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KR102524543B1 - 폼페병의 치료에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

폼페병의 치료에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드 Download PDF

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KR102524543B1
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에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담
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Abstract

본 발명은 폼페병 치료에 사용될 수 있는 안티센스 올리고머 화합물 및 GAA 유전자의 스플라이싱을 조절하는 방법 및 폼페병 치료 방법에 관한 것이다. 또한 상기 안티센스 올리고머 화합물을 포함하는 약학 조성물이 본 발명의 일부이다.

Description

폼페병의 치료에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드{Antisense oligonucleotides useful in treatment of Pompe Disease}
본 발명은 폼페병의 치료에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 GAA 유전자의 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절하고 폼페병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
산 말타아제 결핍증 또는 글리코겐 저장 질병 타입 II라고도 알려진 폼페병(Pompe Disease)은 신체의 근육과 신경 세포를 손상시키는 상염색체 열성 대사 장애이다. 이 질병은 리소좀 산 알파-글루코시다제 효소의 결핍으로 인하여 리소좀에서 글리코겐이 축적되어 야기된다. 글리코겐의 축적은 신체 전체에서 점진적인 근육 약화(근육병)를 야기하고 다양한 신체 조직, 특히, 심장, 골격근, 간 및 신경계에 영향을 미친다.
폼페병에서는, 리소좀 하이드롤라제인 산 말타아제로도 알려진 단백질인 산 알파-글루코시다제(EC 3.2.1.20)가 결함을 갖는다. 이 단백질은 정상적으로는 글리코겐, 말토스 및 이소말토스의 알파-1,4 및 알파-1,6 결합을 분해시키며 세포 글리코겐의 1-3%의 분해에 필요하다. 이 효소의 결핍은 병에 걸린 개체에서 리소좀과 세포질에서 구조적으로 정상인 글리코겐의 축적을 야기한다. 리소좀 내의 과다한 글리코겐 저장은 다른 기관의 정상적 기능을 방해하고 세포 손상을 야기할 수 있다. 결함이 있는 상기 단백질은 17q25.2-q25.3 (염기쌍 75,689,876 내지 75,708,272)에서 염색체 17의 롱암(long arm) 상의 GAA 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기되는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)의 결과이다. 상기 유전자는 대략 20 kb에 걸치며 20개의 엑손을 함유하며 첫번째 엑손이 비코딩이다.
460가지가 넘는 돌연변이가 알려졌지만 (http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html), 단지 몇 가지의 스플라이싱 돌연변이가 규명되었다. GAA 효소 활성을 완전히 제거하는 심각한 돌연변이는 비후성 심근증, 일반적 골격근 약화 및 호흡 부전을 갖는 전통적 유아 질병 과정을 야기하며 1.5년의 수명 이내에 사망을 야기한다. 온건한 돌연변이는 부분적인 GAA 효소 활성을 남기며 아동기 내지 성인기에 개시되는 온건한 표현형을 야기한다. 일반적으로, 일차 섬유아세포에서의 더 높은 잔여 효소 활성은 폼페병의 더 늦은 개시와 관련된다. 효소 대체 요법(ERT)이 폼페병을 위해 개발되었으며, 여기서는 재조합 인간 GAA 단백질이 2주 마다 정맥내로 투여된다. 이 치료법은 전통적 유아 환자의 생명을 구할 수 있으며 늦게 개시된 환자의 질병 진행을 지연시킬 수 있으나, 그 효과는 이질적이다. 전환(T에서 G로) 돌연변이인 IVS1 돌연변이, c.-32-13T>G는 이 질병을 가진 아동,청소년 및 성인에서 가장 일반적이다. 이 돌연변이는 RNA 스플라이싱 부위를 방해한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드(안티센스 올리고머 화합물)은 현재 그들이 스플라이싱을 조절하는 능력에 대해 임상 시험 중이다. 전통적인 예는 듀켄씨근이양증이다. 이 질병에서는, 돌연변이 핫스팟이 소정의 엑손에 존재한다. 안티센스 올리고머 화합물을 이용하여, 돌연변이된 엑손이 건너뛰어지며 돌연변이가 우회된다. 그 결과 여전히 부분적으로 기능성인 약간 더 짧은 단백질이 생성된다. 안티센스 올리고머 화합물이 관련 스플라이스 부위로 타겟팅되어야 함이 명백하므로, 안티센스 올리고머 화합물을 이용하여 엑손 스키핑(exon skipping)을 유도하는 것은 간단하다. 또한 수포성표피박리증에서(WO2013053819) 그리고 레버씨 선천성흑내장(Leber congenital amaurosis symptoms)에서(WO2012168435), 안티센스 올리고뉴클레오티드가 엑손 스키핑을 위해 사용된다.
폼페병에서의 IVS1 돌연변이의 경우, 그러한 전략이 작용하지 않는다. IVS 돌연변이는 엑손 2의 스키핑을 야기하여 정규적 번역 개시 측의 결실을 야기하고 넌센스 매개 쇠퇴(non-sense mediated decay)를 야기하며 따라서 단백질이 전사되지 않는다. 안티센스 치료법이 폼페병에서 IVS1 돌연변이를 위해 작동하기 위해서는, 엑손 포함(exon inclusion)을 유도하는 것이 필요하다. 하지만, 엑손 포함을 유도하는 것은 매우 어려우며, 그 이유는 엑손 포함은 신뢰성있게 예측될 수 없는 스플라이싱 억제자 서열의 타겟팅에 의존하기 때문이다. IVS1 돌연변이의 경우, 스플라이싱 억제자 서열을 차단하는 안티센스 올리고머 화합물이 IVS1 돌연변이의 존재하에서 엑손 2 포함을 촉진할 수 있다. 그러한 억제자 서열은 유전자 내의 어디든, 엑손 내(엑손 스플라이싱 사일런서(silencer) 또는 ESS로 불림) 또는 인트론 내(인트론 스플라이싱 사일런서 또는 ISS로 불림)에 존재할 수 있는 것으로 알려져 있으며 돌연변이에 가깝거나 멀거나 또는 영향받은 스플라이스 부위에 가깝거나 멀 수 있다.
인비트로에서 타겟 유전자의 스플라이싱을 조절할 수 있는 많은 안티센스 화합물이 보고되었지만, GAA 유전자의 스플라이싱을 조절할 수 있는 화합물의 확인이 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 엑손 포함을 유도할 수 있는 안티센스 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 엑손 스플라이싱 사일런서(ESS) 또는 인트론 스플라이싱 사일런서(ISS)를 타겟팅할 수 있는 안티센스 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 IVS-1 돌연변이를 타겟팅할 수 있는 안티센스 화합물을 제공하는 것이다. 본 발명은 상기 목적 중 하나 이상을 충족한다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 1을 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
그 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2-33 및 그의 적어도 80% 동일성을 갖는 서열들을 포함하는 군으로부터 선택되는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
그 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1, 37-40 및 그의 적어도 80% 동일성을 갖는 서열들을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 상보성인 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
그 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 c-32-156_-210를 포함하는 군으로부터 선택되는 서열을 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
그 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 41-540 및 서열번호 541-1583 및 그의 적어도 80% 동일성을 갖는 서열들을 포함하는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
그 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 하기 돌연변이 위치를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보성인 안티센스 올리고머 화합물 및 그의 적어도 80% 동일성을 갖는 서열에 관한 것이다: c.-32-13T>G, c.-32-3C>G c.-32-102T>C, c.-32-56C>T, c.-32-46G>A, c.-32-28C>A, c.-32-28C>T, c.-32-21G>A, c.7G>A, c.11G>A, c.15_17AAA, c.17C>T, c.19_21AAA, c.26_28AAA, c.33_35AAA, c.39G>A, c.42C>T, c.90C>T, c.112G>A, c.137C>T, c.164C>T, c.348G>A, c.373C>T, c.413T>A, c.469C>T, c.476T>C, c.476T>G, c.478T>G, c.482C>T, c.510C>T, c.515T>A, c.520G>A, c.546+11C>T, c.546+14G>A, c.546+19G>A, c.546+23C>A, c.547-6, c.1071, c.1254, c.1552-30, c.1256A>T, c.1551+1G>T, c.546G>T, .17C>T, c.469C>T, c.546+23C>A, c.-32-102T>C, c.-32-56C>T, c.11G>A, c.112G>A, c.137C>T.
그 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 폼페병 치료에 매우 유용한 본 발명에 따른 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 변형되며, 바람직하게는 올리고머 화합물은 균일하게 변형된다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 당이 변형되며, 바람직하게는 당 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-O-메톡시에틸이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 하나 이상의 뉴클레오티드의 염기는 변형된다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 올리고머 화합물의 백본은 변형되며, 바람직하게는 안티센스 올리고머 화합물은 모르폴리노 포스포로티오에이트, 또는 모르폴리노 포스포로디아미데이트이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 12 또는 서열번호 33이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 c.-32-3C>G, c.17C>T c.469C>T c.546+23C>A, c.-32-102T>C c.-32-56C>T c.11G>A c.112G>A, 및 c.137C>T를 포함하는 군으로부터 선택되는 돌연변이 위치를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA의 게놈 핵산 서열에 상보성이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 1, 37-40로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 상보성이다.
그 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 안티센스 올리고머 화합물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포에서 GAA 프리(pre)-mRNA의 스플라이싱을 조절하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 안티센스 올리고머 화합물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 폼페병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 안티센스 올리고머 화합물의 투여 단계를 포함하는, 세포에서 GAA의 기능을 복구하는 방법에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 세포, 바람직하게는 근육세포에서, 비정상적인 유전자 발현을 교정하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 발명에 따른 안티센스 올리고머 화합물을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 세포 또는 환자는 c.-32-13T>G, c.-32-3C>G, c.547-6, c.1071, c.1254, 및 c.1552-30 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 바람직하게는 세포 또는 환자는 돌연변이 c.-32-3C>G 또는 c.-32-13T>G를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 엑손 포함이 이루어지며, 바람직하게는 엑손 2의 포함이 이루어진다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기의 돌연변이 위치를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 결합할 수 있는 화합물에 관한 것이다: c.-32-13T>G, c.-32-3C>G c.-32-102T>C, c.-32-56C>T, c.-32-46G>A, c.-32-28C>A, c.-32-28C>T, c.-32-21G>A, c.7G>A, c.11G>A, c.15_17AAA, c.17C>T, c.19_21AAA, c.26_28AAA, c.33_35AAA, c.39G>A, c.42C>T, c.90C>T, c.112G>A, c.137C>T, c.164C>T, c.348G>A, c.373C>T, c.413T>A, c.469C>T, c.476T>C, c.476T>G, c.478T>G, c.482C>T, c.510C>T, c.515T>A, c.520G>A, c.546+11C>T, c.546+14G>A, c.546+19G>A, c.546+23C>A, c.547-6, c.1071, c.1254, c.1552-30, c.1256A>T, c.1551+1G>T, c.546G>T, .17C>T, c.469C>T, c.546+23C>A, c.-32-102T>C, c.-32-56C>T, c.11G>A, c.112G>A, c.137C>T.
다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1, 37-40로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열에 결합할 수 있는 화합물에 관한 것이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 안티센스 올리고머 화합물 또는 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서 상기 약학 조성물은 추가로 약학적 허용 부형제 및/또는 세포 전달제를 포함한다.
도 1. 스플라이스 부위 돌연변이의 포괄적 분석을 위한 작업흐름. 스플라이스 부위 용법의 변화는 인접 엑손(flanking exons)에 어닐링하는 프라이머를 이용한 PCR(인접 엑손 PCR) 및 이어서 시퀀싱(좌측 파트)에 의해 검출된다. 비정상 스플라이스 생성물은 각 엑손 내에서 어닐링하는 프라이머를 이용하여 정량한다(엑손-내부 qPCR; 우측 파트)
도 2. 건강한 대조군 및 공통의 IVS1 스플라이스 부위 돌연변이를 보유한 폼페 환자의 스플라이싱 분석. A) 건강한 대조군의 인접 엑손 PCR 분석. 엑손 번호는 레인 위에 표시된다. PCR 생성물은 아가로즈 젤에서의 전기영동에 의해 분리하였다. B) A)와 같지만, IVS1 돌연변이를 보유한 폼페 환자 1에 대한 것이다. 밴드 옆의 번호는 추가로 상세히 분석된 생성물을 나타낸다(이하 참조). C) 환자 1에 대해 검출된 주요 스플라이싱 변이체의 그림. 상부 그림은 게놈 DNA를 나타내며, 돌연변이가 표시된다. 하부 그림은 본 연구에서 검출된 스플라이싱 변이체를 나타낸다. 번역 개시 부위는 c.1로 표시된다. 엑손은 상자로 나타낸다. 비-코딩 엑손은 갈색이고, 코딩 엑손은 녹색이다. 인트론은 선으로 나타낸다. 점선은 인트론이 이 그림에서 보다 더 길다는 것을 나타내기 위해 사용된다. 선택적 스플라이스 부위가 표시된다. D) 엑손-내부 qPCR 분석. 정규화를 위해 베타-액틴을 이용하였다. 건강한 대조군으로부터 얻은 값을 100%로 설정하였다. 에러바는 SD (n=3)를 나타낸다.
도 3. 이형접합성 돌연변이/결실을 보유한 폼페 환자 3 및 4의 스플라이싱 분석. A) 환자 3의 인접 엑손 PCR 분석. B) 환자 3에 대해 검출된 주요 스플라이싱 변이체의 그림. C) 환자 4의 인접 엑손 PCR 분석. D) 대립유전자 1로부터 환자 4에서 검출된 주요 스플라이싱 변이체의 그림. E) D)와 같지만, 환자 4, 대립유전자 2에 대한 것임. F) 환자 3 및 4의 엑손-내부 qPCR 분석. 에러바는 SD (n=3)를 나타낸다.
도 4. 동형접합성 돌연변이를 보유한 폼페 환자의 스플라이싱 분석. A) 환자 5의 인접 엑손 PCR 분석. B) 환자 5에 대해 검출된 스플라이싱 변이체의 그림. C) 환자 6의 인접 엑손 PCR 분석. D) 환자 6에 대해 검출된 스플라이싱 변이체의 그림. E) 환자 7의 인접 엑손 PCR 분석. F) 환자 7에 대해 검출된 스플라이싱 변이체의 그림. G) 환자 5, 6 및 7의 엑손-내부 qPCR 분석. 에러바는 SD (n=3)를 나타낸다.
도 5. 폼페 환자 8에서의 복잡한 스플라이싱 변화의 분석. A) 인접 엑손 PCR 분석. B) 엑손 8의 분석으로부터 검출된, 대립유전자 1로부터의 스플라이싱 변이체의 그림. C) 엑손 9의 분석으로부터 검출된, 대립유전자 1로부터의 스플라이싱 변이체의 그림. D) 엑손 10의 분석으로부터 검출된, 대립유전자 2로부터의 스플라이싱 변이체의 그림. E) 엑손-내부 qPCR 분석. 에러바는 SD (n=3)를 나타낸다.
도 6: 표 1. 본 연구에서 사용된 폼페 환자의 실험실 진단.
도 7: 표 2. 연구된 돌연변이에서 야기된 스플라이싱 사건의 요약. 환자 1-3 (청색)은 이전에 규명되었으며 분석의 검증을 위해 사용되었다. 환자 4-8(적색)은 본 연구에서 조사되었으며 모든 환자는 새로운 스플라이싱 사건을 밝혔다.
도 8. 환자 2의 스플라이싱 분석. A) 인접 엑손 PCR 분석. B) 엑손-내부 qPCR 분석.
도 9. 환자 1의 서열 분석.
도 10. 환자 3 (A) 및 4 (B-C)의 서열 분석.
도 11. A) 엑손 5에 어닐링하는 전방 프라이머 및 엑손 8에 어닐링하는 역방 프라이머를 이용한 엑손 7에 대한 환자 5의 인접 엑손 PCR 분석. 비교를 위하여, 엑손 6과 8의 표준 인접 엑손 PCR 반응이 나타난다. 이 환자에서 GAA mRNA 수준은 NMD로 인해 낮음을 참고한다. B). 환자 5의 서열 분석. C) 환자 6의 서열 분석. D) 환자 7의 서열 분석.
도 12. 환자 8의 서열 분석.
도 13. 환자 8에서의 엑손 및 인접 엑손 PCR 분석을 위해 사용된 PCR 프라이머의 위치의 그림. 스플라이싱 돌연변이에 의해 영향을 받는 엑손에 어닐링하는 프라이머 쌍들만이 나타난다.
도 14. 야생형 및 돌연변이 서열에 적용된 다섯 가지 프로그램 (SpliceSiteFinder-like (SSF), MaxEntScan (MES), NNSplice (NNS), GeneSplicer (GS) 및 Human Splicing Finder (HSF))을 이용한 스플라이싱 예측.
도 15: 실시예 1에 사용된 인접 엑손 PCR 프라이머.
도 16: 실시예 1에 사용된 엑손-내부 qPCR 프라이머.
도 17. 안티센스 서열을 가진 새로운 U7 snRNA 벡터를 신속하게 생성하기 위해 오버행 PCR에서 이용되는 변형된 U7 snRNA.
도 18. 변형된 U7 snRNA 렌티바이러스 시스템은 이전에 공지된 바처럼[Liu, S., et al., Inhibition of HIV-1 multiplication by antisense U7 snRNAs and siRNAs targeting cyclophilin A. Nucleic Acids Res, 2004. 32(12): p. 3752-9] CyPA의 스플라이싱을 방해할 수 있다. 상부 도: 사이클로필린 A의 엑손 4(CyPA-E4)의 RT-PCR 분석. - (레인 1): 형질도입되지 않은 HeLa 세포. + (레인 2): Liu et al.의 도 1B에 개시된 U7/E4 안티센스 서열을 발현하는 변형된 U7 snRNA 렌티바이러스로 형질도입된 HeLa 세포(도 17에 개시됨). 하부 도: 베타 액틴 mRNA. M: 분자량 DNA 마커.
도 19. U7 소핵 RNA 시스템을 이용하여 안티센스 서열로 GAA 프리-mRNA의 인트론 1 및 엑손 2 내의 서열에 대해 수행된 스크린의 RT-qPCR을 이용한 RNA 발현 분석. 번호는 표 1에 따른 안티센스 서열 위치를 나타낸다.
도 20. U7 소핵 RNA 시스템을 이용하여 안티센스 서열로 GAA 프리-mRNA의 인트론 1 및 엑손 2 내의 서열에 대해 수행된 스크린의 RT-PCR을 이용한 RNA 발현 분석. 번호는 표 1에 따른 안티센스 서열 위치를 나타낸다. GAA RT-PCR에서, 세 개의 주요 생성물이 관찰된다. 상부 생성물은 엑손 2 포함을 나타내고, 하부 더블릿(doublet)은 엑손 2의 부분적 스키핑(더블릿의 상부 밴드) 및 엑손 2의 완전한 스키핑(더블릿의 하부 밴드)를 나타낸다. 베타-액틴 RT-PCR을 로딩 대조군으로 이용하였다.
도 21. U7 소핵 RNA 시스템을 이용하여 안티센스 서열로 GAA 프리-mRNA의 인트론 1 및 엑손 2 내의 서열에 대해 수행된 스크린의 GAA의 효소 활성. 번호는 표 1에 따른 안티센스 서열 위치를 나타낸다.
도 22. 공평한 인트론 1 및 엑손 2 스크린을 위한 GAA 타겟팅 안티센스 서열의 위치의 예.
도 23. Human Splice Finder 프로그램을 이용한 스플라이스 예측의 예가 인핸서 및 사일런서 모티프 둘다로서 확인된 -178 서열에 대해 양면적 예측이 예상되었음을 입증하였다.
도 24. mRNA 스플라이싱에 영향을 주는 서열을 확인하기 위한 미니유전자 구조체 및 방법. A. 미니유전자를 생성하고 유일한 제한 부위를 추가한다(적색); B. 주형으로 미니유전자를 이용한 축퇴성 PCR을 수행한다; C. 벡터에 PCR 생성물을 연결하고 클론을 생성한다; D. HEK293 세포에서 클론을 형질감염하고 엑손 인접 RT-PCR 및 엑손 내부 qPCR을 통해 엑손 2 포함에 대해 RNA를 ㅂ분석한다; E. 클론의 서열 분석.
도 25. IVS1 미니유전자 스크린에서 확인된 돌연변이의 예. HEK293 세포를 미니유전자 구조체로 형질감염시키고 24시간 후에 스플라이싱을 분석하였다. A. 야생형 미니유전자(WT), IVS1 돌연변이를 함유한 미니유전자(IVS1) 및 편파적이지 않은 미니유전자-기반 스크린에서 확인된 클론 115 및 97의 RT-PCR 분석. 생성물 1: 야생형 mRNA, 생성물 2: 부분 스키핑된 엑손 2 mRNA, 생성물 3: 완전히 스키핑된 mRNA. B. 스플라이스 생성물의 그림. C. RT-qPCR 분석. (별도의 프로모터로부터 동일한 플라스미드 백본으로부터 발현된) 네오마이신의 RT-qPCR 분석에 의해 형질감염 효율에 대해 그리고 베타-액틴 RT-qPCR 분석을 이용하여 세포 수에 대해 값을 정규화하였다.
도 26. 환자 1에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 GAA 엑손 2의 비정상 스플라이싱의 교정.
도 27. 환자 2에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 GAA 엑손 2의 비정상 스플라이싱의 교정.
도 28. 안티센스 올리고머 화합물의 특이성.
도 32: 환자 섬유아세포주 1에 대한 서열번호 33(AON 2)의 효과의 시간 과정.
도 33: GAA 엑손 포함에 대한 게놈 타겟 서열
도 34: N-아세틸갈락토스아민 4-설파타제 (아릴설파타제 B; ARSB)에 대한 건강한 사람의 스플라이싱 분석.
도 35: N-아세틸갈락토사아민 4-설파타제 (아릴설파타제 B; ARSB)에 대한 점액다당류증(Mucopolycaccharidosis) 타입 VI(마로토-라미 증후군(Maroteaux-Lamy syndrome))를 가진 환자의 스플라이싱 분석.
도 36: GAA 엑손 2 포함을 위한 타겟 서열.
도 37: GAA mRNA의 인트론 6의 포함에 대한 넌센스 매개 쇠퇴(NMD) 경로의 억제 결과.
안티센스 기술의 원리는 타겟 핵산에 하이브리드화하는 안티센스 화합물이 전사, 스플라이싱 또는 번역과 같은 유전자 발현 활성을 조절하는 것이다. 이러한 서열 특이성은 안티센스 화합물을 타겟 검증 및 유전자 기능화를 위한 도구로서 그리고 질병에 관련된 유전자의 발현 또는 유전자 생성물을 선택적으로 조절하기 위한 치료제로서 매우 매력적으로 만든다.
일부 진핵 mRNA 전사물이 직접 번역되지만, 다수는 "인트론"으로 알려진 하나 이상의 영역을 함유하며, 인트론은 번역되기 전에 전사물로부터 잘린다. 나머지(그리고 따라서 번역되는) 영역은 "엑손"으로 알려져 있으며 함께 스플라이스되어 연속적인 mRNA 서열을 형성하여, 엑손들이 연결되는 부위에서 엑손-엑손 접합부를 생성한다. 엑손-엑손 접합부의 타겟팅은 정상 스플라이스 생성물의 비정상적 수준이 질병에 관련되거나, 비정상 스플라이스 생성물의 비정상적 수준이 질병에 관련되는 상황에서 유용할 수 있다. 스플라이스 부위, 즉, 인트론-엑손 접합부 또는 엑손-인트론 접합부의 타겟팅은 또한 비정상 스플라이싱이 질병에 관련되거나, 특정 스플라이스 생성물의 과다생산이 질병에 관련되는 상황에서 특히 유용할 수 있다. 재배열 또는 결실로 인한 비정상 융합 접합부 또한 적합한 타겟이다. 상이한 유전자 공급원으로부터의 두 가지(또는 그보다 많은) mRNA의 스플라이싱의 과정을 통해 생성되는 mRNA 전사물은 "융합 전사물"로 알려져 있으며 또한 적합한 타겟이다. 예를 들어, DNA 또는 프리-mRNA에 타겟팅된 안티센스 화합물을 이용하여 인트론이 효과적으로 타겟팅될 수 있음이 알려져 있다. RNase H 기전을 통해 작용하는 올리고뉴클레오티드 화합물과 같은 단일쇄 안티센스 화합물은 프리-mRNA를 타겟팅하는데 효과적이다. 선점-기반(occupancy-based) 기전을 통해 기능하는 안티센스 화합물은, 그들이 예를 들어, mRNA의 RNase H 절단을 유도하지 않고 오히려 mRNA를그대로 남겨두고 원하는 스플라이스 생성물의 생산을 촉진하므로, 스플라이싱을 전용하는데 효과적이다.
DNA의 동일한 게놈 영역으로부터 대안적 RNA 전사물이 생성될 수 있음이 또한 알려져 있다. 이들 대안적 전사물은 일반적으로 "변이체"로 알려져 있다. 보다 구체적으로, "프리-mRNA 변이체"는 동일한 게놈 DNA로부터 생성된 다른 전사물과 그들의 개시 또는 중지 위치가 상이하며 인트론 및 엑손 서열 둘 다를 함유하는, 동일한 게놈 DNA로부터 생성된 전사물이다. 스플라이싱 동안 하나 이상의 엑손 또는 인트론 영역 또는 그 일부의 절단시에, 프리-mRNA 변이체는 더 작은 "mRNA 변이체"를 생성한다. 결과적으로, mRNA 변이체는 프로세싱된 프리-mRNA 변이체이며 각각의 유일한 프리-mRNA 변이체는 항상 스플라이싱의 결과로서 유일한 mRNA 변이체를 생성해야 한다. 이들 mRNA 변이체는 또한 "선택적 스플라이스 변이체"로 알려진다. 프리-mRNA 변이체의 스플라이싱이 발생하지 않으면, 프리-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하다.
변이체는 전사를 개시하거나 중지하기 위한 선택적 시그널의 이용을 통해 생성될 수 있으며 프리-mRNA와 mRNA는 하나 이상의 개시 코돈 또는 중지 코돈을 보유할 수 있음이 알려져 있다. 선택적 개시 코돈을 이용하는 프리-mRNA 또는 mRNA로부터 기원하는 변이체는 그 프리-mRNA 또는 mRNA의 "선택적 개시 변이체"로 알려져 있다. 선택적 중지 코돈을 이용하는 전사물은 그 프리-mRNA 또는 mRNA의 "선택적 중지 변이체"로 알려져 있다. 한 가지 특정 유형의 선택적 중지 변이체는 "폴리A 변이체"이며 여기서는 생산된 다수의 전사물이 전사 기계에 의해 "폴리A 중지 시그널" 중 하나의 대안적 선택으로부터 생성되어, 독특한 폴리A 부위에서 종결하는 전사물을 생성한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "안티센스 기전"은 타겟 핵산과 화합물의 하이브리드화에 관련되는 모든 것들이며, 여기서 하이브리드화의 결과 또는 효과는 타겟 분해 또는 타겟 선점이며 예를 들어 전사 또는 스플라이싱에 관련된 세포 기계의 부수적인 중단이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "포함하다" 및 그의 활용형은 뒤따르는 항목이 포함되지만 구체적으로 언급되지 않은 항목이 배제되는 것은 아님을 의미하기 위하여 비제한적 의미로 사용된다. 또한 동사 "이루어지다"는 본 명세서에서 정의된 화합물 또는 부가 화합물이 구체적으로 확인된 것들 외의 추가적인 성분(들)을 포함할 수 있으며 상기 추가 성분(들)이 본 발명의 유일한 특징을 변경하지 않음을 의미하는 "본질적으로 이루어진"에 의해 대체될 수 있다.
관사 "a" 및 "an"은 하나 또는 하나 보다 많은(즉, 적어도 하나), 관사의 문법적 대상을 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
용어 "개체", "환자" 및 "대상"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 포유동물, 특히 영장류 및 바람직하게는 사람을 지칭한다.
용어 "엑손"은 mRNA의 성숙한 형태에 존재하는 유전자 부분을 지칭한다. 엑손은 ORF (개방 해독 프레임), 즉, 단백질을 인코딩하는 서열, 및 5' 및 3' UTR(비번역 영역)을 포함한다. UTR은 단백질의 번역을 위해 중요하다. 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램이 DNA 서열에서 엑손을 예측하기 위해 이용가능하다 (Grail, Grail 2 및 Genscan 및 엑손-인트론 접합부를 결정하기 위한 US 20040219522호).
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "단백질 코딩 엑손"은 단백질(또는 단백질의 일부)을 코딩(또는 적어도 부분적으로 코딩)하는 엑손을 말한다. mRNA 내의 첫번째 단백질 코딩 엑손은 개시 코돈을 함유하는 엑손이다. mRNA 내의 마지막 단백질 인코딩 엑손은 중지 코돈을 함유하는 엑손이다. 개시 및 중지 코돈은 임의의 많은 공지 프로그램을 이용하여 예측할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "내부 엑손"은 다른 엑손이 그것의 5' 및 3' 말단에서 인접하는 엑손을 말한다. n 엑손을 포함하는 mRNA의 경우, 엑손 2 내지 엑손 (n-1)이 내부 엑손이다. mRNA의 첫번째 및 마지막 엑손은 본 명세서에서 외부 엑손으로 불린다.
용어 "인트론"은 단백질로 번역되지 않는 유전자 부분을 말하며, 게놈 DNA와 프리-mRNA에는 존재하지만, 성숙한 mRNA의 형성에서 제거된다.
용어 "메신저 RNA" 또는 "mRNA"는 게놈 DNA로부터 전사되며 단백질 합성을 위한 코딩 서열을 보유하는 RNA를 말한다. 프리-mRNA (전구체 mRNA)는 게놈 DNA로부터 전사된다. 진핵세포에서는, 프리-mRNA는 mRNA로 프로세싱되며, 이것은 인트론의 제거, 즉, "스플라이싱" 및 5' 및 3' 말단에의 변형(예, 폴리아데닐화)를 포함한다. mRNA는 일반적으로 5'에서 3'으로, 5' 캡(변형된 구아닌 뉴클레오티드), 5'UTR (비번역 영역), 코딩 서열(개시 코돈으로 시작하고 중지 코돈으로 끝남), 3' UTR 및 폴리(A) 테일을 포함한다.
용어 "핵산 서열" 또는 "핵산 분자" 또는 폴리뉴클레오티드는 상호교환적으로 사용되며 단일쇄 또는 이중쇄 형태의 DNA 또는 RNA 분자를 말한다. "분리된 핵산 서열"은 그것이 분리된 자연 환경, 예, 세포 내에 더 이상 있지 않는 핵산 서열을 말한다.
핵산 분자에서 "돌연변이"는 야생형 서열에 비교하여, 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 삽입에 의한 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화를 말한다. "점 돌연변이"는 단일 뉴클레오티드의 치환, 또는 단일 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실이다.
"서열 동일성" 및 "서열 유사성"은 전체 또는 국소 배열 알고리즘을 이용하여 두 개의 펩티드 또는 두 개의 뉴클레오티드 서열을 배열하여 결정할 수 있다. 이어서 서열은 그들이 예를 들어, 프로그램 GAP 또는 BESTFIT 또는 엠보스(Emboss) 프로그램 "Needle" (디폴트 파라미터 이용, 이하 참고)에 의해 적절하게 배열될 때 적어도 소정의 최소의 서열 동일성 백분율을 가질 때 "실질적으로 동일한" 또는 "본질적으로 유사한" 것으로 불릴 수 있다(이하에서 추가로 설명됨). 이들 프로그램은 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 두 서열을 배열하기 위하여 Needleman and Wunsch 전체 배열 알고리즘을 이용하여, 매치 수를 최대화하고 갭 수를 최소화한다. 일반적으로, 디폴트 파라미터가 이용되며, 갭 생성 페널티 = 10 및 갭 확장 페널티 = 0.5이다(뉴클레오티드 및 단백질 배열 둘 다를 위함). 뉴클레오티드의 경우 사용되는 디폴트 스코어링 매트릭스는 DNAFULL이며 단백질의 경우 디폴트 스코어링 매트릭스는 Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915- 10919)이다. 서열 배열 및 백분율 서열 동일성을 위한 점수는 예를 들어, EMBOSS (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 대안적으로, 서열 유사성 또는 동일성은 FASTA, BLAST 등과 같은 데이터베이스를 조사하여 결정될 수 있으나, 서열 동일성을 비교하기 위하여 히트는 쌍으로 검색되고 배열되어야 한다. 두 가지 단백질 또는 두 가지 단백질 도메인, 또는 두 가지 핵산 서열은 백분율 서열 동일성이 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상, 바람직하게는 90%, 95%, 98%, 99% 또는 그 이상이면(핵산을 위해 스코어링 매트릭스 DNAFULL을 그리고 단백질을 위해 Blosum62를 이용하여, 디폴트 파라미터, 즉, 갭 생성 페널티 = 10, 갭 확장 페널티 = 0.5를 이용하여 Emboss "needle"에 의해 결정함), "실질적 서열 동일성"을 갖는다. 그러한 서열은 또한 본 명세서에서 '변이체'로, 예를 들어, 안티센스 올리고머 화합물의 다른 변이체로 불린다. 실질적 서열 동일성을 가진 서열은 반드시 길이가 동일할 필요는 없으며 길이가 상이할 수 있음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖지만 그 중 하나가 3' 및/또는 5' 측에 추가의 뉴클레오티드를 갖는 서열들은 100% 동일하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "하이브리드화"는 일반적으로 프로브 서열과 타겟 서열의 특성에 따라 당업자에게 쉽게 자명할 적절한 엄격도 조건에서의 핵산의 하이브리드화를 의미하기 위해 이용된다. 하이브리드화 및 세척 조건은 잘 알려져 있으며 항온처리 시간, 온도 및/또는 용액의 이온 강도를 변화시켜 원하는 엄격도에 따른 조건의 조절이 쉽게 가능하다. 예를 들어, Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989를 참고한다. 조건의 선택은 하이브리드화되는 서열의 길이, 특히, 프로브 서열의 길이, 핵산의 상대적 G-C 함량 및 허용되는 미스매치의 양에 의해 지배된다. 상보성 정도가 낮은 쇄들 간의 부분 하이브리드화가 필요한 경우에는 낮은 엄격도 조건이 바람직하다. 완전하거나 거의 완전한 상보성이 바람직한 경우에는, 높은 엄격도 조건이 바람직하다. 전형적인 높은 엄격도 조건의 경우, 하이브리드화 용액은 6X S.S.C., 0.01 M EDTA, 1X Denhardt's 용액 및 0.5% SOS를 함유한다. 클로닝된 DNA의 단편의 경우 하이브리드화는 약 3 내지 4 시간 동안 약 68 ℃에서 수행되며 전체 진핵 DNA의 경우에는 약 12 내지 16시간 동안 수행된다. 낮은 엄격도의 경우, 하이브리드화의 온도는 이중쇄(duplex)의 융점(TM) 보다 약 42 ℃ 낮게 감소된다. TM은 용액의 이온 강도 뿐만 아니라 G-C 함량 및 이중쇄 길이의 함수인 것으로 알려져 있다.
용어 "대립유전자(들)"는 특정 유전자좌의 유전자의 하나 이상의 대안적 형태 중 임의의 것을 의미하며, 모든 대립유전자는 한가지 형질 또는 특정 유전자좌의 특징에 관련된다. 하나의 대립유전자는 상동성 염색체 쌍의 각 염색체 상에 존재한다. 이들은 유전자의 동일한 대립유전자이거나(동형접합성) 두 가지 상이한 대립유전자(이형접합성)일 수 있다.
"돌연변이 대립유전자"는 본 명세서에서 야생형 대립유전자와 비교할 때 코딩 서열 (mRNA, cDNA 또는 게놈 서열)에서 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 대립유전자를 말한다. 그러한 돌연변이(들)(예를 들어, 하나 이상의 뉴클레오티드(들)의 삽입, 역위, 결실 및/또는 치환)는, 예를 들어, 단백질이 절단되거나 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 아미노산 서열을 가짐으로 인해, 인비트로 및/또는 인비보 기능성이 감소되거나(기능 감소) 인비트로 및/또는 인비보 기능성이 없는(기능 소실) 인코딩된 단백질을 야기할 수 있다. 그러한 변화는 다른 형태를 갖거나, 다른 세포내 구역에 타겟팅되거나, 변형된 촉매 도메인을 갖거나, 핵산 또는 단백질에 대해 변형된 결합 활성을 갖는 단백질을 야기할 수 있으며, 또한 상이한 스플라이싱 사건을 야기할 수 있다.
유전자 또는 뉴클레오티드 서열 또는 안티센스 올리고머 화합물의 "단편"은 상기 분자의 임의의 서브세트, 예를 들어, 더 짧은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 말한다.
"변이체"는 하나 이상의 치환된 뉴클레오티드를 갖지만 특정 유전자와 하이브리드화하는 능력을 유지하는 뉴클레오티드 치환 변이체와 같은, 안티센스 올리고머 화합물 또는 그 단편과 실질적으로 유사한 분자를 말한다. 바람직하게는 변이체는 본 발명에 의해 확인된 돌연변이를 포함한다. 변이체는 또한 더 긴 서열을 포함한다.
"유사체"는 전체 분자, 변이체 또는 그 단편과 관련하여 실질적으로 유사하거나 기능하는 비천연 분자를 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "전구체 mRNA" 또는 "프리-mRNA"는 하나 이상의 개재 서열(인트론)을 함유하는 미성숙 단일쇄 메신저 리보핵산(mRNA)를 말한다. 프리-mRNA는 세포 핵에서 DNA 주형으로부터 RNA 폴리머라제에 의해 전사되며 인트론과 코딩 영역(엑손)의 교번 서열로 이루어진다. 일단 프리-mRNA가 인트론의 스플라이싱과 엑손의 연결에 의해 완전히 프로세싱되면, 엑손만으로 이루어지는 RNA인 "메신저 RNA" 또는 "mRNA"로 불린다. 진핵 프리-mRNA는 mRNA로 완전히 프로세싱되기 전에 일시적으로 존재한다. 프리-mRNA가 mRNA 서열로 적절하게 프로세싱되면, mRNA는 핵 밖으로 배출되고 궁극적으로는 세포질 내의 리보솜에 의해 단백질로 번역된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "스플라이싱" 및 "프로세싱"은 전사 후 프리-mRNA의 변형을 말하며, 이때 인트론이 제거되고 엑손이 연결된다. 프리-mRNA 스플라이싱은 두 가지의 순차적인 생화학적 반응에 관련된다. 두 가지 반응 모두 RNA 뉴클레오티드 간의 스플라이소좀 트랜스에스테르화에 관련된다. 첫번째 반응에서는, 스플라이소좀 조립 동안 정의되는, 인트론 내의 특이적 분지점 뉴클레오티드의 2'-OH가 5' 스플라이스 부위에서 인트론의 첫번째 뉴클레오티드에 대한 친핵성 공격을 수행하여 올가미 중간체(lariat intermediate)를 형성한다. 두번째 반응에서는, 방출된 5' 엑손의 3'-OH가 3' 스플라이스 부위에서 인트론의 마지막 뉴클레오티드에서 친핵성 공격을 수행하여 엑손을 연결하고 인트론 올가미를 방출한다. 프리-mRNA 스플라이싱은 인트론 사일런서 서열 (ISS), 엑손 사일런서 서열(ESS) 및 말단 스템 루프(TSL) 서열에 의해 조절된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "인트론 사일런서 서열(ISS)" 및 "엑손 사일런서 서열(TSL)"은 프리-mRNA 내에서의 트랜스-작용 단백질 인자의 결합에 의해 선택적 스플라이싱을 조절하여 스플라이스 부위의 차등적 사용을 야기하는, 각각 인트론 및 엑손 내의 서열 요소를 말한다. 전형적으로, 인트론 사일런서 서열이 엑손-인트론 접합부에서의 스플라이스 부위보다 덜 보존된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "스플라이싱의 조절"은 프리-mRNA 전사물의 프로세싱을 변화시켜 하나 이상의 스플라이스 생성물의 증가 또는 감소, 또는 둘 이상의 스플라이스 생성물의 비율의 변화가 있도록 하는 것을 말한다. 스플라이싱의 조절은 또한 프리-mRNA 전사물의 프로세싱을 변화시켜 스플라이싱된 mRNA 분자가 엑손 스키핑 또는 엑손 포함의 결과로서 엑손의 상이한 조합, 하나 이상의 엑손에서의 결실, 또는 스플라이싱된 mRNA에서 정상적으로는 발견되지 않는 추가 서열(예, 인트론 서열)을 함유하도록 하는 것을 말할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "스플라이스 부위"는 프리-mRNA (스플라이싱되지 않은 RNA) 분자 내의 엑손과 인트론 사이의 접합부("스플라이스 접합부"라고도 알려짐)를 말한다. "크립틱(cryptic) 스플라이스 부위"는 일반적으로 사용되지 않지만 일반적 스플라이스 부위가 차단되거나 이용가능하지 않거나 또는 돌연변이가 정상적으로는 휴면인 부위가 활성 스플라이스 부위가 되도록 할 경우에 사용될 수 있다. "비정상 스플라이스 부위"는 천연 DNA 및 프리-mRNA에서의 돌연변이로부터 야기되는 스플라이스 부위이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "스플라이스 생성물" 또는 "스플라이싱 생성물"은 프리-mRNA의 스플라이싱 과정에서 생성되는 성숙한 mRNA 분자이다. 선택적으로 스플라이싱된 프리-mRNA는 적어도 두 가지 상이한 스플라이스 생성물을 갖는다. 예를 들어, 첫번째 스플라이싱 생성물은 두번째 스플라이싱 생성물에 비하여 추가의 엑손, 또는 엑손의 일부를 함유할 수 있다. 선택된 프리-mRNA의 스플라이스 생성물은 당업계에 잘 알려진 다양한 상이한 기술에 의해 확인할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "스플라이스 공여자 부위"는 인트론의 5' 말단에서 또는 대안적으로는 엑손의 3' 말단에서 발견되는 스플라이스 부위를 말한다. 스플라이스 공여자 부위는 "5' 스플라이스 부위"와 상호교환적으로 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "스플라이스 수용자 부위"는 인트론의 3' 말단 또는 대안적으로는 엑손의 5' 말단에서 발견되는 스플라이스 부위를 말한다. 스플라이스 수용자 부위는 "3' 스플라이스 부위"와 상호교환적으로 사용된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "타겟팅" 또는 "~에 타겟팅된"은 올리고머 화합물이 선택된 핵산 분자 또는 핵산 분자의 영역과 하이브리드화하도록 올리고머 화합물을 설계하는 과정을 말한다. 올리고머 화합물을 특정 타겟 핵산 분자에 타겟팅하는 것은 다단계 과정일 수 있다. 상기 과정은 보통 그 발현이 조절되어야 하는 타겟 핵산의 확인으로 시작한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "타겟 핵산" 및 "GAA를 인코딩하는 핵산"은 GAA를 인코딩하는 DNA, 그러한 DNA로부터 전사된 RNA(프리-mRNA 및 mRNA 포함), 및 또한 그러한 RNA로부터 유래된 cDNA를 포함한다. 예를 들어, 타겟 핵산은 그 발현이 특정 질환 또는 질병 상태와 관련된 세포 유전자(또는 그 유전자로부터 전사된 mRNA), 또는 감염 제제로부터의 핵산 분자일 수 있다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 타겟 핵산은 GAA를 인코딩한다.
타겟팅 과정은 보통 또한 안티센스 상호작용이 일어나서 원하는 효과, 예를 들어, 발현의 조절이 야기되기 위한 적어도 하나의 타겟 영역, 분절, 또는 타겟 핵산 내의 부위를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "타겟 mRNA"는 본 발명에서 제공된 올리고머 화합물이 하이브리드화하도록 설계되는 핵산 분자를 말한다. 본 명세서의 내용에서, 타겟 mRNA는 보통 스플라이싱되지 않은 mRNA, 즉 프리-mRNA이다. 본 발명의 내용에서, 타겟 mRNA는 GAA mRNA 또는 GAA 프리-mRNA이다.
"영역"은 적어도 하나의 확인가능한 구조, 기능 또는 특징을 가진 타겟 핵산의 부분으로 정의된다. 타겟 영역은 예를 들어, 특정 엑손 또는 인트론을 포함하거나, 적절한 타겟 영역으로 확인되는 엑손 또는 인트론 내의 선택된 뉴클레오티드만을 포함할 수 있다. 타겟 영역은 또한 스플라이싱 억제자 부위일 수 있다. 타겟 핵산의 영역 내에는 분절이 있다. "분절"은 타겟 핵산 내의 더 작은 영역 또는 하위-부분으로 정의된다. 본 발명에서 사용되는 바와 같이, "부위"는 타겟 핵산 내의 유일한 핵염기 위치로 정의된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 올리고머 화합물의 "타겟 부위"는 상기 화합물이 결합하는 타겟 핵산의 가장 5' 뉴클레오티드이다.
타겟 분해는 RNA:DNA 이중쇄의 RNA 쇄를 절단하는 세포 엔도뉴클레아제인 RNase H를 포함할 수 있다. "DNA-유사한" 단일쇄 안티센스 화합물은 RNAse H에 의한 절단을 유발하는 것으로 알려져 있다. 안티센스 화합물이 하이브리드화하지만 타겟의 절단을 유발하지 않는 선점-기반 안티센스 기전은 번역의 억제, 스플라이싱의 조절, 폴리(A) 부위 선택의 조절 및 조절성 RNA 구조의 파괴를 포함한다. 본 발명의 경우, 선점-기반 안티센스 기전에 사용하기 위한 "RNA-유사한" 안티센스 화합물이 바람직하다.
본 명세서의 내용에서, "스플라이스 부위에 타겟팅된" 올리고머 화합물은 스플라이스 부위를 인코딩하는 핵산의 영역의 적어도 일부와 하이브리드화하는 화합물 또는 mRNA의 스플라이싱이 조절되도록 스플라이스 부위에 근접한 인트론 또는 엑손과 하이브리드화하는 화합물을 말한다.
용어 "올리고머 화합물"은 핵산 분자의 영역에 하이브리드화할 수 있는 중합체 구조를 말한다. 이 용어는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오티드 모방체 및 이들의 키메라 조합을 포함한다. 올리고머 화합물은 보통은 선형으로 제조되지만 연결되거나 다르게는 원형으로 제조될 수 있다. 또한, 분지형 구조가 알려져 있다. 올리고머 화합물은 단일쇄, 이중쇄, 원형, 분지형 또는 헤어핀 형태로 도입될 수 있으며 내부 또는 말단 벌지(bulge) 또는 루프와 같은 구조적 요소를 함유할 수 있다. 올리고머 이중쇄 화합물은 하이브리드화되어 이중쇄 화합물을 형성하는 두 개의 쇄이거나 또는 하이브리드화 및 완전히 또는 부분적으로 이중쇄 화합물을 형성하도록 하기에 충분한 자기 상보성을 가진 단일쇄일 수 있다.
용어 "안티센스 올리고뉴클레오티드, AON, 또는 안티센스 올리고머 화합물"은 상보성 뉴클레오티드 서열을 가진 프리-mRNA 또는 mRNA와 상호작용하고/하거나 하이브리드화하여 유전자 발현 및/또는 스플라이싱을 변경할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 효소-의존성 안티센스 올리고뉴클레오티드는 타겟 mRNA를 분해하기 위하여 RNase H 활성에 의존하며, 단일쇄 DNA, RNA 및 포스포로티오에이트 안티센스를 포함하는 형태를 포함한다. 입체 차단 안티센스 올리고뉴클레오티드 (RNase-H 비의존성 안티센스)는 mRNA의 타겟 서열에 결합하여 유전자 발현 또는 다른 mRNA-의존성 세포 과정을 방해한다. 입체 차단 안티센스는 2'-0 알킬 안티센스 올리고뉴클레오티드, 모르폴리노 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 트리시클로-DNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 입체 차단 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 발명에서 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "RNase H-비의존성"인 안티센스 올리고뉴클레오티드는 타겟 핵산에 하이브리드화될 경우 RNase H에 의한 절단을 유발하지 않는 화합물이다. RNase H-비의존성 올리고머 화합물은 타겟 점유-기반 기전에 의해, 스플라이싱과 같은 유전자 발현을 조절한다. Rnase H-비의존성 안티센스 올리고뉴클레오티드가 본 발명에서 바람직하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "하이브리드화"는 올리고머 화합물의 상보성 쇄의 페어링(pairing)을 의미한다. 본 명세서의 내용에서, 올리고머 화합물은 비-타겟 핵산 서열에의 올리고머 화합물의 비-특이적 결합을 피하기 위한 충분한 정도의 상보성이 있을 경우 특이적으로 하이브리드화가능하다. 당업자는 올리고머 화합물이 언제 특이적으로 하이브리드화가능한지를 결정할 수 있을 것이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "상보적"은 상보적 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 사이의 전통적인 왓슨-크릭 염기 페어링 또는 다른 비전통적인 페어링 유형(예, 훅스틴(Hoogsteen) 또는 역전(reversed) 훅스틴 수소 결합)에 의해 다른 핵산 분자와 수소 결합을 형성할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 본 명세서의 안티센스 올리고머 화합물에 있어서, 안티센스 올리고머 화합물과 그의 상보적 서열의 결합 자유 에너지는 안티센스 올리고머 화합물의 관련 기능이 진행하도록 하기에 충분하며, 특이적 결합이 바람직한 조건하에서, 즉, 엑스 비보 또는 인 비보 치료적 처리의 경우에서의 생리학적 조건하에서, 안티센스 올리고머 화합물이 비-타겟 서열에 비-특이적 결합하는 것을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 있다. 핵산 분자를 위한 결합 자유 에너지의 결정은 잘 알려져 있다(예를 들어, Turner et ah, CSH Symp. Quant. Biol. 1/7:123-133 (1987); Frier et al, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:9373-77 (1986); 및 Turner et al, J. Am. Chem. Soc. 109:3783-3785 (1987) 참고). 따라서, "상보적" (또는 "특이적으로 하이브리드화가능한")은 안티센스 올리고머 화합물과 프리-mRNA 또는 mRNA 타겟 사이에서 안정되고 특이적인 결합이 일어나도록 하는 충분한 정도의 상보성 또는 정밀한 페어링을 나타내는 용어이다. 핵산 분자는 특이적으로 하이브리드화가능하기 위하여 타겟 핵산 서열에 100% 상보적일 필요는 없음이 이해된다. 즉, 둘 이상의 핵산 분자는 완전히 보다는 덜 상보적일 수 있다. 상보성은 두번째 핵산 분자와 수소 결합을 형성할 수 있는 핵산 분자 내의 인접 잔기의 백분율에 의해 나타낸다. 예를 들어, 만일 첫번째 핵산 분자가 10 뉴클레오티드를 가지고 두번째 핵산 분자가 10 뉴클레오티드를 가지면, 첫번째 및 두번째 핵산 분자 사이의 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 뉴클레오티드의 염기 페어링은 각각 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보성을 나타낸다. 타겟 핵산의 영역과 올리고머 화합물의 퍼센트 상보성은 일상적으로 당업계에 알려진 BLAST 프로그램 (기본 국소 배열 조사 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 결정할 수 있다(Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649-656). 퍼센트 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 예를 들어, 디폴트 세팅을 이용하여, Smith and Waterman의 알고리즘(Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489)을 이용하는 Gap 프로그램(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정할 수 있다. "완벽하게" 또는 "완전히" 상보적인 핵산 분자는 첫번째 핵산 분자의 모든 인접 잔기가 두번째 핵산 분자 내의 동일한 수의 인접 잔기와 수소 결합하는 핵산 분자를 의미하며, 여기서 핵산 분자는 동일한 수의 뉴클레오티드를 갖거나(즉, 동일한 길이를 가짐) 두 분자가 상이한 길이를 갖는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "균일하게 변형된" 또는 "완전히 변형된"은 본질적으로 각 뉴클레오시드가 균일한 변형을 가진 당 변형 뉴클레오시드인 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 영역을 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "키메라 올리고머 화합물", "키메라 안티센스 화합물" 또는 "키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물"은 둘 이상의 화학적으로 구별되는 영역을 함유하며, 각 영역은 적어도 하나의 단량체 단위(즉, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에는 뉴클레오티드)를 포함하는 화합물이다. 용어 "키메라 안티센스 화합물"은 구체적으로 동일한 올리고머 화합물 내의 다른 당, 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드간 결합에 비하여 다르게 변형된 당, 핵염기 및/또는 뉴클레오시드간 결합 적어도 하나를 가진 안티센스 화합물을 말한다. 나머지 당, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드간 결합은 독립적으로 변형되거나 변형되지 않을 수 있다. 일반적으로, 키메라 올리고머 화합물은 분리된 위치에 있거나 특정 모티프를 정의할 영역내에 함께 모여있을 수 있는 변형된 뉴클레오시드를 가질 것이다. 키메라 올리고머 화합물은 전형적으로 뉴클레아제 분해에 대한 저항성 증가, 세포 흡수 증가, 및/또는 타겟 핵산에 대한 결합 친화성 증가를 부여하기 위하여 변형된 적어도 하나의 영역을 함유한다. 본 명세서의 내용에서, "키메라 RNase H-비의존성 안티센스 화합물"은 적어도 두 개의 화학적으로 구별되는 영역을 갖지만 타겟 핵산에 하이브리드화할 때 RNase H에 의한 절단에 민감하지 않은 안티센스 화합물이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "뉴클레오시드"는 염기-당 조합이며 "뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유 결합된 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 변형된 당 잔기를 가진 뉴클레오시드는 뉴클레오시드의 리보스 당이 화학적으로 변형된 당 모이어티(moiety)로 치환된 임의의 뉴클레오시드이다. 본 명세서의 내용에서, 화학적으로 변형된 당 모이어티는 2'-O-메톡시에틸, 2'-플루오로, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 2'-디메틸아미노에톡시에톡시, 2'-구아니디늄, 2'-O-구아니디늄 에틸, 2'-카르바메이트, 2'-아미노옥시, 2'-아세트아미도 및 잠긴 핵산을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "RNase H 분해에 저항성인" 화합물은 RNase H 절단에 대한 화합물의 저항성을 증가시키는 적어도 하나의 화학적 변형을 가진 안티센스 화합물이다. 그러한 변형은 당 변형을 가진 뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 변형된 당을 가진 뉴클레오티드는 2'-데옥시리보스 당이 화학적으로 변형된 당 모이어티로 치환된 임의의 뉴클레오티드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 내용에서, 화학적으로 변형된 당 모이어티는 2'-O-(2-메톡시에틸), 2'-플루오로, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 2'-디메틸아미노에톡시에톡시, 2'-구아니디늄, 2'-O-구아니디늄 에틸, 2'-카르바메이트, 2'-아미노옥시, 2'-아세트아미도, 잠긴 핵산 (LNA) 및 에틸렌 가교된 핵산 (ENA)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. RNase H 절단에 저항성인 변형된 화합물은 본 명세서에서 완전히 기재되며 당업계에 잘 알려져 있다.
본 명세서의 내용에서, "세포 흡수"는 올리고머 화합물이 세포 내로 전달되어 내부화되는 것을 말한다. 올리고머 화합물은 예를 들어, 배양에서 성장한 세포(인 비트로), 동물로부터 수집된 세포(엑스 비보) 또는 동물(인 비보)에 투여 후 조직에 의해 내부화될 수 있다.
"대상"은 이식된 세포의 공여자 또는 수용자인 유기체 또는 세포 자체를 의미한다. "대상"은 또한 본 발명의 핵산 분자가 투여될 수 있는 유기체를 말한다. 본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 대상은 포유동물 또는 포유동물 세포이다. 다른 실시형태에서, 대상은 인간 또는 인간 세포이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 안티센스 올리고머 화합물이 투여되는 대상(예, 인간)에서 서술된 질병, 장애 또는 질환을 치료하거나 예방하기에 충분한 양의 안티센스 올리고머 화합물을 의미한다. 본 명세서의 안티센스 올리고머 화합물은 개별적으로, 또는 다른 약물과 조합되어, 본 명세서에서 토의된 질병 또는 질환을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 에를 들어, 특정 질병, 장애 또는 질환을 치료하기 위하여, 안티센스 올리고머 화합물은 환자에게 투여되거나 또는 치료에 적합한 조건하에서, 개별적으로 또는 하나 이상의 약물과 함께, 당업자에게 명백한 적절한 다른 세포에 투여될 수 있다. 본 발명에서 질병은 바람직하게는 폼페병이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용가능한"은 생리학적으로 용인가능하며 일반적으로 인간에게 투여될 때 위장 장애, 어지러움 등과 같은 알러지 또는 유사한 뜻밖의 반응을 생성하지 않는 분자 실체 및 조성물을 말한다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한"은 정부 기관에 의해 허가되거나 미국 약전 또는 동물 그리고 더욱 구체적으로는 인간에서의 사용에 대한 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "분리된"은 언급된 물질이 그의 천연 환경, 예를 들어, 세포로부터 제거됨을 의미한다. 따라서, 분리된 생물학적 물질은 세포 성분, 즉, 천연 물질이 자연적으로 발생하는 세포의 성분(예, 세포질 또는 막 성분) 중 일부 또는 전부가 없을 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "정제된"은 그 물질이 수득된 천연 물질들을 비롯한 무관한 물질, 즉, 오염물의 존재를 감소시키거나 제거하는 조건 하에서 분리된 물질을 말한다. 예를 들어, 정제된 tc-DNA 안티센스 올리고머 화합물은 바람직하게는 조직 배양 성분, 오염물 등을 비롯한 세포 또는 배양 성분이 실질적으로 없다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 없는"은 물질의 분석 시험 맥락에서 적용가능하게 사용된다. 바람직하게는, 오염물이 실질적으로 없는 정제된 물질은 적어도 50% 순수하며; 더욱 바람직하게는 적어도 90% 순수하며, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 순수하다. 순도는 크로마토그래피, 젤 전기영동, 면역분석, 조성 분석, 생물학적 분석 및 공지의 다른 방법에 의해 평가할 수 있다.
본 명세서에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않으면, 언급된 범위 내의 임의의 정수 값 및 적절한 경우, 그 분수(예, 정수의 1/10 및 1/100)값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 같은 임의의 물리적 특징에 관련하여 본 명세서에서 언급된 임의의 수치 범위는 달리 표시되지 않으면, 언급된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "약" 또는 "본질적으로 이루어지는"은 달리 표시되지 않으면, 표시된 범위, 값 또는 구조의 +- 20%를 의미한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다(include)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 사용된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 관사는 계수된 성분의 하나 이상을 말하는 것임이 이해되어야 한다. 선택(예, "또는")의 사용은 대안 중 어느 하나, 둘 모두, 또는 임의의 그 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값의 통계적으로 유의한 범위내를 의미한다. 그러한 범위는 주어진 값 또는 범위의 자릿수 이내, 바람직하게는 50% 이내, 더욱 바람직하게는 20% 이내, 더욱 바람직하게는 10% 이내, 그리고 더욱 더 바람직하게는 5% 이내일 수 있다. 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포함되는 허용가능한 편차는 연구 중인 구체적인 시스템에 의존하며, 당업자에 의해 쉽게 이해될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 1의 단일 뉴클레오티드 다형성을 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
이전의 다른 연구자들에 의한 연구는 듀켄씨 근이양증(DMD)을 비롯한 몇몇 인간 질환에서 엑손 포함을 촉진하는 안티센스 올리고머 화합물을 설계했다. 이 전략은 단순하고 간단하며, 잘-정의된 스플라이스 부위를 차단하는 것에 의존한다. 이것은 엑손 스키핑을 야기하여, 병원성 유전자 변이체를 함유한 엑손을 제거한다. 생성되는 mRNA는 약간 더 짧아 질병을 적어도 부분적으로 완화하기에 충분한 상당한 잔여 활성을 가진 절단된 단백질의 발현을 야기한다. 이 전략은 정규적인 스플라이스 부위가 사실상 모든 유전자에 대해 알려져 있기 때문에 간단한다. 유일한 요건은 프리-mRNA 내의 정규 스플라이스 부위에 결합하여 그 부위의 차단 및 관련 엑손의 스키핑을 야기할 안티센스 올리고머 화합물을 설계하는 것이다.
훨씬 더 어려운 일은 역전된 과정이며, 엑손의 배제가 아닌 포함을 촉진하는 것이다. 엑손 포함을 촉진하기 위하여, 스플라이스 억제자가 안티센스 올리고머 화합물을 이용하여 차단될 수 있다. 하지만, 스플라이스 억제자가 어디에 위치하는지 알려져 있지 않다. 이들은 인트론 내에 또는 엑손 내에 존재할 수 있으며 인트론 또는 엑손 스플라이스 사일런서(각각 ISS 또는 ESS)로 불린다. 그러한 사일런서의 존재를 예측하기 위해 이용가능한 소프트웨어가 있지만 이들은 매우 신뢰성이 낮다. 이것은 또한 예측된 스플라이스 사일런서 모티프의 활성을 확인하는데 실패한, GAA 엑손 1-3을 함유한 미니유전자 시스템을 이용하는 본 발명자들의 경험에 의해 예시된다. 폼페병을 치료하기 위하여 안티센스 올리고머 화합물을 이용하여 GAA의 엑손 2 포함을 촉진하는 아이디어는 완전히 새로운 것이다. 본 발명자들은 수반되는 특허 출원(PCT/NL2014/050375)에서 스플라이스 억제자 서열이 두 가지 스크린에 의해 확인될 수 있음을 보여준다: U7-snRNA 안티센스 올리고머 화합물 스크린 및 무작위 돌연변이/미니유전자 스크린. 이 스크린으로부터의 하나의 타겟 서열은 안티센스 올리고머 화합물로 성공적으로 타겟팅되어, IVS1 변이체의 맥락에서 GAA 엑손 2의 포함을 향상시켰다. 이것은 야생형 GAA mRNA의 향상된 풍부함에 의해 가시화되는 것처럼, IVS1 변이체에 의해 야기된 엑손 2의 비정상 스플라이싱을 교정하였다.
서열번호 1을 타겟팅하는 서열은 GAA 엑손 2의 포함을 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다. 또한 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40을 타겟팅하는 서열은 GAA 엑손 2의 포함을 향상시킬 수 있음이 밝혀졌다. 타겟팅은 서열번호 1 서열의 적어도 일부가 예를 들어, 적어도 일부와 하이브리드화하거나 서열번호 1 서열에 의해 하이브리드화하는 서열에 의해, 또는 서열번호 1의 적어도 일부에 결합하는 서열에 의해 타겟팅됨을 의미하는 것임을 주목한다. 타겟팅하는 서열은 타겟 서열보다 짧거나 길 수 있다.
Figure 112016128736525-pct00001
적합하게는 서열번호 1을 타겟팅하는 서열은 서열번호 1의 적어도 일부와 하이브리드화한다. 하이브리드화하는 서열은 타겟 서열보다 짧거나 길 수 있다. 뉴클레오티드 서열 서열번호 2-33은 GAA 엑손 2 포함을 향상시킬 수 있는 올리고머이다.
21 뉴클레오티드의 하나(서열번호 33)와 25 뉴클레오티드의 하나(서열번호 12)의 두 가지의 변이체 안티센스 올리고머 화합물을 시험하였으며 둘 모두 엑손 2 포함을 향상시키는 것으로 확인되었다. 이것은 GAA 효소 활성을 적어도 2배 향상시켰다. IVS1 변이체를 가진 환자는 ~15% 누수(leaky) 야생형 스플라이싱을 가짐이 알려져 있다. 2배 향상은 ~30%의 효소 활성을 야기하며, 이는 질병 역치인 20%를 초과하며 따라서 리소좀 글리코겐 분해를 적어도 일부 또는 심지어 완전히 회복시킬 것으로 예상된다.
양태 및/또는 그의 실시형태 중 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2-33 및 적어도 80% 동일성을 갖는 그의 변이체 및 단편을 포함하는 군으로부터 선택된 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다. 안티센스 올리고머 화합물은 또한 서열번호 1, 37, 38, 39, 40의 단일 뉴클레오티드 다형성을 타겟팅할 수 있다. 서열번호 2-33의 전체 길이를 가질 필요는 없으며 더 짧거나 긴 서열을 갖는 단편 또한 포함됨이 주목된다. 본 발명자들은 GAA의 엑손 2의 포함을 가능하게 하는 타겟 게놈 서열을 발견하였으며 당업자는 서열번호 1, 37, 38, 39, 40 및 그의 단일 뉴클레오티드 다형성과 같은 이 타겟 게놈 서열을 타겟팅하는 적합한 서열을 찾을 수 있다. 서열번호 1, 37, 38, 39, 또는 41과 같은 이 타겟 게놈 서열을 타겟팅하는 예시적인 서열은 서열번호 2-33일 수 있으나, 또한 적어도 80% 동일성을 갖는 그의 변이체 및 단편일 수 있다. 특히 서열번호 2-33의 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드를 가진 단편과 같은 더 짧은 단편이 포함된다.
그 양태 및/또는 그의 실시형태 중 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1, 37-40 및 그의 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다. 또한 서열번호 1, 37-40을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머 화합물에 적어도 80% 동일성을 갖는 서열도 포함된다. 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성을 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물이 설계될 수 있다.
그 양태 및/또는 그의 실시형태 중 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 게놈 서열 c-32-156_-210을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
그 양태 및/또는 그의 실시형태 중 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2-33, 41-1583 및 그의 적어도 80% 동일성을 갖는 서열들을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
그 양태 및/또는 그의 실시형태 중 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 2-33, 및 41-540을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
그 양태 및/또는 그의 실시형태 중 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 다음 돌연변이의 위치를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적인 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다: c.-32-13T>G, c.-32-3C>G c.-32-102T>C, c.-32-56C>T, c.-32-46G>A, c.-32-28C>A, c.-32-28C>T, c.-32-21G>A, c.7G>A, c.11G>A, c.15_17AAA, c.17C>T, c.19_21AAA, c.26_28AAA, c.33_35AAA, c.39G>A, c.42C>T, c.90C>T, c.112G>A, c.137C>T, c.164C>T, c.348G>A, c.373C>T, c.413T>A, c.469C>T, c.476T>C, c.476T>G, c.478T>G, c.482C>T, c.510C>T, c.515T>A, c.520G>A, c.546+11C>T, c.546+14G>A, c.546+19G>A, c.546+23C>A, c.547-6, c.1071, c.1254, c.1552-30, c.1256A>T, c.1551+1G>T, c.546G>T, .17C>T, c.469C>T, c.546+23C>A, c.-32-102T>C, c.-32-56C>T, c.11G>A, c.112G>A, c.137C>T.
상기에서 확인된 돌연변이는 스플라이싱을 조절하는 것으로 밝혀졌다. 상기 돌연변이 위치를 타겟팅하는 것은 또한 스플라이싱을 조절할 수 있다. 따라서, 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치를 타겟팅하는 것이 이해된다. 돌연변이의 명명법은 위치와 돌연변이를 식별한다. 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치를 타겟팅하며, 돌연변이는 게놈 서열에 또는 프리-mRNA에 존재할 필요가 없음이 이해된다. 따라서 돌연변이의 위치는 돌연변이된 뉴클레오티드의 위치 또는 그 돌연변이의 야생형 뉴클레오티드의 위치이다. 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 뉴클레오티드 및 하류 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 타겟팅될 수 있다. 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 2-50 뉴클레오티드 및/또는 하류 2-50 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 3-45 뉴클레오티드 및/또는 하류 3-45 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 5-40 뉴클레오티드 및/또는 하류 5-40 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 6-35 뉴클레오티드 및/또는 하류 6-35 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 7-33 뉴클레오티드 및/또는 하류 7-33 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 8-30 뉴클레오티드 및/또는 하류 8-30 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 9-28 뉴클레오티드 및/또는 하류 9-28 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 10-25 뉴클레오티드 및/또는 하류 10-25 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 11-22 뉴클레오티드 및/또는 하류 11-22 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 12-20 뉴클레오티드 및/또는 하류 12-20 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 13-18 뉴클레오티드 및/또는 하류 13-18 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅하며, 보다 적합하게는 안티센스 올리고머 화합물은 돌연변이 위치의 상류 14-16 뉴클레오티드 및/또는 하류 14-16 뉴클레오티드를 포함하는 서열을 타겟팅한다.
명명법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 Dunnen and Antonarakis Human mutation 15:7-12(2000) 및 Antonarakis SE, the Nomenclature Working Group. 1998. Recommendations for a nomenclature system for human gene mutations. Hum Mutat 11:1-3 및 웹사이트(http://www.dmd.nl/mutnomen.html)에서 찾을 수 있다. 게놈 위치는 또한 www.pompecenter.nl에서 찾을 수 있다. 이들 모두는 참고로 본원에 통합된다.
바람직하게는 게놈 핵산 서열은 프리-mRNA이다.
이들 안티센스 올리고머 화합물은 글리코겐 저장 질병 타입 II/폼페병의 치료에서 유용하다.
일 양태에서 타겟 서열은 인트론 스플라이싱 사일런서 즉 ISS이다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 양태의 실시형태 및/또는 실시형태에서 타겟 서열은 GCTCTGCACTCCCCTGCTGGAGCTTTTCTCGCCCTTCCTTCTGGCCCTCTCCCCA (서열번호 1)이다. 자연 발생 단일 뉴클레오티드 다형성 또한 포함됨이 주목된다. 서열번호 1을 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물은 폼페 환자를 치료하기에 매우 적합하다. 서열번호 1을 타겟팅하는 예시적인 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 2-33 및 특히 서열번호 12 및 서열번호 33이다. 하지만, 본 발명은 이들 두 서열에 제한되지 않는다. 당업자는 타겟 서열 서열번호 1, 37, 38, 39, 또는 40에 대한 안티센스 올리고머 화합물을 설계할 수 있다. 타겟 서열 서열번호 1에 대한 안티센스 올리고머 화합물은 10 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 11 내지 75 뉴클레오티드, 바람직하게는 12 내지 73 뉴클레오티드, 바람직하게는 13 내지 70 뉴클레오티드, 바람직하게는 14 내지 65 뉴클레오티드, 바람직하게는 15 내지 60 뉴클레오티드, 바람직하게는 16 내지 55 뉴클레오티드, 바람직하게는 17 내지 50 뉴클레오티드, 바람직하게는 18 내지 45 뉴클레오티드, 바람직하게는 19 내지 40 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 38 뉴클레오티드, 바람직하게는 21 내지 35 뉴클레오티드, 바람직하게는 22 내지 33 뉴클레오티드, 바람직하게는 23 내지 30 뉴클레오티드, 바람직하게는 24 내지 29 뉴클레오티드, 바람직하게는 25 내지 28 뉴클레오티드, 바람직하게는 26 내지 27 뉴클레오티드의 길이를 가질 수 있다.
이하에서 서열번호 1을 타겟팅하는 예시적인 안티센스 올리고머 화합물이 제공된다.
Figure 112016128736525-pct00002
Figure 112016128736525-pct00003
상기 예에서 서열은 25 뉴클레오티드 길이지만, 더 긴 변이체 또는 더 짧은 단편 또한 포함된다. 그 예는 21 뉴클레오티드 길이이며 서열번호 12와 동일한 뉴클레오티드를 포함하지만 더 짧은 서열번호 33이다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 2-33 및 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 그의 단편 및 변이체 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 2-33 및 서열번호 2-33에 적어도 80%, 83%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7% 서열 동일성을 갖는 그 단편 및 변이체의 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 서열번호 2-33에 적어도 80% 동일한 서열에 관한 것이다. 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 85% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 88% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 90% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 91% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 92% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 93% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 94% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 95% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 96% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 97% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 98% 동일하며, 더욱 바람직하게는 서열번호 2-33에 적어도 99% 동일하다.
바람직한 안티센스 서열은 서열번호 12 및 서열번호 33, 또는 거기에 적어도 80% 동일하거나, 바람직하게는 서열번호 12 및/또는 33에 적어도 85% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 88% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 91% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 92% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 93% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 94% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 96% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 97% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 동일한 서열이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 2-33의 단편의 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 단편은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 2-33의 단편의 군으로부터 선택되며, 여기서 단편은 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 2-33의 단편의 군으로부터 선택되며, 여기서 단편은 19, 20, 또는 21 뉴클레오티드 길이이다.
안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 41-540의 군으로부터 선택될 수 있다:
U7 스크린으로 확인된 서열: 서열번호 41-97
Figure 112016128736525-pct00004
Figure 112016128736525-pct00005
Figure 112016128736525-pct00006
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Figure 112016128736525-pct00017
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상기 예에서 서열들은 25 뉴클레오티드 길이이지만, 더 긴 변이체 또는 더 짧은 단편 또한 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 41-540 및 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 그 단편 및 변이체의 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 41-540 및 서열번호 41-540에 적어도 80%, 83%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7% 서열 동일성을 갖는 그 단편 및 변이체의 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 서열번호 41-540에 적어도 80% 동일한 서열에 관한 것이다. 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 85% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 88% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 90% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 91% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 92% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 93% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 94% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 95% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 96% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 97% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 98% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 41-540에 적어도 99% 동일하다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 41-540의 단편의 군으로부터 선택되며, 여기서 단편은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 41-540의 단편의 군으로부터 선택되며, 여기서 단편은 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 41-540의 단편의 군으로부터 선택되며, 여기서 단편은 19, 20, 또는 21 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 타겟 서열은 인트론 6의 배제를 제공한다. 서열번호 1584는 인트론 6의 배제를 위한 타겟 서열을 제공함이 밝혀졌다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 타겟 서열은 AACCCCAGAGCTGCTTCCCTTCCAGATGTGGTCCTGCAGCCGAGCCCTGCCCTTAGCTGGAGGTCGACAGGTGGGATCCTGGATGTCTACATCTTCCTGGGCCCAGAGCCCAAGAGCGTGGTGCAGCAGTACCTGGACGTTGTGGGTAGGGCCTGCTCCCTGGCCGCGGCCCCCGCCCCAAGGCTCCCTCCTCCCTCCCTCATGAAGTCGGCGTTGGCCTGCAGGATACCCGTTCATGCCGCCATACTGGGGCCTGGGCTTCCACCTGTGCCGCTGGGGCTACTCCTCCACCGCTATCACCCGCCAGGTGGTGGAGAACATGACCAGGGCCCACTTCCCCCTGGTGAGTTGGGGTGGTGGCAGGGGAG (서열번호 1584)이다. 자연 발생 단일 뉴클레오티드 다형성 또한 포함된다.
또한 하기의 게놈 서열이 GAA의 인트론 6의 배제를 위한 타겟 서열이다:
Figure 112016128736525-pct00019
Figure 112016128736525-pct00020
타겟팅은 서열번호 1584-1589 서열의 적어도 일부가 예를 들어, 적어도 일부와 하이브리드화하거나 서열번호 1584-1589에 의해 하이브리드화하는 서열에 의해 또는 서열번호 1584-1589의 적어도 일부에 결합하는 서열에 의해 타겟팅됨을 의미한다. 타겟팅하는 서열은 타겟 서열보다 짧거나 길 수 있다.
적합하게는 서열번호 1584-1589를 타겟팅하는 서열은 서열번호 1584-1589의 적어도 일부와 하이브리드화한다. 하이브리드화하는 서열은 타겟 서열보다 짧거나 길 수 있다. 뉴클레오티드 서열 서열번호 541-1583은 GAA 인트론 6 배제를 향상시킬 수 있는 올리고머이다.
본 발명의 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 541-1583 및 적어도 80% 동일성을 갖는 그의 변이체 및 단편을 포함하는 군으로부터 선택된 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다. 안티센스 올리고머 화합물은 또한 서열번호 1584-1589의 단일 뉴클레오티드 다형성을 타겟팅할 수 있다. 서열번호 541-1583의 전체 길이를 가질 필요는 없으며, 더 짧거나 긴 서열을 갖는 단편 또한 포함된다. 본 발명자들은 인트론 6의 배제를 가능하게 하는 타겟 게놈 서열을 발견하였으며 당업자는 서열번호 1584-1589 및 그의 단일 뉴클레오티드 다형성과 같은 이 타겟 게놈 서열을 타겟팅하는 적합한 서열을 찾을 수 있다. 서열번호 1584-1589와 같은 이 타겟 게놈 서열을 타겟팅하는 예시적인 서열은 서열번호 541-1583 뿐만 아니라, 적어도 80% 동일성을 갖는 그의 변이체 및 단편일 수 있다. 특히, 서열번호 541-1583의 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드를 가진 단편과 같은 짧은 단편이 포함된다.
본 발명의 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1584-1589 및 그의 단일 뉴클레오티드 다형성을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다. 또한 서열번호 1584-1589를 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머 화합물에 적어도 80% 동일성을 갖는 서열 또한 포함된다. 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성을 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물이 설계될 수 있다.
본 발명의 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 게놈 서열 c.956-25_1194+25을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 41-1583 및 그의 적어도 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
본 발명의 양태 및/또는 실시형태의 일 양태 또는 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 541-1583을 포함하는 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 안티센스 올리고머 화합물에 관한 것이다.
서열번호 1584를 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물은 폼페 환자를 치료하기에 매우 적합하다. 서열번호 1584를 타겟팅하는 예시적인 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 541-1853이다. 하지만, 본 발명은 이들 서열에 제한되지 않는다. 당업자는 타겟 서열 서열번호 1584, 1885, 1586, 1587, 1588, 1589에 대해 안티센스 올리고머 화합물을 설계할 수 있다. 타겟 서열 서열번호 1584, 1885, 1586, 1587, 1588, 또는 1589에 대한 안티센스 올리고머 화합물은 10 내지 100 뉴클레오티드의 길이, 바람직하게는 11 내지 75 뉴클레오티드, 바람직하게는 12 내지 73 뉴클레오티드, 바람직하게는 13 내지 70 뉴클레오티드, 바람직하게는 14 내지 65 뉴클레오티드, 바람직하게는 15 내지 60 뉴클레오티드, 바람직하게는 16 내지 55 뉴클레오티드, 바람직하게는 17 내지 50 뉴클레오티드, 바람직하게는 18 내지 45 뉴클레오티드, 바람직하게는 19 내지 40 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 38 뉴클레오티드, 바람직하게는 21 내지 35 뉴클레오티드, 바람직하게는 22 내지 33 뉴클레오티드, 바람직하게는 23 내지 30 뉴클레오티드, 바람직하게는 24 내지 29 뉴클레오티드, 바람직하게는 25 내지 28 뉴클레오티드, 바람직하게는 26 내지 27 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.
안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 541-1583의 군으로부터 선택될 수 있다.
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상기 예에서, 서열은 18, 21 및 25 뉴클레오티드 길이이지만, 더 긴 변이체 또는 짧은 단편 또한 포함된다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 541-1583 및 그의 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 단편 및 변이체의 군으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 541-1583 및 서열번호 541-1583에 적어도 80%, 83%, 85%, 87%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7% 서열 동일성을 갖는 단편 및 변이체의 군으로부터 선택된다.
또는 서열번호 541-1583에 적어도 80% 동일한 서열이다. 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 85% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 88% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 90% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 91% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 92% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 93% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 94% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 95% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 96% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 97% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 98% 동일하거나, 더욱 바람직하게는 서열번호 541-1583에 적어도 99% 동일하다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 541-1583의 단편의 군으로부터 선택되며, 여기서 단편은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 541-1583의 단편의 군으로부터 선택되며, 여기서 단편은 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 본 발명의 그의 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 541-1583의 단편의 군으로부터 선택되며, 여기서 단편은 19, 20, 또는 21 뉴클레오티드 길이이다.
안티센스 올리고머 화합물은 또한 c.-32-13T>G (IVS1), c.1636+5G>T, c.525delT, c.-32-3C>G, c. 1551+1G>A, c.1075G>A, c.1552-3C>G, c.1437G>A, c.1256A>T, c.1551+1G>T 군으로부터 선택된 돌연변이 위치를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적일 수 있다.
바람직하게는 게놈 핵산 서열은 프리-mRNA이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 또한 c.-32-3C>G, c.-32-13T>G, c.-32-102T>C, c.-32-56C>T, c.-32-46G>A, c.-32-28C>A, c.-32-28C>T, c.-32-21G>A, c.7G>A, c.11G>A, c.15_17AAA, c.17C>T, c.19_21AAA, c.26_28AAA, c.33_35AAA, c.39G>A, c.42C>T, c.90C>T, c.112G>A, c.137C>T, c.164C>T, c.348G>A, c.373C>T, c.413T>A, c.469C>T, c.476T>C, c.476T>G, c.478T>G, c.482C>T, c.510C>T, c.515T>A, c.520G>A, c.546+11C>T, c.546+14G>A, c.546+19G>A, c.546+23C>A, c.547-6, c.1071, c.1254, 및 c.1552-30을 포함하는 군으로부터 선택된 돌연변이 위치를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적일 수 있다.
바람직하게는 게놈 핵산 서열은 프리-mRNA이다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 c.17C>T c.469C>T c.546+23C>A, c.-32-102T>C c.-32-56C>T c.11G>A c.112G>A c.137C>T를 포함하는 군으로부터 선택된 돌연변이 위치를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 또한 c.17C>T c.469C>T c.546+23C>A를 포함하는 군으로부터 선택된 돌연변이 위치를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 또한 c.-32-102T>C c.-32-56C>T c.11G>A c.112G>A c.137C>T를 포함하는 군으로부터 선택된 돌연변이 위치를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적일 수 있다.
돌연변이 위치 c.-32-13T>G (IVS1)를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적인 안티센스 올리고머 화합물이 가장 바람직하다.
돌연변이 위치 c.-32-3C>G, c.1256A>T, c.1551+1G>T, c.546G>T 를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적인 안티센스 올리고머 화합물이 가장 바람직하다.
돌연변이 위치 c.-32-3C>G 를 포함하는 위치를 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적인 안티센스 올리고머 화합물이 가장 바람직하다.
서열번호 1을 타겟팅하는 GAA 유전자의 게놈 핵산 서열에 상보적인 안티센스 올리고머 화합물이 가장 바람직하다. GCTCTGCACTCCCCTGCTGGAGCTTTTCTCGCCCTTCCTTCTGGCCCTCTCCCCA (서열번호 1).
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 8 내지 80 뉴클레오티드 길이, 9 내지 50 뉴클레오티드 길이, 10 내지 30 뉴클레오티드 길이, 12 내지 30 뉴클레오티드 길이, 15 내지 25 뉴클레오티드 길이 또는 약 20 뉴클레오티드 길이이다. 당업자는 이것이 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80 뉴클레오티드의 안티센스 화합물을 포함함을 이해할 것이다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 13 내지 80 뉴클레오티드를 포함한다. 당업자는 이것이 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80 뉴클레오티드의 안티센스 화합물을 구현함을 이해할 것이다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 13 내지 50 뉴클레오티드를 포함한다. 당업자는 이것이 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 뉴클레오티드의 안티센스 화합물을 구현함을 이해할 것이다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 13 내지 30 뉴클레오티드를 포함한다. 당업자는 이것이 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 뉴클레오티드의 안티센스 화합물을 구현함을 이해할 것이다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 20 내지 30 뉴클레오티드를 포함한다. 당업자는 이것이 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30 뉴클레오티드의 안티센스 화합물을 구현함을 이해할 것이다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 15 내지 25 뉴클레오티드를 포함한다. 당업자는 이것이 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25 뉴클레오티드의 안티센스 화합물을 구현함을 이해할 것이다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 20 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 19 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 18 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 17 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 16 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 15 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 14 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 13 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 화합물은 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 8개의 연속적 뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 9개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 10개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 11개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 12개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 13개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 14개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 15개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 16개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 17개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 18개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 19개의 연속적 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 청구된 안티센스 화합물 중 하나로부터의 적어도 20개의 연속적 뉴클레오티드.
올리고뉴클레오티드로부터의 임의의 나머지 뉴클레오티드는 Rnase H에 대한 저항성을 개선하는 올리고뉴클레오티드, 세포-타겟팅 서열, 세포 침투 서열, 마커 서열 또는 임의의 다른 서열일 수 있다.
본 발명에서 개시된 안티센스 화합물을 가진 당업자는 과도한 실험없이 추가의 안티센스 화합물을 확인할 수 있을 것이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드가 치료에 성공하기 위해서는, 올리고뉴클레오티드 화학이 적절한 세포 흡수를 허용해야 한다(Kurreck, J. (2003) Eur. J. Biochem. 270:1628-1644). 스플라이싱 올리고뉴클레오티드는 전통적으로 올리고뉴클레오티드를 RNA-유사가 되어 RNase H에 의한 절단에 저항성이 되도록 하는 균일한 변형을 포함하였으며, 이는 스플라이싱의 조절을 이루는데 중요하다. 스플라이싱의 조절을 위한 안티센스 화합물이 본 발명에서 제공된다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 RNA-유사 및 DNA-유사 화학의 영역을 가진 키메라이다. DAN-유사 화학 영역에도 불구하고, 키메라 화합물은 바람직하게는 RNase H-저항성이며 인 비트로 및 인 비보에서 타겟 mRNA의 스플라이싱을 효과적으로 조절한다. 다른 바람직한 실시형태에서, 개시된 안티센스 올리고머 화합물은 균일하게 변형된 올리고뉴클레오티드에 비교하여 향상된 세포 흡수 및 더 큰 약리학적 활성을 나타낸다.
타겟 mRNA의 스플라이스 부위에 또는 스플라이싱 억제자 서열에, 또는 스플라이싱 인핸서 서열에, 바람직하게는 스플라이싱 억제자 서열에 타겟팅되는 안티센스 올리고머 화합물이 본 명세서에 개시된다. 스플라이스 부위는 비정상 및 크립틱 스플라이스 부위를 포함한다.
당업자는 안티센스 화합물의 활성 제거없이 미스매치 포함이 가능함을 인지한다. 본 발명에서 제공되는 화합물은 따라서 안티센스 화합물의 타겟에의 염기 페어링을 파괴하는 최대 약 20% 뉴클레오티드를 함유할 수 있는 안티센스 화합물에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 화합물은 약 15% 이하, 더욱 바람직하게는 약 10 이하, 가장 바람직하게는 5% 이하의 미스매치를 함유하거나 미스매치를 함유하지 않는다. 나머지 뉴클레오티드는 하이브리드화를 파괴하지 않는다(예, 유니버셜 염기).
뉴클레오티드 친화성 변형의 통합은 비변형 화합물에 비하여 더 많은 수의 미스매치를 허용할 수 있음이 이해된다. 유사하게는, 소정의 올리고뉴클레오티드 서열은 다른 올리고뉴클레오티드 서열보다 미스매치에 더 관대할 수 있다. 당업자는 올리고뉴클레오티드 사이의, 또는 올리고뉴클레오티드와 타겟 핵산 사이의, 적절한 미스매치의 수를, 융점의 결정에 의해서와 같이 결정할 수 있다.
타겟 mRNA에의 하이브리드화는 조건에 의존함이 당업자에게 알려져 있다. "엄격한 하이브리드화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 올리고머 화합물이 그의 타겟 서열에는 하이브리드화하지만 다른 서열에는 최소로 하이브리드화할 조건을 말한다. 엄격한 조건은 서열-의존성이며 다른 환경에서 상이할 것이며, 올리고머 화합물이 타겟 서열에 하이브리드화하는 "엄격한 조건"은 올리고머 화합물의 특성과 조성 및 그들이 조사되는 분석에 의해 결정된다.
안티센스 화합물, 또는 그 일부는 서열번호 또는 특정 Isis 번호를 가진 화합물에 한정된 퍼센트 동일성을 가질 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 서열이 동일한 핵염기 페어링 능력을 가지면 그 서열은 본 명세서에 개시된 서열과 동일하다. 예를 들어, 개시된 서열에서 티미딘 대신 우라실을 함유하는 RNA는 그들 둘 모두가 아데닌과 페어링하므로 동일한 것으로 간주될 것이다. 이 동일성은 올리고머 화합물의 전체 길이에 걸치거나, 안티센스 화합물의 일부에서 일 수 있다(예, 서열 번호에 대한 올리고머 화합물의 퍼센트 동일성을 결정하기 위하여 27-머의 뉴클레오티드 1-20이 20-머에 비교될 수 있다). 안티센스 화합물이 본 명세서에 개시된 안티센스 화합물과 유사하게 기능하기 위하여 본 명세서에 개시된 것과 동일한 서열을 가질 필요는 없음을 당업자는 이해한다. 본 명세서에 교시된 안티센스 화합물의 짧은 버젼, 또는 본 명세서에 교시된 안티센스 화합물의 비동일 버젼 또한 고려된다. 비동일 버젼은 각 염기가 본 명세서에 개시된 안티센스 화합물과 동일한 페어링 활성을 갖지 않는 것들이다. 염기는 더 짧거나 또는 적어도 하나의 무염기(abasic) 부위를 가짐으로써 동일한 페어링 활성을 갖지 않는다. 대안적으로, 비동일 버젼은 다른 페어링 활성을 가진 다른 염기로 대체된 적어도 하나의 염기를 포함할 수 있다(예, G는 C, A, 또는 T에 의해 대체될 수 있다). 퍼센트 동일성은 서열번호 또는 그것이 비교되는 안티센스 화합물에 상응하는 동일한 염기 페어링을 갖는 염기의 수에 따라 계산된다. 비동일 염기는 서로 인접하거나, 올리고뉴클레오티드에 분산되거나, 또는 둘 다일 수 있다.
예를 들어, 20-머의 뉴클레오티드 2-17과 동일한 서열을 가진 16-머는 20-머와 80% 동일하다. 대안적으로, 20-머와 동일하지 않은 4개의 뉴클레오티드를 함유한 20-머는 또한 상기 20-머와 80% 동일하다. 18-머의 뉴클레오티드 1-14와 동일한 서열을 가진 14-머는 상기 18-머와 78% 동일하다. 그러한 계산은 당업자의 능력 이내이다.
퍼센트 동일성은 변형된 서열의 부분에 존재하는 원래 서열 내의 뉴클레오티드 퍼센트에 기초한다. 따라서, 20 핵염기 활성 타겟 분절의 상보체의 전체 서열을 포함하는 30 핵염기 안티센스 화합물은 상기 20 핵염기 활성 타겟 분절의 상보체와 100% 동일성 부분을 갖는 한편, 추가의 10 핵염기 부분을 더 포함할 것이다. 활성 타겟 분절의 상보체는 단일 부분을 구성할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 개시된 활성 타겟 분절의 상보체의 적어도 일부에 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 95% 동일하다.
활성 제거없이 안티센스 화합물의 길이를 증가 또는 감소시키고/시키거나 미스매치 염기를 도입하는 것이 가능함이 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7310, 1992, 참고로 본원에 통합됨)에서는, 13-25 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고머 화합물 시리즈를 그들이 타겟 RNA의 절단을 유도하는 능력에 대해 시험하였다. 안티센스 올리고머 화합물의 단부 근처에 8 또는 11 미스매치 염기를 가진 25 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고머 화합물은, 미스매치가 없는 안티센스 올리고머 화합물보다 적은 정도이긴 하지만, 타겟 mRNA의 특이적 절단을 지시할 수 있다. 유사하게, 타겟 특이적 절단은 1 또는 3 미스매치를 가진 것들을 비롯한 13 핵염기 안티센스 올리고머 화합물을 이용하여 이루어졌다. Maher와 Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988, 참고로 본원에 통합됨)은 탠덤(tandem) 14 핵염기 안티센스 올리고머 화합물 시리즈, 및 상기 탠덤 안티센스 올리고머 화합물 중 둘 또는 셋의 서열로 이루어진 28 및 42 핵염기 안티센스 올리고머 화합물을 각각 토끼 망상적혈구 분석에서 인간 DHFR의 번역 중지 능력에 대해 시험하였다. 세 개의 14 핵염기 안티센스 올리고머 화합물의 각각은 단독으로 28 또는 42 핵염기 안티센스 올리고머 화합물보다 더 온건한 수준이지만, 번역을 억제할 수 있었다. 안티센스 화합물이 원하는 활성을 유지한다면, 타겟에 대한 퍼센트 상보성 및 길이에서 변할 수 있음이 이해된다. 원하는 활성을 결정하는 방법이 본원에서 개시되며 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 안티센스 올리고머 화합물은 타겟 mRNA에 적어도 80% 상보성을, 더욱 바람직하게는 타겟 mRNA에 적어도 85% 상보성을, 더욱 바람직하게는 타겟 mRNA에 적어도 90% 상보성을, 더욱 바람직하게는 타겟 mRNA에 적어도 95% 상보성을, 더욱 바람직하게는 타겟 mRNA에 적어도 96% 상보성을, 더욱 바람직하게는 타겟 mRNA에 적어도 97% 상보성을, 더욱 바람직하게는 타겟 mRNA에 적어도 98% 상보성을, 더욱 바람직하게는 타겟 mRNA에 적어도 99% 상보성을, 더욱 바람직하게는 타겟 mRNA에 적어도 100% 상보성을 가진다.
당업계에 알려진 바와 같이, 뉴클레오시드는 염기-당 조합이다. 뉴클레오시드의 염기 부분은 정상적으로는 헤테로시클릭 염기이다(때로는 "핵염기" 또는 간단히 "염기"로 불림). 그러한 헤테로시클릭 염기의 두 가지 가장 일반적인 부류는 퓨린과 피리미딘이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 모이어티에 공유 결합된 포스페이트기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토퓨라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드의 경우, 포스페이트 기는 당의 2', 3' 또는 5' 하이드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 형성에서, 포스페이트 기는 인접한 뉴클레오시드를 서로 공유 결합시켜 선형 중합체 화합물을 형성한다. 올리고뉴클레오티드 내에서, 포스페이트 기는 일반적으로 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 백본을 형성하는 것으로 말한다. RNA 및 DNA의 정상적인 결합 또는 백본은 3' 에서 5'으로의 포스포디에스테르 결합이다. 그들의 활성을 바꾸기 위하여 올리고뉴클레오티드 내에 화학적 변형을 포함시키는 것이 종종 바람직하다. 화학적 변형은 예를 들어, 그의 타겟 RNA에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키거나, 뉴클레아제 저항성을 증가시키거나, 및/또는 올리고뉴클레오티드의 약동학을 변화시킴으로써, 올리고뉴클레오티드 활성을 변화시킬 수 있다. 그의 타겟에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성을 증가시키는 화학의 이용은 더 짧은 올리고뉴클레오티드 화합물의 이용을 허용할 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 안티센스 화합물은 또한 변형된 당 모이어티를 가진 하나 이상의 뉴클레오시드를 함유할 수 있다. 뉴클레오시드의 푸라노실 당 고리는 치환기의 추가, 같은 자리가 아닌(non-geminal) 두 개의 고리 원자의 가교에 의해 바이시클릭 핵산(BNA)를 형성하는 것 및 4'-위치에서 고리 산소를 위해 -S-, -N(R)- 또는 -C(R1)(R2)과 같은 원자 또는 기의 치환을 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 방식으로 변형될 수 있다. 변형된 당 모이어티는 알려져 있으며 그의 타겟에 대한 안티센스 화합물의 치환성을 변화, 전형적으로는 증가시키기 위해 및/또는 뉴클레아제 저항성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 변형된 당의 대표적 리스트는 LNA 및 ENA (4'-(CH2)2-O-2' 가교)를 비롯한 바이시클릭 변형 당(BNA's); 및 치환된 당, 특히 2'-F, 2'-OCH2 또는 2'-O(CH2)2-OCH3 치환기를 가진 2'-치환된 당을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당은 또한 다른 것들 중에서 당 모방 기로 대체될 수 있다. 변형된 당을 제조하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 적합한 화합물은 2' 위치에서 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬 중 하나를 포함할 수 있으며, 여기서 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있다. O((CH2)nO)mCH3, O(CH2)nOCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 및 O(CH2)nON((CH2)nCH3)2 또한 적합하며, 여기서 n과 m은 1 내지 약 10이다. 다른 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 다음 중 하나를 포함한다: C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알케닐, 알키닐, 알카릴, 아르알킬, O-알카릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리-알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 인터킬레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 가진 다른 치환기. 한 가지 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로도 알려짐) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504), 즉, 알콕시알콕시기를 포함한다. 추가 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, 2'-DMAOE로도 알려진 O(CH2)2ON(CH3)2 기, 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시(2'-O-디메틸-아미노-에톡시-에틸 또는 2'-DMAEOE로도 알려짐), 즉, 2'-O-(CH2)2-O-(CH2)2-N(CH3)2를 포함한다. 다른 변형은 2'-메톡시 (2'-O-CH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2), 2'-알릴 (2'-CH2-CH-CH2), 2'-O-알릴 (2'-O-CH2-CH-CH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 2'-변형은 아라비노 (상부) 위치 또는 리보 (하부) 위치에 있을 수 있다. 한 가지 2'-아라비노 변형은 2'-F이다. 유사한 변형은 또한 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상의 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드 내의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 이루어질 수 있다. 안티센스 화합물은 또한 펜토푸라노실 당의 자리에 시클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 그러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 4,981,957호; 5,118,800호; 5,319,080호; 5,359,044호; 5,393,878호; 5,446,137호; 5,466,786호; 5,514,785호; 5,519,134호; 5,567,811호; 5,576,427호; 5,591,722호; 5,597,909호; 5,610,300호; 5,627,053호; 5,639,873호; 5,646,265호; 5,658,873호; 5,670,633호; 5,792,747호; 5,700,920호; 및, 6,147,200호를 포함한다.
본 발명의 일 양태에서, 올리고머 화합물은 3'-엔도 당 형태를 유도하기 위하여 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오시드는 원하는 3'-엔도 당 형태를 유도하기 위하여 헤테로시클릭 염기, 당 모이어티 또는 둘 모두의 변형을 포함할 수 있다. 이들 변형된 뉴클레오시드는 원하는 3'-엔도 형태 기하학을 유지하면서 올리고머 화합물의 구체적 특성이 향상될 수 있도록 RNA-유사 뉴클레오시드를 모방하기 위해 사용된다.
본 발명에서 RNA 유형 이중쇄(A 형태 헬릭스, 주로 3'-엔도)가 선호되며 이는 그들이 RNase H 저항성이기 때문이다. 보다 안정한 3'-엔도 뉴클레오시드를 이용하여 향상되는 특성은 단백질 결합, 단백질 오프-레이트(off-rate), 흡수 및 소거의 변형을 통한 약동학적 특성의 조절; 뉴클레아제 안정성 및 화학적 안정성의 조절; 올리고머의 결합 친화성 및 특이성의 조절(상보성 서열에 대해서 뿐만 아니라 효소에 대한 친화성 및 특이성); 및 RNA 절단의 효능 증가를 포함하며 이에 제한되지 않는다.
뉴클레오시드 형태는 펜토푸라노실 당의 2', 3' 또는 4'-위치에서의 치환을 비롯한 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 음전성 치환체는 일반적으로 축 위치를 선호하는 반면, 입체적으로 요구하는 치환기는 일반적으로 수평 위치를 선호한다(Principles of Nucleic Acid Structure, Wolfgang Sanger, 1984, Springer-Verlag). 3'-엔도 형태를 선호하도록 2' 위치를 변형하는 것은 인지 요소로서 2'-OH를 유지하면서 이루어질 수 있다(Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713. Harry-O'kuru et al., J. Org. Chem., (1997), 62(6), 1754-1759 및 Tang et al., J. Org. Chem. (1999), 64, 747-754.). 대안적으로, 3'-엔도 형태에 대한 선호는 축 위치에서 음전성 불소 원자를 위치시키는 3'-엔도 형태를 채택하는 2' 데옥시-2'F-뉴클레오시드에 의해 예시되는 바처럼 2'-OH의 결실에 의해 이루어질 수 있다(Kawasaki et al., J. Med. Chem. (1993), 36, 831-841). 생성되는 이중쇄에 A-형태 형태 특성(3'-엔도)을 부여하는, 본 발명에 따라 처리할 수 있는 대표적인 2'-치환기는 2'-O-알킬, 2'-O-치환된 알킬 및 2'-플루오로 치환기를 포함한다. 다른 적합한 치환기는 다양한 알킬 및 아릴 에테르 및 티오에테르, 아민 및 모노알킬 및 디알킬 치환된 아민이다.
리보스 고리의 다른 변형, 예를 들어, 4'-F 변형된 뉴클레오시드를 제공하기 위한 4'-위치에서의 치환(Guillerm et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (1995), 5, 1455-1460 및 Owen et al., J. Org. Chem. (1976), 41, 3010-3017), 또는 예를 들어, 메타노카르바 뉴클레오시드 유사체를 생성하기 위한 변형(Jacobson et al., J. Med. Chem. Lett. (2000), 43, 2196-2203 및 Lee et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters (2001), 11, 1333-1337)은 또한 3'-엔도 형태에 대한 선호를 유도한다. 유사하게, 하나 이상의 뉴클레오시드는 형태가 C3'-엔도 유형 형태, 즉, 잠긴 핵산(LNA, Singh et al, Chem. Commun. (1998), 4, 455-456), 및 에틸렌 가교된 핵산 (ENA(TM), Morita et al, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters (2002), 12, 73-76)으로 고정되도록 하는 방식으로 변형될 수 있다.
당의 바람직한 변형은 2'-O-메틸 2'-O-메톡시에틸, 2'-플루오로, 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 2'-디메틸아미노에톡시에톡시, 2'-구아니디늄, 2'-O-구아니디늄 에틸, 2'-카르바메이트, 2'-아미노옥시, 2'-아세트아미도 및 잠긴 핵산으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 한 가지 바람직한 실시형태에서, 당 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-O-메톡시에틸이다.
올리고머 화합물은 또한 핵염기(종종 당업계에서 헤테로시클릭 염기 또는 간단히 "염기"로 불림) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "비변형" 또는 "천연" 뉴클레오티드는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)를 포함한다. "치환"은 비변형 또는 천연 염기가 다른 비변형 또는 천연 염기로 대체되는 것이다. "변형" 뉴클레오티드는 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 6-메틸 및 아데닌과 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-프로필 및 아데닌 및 구아닌의 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌과 같은 다른 합성 및 천연 뉴클레오티드를 의미한다. 추가 변형 뉴클레오티드는 트리시클릭 피리미딘, 예를 들어, 페녹사진 시티딘 (1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 시티딘 (1H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프(clamp), 예를 들어, 치환된 페녹사진 시티딘(예, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도(5,4-b)(1,4)벤족사진-2(3H)-온), 카르바졸 시티딘 (2H-피리미도(4,5-b)인돌-2-온), 피리도인돌 시티딘 (H-피리도(3',2':4,5)피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온)을 포함한다. 변형 뉴클레오티드는 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로사이클로 치환된 것들, 예를 들어, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈을 포함할 수 있다. 추가의 뉴클레오티드는 미국 특허 3,687,808호에 개시된 것들, The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 개시된 것들, Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613에 개시된 것들, 및 Sanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993에 개시된 것들을 포함한다. 이들 뉴클레오티드 중 일부는 본 발명의 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데 적합한 것으로 당업자에게 알려져 있다. 이들은 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 비롯한, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃만큼 핵산 이중쇄 안정성을 증가시키는 것으로 나타났으며, 현재 적합한 염기 치환이며, 더욱 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때 그러하다. 염기의 변형은 핵산 서열에서 치환을 생성하기 위한 그러한 화학적 변형을 수반하지 않는 것으로 이해된다.
다른 변형 뉴클레오티드 뿐만 아니라 상기 언급된 변형 뉴클레오티드의 일부의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 상기 언급한 미국 특허 3,687,808호, 및 미국 특허 4,845,205호; 5,130,302호; 5,134,066호; 5,175,273호; 5,367,066호; 5,432,272호; 5,457,187호; 5,459,255호; 5,484,908호; 5,502,177호; 5,525,711호; 5,552,540호; 5,587,469호; 5,594,121호, 5,596,091호; 5,614,617호; 5,645,985호; 5,830,653호; 5,763,588호; 6,005,096호; 5,681,941호; 및 5,750,692호를 포함하지만 이제 제한되지 않는다.
본 발명의 올리고머 화합물은 또한 자연-발생 헤테로시클릭 염기 모이어티 중 하나 이상 대신에 폴리시클릭 헤테로시클릭 화합물을 포함할 수 있다. 많은 트리시클릭 헤테로시클릭 화합물이 이전에 보고되었다. 이들 화합물은 타겟 쇄에 대한 변형된 쇄의 결합 특성을 증가시키기 위하여 안티센스 분야에서 일상적으로 사용된다. 가장 연구된 변형은 구아노신에 타겟팅되며 따라서 그들은 G-클램프 또는 시티딘 유사체로 명명되었다. 두번째 쇄에서 구아노신과 3 수소 결합을 만드는 대표적인 시토신 유사체는 1,3-디아자페녹사진-2-온 (Kurchavov, et al., Nucleosides and Nucleotides, 1997, 16, 1837-1846), 1,3-디아자페노티아진-2-온, (Lin, K.-Y.; Jones, R. J.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 3873-3874) 및 6,7,8,9-테트라플루오로-1,3-디아자페녹사진-2-온 (Wang, J.; Lin, K.-Y., Matteucci, M. Tetrahedron Lett. 1998, 39, 8385-8388)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드에 통합된 이들 염기 변형은 상보성 구아닌과 하이브리드화하는 것으로 나타났으며 구아닌은 또한 아데닌과 하이브리드화하고 확장된 적층 상호작용에 의해 나선 열 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다. (미국 특허 공개 20030207804호 및 20030175906호 참고).
시토신 유사체/치환체가 견고한 1,3-디아자페녹사진-2-온 스캐폴드에 부착된 아미노에톡시 모이어티를 가질 경우 추가의 헬릭스-안정화 특성이 관찰되었다(Lin, K.-Y.; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532). 결합 연구는 단일 통합이 모델 올리고뉴클레오티드의 그의 상보적 타겟 DNA 또는 RNA에의 결합 친화성을 향상시켜, 5-메틸 시토신에 비하여 최대 18 ℃의 △Tm을 가질 수 있으며, 이것은 단일 변형에 있어서 높은 친화성 향상임을 입증하였다. 한편, 헬릭스 안정성에서의 이득은 올리고뉴클레오티드의 특이성을 손상시키지 않는다.
본 발명에서 사용하기 적합한, 추가의 트리시클릭 헤테로시클릭 화합물 및 그들을 이용하는 방법은 미국 특허 6,028,183호 및 6,007,992호에 개시된다.
그들의 손상되지 않은 서열 특이성과 함께 페녹사진 유도체의 향상된 결합 친화성은 그들을 보다 강력한 안티센스-기반 약물의 개발을 위한 소중한 핵염기 유사체로 만든다. 사실상, 페녹사진 치환을 함유한 헵타뉴클레오티드가 RNase H를 활성화시킬 수 있으며, 세포 흡수를 향상시키고 증가된 안티센스 활성을 나타낼 수 있음을 입증하는 인 비트로 실험으로부터 전도있는 데이터가 도출되었다 (Lin, K-Y; Matteucci, M. J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 8531-8532). 단일 치환이 20머 2'-데옥시포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 인 비트로 효능을 상당히 개선하는 것으로 나타난 것처럼, 활성 향상은 G-클램프의 경우에 더욱 더 컸다(Flanagan, W. M.; Wolf, J. J.; Olson, P.; Grant, D.; Lin, K.-Y.; Wagner, R. W.; Matteucci, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96, 3513-3518).
헤테로시클릭 염기로서 유용한 추가의 변형 폴리시클릭 헤테로시클릭 화합물은 상기 언급한 미국 특허 3,687,808호, 및 미국 특허 4,845,205호; 5,130,302호; 5,134,066호; 5,175,273호; 5,367,066호; 5,432,272호; 5,434,257호; 5,457,187호; 5,459,255호; 5,484,908호; 5,502,177호; 5,525,711호; 5,552,540호; 5,587,469호; 5,594,121호, 5,596,091호; 5,614,617호; 5,645,985호; 5,646,269호; 5,750,692호; 5,830,653호; 5,763,588호; 6,005,096호; 및 5,681,941호, 및 미국 특허 공개 20030158403호에 개시되지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 개시된 화합물은 뉴클레오시드 또는 다르게는 변형된 단량체 단위를 함께 연결하여 안티센스 화합물을 형성하는 뉴클레오시드간 연결기를 포함할 수 있다. 두 가지 주요 뉴클레오시드간 연결기 부류는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 대표적인 인 함유 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로티오에이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대표적인 비-인 함유 뉴클레오시드간 연결기는 메틸렌메틸이미노 (-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오디에스테르(-O-C(O)-S-), 티오노카르바메이트 (-O-C(O)(NH)-S-); 실록산 (-O-Si(H)2-O-); 및 N,N'-디메틸히드라진 (-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 천연 포스포디에스테르 연결에 비하여, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 안티센스 화합물의 뉴클레아제 저항성을 변화, 전형적으로 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 키랄 원자를 가진 뉴클레오시드간 연결은 라세미, 키랄, 또는 혼합물로서 제조될 수 있다. 대표적인 키랄 뉴클레오시드간 연결은 알킬포스포네이트 및 포스포로티오에이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 인-함유 및 비-인-함유 연결의 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
적합한 변형된 뉴클레오시드간 연결기는 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트, 5'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 비롯한 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 비롯한 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 포스포노아세테이트 및 티오포스포노아세테이트(Sheehan et al., Nucleic Acids Research, 2003, 31(14), 4109-4118 및 Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 940-950 참조), 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 셀레노포스페이트 및 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 하나 이상의 뉴클레오티드간 연결이 3' 대 3', 5' 대 5' 또는 2' 대 2' 연결인 역전된 극성을 가진 것들이다. 역전된 극성을 가진 올리고뉴클레오티드는 가장 3'의 뉴클레오티드간 연결에서 단일 3' 대 3' 연결, 즉, 무염기일 수 있는(핵염기가 없거나 그 대신 하이드록실기를 가짐) 단일 역전 뉴클레오시드 잔기를 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태 또한 포함된다.
N3'-P5'-포스포르아미데이트는 상보적 RNA 쇄에 대한 높은 친화성 및 뉴클레아제 저항성을 나타내는 것으로 보고되었다(Gryaznov et al., J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 3143-3144). N3'-P5'-포스포르아미데이트는 c-myc 유전자의 발현을 특이적으로 하향 조절하기 위하여 연구되어 인 비보에서 일부 성공하였다(Skorski et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997, 94, 3966-3971; 및 Faira et al., Nat. Biotechnol., 2001, 19, 40-44).
상기 인-함유 연결의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 3,687,808호; 4,469,863호; 4,476,301호; 5,023,243호; 5,177,196호; 5,188,897호; 5,264,423호; 5,276,019호; 5,278,302호; 5,286,717호; 5,321,131호; 5,399,676호; 5,405,939호; 5,453,496호; 5,455,233호; 5,466,677호; 5,476,925호; 5,519,126호; 5,536,821호; 5,541,306호; 5,550,111호; 5,563,253호; 5,571,799호; 5,587,361호; 5,194,599호; 5,565,555호; 5,527,899호; 5,721,218호; 5,672,697호 및 5,625,050호를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일부 실시형태에서, 올리고머 화합물은 하나 이상의 포스포로티오에이트 및/또는 헤테로원자 뉴클레오시드간 연결, 특히 -CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2- (메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 알려짐), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2- (여기서, 천연 포스포디에스테르 뉴클레오티드간 연결은 -O-P(-O)(OH)-O-CH2-로 나타내짐)를 가질 수 있다. MMI 유형 뉴클레오시드간 연결은 상기 언급한 미국 특허 5,489,677호에 개시된다. 아미드 뉴클레오시드간 연결은 상기 언급한 미국 특허 5,602,240호에 개시된다.
그 안에 인 원자를 포함하지 않는 일부 올리고뉴클레오티드 백본은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성되는 백본을 갖는다. 이들은 모르폴리노 연결(뉴클레오시드의 당 부분으로부터의 부분에 형성됨); 실록산 백본; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 리보아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 설파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 설포네이트 및 설폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 가진 다른 것들을 가진 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 5,034,506호; 5,166,315호; 5,185,444호; 5,214,134호; 5,216,141호; 5,235,033호; 5,264,562호; 5,264,564호; 5,405,938호; 5,434,257호; 5,466,677호; 5,470,967호; 5,489,677호; 5,541,307호; 5,561,225호; 5,596,086호; 5,602,240호; 5,610,289호; 5,602,240호; 5,608,046호; 5,610,289호; 5,618,704호; 5,623,070호; 5,663,312호; 5,633,360호; 5,677,437호; 5,792,608호; 5,646,269호 및 5,677,439호를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 또는 포스포로디아미데이트이다.
선택된 응용에서의 활성과 같은 그러나 이에 제한되지 않는 특성을 향상시키기 위하여 하나 이상의 단량체 서브유닛(뉴클레오시드가 적합함) 및/또는 뉴클레오시드간 연결의 다수 부위에서 본 발명의 올리고머 화합물 중 하나 이상에 다수의 변형이 이루어질 수 있음이 또한 의도된다.
본 발명에 따라 처리될 수 있는 많은 변형 뉴클레오시드의 합성은 알려져 있다(예를 들어, Chemistry of Nucleosides and Nucleotides Vol 1-3, ed. Leroy B. Townsend, 1988, Plenum press 참고). 변형 뉴클레오시드 및 그들의 올리고머의 형태는 분자 동력학 계산, 핵자기공명 분광법 및 CD 측정과 같은 당업자에게 일상적인 다양한 방법에 의해 추정할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 모르폴리노 포스포로티오에이트 또는 포스포로디아미데이트 모르폴리노이다.
올리고머 화합물의 다른 군은 올리고뉴클레오티드 모방체를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "모방체"는 당, 핵염기, 및/또는 뉴클레오시드간 연결에 대해 치환된 기를 말한다. 일반적으로, 모방체는 당 또는 당-뉴클레오시드간 연결 조합 대신 사용되며, 핵염기는 선택된 타겟에의 하이브리드화를 위해 유지된다. 당 모방체의 대표적인 예는 시클로헥세닐 또는 모르폴리노를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당-뉴클레오시드간 연결 조합을 위한 모방체의 대표적인 예는 펩티드 핵산(PNA) 및 비하전 어키랄(achiral) 연결에 의해 연결된 모르폴리노기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에 모방체는 핵염기 대신 사용된다. 대표적인 핵염기 모방체는 잘 알려져 있으며 트리시클릭 페녹사진 유사체 및 유니버셜 염기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다(Berger et al., Nuc Acid Res. 2000, 28:2911-14, 참고로 본원에 통합됨). 당, 뉴클레오시드 및 핵염기 모방체의 합성 방법은 당업자에게 알려져 있다. 헤테로시클릭 염기 모이어티 또는 변형 헤테로시클릭 염기 모이어티는 바람직하게는 적절한 타겟 핵산과의 하이브리드화를 위해 유지된다.
본 명세서에 개시된 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 함유하여 거울상 이성질체, 부분입체이성질체 및 아미노산 등을 위해서와 같이 절대 입체화학의 면에서 (D) 또는 (L)로서 또는 (R) 또는 (S), [알파] 또는 [베타]로서, 정의될 수 있는 다른 입체이성질체 형태를 형성할 수 있다. 본 명세서는 모든 그러한 가능한 이성질체 및 그들의 라세미 형태 및 광학적으로 순수한 형태를 포함하는 것을 의도한다.
우수한 하이브리드화 특성을 갖는 것으로 나타난 한 가지 그러한 올리고머 화합물인 올리고뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산(PNA)로 불린다 (Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500). PNA는 유리한 하이브리드화 특성, 높은 생물학적 안정성을 가지며 정전기적으로 중성 분자이다. PNA 화합물은 트랜스제닉 마우스 모델에서 비정상 스플라이싱을 교정하기 위해 사용되었다(Sazani et al., Nat. Biotechnol., 2002, 20, 1228-1233). PNA 올리고머 화합물에서는, 올리고뉴클레오티드의 당-백본이 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 뉴클레오티드는 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접 또는 간접적으로 결합된다. PNA 올리고머 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국 특허 5,539,082호; 5,714,331호; 및 5,719,262호를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. PNA 화합물은 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)(미국 캘리포니아주 포스터 시티)로부터 구입가능하다. 기본 PNA 백본에 대한 많은 변형이 알려져 있으며; 특히 하나 또는 두 말단에 접합된 하나 이상의 아미노산을 가진 PNA 화합물이 유용하다. 예를 들어, 1-8 리신 또는 아르기닌 잔기는 PNA 분자의 단부에 접합될 경우 유용하다. 폴리아르기닌 테일이 세포 침투 향상에 적합할 수 있다.
연구된 다른 부류의 올리고뉴클레오티드 모방체는 모르폴리노 고리에 부착된 헤테로시클릭 염기를 가진 연결된 모르폴리노 단위(모르폴리노 핵산)에 기초한다. 모르폴리노 핵산에서 모르폴리노 단량체 단위를 연결하는 많은 연결 기가 보고되었다. 한 부류의 연결기는 비이온성 올리고머 화합물을 제공하기 위하여 선택되었다. 모르폴리노-기반 올리고머 화합물은 세포 단백질과 원치않는 상호작용을 형성할 가능성이 적은 올리고-뉴클레오티드의 비이온성 모방체이다 (Dwaine A. Braasch and David R. Corey, Biochemistry, 2002, 41(14), 4503-4510). 모르폴리노-기반 올리고머 화합물은 제브라피쉬 배아에서 연구되었다(Genesis, volume 30, issue 3, 2001 및 Heasman, J., Dev. Biol., 2002, 243, 209-214 참고). 모르폴리노-기반 올리고머 화합물의 추가 연구 또한 보고되었다(Nasevicius et al., Nat. Genet., 2000, 26, 216-220; 및 Lacerra et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 9591-9596). 모르폴리노-기반 올리고머 화합물은 미국 특허 5,034,506호에 개시된다. 단량체 서브유닛을 연결하는 다양한 상이한 연결기를 가진 모르폴리노 부류의 올리고머 화합물이 제조되었다. 연결기는 키랄에서 어키랄까지 그리고 하전된 것에서 중성까지 다양할 수 있다. 미국 특허 5,166,315호는 -O-P(-O)(N(CH3)2)-O-를 포함하는 연결을 개시하고; 미국 특허 5,034,506호는 어키랄 모르폴리노간 연결을 개시하며; 미국 특허 5,185,444호는 인 함유 키랄 모르폴리노간 연결을 개시한다.
추가 부류의 올리고뉴클레오티드 모방체는 시클로헥센 핵산(CeNA)으로 불린다. CeNA 올리고뉴클레오티드에서, DNA 또는 RNA에 정상적으로 존재하는 푸라노즈 고리는 시클로헥세닐 고리로 대체된다. CeNA DMT 보호된 포스포르아미다이트 단량체가 제조되어 고전적 포스포르아미다이트 화학을 따른 올리고머 화합물 합성을 위해 사용되었다. 완전히 변형된 CeNA 올리고머 화합물 및 CeNA로 변형된 특정 위치를 가진 올리고뉴클레오티드가 제조되어 연구되었다(Wang et al., J. Am. Chem. Soc., 2000, 122, 8595-8602). 일반적으로 DNA 쇄 내로 CeNA 단량체를 통합시키면 DNA/RNA 하이브리드의 안정성을 증가시킨다. CeNA 올리고아데닐레이트는 천연 복합체와 유사한 안정성을 가지고, RNA 및 DNA 상보체와의 복합체를 형성하였다. 천연 핵산 구조 내로 CeNA 구조를 통합하는 연구는 용이한 형태적 적응으로 진행하는 것으로 NMR 및 원이색성에 의해 나타났다. 더욱이 RNA를 타겟팅하는 서열 내로 CeNA를 통합시키는 것은 혈청에 대해 안정하였으며 이.콜라이 RNase H를 활성화시킬 수 있어 타겟 RNA 쇄의 절단을 야기하였다.
추가 변형은 리보실 당 고리의 2'-하이드록실기가 당 고리의 4' 탄소 원자에 연결되어 2'-C,4'-C-옥시메틸렌 연결을 형성하여 바이시클릭 당 모이어티를 형성하는 "잠긴 핵산"(LNA)과 같은 바이시클릭 당 모이어티를 포함한다 (Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001, 8 1-7; 및 Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243에서 리뷰됨; 또한 미국 특허 6,268,490호 및 6,670,461호 참고). 연결은 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 가교하는 메틸렌(-CH2-) 기일 수 있으며, 이 경우 용어 LNA는 바이시클릭 부분을 위해 사용되며; 이 위치에 에틸렌 기의 경우에는, 용어 ENA(TM)이 사용된다(Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; ENA(TM): Morita et al., Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2211-2226). LNA 및 다른 바이시클릭 당 유사체는 상보성 DNA 및 RNA와 매우 높은 이중쇄 열 안정성(Tm=+3 내지 +10℃), 3'-엑소뉴클레아제 분해에 대한 안정성 및 우수한 용해도 특성을 나타낸다. LNA는 프로리고(ProLigo)(프랑스 파리 및 미국 콜로라도 보울더)로부터 구입가능하다.
또한 연구된 LNA의 이성체는 3'-엑소뉴클레아제에 대해 우수한 안정성을 갖는 것으로 나타난 알파-L-LNA이다. 알파-L-LNA는 강력한 안티센스 활성을 나타낸 안티센스 갭머(gapmer) 및 키메라 내로 통합되었다(Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
제조되고 연구된 다른 유사한 바이시클릭 당 모이어티는 단일 메틸렌기를 통해 3'-하이드록실기에서 당 고리의 4' 탄소 원자로 가는 가교를 가져서 3'-C,4'-C-옥시메틸렌 연결을 형성한다(미국 특허 6,043,060호 참고).
LNA는 대단히 안정한 LNA:LNA 이중쇄를 형성하는 것으로 나타났다(Koshkin et al., J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 13252-13253). LNA:LNA 하이브리드화는 가장 열적으로 안정한 핵산 유형 이중쇄 시스템인 것으로 나타났으며, LNA의 RNA-모방 특징이 이중쇄 수준에서 확립되었다. 3 LNA 단량체의 도입(T 또는 A)은 DNA 상보체에 대한 융점을 상당히 증가시켰다(Tm=+15/+11℃). LNA-매개 하이브리드화의 보편성은 대단히 안정한 LNA:LNA 이중쇄의 형성에 의해 강조되었다. LNA의 RNA-모방은 단량체의 N-유형 형태 제한 및 LNA:RNA 이중쇄의 이차 구조와 관련하여 반영되었다.
LNA는 또한 높은 열 친화성을 가진, 상보성 DNA, RNA 또는 LNA와 이중쇄를 형성한다. 원이색성(CD) 스펙트럼은 완전히 변형된 LNA를 포함하는 이중쇄(특히, LNA:RNA)는 구조적으로 A-형태 RNA:RNA 이중쇄와 유사함을 보여준다. LNA:DNA 이중쇄의 핵자기공명(NMR) 검사는 LNA 단량체의 3'-엔도 형태를 확인하였다. 이중쇄 DNA의 인지 또한 입증되어 LNA에 의한 쇄 침입을 제안하였다. 미스매치된 서열의 연구는 LNA가 왓슨-크릭 염기 페어링 규칙을 따르며 상응하는 비변형 기준 쇄에 비하여 일반적으로 개선된 선택성을 가짐을 보여준다. DNA-LNA 키메라는 루시퍼라제 mRNA 내의 다양한 영역(5'-비번역 영역, 개시 코돈의 영역 또는 코딩 영역)에 타겟팅될 때 유전자 발현을 효율적으로 억제하는 것으로 나타났다 (Braasch et al., Nucleic Acids Research, 2002, 30, 5160-5167).
LNA를 함유한 강력하고 비독성인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 개시되었다(Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sc U.S.A., 2000, 97, 5633-5638). 저자들은 LNA가 여러가지 바람직한 특성을 부여함을 입증하였다. LNA/DNA 공중합체는 혈액 혈청과 세포 추출물에서 쉽게 분해되지 않았다. LNA/DNA 공중합체는 살아있는 쥐의 뇌에서의 G-단백질-결합된 수용체 시그널링 및 에스케리키아 콜라이에서의 리포터 유전자의 검출만큼 이질적인 분석 시스템들에서 강력한 안티센스 활성을 나타냈다. 살아있는 인간 유방암 세포 내로 LNA의 리포펙틴-매개된 효율적인 전달 또한 이루어졌다. LNA에 관련된 추가의 성공적인 인 비보 연구는 독성없이 쥐 델타 오피오이드 수용체의 넉다운을 보여줬으며(Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2000, 97, 5633-5638) 다른 연구에서는 RNA 폴리머라제 II의 큰 서브유닛의 번역 차단을 보여줬다(Fluiter et al., Nucleic Acids Res., 2003, 31, 953-962).
LNA 단량체 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민 및 우라실의 합성 및 제조 및 그들의 올리고머화, 및 핵산 인식 특성이 개시되었다(Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). LNA 및 그 제조 또한 WO 98/39352호 및 WO 99/14226호에 개시되었다.
LNA 유사체인, 포스포로티오에이트-LNA 및 2'-티오-LNA가 또한 제조되었다(Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). 핵산 폴리머라제를 위한 기질로서 올리고데옥시리보뉴클레오티드 이중쇄를 함유한 잠긴 뉴클레오시드 유사체의 제조 또한 개시되었다(Wengel et al., WO 99/14226호). 또한, 새로운 형태적으로 제한된 고친화성 올리고뉴클레오티드 유사체인 2'-아미노-LNA의 합성이 개시되었다(Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-LNA가 제조되었으며 그들의 상보성 RNA 및 DNA와의 이중쇄의 열 안정성이 이전에 보고되었다.
제조되고 연구된 다른 올리고뉴클레오티드 모방체는 트레오즈 핵산이다. 이 올리고뉴클레오티드 모방체는 리보스 뉴클레오시드 대신 트레오즈 뉴클레오시드에 기반한다. (3',2')-알파-L-트레오즈 핵산(TNA)에의 초기의 관심은 TNA를 복사할 DNA 폴리머라제가 존재하는지 여부에 대한 의문에 대한 것이었다. 소정의 DNA 폴리머라제는 제한된 길이의 TNA 주형을 복사할 수 있는 것으로 밝혀졌다(Chemical and Engineering News, 2003, 81, 9에 보고됨). 다른 연구에서는 TNA가 상보성 DNA, RNA 및 TNA 올리고뉴클레오티드와 반평행 왓슨-크릭 염기 페어링을 할 수 있는 것으로 결정되었다(Chaput et al., J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 856-857).
일 연구에서, (3',2')-알파-L-트레오즈 핵산을 제조하고 2' 및 3' 아미데이트 유사체와 비교하였다(Wu et al., Organic Letters, 2002, 4(8), 1279-1282). 아미데이트 유사체는 RNA/DNA의 강도와 견줄만한 강도로 RNA 및 DNA에 결합하는 것으로 나타났다.
바이시클릭 및 트리시클릭 뉴클레오시드 유사체를 포함하도록 추가의 올리고뉴클레오티드 모방체가 제조되었다(Steffens et al., Helv. Chim. Acta, 1997, 80, 2426-2439; Steffens et al., J. Am. Chem. Soc., 1999, 121, 3249-3255; Renneberg et al., J. Am. Chem. Soc., 2002, 124, 5993-6002; 및 Renneberg et al., Nucleic acids res., 2002, 30, 2751-2757 참고). 이들 변형된 뉴클레오시드 유사체는 포스포르아미다이트 접근법을 이용하여 올리고머화되었으며 트리시클릭 뉴클레오시드 유사체를 함유한 생성된 올리고머 화합물은 DNA, RNA 및 그 자체에 하이브리드화될 경우 증가된 열 안정성(Tm)을 나타냈다. 바이시클릭 뉴클레오시드 유사체를 함유한 올리고머 화합물은 DNA 이중쇄의 열 안정성에 근접한 열 안정성을 나타냈다.
다른 부류의 올리고뉴클레오티드 모방체는 백본에 인 기를 포함하는 포스포노모노에스테르 핵산으로 불린다. 이 부류의 올리고뉴클레오티드 모방체는 유전자 발현 억제 분야에서(안티센스 올리고뉴클레오티드, 센스 올리고뉴클레오티드 및 삼중쇄-형성 올리고뉴클레오티드), 핵산의 검출을 위한 프로브로서 및 분자 생물학에서 사용하기 위한 보조제로서 유용한 물리적 및 생물학적 그리고 약리학적 특성을 가지는 것으로 보고된다. 시클로부틸 고리가 자연 발생 푸라노실 고리를 대체하는, 본 발명에 따라 처리가능한 추가의 올리고뉴클레오티드 모방체가 제조되었다.
본 발명의 올리고머 화합물의 다른 변형은 올리고머 화합물의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 향상시키는 것과 같은, 올리고머 화합물의 특성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 올리고머 화합물에 화학적으로 연결하는 것을 포함한다. 이들 모이어티 또는 접합체는 일차 또는 이차 하이드록실기와 같은 기능기에 공유 결합된 접합체 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 접합체 기는 인터킬레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약력학적 특성을 향상시키는 기 및 올리고머의 약동학적 특성을 향상시키는 기를 포함한다. 전형적인 접합체 기는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오르세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 약력학적 특성을 향상시키는 기는 흡수를 개선하고, 분해에 대한 저항성을 향상시키고, 및/또는 타겟 핵산과의 서열-특이적 하이브리드화를 강화하는 기를 포함한다. 본 발명의 내용에서, 약동학적 특성을 향상시키는 기는 본 발명의 화합물의 흡수, 분포, 대사 또는 배출을 개선하는 기를 포함한다. 대표적인 접합체 기는 1992년 10월 23일에 출원된 국제특허출원 PCT/US92/09196호 및 미국 특허 6,287,860호 및 6,762,169호에 개시된다.
접합체 모이어티는 콜레스테롤 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 예를 들어, 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 올리고머 화합물은 또한 약물 물질, 예를 들어, 아스피린, 와파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실살코신, 2,3,5-트리이오도벤조산, 플루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 설파 약물, 항당뇨제, 항균제 또는 항생제에 접합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 그들의 제조는 미국 특허 6,656,730에 개시된다.
그러한 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 미국특허 4,828,979호; 4,948,882호; 5,218,105호; 5,525,465호; 5,541,313호; 5,545,730호; 5,552,538호; 5,578,717호, 5,580,731호; 5,580,731호; 5,591,584호; 5,109,124호; 5,118,802호; 5,138,045호; 5,414,077호; 5,486,603호; 5,512,439호; 5,578,718호; 5,608,046호; 4,587,044호; 4,605,735호; 4,667,025호; 4,762,779호; 4,789,737호; 4,824,941호; 4,835,263호; 4,876,335호; 4,904,582호; 4,958,013호; 5,082,830호; 5,112,963호; 5,214,136호; 5,082,830호; 5,112,963호; 5,214,136호; 5,245,022호; 5,254,469호; 5,258,506호; 5,262,536호; 5,272,250호; 5,292,873호; 5,317,098호; 5,371,241호, 5,391,723호; 5,416,203호, 5,451,463호; 5,510,475호; 5,512,667호; 5,514,785호; 5,565,552호; 5,567,810호; 5,574,142호; 5,585,481호; 5,587,371호; 5,595,726호; 5,597,696호; 5,599,923호; 5,599,928호 및 5,688,941호를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
올리고머 화합물은 또한 예를 들어, 뉴클레아제 안정성과 같은 특성을 향상시키기 위하여 올리고머 화합물의 일 말단 또는 양 말단에 일반적으로 부착되는 하나 이상의 안정화기를 갖도록 변형될 수 있다. 캡 구조가 안정화 기에 포함된다. "캡 구조 또는 말단 캡 모이어티"는 올리고뉴클레오티드의 어느 한 말단에서 통합된 화학적 변형을 의미한다(예를 들어, Wincott et al., WO 97/26270 참고). 이들 말단 변형은 말단 핵산 분자를 가진 올리고머 화합물을 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하며, 전달 및/또는 세포 내 국소화를 개선할 수 있다. 캡은 5'-말단(5'-캡) 또는 3'-말단 (3'-캡)에 존재하거나 이중쇄 화합물의 단일 쇄의 양 말단에 또는 양 쇄의 하나 이상의 말단에 존재할 수 있다. 이 캡 구조는 천연 mRNA 분자의 5' 말단에 존재하는 역전된 메틸구아노신 "5' 캡"과 혼동되어서는 안된다. 비제한적인 예에서, 5'-캡은 역전된 무염기 잔기(모이어티), 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드, 4'-티오 뉴클레오티드, 카르보시클릭 뉴클레오티드; 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트 연결; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 어시클릭 3',4'-seco 뉴클레오티드; 어시클릭 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 어시클릭 3,5-디하이드록시펜틸 리뉴클레오티드, 3'-3'-역전된 뉴클레오티드 모이어티; 3'-3'-역전된 무염기 모이어티; 3'-2'-역전된 뉴클레오티드 모이어티; 3'-2'-역전된 무염기 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 3'-포스포르아미데이트; 헥실포스페이트; 아미노헥실 포스페이트; 3'-포스페이트; 3'-포스포로티오에이트; 포스포로디티오에이트; 또는 가교 또는 비가교 메틸포스포네이트 모이어티를 포함한다(보다 상세 사항은 Wincott et al., 국제공개공보 WO 97/26270호 참고).
특히 적합한 3'-캡 구조는 예를 들어, 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(베타-D-에리트로푸라노실) 뉴클레오티드; 4'-티오 뉴클레오티드, 카르보시클릭 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 1,2-아미노도데실 포스페이트; 하이드록시프로필 포스페이트; 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오티드; L-뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 변형 염기 뉴클레오티드; 포스포로디티오에이트; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 어시클릭 3',4'-seco 뉴클레오티드; 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디하이드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-역전된 뉴클레오티드 모이어티; 5'-5'-역전된 무염기 모이어티; 5'-포스포로아미데이트; 5'-포스포로티오에이트; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 가교 및/또는 비-가교 5'-포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트 및/또는 포스포로디티오에이트, 가교 또는 비가교 메틸포스포네이트 및 5'-머캡토 모이어티를 포함한다(보다 상세 사항은 Beaucage and Tyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925 참고).
뉴클레아제 안정성을 부여하기 위하여 올리고머 화합물의 일 또는 양 말단을 캡핑하기 위해 사용될 수 있는 추가의 3' 및 5'-안정화 기는 2003년 1월 16일에 공개된 WO 03/004602호에 개시된 것들을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 올리고머 화합물은 매우 다양한 상이한 양전하로 하전된 중합체와 접합될 수 있다. 양 전하로 하전된 중합체의 예는 펩티드, 예를 들어, 아르기닌 풍부 펩티드(본 발명의 실시에 사용될 수 있는 양 전하로 하전된 펩티드의 예는 R9F2C; (RXR)4 XB (여기서, X는 임의의 아미노산일 수 있음); R5F2R4c; (RFF)3; Tat 단백질, 예를 들어, TAT 서열 CYGRKKRRQRRR; 및 (RFF)3R을 포함), 양이온성 중합체, 예를 들어, 덴드리머 옥타구아니딘 중합체, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물에의 접합을 위해 당업계에 알려진 다른 양 전하로 하전된 분자를 포함한다. 본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 1,000 내지 20,000 달톤, 그리고 바람직하게는 약 5,000 내지 10,000 달톤의 분자량을 가진 중합체를 포함하는 양전하로 하전된 중합체와 접합된다. 양전하로 하전된 중합체의 다른 예는 분지 또는 비분지 쇄에서 다수의 양전하로 하전된 아민기를 가진 폴리에틸렌이민(PEI)이다. PEI는 유전자 및 올리고머 전달 비히클로서 널리 이용되었다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 올리고머 화합물은 세포 침투 서열로 변형된다. 적합한 세포 침투 서열은 세포 침투 펩티드, 예를 들어, TAT 펩티드, MPG, Pep-1, MAP, 푸소제닉(fusogenic), 항균 펩티드(AMP), 살균 펩티드, 살진균 펩티드, 살바이러스성 펩티드를 포함한다.
세포-침투 펩티드(CPP)는 본 발명의 입자의 세포 흡수를 촉진하는 짧은 펩티드이다. 본 발명의 입자는 공유 결합을 통한 화학적 연결을 통해 또는 비공유적 상호작용을 통해 CPP 펩티드와 연합된다. CPP의 기능은 입자를 세포 내로 전달하는 것이며, 이는 살아있는 포유류 세포의 엔도좀에 전달된 화물과의 엔도사이토시스를 통해 일반적으로 일어나는 과정이다. CPP는 전형적으로 리신 또는 아르기닌과 같은 양전하로 하전된 아미노산이 상대적으로 매우 풍부한 아미노산 조성을 갖거나 극성/하전된 아미노산 및 비극성, 소수성 아미노산의 교번 패턴을 함유한 서열을 갖는다. 이들 두 가지 유형의 구조는 각각 폴리양이온성 또는 양친매성으로 불린다. 세번째 CPP 부류는 비극성 잔기만을 함유하며 낮은 총 전하를 갖는 소수성 펩티드이거나 또는 세포 흡수에 중요한 소수성 아미노산기를 갖는다.
예시적인 세포 침투 펩티드는 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1)로부터의 전사-활성화 전사 활성인자(Tat)이며, 이는 배양되는 많은 세포 유형에 의해 주변 배지로부터 효율적으로 흡수될 수 있다. 다른 세포 침투 펩티드는 MPG, Pep-1, 트랜스포르탄, 페네트라틴, CADY, TP, TP10, 아르기닌 옥타머, 폴리아르기닌 서열, Arg8, VP22 HSV-1 구조 단백질, SAP 프롤린-풍부 모티프, 벡토셀(Vectocell)® 펩티드, hCT(9-32), SynB, Pvec, 및 PPTG1이다. 세포 침투 펩티드는 본질적으로 그들의 일차 서열에서 폴리아르기닌 집단을 함유하여 양이온성이거나, 또는 양친매성일 수 있다. CPP는 일반적으로 천연 또는 비천연 단백질 또는 키메라 서열로부터 유래된 30개 미만의 아미노산의 펩티드이다.
적합한 실시형태에서, 올리고머 화합물은 나노입자와 통합되거나 다르게는 연합된다. 나노입자는 특정 세포를 타겟팅하도록 적합하게 변형되고 세포 침투에 최적화될 수 있다. 당업자는 올리고머 화합물을 세포에 전달하기 위하여 나노입자를 이용하는 방법을 알고 있다.
본 발명의 적합한 실시형태에서, 올리고머 화합물은 엔도좀 탈출제 모이어티로 변형된다. 식작용 경로는 세포의 주요 흡수 기전이다. 식작용 경로에 의해 흡수된 화합물은 엔도좀 내에 포획되며 리소좀 내의 특정 효소에 의해 분해될 수 있다. 이것은 목적에 따라 바람직하거나 바람직하지 않을 수 있다. 엔도좀에 의한 흡수가 바람직하지 않다면, 엔도좀 탈출제가 사용될 수 있다. 적합한 엔도좀 탈출제는 클로로퀸, TAT 펩티드일 수 있다.
주어진 올리고머 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실상 전술한 변형 중 둘 이상이 단일 화합물 내에 통합되거나 또는 올리고머 화합물 내의 단일 뉴클레오시드 내에 통합될 수 있다.
본 발명은 또한 키메라 화합물인 올리고머 화합물을 포함한다. 본 발명의 내용에서, "키메라" 올리고머 화합물 또는 "키메라"는 둘 이상의 화학적으로 구별되는 영역을 함유하며 각 영역은 적어도 하나의 단량체 단위, 즉, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에는 뉴클레오티드를 포함하는, 단일- 또는 이중-쇄 올리고머 화합물, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드이다. 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드는 올리고머 화합물의 한 형태이다. 이들 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포 흡수, 전하의 변화, 증가된 안정성 및/또는 타겟 핵산에 대한 증가된 결합 친화성을 올리고뉴클레오티드에 부여하기 위해 변형된 적어도 하나의 영역을 함유한다.
본 발명의 키메라 올리고머 화합물은 둘 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 모방체, 또는 그의 영역 또는 일부의 복합 구조로서 형성될 수 있다. 그러한 화합물은 또한 하이브리드 또는 갭머로 불린다. 그러한 하이브리드 구조의 제조를 교시한 대표적인 미국 특허는 미국 특허 5,013,830호; 5,149,797호; 5,220,007호; 5,256,775호; 5,366,878호; 5,403,711호; 5,491,133호; 5,565,350호; 5,623,065호; 5,652,355호; 5,652,356호; 및 5,700,922호를 포함하지만 이제 제한되지 않는다.
변형 및 비변형 뉴클레오시드의 올리고머화는 DNA를 위한(Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press) 및/또는 RNA를 위한(Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713) 문헌 절차에 따라 일상적으로 수행될 수 있다.
본 발명의 올리고머 화합물은 고체상 합성의 잘 알려진 기술을 통해 편리하고 일상적으로 만들어질 수 있다. 그러한 합성을 위한 장비는 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈(캘리포니아 포스터 시티)를 비롯한 여러 판매사에 의해 판매된다. 당업계에 알려진 그러한 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가로 또는 대안적으로 이용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것이 잘 알려져 있다.
아미다이트 및 그들의 중간체를 비롯한 하기 전구체 화합물은 당업자에게 일상적인 방법에 의해 제조할 수 있다; 5-메틸 dC 아미다이트를 위한 5'-O-디메톡시트리틸-티미딘 중간체, 5-메틸-dC 아미다이트를 위한 5'-O-디메톡시트리틸-2'-데옥시-5-메틸시티딘 중간체, 5-메틸 dC 아미다이트를 위한 5'-O-디메톡시트리틸-2'-데옥시-N4-벤조일-5-메틸시티딘 끝에서 두번째 중간체, (5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-2'-데옥시-N4-벤조일-5-메틸시티딘-3'-O-일)-2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포르아미다이트 (5-메틸 dC 아미다이트), 2'-플루오로데옥시아데노신, 2'-플루오로데옥시구아노신, 2'-플루오로우리딘, 2'-플루오로데옥시시티딘, 2'-O-(2-메톡시에틸) 변형 아미다이트, 2'-O-(2-메톡시에틸)-5-메틸우리딘 중간체, 5'-O-DMT-2'-O-(2-메톡시에틸)-5-메틸우리딘 끝에서 두번째 중간체, (5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-2'-O-(2-메톡시에틸)-5-메틸우리딘-3'-O-일)-2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포르아미다이트 (MOE T 아미다이트), 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-(2-메톡시에틸)-5-메틸시티딘 중간체, 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-(2-메톡시에틸)-N<4>-벤조일-5-메틸-시티딘 끝에서 두번째 중간체, (5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-2'-O-(2-메톡시에틸)-N<4>-벤조일-5-메틸시티딘-3'-O-일)-2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포르아미다이트 (MOE 5-Me-C 아미다이트), (5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-2'-O-(2-메톡시에틸)-N<6>-벤조일아데노신-3'-O-일)-2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포르아미다이트 (MOE A 아미다이트), (5'-O-(4,4'-디메톡시트리페닐메틸)-2'-O-(2-메톡시에틸)-N<4>-이소부티릴구아노신-3'-O-일)-2-시아노에틸-N,N-디이소프로필포스포르아미다이트 (MOE G 아미다이트), 2'-O-(아미노옥시에틸) 뉴클레오시드 아미다이트 및 2'-O-(디메틸아미노옥시에틸) 뉴클레오시드 아미다이트, 2'-(디메틸아미노옥시에톡시) 뉴클레오시드 아미다이트, 5'-O-tert-부틸디페닐실릴-O<2>-2'-안하이드로-5-메틸우리딘, 5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-(2-하이드록시에틸)-5-메틸우리딘, 2'-O-((2-프탈이미드옥시)에틸)-5'-t-부틸디페닐실릴-5-메틸우리딘, 5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-((2-포름아독시민옥시)에틸)-5-메틸우리딘, 5'-O-tert-부틸디페닐실릴-2'-O-(N,N 디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸우리딘, 2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸우리딘, 5'-O-DMT-2'-O-(디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸우리딘, 5'-O-DMT-2'-O-(2-N,N-디메틸아미노옥시에틸)-5-메틸우리딘-3'-((2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포르아미다이트), 2'-(아미노옥시에톡시) 뉴클레오시드 아미다이트, N2-이소부티릴-6-O-디페닐카르바모일-2'-O-(2-에틸아세틸)-5'-O-(4,4'-디메톡시트리틸)구아노신-3'-((2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포르아미다이트), 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (2'-DMAEOE) 뉴클레오시드 아미다이트, 2'-O-(2(2-N,N-디메틸아미노에톡시)에틸)-5-메틸 우리딘, 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-(2(2-N,N-디메틸아미노에톡시)-에틸))-5-메틸 우리딘 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-(2(2-N,N-디메틸아미노에톡시)-에틸))-5-메틸 우리딘-3'-O-(시아노에틸-N,N-디이소프로필)포스포르아미다이트.
올리고뉴클레오티드 합성을 위한 그러한 전구체 화합물의 제조는 당업계에서 일상적이며 미국 특허 6,426,220호 및 PCT 공보 WO 02/36743호에 개시된다.
2'-데옥시 및 2'-메톡시 베타-시아노에틸디이소프로필 포스포르아미다이트는 상업적 공급원(예를 들어, 매사추세츠 니담의 켐젠스(Chemgenes), 또는 버지니아 스털링의 글렌 리서치, 인크(Glen Research, Inc.))으로부터 구입할 수 있다. 다른 2'-O-알콕시 치환된 뉴클레오시드 아미다이트는 미국 특허 5,506,351호에 개시된 대로 제조할 수 있다.
5-메틸-2'-데옥시시티딘(5-Me-C) 뉴클레오티드를 함유한 올리고뉴클레오티드는 상업적으로 이용가능한 포스포르아미다이트(버지니아 스털링의 글렌 리서치, 인크 또는 매사추세츠 니담의 켐젠스)를 이용하여 공지의 방법(Sanghvi, et. al., Nucleic Acids Research, 1993, 21, 3197-3203)에 따라 일상적으로 합성할 수 있다.
2'-플루오로 올리고뉴클레오티드는 개시된 대로(Kawasaki, et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841 및 미국 특허 5,670,633호) 일상적으로 합성할 수 있다.
2'-O-메톡시에틸-치환된 뉴클레오시드 아미다이트는 Martin, P., Helvetica Chimica Acta, 1995, 78, 486-504의 방법에 따라 일상적으로 제조할 수 있다.
아미노옥시에틸 및 디메틸아미노옥시에틸 아미다이트는 미국 특허 6,127,533호의 방법에 따라 일상적으로 제조될 수 있다.
포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드(P-S)는 당업자에게 일상적인 방법에 의해 합성할 수 있다(예를 들어, Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press 참고). 포스피네이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 5,508,270호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
알킬 포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 4,469,863호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
3'-데옥시-3'-메틸렌 포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 5,610,289호 또는 5,625,050호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 5,256,775호 또는 미국 특허 5,366,878호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
알킬포스포노티오에이트 올리고뉴클레오티드는 공개된 PCT 출원 PCT/US94/00902호 및 PCT/US93/06976호 (각각 WO 94/17093 및 WO 94/02499로 공개됨)에 개시된 대로 제조될 수 있다.
3'-데옥시-3'-아미노 포스포르아미다이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 5,476,925호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
포스포트리에스테르 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 5,023,243호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
보라노 포스페이트 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 5,130,302호 및 5,177,198호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
4'-티오-함유 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 5,639,873호에 개시된 대로 합성될 수 있다.
MMI 연결된 올리고뉴클레오시드로도 알려진 메틸렌메틸이미노 연결된 올리고뉴클레오시드, MDH 연결된 올리고뉴클레오시드로도 알려진 메틸렌디메틸하이드라조 연결된 올리고뉴클레오시드 및 아미드-3 연결된 올리고뉴클레오시드로도 알려진 메틸렌카르보닐아미노 연결된 올리고뉴클레오시드, 및 아미드-4 연결된 올리고뉴클레오시드로도 알려진 메틸렌아미노카르보닐 연결된 올리고뉴클레오시드, 및 예를 들어, 교번하는 MMI 및 P-O 또는 P-S 연결을 가진 혼합 백본 화합물은 미국 특허 5,378,825호, 5,386,023호, 5,489,677호, 5,602,240호 및 5,610,289호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
포름아세탈 및 티오포름아세탈 연결된 올리고뉴클레오시드는 미국 특허 5,264,562호 및 5,264,564호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
에틸렌 옥사이드 연결된 올리고뉴클레오시드는 미국 특허 5,223,618호에 개시된 대로 제조될 수 있다.
펩티드 핵산(PNA)은 Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23에서 참조되는 다양한 방법 중 임의의 방법에 따라 제조될 수 있다. 그들은 또한 미국 특허 5,539,082호, 5,700,922호, 5,719,262호, 6,559,279호 및 6,762,281호에 따라 제조될 수 있다.
올리고머 화합물은 적어도 하나의 2'-O-보호된 뉴클레오시드를 당업계에 일상적인 방법에 의해 통합한다. 통합 및 적절한 탈보호 후, 2'-O-보호된 뉴클레오시드는 통합 위치에서 리보뉴클레오시드로 전환될 것이다. 최종 올리고머 화합물 내의 2-리보뉴클레오시드 단위의 수와 위치는 임의의 부위에서 하나로부터 다양할 수 있으며 또는 완전한 2'-OH 변형 올리고머 화합물을 제조하기 위한 전략이 이용될 수 있다.
현재 상업적으로 이용되고 있는 주요 RNA 합성 전략은 5'-[베타]-DMT-2'-O-t-부틸디메틸실릴(TBDMS), 5'-O-DMT-2'-[1(2-플루오로페닐)-4-메톡시피페리딘-4-일] (FPMP), 2'-O-[(트리이소프로필실릴)옥시]메틸(2'-O-CH2-O-Si(iPr)3 (TOM), 및 5'-O-실릴 에테르-2'-ACE (5'-O-비스(트리메틸실록시)시클로도데실옥시실릴]에테르 (DOD)-2'-O-비스(2-아세톡시에톡시)메틸(ACE)을 포함한다. RNA 생성물을 현재 제공하는 일부 회사는 피어스 뉴클레익 애시드 테크놀로지스(Pierce Nucleic Acid Technologies) (위스콘신 밀워키), 다마콘 리서치 인크(Dharmacon Research Inc.) (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific)의 자회사, 콜로라도 라파에트), 및 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.) (아이오와 코랄빌)를 포함한다. 한 회사, 프린스톤 세퍼레이션스(Princeton Separations)는 특히 TOM 및 TBDMS 화학에서 커플링 시간을 감소시키는 것으로 알려진 RNA 합성 활성기를 판매한다. 그러한 활성기는 또한 본 발명의 올리고머 화합물에 처리가능할 것이다.
전술한 RNA 합성 전략은 모두 본 발명의 올리고머 화합물에 적용가능하다. 상기한 것들의 하이브리드인 전략, 예를 들어, 하나의 전략으로부터 5'-보호 기를 이용하고 다른 전략으로부터 2'-O-보호를 이용하는 것 또한 본원에서 고려된다.
키메라 올리고뉴클레오티드, 키메라 올리고뉴클레오시드 및 혼합 키메라 올리고뉴클레오티드/올리고뉴클레오시드는 미국 특허 5,623,065호에 따라 합성될 수 있다.
향상된 세포 흡수 및 더 큰 약리학적 활성을 나타내는 키메라 올리고머 화합물은 미국 특허 8,501,703호에 따라 제조될 수 있다.
올리고머 화합물의 다른 형태는 트리시클로-DNA (tc-DNA) 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 트리시클로-DNA 뉴클레오티드는 백본의 형태적 유연성을 제한하고 비틀림각 γ의 백본 기하학을 최적화하기 위하여 시클로프로판 고리의 도입에 의해 변형된 뉴클레오티드이다. 호모베이직(Homobasic) 아데닌- 및 티민-함유 tc-DNA는 상보성 RNA와 특히 안정한 A-T 염기쌍을 형성한다. 6-22 길이의 트리시클로 뉴클레오티드, 특히 8-20 트리시클로 뉴클레오티드, 더욱 특히 10 내지 18 또는 11 내지 18 트리시클로 뉴클레오티드를 함유한 안티센스 올리고머 화합물이 적합하다. 예를 들어, 트리시클로-DNA(tc-DNA) 안티센스 올리고뉴클레오티드의 예를 위해 WO2010115993호를 참고한다.
변형 및 비변형 뉴클레오시드의 올리고머화는 DNA (Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Ed. Agrawal (1993), Humana Press) 및/또는 RNA (Scaringe, Methods (2001), 23, 206-217. Gait et al., Applications of Chemically synthesized RNA in RNA: Protein Interactions, Ed. Smith (1998), 1-36. Gallo et al., Tetrahedron (2001), 57, 5707-5713)를 위한 문헌 절차에 따라 일상적으로 수행될 수 있다.
안티센스 화합물은 고체상 합성의 공지 기술을 통해 편리하고 일상적으로 제조될 수 있다. 그러한 합성을 위한 장비는 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템즈(캘리포니아 포스터 시티)를 비롯한 여러 판매사에 의해 판매된다. 당업계에 알려진 그러한 합성을 위한 임의의 다른 수단이 추가로 또는 대안적으로 이용될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 기술을 이용하는 것이 알려져 있다. 개시 내용은 안티센스 화합물 합성 방법에 의해 제한되지 않는다.
올리고뉴클레오티드 정제 및 분석 방법은 당업자에게 알려져 있다. 분석 방법은 모세관 전기영동(CE) 및 전기분사-질량 분광법을 포함한다. 그러한 합성 및 분석 방법은 다중웰 플레이트에서 수행될 수 있다. 본 발명에 개시된 방법은 올리고머 정제 방법에 의해 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 본 발명에서 제공된 안티센스 화합물은 RNase H 분해에 저항성이다.
본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 화합물은 적어도 하나의 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 안티센스 화합물은 각 위치에 변형 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 안티센스 화합물은 각 위치에서 균일하게 변형된다.
스플라이싱의 조절은 당업계에 알려진 다양한 방식으로 분석될 수 있다. 타겟 mRNA 수준은 예를 들어, 노던 블롯 분석, 경쟁적 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 또는 실시간 PCR에 의해 정량될 수 있다. RNA 분석은 당업계에 알려진 방법에 의해 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+mRNA에 대해 수행될 수 있다. RNA 분리 방법은 예를 들어, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.1.1-4.2.9 및 4.5.1-4.5.3, John Wiley & Sons, Inc., 1993에 교시된다.
노던 블롯 분석은 당업계에서 일상적이며 예를 들어, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 1, pp. 4.2.1-4.2.9, John Wiley & Sons, Inc., 1996에서 교시된다. 실시간 정량 (PCR)은 PE-어플라이드 바이오시스템즈(캘리포니아 포스터 시티)로부터 구매가능하며 제조사의 설명서에 따라 사용되는 ABI PRISM(TM) 7700 서열 검출 시스템을 이용하여 편리하게 이루어질 수 있다.
타겟 mRNA에 의해 인코딩된 단백질 수준은 면역침전, 웨스턴 블롯 분석(면역블롯팅), ELISA 또는 형광-활성화 세포 분류(FACS)와 같은 다양한 공지 방법으로 정량될 수 있다. 타겟 mRNA에 의해 인코딩된 단백질에 대해 형성된 항체는 확인할 수 있으며 MSRS 항체 카타로그(에리에 코포레이션(Aerie Corporation), 미시간 버밍햄)와 같은 다양한 공급원으로부터 입수할 수 있거나, 종래의 항체 생성법을 통해 제조할 수 있다. 다클론 항혈청의 제조 방법은 예를 들어, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.12.1-11.12.9, John Wiley & Sons, Inc., 1997에서 교시된다. 단클론 항체의 제조는 예를 들어, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.4.1-11.11.5, John Wiley & Sons, Inc., 1997에서 교시된다.
면역침전법은 당업계에서 표준이며 예를 들어, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.16.1-10.16.11, John Wiley & Sons, Inc., 1998에서 찾을 수 있다. 웨스턴 블롯(면역블롯) 분석은 당업계에서 표준이며 예를 들어, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 10.8.1-10.8.21, John Wiley & Sons, Inc., 1997에서 찾을 수 있다. 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)은 당업계에서 표준이며 예를 들어, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Volume 2, pp. 11.2.1-11.2.22, John Wiley & Sons, Inc., 1991에서 찾을 수 있다.
본 발명의 올리고머 화합물의 효과는 RT PCT, qPCR, 인접 엑손 PCR 및/또는 하나 이상의 인접 엑손 증폭 생성물을 얻기 위하여 mRNA에 해당하는 각 내부 엑손에서의 인접 엑손 PCR 및 상기 인접 엑손 증폭 생성물의 존재 및 길이의 검출 및 상기 mRNA의 엑손을 인코딩하는 각 단백질의 정량을 포함하는 방법에 의해 분석될 수 있다.
본 명세서에 제공된 올리고머 화합물은 치료 또는 연구를 위해 이용될 수 있다. 또한, 유전자 발현을 억제하거나 특이성을 가지고 스플라이싱을 조절할 수 있는 안티센스 화합물은 특정 유전자 또는 유전자 생성물의 기능을 밝히거나 생물학적 경로의 다양한 구성원들의 기능 사이의 구별을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 올리고머 화합물은 폼페병의 치료에 사용된다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 올리고머 화합물은 GAA 유전자의 기능의 연구에서 사용된다.
본 명세서에 개시된 화합물은 후생동물, 바람직하게는 포유류, 바람직하게는 인간에서 타겟 mRNA의 스플라이싱을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 비제한적 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 상기 방법은 상기 동물에 타겟 mRNA의 스플라이싱을 조절하는 유효량의 안티센스 화합물을 투여하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 타겟 mRNA의 스플라이싱의 조절은 동물의 체액, 조직, 기관 또는 세포에서 mRNA 스플라이싱 생성물의 수준을 결정하여 측정될 수 있다. 체액은 혈액(혈청 또는 혈장), 림프액, 뇌척수액, 정액, 소변, 윤활액 및 타액을 포함하지만 이에 제한되지 않으며 당업자에게 일상적인 방법에 의해 수득할 수 있다. 조직, 기관 또는 세포는 혈액(예를 들어, 조혈 세포, 예를 들어 인간 조혈 전구 세포, 인간 조혈 줄기세포, CD34+ 세포, CD4+ 세포), 림프구 및 다른 혈액 계통 세포, 피부, 골수, 비장, 흉선, 림프절, 뇌, 척수, 심장, 골격근, 간, 결합조직, 췌장, 전립선, 신장, 폐, 구강 점막, 식도, 위, 장골, 소장, 결장, 방광, 자궁경부, 난소, 정소, 유선, 부신, 및 지방질(백색 및 갈색)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 조직, 기관 및 세포의 샘플은 생검에 의해 일상적으로 수득할 수 있다. 일부 선택적 상황에서, 조직 또는 기관의 샘플은 사망 후 동물로부터 회수할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 스플라이싱의 조절은 섬유아세포, 바람직하게는 일차 섬유아세포, 바람직하게는 폼페병을 앓고 있는 환자로부터의 일차 섬유아세포에서 측정된다.
올리고머 화합물을 이용한 치료의 효과는 당업계에 알려진 일상적인 임상적 방법에 의해, 하나 이상의 화합물과 접촉한 동물로부터 수집된 전술한 유체, 조직 또는 기관에서 타겟 mRNA의 스플라이싱의 조절과 관련된 바이오마커를 측정함으로써 평가될 수 있다. 이들 바이오마커는 글루코스, 콜레스테롤, 지단백질, 트리글리세라이드, 유리 지방산 및 글루코스 및 지질 대사의 다른 마커; 간 트랜스아미나제, 빌리루빈, 알부민, 혈액 우레아 질소, 크레아틴 및 신장 및 간 기능의 다른 마커; 인터루킨, 종양 괴사 인자, 세포내 부착 분자, C-반응성 단백질 및 염증의 다른 마커; 테스토스테론, 에스트로겐 및 다른 호르몬; 종양 마커; 비타민, 미네랄 및 전해질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서 바이오마커는 글리코겐이다.
본 명세서에 개시된 화합물은 적합한 약학적 허용 희석제 또는 담체에 유효량의 화합물을 첨가함으로써 약학 조성물에 이용될 수 있다. 화합물은 또한 스플라이싱에서의 변화에 관련된 질병 및 질환의 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 질병은 폼페병이다.
체액, 기관 또는 조직이 본 발명의 안티센스 화합물 또는 조성물 중 하나 이상의 유효량과 접촉되는 방법이 또한 고려된다. 체액, 기관 또는 조직은 본 발명의 화합물 중 하나 이상과 접촉되어 체액, 기관 또는 조직의 세포에서 타겟 mRNA의 스플라이싱의 조절을 야기할 수 있다. 유효량은 당업자에게 일상적인 방법에 의해 타겟 핵산 또는 그들의 생성물에 대한 안티센스 화합물 또는 화합물들 또는 조성물의 조절 효과를 모니터링하여 결정할 수 있다. 세포 또는 조직이 대상으로부터 분리되어 유효량의 안티센스 화합물 또는 화합물들 또는 조성물과 접촉되고 당업자에게 일상적인 방법에 의해 대상 내로 재도입되는 엑스 비보 치료 방법이 추가로 고려된다.
투여될 안티센스 올리고머 화합물의 충분한 양은 원치않는 질병 증상의 완화를 유도하기에 충분한 양일 것이다. 그러한 양은 특히 환자의 성별, 연령, 체중, 전체적인 신체 상태 등과 같은 인자들에 따라 변할 수 있으며, 각 경우마다 결정될 수 있다. 그 양은 또한 치료되는 상태의 유형, 및 치료 프로토콜의 다른 요소(예, 스테로이드와 같은 다른 의약의 투여 등)에 따라 변할 수 있다. 그 양은 또한 전신 또는 국소와 같은 투여 방법에 따라 변할 수 있다.
약학 제제 내의 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자의 전형적인 투여량은 0.05 내지 1000 mg/kg체중, 그리고 특히 약 5 내지 500 mg/kg체중 범위일 수 있다. 본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 투여량은 2주에 한번 또는 1주에 한번 또는 두번, 또는 치료 효과를 얻는 데 필요한 임의의 빈도로, 약 50 내지 300 mg/kg체중이다. 적합하게는 양은 3-50 mg/kg, 더욱 적합하게는 10-40 mg/kg, 더욱 적합하게는 15-25 mg/kg이다.
투여되는 투여량은 물론 용도 및 활성 성분의 약력학 특징; 수용체의 연령, 건강 및 체중; 증상의 특성 및 정도, 수반되는 치료의 종류, 치료의 빈도 및 원하는 효과와 같은 공지 인자에 따라 변할 것이다. 수용체는 임의의 포유류일 수 있으나, 바람직하게는 인간이다. 본 발명의 일 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 본 약학 조성물의 제형(조성물)은 단위 당 약 1 마이크로그램 내지 50,000 마이크로그램의 활성 성분 및 특히, 단위 당 약 10 내지 10,000 마이크로그램의 활성 성분을 함유할 수 있다(만일 여기서 단위가 1회 주사를 위한 바이알 또는 한 패키지를 의미한다면, 더 많을 것이며 환자의 체중이 50 kg이면 최대 15 g일 것이다). 정맥내 전달의 경우, 약학 제제의 단위 투여량은 일반적으로 체중 kg 당 0.5 내지 500 마이크로그램을 함유할 것이며 바람직하게는 체중 kg 당 5 내지 300 마이크로그램, 특히 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 또는 300 마이크로그램의 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자를 함유할 것이다. 바람직한 정맥내 투여량은 체중 kg 당 10 ng 내지 2000 ㎍, 바람직하게는 3 내지 300 ㎍, 더욱 바람직하게는 10 내지 100 ㎍의 화합물 범위이다. 대안적으로, 단위 투여량은 2 내지 20 밀리그램의 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자를 함유할 수 있으며 앞선 일일 투여량을 제공하기 위하여, 원하면 여러번 투여될 수 있다. 이들 약학 조성물에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자는 보통 조성물 총 중량을 기준으로 약 0.5-95 중량%의 양으로 존재할 것이다.
구체적 일 실시형태에서, 투여량은 개별 환자 반응에 기초하여 상승되거나 감소될 수 있음이 인정된다. 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자의 실제 양이 이용되는 구체적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자, 조제된 구체적인 조성물, 적용 모드 및 구체적인 투여 부위에 따라 변할 것임이 이해될 것이다.
바람직하게는 화합물은 매일, 2일에 한번, 3일에 한번, 1주에 한번, 2주에 한번 또는 한달에 한번 투여된다.
다른 바람직한 실시형태에서, 투여는 예를 들어, 바이러스 벡터를 사용할 경우, 단 한번이다.
만일 안티센스 올리고머 화합물의 바이러스-기반 전달이 선택되면, 적합한 투여량은 이용되는 바이러스 균주, 전달 경로(근육내, 정맥내, 동맥내 또는 기타)와 같은 상이한 인자들에 의존할 것이다. 당업자는 그러한 파라미터가 보통 임상 시험 동안 계산됨을 이해할 것이다. 추가로, 당업자는 질병 증상이 본 명세서에 개시된 치료에 의해 완전히 완화될 수 있는 한편, 반드시 그럴 필요는 없음을 이해할 것이다. 증상의 부분적 또는 간헐적 구제도 수용체에게 큰 이익일 수 있다. 또한, 환자의 치료는 보통 단일 이벤트가 아니다. 오히려, 본 발명의 안티센스 올리고머 화합물은 여러 번 투여될 것이며, 얻어지는 결과에 따라, 수일 간격, 수주 간격, 또는 수개월 간격 또는 심지어 수년 간격일 수 있다.
당업자는 단백질의 기능성 수준을 결정하거나 측정하고 예를 들어, 치료 프로토콜에 대한 반응으로 기능성의 증가 또는 감소 수준을 결정하기 위한 많은 방식이 있음을 알 것이다. 그러한 방법은 단백질의 활성 등을 측정하거나 검출하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 그러한 측정은 일반적으로 표준 또는 대조군 또는 "정상" 샘플과 비교하여 이루어진다. 또한, 단백질의 기능성 결핍이 질병 과정에 관련되는 경우, 바르게 기능하는 단백질의 존재 또는 부재를 간접적으로 검출하거나 단백질의 기능 결핍을 치유하기 위한 치료 프로토콜의 성공을 측정하기 위해 질병 증상을 모니터링하고/하거나 측정할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, GAA 단백질의 기능성이 측정된다. 이것은 당업자에게 잘 알려진 바처럼 효소 활성 분석으로 수행된다.
본 발명의 구체적 실시형태 및/또는 그 실시형태에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단독으로 또는 벡터와 연합되어 인 비보로 전달될 수 있다. 가장 넓은 의미에서, "벡터"는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포로의 전달을 촉진할 수 있는 임의의 비히클이다. 바람직하게는, 벡터는 벡터의 부재를 야기하는 분해 정도에 비하여 감소된 분해로 핵산을 세포에 수송한다. 일반적으로, 본 발명에 유용한 벡터는 네이키드 플라스미드, 비바이러스 전달 시스템(전기천공, 음파천공(sonoporation), 양이온성 형질감염제, 리포좀 등), 파지미드, 바이러스, 안티센스 올리고뉴클레오티드 핵산 서열의 삽입 또는 통합에 의해 조작된 바이러스 또는 세균성 공급원으로부터 유래된 다른 비히클을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바이러스 벡터가 바람직한 유형의 벡터이며 하기 바이러스로부터의 핵산 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: R A 바이러스, 예를 들어, 레트로바이러스(예, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(moloney murine leukemia virus) 및 렌티바이러스 유래 벡터), 하비 쥐 육종 바이러스, 쥐 유방암 바이러스, 및 라우스 육종 바이러스; 아데노바이러스, 아데노-연합 바이러스; SV40-유형 바이러스; 폴리오마 바이러스; 엡스타인-바 바이러스; 파필로마 바이러스; 헤르페스 바이러스; 백시니아 바이러스; 폴리오 바이러스. 당업자는 언급되지 않지만 공지된 다른 벡터를 쉽게 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 바이러스 벡터는 아데노바이러스 및 아데노-연합(AAV) 바이러스를 포함하며, 이들은 유전자 치료에서 인간 사용에 허가된 DNA 바이러스이다. 사실상 12가지의 상이한 AAV 혈청유형(AAV1 내지 12)이 알려져 있으며, 각각이 상이한 조직 향성을 가진다(Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27). 재조합 AAV는 의존성 파보바이러스(dependent parvovirus) AAV로부터 유래된다 (Choi, VW J Virol 2005; 79:6801-07). 아데노-연합 바이러스 타입 1 내지 12는 복제 결핍성이도록 조작될 수 있으며 광범위한 세포 유형과 종을 감염시킬 수 있다(Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27). 이것은 추가로 열 및 지질 용매 안정성; 조혈세포를 비롯한 다양한 계통의 세포에서 높은 형질도입 빈도; 및 중복감염 억제의 결핍에 의한 다수 시리즈의 형질도입의 허용과 같은 이점을 갖는다. 또한, 선택적 압력의 부재하에서 100계대가 넘는 조직 배양에서 야생형 아데노-연합 바이러스 감염이 이어져, 아데노-연합 바이러스 게놈 통합이 상대적으로 안정한 사건임을 의미한다. 아데노-연합 바이러스는 또한 염색체외 방식으로 기능할 수 있다.
다른 벡터는 플라스미드 벡터를 포함한다. 플라스미드 벡터는 당분야에서 방대하게 개시되었으며 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Sambrook et al, 1989를 참고한다. 그들은 많은 바이러스 벡터에서와 같은 안전성 문제를 갖지 않기 때문에 특히 유리하다. 하지만, 숙주 세포와 양립성인 프로모터를 가진 이들 플라스미드는 플라스미드 내에 작동가능하게 인코딩된 유전자로부터의 펩티드를 발현할 수 있다. 일반적으로 사용되는 일부 플라스미드는 pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40, 및 pBlueScript를 포함한다. 다른 플라스미드는 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한, 플라스미드는 DNA의 특정 단편을 제거하고 추가하기 위하여 제한효소와 라이게이션 반응을 이용하여 주문 설계될 수 있다. 플라스미드는 다양한 비경구, 점막 및 국소 경로에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, DNA 플라스미드는 근육내, 피내, 피하, 또는 다른 경로에 의해 주입될 수 있다. 또한 비강내 분무 또는 점적, 직장 좌약에 의해 그리고 경구로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 상기 DNA 플라스미드는 근육내 또는 정맥내로 주사된다. 또한 유전자-총을 이용하여 표피 또는 점막 표면 내로 투여될 수 있다. 플라스미드는 수용액으로, 금입자 상에 건조되어 또는 리포좀, 덴드리머, 달팽이관(cochleate) 및 마이크로캡슐화를 비롯하여 이에 제한되지 않는 다른 DNA 전달 시스템과 함께 제공될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드 핵산 서열은 이종성 조절 영역, 예, 이종성 프로모터의 조절 하에 있다. 프로모터는 또한 예를 들어, 바이러스 프로모터, 예, CMV 프로모터 또는 임의의 합성 프로모터일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 벡터는 하나보다 많은 안티센스 올리고머 화합물을 코딩할 수 있다. 각각의 안티센스 올리고머 화합물은 다른 타겟에 대한 것이다.
본 명세서에 개시된 안티센스 화합물을 포함하는 약학 조성물은 임의의 약학적 허용 염, 에스테르, 또는 그러한 에스테르의 염, 또는 인간을 비롯한 동물에 투여시 생물학적 활성 대사물 또는 그 잔기를 (직접 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 다른 기능성 화학적 등가물을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명은 또한 안티센스 화합물의 전구약물 및 약학적 허용염, 그러한 전구약물의 약학적 허용 염 및 다른 생물학적 등가물에 관한 것이다.
용어 "전구약물"은 비활성이거나 활성이 덜한 형태로 제조되어 내인성 효소, 화학물질, 및/또는 조건의 작용에 의해 신체 또는 그 세포 내에서 활성 형태(즉, 약물)로 전환되는 치료제를 나타낸다. 구체적으로, 올리고뉴클레오티드의 전구약물 버젼은 WO 93/24510호 또는 WO 94/26764호에 개시된 방법에 따라 SATE ((S-아세틸-2-티오에틸)포스페이트) 유도체로서 제조된다. 전구약물은 또한 활성 화합물을 생산하기 위하여 (예를 들어, 말단에서 포스포디에스테르 백본 연결을 통합시킴으로써) 절단되는 뉴클레오티드를 일 또는 양 말단이 포함하는 안티센스 화합물을 포함할 수 있다.
용어 "약학적 허용 염"은 화합물의 생리학적 및 약학적 허용염, 즉, 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하며 원치않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 말한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 나트륨염이 유용하며 인간에게의 치료적 투여에 잘 수용된다. 본 발명의 다른 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, dsRNA 화합물의 나트륨염 또한 제공된다.
본 명세서에 개시된 안티센스 화합물은 또한 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합되거나, 캡슐화되거나, 접합되거나 다르게는 연합될 수 있다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 안티센스 화합물을 포함하는 약학 조성물과 제제를 포함한다. 약학 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지 여부에 따라 그리고 치료될 면적에 따라 많은 방식으로 투여될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 투여는 근육내 또는 정맥내이다.
편리하게는 단위 제형으로 제시될 수 있는 약학 제제는 약학 산업에서 잘 알려진 종래 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기술은 활성 성분을 약학적 담체(들) 또는 부형제(들)과 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액체 담체, 미분된 고형 담체, 또는 둘 모두와 균일하게 그리고 완전히 혼합한 후, 필요하면 생성물을 (예를 들어, 전달을 위한 특정 입자 크기로) 성형함으로써 제조된다. 본 발명의 바람직한 실시형태 및/또는 그의 실시형태에서, 약학 제제는 적절한 용매, 예를 들어, 물 또는 생리식염수 내에, 가능하게는 멸균 제제로, 담체 또는 다른 제제와 함께 근육내 투여를 위해 제조된다.
"약학적 담체" 또는 "부형제"는 약학적 허용 용매, 현탁제 또는 동물에게 하나 이상의 핵산을 전달하기 위한 임의의 다른 약리학적 불활성 비히클일 수 있으며 당업계에 알려져 있다. 부형제는 액체 또는 고체일 수 있으며, 계획된 투여 방식에서, 핵산 및 주어진 약학 조성물의 다른 성분과 조합될 경우, 원하는 부피, 농도 등을 제공하기 위해 선택된다.
본 발명에서 제공되는 조성물은 둘 이상의 안티센스 화합물을 함유할 수 있다. 다른 관련 실시형태에서, 조성물은 첫번째 핵산에 타겟팅된 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드 및 두번째 핵산 타겟에 타겟팅된 하나 이상의 추가의 안티센스 화합물을 함유할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에서 제공되는 조성물은 동일한 핵산 타겟의 상이한 영역에 타겟팅된 둘 이상의 안티센스 화합물을 함유할 수 있다. 둘 이상의 조합된 화합물은 함께 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 조성물은 또한 다른 비-안티센스 화합물 치료제와 조합될 수 있다.
본 명세서에 개시된 안티센스 올리고머 화합물은 수성 현탁액의 제조에 적합한 부형제와 혼합될 수 있다. 그러한 부형제는 현탁제, 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드로프로필-메틸셀룰로스, 소듐 알지네이트, 폴리비닐피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아이며; 분산 또는 습윤화 제제는 자연-발생 포스파티드, 예를 들어, 레시틴, 또는 알킬렌 옥사이드와 지방산의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물, 예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세타놀, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산으로부터 유래된 부분 에스테르 및 헥시톨의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 모노올레이트, 또는 에틸렌 옥사이드와 지방산으로부터 유래된 부분 에스테르 및 헥시톨 무수물의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌 솔비탄 모노올레이트일 수 있다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 방부제, 예를 들어, 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트를 함유할 수 있다. 물을 첨가하여 수성 현탁액을 제조하는 데 적합한 분산가능한 분말 및 과립은 분산 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상의 방부제와 혼합된 활성 성분을 제공한다. 안티센스 올리고머 화합물 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액 형태일 수 있다. 현탁액은 상기에 언급된 적합한 분산 또는 습윤 제제 및 현탁제를 이용하여 공지 기술에 따라 조제될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비독성 비경구 허용성 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액 또는 현탁액일 수 있으며, 예를 들어, 1,3-부탄다이올 중의 용액일 수 있다. 이용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정 오일(fixed oils)이 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 이용된다. 이 목적을 위하여, 합성 모노 또는 디글리세라이드를 포함하는 임의의 무자극성 고정 오일이 이용될 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산이 주사제의 제조에 사용가능하다.
본 발명은 또한 약학적 허용 담체 또는 희석제 내에 약학적 유효량의 원하는 화합물을 포함하는, 저장 또는 투여를 위해 제조된 안티센스 올리고머 화합물 조성물을 포함한다. 치료 용도를 위한 허용가능한 담체 또는 희석제는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co., A.R. Gennaro edit., 1985)에 개시된다. 예를 들어, 방부제 및 안정화제가 제공될 수 있다. 이들은 소듐 벤조에이트, 솔브산, 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 또한, 항산화제 및 현탁제가 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 또한 수중유 에멀젼 형태일 수 있다. 유상은 식물유 또는 미네랄 오일 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 자연-발생 검, 예를 들어, 검 아카시아 또는 검 트라가칸트, 자연-발생 포스파티드, 예를 들어, 대두, 레시틴 및 지방산과 헥시톨로부터 유래된 에스테르 또는 부분 에스테르, 무수물, 예를 들어, 솔비탄 모노올레이트 및 상기 부분 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리옥시 에틸렌 솔비탄 모노올레이트일 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고머 화합물은 치료에 적합한 조성물을 형성하기 위하여 안정화제, 완충제 등이 있거나 없이, 임의의 표준 수단에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 리포좀 전달 기전을 이용하는 것이 바람직할 경우, 리포좀 형성을 위한 표준 프로토콜을 따를 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머 화합물은 임의의 형태로, 예를 들어, 근육내로 또는 국소, 전신, 또는 척추강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 폴리(에틸렌 글리콜) 지질을 함유한 표면-개질된 리포좀 (PEG-변형된, 또는 장기-순환 리포좀 또는 스텔스 리포좀(stealth liposome))을 포함하는 안티센스 올리고머 화합물 조성물의 사용을 특징으로 한다. 이들 제제는 타겟 조직 내에서 안티센스 올리고머 화합물의 축적을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 부류의 약물 담체는 단핵식세포계(MPS 또는 RES)에 의한 옵소닌 작용 및 제거에 저항하여, 캡슐화된 올리고머 화합물을 위한 더 긴 혈액순환 기간 및 조직 노출 향상을 가능하게 한다(Lasic et al, Chem. Rev. 95:2601-2627 (1995) 및 Ishiwata et al, Chem. Pharm. Bull. 43:1005-1011 (1995)). 장기-순환 리포좀은 특히 MPS의 조직에서 축적되는 것으로 알려진 종래의 양이온성 리포좀에 비하여, 안티센스 올리고머 화합물의 약력학과 약동학을 향상시킨다(Liu et al, J. Biol. Chem. 42:24864-24870 (1995); Choi et al, PCT 공개 WO 96/10391호; Ansell et al, PCT 공개 WO 96/10390호; Holland et al, PCT 공개 WO 96/10392호). 장기-순환 리포좀은 또한 간과 비장과 같은 대사적으로 공격적인 MPS 조직에서의 축적을 피하는 그들의 능력에 기초하여, 양이온성 리포좀에 비하여 더 큰 정도로 뉴클레아제 분해로부터 안티센스 올리고머 화합물을 보호하기 쉽다.
본 발명의 제제 및 방법에 따른 안티센스 올리고머 화합물 조성물의 투여 후, 시험 대상은 위약-처리된 또는 다른 적합한 대조군 대상에 비하여, 치료중인 질병 또는 질환과 관련된 하나 이상의 증상에서 약 10% 내지 약 99% 감소를 나타낼 것이다.
실시예
실시예 1
프리-mRNA 스플라이싱에 영향을 미치는 돌연변이는 스플라이싱 조절의 복잡한 기전으로 인해 예측하기가 어렵다. 스플라이싱에 대한 서열 변이체의 효과를 체계적으로 검출하고 규명하기 위한 포괄적인 접근법은 현재의 진단 실무를 개선할 것이다. 여기서, 본 발명자들은 인접 엑손 RT-PCR, PCR 생성물의 서열 분석, 및 모든 코딩 엑손에 대한 엑손-내부 정량 RT-PCR을 조합함으로써 그러한 접근법이 가능함을 보여준다. 일유전자성 상염색체 열성 질병인 폼페병을 야기하는 산-알파 글루코시다제 유전자에서의 규명되지 않은 돌연변이에 그러한 접근법이 적용되었다. 스플라이싱에 대한 효과는 크립틱 스플라이스 부위 사용, 인트론 보유 및 엑손 스키핑을 포함하였다. 이들은 실리코 예측과 상이하였으며, 실험적 테스트의 필요성을 강조하였다. 누수 야생형 스플라이싱의 정도의 정량은 질병 심각성과 상관되었다.
재료 및 방법
환자 및 건강한 대조군
환자들은 임상 증상 및 GAA 효소 활성에 기초하여 폼페병으로 진단받았다. 모든 환자와 건강한 대조군이 분자 분석에 대한 동의서를 제공하였다.
명명법
개시된 돌연변이의 위치는 Ensembl GAA cDNA 어쏘시에이션 번호(association number) ENST00000302262.3에 대해 배열된다. c.1은 GAA mRNA의 코딩 영역의 첫번째 뉴클레오티드를 나타낸다. 추가 넘버링은 HGVS 표준에 따른다[14].
세포 배양 및 cDNA 제조
섬유아세포를 환자 및 건강한 개인의 피부 생검으로부터 분리하였다. 세포를 DMEM 고 글루코스(론자(Lonza)) + 10% 태아소혈청(하이클론(HyClone), 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) + 1% 페니실린/스트렙토마이신(론자)에서 배양하였다. RNAeasy 미니프렙 키트(퀴아젠(Qiagen))를 이용하여 RNA를 분리하였다. 800 ng의 RNA를 iScript cDNA 합성 키트(바이오라드(Biorad))를 이용한 cDNA 생성을 위해 사용하였다. cDNA를 사용 전에 10배 희석하였다.
인접 엑손 PCR 분석
cDNA를 패스트스타트(FastStart) Taq 폴리머라제 (로쉐(Roche))를 이용하여 증폭하였다. 프라이머를 각각 0.333 μM 의 최종 농도로 그리고 각각 0.333 mM의 dNTP를 이용하였다. PCR 프로그램을 바이오라드 s1000 써멀 사이클러(thermal cycler) (4분 동안 96℃, 35X [96℃ 20초, 60℃ 30초, 72℃ 1분], 72℃ 5분)에서 수행하였다. 5 ㎕ 의 각각의 PCR 반응을 에티듐 브로마이드를 함유한 1.5% 아가로즈젤에서 수행하였다. 타이푼(Typhoon) FLA 9000 젤 영상화기(G&E 헬스케어(Healthcare))에서 젤 사진을 촬영하였다. 이용된 프라이머는 도 15에 열거된다.
엑손-내부 qPCR 분석
각 샘플의 상대적 농도를 결정하기 위하여, 4 ㎕의 각 cDNA 샘플(H20에서 10배 희석됨)을 IQ 마스터믹스(Mastermix) (바이오라드) 및 0.333 μM 의 각 프라이머를 함유한 15 ㎕의 PCR 반응을 진행하였다. 각각의 특정 프라이머 세트의 효율을 계산하기 위하여, 모든 샘플을 건강한 대조군 샘플로부터의 표준 곡선에 관련시켰다. 모든 샘플을 세벌로 측정하였다. 사용된 프라이머는 도 16에 열거된다.
생거 시퀀싱(Sanger sequencing)
네덜란드 로테르담 소재의 에라스무스 엠씨(Erasmus MC)의 임상 유전학의 진단 부서에서 게놈 DNA 돌연변이를 확인하였다. 인접 엑손 PCR 생성물의 직접 시퀀싱은 빅 다이 터미네이터(Big Dye Terminator) 키트 v3.1 (어플라이드 바이오시스템즈)을 이용하여 수행하였다. 순수한 DNA 샘플을 얻기 위하여, 스플라이싱 분석에서 젤 상에 보이는 PCR 생성물을 20 ㎕ 피펫 팁으로 찌르고 팁 상의 DNA를 10 ㎕ H2O에 재현탁시켰다. 1 ㎕를 이어서 새로운 PCR(스플라이싱 분석에서 개시된 대로)에서 이용하여 단일 주형으로부터의 DNA를 얻었다. 과량의 프라이머와 dNTP를 제조사의 프로토콜에 따라, 패스트에이피(FastAP) 열민감성 알카라인 포스파타제(써모 사이언티픽)를 이용하여 제거하였다. 샘플을 세파덱스 G-50 (GE 헬스케어)로 정제하고 AB3130 유전자 분석기(어플라이드 바이오시스템즈, 히타치)에서 서열을 결정하였다.
GAA 효소 활성
섬유아세포에서의 GAA의 활성을 개시된 대로[15] 기질로서 4-메틸움벨리페릴-α-글루코피라노시드(4-MU) 또는 글리코겐을 이용하여 측정하였다.
결과
스플라이싱 돌연변이를 검출하기 위한 포괄적 분석
이 방법은 두 부분으로 이루어진다. 첫번째인(도 1, 좌측) 포괄적 RT-PCR은 각 개별 정규 엑손에 인접하는 표준 프라이머를 이용하여 관심 mRNA에서 수행한다(인접 엑손 PCR). 아가로즈 젤 전기영동에 의해 생성물을 분리한다. 생성물 크기의 변화는 선택적/비정상 스플라이싱을 나타낸다. 스플라이싱 접합부는 젤로부터 분리된 생성물의 시퀀싱을 이용하여 또는 PCR 반응의 직접 시퀀싱에 의해 정확하게 결정할 수 있다. 두번째인(도 1, 우측) 표준 qPCR은 각 개별 엑손을 정량하기 위해 수행된다(엑손-내부 qPCR). 각 엑손 내에서 어닐링하는 프라이머가 이용된다. 결과는 베타-액틴 mRNA에 대해 그리고 건강한 대조군에서의 발현에 대해 정규화된다. 결과는 엑손 스키핑/포함을 정량하며, 또한 스플라이싱 돌연변이가 누수 야생형 스플라이싱을 허용하는지 여부를 나타낼 수 있다.
분석의 개발 및 검증
건강한 대조군
분석은 건강한 대조군을 이용하여 개발하였다. 스플라이싱 접합부와 엑손 크기를 검출하기 위하여, 인접 엑손에 어닐링하는 프라이머를 이용하여 일차 섬유아세포로부터 제조된 cDNA에서 인접 엑손 PCR 분석을 수행하였다(도 2A). 젤 전기영동 및 에티듐 브로마이드 염색은 모든 경우에 정확한 분자량 생성물을 나타냈다. 이것은 이들 세포에서 모든 엑손에 대한 정규 스플라이싱을 나타냈다. 일부 추가의 생성물은 주목할만하게 엑손 6과 7 바로 위에서 소량으로 관찰되었다. 서열 분석은 이들이 인트론 6이 보유된 생성물을 대표함을 나타냈다. 이 생성물은 이 건강한 대조군에서 그리고 많은 폼페병 환자에서 관찰되었으며 노이지(noisy) 비정상 스플라이싱을 나타낼 수 있으며, 이는 알려진 현상이다[16]. 개별 엑손은 엑손-내부 qPCR을 이용하여 정량하였다(도 1B). 값을 (qPCR 분석에 의해 측정한 대로) β-액틴 발현에 대해 정규화하였으며, 시험 샘플의 정규화를 위해 사용할 준비가 되었다.
환자 1
잘 개시된 스플라이싱 돌연변이가 상술한 분석을 이용하여 일차 섬유아세포에서 정확하게 검출될 수 있는지 여부를 이 환자를 이용하여 확인하였다. c.-32-13T>G (IVS1) 돌연변이를 선택하였으며 그 이유는 이것이 폼페병의 청소년기/성인기 개시를 야기하는 빈번한 돌연변이이기 때문이었다. 이것은 엑손 2의 스플라이스 수용자 부위에 가까운 인트론 1 내에 위치하며, 엑손 2의 비정상 스플라이싱을 야기하지만 또한 누수 야생형 스플라이싱을 허용한다[17, 18]. 두번째 대립유전자는 NMD로 인해 매우 낮은 수준으로 발현되는 것으로 알려져 있다[19]. 이것은 c.1636 + 5G>T 돌연변이에 의해 야기되며, 인트론 11 포함 및 미성숙 종결 코돈을 야기한다. 이러한 이유로, IVS1 돌연변이를 함유한 대립유전자는 후술하는 대로 스플라이싱 분석에서 우세하다.
인접 엑손 PCR 분석은 엑손 2 증폭으로부터 세 개의 주요 생성물을 생성하였다(도 2A). 이들 생성물을 DNA 시퀀싱에 의해 분석하였으며, 이 분석은 생성물 1이 정규 스플라이싱 접합부를 가진 전체 엑손 2를 대표함을 나타냈다(도 9). 생성물 2는 c.486에서 크립틱 스플라이스 수용자 부위의 이용으로 인해 부분적으로 스키핑된 엑손 2를 함유한 반면, 생성물 3은 완전히 스키핑된 엑손 2를 나타냈다(도 2A 및 S2). 이들 생성물은 IVS1 돌연변이에 대해 보고된 주요 스플라이싱 변이체, 즉, 정상(N)(생성물 1), 스플라이싱 변이체(SV) 1(생성물 2) 및 SV2(생성물 3)에 해당한다[18].
엑손-내부 qPCR 분석은 엑손 2와 모든 다른 엑손의 10-15% 발현을 나타냈다(도 2). 이것은 다음과 같이 설명될 수 있다. IVS1 돌연변이는 엑손 2의 누수 야생형 스플라이싱을 허용하여(도 2A에서 생성물 1), 이전에 주목된 바와 같이[18, 20], 모든 엑손을 함유한 정상 mRNA를 생성한다. 2개의 다른 주요 생성물 2와 3은 모두, 엑손 2에 위치한, 번역의 정규 개시의 결실을 야기한다. 이것은 mRNA 분해를 야기하여, 정량적 엑손-내부 qPCR 분석에서의 적은 기여 및 IVS1 대립유전자로부터의 누수 야생형 GAA mRNA의 우세한 검출을 야기한다. 결론적으로, 스플라이싱에 대한 IVS1 돌연변이의 알려진 효과는 GAA에 대한 포괄적 스플라이싱 분석을 이용하여 신뢰성있게 검출되었다. 누수 야생형 스플라이싱은 건강한 대조군 수준의 10-15%였으며 폼페병의 청소년기/성인기 개시를 설명하였다. 본 발명에서 사용된 다섯 가지 스플라이싱 예측 프로그램(SpliceSiteFinder-like (SSF), MaxEntScan (MES), NNSplice (NNS), GeneSplicer (GS) 및 Human Splicing Finder (HSF))이 모두 스플라이싱에 대한 IVS1 돌연변이의 효과를 검출하는 데 실패하였음이 주목된다(도 14A).
환자 2
이 환자는 분석의 민감성을 시험하기 위해 선택하였다. 동형접합성 c.525delT 돌연변이로 인하여, GAA mRNA 발현은 NMD로 인해 매우 낮다[21]. 놀랍게도, 인접 엑손 PCR 분석은 모든 엑손이 감소된 수준이지만 정확한 크기에서 검출될 수 있음을 보여주었다(도 8). 분자량이 더 높은 생성물이 또한 더욱 더 낮은 수준에서 관찰되었다. 이들은 PCR 반응에서 경쟁하는 스플라이싱된 mRNA의 풍부함이 감소됨으로써 증폭된, 스플라이싱되지 않은 프리-mRNA 종들을 나타낼 수 있다. 잔여 mRNA의 양을 정량하기 위하여, 엑손-내부 qPCR을 수행하였으며, 건강한 대조군에 비하여 모든 엑손의 5-10% 발현을 나타냈다(도 8B). 결론적으로, GAA에 대한 포괄적 스플라이싱 분석은 매우 낮은 mRNA 발현의 분석과 정량을 허용한다. 이것은 특히 해독 프레임 변화의 결과로서 분해되는 mRNA와 관련된다.
환자 3
전체 엑손 18 및 그의 인접 서열을 제거하는 잘 알려진 결실(del ex18, 또는 c.2481 + 102_2646 + 31del)을 보유한 환자에서 세번째 검증을 수행하였다(도 2A). 이 경우는 엑손 18의 스플라이스 부위가 제거되기 때문에 흥미롭다. 이전의 연구는 엑손 17이 정규 스플라이스 부위를 통해 엑손 19에 깔끔하게 스플라이싱되는 새로운 mRNA가 형성됨을 보여주었다[17]. 생성되는 mRNA의 번역 해독 프레임은 그대로 남아 있어서, 이 mRNA가 NMD 경로를 통한 분해에 민감하지 않음을 제안한다(도 7-표 2). 이 환자의 두번째 돌연변이인 c.1548G>A는 엑손 10에서 종결 코돈을 생성한다[22]. mRNA 발현에 대한 그 효과는 지금까지 보고되지 않았다. 미성숙 종결 코돈은 이 대립유전자로부터 충분하지 않은 mRNA를 생성한다.
인접 엑손 PCR은 엑손 17, 18 및 19의 증폭에 대한 변화를 나타냈다(도 3A). 엑손 18 증폭은 하나 대신 두 개의 생성물을 생성했다. 서열 분석은 최고 MW 생성물(번호 4)이 야생형 스플라이싱된 엑손 18을 나타내는 한편, 낮은 MW 생성물(번호 5)이 전체 엑손 18이 결핍되며, 엑손 17과 엑손 19가 그들의 정규 스플라이스 부위를 통해 접합되었음을 나타냈다(도 S3A). 엑손 17과 19의 증폭은 건강한 대조군에 비하여 적은 양의 정확한 생성물을 생산하였다. 그들의 증폭을 위하여 사용된 프라이머는 엑손 18에 어닐링하여, 그들의 검출이 delex18 대립유전자로부터 유래될 수 없었으며 c.1548G>A 대립유전자로부터 왔음에 틀림없음을 나타냈다. 이것은 c.1548G>A 대립유전자가 어느 정도까지 발현됨을 나타내며, 이것은 인접 엑손 PCR에 의한 야생형 스플라이싱된 엑손 18의 온건한 수준의 검출을 설명한다.
c.1548G>A 대립유전자로부터의 발현을 정량하기 위하여, 엑손-내부 qPCR을 수행하였으며 엑손 18의 3% 발현을 나타낸 반면, 모든 다른 엑손은 건강한 대조군 수준의 ~40-50%로 발현되었다(도 3F). 이것은 엑손 18 검출의 낮은 수준에 의해 측정되는 바처럼, c.1548G>A 돌연변이가 매우 낮은 mRNA 발현을 야기함을 보여준다. 모든 다른 엑손의 발현은 delex18 대립유전자로부터 유래되며, 이는 엑손 18이 정확하게 결실되는 안정한 mRNA를 생산한다.
요약하면, 포괄적 스플라이싱 분석은 또한 엑손 결실의 검출과 특성규명을 허용한다. 인접 엑손 PCR과 엑손-내부 qPCR 분석의 결과를 비교함으로써 두 대립유전자 사이에서 정밀분석이 이루어질 수 있다.
신규한 스플라이싱 돌연변이의 특성규명
다음으로, 부분적으로 규명되거나 규명되지 않은 돌연변이를 함유한 많은 환자를 분석하였다.
환자 4
환자 4는 엑손 2의 스플라이스 수용자 부위에 가까운 인트론 1 내에 위치한 c.-32-3C>G에서의 신규한 돌연변이를 함유하였다(도 3D). 이 돌연변이는 공지된 c.-32-3C>A 돌연변이에 대한 그의 유사성에 기초하여 엑손 2의 스플라이싱에 영향을 주는 것으로 생각된다[19]. 이 연구에서는, 엑손 2의 완전한 스킵이 보고되었다. 스플라이싱 예측 프로그램은 c.-32-3C>G 돌연변이가 모두는 아니지만 일부 프로그램에 대해 엑손 2의 스플라이스 수용자 부위를 약화시킴을 나타냈다(도 14C). 두번째 대립유전자는 이전에 보고되었지만[23] 규명되지 않은, 엑손 10의 스플라이스 공여자 부위에 가까운 인트론 10에 위치한 c.1551+1G>A에서의 돌연변이를 함유하였다(도 3E). 공지된 c.1551+1G>C 돌연변이에의 유사성에 기초하여[17, 24], c.1551+1G>A 돌연변이는 엑손 10 스플라이싱에 영향을 주는 것으로 생각된다. 스플라이싱 예측 프로그램은 엑손 10의 스플라이스 공여자 부위의 소실을 나타냈다(도 14C).
인접 엑손 PCR 분석의 결과는 두 엑손, 엑손 2와 엑손 10의 비정상 스플라이싱을 나타냈다(도 3C). 엑손 2의 증폭은 3가지 주요 생성물인 번호 6-8을 생성하였으며, 서열 분석은 이들 생성물이 야생형 스플라이싱, 엑손 2 내의 c.486에서의 크립틱 스플라이스 수용자 부위를 통한 엑손 2의 부분적 스키핑 및 엑손 2의 완전한 스키핑을 각각 포함함을 나타냈다(도 3D 및 도 10B). 이것은 인트론 1 내의 두 개의 독립적인 돌연변이, 즉 폴리피리미딘 트랙트에 위치한 c.-32-13T>G 및 스플라이스 수용자 부위 근처에 위치한 c.-32-3C>G가 엑손 2 스플라이싱에 대하여 동일한 정량적 결과를 가짐을 나타낸다. 스플라이싱 예측 프로그램은 이러한 결과를 정확하게 예측하기에 충분하지 않았다. 엑손 10의 인접 엑손 PCR 증폭은 2개의 주요 생성물 9 및 10을 생성하였다(도 3C). 서열 분석은 생성물 9가 엑손 9, 10 및 11 사이에서 야생형 접합부를 함유하며 생성물 10이 해독 프레임이 그대로 남아 있는 엑손 10 mRNA의 정확한 스킵핑을 나타냄을 보여주었다(도 3E 및 도 10C). 엑손 10의 스플라이스 공여자 부위의 약화의 가장 직접적인 결과가 엑손 10의 스키핑이 아니라 인트론 10의 제거 실패일 것이기 때문에 이것은 놀라운 것이다.
스플라이싱 결함의 정도를 결정하기 위하여, 엑손-내부 qPCR을 수행하였다. 엑손 10은 ~6%로 발현된 반면, 모든 다른 엑손은 건강한 대조군 수준의 ~50%로 발현되었다(도 3F). 이것은 mRNA의 대부분이 엑손 10이 스키핑된 c.1551+1G>A 대립유전자로부터 유래된다는 아이디어와 일치한다. 더 짧은 생성물은 변화되지 않은 해독 프레임을 가지며 안정할 것으로 예상된다. 대조적으로, c.-32-3C>G 대립유전자는 (부분적인) 엑손 2 스키핑을 야기하며, 이는 IVS1 돌연변이와 유사한 mRNA 분해를 야기하는 것으로 알려져 있다. c.-32-3C>G 대립유전자는 엑손-내부 qPCR 결과에 적게 기여한다. 그 기여는 c.-32-3C>G 돌연변이의 누수 야생형 스플라이싱으로부터 야기될 수 있는 엑손 10 발현으로부터 평가될 수 있다. 하지만, 엑손 10 발현을 위한 대안적 공급원은 c.1551+1G>A 대립유전자의 누수 야생형 발현이다. 엑손 10 발현의 매우 낮은 수준은 c.-32-3C>G 및 c.1551+1G>A 둘 모두가 누수 야생형 발현 수준이 낮거나 부재함을 나타낸다. 이것은 c.-32-3C>G 돌연변이가 IVS1 돌연변이에 비교하여 더욱 심각할 수 있음을 나타내며, IVS1 돌연변이는 10-15%의 더 높은 수준의 야생형 스플라이싱을 허용하기 때문이다(도 2D). 폼페병의 임상적 과정은 이 환자에 대해 청소년기 개시를 나타내며, 성인기 개시 환자에 비하여 낮은 GAA 효소 활성 수준 및 야생형 GAA 발현의 낮은 수준과 일치한다(도 6-표 1).
환자 5
환자 5는 엑손 6의 마지막 염기쌍에 위치한 p.Gly359Arg 미스센스 돌연변이인 c.1075G>A에 대해 동형접합성이었다(도 4B)[25]. 이 돌연변이는 스플라이싱에 대한 가능한 효과를 가지며 비병원성으로 짐작되는 것으로 분류되었다[26]. 이것은 엑손 6의 스플라이스 공여자 부위 근처에 위치되며, 스플라이싱 예측 분석은 이 부위의 약화 및 크립틱 스플라이스 공여자 부위 4 뉴클레오티드 상류의 강화를 나타냈다(도 14D).
인접 엑손 PCR 분석은 엑손 7을 위한 생성물의 부재, 다른 엑손의 낮은 수준 및 엑손 2를 위한 저 MW 생성물의 낮은 수준을 보여주었다(도 4A). 예측 및 엑손 6에서 이 돌연변이의 위치에 기초하여, 본 발명자들은 엑손 6과 7 주위의 스플라이싱 접합부가 변경될 수 있는 것으로 생각하였다. 일치하게, 엑손 6 PCR 생성물(생성물 11)의 시퀀싱은 c.1071에서 4 뉴클레오티드 상류에 위치한 엑손 6 내의 크립틱 스플라이스 공여자 부위가 대신 사용되었음을 보여주었다(도 4B 및 도 S4B). 엑손 7 증폭을 위한 전방 프라이머가 변화된 스플라이스 공여자 부위로 인하여 4 미스매치를 가지므로, 이것은 엑손 7을 위한 생성물의 부재를 설명한다. 주목할만하게, 인접 엑손 PCR 분석은 이 돌연변이를 위한 누수 야생형 스플라이싱을 검출하지 못했다. 이것은 관찰되지 않은, 엑손 7 증폭을 위한 야생형 밴드의 존재를 야기하였을 것이다. 엑손 7의 스플라이싱을 더 조사하기 위하여, 엑손 5에 위치한 대안적 전방 프라이머를 사용하였다. 예상된 생성물이 이제 수득되었으며, 생성물 11의 서열 분석에 대해 관찰되는 바처럼, 엑손 6 내의 c.1071로부터 엑손 7의 정규 스플라이스 수용자 부위에의 스플라이싱을 보여주었다(도 11A). 생성되는 mRNA의 해독 프레임은 변화되어 미성숙 종결 코돈을 야기하였다(표 2). 엑손 2 증폭으로 얻어진 저 MW 생성물은 더 조사를 계속하지 않았다. 이것은 다른 미확인 인트론 돌연변이에 의해 야기될 수도 있다. 대안적으로, 야생형 GAA mRNA는 누수 엑손 2 스키핑을 갖는 것으로 알려져 있으며, 그 생성물은 c.1071 돌연변이로 인한 mRNA 분해 때문에 우선적으로 증폭될 수 있다.
엑손-내부 qPCR 분석을 이용한 GAA mRNA 발현의 정량은 모든 GAA 엑손이 IVS1 돌연변이에 대해 관찰된 수준보다 훨씬 낮지만 c.525delT 돌연변이에 대해 관찰된 수준 바로 위인, 매우 낮은 수준으로 발현되었음을 보여주었다(도 4G). 이것은 이 환자에서 누수 야생형 스플라이싱 수준이 매우 낮거나 부재하며, mRNA의 대부분이 불안정함을 확인하였다. 일치하게, 섬유아세포에서 매우 낮은 GAA 활성이 측정되었으며 이 환자의 진단은 폼페병의 가장 심각한 전통적 유아기 형태였다.
환자 6
환자 6은 동형접합성 c.1552-3C>G 돌연변이를 보유하였다. 이 돌연변이는 엑손 11에 가까운 인트론 10에 위치한다(도 4D). 인접 엑손 PCR 분석은 세 개의 생성물(12-14; 도 4E)을 가진, 엑손 10의 비정상 스플라이싱을 나타냈다. 서열 분석은 생성물 14에서, 엑손 10이 완전히 스키핑되었으며 c.1552-30에서 엑손 11 근처의 신규의 스플라이스 수용자 부위가 이용되었음(도 4D 및 11C)을 나타냈다. 이 mRNA는 해독 프레임을 그대로 남겨둔다(표 2). 생성물 13은 야생형 스플라이싱된 mRNA로 확인되었다. 생성물 12는 완전한 인트론 10이 보유된 mRNA로 이루어졌다. 해독 프레임은 이 스플라이싱 생성물에서 파괴된다. 생성물 13과 14는 이전에 검출되었지만[27], 생성물 12는 새로운 것이다. 흥미롭게도, 스플라이싱 예측 프로그램은 엑손 11의 정규 또는 크립틱 스플라이스 수용자 부위의 이용 정도의 예측에 대해 양면적이었다(도 14F). 더욱이, 결과는 어느 경우에도 예상되지 않았다: 엑손 11의 스플라이스 수용자 부위의 약화는 엑손 10의 스키핑을 야기할 것으로 예상되지 않았을 것이다. 대신, 두 가지 생성물이 예상될 수 있다: 엑손 10의 스플라이스 공여자 부위가 c.1552-30에서 크립틱 수용자에 스플라이싱되어 인트론 10의 일부를 가진 엑손 11의 연장 및 추가의 정상 스플라이싱을 야기하는 하나. 다른 예상된 생성물은 엑손 11의 완전한 스키핑일 것이다. 완전히 상이한 결과는 잠재적 스플라이싱 돌연변이의 분자 결과를 분석하기 위하여 실험적 확인이 필요함을 예시한다.
스플라이싱 결함의 정량은 엑손-내부 qPCR 분석으로 수행하였다. 이것은 건강한 대조군 수준의 ~20%에서 모든 엑손의 발현을 나타냈다(도 4G). 엑손 10 발현에서 추가적인 감소는 관찰되지 않아, 대부분의 mRNA가 엑손 10을 포함하여, 생성물 14보다 12와 13을 선호함을 제안한다. 누수 야생형 스플라이싱의 존재(생성물 13)는 잔여 GAA 효소 활성 및 이 환자에서 폼페병의 성인기 개시를 가진 온건한 표현형과 일치한다(표 1). 결론적으로, c.1552-3C>G는 엑손 10 및 인트론 10 주위에서 여러 스플라이싱 결함을 야기하며, 성인기 질병 개시와 양립성인 누수 야생형 스플라이싱을 허용한다.
환자 7
환자 7은 엑손 9의 스플라이스 공여자 부위에 위치한 침묵 돌연변이인 c.1437G>A에 대해 동형접합성이었다(도 4F). 인접 엑손 PCR 분석은 엑손 9 증폭을 위한 하나 대신 두 개의 생성물을 나타냈으며, 엑손 8 및 엑손 10 증폭에 대해 낮은 수율을 나타냈다(도 4E). 서열 분석은 생성물 15가 야생형 스플라이싱된 엑손 9를 나타내는 한편, 생성물 16에서 엑손 9는 완벽하게 스키핑되어 해독 프레임이 변화되지 않은 더 짧은 전사물을 생성함을 나타냈다(도 4F 및 도 11D). 그 위치로부터 예상된 바대로, c.1437G>A 돌연변이는 인 실리코에서 엑손 9의 스플라이스 공여자 부위를 약화시키는 것으로 예상되었다(도 14E). 하지만, 실험 결과는 놀라운 것이었으며, 엑손 9의 스플라이스 공여자 부위의 실패는 엑손 9의 스키핑 보다는 인트론 9의 포함을 야기할 것으로 예상되었기 때문이다. 엑손 8 및 엑손 10 증폭의 생성물은 정확한 크기를 가졌지만 수율이 낮았으며, 그 이유는 엑손 9가 (엑손 8을 위한) 역방 PCR 프라이머 또는 (엑손 10을 위한) 전방 PCR 프라이머의 어닐링을 위한 주형으로서 작용할 가능성이 감소되었기 때문이다.
엑손-내부 qPCR을 이용한 정량은 엑손 9를 제외하고는 모든 엑손에 대해 정상에 가까운(대조군의 70-80%) 발현 수준을 나타냈으며, 엑손 9의 경우에는 건강한 대조군의 단지 5%의 발현을 나타냈다. 이 환자의 청소년기/성인기 질병 개시는 스플라이스 부위 돌연변이의 누수 특성과 일치한다(표 1). 요약하면, c.1437G>A 돌연변이는 엑손 9의 정확한 스키핑을 야기하여 해독 프레임을 그대로 남겨두며, 낮은 수준의 누수 야생형 GAA 스플라이싱을 허용한다.
복합한 케이스의 특성규명: 환자 8
유전자형
환자 8은 대립유전자 1상에 미스센스 돌연변이 c.1256A>T를 함유하였다. 이 돌연변이는 엑손 8의 중간에 위치하며, p.Asp419Val를 야기하며, 온건하게 병원성으로 분류되었다(도 5B) [26]. 두번째 대립유전자는 c.1551+1G>T 돌연변이를 함유하였으며, 이 돌연변이는 엑손 10의 스플라이스 공여자 부위에 가까운 인트론 10 내에 위치한다[26]. 환자 4에 대해 상술한 c.1551+1G>A 돌연변이와 유사하다.
스플라이싱 생성물의 분석
인접 엑손 PCR 분석은 엑손 8, 9, 및 10의 증폭으로부터의 다수의 PCR 생성물을 나타냈다(도 5A). 모든 이들 생성물을 시퀀싱에 의해 분석하였다(도 12). 이 분석은 야생형 엑손 8 스플라이싱의 존재(생성물 17) 및 c.1256A>T 돌연변이의 2nt 상류에 위치한 c.1254의 엑손 8 내의 새로운 스플라이스 공여자 부위의 이용을 나타냈다(생성물 18; 도 5B-C). 이 공여자는 엑손 9의 정규 스플라이싱 수용자 부위에 스플라이싱되었으며 생성되는 해독 프레임은 변하지 않았다(표 2). 사실상 스플라이싱 예측 프로그램은 c.1254가 c.1256A>T 돌연변이로 인해 스플라이스 공여자 부위로 변했음을 보여주었다(도 14G). 엑손 8의 정규 스플라이스 공여자 부위는 변하지 않고 남아 있었으며, 두 부위 중 어느 것이 인 실리코 예측으로부터 선호될 것인지는 명확하지 않았다. 생성물 21은 엑손 10의 야생형 스플라이싱을 나타낸 반면, 생성물 22는 해독 프레임이 그대로 남아 있는 완전한 엑손 10 스키핑의 결과였다(도 5D 및 도 12). c.1551+1G>T 돌연변이에 의한 엑손 10 스플라이스 공여자 부위의 소실은 스플라이싱 예측과 일치하였으나(도 14G), 엑손 10 스키핑보다는 인트론 10 포함이 가장 논리적인 결과 같았기 때문에, 그 결과는 예상되지 못한 것이었다.
낮은 수준의 누수 야생형 스플라이싱의 증거
후술되는 엑손-내부 qPCR 분석과 함께, 인접 엑손 PCR 분석은 생성물의 상대적 강도를 통해 돌연변이의 심각성에 대한 정보를 제공한다. 이들은 스플라이싱 생성물의 확인(도 5B-D) 및 증폭을 위해 사용된 프라이머의 위치(도 13)에 기초하여 설명될 수 있다.
엑손 7
엑손 7의 검출은 엑손 6의 3' 말단에 어닐링하는 전방 프라이머 및 엑손 8의 5' 말단에의 역방 프라이머로 수행된다(도 13). 엑손 8의 5' 말단은 모든 경우에 보유되는 한편, 3' 부분은 c.1256A>T 대립유전자에서 스플라이싱되어 제거된다. 엑손 7의 인접 엑손 PCR 검출은 따라서 이 환자에서 영향을 받지 않아야 하며 사실상 그러한 경우였다(도 5A).
엑손 8
엑손 8의 검출을 위해 사용된 인접 엑손 PCR 프라이머는 엑손 7과 9에 어닐링한다(도 13). 두 엑손 모두 이 환자에서 영향을 받지 않아, 엑손 8 자체의 모든 스플라이싱 변화가 반정량적 방식으로 검출되어야 할 것으로 예측된다. 사실상, 강한 야생형 생성물(번호 17)이 검출되었으며, 대립유전자 2가 우세하였으며, 대립유전자 1 내의 c.1254의 새로운 크립틱 스플라이스 공여자 부위로 인해 약간 더 약한 더 작은 생성물 18이 검출되었다. 생성물 17의 최대 50%가 대립유전자 2로부터 유래될 것으로 예상되며, 따라서 생성물 18에 비하여 더 강한 그의 풍부함은 대립유전자 1이 누수 야생형 스플라이싱을 가짐을 제안한다.
엑손 9
인접 엑손 PCR에 의한 엑손 9의 검출을 위한 PCR 프라이머는, 대립유전자 1에서 스키핑되지 않는 부분인 엑손 8의 5' 부분에, 그리고 대립유전자 2에서 완전히 스키핑되는 엑손 10에 어닐링한다(도 12). 이것은 이들 두 대립유전자로부터 엑손 9의 검출을 복잡하게 한다: 대립유전자 1로부터의 생성물은 엑손 8의 부분적 스키핑으로 인해 정상보다 짧을 것이다. 대립유전자 2로부터의 생성물은 엑손 10의 정확한 스키핑으로 인해 가능하지 않은 한편, 이 엑손은 프라이머 어닐링을 위해 요구된다. 수득된 주요 생성물은 대립유전자 1로부터 유래된 더 짧은 생성물 번호 20이었다. 하지만, 소량의 야생형 생성물 번호 19 또한 관찰되었다. 이것은 두 대립유전자 중 적어도 하나가 누수 야생형 스플라이싱을 허용함을 나타낸다.
엑손 10
엑손 10의 인접 엑손 PCR 분석은 엑손 9 및 엑손 11에서 어닐링하는 프라이머로 수행되며, 두 엑손 모두 영향받지 않는다. 따라서, 결과는 반정량 방식으로 엑손 10의 스플라이싱 변화를 반영한다. 야생형 스플라이싱을 나타내는 생성물 21이 가장 풍부하였으며, 엑손 10이 완전히 스키핑된 생성물 22는 약간 덜 풍부하였다. 대립유전자 1의 엑손 10 스플라이싱이 영향을 받지 않으며 야생형 생성물의 50%를 차지할 수 있으므로, 이 결과는 대립유전자 2 또한 대립유전자 1과 유사한 누수 야생형 스플라이싱을 가짐을 제안한다.
엑손-내부 qPCR 분석을 이용한 정량
각 엑손의 mRNA 발현의 정량은 엑손 8과 10을 제외한 모든 엑손이 건강한 대조군에 비하여 ~2배 더 높은 풍부함을 나타냈음을 보여주었다. 엑손 8과 10은 다른 엑손에 비해서는 2-배 낮은 수준으로 발현되었으나 건강한 대조군의 수준의 80-120%로 발현되었다. 이것은 이 환자에서 비정상적으로 높은 mRNA 발현을 나타낸다. 대립유전자 1(1256A>T)은 엑손 8의 부분적 스키핑이 일어나 qPCR 생성물의 검출에서 실패를 야기하였다. 따라서 엑손 8의 잔여 검출은 대립유전자 2(c.1551+1G>T) 로부터 유래되며, 50% 기여할 것으로 예상되며, 나머지 발현은 대립유전자 1로부터의 누수 야생형 스플라이싱으로부터 유래되기 쉽다. 동일한 논리가 엑손 10의 검출에 적용된다. 이 경우, 발현은 다른 엑손에 대하여 50%에 가까워, c.1551+1G>T 돌연변이가 훨씬 낮은 수준의 야생형 스플라이싱을 허용하였음을 제안한다. 왜 이 환자가 건강한 대조군에 비하여 2-배 더 높은 GAA 발현을 나타내는지 그리고 이러한 증가가 유사한 정도로 두 대립유전자에 적용되는지 여부가 불명확함이 주목된다. 이 환자는 아동기/청소년기 질병 개시를 갖지만 고전적 유아기 폼페병에 비교하여 명확히 덜 영향을 받으며, GAA의 잔여 야생형 발현의 낮은 수준과 일치한다(표 1).
요약하면, 환자 8은 두 가지 스플라이싱 돌연변이를 함유하였다. c.1256A>T는 p.Asp419Val을 야기하며 또한 c.1254에서 새로운 스플라이스 공여자 부위를 생성하여 엑손 8의 부분적 스키핑 및 누수 야생형 스플라이싱을 야기하는, 엑손 8 내의 미스센스 돌연변이이다. c.1551+1G>T는 인트론 10 내에 위치하며 엑손 10의 완벽한 스키핑 및 누수 야생형 스플라이싱을 야기한다. 폼페병의 아동기/청소년기 개시는 두 돌연변이가 모두 온건하게 내지 심각하게 병원성임을 제안한다. 이것은 성인기 개시 환자에 비하여 낮은 GAA 효소 활성 수준과 일치한다.
점액다당류증 유형 VI (마로토-라미 증후군)는 N-아세틸갈락토스아민 4-설파타제(아릴설파타제 B; ARSB)를 코딩하는 유전자에서의 결함에 의해 야기된 상염색체 열성 단성유전자 질환이다. 스플라이싱 분석의 포괄적 특성을 입증하기 위하여, MPSV1에 대해 분석을 적응시켰다. 이를 위하여, 인접 엑손 프라이머를 ARSB 유전자의 모든 코딩 엑손에 대해 설계하였다(엑손 2-7; 첫번째 및 마지막 엑손은 인접될 수 없음). 하기의 프라이머 서열 및 예상 생성물 크기(컬럼 "WT 생성물 크기")를 이용하였다:
Figure 112016128736525-pct00047
Figure 112016128736525-pct00048
건강한 대조군으로부터의 일차 섬유아세포를 성장시키고, 총 RNA를 수집하고, cDNA를 합성하고, 엑손 2-7을 PCR에 의해 증폭하였다. 도 34 참고. 생성물을 아가로즈 젤에서 분리하고 에티듐 브로마이드를 이용하여 가시화하였다. 도 34는 모든 엑손이 예상되는 크기에서 우세한 단일 밴드를 제공함을 보여주었다(크기 마커는 좌측에 표시되며 번호는 bp 단위의 크기를 말한다). 다음으로, 섬유아세포를 ARSB 변이체 c.1142+2T>C에 대해 동형접합성인 환자로부터 성장시켰다. 이 환자는 이전에 Brands et al. (Orphanet J Rare Dis. 2013 Apr 4;8:51)에서 개시되었다. 스플라이싱 결함이 의심되었지만, 입증되지는 않았다. 또한, 잠재적인 스플라이싱 결함이 얼마나 심각할 수 있는지는 알려지지 않았다. 이 변이체의 특성을 분석하기 위하여 스플라이싱 분석을 적용한 결과, 도 35 좌측 부분에 나타난 대로, 두 가지 주요 결과를 갖는 심각한 스플라이싱 결함을 밝혔다: 1) 엑손 5의 증폭에 대한 생성물은 건강한 대조군에 비하여 더 낮았으며: 이제 361 bp 대신 117 bp의 단일 생성물이 얻어졌으며, 이는 엑손 5의 스키핑 및 mRNA에서 244 뉴클레오티드의 결실과 일치하며(상기 참고), 모든 생성물이 건강한 대조군에 비하여 덜 풍부하였다. 이는 244 뉴클레오티드의 결실이 해독 프레임 이동을 야기하여, 넌센스 매개 소멸 경로의 활성화 및 mRNA의 분해를 야기한다는 아이디어와 일치한다. 흥미롭게도, 누수 야생형 스플라이싱이 검출될 수 없었다. 이는 Brands et al. (Orphanet J Rare Dis. 2013 Apr 4;8:51)에서 개시된 대로 이 환자에서 심각하고 빠른 질병 진행과 일치한다. 함께 고려할 때, 발현 및 스플라이싱 분석은 성공적으로 MPSVI에 적용되었으며, c.1142+2T>C ARSB 변이체에 의해 야기된 스플라이싱 결함을 확인하도록 하였다. 누수 야생형 스플라이싱의 부재는 관련 환자의 심각한 표현형과 일치하였다.
실시예 2
1. SF-U7 snRNA 안티센스 벡터의 생성
PstI 및 SalI 오버행(진한 정규 문자형으로 표시됨)을 가진 Fw-GCGCctgcagTAACAACATAGGAGCTGTG (서열번호 1602) 및 Rv- GCGCgtcgacCAGATACGCGTTTCCTAGGA (서열번호 1603) 프라이머를 이용하여 암컷 마우스 게놈 DNA로부터 프로모터를 가진 U7snRNA 유전자를 PCR 증폭에서 수득하였다. 전체 PCR 반응물을 1% 젤 상에 로딩하고 PCR 단편(425 bp)을 제조사의 설명서(인비트로겐(Invitrogen))에 따라 Topo-II-벡터 내로 클로닝하였다. SMopt 및 StuI 부위를 Fw- (GCTCTTTTAGAATTTTTGGAGCAGGTTTTCTGACTTCG (서열번호 1604) 및 Rv-U7snRNA-SmOPT (CGAAGTCAGAAAACCTGCTCCAAAAATTCTAAAAGAGC (서열번호 1605) 또는 Fw- (CCTGGCTCGCTACAGAGGCCTTTCCGCAAGTGTTACAGC (서열번호 1606) 및 Rv-U7snRNA-StuI (GCTGTAACACTTGCGGAAAGGCCTCTGTAGCGAGCCAGG (서열번호 1607)를 내부 프라이머로 이용하고 Fw-M13 (GTAAAACGACGGCCAG) (서열번호 1608) 및 Rv-M13 (CAGGAAACAGCTATGAC) (서열번호 1609)를 외부 프라이머로서 이용하여 내부 및 외부 프라이머 설계에 따라 부위 지시된 돌연변이를 이용하여 생성하였다[Heckman, K.L. and L.R. Pease, Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc, 2007. 2(4): p. 924-32]. PstI 및 SalI 부위를 이용하여 변형된 U7 snRNA 서열을 pRRL.PPT.SF.pre 벡터내로 다시 클로닝하였으며[Warlich E et al., Lentiviral vector design and imaging approaches to visualize the early stages of cellular reprogramming. Mol Ther. 2011 Apr;19(4):782-9.] 원래의 SFFV 프로모터를 대체하였다. 이것은 SF_U7snRNA 벡터를 생성하기 위한 절차이다.
2.고처리 스크리닝을 위한 SF-U7 snRNA 안티센스 벡터의 최적화
원래 사용된 StuI 부위는 Warlich et al의 렌티바이러스 벡터에서 유일하지 않으며 Fw-cctggctcgctacagatgcaTaggaggacggaggacg (서열번호 1610) 및 Rv-cgtcctccgtcctcctAtgcatctgtagcgagccagg (서열번호 1611) 프라이머를 이용하여 부위 지시된 돌연변이에 의해 NsiI 제한 부위에 의해 대체되었다. 대문자는 돌연변이된 잔기를 나타낸다.
3. 안티센스 서열의 삽입
원하는 안티센스 서열을 함유한 오버행 전방 프라이머(gcgcATGCAT-안티센스 서열-ttggagcagg) (서열번호 1612)를 이용하여 오버행 PCR로 새로운 안티센스 서열을 삽입하였다. 진한 대문자는 NsiI 제한 부위를 나타낸다. 역방 프라이머Rv_ms_U7snRNA_SalI는 (GCGCgtcgacCAGATACGCGTTTCCTAGGA) (서열번호 1613)이고 모든 구조체에 대하여 동일하였다. 소문자는 SalI 제한 부위를 나타낸다. PfuUltra HF (Agilent Technologies)를 이용하여 변형된 벡터(SF_U7snRNA_NSI)에서 오버행 PCR을 수행하였다. PCR 프로그램은 95℃에서 30초의 초기 변성 단계, 10초 동안 95℃에서 35 사이클, 30초 동안 60℃ 및 10초 동안 72℃로 이루어졌다. 마지막 연장 단계는 10분 동안 72℃에서였다. 원하는 안티센스 서열과 U7 snRNA를 함유한 PCR 반응물을 0.2% 에티듐브로마이드 염색된 2% 아가로즈 젤 상에 로딩하였다. 이어서 트랜스일루미네이터(UVP, LLC)하에서 밴드를 가시화하고, 잘라내고 QIAquick 젤 추출 키트(퀴아젠 게엠베하(Qiagen GmbH), 독일 힐덴)를 이용하여 추출하였다.
젤 추출 후, 정제된 생성물 16㎕를 1시간 동안 37℃에서 SalI 및 NsiI (로쉐)를 이용하여 분해하고 QIAquick PCR 정제 키트(퀴아젠 게엠베하, 독일 힐덴)를 이용하여 정제하였다.
한편, 원래의 벡터를 1시간 동안 37℃에서 SalI 및 NsiI로 분해하여 안티센스 서열이 없는 벡터를 생성하였다. 분해된 벡터를 에티듐브로마이드 염색을 가진 1% 아가로즈 젤 상에 로딩하였다. 밴드를 트랜스일루미네이터 하에서 가시화하고 분해된 벡터에 해당하는 밴드(6358 bp)를 잘라내고 QIAquick 젤 추출 키트(퀴아젠 게엠베하, 독일 힐덴)를 이용하여 정제하였다.
정제된 분해 벡터 및 분해된 PCR 생성물을 실온에서 1시간 동안 ATP (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England BioLabs))를 이용하여 T4 DNA 리가제로 라이게이션시켰다.
라이게이션 생성물을 이.콜라이(TOP10) 내로 형질전환시키고 100 ㎍/ml 암피실린(시그마(Sigma))을 함유한 LB 한천 플레이트상에 접종시켰다. 밤새 항온처리 후, 미니프렙 배양을 위한 라이게이션 생성물을 위해 세 개의 콜로니를 선택하였다. 선택된 콜로니를 밤새 100 ㎍/ml 암피실린을 함유한 2 ml LB에서 37℃에서 성장시켰다. 플라스미드의 정제는 QIAprep 스핀 미니프렙 키트(퀴아젠 게엠베하, 독일 힐덴)를 이용하여 수행하였다. 추출 후, DNA 농도는 나노브(Nanovue) 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
새로이 생성된 구조체의 서열은 서열 반응을 위하여 빅다이 터미네이터(BigDye Terminator) v3.1 (어플라이드 바이오시스템즈)을 이용한 생거 시퀀싱으로 확인하였으며 그 후 제조사의 설명서에 따라 세파덱스 G-50 (시그마)으로 정제하였다.
서열 서열번호 41-97은 U7 스크린으로 확인된 안티센스 화합물이다. 상기 안티센스 서열은 벡터 내로 클로닝 될 때 DNA로 묘사되지만, 세포에서는 RNA 분자로 전사된다. 당업자는 그러면 T가 U임을 안다.
도 22는 편파적이지 않은 인트론 1 및 엑손 2 스크린을 위한 GAA 타겟팅 안티센스 서열의 위치의 예를 보여준다.
효소 활성 분석
효소 활성은 4-메틸움벨리페론 분석을 이용하여 측정하였다. 12일의 형질도입 후에 샘플을 수집하였다. 용해 완충액은 50mM Tris (pH 7.5), 100mM NaCl, 50mM NaF, 1% Tx-100 및 EDTA를 가진 하나의 정제 프로테아제 억제제(로쉐)로 이루어졌다. 용해 버퍼를 수집 전에 5분 동안 얼음에서 형질도입된 섬유아세포에서 항온처리하였다. 샘플을 직접 이용하거나 액체 질소를 이용하여 스냅-동결하고 -80℃에서 저장하였다. 다르게는, 샘플을 4-메틸움벨리페론 분석에서 추가 사용을 위해 얼음 상에 유지하였다.
GAA 활성은 특성이 형광성인 4-메틸움벨리페릴-α-D-글루코피라노시드 기질을 이용하여 측정하였다. 샘플의 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트(피어스(Pierce), 써모 사이언티픽)를 이용하여 로우리 단백질법에 의해 결정하였다. 소 혈청 알부민(BSA) 표준은 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 0.6, 1.0, 2.0 mg/ml로 이루어졌다. BCA 단백질 분석을 위하여 흡광도를 562 nm에서 측정하였으며, 4-메틸움벨리페론 분석을 위하여 바리오스칸(Varioskan) (써모 사이언티픽) 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 여기는 365 nm에서 그리고 방출은 448 nm에서였다. GAA 효소 활성은 시간 당 총 단백질 밀리그램 당 가수분해된 기질의 나노몰로 표현하였다.
렌티바이러스 벡터 생산 프로메가
렌티바이러스 벡터 생산을 위하여, 10 cm 배양 접시에서 성장하는 90% 융합성 293T 세포를 10 cm 배양 접시 상에 1/8 접종하였다. After 16-24 시간 후, 3 ㎍ U7 snRNA 구조체, 2 ㎍ Pax2 및 1 ㎍ VSV를 푸젠(Fugene) 6 형질감염 제제(프로메가(Promega))를 이용하여 동시형질감염시켰다. 바이러스 상등액(9 ml)을 형질감염 후 72시간에 수집하고, 0.45　㎛ 필터(밀렉스(Millex)HV, 밀리포어(Millipore))에서 여과하고 벡크만(Beckman) 울트라센트리퓨지(벡크만 카울터(Beckman Coulter))에서 20.000 rpm, 4 ℃에서 2시간 동안 울트라-원심분리하여 농축하였다. 바이러스 펠렛을 100 ㎕ 둘베코 변형 이글 배지 저 글루코스(깁코(Gibco), 영국 파이슬리)에 재현탁시키고, 크리오튜브(CryoTubes)(써모 사이언티픽)에 분액하여 -80℃에서 저장하였다. HIV p24 항원 ELISA 키트 (레트로텍(Retrotek), 젭트로메트릭스 코포레이션(ZeptroMetrix Corporation))로 울트라원심분리하여 농축한 후 렌티바이러스 역가를 결정하였다. 바리오스칸 마이크로플레이트 판독기(써모 사이언티픽)로 분석을 측정하였다.
세포의 형질도입
접종 후 24시간에 배양 배지를 6 ng/ml 프로타민 설페이트(시그마(sigma))를 함유한 새로운 배양 배지로 대체하였다. 세포를 동일한 역가의 렌티바이러스로 형질도입시켰다(상기 참조).
환자로부터의 일차 섬유아세포를 U7snRNA AON 구조체를 함유한 렌티바이러스로 상기한 바처럼 형질도입시켰으며 스플라이싱이 일어나도록 하였다. 섬유아세포에서의 스크린은 단일 유형의 U7 snRNA AON을 발현하는 렌티바이러스로 일차 섬유아세포를 함유한 개별 웰을 감염시켜 수행하였다. RNA는 감염 후 5일에 분석하였다. 스플라이싱 생성물은 RT-qPCR로 분석하였다. GAA 효소 활성은 감염 후 12일에 분석하였다(상기 참고: 효소 활성 분석). 도 19는 상이한 AON에 의한 엑손 2 포함에서의 변화를 보여준다. 안티센스 서열을 이용한 GAA의 인트론 1과 엑손 2에 대한 스크린의 RT-qPCR을 이용한 RNA 발현 분석은 U7 소핵 RNA 시스템을 이용하였다. 숫자는 표 1에 따른 안티센스 서열 위치를 나타낸다. 대조군은 첨가된 AON 벡터가 없는 환자 섬유아세포이다.
도 20은 U7 소핵 RNA 시스템에서 사용된 안티센스 서열을 이용한 GAA의 인트론 1과 엑손 2에 대한 스크린의 RT-PCR을 이용한 RNA 분석을 보여준다. 숫자는 표 1에 따른 안티센스 서열 위치를 나타낸다. GAA RT-PCR에서, 세 가지 주요 생성물이 관찰된다. 상부 생성물은 엑손 2 포함을 나타내고, 하부 더블릿은 엑손 2의 부분 스키핑(더블릿의 상부 밴드) 및 엑손 2의 완전한 스키핑(더블릿의 하부 밴드)를 나타낸다. 베타-액틴 RT-PCR을 로딩 대조군으로 이용하였다.
도 21은 U7 소핵 RNA 시스템에서 안티센스 서열을 이용한 GAA의 인트론 1과 엑손 2에 대한 스크린의 GAA 효소 활성을 보여준다. 숫자는 표 1에 따른 안티센스 서열 위치를 나타낸다. 대조군은 첨가된 AON 벡터가 없는 환자 섬유아세포이다.
일부 클론은 엑손 2의 포함을 상당히 증가시키며 그에 따라 IVS1 돌연변이를 가진 폼페 환자를 위한 치료의 잠재적 후보를 제공함이 명백하다. 도 23은 확인된 서열이 인핸서 및 사일런스 모티프 둘다로서 확인되었으므로, 확인된 서열이 예측될 수 없었음을 보여주는 예를 보여준다.
실시예 3
지금까지 폼페병을 야기하는 가장 일반적인 돌연변이는 c.-32-13T>G (IVS1) 돌연변이이다. GAA 유전자 내의 이 돌연변이는 엑손 2의 13 염기쌍 상류의 인트론 내에 위치하며, 이 엑손은 GAA mRNA의 번역을 위한 개시 코돈을 함유한다. IVS1 돌연변이는 GAA 전사물의 대략 90%에서 엑손 2의 미스-스플라이싱을 야기하며 이는 이것이 엑손 2 스플라이스 수용자 부위의 강도를 감소시키는 폴리피리미딘 트랙트를 파괴하기 때문이다.
스플라이스 부위의 이러한 감소된 강도에 대응하기 위하여, GAA 엑손 2의 스플라이싱에 대하여 부정적 효과를 갖는 스플라이싱 인자에 결합하는 서열을 확인하기 원한다. 엑손 2 내 및 그 주위의 임의 돌연변이의 통합에 의해 이들 서열을 찾을 수 있었다.
많은 수의 돌연변이의 빠른 스크리닝을 위하여 GAA 엑손 1, 인트론 1, 엑손 2, 인트론 2, 엑손 3 및 인트론 3의 일부를 함유한 미니유전자를 생성하였다(도 24, 파트 1). 2개의 유일한 제한 부위를 통합시킴으로써, 엑손 2를 둘러싸는 미니유전자의 부분을 돌연변이 서열로 빨리 교환할 수 있다(도 24, 파트 2). PCR을 차선의 조건에서 수행하여 PCR 생성물 내에 임의 돌연변이를 통합시킨다(도 24, 파트 3). 엑손 2 주위에 위치한 제한 부위를 또한 함유한 이들 PCR 생성물은 이어서 직접 목적 벡터 내로 라이게이션될 수 있다. 라이게이션된 생성물의 형질전환 후, 클론을 선택하고 임의 돌연변이를 함유한 플라스미드를 클론으로부터 분리할 수 있다(도 24, 파트 4). 이들 클론을 HEK293 세포내로 별도로 형질감염하면 GAA 미니유전자로부터 RNA-전사물을 생성하여 대조군에 비하여 차이가 있는 스플라이싱을 야기한다. 일 예가 도 파트 5에 나타나며, 인접 엑손 RT-PCR과 엑손 내부 qPCR이 3 클론으로부터 생성된 cDNA에 대해 수행된다(도 24, 파트 5에 나타남). 엑손 2의 더 많은 포함을 야기하는 플라스미드의 시퀀싱은 부정적 방식으로 스플라이싱에 영향을 주는 중요한 서열에 대한 확인을 야기한다. 이들 서열은 후속하여 안티센스 치료를 위한 잠재적 타겟으로서 시험하기 위하여 또는 이 영역에 결합하는 화합물의 스크리닝을 위하여 사용될 수 있다.
도 25는 클론 중 둘의 결과를 제공한다. 클론 115 및 클론 97은 IVS1 돌연변이에 비하여, 각각 엑손 2 포함의 118% 및 297% 증가를 보여준다. 클론 115는 돌연변이 c.17C>T, c.469C>T, 및 c.546+23C>A를 함유한다. 이는 야생형 스플라이싱의 증가(밴드 1) 및 완벽한 스키핑의 감소(밴드 3)를 야기한다. 클론 97은 돌연변이c.-32-102T>C, c.-32-56C>T, c.11G>A, c.112G>A, 및 c.137C>T를 함유한다. 이 클론은 또한 c.-32-553 내지 c.-32-122가 없지만, 이것은 엑손 2 배제에 영향을 주지 않는다(이 영역을 함유하거나 함유하지 않는 미니유전자 구조체로부터의 스플라이싱 비교에 의해 결정됨). 야생형 스플라이싱(밴드 3)이 강하게 증가되는 반면, 부분(밴드 2) 및 완전한(밴드 3) 스키핑이 감소된다.
엑손 1-엑손 3을 위한 미니유전자는 별도로 하고, 본 발명자들은 또한 GAA 엑손 5 내지 GAA 엑손 8의 게놈 영역을 함유한 미니유전자를 생성하였다. 이 미니유전자로 본 발명자들은 IVS1 돌연변이와 유사하게 스플라이싱에 영향을 주는 다른 돌연변이를 시험할 수 있다.
도 36은 GAA mRNA의 인트론 6의 포함에 대한 넌센스 매개 소멸(NMD) 경로의 억제 결과를 보여준다. 건강한 대조군(상부 젤), 유전자형 c.-32-13T>G, c.525delT를 가진 폼페 환자(중간 젤), 및 유전자형 c.525delT, c.525delT를 가진 폼페 환자(하부 젤)으로부터의 일차 섬유아세포의 시클로헥사미드 처리를 수행하였다. NMD 경로의 억제가 없으면(0 시간으로 라벨링된 레인), 엑손 6과 엑손 7의 정규 스플라이싱을 나타내는 강한 밴드가 RT-PCR을 이용하여 검출되었다. 정규 밴드 바로 위에 희미한 밴드가 관찰되었다. 이 밴드는 DNA 서열 분석에 의해 인트론 6의 포함을 나타내는 것으로 결정되었다. 그러한 생성물은 해독 프레임을 변화시켜 NMD 경로의 활성화를 야기하므로, 본 발명자들은 인트론 6 포함이 사실상 적절한 검출을 피하는 빈번한 사건일 수 있다고 생각했다. 이 생각은 NMD 경로의 억제에 의해 확인되었으며, 이는 인트론 6 포함을 나타내는 강한 밴드의 검출을 야기하였다. 이것은 많은 GAA 프리-mRNA 종이 건강한 대조군 및 폼페 환자에서 정규 스플라이싱을 벗어남을 나타냈다. 상기에 언급된 GAA 엑손 5-8을 함유한 미니유전자 및 U7 snRNA 스크린이 엑손 6/7 스플라이싱의 억제자의 차단에 의해 최종 mRNA에서 인트론 6의 포함을 방지할 수 있는 서열을 확인하기 위해 사용될 것이다. 이는 폼페병을 야기하는 누수 야생형 스플라이싱을 가진 모든 스플라이싱 돌연변이에 대한 포괄적 치료법을 나타낼 것이며, 그 이유는 엑손 6/7의 정확한 스플라이싱이 향상되어 누수 야생형 스플라이싱의 정도를 향상시킬 것이기 때문이다.
하기 돌연변이는 증가된 RNA 발현을 제공한다: c.17C>T, c.469C>T, 및 c.546+23C>A., c.-32-102T>C, c.-32-56C>T, c.11G>A, c.112G>A, 및 c.137C>T. 이들 돌연변이가 위치한 mRNA 서열을 타겟팅하는 AON은 환자 치료에 유용할 수 있다. 서열번호 98-540은 미니유전자 접근법에서 발견된 예시적 서열들이다. 상기 표는 서열번호 98-540 및 이들이 타겟팅하는 돌연변이 또는 게놈 서열을 보여준다.
도 26은 서열번호 12 (AON 1)(상부 패널) 및 서열번호 33 (AON 2) (하부 패널)을 위한 투여량-응답 곡선을 보여준다. 하나의 대립유전자 상에 유전자형 c.-32-13T>G (IVS1)을 가지고 다른 대립유전자 상에 c.525delT를 가진 환자-유래 섬유아세포를 미처리하거나('형질감염 없음') 0-20 μM의 안티센스 올리고머 화합물로 항온처리하였다. c.525delT는 넌센스-매개 소멸을 일으키며, 이는 왜 RNA 수준에서의 효과가 주로 IVS1 대립유전자로부터 유래되는지를 설명한다. 3일 후 RNA 분석을 위하여 세포를 수집하고(A, C), 단백질 분석을 위하여 5일 후 세포를 수집하였다(B, D). 서열번호 12 AON 1 및 서열번호 33 (AON 2) 둘 모두 GAA 프리-mRNA의 인트론 1에 존재하는 서열에 결합하며, 이는 U7 snRNA 분석을 이용하여 확인하였다. 이는 엑손 2 포함의 촉진을 야기하여, 야생형 GAA mRNA의 증가된 발현을 야기한다. 이는 mRNA 수준에서(야생형 GAA를 특이적으로 검출하는 프라이머를 이용함) 그리고 단백질 수준에서(GAA 효소 활성을 위한 분석을 이용함) 측정한다.
RNA 분석: 총 RNA를 분리하고, cDNA를 합성하고, RT-qPCR 분석을 수행하여 GAA 엑손 2 포함을 검출하였다(엑손 1을 위해 특이적인 전방 프라이머와 엑손 2에 대해 특이적인 역방 프라이머를 이용함).
단백질 분석: 4-MU 분석을 이용하여 GAA 효소 활성을 측정하였다. 활성을 BCA 분석을 이용하여 측정한 총 단백질에 대해 정규화하였다.
안티센스 올리고머 화합물 처리: 본 발명에서 사용된 안티센스 올리고머 화합물은 유전자 툴로부터 수득한 모르폴리노이다. 안티센스 올리고머 화합물을 제조사의 설명서에 따라 엔도포터(endoporter)(유전자 툴)를 이용하여 세포 내로 형질감염시켰다.
하기의 실험은 환자 섬유아세포주 1(도 26)의 실험과 유사하며 안티센스 올리고머 화합물이 또한 다른 환자로부터의 독립적 세포주 2에서도 작용함을 입증하기 위한 것이다. 이 경우에, 유전자형은 한 대립유전자에서는 IVS1이고 다른 대립유전자에서는 미스센스 변이체(c.923A>C)였다. c.923A>C 대립유전자는 넌센스-매개 소멸을 일으키지 않으며, mRNA 수준은 두 대립유전자의 혼합물을 나타내어, 환자 1에 비하여 IVS1 대립유전자에 대한 효과가 덜 심하도록 함을 주목한다. 도 27은 서열번호 12 (AON 1)(상부 패널) 및 서열번호 33 (AON 2)(하부 패널)을 위한 투여량-응답 곡선을 보여준다.
도 28은 엑손 2 포함을 촉진하는데 있어서 안티센스 올리고머 화합물 서열번호 12 (AON 1) 및 서열번호 33 (AON 2)의 특이성을 보여준다.
서열번호 35 (대조군 AON 2) 및 서열번호 36 (대조군 AON 3)은 GAA의 인트론 1 내의 다른 영역을 타겟팅하지만, 엑손 2 포함을 촉진하는데 있어서 효과적이지 않다. CypA mRNA를 타겟팅하는 무관한 AON(대조군 AON 1; 서열번호 34)은 GAA 엑손 2 포함에 영향을 주지 않는다. 서열번호 12 (AON 1) 및 서열번호 33 (AON 2)는 RT-qPCR 분석(A) 및 수반되는 GAA 효소 활성 분석(B)에 의해 나타난 대로 GAA 엑손 2의 포함을 효율적으로 촉진한다. 이는 서열번호 12 (AON 1) 및 서열번호 33 (AON 2)에서처럼, U7 snRNA 분석에서, 확인된 인트론 스플라이스 사일런싱(ISS) 서열이 타겟팅될 때만, GAA 엑손 2 포함이 촉진됨을 보여준다.
Figure 112016128736525-pct00049
* CypA cDNA 서열은 Refseq entry NM_021130.4임.
** GAA cDNA 서열은 Refseq entry NM_000152.3임.
도 32는 환자 섬유아세포주 1에 대한 서열번호 33 (AON 2)의 효과의 시간 과정을 보여준다. 안티센스 올리고머 화합물의 첨가 후 3-7일에 GAA 활성에 대해 세포를 분석하였다. 안티센스 올리고머 화합물은 실험 동안 배지에 계속 존재하였다.
도 32는 3일 후 GAA 활성에 대한 효과가 시작되고 AON 첨가 후 5일에 최대에 도달함을 보여준다.
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antisense oligomeric compound <400> 43 cccaggaaga ccagcaaggc 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 44 tcaaacacgc ttagaatgtc 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 45 gtctgctaaa atgttacaaa 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 46 gagtgcagag cacttgcaca 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 47 cgagaaaagc tccagcaggg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 48 gagagggcca gaaggaaggg 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 49 gccctgctgt ctagactggg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 50 aggtggccag ggtgggtgtt 20 <210> 51 <211> 20 <212> 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compound <400> 1570 accccaactc accagggg 18 <210> 1571 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1571 caccccaact caccaggg 18 <210> 1572 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1572 ccaccccaac tcaccagg 18 <210> 1573 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1573 accaccccaa ctcaccag 18 <210> 1574 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1574 caccacccca actcacca 18 <210> 1575 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1575 ccaccacccc aactcacc 18 <210> 1576 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1576 gccaccaccc caactcac 18 <210> 1577 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1577 tgccaccacc ccaactca 18 <210> 1578 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1578 ctgccaccac cccaactc 18 <210> 1579 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1579 cctgccacca ccccaact 18 <210> 1580 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1580 ccctgccacc accccaac 18 <210> 1581 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1581 cccctgccac caccccaa 18 <210> 1582 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1582 tcccctgcca ccacccca 18 <210> 1583 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligomeric compound <400> 1583 ctcccctgcc accacccc 18 <210> 1584 <211> 368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 1584 aaccccagag ctgcttccct tccagatgtg gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg 60 aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac atcttcctgg gcccagagcc caagagcgtg 120 gtgcagcagt acctggacgt tgtgggtagg gcctgctccc tggccgcggc ccccgcccca 180 aggctccctc ctccctccct catgaagtcg gcgttggcct gcaggatacc cgttcatgcc 240 gccatactgg ggcctgggct tccacctgtg ccgctggggc tactcctcca ccgctatcac 300 ccgccaggtg gtggagaaca tgaccagggc ccacttcccc ctggtgagtt ggggtggtgg 360 caggggag 368 <210> 1585 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 1585 aaccccagag ctgcttccct tccagatgtg gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg 60 aggtcgacag gtgg 74 <210> 1586 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 1586 gatcctggat gtctacatct tcctgggccc agagcccaag agcgtggtgc agcagtacct 60 ggacgttgtg ggta 74 <210> 1587 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 1587 gggcctgctc cctggccgcg gcccccgccc caaggctccc tcctccctcc ctcatgaagt 60 cggcgttggc ctgc 74 <210> 1588 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 1588 aggatacccg ttcatgccgc catactgggg cctgggcttc cacctgtgcc gctggggcta 60 ctcctccacc gcta 74 <210> 1589 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target sequence <400> 1589 tcacccgcca ggtggtggag aacatgacca gggcccactt ccccctggtg agttggggtg 60 gtggcagggg ag 72 <210> 1590 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1590 gggtgctcct ggacaactac 20 <210> 1591 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1591 cctgttgcaa cttcttcgcc 20 <210> 1592 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1592 atggcacctg ggaatgtacc 20 <210> 1593 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1593 gtgttgttcc agagcccact 20 <210> 1594 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1594 acgctctgaa tgtcacacga 20 <210> 1595 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1595 gttggcagcc agtcagagat 20 <210> 1596 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1596 aaaaagcagt gggctctgga 20 <210> 1597 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1597 cggtgaagag tccacgaagt 20 <210> 1598 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1598 cagaagggcg tgaagaaccg 20 <210> 1599 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1599 cccgtgagga gtttccaatt tc 22 <210> 1600 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1600 acttcgtgga ctcttcaccg 20 <210> 1601 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1601 agtacacggg gactgagtgt 20 <210> 1602 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1602 gcgcctgcag taacaacata ggagctgtg 29 <210> 1603 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1603 gcgcgtcgac cagatacgcg tttcctagga 30 <210> 1604 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1604 gctcttttag aatttttgga gcaggttttc tgacttcg 38 <210> 1605 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1605 cgaagtcaga aaacctgctc caaaaattct aaaagagc 38 <210> 1606 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1606 cctggctcgc tacagaggcc tttccgcaag tgttacagc 39 <210> 1607 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1607 gctgtaacac ttgcggaaag gcctctgtag cgagccagg 39 <210> 1608 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1608 gtaaaacgac ggccag 16 <210> 1609 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1609 caggaaacag ctatgac 17 <210> 1610 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1610 cctggctcgc tacagatgca taggaggacg gaggacg 37 <210> 1611 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1611 cgtcctccgt cctcctatgc atctgtagcg agccagg 37 <210> 1612 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer - first part befiore antisense <400> 1612 gcgcatgcat 10 <210> 1613 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1613 gcgcgtcgac cagatacgcg tttcctagga 30 <210> 1614 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer second part after antisense sequence <400> 1614 ttggagcagg 10 <210> 1615 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TAT sequence <400> 1615 Cys Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 1616 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 1 example <400> 1616 ggccaggaat aacacgatcg 20 <210> 1617 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 9 product 1 <400> 1617 cacggagcgg gcctgtagga 20 <210> 1618 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 9 Product 1 <400> 1618 cacttcacga tcaaagatc 19 <210> 1619 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 9 Product 2 <400> 1619 cacggacggg acatcctga 19 <210> 1620 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 9 Product 3 <400> 1620 cacggagcgg atcaaagatc 20 <210> 1621 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 product 4 <400> 1621 ccccctgcag ggccctggcc 20 <210> 1622 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 Product 4 <400> 1622 ggccaggaat aacacgatcg 20 <210> 1623 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 Product 5 <400> 1623 ccccctgcag aacacgatcg 20 <210> 1624 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 Product 6 <400> 1624 cacggagcgg gcctgtagga 20 <210> 1625 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 Product 6 <400> 1625 cacttcacga tcaaagatc 19 <210> 1626 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 Product 7 <400> 1626 cacggagcgg gacatcctga 20 <210> 1627 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 Product 8 <400> 1627 cacggagcgg atcaaagatc 20 <210> 1628 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 Product 9 <400> 1628 gattgggaaa ggtatggccc g 21 <210> 1629 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 Product 9 <400> 1629 catgtggatt gacatgaacg 20 <210> 1630 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 10 Product 10 <400> 1630 gattgggaag gacatgaacg 20 <210> 1631 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 Product 11 <400> 1631 aatgccatgg atgtggtcct 20 <210> 1632 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 Product 11 <400> 1632 cctggacgtt gatacccgtt 20 <210> 1633 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 product 12 <400> 1633 gattgggaag gtatggcccg 20 <210> 1634 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 Product 12 <400> 1634 catgtggatt gtaagtgtgg 20 <210> 1635 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 Product 12 <400> 1635 tctcttggag gacatgaacg 20 <210> 1636 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 Product 13 <400> 1636 catgtggatt gacatgaacg 20 <210> 1637 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 product 14 <400> 1637 gattgggaag agtcacctac 20 <210> 1638 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 Product 15 <400> 1638 gatcatcgtg gatcctgcca 20 <210> 1639 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 Product 15 <400> 1639 gattgggaag gtatggcccg 20 <210> 1640 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 11 Product 16 <400> 1640 gatcatcgtg gtatggcccg 20 <210> 1641 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 12 Product 17 <400> 1641 cttccccctg gacgtccaat 20 <210> 1642 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 12 Product 17 <400> 1642 gatcatcgtg gatcctgcca 20 <210> 1643 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 12 Product 18 <400> 1643 gttcaacaag gatcctgcca 20 <210> 1644 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 12 product 19 <400> 1644 gattgggaag gtatggcccg 20 <210> 1645 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 12 Product 21 <400> 1645 catgtggatt gacatgaacg 20 <210> 1646 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 12 Product 22 <400> 1646 gattgggaag gacatgaacg 20 <210> 1647 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1647 aaactgaggc acggagcg 18 <210> 1648 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1648 gaagggctcc tcggagaa 18 <210> 1649 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1649 agctcctctg aaatgggcta ca 22 <210> 1650 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1650 gcaaggtccc ggttccaca 19 <210> 1651 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1651 gctaacaggc gctacgaggt 20 <210> 1652 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1652 tgctgtttag caggaacacc c 21 <210> 1653 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1653 ctgttctttg cggaccagtt c 21 <210> 1654 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1654 ccacaacgtc caggtactgc t 21 <210> 1655 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1655 ggtctcaccc tttctacctg g 21 <210> 1656 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1656 gtgatagcgg tggaggagta g 21 <210> 1657 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1657 cagcagtacc tggacgttgt g 21 <210> 1658 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1658 agtccatgta gtccaggtcg tt 22 <210> 1659 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1659 cgttcatgcc gccatact 18 <210> 1660 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1660 ggtctcgttg gtgatgaaaa c 21 <210> 1661 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1661 gacgtccagt ggaacgacct 20 <210> 1662 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1662 acctggtcat ggaactcagc 20 <210> 1663 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1663 gatcctgcca tcagcagct 19 <210> 1664 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1664 tgggttctcc agctcattgt 20 <210> 1665 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1665 aggacatggt ggctgagttc 20 <210> 1666 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1666 cgtagaggtt gtgcaggttg ta 22 <210> 1667 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1667 aacgagcctt ccaacttcat c 21 <210> 1668 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1668 gagcgggaga tcacaaatgg 20 <210> 1669 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1669 caccagtttc tctccacaca cta 23 <210> 1670 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1670 gttccgcatg aaggggtaga 20 <210> 1671 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1671 acacgcccat ttgtgatctc 20 <210> 1672 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1672 gtgtagaggt gggggaggag t 21 <210> 1673 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1673 aaatcctgca gtttaacctg ctg 23 <210> 1674 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1674 gcaggtcgta ccatgtgcc 19 <210> 1675 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1675 gagccgtaca gcttcagcga 20 <210> 1676 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1676 atgtacccag cccggaggt 19 <210> 1677 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1677 cctggactgt ggaccacca 19 <210> 1678 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1678 caggaagatg acctgtgtgt agg 23 <210> 1679 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1679 gtgccagtag aggcccttg 19 <210> 1680 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1680 ggctgtaggt gaagttggag ac 22 <210> 1681 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1681 tcacaaccac agagtcccg 19 <210> 1682 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1682 agaaactgct ctcccatcaa ca 22 <210> 1683 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1683 aaccgcgaga agatgaccc 19 <210> 1684 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1684 gccagaggcg tacagggata g 21 <210> 1685 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1685 agctcctctg aaatgggcta cac 23 <210> 1686 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1686 ggttctcagt ctccatcatc acg 23 <210> 1687 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1687 atccagctaa caggcgctac 20 <210> 1688 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1688 gctcctcgga gaactccac 19 <210> 1689 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1689 ctgttctttg cggaccagtt 20 <210> 1690 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1690 ctgagcatca ggggactgag 20 <210> 1691 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1691 cgaacctcta cgggtctcac 20 <210> 1692 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1692 tgctgtttag caggaacacc 20 <210> 1693 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1693 cttagctgga ggtcgacagg 20 <210> 1694 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1694 cacaacgtcc aggtactgct 20 <210> 1695 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1695 cgttcatgcc gccatact 18 <210> 1696 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1696 ggtcatgttc tccaccacct 20 <210> 1697 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1697 gacgtccagt ggaacgacct 20 <210> 1698 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1698 gaagtcccgg aagccatc 18 <210> 1699 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1699 atcctgccat cagcagctc 19 <210> 1700 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1700 ggtctcgttg gtgatgaaaa 20 <210> 1701 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1701 cactgccttc cccgactt 18 <210> 1702 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1702 acctggtcat ggaactcagc 20 <210> 1703 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1703 acatgaacga gccttccaac 20 <210> 1704 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1704 acgtagggtg ggttctccag 20 <210> 1705 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1705 cctccagcca ccagtttctc t 21 <210> 1706 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1706 tgtgggaggc gatggctt 18 <210> 1707 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1707 gacacgccca tttgtgatct 20 <210> 1708 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1708 ccaggagctc cacacgtc 18 <210> 1709 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1709 ctcagaggag ctgtgtgtgc 20 <210> 1710 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1710 cagactgagc aggctgttgt 20 <210> 1711 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1711 cagcaggcca tgaggaag 18 <210> 1712 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1712 ggcctggtgg aacagtgtg 19 <210> 1713 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1713 cccaaggact ctagcacctg 20 <210> 1714 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1714 caaggggaag tagccagtca 20 <210> 1715 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1715 gtgccagtag aggcccttg 19 <210> 1716 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1716 gaggtggacg ttgatggtgt 20 <210> 1717 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1717 gcctcacaac cacagagtcc 20 <210> 1718 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1718 tctctccatc gtcccagaac 20 <210> 1719 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1719 tgcagaaggt gactgtcctg 20 <210> 1720 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1720 gggctgtagg tgaagttgga 20 <210> 1721 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1721 gggcggagtg tgttagtctc 20 <210> 1722 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1722 ctccaggtga cacatgcaac 20 <210> 1723 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fig. 23 example <400> 1723 gcttttctcg cccttccttc tggccctctc cccagtctag 40 <210> 1724 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Figure 33 example <400> 1724 gctctgcact cccctgctgg agcttttctc gcccttcctt ctggccctct cccca 55 <210> 1725 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Figure 33 AON1 <400> 1725 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Claims (26)

  1. 서열번호 1 또는 단일 뉴클레오티드 다형성을 갖는 서열번호 1을 타겟팅하는 안티센스 올리고머 화합물로서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 10-17 및 33 중 어느 하나를 포함하는 안티센스 올리고머 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 안티센스 올리고머 화합물의 하나 이상의 뉴클레오티드의 당이 변형된 당인 안티센스 올리고머 화합물.
  3. 제2항에 있어서, 당 변형은 2'-O-메틸 또는 2'-O-메톡시에틸인 안티센스 올리고머 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 안티센스 올리고머 화합물의 하나 이상의 뉴클레오티드의 염기가 변형된 염기인 안티센스 올리고머 화합물.
  5. 제1항에 있어서, 안티센스 올리고머 화합물의 백본이 변형된 백본인 안티센스 올리고머 화합물.
  6. 제5항에 있어서, 안티센스 올리고머 화합물의 백본은 모르폴리노 포스포로티오에이트 또는 모르폴리노 포스포로디아미데이트인 안티센스 올리고머 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 안티센스 올리고머 화합물은 서열번호 12 또는 서열번호 33인 안티센스 올리고머 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폼페병의 치료에 사용하기 위한 안티센스 올리고머 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 치료는 산 알파 글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 인간 유전자에서 돌연변이 c.-32-13T>G를 포함하는 환자의 치료인 안티센스 올리고머 화합물.
  10. 제8항에 있어서, 치료는 GAA 프리-mRNA에서 엑손 포함을 야기하는 안티센스 올리고머 화합물.
  11. 제10항에 있어서, 치료는 GAA 프리-mRNA에서 엑손 2의 포함을 야기하는 안티센스 올리고머 화합물.
  12. 세포를 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고머 화합물과 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 GAA 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절하는 인 비트로 방법.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고머 화합물를 포함하는, 세포에서 GAA 프리-mRNA의 스플라이싱을 조절하기 위한 조성물.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고머 화합물을 세포에 투여하는 단계를 포함하는, 세포에서 GAA의 기능을 회복시키는 인 비트로 방법.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고머 화합물를 포함하는, 세포에서 GAA의 기능을 회복시키기 위한 조성물.
  16. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고머 화합물를 포함하는, 대상의 세포에서 비정상적인 유전자 발현을 교정하기 위한 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 세포는 근육 세포인 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 세포 또는 대상이 c.-32-13T>G, c.-32-3C>G, c.547-6, c.1071, c.1254, 및 c.1552-30의 군으로부터 선택되는, 산 알파 글루코시다제(GAA)를 인코딩하는 인간 유전자에서의 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 세포 또는 대상이 돌연변이 c.-32-3C>G 또는 c.-32-13T>G를 포함하는 조성물.
  20. 제12항에 있어서, GAA 프리-mRNA에서 엑손 2 포함이 유도되는 인 비트로 방법.
  21. 제14항에 있어서, GAA 프리-mRNA에서 엑손 2 포함이 유도되는 인 비트로 방법.
  22. 제13항에 있어서, GAA 프리-mRNA에서 엑손 2 포함이 유도되는 조성물.
  23. 제15항에 있어서, GAA 프리-mRNA에서 엑손 2 포함이 유도되는 조성물.
  24. 제16항에 있어서, GAA 프리-mRNA에서 엑손 2 포함이 유도되는 조성물.
  25. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 안티센스 올리고머 화합물 적어도 하나를 포함하는 폼페병의 치료를 위한 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 조성물은 추가로 약학적 허용 부형제 및/또는 세포 전달제를 포함하는 약학 조성물.
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