KR102673090B1 - 합성 폴리펩타이드 에피토프 기반의 백신 조성물 - Google Patents

Abstract

수족구병의 2가지 주요 원인 물질인 EV71 및 CVA16으로부터 선택된 보존 에피토프가 서브 유닛 2가 백신 항원 작제물을 개발하는데 사용된다. 본원에 기재된 상기 백신은 다양한 EV71 및 CVA16 감염 유발 바이러스주에 대한 교차 방어를 제공할 수 있다. 다중 에피토프 백신 항원 암호화 유전자의 발현 및 이와 관련된 정제 방법이 추가로 개시된다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 백신 항원 작제물을 포함하는 수족구병 및 다른 엔테로바이러스 감염에 대한 백신 제형을 개시한다.

Description

합성 폴리펩타이드 에피토프 기반의 백신 조성물

본 발명은 합성 폴리펩타이드 에피토프 기반 백신 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, EV71 및 CVA16으로부터 선택된 보존 에피토프는 서브 유닛 2가 백신 항원 작제물(construct)을 개발하는데 사용되고, 백신 조성물은 개발된 서브 유닛 2가 백신 항원 작제물을 사용하여 제공되며, 여기서, 상기 백신은 다양한 EV71 및 CVA16 감염 유발 바이러스주에 대한 교차 방어를 제공할 수 있다. 또한, 다중 에피토프 백신 항원 암호화 유전자의 발현 및 이와 관련된 정제 방법이 개시된다. 본 발명은 또한 본 발명의 재조합 백신 항원 작제물을 포함하는 수족구병 및 다른 엔테로바이러스 감염에 대한 백신 제형을 개시한다.

수족구병 (hand foot and mouth disease: HFMD)은 엔테로바이러스-71 (EV71) 및 콕삭키바이러스 A16 (CVA16)에 주로 기인하는 흔한 소아과 질병이다. 이들은 모두 단일 가닥 포지티브 센스 RNA 바이러스이며 피코르나바이러스 과에 속한다. EV71은 또한 무균성 수막염에서부터 급성 이완성 마비, 뇌간 뇌염 및 심지어는 사망까지의 범위의 다수의 신경학적 합병증을 일으킨다. 종종, 이들 2종의 바이러스는 공동 순환하고 공동 감염을 일으켜 다수의 아시아 국가의 보건 의료 시스템에 치명적인 영향을 미친다.

EV71 및 CVA16은 수족구병에 대한 2가지 주요 병인 물질이다. 이들 바이러스는 모두 매우 다형성이며, 하나에 대한 항체(들)는 다른 것에 대해 유의한 교차 방어를 제공하지 않을 것이다. 따라서, 이들 2종의 바이러스에 대한 가능성 있는 2가 단백질 조성물은 이러한 질환의 전세계적 부담을 감소시킬 것으로 대단히 기대된다. 중화 항체의 대부분은 엔테로바이러스 중에서 주요 캡시드 단백질 VP1에 위치하는 것으로 널리 공지되어 있다. VP1은 빈번한 돌연변이 및 재조합 현상으로 인해 상이한 바이러스들간에 다수의 서열 가변성을 가지는다 (문헌 [Leitch ECM et al. J. Virol. 2012; 86:2676- 2685]). VP1 서열 변이에 기초하여, EV71은 지금까지 7개의 유전자군 (GgA~GgG)으로 분류되었으며, 유전자군 B 및 C는 B1~B5 및 C1~C5로 추가로 세분화된다 (문헌 [Brown BA et al. J. Virol. 1999; 73:9969-9975]).

따라서, 이들 바이러스 둘 다에 대한 백신의 개발은 이들을 제약하기 위해 매우 바람직하다. 본원의 발명자들은 주로 EV71 및 CA16에 대한 백신으로서 밀접하게 순환하는 다른 HFMD 유발 혈청군에 대해서도 교차 방어하는 잠재력을 가지는 백신을 제안하며, 본원에서 이를 개발하였다. 엔테로바이러스-71 및 콕삭키바이러스-A16의 캡시드 단백질 (VP1)에서 유래한 에피토프의 다중 카피를 암호화하는 독특한 합성 유전자를 디자인하고 작제하였으며, 이는 EV71 및 CA16에 의해 유발되는 수족구 감염에 대한 백신 후보로서의 면역화 잠재력을 가지는 독특하고 매우 효과적인 재조합 단백질 작제물로서 사용된다.

또한, 본 발명자들은 또한 EV71 및 CVA16의 주요 캡시드 단백질인 VP1, VP2 및 VP3 에서 유래한 에피토프 영역을 포함하는 또 다른 백신 후보를 개발하고 본 발명에서 개시하였다.

발명의 목적

본 발명의 하나의 목적은 합성 폴리펩타이드 에피토프 기반의 백신 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 EV71 및 CVA16으로부터 선택되는 보존 에피토프를 사용하는 재조합 서브유닛 2가 백신 항원 작제물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 다양한 EV71 및 CVA16 감염 유발 바이러스주에 대한 교차 방어를 제공할 수 있는 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 다중 에피토프 백신 항원 암호화 유전자의 발현 및 이와 관련된 정제 방법을 추가로 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 재조합 백신 항원 작제물을 포함하는, 수족구병 및 다른 엔테로바이러스 감염에 대한 백신 제형을 제공하는 것이다.

발명의 요지

본 발명의 하나의 실시형태에 따르면, 수족구병에 대한 다중 에피토프 기반의 백신 항원의 개략적 구조 및 코돈 최적화된 유전자 및 단백질 서열이 개시된다.

본 발명의 또 다른 실시형태에 따르면, 적절한 숙주에서 봉입체로서의 본 발명의 코돈 최적화 서열의 발현이 개시된다.

본 발명의 추가의 실시형태는 용해 완충액-I 및 용해 완충액-II에 의한 용해, 세척 완충액 I, II 및 III에 의한 세척, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피에 이어서, 투석 및 적절한 리폴딩 완충액에 의한 서열번호 2 및 서열번호 4의 목적 단백질의 리폴딩 및 회수, 후속적으로 크기 배제 크로마토그래피와 같은 특정 크로마토그래피 정제 기술을 포함하는, 단백질 정제 방법을 기재한다.

본 발명의 추가의 실시형태는 또한 적절한 동물 연구를 통해 본 발명의 면역원성을 확립한다. 서열번호 2 및 4는 엔테로바이러스 및 콕삭키바이러스에 의해 유발되는 수족구병에 대해 충분한 면역 반응을 생성할 수 있다. 본 발명의 백신 항원은 또한 사람에서 수족구병을 일으키는 엔테로바이러스 및 콕삭키바이러스의 임의의 바이러스주에 대해 교차 방어를 유도할 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태로서, 선택적으로 폴리올, 당류 또는 아미노산 또는 조합과 같은 기타 안정화제의 존재하에서, 다중 아쥬반트와 함께 서열번호 2 및 서열번호 4를 포함하는 특정 백신 제형이 또한 이용 가능하게 되었다.

본 발명의 또 다른 양태로서, (a) 백신 항원으로서, 상기 백신 항원이 서열번호 2 (MEV1로 명명) 및 서열번호 4 (MEV2로 명명)로 표시되는 재조합 단백질 서열로부터 선택된 합성 작제물인, 백신 항원; (b) 아쥬반트; (c) 안정화제; 및 (d) 포스페이트 및 시트레이트로부터 선택된 생리학적으로 허용되는 완충액을 포함하는, EV71 및 CA16에 의해 유발되는 수족구병에 대한 예방을 위한 백신 조성물이 제공되며, 여기서, 상기 백신 제형은 5±3℃에서 2년 이상 및 37℃에서 최대 2주 동안 안정하다.

도 1: 엔테로바이러스 A71 및 콕삭키바이러스 A16에 대한 다중 에피토프 2가 백신 유전자 작제물 (MEV1 및 MEV2).
1A: MEV1의 개략도로, 3개의 에피토프의 4개의 카피가 나란히 존재하는 것을 나타낸다. 링커는 에피토프를 분리하여 유연성을 부가한다. NdeI 및 BamHI 서열은 각각 5' 및 3' 말단에 존재한다.
1B: MEV2의 개략도로, 6개의 에피토프의 3개의 카피와, 이어서 추가 3개의 에피토프의 1개의 카피가 나란히 존재하는 것을 나타낸다. 링커는 에피토프를 분리하여 유연성을 부가한다. NdeI 및 BamHI 서열은 각각 5' 및 3' 말단에 존재한다.
도 2: 상이한 농도의 IPTG를 평가하여 MEV1 (2A) 및 MEV2 (2B)의 발현에 대한 최적 농도를 평가하였다. 2A: 좌측으로부터, 레인 1: 비유도된 세포 (IPTG의 부재), 레인 2~4: 각각 0.2 mM, 0.5 mM 및 0.75 mM IPTG로 유도된 세포, 레인 5: 바닥에서부터 각각 16 kDa, 29 kDa, 33 kDa, 43 kDa, 54 kDa, 71 kDa, 91 kDa, 124 kDa 및 250 kDa의 크기를 가지는 단백질에 대한 분자량 마커, 레인 6~8: 각각 0.2 mM, 0.5 mM 및 0.75 mM IPTG로 유도되고, 이어서 용해된 후의 단백질 응집체를 가지는 세포 펠릿, 레인 9~11: 각각 0.2 mM, 0.5 mM 및 0.75 mM IPTG로 유도되고, 이어서 용해된 후의 세포 용해물.
2B: 좌측으로부터, 레인 1: pET11b-MEV2로 형질전환된 비유도된 BL21 (DE3) 세포 (IPTG의 부재), 레인 2~4: 0.2 mM, 0.5 mM 및 0.75 mM IPTG를 사용하여 pET11b-MEV2로 형질전환된 BL21(DE3) 세포의 유도.
결론: 상기 도면의 결과에 의하면, MEV1 및 MEV2의 발현은 광범위한 IPTG 농도를 사용하여 유도될 수 있는 것으로 나타난다.
도 3: MEV1 (3A, 3B) 및 MEV2 (3C)의 발현 수준이 상이한 온도 설정에서 평가된다.
(3A): 좌측으로부터, 레인 1: 비유도된 세포 (IPTG의 부재), 레인 2: 도 1에서 기재된 바와 같은 분자량 단백질 마커, 레인 3~4: 37℃에서 0.2 mM IPTG로 유도되고 용해된 후의 각각의 세포 용해물 및 세포 펠릿, 레인 4~5: 25℃에서 0.2 mM IPTG로 유도되고 용해된 후의 각각의 세포 용해물 및 세포 펠릿.
(3B): 좌측으로부터, 레인 1: 비유도된 세포 (IPTG의 부재), 레인 2: 37℃에서 IPTG로 유도된 세포, 레인 3~4: 37℃에서 0.2 mM IPTG로 유도되고 용해된 후의 각각의 세포 펠릿 (P) 및 세포 용해물 (S), 레인 5: 25℃에서 IPTG로 유도된 세포, 레인 6~7: 25℃에서 0.2 mM IPTG로 유도되고 용해된 후의 각각의 세포 펠릿 (P) 및 세포 용해물 (S), 레인 8: 도 1에서 기재된 바와 같은 분자량 단백질 마커.
(3C): 좌측으로부터, 레인 1: 비유도된 MEV2 유전자 형질전환된 로제타 세포 (IPTG의 부재), 레인 2: 18℃에서 0.2 mM IPTG로 유도된 로제타 세포, 레인 4: 비유도된 MEV2 유전자 형질전환된 BL21 (DE3) 세포, 레인 5: 37℃에서 0.2 mM IPTG로 유도된 BL21 (DE3) 세포, 레인 6: 18℃에서 0.2 mM IPTG로 유도된 BL21 (DE3) 세포, 레인 7: 분자량 단백질 마커.
결론: 도 3A 및 3B로부터 수득된 결과에 의하면, 37℃는 IPTG에 의해 MEV1 및 MEV2를 유도하기 위한 최적의 온도인 것으로 나타났다.
도 4: 2가지의 상이한 농도의 요소 (6 M 및 3 M)가 MEV1 (4A)의 용해도를 개선하기 위해 평가되는 반면, MEV2의 경우에는 가변성 pH를 가지는 DTT의 존재 또는 부재하에 2가지의 상이한 농도의 요소 (6M 및 3M)에 의해 용해도가 평가되었다 (4B, 4C).
4A: 좌측으로부터, 레인 1: 0.2 mM IPTG로 유도되고, 이어서 용해된 후의 세포 용해물, 레인 2: 불용성 세포 응집체가 6 M 요소로 처리된 후의 상청액, 레인 3: 불용성 세포 응집체가 6 M 요소로 처리된 후의 세포 펠릿, 레인 4: 불용성 세포 응집체가 3 M 요소로 처리된 후의 상청액, 레인 5: 불용성 세포 응집체가 3 M 요소로 처리된 후의 세포 펠릿, 레인 6: 도 1에서 기재된 바와 같은 분자량 단백질 마커.
4B: 좌측으로부터, 레인 1: 불용성 세포 응집체가 3 M 요소로 처리된 후의 상청액, 레인 2: 불용성 세포 응집체가 3 M 요소로 처리된 후의 세포 펠릿, 레인 3: 불용성 세포 응집체가 10 mM DTT의 존재하에 3 M 요소로 처리된 후의 상청액, 레인 4: 불용성 세포 응집체가 10 mM DTT의 존재하에 3 M 요소로 처리된 후의 세포 펠릿, 레인 5: 불용성 세포 응집체가 6 M 요소로 처리된 후의 상청액, 레인 6: 불용성 세포 응집체가 6 M 요소로 처리된 후의 세포 펠릿, 레인 7: 불용성 세포 응집체가 10 mM DTT의 존재하에 6 M 요소로 처리된 후의 상청액, 레인 8: 불용성 세포 응집체가 10 mM DTT의 존재하에 6 M 요소로 처리된 후의 세포 펠릿, 레인 9: 도 2B에서 기재된 바와 같은 분자량 단백질 마커.
4C: 좌측으로부터, 레인 1: 0.2 mM IPTG로 유도되고, 이어서 용해 완충액-I (pH 7.4) 중에서 용해된 후의 세포 용해물, 레인 2: 불용성 세포 응집체가 20 mM DTT의 존재하에 용해 완충액-II (pH 7.4) 중에서 6M 요소로 처리된 후의 상청액, 레인 3: 불용성 세포 응집체가 20 mM DTT의 존재하에 용해 완충액-II (pH 7.4) 중에서 6M 요소로 처리된 후의 세포 펠렛, 레인 4: 0.2 mM IPTG로 유도되고, 이어서 용해 완충액 (50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF, pH 8) 중에서 용해된 후의 세포 용해물,
레인 5: 불용성 세포 응집체가 20 mM DTT의 존재하에 용해 완충액 (50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF, pH 8) 중에서 6M 요소로 처리된 후의 상청액, 레인 6: 불용성 세포 응집체가 20 mM DTT의 존재하에 용해 완충액 (50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF, pH 8) 중에서 6M 요소로 처리된 후의 세포 펠릿, 레인 8: 도 2B에서 기재된 바와 같은 분자량 단백질 마커, 레인 8: 0.2 mM IPTG로 유도되고, 이어서 용해 완충액 (50 mM Tris, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF, pH 8.5) 중에서 용해된 후의 세포 용해물, 레인 9: 불용성 세포 응집체가 20 mM DTT의 존재하에 용해 완충액 (50 mM Tris, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF, pH 8.5) 중에서 6M 요소로 처리된 후의 상청액, 레인 10: 불용성 세포 응집체가 20 mM DTT의 존재하에 용해 완충액 (50 mM Tris, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF, pH 8.5) 중에서 6M 요소로 처리된 후의 세포 펠릿 (세포 펠릿의 부피는 잘 용해됨에 따라 레인 10 샘플에 대해 매우 적었다).
결론: 상기 도면에 의하면, 3 M 및 6 M 요소 처리는 미처리된 샘플과 비교할 때 고순도를 가지는 상당량의 MEV1로 회수될 수 있는 반면, 6 M 요소 및 DTT의 존재는 상당량의 가용성 MEV2 단백질을 달성하는데 필요한 것으로 결론지어 진다.
도 5: EV-Ag (MEV1)의 발현 및 정제.
(5A): 발현된 MEV1은 Ni-NTA 수지를 사용하여 IMAC (immobilized metal affinity chromatography) 기술에 의해 친화성 크로마토그래피로 정제되고, SDS-PAGE 전기 영동이 수행되었다. 좌측으로부터, 레인 1: 비유도된 세포 펠릿 (IPTG의 부재), 레인 2: 3 M 요소로 처리된 세포 응집체와 같은 봉입체 (IB)로부터의 상청액, 레인 3: N-NTA 수지를 사용하여 IMAC 매개된 정제 후의 정제 단백질, 레인 4: 도 1에서 기재된 바와 같은 분자량 단백질 마커.
(5B): MEV1의 특이적 발현은 항-his 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 검출되었다. 좌측으로부터, 레인 1: (UP) - 3 M 요소에 의한 처리 후 세포 응집체와 같은 봉입체 (IB)로부터 유래된 상청액 중의 미정제 단백질, 레인 2: (P) - Ni-NTA 수지를 사용하여 IMAC 매개된 정제 후의 정제 단백질.
결론: 도 5의 결과에 의하면, IMAC 정제 단계는 90% 초과의 정제 MEV1을 생성하였고, 특이적 발현은 항-his 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅에 의해 확인된 것으로 나타났다.
도 6: IgG1/IgG2a 비는 상이한 아쥬반트의 존재하에 MEV1 면역화된 Balb/C 마우스 혈청 (1:250)에 대해 측정되었다. CFA (Complete Freund's adjuvant)/IFA (Freund's incomplete adjuvant): 프라임 용량으로서 완전 프로인트 아쥬반트의 존재하의 MEV1 및 후속 부스터 용량으로서 불완전 프로인트 아쥬반트의 존재하에서 MEV1로 면역화된 마우스, 알룸(Alum): 아쥬반트로서 알룸의 존재하에서 MEV1로 면역화된 마우스, MPLA+알룸: 알룸과 MPLA 둘 다로 제형화된 MEV로 면역화된 마우스. Poly(I:C): Poly(I:C)로 제형화된 MEV로 면역화된 마우스, AddaVax: AddaVax로 제형화된 MEV로 면역화된 마우스. MEV1 코팅된 ELISA 플레이트는 혈청 (1:250)으로 처리되고 최종적으로 항-마우스 IgG1-HRP 또는 IgG2a-HRP 2차 항체와 함께 인큐베이션 처리되었다.
결론: CFA/IF 및 알룸으로 아쥬반트 첨가된 MEV1 면역화는 우세한 Th2형 면역 반응을 나타내는 훨씬 더 높은 IgG1 항체를 생성하는 반면, Poly(I:C), AddaVax 및 MPLA+알룸은 Th1형 면역 반응에 대한 약간의 바이어스를 가지는 전체적으로 균형잡힌 Th1/Th2 반응을 나타내는 약간 더 높은 IgG2a 항체를 생성하였다.
도 7: 면역형광에 의한 MEV1 면역화된 혈청과 EV71 및 CVA16의 결합 분석. 혈청은 알룸으로 제형화된 MEV1로 면역화된 마우스 또는 알룸으로 제형화된 PBS로 면역화된 마우스로부터 수집되었다. 이어서, 베로 세포는 0.01의 감염 다중도로 엔테로바이러스 A71 (EV71) 및 콕삭키바이러스 A16 (CVA16)에 의해 감염되었다. 감염된 베로 세포는 도면의 상응하는 패널에서 언급된 바와 같이 1:200 희석 혈청으로 처리된 후 Alexa 488 컨쥬게이트된 항-마우스 IgG 2차 항체와 함께 인큐베이션 처리되고 형광 현미경하에 관찰되었다. 명시야: 현미경의 명시야, 형광: 현미경의 녹색 형광 시야, Ag+알룸: 알룸으로 제형화된 MEV1로 면역화된 마우스로부터 수집된 혈청, PBS+알룸: 알룸으로 제형화된 PBS로 면역화된 마우스로부터 수집된 혈청 (음성 대조군 혈청), EV71 감염된 베로 세포: EV71으로 감염된 베로 세포가 사용된 패널, CVA16 감염된 베로 세포: CVA16으로 감염된 베로 세포가 사용된 패널, 감염되지 않은(Mock infected) 베로 세포: 베로 세포가 바이러스에 감염되지 않은 패널 (감염된 베로 세포에 대한 음성 대조군). 결론: 면역형광 결과에 의하면, 교차 반응성은 EV71과 CVA16 둘 다에 대해 생성된 것으로 나타났다.
도 8: 상이한 아쥬반트의 존재하에 MEV-1 항원 면역화된 마우스로부터의 혈청의 IgG 역가. 혈청은 2차 부스터 처리 후 2주에 수집되었다. ELISA는 차단 후 상이한 농도의 혈청의 존재하에 항원 코팅된 ELISA 플레이트에서 수행되었다. 이어서, 2차 IgG-HRP 컨쥬게이트화 항체가 첨가되었다. TMB 기질은 0.6~1 M HCL로 중단된 발색을 위해 첨가되었다. 색 강도는 ELISA 판독기에서 450 nm에서 기록되었다.
도 9: 상이한 아쥬반트로 제형화된 MEV1로 면역화된 마우스의 비장 세포로부터 분비된 IFN-γ (9A) 및 IL-4 (9B)의 정량화.
도 10: 합성 단백질 작제물 MEV-1의 안정성. 좌측으로부터, 레인 1: 2주 동안 37±2℃에서 안정화제 부재하의 MEV1 단백질, 레인 2: 2주 동안 37±2℃에서 20% 글리세롤 중에서의 MEV1 단백질, 레인 3: 37±2℃에 노출되지 않은 MEV1 단백질 (대조군 단백질), 레인 4: 분자량 단백질 마커.

본 발명에서, 백신 항원 유전자 작제물(construct)로서 기능하는 재조합 항원 다중 에피토프 엔테로바이러스 항원 1 (MEV1)을 작제하기 위해, 각 에피토프의 4개의 카피를 링커에 의해 연결하였다. 서열번호 1에 개시된 바와 같은 표적 유전자 (MEV1) 및 서열번호 2에 개시된 바와 같은 이에 따른 단백질은, 하나의 엔테로바이러스 A71 에피토프, 하나의 콕삭키바이러스 A16 에피토프, 및 엔테로바이러스 A71 바이러스주와 100% 상동성 및 콕삭키바이러스 A16 및 여러 다른 콕삭키바이러스주와 높은 상동성을 가지는 하나의 극도로 보존된 에피토프 각각에 대한 4개의 카피를 보유하도록 설계되므로, 교차 방어를 제공할 것이다. 모든 에피토프는 엔테로바이러스 A71 또는 콕삭키바이러스 A16의 VP1 캡시드 유전자에 존재한다. 5' 및 3' 말단에 각각 NdeI 및 BamH1 제한효소 부위를 가지는 표적 유전자는 발현 벡터 pET11b의 NdeI-BamHI 클로닝 부위에 도입되는 삽입물로서 사용되었다. 상기 삽입물은 또한 발현된 단백질의 용이한 검출 및 정제를 위해 C-말단 6X 히스티딘을 포함한다. 폴리-히스티딘 태그의 존재는 단백질이 후속 단계에서 고정화 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되도록 할 수 있고, 또한 폴리-히스티딘 특이적 항체를 사용하여 발현의 검출을 보조한다. 6X 히스티딘 태그는 보다 작은 크기, 낮은 독성 및 면역원성을 포함하는 여러 이점을 가지므로, 항원의 면역원성을 방해하지 않는다. 상기 삽입물을 가지는 벡터는 본 발명의 상기 유전자 작제물의 발현을 위해 대장균 (E.coli) DH5α (구체적으로는 클로닝을 위해) 및 BL21 (DE3) 세포에서 형질전환되었다.

본 발명은 또한 EV71 CVA16 (MEV2)의 VP1~3 단백질로부터 9개의 에피토프를 포함하는 또 다른 작제물 MEV2를 포함한다. 이들 에피토프는 B 세포와 T 세포 에피토프 둘 다를 포함한다. 표적 유전자 (MEV2) 서열은 서열번호 3에 개시되어 있으며, 이에 따른 단백질 서열은 서열번호 4에 개시되어 있다.

서열번호 1: MEV1의 핵산 서열

CATATGGCTGCAGGTTCTGGTTACGACGGTTACCCGACCTTCGGTGAACACAAACAGGAAAAAGACCTGGAATACGGTGGTTCTGGTGGTTACCTGTTCAAAACCAACCCGAACTACAAAGGTAACGACATCAAAGGTGGTTCTGGTGGTATGCGTATGAAACACGTTCGTGCTTGGATACCGCGTATGCGTGGTGGTTCTGGTGGTTACGACGGTTACCCGACCTTCGGTGAACACAAACAGGAAAAAGACCTGGAATACGGTGGTTCTGGTGGTTACCTGTTCAAAACCAACCCGAACTACAAAGGTAACGACATCAAAGGTGGTTCTGGTGGTATGCGTATGAAACACGTTCGTGCTTGGATACCGCGTATGCGTGGTGGTTCTGGTGGTTACGACGGTTACCCGACCTTCGGTGAACACAAACAGGAAAAAGACCTGGAATACGGTGGTTCTGGTGGTTACCTGTTCAAAACCAACCCGAACTACAAAGGTAACGACATCAAAGGTGGTTCTGGTGGTATGCGTATGAAACACGTTCGTGCTTGGATACCGCGTATGCGTGGTGGTTCTGGTGGTTACGACGGTTACCCGACCTTCGGTGAACACAAACAGGAAAAAGACCTGGAATACGGTGGTTCTGGTGGTTACCTGTTCAAAACCAACCCGAACTACAAAGGTAACGACATCAAAGGTGGTTCTGGTGGTATGCGTATGAAACACGTTCGTGCTTGGATACCGCGTATGCGTCATCATCACCATCACCACTAAGGATCC

(NdeI 및 BamH1 부위의 위치는 밑줄로 표시되어 있으며, 6X 히스티딘의 위치는 상기 서열번호 1의 실제 서열에서 진하게 표시되어 있다.)

서열번호 2: MEV1의 아미노산 서열

MAAGSGYDGYPTFGEHKQEKDLEYGGSGGYLFKTNPNYKGNDIKGGSGGMRMKHVRAWIPRMRGGSGGYDGYPTFGEHKQEKDLEYGGSGGYLFKTNPNYKGNDIKGGSGGMRMKHVRAWIPRMRGGSGGYDGYPTFGEHKQEKDLEYGGSGGYLFKTNPNYKGNDIKGGSGGMRMKHVRAWIPRMRGGSGGYDGYPTFGEHKQEKDLEYGGSGGYLFKTNPNYKGNDIKGGSGGMRMKH VRAWIPRMRHHHHHH

서열번호 3: MEV2의 핵산 서열

CATATGCGTCGTGGCAGCTATGATGGTTATCCGACCTTCGGCGAGCACAAACAAGAAAAAGACCTGGAATACGGCGGCGGCAGCGCGGGCGGCACCGGCACCGAGGACAGCCACCCGCCGTATAAACAAACCCAACCGGGTGCGGGTGGCGGTAGCGTGAACAACGTTCCGACCAACGCGACCAGCCTGATGGAGCGTCTGGGCGGTCCGGGCTACCCGACCTTCGGTGAACACCTGCAAGCGAACGACCTGGATTATGGCCAGTGCGGCGGTGGCAGCAACCAACCGTACCTGTTTAAAACCAACCCGAACTATAAGGGTAACGACATCAAAGGTGGCGGTAGCCACTACCGTGCGCACGCGCGTGCGGGTTATTTCGACTACTATACCGGTCCGGGTCCGTACGATGGCTATCCGACCTTTGGCGAGCACAAGCAGGAAAAAGACCTGGAGTATGGCGGTGGCAGCGCGGGTGGCACCGGCACCGAAGATAGCCACCCGCCGTACAAACAAACCCAGCCGGGTGCGGGTGGCGGTGGCAGCGTGAATAATGTGCCGACCAATGCGACCAGCCTGATGGAACGTCTGGGTGGCCCGGGCTATCCGACCTTTGGCGAACACCTGCAAGCGAATGACCTGGATTACGGCCAATGCGGCGGTGGCAGCAATCAGCCGTACCTGTTTAAGACCAATCCGAATTATAAGGGCAACGACATTAAAGGTGGCAGCCACTATCGTGCGCACGCGCGTGCGGGGTACTTTGACTACTATACCGGTCCGGGTCCGTACGATGGCTATCCGACGTTTGGTGAACACAAGCAGGAGAAAGACCTGGAATATGGTGGTGGTAGCGCGGGTGGCACCGGCACCGAGGATAGCCACCCGCCGTATAAACAAACGCAACCGGGTGCGGGCGGTGGCAGCGTGAATAATGTTCCTACTAATGCTACCAGCCTGATGGAACGCCTGGGTGGTCCGGGTTACCCGACTTTTGGCGAACACCTGCAAGCAAATGACCTGGATTATGGCCAATGCGGTGGCGGTAGCAATCAACCTTACCTGTTTAAGACTAACCCGAACTATAAGGGCAACGACATCAAAGGCGGTGGCAGCCACTATCGTGCGCACGCGCGTGCGGGCTATTTCGATTACTATACCGCGGGCGCGGGTGCGCAGCTGACCATCGGTAACAGCACCATTACCACCCAAGAAGCGGCGAACATCGGCGGTGGCAGCCCGCACCAGTGGATTAACCTGCGTACCAACAACTGCGCGACCATCATTGGTGGCGGTAGCATGGCGACCGGTAAAATGCTGATTGCGTACACCCCGCCGGGTGGTCCGCTGCCGTAAGGATCC

서열번호 4: MEV2의 아미노산 서열

MRRGSYDGYPTFGEHKQEKDLEYGGGSAGGTGTEDSHPPYKQTQPGAGGGSVNNVPTNATSLMERLGGPGYPTFGEHLQANDLDYGQCGGGSNQPYLFKTNPNYKGNDIKGGGSHYRAHARAGYFDYYTGPGPYDGYPTFGEHKQEKDLEYGGGSAGGTGTEDSHPPYKQTQPGAGGGGSVNNVPTNATSLMERLGGPGYPTFGEHLQANDLDYGQCGGGSNQPYLFKTNPNYKGNDIKGGSHYRAHARAGYFDYYTGPGPYDGYPTFGEHKQEKDLEYGGGSAGGTGTEDSHPPYKQTQPGAGGGSVNNVPTNATSLMERLGGPGYPTFGEHLQANDLDYGQCGGGSNQPYLFKTNPNYKGNDIKGGGSHYRAHARAGYFDYYTAGAGAQLTIGNSTITTQEAANIGGGSPHQWINLRTNNCATIIGGGSMATGKMLIAYTPPGGPLP

또한, 본 발명에서 개시된 상기 백신 항원의 본 발명의 재조합 유전자 작제물은 EV71, EVD68, 콕삭키바이러스 A16, 콕삭키바이러스 A4~6, 콕삭키바이러스 A10, 에코바이러스 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 엔테로바이러스로부터 유래된 B 세포 또는 T 세포 에피토프를 포함할 수 있다. 본 발명에서 언급된 다중 에피토프 작제물(들)은 또한 임의의 톡소이드, 전체 단백질 또는 절단된 단백질로서의 플라젤린과 같은 TLR 리간드, CTL 에피토프, T 헬퍼 에피토프, 면역 조절제, 바이러스 유사 입자 등을 포함할 수 있는 보다 양호한 면역원성을 위한 담체 단백질(들)을 포함할 수 있다. 상기 항원 유전자는 또한 폴리-히스티딘 태그, V5 태그, GST 태그, 신호 서열 등과 같은 하나 이상의 태그를 포함할 수 있다.

본 발명의 제안된 재조합 유전자 작제물은 세균, 효모, 포유 동물 세포 또는 바이러스에서 발현될 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 하나의 실시형태에서, 발현 시스템은 대장균 (Escherichia coli)이다. 코돈 최적화는 대장균(E.coli)에서 이종 단백질의 성공적인 생산을 위한 필수 단계이다. 본 발명에서, MEV1 및 MEV2 유전자는 대장균에서의 성공적인 생산을 위해 코돈 최적화되었다. 대장균 발현 시스템에서, 상기 이종 단백질은 종종 불용성 응집체를 형성하며, 세균 용해 완충액에 의한 용해 후에도 봉입체로서 세포 내부에 남아 있다. 봉입체 (IB) 단백질. 모든 봉입체 단백질은 이들의 생화학적 특성에 있어서 매우 특이적이며, 각각의 봉입체 형성 단백질은 특정 실험 조합, 예를 들어, 세척용 완충액과 세포 용해, 상기 단백질의 변성 성분의 특정 조합, 이어서 적절한 기능성 단백질 구조를 위한 상기 표적 단백질의 특정 리폴딩 완충액 중에서의 리폴딩을 필요로 한다. 합성 재조합 유전자 작제물로부터 생성된 임의의 봉입체 형성 단백질의 세포 용해, 변성 및 리폴딩을 포함하는 다운스트림 처리는, 상기 단백질의 자연적 특성이 자연에서 이미 이용 가능한 단백질과 비교하여 초기에 전혀 공지되어 있지 않고 사람의 개입을 통해 봉입체 형성 단백질로서 생성되었기 때문에 훨씬 더 어렵고 예측 불가능하다.

본 발명에서, 포스페이트 완충액은 무독성이고 생리학적 유체의 공통 성분이기 때문에 MEV1에 대해 사용되었다. 이의 pH는 온도에 따라 거의 변하지 않는다. 이것은 무색이므로 단백질 정량화 동안 흡광을 방해하지 않는다. 또한, NaCl은 비특이적 소수성 단백질 상호 작용을 감소시키기 위해 사용된다. 리소자임은 세균의 세포벽 펩티도글리칸에 작용함으로써 세포 용해를 향상시키기 때문에 사용되었다. 본 발명에서, 냉동 해동 사이클 및 초음파 처리는 세균 세포의 파괴에 사용되어 완전한 용해를 유도하였다. 단백질을 분해하는 고온 발생을 피하기 위해 그 사이에 얼음 중에서 냉각시키면서 초음파 처리의 짧은 펄스가 사용되었다. 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 (AEBSF)는 광범위한 세린 프로테아제 억제제이며 무독성이다. AEBSF는 MEV1의 세린 프로테아제 매개성 분해를 방지하기 위해 본 발명에서 사용되었다. 4-(2-아미노에틸)벤젠설포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드 또는 AEBSF는 단백질의 세린 프로테아제 매개성 분해를 방지하는 세린 프로테아제 억제제이다.

또 다른 실시형태에서, 포스페이트 완충액 (pH 7.4~8) 또는 Tris 완충액 (pH 8~8.5)은 MEV1 및 MEV2의 용해 및 가용화에 사용되었다. Tris 용해 완충액은 pH 8~8.5에서 20~50 mM Tris, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF 로 이루어진다.

TritonX-114는 약한 비이온성 계면활성제이다. 이것은 세포 용해에 사용된다. 이것은 또한 20℃ 초과의 온도에서 상 분리에 의한 내독소 감소에 중요한 역할을 한다. 이미다졸은 IMAC 수지에 결합하기 위한 히스티딘에 대한 경쟁자이다. 따라서, 저농도에서는 이것이 비특이적 결합을 방지하므로 세척 완충액에 첨가된다. 보다 높은 농도 (상이한 단백질들 사이에서는 다름)에서, 이것은 태그된 단백질을 방출할 것이며, 목적하는 단백질은 용리액에 들어올 것이다. 이들 특정 성분의 기능은 엔테로바이러스 에피토프를 포함하는 본 발명의 새로운 유전자 작제물 MEV1, MEV2 또는 유사한 작제물로부터의 이들 새로운 단백질에 대해 본 발명을 가장 적합화하는 각각의 특정 단계에서 전략적으로 최적화되었다. 이들 성분은 본 발명에서 정제 절차의 일부로서 포함된다.

일반적으로, 요소 또는 구아니딘 HCl과 같은 변성제는 임의의 IB 단백질을 변성시키는데 사용된다. 이러한 과정에서, 상기 단백질은 변성될 것이고 용액중에 나올 것이다. 그러나, 이후의 단백질은 요소 농도의 단계적 또는 구배 감소에 의해 재생되고 리폴딩될 수 있다. 그러나, 종종 특정의 추가적인 구성 요소는 리폴딩을 기술적으로 보조하고/거나 이로 인해 거기서 결합 및 3차원 구조에 따라 IB 단백질의 다양한 카테고리의 응집을 방지하는 것을 필요로 한다. L-아르기닌 및 L-아르기닌 HCl은 본 발명의 MEV1 및 MEV2의 응집을 방지하는데 필수적인 것으로 밝혀졌다. DTT 또는 DTE와 같은 환원제는 MEV2를 가용화하는데 적합하다.

정제 단계는 친화성 정제, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 재조합 유전자 작제물로부터 유도된 재조합 단백질의 세정 및 정제에 사용되는 완충액(들)은 포스페이트 완충액, Tris 완충액, MOPS 완충액 등을 포함한다.

본 발명의 재조합 단백질(들)은 알룸 (알루미늄 포스페이트, 알루미늄 수산화물), 스쿠알렌계 아쥬반트, 예를 들어, MF59, 몬타나이드 등, RIBI 아쥬반트, 면역원성 시험을 위한 완전 프로인트 아쥬반트 및 불완전 프로인트 아쥬반트, 세균 세포 성분 또는 변형된 버전, 예를 들어, MPL, 무라밀 디펩타이드 등을 포함하는 아쥬반트, 모든 수중유 에멀젼, 모든 유중수 에멀젼, TLR 리간드 기반의 아쥬반트, CpG 및 비-CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, QS-1, ISCOM, ISCOMATRIX 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 사포닌, 비타민, 사이토카인을 포함한 면역 조절제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 아쥬반트로 제형화될 수 있다.

백신의 투여 경로는 경구 또는 비경구일 수 있으며, 비경 구 경로는 근육내, 비강내, 피하, 국소 (tropical), 진피내 또는 경피가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: MEV1 및 MEV2 유전자 작제물로부터의 본 발명의 재조합 단백질의 발현

플라스미드 pET11b 및 pET11b-MEV1을 대장균 BL21 (DE3) 화학적 컴피턴트 세포에 형질전환시켰다. OD₆₀₀이 0.4 내지 0.6에 도달할 때까지 형질전환된 BL21 (DE3) 세포를 37℃에서 진탕시키면서 인큐베이션 처리한 다음, 4 시간 동안 37℃에서 상이한 농도의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)로 유도하였다. IPTG는, lac 오페론의 전사를 촉발하고, 이로 인해 유전자가 lac 작동유전자에 의해 조절되는 재조합 단백질의 발현을 유도하는 락토오스 대사 산물의 분자 모방체이다. 발현을 위한 IPTG의 최적 농도를 측정한 다음, 발현을 위한 다중 에피토프 유전자 (MEV1)의 유도를 다양한 온도 설정에서 또한 측정하였다 (도 3). 발현을 위한 최적 조건을 추후 실험 배치에 대해 평가하였다. pET11b-MEV2를 또한 BL21 (DE3) 세포에 형질전환시킨 후, OD₆₀₀이 0.4 내지 0.6에 도달할 때까지 37℃에서 진탕시키면서 인큐베이션 처리하고, 이어서 4 시간 동안 37℃에서 상이한 농도의 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)로 유도하였다. 발현을 위한 최적 조건을 또한 결정하였다.

실시예 2: 용해 완충액-I 및 용해 완충액-II에 의한 세포 용해

세포를 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 IPTG 유도 후의 MEV1 형질전환된 BL21 (DE3)의 세포 펠릿을 수집하였다. 상기 세포를 현탁액/용해 완충액-I 중에 현탁시켰는데, 여기서, 상기 용해 완충액-I은 pH 7.4에서 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF를 함유하는 용액을 제조함으로써 제조되었다. 먼저 3회의 냉동 해동 사이클을 수행한 후, 그 사이에 30초 간격으로 20초 동안 3회 초음파 처리하여 세포 용해를 수행 하였다. 목적하는 단백질의 위치를 SDS-PAGE에 의해 다시 확인하였다. 목적하는 단백질의 대부분은 세포 잔해물에서 발견되었는데, 이는 불용성 봉입체/봉입 유사체의 형성을 나타낸다. 그 후, 상기 세포를 5~10 mM 이미다졸, 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl 및 1 mM AEBSF의 존재하에서 상이한 농도의 요소 (3~6 M)를 가진 용해 완충액-II 중에서 4℃에서 3~16 시간 동안 용해시켜 불용성 단백질을 회수하였다.

결과에 의하면, 재조합 엔테로바이러스 백신 유전자 (MEV1)는 37℃에서 0.2 mM IPTG를 사용하여 가장 잘 유도된 것으로 나타났다. 상기 단백질은 용해의 정도를 측정하기 위해 계산된 단백질의 이론적 분자량과 일치하는 ~31 kDa 영역에서 발현되는 것으로 밝혀졌다 (도 2). 용해의 정도를 검출하기 위한, 용해된 무세포(cell free) 상청액의 SDS-PAGE 분석에 의하면, 단백질 중 ~10%만이 상청액에 존재하고 나머지는 세포 펠릿에 존재하는 것으로 나타났다 (도 2). 목적하는 유전자의 발현 수준은 37℃와 비교하여 25℃ (도 3의 A) 및 15℃ (도 3의 B)에서 유의하게 개선되지 않았다. 따라서, 37℃를 MEV1의 발현을 위한 최적 온도로서 선택하였다. 그 후, 상기 세포를 3 M 및 6 M 요소 변성 완충액으로 처리하여 재조합 단백질 회수를 증가시켰다. 2가지 상이한 요소 농도를 사용하여 순도의 증가와 함께 단백질 회수의 ~2~5% 차이로 최대 ~65%의 단백질을 회수할 수 있는 것으로 밝혀졌다 (도 4 및 표 1). 복원(renaturation)의 용이성을 위해, 3 M의 요소 농도를 추후 배치에 사용하도록 선택하였다.

MEV-2는 또한 ~47 kDa 영역에서 0.2~0.75 mM IPTG의 존재하에 잘 발현되는 것으로 밝혀졌다 (도 2의 B). MEV2는 15~18℃에서 잘 발현되지 않았다. 상기 발현은 약 37℃에서만 발견되었다. MEV-2는 BL21 (DE3)과 로제타 세포 둘 다에서 형질전환될 때 잘 발현되었다. MEV1과 마찬가지로, MEV2는 용해 완충액-I의 존재하에 잘 용해되지 않았다 (도 4의 C). MEV2에 대한 용해 완충액-I은 pH 8~8.5에서 50 mM Tris, 0.3 M NaCl, 1% Triton X114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF 를 포함하였다. MEV-1과 달리, MEV-2는 3 M 요소의 존재하에 적절하게 용해 및 가용화되지 않았다. 용해도는 6 M 요소에서 약간 더 양호하였다. MEV2 단백질 서열은 4개의 시스테인 분자를 갖기 때문에, 본 발명자들은 MEV2 본래 단백질에서 이황화 결합의 존재를 예측하였다. 따라서, DTT와 같은 환원제의 첨가는 이황화 결합/들을 파괴하는 것을 보조할 수 있으므로, 용해도를 증가시킬 것이다. 본 발명자들은 MEV2 단백질이 6 M 요소 및 10~20 mM DTT의 존재하에 50 mM Tris, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF를 포함하는 용해 완충액-II 중에 용해되고 가용화된다는 것을 밝혀냈다. pH 8~8.5에서 3 M 요소 및 DTT의 존재하에는 유의한 용해도가 관찰되지 않았다.

실시예 3: 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 및 세척 완충액-I, II 및 세척 완충액-II에 의한 MEV 1의 세척

용해 완충액-II로 평형화한 후 5~10 mM 이미다졸의 존재하의 요소 변성 단백질 용액을 Ni-NTA IMAC 컬럼에 첨가하고, 4℃에서 3~16 시간 동안 적절한 결합을 위해 배양하였다. 이어서, 상기 칼럼을 세척 완충액-I로 세척하였는데, 여기서, 상기 세척 완충액-I은 0.1% Triton X-114 및 5~10 mM 이미다졸과 함께 pH 7.4에서 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF, 3 M 요소를 함유하는 용액을 제조함으로써 제조되었다.

다음 세척을 세척 완충액-II에서 수행하였는데, 여기서, 상기 세척 완충액-II는 0.1% Triton X-114 및 20 mM 이미다졸과 함께 pH 7.4에서 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF, 3~6 M 요소 성분들을 함유하는 용액을 제조함으로써 제조되었다. 이어서, 실시예 2에서 사용된 요소의 초기 농도에 따라, 점진적으로 감소하는 요소 농도의 존재하에 세척 완충액-III으로 적어도 2회 또는 그 이상의 세척을 추가로 수행하였는데, 여기서, 상기 세척 완충액-III은 추가로 20 mM 이미다졸과 감소하는 농도의 요소와 함께 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF를 함유하는 용액을 제조함으로써 제조되었다. 상기 세척 완충액-III은 세척 완충액-II와 달리 TritonX-114를 함유하지 않았다. 요소 농도의 점진적인 감소하에 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF를 함유하는 세척 완충액-III을 사용하여 본 발명의 목적 표적 단백질을 컬럼에서 최종적으로 세척한 후, 요소의 존재 유무하에 이미다졸의 농도 (250~500 mM)를 증가시킴으로써 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF의 용리 완충액을 통해 컬럼으로부터 용출시켰다.

대안적으로, IMAC 정제 동안, 3~6 M 요소의 존재하에 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF를 함유하는 세척 완충액-III으로 세척을 수행한 후, 3~6 M 요소, 50 mM Na₂HPO₄, 1 mM AEBSF, 0.3 M NaCl의 존재하에 증가하는 농도 (250~500 mM)의 이미다졸을 포함하는 용리 완충액에 의해 본 발명의 관심 표적 단백질을 칼럼으로부터 용출시킨다.

실시예 4: 표적 단백질 MEV1 및 MEV2의 투석 및 크기 배제 크로마토그래피 및 단백질 리폴딩

이미다졸을 제거하기 위해 10 kDa 컷오프 투석 백을 사용하여 0.1~0.3 M NaCl, 10% 글리세롤 및 0.2~0.5 M 아르기닌 또는 0.2~0.5 M 아르기닌-HCl을 포함하는 리폴딩 완충액의 존재하에 PBS (포스페이트 완충 식염수)에 대해 Ni-NTA 컬럼 기반의 친화성 정제 단백질 (MEV-1)을 추가로 투석하였다. 자동화 크로마토그래피 시스템과 함께 세파크릴 200 또는 수퍼덱스 200을 사용하여 최종 폴리싱 단계로서, 필요에 따라, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다.

대안적으로, (MEV-1의) 요소 변성 단백질 용액을 IMAC 정제에 의해 정제하고, 요소 농도가 점진적으로 감소하여 0 또는 무시할 수 있는 요소 농도로 종결되고 0.2~0.5 M 아르기닌 또는 0.2~0.5 M 아르기닌-HCl, 10%~20% 글리세롤을 포함하는 리폴딩 완충액의 존재하에 10 kDa 투석 백을 사용하는 투석에 의해 후속적으로 리폴딩하거나, 곧장 리폴딩한다. 리폴딩된 재조합 단백질 MEV1을 단일 단계 정제로서, 또는, 필요에 따라, AKTA (자동 크로마토그래피 정제기, GE)와 함께 세파크릴 200 또는 세파덱스 200 또는 수퍼덱스 200을 사용하여 IMAC 정제된 단백질에 대한 최종 단계 정제로서 크기 배제 크로마토그래피로 정제한다. 한편, 0.2~1 M 아르기닌 또는 아르기닌-HCL, 및/또는 0.05 mM 내지 10 mM 사이의 농도를 가지는 시스테인/시스틴 또는 GSSG/GSH 또는 산화된 DTT/환원된 DTT 또는 시스타민/시스테아민과 같은 산화 환원 쌍 시약의 존재하에 감소하는 요소 (6 M에서 0.1 M로) 및 DTT (20 mM에서부터 무시할 수 있는 농도 또는 0.1 mM 이하로) 농도로 MEV2 단백질을 리폴딩시켰다. MEV2 단백질을 상기에서 언급된 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정제한다. 최대 96% 순도의 MEV2 단백질을 달성할 수 있다.

표 4에 주어진 열 응력으로부터 보호하기 위해 (상기 단백질에 유해할 수 있는 반복적 냉동 해동을 피하기 위해), 상기 단백질을 -20℃에서 폴리올 또는 당류, 예를 들어, 5~40% 글리세롤 또는 5~60% 수크로오스 또는 5~40% 트레할로오스 또는 5~40% 소르비톨 중에 저장하였다.

실시예 5: IB 단백질 MEV1 추출 및 정제의 결과 및 성과

Ni-NTA 컬럼으로부터의 용출 분획의 SDS-PAGE 실행 (도 5의 A) 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의한 직접 정제는 각각 약 최대 ~94~96% 순도의 단백질의 존재를 나타냈다 (표 1 및 2). his 태그된 단클론 항체에 의한 웨스턴 블롯 분석은 당해 블롯에서 목적하는 재조합 단백질의 특이적 발현을 나타냈다 (도 5의 B).

IMAC 및 크기 배제 크로마토그래피로부터의 순도 등급 (MEV1에 대해 적용 가능)

단계	순도 %
용해 후	22~28% 사이
요소 변성 후	50~60% 사이
IMAC 정제 후	90~94% 사이의 순도
크기 배제 크로마토그래피 후	92~96% 사이의 순도

크기 배제 크로마토그래피 정제로부터의 순도 등급 (MEV1과 MEV2 둘 다에 대해 적용 가능)

단계	순도 %
용해 후	22~28% 사이
요소 변성 후	50~60% 사이
크기 배제 크로마토그래피 정제 후	최대 96%

실시예 6: MEV1 재조합 단백질의 면역원성

동물 실험 위원회에 의해 승인될 절차를 엄격하게 유지하면서 모든 마우스 실험을 수행하였다. 6주령 암컷 BALB/c 마우스의 그룹을 프로인트 완전 아쥬반트 (CFA; Sigma), 알룸, MPLA 및 알룸, Ribi 아쥬반트, PolyIC, AddaVax (MF59 유사) 또는 PBS와 조합하여, 재조합 단백질 단독으로 접종하였다.

이어서, 모든 마우스를 2주 간격으로 프로인트 불완전 아쥬반트 (IFA) 또는 다른 각각의 아쥬반트 중의 동일한 용량으로 2회 부스터 처리하였다. 1차 면역화 후 2~3주 및/또는 2차 및 3차 면역화 후 2주에, 혈청 샘플을 제조하고, 사용할 때까지 냉동 저장하였다. 마지막 면역화 후 2주에 혈청을 수집한 후 동물을 희생시켰다.

ELISA 플레이트를 0.1 M 카보네이트 완충액 (pH 9.6) 중에서 0.5~1 μg의 MEV1 항원 또는 합성 펩타이드로 밤새 코팅하였다. 다음날, 상기 플레이트를 3% 탈지유 중에서 1.5 시간 동안 차단시켰다. 후속적으로, 연속 희석된 면역화 혈청을 웰에 첨가하고, 1.5 시간 동안 인큐베이션 처리하였다. Tween20 (PBST)을 함유하는 포스페이트 완충 식염수로 수회 세척한 후, 웰을 1:2000 희석 항-마우스 IgG HRP 컨쥬게이트된 항체 (Thermo Scientific) 또는 항-마우스 IgG1 HRP 컨쥬게이트된 항체 (Thermo Scientific) 또는 IgG2a HRP 컨쥬게이트된 항체 (Abcam)와 함께 인큐베이션 처리하고, 추가로 1 시간 동안 인큐베이션 처리하였다. PBST에 의한 수회 세척 및 PBS에 의한 최종 세척 후, ELISA (Amresco)에 대한 TMB (3,3',5,5'-테트라에틸벤지딘) 기질을 발색 현상을 위해 첨가하고, 0.6~1 M HCL로 반응을 정지시켰다.

상이한 아쥬반트의 존재하에 수행된 동물 면역원성 연구 및 ELISA에 의한 수집 혈청의 후속 분석은 상이한 아쥬반트의 존재하에 각각 12500 내지 100000 범위의 종점 역가를 나타냈다 (도 8). 1 초과의 IgG1/IgG2a 비는 Th2 림프구와 주로 관련된 면역 반응을 나타내며, 1 미만의 IgG1/IgG2a 비는 Th1 림프구와 주로 관련된 면역 반응을 나타낸다. 각각 프라임 용량으로서의 10 μg의 항원과 CFA 아쥬반트, 및 2차 부스터 용량으로서의 항원과 IFA 아쥬반트 조합에 의한 면역화 후 12.04의 비를 수득하였다 (도 6). 2차 부스터 용량으로서 10 μg의 항원과 알룸 아쥬반트로 면역화된 비는 7.75인 것으로 밝혀졌다 (도 6). 유도된 항체는 알룸 및 CFA/IFA 아쥬반트의 존재하에 특이적이고 대단히 면역원성이다. MEV1 면역화된 혈청 유래의 IgG1/IgG2a의 보다 높은 비는 면역 반응에서 Th2 림프구의 관여를 나타낸다. IFA의 존재하의 면역화는 최종 부스터 용량 동안 강력한 IgG1 반응을 유도하였다. 알룸의 존재하에 MEV1 면역화된 혈청은 더 많은 IgG1 면역 반응을 지시하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 알룸이 Th2 관련 면역 반응에 관여하는 것으로 나타난 이전 연구를 뒷받침하는 Th2 림프구 관여를 나타낸다. 대조적으로, MPLA+알룸, Poly(I:C) 또는 AddaVax로 제형화된 10 μg의 항원은 0.47, 0.76 및 0.44의 IgG1:IgG2a 비로 약간 더 높은 IgG2a를 생성하였는데, 이는 Th1 매개성 면역 반응에 대한 약간의 편향과 함께 전반적으로 균형 잡힌 Th1/Th2 면역 반응을 나타낸다.

본 발명자들은 또한 상이한 아쥬반트로 제형화된 MEV1에 의해 면역화된 마우스로부터 단리된 비장 세포로부터 Th1 및 Th2 림프구 특이적 면역 반응을 각각 나타내는 인터페론 감마 (IFN-γ) 및 인터류킨-4 (IL-4) 정량적 검정을 수행하였다. 비장 세포를 24 웰 플레이트에 플레이팅 한 후, 항원 또는 펩타이드로 자극하였다. 72 시간 후, 상청액을 수집하고, 키트를 사용하여 사이토카인 검정을 수행하였다. 본 발명자들은 MPLA 및 알룸으로 제형화된 재조합 항원이 유의한 인터페론 감마를 유도하는 반면, 알룸에 의한 제형이 비교적 더 많은 IL-4를 유도한다는 것을 밝혀냈다. 인터페론 감마는 Th1형 반응에 대한 지표이며, IL4는 Th2형 면역 반응에 대한 지표이다. 따라서, MPLA 및 알룸의 존재하의 제형은 더 많은 Th1형 면역 반응을 유도하고, 알룸 단독에 의한 제형은 더 많은 Th2 특이적 면역 반응을 유도한다.

면역형광 검정: 베로 세포를 0.1~0.2 MOI의 EV71 또는 CVA16 바이러스로 감염시켰다. 감염 후 1일에, 상기 세포를 메탄올-아세톤 용액 (1:1 v/ v)으로 1 시간 동안 고정시켰다. 이어서, 상기 세포를 1 시간 동안 1~3% BSA로 차단하였다. 후속적으로, 상기 세포를 연속 희석된 혈청과 실온에서 1.5 시간 동안 또는 4℃에서 밤새 인큐베이션 처리하였다. PBS에 의한 수회 세척 후, 상기 세포를 항-마우스 IgG Alexa Fluor 488 컨쥬게이트된 항체 (Thermo Scientific)와 함께 1 시간 동안 인큐베이션 처리하고 형광 현미경으로 관찰하였다.

1차 항체로서의 MEV1에 대해 발생된 혈청을 사용하여 바이러스 감염된 베로 세포 및 모의 감염된 베로 세포에 의한 면역 형광 검정에 의하면, MEV1 항원에 대해 생성된 항체는 EV71 및 CVA16 바이러스 둘 다와 결합하는 것으로 나타났다 (도 7). 6400의 EV71 항원 특이적 역가 및 800의 CVA16 항원 특이적 역가를 MEV1에 의해 달성한다.

시험관내 중화 검정: 시험관내 중화를 플라크 (PRNT50)의 50% 감소에 의해 평가하였다. 베로 세포를 바이러스 또는 바이러스 혼합물의 사전 최적화된 (pre-optimized) 계수 가능한 플라크 형성 단위 (Plaque forming unit: PFU) 및 12 웰 형식으로 연속 희석된 혈청 (1:1)으로 감염시켰다. 감염 후 1.5 시간 후, 상기 세포를 배지에서 0.8% 카복시메틸 셀룰로오스 (CMC) (Sigma)로 덮어씌웠다. 감염 후 4일에 상기 세포를 10% 포르말린 중에서 고정시키고, 플라크 시각화를 위해 0.8% 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. PRNT50은 플라크 수의 50% 이상 감소를 나타내는 최고 혈청 희석액으로서 계산되었다.

MPLA 및 알룸 조합으로 아쥬반트 첨가된 MEV1은 EV71 및 CVA16에 대해 최고 중화 역가를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (표 3).

PRNT50 역가

아쥬반트 제형	EV71	CVA16
CFA/IFA	40	20
알룸	30	15
알룸+MPLA	80	20
Adavax (MF59 유사)	30	15
Poly(I:C)	30	15

면역 형광 및 PRNT₅₀ 검정으로부터 수득된 결과에 의하면, 2종의 바이러스 모두에 대해 유도 항체의 교차 반응성 및 교차 방어성이 나타났다. 전체 IgG, IgG 이소형 검정 및 사이토카인 검정에 의하면, MEV1은 적절한 아쥬반트의 존재하의 세포성 및 체액성 면역 반응 둘 다가 유의하게 생성될 수 있는 것으로 나타났다.

정제된 합성 MEV-1에 의한 안정성 연구

시간	온도
	4℃ (5±3℃)	37±2℃
1주일	95%	> 90%
2주일	95%	> 70%
1개월	95%
3개월	93%
6개월	91%

SEQUENCE LISTING <110> Bharat Biotech International Limited <120> A SYNTHETIC POLYPEPTIDE EPITOPE BASED VACCINE COMPOSITION <130> P-17-554-IN <140> 201741023411 <141> 2017-07-03 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 777 <212> DNA <213> Nucleic acid sequence of MEV1 <400> 1 catatggctg caggttctgg ttacgacggt tacccgacct tcggtgaaca caaacaggaa 60 aaagacctgg aatacggtgg ttctggtggt tacctgttca aaaccaaccc gaactacaaa 120 ggtaacgaca tcaaaggtgg ttctggtggt atgcgtatga aacacgttcg tgcttggata 180 ccgcgtatgc gtggtggttc tggtggttac gacggttacc cgaccttcgg tgaacacaaa 240 caggaaaaag acctggaata cggtggttct ggtggttacc tgttcaaaac caacccgaac 300 tacaaaggta acgacatcaa aggtggttct ggtggtatgc gtatgaaaca cgttcgtgct 360 tggataccgc gtatgcgtgg tggttctggt ggttacgacg gttacccgac cttcggtgaa 420 cacaaacagg aaaaagacct ggaatacggt ggttctggtg gttacctgtt caaaaccaac 480 ccgaactaca aaggtaacga catcaaaggt ggttctggtg gtatgcgtat gaaacacgtt 540 cgtgcttgga taccgcgtat gcgtggtggt tctggtggtt acgacggtta cccgaccttc 600 ggtgaacaca aacaggaaaa agacctggaa tacggtggtt ctggtggtta cctgttcaaa 660 accaacccga actacaaagg taacgacatc aaaggtggtt ctggtggtat gcgtatgaaa 720 cacgttcgtg cttggatacc gcgtatgcgt catcatcacc atcaccacta aggatcc 777 <210> 2 <211> 255 <212> PRT <213> Amino acid sequence of MEV1 <400> 2 Met Ala Ala Gly Ser Gly Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His 1 5 10 15 Lys Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Leu Phe 20 25 30 Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Met Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Met Arg Gly 50 55 60 Gly Ser Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln 65 70 75 80 Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Leu Phe Lys Thr 85 90 95 Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met 100 105 110 Arg Met Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Met Arg Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys 130 135 140 Asp Leu Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Leu Phe Lys Thr Asn Pro 145 150 155 160 Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Arg Met 165 170 175 Lys His Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Met Arg Gly Gly Ser Gly Gly 180 185 190 Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys Gln Glu Lys Asp Leu 195 200 205 Glu Tyr Gly Gly Ser Gly Gly Tyr Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr 210 215 220 Lys Gly Asn Asp Ile Lys Gly Gly Ser Gly Gly Met Arg Met Lys His 225 230 235 240 Val Arg Ala Trp Ile Pro Arg Met Arg His His His His His His 245 250 255 <210> 3 <211> 1359 <212> DNA <213> Nucleic acid sequence of MEV2 <400> 3 catatgcgtc gtggcagcta tgatggttat ccgaccttcg gcgagcacaa acaagaaaaa 60 gacctggaat acggcggcgg cagcgcgggc ggcaccggca ccgaggacag ccacccgccg 120 tataaacaaa cccaaccggg tgcgggtggc ggtagcgtga acaacgttcc gaccaacgcg 180 accagcctga tggagcgtct gggcggtccg ggctacccga ccttcggtga acacctgcaa 240 gcgaacgacc tggattatgg ccagtgcggc ggtggcagca accaaccgta cctgtttaaa 300 accaacccga actataaggg taacgacatc aaaggtggcg gtagccacta ccgtgcgcac 360 gcgcgtgcgg gttatttcga ctactatacc ggtccgggtc cgtacgatgg ctatccgacc 420 tttggcgagc acaagcagga aaaagacctg gagtatggcg gtggcagcgc gggtggcacc 480 ggcaccgaag atagccaccc gccgtacaaa caaacccagc cgggtgcggg tggcggtggc 540 agcgtgaata atgtgccgac caatgcgacc agcctgatgg aacgtctggg tggcccgggc 600 tatccgacct ttggcgaaca cctgcaagcg aatgacctgg attacggcca atgcggcggt 660 ggcagcaatc agccgtacct gtttaagacc aatccgaatt ataagggcaa cgacattaaa 720 ggtggcagcc actatcgtgc gcacgcgcgt gcggggtact ttgactacta taccggtccg 780 ggtccgtacg atggctatcc gacgtttggt gaacacaagc aggagaaaga cctggaatat 840 ggtggtggta gcgcgggtgg caccggcacc gaggatagcc acccgccgta taaacaaacg 900 caaccgggtg cgggcggtgg cagcgtgaat aatgttccta ctaatgctac cagcctgatg 960 gaacgcctgg gtggtccggg ttacccgact tttggcgaac acctgcaagc aaatgacctg 1020 gattatggcc aatgcggtgg cggtagcaat caaccttacc tgtttaagac taacccgaac 1080 tataagggca acgacatcaa aggcggtggc agccactatc gtgcgcacgc gcgtgcgggc 1140 tatttcgatt actataccgc gggcgcgggt gcgcagctga ccatcggtaa cagcaccatt 1200 accacccaag aagcggcgaa catcggcggt ggcagcccgc accagtggat taacctgcgt 1260 accaacaact gcgcgaccat cattggtggc ggtagcatgg cgaccggtaa aatgctgatt 1320 gcgtacaccc cgccgggtgg tccgctgccg taaggatcc 1359 <210> 4 <211> 449 <212> PRT <213> Amino acid sequence of MEV2 <400> 4 Met Arg Arg Gly Ser Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys 1 5 10 15 Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Gly 20 25 30 Thr Glu Asp Ser His Pro Pro Tyr Lys Gln Thr Gln Pro Gly Ala Gly 35 40 45 Gly Gly Ser Val Asn Asn Val Pro Thr Asn Ala Thr Ser Leu Met Glu 50 55 60 Arg Leu Gly Gly Pro Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala 65 70 75 80 Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Gly Ser Asn Gln Pro Tyr 85 90 95 Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Gly Gly 100 105 110 Gly Ser His Tyr Arg Ala His Ala Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Tyr 115 120 125 Thr Gly Pro Gly Pro Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys 130 135 140 Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Gly 145 150 155 160 Thr Glu Asp Ser His Pro Pro Tyr Lys Gln Thr Gln Pro Gly Ala Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Ser Val Asn Asn Val Pro Thr Asn Ala Thr Ser Leu Met 180 185 190 Glu Arg Leu Gly Gly Pro Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln 195 200 205 Ala Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Gly Ser Asn Gln Pro 210 215 220 Tyr Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Gly 225 230 235 240 Gly Ser His Tyr Arg Ala His Ala Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Tyr 245 250 255 Thr Gly Pro Gly Pro Tyr Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Lys 260 265 270 Gln Glu Lys Asp Leu Glu Tyr Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly Thr Gly 275 280 285 Thr Glu Asp Ser His Pro Pro Tyr Lys Gln Thr Gln Pro Gly Ala Gly 290 295 300 Gly Gly Ser Val Asn Asn Val Pro Thr Asn Ala Thr Ser Leu Met Glu 305 310 315 320 Arg Leu Gly Gly Pro Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Glu His Leu Gln Ala 325 330 335 Asn Asp Leu Asp Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Gly Ser Asn Gln Pro Tyr 340 345 350 Leu Phe Lys Thr Asn Pro Asn Tyr Lys Gly Asn Asp Ile Lys Gly Gly 355 360 365 Gly Ser His Tyr Arg Ala His Ala Arg Ala Gly Tyr Phe Asp Tyr Tyr 370 375 380 Thr Ala Gly Ala Gly Ala Gln Leu Thr Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr 385 390 395 400 Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile Gly Gly Gly Ser Pro His Gln Trp Ile 405 410 415 Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys Ala Thr Ile Ile Gly Gly Gly Ser Met 420 425 430 Ala Thr Gly Lys Met Leu Ile Ala Tyr Thr Pro Pro Gly Gly Pro Leu 435 440 445 Pro

Claims (13)

1. a. 백신 항원으로서, 상기 백신 항원이 서열번호 2 (MEV1로 명명)로 표시되는 재조합 단백질 서열의 합성 작제물인, 백신 항원;
   b. 아쥬반트;
   c. 안정화제; 및
   d. 포스페이트 완충액 및 시트레이트 완충액으로부터 선택된 생리학적으로 허용되는 완충액
   을 포함하는, EV71 및 CA16에 의해 유발되는 수족구병의 예방용 백신 조성물로서,
   상기 백신 조성물이 5±3℃에서 6개월 이상 및 37℃±2에서 최대 2주 동안 안정한, 백신 조성물.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 단백질을 가지는 상기 백신 항원이 서열번호 1로 표시되는 코돈 최적화된 유전자 서열로부터 수득되는, 백신 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 아쥬반트가 알룸, 스쿠알렌계 아쥬반트, 몬타나이드, RIBI 아쥬반트, 완전 프로인트 아쥬반트 및 불완전 프로인트 아쥬반트, MPL, 무라밀 디펩타이드, 수중유 에멀젼, TLR 리간드 기반의 아쥬반트, CpG 올리고뉴클레오타이드, 비-CpG 올리고뉴클레오타이드, 사포닌, 비타민, 및 면역 조절제의 군으로부터 선택되는, 백신 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 알룸이 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 수산화물인, 백신 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 스쿠알렌계 아쥬반트가 MF59인, 백신 조성물.
6. 제3항에 있어서, 상기 사포닌이 QS-1, ISCOM, 또는 ISCOMATRIX 인, 백신 조성물.
7. 제3항에 있어서, 상기 면역 조절제가 사이토카인인, 백신 조성물.
8. 제1항에 있어서, 상기 안정화제가 5~60% 수크로오스 또는 5~40% 트레할로오스의 당류, 또는 5~40% 글리세롤 또는 5~40% 소르비톨과 같은 당 알코올로부터 선택되는, 백신 조성물.
9. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 백신 항원이 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는, 백신 조성물:
   a. 코돈 최적화된 유전자 서열, 즉, 서열번호 1로부터의 서열번호 2의 단백질 서열을, 15℃~37℃ 사이에서 0.2~0.75 mM IPTG을 사용하여, 대장균 (E. coli) BL21 (DE3) 세포 또는 로제타 세포로부터 선택되는 적합한 숙주에서 봉입체의 형태로 발현시키는 단계;
   b. 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿 중의 목적 단백질을 수득하는 단계;
   c. 단계 (b)의 상기 펠릿을, 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF를 포함하는 MEV1에 대한 용해 완충액-I으로 현탁시키고, 동시에 냉동 해동 사이클을 3회 이상 동안 수행한 후, 그 사이에 30초 이상의 간격으로 20초 동안 초음파 처리하는 단계;
   d. 3~6 M 요소, 5~10 mM 이미다졸, 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl 및 1 mM AEBSF를 포함하는 MEV1에 대한 용해 완충액-II로 4℃에서 3~16 시간 동안 세포 용해를 수행하여, pH 7.4에서 MEV1에 대해 불용성 단백질을 회수하여 MEV1의 변성 단백질 용액을 수득하는 단계;
   e. 상기 단계 (d)의 변성 단백질 용액을 Ni-NTA 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 컬럼에 첨가한 후, 0.1% Triton X-114 및 5~10 mM 이미다졸과 함께 pH 7.4에서 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF, 3 M 요소를 포함하는 세척 완충액-I로 세척하는 단계;
   f. MEV1에 대해, 상기 단계 (e) 후에, 0.1% Triton X-114 및 20 mM 이미다졸과 함께 pH 7.4에서 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF, 3~6 M 요소를 포함하는 세척 완충액-II로 세척을 다시 수행한 후; 추가적으로 20 mM 이미다졸과 감소하는 농도의 요소와 함께 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF를 포함하는 세척 완충액-III으로 세척하는 단계;
   g. 선택적으로 3-6M 요소와 함께 이미다졸의 농도 (250~500 mM)를 증가시킴으로서 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF를 포함하는 용리 완충액으로 표적 단백질 MEV1을 용출시키는 단계; 및
   h. 상기 단계 (g) 후에, 10 kDa 컷오프 막을 사용하여 포스페이트 완충 식염수에 대해 MEV-1의 투석을 수행하고, 0.1~0.3 M NaCl, 10% 글리세롤 및 0.2~0.5 M 아르기닌 또는 0.2~0.5M 아르기닌-HCl을 포함하는 리폴딩 완충액으로 리폴딩한 후, 선택적으로, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 92% 내지 96% 이상의 순도를 가지는 최종 단백질 MEV-1을 수득하는 단계.
10. 제1항의 백신 조성물을 제조하는 방법으로서,
    서열번호 2의 백신 항원을 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조하는 것인, 방법:
    a. 코돈 최적화된 유전자 서열, 즉, 서열번호 1로부터의 서열번호 2의 단백질 서열을, 15℃~37℃ 사이에서 0.2~0.75 mM IPTG을 사용하여, 대장균 (E. coli) BL21 (DE3) 세포 또는 로제타 세포로부터 선택되는 적합한 숙주에서 봉입체의 형태로 발현시키는 단계;
    b. 10,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포 펠릿 중의 목적 단백질을 수득하는 단계;
    c. 단계 (b)의 상기 펠릿을, 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl, 1% TritonX-114, 0.5 mg/ml 라이소자임, 1 mM AEBSF를 포함하는 MEV1에 대한 용해 완충액-I으로 현탁시키고, 동시에 냉동 해동 사이클을 3회 이상 동안 수행한 후, 그 사이에 30초 이상의 간격으로 20초 동안 초음파 처리하는 단계;
    d. 3~6 M 요소, 5~10 mM 이미다졸, 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl 및 1 mM AEBSF를 포함하는 MEV1에 대한 용해 완충액-II로 4℃에서 3~16 시간 동안 세포 용해를 수행하여, pH 7.4에서 MEV1에 대해 불용성 단백질을 회수하여 MEV1의 변성 단백질 용액을 수득하는 단계;
    e. 상기 단계 (d)의 변성 단백질 용액을 Ni-NTA 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 컬럼에 첨가한 후, 0.1% Triton X-114 및 5~10 mM 이미다졸과 함께 pH 7.4에서 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF, 3 M 요소를 포함하는 세척 완충액-I로 세척하는 단계;
    f. MEV1에 대해, 상기 단계 (e) 후에, 0.1% Triton X-114 및 20 mM 이미다졸과 함께 pH 7.4에서 50 mM Na₂HPO₄, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF, 3~6 M 요소를 포함하는 세척 완충액-II로 세척을 다시 수행한 후; 추가적으로 20 mM 이미다졸과 감소하는 농도의 요소와 함께 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF를 포함하는 세척 완충액-III으로 세척하는 단계;
    g. 선택적으로 3-6M 요소와 함께 이미다졸의 농도 (250~500 mM)를 증가시킴으로서 50 mM Na₂HPO_4, 0.3 M NaCl, 1 mM AEBSF를 포함하는 용리 완충액으로 표적 단백질 MEV1을 용출시키는 단계; 및
    h. 상기 단계 (g) 후에, 10 kDa 컷오프 막을 사용하여 포스페이트 완충 식염수에 대해 MEV-1의 투석을 수행하고, 0.1~0.3 M NaCl, 10% 글리세롤 및 0.2~0.5 M 아르기닌 또는 0.2~0.5M 아르기닌-HCl을 포함하는 리폴딩 완충액으로 리폴딩한 후, 선택적으로, 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 92% 내지 96% 이상의 순도를 가지는 최종 단백질 MEV-1을 수득하는 단계.
11. 92%~96% 이상의 순도를 가지는 서열번호 2에 기재된 다중 에피토프 합성 단백질.
12. 삭제
13. 삭제