KR102612089B1

KR102612089B1 - 생강나무 잎 추출물의 유효성분을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물

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Publication number: KR102612089B1
Application number: KR1020210012370A
Authority: KR
Inventors: 최식원; 이경태; 김신혜; 이오규; 윤준혁; 손영모
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2023-12-14
Anticipated expiration: 2041-01-28
Also published as: KR20220109523A

Abstract

본 발명은 생강나무 잎 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생강나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물, 또는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생강나무 잎 추출물은 파골세포 분화를 강력히 억제하고 파골세포의 분화의 분자 마커인 TRAP의 활성을 억제하나 파골세포 분화에 관여하는 전구세포인 대식세포에서는 세포 독성을 나타내지 않으며, 조골세포 분화를 촉진하고, 조골세포 분화의 바이오마커인 ALP의 활성을 증가시키며, 조골세포 분화를 검정하는 C2C12 세포에서 세포 독성을 나타내지 않으므로, 골다공증에 관여하는 파골세포와 조골세포의 분화를 동시에 조절하여 골다공증에 우수한 예방 및 치료 효과를 가질 수 있는 활성성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생강나무 잎 추출물의 유효성분을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물{Composition for preventing and treating osteoporosis containing extract of Lindera obtusiloba leaf as an active ingredient}

본 발명은 생강나무 잎 추출물을 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 생강나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물, 또는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품 조성물에 관한 것이다.

골다공증(osteoporosis)은 골흡수와 골형성의 균형이 무너져 발생하는 것으로 골형성보다 과다하게 골 흡수가 진행되는데 기인한 질환으로, 골다공증은 골 조직의 석회가 감소되어 골의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지고, 증세가 진전됨에 따라 골이 약해지기 때문에 작은 충격에도 골절되기 쉽다.

골조직은 조골세포에 의해 형성되고 파골세포에 의해 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다. 골의 항상성은 파골 세포(osteoclast)에 의한 골 흡수(bone resoprtion)와 조골세포(osteoblast)에 의한 골 형성(bone formation)의 대등한 작용에 의한 리모델링 과정(bone remodeling)이 지속적으로 조절되어 유지된다.

그러나 파골 세포의 지나친 활성이나 조골세포 활성의 저하는 리모델링 과정의 불균형을 초래하여, 골다공증(osteoporosis)과 같은 성인 골격계 질환을 유도한다. 이러한 불균형을 해소하기 위해서 일반적으로 파골세포의 지나친 활성을 억제하거나, 조골세포의 활성을 촉진시키거나, 또는 파골 세포의 활성을 억제하고 조골세포의 활성을 촉진하는 방법이 사용되고 있으며, 이들은 골다공증의 치료에 대한 효과적인 치료적 접근 방법으로 인지되고 있다.

파골세포는 조혈모세포의 단핵구로부터 유래되는 세포로서, 마우스의 RAW264.7 단핵구 세포는 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (RANK) ligand)에 의해 융합하여 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다(참조: Boyle WJ, Simonet WS, Lacey DL. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 2003 May 15;423(6937):337-42). 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κB라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수할 수 있다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MAPK, 또는 NF-κB, AP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다(참조: Lee ZH, Kim HH. Signal transduction by receptor activator of nuclear factor kappa B in osteoclasts. Biochem Biophys Res Commun. 2003 May 30;305(2):211-4.). 특히, 파골세포의 생존 및 골 흡수 능력에서 중요한 역할을 하는 신호전달 분자로 밝혀진 ERK와 NF-κB에 의해 파골세포 분화에 특이적인 AP-1 또는 NFAT가 조절될 수 있다고 보고되어 있다. 따라서, RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중 하나로 인지되고 있다.

파골세포를 활성화시키는 중요한 싸이토카인은 Receptor activator of nuclear fractor-κB ligand (RANKL)로서 조골세포 또는 활성화된 면역세포에서 생성된다. 생성된 RANKL은 파골세포 및 전구세포에 위치한 수용체(RANK)와 결합하여 파골세포의 형성과 활성을 촉진시킨다. 또한 RANKL에 대한 생체 내 길항제인 Osteoprotegerin (OPG)가 존재하고 있다. 결국, RANKL과 OPG의 균형에 의하여 파골세포의 형성과 활성이 조절되는 것이다. 그러나 골 흡수를 자극하는 원인(에스트로겐 결핍, 부갑상선 호르몬 항진증 등)이 발생하게 되면 OPG와 RANKL의 균형이 깨지게 되어 파골세포가 활성화되어 골 흡수가 촉진되는 것이다. 활성화된 파골세포는 골 표면에 부착하여 강한 골 용해물질을 분비한다. 골 단백 용해제 중 하나인 카텝신(cathepsin) K가 파골세포 특이적으로 생성 분비되며, 풍부한 칼시토닌 수용체(calcitonin receptor, Cal-R)와 TRAP이 존재하며 실제적으로 골 흡수 작용을하는 산 생성이 활발하고, acting ring을 형성하여 골 기질을 흡수한다고 알려졌다. 따라서 이들의 억제를 통하여 골 흡수 억제 효과를 이끌어낼 수 있을 것이다. 골 흡수를 억제하기 위해 파골 전구세포에서 파골세포로의 분화를 차단하는 분화 과정의 초기단계 저해와 분화된 파골세포의 사멸을 유도하여 골 흡수 과정을 저해하는 연구가 진행되고 있다. 골 흡수 억제제로는 칼슘, 비타민 D, 칼시토닌, 여성호르몬, 티볼론, 선택적 에스트로겐 수용체조절제(selective estrogen receptor modulator, SERM), 비스포스포네이트 등이 이용되고 있다. 그러나 이들 치료법들은 비전형적 골절, 체중증가, 위장장애, 자궁내막암과 유방암 발병 및 하악골 괴사 등 일부 부작용이 보고되고 있다.

골수에 있는 중간엽 줄기세포나 조골전구세포로부터 조골세포로 분화를 유도하는 것은 골 형태발생인자와 같은 bone morphogenetic protein 2 (BMP-2)에 의해 주로 이루어진다. BMP-2는 골 형성과 관련된 연구에서 유용하게 사용되는 중간엽 줄기세포인 C2C12세포의 염기성 인산 분해 효소(ALP)를 활성화해 조골세포로 발전시킨다. 이 효소는 세포의 외막과 석회화 조직에서 높은 농도로 발견되어 석회화 과정 동안 무기인산은 운반, 세포 분열이나 분화의 조절자 역할을 하며 조골세포 활성의 표지인자로 널리 알려져 있다(참조: Stein GS, Lian JB, Owen TA. Relationship of cell growth to the regulation for tissue-specific gene expression during osteoblast differentiation. FASEB J. 1990 4: 3111-3123).

조골세포의 분화는 골기질단백질의 발현과 연관되어 있다. 골기질단백질 중 collagen, ALP 및 osteopontin은 분화초기에 발현되며 BSP 및 OC는 성숙된 조골세포에서 발현된다. 이 중 ALP는 유기인산 에스테르를 가수분해하여 골형성이 일어나는 부위의 인산이온의 농도를 증가시키며, BSP는 골조직세포의 석회화기질 부착에 관여할 뿐만 아니라 hydroxyapatite crystal 형성에도 중요한 역할을 한다. 따라서 이러한 효소의 발현 증가는 골 형성 촉진을 끌어낼 수 있을 것이다. 골 형성 촉진제는 부갑상선 호르몬(Parathyroid hormone, PTH) 제제가 임상에서 유일하게 사용되고 있으나, 주사방식으로 투약의 어려움, 부작용 문제로 인한 2년 이상의 사용제한, 하지통증, 혈청칼슘농도 및 요산 증가 등이 보고되고 있다. 그러므로 안전성이 확보된 효과적인 골 형성 촉진제는 골다공증 등 골 대사 질환의 치료적 접근 방법이 될 것이다.

생강나무(학명: Lindera Obtusiloba)는 녹나무목 녹나무과의 식물이다. 생강나무의 잎 또는 가지를 꺾으면 생강 냄새가 나서 생강나무라 부르며, 산동백나무라고도 부른다. 픔종으로는 고로쇠생강나무(L. obtusiloba for. quinquelobum Uyeki), 둥근잎생강나무(L. obtusiloba for. ovata T.B .Lee), 털생강나무(L. obtusiloba for. villosum Nakai)가 있다.

생강나무는 산지의 계곡이나 숲 속의 냇가에서 자란다. 높이는 3∼6m이고, 나무 껍질은 회색을 띤 갈색이며 매끄럽다. 잎은 어긋나고 달걀 모양 또는 달걀 모양의 원형이며 길이가 5 ~ 15cm이고 윗부분이 3 ~ 5개로 얕게 갈라지며 3개의 맥이 있고 가장자리가 밋밋하다. 잎자루는 길이가 1 ~ 2cm이다. 꽃은 암수딴그루이고 3월에 잎보다 먼저 피며 노란 색의 작은 꽃들이 여러 개 뭉쳐 꽃대 없이 산형꽃차례를 이루며 달린다. 수꽃은 화피 조각 6개와 9개의 수술이 있고, 암꽃은 화피 조각 6개와 1개의 암술, 그리고 헛수술 9개가 있다. 작은 꽃자루은 짧고 털이 있다. 열매는 장과이고 둥글며 지름이 7 ~ 8mm이고 9월에 검은색으로 익는다. 새로 잘라 낸 가지에서 생강 냄새가 나므로 생강나무라고 한다. 연한 잎은 먹을 수 있다. 꽃은 관상용이고, 열매에서는 기름을 짠다. 한방에서는 나무껍질을 삼첩풍이라는 약재로 쓰는데, 타박상의 어혈과 산후에 몸이 붓고 팔다리가 아픈 증세에 효과가 있다.

이에, 본 발명자들은 생강나무를 이용한 골다공증 예방 또는 치료제를 개발하기 위해 노력하던 중, 생강나무 부위별(잎, 가지, 종자) 에탄올 추출물 중 잎 추출물이 파골세포 분화를 더욱 억제하고, 파골세포의 분화의 분자 마커인 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase)의 활성을 억제하나 파골세포 분화에 관여하는 전구세포인 대식세포에서는 세포 독성을 나타내지 않으며, 더욱이 생강나무 잎 에탄올 추출물은 BMP-2에 의해 증가하는 조골세포 분화를 촉진하고, 조골세포 분화를 검정하는 C2C12세포의 세포 독성을 나타내지 않았으며, 조골세포 분화의 바이오마커인 ALP(alkaline phosphatase)의 활성을 유의하게 증가시킴을 확인하여, 생강나무 잎 추출물은 골다공증에 관여하는 파골세포와 조골세포의 분화를 동시에 조절하므로 우수한 치료효과를 가질 수 있는 활성성분으로 제공될 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 생강나무(Lindera obtusiloba) 잎 추출물을 이용하여 파골세포와 조골세포의 분화를 동시에 조절하고 독성이 없는, 골다공증 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생강나무(Lindera obtusiloba) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 생강나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 생강나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 대사질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 생강나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 대사질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 생강나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제 및 조골세포 분화 촉진용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 생강나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 파골세포 분화 억제 및 조골세포 분화 촉진용 건강식품을 제공한다.

본 발명에 따른 생강나무 잎 추출물은 파골세포 분화를 강력히 억제하고 파골세포의 분화의 분자 마커인 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase)의 활성을 억제하나 파골세포 분화에 관여하는 전구세포인 대식세포에서는 세포 독성을 나타내지 않으며, 조골세포 분화를 촉진하고, 조골세포 분화의 바이오마커인 ALP(alkaline phosphatase)의 활성을 증가시키며, 조골세포 분화를 검정하는 C2C12 세포에서 세포 독성을 나타내지 않으므로, 골다공증에 관여하는 파골세포와 조골세포의 분화를 동시에 조절하여 골다공증에 우수한 예방 및 치료 효과를 가질 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 생강나무 잎 추출물은 생강나무의 다른 부위인 가지, 꽃 및 종자 부위 각각의 추출물들에 비해 현저히 우수한 파골세포 분화 억제 및 조골세포 분화 촉진 효과를 나타냄으로써, 다른 부위에 비해 현저히 우수한 골다공증치료 효과를 가지고 있다.

골다공증은 파골세포의 활성이 증가하거나, 조골세포의 분화 능력이 감소함으로써, 골 대사 항상성이 어긋남으로써 발생하는데, 파골세포 억제와 조골세포 촉진의 두기작을 동시에 조절하는 성분은 거의 없다. 이에 대해, 본 발명에 따른 생강나무 잎 추출물은 파골세포 억제와 조골세포 촉진의 동시 조절은 골 대사 질환의 예인 골다공증에 특히 효율적으로 예방할 수 있는 활성성분으로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 생강나무 잎 추출물은 세포의 증식이나 독성이 없이 효과적으로 파골세포를 억제하고, 반면 조골세포는 형성은 촉진함으로 골다공증의 골 대사 항상성에 효과적으로 작용할 수 있다.

도 1은 생강나무 부위별 에탄올 추출물의 파골세포 분화 효능 평가 결과를 보여주는 그림이다.
도 2는 생강나무 잎 추출물의 TRAP 활성 억제 효능 평가 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 파골 전구세포에서의 생강나무 잎 추출물의 세포 독성 평가 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4는 생강나무 부위별 에탄올 추출물의 조골세포 분화 효능 평가 결과를 보여주는 그림이다.
도 5는 생강나무 잎 에탄올 추출물의 조골세포 분화 관여하는 ALP 활성 평가 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6은 생강나무 잎 에탄올 추출물의 C2C12 세포 독성 평가 결과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가진다.

본 발명은 생강나무(Lindera obtusiloba) 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 생강나무 잎 추출물은

1) 건조한 생강나무 잎을 분말로 만들거나 세절한 후 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 추출물을 감압농축한 후 동결건조하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하다.

상기 생강나무는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하고, 상기 알코올로는 C₁ ~ C₄ 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하고, 에탄올을 이용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 추출방법으로는 진탕추출 또는 환류추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 생강나무 잎의 총 분량에 2 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 또한, 추출온도는 10 ~ 100℃인 것이 바람직하며, 15 ~ 35℃인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 추출시간은 1일 ~ 7일이 바람직하며, 1일 ~ 5일이 더욱 바람직하다. 추출 횟수는 1 ~ 5회인 것이 바람직하며, 2 ~ 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 감압농축은 감압농축기를 이용하는 것이 바람직하고 회전진공농축기를 이용하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 감압농축은 10 ~ 70℃에서 농축하는 것이 바람직하고 10 ~ 50℃에서 농축하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 생강나무 잎 추출물은 파골세포 분화를 억제하고, 파골세포의 분화의 분자 마커인 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase)의 활성을 억제하며, 파골세포 분화에 관여하는 전구세포인 대식세포에서는 세포 독성을 나타내지 않는다.

상기 생강나무 잎 추출물은 조골세포 분화를 촉진하고, 조골세포 분화의 바이오마커인 ALP(alkaline phosphatase)의 활성을 증가시키며, 조골세포 분화를 검정하는 C2C12 세포에서 세포 독성을 나타내지 않는다.

본 발명의 한가지 실시예에 따르면, 상기 생강나무 잎 추출물은 가지, 종자 또는 꽃 부위의 추출물에 비해 파골세포 분화를 현저히 억제하고, 농도 의존적으로 TRAP 활성을 억제하며, 세포독성이 없음을 확인하였다.

본 발명의 한가지 실시예에 따르면, 상기 생강나무 잎 추출물은 가지, 종자 또는 꽃 부위의 추출물에 비해 조골세포의 형성 및 분화를 현저히 증가시키고, 농도 의존적으로 ALP 활성을 증가시키며, 세포독성이 없음을 확인하였다.

골다공증은 파골세포의 활성이 증가하거나, 조골세포의 분화 능력이 감소함으로써, 골 대사 항상성이 어긋남으로써 발생하는데, 파골세포 억제와 조골세포 촉진의 두기작을 동시에 조절하는 성분은 거의 없다. 이에 대해, 본 발명에 따른 생강나무 잎 추출물은 파골세포 억제와 조골세포 촉진의 동시 조절은 골 대사 질환의 예인 골다공증에 특히 효율적으로 예방할 수 있는 활성성분으로 제공될 수 있다. 본 발명에 따른 생강나무 잎 추출물은 세포의 증식이나 독성이 없이 효과적으로 파골세포를 억제하고, 반면 조골세포는 형성은 촉진함으로 골다공증의 골 대사 항상성에 효과적으로 작용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물이 적용될 수 있는 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 이는 인간, 돼지, 소, 말, 양, 염소, 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이, 침팬지, 고릴라 등을 모두 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 붕해제로는 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 크로스카멜로스나트륨, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 키토산, 구아검, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴라크릴린 칼륨 등이 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 약학적 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은, 경구투여를 위한 고형 제제에로는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은, 바람직한 투여량으로는 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 약학적 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학적 조성물은 골다공증 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 조성물이다.

상기 건강식품은 건강기능식품 또는 건강보조식품을 모두 포함한다.

상기 추출물은 추출용매로서 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하고, 상기 알코올로는 C₁ ~ C₄ 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하고, 에탄올을 이용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 건강식품 조성물은 상기 추출물을 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 ~ 10 중량%의 양으로 함유할 수 있고, 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 ~ 1 중량%의 양으로 함유할 수 있다.

상기 건강식품 조성물은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있고, 과립제, 정제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 드링크제 등으로 제조될 수 있으며, 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다.

상기 건강식품 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함할 수 있고, 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산화제 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 생강나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

상기 식품 조성물은 본 발명의 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품 조성물의 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 기능성 식품을 모두 포함한다.

상기 식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 기능성 식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

상기 골 대사 질환으로는 골감소증, 골연화증, 칼슘조절 이상(고칼슘혈증, 저칼슘혈증), 근골격 합병증, 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈흡수 질환 및 파게트병(Paget's disease)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.

이하, 하기 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 더욱 구체적으로 상술한다. 그러나 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범주가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 생강나무 추출물의 제조

생강나무 추출물은 국립산림과학원 산림바이오소재연구소(진주시, 월아시험림)에 식재된 수목에서 6 ~ 7월에 가지(당년지, 1년생 잔가지)와 잎을 수집하고, 꽃은 4월, 종자는 9월에 채취한 것을 사용하였다. 각각의 시료는 건조하여 분쇄하고 kg당 2L의 에탄올 용매를 첨가하여 암조건에서 15℃ ~ 35℃ 온도에서 교반하여 1 ~ 5일간 용출하였다. 용출된 추출물은 2 ~ 4회 반복 정치 추출하여 수득하였다. 이렇게 수득한 에탄올 추출물은 여과 후에 10℃ ~ 50℃의 온도에서 감압 농축한 후 수득한 추출물의 무게를 측정하였다. 각각은 추출물은 다음 실험에 활용하기 위하여 DMSO에 녹여서 세포 실험에 사용하였다.

< 실험예 1> 파골세포 분화 억제에 대한 우수 부위 평가

생강나무의 파골세포 분화 억제 우수 부위를 평가하기 위하여 생강나무의 각 부위 가지, 잎, 종자, 꽃을 나타낸 농도별로 동물세포를 활용하여 검정하였다.

세포는 ICR 5 주령 male의 골수에서 BMM(bone marrow macrophage)을 추출하여 파골전구세포로 사용하였다. 파골전구세포는 96-well plate에 1×10⁴/well로 M-CSF(10 ng/ml)와 함께 하루 동안 접종한 후, 생강나무 각각의 부위 추출물을 도면 1에 나타낸 농도로 처리하고 RANKL (30 ng/ml)과 M-CSF (30 ng/ml)로 파골세포로의 분화를 유도하였다. 2일마다 재처리와 배양액을 교체하였고 분화 유도후 4일차에 다핵파골세포로 분화가 완료되었다. 분화 유도된 세포는 10% 포르말린으로 고정하고 0.1% triton을 처리하였다. 그 후 다핵파골세포 분화 바이오마커인 TRAP을 sigma Aldrich사의 TRAP 염색 용액을 활용하여 수행하였다. 광학현미경을 활용하여 사진을 찍어 관찰하였다.

그 결과, 생강나무 추출물들의 각각은 파골세포 분화를 농도별로 억제하는 것을 관찰하였다. 그 중에서 잎 추출물이 파골세포 분화를 다른 부위들에 비해 현저히 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).

< 실험예 2> 생강나무 잎 추출물의 다핵파골세포 형성 억제 효과 확인

생강나무 잎 추출물이 다핵파골세포 형성을 억제하는 확인하기 위하여 바이오마커인 TRAP의 활성을 단백질 활성법을 활용하여 측정하였다. 생강나무 잎 추출물 처리와 함께 파골세포 분화를 유도한 후, sigma aldrich사의 TRAP 활성 측정 시약을 활용하여 측정하였다.

그 결과, 생강나무 잎 추출물은 농도 의존적으로 TRAP의 활성을 억제하는 것으로 확인되었다(도 2).

< 실험예 3> 대식세포(파골세포 전구세포 )에 대한 농도별 세포 독성 평가

상기 <실험예 1, 2>의 파골세포를 억제하는 효능이 세포의 증식을 억제하거나 세포의 수 감소에 따라 나타나는 효능인지 아닌지를 검정하기 위해 BMM에 생강나무 잎 추출물의 세포 독성 검정을 수행하였다. BMM에 M-CSF(30 ng/ml)과 함께 생강나무 잎 추출물을 같이 처리하여 3일간 배양 후 dojindo사의 CCK-8 시약을 이용하여 흡광도를 측정하고 대조군과 상대적인 세포 생존력(%)를 확인하였다.

그 결과, 생강나무 잎 추출물은 어떠한 세포의 독성을 나타내지 않았다(도 3).

< 실험예 4> 조골세포 분화 촉진에 대한 우수 부위 평가

생강나무 추출물의 조골세포 분화 촉진하는 부위를 평가하기 위하여 생강나무의 각각의 부위 추출물의 조골세포 분화 촉진 효능을 검정하였다. C2C12세포는 근아세포로서 BMP-2에 의해서 조골세포로 분화가 유도된다. C2C12 세포는 96-well plate에 3 × 103/well로 접종하고, 하루동안 세포 안정화와 부착을 유도한다. 그 후 조골세포 분화 유도 사이토카인인 R&D system사의 BMP-2 100ng/ml과 생강나무 부위별 추출물을 동시에 처리하여 조골세포의 분화에 따른 추출물의 시너지 효과를 검증하였다. 조골세포의 형성 및 분화 능력을 확인하기 위해 조골세포의 분화 관련 분자마커인 Alkaline phosphatase(ALP)를 염색하여 비교하였다.

그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, 생강나무 각 부위별 추출물은 ALP 염색에서 차이를 보였다. 생강나무 꽃과 가지 추출물에서는 ALP의 염색정도가 변하지 않고 오히려 처리 농도가 높을수록 감소하였으나, 종자와 잎 추출물에서는 ALP의 염색정도가 농도 의존적으로 대조군보다 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 생강나무 잎 추출물에서는 대조군보다 처리농도 의존적으로 현저히 증가함이 확인되며, 10 ug/ml에서는 보라색으로 진하게 염색됨을 확인할 수 있어, 생강나무 잎 추출물이 다른 부위에 비하여 조골세포의 형성 및 분화 능력이 현저히 우수함을 확인할 수 있었다(도 4).

< 실험예 5> 생강나무 잎 추출물의 ALP 활성 효과 확인

생강나무 잎 추출물의 조골세포 분화 촉진 효능을 더욱 더 검정하기 위하여 ALP 활성을 측정하였다. C2C12세포에 BMP-2 100 ng/ml과 생강나무 잎 추출물을 농도별로 처리하여 3일 후에 ALP 활성을 확인하였다. ALP 활성은 Thermo Fisher Scientific사의 Alkaline Phosphatase Reagents(one step PNPP)를 활용하는 방법으로 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타난것과 비슷하게 ALP 활성 역시 10 ug/ml에서 대조군 보다 우수한 것으로 확인되었다(도 5).

< 실험예 6> 생강나무 잎 추출물의 C2C12세포 증식능 확인

생강나무 잎 추출물의 조골세포 형성 및 분화를 촉진하는 효능이 세포 자체의 영향인지를 확인하기 위해서 생강나무 잎 추출물의 C2C12세포 증식능을 확인하였다. C2C12세포에 생강나무 잎 추출물을 도면 6의 나타난 농도로 처리하여 3일 후에 세포 독성평가를 수행하였다. 세포의 독성 평가는 CCK-8 시약을 활용하여 multi-microplate reader를 사용하여 흡광도 450 nm 측정하고 이를 상대적인 세포 생존력(%)으로 나타내었다.

그 결과, 생강나무 잎 추출물은 어떠한 세포의 영향도 없음을 확인하였다(도 6).

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

생강나무(Lindera obtusiloba) 잎을 물, C₁ 내지 C₄ 알코올 또는 이의 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 용매로 추출된 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 추출물은 파골세포 분화를 억제하고, 파골세포의 분화의 분자 마커인 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase)의 활성을 억제하며, 파골세포 분화에 관여하는 전구세포인 대식세포에서는 세포 독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 조골세포 분화를 촉진하고, 조골세포 분화의 바이오마커인 ALP(alkaline phosphatase)의 활성을 증가시키며, C2C12 세포에서 세포 독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 치료용 약학적 조성물.
생강나무(Lindera obtusiloba) 잎을 물, C₁ 내지 C₄ 알코올 또는 이의 수용액으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 용매로 추출된 추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품.
삭제
제5항에 있어서, 상기 추출물은 파골세포 분화를 억제하고, 파골세포의 분화의 분자 마커인 TRAP(Tartrate-resistant acid phosphatase)의 활성을 억제하며, 파골세포 분화에 관여하는 전구세포인 대식세포에서는 세포 독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품.
제5항에 있어서, 상기 추출물은 조골세포 분화를 촉진하고, 조골세포 분화의 바이오마커인 ALP(alkaline phosphatase)의 활성을 증가시키며, C2C12 세포에서 세포 독성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하는 골다공증 예방 및 개선용 건강식품.