KR102575631B1 - 미세조류 생화학적 봉쇄 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미세조류 생화학적 봉쇄 방법에 대한 것으로, 본 발명의 실시예에 따르면, 공생배양 환경에서 미생물에게서 나오는 신호전달물질(AHL)을 kill switch로 활용하여, 미세조류내의 신호전달물질의 농도에 따라 배양과정의 수행과 자멸과정의 수행을 구현할 수 있도록 하는 생화학적 봉쇄시스템을 구현할 있도록 하여, 미세조류를 활용한 다양한 분야에 활용할 수 있도록 하는 효과가 있다.

Description

미세조류 생화학적 봉쇄 방법{Biocontainment method of microalgae}

본 발명은 미세조류 생화학적 봉쇄 방법에 대한 것이다.

미세조류는 이산화탄소와 물, 그리고 태양에너지를 이용하여 에너지주요인자인 유기물을 합성하고 산소를 생산하는 광합성 생물이다. 이러한 미세조류는 대기 중 이산화탄소를 고정할 수 있고, 단백질 및 지질함량이 높으므로 식품, 사료 또는 연료 생산용 바이오매스로 활용될 수 있다. 구체적으로, 미세조류의 1차 대사산물인 지질, 당질 또는 단백질 등은 바이오디젤, 바이오에탄올 또는 바이오가스와 같은 다양한 바이오연료의 공급원 및 다가불포화지방산(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)의 원료로도 사용될 수 있고, 미세조류의 2차 대사산물인 비타민, 카로테노이드, 다당류, 루테인 등의 고부가 유용 물질은 기능성식품, 천연색소, 의약용물질, 동물사료, 수산양식용 사료 등으로 이용될 수 있다.

미세조류를 이용하여 산업폐수, 도시하폐수, 농업폐수 등을 처리하는 연구가 계속되어 오고 있다. 미세조류는 태양의 광에너지와 물속의 전자를 이용하고, 영양염류와 대기중의 탄소를 흡수하여 성장하기 때문에, 지구온난화와 같은 기후변화에 대응할 수 있는 유망한 처리방법이라 할 수 있다. 미세조류는 수계에서 광합성을 통해 질소와 인에 의한 부영양화를 제어하고, 중금속을 제거할 수 있다. 한편, 미생물은 미세조류와 연합하여 수계에서 비타민과 유기물질을 주고받는 것과 같은 상호작용을 진행하여 미세조류의 효과적인 성장을 도우며, 오염된 특정한 환경에서 미세조류와 연합해 오염을 제거하는 것으로 알려져 있다. 하지만 높은 농도의 중금속은 미세조류의 성장을 억제하여 미세조류가 효과적으로 수질을 정화할 수 없도록 한다.

종래기술에서 생명체를 이용한 정화는 주로 사멸한 세포의 외부에의 흡착을 이용한 방법을 사용하지만, 이러한 방법은 오염의 정도에 따라서 사용해야 하는 세포의 양이 증가하게 되는 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하기 위해 미세조류를 성장시키면서 중금속을 제거하면 추가적인 세포의 투입 없이 연속적인 처리가 가능하지만, 특정한 중금속에 의해 오염된 상황에서 미세조류는 성장이 저해되거나 심하면 사멸하는 등의 어려움이 있다.

이와 같이 미세조류를 이용하여 오폐수를 정화하는 분야에 적용기술은 다양하게 발전해 왔지만, 종래의 경우 정화 효율을 극대화 시킬 수 있는 외부 유전자를 도입한 미세조류를 배양하고 중금속을 제거하는 효율을 증대하는 방향으로 개발이 지속되어 왔으나, 배양후 유전자 합성된 미세조류를 활용한 이후의 이를 자연환경에 배출하는 이후의 생태계 교란 및 환경파괴에 대한 리스크가 상존하는 유전자 합성된 미세조류를 처리하는 방법에 대한 필요성이 대두되고 있다.

한국공개특허 제2003-76133호 한국공개특허 제2003-95154호 한국공개특허 제2006-100869호 한국공개특허 제2005-0024728호 한국공개특허 제2012-73432호 한국공개특허 제2011-118908호

본 발명은 상술한 과제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 공생배양 환경에서 박테리아에게서 나오는 신호전달물질(AHL)을 매개로, 미세조류 배양 환경 내 박테리아 개체수에 킬 스위치(kill switch)로 활용하여, 미세조류내의 신호전달물질의 농도에 따라 배양과정의 수행과 자멸과정의 수행을 구현할 수 있도록 하는 생화학적 봉쇄시스템을 구축하는 데 있다.

상술한 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명의 실시예에서는, 미세조류와 박테리아의 공생 배양 과정 중 발생하는 신호 물질(AHL)을 활용한 생화학적 봉쇄(biocontainment) 방법을 구현하되, 세포주를 박테리아와 공동배양하기 전, 비활성된 독성물질의 지속적인 합성을 개시시키는 활성화단계;와 원핵생물과 세포주가 같이 공동배양될 때는 신호물질(AHL)을 인식하는 유도 프로모터로 인해 저해 분자가 합성되어 독성물질 중화시키는 중화단계;와 원핵생물과 세포주가 같이 공동배양되는 배양액이 외부 환경에 배출되어 배양액 내 신호물질(AHL)의 농도 저하에 따라 세포 내 저해 분자 합성을 중지되어 미세조류가 자멸하도록 구현되는 자멸단계;를 포함하는, 미세조류 생화학적 봉쇄 방법을 제공할 수 있도록 한다.

나아가, 활성화단계는, 공동 배양 전, 생화학적 봉쇄에 적용하는 세포주에 대하여 세포자극을 수행하여, 재조합 효소 유전자의 유도 프로모터를 활성화하고, 재조합효소를 합성하는 1단계; 상기 재조합효소를 통해 상기 세포주에 대하여 세포 독소의 합성을 막는 유전자 내 DNA 염기서열을 잘라내고, 지속적으로 세포 내 독소 합성을 수행시키는 2단계;를 포함하여, 세포주의 사용 전 안정적인 단독 배양과 보관 및 조작을 보장한다.

나아가, 상기 중화단계는, 미세조류와 박테리아의 공생 배양 과정을 통해, 활성 상태에서 세포 내 합성되는 독소는 신호 물질(AHL)을 합성하여 분비하는 원핵생물과 세포주가 같이 공동배양될 때는 신호물질(AHL)을 인식하는 유도 프로모터로 인해 저해 분자가 합성되어 독소를 중화시킨다.

나아가, 상기 자멸단계는, 외부 환경으로 배양액을 배출시킬 시 배양액이 외부 하수와 희석되어 신호물질(AHL) 농도가 낮아지게 되어 저해 분자의 합성량이 낮아지고, 이에 따라 독소가 정상 작용하여 세포가 사멸시키는, 미세조류 생화학적 봉쇄 방법을 제공할 수 있도록 한다.

상기 활성화단계 1단계의 재조합 효소 유전자의 유도 프로모터(promoter)는, 특정 외부자극에 반응하는 유도 프로모터로써 본 활성화 단계에서는 열충격에 작동하는 유도 프로모터(Heat shock inducible promoter)를 활용할 수 있다.

그러나 이에 국한하지 않고, 세포주를 사용하는 산업 특성에 따라 가변적으로 선택할 수 있다. 상기 유도 프로모터가 활성화 되어 단백질 합성이 시작되면, 프로모터와 전사종결자 사이의 단백질 정보를 기반으로 합성하는 것을 기작으로 구현되어, 상기 유도 프로모터는 재조합효소 phiC31을 합성한다. 상기 phiC31은 유전자 내 특정 염기서열 attB와 attP 사이의 유전자 구간을 편집하여 제거한다. 상기 유도 프로모터와 phiC31, 그리고 전사종결자 Tnos로 구성된 유전자는 항시성 프로모터(Constitutive Promoter)와 독성 분자인 pezT 사이 양 끝에 attB와 attP 서열을 끼고 위치한다. 따라서 phiC31은 phiC 유전자를 제거하여 항시성 프로모터와 독성분자를 연결하여 지속적인 pezT 생산을 활성화시킨다.

나아가, 상기 중화단계의 유도프로모터는, 전사인자 VP16::TraR을 필요로 하는 4x(TraA)::m35S이며, VP16::TraR은 미세조류 내 들어온 AHL 분자를 통해 알로스테릭하게 프로모터의 cis-regulatory sequence에 결합하여 단백질 합성을 활성시키는, 미세조류 생화학적 봉쇄 방법을 제공할 수 있다.

상기 4x(TraA)::m35S가 활성화되어 단백질 합성이 시작되면, 독소 pezT 저해 분자인 pezA를 합성한다. 세포주 내 AHL 농도가 충분히 높을 경우 pezA이 합성되어 pezT를 경쟁적으로 저해하게 되어 세포 내에서 pezT가 작동하지 못하게하는 단계로 구현되는, 안정적인 공동배양 환경을 제공할 수 있다.

또한, 상기 자멸단계는, 활성화 이후 세포 내 AHL이 역치값 이하로 낮아지면 pezA의 합성량이 줄어들어 pezT의 독성이 세포 내에서 작용하여 자멸하게 되는 단계로 구현되어, 미세조류 생화학적 봉쇄 방법을 제공할 수 있다.

이외에도, 프로모터 이후, 재조합효소, 독소, 저해분자와 함께 리포터마커 유전자 서열을 함께 배치하여 활성화여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 공생배양 환경에서 미생물에게서 나오는 신호전달물질(AHL)을 kill switch로 활용하여, 미세조류내의 신호전달물질의 농도에 따라 미세조류의 배양과정의 수행과 미세조류의 자멸과정의 수행을 구현할 수 있도록 하는 생화학적 봉쇄시스템을 구현할 있도록 하여, 미세조류를 활용한 다양한 분야에 활용할 수 있도록 하는 효과가 있다.

특히, 본 발명은 이러한 생화학적 봉쇄시스템을 하폐수 처리에 특화되게 유전자 합성된 미세조류에 도입하여 생물 안전성으로 높여 슬러지물질의 분해와 관련한 오폐수의 처리산업에 적용하고, 폐수속 생물학적 정화 기능을 저비용으로 구현할 수 있도록 하며, 화학약품을 적용하지 않고 경제적인 비용으로 구현가능한 친환경적인 기술을 제공할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 미세조류에서 미세조류와 박테리아의 공생 배양 과정 중 발생하는 신호 전달 물질(AHL)을 활용한 생화학적 봉쇄(biocontainment) 방법의 개념을 설명하기 위한 개념도이다.
도 2 내지 도 4는 본 발명에 다른 미세조류와 박테리아의 공생 배양 과정 중 발생하는 신호 물질(AHL)을 활용한 생화학적 봉쇄(biocontainment) 방법이 구현되는 시스템 구조를 도시한 것이다.
도 5는 미세조류의 단독배양시의 기작을 나타낸 것이고, 도 6은 미세조류와 박테리아의 공동배양시 기작을 나타낸 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미가 있는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 미세조류에서 미세조류와 박테리아의 공생 배양 과정 중 발생하는 신호 전달 물질(AHL)을 활용한 생화학적 봉쇄(biocontainment) 방법의 개념을 설명하기 위한 개념도이다.

본 발명의 용어 "미세조류"란, 넓은 범위로는 광합성 색소를 포함하여 광합성을 수행할 수 있는 단세포생물을 통칭하여 의미하고, 좁은 범위로는 수서환경에서 서식하고, 광합성을 수행하며, 포자를 이용하여 번식하고, 단세포로서 존재하거나 또는 단세포군집체를 형성할 수 있는 진핵생물을 의미하는데, 서식하는 환경에 따라 민물에서 서식하는 담수조류와 해수에서 서식하는 해양조류로 구분하기도 한다. 본 발명의 목적상 상기 미세조류는 클로렐라 속에 속하는 조류, 바람직하게는 클로렐라 소로키니아나와 데스모데스모스 속에 속하는 조류인 것일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 생화학적 봉쇄(biocontainment)의 기작은, 미생물이 환경에 순응하기 위해 스스로 상호작용인자를 분비하고, 이 분비된 인자를 다른 미생물이 인식하는 현상인 쿼럼센싱(Quorum Sensing)에 기반한 것으로, 미세조류와 박테리아의 공생 배양 과정 중 bacteria의 개체수가 적을 때는 쿼럼센싱(Quorum Sensing)이 일어나지 않으나, 개체수가 증가하여 오토인듀서(autoinducer)의 농도가 일정 수준 이상이 되면 자신들의 개체밀도를 감지하여 다양한 생리적 변화를 수행하게 된다.

특히, 도 1(B)에서와 같이, 유전자 회로에 신호전달물질(AHL)이 존재하는 경우, 미세조류는 해독물질을 생성하는 기작을 진행하게 되며, 유전자 회로에 신호전달물질(AHL)이 없거나 농도가 감소하는 상태에서는 미세조류에서 해독물질의 생성이 중단되게 되어, 독성물질에 의해 자멸하게 된다.

본 발명은, 이를 위해, 미세조류와 박테리아의 공생 배양 과정 중 발생하는 신호 물질(AHL)을 활용한 생화학적 봉쇄(biocontainment) 방법을 구현하되, 미세조류를 박테리아와 공동배양하기 전, 비활성된 독성물질의 지속적인 합성을 개시시키는 활성화단계와 미세조류와 박테리아가 같이 공동배양될 때는 신호물질(AHL)을 인식하는 유도 프로모터로 인해 저해 분자가 합성되어 독성물질을 중화시키는 중화단계와 미세조류와 박테리아가 같이 공동배양되는 배양액이 외부 환경에 배출되어 배양액 내 신호물질(AHL)의 농도 저하에 따라 미세조류 세포 내 저해 분자 합성이 중지되어 미세조류가 자멸하도록 구현되는 자멸단계를 포함하는 미세조류 생화학적 봉쇄 방법을 제공할 수 있도록 한다.

나아가, 활성화단계는, 상기 미세조류를 박테리아와 공동배양하기 전, 생화학적 봉쇄에 적용하는 상기 미세조류에 대하여 세포자극을 수행하여, 재조합 효소 유전자의 유도 프로모터를 활성화하고, 재조합효소를 합성하는 1단계와, 상기 재조합효소를 통해 상기 미세조류에 대하여 세포 독소의 합성을 막는 유전자 내 DNA 염기서열을 잘라내고, 지속적으로 상기 미세조류 세포 내 독소 합성을 수행시키는 2단계를 포함하여, 세포주의 사용 전 안정적인 단독 배양과 보관 및 조작을 보장한다.

이러한 활성화과정을 구현하기 위해서는, 도 2에서 개시한 것과 같은 유전자 회로시스템을 적용할 수 있도록 본 발명은 구성하였다.

즉, 본 발명에서 오폐수의 정화과정에 적용하는 미세조류의 경우, 미세조류를 하폐수에 투입하기 전 독성(PezT)의 활성화를 막아 놓아 보관 및 운반에 용이하게 만들기 위해 설계된 유전자 회로를 구현하며, 하폐수 처리장에 유입하기 전, 즉 모든 유전자가 정상 작동하기 전에 열충격을 통해 독성을 만들어내는 회로를 활성화 하여 정상 작동할 수 있도록 개시 역할을 수행한다

본 발명에서는, 신호전달물질(AHL)을 인위적으로 도입하지 않고, 자연적으로 박테리가가 생성해내는 신호전달물질(AHL)을 활용하여 비용절감을 수행할 수 있도록 하기 위함이다. 나아가, 미세조류 유전자 합성 단계에서 지속적인 신호전달물질(AHL)를 투입하기는 힘들기에 불활성화를 시켜서 단일 배양을 진행하다가 stationary phase에 진입할 때 박테리아가 있는 생물반응조에 함께 배양 시키면서 자연스럽게 열 충격으로 통해 회로가 정상 작동할 수 있도록 하기 위해 도 2에서와 같은 유전자 회로가 필수적이다.

구체적으로, 도 2는 본 발명에 다른 미세조류와 박테리아의 공생 배양 과정 중 발생하는 신호 물질(AHL)을 활용한 생화학적 봉쇄(biocontainment) 방법이 구현되는 유전자 회로시스템 구조를 도시한 것이다.

도 2의 (A)는 미세조류에서 쿼럼센싱(Quorum Sensing)에 의해 해독물질이 합성되는 과정을 도시한 것이고, 도 2의 (B)는 외부환경에 배양액이 노출되어 배양액이 희석되는 경우, 신호전달물질(AHL)의 농도가 낮아지게 되는 경우, 해독물질(저해분자)의 활성이 낮아지게 되고, 이에 따라 독성물질의 정상작동하게 되는 과정을 도시한 것이다.

도 2 (A) 및 도 3을 참조하면, 이는 미세조류와 박테리아가 같이 공동배양될 때는 신호물질(AHL)을 인식하는 유도 프로모터로 인해 저해 분자가 합성되어 독소를 중화시키는 중화시키는 과정(이하, 중화단계)을 예시한 것이다.

즉, 미세조류와 상기 박테리아의 공생 배양 과정을 통해, 활성 상태에서 상기 미세조류 세포 내 합성되는 독소는, 신호 물질(AHL)을 합성하여 분비하는 박테리아와 미세조류가 같이 공동배양될 때, 신호물질(AHL)을 인식하는 유도 프로모터로 인해 저해 분자가 합성되어 중화된다.

나아가, 본 발명에서는, 외부 환경으로 배양액을 배출시킬 시 배양액이 외부 하수와 희석되어 신호물질(AHL) 농도가 낮아지게 되어 저해 분자의 합성량이 낮아지고, 이에 따라 독소가 정상 작용하여 미세조류 세포가 사멸되는 구조로, 미세조류 생화학적 봉쇄 방법을 제공할 수 있도록 한다.

도 2A에 도시된 염기서열 구조에서, VP16(Herpes simplex virus protein vmw65)_TAD(transactivation domain)의 전단과 후단에는 각각 강한 항시성 프로모터(pHSP70A/Rbs2)와 Tnos가 배치된다.

또한, 이러한 유도 프로모터를 작동시키기 위해 자극을 중계하는 전사인자 유전자를 구비할 수 있다. 특히, 본 발명의 실시예로서, 미세조류와 박테리아가 같이 공동배양 환경에 발현을 제어하기 위해서 필요한 신호전달물질(AHL)에 반응하는 유도프로모터인 4x(TraA)::m35S의 경우, 전사인자 VP16::TraR을 필요로 한다.

전사인자인 VP16::TraR은 미세조류 내로 들어온 신호전달물질(AHL) 분자를 통해 알로스테릭하게 프로모터의 cis-regulatory sequence에 결합하여 단백질 합성활성시킨다. 이 경우, 상술한 신호전달물질(AHL) 분자는 C8-AHL(N-octanoyl-Homoserine lactone): (N-옥토아닐-호모세린 락톤)일 수 있다.

상세하게는, 도 3에 도시된 것과 같이, TraR 이라는 단백질로 생성이 될 시 VP16 단백질과 결합하게 되며 VP16::TraR 복합체(전사인자(transcription factor)의 역할을 수행)는 TraA라는 인식서열에 TraR이 붙게된다.

C8-AHL(N-옥토아닐-호모세린 락톤)는 유도 프로모터인 TraA::VP16을 활성화 한다. 또한 TraA는 minimal 꽃양배추모자이크바이러스 유래 35s promote와 결합된 cis-regulatory 서열에 붙어있는 구조로 되어 있다.

이렇게 promoter가 활성화되어 단백질 합성이 시작되면 pezA(독소 pezT 저해 분자)를 생성하게 되고 Tnos에서 단백질 합성이 멈추게 된다.

도 2 (B)와 도 4를 참조하면, 이는, 상술한 중화단계의 기작으로 해독물질(일예로, pezA)을 합성하는 과정을 통해 중화반응이 유지되는 경우에서 벗어나, 독성물질 pezT를 합성하는 시스템 기작을 도시한 것이다.

도 2 (B) 및 도 4에 도시된 것과 같이, 미세조류 내의 재조합유전자의 구조를 고려하면, 유도프로모터를 구비한다.

상기 활성화단계 1단계의 재조합 효소 유전자의 유도 프로모터(promoter)는, 특정 외부자극에 반응하는 유도 프로모터로서, 열충격에 작동하는 유도 프로모터(Heat shock inducible promoter)를 활용할 수 있다.

그러나 이에 국한하지 않고, 세포주를 사용하는 산업 특성에 따라 가변적으로 선택할 수 있다.

상기 유도 프로모터가 활성화 되어 단백질 합성이 시작되면, 프로모터와 전사종결자 사이의 단백질 정보를 기반으로 합성하는 것을 기작으로 구현되어, 상기 유도 프로모터는 재조합효소 phiC31을 합성한다.

상기 phiC31은 유전자 내 특정 염기서열 attB와 attP 사이의 유전자 구간을 편집하여 제거한다.

상기 유도 프로모터와 phiC31, 그리고 전사종결자 Tnos로 구성된 유전자는 항시성 프로모터(Constitutive Promoter)와 독성 분자인 pezT 사이 양 끝에 attB와 attP 서열을 끼고 위치한다. 따라서 phiC31은 phiC 유전자를 제거하여 항시성 프로모터와 독성분자를 연결하여 지속적인 pezT 생산을 활성화시킨다.

즉, 원핵생물과 세포주가 같이 공동배양되는 배양액이 외부 환경에 배출되어 배양액 내 신호물질(AHL)의 농도 저하에 따라 새포 내 독소 합성이 진행되어 미세조류가 자멸하도록 구현되는 과정이다. 이는, 재조합효소를 통해 상기 세포주에 대하여 세포 독소의 합성을 막는 유전자 내 DNA 염기서열을 잘라내고, 지속적으로 세포 내 독소 합성을 수행하는 과정으로 구현되게 된다.

즉, 도 2(B)에 (B1)에 게시된 재조합유전자의 구조를 고려하면, 항시성 프로모터(Constitutive Promoter) 이후에 순차로 배치되는 재조합효소(phiC31)를 구비하는 벡터(Y)가 배치되게 된다.

상기 재조합효소(phiC31)의 경우, 자극에 의해 합성되는 것으로, attB, attP를 인식하여 절단제거하게 되며, attB와 attP 사이에는 순차적으로, 활성화여부 확인을 위한 리포터마커(이를테면, 미세조류에서는 GUS유전자를 발현함)가 배치되게 되며, 본 발명의 실시예에서는, 'mCherry' 형광물질을 적용하여 발현(활성화) 여부를 확인할 수 있도록 할 수 있다. 또는 열충격 유도 프로모터가 더 포함될 수 있으며, 이는 pCvHSP70A(cardio-Vascular Heat shock protein (심혈관 열 충격 단백질에서 유래된 70A promoter))을 적용할 수 있다.

이러한 재조합효소가 활성화하게 되면, 상술한 재조합효소(phiC31)를 구비하는 벡터(Y)에서 attB와 attP를 인식하여 절단하게 되여 원래의 독소 형성 염기서열에서 잘려저, 세포내에서 분해되게 된다.

남겨진 염기서열은 도 2(B)의 (B2)와 같이 항시성 프로모터(Constitutive Promoter) 이후에 순차로 배치되는 독성물질 pezT와 합성에 필요한 요소들의 순서에 맞게 정렬되어 합성되게 된다.

정리하면, 상술한 중화단계의 신호물질(AHL)을 인식하는 유도프로모터는, 전사인자 VP16::TraR을 필요로 하는 4x(TraA)::m35S이며, 상기 VP16::TraR은 미세조류 내 들어온 AHL 분자를 통해 알로스테릭하게 프로모터의 cis-regulatory sequence에 결합하여 단백질 합성을 활성시키게 된다.

이후, 4x(TraA)::m35S가 활성화되어 단백질 합성이 시작되면, 독소 pezT 저해 분자인 pezA를 합성한다. 세포주 내 AHL 농도가 충분히 높을 경우 pezA이 합성되어 pezT를 경쟁적으로 저해하게 되어 세포 내에서 pezT가 작동하지 못하게하는 단계로 구현되는, 안정적인 공동배양 환경을 제공할 수 있다.

또한, 자멸단계의 경우, 상술한 활성화 이후 세포 내 AHL이 역치값 이하로 낮아지면 pezA의 합성량이 줄어들어 pezT의 독성이 세포 내에서 작용하여 자멸하게 되는 단계로 구현되어, 미세조류 생화학적 봉쇄 방법을 제공할 수 있다.

이외에도, 프로모터 이후, 재조합효소, 독소, 저해분자와 함께 리포터마커 유전자 서열을 함께 배치하여 활성화여부를 확인할 수 있다.

도 5 및 도 6을 참조하면, 도 5는 미세조류의 단독배양시의 기작을 나타낸 것이고, 도 6은 미세조류와 박테리아의 공동배양시 기작을 나타낸 것이다.

도 5에서와 같이, 미세조류의 단독배양시 AHL의 유입이 없게 되며, 이 경우에는 활성화 이후 세포내 AHL이 역치값 이하로 낮아지게 되면, pezA의 합성량이 줄어들게 되며, pezT의 독성이 세포 내에서 작용하게 되어, 세포가 사멸하게 된다.

또한, 도 6에서와 같이, 활성화 이후 세포 내 AHL 농도가 충분히 높을 경우 pezA이 합성되어 pezT를 경쟁적으로 저해하게 되어 세포 내에서 pezT가 제대로 작동하지 못하게 된다. 따라서 세포는 계속 배양될 수 있다. 이렇게 활성상태일 때, 세포내에서 합성되는 독성물질 pezT의 경우, AHL을 합성하여 분비하는 원핵생물와 세포주가 같이 공동배양될 때는 AHL을 인식하는 유도 프로모터로 인해 저해 분자(pezA)가 합성되어 독소를 중화시킨다.

이후 외부 환경으로 배양액을 배출시킬 시 배양액이 희석되어 AHL 농도가 낮아지게 되어 저해 분자의 활성이 낮아지고, 이에 따라 독소가 정상 작동되어 미세조류 세포가 사멸하게 된다.

이상에서와 같이 본 발명의 기술적 사상은 바람직한 실시예에서 구체적으로 기술되었으나, 상기한 바람직한 실시예는 그 설명을 위한 것이며, 그 제한을 위한 것이 아니다. 이처럼 이 기술 분야의 통상의 전문가라면 본 발명의 기술 사상의 범위 내에서 본 발명의 실시예의 결합을 통해 다양한 실시예들이 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (5)

1. 미세조류와 박테리아의 공생 배양 과정 중 발생하는 신호 물질(AHL)을 활용한 생화학적 봉쇄(biocontainment) 방법을 구현하되,
   미세조류를 박테리아와 공동배양하기 전, 비활성된 독성물질의 지속적인 합성을 개시시키는 활성화단계;와
   미세조류와 박테리아가 같이 공동배양될 때는 신호물질(AHL)을 인식하는 유도 프로모터로 인해 저해 분자가 합성되어 독성물질을 중화시키는 중화단계;와
   미세조류와 박테리아가 같이 공동배양되는 배양액이 외부 환경에 배출되어 배양액 내 신호물질(AHL)의 농도 저하에 따라 미세조류 세포 내 저해 분자 합성이 중지되어 미세조류가 자멸하도록 구현되는 자멸단계;를 포함하는
   미세조류 생화학적 봉쇄 방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 활성화단계는,
   상기 미세조류를 박테리아와 공동배양하기 전, 생화학적 봉쇄에 적용하는 상기 미세조류에 대하여 세포자극을 수행하여, 재조합 효소 유전자의 유도 프로모터를 활성화하고, 재조합효소를 합성하는 1단계;
   상기 재조합효소를 통해 상기 미세조류에 대하여 세포 독소의 합성을 막는 유전자 내 DNA 염기서열을 잘라내고, 지속적으로 상기 미세조류 세포 내 독소 합성을 수행시키는 2단계;를 포함하는,
   미세조류 생화학적 봉쇄 방법.
   
3. 청구항 2에 있어서,
   상기 중화단계는, 상기 미세조류와 상기 박테리아의 공생 배양 과정을 통해, 활성 상태에서 상기 미세조류 세포 내 합성되는 독소는, 신호 물질(AHL)을 합성하여 분비하는 박테리아와 미세조류가 같이 공동배양될 때, 신호물질(AHL)을 인식하는 유도 프로모터로 인해 저해 분자가 합성되어 중화되고,
   상기 자멸단계는, 외부 환경으로 배양액을 배출시킬 시 배양액이 외부 하수와 희석되어 신호물질(AHL) 농도가 낮아지게 되어 저해 분자의 합성량이 낮아지고, 이에 따라 독소가 정상 작용하여 미세조류 세포가 사멸되는,
   미세조류 생화학적 봉쇄 방법.
   
4. 청구항 3에 있어서,
   상기 활성화단계 1단계의 재조합 효소 유전자의 유도 프로모터(promoter)는, 특정 외부자극에 반응하는 유도 프로모터로서, 열충격에 작동하는 유도 프로모터(Heat shock inducible promoter)를 활용하는,
   미세조류 생화학적 봉쇄 방법.
   
5. 청구항 4에 있어서,
   상기 중화단계의 신호물질(AHL)을 인식하는 유도프로모터는, 전사인자 VP16::TraR을 필요로 하는 4x(TraA)::m35S이며, 상기 VP16::TraR은 미세조류 내 들어온 AHL 분자를 통해 알로스테릭하게 프로모터의 cis-regulatory sequence에 결합하여 단백질 합성을 활성시키는, 미세조류 생화학적 봉쇄 방법.