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KR102708285B1 - 조혈 줄기세포의 선택적 제거 및 대체를 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

조혈 줄기세포의 선택적 제거 및 대체를 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR102708285B1
KR102708285B1 KR1020197030000A KR20197030000A KR102708285B1 KR 102708285 B1 KR102708285 B1 KR 102708285B1 KR 1020197030000 A KR1020197030000 A KR 1020197030000A KR 20197030000 A KR20197030000 A KR 20197030000A KR 102708285 B1 KR102708285 B1 KR 102708285B1
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KR
South Korea
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seq
amino acid
cells
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에릭 오스터택
데본 셰드록
줄리안 데이비드 다운
Original Assignee
포세이다 테라퓨틱스, 인크.
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Abstract

대상체에서 적어도 하나의 표적 세포를 제거하는 방법에 있어서, 복수의 면역 세포를 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 복수의 면역 세포 각각은 적어도 하나의 표적 세포 상의 표적 리간드에 각각 특이적으로 결합하는 하나 이상의 키메라 리간드 수용체(CLR: chimeric ligand receptor)(들)를 발현하며, 표적에 하나 이상의 CLR(들)의 특이적인 결합은 면역 세포를 활성화하고, 활성화된 면역 세포는 표적 세포의 사멸을 유도하는 것인 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 예시적인 표적 세포는 조혈 줄기세포(HSC: hematopoietic stem cell)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.

Description

조혈 줄기세포의 선택적 제거 및 대체를 위한 조성물 및 방법
관련 출원
본 출원은 2017년 3월 13일에 출원된 가출원 USSN 62/470,814호 및 2017년 12월 7일에 출원된 USSN 62/596,062호의 이익을 주장하며, 그 내용은 각각 본원에서 그 전문으로 참고로 포함된다.
서열 목록의 포함
"POTH-026_001WO_SeqList.txt"로 명명된 텍스트 파일의 내용은 2018년 3월 2일에 작성되었으며 크기가 229 KB이며, 이로써 그 전체가 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 분자 생물학, 보다 구체적으로는 조혈 줄기세포(HSC: hematopoietic stem cell)를 선택적으로 표적화하는 키메라 리간드 수용체를 발현하는 세포, 이의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.
내인성 조혈 줄기세포(HSC)를 치료용 HSC 조성물로 대체하기 전에 대상체에서 내인성 HSC를 선택적으로 제거하는 방법(예를 들어, 골수 이식과 관련하여)에 대해 당 업계에서 오랫동안 요구를 느껴왔지만 충족되지 않았다. 본 발명은 대상체에서 내인성 조혈 줄기세포(HSC)를 선택적으로 제거하는 조성물 및 방법을 제공한다.
본 발명은 대상체에서 적어도 하나의 표적 세포를 제거하는 방법에 있어서, 복수의 면역 세포를 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 복수의 면역 세포 각각은 적어도 하나의 표적 세포 상의 표적 리간드에 각각 특이적으로 결합하는 하나 이상의 키메라 리간드 수용체(CLR: chimeric ligand receptor)(들)를 발현하며, 표적 리간드에 대한 하나 이상의 CLR(들)의 특이적인 결합은 면역 세포를 활성화하고, 활성화된 면역 세포는 표적 세포의 사멸을 유도하는 것인 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 방법은 복수의 면역 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 대상체의 면역계를 이식하는 방법에 있어서, (a) 복수의 면역 세포를 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 복수의 면역 세포 각각은 적어도 하나의 표적 세포 상의 표적 리간드에 각각 특이적으로 결합하는 하나 이상의 키메라 리간드 수용체(CLR)(들)를 발현하며, 표적 리간드에 대한 하나 이상의 CLR(들)의 특이적인 결합은 면역 세포를 활성화하고, 활성화된 면역 세포는 표적 세포의 사멸을 유도하는 것인 단계; (b) 복수의 면역 세포를 제거하는 단계; 및 (c) 복수의 치료용 조혈 줄기세포(HSC)를 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료용 HSC"는 본 발명의 표적 세포의 선택적 제거 후 대상체에게 투여되는 다수의 HSC 또는 HSC 집단을 기재하고자 한다. 치료용 HSC는 제거된 표적 HSC를 대체하는 건강하거나 질환이 없는 자기유래 또는 동종이계 HSC를 포함할 수 있다. 대안적으로, 치료용 HSC는 HSC 기능을 개선하기 위해, 니치(niche) 또는 미세 환경을 컨디셔닝하기 위해, 다른 세포 또는 세포 유형을 컨디셔닝하기 위해, 또는 치료용 HSC와 동일한 공급원으로부터의 세포, 조직, 또는 장기로 후속 이식에 대한 대상체의 면역계에 관용을 일으키기 위해 임상적으로 관련된 방식으로 표적 HSC와 상이한 HSC를 포함할 수 있다. 치료용 HSC는 본 발명의 방법의 대상체, 쌍둥이(예를 들어 대상체의 하나 이상의 산발적 돌연변이(들)를 보유하지 않는 쌍둥이), 유전적으로 연관된 개체 또는 유전적으로 연관된 개체의 조합, 및 적합한 MHCI/MHCII 프로필을 가진 개체 또는 적합한 MHCI/MHCII 프로필을 가진 개체의 조합을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 임의의 인간 공급원으로부터 단리 또는 유래될 수 있다. 치료용 HSC는 질환 또는 장애의 하나 이상의 유전학적 또는 후생 유전학적 마커를 포함하지 않는 자기유래 또는 동종이계 HSC를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료용 HSC는 유전자 변형되지 않는다. 특정 실시양태에서, 치료용 HSC는 유전자 변형된다. 치료용 HSC는 질환 또는 장애의 하나 이상의 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 제거하기 위해 유전자 변형될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 치료용 HSC는 다른 세포 또는 세포 유형(예를 들어, 암세포, 줄기세포 또는 전구 세포(골아 세포, 중간엽 줄기세포, 신경 전구 세포 또는 아교 세포) 또는 면역 세포)의 활성에 영향을 미치는 하나 이상의 이온, 소분자, 펩티드, 또는 단백질을 세포 표면상에 발현하거나, 분비하거나, 치료용 HSC의 생착을 위해 더 유리한 조건을 생성하기 위해 특정 생물학적 니치 또는 미세 환경(세포 외 기질, 손상 부위, 줄기세포 니치)을 컨디셔닝하도록 유전자 변형될 수 있다. 또한, 치료용 HSC는, 예를 들어, 하나 이상의 치료용 HSC가 대상체의 면역계와 적합하지 않거나 악성 변환을 겪는 경우, 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드(즉, 안전 스위치)를 함유하도록 유전자 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료용 HSC는 치료용 HSC와 동일한 공여자로부터 유래된 세포, 조직, 이식편 또는 장기의 후속 이식에 대한 대상체의 면역계에 관용을 일으키기 위해 대상체에게 투여된다. 치료용 HSC가 대상체의 면역계에 관용을 일으키면, 면역계는 후속 이식물에 대해 저 반응성을 나타낼 것이거나, 후속 이식물을 거부하지 않을 것이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 표적 세포의 사멸을 유도하는 것은 표적 세포의 세포 용해를 유도하는 것을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포는 복수의 표적 세포이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포는 복수의 표적 세포이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 조혈 줄기세포(HSC)를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포는 복수의 표적 세포이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 면역 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 T 림프구(T 세포)이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 CD4 또는 CD8을 발현한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포는 복수의 표적 세포이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 면역 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 T 림프구(T 세포)이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 헬퍼 T(TH: helper T) 세포이다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 T 세포(TH)는 I형 헬퍼 T(TH1) 세포이다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 T 세포(TH)는 2형 헬퍼 T(TH2) 세포이다. 특정 실시양태에서, 헬퍼 T 세포(TH)는 T 헬퍼 17(TH17) 세포이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포는 복수의 표적 세포이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 면역 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 T 림프구(T 세포)이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 조절 T(TREG: regulatory T) 세포이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 유도된 조절 T(iTREG: induced regulatory T) 세포 또는 자연 조절 T(nTREG: natural regulatory T) 세포이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 유도된 조절 T(iTREG) 세포이다. 특정 실시양태에서, T 세포는 자연 조절 T(nTREG) 세포이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포는 복수의 표적 세포이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 면역 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 자연 살해(NK: natural killer) 세포이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포는 복수의 표적 세포이다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 HSC 및 면역 세포를 포함한다. 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포가 HSC 및 면역 세포를 포함하는 것을 포함하는 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 HSC 세포 및 T 세포 또는 NK 세포를 포함한다. 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포가 HSC 및 면역 세포를 포함하는 것을 포함하는 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 HSC 세포 및 T 세포 및 NK 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 HSC를 포함하고, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 면역 세포를 추가로 포함하고, 대상체는 하나 이상의 CLR(들)을 각각 발현하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물을 거부할 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 HSC를 포함하고, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 면역 세포를 추가로 포함하고, 대상체는 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물을 거부할 위험이 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물은 동종이계이다. 특정 실시양태에서, 동종이계 조성물은 건강한 공여자로부터 유래된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물은 자기유래이다. 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물이 자기유래인 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 대상체는 질환 또는 장애를 가지며, 자기유래 조성물은 질환 또는 장애의 발생 전에, 질환 또는 장애의 완화의 기간에, 또는 질환 또는 장애의 치료 후에 대상체로부터 수득한 생물학적 샘플로부터 유래된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포 중 적어도 하나의 면역 세포는 유전자 변형을 포함하며, 유전자 변형은 T 세포 수용체 또는 주조직 적합성 복합체(MHC: major histocompatability complex)의 발현을 감소시키거나 억제한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포의 일부의 면역 세포는 유전자 변형을 포함하며, 유전자 변형은 T 세포 수용체 또는 주조직 적합성 복합체(MHC)의 발현을 감소시키거나 억제한다. 특정 실시양태에서, 일부는 복수의 면역 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포의 각각의 면역 세포는 유전자 변형을 포함하며, 유전자 변형은 T 세포 수용체(TCR: T-cell receptor) 또는 주조직 적합성 복합체(MHC)의 발현을 감소시키거나 억제한다. 특정 실시양태에서, MHC는 MHC I, MHC II 또는 이들의 조합으로 이루어지거나 이를 포함한다. 특정 실시양태에서, MHC는 MHC I로 이루어지거나 이를 포함한다. 특정 실시양태에서, MHC는 MHC II로 이루어지거나 이를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 단일 가닥 절단, 이중 가닥 절단, 서열 결실, 서열 삽입, 서열 치환 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 실시양태에서, 서열 결실, 서열 삽입, 서열 치환 또는 이들의 조합은 인트론, 엑손, 프로모터, 인핸서, 전사 리프레서, CpG 부위 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 β-2 마이크로글로불린(β2M)을 코딩하는 서열을 포함하며, 유전자 변형은 MHC I의 발현을 감소시키거나 억제한다. 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 HLA-DRα, CIITA 또는 이들의 조합을 코딩하는 서열을 포함하며, 유전자 변형은 MHC II의 발현을 감소시키거나 억제한다. 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 α 쇄(TCRα), β 쇄(TCRβ) 또는 이들의 조합을 코딩하는 서열을 포함하며, 유전자 변형은 TCR의 발현을 감소시키거나 억제한다.
복수의 면역 세포 중 적어도 하나의 면역 세포가 유전자 변형을 포함하며, 유전자 변형이 T 세포 수용체 또는 주조직 적합성 복합체(MHC)의 발현을 감소 또는 억제하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인을 포함하는 조성물에 의해 도입된다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 가이드 RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 Cas9, 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN: Transcription Activator-Like Effector Nuclease), 동원체 및 프로모터 인자 1(Cpf1: Centromere and Promoter Factor 1) 또는 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN: zinc-finger nuclease)로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, Cas9는 촉매 불활성인 Cas9(dCas9) 또는 짧고 촉매 불활성인 Cas9(dsCas9)이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 dCas9는 스태필로코쿠스 피오제네스(Staphyloccocus pyogenes)로부터 단리 또는 유래된 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, dCas9는 촉매 부위를 불활성화하는 dCas9의 아미노산 서열의 위치 10 및 840에서 치환을 갖는 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 치환은 D10A 및 H840A이다. 특정 실시양태에서, dCas9 서열의 위치 1에서 "X" 잔기는 메티오닌(M)이다. 특정 실시양태에서, dCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
특정 실시양태에서, 본 발명의 dCas9는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphyloccocus aureus)로부터 단리 또는 유래된 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, dCas9는 촉매 부위를 불활성화하는 dCas9의 아미노산 서열의 위치 10 및 580에서 치환을 갖는 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 치환은 D10A 및 N580A이다. 특정 실시양태에서, dCas9는 작고 불활성의 Cas9(dSaCas9)이다. 특정 실시양태에서, dSaCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
특정 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 도메인은 Cas9, 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 IIS형 엔도뉴클레아제로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051이다. 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 Clo051이다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인은 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인은 융합 단백질로서 공유적으로 연결된다.
복수의 면역 세포 중 적어도 하나의 면역 세포가 유전자 변형을 포함하며, 유전자 변형이 T 세포 수용체 또는 주조직 적합성 복합체(MHC)의 발현을 감소 또는 억제하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포는 휴지 세포, 활성화된 세포 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포는 활성화된 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포는 휴지 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포는 휴지 CAR-T 세포, 활성화된 CAR-T 세포 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포는 활성화된 CAR-T 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포는 휴지 CAR-T 세포를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포 중 적어도 하나의 면역 세포는 적어도 하나의 표적 세포 상의 표적 리간드에 각각 특이적으로 결합하는 둘 이상의 키메라 리간드 수용체(CLR)(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포의 일부의 면역 세포는 적어도 하나의 표적 세포 상의 표적 리간드에 각각 특이적으로 결합하는 둘 이상의 키메라 리간드 수용체(CLR)(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 일부는 복수의 면역 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포의 각각의 면역 세포는 적어도 하나의 표적 세포 상의 표적 리간드에 각각 특이적으로 결합하는 둘 이상의 키메라 리간드 수용체(CLR)(들)를 발현한다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 제1 CAR은 제1 표적 리간드에 특이적으로 결합하고, 제2 CAR은 제2 표적 리간드에 특이적으로 결합하고, 제1 표적 리간드와 제2 표적 리간드는 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 제1 표적 리간드와 제2 표적 리간드는 상동성이 아니다. 특정 실시양태에서, 제3 또는 후속 CAR은 제3 또는 후속 표적 리간드에 특이적으로 결합한다. 특정 실시양태에서, 제1 표적 리간드, 제2 표적 리간드, 및 제3 또는 후속 표적 리간드는 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 제1 표적 리간드, 제2 표적 리간드, 및 제3 또는 후속 표적 리간드는 상동성이 아니다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 HSC를 포함하고 표적 HSC 상의 표적 리간드는 c-KIT/CD117, CD45, CD34, Thy1/CD90, c-mpl/CD110, CD133, CD49f, ABCG2/CD338, 탄산 무수화 효소 IX/CA9, CD123 및 CD150 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은
의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은
의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은
의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은
의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 c-KIT에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 c-KIT에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 CD133에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 CD133에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 CD133에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 CD133에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 CD133에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 CD133에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 CD133에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 CD133에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 CD133에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 CD133에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 CD133에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 CD133에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 CD133에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 CD133에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 CD133에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 CD133에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다. 특정 실시양태에서, 표적 HSC를 제거하는 복수의 면역 세포의 적어도 하나는 CD133에 특이적으로 결합하는 CAR을 포함하고, 경우에 따라, CAR은 의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열은 CD133에 특이적으로 결합하는 scFv를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 면역 세포를 포함하고 표적 면역 세포 상의 표적 리간드는 CD3, CD4, CD8, CD25, FoxP3, TCRα, TCRβ, TCRαβ, TCRγλ, CD52, NK1.1, CD16, CD30, CD31, CD38, CD56, CD94, NKG2A, NKG2C, NKp30, NKp44, NKp46, CD9, CD103, 및 KIR 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 세포 또는 복수의 표적 세포는 HSC 및 면역 세포를 포함하고, 표적 HSC상의 표적 리간드는 c-KIT/CD117, CD45, CD34, Thy1/CD90, c-mpl/CD110, CD133, CD49f, ABCG2/CD338, 탄산 무수화 효소 IX/CA9, CD123 및 CD150 중 하나 이상을 포함하고, 표적 면역 세포 상의 표적 리간드는 CD3, CD4, CD8, CD25, FoxP3, TCRα, TCRβ, TCRαβ, TCRγλ, CD52, NK1.1, CD16, CD30, CD31, CD38, CD56, CD94, NKG2A, NKG2C, NKp30, NKp44, NKp46, CD9, CD103, 및 KIR 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 방법의 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인(ectodomain); (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인(endodomain)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 인식 영역은 단백질 스캐폴드, 센티린(Centyrin), 단쇄 가변 단편(scFv), VHH, 면역글로불린 및 항체 모방체 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 아이소타입의 항체 또는 이의 단편이다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region), 중쇄 CDR(CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 포함), 경쇄 CDR(CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 포함), 항원 결합 단편(Fab), 가변 도메인(Fv), 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 완전 중쇄, 완전 경쇄, 하나 이상의 불변 도메인, Fc(결정화 가능한 단편) 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 실시양태에서, 항체 모방체는 아피바디, 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린 및 아비머, 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin: Designed Ankyrin Repeat Protein), 피노머(Fynomer), 쿠니츠(Kunitz) 도메인 펩티드, 및 모노바디 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, CLR(들) 중 적어도 하나는 이중 특이적이다. 특정 실시양태에서, 각각의 CLR(들)은 이중 특이적이다. 특정 실시양태에서, CLR(들) 중 적어도 하나는 삼중 특이적이다. 특정 실시양태에서, 각각의 CLR(들)은 삼중 특이적이다.
본 발명의 방법의 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4 및/또는 CD4 서열로부터 유래된 서열을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 인간 4-1BB, 인간 CD28, 인간 CD40, 인간 ICOS, 인간 MyD88, 인간 OX-40 세포 내 세그먼트 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 인간 CD28 및/또는 인간 4-1BB 보조 자극 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 보조 자극 도메인은 막횡단 도메인과 CD28 보조 자극 도메인 사이에 위치한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 면역 세포는 스플릿(split) CLR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 스플릿 CLR은 적어도 하나의 면역 세포에서 동시에 발현될 때, 스플릿 CLR을 발현하지 않는 면역 세포 또는 CLR을 발현하지 않는 면역 세포와 비교하여 면역 세포의 활성을 증가 또는 감소시키는 별개의 세포 내 도메인을 갖는 둘 이상의 CLR(들)을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 면역 세포는 스플릿 CLR을 포함한다. 동시 발현이 면역 세포의 활성을 증가시키는 것을 포함하는 특정 실시양태에서, 스플릿 CLR은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막횡단 도메인, 및 1차 세포 내 신호 전달 도메인으로 이루어진 엔도도메인을 포함하는 제1 CLR, 및 (b) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막횡단 도메인, 및 2차 세포 내 신호 전달 도메인으로 이루어진 엔도도메인을 포함하는 제2 CLR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB, 인간 CD28, 인간 CD40, 인간 ICOS, 인간 MyD88 또는 인간 OX-40 세포 내 세그먼트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 2차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB 및 인간 CD28을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 면역 세포는 스플릿 CLR을 포함한다. 동시 발현이 면역 세포의 활성을 감소시키는 것을 포함하는 특정 실시양태에서, 스플릿 CLR은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막횡단 도메인, 및 1차 세포 내 신호 전달 도메인 2차 세포 내 신호 전달 도메인으로 구성된 엔도도메인을 포함하는 제1 CLR, 및 (b) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막횡단 도메인, 및 억제성 세포 내 신호 전달 도메인으로 이루어진 엔도도메인을 포함하는 제2 CLR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함하고 2차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB, 인간 CD28, 인간 CD40, 인간 ICOS, 인간 MyD88 또는 인간 OX-40 세포 내 세그먼트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 1차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함하고 2차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB 및 인간 CD28을 포함한다. 특정 실시양태에서, 억제성 세포 내 신호 전달 도메인은 PD1, CTLA4, LAG3, B7-H1, B7-1, CD160, BTLA, PD1H, LAIR1, TIM1, TIM3, TIM4, 2B4, 및 TIGIT로부터 유래된 신호 전달 도메인을 포함한다. 이들 억제성 세포 내 신호 전달 도메인 및 전체적으로 또는 부분적으로 사용될 수 있는 다른 분자로부터의 추가 세포 내 신호 전달 성분은 ITIM, ITSM, YVKM, PP2A, SHP2, KIEELE, 및 Y265를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 CLR은 비표적 세포 상의 표적에 선택적으로 결합하여, 제2 CLR이 제1 CLR의 활성을 억제하도록 유도한다. 특정 실시양태에서, 제2 CLR은 표적 또는 비표적 세포에서 사멸을 유도하는 제1 CLR의 능력을 억제한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들)은 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하, 10-13 M 이하, 10-14 M 이하, 10-15 M 이하의 KD로부터 선택된 친화도로 리간드에 결합한다. 특정 실시양태에서, KD는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 대상체에게 동원 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들)을 각각 포함하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물 및 동원 조성물은 순차적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 동원 조성물은 하나 이상의 CLR(들)을 각각 포함하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물이 투여되기 전에 투여된다. 특정 실시양태에서, 동원 조성물은 하나 이상의 CLR(들)을 각각 포함하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물이 투여되기 전의 기간에 투여되며, 여기서 기간은 골수로부터 예를 들어 순환 혈액으로의 HSC의 이동을 허용하여 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 표적 HSC로의 접근을 증가시기에 충분하다. 특정 실시양태에서, 동원 조성물은 하나 이상의 CLR(들)을 각각 포함하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물이 투여되기 전 종점을 포함하여 제1일 내지 제7일 사이에 투여된다. 특정 실시양태에서, 동원 조성물은 과립구 집락 자극 인자(G-CSF: granulocyte colony stimulating factor), 플레릭사포르 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 CLR(들)을 각각 발현하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 생착 또는 하나 이상의 CLR(들)을 각각 발현하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물에 의한 적어도 하나의 표적 세포의 제거 효율을 향상시키기 위해 유효량의 프리컨디셔닝(preconditioning) 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 면역계를 억제한다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 화학요법, 방사선 요법(국소 방사선 조사 및 전신 방사선 조사를 포함하지만 이에 제한되지 않음), 자가 면역 요법 또는 거부반응 방지제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 방사선 요법, 국소 방사선 조사 또는 전신 방사선 조사를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 림프제거제, 골수제거제, 화학요법제 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 림프제거제를 포함한다. 예시적인 림프제거제는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 골수제거제를 포함한다. 예시적인 골수제거제는 낮은 선량 및/또는 국소 방사선 요법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 부술판, 트레오술판, 멜팔란 및 티오테파로 이루어진 군으로부터 선택된 화학요법제를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 하나 이상의 CLR(들)을 각각 발현하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 생착 또는 하나 이상의 CLR(들)을 각각 발현하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물에 의한 적어도 하나의 표적 세포의 제거 효율을 향상시키기 위해 유효량의 프리컨디셔닝 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 하나 이상의 CLR(들)을 각각 발현하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물이 대상체에게 투여되기 전에, 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 하나 이상의 CLR(들)을 각각 발현하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물이 대상체에게 투여되기 1분, 2분, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분 또는 이들 사이의 임의의 분 전에 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 프리컨디셔닝 조성물은 하나 이상의 CLR(들)을 각각 발현하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물이 대상체에게 투여되기 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 18시간, 24시간 또는 이들 사이의 임의의 시간 전에 대상체에게 투여된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포 중 적어도 하나의 면역 세포는 대상체에게 투여하기 전에 사전 방사선 조사된다(pre-irradiated). 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포의 일부의 면역 세포는 대상체에게 투여하기 전에 사전 방사선 조사된다. 특정 실시양태에서, 일부는 복수의 면역 세포의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포의 각각의 면역 세포는 대상체에게 투여하기 전에 사전 방사선 조사된다.
복수의 면역 세포의 적어도 하나 또는 각각의 면역 세포가 대상체에게 투여되기 전에 사전 방사선 조사되는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 제거하는 단계는 유효량의 복수의 사전 방사선 조사된 면역 세포를 대상체에게 투여함으로써 복수의 사전 방사선 조사된 면역 세포의 증식을 예방하고/거나 그의 생존을 단축시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포의 각각의 면역 세포는 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유도성 카스파제 폴리펩티드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유도성 카스파제 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다.
복수의 면역 세포의 각각의 면역 세포가 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 제거하는 단계는 카스파제 폴리펩티드를 유도하기 위해 유효량의 유도제를 대상체에게 투여함으로써 면역 세포의 사멸을 개시하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 각각의 HSC는 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 유도성 카스파제 폴리펩티드는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 유도성 카스파제 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 방법은 유도제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여함으로써 복수의 치료용 HSC의 사멸을 개시하는 단계를 추가로 포함한다.
복수의 면역 세포의 각각의 면역 세포가 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들)을 각각 포함하는 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물은 유도제를 추가로 포함한다. 복수의 면역 세포의 각각의 면역 세포가 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물은 유도제를 추가로 포함한다.
<<본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC는 유전자 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 일부의 HSC는 유전자 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 일부는 복수의 치료용 HSC의 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 각각의 HSC는 유전자 변형을 포함한다.
복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC가 유전자 변형을 포함하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 단일 가닥 절단, 이중 가닥 절단, 서열 결실, 서열 삽입, 서열 치환 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 실시양태에서, 서열 결실, 서열 삽입, 서열 치환 또는 이들의 조합은 인트론, 엑손, 프로모터, 인핸서, 전사 리프레서, CpG 부위 또는 이들의 임의의 조합을 코딩하는 서열을 포함한다. 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC가 유전자 변형을 포함하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인을 포함하는 조성물에 의해 도입된다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 가이드 RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인은 Cas9, 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 동원체 및 프로모터 인자 1(Cpf1) 또는 아연-핑거 뉴클레아제(ZFN)로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 dCas9는 스태필로코쿠스 피오제네스로부터 단리 또는 유래된 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, dCas9는 촉매 부위를 불활성화하는 dCas9의 아미노산 서열의 위치 10 및 840에서 치환을 갖는 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 치환은 D10A 및 H840A이다. 특정 실시양태에서, dCas9 서열의 위치 1에서 "X" 잔기는 메티오닌(M)이다. 특정 실시양태에서, dCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
특정 실시양태에서, 본 발명의 dCas9는 스태필로코쿠스 아우레우스로부터 단리 또는 유래된 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, dCas9는 촉매 부위를 불활성화하는 dCas9의 아미노산 서열의 위치 10 및 580에서 치환을 갖는 dCas9를 포함한다. 특정 실시양태에서, 이들 치환은 D10A 및 N580A이다. 특정 실시양태에서, dCas9는 작고 불활성의 Cas9(dSaCas9)이다. 특정 실시양태에서, dSaCas9의 아미노산 서열은 하기 서열을 포함한다:
특정 실시양태에서, 엔도뉴클레아제 도메인은 Cas9, 전사 활성화 인자 유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN), 또는 IIS형 엔도뉴클레아제로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051이다. 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 Clo051이다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인은 공유적으로 또는 비공유적으로 연결된다. 특정 실시양태에서, DNA 결합 도메인 및 엔도뉴클레아제 도메인은 융합 단백질로서 공유적으로 연결된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 뉴클레아제 도메인은 dSaCas9 및 Clo051을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 예시적인 Clo051 뉴클레아제 도메인은 다음의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다:
예시적인 dCas9-Clo051 뉴클레아제 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 이로 이루어지거나 또는 이로 이루어질 수 있다(밑줄 친 Clo051 서열(서열 번호 34), 링커 굵은 이탤릭체, dCas9 서열 이탤릭체):
복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC가 유전자 변형을 포함하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 상동 재조합의 유도, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN)의 삽입 또는 전위 현상에 의해 도입된다. 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 서열의 삽입을 초래한다. 특정 실시양태에서, 전위 현상은 기능성 전이유전자의 삽입을 초래한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 기능성 전이유전자를 포함하고 여기서 트랜스포존은 피기백(piggyBac) 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존을 포함하는 HSC는 슈퍼 피기백 트랜스포사제를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 HSC는 유전자 변형을 포함하며, 유전자 변형은 상동 재조합의 유도, 단일 가닥 올리고데옥시뉴클레오티드(ssODN)의 삽입 또는 전위 현상에 의해 도입된다. 특정 실시양태에서, 유전자 변형은 서열의 삽입을 초래한다. 특정 실시양태에서, 전위 현상은 기능적 및/또는 치료용 전이유전자의 삽입을 초래한다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 기능성 및/또는 치료용 전이유전자를 포함하고 여기서 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존을 포함하는 적어도 하나의 표적 HSC는 슈퍼 피기백 트랜스포사제를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 표적 HSC는 대상체의 내인성 HSC이다.
본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 피기백 트랜스포존을 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스포사제 효소는 피기백 트랜스포스포사제 또는 상용성 효소를 포함할 수 있다. 특정 실시양태, 특히 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다. 특정 실시양태, 특히, 트랜스포사제가 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 피기백™(PB) 트랜스포사제 효소이다. 피기백(PB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 하기 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다:
특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 3개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 하기 위치 30, 165, 282, 및 538 각각에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 165에서 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 282에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 위치 30에서 아미노산 치환이 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 165에서 아미노산 치환이 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이고, 위치 282에서 아미노산 치환이 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 538에서 아미노산 치환이 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환인 서열 번호 1의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 3에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 82에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 119에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 185에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 187에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 200에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 207에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 209에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 226에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 235에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 240에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 241에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 243에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 258에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 발린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 315에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 319에서 아미노산 치환은 트레오닌(T)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 327에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 328에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 421에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 436에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 456에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 470에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 485에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 552에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 194에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 372에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 375에서 아미노산 치환은 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 450에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 509에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함할 수 있다. 피기백™ 트랜스포사제 효소가 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 및 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환 및 서열 번호 1의 위치 450에서 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 면역계 질환 또는 장애를 갖거나 대상체는 면역계 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 자가 면역 질환 또는 장애를 갖는다. 특정 실시양태에서, 자가 면역 질환 또는 장애는 급성 파종 뇌척수염(ADEM: disseminated encephalomyelitis), 급성 괴사성 출혈성 백질 뇌염, 애디슨병, 무감마글로불린혈증, 원형 탈모증, 아밀로이드증, 강직성 척추염, 항-GBM/항-TBM 신염, 항인지질 증후군(APS: antiphospholipid syndrome), 자가 면역 혈관 부종, 자가 면역 재생불량성 빈혈, 자가 면역 자율신경 실조증, 자가 면역 간염, 자가 면역 고지혈증, 자가 면역성 면역 결핍증, 자가 면역 내이 질환(AIED: autoimmune inner ear disease), 자가 면역 심근염, 자가 면역 난소염, 자가 면역 췌장염, 자가 면역 망막증, 자가 면역 혈소판소성 자반병(ATP: autoimmune thrombocytopenic purpura), 자가 면역 갑상선 질환, 자가 면역 두드러기, 축삭 & 신경세포 신경병증, 발로병, 베체트병, 수포성 유사천포창, 심근병증, 캐슬만병, 셀리악병, 샤가스병, 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(CIDP: chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy), 만성 재발성 다발성 골수염(CRMO: chronic recurrent multifocal ostomyelitis), 척-스트라우스 증후군, 흉터 유사천포창/양성 점막 유사천포창, 크론병, 코간스 증후군, 한랭 응집소증, 선천성 심장 차단, 콕사키 심근염, 크레스트병, 본태성 혼합 한랭글로불린혈증, 탈수초성 신경병증, 포진형 피부염, 피부근염, 데빅병(시신경 척수염), 원반모양 루푸스, 드레슬러 증후군, 자궁내막증, 호산구성 식도염, 호산구성 근막염, 결절 홍반, 실험적 알레르기성 척수염, 에반스 증후군, 섬유성 폐포염, 거대세포 동맥염(측두 동맥염), 거대세포 심근염, 사구체신염, 굿파스쳐 증후군, 육아종증 다발혈관염(GPA: Granulomatosis with Polyangiitis), 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 뇌염, 하시모토 갑상선염, 용혈성 빈혈, 헤노흐-쇤라인 자반병, 임신 포진, 저감마글로불린혈증, 특발성 혈소판 감소성 자반병(ITP: idiopathic thrombocytopenic purpura), IgA 신장병증, IgG4 연관 경화성 질환, 면역조절 지질단백질, 봉입체 근염, 간질성 방광염, 소아 관절염, 소아 당뇨(1형 당뇨), 소아 근염, 가와사키 증후군, 람베르트-이튼 증후군, 백혈구 파괴 혈관염, 편평 태선, 경화성 태선, 목질 결막염, 선상 IgA 질환(LAD: linear IgA disease), 루푸스(SLE, 라임병, 만성 매니에르병, 현미경적 다발혈관염, 혼합 결합 조직병(MCTD: mixed connective tissue disease), 무렌 궤양, 무카-하베르만병, 다발성 경화증, 중증근무력증, 근염, 기면증, 시신경척수염(데빅), 중성구 감소증, 눈의 흉터 유사천포창, 시신경염, 회귀성 류마티즘, PANDAS(Pediatric Autoimmune Neuropsychiatric Disorders Associated with Streptococcus: 연쇄 구균 감염 관련 소아기 자가 면역성 신경정신과적 질환), 방종양성 소뇌 변성, 발작성 야간 혈색소 뇨증(PNH: Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria), 패리-롬버그 증후군, 파르소니지-터너 증후군, 평면부염(주변부 포도막염), 천포창, 말초 신경병증, 정맥주위성 뇌척수염, 악성 빈혈, POEMS 증후군, 결절성 다발동맥염, I형 자가 면역성 다선 증후군, II형 자가 면역성 다선 증후군, III형 자가 면역성 다선 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발근염, 심근경색 후 증후군, 심막 절개 후 증후군, 프로게스테론 피부염, 원발성 담즙성 간경화증, 원발 경화성 담관염, 건선, 건선성 관절염, 특발성 폐섬유증, 괴저성 농피증, 진성 적혈구계 무형성증, 레이노 현상, 반응성 관절염, 반사성 교감신경성 이영양증, 레이터 증후군, 재발성 다발 연골염, 하지 불안 증후군, 후복막 섬유증, 류마티스 열, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 슈미트 증후군, 공막염, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 정자 & 고환 자가면역, 강직인간 증후군, 아급성 세균성 심내막염(SBE: subacute bacterial endocarditis), 스삭 증후군, 교감성 안염, 타카야수 동맥염, 측두 동맥염/거대 세포 동맥염, 혈소판 감소성 자반병(TTP: thrombocytopenic purpura), 톨로사-헌트 증후군, 횡단 척수염, 1형 당뇨병, 궤양성 대장염, 미분화 결합 조직 질환(UCTD: undifferentiated connective tissue disease), 포도막염, 수포성 피부염 또는 백반증이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 면역 손상된다(immunocompromised).
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 염증성 장애를 갖는다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 면역계 질환 또는 장애를 갖거나 대상체는 면역계 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 면역계 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 면역계 질환 또는 장애는 의학적 개입으로 유발된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 면역계 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 그의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 전구 세포는 조혈 줄기세포(HSC)이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 그의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 전구 세포는 조혈 줄기세포(HSC)이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 림프종, 백혈병, 골수종 또는 악성 면역 증식성 질환이다. 특정 실시양태에서, 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 역형성 대세포 림프종, 혈관면역아구성 T 세포 림프종(AILT: angioimmunoblastic T-cell lymphoma), 간비장 T 세포 림프종, B 세포 림프종, 세망내피증, 세망증, 미세교종, 광범위 큰 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 점막 관련 림프 조직 림프종, B 세포 만성 림프구성 백혈병, 외투 세포 림프종(MCL: mantle cell lymphoma), 버킷 림프종, 종격동 큰 B 세포 림프종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 림프절 변연부 B 세포 림프종, 비장 변연부 림프종(SMZL: splenic marginal zone lymphoma), 혈관내 큰 B 세포 림프종, 원발성 삼출성 림프종, 림프종양 육아종증 또는 결절성 림프구 우세형 호지킨 림프종이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 그의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 전구 세포는 조혈 줄기세포(HSC)이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 림프종, 백혈병, 골수종 또는 악성 면역 증식성 질환이다. 특정 실시양태에서, 백혈병은 형질세포성 백혈병(PCL: plasma cell leukemia), 급성 적혈병 및 적백혈병, 급성 적혈병 골수증, 급성 적백혈병, 하일마이어-쇠너병, 급성 거핵모구성 백혈병(AMKL: acute megakaryoblastic leukemia), 비만세포성 백혈병, 범골수증, 골수섬유증 동반 급성 범골수증(APMF: acute panmyelosis with myelofibrosis), 림프육종 세포성 백혈병, 급성 전환기(blastic phase) 만성 골수성 백혈병, 줄기세포 백혈병, 가속기 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(AML: acute myeloid leukemia), 진성 다혈구증, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 호염기구성 백혈병, 급성 호산구성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 급성 성숙 골수아구성 백혈병, 급성 골수성 수지상 세포 백혈병, 성인 T 세포 백혈병/림프종, 공격성 NK 세포 백혈병, B 세포 전림프구성 백혈병, B 세포 만성 림프구성 백혈병, B 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수 단핵구성 백혈병, 만성 호중구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 털세포 백혈병 또는 만성 특발성 골수 섬유증이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 그의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 전구 세포는 조혈 줄기세포(HSC)이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 림프종, 백혈병, 골수종 또는 악성 면역 증식성 질환이다. 특정 실시양태에서, 골수종은 다발성 골수종, 칼러병, 골수종증, 고립 골수종, 형질 세포 백혈병, 골수 외 형질 세포종, 악성 형질 세포 종양 또는 형질 세포종이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 그의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 전구 세포는 조혈 줄기세포(HSC)이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 림프종, 백혈병, 골수종 또는 악성 면역 증식성 질환이다. 특정 실시양태에서, 악성 면역 증식성 질환은 알파 중쇄 질환 또는 감마 중쇄 질환이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 그의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 전구 세포는 조혈 줄기세포(HSC)이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 빈혈이다. 특정 실시양태에서, 빈혈은 용혈성 빈혈, 자가 면역 용혈성 빈혈, 선천성 용혈성 빈혈, 재생 불량성 빈혈, β-지중해 빈혈, 선천성 적혈구 무형성증, 선천성 적혈구 형성 이상 빈혈, 글루코스-6-인산탈수소효소 결핍, 판코니 빈혈, 유전성 구형 적혈구증, 유전성 타원 적혈구증, 유전성 열변형 적혈구증(hereditary pyropoikilocytosis), 태아 헤모글로빈의 유전적 존속, 유전성 유구 적혈구증, 헥소키나제 결핍증, 과색소성 빈혈, 저색소성 빈혈, 무효 적혈구 생성, 대적혈구 빈혈, 거대 적혈모구 빈혈, 골수 장애성 빈혈, 신경 유극 적혈구증, 무도병-유극 적혈구증, 발작성 야간 혈색소 뇨증, 피루베이트 키나제 결핍증, Rh 겹핍 증후군, 겸상 적혈구병, 철적혈모구 빈혈, 유구 적혈구성 타원 적혈구증, 지중해 빈혈, 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI: triosephosphate isomerase) 결핍증 또는 온난 자가 면역성 용혈성 빈혈이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 그의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 전구 세포는 조혈 줄기세포(HSC)이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 응고 장애 또는 출혈성 질환이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 응고 장애이다. 특정 실시양태에서, 응고 장애는 탈피브린 증후군, 단백질 C 결핍, 단백질 S 결핍, 인자 V 라이덴, 혈소판 증가증, 혈전증, 재발성 혈전증, 항인지질 증후군, 원발성 항인지질 증후군 또는 혈전성 혈소판 감소성 자반병(TTP)이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 그의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 전구 세포는 조혈 줄기세포(HSC)이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 응고 장애 또는 출혈성 질환이다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 출혈성 질환이다. 특정 실시양태에서, 출혈성 질환은 혈소판 감소증, 혈우병, 혈우병 A, 혈우병 B, 혈우병 C, 폰 빌레브란트병(vWD: Von Willebrand disease), 유전성 폰 빌레브란트병(vWD), vWD 1형, vWD 2형, vWD 3형, 글란즈만 혈소판무력증 또는 비스코트-알드리히 증후군(WAS: Wiskott-Aldrich syndrome)이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물에 의해 접촉될 수 있는 2차 표적 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 2차 표적 세포는 줄기세포 또는 전구 세포이다. 특정 실시양태에서, 줄기세포는 체세포 줄기세포이다. 특정 실시양태에서, 줄기세포는 표적 HSC, 중간엽 줄기세포, 표피 줄기세포, 상피 줄기세포, 신경 줄기세포이다. 특정 실시양태에서, 2차 표적 세포는 분화된 세포이다. 특정 실시양태에서, 분화된 세포는 적혈구, 백혈구, 단핵구, 과립구, 혈소판 또는 수지상 세포이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물에 의해 접촉될 수 있는 2차 표적 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 2차 표적 세포는 줄기세포 또는 전구 세포이다. 특정 실시양태에서, 전구 세포는 골아 세포이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 HSC는 골아 세포의 활성을 증강시키는 리간드, 펩티드 또는 단백질을 분비하도록 변형된다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물은 비정상 골아 세포 기능과 관련된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비정상 골아 세포 기능과 관련된 질환 또는 장애에 대한 하나 이상의 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 비정상 골아 세포 기능과 관련된 질환 또는 장애는 파제트병, 저인산증 또는 골화석증이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물에 의해 접촉될 수 있는 2차 표적 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 2차 표적 세포는 분화된 세포이다. 특정 실시양태에서, 분화된 세포는 적혈구, 백혈구, 단핵구, 과립구, 혈소판 또는 수지상 세포이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 HSC는 과립구의 활성을 증강시키는 리간드, 펩티드 또는 단백질을 분비하도록 변형된다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물은 비정상 과립구 기능과 관련된 질환 또는 장애를 치료 또는 예방한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 비정상 과립구 기능과 관련된 질환 또는 장애에 대한 하나 이상의 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 갖는다. 특정 실시양태에서, 비정상 과립구 기능과 관련된 질환 또는 장애는 만성 육아종성 질환이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 면역계 질환 또는 장애를 갖거나 대상체는 면역계 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 면역계 질환 또는 장애는 의학적 개입으로 유발된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 과거, 현재 또는 미래의 의학적 개입으로 인해 면역계 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 면역계 질환 또는 장애를 갖거나 대상체는 면역계 질환 또는 장애를 일으킬 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 면역계 질환 또는 장애는 감염에 의해 유발되었다. 특정 실시양태에서, 대상체는 과거, 현재 또는 잠재적 감염으로 인해 면역계 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 감염은 바이러스성, 박테리아성 및/또는 미생물성이다. 특정 실시양태에서, 감염은 바이러스성이다. 특정 실시양태에서, 감염은 바이러스성이며, 감염의 결과로서 대상체는 면역 손상된다. 특정 실시양태에서, 대상체는 HIV에 노출되거나 HIV에 감염되었다. 특정 실시양태에서, 대상체는 AIDS가 발생되었다. 특정 실시양태에서, 감염은 바이러스성이다. 특정 실시양태에서, 감염은 바이러스성이고 대상체는 암이 발생한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 투여는 전신적이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 정맥내 경로를 통해 투여된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 투여는 국소적이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 골내, 척수내 또는 뇌내 주입을 통해 투여된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 투여는 전신적이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 정맥내 경로를 통해 투여된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 투여는 국소적이다. 특정 실시양태에서, 조성물은 골내 주입을 통해 투여된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물은 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물은 유도제를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC는 유전자 변형된다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 각각의 HSC는 유전자 변형된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC는 유전자 변형된다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 각각의 HSC는 유전자 변형된다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 면역 질환 또는 장애를 가지며, 여기서 복수의 치료용 HSC는 면역 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 개선한다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC는 대상체의 면역 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 개선하도록 유전자 변형된다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 각각의 HSC는 대상체의 면역 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 개선하도록 유전자 변형된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 그의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 가지며, 복수의 치료용 HSC는 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 개선한다. 특정 실시양태에서, 질환 또는 장애는 응고 장애이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC는 응고 장애의 징후 또는 증상을 개선하는 단백질을 분비하도록 변형되었다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 대다수의 HSC는 응고 장애의 징후 또는 증상을 개선하는 단백질을 분비하도록 변형되었다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 각각의 HSC는 응고 장애의 징후 또는 증상을 개선하는 단백질을 분비하도록 변형되었다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC, 대다수의 HSC, 또는 각각의 HSC는 응고 장애의 징후 또는 증상을 개선하는 단백질을 분비하도록 변형된다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC, 대다수의 HSC 또는 각각의 HSC는 하나 이상의 응고 인자를 분비하도록 변형된다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 글리코겐 저장 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 가지며, 복수의 치료용 HSC는 글리코겐 저장 질환 또는 장애의 징후 또는 증상을 개선한다. 특정 실시양태에서, 글리코겐 저장 질환 또는 장애는 글리코겐 저장 질환(GSD: glycogen storage disease) 0형, GSD I형, GSD II형, GSD III형, GSD IV형, GSD V형, GSD VI형, GSD VII형, GSD IX형, GSD X형, GSD XI형, GSD XII형 또는 GSD XIII형이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC, 대다수의 HSC 또는 각각의 HSC는 글리코겐 신타제, 글루코스-6-포스파타제, 산 알파-글루코시다제, 글리코겐 탈분지 효소, 글리코겐 분지 효소, 근육 글리코겐 포스포릴라제, 간 글리코겐 포스포릴라제, 근육 포스포프룩토키나제, 포스포릴라제 키나제, 글루코스 수송체 GLUT2, 알돌라제 A 또는 β-에놀라제 중 하나 이상을 분비하도록 변형되며, 여기서 복수의 치료용 HSC는 각각 GSC 0형, GSD I형, GSD II형, GSD III형, GSD IV형, GSD V형, GSD VI형, GSD VII형, GSD IX형, GSD X형, GSD XI형, GSD XII형 또는 GSD XIII형의 징후 또는 증상을 개선한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 면역계 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 가지며, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC, 일부의 HSC 또는 각각의 HSC는 유전적 변형을 포함하고, 복수의 치료용 HSC의 적어도 하나의 HSC, 일부의 HSC 또는 HSC의 각각의 HSC는 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 유전적 변형은 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 제거하였다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 HSC는 자기유래이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 각각의 HSC는 자기유래이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 유전자 변형된 HSC는 자기유래이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 각각의 유전자 변형된 HSC는 자기유래이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 HSC는 동종이계이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 각각의 HSC는 동종이계이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 하나 이상의 유전자 변형된 HSC는 동종이계이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 각각의 유전자 변형된 HSC는 동종이계이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 방법은 이식편 대 숙주 질환(GvHD: graft-versus-host disease)의 발병 또는 진행을 치료 또는 예방한다. 특정 실시양태에서, GvHD를 치료하는 것은 GvHD의 징후 또는 증상을 감소시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, GvHD는 급성 GvHD이다. 특정 실시양태에서, GvHD는 만성 GvHD이다. 특정 실시양태에서, GvHD의 징후 또는 증상은 피부 발진, 피부 수포, 메스꺼움, 구토, 복부 경련, 설사, 식욕 부진, 황달, 구강 건조증, 인후 건조증, 과도한 구강 건조증, 과도한 인후 건조증, 구강 또는 인후의 궤양, 기관지 조직 건조증, 내피 조직의 건조증, 표면 조직 건조증, 피부의 패치의 상실, 피부 변색, 피부 흉터, 피부 흉터와 동시 발생한 관절 이동성 감소, 피부 상처와 동시 발생한 탈모, 안구 건조증을 일으키는 눈물 형성의 상실 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 방법이 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 발병 또는 진행을 치료 또는 예방하는 것을 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 이식 수여자이다. 특정 실시양태에서, 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물은 이식물 투여 전에 대상체에게 투여되고, 여기서 복수의 치료용 HSC 및 이식물은 동일한 공여자로부터 단리 또는 유래된다. 특정 실시양태에서, 방법은 복수의 치료용 HSC를 포함하는 조성물의 투여 후 이식물에 대한 대상체의 면역계의 관용을 일으키기에 충분한 기간을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 이식물은 세포, 조직, 조직 이식편, 장기, 장기 이식편 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 장기는 고형 장기이다.
[도 1]은 본 발명의 예시적인 유도성 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 도시하는 개략도이다.
[도 2A-B]는 예시적인 유도제 AP1903을 사용하여 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드(iC9 안전 스위치)의 시험관 내 효능을 평가한 결과를 도시하는 일련의 그래프이다. 본 발명의 카르티린을 발현하는 세포를 A) 해동시키고 하룻밤 휴지시키거나 B) 이뮤노컬트(ImmunoCult)™ 인간 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화제 시약을 사용하여 5일 동안 활성화하고 AP1903으로 표시된 기간 및 농도에 대해 처리하였다. 모든 데이터 포인트는 삼중으로 수집하였으며 수집된 1,500개 비드 이벤트당 처리 군에서 생존 세포 수를 비처리 군에서 평균 생존 세포 수로 나누어 상대 생존능을 결정하였다. 테스트된 모든 용량 수준에 걸쳐 2시간에 활성화되지 않은 카르티린 발현 세포의 80% 초과가 배양물로부터 제거되었다(도 1). 활성화되지 않은 세포에서 24시간과 48시간 시점 사이에서 관찰할 수 있는 차이는 없었다. 그러나 활성화된 카르티린 발현 세포에서는, 용량 반응 및 시간 반응 모두가 관찰되었다. AP1903 투여 12시간 후, 세포의 > 65%가 1 nM의 낮은 농도에 의해 사멸되었다. 데이터는 iC9 안전 스위치가 카르티린 발현 세포에서 기능적으로 발현되었고 효과적이었음을 입증한다. AP1903/iC9 시스템은 활성화되지 않은 세포와 비교할 때 활성화된 세포에 대해 사용될 때 더 효과적이었다. 카르티린의 발현은 세포의 활성화 시 증가하고 벡터 설계가 제공된다면 iC9의 발현도 증가할 수 있다. 따라서, 활성화된 세포는 더 높은 수준의 iC9를 발현시켜 AP1903에 더 민감하게 만들 수 있다. 많은 실시양태에서, 만약 안전 스위치를 사용한다면 활성화된 세포가 표적이 될 것이다. 이들 데이터는 활성화된 세포가 48시간에 세포의 > 95% 사멸됨으로써 AP1903에 실제로 더 민감하다는 것을 확인해준다.
[도 3]은 전신 방사선 조사 또는 부술판과 같은 유전독성제를 사용한 이식 전의 HSC의 종래의 제거 방법(맨 위 순서)을 본 발명의 방법(맨 아래 순서)과 대조하는 개략도이다. 이 도면에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법은 기능적인 그리고 건강한 수준의 혈액 세포 생산을 유지하는 이식시 HSC의 우수한 생착을 달성하는 비-유전독성 방법을 제시한다.
[도 4]는 조혈 전구 세포(HPC: hematopoietic progenitor cell)를 포함하여 비-HSC의 고갈을 최소화하기 위해 자기유래 또는 동종이계 CAR 탠덤(tandem) 표적화를 위해 가능한 표면 HSC 마커 조합을 도시하는 개략도이다.
[도 5A]는 c-kit 또는 CD133 발현 세포에 대한 ScFv 서열을 갖는 CAR 구조물을 도시하는 개략도이다. CAR 구조물은 CAR-T 세포를 생성하는데 사용된 mRNA에 의해 코딩되는 예시적인 신호 전달 도메인에 커플링된 예시적인 CAR 서열을 도시한다.
[도 5B]는 [도 5A]에 도시된 예시적인 CAR에 사용될 수 있는 예시적인 c-kit ScFv (1) (서열 번호 69), c-kit ScFv (2) (서열 번호 70), c-kit ScFv (3) (서열 번호 71), c-kit ScFv (4) (서열 번호 72), c-kit ScFv (5) (서열 번호 73), c-kit ScFv (6) (서열 번호 74) 및 c-kit ScFv (7) (서열 번호 75)의 일련의 서열이다.
[도 5C]는 [도 5A]에 도시된 예시적인 CAR에 사용될 수 있는 예시적인 c-kit ScFv (8) (서열 번호 76); 예시적인 c-kit 리간드 (1) (서열 번호 77), c-kit 리간드 (2) (서열 번호 78) 및 마우스 c-kit 리간드 (서열 번호 79); 및 예시적인 CD133 scFv (1) (서열 번호 80), CD133 scFv (2) (서열 번호 81) 및 CD133 scFv (3) (서열 번호 82)의 일련의 서열이다.
[도 5D]는 [도 5A]에 도시된 예시적인 CAR에 사용될 수 있는 예시적인 CD133 scFv (4) (서열 번호 83), CD133 scFv (5) (서열 번호 84), CD133 scFv (6) (서열 번호 85), CD133 scFv (7) (서열 번호 86) 및 CD133 scFv (8) (서열 번호 87)의 일련의 서열이다. [도 5A]에 도시된 예시적인 CAR의 서열이 또한 제공된다 (서열 번호 88).
[도 6A-E]는 c-kit(CD117) 또는 프로미닌-1(CD133)을 발현하는 인간 조혈 세포를 특이적으로 표적화하는 데 있어 CAR-T 세포의 시험관 내 효능을 평가한 결과를 도시하는 일련의 그래프이다. 인간 말초 혈액으로부터 단리된 CD3/CD28-자극된 범 T 세포(pan T-cell)를 c-kit 또는 CD133에 대한 각각의 CAR 후보 물질을 코딩하는 mRNA로 전기천공시켰다(도 5). mRNA 도입 후 당일, 항-마우스 IgG 염색 및 유동 세포 분석으로부터 항체-유도된 ScFv 서열로부터의 CAR 발현을 측정하였다(도 6A). 5시간에 CD107a 발현에 따른 탈과립화를 통해 표적 세포의 존재하에서 이펙터 CAR-T 세포의 활성화(이펙터 대 표적 세포 비 3:1)를 입증하였다. 내인성으로 균일하게 c-kit을 발현하는 TF-1 세포가 비-c-kit 발현 라지(Raji) 세포와 5% 비율로 혼합될 때 더 낮은 활성화로 c-kit에 대한 CAR-T 세포의 가장 높은 활성화를 유발하였다(도 6B). CAR-T 세포 활성화는 인간 골수 세포와의 공동 배양에 대해 유사하게 나타났지만, 마우스 c-kit 발현 EML-C1 세포주와의 공동 배양 후 모의 CAR-T 대조군 세포를 제외하고는 유의한 활성화가 관찰되지 않았다(도 6B). TF-1 세포는 항-CD133 항체 염색 및 유동 세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 CD133 코딩된 mRNA의 전기천공 후에 CD133을 발현하였다(데이터 미제시). 이들 형질감염된 세포는 8개의 항-CD133 ScFv 서열 중 4개를 포함하는 CAR-T 세포의 활성화를 가능하게 하였다. 비-CD133 발현 라지 세포와 5% 비율로 혼합된 CD133 발현 TF-1 세포 또는 인간 골수 세포에 대해 항-CD133 CAR-T 자극이 더 적게 나타났다(도 6C). CAR-T 세포를 인간 골수와 함께 2일 동안 공동 배양한 후(이펙터 대 표적 세포 비 3:1), 세포를 항-인간 CD34, CD117 및 CD133 항체로 염색하고 유동 세포 분석법으로 분석하거나 12일에 걸쳐 조혈 콜로니(CFU) 생성을 위해 인간 성장 인자가 보충된 메틸셀룰로오스 배양액(메토컬트(MethoCult)™, H4434)에 플레이팅하였다. CD34 양성 집단 내 유동 세포 분석은 6개의 항-c-kit CAR-T 세포 후보 중 3개에 대해 c-kit 양성 세포의 비율 감소와 7개의 항-c-kit CAR-T 세포 후보 중 3개에 대해 CD133 양성 세포의 비율 감소를 나타냈다(도 6D). CFU 생존 분석은 8개의 항-c-kit CAR-T 세포 후보 중 7개에 대해 기능성 조혈 전구체의 고갈을 최대 85%까지 나타내었다(도 6E).
[도 7]은 HSC를 표적화하기 위한 피기백(PB) 트랜스포존 벡터를 도시한 개략도이다. 유도성 절두된 카스파제 9(iCasp9), 키메라 항원 수용체(CAR) 및 디히드로폴레이트 환원 효소(DHFR: dihydrofolate reductase) 내성 유전자로 이루어진 트리시스트론 카세트를 유도하는데 구성적 프로모터로서 신장 인자-1 알파(EF1α)를 사용한다. CAR 영역은 CD8a 선도 펩티드, CD8a 힌지, CD8a 막횡단(TM) 도메인, 41BB 보조 자극 도메인 및 CD3 제타 쇄로 이루어진 신호 전달 도메인에 커플링된 항-인간 c-kit 및 CD133 IgG로부터의 가변 영역(VL 및 VH ScFv 서열)로 구성된다. SV40 폴리A 신호 및 250 bp cHS4 염색질 인슐레이터가 표시되어 있다. 전위 과정에서, 동시 전달된 PB 트랜스포사제는 트랜스포존 벡터의 양 말단에 위치한 트랜스포존 특이적 역전된 말단 반복 서열(ITR: inverted terminal repeat sequence)을 인식하고 전달된 DNA 플라스미드에서 원래 위치로부터 내용물을 효율적으로 이동시키고 이를 TTAA 염색체 위치에 효율적으로 통합시킨다.
[도 8A]는 피기백(PB) 전위된 항-CD117 또는 항-CD133 CAR-T 세포의 유동 세포 분석을 도시하는 일련의 플롯이다. 인간 말초 혈액 T 세포를 슈퍼 피기백(SPB) 트랜스포사제를 코딩하는 mRNA와 함께 PB 트랜스포존 pDNA(도 7)로 사전에 전기천공시켰다. CD3, CD4, CD8, CD56, CD45RA, CD62L, CCR7, CD45RO, PD1, Tim3, Lag3, CD184/CXCR4, CD25, CD127 및 CD28에 대한 항체를 사용하여 표현형 분석을 수행하였다.
[도 8B]는 [도 8A]에 나타낸 각각의 조건하에 존재하는 CD4- 및 CD8- 양성 T 세포의 비율을 도시하는 일련의 그래프이다.
[도 8C]는 피기백(PB) 전위된 항-CD117 또는 항-CD133 CAR-T 세포의 유동 세포 분석을 도시하는 일련의 플롯이다. 인간 말초 혈액 T 세포를 슈퍼 피기백(SPB) 트랜스포사제를 코딩하는 mRNA와 함께 PB 트랜스포존 pDNA(도 7)로 사전에 전기천공시켰다. CD3, CD4, CD8, CD56, CD45RA, CD62L, CCR7, CD45RO, PD1, Tim3, Lag3, CD184/CXCR4, CD25, CD127 및 CD28에 대한 항체를 사용하여 표현형 분석을 수행하였다.
[도 8D]는 [도 8C]에 나타낸 각각의 조건하에 존재하는 CD4- 및 CD8- 양성 T 세포의 비율을 도시하는 일련의 그래프이다.
[도 9A-B]는 피기백(PB) 전위된 CAR-T 세포에 의한 표적화 후에 골수 조혈 전구체의 생존능을 도시하는 한 쌍의 그래프이다. CAR-T 세포를 인간 또는 원숭이(레수스 마카크(Rhesus macaque)) 골수 세포와 2일 동안 공동 배양(이펙터 대 표적 세포 비 3:1)한 후, 12일에 걸쳐 조혈 콜로니(CFU) 생성을 위해 인간 성장 인자가 보충된 메틸셀룰로오스 배양액(메토컬트™, H4434)에 세포를 플레이팅하였다. CFU 생존 분석은 8개의 항-c-키트 CAR-T 세포 후보 중 3개에 대해 인간 기능성 조혈 전구체의 고갈을 70% 초과까지 보였다(도 9A), 이러한 동일한 항-c-kit ScFv 서열을 코딩하는 CAR-T 세포는 또한 원숭이 골수로부터의 조혈 전구체를 고갈시켜, 이 종과의 교차 반응성을 입증하였다.
[도 10A-D]는 항-c-kit 및 항-CD133 CAR-T 세포에 의한 조약돌 영역 형성 세포(CAFC: Cobblestone Area Forming Cell)의 고갈을 나타내는 한 쌍의 그래프이다. 인간 mPB CD34+ 세포를 c-kit ScFv를 코딩하는 항-c-kit CAR-T 세포(이펙터 대 표적 세포 비 3:1) (2) 또는 CD133 ScFv를 코딩하는 항-CD133 CAR-T 세포 (3)와 24시간 동안 공동 배양하였다(도 5). 이어서, 피기백 트랜스포존(도 1) 내 iC9의 동시 발현에 기인한 CAR-T 세포의 제거를 위해 10 nM AP1903으로 추가 24hr 동안 공동 배양물을 처리하고, 세포를 10-6 M 히드로코르티손이 보충된 마이엘로컬트(MyeloCult) 배지(Stem Cell Technologies)에 96 웰 플레이트에 연속 희석된 미리 확립되고 방사선 조사된(30 Gy) MS-5 골수 기질 세포층에 플레이팅하였다. LTC에서 2주 및 5주에 CAFC의 형성에 대해 양성 또는 음성인 웰의 수를 확인하고 L-Calc 소프트웨어(Stem Cell Technologies)를 사용하여 제한 희석 분석에 의해 CAFC 빈도 및 개수를 결정하였다.
[도 11A-B]는 예시적인 PB 벡터 구조물 및 제조 과정을 도시한 일련의 다이어그램이다: (A) 안전 스위치, 키메라 항원 수용체(CAR), 및 측면의 염색질 인슐레이터를 가진 선별 유전자로 이루어진 트리시스트론 카세트를 유도하는데 구성적 프로모터를 사용한다; (B) 범 T 세포를 성분 채집 산물로부터 단리한 다음, 항-CD117 또는 항-CD133 CAR 피기백™ 트랜스포존 플라스미드 DNA 및 시험관 내 전사된 피기백™ 트랜스포사제 mRNA로 전기천공시켰다. 그 후, 전기천공된 세포를 활성화, 증식 및 선별한 후 냉동시킨다. 이 과정에서 > 95% CAR 발현을 보이는 > 1 x 109 세포를 얻는다.
[도 12A-B]는 예시적인 PB CAR-T 표현형을 도시하는 일련의 그래프이다: CD117 및 CD133 항원에 대한 PB CAR-T 세포를 제조 공정 후 전형적인 T 세포 마커에 대해 유동 세포 분석법에 의해 평가하였다. (A) PB CAR-T 세포의 줄기세포 기억 표현형을 나타내는 CD4, CD8 및 기억 마커의 발현; (B) PB CAR-T 세포는 일반적으로 골수 귀소성과 관련된 마커인 CXCR4를 발현한다.
[도 13A-B]는 동원된 말초 혈액 CD34+ 세포로부터의 CD34+CD38- 전구체 집단 및 CFU에 대한 항-CD117 또는 항-CD133 CAR-T 세포의 예시적인 활성을 도시하는 일련의 그래프이다: 동원된 인간 말초 혈액으로부터 단리된 CD34+ 세포를 항-c-kit 및 CD133 CAR-T 세포와 48시간 동안 인큐베이션한 후, 남아 있는 세포의 FACS 표현형 결정 (A) 및 CFU 생존 분석 (B)을 수행하였다. 항-CD117 CAR-T는 원시 CD34+CD38- 집단으로부터 ckit+ 및 CD133+ 세포의 > 95%를 고갈시켰던 한편, 항-CD133 CAR-T는 이 집단으로부터 CD133+ 세포의 > 90%를 고갈시켰다 (A). 또한, 항-CD117 및 항-CD133 CAR-T 세포 모두는 테스트된 모든 E:T 비에서 콜로니 형성을 감소시켰다.
[도 14]는 장기간 조약돌 영역 형성 세포(CAFC)에 대한 항-CD117 또는 항-CD133 CAR-T 세포의 예시적인 활성을 도시하는 한 쌍의 그래프 및 해당 사진이다: CAR-T 세포를 동원된 인간 말초 혈액 CD34+ 세포와 2일 동안 공동 배양한 후(이펙터 대 표적 세포 비 3:1), 세포를 2개월에 걸쳐 CAFC의 생성을 위해 연속 희석된 MS-5 기질 세포 상에 플레이팅하였다. 플레이팅 5주 후에, CAR-T 세포 모두는 CAFC의 빈도를 유의하게 감소시켰으며, 이는 이들 CAR-T 세포가 바로 원시 세포를 성공적으로 표적화함을 시사한다.
[도 15A-C]는 PB CAR-T 세포의 골수 귀소성을 도시하는 일련의 그래프이다: PB CAR-T 세포는 CXCR4 발현을 증가시키기 위해 인자를 첨가(+)하거나 인자 없이(-) 배양하였다. 각각의 처리 군으로부터의 세포를 개별적으로 표지하고, 혼합하고, 4주령의 방사선 조사된 NSG 마우스에 IV로 주사하였다. (A) 인자를 추가하여 24시간 배양 후 CXCR4 발현 증가; (B) 입력 세포 비; (C) 세포 주사 16h 후, 처리와 상관없이 CAR-T 세포가 혈액 및 골수에서 동일한 비율로 발견되었다.
본 발명의 조성물 및 방법은 대상체에서 표적 세포를 선택적으로 제거하기 위해 키메라 리간드/항원 수용체(CLR/CAR)를 발현하는 유전자 변형된 면역 세포를 이용한다. 또한, 본 발명의 조성물 및 방법은 이들 CLR/CAR 발현 면역 세포가 표적 세포를 선택적으로 제거하면 CLR/CAR 발현 면역 세포를 선택적으로 제거할 수 있다. 특히 흥미롭게도, 본 발명의 조성물 및 방법은 유전자 변형될 수도 있는 치료용 세포의 후속적인 이식으로 선택적으로 파괴된 대상체의 본래 세포에 존재하는 유전적 결함을 교정하거나, 선택적으로 파괴된 세포 집단을 대체하거나, 대상체의 본래 세포 집단을 보충하여 암을 포함한 유전자, 면역 및 혈액 기반 장애를 치료할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 줄기세포 이식을 위한 선택적 컨디셔닝 전략으로서 수여자 조혈 세포에 대한 '약물-가역성' CAR-T 세포 또는 다수의 세포를 제공한다. 자기유래 또는 동종이계 조혈 줄기세포(HSC)의 이식은 광범위한 악성 및 비악성 혈액 질환을 치료할 수 있는 능력이 입증되었다. 그러나 예비 요법은 통상적으로 전신 방사선 조사 및/또는 화학요법을 통한 공격적이고 유전독성 치료를 수반하며, 이로 인해 광범위한 적용을 제한하는 심각하고 심지어 생명을 위협하는 합병증이 발생한다. 이전의 실험 연구는 수여자 HSC의 고갈이 복합 공여자 HSC의 성공적인 생착을 허용하는 데 있어 이들 컨디셔닝 요법의 필수 요건임을 확립하였다. 동물 및 임상 연구는 동종이계 반응성의 항-HSC 공여자 T 세포가 추가로 줄기세포 생착을 촉진하지만, 이는 종종 GvHD의 위험이 수반됨을 또한 보였다. 이는 항-c-kit 및 항-CD45 항체-유도된 치료와 같이 낮은 독성 부작용을 갖는 HSC의 고갈을 위한 대안적인 컨디셔닝 방법의 고려를 촉발시켰다. 이러한 방식으로, 줄기세포 이식 컨디셔닝을 위한 수명이 짧은, 유전적으로 조작된 키메라 항원 수용체(CAR)-T 세포의 적용에 의해 더 정확한 HSC 표적화가 달성될 수도 있다.
본 발명자들은 비바이러스성 피기백™(PB) 트랜스포존 시스템을 사용한 유전자 변형을 통해 수여자 HSC 표적화를 위한 신규의 제어 가능한 CAR-T 접근법을 개발하였다. 바이러스성 벡터 전달 시스템과 달리, PB의 비교적 큰 운반 용량은 동일한 트리-시스트론 전이유전자 카세트 내에서 코딩되는 적어도 3개의 별개의 유전자의 안정적인 도입을 허용한다. 여기에는 HSC 표면상에 항원으로 발현된다고 알려진 마커인 인간 c-kit(CD117) 또는 프로민-1(CD133)을 표적화하는 2세대 CAR이 포함된다. 또한, 약물 내성 요소는 비-유전독성 약물과 함께, 제조 과정에서 CAR-T 세포 정제의 효과적인 방법을 제공하는 선별 유전자로서 작용한다. 중요하게도, 소분자 약물-유도성 안전 스위치 유전자가 또한 포함되어 수여자 HSC의 고갈 후와 공여자 HSC 이식 전에 CAR-T 세포의 생체 내 신속한 청소를 용이하게 한다. 마지막으로, 제조 과정의 결과로서, CAR-T 세포의 대부분은 CXCR4와 같은 케모카인 수용체를 발현하여, 상주하는 HSC의 제거를 위해 골수(BM)로의 더 선택적인 트래피킹(trafficking)을 허용할 수 있다.
항-HSC CAR 구조물 패널로부터 우세 후보를 선별하기 위해, 인간 말초 혈액으로부터 CD3/CD28 자극된 T 세포를 먼저 c-kit 또는 CD133에 대한 각각의 CAR 후보를 코딩하는 mRNA로 전기천공시켰다. 형질감염된 T 세포에서 CAR 표면 발현은 유동 세포 분석법에 의해 확인하였다. mRNA-형질감염된 CAR-T 세포를 c-kit 또는 CD133를 발현하는 마우스 또는 인간 세포주(EML-C1, TF-1 및 K562)뿐 아니라 마우스 및 인간 1차 BM 세포와 공동 배양하여 시험관 내 기능 분석을 수행하였다. 우세 CAR 후보는 CD107a 발현 및 IFNγ 분비에 따른 탈과립화를 통한 CAR-T 세포의 그들의 특이적 활성화로부터 확인되었다. 게다가, 이들 CAR은 c-kit 또는 CD133 양성 세포를 선택적으로 고갈시킬 수도 있었다. 흥미롭게도, 일부 mRNA-형질감염된 CAR-T 세포는 그의 가용성 리간드, 줄기세포 인자의 존재하에서도 표적 c-kit+ TF-1 세포에 대한 이펙터 활성을 유지하였다. 다음으로, 우세 CAR 후보를 동일한 트리-시스트론 전이유전자에서 선별 및 약물-유도성 안전 스위치 유전자와 동시 발현한 다음 PB를 사용하여 T 세포에 안정적으로 전달하였다. 제조 과정은 CD62L 및 CD45RA의 양성 발현에 의해 결정되는 바와 같이 주로 T 기억 줄기세포(Tscm) 표현형인 CAR-T 세포를 생성하였으며, 또한 높은 수준의 CXCR4 케모카인 수용체를 발현하였다. mRNA-형질감염된 CAR-T 세포와 유사하게, 이들 안정적으로 전위된 세포는 c-kit 또는 CD133 발현 표적 세포의 특이적 고갈을 포함하여 광범위한 이펙터 능력을 가질 수 있었다.
앞으로의 연구는 표준 부술판 또는 방사선 조사 컨디셔닝 대조군과 함께 사전 확립된 이종(xenogeneic) 인간 조혈 키메라성을 갖는 면역 결핍 NSG 마우스에서 PB-생산된 우세 항-HSC CAR-T 세포를 평가할 것이다. 이 접근법은 BM에서 내인성 HSC의 고갈을 위한 최소 독성 이식 요법으로 안내하고 생착된 동종이계 또는 유전자 교정된 줄기세포로의 그들의 대체를 확보하기 위해 예상되는 신규한 표적화된 생물학적 요법을 구성한다.
HSC 이식 전의 대안적인 컨디셔닝 요법의 필요성: 미국에서 연간 5,000명 이상의 환자가 HSC 이식 전에 골수 제거 컨디셔닝 요법으로 치료된다. 이러한 컨디셔닝 요법의 대부분은 주로 HSC 고갈제로서 적용되지만 생명을 위협하는 주요 합병증에 의해 제한되는 고선량의 유전독성 방사선 조사 또는 부술판으로 이루어진다. c-kit 및 CD45와 같이 HSC에서 발현되는 항원에 대한 단클론 항체는 대안으로 고려되어왔다. CAR-T 세포는 골수에 존재하는 HSC의 더 효과적이고 선택적이고 안전한 고갈을 제공할 수 있다. 피기백™으로 생산된 CAR-T 세포는 선별을 위한 것들을 포함한 다수의 유전자 및 공여자 HSC 이식 전에 CAR-T 세포를 청소할 수 있는 안전 스위치의 도입을 허용하는 큰 적재 용량을 갖는 비바이러스 시스템이다. PB CAR-T 세포는 또한 생체 내 효능을 향상시키기 위한 줄기세포 기억(SCM: stem-cell memory) 표현형을 나타내며 골수로 더 잘 귀소할 수 있다.
CD117 또는 CD133에 대해 표적화된 PB CAR-T 세포는 인간 및 원숭이 골수로부터의 조혈 전구 세포 및 인간 CD34+ 세포로부터의 원시 CAFC를 고갈시킨다. PB CAR-T 세포는 줄기세포 기억 표현형을 나타내고 자연적으로 CXCR4를 발현하지만, 발현은 추가된 인자와 함께 24시간 배양에 의해 증가될 수 있다. PB CAR-T 세포는 주사 후 16시간 이내에 성공적으로 골수로 귀소한다. 이 데이터는 최소 비-유전독성 HSC 이식 요법으로서 BM에서 내인성 HSC를 표적화하는 PB CAR-T 세포의 사용을 지지한다.
조혈계는 자가-재생의 주요 특징 및 궁극적으로 혈액 및 면역계의 기능 세포를 발생시키는 다중 계통 전구체 집단을 생성하는 능력에 의해 정의되는 원시 조혈 줄기세포(HSC)의 희소 집단에 의해 유지된다. 정상적인 포유동물 조혈계는 대개 골수 내에서 성인 신체 곳곳에 분포되어 있으며 정지 줄기세포 및 계통 수임(committed) 전구체로 이루어진다. 전구체는 차례로 적혈구, 단핵구, 과립구, 혈소판, 수지상 세포, B 세포 및 T 세포와 같이 정해진 기능을 갖는 분화된 세포를 발생시킨다. 따라서 HSC의 증식 가능성은 상당한데 그 이유는 자가 재생을 통해 자신을 영속시킬 수 있는 고유한 능력을 갖기 때문이다. 줄기세포 계통 및 발생 잠재력을 구별하는 방법은 표현형 및 기능적 특성을 사용해왔다. 유용하다고 밝혀진 조혈 줄기세포(HSC)의 정의된 특징은 이식 후, 특히 전신 방사선 치료 후 수여자의 조혈계를 재증식할 수 있는 HSC의 능력이다. 따라서, 암, 면역 장애 및 이식 거부와 같이 HSC와 관련된 질환을 치료함에 있어 숙주 HSC를 효과적으로 고갈시키거나 불활성화시키는 것이 중요하다. 그러나 이는 어려운 것으로 판명되었는데, 특히 HSC의 빈도가 매우 낮아(경쟁적 재증식 실험에서 골수 세포 10만 개당 단지 1 ~ 2개로 추정됨) 이들 세포를 표적화하고 제거하기 더 어렵게 만들기 때문이다. 현재 치료법은 전형적으로 HSC뿐 아니라 조혈계의 많은 세포를 제거하는 고용량의 세포 독성제의 투여를 수반한다. 이 치료법은 명백한 단점과 심각한 독성 부작용을 갖는다. 따라서, HSC 고갈을 위한 개선된 치료법(예를 들어, 공여자 HSC를 이식하기 전에 완전하거나 혼합된 조혈 세포 키메라성을 확립하는 것)이 유리할 것이다.
임상적으로, 골수 및 조혈 줄기세포 이식은 대개 환자에서 고용량 화학요법 또는 방사선 조사에 의해 내인성 줄기세포가 고갈된 경우, 환자에게 혈액 세포를 생성하는 능력을 제공하는 수단으로서 널리 사용된다. 골수 및 말초 혈액은 현재 자기유래 및 동종이계 줄기세포의 공급원으로 사용된다. 앞으로, 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포(iPSC: induced pluripotent stem cell)로부터 유래된 것을 포함하는 배양된 줄기세포가 이식을 위한 HSC에 대한 대안을 제공할 수 있다.
이식 실패 또는 이식편 기능 불량은 골수 억제 약물의 투여, 이식-대-숙주 질환, 및 이식 후 초기의 감염에 의해 야기될 수 있다. 생착 불량은 환자의 기저 질환 또는 이전 치료와 관련된 미세 환경 또는 골수 기질 장애로 인해 발생할 수도 있다.
수여자가 공여자 이식편을 수용하도록 적절하게 컨디셔닝될 때, MHC 마커와 같은 특정 리간드에 대한 림프계 세포의 반응 또는 그 리간드 또는 리간드들과 그들의 상호작용의 결과로서 리간드의 양상과 관련하여 비반응성의 활성 상태가 보인다. 특이적 관용이 달성된다. 완전한 동종이계 공여자 골수 이식을 받는 숙주는 면역 억제 없이 동일한 공여자로부터의 신장 동종 이식편을 수용한다. 그러나 현재 광범위한 골수 제거 컨디셔닝을 이용하여 실시되는 완전 동종이계 골수 이식은 특정 연령 범위 및 병력의 환자에 적용성이 제한된다. 고선량의 전신 방사선 조사를 포함하는 골수 제거 컨디셔닝 요법은 종종 면역 거부를 방지하도록 설계된 치료(예를 들어, 사이클로포스파미드)와 함께 HSC 이식에 사용된다. 이러한 컨디셔닝은 수여자에서 이식된 동종이계 공여자 HSC의 생착을 확보하는데 사용된다. 그러나 이들 치료는 수여자에 대한 독성(예를 들어, 장염, 폐렴, 신독성, 고지혈증, 골수 억제) 및 악화된 GVHD 및 면역 결핍의 합병증(예를 들어, 감염 및 악성 종양)과 같은 바람직하지 않은 부작용을 가질 수 있다. 이러한 부작용은 부분적으로 사이토카인-유도된 부작용으로 생각되며 수여자의 장기 시스템에 손상을 일으킬 수 있다. 따라서, 독성이 낮은 이식 전 및 이식 후 컨디셔닝 요법이 매우 바람직하다. 본 발명은 기존의 치료 옵션으로 인한 부정적인 부작용을 전혀 유발하지 않는 HSC의 선택적 제거 및 대체를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
HSC의 생착을 위한 조성물 및 방법이 제공되며, 여기서 특정 CAR-T 이펙터 세포를 입양적으로 전달함으로써 내인성 줄기세포가 선택적으로 제거되어 공여자 줄기세포의 생착을 위한 니치가 개방된다. 선택적 제거는 조직에서 세포의 일반적인 제거 없이 표적화된 조직에서 내인성 줄기세포를 실질적으로 제거한다. 생착의 효율은 전처리 없이 얻은 생착과 비교하여 선택적 제거에 의해 상당히 향상된다. 이러한 선택적 제거는 비선택적 제거를 수반하는 방법과 비교하여 생착 기간 동안 표적화된 조직의 기능을 개선할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 기존의 비선택적 제거 방법(예를 들어 방사선 조사 또는 화학요법)을 사용하지 않고 효과적인 HSC 생착을 제공한다. 방사선 조사 및 화학요법은 표적화된 조직의 기능에 관여하는 분화된 세포(예를 들어, 말초 혈액 세포 수를 유지하는 전구체 집단상에)를 제거하고 다른 조직(예를 들어, 위장 상피 세포, 폐, 간 및 신장 세포)에 바람직하지 않은 부작용을 유발하고 이차 악성 종양의 위험을 증가시킨다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 공여자 줄기세포의 이식 전에 내인성 HSC를 특이적으로 고갈시킬 수 있는 CAR-T 세포를 환자에게 투여함으로써 선택적 제거가 달성된다. 제거 후 그리고 환자로부터 HSC 제거 CAR-T 세포를 실질적으로 제거하기에 충분한 기간 후에, 유효량의 공여자 줄기세포가 환자에게 도입된다.
본 발명의 조성물 및 방법은 하기 비제한적인 예시 용도에 대해 혼합 조혈 세포 키메라성을 확립하기 위한 확립된 비선택적 제거 방법(예를 들어 방사선 조사 및 화학요법)과 비교할 때 비독성 또는 상대적으로 낮은 독성의 컨디셔닝 요법을 제공한다: (a) 악성 및 비악성 질환, 특히 혈액 질환에서 상기 질환의 치료에서의 용도; (b) 세포, 조직 및/또는 고형 장기 이식에 대한 면역학적 수용의 촉진에서의 용도; (c) 이식편 대 숙주 병(GvHD)을 예방 또는 감소시키기 위한 용도; (d) 공여자-백혈구 주입물(DLI: donor-leukocyte infusion)을 투여하기 위한 플랫폼을 제공하기 위한 용도; (e) 효소 결핍 질환의 치료에서의 용도; (f) 자가 면역 질환의 치료에서의 용도; 및 (g) HSC 유도체에 영향을 미치는 선천성 질환에서의 용도.
줄기세포 미세 환경
줄기세포와 그들의 미세 환경과의 상호작용은 유지, 증식 및 분화를 위한 중요한 신호를 제공한다. 줄기세포가 존재하는 이러한 물리적 환경은 줄기세포 미세 환경 또는 니치로 지칭될 수 있다. 이 니치에 관련된 간질 세포 및 다른 세포는 HSC 조절에 많은 영향을 미치는 가용성의 결합되는 인자를 제공한다.
줄기세포와 니치 사이의 상호작용에 관한 다양한 모델이 제안되었다. 가장 간단한 형태로, 줄기세포가 분열할 때 하나의 딸 세포만이 니치에 남아 있고 다른 딸 세포는 니치를 떠나 분화하는 모델이 제안되었다.
본 발명의 조성물 및 방법의 특별한 이점은 근접한 환경 내에서만 또는 특정 미세 환경 내에서만 CLR/CAR 발현 T 세포를 활성화하는 능력이다. 이러한 물리적 선택성은 주어진 치료법의 표적이 아닌 세포, 니치 및 미세 환경에 미치는 본 발명의 조성물의 효과를 최소화한다.
또한, 미세 환경은 하나 이상의 표적 세포의 분비체(secretome)으로 정의될 수 있기 때문에, 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포는 CLR/CAR이 일단 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포가 분비된 단백질과 접촉하거나 주어진 농도에서 분비된 단백질과 접촉할 때에만 활성화되도록 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포는 CLR/CAR이 본 발명의 아폽토시스 유도제 또는 비표적 세포의 내인성 분비체의 성분과 접촉할 때 비활성화되거나 제거되도록 변형될 수 있다.
본 발명의 미세 환경은 하나 이상의 표적 세포의 표면상의 단백질의 발현에 의해 정의될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포는 CLR/CAR이 일단 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포가 표적 세포 상의 하나 이상의 세포 표면에 결합된 단백질(들)과 접촉할 때에만 활성화되도록 변형될 수 있다. 또한, 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포는 CLR/CAR이 본 발명의 아폽토시스 유도제 또는 비표적 세포의 세포 표면에 결합된 단백질과 접촉할 때 비활성화되거나 제거되도록 변형될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포는 표적 암세포 상의 하나 이상의 리간드에 특이적으로 결합하는 CLR/CAR을 발현하도록 변형될 수 있지만, 또한 활성화될 표적 암세포 미세 환경에 존재하는 하나 이상의 분비되는 단백질(예를 들어, 하나 이상의 사이토카인, 혈관형성을 유도하는 하나 이상의 인자, 세포 외 기질을 분해하는 하나 이상의 인자 등)의 결합을 요구할 수 있다. 디지털 세계에서와 같이, 이 2-인자 인증 시스템은 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포가 표적 세포만을 제거하고 비표적 세포 또는 비표적 환경에 부정적인 영향을 미치지 않도록 보장한다. 상기한 바와 같이, 필요한 신호 중 하나 이상이 표적 세포 및 표적 미세 환경과 일치하지 않으면, 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포는 비표적 세포의 위험 제거보다는 아폽토시스를 유도하도록 변형될 수 있다. 디지털 세계보다 우수하게, 본 발명의 CLR/CAR 발현 면역 세포는 예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 별개의 리간드(세포 표면에 결합된 리간드, 분비되는 리간드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있음)로부터 다인자 인증을 요구하도록 변형될 수 있다. 본원에 사용되는 용어 리간드는 본 발명의 CAR이 특이적으로 결합하는 임의의 서열, 핵산 또는 아미노산을 기재하기 위해 사용될 수 있다.
키메라 리간드/항원 수용체( CLR /CAR)
용어 "키메라 리간드 수용체(CLR)" 및 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 본 명세서 전반에 걸쳐 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 키메라 수용체는 본 발명의 표적 항원 및/또는 표적 리간드에 특이적으로 결합할 수 있다.
본 발명의 예시적인 CLR(들)/CAR(들)은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 인식 영역은 단백질 스캐폴드, 센티린, 단쇄 가변 단편(scFv), VHH, 면역글로불린 및 항체 모방체 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 아이소타입의 항체 또는 이의 단편이다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 상보성 결정 영역(CDR), 중쇄 CDR(CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 포함), 경쇄 CDR(CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 포함), 항원 결합 단편(Fab), 가변 도메인(Fv), 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 완전 중쇄, 완전 경쇄, 하나 이상의 불변 도메인, Fc(결정화 가능한 단편) 또는 이들의 임의의 조합이다. 특정 실시양태에서, 항체 모방체는 아피바디, 아필린, 아피머, 아피틴, 알파바디, 안티칼린 및 아비머, 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin), 피노머, 쿠니츠 도메인 펩티드, 그리고 모노바디를 포함한다. 특정 실시양태에서, CLR(들) 중 적어도 하나는 이중 특이적이다. 특정 실시양태에서, 각각의 CLR(들)은 이중 특이적이다. 특정 실시양태에서, CLR(들) 중 적어도 하나는 삼중 특이적이다. 특정 실시양태에서, 각각의 CLR(들)은 삼중 특이적이다.
본 발명의 방법의 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4 및/또는 CD4 서열로부터 유래된 서열을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들) 각각은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, (a)의 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 인간 4-1BB, 인간 CD28, 인간 CD40, 인간 ICOS, 인간 MyD88, 인간 OX-40 세포 내 세그먼트 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 인간 CD28 및/또는 인간 4-1BB 보조 자극 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 보조 자극 도메인은 막횡단 도메인과 CD28 보조 자극 도메인 사이에 위치한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 면역 세포는 스플릿 CLR/CAR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 스플릿 CLR/CAR은 적어도 하나의 면역 세포에서 동시에 발현될 때, 스플릿 CLR/CAR을 발현하지 않는 면역 세포 또는 CLR/CAR을 발현하지 않는 면역 세포와 비교하여 면역 세포의 활성을 증가 또는 감소시키는 별개의 세포 내 도메인을 갖는 둘 이상의 CLR(들)/CAR(들)을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 면역 세포는 스플릿 CLR/CAR을 포함한다. 동시 발현이 면역 세포의 활성을 증가시키는 것을 포함하는 특정 실시양태에서, 스플릿 CLR/CAR은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막횡단 도메인, 및 1차 세포 내 신호 전달 도메인으로 이루어진 엔도도메인을 포함하는 제1 CLR/CAR, 및 (b) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막횡단 도메인, 및 2차 세포 내 신호 전달 도메인으로 이루어진 엔도도메인을 포함하는 제2 CLR/CAR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 2차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB, 인간 CD28, 인간 CD40, 인간 ICOS, 인간 MyD88 또는 인간 OX-40 세포 내 세그먼트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 2차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB 및 인간 CD28을 포함한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 복수의 면역 세포를 포함하는 조성물의 적어도 하나의 면역 세포는 스플릿 CLR/CAR을 포함한다. 동시 발현이 면역 세포의 활성을 감소시키는 것을 포함하는 특정 실시양태에서, 스플릿 CLR/CAR은 (a) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막횡단 도메인, 및 1차 세포 내 신호 전달 도메인 2차 세포 내 신호 전달 도메인으로 구성된 엔도도메인을 포함하는 제1 CLR/CAR, 및 (b) 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인, 막횡단 도메인, 및 억제성 세포 내 신호 전달 도메인으로 이루어진 엔도도메인을 포함하는 제2 CLR/CAR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 1차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함하고 2차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB, 인간 CD28, 인간 CD40, 인간 ICOS, 인간 MyD88 또는 인간 OX-40 세포 내 세그먼트를 포함한다. 특정 실시양태에서, 1차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함하고 2차 세포 내 신호 전달 도메인은 인간 4-1BB 및 인간 CD28을 포함한다. 특정 실시양태에서, 억제성 세포 내 신호 전달 도메인은 PD1, CTLA4, LAG3, B7-H1, B7-1, CD160, BTLA, PD1H, LAIR1, TIM1, TIM3, TIM4, 2B4, 및 TIGIT로부터 유래된 신호 전달 도메인을 포함한다. 이들 억제성 세포 내 신호 전달 도메인 및 전체적으로 또는 부분적으로 사용될 수 있는 다른 분자로부터의 추가 세포 내 신호 전달 성분은 ITIM, ITSM, YVKM, PP2A, SHP2, KIEELE, 및 Y265를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 제2 CLR/CAR은 비-표적 세포 상의 표적에 선택적으로 결합하여, 제2 CLR/CAR이 제1 CLR/CAR의 활성을 억제하도록 유도한다. 특정 실시양태에서, 제2 CLR/CAR은 표적 또는 비표적 세포에서 사멸을 유도하는 제1 CLR/CAR의 능력을 억제한다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 CLR(들)/CAR(들)은 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하, 10-13 M 이하, 10-14 M 이하, 10- 15 M 이하의 KD로부터 선택된 친화도로 리간드에 결합한다. 특정 실시양태에서, KD는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정된다.
스캐폴드 단백질
본 발명의 단백질 스캐폴드는 피브로넥틴 III 형(FN3) 반복 단백질, 코딩 또는 상보적인 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 조합물, 제제, 장치 및 이들의 제조 및 사용 방법으로부터 유래될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 단백질 스캐폴드는 인간 테나신-C(이하, "테나신")의 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열로 구성된다. 추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 15 FN3 도메인의 컨센서스 서열이다. 본 발명의 단백질 스캐폴드는 다양한 분자, 예를 들어 세포 표적 단백질에 결합하도록 설계될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 리간드의 야생형 및/또는 변이체 형태의 에피토프에 결합하도록 설계될 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 추가적인 분자 또는 모이어티, 예를 들어 항체의 Fc 영역, 알부민 결합 도메인 또는 반감기에 영향을 미치는 다른 모이어티를 포함할 수 있다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 단백질 스캐폴드를 코딩할 수 있는 핵산 분자에 결합될 수 있다.
본 발명은 숙주 세포에서 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열에 기초하여 적어도 하나의 단백질 스캐폴드를 발현시키는 적어도 하나의 방법에 있어서, 적어도 하나의 단백질 스캐폴드가 검출 가능하고/거나 회수 가능한 양으로 발현되는 조건하에 본원에 기재된 바와 같은 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명은 (a) 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 코딩 핵산에 기초한 단백질 스캐폴드; 및 (b) 적합하고/거나 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 적어도 하나의 조성물을 제공한다.
본 발명은 피브로넥틴 III 형(FN3) 반복 단백질, 바람직하게는 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열, 더 바람직하게는 인간 테나신으로부터의 다중 FN3 도메인의 컨센서스 서열에 기초한 단백질 스캐폴드의 라이브러리를 생성하는 방법을 제공한다. 라이브러리는 스캐폴드의 일부분, 예를 들어 루프 영역의 특정 위치에서 분자 내의 아미노산 또는 아미노산의 개수를 (돌연변이에 의해) 변경하여 연속한 세대의 스캐폴드를 생성함으로써 형성된다. 라이브러리는 단일 루프의 아미노산 조성을 변경함으로써 또는 다수의 루프 또는 스캐폴드 분자의 추가 위치를 동시에 변경함으로써 생성될 수 있다. 변경된 루프는 이에 따라 길어지거나 짧아질 수 있다. 이러한 라이브러리는 각 위치에서 가능한 모든 아미노산 또는 설계된 서브세트의 아미노산을 포함하도록 생성될 수 있다. 라이브러리 구성원은 시험관 내 또는 CIS 디스플레이(DNA, RNA, 리보솜 디스플레이 등), 효모, 세균 및 파지 디스플레이와 같은 디스플레이로 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 환원 조건 하에서의 안정성 및 고농도에서의 용해도와 같은 향상된 생물물리학적 특성을 제공하며; 이들은 이. 콜라이(E. coli)와 같은 원핵생물 시스템, 효모와 같은 진핵생물 시스템 및 토끼 망상 적혈구 용해물 시스템과 같은 시험관 내 전사/번역 시스템에서 발현되고 폴딩될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 스캐폴드 라이브러리를 표적으로 패닝하고 결합체를 검출함으로써 특정 표적에 결합하는 스캐폴드 분자를 생성하는 방법을 제공한다. 다른 관련 양태에서, 본 발명은 원하는 활성을 갖는, 예를 들어 특정 친화도로 표적 단백질에 결합할 수 있는 단백질 스캐폴드를 생성하거나 친화도 성숙시키는 데 사용될 수 있는 스크리닝 방법을 포함한다. 친화도 성숙은 파지 디스플레이 또는 시험관 내 디스플레이와 같은 시스템을 사용하여 돌연변이 유발 및 선별의 반복적인 라운드에 의해 달성될 수 있다. 이 과정 중에 돌연변이 유발은 특정 스캐폴드 잔기에 대한 부위 지정 돌연변이 유발, 오류가 발생하기 쉬운 PCR로 인한 무작위 돌연변이 유발, DNA 셔플링 및/또는 이들 기술의 조합의 결과일 수 있다.
본 발명은 제한 없이 포유동물 유래 스캐폴드를 포함하는 피브로넥틴 III형(FN3)의 컨센서스 서열에 기초한 단리된 재조합 및/또는 합성 단백질 스캐폴드뿐 아니라 컨센서스 FN3 서열에 기초한 단백질 스캐폴드를 코딩하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 코딩 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 진단 및 치료 조성물, 방법 및 장치를 포함하여, 상기 핵산 및 단백질 스캐폴드의 제조 및 사용 방법을 추가로 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 국소, 경구로 또는 혈액-뇌 장벽을 통과하여 투여될 수 있는 능력, 포유동물 세포 발현에 비해 공급원의 기능으로서 단백질의 증가된 발현을 허용하는 이. 콜라이에서 발현할 수 있는 능력, 다중 표적 또는 동일한 표적의 다중 에피토프에 결합하는 이중 특이적 또는 탠덤의 분자로 조작될 수 있는 능력, 약물, 중합체, 및 프로브에 접합될 수 있는 능력, 고농도로 제제화될 수 있는 능력, 및 질환 조직 및 종양에 효과적으로 침투하는 상기 분자의 능력과 같이, 종래의 치료법에 대한 이점을 제공한다.
또한, 단백질 스캐폴드는 항체의 가변 영역을 모방하는 폴드와 관련하여 항체의 많은 특성을 갖는다. 이 배향은 FN3 루프가 항체 상보성 결정 영역(CDR)과 유사하게 노출될 수 있다. 이들은 세포 표적에 결합할 수 있어야 하고, 특정 결합 또는 관련 특성을 개선하기 위해, 루프는 변경, 예를 들어, 친화도 성숙될 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드의 6개의 루프 중 3개는 위상적으로 항체의 상보성 결정 영역(CDR 1 내지 3), 즉 리간드 결합 영역에 해당하는 한편, 나머지 3개의 루프는 항체 CDR과 유사한 방식으로 표면에 노출된다. 이들 루프는 서열 번호 1의 잔기 13 내지 16, 22 내지 28, 38 내지 43, 51 내지 54, 60 내지 64 및 75 내지 81에 또는 대략 이들 잔기에 걸쳐있다. 바람직하게는, 잔기 22 내지 28, 51 내지 54 및 75 내지 81에서 또는 대략 이들 잔기에서 루프 영역은 결합 특이성 및 친화도를 위해 변경된다. 하나 이상의 이들 루프 영역은 골격 부분으로서 그의 서열을 유지하는 다른 루프 영역 및/또는 다른 가닥과 무작위 배정되어 라이브러리를 형성하고, 특정 단백질 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 라이브러리로부터 강력한 결합체를 선택할 수 있다. 하나 이상의 루프 영역은 단백질과 항체 CDR의 상호작용과 유사하게 표적 단백질과 상호작용할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드는 항체 모방체를 포함할 수 있다.
용어 "항체 모방체"는 표적 서열에 특이적으로 결합하고 자연 발생 항체와는 다른 구조를 갖는 유기 화합물을 기재함을 의미한다. 항체 모방체는 단백질, 핵산 또는 소분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 항체 모방체가 특이적으로 결합하는 표적 서열은 리간드일 수 있다. 항체 모방체는 우수한 용해도, 조직 침투력, 열과 효소에 대한 안정성(예를 들어, 효소 분해에 대한 내성) 및 낮은 생산 비용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 항체보다 우수한 특성을 제공할 수 있다. 예시적인 항체 모방체는 애피바디, 애필린, 애피머, 애피틴, 알파바디, 안티칼린, 및 아비머(결합 활성(avidity) 다량체로도 공지됨), DARPin(설계된 안키린 반복 단백질), 피노머, 쿠니츠 도메인 펩티드, 및 모노바디를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 애피바디 분자는 디설피드 다리를 전혀 갖지 않는 하나 이상의 알파 나선을 포함하거나 이로 이루어진 단백질 스캐폴드를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 애피바디 분자는 3개의 알파 나선을 포함하거나 이들로 이루어진다. 예를 들어, 본 발명의 애피바디 분자는 면역글로불린 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 애피바디 분자는 단백질 A의 Z 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 애필린 분자는 예를 들어 감마-B 크리스탈린 또는 유비퀴틴의 노출된 아미노산의 변형에 의해 생산된 단백질 스캐폴드를 포함한다. 애필린 분자는 기능적으로 리간드에 대한 항체의 친화도를 모방하지만, 구조적으로 항체를 모방하지는 않는다. 애필린을 만드는 데 사용되는 임의의 단백질 스캐폴드에서, 적절하게 폴딩된 단백질 분자에서 용매 또는 가능한 결합 파트너에 접근 가능한 아미노산은 노출된 아미노산으로 간주한다. 이들 노출된 아미노산 중 임의의 하나 이상은 표적 리간드 서열 또는 리간드에 특이적으로 결합하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 애피머 분자는 특정 표적 서열에 대한 고친화도 결합 부위를 제공하는 펩티드 루프를 나타내도록 조작된 고도로 안정한 단백질을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 본 발명의 예시적인 애피머 분자는 시스타틴 단백질 또는 이의 3차 구조를 기본으로 하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 본 발명의 예시적인 애피머 분자는 역 평행 베타-시트 상부에 놓인 알파-나선을 포함하는 공통의 3차 구조를 공유할 수 있다.
본 발명의 애피틴 분자는 인공 단백질 스캐폴드를 포함하며, 그 구조는 예를 들어 DNA 결합 단백질(예를 들어, DNA 결합 단백질 Sac7d)로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 애피틴은 리간드의 전체 또는 일부일 수 있는 표적 서열에 선택적으로 결합한다. 본 발명의 예시적인 애피틴은 DNA 결합 단백질의 결합 표면상의 하나 이상의 아미노산 서열을 무작위 배정하고 그 결과 단백질을 리보솜 디스플레이 및 선별을 적용함으로써 제조된다. 본 발명의 애피틴의 표적 서열은 예를 들어 게놈에서 또는 펩티드, 단백질, 바이러스 또는 박테리아의 표면에서 발견될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 애피틴 분자는 효소의 특이적 억제제로서 사용될 수 있다. 본 발명의 애피틴 분자는 내열성 단백질 또는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명의 알파바디 분자는 또한 세포 침투성 알파 바디(CPAB: Cell-Penetrating Alphabody)로 지칭될 수 있다. 본 발명의 알파바디 분자는 다양한 표적 서열(리간드를 포함함)에 결합하는 작은 단백질(전형적으로 10 kDa 미만)을 포함한다. 알파바디 분자는 세포 내 표적 서열에 도달하고 결합할 수 있다. 구조적으로, 본 발명의 알파바디 분자는 단쇄 α 나선(자연 발생 코일형 코일(coiled-coil) 구조와 유사함)을 형성하는 인공 서열을 포함한다. 본 발명의 알파바디 분자는 표적 단백질에 특이적으로 결합하도록 변형된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있다. 분자의 결합 특이성에 관계없이, 본 발명의 알파바디 분자는 정확한 폴딩 및 열 안정성을 유지한다.
본 발명의 안티칼린 분자는 단백질 또는 소분자의 표적 서열 또는 부위에 결합하는 인공 단백질을 포함한다. 본 발명의 안티칼린 분자는 인간 리포칼린으로부터 유래된 인공 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 안티칼린 분자는 예를 들어 단클론 항체 또는 이의 단편 대신에 사용될 수 있다. 안티칼린 분자는 단클론 항체 또는 이의 단편보다 우수한 조직 침투 및 열 안정성을 나타낼 수 있다. 본 발명의 예시적인 안티칼린 분자는 약 20 kDa의 질량을 갖는 약 180개의 아미노산을 포함할 수 있다. 구조적으로, 본 발명의 안티칼린 분자는 루프 및 부착된 알파 나선에 의해 쌍으로 연결된 역 평행 β-가닥을 포함하는 배럴 구조를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 안티칼린 분자는 루프 및 부착된 알파 나선에 의해 쌍으로 연결된 8개의 역 평행 β-가닥을 포함하는 배럴 구조를 포함한다.
본 발명의 아비머 분자는 표적 서열(리간드일 수도 있음)에 특이적으로 결합하는 인공 단백질을 포함한다. 본 발명의 아비머는 동일한 표적 내에 또는 별개의 표적들 내의 여러 결합 부위를 인식할 수 있다. 본 발명의 아비머가 하나 초과의 표적을 인식할 때, 아비머는 이중 특이적 항체의 기능을 모방한다. 인공 단백질 아비머는 각각 약 30 내지 35개 아미노산의 2개 이상의 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 이들 펩티드는 하나 이상의 링커 펩티드를 통해 연결될 수 있다. 아비머의 하나 이상의 펩티드의 아미노산 서열은 막 수용체의 A 도메인으로부터 유래될 수 있다. 아비머는 경우에 따라 디설피드 결합 및/또는 칼슘을 포함할 수 있는 견고한 구조를 갖는다. 본 발명의 아비머는 항체와 비교하여 더 우수한 열 안정성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 DARPin(설계된 안키린 반복 단백질)은 표적 서열에 대해 높은 특이성 및 높은 친화도를 갖는 유전자 조작된, 재조합 또는 키메라 단백질을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 DARPin은 안키린 단백질로부터 유래되고, 경우에 따라, 안키린 단백질의 적어도 3개의 반복 모티프(반복적인 구조 단위로도 지칭됨)를 포함한다. 안키린 단백질은 고친화도 단백질-단백질 상호작용을 매개한다. 본 발명의 DARPin은 큰 표적 상호작용 표면을 포함한다.
본 발명의 피노머는 인간 Fyn SH3 도메인으로부터 유래된 작은 결합 단백질(약 7 kDa)을 포함하고 항체와 동일한 친화도 및 동일한 특이성으로 표적 서열 및 분자에 결합하도록 조작된다.
본 발명의 쿠니츠 도메인 펩티드는 쿠니츠 도메인을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 쿠니츠 도메인은 프로테아제 활성을 억제하기 위한 활성 부위를 포함한다. 구조적으로, 본 발명의 쿠니츠 도메인은 디설피드가 풍부한 알파+베타 폴드를 포함한다. 이 구조는 소 췌장 트립신 억제제에 의해 예시된다. 쿠니츠 도메인 펩티드는 특정 단백질 구조를 인식하고 경쟁적인 프로테아제 억제제로서 역할을 한다. 본 발명의 쿠니츠 도메인은 에칼란티드(인간 지방 단백질 관련 응고 억제제(LACI: lipoprotein-associated coagulation inhibitor)로부터 유래됨)를 포함할 수 있다.
본 발명의 모노바디는 단쇄 항체와 크기가 유사한 작은 단백질(약 94개 아미노산을 포함하고 약 10 kDa의 질량을 가짐)이다. 이 유전자 조작된 단백질은 리간드를 포함한 표적 서열에 특이적으로 결합한다. 본 발명의 모노바디는 하나 이상의 상이한 단백질 또는 표적 서열을 특이적으로 표적화할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 모노바디는 인간 피브로넥틴의 구조를 모방하는 단백질 스캐폴드, 더 바람직하게는 피브로넥틴의 10번째 세포 외 III형 도메인의 구조를 모방하는 단백질 스캐폴드를 포함한다. 피브로넥틴의 10번째 세포 외 III형 도메인 및 이의 모노바디 모방체는 배럴을 형성하는 7개의 베타 시트 및 항체의 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 상응하는 각각의 측면에 노출된 3개의 루프를 포함한다. 항체의 가변 도메인의 구조와는 대조적으로, 모노바디는 중앙 디설피드 결합뿐만 아니라 금속 이온에 대한 결합 부위가 전혀 없다. 다중 특이적 모노바디는 루프 BC 및 FG를 변형시킴으로써 최적화될 수 있다. 본 발명의 모노바디는 아드넥틴을 포함할 수 있다.
이러한 방법은 적어도 하나의 스캐폴드 단백질을 포함하는 유효량의 조성물 또는 약학 조성물을 증상, 효과 또는 기전에 있어서 이러한 조절, 치료, 완화, 예방 또는 감소가 필요한 세포, 조직, 장기, 동물 또는 환자에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 유효량은 본원에 기재되거나 관련 기술 분야에 공지된 바와 같은 공지된 방법을 사용하여 수행되고 결정된 바와 같이 단일(예를 들어, 볼루스), 다중 또는 연속 투여당 약 0.001 내지 500 mg/kg의 양, 또는 단일, 다중 또는 연속 투여당 혈청 농도 0.01 내지 5000 μg/ml의 혈청 농도를 달성하기 위한 양 또는 그 안의 임의의 유효 범위 또는 값을 포함할 수 있다.
스캐폴드 단백질의 생산 및 생성
본 발명의 적어도 하나의 스캐폴드 단백질은 당 업계에 잘 공지된 바와 같이, 경우에 따라 세포주, 혼합 세포주, 불멸화 세포 또는 불멸화 세포의 클론 집단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001)]을 참조한다.
스캐폴드 단백질로부터의 아미노산은 당 업계에 공지된 바와 같이, 면역원성을 감소시키거나 결합, 친화도, 온-레이트, 오프-레이트, 결합력, 특이성, 반감기, 안정성, 용해도 또는 임의의 다른 적절한 특성을 감소, 향상 또는 변형시키기 위해 변경, 첨가 및/또는 결실될 수 있다.
경우에 따라, 스캐폴드 단백질은 리간드에 대한 고친화도 및 다른 유리한 생물학적 특성을 유지하면서 조작될 수 있다. 이 목표를 달성하기 위해, 스캐폴드 단백질은 경우에 따라 부모 및 조작된 서열의 3차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 다양한 개념의 조작된 생성물의 분석 공정에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로 3차원 모델이 이용 가능하며 당업자에게는 익숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 입체형태 구조를 예시하고 디스플레이하고 가능한 면역원성을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다(예를 들어, 캘리포니아주 몬로비아 소재의 젠코(Xencor, Inc.)의 이뮤노필터(Immunofilter) 프로그램). 이들 디스플레이의 조사는 후보 서열의 작용에 있어 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 스캐폴드 단백질의 그의 리간드에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 표적 리간드(들)에 대한 친화도와 같은 원하는 특성이 달성되도록 부모 및 기준 서열로부터 잔기를 선택하고 조합할 수 있다. 상기 절차에 대안적으로 또는 추가적으로, 다른 적절한 조작 방법이 사용될 수 있다.
스캐폴드 단백질의 스크리닝
유사한 단백질 또는 단편에 특이적인 결합에 대한 단백질 스캐폴드의 스크리닝은 뉴클레오티드(DNA 또는 RNA 디스플레이) 또는 펩티드 디스플레이 라이브러리, 예를 들어, 시험관 내 디스플레이를 사용하여 편리하게 달성될 수 있다. 상기 방법은 원하는 기능 또는 구조를 가지는 개별 구성원에 대하여 대량의 펩티드 수집물의 스크리닝을 포함한다. 디스플레이된 뉴클레오티드 또는 펩티드 서열은 3 내지 5,000개 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 길이, 빈번하게는, 5 내지 100개의 아미노산 길이, 대개는 약 8 내지 25개의 아미노산 길이일 수 있다. 펩티드 라이브러리를 생성하는 직접적인 화학적 합성 방법 이외에도, 여러 재조합 DNA 방법이 기술되어 있다. 한 유형은 박테리오파지 또는 세포 표면상 펩티드 서열의 디스플레이를 포함한다. 각 박테리오파지 또는 세포는 특정의 디스플레이된 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한다. 상기 방법은 PCT 특허 공개 제91/17271호, 제91/18980호, 제91/19818호, 및 제93/08278호에 기술되어 있다.
펩티드 라이브러리를 생성하는 다른 시스템은 시험관 내 화학적 합성 및 재조합 방법, 둘 모두의 양태를 가진다. PCT 특허 공개 제92/05258호, 제92/14843호, 및 제96/19256호를 참조한다. 또한, 미국 특허 제5,658,754호; 및 제5,643,768호를 참조한다. 펩티드 디스플레이 라이브러리, 벡터, 및 스크리닝 키트는 인비트로겐(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재), 및 케임브리지 안티바디 테크놀러지즈(Cambridge Antibody Technologies: 영국 캠브리지셔 소재)와 같은 공급업체로부터 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 제4,704,692호, 제4,939,666호, 제4,946,778호, 제5,260,203호, 제5,455,030호, 제5,518,889호, 제5,534,621호, 제5,656,730호, 제5,763,733호, 제5,767,260호, 제5856456호(엔존(Enzon)에 양도됨), 제5,223,409호, 제5,403,484호, 제5,571,698호, 제5,837,500호(다이액스(Dyax)에 양도됨), 제5,427,908호, 제5,580,717호(애피맥스(Affymax)에 양도됨); 제5,885,793호(케임브리지 안티바디 테크놀러지즈에 양도됨), 제5,750,373호(제넨테크(Genentech)에 양도됨), 제5,618,920호, 제5,595,898호, 제5,576,195호, 제5,698,435호, 제5,693,493호, 제5,698,417호(조마(Xoma)에 양도됨), 문헌[Colligan, 상기 문헌]; [Ausubel, 상기 문헌]; 또는 [Sambrook, 상기 문헌]을 참조한다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 광범위한 친화도(KD)로 인간 또는 다른 포유동물 단백질에 결합할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드는 경우에 따라 고친화도로, 예를 들어, 당업자에 의해 실시되는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명 또는 키넥사(Kinexa) 방법에 의해 결정된 바와 같이, 약 10-7 M 이하, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 0.1 내지 9.9(또는 그 안의 임의의 범위 또는 값) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 또는 상기 내의 임의의 범위 또는 값의 KD로 표적 단백질에 결합할 수 있다.
리간드에 대한 단백질 스캐폴드의 친화도 또는 결합도는 임의의 적합한 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Berzofsky et. al., "Antibody-Ligand Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992)] 및 본원에 기재된 방법을 참조). 특정 단백질 스캐폴드-리간드 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH)에서 측정되는 경우 달라질 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 리간드-결합 매개 변수(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 바람직하게는 단백질 스캐폴드 및 리간드의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충액, 예를 들어 본원에 기재된 완충액으로 수행된다.
단백질, 항체 및 다른 길항제가 표적 단백질과의 결합에 대해 본 발명의 단백질 스캐폴드와 경쟁하고/하거나 에피토프 영역을 공유하는 것을 결정하기 위해 본 발명의 단백질 스캐폴드와 경쟁 분석을 수행할 수 있다. 당업자에게 용이하게 공지된 이러한 분석은 단백질 상의 제한된 수의 결합 부위에 대해 길항제 또는 리간드 사이의 경쟁을 평가한다. 단백질 및/또는 항체는 경쟁 전 또는 후에 고정되거나 불용화되고, 표적 단백질에 결합된 샘플은 예를 들어 디캔팅(단백질/항체가 사전 불용화되는 경우) 또는 원심 분리(경쟁 반응 후에 단백질/항체가 침전되는 경우)에 의해 분리된다. 또한, 경쟁적 결합은 표적 단백질에 단백질 스캐폴드의 결합 또는 결합의 결여에 의해 기능이 변경되는지에 의해, 예를 들어 단백질 스캐폴드 분자가 예를 들어 표지의 효소 활성을 억제 또는 강화하는지에 의해 결정될 수 있다. 당 업계에 공지된 바와 같이, ELISA 및 다른 기능 분석이 사용될 수 있다.
센티린 및 카르티린
본 발명은 (a) 적어도 하나의 센티린을 포함하는 리간드 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인, 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 리간드/항원 수용체(CLR/CAR)를 제공한다. 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 센티린을 포함하는 CLR/CAR을 카르티린으로 지칭한다. 특정 실시양태에서, 리간드 인식 영역은 이중 특이적 또는 탠덤의 CLR/CAR을 생산하기 위해 2개의 센티린을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리간드 인식 영역은 3중 특이적 CLR/CAR을 생산하기 위해 3개의 센티린을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 (a) 적어도 하나의 단백질 스캐폴드 또는 항체 모방체를 포함하는 항원 인식 영역을 포함하는 엑토도메인; (b) 막횡단 도메인 및 (c) 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 키메라 리간드/항원 수용체(CLR/CAR)를 제공한다. 특정 실시양태에서, 리간드 인식 영역은 이중 특이적 또는 탠덤의 CLR/CAR을 생산하기 위해 2개의 스캐폴드 단백질 또는 항체 모방체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 리간드 인식 영역은 3중 특이적 CLR/CAR을 생산하기 위해 3개의 단백질 스캐폴드 또는 항체 모방체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 특정 실시양태에서, 엑토도메인은 리간드 인식 영역과 막횡단 도메인 사이에 힌지를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 CLR/CAR의 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CLR/CAR의 특정 실시양태에서, 신호 펩티드는 인간 CD8α 신호 펩티드를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩티드는 (서열 번호 31)를 포함하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩티드는 (서열 번호 31)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 31)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 신호 펩티드는 (서열 번호 32)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 CLR/CAR의 특정 실시양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD2, CD3δ, CD3ε, CD3γ, CD3ζ, CD4, CD8α, CD19, CD28, 4-1BB 또는 GM-CSFR 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CLR/CAR의 특정 실시양태에서, 막횡단 도메인은 인간 CD8α 막횡단 도메인을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. CD8α 막횡단 도메인은 (서열 번호 33)를 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 33)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CD8α 막횡단 도메인은 (서열 번호 35)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 CLR/CAR의 특정 실시양태에서, 엔도도메인은 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 CLR/CAR의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 인간 4-1BB, CD28, CD40, ICOS, MyD88, OX-40 세포 내 세그먼트 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 CLR/CAR의 특정 실시양태에서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인은 CD28 및/또는 4-1BB 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다. CD28 보조 자극 도메인은 (서열 번호 36)을 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 36)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. CD28 보조 자극 도메인은 (서열 번호 37)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 보조 자극 도메인은 (서열 번호 38)을 포함하는 아미노산 서열 또는 (서열 번호 38)을 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 4-1BB 보조 자극 도메인은 (서열 번호 39)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 4-1BB 보조 자극 도메인은 막횡단 도메인과 CD28 보조 자극 도메인 사이에 위치될 수 있다.
본 발명의 CAR의 특정 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α, IgG4 및/또는 CD4 서열로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 CLR/CAR의 특정 실시양태에서, 힌지는 인간 CD8α 서열로부터 유도된 서열을 포함할 수 있다. 힌지는 (서열 번호 40)를 포함하는 인간 CD8α 아미노산 서열 또는 (서열 번호 40)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 인간 CD8α 힌지 아미노산 서열은
(서열 번호 41)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 센티린은 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있으며, 상기 스캐폴드는 리간드에 특이적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 센티린은 적어도 하나의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인의 컨센서스 서열을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함할 수 있으며, 상기 스캐폴드는 리간드에 특이적으로 결합할 수 있다. 적어도 하나의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인은 인간 단백질로부터 유래될 수 있다. 인간 단백질은 테나신-C일 수 있다. 컨센서스 서열은
(서열 번호 42) 또는
(서열 번호 43)를 포함할 수 있다. 컨센서스 서열은 (서열 번호 44)를 포함하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다. 컨센서스 서열은 (a) 컨센서스 서열의 위치 13 내지 16에서 아미노산 잔기 TEDS (서열 번호 63)를 포함하거나 이로 이루어진 A-B 루프; (b) 컨센서스 서열의 위치 22 내지 28에서 아미노산 잔기 TAPDAAF (서열 번호 64)를 포함하거나 이로 이루어진 B-C 루프; (c) 컨센서스 서열의 위치 38 내지 43에서 아미노산 잔기 SEKVGE (서열 번호 65)를 포함하거나 이로 이루어진 C-D 루프; (d) 컨센서스 서열의 위치 51 내지 54에서 아미노산 잔기 GSER (서열 번호 66)를 포함하거나 이로 이루어진 D-E 루프; (e) 컨센서스 서열의 위치 60 내지 64에서 아미노산 잔기 GLKPG (서열 번호 67)를 포함하거나 이로 이루어진 E-F 루프; (f) 컨센서스 서열의 위치 75 내지 81에서 아미노산 잔기 KGGHRSN (서열 번호 68)을 포함하거나 이로 이루어진 F-G 루프; 또는 (g) (a) 내지 (f)의 임의의 조합 내에 하나 이상의 위치에서 변형될 수 있다. 본 발명의 센티린은 적어도 5개의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인, 적어도 10개의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인 또는 적어도 15개의 피브로넥틴 III 형(FN3) 도메인을 포함할 수 있다. 스캐폴드는 10-9 M 이하, 10-10 M 이하, 10-11 M 이하, 10-12 M 이하, 10-13 M 이하, 10-14 M 이하 및 10-15 M 이하의 KD로부터 선택된 적어도 하나의 친화도로 리간드에 결합할 수 있다. KD는 표면 플라즈몬 공명에 의해 결정될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CLR/CAR 및 적어도 하나의 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 CLR/CAR을 포함하는 트랜스포존을 제공한다.
본 발명의 트랜스포존은 트랜스포존을 발현하는 세포의 동정, 농축 및/또는 단리를 위한 선별 유전자를 포함할 수 있다. 예시적인 선별 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 임의의 유전자 생성물(예를 들어, 전사체, 단백질, 및 효소)을 코딩한다. 예시적인 선별 유전자는 선별 유전자에 의해 코딩된 유전자 생성물의 부재하에서 세포가 민감한(또는 세포에 치명적일 수 있는) 약물 공격에 대한 내성을 부여하는데 필수적인 임의의 유전자 생성물(예를 들어, 전사체, 단백질, 및 효소)을 코딩한다. 예시적인 선별 유전자는 선별 유전자의 부재하에서 세포 생존능 및/또는 생존에 필수적인 하나 이상의 영양소가 결여된 세포 배지에서 생존능 및/또는 생존에 필수적인 임의의 유전자 생성물(예를 들어, 전사체, 단백질, 효소)을 코딩한다. 예시적인 선별 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디히드로폴레이트 환원 효소를 코딩하며 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타아제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다약제 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 디히드로게나아제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타제를 코딩함), 및 NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 트랜스포존은 에피솜으로 유지되거나 재조합/변형된 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 트랜스포존은 비바이러스 유전자 전달을 향상시키기 위해 트랜스포존 및 트랜스포사제를 이용하는 2가지 성분 피기백 시스템의 일부일 수 있다. 이 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스-조절 인슐레이터 요소가 측면에 위치한 키메라 리간드/항원 수용체를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포손이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스-조절 인슐레이터 요소가 측면에 위치한 리간드/항원 수용체를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포사제가 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 피기백™(PB) 트랜스포사제 효소이다. 피기백(PB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 하기 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다:
특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 3개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 하기 위치 30, 165, 282, 및 538 각각에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 165에서 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 282에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 위치 30에서 아미노산 치환이 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 165에서 아미노산 치환이 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이고, 위치 282에서 아미노산 치환이 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 538에서 아미노산 치환이 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환인 서열 번호 1의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 3에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 82에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 119에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 185에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 187에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 200에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 207에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 209에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 226에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 235에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 240에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 241에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 243에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 258에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 발린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 315에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 319에서 아미노산 치환은 트레오닌(T)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 327에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 328에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 421에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 436에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 456에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 470에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 485에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 552에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 194에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 372에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 375에서 아미노산 치환은 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 450에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 509에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함할 수 있다. 피기백™ 트랜스포사제 효소가 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 및 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환 및 서열 번호 1의 위치 450에서 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환을 포함할 수 있다.
유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드
본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 기존의 유도성 폴리펩티드보다 우수한데, 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드가 훨씬 낮은 면역원성이기 때문이다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드이고, 따라서 비천연적으로 발생하지만, 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 생산하기 위해 재조합되는 서열은 숙주 인간 면역계가 "비-자기"로서 인식할 수 있는 비인간 서열을 포함하지 않으며, 결과적으로, 본 밞명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 받는 대상체, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 포함하는 세포 또는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 포함하는 조성물 또는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 포함하는 세포에서 면역 반응을 유도한다.
본 발명의 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체 리간드 결합 영역일 수 있다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 또한 "iC9 안전 스위치"로도 지칭될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존은 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함할 수 있다. 변형은 위치 36에서의 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)일 수 있다. 특정 실시양태에서, FKBP12 폴리펩티드는 (서열 번호 45)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, FKBP12 폴리펩티드는 (서열 번호 46)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 위치 36에 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)을 가지는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있는 리간드 결합 영역에 특이적인 유도제는, 둘 모두가 합성 약물인 AP20187 및/또는 AP1903을 포함한다.
본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 링커 영역은 GGGGS (서열 번호 47)를 포함하는 아미노산, 또는 GGAGGAGGAGGATCC (서열 번호 48)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 발명의 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 87에 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 282에 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 (서열 번호 49)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 50)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
폴리펩티드가 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 (서열 번호 51)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 52)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
트랜스포존 및 트랜스포사제
본 발명의 트랜스포존은 예를 들어, 본 발명의 단백질 스캐폴드, 센티린 또는 카르티린 중 하나 이상과 본 발명의 선별 유전자 사이에 위치하는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드(들)를 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스포존은 본 발명의 단백질 스캐폴드, 센티린 또는 카르티린 중 하나 이상과 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드 사이에 위치하는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드(들)를 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스포존은 적어도 2개의 자가 절단 펩티드(들)를 포함할 수 있으며, 제1 자가 절단 펩티드는 예를 들어, 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드의 상류 또는 바로 상류에 위치하고, 제2의 자가 절단 펩티드는, 예를 들어 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드의 하류 또는 바로 상류에 위치한다.
적어도 하나의 자가 절단 펩티드는 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 53)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 53)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 54)를 포함하는 아미노산 서열, (서열 번호 54)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 55)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 56)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 56)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 57)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 57)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 58)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 58)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 59)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 59)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 60)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 60)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 61)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 61)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 제1 및 제2 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며, 제1 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, 본 발명의 단백질 스캐폴드, 센티린 또는 카르티린 중 하나 이상의 상류에 위치하고, 제2의 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, 본 발명의 단백질 스캐폴드, 센티린 또는 카르티린 중 하나 이상의 하류에 위치한다. 제1 및/또는 제2 자가 절단 펩티드는 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 53)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 53)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 54)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 54)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 55)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 56)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 56)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 57)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 57)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 58)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 58)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 59)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 59)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 60)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 60)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 61)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 61)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 조성물은 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드를 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제 효소를 코딩하는 서열은 mRNA 서열일 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 피기백 트랜스포존을 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스포사제 효소는 피기백 트랜스포스포사제 또는 상용성 효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 2개의 시스-조절 인슐레이터 요소가 측면에 위치한 키메라 리간드/항원 수용체를 코딩하는 서열을 갖는 플라스미드 DNA 트랜스포존이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포존은 피기백 트랜스포존이다. 본 발명의 트랜스포사제 효소는 피기백 트랜스포스포사제 또는 상용성 효소를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 특히 트랜스포존이 피기백 트랜스포존인 실시양태에서, 트랜스포사제는 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제이다. 특정 실시양태에서, 특히, 트랜스포사제가 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제인 실시양태에서, 트랜스포사제를 코딩하는 서열은 mRNA 서열이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 피기백™(PB) 트랜스포사제 효소이다. 피기백(PB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 하기 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다:
특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 2개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 위치 30, 165, 282, 또는 538 중 3개 이상에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 서열의 하기 위치 30, 165, 282, 및 538 각각에서 아미노산 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 피기백TM(PB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 30에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 165에서 아미노산 치환은 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 282에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1의 서열의 위치 538에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환이다.
본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포사제 효소는 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 위치 30에서 아미노산 치환이 이소류신(I)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 165에서 아미노산 치환이 글리신(G)에서 세린(S)으로의 치환이고, 위치 282에서 아미노산 치환이 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이고, 위치 538에서 아미노산 치환이 아스파라긴(N)에서 리신(K)으로의 치환인 서열 번호 1의 서열의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 슈퍼 피기백™(SPB) 트랜스포사제 효소는 하기와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트가 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다:
트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 3, 46, 82, 103, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 258, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 486, 503, 552, 570 및 591 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 또는 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 위치 46, 119, 125, 177, 180, 185, 187, 200, 207, 209, 226, 235, 240, 241, 243, 296, 298, 311, 315, 319, 327, 328, 340, 421, 436, 456, 470, 485, 503, 552 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 3에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 46에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 82에서 아미노산 치환은 이소류신(I)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 119에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 125에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 177에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 180에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 185에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 187에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 200에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 207에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 209에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 226에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 235에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 240에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 241에서 아미노산 치환은 페닐알라닌(F)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 243에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 258에서 아미노산 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 트립토판(W)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 296에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 298에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 311에서 아미노산 치환은 프롤린(P)에서 발린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 315에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 319에서 아미노산 치환은 트레오닌(T)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 327에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 328에서 아미노산 치환은 티로신(Y)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 340에서 아미노산 치환은 시스테인(C)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 421에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 히스티딘(H)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 436에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 456에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 티로신(Y)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 470에서 아미노산 치환은 류신(L)에서 페닐알라닌(F)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 485에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 류신(L)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 503에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 이소류신(I)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 552에서 아미노산 치환은 발린(V)에서 리신(K)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 아미노산 치환은 알라닌(A)에서 트레오닌(T)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 591에서 아미노산 치환은 글루타민(Q)에서 아르기닌(R)으로의 치환이다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 하나 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570 중 2, 3, 4, 5, 6개 이상에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 트랜스포사제가 위치 30, 165, 282 및/또는 538에서 상기한 돌연변이를 포함하는 실시양태를 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 포함할 수 있거나 슈퍼 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 103, 194, 372, 375, 450, 509 및 570에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 103에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 프롤린(P)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 194에서 아미노산 치환은 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 372에서 아미노산 치환은 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 375에서 아미노산 치환은 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 450에서 아미노산 치환은 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 509에서 아미노산 치환은 세린(S)에서 글리신(G)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 위치 570에서 치환은 아스파라긴(N)에서 세린(S)으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함할 수 있다. 피기백™ 트랜스포사제 효소가 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환을 포함하는 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1 또는 서열 번호 2의 서열의 위치 372, 375 및 450에서 아미노산 치환을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 및 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 피기백™ 트랜스포사제 효소는 서열 번호 1의 위치 194에서 메티오닌(M)에서 발린(V)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 372에서 아르기닌(R)에서 알라닌(A)으로의 치환, 서열 번호 1의 위치 375에서 리신(K)에서 알라닌(A)으로의 치환 및 서열 번호 1의 위치 450에서 아스파르트산(D)에서 아스파라긴(N)으로의 치환을 포함할 수 있다.
벡터
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 벡터는 재조합 벡터일 수 있다.
본 발명의 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터 단리 또는 유래된 서열을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 재조합 AAV(rAAV)를 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 단백질 스캐폴드, 센티린 또는 카르티린을 코딩하는 서열 옆에 시스로 위치하는 2개 이상의 역전된 말단 반복(ITR) 서열을 포함한다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 모든 혈청형(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 및 AAV9)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 자가 상보적 AAV(scAAV) 및 하나의 혈청형의 게놈 및 다른 혈청형의 캡시드를 함유하는 AAV 혼성체(예를 들어, AAV2/5, AAV-DJ 및 AAV-DJ8)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 예시적인 아데노 관련 바이러스 및 재조합 아데노 관련 바이러스는 rAAV-LK03을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 바이러스 벡터는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 선별 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선별 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 공격받을 때 세포능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있으며 여기서 유전자 생성물은 화합물에 내성을 부여한다. 본 발명의 예시적인 선별 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디히드로폴레이트 환원 효소를 코딩하며 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타아제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다약제 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 디히드로게나아제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타제를 코딩함), 및 NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이러스 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체 리간드 결합 영역일 수 있다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 또한 "iC9 안전 스위치"로도 지칭될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 바이러스 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함할 수 있다. 변형은 위치 36에서의 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)일 수 있다. 특정 실시양태에서, FKBP12 폴리펩티드는
(서열 번호 45)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, FKBP12 폴리펩티드는
(서열 번호 46)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 위치 36에 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)을 가지는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있는 리간드 결합 영역에 특이적인 유도제는, 둘 모두가 합성 약물인 AP20187 및/또는 AP1903을 포함한다.
본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 링커 영역은 GGGGS (서열 번호 47)를 포함하는 아미노산, 또는 GGAGGAGGAGGATCC (서열 번호 48)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 발명의 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 87에 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 282에 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 (서열 번호 49)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 50)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
폴리펩티드가 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 (서열 번호 51)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 52)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 발명의 바이러스 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 자가 절단 펩티드는 CAR과 선별 유전자 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함하며, 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류에 위치한다. 본 발명의 바이러스 벡터는, 예를 들어, 본 발명의 단백질 스캐폴드, 센티린 또는 카르티린 중 하나 이상의 것과 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드 사이에 위치한, 적어도 하나의 자가 절단 펩티드(들)를 포함할 수 있다. 본 발명의 바이러스 벡터는 적어도 2개의 자가 절단 펩티드(들)을 포함하며, 제1 자가 절단 펩티드는 예를 들어 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드의 상류 또는 바로 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는, 예를 들어 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드의 하류 또는 바로 상류에 위치한다. 자가 절단 펩티드는 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 53)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 53)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 54)를 포함하는 아미노산 서열, (서열 번호 54)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 55)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 56)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 56)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 57)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 57)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 58)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 58)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 59)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 59)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 60)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 60)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 61)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 61)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 나노입자 벡터이다. 본 발명의 예시적인 나노입자 벡터는 핵산(예를 들어, RNA, DNA, 합성 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 이들의 임의의 조합), 아미노산(L-아미노산, D-아미노산, 합성 아미노산, 변형된 아미노산, 또는 이들의 임의의 조합), 중합체(예를 들어, 폴리머좀), 미셀, 지질(예를 들어, 리포솜), 유기 분자(예를 들어, 탄소 원자, 시트, 섬유, 튜브), 무기 분자(예를 들어, 인산칼슘 또는 금) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 나노입자 벡터는 수동적으로 또는 능동적으로 세포막을 가로 질러 운반될 수 있다.
본 발명의 나노입자 벡터는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 선별 유전자는 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선별 유전자는 선택적 세포 배양 조건에 의해 공격받을 때 세포 생존능 및 생존에 필수적인 유전자 생성물을 코딩할 수 있다. 선택적 세포 배양 조건은 세포 생존능 또는 생존에 유해한 화합물을 포함할 수 있으며 여기서 유전자 생성물은 화합물에 내성을 부여한다. 예시적인 선별 유전자는 neo(네오마이신에 대한 내성을 부여함), DHFR(디히드로폴레이트 환원 효소를 코딩하며 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여함), TYMS(티미딜레이트 신테타아제를 코딩함), MGMT(O(6)-메틸구아닌-DNA 메틸트랜스퍼라제를 코딩함), 다약제 내성 유전자(MDR1), ALDH1(알데히드 디히드로게나아제 1 패밀리, 구성원 A1), FRANCF, RAD51C(RAD51 파라로그 C를 코딩함), GCS(글루코실세라미드 신타제를 코딩함), 및 NKX2.2(NK2 호메오박스 2를 코딩함), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 나노입자 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 비인간 서열은 제한 부위를 포함한다. 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 다량체 리간드 결합 영역일 수 있다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 또한 "iC9 안전 스위치"로도 지칭될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 나노입자 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 나노입자 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 카스파제 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 나노입자 벡터는 (a) 리간드 결합 영역, (b) 링커, 및 (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 여기서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 비인간 서열을 포함하지 않는다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 리간드 결합 영역은 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 리간드 결합 영역의 아미노산 서열은 서열의 위치 36에서 변형을 포함할 수 있다. 변형은 위치 36에서의 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)일 수 있다. 특정 실시양태에서, FKBP12 폴리펩티드는 (서열 번호 45)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, FKBP12 폴리펩티드는
(서열 번호 46)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 위치 36에 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)을 가지는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함할 수 있는 리간드 결합 영역에 특이적인 유도제는, 둘 모두가 합성 약물인 AP20187 및/또는 AP1903을 포함한다.
본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 링커 영역은 GGGGS (서열 번호 47)를 포함하는 아미노산, 또는 GGAGGAGGAGGATCC (서열 번호 48)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 특정 실시양태에서, 링커를 코딩하는 핵산 서열은 제한 부위를 포함하지 않는다.
본 발명의 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 87에 아르기닌(R)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 대안적으로, 또는 추가로, 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 서열의 위치 282에 알라닌(A)을 포함하지 않는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드, 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 절두된 카스파제 9 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 절두된 카스파제 9 폴리펩티드는 (서열 번호 49)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 50)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
폴리펩티드가 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 포함하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드의 특정 실시양태에서, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드는 (서열 번호 51)를 포함하는 아미노산 서열, 또는
(서열 번호 52)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
본 발명의 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 자가 절단 펩티드는 CAR과 나노입자 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR의 상류에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류에 위치한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR과 나노입자 사이에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류에 위치한다. 일부 실시양태에서, 나노입자 벡터는 적어도 하나의 자가 절단 펩티드를 포함할 수 있으며 여기서 제1 자가 절단 펩티드는 CAR과 나노입자 사이에 위치하고 제2 자가 절단 펩티드는 CAR의 하류, 예를 들어 CAR과 선별 유전자 사이에 위치한다. 본 발명의 나노 입자 벡터는 예를 들어 본 발명의 단백질 스캐폴드, 센티린 또는 카르티린 중 하나 이상과 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드 사이에 위치한 적어도 하나의 자가 절단 펩티드(들)를 포함할 수 있다. 본 발명의 나노입자 벡터는 적어도 2개의 자가 절단 펩티드(들)를 포함할 수 있으며, 제1 자가 절단 펩티드는 예를 들어, 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드의 상류 또는 바로 상류에 위치하고, 제2의 자가 절단 펩티드는, 예를 들어 본 발명의 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드의 하류 또는 바로 상류에 위치한다. 자가 절단 펩티드는, 예를 들어, T2A 펩티드, GSG-T2A 펩티드, E2A 펩티드, GSG-E2A 펩티드, F2A 펩티드, GSG-F2A 펩티드, P2A 펩티드, 또는 GSG-P2A 펩티드를 포함할 수 있다. T2A 펩티드는 (서열 번호 53)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 53)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 54)를 포함하는 아미노산 서열, (서열 번호 54)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-T2A 펩티드는 (서열 번호 55)를 포함하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. E2A 펩티드는 (서열 번호 56)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 56)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-E2A 펩티드는 (서열 번호 57)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 57)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. F2A 펩티드는 (서열 번호 58)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 58)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-F2A 펩티드는 (서열 번호 59)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 59)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. P2A 펩티드는 (서열 번호 60)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 60)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다. GSG-P2A 펩티드는 (서열 번호 61)를 포함하는 아미노산 서열, 또는 (서열 번호 61)를 포함하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 99%의 동일성을 가지는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
CAR 발현 세포
본 발명은 본 발명의 CAR을 포함하는 세포를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 트랜스포존을 포함하는 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 CAR, 트랜스포존 또는 벡터를 포함하는 세포는 세포 표면상에 CAR을 발현할 수 있다. 세포는 임의의 유형의 세포일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 면역 세포이다. 면역 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 자연 살해(NK) 유사 세포(예를 들어 사이토카인 유도된 살해(CIK: Cytokine Induced Killer) 세포), 조혈 전구 세포, 말초 혈액(PB) 유래 T 세포 또는 제대혈(UCB) 유래 T 세포일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. T 세포는 헬퍼 T 세포, 헬퍼 1형 T 세포, 헬퍼 2형 T 세포, 헬퍼 17 T 세포, 조절 T 세포, 자연 조절 T 세포 또는 유도된 조절 T 세포일 수 있다. T 세포는 CD4+일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 인공 리간드 제시 세포이며, 이는 경우에 따라 본 발명의 변형된 면역 세포 또는 T 세포를 자극 및 증식시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이며, 이는 경우에 따라 인공 또는 변형된 리간드 제시 세포로서 사용될 수 있다.
입양 요법에 사용될 수 있는 본 발명의 변형된 세포는 자기유래 또는 동종이계일 수 있다.
CAR 발현 세포의 제조 방법
본 발명은 세포의 표면상에 키메라 리간드/항원 수용체(CLR/CAR)를 발현하는 방법에 있어서, (a) 세포 집단을 수득하는 단계; (b) 세포 집단에서 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로 질러 CAR을 전달하기에 충분한 조건하에서 세포 집단을 본 발명의 CAR 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함하는 조성물에 접촉시켜 변형된 세포 집단을 생성하는 단계; (c) 트랜스포존의 통합에 적합한 조건하에서 변형된 세포 집단을 배양하는 단계; 및 (d) 세포 표면상에 CAR을 발현하는 변형된 세포 집단으로부터 적어도 하나의 세포를 증식 및/또는 선별하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 세포 집단은 백혈구 및/또는 CD4+ 및 CD8+ 백혈구를 포함할 수 있다. 세포 집단은 CD4+ 및 CD8+ 백혈구를 최적화된 비로 포함할 수 있다. CD4+ 대 CD8+ 백혈구의 최적화된 비는 생체 내에서 자연적으로 발생하지 않는다. 세포 집단은 종양 세포를 포함할 수 있다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존 또는 벡터는 CAR 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함한다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 세포 집단에서 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로 질러 CAR을 코딩하는 서열을 전달하기에 충분한 조건은 뉴클레오펙션을 포함한다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 세포 집단에서 적어도 하나의 세포의 세포막을 가로 질러 CAR을 코딩하는 서열을 전달하기에 충분한 조건은 지정된 전압에서 1회 이상의 펄스의 전력의 1회 이상의 적용, 완충액 및 하나 이상의 보충 인자(들)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충액은 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector), 인간 T 세포 뉴클레오펙션 완충액 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 보충 인자(들)는 (a) 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 또는 이들의 임의의 조합; (b) 염, 미네랄, 대사 산물 또는 이들의 임의의 조합; (c) 세포 배지; (d) 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제; 및 (e) 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약을 포함할 수 있다. 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 또는 이들의 임의의 조합은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림포톡신-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 염, 미네랄, 대사 산물 또는 이들의 임의의 조합은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산 나트륨, L-글루타민, MEM 비필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오시드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼스 염(Earle's Salts), 2-메르캅토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 플러스 보충제(Nucleofector PLUS Supplement), KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산 나트륨, 만니톨, 숙신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, 트리스/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리-에틸렌-글리콜, 폴록사머(Poloxamer) 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리-비닐피롤리돈, Pop313, 크라운(Crown)-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로(CellGro) DC 배지, CTS 옵티마이저(OpTimizer) T 세포 증식(Expansion) SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 증식 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 증식 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 카스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β) 억제제(예를 들어, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약은 pH 조절제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소 또는 임의의 조합을 포함한다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, CAR 또는 본 발명의 CAR을 코딩하는 서열의 통합에 적합한 조건은 적어도 하나의 완충액 및 하나 이상의 보충 인자(들)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존 또는 벡터는 본 발명의 CAR 또는 CAR을 코딩하는 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 완충액은 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, 아막사 뉴클레오펙터, 인간 T 세포 뉴클레오펙션 완충액 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 보충 인자(들)는 (a) 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 또는 이들의 임의의 조합; (b) 염, 미네랄, 대사 산물 또는 이들의 임의의 조합; (c) 세포 배지; (d) 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제; 및 (e) 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약을 포함할 수 있다. 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 또는 이들의 임의의 조합은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림포톡신-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 염, 미네랄, 대사 산물 또는 이들의 임의의 조합은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산 나트륨, L-글루타민, MEM 비필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오시드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼스 염, 2-메르캅토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 플러스 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산 나트륨, 만니톨, 숙신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, 트리스/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리-에틸렌-글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리-비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 증식 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 증식 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 증식 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 하나 이상의 아폽토시스 경로(들) 또는 이들의 조합의 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 카스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β) 억제제(예를 들어, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약은 pH 조절제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소 또는 임의의 조합을 포함한다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 증식 및 선별 단계는 순차적으로 일어난다. 선별하기 전에 증식이 일어날 수 있다. 증식은 선별 후에 일어날 수 있고, 경우에 따라 증식 후에 추가(즉, 제2) 선별이 일어날 수 있다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 증식 및 선별 단계는 동시에 일어날 수 있다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 증식은 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 리간드와 접촉시켜 CAR을 통해 적어도 하나의 세포를 자극함으로써 증식된 세포 집단을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 리간드는 기판의 표면에 제시될 수 있다. 기판은 표면, 웰, 비드 또는 이들의 다수, 및 기질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 형태를 가질 수 있다. 기판은 상자성 또는 자성 성분을 추가로 포함할 수 있다. CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 리간드는 기판의 표면상에 제시될 수 있으며, 여기서 기판은 자성 비드이고, 변형 및 확창된 세포 집단으로부터 자성 비드를 제거 또는 분리하기 위해 자석이 사용될 수 있다. 리간드는 세포 또는 인공 리간드 제시 세포의 표면에 제시될 수 있다. 본 발명의 인공 리간드 제시 세포는 종양 세포 및 줄기세포를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 트랜스포존 또는 벡터는 선별 유전자를 포함하고, 선별 단계는 변형된 세포 집단의 적어도 하나의 세포를 선별 유전자가 내성을 부여하는 화합물과 접촉시켜 선별 유전자를 발현하는 세포를 선별 단계에서 생존한 것으로서 확인하고 선별 유전자를 발현하지 못하는 세포를 선별 단계에서 생존하지 못하는 것으로서 확인하는 단계를 포함한다.
CAR을 발현하는 이 방법의 특정 실시양태에서, 증식 및/또는 선별 단계는 종점을 포함하여 10 내지 14일의 기간 동안 진행될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법의 변형, 증식 및 선별된 세포 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.
조혈 줄기세포
본 발명의 조성물은 대상체로부터 본래의 HSC의 선택적 제거 후 이식을 위한 다수의 조혈 줄기세포(HSC)를 포함할 수 있다.
조혈 줄기세포(HSC)는 다분화능의 자가 재생 전구 세포이다. 림프 및 골수 계통에서 분화된 모든 혈액 세포는 HSC에서 발생한다. HSC는 성인 골수, 말초 혈액 및 제대혈에서 발견될 수 있다.
골수 이식 형태의 HSC 이식은 종종 대상체의 면역계의 잔존물이 이식된 세포를 공격하거나 이식된 세포의 생존에 도움이 되지 않는 조건을 생성하기 때문에 실패한다. 본 발명의 조성물 및 방법의 개발 전에, 골수 이식 전에 HSC의 제거는 효과가 없거나 의도된 HSC 이외의 세포 집단에 해를 끼쳤다. 본 발명의 조성물 및 방법은 HSC 표면 리간드를 특이적으로 표적화하는 키메라 리간드 수용체(CAR)를 발현하는 면역 세포로 이들 HSC를 표적화함으로써 질환을 유발하는, 손상되거나, 기능 불량이거나 유전적 결함을 갖는 HSC를 선택적으로 제거하는 방법을 제공한다. CAR 발현 면역 세포를 포함하는 조성물은 면역 세포를 사전 방사선 조사함으로써 또는 유도제의 투여시, 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드(그 외 "안전 스위치"라고도 지칭됨)를 포함하는 외인성 CAR 발현 면역 세포만의 아폽토시스를 개시하는 유도성 아폽토시스 유발성 폴리펩티드를 함유하도록 이들 세포를 추가로 변형시킴으로써 이들이 기능 수행을 완료하면 이들은 제거될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 다수의 HSC의 이식을 추가로 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 이식된 HSC는 유전자 변형된다.
본 발명의 HSC는 DNA 국소화 도메인 및 이펙터 도메인을 포함하는 조성물에 의해 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, DNA 국소화 도메인은 Cas9, 불활성화된 Cas9, 짧은 Cas9, 짧고 불활성화된 Cas9, TALEN 또는 아연-핑거 단백질의 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이펙터는 엔도뉴클레아제를 포함한다. 바람직하게는, 엔도뉴클레아제는 IIS형 엔도뉴클레아제이다. 특정 실시양태에서, IIS형 엔도뉴클레아제는 AciI, Mn1I, AlwI, BbvI, BccI, BceAI, BsmAI, BsmFI, BspCNI, BsrI, BtsCI, HgaI, HphI, HpyAV, Mbo1I, My1I, PleI, SfaNI, AcuI, BciVI, BfuAI, BmgBI, BmrI, BpmI, BpuEI, BsaI, BseRI, BsgI, BsmI, BspMI, BsrBI, BsrBI, BsrDI, BtgZI, BtsI, EarI, EciI, MmeI, NmeAIII, BbvCI, Bpu10I, BspQI, SapI, BaeI, BsaXI, CspCI, BfiI, MboII, Acc36I, FokI 또는 Clo051 중 하나 이상이다. 게놈 편집 도구에 대한 자세한 내용은 PCT/US2016/037922호(그 내용은 전문으로 본원에 참고로 포함됨)를 참조한다. DNA 국소화 도메인 및 이펙터 도메인을 포함하는 조성물은 트랜스포존에 포함될 수 있다. 벡터에 포함된 것들을 포함하여 DNA 국소화 도메인 및 이펙터 도메인을 포함하는 조성물은 발현 및/또는 세포로의 전달을 위한 벡터에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명의 HSC는 질환 또는 장애의 유전학적 또는 후성 유전학적 마커를 제거하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 HSC는 핵산 또는 단백질을 발현 또는 과발현하거나 본 발명의 질환 또는 장애를 치료하기 위한 분자 펩티드, 단백질 또는 화합물을 분비하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 HSC는 핵산 또는 단백질을 발현 또는 과발현하거나 본 발명의 면역 반응을 변형시키기 위한 분자, 펩티드, 단백질 또는 화합물을 분비하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 HSC는 본 발명의 CAR 발현 면역 세포의 활성을 변형시키기 위한 세포 표면 리간드를 발현 또는 과발현하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 이식된 HSC는 본 발명의 CAR 발현 면역 세포에 결합시, 임의의 잔류 CAR 발현 면역 세포가 이식된 HSC 세포를 선택적으로 제거하지 못하도록 면역 세포를 비활성화시키는 리간드를 발현할 수 있다.
핵산 분자
단백질 스캐폴드를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태와 같은 RNA 형태일 수 있거나, 클로닝에 의해 수득된 또는 합성 생산된 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하지만 이에 제한되지 않는 DNA의 형태, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA는 삼중 가닥, 이중 가닥 또는 단일 가닥 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 적어도 하나의 가닥의 DNA 또는 RNA의 임의의 부분은 센스 가닥으로도 알려진 코딩 가닥일 수 있거나, 안티 센스 가닥으로도 지칭되는 비코딩 가닥일 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는, 경우에 따라 하나 이상의 인트론과 함께, 오픈 리딩 프레임(ORF: open reading frame), 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 적어도 하나의 특정 부분을 포함하는 핵산 분자; 표적 단백질에 결합하는 단백질 스캐폴드 또는 루프 영역에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상기한 것들과 실질적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하지만, 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 본원에 기재된 바와 같고/거나 당 업계에 공지된 바와 같은 단백질 스캐폴드를 여전히 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 암호는 당 업계에 잘 공지되어 있다. 따라서, 당업자가 본 발명의 특정 단백질 스캐폴드를 코딩하는 이러한 축퇴성 핵산 변이체를 생성하는 것은 일상적일 것이다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상기]를 참조하며, 이러한 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다.
본원에서 지시된 바와 같이, 단백질 스캐폴드를 코딩하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는 단백질 스캐폴드 단편 자체의 아미노산 서열을 코딩하는 것; 전체 단백질 스캐폴드 또는 이들의 일부에 대한 코딩 서열; 단백질 스캐폴드, 단편 또는 일부에 대한 코딩 서열뿐만 아니라, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호(예를 들어, 리보솜 결합 및 mRNA의 안정성)를 포함하는 mRNA 프로세싱, 전사에 역할을 하는 전사되는 비번역 서열과 같은 비코딩 5' 및 3' 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는 추가적인 비코딩 서열과 함께, 적어도 하나의 인트론과 같은 상기한 추가의 코딩 서열이 있거나 없는 적어도 하나의 신호 선도서열 또는 융합 펩티드에 대한 코딩 서열과 같은 추가의 서열; 추가적인 기능을 제공하는 아미노산과 같은 추가적인 아미노산을 코딩하는 추가의 코딩 서열을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 단백질 스캐폴드를 코딩하는 서열은 단백질 스캐폴드 단편 또는 일부를 포함하는 융합된 단백질 스캐폴드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 코딩하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수 있다,
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드와 선택적으로 혼성화하는 폴리뉴클레오티드
본 발명은 선택적 혼성화 조건하에서 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드와 혼성화하는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 이 실시양태의 폴리뉴클레오티드는 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 단리, 검출 및/또는 정량하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 기탁된 라이브러리에서 부분 또는 전장 클론을 확인, 단리 또는 증폭하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 포유동물 핵산 라이브러리로부터 단리된 게놈 또는 cDNA 서열이거나 상기 라이브러리부터의 cDNA에 상보적이다.
바람직하게는, cDNA 라이브러리는 80% 이상의 전장 서열, 바람직하게는 85% 또는 90% 이상의 전장 서열, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 전장 서열을 포함한다. cDNA 라이브러리는 희귀 서열의 표현을 증가시키도록 정규화될 수 있다. 낮거나 중등도의 엄격성 혼성화 조건은 전형적으로, 전적인 것은 아니지만, 상보적인 서열에 비해 감소한 서열 동일성을 갖는 서열과 함께 사용된다. 경우에 따라, 더 높은 동일성의 서열에 대해 중등도 및 높은 엄격성 조건이 임의로 사용될 수 있다. 낮은 엄격성 조건은 약 70% 서열 동일성을 갖는 서열의 선택적 혼성화를 가능하게 하며, 이종상동성(orthologous) 또는 유사(paralogous) 서열을 확인하는데 사용될 수 있다.
경우에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 단백질 스캐폴드의 적어도 일부를 코딩할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대한 선택적인 혼성화에 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 문헌 (Ausubel); 상기 문헌(Colligan)은 각각 전체가 본원에 참고로 포함된다.
핵산의 제작
본 발명의 단리된 핵산은 당 업계에 잘 공지된 바와 같이, (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술, 및/또는 (d) 이들의 조합을 사용하여 제조될 수 있다.
핵산은 편리하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 이외의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중 클로닝 부위가 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 핵산에 삽입될 수 있다. 또한, 번역 가능한 서열이 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 발명의 핵산은 경우에 따라, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터 또는 링커이다.
클로닝 및/또는 발현에서 기능을 최적화하기 위해, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해, 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입을 향상시키기 위해, 추가의 서열이 상기 클로닝 및/또는 발현 서열에 첨가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터 및 링커의 사용은 당 업계에 잘 공지되어 있다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel] 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
핵산을 제작하기 위한 재조합 방법
RNA, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합과 같은 본 발명의 단리된 핵산 조성물은 당업자에게 공지된 많은 클로닝 방법론을 사용하여 생물학적 공급원으로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 엄격한 조건하에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리에서 원하는 서열을 동정한다. RNA의 단리 및 cDNA 및 게놈 라이브러리의 제작은 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel] 또는 상기 문헌[Sambrook] 참조).
핵산 스크리닝 및 단리 방법
cDNA 또는 게놈 라이브러리는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열에 기초한 프로브를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 프로브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화시켜 동일한 또는 상이한 유기체에서 상동성 유전자를 단리하는 데 사용될 수 있다. 당업자는 분석법에서 다양한 엄격도의 혼성화가 사용될 수 있으며; 혼성화 또는 세척 매질이 엄격할 수 있음을 이해할 것이다. 혼성화 조건의 엄격도가 높을수록, 이중체 형성이 일어나기 위해서는 프로브와 표적 사이의 상보성 정도가 더욱 커야 한다. 엄격도는 온도, 이온 강도, pH 및 포름아미드와 같은 부분 변성 용매의 존재 중 하나 이상에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 혼성화의 엄격성은 예를 들어, 0% 내지 50% 범위 내에서 포름아미드의 농도 조작을 통해 반응물 용액의 극성을 변화시킴으로써 알맞게 변화된다. 검출 가능한 결합을 위해 요구되는 상보성 정도(서열 동일성)는 혼성화 매질 및/또는 세척 매질의 엄격성에 따라 달라질 것이다. 상보성 정도는 최적으로는 100%, 또는 70 내지 100%, 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값이 될 것이다. 그러나 혼성화 및/또는 세척 매질의 엄격성을 감소시킴으로써 프로브와 프라이머에서의 소수의 서열 변이가 상쇄될 수 있다는 점을 이해하여야 한다.
RNA 또는 DNA의 증폭 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있으며 본원에 제시된 교시 및 지침에 기초하여 과도한 실험 없이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
DNA 또는 RNA의 공지된 증폭 방법으로는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 관련된 증폭 프로세스(예를 들어, 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 제4,800,159호, 제4,965,188(Mullis, et al.); 제4,795,699호, 및 제4,921,794(Tabor, et al); 제5,142,033호(Innis); 제5,122,464호(Wilson, et al.); 제5,091,310호(Innis); 제5,066,584호(Gyllensten, et al); 제4,889,818호(Gelfand, et al); 제4,994,370호(Silver, et al); 제4,766,067호(Biswas); 제4,656,134호(Ringold) 참조) 및 이중 가닥 DNA 합성을 위한 주형으로서 표적 서열에 대한 안티센스 RNA를 사용하는 RNA 매개 증폭(미국 특허 제5,130,238호(Malek, et al.), 상표명 NASBA)(상기 참고문헌의 전체 내용은 본원에서 참고로 포함됨)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌 [Ausubel, 상기 문헌]; 또는 [Sambrook, 상기 문헌] 참조).
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 관련 유전자의 서열을 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 직접적으로 증폭하는데 사용될 수 있다. PCR 및 다른 시험관 내 증폭 방법은 또한 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 클로닝하는 데, 샘플 중 원하는 mRNA의 존재를 검출하기 위한 프로브로서 사용하기 위한 핵산을 제조하는 데, 핵산 서열분석을 위해, 또는 다른 목적을 위해 유용할 수 있다. 시험관 내 증폭 방법을 통해 기술자에게 지시하기에 충분한 기술의 예는 문헌[Berger, 상기 문헌, Sambrook, 상기 문헌, 및 Ausubel, 상기 문헌]뿐만 아니라, 미국 특허 제4,683,202호(1987)(Mullis, et al.); 및 문헌[Innis, et al., PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Eds., Academic Press Inc., San Diego, Calif. (1990)]에서도 살펴볼 수 있다. 게놈 PCR 증폭을 위해 상업적으로 이용 가능한 키트는 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 어드밴티지-GC 게노믹 PCR 키트(Advantage-GC Genomic PCR Kit)(Clontech)를 참조한다. 추가로, 예를 들어, T4 유전자 32 단백질(Boehringer Mannheim)을 사용하여 긴 PCR 생성물의 수율을 개선할 수 있다.
핵산 제작을 위한 합성 방법
본 발명의 단리된 핵산은 공지된 방법에 의한 직접적인 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다(예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상기 문헌] 참조). 화학적 합성은 일반적으로 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 제조하고, 이는 상보적인 서열과 혼성화에 의해, 또는 주형으로서 단일 가닥을 사용하는 DNA 폴리머라제에 의한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성이 약 100개 이상의 염기의 서열로 제한될 수 있지만, 짧은 서열의 결찰에 의해 더욱 긴 서열이 수득될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
재조합 발현 카세트
본 발명은 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 카세트를 추가로 제공한다. 본 발명의 핵산 서열, 예를 들어, 본 발명의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 cDNA 또는 게놈 서열은 적어도 하나의 원하는 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 재조합 발현 카세트를 제작하는 데 사용될 수 있다. 재조합 발현 카세트는 전형적으로 의도된 숙주 세포에서 폴리뉴클레오티드의 전사를 지시하는 전사 개시 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함할 것이다. 본 발명의 핵산의 발현을 지시하는 데 이종성 및 비이종성(즉, 내인성) 프로모터, 둘 모두가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 발현을 상향 또는 하향 조절하기 위해 프로모터, 인핸서, 또는 다른 요소로서 작용하는 단리된 핵산이 비이종성 형태의 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 적절한 위치(상류, 하류 또는 인트론 내) 도입될 수 있다. 예를 들어, 내인성 프로모터는 생체 내 또는 시험관 내에서 돌연변이, 결실 및/또는 치환에 의해 변경될 수 있다.
벡터 및 숙주 세포
본 발명은 또한 당 업계에 널리 공지된 바와 같이, 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 재조합 벡터로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의한 적어도 하나의 단백질 스캐폴드의 생산에 관한 것이다. 예를 들어, 상기 문헌[Sambrook, et al.; Ausubel, et al.]을 참조하며, 이들 각각은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
예를 들어, PB-EF1a 벡터가 사용될 수 있다. 벡터는 하기 뉴클레오티드 서열을 포함한다:
폴리뉴클레오티드는 경우에 따라 숙주에서의 증식을 위한 선별 마커를 함유하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 인산 칼슘 침전물과 같은 침전물 또는 하전된 지질과의 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스일 경우, 적절한 패키징 세포주를 사용하여 시험관 내에서 패키징한 다음 숙주 세포로 형질도입될 수 있다.
DNA 삽입물은 적절한 프로모터에 작동 가능하게 연결되어야 한다. 발현 구조물은 전사 개시, 종결을 위한 부위 및 전사되는 영역 내에 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 추가로 포함할 것이다. 구조물에 의해 발현되는 성숙한 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 번역되는 mRNA의 말단에 적절하게 위치된 개시 및 종결 코돈(예를 들어, UAA, UGA 또는 UAG)에서 번역 개시를 포함할 것이며, 포유동물 또는 진핵 세포 발현에서 UAA 및 UAG가 선호된다.
발현 벡터는 바람직하게는 그러나 경우에 따라 적어도 하나의 선별 가능한 마커를 포함할 것이다. 이러한 마커로는 예를 들어, 진핵생물 세포 배양을 위한 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 미코페놀산 또는 글루타민 신테타아제(GS, 미국 특허 제5,122,464호; 제5,770,359호; 제5,827,739호), 블라스티시딘(bsd 유전자) 내성 유전자뿐만 아니라 이. 콜라이 및 기타 박테리아 또는 원핵생물에서 배양하기 위한 암피실린, 제오신(Sh bla 유전자), 퓨로마이신(pac 유전자), 하이그로마이신 B(hygB 유전자), G418/제네티신(neo 유전자), 카나마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 카르베니실린, 블레오마이신, 에리트로마이신, 폴리믹신 B 또는 테트라사이클린 내성 유전자가 포함되나 이에 제한되지는 않는다(상기 특허는 이로써 전체가 본원에 참고로 포함됨). 상기한 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건은 당 업계에 공지되어있다. 적합한 벡터는 당업자에게 기꺼이 명백할 것이다. 숙주 세포 내로 벡터 구조물의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질 매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 당 업계, 예를 들어 상기 문헌[Sambrook, Chapter 1-4 and 16-18; Ausubel, Chapters 1, 9, 13, 15, 16]에 기재되어 있다.
발현 벡터는 바람직하게는 그러나 경우에 따라 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포를 단리하기 위한 적어도 하나의 선별 가능한 세포 표면 마커를 포함할 것이다. 본 발명의 선별 가능한 세포 표면 마커는 세포 또는 세포의 서브세트를 세포의 정의된 또 다른 서브세트와 구별하는 표면 단백질, 당단백질 또는 단백질 군을 포함한다. 바람직하게는 선별 가능한 세포 표면 마커는 본 발명의 조성물 또는 방법에 의해 변형된 세포를 본 발명의 조성물 또는 방법에 의해 변형되지 않은 세포와 구별한다. 이러한 세포 표면 마커는 "세포 표면 항원 무리(cluster of designation)" 또는 "분류 결정 인자(classification of determinant)" 단백질(종종 "CD"로 약칭됨), 예를 들어 CD19, CD271, CD34, CD22, CD20, CD33, CD52, 또는 이들의 임의의 조합의 절두된 또는 전체 길이 형태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 세포 표면 마커는 자살 유전자 마커 RQR8을 추가로 포함한다(Philip B et al. Blood. 2014 Aug 21; 124(8):1277-87).
발현 벡터는 바람직하게는 그러나 경우에 따라, 본 발명의 조성물 및 방법에 의해 변형된 세포를 단리하기 위한 적어도 하나의 선별 가능한 약물 내성 마커를 포함할 것이다. 본 발명의 선별 가능한 약물 내성 마커는 야생형 또는 돌연변이 Neo, DHFR, TYMS, FRANCF, RAD51C, GCS, MDR1, ALDH1, NKX2.2, 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 단백질 스캐폴드는 융합 단백질과 같은 변형된 형태로 발현될 수 있으며, 분비 신호뿐만 아니라 추가적인 이종 기능성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가 아미노산, 특히 하전된 아미노산의 영역이 숙주 세포에서, 정제 중에 또는 후속적인 취급 및 보관 중에 안정성 및 지속성을 향상시키기 위해 단백질 스캐폴드의 N- 말단에 첨가될 수 있다. 또한, 펩티드 모이어티는 정제를 용이하게 하기 위해 본 발명의 단백질 스캐폴드에 첨가될 수 있다. 이러한 영역은 단백질 스캐폴드 또는 이의 적어도 하나의 단편의 최종 제조 전에 제거될 수 있다. 이러한 방법은 상기 문헌[Sambrook, Chapters 17.29-17.42 and 18.1-18.74; Ausubel, Chapters 16, 17 and 18]과 같은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어있다.
당업자는 본 발명의 단백질을 코딩하는 핵산의 발현에 이용 가능한 다수의 발현 시스템에 대해 잘 알고 있다. 다르게는, 본 발명의 핵산은 본 발명의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 내인성 DNA를 함유하는 숙주 세포에서 (조작에 의해) 작동시킴(turning on)으로써 숙주 세포에서 발현될 수 있다. 이러한 방법은 전체가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,580,734호, 제5,641,670호, 제5,733,746호 및 제5,733,761호에 기재된 바와 같이 당 업계에 잘 공지되어 있다.
단백질 스캐폴드, 이의 특정 부분 또는 변이체의 생산에 유용한 세포 배양의 예는 당 업계에 공지된 바와 같이 박테리아, 효모 및 포유동물 세포이다. 포유동물 세포 현탁액 또는 생물 반응기가 사용될 수도 있지만 포유동물 세포 시스템은 종종 세포의 단일 층의 형태로 존재할 것이다. 손상되지 않은 글리코실화된 단백질을 발현할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 본 기술 분야에서 개발되었고, 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)(버지니아주 마나사스 소재)(www.atcc.org)로부터 쉽게 이용 가능한 COS-1(예를 들어, ATCC CRL 1650), COS-7(예를 들어, ATCC CRL-1651), HEK293, BHK21(예를 들어, ATCC CRL-10), CHO(예를 들어, ATCC CRL 1610) 및 BSC-1(예를 들어, ATCC CRL-26) 세포주, Cos-7 세포, CHO 세포, hep G2 세포, P3X63Ag8.653, SP2/0-Ag14, 293 세포, HeLa 세포 등을 포함한다. 바람직한 숙주 세포는 골수종 및 림프종 세포와 같은 림프계 기원의 세포를 포함한다. 특히 바람직한 숙주 세포는 P3X63Ag8.653 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1580) 및 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 수탁 번호 CRL-1851)이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 재조합 세포는 P3X63Ab8.653 또는 SP2/0-Ag14 세포이다.
이들 세포를 위한 발현 벡터는 하기 발현 조절 서열 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 예를 들어(그러나 이에 제한되지는 않음), 복제 기점; 프로모터(예를 들어, 후기 또는 초기 SV40 프로모터, CMV 프로모터(미국 특허 제5,168,062호; 제5,385,839호), HSV tk 프로모터, pgk(포스포글리세레이트 키나제) 프로모터, EF-1 알파 프로모터(미국 특허 제5,266,491호), 적어도 하나의 인간 프로모터, 인핸서, 및/또는 프로세싱 정보 부위, 예를 들어 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위(예를 들어, SV40 거대 T Ag 폴리 A 첨가 부위) 및 전사 종결 서열. 예를 들어, 상기 문헌[Ausubel et al.; Sambrook, et al.]을 참조한다. 본 발명의 핵산 또는 단백질의 생산에 유용한 다른 세포는 공지되어 있고/거나, 예를 들어 세포주 및 하이브리도마의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 카탈로그(www.atcc.org) 또는 기타 공지된 또는 상용 공급처로부터 이용 가능하다.
진핵 숙주 세포가 사용되는 경우, 폴리아데닐화 또는 전사 종결 서열이 전형적으로 벡터에 혼입된다. 종결 서열의 예는 소 성장 호르몬 유전자의 폴리아데닐화화 서열이다. 전사체의 정확한 스플라이싱을 위한 서열도 포함될 수 있다. 스플라이싱 서열의 예는 SV40의 VP1 인트론이다(Sprague, et al., J. Virol. 45:773-781 (1983)). 또한, 숙주 세포에서 복제를 조절하기 위한 유전자 서열은 당 업계에 공지된 바와 같이 벡터에 혼입될 수 있다.
단백질 스캐폴드의 정제
단백질 스캐폴드는 단백질 A 정제, 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성(hydrophobic interaction) 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는 잘 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수 및 정제될 수 있다. 고성능 액체 크로마토그래피("HPLC": High performance liquid chromatography)도 정제에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Colligan, Current Protocols in Immunology, or Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y., (1997-2001), 예를 들어, Chapters 1, 4, 6, 8, 9, 10]을 참조하며, 이들 각각은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 천연 정제 산물, 화학적 합성 절차의 산물, 및 예를 들어 이. 콜라이, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 산물을 포함한다. 재조합 생산 절차에서 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 글리코실화될 수 있거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 이러한 방법은 상기 문헌[Sambrook, Sections 17.37-17.42; Ausubel, Chapters 10, 12, 13, 16, 18 and 20, Colligan, Protein Science, Chapters 12-14, 이들 모두는 전체가 본원에 참고로 포함됨]와 같은 많은 표준 실험실 매뉴얼에 기술되어있다.
아미노산 코드
본 발명의 단백질 스캐폴드를 구성하는 아미노산은 종종 축약된다. 아미노산 표기는 당해 분야에서 잘 이해되는 바와 같이 단일 문자 코드, 3문자 코드, 명칭 또는 3개의 뉴클레오티드 코돈(들)에 의해 아미노산을 지정하여 나타낼 수 있다(문헌[Alberts, B., et al., Molecular Biology of The Cell, Third Ed., Garland Publishing, Inc., New York, 1994] 참조). 본원의 단백질 스캐폴드는 본원에서 특정된 바와 같은 자연적 돌연변이 또는 인간 조작으로부터의 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질 스캐폴드에서 기능에 필수적인 아미노산은 부위 지정 돌연변이 유발 또는 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발에 의해 확인될 수 있다(예를 들어, 상기 문헌[Ausubel, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)]). 후자의 절차는 분자 내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 이어서, 생성된 돌연변이 분자를 생물학적 활성, 예를 들어, 그러나 이에 제한되지 않는, 하나 이상의 중화 활성에 대해 시험한다. 단백질 스캐폴드 결합에 결정적인 부위는 또한 결정화, 핵자기 공명 또는 광친화성 표지와 같은 구조 분석에 의해 확인될 수 있다(Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) 및 de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
당업자가 이해하는 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 생물학적 활성 단백질 스캐폴드를 포함한다. 생물학적 활성 단백질 스캐폴드는 천연(비합성), 내인성 또는 관련된 및 공지된 단백질 스캐폴드의 특이적 활성의 적어도 20%, 30%, 또는 40%, 및, 바람직하게, 적어도 50%, 60%, 또는 70%, 및 가장 바람직하게, 적어도 80%, 90%, 또는 95% 내지 99% 이상인 특이적 활성을 가진다. 효소 활성 및 기질 특이성의 척도를 분석하고, 정량하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 유기 모이어티의 공유적 부착에 의해 변형된, 본원에 기술된 바와 같은 단백질 스캐폴드 및 단편에 관한 것이다. 상기 변형으로 약물 동태학적 특성이 개선된(예를 들어, 생체 내 혈청 반감기가 증가한) 단백질 스캐폴드 단편을 생산할 수 있다. 유기 모이어티는 선형 또는 분지형 친수성 중합체 기, 지방산기, 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 특정 실시양태에서, 친수성 중합체 기는 분자량이 약 800 내지 약 120,000 달톤일 수 있고, 폴리알칸 글리콜(예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜(PPG: polypropylene glycol), 탄수화물 중합체, 아미노산 중합체 또는 폴리비닐 피롤리돈일 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 기는 약 8 내지 약 40개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
본 발명의 변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 항체에 직접 또는 간접적으로 공유 결합된 하나 이상의 유기 모이어티를 포함할 수 있다. 본 발명의 단백질 스캐폴드 또는 단편에 결합하는 각 유기 모이어티는 독립적으로 친수성 중합체 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "지방산"은 모노카복실산 및 디카복실산을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "친수성 중합체 기"는 옥탄에서보다 물에서 더욱 큰 가용성을 가지는 유기 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 폴리리신은 옥탄보다 물 중에서 더욱 큰 가용성을 가진다. 따라서, 폴리리신의 공유적 부착에 의해 변형된 단백질 스캐폴드가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 단백질 스캐폴드를 변형시키는 데 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들어, 폴리알칸 글리콜(예를 들어, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG: monomethoxy-polyethylene glycol), PPG 등), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 셀룰로오스, 올리고당, 다당류 등), 친수성 아미노산의 중합체(예를 들어, 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트 등), 폴리알칸 옥시드(예를 들어, 폴리에틸렌 옥시드, 폴리프로필렌 옥시드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 단백질 스캐폴드를 변형시키는 친수성 중합체는 개별 분자체로서 분자량이 약 800 내지 약 150,000 달톤이다. 예를 들어, PEG5000 및 PEG20,000(여기서, 아래에 적힌 숫자는 중합체의 평균 분자량(달톤)임)이 사용될 수 있다. 친수성 중합체 기는 1 내지 약 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르 기로 치환되는 친수성 중합체는 적합한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 아민 기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카복실레이트(예를 들어, N,N-카보닐 디이미다졸로 활성화된 것)는 중합체 상의 히드록실 기에 커플링될 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드를 변형시키는데 적합한 지방산 및 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나, 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 단백질 스캐폴드를 변형시키는데 적합한 지방산은 예를 들어, n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-에이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트리아콘타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), 시스-Δ9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 모든 시스-Δ5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄디오산, 테트라데칸디오산, 옥타데칸디오산, 도코산디오산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지형 저급 알킬 기를 포함하는 디카복실산의 모노에스테르를 포함한다. 저급 알킬 기는 1 내지 약 12개, 바람직하게, 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 적합한 방법을 사용하여, 예를 들어, 하나 이상의 개질제와의 반응에 의해 제조될 수 있다. 용어로서 본원에서 사용되는 "개질제"는 활성화 기를 포함하는 적합한 유기 기(예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)를 지칭한다. "활성화 기"는 적절한 조건하에서 제2 화학기와 반응하여 개질제와 제2 화학기 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 모이어티 또는 작용기이다. 예를 들어, 아민 반응성 활성화 기는 친전자성 기, 예를 들어, 토실레이트, 메실레이트, 할로(클로로, 브로모, 플루오로, 아이오도), N-히드록시숙신이미딜 에스테르(NHS) 등을 포함한다. 티올과 반응할 수 있는 활성화 기는 예를 들어, 말레이미드, 아이오도아세틸, 아크릴로일, 피리딜 디술피드, 5-티올-2-니트로벤조산 티올(TNB-티올) 등을 포함한다. 알데히드 작용기는 아민- 또는 히드라지드 함유 분자에 커플링될 수 있고, 아지드기는 3가의 인 기와 반응하여 포스포라미데이트 또는 포스포리미드 결합을 포함할 수 있다. 활성화 기를 분자 내로 도입시키는 데 적합한 방법은 당 업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996)] 참조). 활성화 기는 유기 기(예를 들어, 친수성 중합체, 지방산, 지방산 에스테르)에 직접, 또는 링커 모이어티, 예를 들어, 2가 C1-C12 기(여기서, 하나 이상의 탄소 원자는 이종원자, 예를 들어, 산소, 질소 또는 황으로 대체될 수 있음)를 통해 결합될 수 있다. 적합한 링커 모이어티는 예를 들어, 테트라에틸렌 글리콜, ―(CH2)3―, ―NH―(CH2)6―NH―, ―(CH2)2―NH― 및 ―CH2―O―CH2―CH2―O―CH2―CH2―O―CH―NH―를 포함한다. 링커 모이어티를 포함하는 개질제는 예를 들어, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC)의 존재하에서 모노-Boc-알킬디아민(예를 들어, 모노-Boc-에틸렌디아민, 모노-Boc-디아미노헥산)을 지방산과 반응시켜 유리 아민과 지방산 카복실레이트 사이에 아미드 결합을 형성함으로써 제조될 수 있다. Boc 보호기는 기술된 바와 같이, 트리플루오로아세트산(TFA)으로 처리하여 또 다른 카복실레이트에 커플링될 수 있는 1급 아민을 노출시킴으로써 생성물로부터 제거될 수 있거나, 말레산 무수물과 반응될 수 있고, 생성된 생성물은 환화되어 지방산의 활성화된 말레이미도 유도체를 생성할 수 있다(예를 들어, WO 92/16221호(Thompson, et.al.)(그의 전체 교시 내용은 본원에서 참고로 포함됨)).
본 발명의 변형된 단백질 스캐폴드는 단백질 스캐폴드 또는 단편을 개질제와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 유기 모이어티는 아민 반응성 개질제, 예를 들어, PEG의 NHS 에스테르를 사용하여 비부위 특이적인 방식으로 단백질 스캐폴드에 결합될 수 있다. 본 발명의 단백질 스캐폴드의 특이적 부위에 결합된 유기 모이어티를 포함하는 변형된 단백질 스캐폴드 및 단편은 적합한 방법, 예를 들어, 역 단백질분해(Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), 및 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, Calif. (1996))에 기재된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
백혈구 성분 채집 산물로부터 T 세포 단리
백혈구 성분 채집 산물 또는 혈액은 임상 기관에서 폐쇄 시스템 및 표준 방법(예를 들어, COBE 스펙트라 아페레시스 시스템(COBE Spectra Apheresis System))을 사용하여 대상체로부터 수집할 수 있다. 바람직하게는, 산물은 표준 백혈구 채집 수집 백(bag)에 표준 병원 또는 기관 백혈구 성분 채집 절차에 따라 수집된다. 예를 들어, 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 백혈구 성분 채집 과정에서 일반적으로 사용되는 것 이외에 추가의 항응고제 또는 혈액 첨가제(헤파린 등)는 포함되지 않는다,
대안적으로, 백혈구(WBC: white blood cell)/말초 혈액 단핵 세포(PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell)(바이오세이프 세팩스 2(Biosafe Sepax 2)(폐쇄/자동화) 사용) 또는 T 세포(클리니맥스® 프로디지(CliniMACS® Prodigy)(폐쇄/자동화) 사용)는 전혈로부터 직접 단리될 수 있다. 그러나 특정 대상체(예를 들어, 암으로 진단받고/거나 치료받은 대상체)에서, WBC/PBMC 수율은 백혈구 성분 채집에 의해 단리될 때보다 전혈로부터 단리될 때 상당히 낮을 수 있다.
백혈구 성분 채집 절차 및/또는 직접적인 세포 단리 절차는 본 발명의 임의의 대상체에 사용될 수 있다.
백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 절연 용기에 포장되어야 하고 임상 프로토콜과 함께 사용 승인된 표준 병원 또는 기관 혈액 수집 절차에 따라 제어된 실온(+19℃ 내지 +25℃)에서 유지되어야 한다. 백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 냉장 보관해서는 안 된다.
백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 농도는 수송 과정에서 mL당 0.2x109 세포를 초과하지 않아야 한다. 백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 강렬한 혼합은 피해야한다.
백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은, 예를 들어 하룻밤, 보관되어야 한다면, 제어된 실내 온도(상기와 동일)로 유지되어야 한다. 보관 중에, 백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 농도는 mL당 0.2x109 세포를 초과해서는 안 된다.
바람직하게는, 백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 세포는 자기유래 혈장에 보관되어야 한다. 특정 실시양태에서, 백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물의 세포 농도가 mL당 0.2x109 세포보다 높으면, 산물은 자기유래 혈장으로 희석되어야한다.
바람직하게는, 백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 표지 및 분리 절차를 시작할 때 24시간보다 길어서는 안 된다. 백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물은 폐쇄 및/또는 자동화 시스템(예를 들어, 클리니맥스 프로디지)을 사용하여 세포 표지를 위해 처리 및/또는 제조될 수 있다.
자동화 시스템은 가능하게는 피콜레이션(ficolation) 및/또는 세포 산물(예를 들어, 백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물)의 세척에 의해 추가적인 백혈구 연층 분리를 수행할 수 있다.
폐쇄 및/또는 자동화 시스템을 사용하여 (예를 들어 백혈구 성분 채집 산물, 혈액, WBC/PBMC 조성물 및/또는 T 세포 조성물로부터) T 세포 단리를 위한 세포를 제조하고 표지할 수 있다.
WBC/PBMC를 직접적으로 뉴클레오펙션시킬 수 있지만(더 쉽고 추가적인 단계를 피할 수 있음), 본 발명의 방법은 먼저 뉴클레오펙션 전에 T 세포를 단리하는 단계를 포함할 수 있다. PBMC를 직접적으로 뉴클레오펙션하는 더 쉬운 전략은 CAR 신호 전달을 통해 매개되는 CAR+ 세포의 선택적 증식을 필요로 하며, 이는 T 세포를 기능적으로 소진시켜 산물의 생체 내 효율을 직접 감소시키는 열등한 증식 방법임을 저절로 입증하고 있다. 산물은 T 세포, NK 세포, NKT 세포, 단핵구, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 CAR+ 세포의 이종성 조성물일 수 있으며, 이는 환자마다 산물의 변동성을 증가시키고 투여 및 CRS 관리를 더욱 어렵게 만든다. T 세포는 종양 억제 및 살해의 주요 이펙터인 것으로 생각되기 때문에, 자기유래 산물의 제조를 위한 T 세포 단리는 더욱 이종성인 다른 조성물에 비해 상당한 이점을 초래할 수 있다.
T 세포는 단방향 표지 절차 또는 간접적으로 2단계 표지 절차에서 표지된 세포의 농축 또는 표지된 세포의 고갈에 의해 직접 단리될 수 있다. 본 발명의 특정 농축 전략에 따르면, T 세포는 세포 수집 백에서 수집되고 비-표지 세포(비표적 세포)는 음성 분획 백에 수집될 수 있다. 본 발명의 농축 전략과 대조적으로, 비표지된 세포(표적 세포)는 세포 수집 백에서 수집되고 표지된 세포(비표적 세포)는 음성 분획 백 또는 비표적 세포 백에 각각 수집된다. 선별 시약은 항체 코팅된 비드를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 항체 코팅된 비드는 변형 및/또는 증식 단계 전에 제거되거나, 변형 및/또는 증식 단계 전에 세포 상에 유지될 수 있다. 세포 마커의 하기의 하나 이상의 비제한적인 예가 T 세포를 단리하는 데 사용될 수 있다: CD3, CD4, CD8, CD25, 항-비오틴, CD1c, CD3/CD19, CD3/CD56, CD14, CD19, CD34, CD45RA, CD56, CD62L, CD133, CD137, CD271, CD304, IFN-감마, TCR 알파/베타, 및/또는 이들의 임의의 조합. T 세포의 단리 방법은 T 세포를 단리하는 데 사용될 수 있는 하기의 하나 이상의 비제한적인 예의 세포 마커 중 하나 이상에 특이적으로 결합하고/거나 이들을 검출 가능하게 표지하는 하나 이상의 시약을 포함할 수 있다: CD3, CD4, CD8, CD25, 항-비오틴, CD1c, CD3/CD19, CD3/CD56, CD14, CD19, CD34, CD45RA, CD56, CD62L, CD133, CD137, CD271, CD304, IFN-감마, TCR 알파/베타, 및/또는 이들의 임의의 조합. 이들 시약은 "우수 제조 관리 기준"("GMP": Good Manufacturing Practices) 등급일 수도 아닐 수도 있다. 시약에는 써모 다이나비드(Thermo DynaBeads) 및 밀테니(Miltenyi) 클리니맥스 제품이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 T 세포를 단리하는 방법은 표지 및/또는 단리 단계의 다중 반복을 포함할 수 있다. 본 발명의 T 세포를 단리하는 방법의 임의의 시점에서, 원하지 않는 세포 및/또는 원하지 않는 세포 유형은 원하지 않는 세포 및/또는 원하지 않는 세포 유형을 양성 또는 음성으로 선별함으로써 본 발명의 T 세포 산물 조성물로부터 고갈될 수 있다. 본 발명의 T 세포 산물 조성물은 CD4, CD8 및/또는 다른 T 세포 마커(들)를 발현할 수 있는 추가의 세포 유형을 포함할 수 있다.
T 세포의 뉴클레오펙션을 위한 본 발명의 방법은 예를 들어 뉴클레오펙션 후, 단리 단계 또는 TCR 신호전달을 통한 선택적 증식 단계를 포함하는 WBC/PBMC의 집단 또는 조성물에서 T 세포의 뉴클레오펙션 방법에 의한 T 세포 단리 단계를 제거할 수 있다.
T 세포 농축 및/또는 분류 전 또는 후에 양성 또는 음성 선별에 의해 특정 세포 집단이 고갈될 수 있다. 세포 산물 조성물로부터 고갈될 수 있는 세포 조성물의 예는 골수 세포, CD25+ 조절 T 세포(TReg), 수지상 세포, 대식세포, 적혈구, 비만 세포, 감마-델타 T 세포, 자연 살해(NK), 자연 살해(NK)-유사 세포(예를 들어, 사이토카인 유도된 살해(CIK) 세포), 유도된 자연 살해(iNK) T 세포, NK T 세포, B 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 T 세포 산물 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. CD4+ 및 CD8+ T 세포는 단리 또는 선별 절차 중에 별도의 수집 백으로 단리될 수 있다. CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 추가로 개별적으로 처리될 수 있거나, 재구성 후(동일한 조성물 내로의 조합) 특정 비로 처리될 수 있다.
CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포가 재구성될 수 있는 특정 비는 사용된 증식 기술의 유형 및 효능, T 세포 산물 조성물의 증식에 이용된 세포 배지 및/또는 성장 조건에 따라 달라질 수 있다. 가능한 CD4+: CD8+ 비의 예는 50%:50%, 60%:40%, 40%:60% 75%:25% 및 25%:75%를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
CD8+ T 세포는 강한 종양 세포 살해능을 나타내는 한편, CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포 증식능 및 증식 기능을 지원하는데 필요한 많은 사이토카인을 제공한다. 정상 공여자로부터 단리된 T 세포는 주로 CD4+이기 때문에, T 세포 산물 조성물은 CD4+:CD8+ 비에 대해 시험관 내에서 인위적으로 조정되어 생체 내에서 다르게 존재하는 CD4+ T 세포 대 CD8+ T 세포의 비를 개선한다. 또한, 자기유래 T 세포 산물 조성물의 생체 외 증식을 위해 최적화된 비가 사용될 수 있다. T 세포 산물 조성물의 인위적으로 조정된 CD4+:CD8+ 비의 관점에서, 본 발명의 산물 조성물은 T 세포의 임의의 자연 발생 집단과는 상당히 상이하고 현저히 큰 이점을 제공할 수 있음에 주목하는 것이 중요하다.
T 세포 단리를 위한 바람직한 방법은 미접촉 범 T 세포를 생성하기 위한 음성 선별 전략을 포함할 수 있는데, 이는 생성된 T 세포 조성물이 조작되지 않았고 T 세포의 자연 발생 다양성/비를 함유하는 T 세포를 포함함을 의미한다.
양성 또는 음성 선별에 사용될 수 있는 시약은 자성 세포 분리 비드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 자성 세포 분리 비드는 본 발명의 T 세포 단리 방법에서 다음 단계를 수행하기 전에 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 또는 CD4+와 CD8+ T 세포의 혼합 집단의 선별된 집단으로부터 제거되거나 고갈될 수 있다.
T 세포 조성물 및 T 세포 산물 조성물은 동결 보존, 표준 T 세포 배양 배지에 보관 및/또는 유전자 변형을 위해 제조될 수 있다.
T 세포 조성물, T 세포 산물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴지 T 세포 조성물 또는 이의 임의의 일부는 높은 회수율, 생존능, 표현형 및/또는 기능적인 능력을 가진 인간 세포를 보관 및 회수하기 위해 최적화된 표준 동결 보존 방법을 사용하여 동결 보존될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 동결 보존 매질 및/또는 프로토콜이 사용될 수 있다. 본 발명의 동결 보존 방법은 냉동 관련 독성을 감소시키는 DMSO 미함유 동결 보존제(예를 들어, CryoSOfree™ DMSO 미함유 동결 보존 매질)를 포함할 수 있다.
T 세포 조성물, T 세포 산물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴지 T 세포 조성물 또는 이의 임의의 일부는 배양 배지에 보관될 수 있다. 본 발명의 T 세포 배양 배지는 세포 보관, 세포 유전자 변형, 세포 표현형 및/또는 세포 증식에 최적화될 수 있다. 본 발명의 T 세포 배양 배지는 하나 이상의 항생제를 포함할 수 있다. 세포 배양 배지 내에 항생제의 포함은 뉴클레오펙션을 통한 유전자 변형 후 형질감염 효율 및/또는 세포 수율을 감소시킬 수 있기 때문에, 특정 항생제(또는 이들의 조합) 및 그들의 각각의 농도(들)는 뉴클레오펙션을 통한 유전자 변형 후 최적의 형질감염 효율 및/또는 세포 수율을 위해 변경될 수 있다.
본 발명의 T 세포 배양 배지는 혈청을 포함할 수 있고, 또한 혈청 조성 및 농도는 최적의 세포 결과를 위해 변경될 수 있다. 인간 AB 혈청은 T 세포의 배양을 위해 FBS/FCS보다 바람직한데, 그 이유는 FBS/FCS가 본 발명의 T 세포 배양 배지에 사용하기 위해 고려되긴 하지만, 이종(xeno)-단백질을 도입할 수 있기 때문이다. 혈청은 배양물 내 T 세포 조성물이 투여를 위해 의도된 대상체의 혈액으로부터 단리될 수 있으므로, 본 발명의 T 세포 배양 배지는 자기유래 혈청을 포함할 수 있다. 무혈청 배지 또는 혈청 대용물도 본 발명의 T 세포 배양 배지에 사용될 수 있다. 본 발명의 T 세포 배양 배지 및 방법의 특정 실시양태에서, 무혈청 배지 또는 혈청 대용물은 더 큰 생존력을 갖고, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션시키고, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고, 더 바람직한 세포 표현형 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 나타내는 더 건강한 세포를 포함한, 그러나 이에 제한되지 않는, 이종 혈청을 배지에 보충하는 것보다 이점을 제공할 수 있다.
T 세포 배양 배지는 상업적으로 이용 가능한 세포 성장 배지를 포함할 수 있다. 예시적인 상업적으로 이용 가능한 세포 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 증식 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 증식 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 증식 배지 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
T 세포 조성물, T 세포 산물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴지 T 세포 조성물 또는 이의 임의의 일부는 유전자 변형을 위해 제조될 수 있다. 유전자 변형을 위한 T 세포 조성물, T 세포 산물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴지 T 세포 조성물 또는 이의 임의의 일부의 제조는 원하는 뉴클레오펙션 완충액에서의 세포 세척 및/또는 재현탁을 포함할 수 있다. 동결 보존된 T 세포 조성물은 해동되고 뉴클레오펙션에 의한 유전자 변형을 위해 제조될 수 있다. 동결 보존된 세포는 표준 또는 공지된 프로토콜에 따라 해동될 수 있다. 동결 보존된 세포의 해동 및 제조는 더 큰 생존능을 가지고, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션시키고, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고, 더 바람직한 세포 표현형 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 나타내는 세포를 생산하도록 최적화될 수 있다. 예를 들어, 그리폴스 알부테인(Grifols Albutein)(25% 인간 알부민)이 해동 및/또는 제조 공정에 사용될 수 있다.
유전자 변형 T 세포
T 세포 조성물, T 세포 산물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴지 T 세포 조성물 또는 이의 임의의 일부는 예를 들어 전기천공과 같은 뉴클레오펙션 전략을 사용하여 유전자 변형될 수 있다. 뉴클레오펙션될 총 세포 수, 뉴클레오펙션 반응의 총 부피 및 샘플의 정확한 제조시기는 더 큰 생존능을 가지고, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션시키고, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고, 더 바람직한 세포 표현형 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 나타내는 세포를 생산하도록 최적화될 수 있다.
뉴클레오펙션 및/또는 전기천공은 예를 들어 론자 아막사(Lonza Amaxa), 맥스사이트 펄스애길(MaxCyte PulseAgile), 하바드 어파라투스 BTX(Harvard Apparatus BTX) 및/또는 인비트로젠 네온(Invitrogen Neon)을 사용하여 수행될 수 있다. 가소성 중합체 전극을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비금속 전극 시스템이 뉴클레오펙션에 바람직할 수 있다.
뉴클레오펙션에 의한 유전자 변형 전에, T 세포 조성물, T 세포 산물 조성물, 자극되지 않은 T 세포 조성물, 휴지 T 세포 조성물 또는 이의 임의의 일부는 뉴클레오펙션 완충액에 재현탁될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오펙션 완충액은 상업적으로 이용 가능한 완충액을 포함한다. 본 발명의 뉴클레오펙션 완충액은 더 큰 생존능을 가지고, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션시키고, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고, 더 바람직한 세포 표현형 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 나타내는 세포를 생산하도록 최적화될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오펙션 완충액은 PBS, HBSS, OptiMEM, BTXpress, 아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector), 인간 T 세포 뉴클레오펙션 완충액 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 뉴클레오펙션 완충액은 더 큰 생존능을 가지고, 더 높은 효율로 뉴클레오펙션시키고, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고, 더 바람직한 세포 표현형 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 나타내는 세포를 생산하기 위해 하나 이상의 보충 인자를 포함할 수 있다. 예시적인 보충 인자는 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 사이토카인, 케모카인 및 인터루킨은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림포톡신-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 보충 인자는 염, 미네랄, 대사 산물 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 염, 미네랄, 대사 산물은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산 나트륨, L-글루타민, MEM 비필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오시드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼스 염, 2-메르캅토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 플러스 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산 나트륨, 만니톨, 숙신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, 트리스/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리-에틸렌-글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리-비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 보충 인자는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 증식 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 증식 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 증식 배지 및 이들의 임의의 조합과 같은 배지를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 보충 인자는 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 아폽토시스 경로(들) 및 이들의 조합의 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 카스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β) 억제제(예를 들어, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 보충 인자는 세포 전달을 향상시키고/거나, 핵 전달 또는 수송을 향상시키고/거나, 핵산의 핵으로의 촉진된 수송을 향상시키고/거나, 염색체 외 핵산의 분해를 향상시키고/거나 DNA 매개 독성을 감소시키는 방식으로 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 예시적인 시약은 pH 조절제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
트랜스포존 및 트랜스포사제를 포함하는 전위 시약은 세포를 뉴클레오펙션 완충액(경우에 따라 뉴클레오펙션 반응 바이알 또는 큐벳 내에 함유됨)에 첨가하기 전, 첨가와 동시에 또는 첨가한 후에 본 발명의 뉴클레오펙션 반응에 첨가될 수 있다. 본 발명의 트랜스포존은 플라스미드 DNA, 선형화된 플라스미드 DNA, PCR 생성물, 도기본(DOGGYBONE)™ DNA, mRNA 주형, 단일 또는 이중 가닥 DNA, 단백질-핵산 조합 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스포존은 하나 이상의 TTAA 부위(들), 하나 이상의 역전된 말단 반복(들)(ITR), 하나 이상의 긴 말단 반복(LTR: long terminal repeat), 하나 이상의 인슐레이터(들), 하나 이상의 프로모터(들), 하나 이상의 전장 또는 절두된 유전자(들), 하나 이상의 폴리A 신호(들), 하나 이상의 자가 절단 2A 펩티드 절단 부위(들), 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(들)(IRES: internal ribosome entry site), 하나 이상의 인핸서(들), 하나 이상의 조절 인자(들), 하나 이상의 복제 기점(들) 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 하나 이상의 전장 또는 절두된 유전자(들)를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 트랜스포존에 의해 도입된 전장 및/또는 절두된 유전자(들)는 신호 펩티드, 센티린, 단쇄 가변 단편(scFv), 힌지, 막횡단 도메인, 보조 자극 도메인, 키메라 리간드/항원 수용체(CLR/CAR), 키메라 T 세포 수용체(CAR-T), 카르티린(센티린을 포함하는 CAR-T), 수용체, 리간드, 사이토카인, 약물 내성 유전자, 종양 리간드, 동종(allo) 또는 자가(auto) 리간드, 효소, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 형광 단백질, 뮤테인 또는 이들의 임의의 조합을 코딩할 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 물, TAE, TBE, PBS, HBSS, 배지, 본 발명의 보충 인자 또는 이들의 임의의 조합에 제조될 수 있다.
본 발명의 트랜스포존은 임상 안전성을 최적화하고/거나 제조 가능성을 향상시키도록 설계될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본 발명의 트랜스포존은 불필요한 서열 또는 영역을 제거하고/거나 비-항생제 선별 마커를 포함함으로써 임상 안전성을 최적화하고/거나 제조 가능성을 개선하도록 설계될 수 있다. 본 발명의 트랜스포존은 GMP 등급일 수 있거나 아닐 수 있다.
본 발명의 트랜스포사제 효소는 하나 이상의 플라스미드 DNA, mRNA, 단백질, 단백질-핵산 조합 또는 이들의 임의의 조합의 하나 이상의 서열에 의해 코딩될 수 있다.
본 발명의 트랜스포사제 효소는 물, TAE, TBE, PBS, HBSS, 배지, 본 발명의 보충 인자 또는 이들의 임의의 조합에 제조될 수 있다. 본 발명의 트랜스포사제 효소 또는 이들을 코딩 또는 전달하는 서열/구조물은 GMP 등급일 수 있거나 아닐 수 있다.
본 발명의 트랜스포존 및 트랜스포사제 효소는 임의의 수단에 의해 세포로 전달될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 플라스미드 DNA(pDNA)에 의한 본 발명의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제의 세포로의 전달을 포함하지만, 전달을 위한 플라스미드의 사용은 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제가 세포의 염색체 DNA 내에 통합되게 할 수 있으며, 이는 트랜스포사제 발현을 지속시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제 효소는 염색체 통합 가능성을 제거하기 위해 mRNA 또는 단백질로서 세포에 전달될 수 있다.
본 발명의 트랜스포존 및 트랜스포사제는 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제를 뉴클레오펙션 반응에 도입하기 전에 단독으로 또는 서로 조합하여 사전 인큐베이션될 수 있다. 트랜스포존 및 트랜스포사제 각각의 절대량뿐만 아니라 상대량, 예를 들어 트랜스포존 대 트랜스포사제의 비가 최적화될 수 있다.
경우에 따라, 바이알 또는 큐벳에서, 뉴클레오펙션 반응의 제조 후, 반응은 뉴클레오펙터 장치에 로딩될 수 있고 제조자의 프로토콜에 따라 전기 펄스의 전달을 위해 활성화될 수 있다. 본 발명의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제(또는 본 발명의 트랜스포존 및/또는 트랜스포사제를 코딩하는 서열)를 세포로 전달하기 위해 사용되는 전기 펄스 조건은 향상된 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능, 더 바람직한 세포 표현형 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 갖는 세포를 생산하기 위해 최적화될 수 있다. 아막사 뉴클레오펙터 기술을 사용할 때, 아막사 2B 또는 4D 뉴클레오펙터에 대한 각각의 다양한 뉴클레오펙션 프로그램이 고려된다.
본 발명의 뉴클레오펙션 반응 후, 세포를 세포 배지에 부드럽게 첨가할 수 있다. 예를 들어, T 세포가 뉴클레오펙션 반응을 거칠 때, T 세포는 T 세포 배지에 첨가될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오펙션 후 세포 배지는 임의의 하나 이상의 상업적으로 이용 가능한 배지를 포함할 수 있다. 본 발명 뉴클레오펙션 후 세포 배지 (본 발명의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 포함)는 더 큰 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율을 가지고, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능을 나타내고, 더 바람직한 세포 표현형 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 나타내는 세포를 생산하기 위해 최적화될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오펙션 후 세포 배지(본 발명의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지 포함)는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 증식 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 증식 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 증식 배지 및 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 뉴클레오펙션 후 세포 배지(본 발명의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지 포함)는 생존능, 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 생존능, 세포 표현형 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 향상시키는 본 발명의 하나 이상의 보충 인자를 포함할 수 있다. 예시적인 보충 인자는 재조합 인간 사이토카인, 케모카인, 인터루킨 및 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 사이토카인, 케모카인, 및 인터루킨은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림포톡신-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 보충 인자는 염, 미네랄, 대사 산물 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 염, 미네랄, 대사 산물은 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산 나트륨, L-글루타민, MEM 비필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오시드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼스 염, 2-메르캅토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 플러스 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산 나트륨, 만니톨, 숙신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, 트리스/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리-에틸렌-글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리-비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 보충 인자는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 증식 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 증식 배지, 이뮤노컬트 T 세포 증식 배지 및 이들의 임의의 조합과 같은 배지를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 보충인자는 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 아폽토시스 경로 및 이들의 조합의 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 억제제는 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, 1형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 카스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β) 억제제(예를 들어, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 보충 인자는 세포 전달을 향상시키고/거나, 핵 전달 또는 수송을 향상시키고/거나, 핵산의 핵으로의 촉진된 수송을 향상시키고/거나, 염색체 외 핵산의 분해를 향상시키고/거나 DNA 매개 독성을 감소시키는 방식으로 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 하나 이상의 핵산을 변형 또는 안정화시키는 예시적인 시약은 pH 조절제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소 및 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 뉴클레오펙션 후 세포 배지(본 발명의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 포함)는 실온에서 사용되거나 예를 들어 종점을 포함하여 32℃ 내지 37℃로 예열될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오펙션 후 세포 배지(본 발명 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지 포함함)는 세포 생존능 및/또는 본 발명의 트랜스포존 또는 그의 일부의 발현을 유지 또는 향상시키는 임의의 온도로 예열될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오펙션 후 세포 배지(본 발명의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 포함)는 조직 배양 플라스크 또는 디쉬, G-Rex 플라스크, 생물 반응기 또는 세포 배양 백, 또는 임의의 다른 표준 용기에 함유될 수 있다. 본 발명의 뉴클레오펙션 후 세포 배지(본 발명의 뉴클레오펙션 후 T 세포 배지를 포함)는 가만히 두거나, 대안적으로, 흔들릴 수 있다(예를 들어, 요동, 소용돌이 또는 진탕됨).
뉴클레오펙션 후 세포 배양물은 유전자 변형된 세포를 포함할 수 있다. 뉴클레오펙션 후 T 세포 배양물은 유전자 변형된 T 세포를 포함할 수 있다. 본 발명의 유전자 변형된 세포는 정해진 기간 동안 휴지되거나, 예를 들어 T 세포 익스팬더(expander) 기술의 추가에 의해 증식을 위해 자극될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 세포는 정해진 기간 동안 휴지되거나, 예를 들어 T 세포 익스팬더 기술의 추가에 의해 증식을 위해 즉시 자극될 수 있다. 본 발명의 유전자 변형된 세포는 적응하기에 충분한 시간, 전위가 일어날 시간, 및/또는 양성 또는 음성 선별을 위한 시간을 허용하도록 휴지될 수 있으며, 이는 향상된 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능, 바람직한 세포 표현형, 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 초래한다. 본 발명의 유전자 변형된 세포는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간 이상 휴지될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 선별된 유전자 변형된 세포는 예를 들어 하룻밤 휴지될 수 있다. 특정 양태에서, 하룻밤은 약 12시간이다. 본 발명의 유전자 변형된 세포는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상 휴지될 수 있다.
본 발명의 유전자 변형된 세포는 뉴클레오펙션 반응 후 및 익스팬더 기술의 추가 전에 선별될 수 있다. 유전자 변형된 세포의 최적의 선별을 위해, 변형된 세포(예를 들어, 변형되지 않은 세포로부터의 변형된 세포의 분화)의 확인을 용이하게 하기 위해, 세포는 적어도 2 내지 14일 동안 뉴클레오펙션 후 세포 배지에서 휴지하도록 할 수 있다.
일찍이 뉴클레오펙션 후 24시간에, 본 발명의 트랜스포존의 성공적인 뉴클레오펙션 시 변형된 T 세포에서 CAR/카르티린의 발현 및 본 발명의 선별 마커를 검출할 수 있다. 트랜스포존의 염색체 외 발현으로 인해, 선별 마커 단독의 발현은 변형된 T 세포(트랜스포존이 성공적으로 통합된 세포)를 변형되지 않은 T 세포(트랜스포존이 성공적으로 통합되지 않은 세포)와 구별하지 못 할 수 있다. 트랜스포존의 염색체 외 발현이 선별 마커에 의한 변형된 세포의 검출을 모호하게 할 때, 뉴클레오펙션된 세포(변형된 세포 및 비 변형된 세포 모두)는 세포가 발현을 중단하거나 모든 염색체 외 트랜스포존 발현을 상실하도록 일정 기간(예를 들어, 2 내지 14일) 동안 휴지될 수 있다. 이 연장된 휴지 기간 후에, 변형된 T 세포만이 선별 마커의 발현에 대해 양성으로 남아 있어야 한다. 이 연장된 휴지 기간의 길이는 각각의 뉴클레오펙션 반응 및 선별 과정에 대해 최적화될 수 있다. 트랜스포존의 염색체 외 발현이 선별 마커에 의한 변형된 세포의 검출을 모호하게 할 때, 이러한 연장된 휴지 기간 없이 선별이 수행될 수 있지만, 이후 시점(예를 들어, 도중 또는 이후)에 추가 선별 단계가 포함될 수 있다.
본 발명의 유전자 변형된 세포의 선별은 임의의 수단에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 특정 실시양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 세포의 선별은 특정 선별 마커를 발현하는 세포를 단리함으로써 수행될 수 있다. 본 발명의 선별 마커는 트랜스포존 내 하나 이상의 서열에 의해 코딩될 수 있다. 본 발명의 선별 마커는 성공적인 전위의 결과로서 변형된 세포에 의해 발현될 수 있다(즉, 트랜스포존 내 하나 이상의 서열에 의해 코딩되지 않음). 특정 실시양태에서, 본 발명의 유전자 변형된 세포는 뉴클레오펙션 후 세포 배지의 표적 화합물에 내성을 부여하는 선별 마커를 함유한다. 표적 화합물은 예를 들어, 선별 마커에 의해 변형된 세포에 부여된 내성이 없으면, 세포 사멸을 초래할 항생제 또는 약물을 포함할 수 있다. 예시적인 선별 마커는 neo, DHFR, TYMS, ALDH, MDR1, MGMT, FANCF, RAD51C, GCS 및 NKX2.2 유전자 중 하나 이상의 야생형(WT) 또는 돌연변이 형태를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 선별 마커는 표면-발현된 선별 마커 또는 표면-발현된 태그를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들은 각각 Ab-코팅된 자성 비드 기술 또는 칼럼 선별에 의해 표적화될 수 있는다. 단백질 정제에 사용되는 것과 같은 절단 가능한 태그가 효율적인 칼럼 선별, 세척 및 용리를 위해 본 발명의 선별 마커에 추가될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 선별 마커는 변형된 세포(변형된 T 세포 포함)에 의해 자연적으로 발현되지 않으므로, 변형된 세포의 물리적 단리(예를 들어, 세포 분류 기술에 의함)에 유용할 수 있다. 변형된 세포(변형된 T 세포 포함)에 의해 자연적으로 발현되지 않는 본 발명의 예시적인 선별 마커는 CD271, CD19, CD52, CD34, RQR8, CD22, CD20, CD33 및 이들의 임의의 조합의 전장, 돌연변이 또는 절두된 형태를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 유전자 변형된 세포는 뉴클레오펙션 반응 후에 선택적으로 증식될 수 있다. 특정 실시양태에서, CAR/카르티린을 포함하는 변형된 T 세포는 CAR/카르티린 자극에 의해 선택적으로 증식될 수 있다. CAR/카르티린을 포함하는 변형된 T 세포는 표적이 덮인 시약(예를 들어, 표적을 발현하는 종양 주 또는 정상 세포주 또는 표적에 덮인 익스팬더 비드)과의 접촉에 의해 자극될 수 있다. 대안적으로, CAR/카르티린을 포함하는 변형된 T 세포는 방사선 조사된 종양 세포, 방사선 조사된 동종이계 정상 세포, 방사선 조사된 자기유래 PBMC와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. 자극에 사용된 표적-발현 세포에 의한 본 발명의 세포 산물 조성물의 오염을 최소화하기 위해, 예를 들어, 세포 산물 조성물이 대상체에게 직접 투여될 수 있을 경우, CAR/카르티린 표적 단백질로 코팅된 익스팬더 비드를 사용하여 자극이 수행될 수 있다. CAR/카르티린 자극에 의한 CAR/카르티린을 포함하는 변형된 T 세포의 선택적 증식은 변형된 T 세포를 기능적으로 소진시키지 않도록 최적화될 수 있다.
본 발명의 선별된 유전자 변형된 세포는 정해진 기간 동안 동결 보존되거나, 휴지되거나, 세포 익스팬더 기술의 추가에 의해 증식을 위해 자극될 수 있다. 본 발명의 선별된 유전자 변형된 세포는 정해진 기간 동안 동결 보존되거나, 세포 익스팬더 기술의 추가에 의해 증식을 위해 즉시 자극될 수 있다. 본 발명의 선별된 유전자 변형된 세포가 T 세포일 때, T 세포는 T 세포 익스팬더 기술의 추가에 의해 증식을 위해 자극될 수 있다. 본 발명의 선별된 유전자 변형된 세포는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간 이상 휴지될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 선별된 유전자 변형된 세포는 예를 들어 하룻밤 휴지될 수 있다. 특정 양태에서, 하룻밤은 약 12시간이다. 본 발명의 선별된 유전자 변형된 세포는 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 이상 휴지될 수 있다. 본 발명의 선별된 유전자 변형된 세포는 임의의 정해진 기간 동안 휴지될 수 있으며, 이는 향상된 생존능, 더 높은 뉴클레오펙션 효율, 뉴클레오펙션 후 더 큰 생존능, 바람직한 세포 표현형, 및/또는 증식 기술의 추가시 더 큰/더 빠른 증식을 초래한다.
선별된 유전자 변형된 세포(본 발명의 선별된 유전자 변형된 T 세포 포함)는 임의의 표준 동결 보존 방법을 사용하여 동결 보존될 수 있으며, 이는 높은 회수율, 생존능, 표현형, 및 기능적 능력을 가진 인간 세포를 보관 및/또는 회수하기 위해 최적화될 수 있다. 본 발명 내용의 동결 보존 방법은 상업적으로 이용 가능한 동결 보존 매질 및/또는 프로토콜을 포함할 수 있다.
선별된 유전자 변형 세포(본 발명의 선별된 유전자 변형 T 세포 포함)의 전위 효율은 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 익스팬더 기술을 적용하기 전에, 선별된 유전자 변형된 세포(본 발명의 선별된 유전자 변형 T 세포 포함)에 의한 트랜스포존의 발현은 형광 활성화 세포 분류(FACS: fluorescence-activated cell sorting)에 의해 측정될 수 있다. 선별된 유전자 변형된 세포(본 발명의 선별된 유전자 변형 T 세포 포함)의 전위 효율의 결정은 트랜스포존(예를 들어, CAR)을 발현하는 선별된 세포의 백분율을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 대안적으로, 또는 추가로, T 세포의 순도, 트랜스포존 발현(예를 들어 CAR 발현)의 평균 형광 강도(MFI: Mean Fluorescence Intensity), CAR(트랜스포존으로 전달된 CAR)의 표적의 탈과립화 및/또는 CAR 리간드를 발현하는 세포의 살해를 매개하는 능력, 및/또는 선별된 유전자 변형된 세포(본 발명의 선택된 유전자 변형 T 세포 포함)의 표현형은 임의의 수단에 의해 평가될 수 있다.
본 발명의 세포 산물 조성물은 특정 출하 기준(release criteria)을 충족시킬 때 대상체에게 투여를 위해 출하될 수 있다. 예시적인 출하 기준은 세포 표면상에서 검출 가능한 수준의 CAR을 발현하는 변형, 선별 및/또는 증식된 T 세포의 특정 백분율을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
CAR 발현 T 세포의 생산
본 발명의 유전자 변형된 세포(유전자 변형된 T 세포 포함)는 익스팬더 기술을 사용하여 증식될 수 있다. 본 발명의 익스팬더 기술은 상업적으로 이용 가능한 익스팬더 기술을 포함할 수 있다. 본 발명의 예시적인 익스팬더 기술은 TCR을 통한 본 발명의 유전자 변형된 T 세포의 자극을 포함한다. 본 발명의 유전자 변형된 T 세포의 자극을 위한 모든 수단이 고려되지만, TCR을 통한 본 발명의 유전자 변형된 T 세포의 자극이 바람직한 방법이며, 이는 우수한 수준의 살해능을 갖는 산물을 생성할 수 있다.
TCR을 통해 본 발명의 유전자 변형된 T 세포를 자극하기 위해, 써모 익스팬더 다이나비드(Thermo Expander DynaBeads)가 3:1 비드 대 T 세포 비로 사용될 수 있다. 익스팬더 비드가 생체 분해성이지 않으면, 비드는 익스팬더 조성물로부터 제거될 수 있다. 예를 들어, 비드는 약 5일 후에 익스팬더 조성물로부터 제거될 수 있다. TCR을 통해 본 발명의 유전자 변형된 T 세포를 자극하기 위해, 밀테니(Miltenyi) T 세포 활성화/증식 시약이 사용될 수 있다. TCR을 통해 본 발명의 유전자 변형된 T 세포를 자극하기 위해, 스템셀 테크놀로지(StemCell Technologies)의 이뮤노컬트 인간 CD3/CD28 또는 CD3/CD28/CD2 T 세포 활성화제 시약이 사용될 수 있다. 가용성 사량체 항체 복합체는 일정 기간 후에 분해될 수 있고 과정으로부터 제거를 필요로 하지 않기 때문에 이 기술이 바람직할 수 있다.
인공 리간드 제시 세포(APC: artificial ligand presenting cell)는 표적 리간드를 동시 발현하도록 조작될 수 있고 본 발명의 TCR 및/또는 CAR을 통해 본 발명의 세포 또는 T 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. 인공 APC는 종양 세포주(예를 들어, 불멸화된 골수성 백혈병 주 K562를 포함)를 포함할 수 있거나 이로부터 유래될 수 있고, 다수의 보조 자극 분자 또는 기술(예를 들어 CD28, 4-1BBL, CD64, mbIL-21, mbIL-15, CAR 표적 분자 등)을 동시 발현하도록 조작될 수 있다. 본 발명의 인공 APC가 보조 자극 분자와 조합될 때, 조건은 바람직하지 않은 표현형 및 기능적 능력, 즉 말단-분화된 이펙터 T 세포의 발생 또는 출현을 방지하도록 최적화될 수 있다.
방사선 조사된 PBMC(자가 또는 동종)는 CD19와 같은 일부 표적 리간드를 발현할 수 있고, 본 발명의 TCR 및/또는 CAR을 통해 본 발명의 세포 또는 T 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 방사선 조사된 종양 세포는 일부 표적 리간드를 발현할 수 있고 본 발명의 TCR 및/또는 CAR을 통해 본 발명의 세포 또는 T 세포를 자극하는데 사용될 수 있다.
플레이트에 결합된 및/또는 가용성 항-CD3, 항-CD2 및/또는 항-CD28 자극은 본 발명의 TCR 및/또는 CAR을 통해 본 발명의 세포 또는 T 세포를 자극하는데 사용될 수 있다.
리간드-코팅된 비드는 표적 단백질을 나타낼 수 있고 본 발명의 TCR 및/또는 CAR을 통해 본 발명의 세포 또는 T 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, CAR/카르티린 표적 단백질로 코팅된 익스팬더 비드는 본 발명의 TCR 및/또는 CAR을 통해 본 발명의 세포 또는 T 세포를 자극하는데 사용될 수 있다.
증식 방법은 TCR 또는 CAR/카르티린을 통해 그리고 표면-발현된 CD2, CD3, CD28, 4-1BB, 및/또는 유전자 변형된 T 세포 상의 다른 마커를 통해 본 발명의 세포 또는 T 세포의 자극을 유도하였다.
뉴클레오펙션 후 대략 24시간까지 뉴클레오펙션 직후에 본 발명의 세포에 증식 기술을 적용할 수 있다. 다양한 세포 배지가 증식 절차 중에 사용될 수 있지만, 본 발명의 바람직한 T 세포 증식 배지는 예를 들어, 더 큰 생존능, 세포 표현형, 총 증식, 또는 생체 내 지속능, 생착능 및/또는 CAR 매개 살해능을 갖는 세포를 생산할 수 있다. 본 발명의 세포 배지는 본 발명의 유전자 변형된 세포의 증식, 표현형 및 기능을 개선/향상시키도록 최적화될 수 있다. 증식된 T 세포의 바람직한 표현형은 T 줄기세포 기억, T 중심 및 T 이펙터 기억 세포의 혼합물을 포함할 수 있다. 익스팬더 다이나비드는 주로 중심 기억 T 세포를 생산할 수 있으며, 이는 진료소에서 우수한 성능으로 이어질 수 있다.
본 발명의 예시적인 T 세포 증식 배지는 PBS, HBSS, OptiMEM, DMEM, RPMI 1640, AIM-V, X-VIVO 15, 셀그로 DC 배지, CTS 옵티마이저 T 세포 증식 SFM, TexMACS 배지, PRIME-XV T 세포 증식 배지, 이뮤노컬트-XF T 세포 증식 배지, 또는 이들의 임의의 조합을 부분적으로 또는 전체적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 T 세포 증식 배지는 하나 이상의 보충 인자를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 T 세포 증식 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 생존능, 세포 표현형, 총 증식을 향상시키거나 생체 내 지속능, 생착능 및/또는 CAR 매개 살해능을 증가시킨다. 본 발명의 T 세포 증식 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 재조합 인간 사이토카인, 케모카인 및/또는 인터루킨, 예를 들어 IL2, IL7, IL12, IL15, IL21, IL1, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, CXCL8, IL9, IL10, IL11, IL13, IL14, IL16, IL17, IL18, IL19, IL20, IL22, IL23, IL25, IL26, IL27, IL28, IL29, IL30, IL31, IL32, IL33, IL35, IL36, GM-CSF, IFN-감마, IL-1 알파/IL-1F1, IL-1 베타/IL-1F2, IL-12 p70, IL-12/IL-35 p35, IL-13, IL-17/IL-17A, IL-17A/F 이종이량체, IL-17F, IL-18/IL-1F4, IL-23, IL-24, IL-32, IL-32 베타, IL-32 감마, IL-33, LAP(TGF-베타 1), 림포톡신-알파/TNF-베타, TGF-베타, TNF-알파, TRANCE/TNFSF11/RANK L, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 T 세포 증식 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 염, 미네랄 및/또는 대사 산물, 예를 들어 HEPES, 니코틴아미드, 헤파린, 피루브산 나트륨, L-글루타민, MEM 비필수 아미노산 용액, 아스코르브산, 뉴클레오시드, FBS/FCS, 인간 혈청, 혈청 대용물, 항생제, pH 조절제, 얼스 염, 2-메르캅토에탄올, 인간 트랜스페린, 재조합 인간 인슐린, 인간 혈청 알부민, 뉴클레오펙터 플러스 보충제, KCL, MgCl2, Na2HPO4, NAH2PO4, 락토비온산 나트륨, 만니톨, 숙신산나트륨, 염화나트륨, CINa, 글루코스, Ca(NO3)2, 트리스/HCl, K2HPO4, KH2PO4, 폴리에틸렌이민, 폴리-에틸렌-글리콜, 폴록사머 188, 폴록사머 181, 폴록사머 407, 폴리-비닐피롤리돈, Pop313, 크라운-5, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 T 세포 증식 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 세포 DNA 감지, 대사, 분화, 신호 전달, 아폽토시스 경로의 억제제, 예를 들어 TLR9, MyD88, IRAK, TRAF6, TRAF3, IRF-7, NF-KB, I형 인터페론, 염증 유발성 사이토카인, cGAS, STING, Sec5, TBK1, IRF-3, RNA pol III, RIG-1, IPS-1, FADD, RIP1, TRAF3, AIM2, ASC, 카스파제1, Pro-IL1B, PI3K, Akt, Wnt3A의 억제제, 글리코겐 신타제 키나제-3β(GSK-3β) 억제제(예를 들어, TWS119), 바필로마이신, 클로로퀸, 퀴나크린, AC-YVAD-CMK, Z-VAD-FMK, Z-IETD-FMK 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 T 세포 증식 배지에 포함될 수 있는 보충 인자는 세포 전달을 향상시키고/거나, 핵 전달 또는 수송을 향상시키고/거나, 핵산의 핵으로의 촉진된 수송을 향상시키고/거나, 염색체 외 핵산의 분해를 향상시키고/거나 DNA 매개 독성을 감소시키는 방식으로 핵산을 변형 또는 안정화시키는 시약, 예를 들어 pH 조절제, DNA 결합 단백질, 지질, 인지질, CaPO4, NLS 서열을 갖거나 갖지 않는 순 중성 전하 DNA 결합 펩티드, TREX1 효소 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 유전자 변형된 세포는 선별 가능한 약물 또는 화합물의 사용에 의해 증식 과정 중에 선별될 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 본 발명의 트랜스포존이 배양 배지에 첨가된 약물에 대해 유전자 변형된 세포 내성을 부여하는 선별 마커를 코딩할 수 있는 경우, 선별은 증식 과정 중에 일어날 수 있고 선별이 일어나는데 대략 1 내지 14일의 배양이 필요할 수 있다. 본 발명의 트랜스포존에 의해 코딩되는 선별 마커로서 사용될 수 있는 약물 내성 유전자의 예는 유전자 neo, DHFR, TYMS, ALDH, MDR1, MGMT, FANCF, RAD51C, GCS, NKX2.2, 또는 이들의 임의의 조합의 야생형(WT) 또는 돌연변이 형태를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 선별 마커가 내성을 부여할 수 있는 배양 배지에 첨가될 수 있는 해당 약물 또는 화합물의 예는 G418, 퓨로마이신, 암피실린, 카나마이신, 메토트렉세이트, 멜팔란, 테모졸로미드, 빈크리스틴, 에토포시드, 독소루비신, 벤다무스틴, 플루다라빈, 아레디아(파미드론산나트륨), 베세넘(카르무스틴), BiCNU(카르무스틴), 보르테조밉, 카르필조밉, 카르무브리스(카르무스틴), 카르무스틴, 클라펜(사이클로포스파미드), 사이클로포스파미드, 사이톡산(사이클로포스파미드), 다라투무맙, 다르잘렉스(다라투무맙), 독실(독소루비신 염산염 리포솜), 독소루비신 염산염 리포솜, 독스-SL(독소루비신 염산염 리포솜), 엘로투주맙, 엠플리시티(엘로투주맙), 에바세트(독소루비신 염산염 리포솜), 파리닥(파노비노스타트), 익사조밉 시트레이트, 키프롤리스(카르필조밉) 레날리도미드, 리포독스(독소루비신 염산염 리포솜), 모조빌(플레릭사포르), 네오사르(사이클로포스파미드), 닌라로(익사조밉 시트레이트), 파미드론산나트륨, 파노비노스타트, 플레릭사포르, 포말리도미드, 포말리스트(포말리도미드), 레블리미드(레날리도미드), 시노비르(탈리도미드), 탈리도미드, 탈로미드(탈리도미드), 벨케이드(보르테조밉), 졸레드론산, 조메타(졸레돈산), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 T 세포 증식 과정은 웨이브(WAVE) 생물 반응기, G-Rex 플라스크, 또는 임의의 다른 적합한 용기 및/또는 반응기에서 세포 배양 백에서 일어날 수 있다.
본 발명의 세포 또는 T 세포 배양물은 흔들림 없이 유지되거나, 흔들리거나, 소용돌이치거나 진탕될 수 있다.
본 발명의 세포 또는 T 세포 증식 과정은 배양 기간, 세포 농도, T 세포 배지 첨가/제거 일정, 세포 크기, 총 세포 수, 세포 표현형, 세포 집단의 순도, 성장 세포 집단에서의 유전자 변형 세포의 백분율, 보충제의 사용 및 조성, 익스팬더 기술의 첨가/제거 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 그러나 이에 제한되지 않는, 특정 조건을 최적화할 수 있다.
본 발명의 세포 또는 T 세포 증식 과정은 생성된 증식된 세포 집단의 제제화 전에 미리 정의된 종점까지 계속될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 세포 또는 T 세포 증식 과정은 적어도 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24시간; 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30일; 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12주; 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6개월, 또는 적어도 1년의 미리 결정된 시간 동안 계속될 수 있다. 본 발명의 세포 또는 T 세포 증식 과정은 생성된 배양물이 부피(μl, ml, L)당 1, 10, 100, 1000, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010 세포 또는 이들 사이의 임의의 밀도의 미리 결정된 전체 세포 밀도에 도달할 때까지 계속될 수 있다. 본 발명의 세포 또는 T 세포 증식 과정은 생성된 배양물의 유전자 변형된 세포가 1%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 또는 이들 사이의 임의의 퍼센트의 발현의 임계 값 수준(생성된 유전자 변형된 세포가 임상적으로 효능이 있다고 나타내는 발현의 최소, 최대 또는 평균 수준)의 본 발명의 트랜스포존의 미리 결정된 발현의 수준을 나타낼 때까지 계속될 수 있다. 본 발명의 세포 또는 T 세포 증식 과정은 생성된 배양물의 유전자 변형된 세포 비율 대 비변형된 세포의 비율이 적어도 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 2:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 또는 이들 사이의 임의의 비율로 미리 결정된 임계 값에 도달할 때까지 계속될 수 있다.
투여 전 CAR 발현 T 세포의 품질 관리 분석
유전자 변형된 세포의 백분율은 본 발명의 증식 과정 동안 또는 후에 평가될 수 있다. 본 발명의 유전자 변형 세포에 의한 트랜스포존의 세포 발현은 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, FACS는 본 발명의 CAR을 발현하는 세포 또는 T 세포의 백분율을 결정하는데 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 유전자 변형된 세포 또는 T 세포의 순도, 본 발명의 유전자 변형된 세포 또는 T 세포에 의해 발현된 CAR의 평균 형광 강도(MFI), CAR 리간드를 발현하는 표적 세포의 탈과립화 및 살해를 매개하는 CAR의 능력 및/또는 CAR+ T 세포의 표현형이 평가될 수 있다.
대상체에게 투여하기 위한 본 발명의 조성물은 조성물이 약품으로서 제제화 및/또는 대상체에게 투여에 안전하고 효과적임을 나타내는 하나 이상의 "출하 기준"을 충족시키도록 요구될 수 있다. 출하 기준은 본 발명의 조성물(예를 들어, 본 발명의 T 세포 산물)이 그의 세포 표면상에서 본 발명의 CAR의 검출 가능한 수준을 발현하는 특정 백분율의 T 세포를 포함하는 요건을 포함할 수 있다.
증식 과정은 특정 기준이 충족될 때까지(예를 들어, 특정 총 세포 수 달성, 기억 세포의 특정 집단 달성, 특정 크기의 집단 달성) 계속되어야 한다.
특정 기준은 증식 과정이 종료되어야 하는 시점을 표시한다. 예를 들어, 세포가 300fL의 세포 크기에 도달하면 세포는 제제화, 재활성화 또는 동결 보존되어야 한다(그렇지 않으면 이 임계 값을 초과하는 세포는 사멸하기 시작할 수 있음). 세포 집단이 300 fL 미만의 평균 세포 크기에 도달하는 즉시 동결 보존은 세포가 동결 보존 전에 완전히 정지 상태에 도달하지 않았기 때문에 해동 및 배양시 세포 회수가 더 우수할 수 있다(완전 정지 크기는 약 180 fL 임). 증식 전에, 본 발명의 T 세포는 약 180 fL의 세포 크기를 가질 수 있지만, 증식 3일 후에 세포 크기를 대략 900 fL로 4배 이상 증가시킬 수 있다. 다음 6 내지 12일에 걸쳐, T 세포 집단은 세포 크기를 180 fL의 완전 정지 상태로 천천히 감소시킬 것이다.
제제화를 위한 세포 집단을 제조하는 방법은 세포 집단의 세포를 농축하는 단계, 세포를 세척하는 단계 및/또는 약물 내성 또는 특정 표면 발현 마커에 대해 분류하는 자성 비드를 통한 세포의 추가의 선별 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 제제화를 위한 세포 집단을 제조하는 방법은 최종 산물의 안전성 및 순도를 보장하기 위한 분류 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 환자로부터의 종양 세포가 본 발명의 유전자 변형된 T 세포를 자극하기 위해 사용되었거나 제제화를 위해 제조되고 있는 본 발명의 유전자 변형된 T 세포를 자극하기 위해 유전자 변형된 경우, 환자로부터의 종양 세포는 최종 산물에 포함되지 않는 것이 중요하다.
CAR 발현 세포의 투여 및 보존
본 발명의 약학 제제는 주입, 동결 보존 및/또는 보관을 위해 백에 분배될 수 있다.
본 발명의 약학 제제는 표준 프로토콜, 및 경우에 따라 주입할 수 있는 동결 보존 매질을 사용하여 동결 보존될 수 있다. 예를 들어, DMSO 미함유 동결 보존제(예를 들어, CryoSOfree™ DMSO 미함유 동결 보존 매질)를 사용하여 냉동 관련 독성을 줄일 수 있다. 본 발명의 동결 보존된 약학 제제는 나중에 환자에게 주입하기 위해 보관될 수 있다. 효과적인 치료는 본 발명의 약학 제제의 다중 투여를 필요로 할 수 있고, 따라서 약학 제제는 냉동 보관될 수 있지만 개별 용량의 해동을 위해 분리될 수 있는 미리 분취된 "용량"으로 포장될 수 있다.
본 발명의 약학 제제는 실온에서 보관될 수 있다. 효과적인 치료는 본 발명의 약학 제제의 다중 투여를 필요로 할 수 있고, 따라서 약학 제제는 함께 보관될 수 있지만 개별 용량의 투여를 위해 분리될 수 있는 미리 분취된 "용량"으로 포장될 수 있다.
본 발명의 약학 제제는, 예를 들어 병태의 완화 및 재발이 뒤따르는 후일에 투여를 필요로 할 수 있는, 동종이계 치료 사례의 동일한 환자에게 추가의 용량을 생성하기 위한 후속 재증식 및/또는 선별을 위해 보관될 수 있다.
입양 세포 요법으로서 변형된 세포의 주입
본 발명은 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 변형된 면역 세포 및 HSC를 제공한다. 본 발명의 변형된 세포는 실온 및 체온을 비롯한 임의의 온도에서의 보관을 위해 제제화될 수 있다. 본 발명의 변형된 세포는 동결 보존, 및 후속적인 해동을 위해 제제화될 수 있다. 본 발명의 변형된 세포는 멸균 포장재로부터 대상체에 직접적인 투여를 위해 약학적으로 허용 가능한 담체에 제제화될 수 있다. 본 발명의 변형된 세포는 최소 수준의 세포 기능 및 CAR/카르티린 발현을 보장하기 위해 세포 생존능 및/또는 CART/카르티린 발현 수준의 지표와 함께 약학적으로 허용 가능한 담체에 제제화될 수 있다. 본 발명의 변형된 세포는 추가 증식을 억제하고/거나, 세포 사멸을 방지하기 위한 하나 이상의 시약과 함께 약학적으로 허용되는 담체에 처방된 밀도로 제제화될 수 있다.
실시예
실시예 1: 인간 범 T 세포 내로 피기백 통합된 iC9 안전 스위치의 발현 및 기능
인간 범 T 세포를 아막사 4D 뉴클레오펙터를 사용하여 4개의 피기백 트랜스포존 중 하나로 뉴클레오펙션시켰다. "모의" 조건을 받은 변형된 T 세포를 공 피기백 트랜스포존으로 뉴클레오펙션시켰다. 변형된 T 세포는 치료제(카르티린을 코딩하는 서열)를 단독으로 함유하는 피기백 트랜스포사제 또는 통합된 iC9 서열 및 치료제(카르티린을 코딩하는 서열)를 함유하는 피기백 트랜스포사제를 받았다.
[도 1]은 리간드 결합 영역, 링커, 및 절두된 카스파제 9 폴리펩티드를 함유하는 iC9 안전 스위치의 개략도를 제공한다. 구체적으로, iC9 폴리펩티드는 위치 36에서 페닐알라닌(F)에서 발린(V)으로의 치환(F36V)을 포함하는 FK506 결합 단백질 12(FKBP12) 폴리펩티드를 포함하는 리간드 결합 영역을 함유한다.
iC9 폴리펩티드의 FKBP12 폴리펩티드는 (서열 번호 45)를 포함하는 아미노산 서열에 의해 코딩된다. iC9 폴리펩티드의 FKBP12 폴리펩티드는 (서열 번호 46)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. iC9 폴리펩티드의 링커 영역은 GGGGS (서열 번호 47)를 포함하는 아미노산, 및 GGAGGAGGAGGATCC (서열 번호 48)를 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. iC9 폴리펩티드의 링커 영역을 코딩하는 핵산 서열은 (서열 번호 49)를 포함하는 아미노산에 의해 코딩된다. iC9 폴리펩티드의 링커 영역을 코딩하는 핵산 서열은 (서열 번호 50)을 포함하는 핵산 서열에 의해 코딩된다.
iC9 안전 스위치를 테스트하기 위해, 4개의 변형된 T 세포 각각을 0, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM 또는 1000 nM AP1903(AP1903에 대한 유도제)와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 생존능은 아폽토시스를 거치는 세포에 대한 마커로서 형광 인터칼레이터인 7-아미노액티노마이신 D(7-AAD)를 사용하는 유동 세포 분석에 의해 평가하였다.
세포 생존능을 제12일에 평가하였다(도 2 참조). 데이터는 iC9 구조물을 포함하는 세포에서 유도제의 농도가 증가함에 따라 우측 하단에서 좌측 상단 사분면으로 세포 집단의 이동을 보여준다; 그러나 이러한 효과는 iC9 구조물이 없는 세포(카르티린만을 받은 세포)에서는 관찰되지 않으며, 여기서 세포는 유도제의 농도에 관계없이 이들 두 영역 사이에 균일하게 분포된다. 또한, 세포 생존능을 제19일에 평가하였다(도 3 참조). 데이터는 [도 2](뉴클레오펙션 후 제12일)에 나타낸 바와 동일한 경향을 나타낸다; 그러나, 좌측 상단 사분면으로 집단 이동은 이 더 늦은 시점(뉴클레오펙션 후 제19일)에 더욱 뚜렷하다.
집계된 결과의 정량화를 수행하였으며, [도 4]에 제공하며, 이는 제12일([도 2] 및 좌측 그래프) 또는 제19일([도 3] 및 우측 그래프)에 각각의 변형된 세포 유형에 대한 iC9 스위치의 유도제(AP1903)의 농도의 함수로서 iC9 안전 스위치가 세포 생존율에 미치는 유의한 영향을 나타낸다. iC9 안전 스위치의 존재는 제12일까지 상당수의 세포에서 아폽토시스를 유도하고 그 효과는 제19일까지 더욱더 극적이다.
본 연구의 결과는 AP1903이 심지어 본 연구의 최저 농도(0.1 nM)에서도 아폽토시스를 유도하기 때문에 iC9 안전 스위치가 유도제(예를 들어, AP1903)와 접촉할 때 활성 세포를 제거하는데 매우 효과적임을 보여준다. 또한, iC9 안전 스위치는 트리시스트론 벡터의 일부로서 기능적으로 발현될 수 있다.
실시예 2: c-kit(CD117) 및 프로미닌 -1(CD133)을 표적화하는 CAR-T 세포에 의한 조혈 세포의 고갈
특이적으로 활성화되고 HSC의 표면상에 항원으로 발현된다고 공지된 마커인 인간 c-kit(CD117) 또는 프로미닌-1(CD133)을 보유한 조혈 세포를 고갈시키는 인간 CAR-T 세포의 능력을 증명하기 위해서 실험 연구를 수행하였다. CAR 구조물 패널로부터 우세 후보를 선별하기 위해, 먼저 인간 말초 혈액으로부터 CD3/CD28-자극된 범 T 세포를 c-kit 또는 CD133에 대한 각각의 CAR 후보를 코딩하는 mRNA로 전기천공시켰다(도 5). 형질감염된 T 세포에서 CAR 표면 발현을 유동 세포 분석법에 의해 결정하였다(도 6A). mRNA-형질감염된 CAR-T 세포를 c-kit 또는 CD133을 발현하는 마우스 또는 인간 세포주(EML-C1 및 TF-1)뿐 아니라 인간 1차 BM 세포와 공동 배양하여 시험관 내 기능 분석을 수행하였다. 우세 항-c-kit 및 항-CD133 CAR 후보를 표면에서의 이들의 발현 수준뿐 아니라 CD107a 발현에 따른 탈과립화를 통한 CAR-T 세포의 특이적 활성화로부터 확인하였다(도 6B 및 C). 또한, CAR-T 사멸 능력을 평가하기 위해 인간 골수와 CAR-T 세포를 2일에 걸쳐 공동 배양한 후, CD34, CD117 및 CD133 세포 표면 항원을 유동 세포 분석을 수행하고 12일에 걸쳐 조혈 콜로니(CFU)의 생성을 위해 인간 성장 인자가 보충된 메틸셀룰로오스 배양액(메토컬트™, H4434)에 세포를 플레이팅하였다. 6개의 항-c-kit CAR-T 세포 후보 중 3개와 배양한 후 CD34+/CD117+ 세포의 비율 감소가 관찰되었던 한편, 7개의 항-CD133 CAR-T 후보 중 3개에 대해 CD34+/CD133+ 세포 감소가 관찰되었다(도 6D). CFU 기능 분석은 8개의 항-c-kit CAR-T 세포 후보 중 7개에 의해 골수에서 조혈 전구체의 효과적인 고갈을 보였다(도 6E). 따라서 이 데이터는 BM에서 내인성 HSC의 고갈을 위한 그리고 생착된 동종이계 또는 유전자 교정된 줄기세포로의 대체를 허용하기 위한 최소 독성 이식 요법에 대한 본 발명자들의 새로운 접근법을 뒷받침해준다.
c-kit 또는 CD133에 대한 동일한 CAR 카세트(도 5)를 메토트렉세이트로 생체 외 처리 후 전위된 T 세포의 선별을 위해 사용되는 DHFR 유전자, 및 예를 들어, AP1903의 투여 후와 공여자 HSC의 이식 전에 생체 내에서 CAR-T 세포의 청소를 허용하는 iC9 유전자와 함께 트리시스트론 피기백 트랜스포존 벡터(도 7)에 삽입한다.
c-kit 또는 CD133(도 5)에 대한 각각의 선택된 CAR 후보를 코딩하는 피기백 트랜스포존(도 7)을 슈퍼 피기백(SPB) 트랜스포사제를 코딩하는 mRNA와 함께 각각의 pDNA의 전기천공을 통해 인간 말초 혈액으로부터 단리된 범 T 세포에 도입하였다. 이어서, 수거된 세포는 CD3, CD4, CD8, CD56, CD45RA, CD62L, CCR7, CD45RO, PD1, Tim3, Lag3, CD184/CXCR4, CD25, CD127 및 CD28에 대한 항체를 사용하여 세포 표면 항원에 대한 유동 세포 분석법을 통해 표현형을 결정하였다(도 8). 이 분석은 대부분의 CD8+ T 세포가 CD45RA 및 CD62L 동시-발현(68.7-88.7%)에 따라 줄기세포 기억(SCM) 표현형임을 나타냈다. 대부분의 CD8+ T 세포는 또한 세포의 골수로의 귀소성을 매개하는 것으로 알려진 케모카인 CXCL12/SDF-1에 대한 수용체인 CXCR4(73.1-93.6%)를 발현하였다.
이어서, CAR-T 살해능을 평가하기 위해 상기 피기백 전위된 CAR-T 세포를 인간 골수(HuBM) 세포 또는 원숭이(레수스 마카크) 골수(MoBM) 세포와 2일에 걸쳐 공동 배양하고 12일에 걸쳐 조혈 콜로니(CFU)의 생성을 위해 인간 성장 인자가 보충된 메틸셀룰로오스 배양액(메토컬트™, H4434)에 세포를 플레이팅하여 시험관 내 기능 분석을 수행하였다. CFU 기능 분석은 8개의 항-c-키트 CAR-T 세포 후보 중 3개에 의해 골수에서 인간 조혈 전구체의 효과적인 고갈을 보였던 한편(도 9A), 원숭이 골수 전구체의 고갈은 8개의 항-c-kit CAR-T 세포 후보 중 4개에 대해 관찰되었다(도 9B).
c-kit 또는 CD133에 대해 선별된 피기백 전위된 CAR-T 세포에 관한 추가 연구는 이들을 G-CSF 동원된 말초 혈액(mPB: mobilized peripheral blood) 세포로부터 단리된 CD34+ 세포와 공동 배양한 후 피기백 벡터(도 1)에 기인한 CAR-T를 제거하기 위해 AP1903으로 처리한 후 연속 희석된 방사선 조사된 MS-5 골수 기질 세포 상에 배양한 후 수행하였다. 이들 장기간 배양물(LTC: long-term culture)을 배양 시간에 따라 증가하는 원시성의 조혈 세포 서브세트의 형성을 평가하는 조약돌 영역 형성 세포(CAFC)의 존재 또는 부재에 대해 평가하였다. 플레이팅 후 2주 및 5주에, L-Calc 소프트웨어(Stem Cell Technologies)를 사용하여 제한 희석 분석에 의해 95% 신뢰 구간(95% CI)을 갖는 CAFC 빈도 및 개수를 결정하였다. 항-c-kit CAR-T 세포와 CD34+ 세포의 사전 공동 배양은 13%의 생존 분율로 LTC에서 2주에 형성되는 CAFC의 개수를 유의하게 고갈시키는 효과를 보였던 한편(도 10A), 항-CD133 CAR-T와의 공동-배양은 43% 생존율로 CAFC의 보다 중간 수준의 고갈을 보였다. 5주 후반 시점에서 CAFC 빈도의 평가는 또한 14% 생존율로 항-c-kit CAR-T 세포로부터 유사한 수준의 고갈을 보여준 한편, 이 CAFC 서브세트는 2주에 더 일찍 발생하는 CAFC와 비교하여 항-CD133 CAR-T 세포로부터 더 높은 고갈(22% 생존)을 나타냈다(도 10C 및 D). 항-CD133 CAR-T에 의한 장기 성장 가능성을 갖는 원시 조혈 세포의 더 선택적인 고갈은 이식 후 더 빠르고 일시적인 조혈 회복을 허용하는 수임 HPC을 남겨두면서 원시 HSC로부터 영구적 생착을 허용함으로써 후속 HSC 이식을 받는 환자에서 개선된 임상 결과의 기초를 제공한다(도 3).
참고에 의한 포함
임의의 상호 참조된 또는 관련된 특허 또는 출원을 비롯한 본원에 인용된 모든 문헌은 명백히 배제되거나 달리 제한되지 않는 한 이로써 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 어떤 문헌의 인용도 이 문헌이 본원에 개시 또는 청구된 임의의 발명에 관한 선행 기술임을 인정하거나 이 문헌이 단독으로 또는 임의의 다른 참고문헌 또는 참고문헌들과의 임의의 조합으로 임의의 상기 발명을 교시, 제안 또는 개시하는 것임을 인정하는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 용어의 임의의 의미 또는 정의가 참고로 포함된 문헌에서 동일한 용어의 임의의 의미 또는 정의와 상충하는 범위까지 본 명세서의 해당 용어에 지정된 의미 또는 정의가 적용될 것이다.
다른 실시양태
본 발명의 특정 실시양태가 예시되고 기술되었지만, 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고서 다양한 다른 변경 및 변형이 이루어질 수 있다. 첨부된 청구항의 범위는 본 발명의 범위 내에 있는 이러한 모든 변경 및 변형을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Poseida Therapeutics, Inc. <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR SELECTIVE ELIMINATION AND REPLACEMENT OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS <130> POTH-026/001WO <160> 88 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 594 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln 1 5 10 15 Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp 20 25 30 His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile 35 40 45 Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu 50 55 60 Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn 65 70 75 80 Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His 85 90 95 Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu 100 105 110 Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile 115 120 125 Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile 130 135 140 Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg 145 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cagcaccagc 840 cctgaggacg aatcaccagg gagcaaccct gaaccagatg caactccatt ccaggaggga 900 ctgaggacct ttgaccagct ggatgctatc tcaagcctgc ccactcctag tgacattttc 960 gtgtcttaca gtaccttccc aggctttgtc tcatggcgcg atcccaagtc agggagctgg 1020 tacgtggaga cactggacga catctttgaa cagtgggccc attcagagga cctgcagagc 1080 ctgctgctgc gagtggcaaa cgctgtctct gtgaagggca tctacaaaca gatgcccggg 1140 tgcttcaatt ttctgagaaa gaaactgttc tttaagactt cc 1182 <210> 53 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 54 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 55 <211> 63 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 ggatctggag agggaagggg aagcctgctg acctgtggag acgtggagga aaacccagga 60 cca 63 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 57 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atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt 180 tatttatgtt tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta 240 acaaaacttt tatcgaatac ctgcagcccg ggggatgcag agggacagcc cccccccaaa 300 gcccccaggg atgtaattac gtccctcccc cgctaggggg cagcagcgag ccgcccgggg 360 ctccgctccg gtccggcgct ccccccgcat ccccgagccg gcagcgtgcg gggacagccc 420 gggcacgggg aaggtggcac gggatcgctt tcctctgaac gcttctcgct gctctttgag 480 cctgcagaca cctgggggga tacggggaaa agttgactgt gcctttcgat cgaaccatgg 540 acagttagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg 600 gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg 660 cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta 720 gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc 780 cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa 840 cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt 900 tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct 960 tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg 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atagggtgtg ctgtctcatc attttggcaa 1860 agattggcca ccaagcttgt cctgcaggag ggtcgacgcc tctagacggg cggccgctcc 1920 ggatccacgg gtaccgatca catatgcctt taattaaaca ctagttctat agtgtcacct 1980 aaattccctt tagtgagggt taatggccgt aggccgccag aattgggtcc agacatgata 2040 agatacattg atgagtttgg acaaaccaca actagaatgc agtgaaaaaa atgctttatt 2100 tgtgaaattt gtgatgctat tgctttattt gtaaccatta taagctgcaa taaacaagtt 2160 aacaacaaca attgcattca ttttatgttt caggttcagg gggaggtgtg ggaggttttt 2220 tcggactcta ggacctgcgc atgcgcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgttt 2280 tccccgtatc cccccaggtg tctgcaggct caaagagcag cgagaagcgt tcagaggaaa 2340 gcgatcccgt gccaccttcc ccgtgcccgg gctgtccccg cacgctgccg gctcggggat 2400 gcggggggag cgccggaccg gagcggagcc ccgggcggct cgctgctgcc ccctagcggg 2460 ggagggacgt aattacatcc ctgggggctt tggggggggg ctgtccctct caccgcggtg 2520 gagctccagc ttttgttcga attggggccc cccctcgagg gtatcgatga tatctataac 2580 aagaaaatat atatataata agttatcacg taagtagaac atgaaataac aatataatta 2640 tcgtatgagt taaatcttaa aagtcacgta aaagataatc atgcgtcatt ttgactcacg 2700 cggtcgttat agttcaaaat cagtgacact taccgcattg acaagcacgc ctcacgggag 2760 ctccaagcgg cgactgagat gtcctaaatg cacagcgacg gattcgcgct atttagaaag 2820 agagagcaat atttcaagaa tgcatgcgtc aattttacgc agactatctt tctagggtta 2880 atctagctag ccttaagggc gcctattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga 2940 aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt 3000 attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg 3060 cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac 3120 gcaggaaaga acatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 3180 cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 3240 ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 3300 actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 3360 gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 3420 ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 3480 gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 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Gly Gly Thr Lys Val Glu Val Lys Gly Gly Gly Gly Ser 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Leu Met Ser Trp Val Arg 145 150 155 160 Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Val Pro Ser 165 170 175 Gly Gly Phe Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile 180 185 190 Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 195 200 205 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Gln Thr Gly 210 215 220 Ser Trp Arg Val His Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser <210> 77 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn 20 25 30 Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met 35 40 45 Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile 85 90 95 Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys 100 105 110 Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro 115 120 125 Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile 130 135 140 Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val 145 150 155 160 Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr 165 170 175 Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser Leu Arg Asn Asp 180 185 190 Ser Ser Ser Ser Asn Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro Gly Asp Ser Ser 195 200 205 Leu His 210 <210> 78 <211> 182 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn 20 25 30 Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met 35 40 45 Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys 50 55 60 Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile 85 90 95 Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys 100 105 110 Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro 115 120 125 Arg Leu Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile 130 135 140 Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val 145 150 155 160 Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Gly Lys Ala Lys Asn Pro Pro 165 170 175 Gly Asp Ser Ser Leu His 180 <210> 79 <211> 210 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Lys Glu Ile Cys Gly Asn Pro Val Thr Asp Asn 20 25 30 Val Lys Asp Ile Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Asn Asp Tyr Met 35 40 45 Ile Thr Leu Asn Tyr Val Ala Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys 50 55 60 Trp Leu Arg Asp Met Val Ile Gln Leu Ser Leu Ser Leu Thr Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile 85 90 95 Ile Asp Lys Leu Gly Lys Ile Val Asp Asp Leu Val Leu Cys Met Glu 100 105 110 Glu Asn Ala Pro Lys Asn Ile Lys Glu Ser Pro Lys Arg Pro Glu Thr 115 120 125 Arg Ser Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Ser Ile Phe Asn Arg Ser Ile 130 135 140 Asp Ala Phe Lys Asp Phe Met Val Ala Ser Asp Thr Ser Asp Cys Val 145 150 155 160 Leu Ser Ser Thr Leu Gly Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr 165 170 175 Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser Leu Arg Asn Asp 180 185 190 Ser Ser Ser Ser Asn Arg Lys Ala Ala Lys Ala Pro Glu Asp Ser Gly 195 200 205 Leu Gln 210 <210> 80 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser 130 135 140 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser 145 150 155 160 Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys 165 170 175 Pro Trp Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Leu Ser Ser 195 200 205 Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser 210 215 220 Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 225 230 235 <210> 81 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro 130 135 140 Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser 145 150 155 160 Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu 195 200 205 Thr Leu Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 Leu Lys <210> 82 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser 115 120 125 Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Asn Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr 165 170 175 Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser 180 185 190 Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys 195 200 205 Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Tyr Gly Asp Tyr 210 215 220 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 83 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Asp Leu Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Glu Val Lys 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys 130 135 140 Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His 145 150 155 160 Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile 165 170 175 Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile 195 200 205 Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp 210 215 220 Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 84 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser 130 135 140 Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser 145 150 155 160 Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg 165 170 175 Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro 195 200 205 Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser 210 215 220 Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 <210> 85 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro 130 135 140 Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser 145 150 155 160 Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 165 170 175 Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly 180 185 190 Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 195 200 205 Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 210 215 220 Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 225 230 235 240 Ile Lys <210> 86 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly 100 105 110 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser 115 120 125 Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys 130 135 140 Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His Trp Val Asn Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Leu Asn Thr Glu Thr 165 170 175 Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser 180 185 190 Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys 195 200 205 Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp Tyr Gly Asp Tyr 210 215 220 Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 87 <211> 242 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser Ser Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Leu Glu Val Lys 115 120 125 Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys 130 135 140 Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Met His 145 150 155 160 Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Leu 165 170 175 Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp Asp Phe Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile 195 200 205 Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Thr Asp 210 215 220 Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser <210> 88 <211> 486 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Met 20 25 30 Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser 35 40 45 Ser Val Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro 50 55 60 Lys Pro Trp Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Leu Ser 85 90 95 Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His 100 105 110 Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ser 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser 130 135 140 Ser Leu Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro 145 150 155 160 Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 165 170 175 Asp Tyr Ser Met His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys 180 185 190 Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala Asp 195 200 205 Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr 210 215 220 Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Phe Cys Ala Thr Asp Tyr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg 325 330 335 Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln 340 345 350 Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu 355 360 365 Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 370 375 380 Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 385 390 395 400 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 405 410 415 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 420 425 430 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 435 440 445 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 450 455 460 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 465 470 475 480 Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485

Claims (209)

  1. 적어도 하나의 표적 조혈 줄기세포(HSC: hematopoietic stem cell) 상의 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 키메라 리간드 수용체(CLR: chimeric ligand receptor)(들)를 발현하는 복수의 T 세포를 포함하는, 치료용 HSC의 이식 이전에 대상체에 있어서의 상기 표적 HSC를 제거하는 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 방법은 유효량의 상기 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 적어도 하나의 표적 HSC 상의 표적 리간드는 c-KIT/CD117이고, 상기 표적 리간드에 대한 하나 이상의 CLR(들)의 특이적인 결합은 T 세포를 활성화하고, 활성화된 T 세포는 상기 표적 HSC의 사멸을 유도하고,
    상기 CLR은,
    (a) 엑토도메인(ectodomain)으로서, 상기 엑토도메인은
    i) 인간 CD8α 신호 펩티드를 포함하는 신호 펩티드;
    ii) 서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 scFv; 및
    iii) 인간 CD8α 힌지 도메인을 포함하는 힌지 도메인을 포함하는 것인 엑토도메인;
    (b) 인간 CD8α 막횡단 도메인을 포함하는 막횡단 도메인;
    (c) 인간 4-1BB 보조 자극 도메인을 포함하는 보조 자극 도메인; 및
    (d) 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 것인 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법이 복수의 T 세포를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방법이, 복수의 치료용 조혈 줄기세포(HSC)를 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  4. 적어도 하나의 표적 조혈 줄기세포(HSC: hematopoietic stem cell) 상의 표적 리간드에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 키메라 리간드 수용체(CLR: chimeric ligand receptor)(들)를 발현하는 복수의 T 세포를 포함하는, 치료용 조혈 줄기세포(HSC) 생착 방법에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 방법은
    유효량의 상기 조성물을 대상체에게 투여하는 단계로서, 상기 표적 리간드에 대한 하나 이상의 CLR(들)의 특이적인 결합은 T 세포를 활성화하고, 활성화된 T 세포는 상기 표적 HSC의 사멸을 유도하는 단계;
    상기 복수의 T 세포를 제거하는 단계; 및
    상기 복수의 치료용 조혈 줄기세포(HSC)를 포함하는 조성물의 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 CLR은,
    (a) 엑토도메인(ectodomain)으로서, 상기 엑토도메인은
    i)인간 CD8α 신호 펩티드를 포함하는 신호 펩티드;
    ii)서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 scFv; 및
    iii)인간 CD8α 힌지 도메인을 포함하는 힌지 도메인을 포함하는 것인 엑토도메인;
    (b) 인간 CD8α 막횡단 도메인을 포함하는 막횡단 도메인;
    (c) 인간 4-1BB 보조 자극 도메인을 포함하는 보조 자극 도메인; 및
    (d) 인간 CD3ζ 엔도도메인을 포함하는 엔도도메인을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포가 인간 말초 혈액 유래 T 세포인 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, T 세포가 유도성 카스파제 폴리펩티드 또는 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 포함하는 것인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 유도성 카스파제 폴리펩티드가
    (a) 리간드 결합 영역,
    (b) 링커, 및
    (c) 절두된 카스파제 9 폴리펩티드
    를 포함하는 것인 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 복수의 T 세포를 제거하는 단계는 유효량의 유도제를 상기 대상체에게 투여하여 카스파제 폴리펩티드를 유도함으로써 T 세포의 사멸을 개시하는 것을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 대상체가 면역계 질환 또는 장애를 갖고 있거나, 상기 대상체가 면역계 질환 또는 장애가 발생할 위험이 있거나;
    자가 면역 질환 또는 장애;
    암;
    염증성 장애;
    빈혈;
    응고 장애;
    출혈성 질환; 또는
    혈액 세포, 혈액에서 순환하는 면역 세포, 골수 세포 또는 이들의 전구 세포에서 나타나는 질환 또는 장애에 대한 유전학적 또는 후성 유전학적 마커
    를 갖고 있거나; 또는
    상기 대상체가 면역 손상되어 있는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 암이 림프종, 백혈병, 골수종 또는 악성 면역 증식성 질환인 조성물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 신호 펩티드가 서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 힌지 영역이 서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 막횡단 도메인이 서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 엔도도메인이 서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 적어도 하나의 보조 자극 도메인이 서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 CLR(들)이 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 하나 이상의 CLR(들)이
    서열 번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8α 신호 펩티드;
    서열 번호 73의 아미노산 서열을 포함하는 리간드 인식 영역;
    서열 번호 40의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8α 힌지 영역;
    서열 번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD8α 막횡단 도메인;
    서열 번호 38의 아미노산 서열을 포함하는 인간 4-1BB 보조 자극 도메인; 및
    서열 번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD3ξ 엔도도메인
    을 포함하는 것인 조성물.
  18. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 T 세포가, CLR을 코딩하는 서열을 포함하는 트랜스포존을 사용하여 상기 하나 이상의 CLR을 발현하도록 유전적으로 변형된 것인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 트랜스포존이 CLR을 코딩하는 서열, 유도성 카스파제 폴리펩티드를 코딩하는 서열 및 선별 유전자를 포함하는 piggyBac™(PB) 트랜스포존인 조성물.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 복수의 T 세포의 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%가 상기 하나 이상의 CLR(들)을 발현하는 것인 조성물.
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