,
Wherein the quencher is bound to at least one of the adenosine tails,
A method for detecting a target substance.
상기 형광단은, 상기 소광제가 흡수하는 영역의 파장대를 방출하는 것인,
표적 물질의 검출 방법.
According to claim 1,
The fluorophore will emit a wavelength band in the region where the quencher absorbs,
A method for detecting a target substance.
를 포함하고,
상기 중합체 입자의 적어도 일부분에 헤어핀 구조의 프로브가 결합되고, 나머지 중 적어도 일부분에 형광단이 로딩되고,
상기 헤어핀 구조의 하나의 말단에 소광제가 결합되고, 나머지 말단은 상기 중합체 입자에 결합되고,
상기 소광제 대 상기 형광단의 농도비는, 1 : 3.3 × 103 내지 1 : 3.3 × 105 인 것인,
검출 시스템.
a probe-polymer particle complex having a hairpin structure;
including,
A probe having a hairpin structure is bound to at least a portion of the polymer particle, and a fluorophore is loaded onto at least a portion of the remainder;
A matting agent is bound to one end of the hairpin structure, and the other end is bound to the polymer particle;
The concentration ratio of the quencher to the fluorophore is 1: 3.3 × 10 3 to 1: 3.3 × 10 5 will,
detection system.
상기 소광제는, 상기 검출 시스템 중 0.033 nM 내지 3.3 nM 의 농도로 포함되는 것인,
검출 시스템.
12. The method of claim 11,
Wherein the quencher is included in a concentration of 0.033 nM to 3.3 nM in the detection system,
detection system.
헤어핀 구조의 프로브와 중합체 입자를 결합시키는 단계; 및
상기 헤어핀 구조의 프로브가 결합된 중합체 입자에 형광물질을 로딩하는 단계;
를 포함하고,
상기 헤어핀 구조의 프로브의 아민기가 상기 중합체 입자에 결합하고,
상기 중합체 입자에 형광물질을 로딩하는 단계는, 상기 헤어핀 구조의 프로브가 결합된 중합체 입자와 형광단 용액을 혼합하고 형광단 용매를 증발시키는 것인,
검출 시스템의 제조방법.preparing a probe having a hairpin structure in which a quencher is bound to one end and functionalized with an amine group at the other end;
binding the probe having a hairpin structure to the polymer particle; and
loading a fluorescent material onto the polymer particles to which the hairpin-structured probe is bound;
including,
The amine group of the probe having the hairpin structure binds to the polymer particle,
The loading of the fluorescent material onto the polymer particles comprises mixing the polymer particles to which the hairpin-structured probe is bound and a fluorophore solution and evaporating the fluorophore solvent,
A method for manufacturing a detection system.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200051444A KR102315849B1 (en) | 2020-04-28 | 2020-04-28 | Detection method using step-wise on/off detection of biological targets, detection system and its manufacturing method |
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| KR1020200051444A KR102315849B1 (en) | 2020-04-28 | 2020-04-28 | Detection method using step-wise on/off detection of biological targets, detection system and its manufacturing method |
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Citations (1)
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- 2020-04-28 KR KR1020200051444A patent/KR102315849B1/en active Active
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