KR102414655B1 - 질환 상태의 백혈구를 검출하거나, 백혈구 관련 질환을 진단하는 장치 또는 방법 - Google Patents
질환 상태의 백혈구를 검출하거나, 백혈구 관련 질환을 진단하는 장치 또는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구를 검출하거나, 백혈구 관련 질환을 진단하는 장치 또는 방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 장치 또는 방법에 의하면, 개체로부터 분리된 소량의 시료를 이용하여 조기에 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구를 검출할 수 있고, 이로부터 백혈구 관련 질환, 예를 들면, 염증, 감염성 질환, 면역 질환, 대사 질환, 또는 암 등을 진단할 수 있는 효과가 있다.
Description
질환 상태의 백혈구를 검출하거나, 백혈구 관련 질환을 진단하는 장치 또는 방법에 관한 것이다.
백혈구는 감염성 질병과 외부 물질로부터 신체를 보호하는 면역계의 세포로서 혈액에서 적혈구를 제외한 나머지 세포이다. 생체가 외부 감염체에 의해 감염되거나, 체내에 암 조직이 발달하였을 때 인체의 면역 기작에 의해 백혈구는 이동하면서 혈관 내벽을 따라 롤링하고, 혈관 내벽세포에 강력히 부착(firm adhesion)하여, 혈관 벽을 통해 유출된다고 알려져 있다.
한편, 패혈증은 외부 감염체의 침투로 전신에 염증 및 과도한 면역반응으로 생체주요장기가 훼손되며 짧은 시간 내에 사망에 이르는 응급질환이다. 패혈증의 진단은 감염균 배양, 혈액 내 지표 단백질 농도측정 등의 방법으로 이루어지고 있지만 위음성 비율이 높으며 빠른 처치가 필요함에도 진단에 오랜 시간이 소모되어 정확하고 효과적인 진단이 어려운 실정이다.
또한, 암 질환의 경우 조기진단이 이루어질 시 완치율을 높일 수 있지만 위내시경, 간초음파 검사와 혈중 바이오마커 검사, 유방촬영술, 자궁경부세포검사 등에 기초한 현재의 암 진단기술은 다른 종류의 암에 대해 각기 다른 진단을 실시해야 하기에 비용과 시간소모가 크고 과정이 복잡하며, 조기검진을 위해 높은 빈도로 검사를 시행하여야 해 실질적으로 조기검진이 어렵다는 문제점이 있다. 이와 같이 질환 상태의 백혈구의 조기검진을 위한 다양한 연구가 진행되고 있으나(한국 공개특허 10-1995-7003150), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상에서는 상기한 바와 같은 문제를 해결하기 위하여, 백혈구의 특성을 이용하여, 소량의 시료로도 질환 상태의 백혈구를 검출하거나, 백혈구 관련 질환인 암 또는 감염성 질환 등을 진단할 수 있는 방법 및 장치를 제공한다.
일 양상은 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 백혈구 혈관외유출 인자(leukocyte extravasation factor)와 접촉시켜, 상기 시료 내의 질환 상태의 백혈구가 백혈구 혈관외유출 인자에 포획되어 상기 포획된 백혈구를 검출하는 단계를 포함하는 질환 상태의 백혈구를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시켜, 상기 시료 내의 질환 상태의 백혈구가 백혈구 혈관외유출 인자에 포획되어 상기 포획된 백혈구를 검출하는 단계를 포함하는 백혈구 관련 질환의 진단에 관한 정보를 제공하거나 백혈구 관련 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 채널의 벽면, 입자의 표면, 용기의 적어도 일부분 또는 웰의 적어도 일부분에 백혈구 혈관외유출 인자가 고정화된 채널, 입자, 용기 또는 웰을 포함하는 질환 상태의 백혈구 검출부를 포함하고, 상기 백혈구 혈관외유출 인자에 의해 분리된 생물학적 시료 내의 질환 상태의 백혈구가 포획되고 검출되는 것인 질환 상태의 백혈구를 검출하는 장치를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 채널의 벽면, 입자의 표면, 용기의 적어도 일부분 또는 웰의 적어도 일부분에 백혈구 혈관외유출 인자가 고정화된 채널, 입자, 용기 또는 웰을 포함하는 질환 상태의 백혈구 검출부를 포함하고, 상기 백혈구 혈관외유출 인자에 의해 분리된 생물학적 시료 내의 질환 상태의 백혈구가 포획되고 검출되는 것인 백혈구 관련 질환을 진단하는 장치를 제공하는 것이다.
일 양상은 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 백혈구 혈관외유출 인자(leukocyte extravasation factor)와 접촉시켜, 상기 시료 내의 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구가 백혈구 혈관외유출 인자에 포획되어 상기 포획된 백혈구를 검출하는 단계를 포함하는 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구를 검출하는 방법을 제공한다.
다른 양상은 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시켜, 상기 시료 내의 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구가 백혈구 혈관외유출 인자에 포획되어 상기 포획된 백혈구를 검출하는 단계를 포함하는 백혈구 관련 질환의 진단에 관한 정보를 제공하거나 백혈구 관련 질환을 진단하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "백혈구(leukocyte)"는 감염성 질병과 외부 물질 등으로부터 신체를 보호하는 면역계의 세포로서 혈액에서 적혈구를 제외한 나머지 세포를 의미하고, 구체적으로 과립성 백혈구와 무과립성 백혈구를 포함할 수 있다. 과립성 백혈구의 예시는 호중구, 호염기구, 또는 호산구를 포함하고, 무과립성 백혈구의 예시는 림프구 또는 단핵구를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자에 포획되는 백혈구 중 호중구의 비율이 가장 높을 수 있다. 따라서, 상기 방법에 의하여 질환 상태의 호중구 또는 비정상 상태의 호중구를 효과적으로 검출할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "백혈구 혈관외유출(leukocyte extravasation)"은 개체의 조직손상, 감염 등의 여러 원인에 의해 백혈구가 혈관을 지나면서 혈관 내피 세포의 인자들에 의해 포획되고(capture), 롤링하고(rolling), 부착되고(adhesion), 이행하는(transmigration) 일련의 과정을 포함하고, 상기 혈관 내피 세포의 인자들과의 일시적, 비가역적, 및 부착성 상호작용을 일으키는 과정을 의미할 수 있다. 상기 백혈구 혈관외유출은 백혈구 부착 카스케이드(leukocyte adhesion cascade)와 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "백혈구 혈관외유출 인자(leukocyte extravasation factor)"는 상기한 바와 같은 백혈구 혈관외유출에 관여하는 인자를 의미할 수 있다. 구체적으로, 백혈구 혈관외유출 인자는 혈관 내피 세포에서 발현하며, 혈관 내피 세포벽을 따라 백혈구를 포획하고, 롤링시키고, 혈관 내피 세포벽에 부착시킬 수 있는 인자를 포함하는 것일 수 있다. 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 P-셀렉틴(P-selectin), E-셀렉틴(E-selectin), CD34, ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule-1), 가용성 ICAM-1, ICAM-2, 가용성 ICAM-2, GlyCAM-1 (Glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1), MadCAM-1 (mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1), PECAM-1 (platelet/endothelial-cell-adhesion molecule), JAM-A (junctional adhesion molecule A), JAM-B, JAM-C, ESAM (endothelial cell-selective adhesion molecule), VCAM-1 (vascular cell-adhesion molecule 1), CD99(cluster of differentiation 99), 인테그린, 이들의 세포외 도메인, 이들을 포함하는 세포, 이들을 포함하는 세포의 멤브래인(membrane), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 인자일 수 있다. 구체적으로, 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 ICAM-1, E-셀렉틴, P-셀렉틴, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 인자일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 백혈구 혈관외유출 인자가 ICAM-1, E-셀렉틴, 및 P-셀렉틴인 경우, 상기 방법에 있어서, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구의 검출율이 현저히 증가할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "셀렉틴(selectin)"은 세포 부착 분자의 패밀리로, 셀렉틴의 세포막관통도메인, N-말단 칼슘 의존성 렉틴 도메인, 세포외 도메인, EGF-유사 도메인, 또는 이들의 조합의 융합 단백질을 모두 포함하는 의미이다. 또한, 상기 셀렉틴은 L-셀렉틴, P-셀렉틴, E-셀렉틴, 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "인테그린(integrin)"은 세포-세포외 기질 부착을 촉진하는 세포막관통 수용체를 의미할 수 있고, 알파 유닛과 베타 유닛의 두 개의 서브 유닛을 포함할 수 있다. 구체적으로, 인테그린은 VLA1, VLA2, VLA3, VLA4, VLA5, VLA6, LFA1A, MAC-1, LFA-1 등을 포함하고, 각 서브 유닛들의 조합의 융합 단백질을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 채널의 벽면, 입자의 표면, 용기의 적어도 일부분 또는 웰의 적어도 일부분에 고정화된 것일 수 있다.
상기 채널은 미세 유체 채널일 수 있다. 구체적으로, 상기 미세 유체 채널은 채널의 내부 벽면의 적어도 일부분에 상기 백혈구 혈관외유출 인자가 고정화된 것일 수 있다.
상기 미세 유체 채널의 단면의 폭(높이, 너비, 또는 직경)은 약 5 내지 10000 μm일 수 있다. 구체적으로, 상기 미세 유체 채널의 단면의 폭(높이, 너비, 또는 직경)은 약 5 내지 5000, 약 5 내지 2000, 약 5 내지 1000, 약 5 내지 500, 약 5 내지 100, 약 5 내지 50, 약 50 내지 10000, 약 50 내지 5000, 약 50 내지 2000, 약 50 내지 1000, 약 50 내지 500, 약 50 내지 100, 약 100 내지 10000, 약 100 내지 5000, 약 100 내지 2000, 약 100 내지 1000, 약 100 내지 500, 약 500 내지 10000, 약 500 내지 5000, 약 500 내지 2000, 또는 약 500 내지 1000 일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 미세 유체 채널의 단면의 폭(높이, 너비, 또는 직경)이 약 5 μm 미만일 경우, 백혈구의 직경이 5 μm 이상임을 고려할 때, 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 상기 미세 유체 채널에 주입하였을 때 채널 내에서의 이동 또는 흐름이 원활하지 못하여 백혈구 혈관외유출 인자에 의한 백혈구 포획율 또는 포획된 백혈구의 검출율이 현저히 감소할 수 있고, 상기 미세 유체 채널의 단면의 폭(높이, 너비, 또는 직경)이 약 10000 μm 초과일 경우, 관찰의 어려움, 큰 시료의 소모량, 및 낮은 효율의 백혈구와 혈관외유출 인자와의 반응 등의 문제로 유의성 있는 검출 결과를 수득하기 어려울 수 있다.
본 명세서에서 용어 "고정화된(immobilized)"은 기질(채널, 입자, 용기 또는 웰)과 단백질 인자(백혈구 혈관외유출 인자) 사이의 화학적 또는 물리적 결합을 의미할 수 있다. 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 고정화 화합물 또는 링커를 통해 상기 채널, 입자, 용기 또는 웰에 고정화된 것일 수 있다.
상기 고정화 화합물 또는 링커는 백혈구 혈관외유출 인자를 기질(채널, 입자, 용기, 또는 웰)의 표면에 고정화하기 위한 링커를 의미할 수 있다. 상기 고정화 화합물 또는 링커는 비오틴, 아비딘, 스트렙트아비딘, 탄수화물, 폴리 L-리신, 티올기, 아민기, 알코올기, 카르복실기, 아미노기, 설퍼기, 알데히드기, 카르보닐기, 숙신이미드기, 말레이미드기, 에폭시기, 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물 또는 그의 조합인 것일 수 있다. 아미노기를 갖는 화합물의 예에는, 3-아미노프로필트리메톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란 (EDA), 트리메톡시실릴프로필디에틸렌트리아민 (DETA), 3-(2-아미노에틸아미노프로필) 트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란가 포함될 수 있고, 알데히드기를 갖는 화합물에는 글루타르알데히드가 포함될 수 있다. 티올기를 갖는 화합물의 예에는 4-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTS)가 포함될 수 있다. 또한, 에폭시기를 갖는 화합물의 예에는, 3-글리시드옥시프로필트리메톡시실란, 이소티오시아네이트기를 갖는 화합물의 예에는, 4-페닐렌디이소티오시아네이트(PDITC), 숙신이미드 및 말레이미드기를 갖는 화합물의 예에는, 디숙신이미딜 카르보네이트 (DSC) 또는 숙신이미딜 4-(말레이미드페닐) 부틸레이트(SMPB)가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "질환 상태의 백혈구"는 면역 세포로서의 기능을 하기 위해 세포 신호 전달 경로에 따라 백혈구가 필요로 하는 부위로 이동할 수 있는 상태 또는 면역세포로서의 기능에 이상이 생겨 이동이 억제된 상태, 또는 관련 인자들의 발현량이 증가 또는 감소되었거나 또는 관련 인자들이 활성화 또는 활성이 억제된 상태를 의미하고, "비정상 상태의 백혈구" 또는 "면역 기능이 비정상적인 상태의 백혈구"의 의미를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 "질환 상태" 또는 "비정상 상태"의 백혈구라고 표현하여 "정상 상태"의 백혈구와 구분하였지만, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구는 개체의 질환 상태, 또는 개체의 비정상 상태로 인한 백혈구의 면역 세포로서의 기능 및 특성이 그렇지 않은 정상 개체와 대비하여 변화된 상태를 포함할 수 있다. 따라서, 상기 "질환 상태의 백혈구" 또는 "비정상 상태의 백혈구"는 "질환 상태의 개체의 백혈구", "질환 상태의 개체로부터 분리된 백혈구", "의학적 비정상 상태의 개체의 백혈구", 또는 "의학적 비정상 상태의 개체로부터 분리된 백혈구"를 포함하여 의미할 수 있다.
상기 백혈구는 혈액에서 적혈구를 제외한 나머지 면역계의 세포로서 모든 종류의 세포(호중구, 호염기구, 호산구, 림프구, 단핵구 등)를 포함할 수 있으므로, 본 명세서에서 용어 "질환 상태의 호중구(또는 호염기구, 호산구, 림프구, 단핵구 등)" 또는 "비정상 상태의 호중구(또는 호염기구, 호산구, 림프구, 단핵구 등)는 상기 "질환 상태의 백혈구" 또는 "비정상 상태의 백혈구"에 대한 설명과 동일하게 정의되거나, 동일한 의미를 나타낼 수 있다.
또한, 상기 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구 또는 이들의 백혈구 세포 집단은 정상 상태의 백혈구 또는 이들의 백혈구 세포 집단 대비 백혈구 혈관외유출 인자와의 결합능이 증가되거나 감소된 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구는 정상 상태의 백혈구 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자의 발현 또는 활성이 증가 또는 감소되었거나, 상기 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구 세포 집단은 정상 상태의 백혈구 세포 집단 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자의 발현 또는 활성이 증가 또는 감소된 것일 수 있다.
상기 세포 집단의 인자의 발현 또는 활성의 증가 또는 감소는, 단일 세포 수준이 아닌, 복수의 세포에 대하여 언급된 인자의 발현 또는 활성이 증가 또는 감소된 것을 나타낼 수 있고, 상세하게는, 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자를 발현하거나 활성화된 세포의 수가 증가 또는 감소한 것을 나타낼 수 있다.
상기 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자는 시알화된 탄수화물(sialylated carbohydrates), L-셀렉틴(L-selectin), PSGL-1(P-selectin glycoprotein ligand 1), LFA-1(Leukocyte function-associated antigen 1), Mac-1(Integrin alpha M; Macrophage-1 antigen), VLA-4, CD24, CD44 및 ESL-1(E-selectin ligand 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 방법의 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구에 있어서, 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 포함하는 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료를 포함하여 상기 시료는 액체 상태(예컨대, 혈액, 현탁액 등)일 수 있다. 즉, 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구(또는 이를 포함하는 시료)는 액체에 백혈구가 포함되어 있는 상태(예컨대, 혈액, 현탁액 등)일 수 있다. 따라서, 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구(또는 이를 포함하는 시료)는 백혈구 외에 생리식염수 및 배양액 등을 더 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법에서, 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시키는 것은 내부 벽면에 상기 백혈구 혈관외유출 인자가 고정화된 상기 채널에 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 주입하는 것에 의하여 수행되는 것일 수 있다. 이때, 상기 채널에 주입되는 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구는 액체에 백혈구가 포함되어 있는 상태(예컨대, 혈액, 현탁액 등)로 상기 채널에 주입되어 채널을 통과하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 채널에 주입되는 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구에 포함된 백혈구의 농도는 약 102 내지 109, 약 104 내지 108, 약 105 내지 107, 약 105 내지 106, 약 106 내지 108, 또는 약 106 내지 107 cells/ml인 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 채널에 주입되는 백혈구의 농도가 약 102 cells/ml 미만일 경우, 유의성 있는 검출 결과를 수득하기 어려울 수 있고, 상기 채널에 주입되는 백혈구의 농도가 약 109 cells/ml 초과일 경우, 요구되는 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료부터 분리된 백혈구의 양이 많아져 시료 획득에 어려움이 있을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구는 약 0.1 내지 100, 약 1 내지 50, 약 1 내지 50, 약 2 내지 40, 약 3 내지 30, 약 4 내지 20, 또는 약 5 내지 10 μL/min의 유속으로 상기 채널에 주입되는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 유속이 상기 수치범위를 벗어나는 경우, 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구의 채널 내에서의 이동 또는 흐름이 너무 느리거나 너무 빨라서, 검출 효율 또는 백혈구 혈관외유출 인자에 의한 백혈구 포획율 또는 포획된 백혈구의 검출율이 현저히 높거나 감소할 수 있고, 이로 인해, 유의성 있는 검출 결과를 수득하기 어려울 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법의 상기 검출은 포획된 백혈구를 이미징하여 검출하거나, 형광 염색하여 검출하거나, 포획된 백혈구를 용해시켜 분리된 백혈구 용해물(lysate)을 측정하거나, 또는 상기 백혈구 또는 백혈구 혈관외유출 인자에 검출 가능한 표지가 부착되어 검출하는 것일 수 있다.
상기 검출은 백혈구의 존재를 검출해낼 수 있는 통상의 당업자에게 적절한 수단이 모두 사용가능하며, 특정 수단에 한정되지 않는다.
예를 들면, 상기 검출은 카메라 및/또는 이미지 센서로 검출하는 것일 수 있다. 상기 카메라는 디지털 카메라를 포함하는 모든 종류의 카메라 및 이미지 센서(image sensors)를 포함한다. 또한, 예를 들면, 현미경으로 형광없이 확인하는 경우 Bright-field, Phase-contrast, Dark-field 등의 방법으로 세포를 이미징할 수 있는 장비를 이용하여 백혈구를 검출할 수 있다. 더욱 상세하게는 카메라 및 이미지 센서를 배율조정 렌즈와 함께 사용하거나 또는 사용하지 않고 Bright-field, Phase-contrast, Dark-field 등의 방법을 통해 백혈구를 검출할 수 있다. 상기 이미징을 통해 수득한 이미지를 이미지 분석 프로그램 등을 통해 세포의 수를 수동/자동으로 셀 수 있다.
상기 형광 염색은 살아있거나 죽어있는 세포를 육안으로 확인할 수 있도록, 녹색, 적색 등의 형광을 띄는 염색 시약을 이용하여 세포를 면역 형광 염색하는 것을 의미할 수 있다. 상기 염색된 세포를 촬영함으로써 수득한 세포의 형광 이미지를 통하여 세포의 활성도, 골격 등을 확인할 수 있다. 상기 형광 염색을 위하여, 형광물질, [칼세인 AM(Calcein AM), FITC(Fluorescein isothiocuanate), 팔로딘(Phalloidin), 플루오레세인(fluorescein), 로다민, TAMRA(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine), Cy-3, Cy-5, 텍사스레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole), 헥스트(Hoechst staining), Dil Stain (DiIC18(3)) 및 코마린(Coumarin)], 형광 염료(Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 647(Life Technology 사), DyLight 633, DyLight 650, DyLight 680(Thermo Fisher 사), TF5, TF6, TF7(ACZO Biotech), Quantum dots 등) 및 형광 염료를 내포한 입자(Flash Red(Bangs Labs 사), Dark Red, Infrared(Invitrogen 사), Sky Blue(Sperotech 사) 등) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법의 상기 검출에 있어서, 상기 포획된 백혈구를 용해시켜 분리된 백혈구 용해물(lysate)을 측정하는 것은, 구체적으로, 백혈구 용해제(예컨대, SDS 등의 계면활성제 등) 등을 이용하여 상기 백혈구 혈관외유출 인자에 의하여 포획된 백혈구를 파괴하여 백혈구 용해물(lysate)을 분리하고, 분리된 백혈구 용해물(lysate)을 측정하는 것일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분리된 백혈구 용해물(lysate)은 핵산, 세포막 단백질, 세포질 단백질, 또는 세포핵 단백질일 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분리된 백혈구 용해물(lysate)을 측정하기 위해서 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction: PCR) 방법, FISH(fluorescence in situ hybridization) 방법, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯(Western blot), 또는 immune-detection 방법(예컨대, 항체 등을 이용한 면역검출법 등)을 사용할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 검출 가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 자기적 표지, 또는 간접 표지일 수 있다. 광학적 표지는 검출가능한 광학적 신호를 발생시키는 물질로서, 방사성 물질, 또는 형광 물질과 같은 발색 물질일 수 있다. 간접 표지는 기질을 발색 물질로 전환시키는 효소 또는 그 기질, 항체 또는 항원과 같이 특정 물질과 결합한 결과, 검출가능한 표지를 발생시킬 수 있는 물질을 나타낸다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 내의 단위 시료 부피당 총 백혈구의 수를 계수하거나, 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 내의 백혈구를 분리하고 이를 계수하는 단계를 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 총 백혈구의 수를 계수하는 단계는 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 상기 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시키지 않은 상태에서, 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구 자체에 포함된 단위 시료 부피당 총 백혈구의 수를 계수하는 것일 수 있다.
상기 계수하는 단계는 백혈구를 검출하는 단계의 전, 후, 또는 중에 수행될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 내의 백혈구를 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리하는 단계는 분리된 백혈구의 수를 계수하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분리된 생물학적 시료 내의 백혈구를 분리하는 단계는 예를 들면, 분리된 생물학적 시료를 미세구조체 어레이가 포함된 채널에 주입시켜, 일정 크기를 갖는 백혈구가 미세구조체 어레이에 일시적으로 포획될 수 있도록 하는 것을 포함하거나, 분리된 생물학적 시료가 전혈인 경우, 전혈에서 적혈구를 선택적으로 용혈시킨 후 원심분리하여 백혈구를 분리하는 것을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 분리하는 단계는 백혈구를 검출하는 단계 중 또는 검출하는 단계 전에 수행될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법의 상기 검출하는 단계는 상기 계수된 단위 시료 부피당 총 백혈구 수 대비 상기 혈관외유출 인자에 의해 포획된 백혈구 수의 비율을 분석하거나, 상기 분리된 백혈구 수 중 상기 혈관외유출 인자에 의해 포획된 백혈구의 수를 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법의 상기 검출하는 단계는 시험 목적이 되는 개체의 시료에 포함된 단위 시료 부피당 총 백혈구 수 대비 상기 시험 목적이 되는 개체의 시료로부터 분리된 백혈구로서 상기 혈관외유출 인자에 의해 포획된 백혈구 수의 비율을 분석하는 단계; 및/또는 상기 분석된 비율을, 정상 개체의 시료에 포함된 단위 시료 부피당 총 백혈구 수 대비 상기 정상 개체의 시료로부터 분리된 백혈구로서 상기 혈관외유출 인자에 의해 포획된 백혈구 수의 비율과 비교하는 단계; 및/또는 상기 시험 목적이 되는 개체의 시료로부터 분석된 비율이 상기 정상 개체의 시료로부터 분석된 비율보다 높거나 또는 낮은 경우, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구로 판정하거나, 개체의 질환 상태 또는 의학적 비정상 상태를 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 기 분리된 임의의 수의 백혈구를 채취하는 경우, 상기 검출하는 단계는 상기 분리되고 계수된 백혈구 수 중 상기 혈관외유출 인자에 의해 포획된 백혈구의 수를 분석하는 단계; 및/또는 상기 분석된 백혈구의 수를 상기 혈관외유출 인자에 의해 포획된 정상 백혈구(또는 정상 개체의 시료로부터 분리된 백혈구) 수와 비교하여 높거나 또는 낮은 경우, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구로 판정하거나, 개체의 질환 상태 또는 의학적 비정상 상태를 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 검출하는 단계는 검출된 백혈구(예를 들면, 광학적 신호 등)가 정상 상태의 백혈구 또는 정상 개체의 시료로부터 분리된 백혈구(예를 들면, 참조 신호)와 비교하여 증가 또는 감소한 경우, 개체의 질환 상태 또는 의학적 비정상 상태를 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 정상 개체의 시료에 포함된 단위 시료 부피당 총 백혈구 수 대비 상기 정상 개체의 시료로부터 분리된 백혈구로서 상기 혈관외유출 인자에 의해 포획된 백혈구 수의 비율은 정상 개체에서 추가적으로 정하거나, 참조 수치로 미리 정해진 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 질환 상태 또는 상기 백혈구 관련 질환은 염증, 감염성 질환, 면역 질환, 대사 질환, 암 또는 암 전이를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "감염성 질환"은 바이러스, 세균, 곰팡이 또는 진균의 전신성 또는 국부성 감염, 패혈증, 균혈증, 또는 바이러스 혈증을 포함하는 의미일 수 있다. 예시적으로, 바이러스 또는 진균의 감염증은 슈도모나스 (Pseudomonas), 엑세리키아 (Excherichia), 클레브실라 (Klebsiella), 엔트로박터 (Enterobacter), 프로테우스 (Proteus), 세라티아 (Serratia), 캔디다 (Candida), 스트라필로코시 (Staphylococci), 스트렙토코시 (Streptococci), 클라미디아 (Chlamydia), 미코플라즈마 (Mycoplasma) 및 다양한 다른 종에 의한 박테리아 또는 진균 감염으로부터 발생하는 질환 또는 증상을 포함할 수 있다. 예시적인 바이러스 감염증은 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스 (Coronavirus), 아데노바이러스 (Adenovirus), 파라인플루엔자 (parainfluenza) 바이러스, 리노바이러스(Rhinovirus), 호흡기 합포체 바이러스 (respiratory syncytial virus: RSVs), 헤르페스 바이러스 (Herpes virus), 사이토메갈로바이러스 (cytomegalovirus), 예를 들어 간염 B 및 C와 같은 간염 바이러스 (heptatitis virus) 및 다양한 다른 종에 의한 바이러스 감염으로부터 발생하는 질환 또는 증상을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "면역 질환"은 면역계를 자극하거나 (즉, 면역 활성화 상태 또는 면역 비활성화 상태를 유발하거나), 면역 자극 (면역 활성화), 면역 과잉, 면역 비활성화 또는 면역 저하에 의하여 유발되는 모든 질병일 수 있으며, 예컨대, 바이러스, 세균, 곰팡이 또는 진균 등의 전신성 또는 국부성 감염 (예컨대, 초기 감염, 장기적 감염 등), 염증 (예컨대, 급성 염증 또는 만성 염증), 패혈증, 균혈증, 암, 암전이, 자가면역질환, 심혈관계 질환 (동맥경화, 뇌졸중 등), 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 면역 관련 질환은 앞서 설명한 전신성 또는 국부성 감염, 급성 염증, 패혈증, 균혈증, 자가면역질환, 심혈관계 질환 (동맥경화, 뇌졸중 등) 등의 면역 자극 (면역 활성화) 상태 또는 면역 이상 (즉, 면역 과잉) 상태와 관련 있거나 이에 의하여 유발되는 질병; 또는 장기적 감염, 만성 염증, 암, 암전이 등의 면역 이상 (즉, 면역 비활성화 또는 면역 저하) 상태와 관련 있거나 이에 의하여 유발되는 질병을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "염증" 이란, 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극으로 인한 숙주 침입에 관한 신체 조직의 국소화된 보호 반응으로 나타나는 결과로서, 이러한 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염 성원인, 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인, 또는 독소, 약물 또는 산업적 시약과 같은 화학약품, 또는 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역 반응, 또는 산화성 스트레스와 관련된 이상 상태일 수 있다. 본 발명의 염증성 질환의 예로는 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 패혈증, 패 혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전 또는 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease)이다.
본 명세서에서 용어 "대사 질환"은 호르몬, 당질, 지질, 단백질, 비타민, 미네랄 또는 수분 등의 체내 화학 조성의 불균형에 의한 질환을 의미할 수 있다. 본 명세서의 대사 질환의 예로는, 비만, 당뇨병(예를 들면, I형 또는 II형 당뇨병), 인슐린 저항증, 죽상경화증, 동맥경화증, 간지방증(hepatic steatosis), 지방간(fatty liver), 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증 또는 고지혈증을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "암"이란 정상적인 세포사멸 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하고, 주변 조직으로 침윤할 수 있는 특징을 갖는 질병군을 말한다. 폐암, 후두암, 위암, 대장/직장암, 간암, 담낭암, 췌장암, 유방암, 자궁 경부암, 전립선암, 신장암, 피부암 등의 상피세포 등에서 유래하는 암종(carcinoma), 골암, 근육암, 지방암, 섬 유세포암 등의 결합조직세포에서 유래하는 육종(sarcoma), 백혈병, 림프종, 다발성골수종 등의 조혈세포에서 유래하는 혈액암, 신경조직에 발생하는 종양 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "분리된 생물학적 시료"는 개체로부터 분리된 생물학적 시료를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 분리된 생물학적 시료는 개체의 체외로 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 골수액, 조직액, 윤활액(synovial fluid), 타액, 비액, 객담, 뇌척수액, 안구액 및 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 질환 상태 또는 의학적 비정상 상태가 의심되는 개체로부터 분리된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 개체는 인간을 포함하는 모든 동물을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 마우스, 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 포함한다. 또한, 상기 개체는 질환 상태 또는 의학적 비정상 상태가 의심되는 개체이거나, 이미 질환 상태 또는 의학적 비정상 상태를 가지는 것으로 판정된 개체일 수 있다.
특정 이론에 제한됨이 없이, 도 1에 도식화된 바와 같이, 일 구체예에 따른 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구(또는 질환 개체 또는 의학적 비정상 상태의 개체의 백혈구)는 백혈구 혈관외유출과 관련된 인자(예를 들면, 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자)의 발현량이 증가 또는 활성화되거나 감소 또는 활성이 억제된다(백혈구 표면). 따라서, 도 2는 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자가 활성화 또는 인자의 발현량이 증가한 경우에 대한 예시로서, 도 2에 도식화된 바와 같이, 상기 백혈구 혈관외유출과 관련된 인자의 발현량이 증가하거나 발현량이 증가한 백혈구의 수가 증가하게 되면, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구(또는 질환 개체 또는 의학적 비정상 상태의 개체의 백혈구)는, 정상 상태의 백혈구(또는 정상 개체의 백혈구) 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 더 많이 결합 또는 더 강하게 결합할 수 있는 상태가 되거나 그와 같은 상태의 백혈구 수가 증가하게 되고, 이러한 백혈구의 특성을 이용하여 채널, 입자, 용기 또는 웰에 고정화 또는 부착된 백혈구 혈관외유출 인자와 개체로부터 분리된 백혈구를 접촉시킴으로써, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구(또는 질환 개체 또는 의학적 비정상 상태의 개체의 백혈구)를 검출할 수 있다. 예컨대, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구(또는 질환 개체 또는 의학적 비정상 상태의 개체의 백혈구)를 상기 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시킨 경우, 정상 상태의 백혈구(또는 정상 개체의 백혈구)를 상기 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시킨 경우와 비교하여 더 많은 수의 백혈구가 상기 백혈구 혈관외유출 인자에 의하여 포획되어 검출될 수 있다. 반대로, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구(또는 질환 개체 또는 의학적 비정상 상태의 개체의 백혈구)에서 상기 백혈구 혈관외유출과 관련된 인자의 발현량이 감소하거나 발현량이 감소한 백혈구의 수가 증가하게 되면, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구(또는 질환 개체 또는 의학적 비정상 상태의 개체의 백혈구)는, 정상 상태의 백혈구(또는 정상 개체의 백혈구) 대비 상기 백혈구 혈관외유출 인자와 더 적게 결합 또는 더 약하게 결합할 수 있는 상태가 되거나 그와 같은 상태의 백혈구 수가 증가하게 되고, 이러한 백혈구의 특성을 이용하여 채널, 입자, 용기 또는 웰에 고정화 또는 부착된 백혈구 혈관외유출 인자와 개체로부터 분리된 백혈구를 접촉시킴으로써, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구(또는 질환 개체 또는 의학적 비정상 상태의 개체의 백혈구)를 검출할 수 있다. 예컨대, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구(또는 질환 개체 또는 의학적 비정상 상태의 개체의 백혈구)를 상기 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시킨 경우, 정상 상태의 백혈구(또는 정상 개체의 백혈구)를 상기 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시킨 경우와 비교하여 더 적은 수의 백혈구가 상기 백혈구 혈관외유출 인자에 의하여 포획되어 검출될 수 있다.
상기 백혈구 관련 질환의 진단에 관한 정보를 제공하거나 백혈구 관련 질환을 진단하는 방법은 이미 상기 백혈구 관련 질환을 가지는 것으로 판정된 개체의 질환의 진행 경과 또는 질환의 진행 상태(예컨대, 암 또는 염증의 진행 상태, 암의 병기, 암의 전이 여부 등)에 관한 정보를 제공하는 방법을 포함할 수 있다.
따라서, 상기 백혈구 관련 질환의 진단에 관한 정보를 제공하거나 백혈구 관련 질환을 진단하는 방법은 이미 백혈구 관련 질환을 가지는 것으로 판정된 개체의 백혈구를 포함하는 상기 개체로부터 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시켜, 상기 시료 내의 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구가 백혈구 혈관외유출 인자에 포획되어 상기 포획된 백혈구를 검출하는 단계를 포함하는 백혈구 관련 질환의 진행 경과 또는 질환의 진행 상태에 관한 정보를 제공하는 방법을 포함할 수 있다.
상기 백혈구 관련 질환의 진행 경과 또는 질환의 진행 상태에 관한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 검출하는 단계는 상기 백혈구 혈관외유출 인자에 포획되어 검출된 백혈구를 정량적으로 평가하는 단계; 및/또는 상기 정량적으로 평가하는 단계에서 얻어진 수치를 하나 이상의 참조 수치와 비교하는 단계; 및/또는 상기 정량적으로 평가하는 단계에서 얻어진 수치가 상기 하나 이상의 참조 수치 중 특정 참조 수치와 동일하거나, 특정 참조 수치의 수치범위에 속하거나, 특정 참조 수치보다 높거나 또는 낮은 경우, 이미 백혈구 관련 질환을 가지는 것으로 판정된 개체의 질환의 진행 경과 또는 질환의 진행 상태(예컨대, 암 또는 염증의 진행 상태, 암의 병기, 암의 전이 여부 등)를 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 참조 수치는 수치범위일 수 있다. 또한, 상기 참조 수치는 미리 정해진 것으로 통계적 분석에 의하여 표준화된 수치일 수 있다. 예컨대, 상기 참조 수치는 미리 정해진 것으로서, 시험 목적이 되는 개체, 즉, 이미 백혈구 관련 질환을 가지는 것으로 판정된 개체의 질환과 동일한 질환을 가지는 것으로 판정된 1 이상의 다른 개체로부터 분리된 백혈구를 상기 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시켜 검출된 백혈구를 정량적으로 평가한 수치일 수 있다. 이때, 상기 참조 수치는, 질환의 진행 경과 또는 질환의 진행 상태에 따라 반복적으로 평가하여 얻어진 복수의 수치 또는 수치범위일 수 있다.
다른 양상은 채널의 벽면, 입자의 표면, 용기의 적어도 일부분 또는 웰의 적어도 일부분에 백혈구 혈관외유출 인자가 고정화된 채널, 입자, 용기 또는 웰을 포함하는 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구 검출부를 포함하고, 상기 백혈구 혈관외유출 인자에 의해 분리된 생물학적 시료 내의 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구가 포획되고 검출되는 것인 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구를 검출하는 장치를 제공한다.
또 다른 양상은 채널의 벽면, 입자의 표면, 용기의 적어도 일부분 또는 웰의 적어도 일부분에 백혈구 혈관외유출 인자가 고정화된 채널, 입자, 용기 또는 웰을 포함하는 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구 검출부를 포함하고, 상기 백혈구 혈관외유출 인자에 의해 분리된 생물학적 시료 내의 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구가 포획되고 검출되는 것인 백혈구 관련 질환의 진단 장치를 제공한다.
상기 채널은 미세 유체 채널일 수 있다.
상기 장치는 분리된 생물학적 시료가 주입되는 주입부 및/또는 분석된 시료가 배출되는 배출부를 더 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 장치는 분리된 생물학적 시료로부터 백혈구를 분리하는 분리부를 더 포함할 수 있다. 상기 분리부를 통해 분리된 백혈구는 상기 검출부로 주입되는 것일 수 있다. 상기 분리부에서 수행될 수 있는 분리된 생물학적 시료로부터 백혈구를 분리하는 단계 또는 방법에 대해서는 상기한 바와 같다. 또한, 상기 장치는 포획된 백혈구를 검출할 수 있는 검출수단을 포함하는 분석부를 더 포함할 수 있다.
상기 장치는 진단 키트, 검출 키트, 미세유체소자, 또는 미세유체칩일 수 있다.
상기 장치에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구를 검출하거나, 백혈구 관련 질환을 진단하는 장치 또는 방법에 의하면, 개체로부터 분리된 소량의 시료를 이용하여 조기에 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구를 검출할 수 있고, 이로부터 백혈구 관련 질환, 예를 들면, 염증, 감염성 질환, 면역 질환, 대사 질환, 또는 암 등을 진단할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 정상 상태의 백혈구의 표면 수용체와 질환 상태의 백혈구의 표면 수용체의 차이를 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 방법 및 장치의 질환 상태의 백혈구의 검출 원리를 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여, 정상 상태의 백혈구와 패혈증 상태의 백혈구가 채널에 부착되는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 정상 상태 또는 패혈증 상태의 백혈구를 형광 염색한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 일 구체예에 따른 정상 상태 또는 패혈증 상태의 백혈구의 PSGL-1 단백질의 평균 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 정상 상태 또는 패혈증 상태의 백혈구의 (채널에 붙은 백혈구수)/(샘플 총 백혈구수)%를 나타낸 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 정상 상태 또는 패혈증 상태의 백혈구의 (채널에 붙은 백혈구수)/(샘플 총 백혈구수)%를 나타낸 결과이다.
도 8은 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 정상 상태 또는 암 상태의 백혈구를 형광 염색한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 일 구체예에 따른 정상 상태 또는 암 상태의 백혈구의 (채널에 붙은 백혈구수)/(샘플 총 백혈구수)%를 나타낸 결과이다.
도 10a는 마우스 종양 모델의 암세포 접종 후 시간별 종양 크기 변화를 나타낸 결과이다.
도 10b는 마우스 종양 모델의 암세포 접종 후 시간별 종양 무게 변화를 나타낸 결과이다.
도 11은 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 정상 상태 또는 암 상태의 백혈구의 수를 집계한 결과이다.
도 12는 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 백혈구 중 호중구의 비율을 나타낸 결과이다.
도 13a는 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 백혈구를 형광현미경으로 이미징한 사진이다.
도 13b는 도 13a와 동일한 채널에 부착된 백혈구를 BF(Bright field) 상에서 현미경으로 이미징한 사진이다.
도 13c는 도 13b의 BF 상에서 현미경으로 이미징한 것을 이용하여 세포 수를 자동으로 계수한 사진(ImageJ, USA)이다.
도 13d는 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 백혈구를 형광이미지(CT) 및 Bright field(BF) 이미지에서 계수한 것의 차이를 나타낸 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 방법 및 장치의 질환 상태의 백혈구의 검출 원리를 도식화하여 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여, 정상 상태의 백혈구와 패혈증 상태의 백혈구가 채널에 부착되는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 정상 상태 또는 패혈증 상태의 백혈구를 형광 염색한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 5는 일 구체예에 따른 정상 상태 또는 패혈증 상태의 백혈구의 PSGL-1 단백질의 평균 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 구체예에 따른 정상 상태 또는 패혈증 상태의 백혈구의 (채널에 붙은 백혈구수)/(샘플 총 백혈구수)%를 나타낸 그래프이다.
도 7은 일 구체예에 따른 정상 상태 또는 패혈증 상태의 백혈구의 (채널에 붙은 백혈구수)/(샘플 총 백혈구수)%를 나타낸 결과이다.
도 8은 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 정상 상태 또는 암 상태의 백혈구를 형광 염색한 결과를 나타낸 이미지이다.
도 9는 일 구체예에 따른 정상 상태 또는 암 상태의 백혈구의 (채널에 붙은 백혈구수)/(샘플 총 백혈구수)%를 나타낸 결과이다.
도 10a는 마우스 종양 모델의 암세포 접종 후 시간별 종양 크기 변화를 나타낸 결과이다.
도 10b는 마우스 종양 모델의 암세포 접종 후 시간별 종양 무게 변화를 나타낸 결과이다.
도 11은 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 정상 상태 또는 암 상태의 백혈구의 수를 집계한 결과이다.
도 12는 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 백혈구 중 호중구의 비율을 나타낸 결과이다.
도 13a는 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 백혈구를 형광현미경으로 이미징한 사진이다.
도 13b는 도 13a와 동일한 채널에 부착된 백혈구를 BF(Bright field) 상에서 현미경으로 이미징한 사진이다.
도 13c는 도 13b의 BF 상에서 현미경으로 이미징한 것을 이용하여 세포 수를 자동으로 계수한 사진(ImageJ, USA)이다.
도 13d는 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 채널에 부착된 백혈구를 형광이미지(CT) 및 Bright field(BF) 이미지에서 계수한 것의 차이를 나타낸 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 질환 상태의 백혈구를 검출하기 위한 미세 유체 채널을 포함하는 미세 유체 칩의 제조
질환 상태의 백혈구를 검출하기 위하여, 백혈구 혈관외유출 인자(leukocyte extravasation factor)로 코팅된 미세 유체 채널을 포함하는 미세 유체 칩을 제조하였다.
구체적으로, 채널(너비: 약 400 μm, 높이: 약 100 μm, 길이: 약 27 mm) 패턴을 가지는 표면을 포함하는 폴리디메틸실록산(polydimethylsiloxane, PDMS)을 준비하였다. 상기 PDMS의 채널 패턴을 가지는 표면을 공기 플라즈마 처리하고 약 10% APTES(3-Aminopropyltriethoxysilane, 약 99.9%의 에탄올에 용해됨)로 처리하였다. 그 후, APTES로 처리된 PDMS 표면을 알데히드기가 활성화된 글라스슬라이드(LumiNano, Korea)와 접합하고 약 37°C에서 약 5시간 동안 반응시켜, 미세 유체 채널을 포함하는 미세 유체 칩을 제작하였다.
그 후, 상기 미세 유체 채널의 내부를 백혈구 혈관외유출 인자들로 코팅하였다. 구체적으로, ICAM-1 + E-셀렉틴; 및 ICAM-1 + E-셀렉틴 + P-셀렉틴 (각각 약 5 μg/ml) 등이 포함되어 있는 1XPBS(pH7.4)를 약 2 내지 4분 동안 약 10 μL/min의 속도로 주입구를 통해 상기 미세 유체 채널로 주입하였다. 이 상태에서 유체의 흐름을 제어하는 마이크로 펌프의 작동을 멈춘 후, 실온 조건에서 상기 미세 유체 채널에 주입된 액체를 약 30분 동안 그대로 두어 단백질들이 알데히드기에 부착되도록 유도하였다. 그 후, 약 3% bovine serum albumin을 포함하는 1XPBS(pH 7.4)를 약 4분 동안 약 10 μL/min 유속으로 채널에 주입하고 마이크로 펌프의 작동을 멈춘 후 약 1시간 동안 액체를 채널에 그대로 두어 비특이적 반응을 막는 블로킹 과정을 거친 후, 1XPBS(pH7.4)를 약 4분 동안 약 10 μL/min 유속으로 채널에 주입하여 세척하였다.
그 결과, 백혈구 혈관외유출 인자로 코팅된 미세 유체 채널을 포함하는 미세 유체 칩을 수득하였다. 모든 시료의 처리는 상기 미세 유체 칩에 마련된 주입부와 배출부를 통해 이루어졌다.
실험예 1: 백혈구 혈관외유출 인자를 이용한 패혈증 질환 상태의 백혈구의 검출
백혈구 혈관외유출 인자를 이용한 패혈증 질환 상태의 백혈구를 검출하기 위해 하기와 같은 실험을 실시하였다.
먼저 9주령의 위스타 랫트 수컷(Wistar rat)에 E. coli K12(약 108 CFU/1 mL 생리식염수)를 복강 주입하여 패혈증을 유발하였다.
그 후, 준비된 패혈증 유발된 랫트 또는 정상 랫트의 혈액 약 50 μL를 채취하여 ACK lysis 버퍼와 약 1:20의 비율로 혼합한 뒤, 상온에서 약 5분 동안 반응시킨 후, 원심분리를 이용하여 백혈구를 분리하였다. 분리된 백혈구를 1XPBS로 세척한 후, 약 100 μL 1XPBS에 희석하여 백혈구를 포함하는 생물학적 시료를 제조하였다. 상기 실시예 1과 동일하게 랫트 ICAM-1, 랫트 P-셀렉틴, 및 랫트 E-셀렉틴(각각 약 5 μg/ml 농도의 용액 이용) 등이 고정화된 미세 유체 채널을 포함하는 미체 유체 칩을 준비하고, 상기 준비된 채널의 주입구로 상기 생물학적 시료를 약 8 μl/min 속도로 약 10분간 주입하여 흘려준 후, 채널에 부착되지 않은 백혈구를 제거하기 위하여, 1XPBS를 채널 내로 약 8 μl/min의 유속으로 주입하여 약 4분 동안 세척하고, 이를 약 2번 더 반복하였다. 그 후 상기 미세 유체 채널에 부착 또는 포획되어 있는 백혈구를 염색하기 위해 Hoechst와 Cell tracker 등의 염색약으로 채널 내부를 채우고 약 20분 동안 상온에서 배양한 후, 1XPBS를 채널 내로 약 8 μl/min의 유속으로 주입하여 약 4분 동안 세척하였다. 그 후, 각 채널 내부를 형광 현미경으로 촬영하였고, 백혈구가 부착된 각 채널의 내부 이미지를 캡처하고 채널에 포획된 총 백혈구 수를 집계하였다.
샘플 총 백혈구 수 분석을 위해 준비된 패혈증 유발된 랫트 또는 정상 랫트에서 따로 약 50 μL의 혈액을 채취하여 상술한 방법과 동일한 방법으로 백혈구를 분리한 후, 분리된 백혈구를 약 100 μL 1XPBS에 희석하여 생물학적 시료를 제조하고 CellTracker, DAPI, 또는 Hoechst로 염색 후 hemocytometer를 이용하여 전체 백혈구 수를 집계하였다.
그 후, (채널에 부착된 백혈구)/(샘플 총 백혈구의 수)(%)를 이용하여 대조군(정상 랫트)과 패혈증군의 각 채널에 포획된 백혈구의 비율을 비교하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 각 채널에 고정화하여 각 채널에서 패혈증 질환 상태의 백혈구(패혈증 질환 랫트의 백혈구)와 정상 상태의 백혈구(정상 랫트의 백혈구)를 포획한 결과, 패혈증 질환 상태의 백혈구가 정상 상태의 백혈구 대비 더 많이 채널에 부착되었다.
또한, 상기 ICAM-1 + E-셀렉틴 + P-셀렉틴 등이 고정화된 채널에서 CellTracker로 염색된 세포를 형광 현미경으로 촬영하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 각 채널에 부착된 백혈구를 CellTracker로 염색한 결과 패혈증 상태의 백혈구가 정상 대조군의 백혈구보다 더 많이 채널에 부착되었다.
이러한 결과는, 일 구체예에 따른 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구는 백혈구 혈관외유출과 관련된 인자(예를 들면, 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자)의 발현량이 증가하게 되거나 발현량이 증가한 백혈구의 수가 많아지게 되고, 상기 백혈구 혈관외유출과 관련된 인자의 발현량이 증가하게 되면, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구는, 정상 상태의 백혈구 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 더 많이 결합 또는 더 강하게 결합할 수 있는 상태가 되며, 이러한 백혈구의 특성을 이용하여 채널, 입자, 용기 또는 웰에 고정화된 백혈구 혈관외유출 인자와 개체로부터 분리된 백혈구를 접촉시킴으로써, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구를 검출할 수 있음을 의미한다.
실험예 2: 질환 상태의 백혈구의 발현 인자의 확인
질환 상태의 백혈구에서 백혈구 혈관외유출 인자와 상호작용하는 단백질의 발현이 실제로 증가되어 있는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1과 동일하게 패혈증 유발된 랫트와 정상 랫트에서 백혈구를 분리하고, 그를 형광 염색 하였다. 상기 분리된 백혈구의 PSGL-1의 평균 발현량을 단일 세포 수준에서 형광 강도의 측정을 통해 비교하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 패혈증 유발된 랫트의 백혈구에서 정상 랫트의 백혈구 대비 PSGL-1의 발현량이 약 2배 정도 증가한 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구는 백혈구 혈관외유출 인자와 상호작용하는 인자의 발현량이 증가하게 되고, 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 이용하여 패혈증 등 백혈구의 표면 관련 인자 발현량을 증가시키는 질환을 진단할 수 있음을 의미한다.
실험예 3: 백혈구 혈관외유출 인자를 이용한 패혈증의 조기 검출
백혈구 혈관외유출 인자를 이용하여 패혈증을 조기에 진단할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로, 박테리아 접종 후 시간의 경과에 따른 (채널에 부착된 백혈구수)/(샘플 총백혈구수)%를 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 박테리아 접종 후 약 1시간만 지나도 패혈증군과 대조군의 수치가 유의미하게 차이가 나는 것을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 이용하여 패혈증을 매우 적은 시료로도 조기에 검출할 수 있음을 의미한다.
실험예 4: 백혈구 혈관외유출 인자를 이용한 다양한 감염원으로 유발된 감염성 질환 또는 염증 진단
백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 다양한 감염원으로 유발된 감염성 질환 또는 염증을 진단할 수 있는지 확인하였다.
먼저, 8주령의 위스타 랫트 수컷(Wistar rat)에 1mL 생리식염수(샴 대조군), E. coli K12(약 108 CFU/1 mL 생리식염수), 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS; 약 5 mg/kg), 메티실린-저항성 스태필로코커스 아레우스(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA; 약 108 CFU/1 mL 생리식염수)를 각각의 랫트에 복강주입하고 약 4시간 동안 랫트를 사육하여 다양한 패혈증 유발 물질 및 박테리아에 의해 유발된 감염성 질환 또는 염증 상태의 랫트를 준비하였다.
상기 실시예 1과 동일하게 랫트 ICAM-1, 랫트 P-셀렉틴, 및 랫트 E-셀렉틴(각각 약 5 μg/ml 농도의 용액 이용) 등이 고정화된 미세 유체 채널을 포함하는 미체 유체 칩을 준비하고, 실험예 1과 동일한 방법으로, 상기 랫트로부터 분리된 백혈구를 상기 미세 유체 채널에 주입한 후, (채널에 부착된 백혈구수)/(샘플 총 백혈구수)%를 측정하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 샴 대조군 및 다양한 원인에 의해 유래된 패혈증 상태의 백혈구 및 염증 상태의 백혈구를 이용한 결과, 샴 대조군(생리식염수만을 복강주입한 랫트)과 대조군(정상 랫트)의 백혈구를 주입한 채널에서는, 각 채널에 부착된 백혈구 수의 비율에서 차이가 없었지만, E. coli, MRSA, LPS 등의 다양한 감염원으로 유발된 감염성 질환 또는 염증을 가지는 실험군의 백혈구를 주입한 채널에서는 채널에 부착된 백혈구 수가 현저하게 증가된 것을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 이용하여 다양한 감염성 질환, 또는 염증 상태의 백혈구를 검출함으로써, 해당 질환에 대한 진단이 가능함을 의미한다.
실험예 5: 백혈구 혈관외유출 인자를 이용한 암의 조기 진단
백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 암을 조기 진단 할 수 있는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 실시하였다.
먼저, 4T1 암세포(유방암세포)를 약 10% fetal bovine serum(FBS)와 약 1% 항생제가 들어있는 RPMI 1640 배지에서 약 37°C 및 약 5% CO2 조건의 인큐베이터에서 배양하였다. 배지는 약 2 내지 3일에 한 번씩 교체되었고, 세포가 플라스크에서 약 80% 정도 찼을 때 약 0.25% 트립신/EDTA 용액을 이용하여 계대배양하였다.
그 후, 8주령 암컷 BALB/C 마우스의 유방 지방 패드(mammary fat pad)부분에 상기 배양된 4T1 암세포를 약 3X106 cells/0.1 mL 1XPBS(pH 7.4)의 농도로 주입하였다. 주입한 후 1주간 케이지 내에서 사육하였다.
상기 실시예 1과 동일하게, 마우스 ICAM-1, 마우스 P-셀렉틴, 및 마우스 E-셀렉틴(각각 약 5 μg/ml 농도의 용액 이용) 등이 고정화된 미세 유체 채널을 포함하는 미체 유체 칩을 준비하고, 준비된 암이 유발된 마우스 또는 암을 유발시키지 않은 마우스의 혈액 약 50 μL를 채취하여 ACK lysis 버퍼와 약 1:20의 비율로 혼합하고 상온에서 약 5분 동안 반응시킨 후, 원심분리를 이용하여 백혈구를 분리하였다. 분리된 백혈구를 1XPBS로 세척한 후, 약 100 μL 1XPBS에 희석하여 백혈구를 포함하는 생물학적 시료를 제조하였다. 상기 마우스로부터 분리된 백혈구를 포함하는 시료를 상기 미세 유체 채널에 주입한 후, 상기 채널에 포획된 세포에 대하여 형광 염색 이미지 촬영을 수행한 후, (채널에 부착된 백혈구수)/(샘플 총 백혈구수)%를 측정하였으며, 그 결과를 각각 도 8 및 도 9에 나타내었다.
도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, 암 유발된 마우스의 백혈구를 채널에 주입한 경우, 대조군 마우스의 백혈구를 채널에 주입한 경우보다 백혈구가 유의하게 더 많이 채널에 부착되어 검출된 것을 알 수 있었고, 암에 걸린 개체를 암 발생 약 1주 만에도 조기에 진단 가능함을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구는 백혈구 혈관외유출 인자와 상호작용하는 인자의 발현량이 증가하거나 정상 상태의 백혈구 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자의 발현량이 증가된 백혈구의 수가 증가하게 되고, 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 이용하여 암 등 백혈구의 표면 관련 인자 발현량을 증가시키는 질환을 진단할 수 있음을 의미한다. 특히, 이러한 결과는, 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 이용하여 암을 매우 적은 시료로도 조기에 진단할 수 있음을 의미한다.
실험예 6: 백혈구 혈관외유출 인자를 이용한 암의 진단
백혈구 혈관외유출 인자를 사용하여 암을 진단 할 수 있는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 실시하였다.
먼저, 상기 실험예 5와 동일한 방법으로 4T1 암세포를 배양하였다.
그 후, 8주령 암컷 BALB/C 마우스의 유방 지방 패드(mammary fat pad)부분에 상기 배양된 4T1 암세포를 약 3X106 cells/0.1 mL 1XPBS(pH 7.4)의 농도로 주입하였다. 주입한 후, 암 진행 기간(총 4주)에 따라 약 1주일 간격으로 총 4그룹(1주, 2주, 3주, 4주)으로 세분화하였다. 또한, 아무것도 주입하지 않은 건강한 마우스 모델을 종양 모델과 같이 4 그룹으로 세분화하여 대조군으로서 사용되었다. 약 0.1 mL 1XPBS(pH 7.4)를 마우스의 유방 지방 패드(mammary fat pad)부분에 주입한 샴 대조군 역시 종양 모델과 같이 4 그룹으로 세분화하여 사용되었다. 또한 종양 모델이 잘 제작되었는지 확인하기 위해, 4T1 암세포 주입 후 4주까지 약 1주 간격으로 마우스 종양 모델의 종양 크기와 무게를 측정하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 구체적으로, 마우스 종양 모델에서 종양을 외과적으로 분리한 후 종양 지름(cm)을 측정하였고(종양의 가장 큰 부분에 걸쳐서 서로 수직 방향으로 지름을 두 번 이상 측정하였음.), 종양 지름 측정 후 전자 저울을 통해 무게(mg)를 측정하였다. 종양의 평균 지름은 다음 공식을 통해 계산되었다:
Formula = √(d1×d2) (d1 및 d2는 종양의 가장 긴 지름으로서, 서로 수직 방향인 지름 각각을 의미함.).
도 10에 나타낸 바와 같이, 4T1 암세포 주입 후 1주차부터 4주차까지 종양 크기와 무게가 모두 현저히 증가하였음을 확인하였다. 따라서, 마우스 종양 모델에서 암이 성공적으로 형성되었음을 확인하였다.
상기 실시예 1과 동일하게, 마우스 ICAM-1, 마우스 P-셀렉틴, 및 마우스 E-셀렉틴(각각 약 5 μg/ml 농도의 용액 이용) 등이 고정화된 미세 유체 채널을 포함하는 미세 유체 칩을 준비하였다. 상기 마우스로부터 백혈구를 분리하고 분리된 백혈구를 1XPBS로 세척한 후, 그 중 일부를 따로 분리하여 Hoechst로 염색하여 Hemocytometer와 형광현미경을 이용하여 백혈구의 수를 센 후, 나머지 백혈구를 1XPBS를 이용하여 최종 농도(약 106 cells/ml)로 희석하여 백혈구를 포함하는 생물학적 시료를 제조하였다. 상기 생물학적 시료를 상기 미세 유체 채널에 약 8 μL/min의 유속으로 약 10분 동안 주입하여, 약 8만 개의 백혈구가 각각의 채널 내로 주입되도록 하였다. 상기 백혈구를 포함하는 생물학적 시료를 채널에 주입하여 흘려준 후, 채널에 부착되지 않은 백혈구를 제거하기 위하여, 1XPBS를 채널 내로 약 8 μl/min의 유속으로 주입하여 약 4분 동안 세척하고, 이를 약 2번 더 반복하였다. 그 후 상기 미세 유체 채널에 부착 또는 포획되어 있는 백혈구를 염색하기 위해 Hoechst와 Cell tracker 등의 염색약으로 채널 내부를 채우고 약 20분 동안 상온에서 배양한 후, 1XPBS를 채널 내로 약 8 μl/min의 유속으로 주입하여 약 4분 동안 세척하였다. 그 후, 각 채널 내부를 형광 현미경으로 촬영하였고, 백혈구가 부착된 각 채널의 내부 이미지를 캡처하고 채널에 포획된 총 백혈구 수를 집계하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, 암 유발된 마우스의 백혈구를 채널에 주입한 경우, 대조군 마우스나 샴 대조군 마우스의 백혈구를 채널에 주입한 경우보다 백혈구가 유의하게 더 많이 채널에 부착되어 검출된 것을 알 수 있었다. 구체적으로, 4T1 암세포 주입 후 1주차부터 4주차까지 모든 그룹의 마우스 종양 모델의 경우, 종양을 유발하지 않은 마우스 모델과 비교하여 채널에 부착된 백혈구 수가 현저히 증가하였음을 확인하였다. 특히, 마우스에 4T1 암세포를 주입한 후 4주 동안 기간의 경과에 따라 점차적으로 종양의 크기가 커졌으며(도 10 참고), 암 유발 마우스의 종양의 크기가 커질수록 암 유발 마우스로부터 분리된 백혈구 중 채널에 부착되어 검출된 백혈구의 양도 함께 증가함을 확인하였다.
이러한 결과는, 질환 상태의 백혈구 또는 비정상 상태의 백혈구는 백혈구 혈관외유출 인자와 상호작용하는 인자의 발현량이 증가하거나 정상 상태의 백혈구 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자의 발현량이 증가된 백혈구의 수가 증가하게 되고, 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 이용하여 암 등 백혈구의 표면 관련 인자 발현량을 증가시키는 질환을 효과적으로 진단할 수 있음을 의미한다. 또한, 이러한 결과는, 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 이용하여 암 등 백혈구의 표면 관련 인자 발현량을 증가시키는 질환을 가지는 개체의 암 등 질환의 진행 경과를 정량적으로 평가하거나, 암 등 질환의 진행 상태를 진단할 수 있음을 의미한다.
실험예 7: 검출된 백혈구 중 호중구의 비율 확인
일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자를 이용하여 검출된 백혈구 중 호중구의 비율을 분석하였다.
구체적으로, 실험예 6의 마우스 종양 모델(실험군)과 종양을 유발하지 않은 마우스 모델(대조군, 샴 대조군)로부터 분리된 백혈구를 실험예 6에서와 같이 제작한 미세 유체 채널에 주입한 후, 각 채널 내부에 포획된 백혈구를 대상으로 분석하였다. 더욱 구체적으로, 백혈구가 포획된 각 미세 유체 채널을 약 4% 파라포름알데히드 용액으로 상온에서 약 10분 동안 반응시켜 채널 내 포획된 백혈구를 고정하였다. 고정 후 1XPBS로 채널을 세척하였고, 시약 침투성을 높이기 위해 약 10분 동안 약 0.5% Triton-X 용액을 채널에 주입한 후 1XPBS로 세척하였다. 그 후, 비 특이적 결합 차단을 위해 약 3% BSA를 주입하고 약 1시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다음으로, 호중구를 식별하기 위해 호중구의 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase)를 표적하는 FITC 형광이 부착된 항체를 채널 내로 주입하였다. 또한, 채널 내에 포획된 모든 백혈구들을 시각화하기 위해 Hoechst 시약으로 채널 내 세포를 약 4℃에서 약 24시간 동안 염색하였다. 1XPBS로 채널을 세척한 후 형광 현미경을 통해 각 채널 내 포획된 총 백혈구 수와 호중구 수를 집계하여 포획된 백혈구 내에서 호중구의 비율을 계산하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 실험군과 대조군, 샴 대조군의 마우스 모델 모두 모든 그룹에서, 백혈구 혈관외유출 인자로 코팅된 미세 유체 채널에 포획된 백혈구 중 호중구가 가장 높은 비율로 존재함을 확인하였다.
이러한 결과는, 일 구체예에 따른 백혈구 혈관외유출 인자와 상호작용하는 백혈구 중 대다수가 호중구임을 의미할 수 있다.
실험예 8: Bright field에서의 백혈구 검출 및 분석
형광이미지뿐 아니라 Bright field(BF)에서 포획된 백혈구 계수가 가능하다면 일반 카메라 등으로도 분석을 할 수 있어 현장진료검사(Point-of-Care)에 본 발명이 더욱 유용하게 사용될 수 있으므로, 본 실험예에서는 BF를 통한 백혈구의 검출 및 분석을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 1과 동일한 방법으로, 박테리아 접종 약 12시간 후 랫트 혈액을 채취하여 백혈구를 분리하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 제조된, 랫트 ICAM-1, 랫트 P-셀렉틴, 및 랫트 E-셀렉틴(각각 약 5 μg/ml 농도의 용액 이용) 등이 고정화된 미세 유체 채널을 포함하는 미세 유체 칩에 상기 분리된 백혈구를 주입하였다. 그 후, 실험예 1과 동일한 방법으로 각 채널에 포획된 세포를 CellTracker를 이용해 염색한 것을 각각 형광현미경으로 이미징한 것과 현미경에서 BF 모드로 이미징한 것의 (채널에 부착된 백혈구수)/(샘플 총 백혈구수)%를 측정하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 형광 이미지를 통한 분석과 BF에서 분석한 결과의 차이가 통계학적으로 차이가 없음을 알 수 있었고, BF 상에서 이미지한 것으로도 세포 수를 형광이미지처럼 계수할 수 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 일 구체예에 따른 방법 및 장치가 값 비싸고 휴대가 어려운 장비 없이도 질환 혹은 면역 상태 등의 현장 진단을 가능 함을 알 수 있다.
Claims (28)
- 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 백혈구 혈관외유출 인자(leukocyte extravasation factor)와 접촉시켜, 상기 시료 내의 질환 상태의 백혈구가 백혈구 혈관외유출 인자에 포획되어 상기 포획된 백혈구를 검출하는 단계를 포함하는 질환 상태의 백혈구를 검출하는 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 채널의 벽면, 입자의 표면, 용기의 적어도 일부분 또는 웰의 적어도 일부분에 고정화된 것인 방법.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 방법은 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 내의 단위 시료 부피당 총 백혈구의 수를 계수하거나, 상기 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 내의 백혈구를 분리하고 이를 계수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 3에 있어서, 상기 검출하는 단계는 상기 계수된 단위 시료 부피당 총 백혈구 수 대비 상기 혈관외유출 인자에 의해 포획된 백혈구 수의 비율을 분석하거나, 상기 분리된 백혈구 수 중 상기 혈관외유출 인자에 의해 포획된 백혈구의 수를 분석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 셀렉틴(selectins), CD34, ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule-1), 가용성 ICAM-1, ICAM-2, 가용성 ICAM-2, GlyCAM-1(Glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1), MadCAM-1(mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1), PECAM-1(platelet/endothelial-cell-adhesion molecule), JAM-A(junctional adhesion molecule A), JAM-B, JAM-C, ESAM(endothelial cell-selective adhesion molecule), VCAM-1(vascular cell-adhesion molecule 1), CD99(cluster of differentiation 99), 인테그린, 이들의 세포외 도메인, 이들을 포함하는 세포, 이들을 포함하는 세포의 멤브래인(membrane), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 인자인 것인 방법.
- 청구항 5에 있어서, 상기 셀렉틴은 P-셀렉틴(P-selectin), E-셀렉틴(E-selectin), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
- 청구항 2에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 고정화 화합물 또는 링커를 통해 상기 채널, 입자, 용기 또는 웰에 고정화된 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 질환 상태의 백혈구 또는 백혈구 세포 집단은 정상 상태의 백혈구 또는 백혈구 세포 집단 대비 백혈구 혈관외유출 인자와의 결합능이 증가 또는 감소된 것인 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 질환 상태의 백혈구는 정상 상태의 백혈구 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자의 발현 또는 활성이 증가 또는 감소되었거나, 상기 질환 상태의 백혈구 세포 집단은 정상 상태의 백혈구 세포 집단 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자의 발현 또는 활성이 증가 또는 감소된 것인 방법.
- 청구항 9에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자는 시알화된 탄수화물(sialylated carbohydrates), L-셀렉틴(L-selectin), PSGL-1(P-selectin glycoprotein ligand 1), LFA-1(Leukocyte function-associated antigen 1), Mac-1(Integrin alpha M; Macrophage-1 antigen), VLA-4, CD24, CD44 및 ESL-1(E-selectin ligand 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 질환 상태는 염증, 감염성 질환, 면역 질환, 암 또는 암 전이인 것인 방법.
- 청구항 11에 있어서, 상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 곰팡이 또는 진균의 전신성 또는 국부성 감염, 패혈증, 균혈증, 또는 바이러스 혈증인 것인 방법.
- 청구항 1에 있어서, 상기 검출은 포획된 백혈구를 이미징하여 검출하거나, 형광 염색하여 검출하거나, 포획된 백혈구를 용해시켜 분리된 백혈구 용해물(lysate)을 측정하거나, 또는 상기 백혈구 또는 백혈구 혈관외유출 인자에 검출 가능한 표지가 부착되어 검출하는 것인 방법.
- 백혈구를 포함하는 분리된 생물학적 시료 또는 상기 생물학적 시료로부터 분리된 백혈구를 백혈구 혈관외유출 인자와 접촉시켜, 상기 시료 내의 질환 상태의 백혈구가 백혈구 혈관외유출 인자에 포획되어 상기 포획된 백혈구를 검출하는 단계를 포함하는 질환 상태의 백혈구 관련 질환의 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 채널의 벽면, 입자의 표면, 용기의 적어도 일부분 또는 웰의 적어도 일부분에 고정화된 것인 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 셀렉틴(selectins), CD34, ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule-1), 가용성 ICAM-1, ICAM-2, 가용성 ICAM-2, GlyCAM-1(Glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1), MadCAM-1(mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1), PECAM-1(platelet/endothelial-cell-adhesion molecule), JAM-A(junctional adhesion molecule A), JAM-B, JAM-C, ESAM(endothelial cell-selective adhesion molecule), VCAM-1(vascular cell-adhesion molecule 1), CD99(cluster of differentiation 99), 인테그린, 이들의 세포외 도메인, 이들을 포함하는 세포, 이들을 포함하는 세포의 멤브래인(membrane), 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 인자인 것인 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 셀렉틴은 P-셀렉틴(P-selectin), E-셀렉틴(E-selectin), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
- 청구항 14에 있어서, 상기 백혈구 관련 질환은 염증, 감염성 질환, 면역 질환, 암 또는 암 전이인 것인 방법.
- 청구항 18에 있어서, 상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 곰팡이 또는 진균의 전신성 또는 국부성 감염, 패혈증, 균혈증 또는 바이러스 혈증인 것인 방법.
- 채널의 벽면, 입자의 표면, 용기의 적어도 일부분 또는 웰의 적어도 일부분에 백혈구 혈관외유출 인자(leukocyte extravasation factor)가 고정화된 채널, 입자, 용기 또는 웰을 포함하는 질환 상태의 백혈구 검출부를 포함하고,
상기 백혈구 혈관외유출 인자에 의해 분리된 생물학적 시료 내의 질환 상태의 백혈구가 포획되고 검출되는 것인, 질환 상태의 백혈구를 검출하거나, 백혈구 관련 질환을 진단하는 장치. - 청구항 20에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자는 셀렉틴(selectins), CD34, ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule-1), 가용성 ICAM-1, ICAM-2, 가용성 ICAM-2, GlyCAM-1(Glycosylation-dependent cell adhesion molecule-1), MadCAM-1(mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1), PECAM-1(platelet/endothelial-cell-adhesion molecule), JAM-A(junctional adhesion molecule A), JAM-B, JAM-C, ESAM(endothelial cell-selective adhesion molecule), VCAM-1(vascular cell-adhesion molecule 1), CD99(cluster of differentiation 99), 인테그린, 이들 중에서 1종 이상을 포함하는 세포 및 세포의 멤브레인(membrane), 이들의 세포외 도메인 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 인자인 것인 장치.
- 청구항 21에 있어서, 상기 셀렉틴은 P-셀렉틴(P-selectin), E-셀렉틴(E-selectin), 또는 이들의 조합인 것인 장치.
- 청구항 20에 있어서, 상기 질환 상태의 백혈구 또는 백혈구 세포 집단은 정상 상태의 백혈구 또는 백혈구 세포 집단 대비 백혈구 혈관외유출 인자와의 결합능이 증가 또는 감소된 것인 장치.
- 청구항 23에 있어서, 상기 질환 상태의 백혈구는 정상 상태의 백혈구 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자의 발현 또는 활성이 증가 또는 감소되었거나, 상기 질환 상태의 백혈구 세포 집단은 정상 상태의 백혈구 세포 집단 대비 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자의 발현 또는 활성이 증가 또는 감소된 것인 장치.
- 청구항 24에 있어서, 상기 백혈구 혈관외유출 인자와 결합할 수 있는 인자는 시알화된 탄수화물(sialylated carbohydrates), L-셀렉틴(L-selectin), PSGL-1(P-selectin glycoprotein ligand 1), LFA-1(Lymphocyte function-associated antigen 1), Mac-1(Integrin alpha M; Macrophage-1 antigen), VLA-4, CD24, CD44 및 ESL-1(E-selectin ligand 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인 장치.
- 청구항 20에 있어서, 상기 질환 상태 또는 백혈구 관련 질환은 염증, 감염성 질환, 면역 질환, 대사 질환, 암 또는 암 전이인 것인 장치.
- 청구항 26에 있어서, 상기 감염성 질환은 바이러스, 세균, 곰팡이 또는 진균의 전신성 또는 국부성 감염, 패혈증, 균혈증, 또는 바이러스 혈증인 것인 장치.
- 청구항 20에 있어서, 상기 검출은 포획된 백혈구를 이미징하여 검출하거나, 형광 염색하여 검출하거나, 포획된 백혈구를 용해시켜 분리된 백혈구 용해물(lysate)을 측정하거나, 또는 상기 백혈구 또는 백혈구 혈관외유출 인자에 검출 가능한 표지가 부착되어 검출하는 것인 장치.
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