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KR102648489B1 - Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna - Google Patents

Crispr/cas-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 rna Download PDF

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KR102648489B1
KR102648489B1 KR1020177031965A KR20177031965A KR102648489B1 KR 102648489 B1 KR102648489 B1 KR 102648489B1 KR 1020177031965 A KR1020177031965 A KR 1020177031965A KR 20177031965 A KR20177031965 A KR 20177031965A KR 102648489 B1 KR102648489 B1 KR 102648489B1
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sgrna
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KR1020177031965A
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매튜 에이치 폴테우스
아얄 헨델
조 클라크
라스무스 오 백
다니엘 이 라이언
더글라스 제이 델린저
로버트 카이저
조엘 마이어슨
Original Assignee
더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티
애질런트 테크놀로지스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

본 발명은 세포에서 표적 핵산(예를 들어, 표적 DNA 또는 표적 RNA)의 CRISPR/Cas-기반 유전자 조절(예를 들어, 게놈 편집 또는 유전자 발현)을 유도하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은, 생체외 치료에 사용하기 위해 1차 세포에서 또는 생체내 치료에 사용하기 위해 대상내 세포에서 표적 핵산의 유전자 조절을 증대시키는 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 사용하는 것을 포함한다. 또한, 본원에서는 유전자 질환과 연관된 표적 유전자에서의 돌연변이를 교정하기에 충분한 양의 변형된 sgRNA를 투여함으로써 대상에서 유전자 질환을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다.

Description

CRISPR/CAS-매개 유전자 조절을 위한 화학적으로 변형된 가이드 RNA
관련 출원의 교차-참조
본 출원은 2015년 4월 6일자로 출원된 미국 가출원 제 62/143,729 호 및 2015년 5월 12일자로 출원된 미국 가출원 제 62/160,545 호를 우선권 주장하며, 상기 출원들의 개시내용은 본원에 모든 의도에 대해 전체적으로 참고로 인용된다.
연방정부 지원 연구 개발하에 수행된 발명에 대한 권리에 관한 서술
본 발명은 국립 보건원에 의해 수주된 계약 EY018244 및 AI097320에 따라 정부 지원하에 수행되었다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
조작된 뉴클레아제를 사용한 게놈 편집은 근본적으로 관심대상인 임의의 게놈 서열을 변형시키기 위한 획기적인 기술이다[Porteus, M.H. & Carroll, D., Nature Biotechnology 23, 967-973 (2005)]. 상기 기술은 조작된 뉴클레아제를 이용하여 부위-특이적 이중가닥 파손(DSB)을 유발한 후 내인성 세포 복구 메카니즘에 의해 DSB를 해결한다. 결과는, 파손 부위에서 삽입 또는 결실(in/del)을 유발하는 돌연변이유발 비상동적 말단-결합(NHEJ)을 통한 특정 부위의 돌연변이, 또는 외인적으로 도입된 공여체 주형을 이용한 상동적 재조합(HR)을 통한 게놈 서열의 정밀한 변화이다[Hendel et al., Trends in Biotechnology 33, 132-140 (2015)]. 상기 플랫폼에 최근에 주요하게 추가된 것은 RNA-유도형 뉴클레아제(Cas) 및 짧은 가이드 RNA(sgRNA)로 이루어지는 주기적 간격으로 분포하는 회문구조 반복서열(clustered regularly interspaced palindromic repeat, CRISPR)/Cas 시스템이다[Jinek, M. et al., Science 337, 816-821 (2012), Mali, P. et al., Science 339, 823-826 (2013), Cong, L. et al., Science 339, 819-823 (2013), Hsu et al., Cell 157, 1262-1278 (2014)]. 가이드 RNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)로 지칭되는 2개의 RNA로 이루어지며, 이들은 전형적으로 키메라 단일 가이드 RNA(sgRNA)에서 융합된다.
게놈 편집을 위한 sgRNA는 100개의 뉴클레오티드(nt)로 이루어질 수 있으며, 이들중 5' 말단에서의 20개 nt는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성에 의해 표적 DNA 서열에 하이브리드화되고 표적 게놈 DNA를 절단하도록 Cas 엔도뉴클레아제를 유도한다.
CRISPR/Cas 시스템은 또한 유전자 발현의 서열-특이적 조절, 예를 들어, 유전자 발현의 억제 또는 활성화에 적합화되었다. 엔도뉴클레아제 활성이 결여된 특정한 Cas9 폴리펩티드 변이체를 이용하여, 표적 유전자들이 억제되거나 활성화될 수 있다[Qi et al., Cell, 2013, 152(5):1173-7783, Perez-Pinera et al., Nat Methods, 2013, 10(10):973-976, Maeder et al., Nat Methods, 2013, 10(10):977-979, Gilbert et al., Cell, 2014, 159:647-661, O'Connell et al., Nature, 2014, 516:263-266].
유감스럽게도, CRISPR/Cas 시스템을 이용한 게놈 편집 및 유전자 발현 조절은, 특히 1차 세포에서, 여전히 비효율적이다. 따라서, 유전자 조절, 예를 들어, 게놈 편집, 유전자 발현 억제 및 유전자 발현 활성화에 사용될 수 있는 CRISPR/Cas 시스템을 기반으로 하는 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요성이 당해 분야에 계속 존재한다. 본 발명은 상기 필요를 충족시킬 뿐아니라 추가의 이점들도 제공한다.
본 발명은 세포에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도(예를 들어, 억제, 조절, 증대 등)하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 1차 세포(예를 들어, 생체외 치료에 사용하기 위해 시험관 내에서 배양된)에서 또는 인간과 같은 대상내 세포(예를 들어, 생체내 시험에 사용하기 위한)에서 게놈 편집 및/또는 표적 핵산의 유전자 발현의 억제 또는 활성화를 증대시키는 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 질환과 연관된 표적 유전자에서 돌연변이를 교정시키는 정밀한 게놈 편집을 증대시킴으로써 대상에서 상기 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 뉴클레아제-매개 게놈 편집 기술로 처리할 수 있는 임의의 세포 유형에 및 임의의 유전자좌에서 사용될 수 있다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은,
(a) 표적 핵산에 상보적인 제 1 뉴클레오티드 서열 및 CRISPR-연관 단백질(Cas) 폴리펩티드와 상호작용하는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)(이때, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다); 및
(b) Cas 폴리펩티드, Cas 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA, 및/또는 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터
(이때, 상기 변형된 sgRNA는 Cas 폴리펩티드를 표적 핵산으로 유도하고, 상기 변형된 sgRNA는 상응하는 비변형된 sgRNA에 비해 증대된 활성하에 표적 핵산의 유전자 조절을 유도한다)를 1차 세포 내에 도입하는 것을 포함하는, 1차 세포에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도하는 방법을 제공한다.
관련된 양태에서, 본 발명은,
(a) 표적 DNA에 상보적인 제 1 뉴클레오티드 서열 및 CRISPR-연관 단백질(Cas) 폴리펩티드와 상호작용하는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)(이때, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다); 및
(b) Cas 폴리펩티드, Cas 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA, 및/또는 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터
(이때, 상기 변형된 sgRNA는 Cas 폴리펩티드를 표적 DNA로 유도하고, 상기 변형된 sgRNA는 상응하는 비변형된 sgRNA에 비해 표적 DNA의 게놈 편집을 (예를 들어, 변형된 sgRNA의 증가된 안정성 및/또는 표적 DNA에 대한 변형된 sgRNA의 증가된 특이성을 통해) 증대시킨다)를 1차 세포 내에 도입하는 것을 포함하는, 1차 세포에서 표적 DNA의 게놈 편집을 증대시키는 방법을 제공한다.
두 번째 양태에서, 본 발명은, 대상에게 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 유전자 질환과 연관된 표적 유전자에서 돌연변이를 교정하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는(이때, 상기 변형된 sgRNA는 표적 유전자에 상보적인 제 1 뉴클레오티드 서열 및 CRISPR-연관 단백질(Cas) 폴리펩티드와 상호작용하는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다), 상기 대상에서 유전자 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적들, 특징들 및 이점들은 하기의 상세한 설명 및 도면들로부터 당해 분야에 기술을 가진 자에게 분명할 것이다.
도 1a 내지 1g는 합성되고 화학적으로 변형된 sgRNA가 시험관 내에서 높은 수준의 DNA 절단 및 인간 세포주(K562)에서 높은 빈도의 in/del을 촉진하는 것을 보여준다. 도 1a는 Cas9에 부하되고 이의 게놈 표적 부위에 결합된 IL2RG sgRNA의 2차 구조의 서열 및 개략도를 보여준다. 화학적 변형을 갖는 뉴클레오티드들은 흰색 깃발로 표시되어 있다. 도 1b는 sgRNA의 화학 합성시 혼입된 화학적 변형의 구조를 나타낸 것이다(서열에 대해서는 표 1 참조). 존재하는 경우, 2'-O-메틸(M), 2'-O-메틸, 3'-포스포로티오에이트(MS) 또는 2'-O-메틸, 3'-티오PACE(MSP)를 포함하는 화학적 변형(회색으로 나타냄)이 5' 및 3' 말단 둘 다에서 3개의 말단 뉴클레오티드들에 혼입되었다. 도 1c는 PCR 앰플리콘의 심층 서열분석에 의해 측정된 바와 같은 돌연변이유발 NHEJ에 의한 유전자 파괴를 보여준다. 도 1d는 합성 sgRNA와 함께 Cas9에 의해 유도된 K562 세포내 3개의 유전자좌 IL2RG, HBB 및 CCR5에서 HR에 의한 유전자 부가를 보여준다. 합성 sgRNA는 100만개 세포 당 1 ㎍(밝은 음영) 또는 20 ㎍(짙은 음영)으로 전달되었다. Cas9는 플라스미드(2 ㎍)로부터 발현되었고, HR 실험의 경우 5 ㎍의 GFP-암호화 공여체 플라스미드가 포함되었다. 양성 대조군으로서, sgRNA 및 Cas9 단백질 둘 다를 암호화하는 sgRNA 플라스미드 2 ㎍을 사용하였다(회색 막대). 막대들은 평균값 +SEM, n=3을 나타낸다. 도 1e는 20 ㎍의 sgRNA에 대해 도 1c에서 수행된 바와 같이 합성 sgRNA에 의해 매개된 표적화 절단의 특이성을 보여준다. in/del 빈도는, 표적화된 게놈 유전자좌 및 각 유전자에 대해 3개의 생물정보학적으로 예측된 표적이탈(off-target) 유전자좌의 PCR 앰플리콘의 심층 서열분석에 의해 측정하였다. 막대들은 평균값 +SEM, n=3을 나타낸다. 도 1f는 전기천공을 이용하여 100만개 K562 세포 내에 15 ㎍ Cas9 mRNA 및 10 ㎍ IL2RG 합성 sgRNA의 시차를 둔 전달을 보여준다. 막대들은, 기준 대조군으로서 모의-처리된 샘플을 사용하여, sgRNA 표적 부위에 걸쳐있는 PCR 앰플리콘의 TIDE 분석에 의해 측정된 바와 같은 평균 in/del 빈도 +SEM, n=3을 나타낸다. 도 1g에서는, Gas9 단백질이 2.5 몰 과량의 표시된 합성 IL2RG와 사전-복합체화되고 표시된 양으로 100만개 K562 세포 내에 핵내도입(nucleofect)되었다. in/del 빈도는 상기에서와 같이 TIDE 분석에 의해 측정하였고, 막대들은 평균 in/del 빈도 +SEM, n=3을 나타낸다.
도 2a 내지 2c는 화학적으로 변형된 sgRNA가 1차 인간 T 세포 및 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)에서 높은 비율의 유전자 파괴를 촉진함을 보여준다. 100만개 1차 인간 T 세포를 10 ㎍의 표시된 합성 sgRNA 및 15 ㎍ Cas9 mRNA 또는 1 ㎍ Cas9-암호화 플라스미드로 핵내도입시켰다(도 2a). sgRNA 및 Cas9 단백질을 둘 다 암호화하는 플라스미드 1 ㎍을 비교를 위해 포함시켰다. 막대들은, sgRNA 표적 부위에 걸쳐있는 PCR 앰플리콘의 TIDE 분석에 의해서 및 기준 대조군으로서 모의-처리 샘플을 사용하여 측정된 바와 같은 3명의 상이한 공여체들에 대한 평균 in/del 빈도 +SEM, n=6을 나타낸다. 도 2b에서는, 2.5 몰 과량의 표시된 합성 CCR5 sgRNA와 사전-복합체화된 15 ㎍ Cas9 단백질을 사용한 것을 제외하고, 자극된 T 세포를 상기와 같이 핵내도입시켰다. in/del 빈도는 상기와 같이 TIDE 분석에 의해 측정하였다. 막대들은 3명의 상이한 공여체들에 대한 평균 in/del 빈도 + SEM, n=6을 나타낸다. 도 2c에서는, 500,000개의 가동화된 인간 말초혈 CD34+ HSPC를 IL2RG 또는 HBB를 표적화하는 표시된 합성 sgRNA 10 ㎍ 및 15 ㎍ Cas9 mRNA 또는 1 ㎍ Cas9 플라스미드로 핵내도입시켰다. sgRNA 및 Cas9 단백질을 둘 다 암호화하는 sgRNA 플라스미드 1 ㎍을 비교를 위해 포함시켰다. 막대들은 T7 엔도뉴클레아제 절단 분석에 의해 측정된 바와 같은 평균 in/del 빈도 +SEM, n=3을 나타낸다. 도 2d에서는, 100만개의 자극된 T 세포 또는 가동화된 인간 말초혈 CD34+ HSPC를 15 ㎍ Cas9 mRNA 및 10 ㎍의 표시된 합성 CCR5 sgRNA로 핵내도입시켰다. 함께 사용된 경우, 각각의 sgRNA의 양은 5 ㎍이었다. 단일 sgRNA를 갖는 샘플에 대한 in/del 빈도는 상기와 같이 TIDE 분석에 의해 측정하였고, 2개의 sgRNA를 갖는 샘플에 대한 in/del 빈도는 클로닝된 PCR 산물의 서열분석에 의해 측정하였다(도 18a 및 18b 참조). 막대들은 평균 in/del 빈도 +SEM, n=3을 나타낸다.
도 3은 시험관 내에서 화학적으로 변형된 sgRNA에 의해 유도된 dsDNA 표적들의 Cas9 절단을 보여준다. 막대들은 Cas9 단백질 및 sgRNA로 처리된 표적 DNA 단편들(도 4 참조)의 절단 생성물들의 % 수율을 나타낸다. 각 sgRNA의 3개의 독립적인 합성물들에 대한 평균값 +SEM을 나타내었다.
도 4는 시험관 내에서 화학적으로 변형된 sgRNA에 의해 유도된 dsDNA 표적들의 Cas9 절단을 보여준다. dsDNA 표적들의 생화학적 절단으로부터 수득된 절단 생성물들은 바이오어낼라이저(Bioanalyzer) 2200 상의 DNA 7500 랩칩(LabChip) 상에서 분석하였다. 대표적인 겔들을 각각의 표적에 대해 나타내었고, 추가의 복제물들은 도 3에 도표화된 결과들에 포함되어 있다. 샘플들은 다음과 같았다: (L): 래더(ladder), (1): 비변형 sgRNA + 표적 DNA(-Cas9 모의 처리됨), (2): 표적 DNA + Cas9 단백질(-sgRNA 모의 처리됨), (3): 비변형 sgRNA + 표적 DNA + Cas9 단백질, (4): M sgRNA + 표적 DNA + Cas9 단백질, (5): MS sgRNA + 표적 DNA + Cas9 단백질, 및 (6) MSP sgRNA + 표적 DNA + Cas9 단백질.
도 5는 합성 sgRNA에 의해 매개된 표적화 절단의 특이성을 예시한다. 표적 특이성은, 1 ㎍ sgRNA로 핵내도입된 도 1c의 샘플을 사용하는 것을 제외하고 일루미나(Illumina) 심층 서열분석을 이용하여 도 1e에서와 같이 평가하였다. in/del 빈도는 각각의 sgRNA에 대해 3개의 생물정보학적으로 예측된 표적이탈 유전자좌로부터의 PCR 앰플리콘의 심층 서열분석에 의해 측정하였다. 막대들은, 로그 눈금위에 나타낸, 평균값 +SEM, n=3을 나타낸다. in/del %를 나타낸 표 5 참조.
도 6은 K562 세포에서 IL2RG 및 Cas9 mRNA를 표적화하는 MSP sgRNA의 적정을 보여준다. 측정된 in/del 빈도는 3개의 복제물로부터의 평균이고, 값들은 히트맵(heat map)으로 표시되어 있다. 복제물들(n=3)의 SEM은 명료성을 위해 표시되지 않았지만, 모두 측정된 표시된 값들의 4% 미만이다. in/del 빈도는 sgRNA 표적 부위에 걸쳐있는 PCR 앰플리콘의 TIDE 분석에 의해서 및 기준 대조군으로서 모의-처리된 샘플을 사용하여 측정하였다.
도 7은 sgRNA 및 Cas9 mRNA의 시차를 둔 전달의 도식적인 실험 개요를 나타낸 것이다. 도 1g에 대한 데이터를 제공하는 상기 실험의 도식적인 개관. K562 세포를 표시된 시점에서 IL2RG를 표적화하는 Cas9 mRNA 및/또는 sgRNA로 핵내도입시켰다. 마지막 성분의 핵내도입 72 시간 후에 게놈 DNA를 추출하고, in/del 빈도를 기준 대조군으로서 모의-처리된 샘플을 사용하여 TIDE에 의해 측정하였다.
도 8은 상이한 판매회사들로부터의 Cas9 단백질을 비교한 것이다. 100만개 K562 세포를 2.5 몰 과량의 MS sgRNA와 사전-복합체화된 15 ㎍ Cas9 단백질로 핵내도입시킨지 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고 in/del 빈도를 기준 대조군으로서 모의-처리된 샘플을 사용하여 TIDE에 의해 측정하였다. 막대들은 평균 +SEM, n=3을 나타낸다.
도 9a 및 9b는 표적화 절단의 특이성이 합성 IL2RG sgRNA 및 Cas9 플라스미드, mRNA 또는 단백질에 의해 매개됨을 보여준다. 표적 특이성은 일루미나 심층 서열분석을 이용하여 도 1e 및 도 5에서와 같이 평가하고 선형 눈금(도 9a) 및 로그 눈금(도 9b) 위에 나타내었다. 100만개의 K562 세포를 (i) 2 ㎍ Cas9 플라스미드 + 20 ㎍ sgRNA, (ii) 15 ㎍ CAs9 mRNA + 10 ㎍ sgRNA, 또는 (iii) 7.6 ㎍ sgRNA와 사전-복합체화된 15 ㎍ Cas9 단백질(단백질:sgRNA 몰비 = 1:2.5)로 핵내도입시켰다. Cas9 플라스미드 결과는 도 1e에서 나타낸 바와 같다. 막대들은 평균 in/del 빈도 +SEM, n=3을 나타낸다.
도 10은 1차 인간 T 세포에서의 높은 RNA 핵내도입 효율을 보여준다. 3명의 상이한 공여체들로부터의 자극된 T 세포를 자극 3일 후에 GFP mRNA로 핵내도입시켰다. GFP의 발현은 유세포분석에 의해 핵내도입 3일 후에 측정하였다. 핵내도입된 세포(회색)에서의 GFP 발현은 모의-형질감염된 세포(까만색)와 대비하여 나타내었다.
도 11은 T 세포 핵내도입에서 증가하는 CCR5 sgRNA 및 Cas9 mRNA 양이 유사한 in/del 빈도를 제공하였음을 보여준다. 자극된 T 세포를 표시된 양의 MSP CCR5 sgRNA 및 Cas9 mRNA로 핵내도입시켰다. in/del 빈도는 sgRNA 표적 부위에 걸쳐있는 PCR 앰플리콘의 TIDE 분석에 의해서 및 기준 대조군으로서 모의-처리된 샘플을 사용하여 측정하였다. 평균 in/del 빈도는 +SEM, n=6으로 나타내었다.
도 12는 CD4+, CD8+ 및 전체 T 세포 집단에서 유사한 in/del 빈도를 보여준다. 자극된 T 세포는 CCR5 MSP sgRNA 및 Cas9 mRNA로 핵내도입시키고, 이어서 CD4+ 및 CD8+ 아집단으로 분류하였다. in/del 빈도는 TIDE에 의해 측정하였으며 벌크 집단에서의 in/del 빈도와 비교하였다. 막대들은 1개의 T 세포 공여체에 대한 평균 in/del 빈도 +SEM, n=8을 나타낸다.
도 13은 1차 인간 T 세포에서 in/del 빈도가 시간 경과에 따라 안정함을 보여준다. 자극된 T 세포를 CCR5 MSP sgRNA 및 Cas9 mRNA로 핵내도입시켰다. 표시된 시점에서 gDNA를 세포들의 부분군으로부터 추출하고, in/del 빈도를 sgRNA 표적 부위에 걸쳐있는 PCR 앰플리콘의 TIDE 분석에 의해서 및 기준 대조군으로서 모의-처리된 샘플을 사용하여 측정하였다. 평균 in/del 빈도는 3명의 상이한 T 세포 공여체에 대해 +/-SEM, n=6으로 나타내었다.
도 14는 Cas9 플라스미드에 비해 합성 sgRNA 및 Cas9 mRNA로 핵내도입된 T 세포에서 더 낮은 빈도의 세포 사멸을 보여준다. 100만개의 자극된 T 세포를 10 ㎍의 표시된 합성 sgRNA 및 15 ㎍ Cas9 mRNA 또는 1 ㎍ Cas9-암호화 플라스미드로 핵내도입시켰다. CCR5 sgRNA 및 Cas9 단백질을 둘 다 암호화하는 플라스미드 1 ㎍을 비교를 위해 포함시켰다(sgRNA 플라스미드). 핵내도입 3일 후에, 세포를 라이브/데드(LIVE/DEAD) 세포 염색으로 염색하였다. 막대들은, 3명의 상이한 T 세포 공여체들에 대한 사멸 세포의 평균 % +SEM, n=6을 나타낸다.
도 15는 T 세포 내에 합성 sgRNA의 핵내도입후 증식 분석으로부터 수득된 결과를 보여준다. 2개의 상이한 공여체들로부터의 자극된 T 세포를 제 0 일에 핵내도입시키고, 셀타이터 글로(CellTiter Glo) 분석을 이용하여 세포 증식을 모니터링하였다. 복제물들의 SEM은 명료성을 위해 나타내지 않았지만, 모두 표시된 값들의 15% 미만이다.
도 16은 비자극 T 세포에서의 CCR5 분포를 보여준다. 3명의 상이한 공여체들로부터의 비자극 인간 T 세포를 단리한 날에 MS sgRNA 및 Cas9 mRNA로 핵내도입시켰다. 핵내도입 3일 후에 gDNA를 추출하고 in/del 빈도를 기준 대조군으로서 모의-처리된 샘플을 사용하여 TIDE에 의해 측정하였다. 막대들은 평균 +SEM, n=2를 나타낸다.
도 17은 가동화된 PB CD34+ HSPC에서 IL2RG 및 HBB에 대한 in/del 빈도를 예시한다. CD34+ HSPC의 핵내도입 3일 후에, 게놈 DNA를 추출하고 in/del 빈도를 T7 분석에 의해 측정하였다. IL2RG 및 HBB 각각에 대한 3개의 생물 복제물들중 1개의 대표적인 겔을 나타내었다. +SEM, n=2.
도 18a 및 18b는 2개의 sgRNA를 사용하여 1차 인간 T 세포 및 CD34+ HSPC에서 높은 CCR5 유전자 변형 빈도를 보여준다. 3명의 상이한 공여체들로부터의 자극된 T 세포 및 PB 가동화된 CD34+ HSPC를 Cas9 mRNA와 함께 "D" 및 "Q" sgRNA로 3중으로 핵내도입시켰다. 핵내도입 3일 후에 gDNA를 추출하고, CCR5의 변형된 영역을 한 쌍의 프라이머를 사용하여 PCR-증폭시켜 비변형된 대립유전자에 대한 2.1kb 앰플리콘을 생성하였다(도 18a). PCR 앰플리콘을 형질전환을 위해 플라스미드내에 서브클로닝하고, 개별적인 대립유전자를 나타내는 개개 콜로니들을 서열분석하고 예상 게놈 서열에 대해 참조하고 대립유전자 유전자형에 따라 분류하였다(도 18b).
도 19는 MS-변형된 sgRNA가 CD34+ HSPC에서 비변형된 sgRNA보다 우수하게 작용함을 보여준다. CD34+ HSPC를 2.5 몰 과량의 표시된 합성 HBB sgRNA와 사전-복합체화된 30 ㎍ Cas9 단백질로 핵내도입시켰다. indel 빈도는 핵내도입 4일 후에 TIDE 분석에 의해 측정하였다. 막대들은 3명의 상이한 공여체들에 대한 평균 indel 빈도 +SEM, n=3을 나타낸다. ** p < 0.01, 스튜던트 t 검정(Student's t test).
도 20은 변형된 sgRNA가 효과적인 다중 게놈 편집에 사용될 수 있음을 보여준다. 100만개의 K562 세포를 15 ㎍ Cas9 mRNA 및 5 ㎍ CCR5, HBB, 또는 IL2RG MS-변형된 sgRNA 또는 3개 sgRNA 모두(다중화)(3x5 ㎍)로 핵내도입시켰다. indel 빈도는 핵내도입 3일 후에 3개의 유전자좌 각각에서 TIDE 분석에 의해 측정하였다. 막대들은 평균 indel 빈도 +SEM, n=3을 나타낸다. *** p < 0.001, n.s. = p ≥ 0.05, 스튜던트 t 검정.
도 21은 화학적으로 변형된 CCR5 sgRNA, Cas9 mRNA 및 CCR5 ssODN을 사용한 상동적 재조합 후에 CCR5 표적 부위에 걸쳐있는 PCR 산물을 보여준다.
서론
본원에서는 시험관내 세포(예를 들어, 생체외 치료에 사용하기 위한 1차 세포) 또는 생체내 세포(예를 들어, 인간과 같은 대상의 장기 또는 조직내 세포)에서 CRISPR/Cas-기반 게놈 편집 및/또는 유전자 발현의 조절을 위한 방법이 제공된다. 특히, 본원에 제공된 방법은, 상응하는 비변형된 sgRNA에 비해 유전자 조절(예를 들어, 게놈 편집, 유전자 발현의 억제 및 유전자 발현의 활성화) 동안 증대된 활성을 갖는 화학적으로 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 사용한다. 특정 양태에서, 본 발명은 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편, Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터와 함께 표적 핵산에 하이브리드화되는 화학적으로 변형된 sgRNA를 도입함으로써 세포에서 표적 핵산의 유전자 조절을 위한 방법을 제공한다. 특정한 다른 양태에서, 본 발명은 유전자 질환과 연관된 유전자 돌연변이를 교정하기에 충분한 양의 화학적으로 변형된 sgRNA를 투여함으로써 대상에서 상기 유전자 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
일반적 원리
본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한, 당해 분야에 기술에 속하는 면역학, 생화학, 화학, 분자생물학, 미생물학, 세포생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 통상적인 기술들을 이용한다(문헌 [Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989), Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987)), the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)] 참조).
상업적으로 시판하지 않는 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 문헌 [Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984)]에 기술된 바와 같이, 자동 합성기를 사용하여, 문헌 [Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett . 22:1859-1862 (1981)]에 처음 기술된 고체상 포스포르아미다이트 트라이에스터 방법에 따라서 화학적으로 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 정제는 임의의 당해분야에 알려진 방법, 예를 들어, 문헌 [Pearson and Reanier, J. Chrom. 255:137-149 (1983)]에 기술된 바와 같은 천연 아크릴아미드 겔 전기영동 또는 음이온-교환 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 수행한다.
정의
구체적으로 달리 나타내지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 또한, 본원에 기술된 방법 또는 물질과 유사하거나 등가인 임의의 방법 또는 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 하기의 용어들을 정의한다.
본원에서 사용된 단수형 표현은 1개의 구성원을 갖는 양태를 포함할 뿐 아니라 1개보다 많은 구성원을 갖는 양태도 포함한다. 예를 들어, 단수형 표현은 문맥에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 다수의 상기 세포들을 포함하고, "약제"에 대한 언급은 당해 분야에 숙련된 자에게 공지된 1개 이상의 약제들 등에 대한 언급을 포함한다.
용어 "1차 세포"는 다세포 유기체로부터 직접 단리된 세포를 말한다. 1차 세포는 전형적으로 집단 배가가 거의 일어나지 않았으므로 연속계대 (종양 또는 인공적으로 불멸화된) 세포주와 비교하여 이들이 유도된 조직의 주기능 성분을 더 많이 나타낸다. 일부 경우들에서, 1차 세포는 단리된 다음 즉시 사용된 세포들이다. 다른 경우에서, 1차 세포는 무기한으로 분열할 수 없으므로 시험관 내에서 장기간동안 배양될 수 없다.
용어 "게놈 편집"은 1개 이상의 뉴클레아제 및/또는 니카아제(nickase)를 사용하여 DNA가 삽입되거나, 치환되거나, 표적 DNA, 예를 들어, 세포의 게놈으로부터 제거되는 유전자 조작의 한 유형을 말한다. 뉴클레아제는 게놈내 목적하는 위치에서 특이적인 이중-가닥 파손(DSB)을 유발하고, 세포의 내인성 메카니즘을 이용하여 상동성-유도 복구(HDR)(예를 들어, 상동적 재조합)에 의해 또는 비상동적 말단 결합(NHEJ)에 의해 상기 유도된 파손을 복구시킨다. 니카아제는 게놈내 목적하는 위치에서 특이적 단일-가닥 파손을 유발한다. 비-제한적인 한 예에서, 2개의 니카아제를 사용하여 표적 DNA의 반대 가닥 상에 2개의 단일-가닥 파손을 유발함으로써 평활 말단 또는 접착성 말단을 생성시킬 수 있다. CRISPR-연관 단백질(Cas) 뉴클레아제, 아연 집게 뉴클레아제(ZFN), 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN), 메가뉴클레아제, 기타 엔도- 또는 엑소-뉴클레아제, 이의 변이체, 이의 단편 및 이들의 조합을 포함하나 이로 한정되지는 않는 임의의 적합한 뉴클레아제가 표적 DNA 서열의 게놈 편집을 유도하기 위해 세포 내에 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 DNA 서열의 뉴클레아제-매개 게놈 편집은, 예를 들어, 상동성-유도 복구(HDR)를 통한 정밀한 게놈 편집의 효율을 개선하기 위해 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드 또는 Cas9 mRNA)와 함께 본원에 기술된 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 사용하여 "유도"되거나 "조절"(예를 들어, 증대)될 수 있다.
용어 "상동성-유도 복구" 또는 "HDR"은 복구를 유도하기 위해 상동적 주형을 사용하여 이중-가닥 DNA 파손을 정확하고 정밀하게 복구하기 위한 세포내 메카니즘을 말한다. HDR의 가장 일반적인 형태는 뉴클레오티드 서열이 2개의 유사하거나 동일한 DNA 분자들 사이에서 교환되는 유전자 재조합의 한 유형인 상동적 재조합(HR)이다.
용어 "비상동적 말단 결합" 또는 "NHEJ"는 파손 말단들이, 상동적 주형이 필요없이 직접 접합되는, 이중-가닥 DNA 파손을 복구하는 경로를 말한다.
용어 "핵산", "뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 말한다. 상기 용어는 단일-, 이중- 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및/또는 피리미딘 염기 또는 다른 천연, 화학적으로 변형되거나, 생화학적으로 변형되거나, 비-천연, 합성 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA, RNA 및 이의 유사체들의 혼합물을 포함할 수 있다. 구체적으로 한정되지 않는 한, 상기 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 성질을 가지며 천연 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 암묵적으로 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 동의 코돈 치환), 대립유전자, 이종상동체, 단일 뉴클레오티드 다형체(SNP) 및 상보적 서열뿐 아니라, 명확하게 나타낸 서열을 포함한다. 특히, 동의 코돈 치환은, 1개 이상의 선택된(또는 모든) 코돈들의 3번째 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol . Chem . 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]. 용어 "핵산"은 유전자, cDNA, 및 유전자에 의해 암호화된 mRNA와 상호교환적으로 사용된다.
용어 "뉴클레오티드 유사체" 또는 "변형된 뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 질소성 염기(예를 들어, 시토신(C), 티민(T) 또는 우라실(U), 아데닌(A) 또는 구아닌(G)) 내에 또는 위에, 또는 뉴클레오시디의 당 잔기(예를 들어, 리보스, 데옥시리보스, 변형된 리보스, 변형된 데옥시리보스, 6-원 당 유사체, 또는 개방-쇄 당 유사체) 내에 또는 위에, 또는 포스페이트에 1개 이상의 화학 변형(예를 들어, 치환)을 함유하는 뉴클레오티드를 말한다.
용어 "유전자" 또는 "폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 폴리펩티드 쇄를 생성하는데 수반된 DNA의 분절을 의미한다. 상기 DNA 분절은 유전자 산물의 전사/번역 및 전사/번역의 조절에 수반된 암호화 영역(리더 또는 트레일러) 이전 및 이후의 영역들 뿐 아니라, 개개 암호화 분절(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수 있다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 아미노산 잔기들의 중합체를 말하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 아미노산의 인공적 화학 모방체인 아미노산 중합체 뿐 아니라, 천연 아미노산 중합체 및 비-천연 아미노산 중합체에도 적용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 상기 용어는 아미노산 잔기들이 공유 펩티드 결합에 의해 연결된, 전장 단백질을 포함하여 임의의 길이를 갖는 아미노산 쇄를 포함한다.
용어 "변이체"는 천연에서 존재하는 것에서 벗어나는 유기체, 균주, 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 또는 특징의 한 형태를 말한다.
용어 "상보성"은 전통적인 왓슨-크릭 또는 다른 비-전통적 유형에 의해 또 다른 핵산 서열과 수소 결합을 형성하는 핵산의 능력을 말한다. % 상보성은 제 2의 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍 형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자내 잔기들의 백분율을 나타낸다(예를 들어, 10개 중에서 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보적임). "완전히 상보적"은 핵산 서열의 모든 인접 잔기들이 제 2의 핵산 서열내 동일한 수의 인접 잔기들과 수소 결합할 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "실질적으로 상보적"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오티드들의 영역에 대해 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%. 97%, 98%, 99%, 또는 100%인 상보성의 정도를 말하거나, 엄격한 조건하에서 하이브리드화되는 2개의 핵산을 말한다.
하이브리드화를 위한 "엄격한 조건"이라는 용어는 표적 서열에 대한 상보성을 갖는 핵산이 대부분 표적 서열과 하이브리드화되고 실질적으로 비-표적 서열에는 하이브리드화되지 않는 조건을 말한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존성이며, 많은 요인들에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록 서열이 그 표적 서열에 특이적으로 하이브리드화되는 온도가 높다. 엄격한 조건의 비-제한 예는 문헌 [Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part 1, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y]에 상세하게 기술되어 있다.
용어 "하이브리드화"는 1개 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여 뉴클레오티드 잔기들의 염기들 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 말한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기쌍 형성, 훅스테인(Hoogstein) 결합에 의해 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 일어날 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자가-하이브리드화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
"재조합 발현 벡터"는 숙주 세포에서 특정 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 허용하는 일련의 특정 핵산 요소들을 갖는, 재조합적으로 또는 합성적으로 생성된 핵산 구조물이다. 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 게놈 또는 핵산 단편의 일부일 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터에 작동가능하게 연결된, 전사될 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이와 관련하여 "작동가능하게 연결된"은 암호화 서열의 전사를 유도하는 프로모터와 같은 요소들의 적절한 생물학적 기능을 허용하는 상대적 위치에 놓인 2개 이상의 유전자 요소, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 암호화 서열 및 프로모터를 의미한다. 용어 "프로모터"는 본원에서 핵산의 전사를 유도하는 핵산 조절 서열의 배열을 말하기 위해 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 프로모터는 폴리머라제 2형 프로모터의 경우에서 TATA 요소와 같은, 전사 개시 부위 부근의 필수적인 핵산 서열을 포함한다. 프로모터는 또한 선택적으로, 전사 개시 부위로부터 수천개 염기쌍만큼 멀리 위치할 수 있는 원위 증폭인자 또는 억제인자 요소를 포함한다. 발현 벡터에 존재할 수 있는 다른 요소들로는 전사를 증대시키고(예를 들어, 증폭인자) 전사를 종료시키는(예를 들어, 종결인자) 요소들 뿐 아니라, 발현 벡터로부터 생성된 재조합 단백질에 특정한 결합 친화도 또는 항원성을 제공하는 요소들이 포함된다.
"재조합체"는 유전적으로 변형된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 세포, 조직 또는 유기체를 말한다. 예를 들어, 재조합 폴리뉴클레오티드(또는 재조합 폴리뉴클레오티드의 복사체 또는 보체)는 공지된 방법을 이용하여 제조된 것이다. 제 2의 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 암호화 서열)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 재조합 발현 카세트는 인간 조작의 결과로서(예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989) or Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, John Wiley & Sons, Inc. (1994-1998)]에 기술된 방법에 의해) 제 2 폴리뉴클레오티드에 이종인 프로모터를 포함할 수 있다. 재조합 발현 카세트(또는 발현 벡터)는 전형적으로 천연에서 발견되지 않는 조합으로 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를 들어, 인간 조작된 제한효소 부위 또는 플라스미드 벡터 서열은 프로모터 측면에 위치하거나 프로모터를 다른 서열들로부터 분리시킬 수 있다. 재조합 단백질은 재조합 폴리뉴클레오티드로부터 발현되는 단백질이며, 재조합 세포, 조직 및 유기체는 재조합 서열(폴리뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드)을 포함하는 것들이다.
용어 "단일 뉴클레오티드 다형성" 또는 "SNP"는 대립유전자 내부를 포함하여, 폴리뉴클레오티드에 의한 단일 뉴클레오티드의 변화를 말한다. 이것은 1개 뉴클레오티드의 또 다른 뉴클레오티드에 의한 치환 뿐 아니라, 단일 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입을 포함할 수 있다. 가장 전형적으로, SNP는 이중대립유전자 마커이지만, 3중- 및 4중-대립유전자 마커도 또한 존재할 수 있다. 비-제한 예로써, SNP A＼C를 포함하는 핵산 분자는 다형성 위치에 C 또는 A를 포함할 수 있다.
용어 "배양하다", "배양하는", "성장하다", "성장하는", "유지하다", "유지하는", "증식시키다", "증식시키는" 등은, 세포 배양균 자체 또는 배양 과정에 대해 언급할 때, 세포(예를 들어, 1차 세포)가 통제된 조건하에서, 예를 들어, 생존에 적합한 조건하에서 이의 정상적인 환경 외에서 유지되는 것을 의미하는 것으로 상호교환적으로 사용될 수 있다. 배양된 세포는 생존하게 되고, 배양은 세포 성장, 정체, 분화 또는 분열을 야기할 수 있다. 상기 용어는, 일부 세포가 자연적으로 사멸하거나 노쇠할 수 있기 때문에, 배양물중 모든 세포가 생존하거나 성장하거나 분열하는 것을 의미하지는 않는다. 세포는 전형적으로 배지중에서 배양되며, 상기 배지는 배양 과정동안 교체될 수 있다.
용어 "대상", "환자" 및 "개체"는 본원에서 인간 또는 동물을 포함하는 것으로 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 동물 대상은 포유동물, 영장류(예를 들어, 원숭이), 가축 동물(예를 들어, 말, 소, 양, 돼지 또는 염소), 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이), 실험실 시험 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 기니 피그, 조류), 수의과적으로 중요한 동물, 또는 경제적으로 중요한 동물일 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "투여하는"은 대상에게 경구 투여, 국소 접촉, 좌약으로서 투여, 정맥내, 복강내, 근육내, 병변내, 척추강내, 비강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 비경구 및 경점막을 포함한 임의의 경로(예를 들어, 구강, 설하, 구개, 잇몸, 코, 질, 직장 또는 경피)에 의한다. 비경구 투여는, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 소동맥내, 피내, 피하, 복강내, 심실내 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식으로는 리포좀 제형, 정맥내 주입, 경피용 패치 등의 사용이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
용어 "치료하는"은 치료 이점 및/또는 예방 이점을 포함하나 이로 한정되지는 않는 유리하거나 바람직한 결과를 얻기 위한 접근방법을 말한다. 치료 이점은 치료중인 하나 이상의 질환, 병태 또는 증상에서 임의의 치료적으로 적절한 개선 또는 상기 질환, 병태 또는 증상에 대한 효과를 의미한다. 예방 이점을 위해서, 조성물은 특정 질환, 병태 또는 증상이 발생할 위험이 있는 대상에게, 또는 질환, 병태 또는 증상이 아직 뚜렷해지지 않았을지라도 질환의 하나 이상의 생리학적 증상을 보고하는 대상에게 투여될 수 있다.
용어 "효과량" 또는 "충분량"은 유리하거나 바람직한 결과를 수행하기에 충분한 약제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 변형된 단일 가이드 RNA 등)의 양을 말한다. 치료 효과량은 다음의 하나 이상에 따라 달라질 수 있다: 치료되는 대상 및 질환 상태, 대상의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등(이것들은 당해 분야에 통상의 기술을 가잔 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다). 특정량은 다음 중 하나 이상에 따라 달라질 수 있다: 선택된 특정 약제, 표적 세포 유형, 대상내 표적 세포의 위치, 후속 투약 요법, 다른 약제와 함께 투여되는지 여부, 투여 시기, 및 운반되는 물리적 전달 시스템.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 세포, 유기체 또는 대상에게 약제(예를 들어, Cas 뉴클레아제, 변형된 단일 가이드 RNA 등)의 투여를 촉진하는 물질을 말한다. "약학적으로 허용되는 담체"는 조성물 또는 제형에 포함될 수 있고 환자에게 중대한 불리한 독물학적 영향을 야기하지 않는 담체 또는 부형제를 말한다. 약학적으로 허용되는 담체의 비-제한 예로는 물, NaCl, 표준 식염수 용액, 락테이트화 링거(Ringer)액, 표준 슈크로스, 표준 글루코스, 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 착색제 등이 포함된다. 당해 분야에 기술을 가진 자라면 다른 약학적 담체가 본 발명에 유용함을 인지할 것이다.
CRISPR 시스템의 성분들에 관하여, 용어 "증가하는 안정성"은 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 구조를 안정화시키는 변형을 말한다. 상기 용어는 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 분해를 감소시키거나, 억제하거나, 저하시키거나, 경감시키는 변형을 포함한다.
CRISPR 시스템의 성분들에 관하여, 용어 "증가하는 특이성"은 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 특이적 활성(예를 들어, 표적적중(on-target) 활성)을 증가시키는 변형을 말한다. 상기 용어는 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 비-특이적 활성(예를 들어, 표적이탈 활성)을 감소시키거나, 억제하거나, 저하시키거나, 경감시키는 변형을 포함한다.
CRISPR 시스템의 성분들에 관하여, 용어 "감소하는 독성"은 세포, 유기체, 대상 등에 대한 CRISPR 시스템의 임의의 분자 성분의 독성 효과를 감소시키거나, 억제하거나, 저하시키거나, 경감시키는 변형을 말한다.
CRISPR 시스템의 성분들에 관하여, 용어 "증대된 활성"은 게놈 편집 및/또는 유전자 발현을 유도하거나, 조정하거나, 조절하거나, 제어하는 효율 및/또는 빈도에서의 증가 또는 개선을 말한다.
기준 수치와 관련하여 용어 "약"은 값 + 또는 - 상기 값으로부터의 10%의 범위를 포함할 수 있다. 예를 들어, "약 10"의 양은 9, 10 및 11의 기준 숫자를 포함하여 9 내지 11의 양을 포함한다. 기준 수치와 관련하여 용어 "약"은 또한 값 + 또는 - 상기 값으로부터 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1%의 범위를 포함할 수 있다.
실시양태들에 대한 설명
본 발명은 세포내 표적 핵산의 유전자 조절을 유도하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 1차 세포(예를 들어, 생체외 치료에 사용하기 위해 시험관 내에서 배양된)에서 또는 인간과 같은 대상내 세포(예를 들어, 생체내 시험에 사용하기 위한)에서 게놈 편집 및/또는 표적 핵산의 유전자 발현의 억제 또는 활성화를 증대시키는 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 질환과 연관된 표적 유전자에서 돌연변이를 교정시키는 정밀한 게놈 편집을 증대시킴으로써 대상에서 상기 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 뉴클레아제-매개 게놈 편집 기술로 처리할 수 있는 임의의 세포 유형에 및 임의의 유전자좌에 사용될 수 있다.
첫 번째 양태에서, 본 발명은,
(a) 표적 핵산에 상보적인 제 1 뉴클레오티드 서열 및 CRISPR-연관 단백질(Cas) 폴리펩티드와 상호작용하는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)(이때, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다); 및
(b) Cas 폴리펩티드, Cas 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA, 및/또는 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터
(이때, 상기 변형된 sgRNA는 Cas 폴리펩티드를 표적 핵산으로 유도하고, 상기 변형된 sgRNA는 상응하는 비변형된 sgRNA에 비해 증대된 활성하에 표적 핵산의 유전자 조절을 유도한다)를 1차 세포 내에 도입하는 것을 포함하는, 1차 세포에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도(예를 들어, 개시, 조절, 증대 등)하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 증대된 활성은 변형된 sgRNA의 증가된 안정성 및/또는 표적 핵산에 대한 변형된 sgRNA의 증가된 특이성을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적 핵산은 표적 DNA 또는 표적 RNA를 포함한다. 표적 핵산의 유전자 조절은 표적 핵산에 의한 특이적 유전자 산물(예를 들어, 단백질 또는 RNA)의 생성을 증가시키거나 감소시키기 위해 세포에 의해 사용된 임의의 메카니즘을 포함하고, 표적 핵산의 게놈 편집 또는 표적 핵산의 유전자 발현의 조절(예를 들어, 억제 또는 활성화)을 포함한다. 일부 경우에서, 유전자 조절은 표적 DNA의 게놈 편집을 포함한다. 게놈 편집은 표적 DNA의 상동성-유도 복구(HDR) 또는 비상동적 말단 결합(NHEJ)일 수 있다. 다른 경우에서, 유전자 조절은 엔도뉴클레아제-결핍 Cas 폴리펩티드를 사용하여 표적 DNA 또는 표적 RNA의 유전자 발현을 조절(예를 들어, 억제 또는 활성화)하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 1차 세포 내에 재조합 공여체 복구 주형을 도입하는 것을 추가로 포함한다. 특정 상황에서, 재조합 공여체 복구 주형은 표적 DNA의 2개의 비-중복 상동 부분을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 상기 뉴클레오티드 서열들은 게놈 편집될 표적 DNA에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 위치한다. 다른 경우에서, 재조합 공여체 복구 주형은, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 교정하는 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 표적 DNA의 2개의 비-중복 상동 부분을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN) 주형을 포함하며, 이때 상기 뉴클레오티드 서열들은 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 위치한다.
일부 실시양태에서, 1차 세포는 변형된 sgRNA 및 Cas 폴리펩티드를 1차 세포 내에 도입하기 전에 다세포 유기체로부터 단리된다. 다세포 유기체는 식물, 다세포 원생생물, 다세포 진균, 또는 포유동물(예를 들어, 인간)과 같은 동물일 수 있다. 특정한 경우에서, 1차 세포는 줄기 세포, 면역 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 줄기 세포의 비-제한 예로는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC), 예를 들어, CD34+ HSPC, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 장기 줄기 세포 및 이들의 조합이 포함된다. 면역 세포의 비-제한 예로는 T 세포(예를 들어, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 종양 침윤 세포(TIL), 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 효과기 T 세포), 자연 살해세포, 단핵구, 말초혈 단핵 세포(PBMC), 말초혈 림프구(PBL) 및 이들의 조합이 포함된다. 다른 실시양태에서, 1차 세포 또는 이의 자손(예를 들어, 1차 세포에서 유도된 세포)은 변형된 sgRNA 및 Cas 폴리펩티드를 1차 세포 내에 도입시킨 후에 다세포 유기체(예를 들어, 인간)로 복귀(예를 들어, 임의의 허용되는 전달 시스템 및 전달 경로를 통해 투여)된다.
일부 실시양태에서, 1차 세포는 1차 세포들의 집단을 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 sgRNA는 1차 세포들 집단의 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도한다. 다른 경우에서, 1차 세포들의 집단은 적어도 약 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 또는 109 개의 1차 세포를 포함한다. 특정한 상황에서, 유전자 조절은 1차 세포들의 집단에서 표적 DNA의 게놈 편집(예를 들어, HDR 또는 NHEJ)을 포함한다. 특정한 다른 경우에서, 유전자 조절은 엔도뉴클레아제-결핍 Cas 폴리펩티드를 사용하여 1차 세포들의 집단에서 표적 DNA 또는 표적 RNA의 유전자 발현을 조절(예를 들어, 억제 또는 활성화)하는 것을 포함한다. 비-제한 예로서, 변형된 sgRNA는 Cas 폴리펩티드(예를 들어, 리보핵단백질(RNP) 복합체로서) 또는 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA와 함께 변형된 sgRNA를 1차 T 세포 내에 도입시킨 후 1차 T 세포 집단의 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60% 이상에서 HDR(예를 들어, in/del 빈도)을 유도할 수 있다. 또 다른 비-제한 예로서, 변형된 sgRNA는, Cas 폴리펩티드(예를 들어, RNP 복합체로서) 또는 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA와 함께 변형된 sgRNA를 1차 HSPC 내에 도입시킨 후 1차 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 집단의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% 또는 60% 이상에서 HDR(예를 들어, in/del 빈도)을 유도할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA의 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열 중 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드는 리보스기, 포스페이트기, 핵염기 또는 이들의 조합에 변형을 포함한다. 리보스기에서의 변형은 리보스기의 2' 위치에서의 변형일 수 있다. 일부 경우에서, 리보스기의 2' 위치에서의 변형은 2'-O-메틸, 2'-플루오로, 2'-데옥시 및 2'-O-(2-메톡시에틸)로 이루어진 군에서 선택된다. 포스페이트기에서의 변형은 포스포로티오에이트 변형일 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 sgRNA의 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열 중 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드는 2'-O-메틸(M) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트(MS) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 3'-티오PACE(MSP) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 sgRNA는 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 MS 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 sgRNA는 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 MSP 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 sgRNA는 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 MS 뉴클레오티드 및 1개 이상의 MSP 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 sgRNA는 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열에 M 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 일부 경우에서, 변형된 sgRNA는 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열에 변형된 뉴클레오티드로서 MS 뉴클레오티드 및/또는 MSP 뉴클레오티드만을 포함한다. 다른 경우에서, 변형된 sgRNA는 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 MS 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 MSP 뉴클레오티드를 포함하고, 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열에 1개 이상의 M 뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA의 제 1 뉴클레오티드 서열은 약 20개 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 경우에서, 제 1 뉴클레오티드 서열에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이다. 특정한 경우에서, 제 1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제 1 뉴클레오티드 서열)의 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 경우에서, 제 1 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 약 20개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제 1 뉴클레오티드 서열)의 뉴클레오티드 모두가 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 경우에서, 변형된 뉴클레오티드는 제 1 뉴클레오티드 서열의 5'-말단(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 5'-말단 부근(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에 위치하고/하거나 제 1 뉴클레오티드 서열 내의 내부 위치에 위치한다. 다른 경우에서, 제 1 뉴클레오티드 서열에서 약 10 내지 약 30%의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA의 제 2 뉴클레오티드 서열은 약 80개 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 경우에서, 제 2 뉴클레오티드 서열에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이다. 특정 상황에서, 제 2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 약 80개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제 2 뉴클레오티드 서열)의 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 또는 80개 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이다. 다른 경우에서, 제 2 뉴클레오티드 서열(예를 들어, 약 80개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 제 2 뉴클레오티드 서열) 중의 뉴크레오티드 모두가 변형된 뉴클레오티드이다. 일부 경우에서, 변형된 뉴클레오티드는 제 2 뉴클레오티드 서열의 3'-말단(예를 들어, 3'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 3'-말단 부근(예를 들어, 3'-말단의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에 위치하고/하거나 제 2 뉴클레오티드 서열 내의 내부 위치에 위치한다. 다른 경우에서, 제 2 뉴클레오티드 서열에서 약 1 내지 약 10%의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 변형된 sgRNA는, 제 1 뉴클레오티드 서열의 5'-말단(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 5'-말단 부근(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에서 시작하여 1, 2 또는 3개의 연속적인 또는 비-연속적인 변형된 뉴클레오티드, 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 3'-말단(예를 들어, 3'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 3'-말단 부근(예를 들어, 3'-말단의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에서 시작하여 1, 2 또는 3개의 연속적인 또는 비-연속적인 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 경우에서, 변형된 sgRNA는, 제 1 뉴클레오티드 서열의 5'-말단(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 5'-말단 부근(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에 1개의 변형된 뉴클레오티드, 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 3'-말단(예를 들어, 3'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 3'-말단 부근(예를 들어, 3'-말단의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 경우에서, 변형된 sgRNA는 제 1 뉴클레오티드 서열의 5'-말단(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 5'-말단 부근(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에서 시작하여 2개의 연속적인 또는 비-연속적인 변형된 뉴클레오티드, 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 3'-말단(예를 들어, 3'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 3'-말단 부근(예를 들어, 3'-말단의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에서 시작하여 2개의 연속적인 또는 비-연속적인 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 경우에서, 변형된 sgRNA는 제 1 뉴클레오티드 서열의 5'-말단(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 5'-말단 부근(예를 들어, 5'-말단에서의 말단 뉴클레오티드의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에서 시작하여 3개의 연속적인 또는 비-연속적인 변형된 뉴클레오티드, 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 3'-말단(예를 들어, 3'-말단에서의 말단 뉴클레오티드) 또는 3'-말단 부근(예를 들어, 3'-말단의 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 이내)에서 시작하여 3개의 연속적인 또는 비-연속적인 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 변형된 sgRNA는 제 1 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 3개의 연속적인 변형된 뉴클레오티드, 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 3'-말단에 3개의 연속적인 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA는 화학적으로 합성된다. 다른 실시양태에서, 유전자 조절을 유도하는 방법은 다수의 변형된 sgRNA를 사용하여 단일 표적 핵산 서열 또는 상이한 표적 핵산 서열들의 다중 유전자 조절(예를 들어, 게놈 편집 또는 유전자 발현 조절)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 다중 유전자 조절은 상응하는 비변형된 sgRNA의 사용에 비해 더 효과적이고/이거나 일관된다. 특정한 경우에서, 다수의 변형된 sgRNA가 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20개 이상의 상이한 변형된 sgRNA를 포함하며, 이때 각각의 변형된 sgRNA는 상이한 표적 핵산으로 유도된다. 다른 경우에서, 다수의 변형된 sgRNA는 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20개 이상의 상이한 변형된 sgRNA를 포함하며, 이때 각각의 변형된 sgRNA는 동일한 표적 핵산으로 유도된다.
특정 실시양태에서, Cas 폴리펩티드는 Cas 폴리펩티드 변이체 또는 Cas 폴리펩티드 단편이다. 특정 실시양태에서, Cas 폴리펩티드는 Cas9 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 단편이다. 다른 실시양태에서, 1차 세포 내에 도입하는 단계는 1차 세포를 전기천공(예를 들어, 핵내도입을 통해)하는 것을 포함한다.
두 번째 양태에서, 본 발명은, 유전자 질환과 연관된 표적 유전자에서 돌연변이를 교정하기에 충분한 양으로 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 대상에게 투여하는(이때, 상기 변형된 sgRNA는 표적 유전자에 상보적인 제 1 뉴클레오티드 서열 및 CRISPR-연관 단백질(Cas) 폴리펩티드와 상호작용하는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열 중 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이다) 것을 포함하는, 상기 대상에서 유전자 질환을 예방하거나 치료하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 유전자 질환은 X 염색체-관련 중증 복합 면역 결핍, 겸상적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 혈우병, 종양형성, 암, 노인성 황반 변성, 조현병, 트라이뉴클레오티드 반복 장애, 취약 X 증후군, 프리온-관련 장애, 근위축성 측색 경화증, 약물 남용, 자폐증, 알츠하이머(Alzheimer) 질환, 파킨슨(Parkinson) 질환, 낭성 섬유증, 혈액 및 응고 질환 또는 장애, 염증, 면역-관련 질환 또는 장애, 대사 질환, 간 질환 및 장애, 신장 질환 및 장애, 근육/골격 질환 및 장애, 신경학 및 신경 질환 및 장애, 심혈관 질환 및 장애, 폐 질환 및 장애, 눈 질환 및 장애, 및 바이러스 감염(예를 들어, HIV 감염)으로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상에게 Cas 폴리펩티드, Cas 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA, 및/또는 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상에게 재조합 공여체 복구 주형을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정한 경우에서, 재조합 공여체 복구 주형은 표적 유전자의 2개의 비-중복 상동 부분을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 상기 뉴클레오티드 서열들은 게놈 편집될 표적 유전자에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 위치한다. 다른 경우에서, 재조합 공여체 복구 주형은, 표적 유전자에서 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 교정하는 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자의 2개의 비-중복 상동 부분을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN) 주형을 포함하며, 이때 상기 뉴클레오티드 서열들은 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 위치한다.
특정 실시양태에서, 변형된 sgRNA를 투여하는 것은, 상응하는 비변형된 sgRNA를 투여하는 것에 비해 표적 유전자에서 돌연변이를 교정하는 Cas 폴리펩티드의 효과를 증대시킨다. 대상에서 유전자 질환을 예방하거나 치료하는 방법에 사용되는 변형된 sgRNA와 관련된 비-제한 실시양태는 상기에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA, Cas 폴리펩티드 및/또는 재조합 공여체 복구 주형은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 대상에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA, Cas 폴리펩티드 및/또는 재조합 공여체 복구 주형은 나노입자, 리포좀, 미셀, 비로좀, 핵산 복합체 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 전달 시스템을 통해 대상에게 투여된다. 특정한 경우에서, 핵산 복합체는 Cas 폴리펩티드와 복합체화된 변형된 sgRNA를 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA, Cas 폴리펩티드 및/또는 재조합 공여체 복구 주형은 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 피내, 피하, 소동맥내, 심실내, 두개내, 병변내, 척추강내, 국소, 경점막, 비강내 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 전달 경로를 통해 대상에게 투여된다.
본원에 기술된 화학적으로 변형된 sgRNA는 유전자 발현 억제를 위한 CRISPRi, 유전자 발현 활성화를 위한 CRISPRa, 게놈 유전자좌의 동적 가시화를 위한 CRISPR 영상화 도구, 및 CRISPR-매개 RNA 인식 및 절단을 포함하나 이로 한정되지는 않는 임의의 CRISPR-연관 기술에 사용될 수 있다. 일부 경우에서, sgRNA는 소분자 또는 단백질의 영상화 및/또는 소분자 또는 단백질의 시험관내 세포 또는 생체내 세포로의 전달에 사용될 수 있다. 따라서, sgRNA는 연구 및 치료 용도에 사용될 수 있다.
A. CRISPR / Cas 시스템
게놈 변형의 CRISPR/Cas 시스템은 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 뉴클레아제) 또는 이의 변이체 또는 단편, Cas 뉴클레아제를 표적 게놈 DNA로 표적화하는 가이드 서열 및 Cas 뉴클레아제와 상호작용하는 스캐폴드 서열(예를 들어, tracrRNA)을 함유하는 DNA-표적화 RNA(예를 들어, 변형된 sgRNA), 및 선택적으로, 공여체 복구 주형을 포함한다. 일부 경우에서, 다음 돌연변이: D10A, H840A, D839A 및 H863A 중 하나 이상을 함유하는 Cas9 돌연변이체와 같은 Cas 뉴클레아제의 변이체, 또는 Cas9 니카아제가 사용될 수 있다. 다른 경우에서, 목적하는 성질(예를 들어, 단일- 또는 이중-가닥 파손을 유발하고/하거나 유전자 발현을 조절할 수 있는)을 갖는 Cas 뉴클레아제의 또는 이의 변이체의 단편이 사용될 수 있다. 공여체 복구 주형은 형광 단백질 또는 항생물질 내성 마커와 같은 리포터 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 표적 DNA에 상동성이고 유전자 변형 부위의 측면에 위치하는 상동성 팔(arm)을 포함할 수 있다. 또는, 공여체 복구 주형은 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN)일 수 있다.
1. Cas 뉴클레아제 및 이의 변이체
CRISPR(주기적 간격으로 분포하는 회문구조 반복서열)/Cas(CRISPR-연관 단백질) 뉴클레아제 시스템은 게놈 조작에 사용될 수 있는 세균 시스템을 기반으로 하는 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 상기 시스템은 많은 세균 및 고세균의 후천성 면역 반응의 일부를 기반으로 한다. 바이러스 또는 플라스미드가 세균에 침입할 때, 침입체 DNA의 분절들이 "면역" 반응에 의해 CRISPR RNA(crRNA)로 전환된다. cdRNA는 이어서 부분 상보성을 갖는 영역을 통해 tracrRNA로 불리는 또 다른 유형의 RNA와 결합하여 Cas(예를 들어, Cas9) 뉴클레아제를 "프로토스페이서"로 불리는 표적 DNA내 crRNA에 상동성인 영역으로 유도한다. Cas(예를 들어, Cas9) 뉴클레아제는 DNA를 절단하여 crRNA 전사체 내에 함유된 20-뉴클레오티드 가이드 서열에 의해 특정된 부위들에서의 이중-가닥 파손에서 평활 말단을 생성한다. Cas(예를 들어, Cas9) 뉴클레아제는 부위-특이적 DNA 인식 및 절단에 crRNA 및 tracrRNA를 둘 다 필요로 한다. 상기 시스템은 현재, crRNA 및 tracrRNA가 1개의 분자("단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA")로 융합될 수 있도록 조작되었고, 상기 단일 가이드 RNA의 cdRNA 등가 부분은 Cas(예를 들어, Cas9) 뉴클레아제가 임의의 목적 서열을 표적화하도록 유도하도록 조작될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Jinek et al. (2012) Science, 337:816-821; Jinek et al. (2013) eLife , 2:e00471; Segal (2013) eLife, 2:e00563] 참조). 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 세포의 게놈내 목적하는 표적에서 이중-가닥 파손을 유발하도록 조작될 수 있으며, 세포의 내인성 메카니즘을 이용하여 상동성-유도 복구(HDR) 또는 비상동적 말단-결합(NHEJ)에 의해 상기 유도된 파손을 복구할 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 DNA 절단 활성을 갖는다. Cas 뉴클레아제는 표적 DNA 서열내 한 위치에서 1개 또는 2개 가닥 모두의 절단을 유도할 수 있다. 예를 들어, Cas 뉴클레아제는 표적 DNA 서열의 단일 가닥을 절단하는 1개 이상의 불활성화 촉매 도메인을 갖는 니카아제일 수 있다.
Cas 뉴클레아제의 비-제한 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 동족체, 이의 변이체, 이의 단편, 이의 돌연변이체 및 이의 유도체가 포함된다. Cas 뉴클레아제의 3가지 주요 유형(1형, 2형 및 3형), 및 5개의 1형, 3개의 2형 및 2개의 3형 단백질을 포함한 10개의 아형이 존재한다(예를 들어, 문헌 [Hochstrasser and Doudna, Trends Biochem Sci, 2015:40(1):58-66] 참조). 2형 Cas 뉴클레아제로는 Cas1, Cas2, Csn2 및 Cas9가 포함된다. 이들 Cas 뉴클레아제는 당해 분야에 숙련된 자들에게 공지되어 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 야생형 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 예를 들어, NBCI Ref. Seq. No. NP_269215에 나타나 있으며, 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus) 야생형 Cas9 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 예를 들어, NBCI Ref. Seq. No. WP_011681470에 나타나 있다. 본 발명에 유용한 CRISPR-관련 엔도뉴클레아제는, 예를 들어, 미국 출원 공개 제 2014/0068797 호, 제 2014/0302563 호 및 제 2014/0356959 호에 개시되어 있다.
Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas9 폴리펩티드는 다음을 포함하나 이로 한정되지는 않는 다양한 세균 종들로부터 유도될 수 있다: 베일로넬라 아티피 칼(Veillonella atypical), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 필리팩터 알로시스(Filifactor alocis), 솔로박테리움 무레이(Solobacterium moorei), 코프로코커스 카투스(Coprococcus catus), 트레포네마 덴티콜 라(Treponema denticola), 펩토니필루스 두에르데니(Peptoniphilus duerdenii), 카 테니박테리움 미츠오카이(Catenibacterium mitsuokai), 스트렙토코커스 뮤탄 스(Streptococcus mutans), 리스테리아 이노쿠아(Listeria innocua), 스태필로코커 스 슈도인터메디우스(Staphylococcus pseudintermedius), 애시드아미노코커스 인테 스틴(Apcidaminococcus intestine), 올세넬라 울리(Olsenella uli), 오에노코커스 키타하라(Oenococcus kitaharae), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 미코플라스마 모빌(Mycoplasma mobile), 미코플라스마 갈리셉티쿰(Mycoplasma gallisepticum), 미코플라스마 오비뉴모니에(Mycoplasma ovipneumoniae), 미코플라스마 카니 스(Mycoplasma canis), 미코플라스마 시노비에(Mycoplasma synoviae), 유박테리움 렉테일(Eubacterium rectale), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 유박테리움 돌리쿰(Eubacterium dolichum), 락토바실러스 코리니포 미스 아종 토르켄스 ( Lsactobacillus coryniformis subsp. Torquens), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 루미노코커스 알부스(Ruminococcus albus), 아케라만시아 무시니필라(Akkermansia muciniphila), 아시도터머스 셀룰로라이티쿠스(Acidothermus cellulolyticus), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 덴티움(Bifidobacterium dentium), 코리네박테리움 디프테리아(Cmorynebacterium diphtheria), 엘루시마이크로븀 미누텀(Elusimicrobium minutum), 니트라티프랙터 살수기니스(Nitratifractor salsuginis), 스페로카에타 글로버스(Spphaerochaeta globus), 피브로박터 숙시노게네스 아종 숙시노게네스(Fibrobacter succinogenes subsp . Succinogenes), 박테로이데스 프라질리 스(Bacteroides fragilis), 카프노시토파가 오크라세아(Capnocytophaga ochracea), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 프레보텔란 미칸 스(Pkrevotella micans), 프레보텔라 루미니콜라(Prevotella ruminicola), 플라보 박테리움 콜룸나르(Flavobacterium columnare), 아미노모나스 파우시보란 스(Aminomonas paucivorans), 로도스피릴룸 루브럼(Rhodospirillum rubrum), 칸디 다투스 푸니세이스피릴룸 마리눔(Candidatus Puniceispirillum marinum), 베르미네 프로박터 에이세니아(Verminephrobacter eiseniae), 랄스토니아 시지기 ( Ralstonia syzygii), 디노로세오박터 시바에(Dinoroseobacter shibae), 아조스피릴 룸(Azospirillum), 니트로박터 함부르겐시스(Nitrobacter hamburgensis), 브라디리 조븀(Bradyrhizobium), 울리넬라 숙시노게네스(Wolinella succinogenes), 캄필로박 터 제주니 아종 제주니(Campylobacter jejuni subsp. Jejuni), 헬리코박터 무스텔 라(Hxelicobacter mustelae), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 아시도보락스 에브레우스(Acidovorax ebreus), 클로스트리듐 퍼프린겐스(Clostridium perfringens), 파르비바쿨럼 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 로세부리아 인테스티날리스(Roseburia intestinalis), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 파스튜렐라 멀토시다 아종 멀토시다(Pasteurella multocida subsp . Multocida), 수테렐라 와즈워텐시스(Sutterella wadsworthensis), 프로테오박테리움(proteobacterium), 레지오넬라 뉴모필 라(Legionella pneumophila), 파라수테렐라 엑스크레멘티호미니스(Parasutterella excrementihominis), 울리넬리 숙시노게네스(Wolinella succinogenes), 및 프란시 셀라 노비시다(Fsrancisella novicida).
"Cas9"는 RNA-유도 이중-가닥 DNA-결합 뉴클레아제 단백질 또는 니카아제 단백질을 말한다. 야생형 Cas9 뉴클레아제는 상이한 DNA 가닥을 절단하는 2개의 기능성 도메인, 예를 들어, RuvC 및 HNH를 갖는다. Cas9는 2개 기능성 도메인이 모두 활성일 때 게놈 DNA(표적 DNA)에서 이중-가닥 파손을 유도할 수 있다. Cas9 효소는 다음으로 이루어진 군에 속하는 세균들로부터 유도된 Cas9 단백질의 1개 이상의 촉매 도메인을 포함할 수 있다: 코리네박터(Corynebacter), 수테렐 라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마(Treponema), 필리팩 터(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 미코플라스마(Mycoplasma), 박터로이데스(Bacteroides), 플라비볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 스파에로카에타(Sphaerochaeta), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루코나세토박터(Gluconacetobacter), 나이세리아(Neisseria), 로세부리아(Roseburia), 파르비바 쿨럼(Parvibaculum), 스태필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프락터(Nitratifractor), 및 캄필로박터(Campylobacter). 일부 실시양태에서, 상기 2개의 촉매 도메인은 상이한 세균 종들로부터 유도된다.
Cas9 뉴클레아제의 유용한 변이체들은 단일 불활성 촉매 도메인, 예를 들어, RuvC- 또는 HNH- 효소 또는 니카아제를 포함할 수 있다. Cas9 니카아제는 단지 1개의 활성 기능성 도메인을 가지며 표적 DNA의 1개 가닥만을 절단함으로써, 단일-가닥 파손 또는 틈새(nick)를 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적어도 D10A 돌연변이를 갖는 돌연변이 Cas9 뉴클레아제는 Cas9 니카아제이다. 다른 실시양태에서, 적어도 H840A 돌연변이를 갖는 돌연변이 Cas9 뉴클레아제는 Cas9 니카아제이다. Cas9 니카아제에 존재하는 돌연변이의 다른 예로는, 제한하지 않고, N854A 및 N863A가 포함된다. 반대쪽 DNA 가닥을 표적화하는 2개 이상의 DNA-표적화 RNA가 사용되는 경우, 이중-가닥 파손은 Cas9 니카아제를 사용하여 도입될 수 있다. 이중-틈새 유도된 이중-가닥 파손은 NHEJ 또는 HDR에 의해 복구될 수 있다[Ran et al., 2013, Cell, 154:1380-1389]. 상기 유전자 편집 전략은 HDR을 촉진하고 표적이탈 DNA 부위에서의 indel 돌연변이의 빈도를 감소시킨다. Cas9 뉴클레아제 또는 니카아제의 비-제한 예는, 예를 들어, 미국 특허 제 8,895,308 호; 제 8,889,418 호; 및 제 8,865,406 호 및 미국 출원 공개 제 2014/0356959 호, 제 2014/0273226 호 및 제 2014/0186919 호에 기술되어 있다. Cas9 뉴클레아제 또는 니카아제는 표적 세포 또는 표적 유기체에 대해 코돈-최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제는 RuvC1 및 HNH 뉴클레아제 도메인의 2개의 침묵 돌연변이(D10A 및 H840A)를 함유하는 Cas9 폴리펩티드일 수 있으며, 이것은 dCas9로 지칭된다[Jinek et al., Science, 2012, 337:816-821; Qi et al., Cell, 152(5):1173-1183]. 한 실시양태에서, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 dCas9 폴리펩티드는 위치 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, A987 또는 이들의 임의의 조합에 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 상기 dCas9 폴리펩티드 및 이의 변이체에 대한 설명은, 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 2013/176772 호에 제공되어 있다. dCas9 효소는 D10, E762, H983 또는 D986에서의 돌연변이뿐 아니라, H840 또는 N863에서의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, dCas9 효소는 D10A 또는 D10N 돌연변이를 함유한다. 또한, dCas9 효소는 H840A, H840Y, 또는 H840N을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 dCas9 효소는 D10A 및 H840A; D10A 및 H840Y; D10A 및 H840N; D10N 및 H840A; D10N 및 H840Y; 또는 D10N 및 H840N을 포함한다. 치환은, Cas9 폴리펩티드가 촉매적으로 불활성이 되고 표적 DNA에 결합할 수 있게 하기 위한 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있다.
특정 실시양태에서, dCas9 폴리펩티드는 뉴클레아제 활성의 결여와 같이 촉매적으로 불활성이다. 일부 경우에서, dCas9 효소 또는 이의 변이체 또는 단편은 표적 서열의 전사를 차단할 수 있고, 일부 경우에서는 RNA 폴리머라제를 차단할 수 있다. 다른 경우에서, dCas9 효소 또는 이의 변이체 또는 단편은 표적 서열의 전사를 활성화시킬 수 있다.
게놈 편집 방법에 있어서, Cas 뉴클레아제는 dCas9에 연결된 IIS형 제한 효소, FokI의 촉매 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 같은 Cas9 융합 단백질일 수 있다. FokI-dCas9 융합 단백질(fCas9)은 2개의 가이드 RNA를 사용하여 표적 DNA의 단일 가닥에 결합하여 이중-가닥 파손을 생성한다.
유전자 조절(예를 들어, 표적 DNA의 전사 조절)의 경우, dCas9(이로 한정되지는 않는다)와 같은 뉴클레아제-결핍 Cas 단백질이 전사 활성화 또는 전사 억제에 사용될 수 있다. 뉴클레아제-결여 Cas 단백질을 사용하여 유전자 발현을 불활성화시키는 방법은, 예를 들어, 문헌 [Larson et al., Nat. Protoc ., 2013, 8(11):2180-2196]에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 재조합 발현 벡터에 존재한다. 특정한 경우에서, 재조합 발현 벡터는 바이러스 구조물, 예를 들어, 재조합 아데노-연관 바이러스 구조물, 재조합 아데노바이러스 구조물, 재조합 렌티바이러스 구조물 등이다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 우두 바이러스, 소아마비 바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, SV40, 단순 헤르페스 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 등을 기반으로 할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 라우스(Rous) 육종 바이러스, 하비(Harvey) 육종 바이러스, 조류 백혈병 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 유방 종양 바이러스 등과 같은 레트로바이러스로부터 유도된 벡터를 기반으로 할 수 있다. 유용한 발현 벡터는 당해 분야에 기술을 가진 자들에게 공지되어 있으며, 많은 벡터들이 상업적으로 시판된다. 하기의 벡터들은 진핵 숙주 세포에 대한 예로써 제공된다: pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVLSV40. 그러나, 숙주 세포와 양립가능한 경우 임의의 다른 벡터도 사용할 수 있다. 예를 들어, Cas9 효소를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 유용한 발현 벡터는, 예를 들어, 애드진(Addgene), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 및 오리진(Origene)에서 상업적으로 시판한다.
사용된 표적 세포/발현 시스템에 따라서, 프로모터, 전사 증폭인자, 전사 종결인자 등을 포함한 많은 전사 및 번역 조절 요소들 중 임의의 요소가 발현 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 프로모터는 바이러스 또는 임의의 유기체, 예를 들어, 원핵 또는 진핵 유기체로부터 유도될 수 있다. 적합한 프로모터로는 SV40 초기발현 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복서열(LTR) 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기발현 프로모터(Ad MLP); 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 예를 들어, CMV 급속 초기발현 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 인간 U6 소핵 프로모터(U6), 증폭된 U6 프로모터, 인간 H1 프로모터(H1) 등이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
Cas 뉴클레아제 및 이의 변이체 또는 단편은, Cas 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편, Cas 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 Cas 폴리펩티드 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로서 세포(예를 들어, 생체외 치료를 위한 1차 세포와 같은 시험관내 세포, 또는 환자에서와 같은 시험관내 세포) 내에 도입될 수 있다.
2. 변형된 단일 가이드 RNA( sgRNA )
게놈 변형의 CRISPR/Cas 시스템에 사용하기 위한 변형된 sgRNA는 전형적으로, 표적 핵산 서열에 상보적인 가이드 서열(예를 들어, crRNA), 및 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편과 상호작용하는 스캐폴드 서열(예를 들어, tracrRNA)을 포함한다. 본 발명자들은, 하나 이상의 화학 변형을 함유하는 변형된 sgRNA가 1차 세포(예를 들어, T 세포 또는 조혈 줄기 및 전구 세포)에서 CRISPR-기반 유전자 조절(예를 들어, 게놈 편집 또는 유전자 발현 조절)에 사용될 때 상응하는 비변형된 sgRNA에 비해 변형된 sgRNA의 활성, 안정성 및 특이성을 증가시키고/시키거나 독성을 감소시킬 수 있음을 밝혀내었다. 선행 기술에 비해 변형된 sgRNA의 이점으로는 1차 세포와 같은 표적 세포 내로의 더 용이한 전달 뿐 아니라, 표적 세포 내에서 증가된 안정성, 증가된 활성 기간 및 감소된 독성이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 일부 경우에서, CRISPR/Cas 시스템의 일부로서 변형된 sgRNA는 다른 시스템들에 비해 보다 높은 빈도의 표적적중 유전자 조절을 제공한다. 다른 경우에서, 변형된 sgRNA는 이의 비변형된 서열 등가물에 비해 개선된 활성 및/또는 특이성을 제공한다.
특정한 경우에서, 변형된 sgRNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편과 복합체화되어 세포(예를 들어, 생체외 치료를 위한 1차 세포와 같은 시험관내 세포, 또는 환자 내에서와 같은 생체내 세포) 내에 도입하기 위한 리보핵단백질(RNP)-기반 전달 시스템을 형성한다. 다른 경우에서, 변형된 sgRNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 세포(예를 들어, 생체외 치료를 위한 1차 세포와 같은 시험관내 세포, 또는 환자 내에서와 같은 생체내 세포) 내에 도입된다. 또 다른 경우에서, 변형된 sgRNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터와 함께 세포(예를 들어, 생체외 치료를 위한 1차 세포와 같은 시험관내 세포, 또는 환자 내에서와 같은 생체내 세포) 내에 도입된다.
일부 경우에서, 1차 세포와 같은 표적 세포들에서 효과적인 다중 CRISPR-기반 유전자 조절(예를 들어, 게놈 편집 또는 유전자 발현 조절)에 다수의 변형된 sgRNA가 사용될 수 있다. 다수의 변형된 sgRNA는, 동일한 표적 핵산 서열에 또는 상이한 표적 핵산 서열에 하이브리드화되는 변형된 sgRNA를 적어도 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상 포함할 수 있다. 상기 다수의 변형된 sgRNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편과의 복합체로, 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, mRNA 또는 재조합 발현 벡터)로서, 세포(예를 들어, 생체외 치료를 위한 1차 세포와 같은 시험관내 세포, 또는 환자 내에서와 같은 생체내 세포) 내에 도입될 수 있다.
변형된 sgRNA의 핵산 서열은, 표적 서열과 하이브리드화되고 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기 위해 표적 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 표적 DNA 서열)과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA의 가이드 서열과 이의 상응하는 서열 사이의 상보성 정도는, 적합한 정렬 알고리즘을 이용하여 최적으로 정렬될 때, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이거나, 그보다 더 크다. 최적 정렬은 서열을 정렬시키기 위한 임의의 적절한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 알고리즘의 비-제한 예로는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 변환(Burrows-Wheeler Transform)을 기반으로 하는 알고리즘(예를 들어, 버로우즈 휠러 정렬자(Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(노보크래프트 테크놀로지스(Novocraft Technologies), ELAND(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌디에이고), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용가능), 및 Maq(maq.sourceforge. net에서 이용가능)가 포함된다. 일부 실시양태에서, 가이드 서열은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상 뉴클레오티드의 길이이다. 일부 경우에서, 가이드 서열은 약 20개 뉴클레오티드의 길이이다. 다른 경우에서, 가이드 서열은 약 15개 뉴클레오티드의 길이이다. 다른 경우에서, 가이드 서열은 약 25개 뉴클레오티드의 길이이다. 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적합한 분석에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험될 가이드 서열을 포함하여, CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분들이, 예를 들어, CRISPR 서열의 성분들을 암호화하는 벡터를 사용한 형질감염에 의해 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포에 제공될 수 있으며, 이어서 표적 서열 내의 선택적인 절단을 평가할 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은, 표적 서열, 시험될 가이드 서열을 포함한 CRISPR 복합체의 성분들 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 제공하고, 시험 가이드 서열과 대조군 가이드 서열 반응 사이에 표적 서열에서의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다.
변형된 sgRNA의 뉴클레오티드 서열은 임의의 전술한 웹-기반 소프트웨어를 사용하여 선별할 수 있다. DNA-표적화 RNA를 선별하기 위한 고려사항들로는 사용될 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드)에 대한 PAM 서열, 및 표적이탈 변형을 최소화하기 위한 전략이 포함된다. CRISPR 디자인 툴(CRISPR Design Tool)과 같은 도구들은 변형된 sgRNA를 제조하고, 표적 변형 효율을 평가하고/하거나 표적이탈 부위에서의 절단을 평가하기 위한 서열들을 제공할 수 있다. 변형된 sgRNA의 서열을 선별하기 위한 또 다른 고려사항은 가이드 서열내 2차 구조의 정도를 감소시키는 것을 포함한다. 2차 구조는 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 접힘 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일부 프로그램들은 최소 깁스(Gibbs) 자유 에너지를 계산하는 것을 기반으로 한다. 적합한 알고리즘의 예로는 mFold[Zuker and Stiegler, Nucleic Acids Res, 9 (1981), 133-148], UNAFold 패키지[Markham et al., Methods Mol Biol, 2008, 453:3-31] 및 RNA접힘 형태 ViennaRNa 패키지가 포함된다.
가이드 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드 및/또는 변형된 sgRNA의 스캐폴드 서열의 1개 이상의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 약 20개 뉴클레오티드 길이인 가이드 서열은 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 일부 경우에서, 가이드 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 경우에서, 가이드 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 가이드 서열의 임의의 핵산 위치에 위치할 수 있다. 즉, 변형된 뉴클레오티드는 가이드 서열의 첫 번째 및/또는 마지막 뉴클레오티드에 또는 그 부근에, 및/또는 그 사이의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 20개 뉴클레오티드의 길이인 가이드 서열의 경우, 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드들이 가이드 서열의 핵산 위치 1, 위치 2, 위치 3, 위치 4, 위치 5, 위치 6, 위치 7, 위치 8, 위치 9, 위치 10, 위치 11, 위치 12, 위치 13, 위치 14, 위치 15, 위치 16, 위치 17, 위치 18, 위치 19, 및/또는 위치 20에 위치할 수 있다. 특정한 경우에서, 가이드 서열의 약 10% 내지 약 30%, 예를 들어, 약 10% 내지 약 25%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 약 15% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30% 또는 약 25% 내지 약 30%가 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 경우에서, 가이드 서열의 약 10% 내지 약 30%, 예를 들어, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29%, 또는 약 30%가 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA의 스캐폴드 서열은 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 예를 들어, 약 80개 뉴클레오티드의 길이인 스캐폴드 서열은 1개 이상, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 일부 경우에서, 스캐폴드 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 경우에서, 스캐폴드 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 19, 20개 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 뉴클레오티드는 스캐폴드 서열의 임의의 핵산 위치에 위치할 수 있다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 스캐폴드 서열의 첫 번째 및/또는 마지막 뉴클레오티드에 또는 그 부근에, 및/또는 그 사이의 임의의 위치에 존재할 수 있다. 예를 들어, 약 80개 뉴클레오티드의 길이인 스캐폴드 서열의 경우, 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드들이 상기 서열의 핵산 위치 1, 위치 2, 위치 3, 위치 4, 위치 5, 위치 6, 위치 7, 위치 8, 위치 9, 위치 10, 위치 11, 위치 12, 위치 13, 위치 14, 위치 15, 위치 16, 위치 17, 위치 18, 위치 19, 위치 20, 위치 21, 위치 22, 위치 23, 위치 24, 위치 25, 위치 26, 위치 27, 위치 28, 위치 29, 위치 30, 위치 31, 위치 32, 위치 33, 위치 34, 위치 35, 위치 36, 위치 37, 위치 38, 위치 39, 위치 40, 위치 41, 위치 42, 위치 43, 위치 44, 위치 45, 위치 46, 위치 47, 위치 48, 위치 49, 위치 50, 위치 51, 위치 52, 위치 53, 위치 54, 위치 55, 위치 56, 위치 57, 위치 58, 위치 59, 위치 60, 위치 61, 위치 62, 위치 63, 위치 64, 위치 65, 위치 66, 위치 67, 위치 68, 위치 69, 위치 70, 위치 71, 위치 72, 위치 73, 위치 74, 위치 75, 위치 76, 위치 77, 위치 78, 위치 79, 및/또는 위치 80에 위치할 수 있다. 일부 경우에서, 스캐폴드 서열의 약 1% 내지 약 10%, 예를 들어, 약 1% 내지 약 8%, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 3% 내지 약 7%가 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 경우에서, 스캐폴드 서열의 약 1% 내지 약 10%, 예를 들어, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10%가 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
sgRNA의 변형된 뉴클레오티드는 리보스(예를 들어, 당)기, 포스페이트기, 핵염기 또는 이의 임의의 조합에서의 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 리보스기에서의 변형은 리보스의 2' 위치에서의 변형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 2'-플루오로-아라비노 핵산, 트라이사이클-DNA(tc-DNA), 펩티드 핵산, 사이클로헥센 핵산(CeNA), 잠금 핵산(LNA), 에틸렌-가교 핵산(ENA), 포스포다이아미데이트 모폴리노, 또는 이들의 조합을 포함한다.
변형된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체들은 당- 및/또는 주쇄-변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다(즉, 포스페이트-당 주쇄에 변형을 포함할 수 있다). 예를 들어, 천연 또는 자연적 RNA의 포스포다이에스터 결합은 질소 또는 황 이종원자중 적어도 1개를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 주쇄-변형된 리보뉴클레오티드에서, 인접 리보뉴클레오티드에 연결하는 포스포에스터기는 변형된 기, 예를 들어, 포스포티오에이트기의 변형된 기로 대체될 수 있다. 바람직한 당-변형된 리보뉴클레오티드에서, 2' 잔기는 H, OR, R, 할로, SH, SR, NH2, NHR, NR2 또는 ON으로부터 선택된 기이고, 여기서 R은 C1-C6 알킬, 알케닐 또는 알키닐이고, 할로는 F, Cl, Br 또는 I이다.
일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 당 변형을 함유한다. 당 변형의 비-제한 예로는 2'-데옥시-2'-플루오로-올리고리보뉴클레오티드(2'-플루오로-2'-데옥시시티딘-5'-트라이포스페이트, 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘-5'-트라이포스페이트), 2'-데옥시-2'-데아민 올리고리보뉴클레오티드(2'-아미노-2'-데옥시시티딘-5'-트라이포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시우리딘-5'-트라이포스페이트), 2'-O-알킬 올리고리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-C-알킬 올리고리보뉴클레오티드(2'-O-메틸시티딘-5'-트라이포스페이트, 2'-메틸우리딘-5'-트라이포스페이트), 2'-C-알킬 올리고리보뉴클레오티드, 및 이의 이성질체(2'-아라시티딘-5'-트라이포스페이트, 2'-아라우리딘-5'-트라이포스페이트), 아지도트라이포스페이트(2'-아지도-2'-데옥시시티딘-5'-트라이포스페이트, 2'-아지도-2'-데옥시우리딘-5'-트라이포스페이트), 및 이들의 조합이 포함된다.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA는 1개 이상의 2'-플루오로, 2'-아미노 및/또는 2'-티오 변형을 함유한다. 일부 경우에서, 상기 변형은 2'-플루오로-시티딘, 2'-플루오로-우리딘, 2'-플루오로-아데노신, 2'-플루오로-구아노신, 2'-아미노-시티딘, 2'-아미노-우리딘, 2'-아미노-아데노신, 2'-아미노-구아노신, 2,6-다이아미노퓨린, 4-티오-우리딘, 5-아미노-알릴-우리딘, 5-브로모-우리딘, 5-요오도-우리딘, 5-메틸-시티딘, 리보-티미딘, 2-아미노퓨린, 2'-아미노-부티릴-피렌-우리딘, 5-플루오로-시티딘, 및/또는 5-플루오로-우리딘이다.
96개보다 많은 천연 뉴클레오시드 변형이 포유동물 RNA에서 발견되었다(예를 들어, 문헌 [Limbach et al., Nucleic Acids Research, 22(12):2183-2196 (1994)] 참조). 뉴클레오티드 및 변형된 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드의 제조는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제 4,373,071 호, 제 4,458,066 호, 제 4,500,707 호, 제 4,668,777 호, 제 4,973,679 호, 제 5,047,524 호, 제 5,132,418 호, 제 5,153,319 호, 제 5,262,530 호 및 제 5,700,642 호에 기술되어 있다. 본원에 기술된 바와 같이 사용하기에 적합한 많은 변형 뉴클레오시드 및 변형 뉴클레오티드들이 상업적으로 시판한다. 뉴클레오시드는 천연 뉴클레오시드의 유사체일 수 있다. 일부 경우에서, 상기 유사체는 다이하이드로우리딘, 메틸아데노신, 메틸시티딘, 메틸우리딘, 메틸슈도우리딘, 티오우리딘, 데옥시시토딘 및 데옥시우리딘이다.
일부 경우에서, 본원에 기술된 변형된 sgRNA는 핵염기-변형된 리보뉴클레오티드, 즉, 천연 핵염기 대신 1개 이상의 비-천연 핵염기를 함유하는 리보뉴클레오티드를 포함한다. 변형 뉴클레오시드 및 변형 뉴클레오티드에 혼입될 수 있는 변형된 핵염기의 비-제한 예로는 다음이 포함된다: m5C(5-메틸시티딘), m5U(5-메틸우리딘), m6A(N6-메틸아데노신), s2U(2-티오우리딘), Um(2'-0-메틸우리딘), m1A(1-메틸 아데노신), m2A(2-메틸아데노신), Am(2-1-O-메틸아데노신), ms2m6A(2-메틸티오-N6-메틸아데노신), i6A(N6-이소펜테닐 아데노신), ms2i6A(2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신), io6A(N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신), ms2io6A(2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜테닐)아데노신), g6A(N6-글리시닐카바모일아데노신), t6A(N6-트레오닐 카바모일아데노신), ms2t6A(2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신), m6t6A(N6-메틸-N6-트레오닐카바모일아데노신), hn6A(N6-하이드록시노르발릴카바모일 아데노신), ms2hn6A(2-메틸티오-N6-하이드록시노르발릴 카바모일아데노신), Ar(p)(2'-O-리보실아데노신(포스페이트)), I(이노신), m11(1-메틸이노신), m'Im(1,2'-O-다이메틸이노신), m3C(3-메틸시티딘), Cm(2T-O-메틸시티딘), s2C(2-티오시티딘), ac4C(N4-아세틸시티딘), f5C(5-포밀시티딘), m5Cm(5,2-O-다이메틸시티딘), ac4Cm(N4-아세틸-2TO-메틸시티딘), k2C(라이시딘), m1G(1-메틸구아노신), m2G(N2-메틸구아노신), m7G(7-메틸구아노신), Gm(2'-O-메틸구아노신), m22G(N2,N2-다이메틸구아노신), m2Gm(N2,2'-O-다이메틸구아노신), m22Gm(N2,N2,2'-O-트라이메틸구아노신), Gr(p)(2'-O-리보실구아노신(포스페이트)), yW(와이부토신), o2yW(퍼옥시와이부토신), OHyW(하이드록시와이부토신), OHyW*(저변형된 하이드록시와이부토신), imG(와이오신), mimG(메틸구아노신), Q(케오신), oQ(에폭시케오신), galQ(갈락토실-케오신), manQ(만노실-케오신), preQo(7-시아노-7-데아자구아노신), preQi(7-아미노메틸-7-데아자구아노신), G(아르케오신), D(다이하이드로우리딘), m5Um(5,2'-O-다이메틸우리딘), s4U(4-티오우리딘), m5s2U(5-메틸-2-티오우리딘), s2Um(2-티오-2'-O-메틸우리딘), acp3U(3-(3-아미노-3-카복시프로필)우리딘), ho5U(5-하이드록시우리딘), mo5U(5-메톡시우리딘), cmo5U(우리딘 5-옥시아세트산), mcmo5U(우리딘 5-옥시아세트산 메틸 에스터), chm5U(5-(카복시하이드록시메틸)우리딘)), mchm5U(5-(카복시하이드록시메틸)우리딘 메틸 에스터), mcm5U(5-메톡시카보닐 메틸우리딘), mcm5Um(S-메톡시카보닐메틸-2-O-메틸우리딘), mcm5s2U(5-메톡시카보닐메틸-2-티오우리딘), nm5s2U(5-아미노메틸-2-티오우리딘), mnm5U(5-메틸아미노메틸우리딘), mnm5s2U(5-메틸아미노메틸-2-티오우리딘), mnm5se2U(5-메틸아미노메틸-2-셀레노우리딘), ncm5U(5-카바모일메틸 우리딘), ncm5Um(5-카바모일메틸-2'-O-메틸우리딘), cmnm5U(5-카복시메틸아미노메틸우리딘), cnmm5Um(5-카복시메틸아미노메틸-2-L-O-메틸우리딘), cmnm5s2U(5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘), m62A(N6,N6-다이메틸아데노신), Tm(2'-O-메틸이노신), m4C(N4-메틸시티딘), m4Cm(N4,2-O-다이메틸시티딘), hm5C(5-하이드록시메틸시티딘), m3U(3-메틸우리딘), cm5U(5-카복시메틸우리딘), m6Am(N6,T-O-다이메틸아데노신), rn62Am(N6,N6,O-2-트라이메틸아데노신), m2'7G(N2,7-다이메틸구아노신), m2'2'7G(N2,N2,7-트라이메틸구아노신), m3Um(3,2T-O-다이메틸우리딘), m5D(5-메틸다이하이드로우리딘), f5Cm(5-포밀-2'-O-메틸시티딘), m1Gm(1,2'-O-다이메틸구아노신), m'Am(1,2-0-다이메틸 아데노신)이리노메틸우리딘), tm5s2U(S-타우리노메틸-2-티오우리딘)), imG-14(4-데메틸 구아노신), imG2(이소구아노신), 또는 ac6A(N6-아세틸아데노신), 하이포잔틴, 이노신, 8-옥소-아데닌, 이의 7-치환된 유도체, 다이하이드로우라실, 슈도우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-아미노우라실, 5-(C1-C6)-알킬우라실, 5-메틸우라실, 5-(C2-C6)-알케닐우라실, 5-(C2-C6)-알키닐우라실, 5-(하이드록시메틸)우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-하이드록시시토신, 5-(C1-C6)-알킬시토신, 5-메틸시토신, 5-(C2-C6)-알케닐시토신, 5-(C2-C6)-알키닐시토신, 5-클로로시토신, 5-플루오로시토신, 5-브로모시토신, N2-다이메틸구아닌, 7-데아자구아닌, 8-아자구아닌, 7-데아자-7-치환된 구아닌, 7-데아자-7-(C2-C6)알키닐구아닌, 7-데아자-8-치환된 구아닌, 8-하이드록시구아닌, 6-티오구아닌, 8-옥소구아닌, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 2,4-다이아미노퓨린, 2,6-다이아미노퓨린, 8-아자퓨린, 치환된 7-데아자퓨린, 7-데아자-7-치환된 퓨린, 7-데아자-8-치환된 퓨린, 및 이들의 조합.
일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA의 포스페이트 주쇄는 변화된다. 변형된 sgRNA는 1개 이상의 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트(예를 들어, N3'-P5'-포스포르아미데이트(NP)), 2'-O-메톡시-에틸(2'MOE), 2'-O-메틸-에틸(2'ME), 및/또는 메틸포스포네이트 결합을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 sgRNA의 가이드 서열의 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드들 및/또는 스캐폴드 서열의 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드들은 2'-O-메틸(M) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트(MS) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 3'-티오PACE(MSP) 뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우에서, 변형된 sgRNA는 1개 이상의 MS 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 경우에서, 변형된 sgRNA는 1개 이상의 MSP 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 경우에서, 변형된 sgRNA는 1개 이상의 MS 뉴클레오티드 및 1개 이상의 MSP 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 경우에서, 변형된 sgRNA는 M 뉴클레오티드를 포함하지 않는다. 특정한 경우에서, 변형된 sgRNA는 1개 이상의 MS 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 MSP 뉴클레오티드를 포함하고, 1개 이상의 M 뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 특정한 다른 경우에서, MS 뉴클레오티드 및/또는 MSP 뉴클레오티드는 변형된 sgRNA에 존재하는 유일한 변형된 뉴클레오티드이다.
본원에 기술된 임의의 변형들은 조합되고 변형된 sgRNA의 가이드 서열 및/또는 스캐폴드 서열에 혼입될 수 있음을 유의해야 한다.
일부 경우에서, 변형된 sgRNA는 줄기 루프, 예를 들어, M2 줄기 루프 또는 테트라루프와 같은 구조적 변형을 또한 포함한다.
변형된 sgRNA는 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 sgRNA는 화학적으로 합성된다. 변형된 sgRNA는 2'-O-티오노카바메이트-보호된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하여 합성될 수 있다. 방법들은, 예를 들어, 문헌 [Dellinger et al., J.American Chemical Society 133, 11540-11556 (2011); Threlfall et al., Organic & Biomolecular Chemistry 10, 746-754 (2012); and Dellinger et al., J. American Chemical Society 125, 940-950 (2003)]에 기술되어 있다.
화학적으로 변형된 sgRNA는 임의의 CRISPR-연관 기술, 예를 들어, RNA-유도 기술과 함께 사용될 수 있다. 본원에서 기술된 바와 같이, 변형된 sgRNA는 임의의 조작 또는 인공 Cas9 폴리펩티드를 포함하여 임의의 Cas 뉴클레아제 또는 이의 변이체 또는 단편에 대한 가이드로서 작용할 수 있다. 변형된 sgRNA는 생체외 치료를 위해 또는 생체 내에서(예를 들어, 동물 내에서) 단리된 1차 세포내 DNA 및/또는 RNA 분자를 표적화할 수 있다. 본원에 개시된 방법들은 게놈 편집, 유전자 조절, 영상화 및 임의의 다른 CRISPR-기반 용도에 적용될 수 있다.
3. 공여체 복구 주형
일부 실시양태에서, 본 발명은 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 뉴클레아제) 절단 부위의 어느 한 측면에서 표적 DNA 서열(예를 들어, 표적 유전자 또는 유전자좌)의 부분들에 상동성인 2개의 상동성 팔을 포함하는 재조합 공여체 복구 주형을 제공한다. 특정한 경우에서, 재조합 공여체 복구 주형은 리포터 폴리펩티드(예를 들어, 검출가능한 폴리펩티드, 형광성 폴리펩티드 또는 선택성 마커)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 리포터 카세트, 및 상기 리포터 카세트 측면에 위치하고 Cas 뉴클레아제 절단 부위의 어느 한 측면에서 표적 DNA의 부분들에 상동성인 2개의 상동성 팔을 포함한다. 리포터 카세트는 자가-절단 펩티드를 암호화하는 서열, 1개 이상의 핵 위치 신호, 및/또는 형광성 폴리펩티드, 예를 들어, 슈퍼폴더 GFP(sfGFP)를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상동성 팔들은 동일한 길이이다. 다른 실시양태에서, 상동성 팔들은 상이한 길이이다. 상동성 팔은 적어도 약 10개 염기쌍(bp), 예를 들어, 적어도 약 10 bp, 15 bp, 20 bp, 25 bp, 30 bp, 35 bp, 45 bp, 55 bp, 65 bp, 75 bp, 85 bp, 95 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 300 bp, 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp, 550 bp, 600 bp, 650 bp, 700 bp, 750 bp, 800 bp, 850 bp, 900 bp, 950 bp, 1000 bp, 1.1 킬로베이스(kb), 1.2 kb, 1.3 kb, 1.4 kb, 1.5 kb, 1.6 kb, 1.7 kb, 1.8 kb, 1.9 kb, 2.0 kb, 2.1 kb, 2.2 kb, 2.3 kb, 2.4 kb, 2.5 kb, 2.6 kb, 2.7 kb, 2.8 kb, 2.9 kb, 3.0 kb, 3.1 kb, 3.2 kb, 3.3 kb, 3.4 kb, 3.5 kb, 3.6 kb, 3.7 kb, 3.8 kb, 3.9 kb, 4.0 kb 이상일 수 있다. 상동성 팔은 약 10 bp 내지 약 4 kb, 예를 들어, 약 10 bp 내지 약 20 bp, 약 10 bp 내지 약 50 bp, 약 10 bp 내지 약 100 bp, 약 10 bp 내지 약 200 bp, 약 10 bp 내지 약 500 bp, 약 10 bp 내지 약 1 kb, 약 10 bp 내지 약 2 kb, 약 10 bp 내지 약 4 kb, 약 100 bp 내지 약 200 bp, 약 100 bp 내지 약 500 bp, 약 100 bp 내지 약 1 kb, 약 100 bp 내지 약 2 kb, 약 100 bp 내지 약 4 kb, 약 500 bp 내지 약 1 kb, 약 500 bp 내지 약 2 kb, 약 500 bp 내지 약 4 kb, 약 1 kb 내지 약 2 kb, 약 1 kb 내지 약 2 kb, 약 1 kb 내지 약 4 kb, 또는 약 2 kb 내지 약 4 kb일 수 있다.
공여체 복구 주형은 발현 벡터 내에 클로닝될 수 있다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자들에게 공지된 통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 발현 벡터가 사용될 수 있다.
재조합 공여체 복구 주형 대신, 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN) 공여체 주형이 상동적 재조합-매개 복구에 사용될 수 있다. ssODN은 표적 DNA 내에 짧은 변형을 도입하는데 유용하다. 예를 들어, ssODN은 SNP와 같은 유전자 돌연변이를 정밀하게 교정하는데 적합하다. ssODN은 Cas 뉴클레아제 절단의 표적 부위의 각 측면상에 2개의 측면에 인접한 상동적 서열을 함유할 수 있으며, 표적 DNA에 대해 센스 또는 안티센스 방향으로 배향될 수 있다. 각각의 측면인접 서열은 적어도 약 10개 염기쌍(bp), 예를 들어, 적어도 약 10 bp, 15 bp, 20 bp, 25 bp, 30 bp, 35 bp, 40 bp, 45 bp, 50 bp, 55 bp, 60 bp, 65 bp, 70 bp, 75 bp, 80 bp, 85 bp, 90 bp, 95 bp, 100 bp, 150 bp, 200 bp, 250 bp, 300 bp, 350 bp, 400 bp, 450 bp, 500 bp, 550 bp, 600 bp, 650 bp, 700 bp, 750 bp, 800 bp, 850 bp, 900 bp, 950 bp, 1 kb, 2 kb, 4 kb 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 상동성 팔은 약 10 bp 내지 약 4 kb, 예를 들어, 약 10 bp 내지 약 20 bp, 약 10 bp 내지 약 50 bp, 약 10 bp 내지 약 100 bp, 약 10 bp 내지 약 200 bp, 약 10 bp 내지 약 500 bp, 약 10 bp 내지 약 1 kb, 약 10 bp 내지 약 2 kb, 약 10 bp 내지 약 4 kb, 약 100 bp 내지 약 200 bp, 약 100 bp 내지 약 500 bp, 약 100 bp 내지 약 1 kb, 약 100 bp 내지 약 2 kb, 약 100 bp 내지 약 4 kb, 약 500 bp 내지 약 1 kb, 약 500 bp 내지 약 2 kb, 약 500 bp 내지 약 4 kb, 약 1 kb 내지 약 2 kb, 약 1 kb 내지 약 2 kb, 약 1 kb 내지 약 4 kb, 또는 약 2 kb 내지 약 4 kb이다. ssODN은 길이가 적어도 약 25개 뉴클레오티드(nt), 예를 들어, 적어도 약 25 nt, 30 nt, 35 nt, 40 nt, 45 nt, 50 nt, 55 nt, 60 nt, 65 nt, 70 nt, 75 nt, 80 nt, 85 nt, 90 nt, 95 nt, 100 nt, 150 nt, 200 nt, 250 nt, 300 nt 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, ssODN은 길이가 약 25 내지 약 50; 약 50 내지 약 100; 약 100 내지 약 150; 약 150 내지 약 200; 약 200 내지 약 250; 약 250 내지 약 300; 또는 약 25 nt 내지 약 300 nt이다.
일부 실시양태에서, ssODN 주형은 적어도 1개, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500개 이상의 본원에 기술된 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 경우에서, ssODN의 서열의 적어도 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99%가 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 변형된 뉴클레오티드는 ssODN의 한쪽 또는 양쪽 말단에 위치한다. 변형된 뉴클레오티드는 1번째, 2번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 7번째, 8번째, 9번째 또는 10번째 말단 뉴클레오티드 또는 이의 임의의 조합에 존재할 수 있다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오티드는 ssODN 주형의 양쪽 말단에서의 3개의 말단 뉴클레오티드에 존재할 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오티드는 말단에 대해 내부에 위치할 수 있다.
4. 표적 DNA
CRISPR/Cas 시스템에서, 표적 DNA 서열은 DNA-표적화 RNA(예를 들어, 변형된 sgRNA)의 단편에 상보적일 수 있으며, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열이 바로 뒤따를 수 있다. 표적 DNA 부위는 사용된 Cas9의 세균 종에 특이적인 PAM 서열의 5'에 인접하여 위치할 수 있다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스-유래 Cas9의 PAM 서열은 NGG이고; 나이세리아 메닌지티디스-유래 Cas9의 PAM 서열은 NNNNGATT; 스트렙토코커스 써모필루스-유래 Cas9의 PAM 서열은 NNAGAA이고; 트레포네마 덴티콜라-유래 Cas9의 PAM 서열은 NAAAAC이다. 일부 실시양태에서, PAM 서열은 5'-NGG(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드이다); 5'-NRG(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드이고, R은 퓨린이다); 또는 5'-NNGRR(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드이고, R은 퓨린이다)일 수 있다. 스트렙토코커스 피오게네스 시스템의 경우, DNA-표적화 RNA(예를 들어, 변형된 sgRNA)의 가이드 서열이 반대 가닥과 염기쌍을 형성하여 PAM 서열의 약 3개 염기쌍 위쪽에서 절단되는 것을 매개하도록, 선택된 표적 DNA 서열은 5'-NGG PAM(여기서, N은 임의의 뉴클레오티드이다)의 바로 앞에 위치(예를 들어, 5'에 위치)해야 한다.
일부 실시양태에서, DNA-표적화 RNA(예를 들어, 변형된 sgRNA)의 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 DNA 서열 사이의 상보성 정도는, 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때, 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이거나, 그보다 더 크다. 최적 정렬은 서열을 정렬시키기 위한 임의의 적절한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 상기 알고리즘의 비-제한 예로는 스미스-워터만 알고리즘, 니들만-분쉬 알고리즘, 버로우즈-휠러 변환을 기반으로 하는 알고리즘(예를 들어, 버로우즈 휠러 정렬자), ClustalW, Clustal X, BLAT, Novoalign(노보크래프트 테크놀로지스, 셀랑고르, 말레이시아), 및 ELAND(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌디에이고)가 포함된다.
표적 DNA 부위는 ZiFiT 타게터(Targeter) 소프트웨어[Sander et al., 2007, Nucleic Acids Res, 35:599-605; Sander et al., 2010, Nucleic Acids Res, 38:462-468], E-CRISP[Heigwer et al., 2014, Nat Methods, 11:122-123], RGEN 툴[Bae et al., 2014, Bioinformatics, 30(10):1473-1475], CasFinder[Aach et al., 2014, bioRxiv], DNA2.0 gNRA 디자인 툴(DNA2.0, 미국 캘리포니아주 멘로파크) 및 CRISPR 디자인 툴(브로드 인스티튜트(Broad Institute), 미국 매사추세츠주 케임브리지)과 같은 웹-기반 소프트웨어를 사용하여 사전정의된 게놈 서열(유전자)에서 선택될 수 있다. 상기 도구들은 게놈 서열(예를 들어, 관심대상인 유전자 또는 유전자좌)을 분석하고 유전자 편집에 적합한 표적 부위를 확인한다. 각각의 DNA-표적화 RNA(예를 들어, 변형된 sgRNA)에 대한 표적이탈 유전자 변형을 평가하기 위해, 표적이탈 부위의 컴퓨터에 의한 예측은 염기쌍 형성 불일치(mismatch) 존재, 위치 및 분포의 정량적 특이성 분석을 기반으로 이루어진다.
5. 유전자 발현 조절
유전자 발현 억제 또는 유전자 발현 활성화와 같은 유전자 발현을 조절하는 CRISPR/Cas 시스템은 야생형 또는 천연 Cas 뉴클레아제의 변이체 또는 단편(예를 들어, Cas9 폴리펩티드 변이체 또는 단편) 및 DNA-표적화 sgRNA 또는 RNA-표적화 sgRNA를 포함할 수 있다. 비-제한 예로서, Cas9 변이체 또는 단편 및 sgRNA의 일부분에 상보적인 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 sgRNA를 포함하는 복합체는 전사 개시 및 RNA 폴리머라제에 의한 연장을 차단하거나 저해할 수 있다. 이것은, 이어서 표적 DNA의 유전자 발현을 저해하거나 억제할 수 있다. 또는, 상이한 Cas9 변이체 또는 단편 및 sgRNA의 일부분에 상보적인 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 sgRNA를 포함하는 복합체는 표적 DNA의 유전자 발현을 유도하거나 활성화시킬 수 있다.
유전자 발현을 불활성화시키거나 감소시키기 위해 CRISPR 간섭(CRISPRi)을 수행하는 방법에 대한 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌 [Larson et al., Nature Protocols, 2013, 8(11):2180-2196, and Qi et al., Cell, 152, 2013, 1173-1183]에서 확인된다. CRISPRi에서, sgRNA-Cas9 변이체 복합체는 단백질 암호화 영역의 비주형 DNA 가닥에 결합하고 전사 연장을 차단할 수 있다. 일부 경우에서, sgRNA-Cas9 변이체 복합체가 유전자의 프로모터 영역에 결합하는 경우, 상기 복합체는 전사 개시를 방해하거나 저해한다.
유전자 발현을 증가시키기 위해 CRISPR 활성화를 수행하는 방법에 대한 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌 [Cheng et al., Cell Research, 2013, 23:1163-1171, Konerman et al., Nature, 2015, 517:583-588] 및 미국 특허 제 8,697,359 호에서 확인된다.
유전자 발현을 조절하기 위한 CRISPR-기반 RNA 결합 및/또는 절단을 위한 방법에 대한 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌 [O'Connell et al., Nature, 2014, 516:263-266] 및 미국 특허출원 공개 제 2014/0302563 호에서 확인된다.
유전자 발현의 CRISPR-기반 조절을 위해, 내부핵산분해(endonucleolytic) 활성이 결여된 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드)의 촉매적으로 불활성인 변이체가 사용될 수 있다. 일부 실시양테에서, Cas 뉴클레아제는 RuvC-유사 및 HNH 뉴클레아제 도메인에 2개 이상의 점 돌연변이를 함유하는 Cas9 변이체이다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 D10A 및 H840A 아미노산 치환을 가지며, 상기 변이체는 dCas9로 지칭된다[Jinek et al., ㅇScience, 2012, 337:816-821; Qi et al., Cell, 152(5):1173-1183]. 일부 경우에서, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 dCas9 폴리펩티드는 위치 D10, G12, G17, E762, H840, N854, N863, H982, H983, A984, D986, A987 또는 이들의 임의의 조합에서 1개 이상의 돌연변이를 포함한다. 상기 dCas9 폴리펩티드 및 이의 변이체에 대한 설명은, 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 2013/176772 호에 제공되어 있다. dCas9 효소는 D10, E762, H983 또는 D986에서의 돌연변이 뿐 아니라, H840 또는 N863에서의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 경우에서, dCas9 효소는 D10A 또는 D10N 돌연변이를 함유한다. 또한, dCas9 효소는 H840A, H840Y, 또는 H840N을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, dCas9 효소는 D10A 및 H840A; D10A 및 H840Y; D10A 및 H840N; D10N 및 H840A; D10N 및 H840Y; 또는 D10N 및 H840N 치환을 포함한다. 상기 치환들은 Cas9 폴리펩티드가 촉매적으로 불활성이 되고 표적 DNA에 결합할 수 있게 하기 위한 보존적 또는 비-보존적 치환일 수 있다.
특정 실시양태에서, dCas9 폴리펩티드는 뉴클레아제 활성의 결여와 같이 촉매적으로 불활성이다. 일부 경우에서, dCas9 효소 또는 이의 변이체 또는 단편은 표적 서열의 전사를 차단할 수 있고, 일부 경우에서는 RNA 폴리머라제를 차단할 수 있다. 다른 경우에서, dCas9 효소 또는 이의 변이체 또는 단편은 표적 서열의 전사를 활성화시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 내부핵산분해 활성이 결여된 Cas9 변이체(예를 들어, dCas9)는 전사 억제 도메인, 예를 들어, 크루펠 관련 박스(Kruppel associated box, KRAB) 도메인, 또는 전사 활성화 도메인, 예를 들어, VP16 전사활성화 도메인에 융합될 수 있다. 일부 실시양태에서, Cas9 변이체는 dCas9 및 전사 인자, 예를 들어, RNA 폴리머라제 오메가 인자, 열충격 인자 1, 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드이다. 다른 실시양태에서, Cas9 변이체는 dCas9 및 DNA 메틸라제, 히스톤 아세틸라제, 또는 이의 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드이다.
RNA 결합 및/또는 RNA 절단에 의해 매개된 유전자 발현의 CRISPR-기반 조절을 위해, 예를 들어, 문헌 [O'Connell et al., Nature, 2014, 516:263-266]에 기술된 바와 같은, 내부핵산분해 활성을 갖는 적절한 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 변이체가 사용될 수 있다. 다른 유용한 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 변이체들은, 예를 들어, 미국 특허출원 공개 제 2014/0302563 호에 기술되어 있다. RNA를 절단할 수 있는 다른 CRISPR-관련 효소로는 Csy4 엔도리보뉴클레아제, CRISPR-관련 Cas6 효소, Cas5 계열 구성원 효소, Cas6 계열 구성원 효소, 1형 CRISPR 시스템 엔도리보뉴클레아제, 2형 CRISPR 시스템 엔도리보뉴클레아제, 3형 CRISPR 시스템 엔도뉴클레아제, 및 이의 변이체들이 포함된다.
CRISPR-기반 RNA 절단의 일부 실시양태에서, PAM 서열(예를 들어, PAMmer)을 함유하는 DNA 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥 RNA 전사체에 결합하고 상기 전사체를 절단하기 위해 본원에 기술된 변형된 sgRNA 및 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 변이체와 함께 사용된다. 적절한 PAMmer 서열에 대한 상세한 설명은, 예를 들어, 문헌 [O'Connell et al., Nature, 2014, 516:263-266]에서 확인된다.
Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편은 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터로서 제공될 수 있다. 추가의 세부사항은 상기에서 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 표적 유전자의 상이한 영역들을 표적화하여 상기 표적 유전자의 유전자 발현을 조절하기 위해 다수의 변형된 sgRNA가 사용된다. 상기 다수의 변형된 sgRNA는 각각의 변형된 sgRNA 단독에 비해 단일 표적 유전자의 유전자 발현의 상승적 조절(예를 들어, 억제 또는 활성화)을 제공할 수 있다. 다른 실시양태에서, 2개 이상의 표적 유전자들의 유전자 발현을 조절하기 위해 다수의 변형된 sgRNA가 사용된다.
B. 1차 세포
본 발명은 관심대상인 임의의 1차 세포에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 1차 세포는 임의의 다세포 유기체로부터 단리된 세포, 예를 들어, 식물 세포(예, 쌀 세포, 밀 세포, 토마토 세포, 애기장대(Arabidopsis thaliana) 세포, 옥수수(Zea mays) 세포 등), 다세포 원생생물로부터의 세포, 다세포 진균으로부터의 세포, 무척추 동물(예를 들어, 과실파리, 자포동물, 극피동물, 선충 등)로부터의 세포 또는 척추 동물(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유동물 등)로부터의 세포와 같은 동물 세포, 인간으로부터의 세포, 건강한 인간으로부터의 세포, 인간 환자로부터의 세포, 암 환자로부터의 세포 등일 수 있다. 일부 경우에서, 유전자 조절이 유도된 1차 세포는 대상(예를 들어, 환자)에게 이식될 수 있다. 예를 들어, 1차 세포는 치료될 대상(예를 들어, 환자)으로부터 유도될 수 있다.
줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 성인 줄기 세포(예, 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 조혈 줄기 세포, 장기 줄기 세포), 전구 세포, 체세포(예, 섬유아세포, 간세포(hepatocyte), 심장 세포, 간 세포(liver cell), 췌장 세포, 근육 세포, 피부 세포, 혈액 세포, 신경 세포, 면역 세포), 및 몸, 예를 들어, 인체의 임의의 다른 세포와 같은 임의 유형의 1차 세포가 유리할 수 있다. 상기 세포는 대상, 예를 들어, 동물 대상 또는 인간 대상으로부터 유도된 1차 세포 또는 1차 세포 배양물일 수 있으며, 제한된 계대수동안 시험관 내에서 성장될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 세포는 질환 세포이거나, 질환을 갖는 대상으로부터 유도된다. 예를 들어, 상기 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다.
1차 세포는 임의의 표준 방법에 의해 대상으로부터 채취될 수 있다. 예를 들어, 피부, 근육, 골수, 비장, 간, 신장, 췌장, 폐, 장, 위 등과 같은 조직으로부터의 세포는 조직 생검 또는 세침 흡인에 의해 채취될 수 있다. 혈액 세포 및/또는 면역 세포는 전혈, 혈장 또는 혈청으로부터 단리될 수 있다. 일부 경우에서, 적합한 1차 세포로는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 말초혈 림프구(PBL), 및 예를 들어, T 세포, 자연 살해 세포, 단핵구, 자연 살해 T 세포, 단핵구-전구체 세포, 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC), 예를 들어, CD34+ HSPC, 또는 비-만능 줄기 세포와 같은(이로 한정되지는 않는다) 다른 혈액 세포 부분군이 포함된다. 일부 경우에서, 상기 세포는 종양 침윤 세포(TIL), CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 임의의 다른 유형의 T 세포와 같은 임의의 T 세포를 포함하나 이로 한정되지는 않는 임의의 면역 세포일 수 있다. T 세포는 또한 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 또는 효과기 T 세포를 포함할 수 있다. T 세포는 또한 특정 집단 및 표현형으로 편중될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 표현형으로 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) 및/또는 IL-7Rα(+)를 포함하도록 편중될 수 있다. CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+) 및/또는 IL-7Rα(+)를 포함한 목록으로부터 선택된 1개 이상의 마커를 포함하는 적절한 세포가 선택될 수 있다. 유도 만능 줄기 세포는, 예를 들어, 미국 특허 제 7,682,828 호, 제 8,058,065 호, 제 8,530,238 호, 제 8,871,504 호, 제 8,900,871 호 및 제 8,791,248 호에 기술된 표준 프로토콜에 따라서 분화 세포로부터 생성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1차 세포는 시험관내 세포이다. 다른 실시양태에서, 1차 세포는 생체외 세포이다.
C. 생체외 치료
본원에 기술된 방법은 생체외 치료에 사용될 수 있다. 생체외 치료는 유기체 밖에서 생성되거나 변형된 조성물(예를 들어, 세포)을 대상(예를 들어, 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물(예를 들어, 세포)은 본원에 개시된 방법에 의해 생성되거나 변형될 수 있다. 예를 들어, 생체외 치료는 유기체 밖에서 생성되거나 변형된 1차 세포를 대상(예를 들어, 환자)에게 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 상기 1차 세포는, 1차 세포내 표적 핵산을 1개 이상의 본원에 기술된 변형된 sgRNA 및 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편, Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드)를 암호화하는 mRNA 또는 이의 변이체 또는 단편, 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 이의 변이체 또는 단편을 포함하는 재조합 발현 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는 본 발명의 방법에 따라서 시험관 내에서 배양되었다.
일부 실시양태에서, 조성물(예를 들어, 세포)은 생체외 치료에 의해 치료될 대상(예를 들어, 환자)으로부터 유도될 수 있다. 일부 실시양태에서, 생체외 치료는 세포-기반 치료, 예를 들어, 입양 면역치료를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 생체외 치료에 사용되는 조성물은 세포일 수 있다. 상기 세포는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 말초혈 림프구(PBL), 및 기타 혈액 세포 부분군을 포함하나 이로 한정되지는 않는 1차 세포일 수 있다. 1차 세포는 면역 세포일 수 있다. 1차 세포는 T 세포(예를 들어, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+ T 세포), 자연 살해 세포, 단핵구, 자연 살해 T 세포, 단핵구-전구체 세포, 조혈 줄기 세포 또는 비-만능 줄기 세포, 줄기 세포 또는 전구 세포일 수 있다. 1차 세포는 CD34+ HSPC와 같은 조혈 줄기 또는 전구 세포(HSPC)일 수 있다. 1차 세포는 인간 세포일 수 있다. 1차 세포는 단리되고, 선별되고/되거나 배양될 수 있다. 1차 세포는 생체 외에서 증식될 수 있다. 1차 세포는 생체 내에서 증식될 수 있다. 1차 세포는 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+), 및/또는 IL-7Rα(+)일 수 있다. 1차 세포는 그를 필요로 하는 대상에게 자가유래성일 수 있다. 1차 세포는 그를 필요로 하는 대상에게 비-자가유래성일 수 있다. 1차 세포는 우수 제조 기준(GMP) 상용성 시약일 수 있다. 1차 세포는 그를 필요로 하는 대상에서, 암, 감염, 자가면역 질환 또는 이식편-대-숙주 질환(GVHD)을 포함한 질환들을 치료하기 위한 병용 치료의 일부일 수 있다.
생체외 치료의 비-제한 예로서, 1차 세포는 1차 세포 내의 표적 핵산을 Cas 뉴클레아제 및 변형된 sgRNA와 접촉시키기 전에 다세포 유기체(예를 들어, 식물, 다세포 원생생물, 다세포 진균, 무척추 동물, 척추 동물 등)로부터 단리될 수 있다. 표적 핵산을 Cas 뉴클레아제 및 변형된 sgRNA와 접촉시킨 후, 1차 세포 또는 이의 자손세포(예를 들어, 1차 세포로부터 유도된 세포)는 다세포 유기체로 복귀될 수 있다.
D. 표적 세포 내 에 핵산을 도입하는 방법
표적 세포(숙주 세포) 내에 폴리펩티드 및 핵산을 도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 임의의 공지된 방법을 사용하여 뉴클레아제 또는 핵산(예를 들어, 뉴클레아제를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, DNA-표적화 FNA(예, 변형된 단일 가이드 RNA), 상동성-유도 복구(HDR)를 위한 공여체 복구 주형 등)을 세포, 예를 들어, 줄기 세포, 전구 세포 또는 분화 세포와 같은 1차 세포 내에 도입할 수 있다. 적절한 방법의 비-제한 예로는 전기천공, 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 리포펙션, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민(PEI)-매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포좀-매개 형질감염, 입자 총 기술, 인산칼슘 침전, 직접 미세주입, 나노입자-매개 핵산 전달 등이 포함된다.
일부 실시양태에서, CRISPR/Cas-매개 유전자 조절의 성분들은 전달 시스템을 이용하여 세포 내에 도입될 수 있다. 특정한 경우에서, 상기 전달 시스템은 나노입자, 미세입자(예를 들어, 중합체 미세중합체), 리포좀, 미셀, 비로좀, 바이러스 입자, 핵산 복합체, 형질감염제, 전기천공제(예를 들어, 네온(NEON) 형질감염 시스템 이용), 핵내도입제, 리포펙션제, 및/또는 뉴클레아제 성분(폴리펩티드로서 또는 발현 구조물에 의해 암호화된) 및 1개 이상의 핵산 성분, 예를 들어, DNA-표적화 RNA(예, 변형된 단일 가이드 RNA) 및/또는 공여체 복구 주형을 포함하는 완충 시스템을 포함한다. 예를 들어, 상기 성분들은 양이온성 서브미크론 수중유적형 유화액 내에 캡슐화되거나 패키징되도록 리포펙션제와 혼합될 수 있다. 또는, 상기 성분들은 전달 시스템없이, 예를 들어, 수용액으로서 전달될 수 있다.
리포좀을 제조하고 리포좀 내에 폴리펩티드 및 핵산을 캡슐화하는 방법은, 예를 들어, 문헌 [Methods and Protocols, Volume 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols. (ed. Weissig). Humana Press, 2009 and Heyes et al. (2005) J Controlled Release 107:276-87]에 기술되어 있다. 미세입자를 제조하고 폴리펩티드 및 핵산을 캡슐화하는 방법은, 예를 들어, 문헌 [Functional Polymer Colloids and Microparticles volume 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002 and Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines. (eds. Cohen & Bernstein). CRC Press, 1996]에 기술되어 있다.
E. 게놈 편집 효율 평가 방법
정확한 게놈 편집 변형의 존재를 기능적으로 시험하기 위해, 표적 DNA를 당해 분야의 전문가들에게 공지된 표준 방법에 의해 분석할 수 있다. 예를 들어, indel 돌연변이는 서베이어(SURVEYOR)® 돌연변이 검출 키트(인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies), 미국 아이오와주 코럴빌) 또는 가이드-잇™ 인델 식별 키트(Guide-it™ Indel Identification Kit)(클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 마운틴뷰)를 사용하여 서열분석에 의해 확인할 수 있다. 상동성-유도 복구(HDR)는 서열분석 또는 RFLP 분석과 함께 PCR-기반 방법에 의해 검출할 수 있다. PCR-기반 키트의 비-제한 예로는 가이드-잇 돌연변이 검출 키트(Guide-it Mutation Detection Kit)(클론테크) 및 진아트® 게놈 절단 검출 키트(GeneArt® Genomic Cleavage Detection Kit)(라이프 테크놀로지스, 미구 캘리포니아주 칼즈배드)가 포함된다. 심층 서열분석도 또한, 특히 많은 수의 샘플 또는 잠재적인 표적/표적이탈 부위에 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 게놈 편집의 효율(예를 들어, 특이성)은 표적적중 및 표적이탈 경우를 포함하여 모든 게놈 절단 경우의 수 또는 %에 대한 표적적중 게놈 절단 경우의 수 또는 %에 상응한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 변형된 sgRNA는 상응하는 비변형된 sgRNA에 비해 1차 세포와 같은 세포내 표적 DNA 서열의 게놈 편집을 증대시킬 수 있다. 게놈 편집은 상동성-유도 복구(HDR)(예를 들어, 삽입, 결실 또는 점 돌연변이) 또는 비상동적 말단 결합(NHEJ)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 세포내 표적 DNA 서열의 뉴클레아제-매개 게놈 편집 효율은 상응하는 비변형된 sgRNA 서열에 비해 본원에 기술된 변형된 sgRNA의 존재하에서 적어도 약 0.5배, 0.6배, 0.7배, 0.8배, 0.9배, 1배, 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 5.5배, 6배, 6.5배, 7배, 7.5배, 8배, 8.5배, 9배, 9.5배, 10배, 15배, 20배, 25배, 30배, 35배, 40배, 45배, 50배 이상만큼 증대된다.
F. 세포내 표적 핵산의 유전자 조절 방법
본원에서는 세포내 표적 핵산의 유전자 조절, 예를 들어, 게놈 편집 및/또는 유전자 발현 조절(예를 들어, 억제 또는 활성화)을 유도하는 방법이 제공된다. 상기 세포는 시험관내(예를 들어, 생체외 치료에 사용하기 위한 1차 세포) 또는 생체내(예를 들어, 인간과 같은 대상의 장기 또는 조직내 세포) 세포일 수 있다.
게놈 편집을 유도하는 방법은, 세포 내에 본원에 기술된 변형된 sgRNA, 및 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편, Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 도입하는 것을 포함한다. 상기 변형된 sgRNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 표적 핵산(예를 들어, 표적 DNA)으로 유도한다. 변형된 sgRNA는 상응하는 비변형된 sgRNA 서열에 비해 증대된 활성, 안정성 및/또는 표적 DNA에 대한 특이성을 갖는다. 일부 경우에서, 게놈 편집은 표적 DNA의 비상동적 말단 결합(NHEJ)이다. 다른 경우에서, 게놈 편집은 표적 DNA의 상동성-유도 복구(HDR)이다. HDR의 일부 실시양태에서, 재조합 공여체 복구 주형이 세포에 부가된다. 재조합 공여체 복구 주형은 표적 DNA의 2개의 비-중복 상동 부분을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있으며, 이때 상기 뉴클레오티드 서열들은 표적 DNA에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 재조합 공여체 복구 주형은, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 교정하기 위한 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 표적 DNA의 2개의 비-중복 상동 부분을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN) 주형을 포함하며, 이때 상기 뉴클레오티드 서열들은 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 위치한다. 변형된 sgRNA 및/또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편, Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터는 전기천공과 같은 임의의 적합한 방법을 이용하여 세포 내에 도입된다.
세포내 표적 핵산, 예를 들어, 표적 DNA의 유전자 발현을 조절(예를 들어, 억제 또는 활성화)하는 방법은, 세포 내에 본원에 기술된 변형된 sgRNA 및 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편, Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 도입(예를 들어, 전기천공)하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 변이체는 엔도뉴클레아제-결여 Cas(예를 들어, dCas9) 폴리펩티드이다. 일부 경우에서, Cas9 변이체는 야생형 Cas9 폴리펩티드에 비해 2개 이상의 아미노산 치환을 가질 수 있다. 다른 경우에서, Cas9 변이체는 이중-가닥 DNA를 절단할 수 없다. Cas9 뉴클레아제 변이체는 Cas(예를 들어, dCas9) 융합 폴리펩티드일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 융합 폴리펩티드는 전사 억제 도메인, 전사 활성화 도메인, 전사 인자, 히스톤 변형 효소(예를 들어, 히스톤 데아세틸라제, 히스톤 메틸트랜스퍼라제, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제), DNA 변형 효소(예를 들어, DNA 메틸트랜스퍼라제) 등을 포함한다.
세포내 표적 핵산, 예를 들어, 표적 RNA의 유전자 발현을 조절(예를 들어, 억제 또는 활성화)하는 방법은, 세포 내에 본원에 기술된 변형된 sgRNA 및 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편, Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터를 도입(예를 들어, 전기천공)하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 변이체는 감소된 내부핵산분해 활성을 가지거나 상기 활성이 결여된다. Cas 뉴클레아제 변이체는 폴리펩티드가 2중-가닥 DNA를 절단할 수 없도록 하는 2개 이상의 아미노산 치환을 함유할 수 있다. Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9) 변이체는 엔도리보뉴클레아제 활성을 가질 수 있으며 표적 RNA를 절단할 수 있다.
G. 대상에서 유전자 질환을 예방하거나 치료하는 방법
본원에 기술된 변형된 sgRNA는 유전자 조절 효율을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 변형된 sgRNA는 상응하는 비변형된 sgRNA에 비해 증대된 활성하에 유전자 조절을 유도할 수 있다. 일부 경우에서, 증대된 활성은 변형된 sgRNA의 증가된 안정성 및/또는 표적 핵산에 대한 변형된 sgRNA의 증가된 특이성을 포함한다. 또 다른 예로서, 변형된 sgRNA는 상응하는 비변형된 sgRNA에 비해 세포 독성의 감소하에 유전자 조절을 유도할 수 있다.
변형된 sgRNA는 유전자 질환의 표적화 뉴클레아제-기반 치료법에 적용될 수 있다. 1차 환자 세포의 게놈내 유전자 돌연변이를 정밀하게 교정하기 위한 현행 접근방법들은 매우 비효율적이었다(1% 미만의 세포들이 정밀하게 편집될 수 있다). 본원에 제공된 변형된 sgRNA는 게놈 편집 활성을 증대시키고 게놈 편집-기반 치료의 효능을 증가시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 sgRNA는 유전자 질환을 갖는 대상에서 유전자의 생체내 유전자 편집에 사용될 수 있다. 변형된 sgRNA는 임의의 적합한 투여 경로를 통해서 및 뉴클레아제-기반 치료의 효과를 증대(예를 들어, 게놈 편집 효율을 개선)시키기에 충분한 용량 또는 양으로 대상에게 투여될 수 있다.
본원에서는 질환과 연관된 유전자 돌연변이를 교정함으로써 그를 필요로 하는 대상에서 유전자 질환을 예방하거나 치료하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대상에게 본원에 기술된 변형된 sgRNA를 돌연변이를 교정하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. 본원에서는 또한 질환과 연관된 유전자 돌연변이를 교정함으로써 그를 필요로 하는 대상에서 유전자 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 본원에 기술된 변형된 sgRNA의 용도가 제공된다. 변형된 sgRNA는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편, Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 Cas 뉴클레아제(예를 들어, Cas9 폴리펩티드) 또는 이의 변이체 또는 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 또한 포함하는 조성물에 함유될 수 있다. 일부 경우에서, 변형된 sgRNA는 전술한 전달 시스템에 포함된다.
상기 방법에 의해 교정될 수 있는 유전자 질환으로는 X 염색체-관련 중증 복합 면역 결핍, 겸상적혈구 빈혈증, 지중해빈혈, 혈우병, 종양형성, 암, 노인성 황반 변성, 조현병, 트라이뉴클레오티드 반복 장애, 취약 X 증후군, 프리온-관련 장애, 근위축성 측색 경화증, 약물 남용, 자폐증, 알츠하이머 질환, 파킨슨 질환, 낭성 섬유증, 혈액 및 응고 질환 또는 장애, 염증, 면역-관련 질환 또는 장애, 대사 질환, 간 질환 및 장애, 신장 질환 및 장애, 근육/골격 질환 및 장애(예를 들어, 근이영양증, 듀켄(Duchenne)씨 근이영양증), 신경학 및 신경 질환 및 장애, 심혈관 질환 및 장애, 폐 질환 및 장애, 눈 질환 및 장애, 바이러스 감염(예를 들어, HIV 감염) 등이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다.
실시예
하기의 실시예는 청구된 본 발명을 예시하기 위해 제공되며 제한하는 것이 아니다.
실시예 1. 화학적으로 변형된 가이드 RNA는 인간 1차 세포에서 CRISPR / Cas 게놈 편집을 증대시킨다
CRISPR/Cas-매개 게놈 편집은 Cas 엔도뉴클레아제에 의해 촉진된 부위-특이적 DNA 절단을 유도하는 가이드 RNA에 의존한다. 여기서는 화학적으로 합성된 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 사용을 보고하고, 화학적 변화에 의한 sgRNA의 변형이 인간 1차 T 세포 및 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포에서 게놈 편집을 급격히 증대시킴을 밝힌다. 이 접근방법은 CRISPR/Cas 기술의 다수의 생명공학 및 치료적 용도를 가속화하는 가능성하에 게놈 편집의 개발을 간소화하는 단순하고 매우 효과적인 방법이다.
조작된 뉴클레아제를 사용한 게놈 편집은 근본적으로 관심대상인 임의의 게놈 서열을 변형시키기 위한 획기적인 기술이다[Porteus, M.H. & Carroll, D., Nature Biotechnology 23, 967-973 (2005)]. 상기 기술은 조작된 뉴클레아제를 이용하여 부위-특이적 이중가닥 파손(DSB)을 유발한 후 내인성 세포 복구 메카니즘에 의해 DSB를 해결한다. 결과는, 파손 부위에서 삽입 또는 결실(in/del)을 유발하는 돌연변이유발 비상동적 말단-결합(NHEJ)을 통한 특정 부위의 돌연변이, 또는 외인적으로 도입된 공여체 주형을 이용한 상동적 재조합(HR)을 통한 게놈 서열의 정밀한 변화일 수 있다[Hendel et al., Trends in Biotechnology 33, 132-140 (2015)]. 상기 플랫폼에 최근에 주요하게 추가된 것은 RNA-유도형 뉴클레아제(Cas) 및 짧은 가이드 RNA(sgRNA)로 이루어지는 주기적 간격으로 분포하는 회문구조 반복서열(CRISPR)/Cas 시스템이다[Jinek, M. et al., Science 337, 816-821 (2012), Mali, P. et al., Science 339, 823-826 (2013), Cong, L. et al., Science 339, 819-823 (2013), Hsu et al., Cell 157, 1262-1278 (2014)]. 가이드 RNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)로 지칭되는 2개의 RNA로 이루어지며, 이들은 유전자 편집을 위해 전형적으로 키메라 단일 가이드 RNA(sgRNA)에 융합된다. sgRNA는 100개의 뉴클레오티드(nt)로 이루어질 수 있으며, 이들중 5' 말단에서의 20개 nt는 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 표적 DNA 서열에 하이브리드화되고 표적 게놈 DNA를 절단하도록 Cas 엔도뉴클레아제를 유도할 수 있다(도 1a). sgRNA는, 예를 들어, 시험관내 전사에 의해 제조된 RNA로서, 또는 RNA 폴리머라제 III 프로모터로부터 발현된 sgRNA를 갖는 DNA 벡터를 사용하여 세포 내에 전달될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템을 사용한 게놈 편집은 인간 세포주에서 매우 효과적이지만, 1차 인간 세포에서 CRISPR/Cas 게놈 편집은 일반적으로 보다 까다롭다. 상기 감소된 활성에 대한 이유는 여전히 알기 어렵지만, 기여 요인들은 형질감염 비율, 프로모터 활성, 엑소뉴클레아제 활성, 핵산을 전달할 때 선천적인 인터페론 면역 반응, 및 DNA 복구 충실도에서의 차이를 포함할 수 있다. 여기서는 화학적으로 합성된 sgRNA가 높은 수준의 게놈 편집을 유도할 수 있음을 입증하고, 추가로 sgRNA의 화학적 변화가 인간 1차 T 세포 및 CD34+ 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC) 둘 다에서 게놈 편집을 급격히 증대시킬 수 있음을 밝힌다. 화학적으로 변형된 sgRNA를 사용하여 상기 세포 유형들에서 게놈 편집의 증가는, DNA 발현 플라스미드를 통해서보다는 mRNA 또는 단백질로서 Cas9를 전달함으로써 더 개선되며, 따라서 CRISPR/Cas 시스템을 위한 단순하고 완전한 RNA 또는 리보핵단백질(RNP)-기반 전달 시스템을 제공한다.
결과
RNA 합성 기술에서의 최근의 진보는 100 nt보다 큰 길이의 RNA를 화학적으로 합성하는 것을 실현가능하게 하였다[Dellinger, D.J. et al., Journal of the American Chemical Society 133, 11540-11556 (2011)]. 게놈 편집을 위한 화학적으로 합성된 sgRNA의 유용성을 시험하기 위해, 이전에 기술된 절차에 따라서[Dellinger, D.J. et al., Journal of the American Chemical Society 133, 11540-11556 (2011)] ABI 394 합성기 및 2'-O-티오노카바메이트-보호된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하여 100 nt의 전장 sgRNA를 합성하였다. 또한, 효능에 대한 이의 영향을 평가하기 위해 양쪽 말단에서 다양한 화학적 변형을 갖는 sgRNA를 합성하였다(도 1a 및 1b, 및 표 1). 존재하는 경우, 2'-O-메틸(M), 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트(MS), 또는 2'-O-메틸 3'-티오PACE(MSP)를 포함하는 화학적 변형을 5' 및 3' 말단 둘 다에서 3개의 말단 뉴클레오티드에 혼입시켰다. 상기 3개의 변형은 혈청 및 뱀독 포스포르다이에스터라제에 대한 이의 이전에 보고된 안정성 뿐 아니라 핵산의 면역자극 성질에 대한 이의 광범위한 보고된 효과로 인해 평가에 선택되었다[Deleavey, G.F. & Damha, M.J., Journal of the American Chemical Society 125, 940-950 (2003), Hendel et al., Cell Reports 7, 293-305 (2014)]. 하기의 인간 유전자들 각각의 세포주에서 높은 유전자 편집 비율을 제공하는 것으로 이전에 보고된 다음 3개의 sgRNA를 선택하였다[Hendel et al., Cell Reports 7, 293-305 (2014), Cradick et al., Nucleic Acids Research 41, 9584-9592 (2013)]: (i) 선천적인 원발성 면역결핍 SCID-X1의 원인이 되는 돌연변이인 IL2RG, (ii) 겸상 적혈구 빈혈증 및 지중해빈혈의 원인이 되는 돌연변이인 HBB, 및 (iii) HIV의 보조수용체를 암호화하고 항-HIV 임상 시험에서 치료적 유전자 편집을 위한 표적으로서 현재 연구중인 CCR5[Tebas, P. et al., The New England Journal of Medicine 370, 901-910 (2014)]. 먼저, 정제된 재조합 Cas9 단백질 및 각각의 합성 sgRNA의 존재하에서 시험관 내에서 표적 DNA 절단을 시험하였다. 모든 화학적으로 합성되고 변형된 sgRNA는 Cas9 단백질의 존재하에서 이의 DNA 표적을 효과적으로 절단하였다(도 3 및 4).
다음으로, 합성된 sgRNA가 인간 세포주에서 돌연변이유발 NHEJ 및 유전자 파괴를 나타내는 표적화된 in/del을 포함하는지를 조사하였다. Cas9를 암호화하는 DNA 플라스미드와 함께 각각의 sgRNA를 핵내도입에 의해 K562 세포 내에 전달하고 in/del 빈도를 분석하였다. IL2RG 유전자좌를 표적화하는 합성 비변형된 sgRNA 1 ㎍의 전달은 2.4%의 표적화된 in/del 빈도를 제공하여 이의 기능성을 입증하였다(도 1c, 밝은 음영 막대). M 변형된 sgRNA의 경우, 13.5%로의 in/del 빈도의 소폭 증가가 관찰되어 비변형된 sgRNA에 비해 안정성에서 약간의 개선을 시사하였다. 두드러지게, 동일한 양의 화학적으로 변형된 sgRNA는 in/del 빈도를 MS 및 MSP 변형된 sgRNA에 각각에 있어서 68.0% 및 75.7%로 증가시켰다. 변형된 sgRNA의 양을 20배 증가시키면, 모든 경우에서 in/del 빈도가 더 증가되어 MS 및 MSP sgRNA가 각각 75.3% 및 83.3%가 되었으며(도 1c, 짙은 음영 막대), 이것은 플라스미드로부터 CRISPR/Cas 시스템을 발현시켜 수득된 빈도와 필적하였다. HBB 및 CCR5 표적들에 대해서도 매우 유사한 결과가 수득되어(도 1c), 인간 세포에서 높은 수준의 표적화 유전자 돌연변이를 유도하는 화학 변형된 sgRNA의 일반적인 능력을 입증하였다. 다음으로, 상기 합성 sgRNA가 HR을 통해 유전자 표적화를 자극할 수 있는지를 측정하였다. CRISPR 절단 부위의 상동성 5' 및 3'의 약 0.8 kb 팔을 갖는 3개의 유전자좌 각각에 대한 표적화 벡터를 설계하였다. 상동성 팔 사이에, 표적화 유전자좌에서 성공적인 HR시에 안정하게 통합될 수 있는 GFP 발현 카세트를 포함시켰다[Lombard. et al., Nature Methods, 8, 861-869 (2011); Voit et al., Nucleic Acids Research 42, 1365-1378 (2014)]. 3개의 표적화 유전자좌 모두에서, MS 및 MSP sgRNA는 비변형된 및 M 변형된 sgRNA보다 훨씬 더 높은 수준의 HR을 자극하였다(도 1d). 더 높은 sgRNA 수준(20 ㎍)에서, IL2RG, HBB, 및 CCR5에서 MSP sgRNA에 대해 각각 20.6%, 25.5%, 및 50.0%의 HR 비율이 측정되었다. 상기 빈도들은 플라스미드로부터 CRISPR/Cas 시스템을 전부 발현시켜 수득된 빈도와 필적하거나 그 보다 높다.
화학적으로 변형된 sgRNA가 표적이탈 활성에 영향을 미치는지를 조사하기 위해, 심층 서열분석을 이용하여 각각의 sgRNA에 대한 3개의 상이한 유전자좌에서의 표적이탈 돌연변이 빈도를 측정하였다. 상기 표적이탈 부위 중 8개는 인실리코(in silico) 예측 도구[Hsu et al., Nature Biotechnology 31, 827-832 (2013), Cradick et al., Molecular therapy. Nucleic acids, 3, e214 (2014)]에 의해 예측되었고, HBB sgRNA의 경우에는 sgRNA가 높은 수준의 표적이탈 활성을 갖는 것으로 이전에 밝혀진[Cradick et al., Nucleic Acid Research, 42, 9584-9592, (2013)] 1개의 표적이탈 부위를 포함시켰다. 8개 예측 부위들 중 4개에서, 변형된 sgRNA에 대해 높은 수준의 표적적중 활성이 검출됨에도 불구하고 모든 화학 합성된 sgRNA에 대해 배경에 가까운 표적이탈 활성이 확인되었다(도 1e 및 5, 표 5). sgRNA의 화학적 변형은 다른 4개의 예측 부위에서 더 높은 표적이탈 활성을 야기하는 경향이 있지만, 활성 수준은 가변적이었다. 일부 경우에서, 표적적중 대 표적이탈 in/del 빈도의 비는 변형된 sgRNA를 사용하여 개선되어, 개선된 상대적 특이성을 시사하였다. 이러한 결론에 대한 세부사항은 하기에서 요약된다. 2개의 표적이탈 부위(이전에 HBB sgRNA가 유의적 표적이탈 활성을 나타내었던 IL2RG "표적이탈 2" 및 HBB "표적이탈 1")에서 비변형된 sgRNA에 대한 활성만을 검출하였으며, 이에 의해 비변형된 sgRNA와 변형된 sgRNA 사이의 표적적중:표적이탈 비를 비교할 수 있었다. IL2RG 부위에서 상기 표적적중:표적이탈 비는 MSP sgRNA에 비해 비변형된 sgRNA의 경우에 5.8배 더 우수한(도 1e 및 표 5) 반면, HBB 부위의 경우 상기 비는 비변형된 sgRNA에 비해 MSP sgRNA의 경우에 2.6배 및 1.5배(1 ㎍ 및 20 ㎍에 대해) 더 우수하였다(도 1e 및 5, 표 5). 변형된 sgRNA의 표적적중:표적이탈 비와 sgRNA 플라스미드의 표적적중:표적이탈 비를 비교하면, sgRNA 플라스미드는 CCR5 "표적이탈 2" 및 IL2RG "표적이탈 2"에서 더 우수한 비를 나타낸 반면, HBB "표적이탈 1"에 대해서는 MSP sgRNA가 더 우수한 표적적중:표적이탈 비를 나타내었다(도 1e 및 표 5). HBB 표적이탈 1 부위를 제외하고, 측정된 최고 표적이탈 빈도는 "표적이탈 2"에서 IL2RG sgRNA를 사용하였을 때로, 1 ㎍ 및 20 ㎍ MS sgRNA를 사용한 경우 각각 1.0% 및 7.8%의 in/del 빈도를 야기하였다. 흥미롭게, 동일 부위에서 IL2RG MSP sgRNA의 표적이탈 활성은, 더 높은 표적적중 활성을 가짐에도 불구하고, MS sgRNA에 비해, 각각 2.7배 및 2.8배 더 낮았다. 마찬가지로, MSP sgRNA의 표적이탈 활성은, 이전에 HBB sgRNA가 유의적인 표적이탈 활성을 나타낸 HBB 표적이탈-1 부위에서 MS sgRNA에 비해 더 우수하였다. CCR5 "표적이탈 2"에서는 반대 현상이 관찰되어, MSP sgRNA가 MS sgRNA에 비해 더 높은 표적이탈 활성을 나타내었다. 종합해보면, 상기 결과들은 전형적으로 화학적으로 변형된 sgRNA가 높은 특이성을 유지함을 시사한다. 표적적중:표적이탈 비에서 관찰된 차이는 sgRNA에 대한 화학적 변화가 표적적중:표적이탈 활성을 조절하는 잠재력을 가질 수 있다는 가능성을 시사하지만, 해당 화학적 변화의 영향은 서열-의존성인 것으로 보이며 또한 세포 유형 및 전달 조건과 같은 다른 요인들에 따라서도 달라질 수 있다. 이러한 관찰결과들이 다른 종에서 상이한 유전자좌를 표적화하는 다른 sgRNA에 일반화될 수 있는지는 추가의 연구를 필요로 할 것이다.
인간 세포주에서 화학적으로 변형된 sgRNA의 성능을 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 sgRNA를 Cas9를 암호화하는 mRNA와 동시-전달하는 "전체 RNA" 전달 플랫폼으로 전환하였다. 다양한 양의 MSP sgRNA(1 내지 20 ㎍)와 함께 다양한 양의 Cas9 mRNA(1 내지 15 ㎍)를 사용하여 IL2RG 유전자좌에서의 in/del 빈도를 측정하였다(도 6). 각각 1 ㎍의 Cas9 mRNA 및 MSP sgRNA를 사용하였을 때 70% in/del로의 약간의 감소를 제외하고, 시험한 모든 농도에 대해 81 내지 90%의 유사하게 높은 비율의 in/del이 관찰되어, 상기 "전체 RNA" 접근방법의 높은 효율을 입증하였다. 화학적 변형이 sgRNA 활성의 반감기에 영향을 미쳤는지를 조사하기 위해, Cas9 mRNA 및 IL2RG를 표적화하는 다양한 합성 sgRNA를 핵내도입에 의해 동시-전달하거나, 순차적으로 전달하는 실험을 수행하였다(도 7). Cas9 mRNA와 MS 또는 MSP sgRNA의 동시-전달은 각각 87% 및 84% in/del의 높은 편집 빈도를 제공하였다(도 1f). M sgRNA가 66% in/del을 야기한 반면, 비변형된 sgRNA는 높지 않은 7.0%를 야기하여, Cas9 mRNA와 동시-전달될 때 sgRNA 변형의 중요성을 분명하게 나타내었다. 흥미롭게, 먼저 Cas9 mRNA를 전달하고 4 또는 8 시간 후에 sgRNA를 전달한 결과, 비변형된 sgRNA와 화학적으로 변형된 sgRNA 사이의 효율에 차이없이 4개 sgRNA 모두에 걸쳐 높고 필적하는 수준의 in/del(83.1% 내지 92.4%)을 제공하였다(도 1f). 대조적으로, sgRNA를 먼저 전달하고 4, 8, 12 또는 24 시간 후에 Cas9 mRNA를 전달한 경우, 비변형된 sgRNA를 사용하여 수득된 in/del 빈도는 4-시간 시점까지 이미 배경에 가까운 수준으로 떨어졌다. M sgRNA의 경우에서도, 배경에 가까운 수준으로의 in/del 빈도의 감소가 관찰되었지만, 상기 하락은 약간 지연되어, 비변형된 sgRNA에 비해 안정성에서 약간의 개선을 시사하였다. MS sgRNA의 경우, 24 시간 시점까지 in/del 빈도에 감소는 관찰되지 않았고, 상기 시점에서 비율은 53%로 저하되었다. 두드러지게, MSP sgRNA의 경우, sgRNA와 Cas9 전달 사이에서 24 시간 지연 후에조차 활성의 유의적인 감소가 검출되지 않았다. 이러한 결과들은 sgRNA 말단-변형이 세포내 안정성을 증대시키는 본 발명의 모델과 일치하므로, Cas9 mRNA와 sgRNA가 인간 세포 내에 동시-전달될 때 게놈 편집의 증가된 효능을 가능하게 한다. 비변형된 sgRNA에 의해 유도된 in/del 빈도가, Cas9가 먼저 전달되었을 때, 감소되지 않았다는 사실은, Cas9 단백질이 sgRNA를 분해로부터 보호한다는 것을 시사한다. 상기 가설을 연구하기 위해, 비변형된 또는 MS IL2RG sgRNA를 재조합 Cas9 단백질과 복합체화시킨 후에 상기 활성 RNP를 2가지 상이한 양으로 K562 세포 내에 전기천공시켰다(도 1g 및 8). 소량의 RNP를 사용하여, 비변형된 sgRNA에 비해 MS sgRNA를 사용하였을 때 3.8배 더 높은 in/del 빈도가 관찰되었고(35.7% 대 9.5%), 다량의 RNP를 사용한 경우, 상기 증가는 2.3배였다(81.0% 대 35.9%). 그러나, MS sgRNA와 비변형된 sgRNA 사이의 비는 sgRNA를 Cas9 mRNA와 동시-전달했을때 관찰된 것보다 훨씬 더 낮아서(도 1f "동시-전달"과 비교), Cas9 단백질이 비변형된 sgRNA를 분해로부터 부분적으로 보호함을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, sgRNA에 대한 변형은 Cas9 단백질과 사전-복합체화된 sgRNA를 전달하였을 때도 여전히 게놈 편집 효율을 개선시킨다. 다음으로, Cas9 플라스미드, Cas9 mRNA와 함께 또는 Cas9 단백질과 사전-복합체화되어 전달될 때 이전에 연구된 3개의 표적이탈 부위에서 비변형된 sgRNA와 MS IL2RG sgRNA의 표적이탈 활성을 비교하였다. 비변형된 sgRNA의 경우, 3개의 Cas9 공급원 모두 및 3개의 표적이탈 부위 모두에 걸쳐서 낮은 수준의 in/del(<0.37%)이 검출되었다(도 9a 및 9b). MS sgRNA의 경우, Cas9 mRNA에 비해 Cas9 플라스미드를 전달할 때 3개 표적이탈 부위 모두에서 개선된 표적적중:표적이탈 비가 관찰되었다(2.6배 내지 3.0배). 현저하게, Cas9 RNP를 MS sgRNA와 함께 전달한 경우, 3개 부위 모두에서 Cas9 플라스미드 및 mRNA에 비해 훨씬 더 우수한 표적적중:표적이탈 비가 검출되었으며, 상기 부위들 중 2개 부위에서는 배경에 가까운 표적이탈 활성이 검출되었다. 요컨대, 화학적으로 변형된 sgRNA는 Cas9 mRNA와 동시-전달되거나 RNP로서 전달될 때 인간 세포주에서의 게놈 편집에 있어서 비변형된 sgRNA에 비해 상당한 이점을 나타낸다.
다음으로, 1차 세포에서 화학적으로 변형된 sgRNA를 시험하였다. CD4+ T 세포에서 아연-집게 뉴클레아제(ZFN)를 사용한 CCR5 유전자 파괴는 항-HIV 치료법으로서 임상 시험에서 현재 연구되고 있다[Tebas et al. New Eng Jour of Med, 370, 901-910 (2014)]. 그러나, 최근의 연구는 인간 1차 T 세포의 게놈이 본질적으로 단일 sgRNA를 사용하는 CRISPR/Cas9 플라스미드 시스템을 사용하여 편집하기에 어렵고, 세포주에서 높은 대립유전자 변형 빈도를 야기하는 sgRNA가 형질감염된 세포들이 풍부할 때조차 T 세포에서의 효능이 실질적으로 감소되었음을 밝혔다[Mandal et al., Cell Stem Cell, 15, 643-652 (2014)]. Cas9-암호화 mRNA와 동시-전달된 자극된 인간 1차 T 세포에서 화학적으로 변형된 CCR5 sgRNA를 시험하였다. 중요하게, GFP mRNA를 사용하여 유세포분석에 의해 측정시 T 세포에서 98%보다 큰 핵내도입 효율이 일관되게 관찰되어(도 10), 형질감염 세포를 증가시킬 필요가 없었다. sgRNA 및 Cas9를 둘 다 암호화하는 sgRNA 플라스미드의 핵내도입은 배경보다 높은 대립유전자 변형 빈도를 야기하지 않았다(도 2a). 그러나, Cas9에 대한 DNA 발현 플라스미드로 MSP sgRNA를 동시-형질감염시키면 활성을 9.3% in/del 빈도로 증가시킬 수 있었다. 비변형된 sgRNA 또는 M sgRNA에 의한 Cas9 mRNA의 핵내도입은 배경보다 높은 대립유전자 변형 비율을 야기하지 않았다. 대조적으로, MS 또는 MSP sgRNA에 의한 Cas9 mRNA의 핵내도입은 각각 주목할만한 48.7% 및 47.9% in/del 빈도를 야기하였다. sgRNA 또는 Cas9 mRNA의 양을 증가시켜도 더 높은 in/del 빈도는 야기하지 않았다(도 11). Cas9 mRNA 및 MSP sgRNA로 핵내도입된 세포의 경우, CD4+, CD8+, 및 전체 T 세포 집단에서 필적하는 대립유전자 변형 빈도를 확인하였다(도 12). 중요하게, 상기 관찰된 높은 변형 빈도는 21일의 시간 경과동안 MSP sgRNA에 대해 측정하였을 때 안정하였으며(도 13), 상당한 세포 사멸 및 감소된 증식 가능성을 야기한 플라스미드 핵내도입과 대조적으로, 변형된 sgRNA로 핵내도입한 후 세포 생존력 및 증식에는 약간의 영향만이 관찰되었다(도 14 및 15). 자극된 T 세포보다 편집하기에 더 어려운 것으로 밝혀진[Yi et al., Molecular Therapy Nucleic Acids, 3, e198 (2014)] 비자극 T 세포에서의 MS sgRNA도 또한 시험하였다. 자극된 T 세포와 달리, 비자극 T 세포에서의 in/del 빈도는 6.6% 내지 22.2%의 범위로, 더 높은 공여체 생존력을 나타내었다(도 16). 자극된 T 세포에서보다 더 낮았지만, 비자극 T 세포에서의 상기 편집 빈도는, 특히 활성화 및 지연된 배양이 세포의 이어지는 생물 기능에 영향을 미칠 수 있는 T 세포 조작에서 여전히 유용성을 가질 수 있다. 다음으로, 자극된 1차 T 세포에서 비변형된 sgRNA 및 MS sgRNA를 사용한 RNP 전달을 시험하였다. K562 세포에서 수득된 결과와 유사하게, 비변형된 sgRNA에 비해 MS sgRNA의 in/del 빈도에서 2.4배 개선이 관찰되어(30.7% 대 12.8%), Cas9 단백질과 사전-복합체화되어 전달될 때 화학적으로 변형된 sgRNA의 용도를 더 뒷받침하였다.
HSPC에서의 유전자 치료는 조혈계의 유전적 또는 후천적 질환을 치료하기 위해 광범위하게 연구되었다. IL2RG 및 HBB를 표적화하는 화학적으로 변형된 sgRNA가 가동화된 말초혈로부터 단리된 CD34+ HSPC에서 작용하는지를 시험하였다. 또한, sgRNA 및 Cas9를 둘 다 발현하는 sgRNA 플라스미드는 검출가능한 in/del 빈도를 야기하지 않았지만, MSP sgRNA를 Cas9 DNA 발현 플라스미드로 동시-형질감염시킨 결과 IL2RG 및 HBB에 대해 in/del 빈도를 각각 3.2% 및 5.2%로 증가시켰다(도 2c 및 17). T 세포에서의 관찰결과와 유사하게, Cas9 mRNA로 동시-형질감염시켰을 때 비변형된 sgRNA 또는 M sgRNA를 사용하여 어느 한 유전자좌에서 in/del이 검출되지 않았지만, MS 및 MSP sgRNA는 각각 높은 in/del 빈도를 야기하였다: IL2RG에 대해 MS 및 MSP sgRNA의 경우 각각 17.5% 및 17.7% in/del 빈도가 검출되었고, HBB에 대해 빈도는 각각 23.4% 및 22.0%로 훨씬 더 높았다. 추가의 연구는, 화학적으로 변형된 sgRNA에 의한 HSPC의 유전자 변형이 이의 다능성 능력에 영향을 미치는지, 또는 장기 재증식 줄기 세포 및 계통이 정해진(lineage-committed) 전구 세포 사이에서 편집 효율이 상이한지를 밝힐 수 있었다.
최근의 연구는 2개 sgRNA의 동시 사용이 인간 1차 T 세포 및 CD34+ HSPC에서 유전자 파괴를 개선할 수 있음을 보여주었다[Mandal et al., Cell Stem Cell, 15, 643-652 (2014)]. 본 발명자들은 205 bp 간격으로 절단된, 상기 연구에서 보고된 서열들을 갖는 MS 및 MSPCCR5 sgRNA를 화학적으로 합성하였다("D" 및 "Q"로 지칭). 이들을 T 세포 및 CD34+ HSPC에서 Cas9 mRNA와 동시-전달하여 시험하였다. 상기 2개의 sgRNA를 개별적으로 사용한 경우, TIDE 분석을 이용하여 대립유전자 변형 빈도를 정량화하였다. 둘 다 사용된 경우, 클로닝된 PCR 산물의 서열분석에 의해 대립유전자 변형 빈도를 정량화하였으며, 이에 의해 상기 2개의 sgRNA 표적 부위 사이 서열의 결실에 대해 이전에 보고된 높은 발생률을 포함하여 편집의 전체 영역을 정량화할 수 있었다. 1차 T 세포에서 개별적으로 사용된 경우, "D" sgRNA는 MS 및 MSP sgRNA의 경우 각각 56.0% 및 56.3% in/del을 야기하였고, "Q" sgRNA는 각각 62.6% 및 69.6%를 야기하였다(도 2d 및 18a). 함께 사용된 경우, MS 및 MSP sgRNA에 대해 각각 73.9% 및 93.1%로 관찰된 바와 같이 대립유전자 변형 빈도가 증가되었으며, 상기 변형의 대부분은 2개 sgRNA 표적 부위 사이의 결실이었다(도 18b). CD34+ HSPC에서, 전체적인 빈도는 더 낮았지만 관찰결과는 유사하였다. 따라서, "D" sgRNA의 경우, MS 및 MSP sgRNA에 대해 각각 9.8% 및 11.2% 대립유전자 변형 빈도가 관찰되었고, "Q" sgRNA의 경우에는 17.8% 및 19.2%이었다(도 2d 및 18b). 함께 사용된 경우, 빈도는 MS 및 MSP sgRNA의 경우 각각 37.8% 및 43.0%로 증가되었다. 2개의 화학적으로 변형된 sgRNA의 사용은 1차 인간 T 세포 및 CD34+ HSPC에서 유전자 파괴를 촉진하는 매우 효과적인 방법이라고 결론지어진다.
도 19는 CD34+ HSPC에서 상응하는 비변형된 sgRNA보다 우수한 MS-변형된 sgRNA 성능을 보여주는 추가의 실험 데이터를 제공한다. 도 20은 변형된 sgRNA가 효과적인 다중 게놈 편집에 사용될 수 있음을 보여준다.
본 연구에서는, 화학적으로 합성된 sgRNA가 표적화 게놈 편집에 효과적으로 사용될 수 있음을 보이고, 화학적으로 변형된 sgRNA가 인간 1차 T 세포 및 CD34+ HSPC에서 게놈 편집 효율을 상당히 증대시킴을 입증한다. 화학적으로 합성되고 변형된 sgRNA는 발현되거나 시험관내 전사된 sgRNA에 비해 이점들, 그중에서도 다음의 이점들을 제공한다: (1) 증가된 효능, (2) 생명공학 및 치료 용도의 고도로 순수한 sgRNA의 강력하고 확장가능한 생산, (3) 각각 전형적으로 sgRNA의 플라스미드 발현 또는 시험관내 전사에 사용되는 U6 또는 T7 프로모터에 의해 부여된 첫번째 전사된 뉴클레오티드에 대한 제한에 대비하여 sgRNA 설계에서 보다 큰 유연성, 및 (4) DNA 플라스미드-기반 시스템보다 1차 세포에서 더 낮은 세포독성하에 매우 활성인 "RNA 단독" 또는 RNP CRISPR 플랫폼의 가능화. CRISPR/Cas 시스템을 오직 RNA 또는 RNP CRISPR 시스템으로 단순화시키는 것은, 바이러스 벡터의 일부로서 전달될 때 그러하듯이, 뉴클레아제가 연속적으로 발현되지 않도록, 상기 시스템 자체를 생체내 전달을 위한 상이한 나노입자 벡터들내에서의 조작에 적합하게 한다. 더우기, 화학적으로 변형된 sgRNA는 다중 게놈 편집 뿐 아니라 igh-처리 다중-웰 실험을 향상시킬 것으로 예상된다. 또한, 변형된 sgRNA는 광범위한 CRISPR-연관 기술들, 예를 들어, 유전자 발현의 억제 및 활성화를 위한 CRISPRi/CRISPRa 시스템[Gilbert, L.A. et al., Cell 159, 647-661 (2014)], 게놈 유전자좌의 동적 가시화를 위한 CRISPR 영상화 도구[Chen, B. et al., Cell 155, 1479-1491 (2013)], 및 CRISPR-매개 RNA 인식 및 절단[O'Connell, M.R. et al., Nature 516, 263-266 (2014)]을 개선할 것으로 예상된다. 상기 기술은 표적 세포 또는 조직으로의 세포내 전달을 개선하고, 영상화 및 생화학 연구를 위한 다양한 분자로의 접합을 가능하게 하도록 더 발전될 수 있다. 추가의 연구들은 더 다양한 화학적 변형을 연구하고, 최적화된 sgRNA의 합리적인 설계를 위한 변형들의 상이한 위치 뿐 아니라, 변형된 sgRNA의 증대된 활성에 대한 메카니즘을 조사할 수 있다. 결론적으로, 본원에 제공된 바와 같은 화학적으로 변형된 sgRNA는 다수의 CRISPR/Cas 생명공학 및 치료 용도를 개선할 것으로 생각된다.
재료 및 방법
1. sgRNA 합성
모든 RNA 올리고머들은 이전에 기술된 절차들[Dellinger et al., Journal of the American Chemical Society 133, 11540-11556 (2011)]에 따라서 2'-O-티오노카바메이트-보호된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트(시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스, 또는 터모 피셔(Thermo Fisher), 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 ABI 394 합성기(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼즈배드) 상에서 합성하였다. 2'-O-메틸 포스포르아미다이트는 터모 사이언티픽(Thermo Scientific)(미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드)에서 구입하였으며, 2'-O-티오노카바메이트 보호된 포스포르아미다이트와 동일한 조건하에서 RNA 올리고머내에 혼입시켰다. 티오포스포노아세테이트(티오PACE) 변형된 RNA의 합성에 사용된 2'-O-메틸-3'-O-(다이이소프로필아미노)포스피노아세트산-1,1-다이메틸시아노에틸 에스터-5'-O-다이메톡시트리틸 뉴클레오시드는 필수적으로 공개된 방법에 따라서 합성하였다[Threlfall et al., Organic & biomolecular chemistry, 10, 746-754 (2012); Dellinger et al., Journal of the American Chemical Society, 125, 940-950 (2003)]. 포스포로티오에이트 함유 올리고머의 경우, 커플링 반응후 요오드 산화 단계를, 6분동안 피리딘-아세토니트릴(3:2) 혼합물 중의 3-((N,N-다이메틸아미노메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-다이티아졸로-5-티온의 0.05 M 용액을 사용한 황화 단계로 대체하였다. 달리 언급되지 않는 한, 고체상 RNA 합성을 위한 시약들은 글렌 리서치(Glen Research)(미국 버지니아주 스털링)에서 구입하였다.
모든 올리고뉴클레오티드들은 역상 HPLC를 사용하여 정제하고 애질런트(Agilent) 6520 Q-TOF 질량분석계(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주 산타클라라)에 연결된 애질런트 1290 인피니티(Infinity) 시리즈 LC 시스템(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies)을 사용하여 LC-MS에 의해 분석하였다. 표 1은 사용된 모든 sgRNA의 서열을 나타내며, 전하의 디콘볼루션(deconvolution)으로부터 수득된 질량은 확인된 피크들의 계열을 명시한다. 디콘볼루션은 매스 헌터 정량 분석(Mass Hunter Qualitative Analysis)(버전 B.06.00) 소프트웨어(애질런트)를 사용하여 수행하였다.
본 연구에 사용된 모든 sgRNA의 개관
서열번호 명칭 서열 계산
질량
(Da) 		관찰
질량
(Da)
서열번호 4 HBB
비변형된 sgRNA 		CUUGCCCCACAGGGCAGUAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32187.42 32187.84
서열번호 5 HBB M sgRNA CUUGCCCCACAGGGCAGUAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32271.54 32271.35
서열번호 6 HBB MS sgRNA CUUGCCCCACAGGGCAGUAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32367.42 32367.31
서열번호 7 HBB MSP sgRNA CUUGCCCCACAGGGCAGUAAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32619.93 32619.39
　
서열번호 8 IL2G
비변형된 sgRNA 		UGGUAAUGAUGGCUUCAACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32214.40 32214.37
서열번호 9 IL2G M sgRNA UGGUAAUGAUGGCUUCAACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32298.52 32297.01
서열번호 10 IL2G MS sgRNA UGGUAAUGAUGGCUUCAACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32394.4 32395.43
서열번호 11 IL2G MSP sgRNA UGGUAAUGAUGGCUUCAACAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32646.91 32645.39
　
서열번호 12 CCR5
비변형된 sgRNA		 GGCAGCAUAGUGAGCCCAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32290.51 32289.07
서열번호 13 CCR5 M sgRNA GGCAGCAUAGUGAGCCCAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32374.63 32375.3
서열번호 14 CCR5 MS sgRNA GGCAGCAUAGUGAGCCCAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUU●UU 32470.51 32469.92
서열번호 15 CCR5 MSP sgRNA GGCAGCAUAGUGAGCCCAGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32723.02 32721.96
　
서열번호 16 CCR5 'D' MS sgRNA UCACUAUGCUGCCGCCCAGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32281.32 32282.52
서열번호 17 CCR5 'D' MSP sgRNA UCACUAUGCUGCCGCCCAGUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32533.83 32533.55
서열번호 18 CCR5 'Q' MS sgRNA GCUGUGUUUGCGUCUCUCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32252.22 32253.21
서열번호 19 CCR5 'Q' MSP sgRNA GCUGUGUUUGCGUCUCUCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 32504.73 32504.63
sgRNA 서열 뿐 아니라 계산된 분자량 및 관찰 분자량을 나타내었다. 2'-O-메틸 변형을 갖는 뉴클레오티드들은 밑줄이 쳐있다. 포스페이트 주쇄에서의 변형은 ●(MS) 및 ◆(MSP)로 나타내었다.
2 . 시험관내 절단 분석
4kb PAM-처리가능한 표적들은 플라스미드-매개 인간 서열의 예비 PCR 증폭에 의해 제조하였다. 20 ㎕ 반응 부피에서, pH 7.6에서 50 nM sgRNA, 39 nM 재조합 정제된 Cas9 단백질(애질런트) 및 10 mM MgCl2의 존재하에서 50 f몰의 선형화 DNA를 37 ℃에서 30분동안 배양하였다. 종료시, 0.5 ㎕의 RNace It(애질런트)를 가하고, 37 ℃에서 5분동안 계속 배양한 다음 70 ℃에서 15분동안 배양하였다. 이어서, 0.5 ㎕의 프로테이나제 K(Proteinase K)(Mol. Bio. grade, NEB)를 가하고 37 ℃에서 15분동안 배양하였다. 분취량들을 DNA 7500 랩칩에 부하하고 바이오어낼라이저(Bioanalyzer) 2200에서 분석하였다. 절단 빈도는 식: (a/b) x 100에 의해 계산하였으며, 여기서 "a"는 2개의 절단 생성물의 밴드 세기의 합이고, b는 절단 및 비절단 DNA의 밴드 세기의 합이다.
3. 플라스미드
인간 코돈-최적화 SpCas9 발현 카세트 및 키메라 sgRNA의 발현을 유도하는 인간 U6 프로모터를 함유하는 px330(애드진(Addgene) 플라스미드 #42230) 내에 20bp 올리고뉴클레오티드 표적 서열을 클로닝시켜 sgRNA 발현 벡터를 구축하였다(sgRNA 서열에 대해 표 1 참조).
벡터를 표적화하는 3개 플라스미드 모두 약 2 x 800bp의 상동성 팔을 가지며, 상기 팔은 K562 세포로부터 단리된 게놈 DNA를 사용하여 상응하는 유전자좌의 PCR 증폭에 의해 생성하였다. 상동성 팔은 이어서 표준 클로닝 방법을 이용하여 pBluescript SK+를 기반으로 하는 약 2,900 염기쌍 벡터내에 클로닝하였다. 상동성 팔들 사이에서, HBB 및 CCR5 공여체는 둘 다 GFP의 발현을 유도하는 EF1α 프로모터를 함유한다. IL2RG 공여체는 프로모터가 결여되어 있으며 GFP 발현을 유도하는 IL2RG 유전자의 내인성 활성에 의존한다. IL2RG 표적화 벡터의 핵산 서열은 서열번호 1로 나타내었다. HBB 표적화 벡터의 핵산 서열은 서열번호 2로 나타내었다. CCR5 표적화 벡터의 핵산 서열은 서열번호 3으로 나타내었다.
4. 세포 배양 및 핵내도입
K562 및 T 세포를 37 ℃, 5% CO2, 및 주위 산소 수준에서 배양하였다. CD34+ 조혈 줄기/전구 세포(HSPC)는 37 ℃, 5% CO2, 및 5% O2에서 배양하였다. K562 세포는, 10% 소 성장 혈청, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 100 단위/ml 페니실린 및 2 mM L-글루타민으로 보충된 RPMI 1640(하이클론(HyClone))중에서 유지시켰다. K562 세포는 론자 뉴클레오펙터(Lonza Nucleofector) 2b(프로그램 T-016), 및 100 mM KH2PO4, 15 mM NaHCO3, 12 mM MgCl2 x 6H20, 8 mM ATP, 2 mM 글루코스를 함유하는 핵내도입 완충액(pH 7.4)을 사용하여 핵내도입시켰다. 핵내도입 조건: 100 ㎕ 핵내도입 용액, 106 세포, 1 내지 20 ㎍의 화학적으로 변형된 sgRNA, 1 내지 15 ㎍ Cas9 mRNA(Cas9 mRNA, 5meC, Ψ, 제품 코드: L-6125, 트라이링크 바이오테크놀로지스(TriLink BioTechnologies), 미국 캘리포니아주 샌디에이고), 2 ㎍ sgRNA/Cas9-암호화 플라스미드, 또는 5 ㎍ HR 공여체 플라스미드. CD3+ T 세포는 인간 Pan T 세포 단리 키트(밀테나이 바이오텍(Miltenyi Biotec), 미국 캘리포니아주 샌디에이고)를 사용하여 스탠포드 의과대학 혈액 센터(Stanford School of Medicine Blood Center)에서 입수한 백혈구연층으로부터 단리하였다. CD3+ 세포는, 5% 인간 혈청(시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스), 100 IU/mL 인간 재조합 IL-2(페프로테크(Peprotech), 미국 뉴저지주 로키힐), 및 10 ng/mL 인간 재조합 IL-7(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences), 미국 캘리포니아주 새너제이)로 보충된 X-VIVO 15(론자, 미국 메릴랜드주 워커스빌) 중에서 유지시켰다. 형질도입 전에, T 세포를 고정화된 항-CD3 항체(클론: OKT3, 이바이오사이언스(eBioscience), 미국 캘리포니아주 샌디에이고) 및 가용성 항-CD28 항체(클론: CD28.2, 이바이오사이언스)로 3일동안 활성화시켰다. 비-활성화 CD3+ T 세포의 경우, 세포를 단리 직후에 핵내도입시켰다. 론자 뉴클레오펙터 2b(프로그램 U-014) 및 인간 T 세포 뉴클레오펙터 키트(VPA-1002, 론자)를 사용하여 T 세포를 핵내도입시켰다. 핵내도입 조건: 100 ㎕ 핵내도입 용액, 106 세포, 10 내지 20 ㎍의 화학적으로 변형된 sgRNA, 15 내지 30 ㎍ Cas9(또는 15 ㎍ eGFP mRNA, 트라이링크 바이오테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 샌디에이고), 1 ㎍ sgRNA/Cas9-암호화 플라스미드. 가동화된 인간 말초혈 CD34+ HSPC는 올셀즈(AllCells)로부터 구입하고 제조사의 지시에 따라서 해동하였다. CD34+ HSPC는 SCF(100 ng/ml), TPO(100 ng/ml), Flt3-리간드(100 ng/ml), IL-6(100 ng/ml) 및 스템리게닌1(StemRegenin1)(0.75 mM)로 보충된 X-VIVO 15(론자)중에서 유지시켰다. CD34+ HSPC는 론자 4D-뉴클레오펙터(프로그램 EO-100) 및 P3 1차 세포 4D-뉴클레오펙터 키트(V4XP-3024)를 사용하여 핵내도입시켰다. 핵내도입 조건: 100 ㎕ 핵내도입 용액, 5x105 세포, 10 ㎍의 화학적으로 변형된 sgRNA, 15 ㎍ Cas9 mRNA, 1 ㎍ 플라스미드. Cas9 RNP 실험을 위해, Cas9 단백질을 PNA 바이오(PNA Bio)(미국 캘리포니아주 사우전드 오크스) 또는 라이프 테크놀로지스(미국 캘리포니아주 칼즈배드)로부터 구입하였다. 도 8을 제외하고 모든 RNP 실험에, PNA 바이오로부터 구입한 Cas9 단백질을 사용하였다. Cas9 단백질은 25 ℃에서 1:2.5의 Cas9:sgRNA 몰비로 10분동안 sgRNA와 복합체화시켰다. RNP를, 100 ㎕의 각각의 핵내도입 용액중에서 106 세포로 전술한 바와 같이 K562 세포 또는 T 세포 내에 핵내도입시켰다. 이중 sgRNA 실험을 위해, 총 sgRNA 양은 10 ㎍(개별적으로 사용되는 경우 10 ㎍ 및 함께 사용되는 경우 2x5 ㎍)이었다. T 세포 및 CD34+ HSPC 둘 다에 있어서, sgRNA를 15 ㎍ Cas9 mRNA로 106 세포 내에 핵내도입시켰다. T 세포 핵내도입은 상기와 같이 수행한 반면, CD34+ HSPC의 핵내도입은 론자 뉴클레오펙터 2b(프로그램 U-014) 및 인간 T 세포 뉴클레오펙터 키트(VPA-1002, 론자)를 사용하여 T 세포 핵내도입과 유사하였다. 핵내도입 직후에 CD34+ HSPC를 30 ℃에서 24 시간동안 배양한 후, 이들을 게놈 DNA 채취까지 37 ℃로 옮겼다.
5. 유세포분석 및 형광 활성화 세포 분류( FACS )
HR 실험을 위해, 에피솜 플라스미드로부터 남은 eGFP 발현이 없을 때 세포 유형에 따라서 핵내도입 2 내지 3 주 후에 세포를 분석하였다. eGFP 발현은 어큐리(Accuri) C6 유세포분석기(비디 바이오사이언시즈, 미국 캘리포니아주 새너제이) 상에서 측정하였다. 세포 사멸은 라이브/데드 정착성 적혈구 사멸 세포 염색 키트(LIVE/DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit)(라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 칼즈배드)로 제조사의 지시에 따라서 측정하였으며, 세포는 어큐리 C6 유세포분석기에서 분석하였다. CD3+ T 세포의 CD4+ 및 CD8+ 집단으로의 분류를 위해, 세포를 PE-Cy7 항-인간 CD4(클론: RPA-T4, 톤보 바이오사이언시즈(Tonbo Biosciences), 미국 캘리포니아주 샌디에이고) 및 APC 항-인간 CD8a(클론: RPA-T8, 톤보 바이오사이언시즈)의 혼합물로 염색하고, 2개의 집단을 FACS Aria II SORP 상에서 분류하였다.
6. TIDE 및 T7 분석을 이용한 대립유전자 변형 빈도의 측정
TIDE 및 T7 분석을 위해, 핵내도입 3일 후에(달리 나타내지 않은 경우) 퀵익스트랙트 DNA 추출 용액(QuickExtract DNA Extraction Solution)(에피센터(Epicentre), 미국 위스콘신주 매디슨)을 제조사의 지시에 따라 사용하여 세포로부터 gDNA를 추출하였다. sgRNA 게놈 표적 부위에 걸쳐있는 PCR 앰플리콘을 하기의 프라이머 쌍을 사용하여 아이프루프 하이-피델리티 마스터 믹스(iProof High-Fidelity Master Mix)(바이오-래드(Bio-Rad), 미국 캘리포니아주 허큘러스)를 사용하여 생성하였다:
IL2RG_fw (서열번호 84): 5'-TCACACAGCACATATTTGCCACACCCTCTG-3',
IL2RG_RV (서열번호 85): 5'-TGCCCACATGATTGTAATGGCCAGTGG-3',
HBB_fw (서열번호 86): 5'-CCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAG-3',
HBB_rv (서열번호 87) 5'-AGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAG-3',
CCR5_fw (서열번호 88): 5'-GCACAGGGTGGAACAAGATGG-3',
CCR5_rv (서열번호 89): 5'-CACCACCCCAAAGGTGACCGT-3'
T7 분석을 위해, PCR 앰플리콘을 정제하고 200 ng를 터모사이클러(thermocycler)에서 변성시키고 재-어닐링시키고, T7 엔도뉴클레아제 I(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 월섬)로 제조사의 프로토콜에 따라서 절단하였다. 절단된 DNA를 4 내지 20% TBE 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시키고, 다이아몬드 핵산 염료(Diamond Nucleic Acid Dye)(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주 매디슨)로 염색하고, 케미독(ChemiDoc) XRS+(바이오-래드) 상에서 가시화시켰다. 이미지 랩 소프트웨어(Image Lab Software)(바이오-래드)를 사용하여 밴드 강도를 분석하고, 대립유전자 변형 빈도를 식: 100 x (1 - (1 - 절단 분획)^0.5)을 이용하여 산출하였다. TIDE(Tracking of In/dels by Decomposition, Brinkman et al., Nucleic Acids Research 42, e168 (2014))를 사용하여 대립유전자 변형 빈도를 분석하기 위해, 정제된 PCR 산물을 2개 프라이머를 모두 사용하여 생거(Sanger)-서열분석하고, 각각의 서열 크로마토그램을 웹사이트 tide.nki.nl에서 이용가능한 온라인 TIDE 소프트웨어로 분석하였다. 분석은 모의-형질감염된 샘플로부터 기준 서열을 사용하여 수행하였다. 파라미터들은, 높은 질의 추적하에 최대 가능한 창을 포괄하기 위해 10개 뉴클레오티드의 최대 in/del 크기 및 분해 창으로 설정하였다. 3.5%의 검출 민감도 미만의 모든 TIDE 분석은 0%로 설정하였다. TOPO-클로닝된 PCR 단편의 서열분석을 위해, 72 ℃ 어닐링 온도 및 2 분의 연장 시간을 포함한 25 주기하에 아이프루프 하이-피델리티 마스터 믹스 및 프라이머 5'-GGCTGTTGTCATCTATGACCTTCCC-3'(서열번호 90) 및 5'-TGTAAACTGAGCTTGCTCGCTCG-3'(서열번호 91)를 사용하여 절단 부위에 걸쳐있는 2.1kb 앰플리콘(WT 크기)을 생성하였다. PCR 반응 생성물들은 제로 블런트 토포 PCR 클로닝 키트(Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit)(라이프 테크놀로지스)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 플라스미드내에 직접 서브클로닝하였다. TOPO 반응물은 XL-1 블루 반응능 세포로 형질전환시키고, 카나마이신을 함유한 아가 플레이트 상에 플레이팅하고, 단일 콜로니들을 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification)에 의해 McLab(미국 캘리포니아주 사우스샌프란시스코)에 의해 플레이트로부터 직접 서열분석한 후 프라이머 5'-GCACAGGGTGGAACAAGATGG-3'(서열번호 92)를 사용하여 서열분석하였다.
7. 증식 분석
핵내도입후 T 세포의 증식을 측정하기 위해, 셀타이터-글로(CellTiter-Glo) 2.0 분석(프로메가, 미국 위스콘신주 매디슨)을 이용하였다. 핵내도입 직후에, T 세포를 다중 96-웰 U-바닥 96-웰 플레이트에 3x104 세포/웰로 옮겼다. 핵내도입 직후 및 24 시간 간격으로, 세포들을 100 ㎕ 배지중에서 백색 96-웰 플레이트로 옮기고 100 ㎕ 셀타이터-글로 2.0을 제조사의 지침에 따라 가하였다. 발광을 1 초의 노출 시간을 사용하여 테칸 인피니트 200 프로(Tecan Infinite 200 PRO)(테칸, 스위스 맨네도르프) 상에서 판독하였다.
8. 게놈 변형의 효율 및 특이성을 정량화하기 위한 심층 서열분석
각각의 유전자 표적화 실험을 위해, 형질감염 48 시간후에 다양한 CRISPR-처리된 K562 세포 및 대조군 K562 세포로부터 게놈 DNA를 추출하였다. CRISPR 표적 및 3개의 표적이탈(표 2) 측면에 위치한 게놈 영역들을 2회의 PCR에 의해 증폭시켜 (처리-특이적) 바코드 및 일루미나(Illumina) 서열분석 어댑터를 부착시켰다(표 3). 바코드된 PCR 앰플리콘을 동몰로 모으고, 스핀-컬럼으로 정제하고, 일루미나 MiSeq DNA 서열분석기 플랫폼에서 서열분석하였다. 추가의 세부사항에 대해서는 하기의 "9. 심층 서열분석을 위한 CRISPR 표적적중 및 예측된 표적이탈 앰플리콘의 생성" 단락을 참고하시오.
표 2는 PCR 앰플리콘의 심층 서열분석에 의해 정보를 얻은 표적적중 및 표적이탈 유전자좌의 목록을 제공한다. CCR5, HBB, 및 IL2RG-표적화 CRISPR 실험을 위해, 의도된 게놈 표적 서열('ON') 및 3개의 컴퓨터로 예측된 표적이탈 서열("OFF1-3")을 이의 게놈 위치(인간 게놈 구성 조립체 hg38)와 함께 나타내었다. 선택된 표적이탈 서열들은, COSMID에 의해 유의적 활성을 갖는 것으로 유일하게 예측된 HBB-OFF3을 제외하고, COSMID [Cradick et al., Molecular therapy. Nucleic acids 3, e214 (2014)] 및 최적 CRISPR 디자인(Optimized CRISPR Design)[Hsu et al., Nature Biotechnology, 31, 827-832 (2013)] 웹툴(MIT 설계) 둘 다에 의해 최고-득점원으로 예측되었다. 예측된 표적 활성은 COSMID 점수값이 증가하고 "MIT 디자인" 점수값이 감소함에 따라 증가한다. 표적이탈 서열들내 PAM 부위 및 불일치서열은 각각 적색 및 굵은 활자로 표시되어 있다.
PCR 앰플리콘의 심층 서열분석에 의해 정보를 얻은 표적적중 및 표적이탈 유전자좌의 목록
서열번호 표적
ID 		표적 부위 서열 (5'→ 3') 게놈 위치 가닥 표적 점수
COSMID MIT
디자인
CCR5 표적화 가이드 RNA
서열번호 20 ON GGCAGCATAGTGAGCCCAGAAGG Chr3:46373153-46373175 - 0 56
서열번호 21 OFF1 ATCATCATAGTGAGCCCAGAG A G Chr3:15440658-15440680 + 0.44 2.4
서열번호 22 OFF2 ACCAGCAGAGTGAGCCCAGAGGG Chr4:3744369-3744391 + 0.52 2.6
서열번호 23 OFF3 AGGAGCAGAGTGAGCCCAGAG A G Chr15:92469456-92469478 + 0.54 2.6
HBB 표적화 가이드 RNA
서열번호 24 ON CTTGCCCCACAGGGCAGTAACGG Chr11:5226968-5226990 + 0 65
서열번호 25 OFF1 TCAGCCCCACAGGGCAGTAAGGG Chr9:101833584-101833606 + 0.4 2.3
서열번호 26 OFF2 CCTCTCCCACAGGGCAGTAAAGG Chr17:68628098-68628120 - 0.49 2.4
서열번호 27 OFF3 TTTTCCCCAAAGGGCAGTAATAG Chr13:109165988-109166010 + 0.79 N/A
IL2RG 표적화 가이드 RNA
서열번호 28 ON TGGTAATGATGGCTTCAACATGG ChrX:71111519-71111541 + 0 49
서열번호 29 OFF1 TGGGAAGGATGGCTTCAACAC A G Chr7:151485304-151485326 - 0.4 3.9
서열번호 30 OFF2 TGGTGAGGATGGCTTCAACACGG Chr1:167730172-167730194 - 0.42 3.7
서열번호 31 OFF3 TGGTAATGATGACTTCAACATAG Chr3:72764801-72764823 - 0.8 49.2
표 3은 심층 서열분석에 의해 in/del 빈도를 정량화하기 위한 표적적중 및 표적이탈 앰플리콘의 생성에 사용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 목록을 나타낸 것이다. 유전자-특이적 앰플리콘 프라이머들의 유전자-특이적 하이브리드화 서열 및 일루미나 바코드화 프라이머들의 바코드는 각각 밑줄 및 굵은 활자로 표시되어 있다.
Figure 112017109200677-pct00001
Figure 112017109200677-pct00002
유전자-특이적 앰플리콘 프라이머들의 유전자-특이적 하이브리드화 서열 및 일루미나 바코드화 프라이머들의 바코드는 각각 밑줄 및 굵은 활자로 표시되어 있다.
서열분석 데이터의 분석을 위해, 상이한 처리들로부터 수득된 판독물들을 이의 상응하는 처리 바코드에 의해 저장처리하고 디폴트 파라미터하에 BWA-MEM[Li et al., Bioinformatics 26, 589-595 (2010)](bwa-0.7.10)을 사용하여 게놈으로 지도화하였다. 일치하지 않는 쌍을 이룬 말단 지도들(>1Kbp 이격된)을 BWA-MEM에서 디폴트 파라미터에 의해 정의된 바와 같은 낮은 질의 지도화되고 2차로 정렬된 판독물들과 함께 분석으로부터 걸러냈다. 표적적중 및 표적이탈 영역 각각에 대해, 예측된 절단-부위 주위의 in/del을 갖는 판독물들의 %를 산출하였으며, 이때 상기 예측된 절단-부위는 PAM 부위 위쪽으로 3번째 및 4번째 위치 사이인 것으로 추정된다. 게놈내 각각의 위치에 대한 in/del %는 in/del[i] = (I[i]+D[i])/C[i]를 사용하여 산출하였고, 여기서 D[i] 및 I[i]는 각각 위치 i에서 임의 크기의 결실 또는 삽입을 갖는 판독물의 수를 나타내고, C[i]는 위치 i를 포함하는 임의의 게놈 간격으로 지도화된 판독물의 수를 나타낸다. 이어서, 각 표적에 대한 in/del %를 in/del[c]에 의해 산출하였으며, 여기서, c는 PAM 부위 위쪽으로 4번째 위치인 예상 절단-부위이다. 위치 4에 호모-뉴클레오티드 서열, IL2Rg에 "AA" 및 CCR5에 "CCC", 및 삽입을 갖는 경우에, BWA_MEM 정렬자는 삽입된 뉴클레오티드의 위치를 분석할 수 없다. 이것은 위치 4 대신에 구체적으로 IL2Rg 및 CCR5 표적이탈 영역에 대해 각각 위치 3 및 6을 취하여 정렬 기록에서 상대 위치를 취함으로써 교정되었다.
9. 심층 서열분석을 위한 CRISPR 표적적중 및 예측된 표적이탈 앰플리콘의 생성
각각의 표적화 유전자좌에 대해, 1 ㎍ 또는 20 ㎍의 합성 가이드 RNA(비변형, M, MS 또는 MSP) 및 2 ㎍의 Cas9 발현 플라스미드(PX330), sgRNA 및 Cas9 단백질 둘 다를 암호화하는 sgRNA 플라스미드 2 ㎍(양성 대조군), 또는 2 ㎍의 PX330 단독(Cas9 단독, 음성 대조군)으로 106 K562 세포를 형질감염시켰다. 또한, IL2RG 유전자좌를 표적화하는 실험을 위해, 15 ㎍ Cas9 mRNA 및 10 ㎍의 합성 가이드 RNA(비변형 또는 MS), 7.6 ㎍의 합성 가이드 RNA(비변형 또는 MS)와 사전-복합체화된 15 ㎍ Cas9 단백질로 106 K562 세포를 형질감염시켰다. 이들 샘플 및 모의 형질감염 샘플로부터의 게놈 DNA(제 2 음성 대조군)를 형질감염 72 시간 후에 퀵익스트랙트™ DNA 추출 용액(에피센터, 미국 위스콘신주 매디슨)을 제조사의 설명서에 따라서 사용하여 추출하였다. PfuUltra II HS 2x 마스터 믹스(애질런트 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 산타클라라), 및 MiSeq(일루미나, 미국 캘리포니아주 샌디에이고) 플랫폼에 의한 심층 서열분석에 사용된 서열분석 프라이머(표 3)를 갖는 앰플리콘 말단을 표지화하는 유전자-특이적 프라이머를 사용하여, 표적적중 및 3개의 컴퓨터로 예측된 표적이탈 유전자좌(표 2)의 PCR 증폭에 대한 주형으로 40 ng의 게놈 DNA를 사용하였다. 표적적중 및 표적이탈 앰플리콘(표 4) 상에서 2차 PCR 반응을 수행하여 추가의 일루미나 서열분석 어댑터(즉, P5, P7) 및 주문제작된 이중 8-bp 바코드를 부가하여, 상응하는 형질감염 처리를 독특하게 식별하였다. 2차 PCR 후에, 바코드된 앰플리콘을 애질런트 D1000 테이프스테이션(TapeStation)에 의해 정량화하고, 동몰 농도로 모은 후 키아퀵 PCR 정제 키트(QIAquick PCR Purification Kit)(키아겐(Qiagen), 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 정제하였다. 정제된 라이브러리를 일루미나 MiSeq DNA 서열분석기 상에서, NGS DNA 서열분석 서비스(세크마틱(Seqmatic), 미국 캘리포니아주 프리몬트)에 의한 이중 지수화 하에 2 x 201 주기로 서열분석하였다.
표 4는 in/del 빈도의 심층 서열분석을 위해 생성된 CCR5, HBB, 및 IL2RG 표적적중 및 표적이탈 앰플리콘의 목록을 나타낸 것이다. (비편집 게놈 DNA의) 앰플리콘 크기는 표적 부위로부터 유전자-특이적 프라이머의 하이브리드화 서열까지 최소 50bp 하에 183 내지 220 bp 범위이다. 게놈 DNA로부터 앰플리콘 생성에 사용된 하이브리드화 서열들 및 추정 CRISPR-표적 부위는 각각 밑줄 및 굵은 활자로 표시되어 있다.
Figure 112017109200677-pct00003
Figure 112017109200677-pct00004
(비편집 게놈 DNA의) 앰플리콘 크기는, 표적 부위로부터 유전자-특이적 프라이머의 하이브리드화 서열까지 최소 50 bp 하에 183 내지 220 bp의 범위이다. 게놈 DNA로부터 앰플리콘 생성에 사용된 하이브리드화 서열들 및 추정 CRISPR-표적 부위는 각각 밑줄 및 굵은 활자로 표시되어 있다.
10. 화학적으로 변형된 sgRNA의 표적적중 및 표적이탈 활성
표 5는 도 1c, 1e 및 5의 기반이 되는 숫자들을 나타낸다. 2 ㎍ Cas9 플라스미드 및 1 ㎍ sgRNA(위 패널) 또는 20 ㎍ sgRNA(아래 패널)를 사용하여 도 1c에서 수행된 바와 같이 합성 sgRNA에 의해 매개된 표적화 절단의 특이성. in/del 빈도는 표적 게놈 유전자좌 및 각각의 유전자에 대한 3개의 생물정보학적으로 예측된 표적이탈 유전자좌로부터 PCR 앰플리콘의 심층 서열분석에 의해 측정하였다. 평균 값들은 +/-SEM, n=3으로 나타내었다.
Figure 112017109200677-pct00005
Figure 112017109200677-pct00006
실시예 2. 화학적으로 변형된 가이드 RNA 및 합성 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 (ssODN) 주형을 사용한 CRISPR / Cas9 -기반 상동적 재조합
3명의 상이한 공여체들로부터의 자극된 인간 1차 T 세포를 10 ㎍ CCR5 sgRNA(비변형 또는 MS), 15 ㎍ Cas9 mRNA, 및 2.81 ㎍의 183nt CCR5 ssODN(양쪽 말단에서의 3개 말단 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트("PS") 결합을 갖거나 갖지 않는)으로 핵내도입시켰다. ssODN은 WT CCR5 서열에는 존재하는 않는 중심 HindIII 제한효소 부위를 함유하였다. 핵내도입 3일 후에 게놈 DNA(gDNA)를 추출하고, 표적 부위에 걸쳐있는(ssODN에 상동성인 서열 밖의) PCR 산물들을 생성하고 HindIII로 절단하였다. 제한효소 단편들을 2% TBE 아가로스 겔 상에서 분석하고 HDR 빈도를 산출하였다.
도 21은 HDR 실험으로부터의 아가로스 겔을 나타낸다. HDR 빈도는 변형된 sgRNA가 사용된 경우 증가하였다. 또한, HDR 빈도는 ssODN이 양쪽 말단에서의 3개 말단 뉴클레오티드들 사이에 포스포로티오에이트 결합을 함유한 경우에 더 증가하였다.
상기 본 발명을 명확한 이해를 위해 예시 및 실시예로써 다소 상세히 기술하였지만, 당해 분야의 기술을 가진 자라면 특정한 변화 및 변경이 첨부된 특허청구범위의 범위 안에서 실시될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 본원에 제공된 각각의 참조문헌은 각각의 참조문헌이 개별적으로 참고로 도입되는 바와 동일한 정도로 전체로 참고로 도입된다.
비공식적 서열 목록
서열번호 1
IL2RG 표적화 벡터 서열
Figure 112017109200677-pct00007
Figure 112017109200677-pct00008
IL2RG 상동성 팔은 굵은 활자 및 이탤릭체로 표시되어 있다. 키메라 인트론은 밑줄로 표시되어 있다. GFP 서열은 대문자 및 이탤릭체로 표시되어 있다. BGH 폴리(A) 서열은 이중-밑줄로 표시되어 있다.
서열번호 2
HBB 표적화 벡터 서열
Figure 112017109200677-pct00009
Figure 112017109200677-pct00010
HBB 상동성 팔은 굵은 활자 및 이탤릭체로 표시되어 있다. EF1α 프로모터는 밑줄로 표시되어 있다. GFP 서열은 대문자 및 이탤릭체로 표시되어 있다. BGH 폴리(A) 서열은 이중-밑줄로 표시되어 있다.
서열번호 3
CCR5 표적화 벡터 서열
Figure 112017109200677-pct00011
Figure 112017109200677-pct00012
HBB 상동성 팔은 굵은 활자 및 이탤릭체로 표시되어 있다. EF1α 프로모터는 밑줄로 표시되어 있다. GFP 서열은 대문자 및 이탤릭체로 표시되어 있다. WPRE 서열은 파선 밑줄로 표시되어 있다. BGH 폴리(A) 서열은 이중-밑줄로 표시되어 있다.
서열번호 4 내지 19
표 1 참조
서열번호 20 내지 31
표 2 참조
서열번호 32 내지 71
표 3 참조
서열번호 72 내지 83
표 4 참조
서열번호 84
IL2RG_fw: 5'-TCACACAGCACATATTTGCCACACCCTCTG-3'
서열번호 85
IL2RG_RV: 5'-TGCCCACATGATTGTAATGGCCAGTGG-3'
서열번호 86
HBB_fw: 5'-CCAACTCCTAAGCCAGTGCCAGAAGAG-3'
서열번호 87
HBB_rv: 5'-AGTCAGTGCCTATCAGAAACCCAAGAG-3'
서열번호 88
CCR5_fw: 5'-GCACAGGGTGGAACAAGATGG-3'
서열번호 89
CCR5_rv: 5'-CACCACCCCAAAGGTGACCGT-3'
서열번호 90
5'-GGCTGTTGTCATCTATGACCTTCCC-3'
서열번호 91
5'-TGTAAACTGAGCTTGCTCGCTCG-3'
서열번호 92
5'-GCACAGGGTGGAACAAGATGG-3'
SEQUENCE LISTING <110> The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Agilent Technologies, Inc. <120> CHEMICALLY MODIFIED GUIDE RNAS FOR CRISPR/CAS-MEDIATED GENE REGULATION <130> 079445-000520PC-1004539 <140> PCT/US2016/026028 <141> 2016-04-05 <150> US 62/143,729 <151> 2015-04-06 <150> US 62/160,545 <151> 2015-05-12 <160> 92 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5688 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL2RG targeting vector sequence <400> 1 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600 taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccta 660 actataacgg tcctaaggta gcgattaatt aatgggagaa acaccacaga agcagagtgg 720 gttatattct ctgggtgaga gagggggaga aattgaagct gattctgagg tttcaagtct 780 gggtgactga gagggtgacg ataccattga ctgaggtggg gaaggcagga agagaagcag 840 agttggggga agatgggaag cttgaagcta gtattgttgt tcctccattt ctagaatatt 900 tttgtattat aagtcacact tcctcgccag tctcaacagg gacccagctc aggcagcagc 960 taagggtggg tattctggtt tggattagat cagaggaaag acagctgtat atgtgcccac 1020 aggagccaag acggtatttt ccatcctccc aaaacagtag agctttgaca gagatttaag 1080 ggtgaccaag tcaaggaaga ggcatggcat agaacggtga tgtcgggggt gggggttcag 1140 aacttccatt atagaaggta atgatttaga ggagaaggtg gttgagaatg gtgctagtgg 1200 tagtgaacag atccttccca ggatctaggt gggctgagga tttttgagtc tgtgacacta 1260 ttgtatatcc agctttagtt tctgtttacc accttacagc agcacctaat ctcctagagg 1320 acttagcccg tgtcacacag cacatatttg ccacaccctc tgtaaagccc tggtttataa 1380 ggttctttcc accggaagct atgacagagg aaacgtgtgg gtggggaggg gtagtgggtg 1440 agggacccag gttcctgaca cagacagact acacccaggg aatgaagagc aagcgcctct 1500 agaattaccc tgttatccct aaggtaagta tcaaggttac aagacaggtt taaggaggcc 1560 aatagaaact gggcttgtcg agacagagaa gattcttgcg tttctgatag gcacctattg 1620 gtcttactga catccacttt gcctttctct ccacaggggt accgaagccg ctagcgctac 1680 cggtcgccac catgcccgcc atgaagatcg agtgccgcat caccggcacc ctgaacggcg 1740 tggagttcga gctggtgggc ggcggagagg gcacccccga gcagggccgc atgaccaaca 1800 agatgaagag caccaaaggc gccctgacct tcagccccta cctgctgagc cacgtgatgg 1860 gctacggctt ctaccacttc ggcacctacc ccagcggcta cgagaacccc ttcctgcacg 1920 ccatcaacaa cggcggctac accaacaccc gcatcgagaa gtacgaggac ggcggcgtgc 1980 tgcacgtgag cttcagctac cgctacgagg ccggccgcgt gatcggcgac ttcaaggtgg 2040 tgggcaccgg cttccccgag gacagcgtga tcttcaccga caagatcatc cgcagcaacg 2100 ccaccgtgga gcacctgcac cccatgggcg ataacgtgct ggtgggcagc ttcgcccgca 2160 ccttcagcct gcgcgacggc ggctactaca gcttcgtggt ggacagccac atgcacttca 2220 agagcgccat ccaccccagc atcctgcaga acgggggccc catgttcgcc ttccgccgcg 2280 tggaggagct gcacagcaac accgagctgg gcatcgtgga gtaccagcac gccttcaaga 2340 cccccatcgc cttcgccaga tctcgagctc gatgactcga gggcgcgccc cgctgatcag 2400 cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 2460 tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 2520 attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg 2580 aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg 2640 cggaaagaac gtttaaacac tagtgaagag caagcgccat gttgaagcca tcattaccat 2700 tcacatccct cttattcctg cagctgcccc tgctgggagt ggggctgaac acgacaattc 2760 tgacgcccaa tgggaatgaa gacaccacag ctggtgggaa atctgggact ggagggggct 2820 ggtgagaagg gtggctgtgg gaaggggccg tacagagatc tggtgcctgc cactggccat 2880 tacaatcatg tgggcagaat tgaaaagtgg agtgggaagg gcaaggggga gggttccctg 2940 cctcacgcta cttcttcttt ctttcttgtt tgtttgtttc tttctttctt ttgaggcagg 3000 gtctcactat gttgcctagg ctggtctcaa actcctggcc tctagtgatc ctcctgcctc 3060 agcctttcaa agcaccagga ttacagacat gagccaccgt gcttggcctc ctccttctga 3120 ccatcatttc tctttccctc cctgccttca ttttctcccc aatctagatt tcttcctgac 3180 cactatgccc actgactccc tcagtgtttc cactctgccc ctcccagagg ttcagtgttt 3240 tgtgttcaat gtcgagtaca tgaattgcac ttggaacagc agctctgagc cccagcctac 3300 caacctcact ctgcattatt ggtatgagaa gggacgaggg ggaggggatg aagaagaggt 3360 gggttggatc agagaccaag agagagggta gcaagtctcc caggtacccc actgttttct 3420 cctggggtaa gtcataagtc ggtgccattt cattacctct ttctccgcac ccgacataga 3480 tgagctccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaattgc gcgcttggcg taatcatggt 3540 catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg 3600 gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt 3660 tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg 3720 gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 3780 actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 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gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa 5520 aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt 5580 attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga 5640 aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccac 5688 <210> 2 <211> 7171 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HBB targeting vector sequence <400> 2 ctaaattgta agcgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc 60 attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga 120 gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga acgtggactc 180 caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc 240 ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag 300 cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa 360 agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac 420 cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcc cattcgccat tcaggctgcg 480 caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540 gggatgtgct 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P5-BC_C-fwd primer sequence <400> 58 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg tagcactcga caggttcaga gttctacagt 60 ccgacgatc 69 <210> 59 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P5-BC_D-fwd primer sequence <400> 59 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacg ctcatagcga caggttcaga gttctacagt 60 ccgacgatc 69 <210> 60 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P5-BC_E-fwd primer sequence <400> 60 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca tgcatcgcga caggttcaga gttctacagt 60 ccgacgatc 69 <210> 61 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P5-BC_F-fwd primer sequence <400> 61 aatgatacgg cgaccaccga gatctacaca gtcgatccga caggttcaga gttctacagt 60 ccgacgatc 69 <210> 62 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P5-BC-G_fwd primer sequence <400> 62 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc actgtgacga caggttcaga gttctacagt 60 ccgacgatc 69 <210> 63 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P5-BC-H_fwd primer sequence <400> 63 aatgatacgg cgaccaccga gatctacacc gagtatccga caggttcaga gttctacagt 60 ccgacgatc 69 <210> 64 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P7-BC-A_rev primer sequence <400> 64 caagcagaag acggcatacg agattagagc tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatct 66 <210> 65 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P7-BC_B rev primer sequence <400> 65 caagcagaag acggcatacg agattcatag cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatct 66 <210> 66 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P7-BC_C rev primer sequence <400> 66 caagcagaag acggcatacg agatgtagca ctgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatct 66 <210> 67 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P7-BC_D rev primer sequence <400> 67 caagcagaag acggcatacg agatgctcat aggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatct 66 <210> 68 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P7-BC_E_rev primer sequence <400> 68 caagcagaag acggcatacg agatatgcat cggtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatct 66 <210> 69 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P7-BC_F_rev primer sequence <400> 69 caagcagaag acggcatacg agatagtcga tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatct 66 <210> 70 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P7-BC-G_ rev primer sequence <400> 70 caagcagaag acggcatacg agatcactgt gagtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatct 66 <210> 71 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic P7-BC-H_rev primer sequence <400> 71 caagcagaag acggcatacg agatcgagta tcgtgactgg agttcagacg tgtgctcttc 60 cgatct 66 <210> 72 <211> 228 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CCR5 ON target amplicon <400> 72 caaacacagc atggacgaca gccaggtacc tatcgattgt caggaggatg atgaagaaga 60 ttccagagaa gaagcctata aaatagagcc ctgtcaagag ttgacacatt gtatttccaa 120 agtcccactg ggcggcagca tagtgagccc agaaggggac agtaagaagg aaaaacaggt 180 cagagatggc caggttgagc aggtagatgt cagtcatgct cttcagcc 228 <210> 73 <211> 225 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CCR5 OFF1 target amplicon <400> 73 ggggaagcag tctggactta gaaaggaaat aggtggtctg tcataggggc tttcattaga 60 gttaaacttc atagagtcaa ctgtttcatc atcatagtga gcccagagag ccactgccca 120 gcagcatgct cacaccacct accctagtgt aggtaatagg tctacgctag gaccccgtgc 180 tgggctctca gcccatcatg agattttggt ggatttaatg gcagg 225 <210> 74 <211> 183 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CCR5 OFF2 target amplicon <400> 74 agcgagtcga gttcaggtgg gagcagaggg cgcccaccag cagagcgagt cgagtccagg 60 cgggagcaga gggcgcacac cagcagagtg agcccagagg gtttaaagaa ggggcggtct 120 ctacggtatg ggtagagtca ggggaactag gaaaggacag agcagaacct ggggtaggta 180 gcc 183 <210> 75 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic CCR5 OFF3 target amplicon <400> 75 tctcaccaac actgccgaat gtcatctctt ctcatcttta tctctattct ttgcttcctg 60 tcttcagggc tcttcccttg gcattcacca ggagcagagt gagcccagag agctgagtgg 120 tatcccttct tcttgggtcc ctgagccctg acctggagca atgctgtgag acagcaggaa 180 aggaggggag tgtggagtgg ggagcactat atgcca 216 <210> 76 <211> 229 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HBB ON target amplicon <400> 76 tctgtctcca catgcccagt ttctattggt ctccttaaac ctgtcttgta accttgatac 60 caacctgccc agggcctcac caccaacttc atccacgttc accttgcccc acagggcagt 120 aacggcagac ttctcctcag gagtcagatg caccatggtg tctgtttgag gttgctagtg 180 aacacagttg tgtcagaagc aaatgtaagc aatagatggc tctgccctg 229 <210> 77 <211> 230 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HBB OFF1 target amplicon <400> 77 tcccgttctc cacccaatag ctatggaaag gggaagatcc cagagaactt ggataggaaa 60 ggtgaagtca gagcagtgct tcagccccac agggcagtaa gggcagcctt cctctaaata 120 ccagattccc aaatctggct gtgctttcaa tttgggagtt ggacatactg ctaaactata 180 atttcttagg ccgtacctaa aatatattat ggaagcatag cctggaaatc 230 <210> 78 <211> 229 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HBB OFF2 target amplicon <400> 78 gttggcaggg agacttacca gcttcccgta tctccctcca catggaggca ggacacgctc 60 tggccttgcc caccctccca ctagcctctc ccacagggca gtaaaggtga gtctgggaga 120 aagaaccggt cagacttagt tcagctccac cctttcctcc tgggagtgag tctttccaag 180 acagagcatg tttttttcta cccctcagtg agaacagtcg taccatggg 229 <210> 79 <211> 220 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic HBB OFF3 target amplicon <400> 79 tggggccttc aagtgttctt cccaagagtc agagtgaacc agaaccaaga accatgttga 60 gttgcccaga tgtaaccagg cctacaggta cctgggagaa acacgtgtac attttcccca 120 aagggcagta atagcatcct aggcttcaaa acattcatag aaaccatttt tcaaatgcaa 180 agtccaacac agttagaaat aaccaggcat aggagcacac 220 <210> 80 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL2RG ON target amplicon <400> 80 cattgggcgt cagaattgtc gtgttcagcc ccactcccag caggggcagc tgcaggaata 60 agagggatgt gaatggtaat gatggcttca acatggcgct tgctcttcat tccctgggtg 120 tagtctgtct gtgtcaggaa cctgggtccc tcacccacta cccctcccca cccacacgtt 180 tcctctgtca tagcttccgg tggaaagaac ct 212 <210> 81 <211> 219 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL2RG OFF1 target amplicon <400> 81 tccggaagtt attcaagtct gattttcttt cctcccttgt cagggaaaag aagttgtgac 60 aaattgcttg gatccttaag cttaagtggg aaggatggct tcaacacaga acatctgttt 120 cattgctgtt ttatccgtca gtaaaactgt tacttctttt atgtactaaa agttcttagc 180 acttaactaa tattagctct ttgtgctctg atgccagac 219 <210> 82 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL2RG OFF2 target amplicon <400> 82 cctgggccat atcaagagac tctgcctcaa aaaagaaaag aaagaaagaa aaagaaaaaa 60 aaaagaacat cattaaaaat ccctgaggag catttagagt attgggtggc acaaacagat 120 tctgcatgat tggtgaggat ggcttcaaca cggcagcttt attcctcttt aacagagtca 180 gcagcatcaa ggcatgaggg atcttggcac aaacatcacc ccaaaga 227 <210> 83 <211> 221 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic IL2RG OFF3 target amplicon <400> 83 cacaacagtt gacccaggaa cagggggaac ctcccaccat tcccatccca ctgtttgatc 60 agatccaaga atccacaata ttgagagtga atgaaaagtg tcagctggta atgatgactt 120 caacatagtc agaactcttt ggggtgttcc aaacatcatg gtgcatatgt attacctggg 180 agtcttgtta aaaagactcc tgttcagaga cctgggttgg g 221 <210> 84 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic IL2RG_fw primer <400> 84 tcacacagca catatttgcc acaccctctg 30 <210> 85 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic IL2RG_RV primer <400> 85 tgcccacatg attgtaatgg ccagtgg 27 <210> 86 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic HBB_fw primer <400> 86 ccaactccta agccagtgcc agaagag 27 <210> 87 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CCR5_fw primer <400> 87 agtcagtgcc tatcagaaac ccaagag 27 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic CCR5_rv primer <400> 88 gcacagggtg gaacaagatg g 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 89 caccacccca aaggtgaccg t 21 <210> 90 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 90 ggctgttgtc atctatgacc ttccc 25 <210> 91 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 91 tgtaaactga gcttgctcgc tcg 23 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 92 gcacagggtg gaacaagatg g 21

Claims (50)

  1. (a) 표적 핵산에 상보적인 제 1 뉴클레오티드 서열 및 CRISPR-연관 단백질(Cas) 폴리펩티드와 상호작용하는 제 2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변형된 단일 가이드 RNA(sgRNA); 및
    (b) Cas 폴리펩티드, Cas 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA, 및/또는 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터
    를 1차 세포 내에 도입하는 것을 포함하는, 시험관내 또는 생체외 1차 세포에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도하는 방법으로서,
    이때, 상기 제 1 뉴클레오티드 서열 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이고,
    상기 변형된 sgRNA가 Cas 폴리펩티드를 표적 핵산으로 유도하고, 상기 변형된 sgRNA가 상응하는 비변형된 sgRNA에 비해 증대된 활성하에 표적 핵산의 유전자 조절을 유도하고,
    (i) 상기 변형된 sgRNA가 제 1 뉴클레오티드 서열의 5'-말단의 5개 뉴클레오티드 이내에 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고/하거나 제 2 뉴클레오티드 서열의 3'-말단의 5개 뉴클레오티드 이내에 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하고,
    (ii) 변형된 뉴클레오티드가 2'-O-메틸(M) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트(MS) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 3'-티오PACE(MSP) 뉴클레오티드 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    증대된 활성이 변형된 sgRNA의 증가된 안정성 및/또는 표적 핵산에 대한 변형된 sgRNA의 증가된 특이성을 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    표적 핵산이 표적 DNA 또는 표적 RNA를 포함하는, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    유전자 조절이 표적 DNA의 게놈 편집을 포함하는, 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    게놈 편집이 표적 DNA의 상동성-유도 복구(HDR) 또는 비상동적 말단 결합(NHEJ)을 포함하는, 방법.
  6. 제 4 항에 있어서,
    재조합 공여체 복구 주형을 1차 세포 내에 도입하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    재조합 공여체 복구 주형이 표적 DNA의 2개의 비-중복 상동 부분을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열이 게놈 편집될 표적 DNA에 상응하는 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 위치하는, 방법.
  8. 제 6 항에 있어서,
    재조합 공여체 복구 주형이 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)을 교정하기 위한 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 단일-가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN) 주형 및 표적 DNA의 2개의 비-중복 상동 부분을 포함하는 2개의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 뉴클레오티드 서열이 돌연변이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5' 및 3' 말단에 위치하는, 방법.
  9. 제 3 항에 있어서,
    유전자 조절이 엔도뉴클레아제가 결여된 Cas 폴리펩티드를 사용한 표적 DNA 또는 표적 RNA의 유전자 발현의 억제 또는 활성화를 포함하는, 방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    1차 세포가 줄기 세포, 면역 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    줄기 세포가 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC), 중간엽 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 장기 줄기 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    면역 세포가 T 세포, 자연 살해 세포, 단핵구, 말초혈 단핵 세포(PBMC), 말초혈 림프구(PBL) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    1차 세포가 1차 세포 집단을 포함하는, 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    변형된 sgRNA가 1차 세포 집단의 약 30% 이상에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도하는, 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    변형된 sgRNA가 1차 세포 집단의 약 40% 이상에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도하는, 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    변형된 sgRNA가 1차 세포 집단의 약 50% 이상에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도하는, 방법.
  17. 제 13 항에 있어서,
    변형된 sgRNA가 1차 세포 집단의 약 60% 이상에서 표적 핵산의 유전자 조절을 유도하는, 방법.
  18. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 1 뉴클레오티드 서열이 약 20개 뉴클레오티드의 길이인, 방법.
  19. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 1 뉴클레오티드 서열에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인, 방법.
  20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 1 뉴클레오티드 서열에서 약 10% 내지 약 30%의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인, 방법.
  21. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 2 뉴클레오티드 서열이 약 80개 뉴클레오티드의 길이인, 방법.
  22. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 2 뉴클레오티드 서열에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인, 방법.
  23. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    제 2 뉴클레오티드 서열에서 약 1% 내지 약 10%의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인, 방법.
  24. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    변형된 sgRNA가 제 1 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 또는 5'-말단 부근에 1, 2 또는 3개의 연속적인 또는 비-연속적인 변형된 뉴클레오티드, 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 3'-말단에 또는 3'-말단 부근에 1, 2 또는 3개의 연속적인 또는 비-연속적인 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    변형된 sgRNA가 제 1 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 3개의 연속적인 변형된 뉴클레오티드, 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 3'-말단에 3개의 연속적인 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  26. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    변형된 sgRNA가 화학적으로 합성되는, 방법.
  27. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    변형된 sgRNA가 적어도 2개의 상이한 변형된 sgRNA를 포함하고, 각각의 변형된 sgRNA가 상이한 표적 핵산에 대해 유도되는, 방법.
  28. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    Cas 폴리펩티드가 Cas 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA인, 방법.
  29. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    Cas 폴리펩티드가 Cas9 폴리펩티드, 이의 변이체 또는 이의 단편인, 방법.
  30. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    1차 세포 내에 도입하는 단계가 1차 세포를 전기천공하는 것을 포함하는, 방법.
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