KR102749064B1 - 분석물 추출, 농축 및 검출을 통합하기 위한 장치 - Google Patents
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Abstract
샘플에서 표적 분석물을 검출하기 위해 수성 2-상 시스템 및 측방 유동 검정을 사용하는 장치 및 방법이 본원에 개시된다. 이러한 장치 및 방법은 생물학적 샘플, 예를 들면, 혈액 또는 혈청에서 질환 또는 상태를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이러한 장치 및 방법은 식품 샘플에서 알레르겐 또는 물 샘플에서 오염물질, 예를 들면, 환경 독소를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 장치 및 키트 성분은 편리하게 휴대용 용기로 조립할 수 있고, 대부분의 설정에서의 작동에 적합할 수 있다. 장치는 사용이 간편하여 단순히 샘플을 장치에 첨가하기 위해 비숙련된 작업자를 필요로 한다. 편리하게는, 표적 분석물을 검출하기 위해 소요되는 시간은 매우 짧다. 따라서, 본원에 개시된 장치 및 방법은 관리 시점에 대한 신규하고 유용한 수단을 제공한다.
Description
본 출원은 하기의 이익을 주장한다: U.S. 가출원 제 61/949,887호(2014년 3월 7일에 출원) 및 U.S. 가출원 제 61/953,870호(2014년 3월 16일에 출원), 이는 그 전체가 참고로 본원에 인용되어 있다.
배경
한편으로 물질 및 재료를, 다른 한편으로 질환 및 상태를 포함하는 미지의 것의 식별은 다수의 상이한 업계에서 최고로 중요하다. 효소 및 항체는 의료 진단, 식품 검사, 환경 오염(예: 독소, 병원체)을 포함하나, 이에 국한되지 않는 다양한 문맥으로 사용된다.
요약
의료, 소비자 및 다른 용도에 유용한 도구로서 관리 시점(POC) 또는 사용 시점에서 수행된 시험을 포함하여 방법, 장치, 키트 및 시스템이 본원에 기재된다. 특정 용도에서 관리 시점 또는 사용 위치는 의료 시설, 모바일 클리닉, 직장, 공장, 농장 및 가정을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 주제는 비제한적인 예로써, 대기 오염 물질, 독소, 식품 및 의약품의 성분, 및 산업, 군사 및 우주 관련 용도를 포함하는 다양한 다른 용도에 또한 유용하다. 다른 양상 중에서, 신속하고 간단하고 사용하기에 용이한 시험이 본원에 제공된다. 시험은, 경우에 따라, 약간의 임상적 진단 훈련을 갖는 개인에 의해 수행될 수 있다. 비용 및 시간 효율적인 방식으로 시험 결과를 획득하는 방법도 또한 본원에 기재된다. 이러한 시험은 특히 신뢰가능하고, 소량의 생체분자에 대해 민감할 필요가 있다. 또한, 본원에 기재된 시험은, 예를 들면, 온도 및/또는 습도가 크게 변화하는 많은 다른 환경과 호환된다. 따라서, 본원에 기재된 관리 시점 또는 사용 시점을 위한 장치는 최소량의 장비를 필요로 할 수 있고, 광범위한 환경 조건에서 안정하다.
또한, 표적 분석물을 검출하기 위한 측방 유동 검정(LFA) 기술 및 수성 다상 시스템을 포함하는 장치 및 방법도 본원에 개시된다. 특정 구현예에서, 이러한 장치 및 방법은 이전 LFA 검정의 검출 한계에 비해 효소 결합 면역흡수검정(ELISA)와 같은 실험실 기반 검정의 감도에 접근하거나 충족시키고, 특정의 경우에는 이를 초과하는 적어도 약 100 내지 약 1000배의 개선을 제공하기 위해 LFA와 함께 수성 다상 시스템의 농축 능력을 사용한다.
일반적으로, 특정 용도에서, 표적 분석물을 함유하는 목적하는 샘플을 수성 2-상 시스템(ATPS)에 적용한다. 본원에 기재된 바와 같이, 방법 및 장치는 이의 존재가 검출되고/되거나 정량화될 수 있는 LFA 상에서 표적 분석물의 후속적 검출과 함께 ATPS의 단일 상 또는 계면으로부터 표적 분석물을 농축시키고 추출시키기 위해 개발되었다. 대안적으로 또는 추가로, 표적 분석물은 통합된 ATPS-LFA 시스템 상에서 농축되고 검출되고/되거나 정량화될 수 있다. 따라서, 추출은 ATPS를 원활하게 하류 LFA 검출과 통합함으로써 바이패싱될 수 있다. 본원에 기재된 특정 용도에서, 이러한 장치는 단지 목적하는 샘플을 첨가하기 위해 사용자를 필요로 한다. 다양한 구현예에서, 이러한 장치는 혈청, 타액, 소변, 혈액 또는 면봉 샘플과 같은 생물학적 샘플에서 표적 분석물을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 개시된 장치는, 특정 구현예에서, 휴대용 진단 장치를 형성하기 위해 편리하게 조립된다. 본원에 기재된 다양한 장치 및 방법은 최소한의 훈련, 전력 및 장비를 필요로 하는, 강력하고 범용성, 확장성의 저렴하고 민감하고 간단하고 정확하다는 것을 증명한다. 이하 논의는 일반적으로 수성 2-상 시스템(ATPS)에 관해서이지만, 3-상 또는 4-상, 심지어 더 큰 상 시스템이 유사하게 실시될 수 있음이 유의된다.
이러한 개념이 어떻게 기능하는지를 설명하기 위해, 이러한 기술의 예가 본원에 기재된다. 이러한 예는 예시적이고 비제한적인 것으로 의도된다. 본원에 제공된 교시를 사용하여, ATPS 및 측방 유동 검출을 통합하는 다수의 다른 시스템이 용이하게 실시될 수 있다. 본원에 기재된 실시예 및 구현예는 단지 예시 목적을 위한 것이고, 이에 비추어 다양한 변형 및 변경이 당업자에게 제시될 것이고 본원의 취지 및 범위 및 첨부된 특허청구범위의 범위 내에 포함되어야 한다는 것이 이해된다. 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전체가 본원에 참조로 인용된다.
본원에 기재된 방법, 장치, 키트 및 시스템을 포함하는 본원에 기재된 주제의 양상은 샘플 중에서 표적 분석물을 검출 및/또는 정량화하기 위한 장치이고, 상기 장치는 다음을 포함한다: (a) 측방 유동 검정 (LFA); 및 (b) 수성 2-상 시스템(ATPS). 특정 용도에서, ATPS는 제1 상 용액 및 제2 상 용액을 분할하는 혼합 상 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로 혼합 상의 분할은 LFA 내에서 발생한다. 특정 구현예에서, 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로 혼합 상의 분할은 LFA 내에서 발생하지 않는다. 특정 용도에서, 표적 분석물은 혼합 상 용액과 접촉되고, 표적 분석물은 제1 상 용액 또는 제2 상용액이 분리될 때/분리된 후, 제1 상 용액 또는 제2 상 용액으로 분할된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 혼합 상 용액과 접촉되고, 표적 분석물은 제1 상 용액 또는 제2 상용액이 분리될 때/분리된 후, 제1 상 용액과 제2 상 용액의 계면에서 분할된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 분할시 농축된다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액의 성분 및 제2 상 용액의 성분은 모두 다공성 매트릭스에 배치되어 상기 다공성 매트릭스 내에서 상기 2-상 ATPS를 형성하기에 충분한 양으로 존재한다.
특정 구현예에서, 제1 상 용액은 미셀 용액을 포함하고, 제2 상 용액은 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 상 용액을 중합체를 포함하고, 제2 상 용액은 미셀 용액을 포함한다. 특정 용도에서, 제1 상 용액은 미셀 용액을 포함하고, 제2 상 용액은 염을 포함한다. 특정 용도에서, 제1 상 용액은 염을 포함하고, 제2 상 용액은 미셀 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 미셀 용액은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 비이온성 계면활성제는 세토마크로골, 세토스테아릴 알코르 세틸 알코올, 코크아미드, 데실 글루코사이드, IGEPAL, 이소세테쓰, 라우릴 글루코사이드, 모노라우린, 노니데트, 노녹시놀, NP-40, 옥틸 글루코사이드, 올레일 알콜, 폴록사머, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 폴리소르베이트, 폴리글리세롤, 소르비탄, 스테아릴 알코올, 트리톤-X 및 트윈으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 용도에서, 미셀 용액은 트리톤-X 용액이다. 일부 구현예에서, 트리톤-X 용액은 트리톤-X-100 용액 및 트리톤-X-114 용액으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 상 용액은 제1 중합체를 포함하고, 제2 상 용액은 제2 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1/제2 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 중합체를 포함하고, 제2 상 용액은 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 염을 포함하고, 제2 상 용액은 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 제2 상 용액은 인산칼륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 인산칼륨을 포함하고, 제2 상 용액은 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 상 용액은 표 1의 성분 1로부터 선택되고, 제2 상 용액은 본원에 기재된 표 1의 성분 2로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 제2 상 용액은 표 1의 성분 1로부터 선택되고, 제1 상 용액은 본원에 기재된 표 1의 성분 2로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 표적 분석물은 단백질, 항원, 생체분자, 당 잔기, 지질, 핵산, 스테롤 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 특정 용도에서, 표적 분석물은 식물, 동물, 바이러스, 진균, 원생동물 및 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유기체로부터 유래된다. 하나의 구현예에서, 장치는 프로브를 추가로 포함하고, 여기서 프로브는 표적 분석물과 상호작용한다.
본원에 기재된 방법, 장치, 키트 및 시스템의 또 다른 양상은 적어도 1개의 표적 분석물, 또는 적어도 2개의 상이한 표적 분석물, 또는 적어도 3개의 상이한 표적 분석물, 또는 적어도 4개의 상이한 표적 분석물, 또는 적어도 5개의 상이한 표적 분석물, 또는 적어도 7개의 상이한 표적 분석물, 또는 적어도 10개의 상이한 표적 분석물, 또는 적어도 15개의 상이한 표적 분석물, 또는 적어도 20개의 상이한 표적 분석물, 또는 심지어 더 큰 수의 상이한 표적 분석물과 상호작용하는 하나 이상의 프로브를 포함하는 LFA 장치이다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 프로브, 또는 적어도 3개의 상이한 프로브, 또는 적어도 4개의 상이한 프로브, 또는 적어도 5개의 상이한 프로브, 또는 적어도 7개의 상이한 프로브, 또는 적어도 10개의 상이한 프로브, 또는 적어도 15개의 상이한 프로브, 또는 적어도 20개의 상이한 프로브가 본원에 기재된다. 특정 구현예에서, 합성 중합체, 금속, 광물, 유리, 석영, 세라믹, 생물학적 중합체, 플라스틱 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재료를 포함하는 본원에 기재된 프로브가 제공된다. 특정 구현예에서, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 셀룰로즈, 키틴, 나일론, 폴리옥시메틸렌(DELRIN®), 폴리테트라플루오로에틸렌(TEFLON®), 폴리비닐 클로라이드 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중합체를 포함하는 본원에 제공된 프로브가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리프로필렌은 폴리프로필렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 폴리에틸렌은 폴리에틸렌 글리콜이다. 특정 구현예에서, 덱스트란 및 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합으로부터 선택된 생체 중합체를 포함하는 프로브가 제공된다. 특정 구현예에서, 금속(예: 금, 은, 티탄, 스테인레스 강, 알루미늄, 백금 및/또는 이의 합금으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속)을 포함하는 프로브가 제공된다.
본원에 기재된 방법, 장치, 키트 및 시스템의 특정 양상에서, 나노입자(예: 금 나노입자)를 포함하는 프로브가 제공된다. 특정 구현예에서, 프로브는 코팅을 포함한다. 다양한 구현예에서, 코팅은 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 중합체(예: 폴리프로필렌글리콜), 또는 그래프트 공중합체, 예를 들면, 폴리(l-리신)-그래프트-덱스트란(PLL-g-dex, 폴리(l-리신) 골격 상에서 그래프트된 덱스트란 측쇄를 갖는 그래프트 공중합체 등)을 포함할 수 있다. 하나의 예시적이지만 비제한적인 구현예에서, 코팅은 덱스트란을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 코팅은 친수성 단백질을 포함한다. 특정 용도에서, 코팅은 혈청 알부민을 포함한다. 특정 구현예에서, 코팅은 제1 상 용액 또는 제2 상 용액에 대한 친화성을 갖는다. 특정 구현예에서, 프로브는 표적 분석물에 결합하는 결합 잔기를 포함한다. 특정 구현예에서, 결합 잔기는 항체, 레시틴, 단백질, 당단백질, 핵산, 소분자, 중합체 및 지질 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 결합 잔기는 항체 또는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 프로브는 자기 입자를 포함한다. 특정 구현예에서, 방법, 장치, 키트 및 시스템은 자석을 포함한다. 특정 구현예에서, 자석은 표적 분석물의 제1 상 용액 또는 제2 상 용액으로의 분할을 촉진시키고/시키거나 증가시키도록 구성된다. 하나의 구현예에서, 자석은 LFA를 통해 표적 분석물의 유동을 촉진시키고/시키거나 증가시키도록구성된다. 특정 구현예에서, 자석은 장치에 부착가능하고/하거나 장치로부터 탈착가능하다. 본원에 제공된 방법, 장치, 키트 및 시스템의 특정 용도에서, ATPS와 접촉되도록 구성된 집전기가 제공되고, 여기서, 표적 분석물은 집전기와 제1 상 용액 및/또는 제2 상 용액의 계면에서 분할된다. 일부 구현예에서, 집전기는 플라스틱, 메조다공성 재료, 실리카, 중합체(예: 폴리프로필렌, 폴리옥시메틸렌(DELRIN®), 폴리테트라플루오로에틸렌(TEFLON®) 등), 자석, 세공을 갖는 재료, 홈이 있는 재료 및 이의 임의의 조합으로부터 선택된 재료를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법, 장치, 키트 및 시스템은 검출가능한 라벨을 포함하는 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출가능한 표지는 비색 표지, 형광 표지, 효소 표지, 컬러리제닉 표지, 방사성 표지, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, LFA는 다공성 매트릭스를 포함한다. 특정 용도에서, 다공성 매트릭스는 혼합 상 용액, 제1 상 용액, 제2 상 용액 및/또는 표적 분석물이 LFA를 통해 유동하도록 하기에 충분히 다공성이다. 특정 구현예에서, 혼합 상 용액, 제1 상 용액, 제2 상 용액 및/또는 표적 분석물이 LFA, 및 이의 임의의 조합을 통해 수직으로 및/또는 수평으로 유동하도록 하기에 충분히 길고/길거나 깊은 본원에 제공된 다공성 매트릭스가 제공된다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액이 제1 속도로 다공성 매트릭스를 통해 유동하고, 제2 상 용액이 제2 속도로 다공성 매트릭스를 통해 유동하는 방법, 장치, 키트 또는 시스템이 제공되고, 여기서 제1 속도 및 제2 속도는 상이하다. 특정 구현예에서, 다공성 매트릭스는 셀룰로즈, 유리 섬유, 니트로셀룰로즈, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 나일론, 전하 변형된 나일론, 폴리에테르설폰 및 이들의 조합으로부터 선택된 재료를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 분석물 포획 잔기를 포함하는 LFA가 제공되고, 여기서 표적 분석물 포획 잔기는 표적 분석물과 상호작용한다. 특정 구현예에서, 경쟁 검정을 포함하는 LFA가 제공된다. 특정 구현예에서, 표적 분석물을 포함하는 LFA가 제공된다. 특정 구현예에서, 샌드위치 검정을 포함하는 LFA를 사용하는 방법, 장치, 키트 및/또는 시스템이 제공된다. 특정 구현예에서, LFA는 프로브 포획 잔기를 포함하고, 여기서 프로브 포획 잔기는 프로브 또는 이의 성분과 상호작용한다. 특정 구현예에서, 혼합 용액 상 용액은 LFA 스트립 상 및/또는 내에서 탈수되고, 샘플의 첨가시 혼합 상 용액은 재1 상 용액 및 제2 상 용액으로 분할된다.
본원에 기재된 방법, 장치, 키트 및/또는 시스템의 특정 구현예에서, 용액을 함유하기에 충분한 용적으로 갖는 웰을 포함하는 LFA가 제공된다. 특정 용도에서, 용액은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: ATPS의 적어도 일부, 제1 상 용액의 적어도 일부, 제2 상 용액의 적어도 일부, 표적 분석물의 재현탁 용액 및 이의 조합. 추가의 또는 추가적인 구현예에서, 웰을 포함하는 LFA가 제공되고, 상기 웰은 코너, 말단, 중앙, 접합, 오프-센터 및 굴곡부에서 선택되는 LFA의 위치에 배치된다. 일부 구현예에서, 웰은 필터 패드, 완충 패드, 계면활성제 패드, 염 패드, 프로브 패드, 중합체 패드 및 이의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 패드를 포함한다. 특정 구현예에서, 스트립을 포함하는 LFA가 제공된다. 추가의 또는 추가적인 구현예에서, 단, 스트립은 다음에 도시된 구조로부터 선택된 구조에 따라서구성된다: 도 16, 20 및 62-70. 추가의 또는 추가적인 구현예에서, 스트립이 다중 경로 루트를 포함하는 LFA가 제공된다. 특정 용도에서, LFA는 추가로 건조 수신지를 포함한다. 일부 구현예에서, 장치는 작동 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 장치에 샘플(예: 생물학적 샘플)을 투여하기 위한 포트를 포함하는 장치가 제공된다. 특정 용도에서, ATPS에 접속되어 있는 포트가 제공된다. 일부 구현예에서, ATPS 및 LFA가 통합되고, 포트가 LFA에 접속되어 있는 경우, LFA가 제공된다. 특정 구현예에서, 포트는 튜브, 깔때기, 밸브, 주사기, 빨대, 채널, 플런저, 피스톤, 중력 공급 장치, 펌프 및 이들의 조합으로부터 선택된 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, 장치는 전력 공급원을 필요로 하지 않는다. 특정 구현예에서, ATPS 및 LFA는 장치의 사용 전에 통합된다. 추가의 또는 추가적인 구현예에서, ATPS 및 LFA는 장치의 사용 전에 분리된다. 일부 구현예에서, 장치는 LFA를 ATPS로 삽입하도록 구성된다.
특정 양상에서, 본원에 기재된 방법, 장치, 시스템 및/또는 키트는 다음을 포함하는 장치를 포함하거나 사용한다: (a) ATPS를 함유하기 위한 챔버를 포함하는 제1 성분; 및 (b) LFA를 포함하는 제2 성분. 이 양상의 하나의 구현예에서, 샘플 및/또는 표적 분석물, 또는 이들 모두를 ATPS로 전달하는 작동기를 포함하는 장치가 제공된다. 특정 구현예에서, 용액을 LFA에 전달하는 작동기를 추가로 포함하는 장치가 제공된다. 특정 용도에서, 혼합 상 용액, 제1 상 용액 및 제2 상 용액, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용액을 포함하는 LFA가 제공된다. 특정 구현예에서, ATPS 및 LFA는 단일 하우징에 함유된다. 특정 용도에서, 휴대형 LFA 장치가 제공된다.
특정 양상에서, 샘플에서 표적 분석물을 검출하고/하거나 정량화하기 위한 방법, 장치, 시스템 및/또는 키트가 제공되고, 여기서 검출 및/또는 정량화는 다음을 포함한다: (a) 본원에 기재된 바에 따르는 장치에 샘플을 적용하는 단계; 및 (b) LFA 상의 표적 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계. 특정 구현예에서, 상기 방법은 샘플을 ATPS에 적용하는 단계를 포함한다. 특정 용도에서, 상기 방법은 샘플을 LFA에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 LFA 및 ATPS는 통합된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 ATPS에서 표적 분석물을 농축시키는 단계를 포함한다. 하나의 구현예에서, 상기 방법은 LFA에서 표적 분석물을 농축시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 생물학적 유기체(예: 식물, 동물, 조류, 진균 등)으로부터 조직/유체, 식품 샘플, 화학 샘플, 약물 샘플, 및 환경 샘플(예: 물 샘플, 토양 샘플 등), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 샘플을 사용한다. 일부 구현예에서, 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플, 기관지 폐포 세척액, 비강 샘플, 분변 샘플, 상처나 수술 부위로부터의 샘플, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 샘플이 제공된다. 특정 구현예에서, 표적 분석물은 생물학적 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 지질, 소분자, 당, 항체, 항원, 효소 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 샘플은 척추동물(예: 포유동물, 조류 등), 세균, 바이러스, 원생동물, 조류, 진균, 원생동물, 약물, 병원균, 독소, 환경 오염 물질 및 이들의 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공급원으로부터 유래된다.
특정 양상에서, 샘플에서 표적 분석물을 검출하기 위한 종이 유체 장치를 사용하는 방법, 장치, 키트 및/또는 시스템이 제공되고, 여기서 종이 유체 장치는 수성 2-상 시스템(ATPS)과 함께 사용된다. 특정 구현예에서, 장치는 ATPS 또는 이의 성분이 배치된 다공성 매트릭스를 포함하고, 여기서 다공성 매트릭스는 ATPS 또는 이의 성분이 유체 상으로 존재할 때 ATPS 또는 이의 성분이 다공성 매트릭스를 통해 유동하도록 구성되고, 유동하기에 충분한 다공성을 갖는다.
특정 구현예에서, 종이 유체 장치는 ATPS 또는 이의 성분을 포함한다. 특정 구현예에서, ATPS 또는 이의 성분은 제1 상 용액, 제2 상 용액 및 혼합 상 용액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 여기서 혼합 상 용액은 제1 상 용액 및 제2 상 용액 및/또는 이들의 조합의 혼합물을 포함한다. 특정 구현예에서, ATPS 및/또는 이의 성분은 다공성 매트릭스의 적어도 제1 부분 위 및/또는 내에서 탈수된다. 특정 용도에서, 다공성 매트릭스의 제1 부분이 다공성 매트릭스의 제2 부분과 상이한 너비를 갖는 종이 유체 장치, 방법, 시스템 및/또는 키트가 제공된다. 추가의 또는 추가적인 구현예에서, ATPS를 탈수시키기 위해 샘플을 사용하여 ATPS 또는 이의 성분을 유체 상으로 제공하는 종이 유체 장치, 방법, 시스템 및/또는 키트가 제공된다. 일부 구현예에서, 종이 유체 장치는 혼합 상 용액, 제1 상 용액, 제2 상 용액, 샘플 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 내용물을 함유하기 위한 웰을 포함한다. 특정 용도에서, 종이 유체 장치는 웰의 내용물을 다공성 매트릭스 내 및/또는 위에 방출시키기 위한 작동기를 포함한다. 특정 구현예에서, 웰은 필터 패드, 완충 패드, 계면활성제 패드, 염 패드, 프로브 패드, 중합체 패드 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 패드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액 및 제2 상 용액은 상이한 속도로 다공성 매트릭스를 통해 유동한다. 하나의 구현예에서, 제1 상 용액 및 제2 상 용액은 상이한 방향으로 다공성 매트릭스를 통해 유동한다. 특정 구현예에서, 제1 상 용액은 미셀 용액을 포함하고, 제2 상 용액은 중합체를 포함한다. 더욱 특정의 구현예에서, 제1 상 용액은 미셀 용액을 포함하고, 제2 상 용액은 염을 포함한다. 특정 용도에서, 트리톤-X (또는 다른 계면활성제) 미셀 용액을 포함하는 종이 유체 장치가 제공된다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 중합체를 포함하고, 제2 상 용액은 중합체를 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 상 용앤은 중합체를 포함하고, 제2 상 용액은 염을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 상 용액이 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고 제2 상 용액이 인산칼륨을 포함하는 종이 유체 조성물이 제공된다.
하나의 양상에서, 제1 상 용액이 표 1의 성분 1로부터 선택되고, 제2 상 용액이 표 1의 성분 2로부터 선택되는 종이 유체 장치를 포함하는 방법, 장치, 시스템 및/또는 키트가 제공된다. 특정 용도에서, 다음에 도시된 구조에 따라 구성되어 있는 장치, 방법, 시스템 및/또는 키트가 제공된다: 도 16, 20 및 62-70. 특정 용도에서, 제1 경로 및 제2 경로를 포함하는 다공성 매트릭스가 제공된다.
또 다른 양상에서, 종이 유체 장치를 포함하거나 사용하는 방법, 장치, 시스템 및/또는 키트가 제공되고, 여기서 제1 상 용액은 우선적으로 제1 경로를 통해 유동하고, 제2 상 용액은 우선적으로 제2 경로를 통해 유동한다. 일부 구현예에서, 조성물/장치가 프로브-분석물 복합체를 생성하기 위해 표적 분석물에 결합하는프로브를 포함하는 종이 유체 장치가 제공된다. 특정 구현예에서, 사용시, 표적 분석물이 프로브-분석물 복합체 중의 프로브에 결합되는 종이 유체 조성물이 제공된다. 일부 구현예에서, 자기 입자를 포함하는 프로브가 제공된다. 특정 구현예에서, 장치는 다공성 매트릭스의 부분으로 자기 입자를 유인하도록 배향된 자기장을 포함하고/하거나 방법은 이러한 자기장을 사용하고, 여기서 자기장 입자 상의 자기장의 힘은 다공성 매트릭스의 부분을 향해 프로브-분석물 복합체의 유동을 향상시킨다. 특정 구현예에서, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리옥시메틸렌(DELRIN®), 폴리테트라플루오로에틸렌(TEFLON®), 덱스트란 및 폴리비닐 클로라이드, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중합체를 포함하는 프로브가 제공된다. 일부 구현예에서, 폴리에틸렌은 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 폴리프로필렌은 폴리프로필렌 글리콜이다. 하나의 구현예에서, 콜라겐, 셀룰로즈 및 키틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물학적 중합체를 포함하는 프로브가 제공된다. 특정 용도에서, 프로브가 금, 은, 티탄, 스테인레스 강, 알루미늄, 백금, 이의 합금 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속을 포함하는 종이 유체 장치가 제공된다. 하나의 구현예에서, 나노입자(예: 금 나노입자)를 포함하는 프로브가 제공된다. 특정 용도에서, 프로브는 코팅을 포함한다. 특정 구현예에서, 코팅은 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 하나의 구현예에서, 코팅은 덱스트란을 포함한다. 하나의 구현예에서, 코팅은 폴리프로필렌을 포함한다. 하나의 구현예에서, 코팅은 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 특정 구현예에서, 코팅은 친수성 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 코팅은 혈청 알부민을 포함한다. 특정 용도에서, 프로브가 제1 상 용액 또는 제2 상 용액에 대해 친화성을 갖는 코팅을 갖는 종이유체 조성물/장치가 제공된다.
본원에 기재된 방법, 장치, 시스템 및/또는 키트의 특정 양상에서, 프로브를 포함하는 종이 유체 조성물/장치가 제공되고, 여기서 프로브는 표적 분석물에 결합하는 결합 잔기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항체, 렉틴, 단백질, 당단백질, 핵산, 소분자, 지질 및/또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 결합 잔기를 포함하는 종이 유체 장치가 제공된다. 특정 구현예에서, 항체 또는 항체 단편을 포함하는 결합 잔기를 포함하는 프로브가 제공된다. 특정 구현예에서, 검출가능한 표지를 포함하는 프로브를 포함하는 종이 유체 장치가 제공된다. 하나의 구현예에서, 검출가능한 표지는 비색 표지, 형광 표지, 효소 표지, color genic 표지, 방사성 표지 및 이들의 조립으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 특정 용도에서, 건조 수신지를 추가로 포함하는 종이 유체 조성물이 제공되고, 여기서 제1 상 용액 또는 제2 상 용액은 우선적으로 다공성 매트릭스를 통해 건조 수신지를 향해 유동한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 방법, 장치, 시스템 및/또는 키트는 사용시 작동 완충제를 포함하는 종이 유체 장치/조성물을 포함하고, 여기서 제1 상 용액 및/또는 제2 상 용액은 작동 완충제와 접촉시 다공성 매트릭스를 통해 보다 신속하게 유동한다. 본원에 기재된 주제의 특정 용도에서, 셀룰로즈, 유리 섬유, 니트로셀룰로즈, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 나일론, 전하 변형된 나일론, 폴리에테르설폰 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된 재료를 포함하는 다공성 매트릭스를 포함하는 종이 유체 장치가 제공된다. 하나의 구현예에서, 표적 분석물 포획 잔기를 포함하는 다공성 매트릭스를 포함하는 종이 유체 장치가 제공되고, 여기서 표적 분석물 포획 잔기는 표적 분석물 또는 이의 성분과 상호작용한다. 하나의 구현예에서, 종이 유체 장치는 표적 분석물을 추가로 포함한다. 하나의 구현에에서, 다공성 매트릭스는 프로브 포획 잔기를 포함하고, 여기서 프로브 포획 잔기는프로브 또는 이의 성분과 상호작용한다. 특정 구현예에서, 경쟁 검정을 포함하거나 촉진시키는 LFA가 제공된다. 특정 구현예에서, LFA는 샌드위치 검정을 포함한다. 특정 구현예에서, 종이 유체 조성물이 제공되고, 여기서 다공성 매트릭스는 표적 분석물이 다공성매트릭스를 통해 유동할 때 표적 분석물을 농축시키도록 구성된다. 특정 용도에서, 종이 유체 장치는 대조군 분석물을 포함하고, 여기서 다공성 매트릭스 상에서 대조군 분석물과 표적 분석물의 비교는 표적 분석물의 정량화를 제공한다.
특정 양상에서, 샘플 중에서 표적 분석물을 검출하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 다음을 포함한다: (a) 본원에 기재되고/되거나 특허청구된 장치에 샘플을 적용하는 단계; 및 (b) 표적 분석물의 존재또는 부재를 검출하는 단계.
도면의 간단한 설명
상기 요약 뿐만 아니라 다음 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독될 때 더욱 잘 이해될 수 있다. 도면은 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 의도된다. 본 개시는 본원에 제시된 정확한 배열, 실시예 및 수단에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
도 1 (상부) 전형적인 측방-유동 면역검정 시험 스트립의 개략도. LFA에 의해 사용된 두 개의 예시적 메커니즘이 제시된다: 샌드위치 검정(하부 좌측) 및 경쟁 검정(하부 우측).
도 2는 ATPS와 포획 프로브를 사용하는 분석물 농도를 위한 개략적 대표도이다. 프로브는 표적 분석물을 포획하고, 극도로 상 중의 하나로 분할한다. 이어서, 농축된 프로브를 함유하는 상을 LFA를 통한 후속 분석을 위해 수집할 수 있다
도 3은 ATPS와 자기 포획 프로브를 사용하는 분석물 농도를 위한 개략적 대표도를 도시한다. 프로브는 표적 분석물을 포획하고, 상 중의 하나로 분할한다. 자기 프로브를 보다 적은 용적으로 추가로 농축시키는 자석을 적용한다.
도 4는 ATPS로부터 농축된 분석물을 LFA 시험 스트립으로 이동시키기 위해 피스톤 및 플런저를 사용하는 휴대용 장치의 하나의 예시적이지만 비제한적인 설계를 도시한다. 이 장치는 농축 챔버 및 검출 챔버로 구성된다. 이 실시예에서, 분석물을 ATPS의 하부 벌크 상에서 농축시킨다. 샘플을 수집하기 위해, (1) 플런저를 압축시킨다. 샘플을 ATPS 용액과 혼합한다. 후속적으로 (2), 용액을 인출하기 위해, 장치의 선단을 샘플에 삽입한 후, (3) 플런저를 방출시키고, (4) PEN 장치를 캡으로 밀봉시킨다. (5) 분석물을 하부 벌크 상에서 농축시킨 후, 검출 단계는 (6) 플런저를 “TEST” 위치에서 회전시키고(이는 피스톤을 저하시키고), (7) 농축된 분석물을 체크 밸브를 통해 검출 챔버로 유도함으로써 개시한다. (8) 피스톤의 이동을 보장하기 위해 홈에서 포획 잠금을 조절하고, 조절된 양의 용적만이 검출 챔버로 유도된다.
도 5는 LFA 시험 스트립을 농축된 분석물을 함유하는 상부 상에 기계적으로 삽입하는 휴대용 장치의 하나의 예시적이고 비제한적인 설계를 도시한다. ATPS 용액과 예비혼합된 샘플을 유인하기 위해, 장치의 측면 위의 (1) 버튼을 누른다. 상분리를 완료하고 분석물을 상부 벌크 상에서 농축시킨 후, 검출 단계는 스트립의 샘플 패드가농축된 분석물과 접촉되도록 LFA 시험 스트립을 저하시키는 (2) 검출 버튼을 누름으로써 개시된다. 최종적으로, (3) 결과는 결과 윈도우를 통해 해석될 수 있다.
도 6a-d 는 밀봉 웰(A)을 시행하기 위한 휴대용 장치의 예시적이지만 비제한적인설계를 도시한다. ATPS 용액은 웰에서 혼합된다. 상 분리가 완료된 후, 웰의 유동은 웰의 하부에서 밀봉부를 천공함으로써 포획될 수 있고, 농축된분석물을 함유하는 하부 상은 검출을 향해 유동한다. 이 접근법은 분석물을 상부 또는 하부 상에서 농축시키는 장치에 도입할 수 있다. 분석물이 하부 상에서 농축되면, 웰은 검출을 향한 하부 상의 유동을 포획하는 장치 챔버에서 함몰된다. 대안적으로, 웰은 아래로부터 적재될 수 있고, 웰에 첨가된 버튼은 장치 상에 도입된다. 이 버튼이 눌렸을 때, 이는 시험 스트립이 웰과 접촉되도록 할 수 있다. 도 6b 및 도 6c는 다음의 결과를 도시한다: 1:1 용적 PEG: 염 ATPS 및 9:1 용적 PEG: 시험 스트립 상 염 ATPS. 도 6d는 웰을 천공시키고 LFA를 통해 ATPS 용액(들)의 유동을 포획하기 위한 예시적인 메카니즘을 예시한다: 웰(하부 패널)과 접촉된 버튼을 함몰시키거나 웰 자체(상부 패널)을 함몰시킨다.
도 7은 휴대용 장치의 하나의 예시적이지만 비제한적인 설계를 도시한다. 이 장치는 다음에 제시된 장치와 유사하다: 도 4, 그러나 자기 프로브를 사용한다. 하부 상의 형성 동안, 펜의 캡 부근의 자석은 추가로 자기 프로브를 보다 작은 용적으로 농축시킨다. 펜의 버튼이 함몰되면, 자기 입자는 검출을 개시하는 체크 밸브를 통해 플러슁된다.
도 8은 계면에서 농축 현상의 개략적 대표도를 도시한다. 프로브 및 ATPS의 특정 특성에 기인하여, 프로브는 계면예서 분할되고 매우 농축된다. 이어서, 계면은 LFA를 통해 후속 분석을 위해 수집할 수 있다.
도 9는 고체-액체 계면 농도의 관찰을 도시한다. 프로브는 PEG-염 ATPS을 함유하는 튜브의 폴리프로필렌 벽에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
도 10a-b: (a) PEG-염 ATPS 중 폴리프로필렌 스틱을 사용하는 분석물-프로브 복합체의 실험적 수집을 도시한다. (b) 고체-액체 계면 농도의 개략적 대표도를 도시한다. 프로브는 균질한 용액 중의 표적 분석물에 결합한다. 튜브의 벽이 유리이기 때문에, 프로브는 우선적으로 TPS에 삽입된 폴리프로필렌 수집기에 부착된다. 농축된 프로브를 함유하는 수집기는 제거될 수 있고, 프로브는 후속적 LFA를 통해 검출을 위해 재현탁될 수 있다. 이러한 입자는 2-상 시스템이 존재할 경우에만 고체 프로필렌에 부착된다는 것을 주의한다.
도 11은 고체-액체 계면 농도를 사용하는 휴대용 장치의 개략적 대표도를 도시한다. ATPS 샘플은 농도 웰 및 프로브를 수집하기 위해 삽입된 수집 스틱에 첨가된다. 프로브가 수집 스틱에 부착된 후, 이는 프로브를 재현탁시키고 검출을 위해 LFA를 향한 유동을 포획하는 검출 웰로 이동한다.
도 12a-c는 (a) 종이가 그것이 유동할 때 ATPS 상 분리가 일어나도록 한다는 것을도시한다. 중합체-염 ATPS가 이 실시예에 사용된다. 소수성 및 보자 점성의 상의 벌크한 성분은 뒤에 지연되는 반면, 농축된 표적 분석물을 함유하는친수성 및 덜 점성의 상은 종이를 통해 신속하게 유동한다. (b) 1:1 중합체-염 ATPS 상은 종이에서 분리되고, 5분 이내에 종이를 통해 유동한다. (c) 9:1 PEG-염 ATPS는 또한 5분 이내에 종이를 통해 유동하지만, 중합체 결핍 상 중의 포획 프로브는 보다 적은 용적으로 인해 쉽게 볼 수 없다.
도 13a-c 는 (A) 종이 웰이 보다 효율적인 ATPS 상 분리를 가능하게 한다는 것을 도시한다. 소수성 및 보다 점성인 상의 벌크 성분은 종이에 의해 보유되고, 웰의 상부 층에 잔류하는 반면, 표적 분석물을 함유하는 친수성 및 덜 점성인 상은 신속하게 하부 층으로 유동한다. 분석물의 수집을 향상시키기 위해, 상의 정합성을 유지시키면서 작동 완충제의 첨가를 멤브레인 상에서 종이 웰로부터 플러슁하기 위해 적용할 수 있다. 도 13b는 1:1 PEG-염 ATPS 상이 종이의 층에서 분리되고, 검출용 멤브레인을 통해 유동한다는 것을 도시한다. 도 13c는 9:1 PEG-염 ATPS가 고농도에서 거대한 PEG 분자를 함유하는 PEG 풍부 상으로 인해 더욱 느리게 멤브레인을 통해 유동한다는 것을 도시한다. 이어서, 농축된 염 상은 리딩 엣지가 된다.
도 14a-d는 (A) 3D 종이 웰의 변동을 도시하고, 여기서 본 발명자들은 농도 웰 및혼합 웰을 모두 사용한다. 검정을 시작하기 위해, ATPS 용액과 혼합된 샘플을 농도 웰에 적용한다. (B) 이어서, 완충제를 상 분리를 촉진시키기 위해 농도 웰에 첨가한다. (C) 농축된 분석물이 혼합 웰에 도달하면, (D) 또 다른 완충제를 유동을 촉진시키고 농축된 분석물이 LFA 시험 스트립 하류에 도달하도록 하기 위해 혼합 웰에 첨가한다.
도 15a-b는 성분이 샘플 용액으로 재수화된 후 상 분리를 유도할 수 있는 종이스트립 내에서 ATPS를 위해 필요한 성분을 탈수시키는 방법을 증명한다(a). 이 실험에서, 샘플 용액은 중합체 풍부 상을 선호하는 블루 염료, 및 중합체 결핍 상을 선호하는LFA를 위한 레드 비색 나노입자 지시제로 구성된다. FG는 유리 섬유 종이를 의미한다. (b) 탈수된 ATPS 성분을 포함하지 않는 대조군 상태.
도 16a-e는 탈수된 PEG-염 ATPS 성분을 사용하는 상이한 종이 장치 구조를 예시한다. (a) 별도의 PEG 및 염 세그먼트를 갖는 간단한 구조. (b) 조합된 PEG 및 염 세그먼트를 갖는 간단한 구조. (c) 농축 효율을 향상시키기 위해 복수의 반복 세그먼트를 도입하는 예. (d) PEG 세그먼트가 장치의 직접 유동 경로에 존재하지 않는 실시예 c의 반복. (e) 유동 경로의 말단에서 상 분리 부위를 배치하는 구조의 예. 이 개략도에 도시되지 않은 LFA 시험 스트립은 장치의 하류 영역에 배치된다.
도 17a-b는 (A) 크기 배제에 기초하여 목적하는 분석물을 제외한 PEG 풍부 상을 형성하는 탈수된 PEG 세그먼트에서 용액을 인출함으로써 리등 유체를 추가로 농축시키기 위해 사용될 수 있는 PEG-염 용지-유일 진단 내에서 탈수된 PEG 세그먼트를 오프셋팅하는 방법을 예시하는 개략도; 및 (B) 농축 효과를 증명하는 실험을 도시한다.
도 18a-b 는 (A) 농축된 분석물을 함유하는 지체 상을 LFA 시험 스트립을 향해 구동시키기 위해 작동 완충제를 도입하는 개략적 대표도; 및 (B) 농축된 분석물을 함유하는 리딩 상을 LFA 시험 스트립을 향해 구동시키기 위해 작동 완충제를 도입하기 위한 예시적인 대안 설계를 도시한다.
도 19는 상이한 종이 재료를 갖는 3D 종이 웰을 사용하는 유동 재라우팅 설계의 개략적 대표도를 도시한다. 중합체 풍부 상은 더욱 소수성이고, 우선적으로 더욱 소수성 종이로 유동하는 반면, 중합체 결핍상은 친수성 종이를 통해 더욱 우선적으로 유동한다. LFA 시험 스트립은 검출을 위한 이 장치의 하류 영역에 부착될 수 있다.
도 20은 농축 용량을 향상시키기 위해 자기 프로브의 사용을 도입하는 종이 장치레이아웃의 상이한 예를 예시한다. 여기서, 자석의 위치는 표적 분석물에 결합되어 있는 입자 상에서 작용하는 힘을 제공한다. 이는 LFA 검출 영역을 갖는 종이의 측면에서 입자를 효율적으로 농축시킨다.
도 21a-c는 GMP가 하부 PEG 불량 상에서 극도로 분할되는 것으로 밝혀졌음을 도시한다(a). 이는 ATPS 용액(c)으로부터 신속하게 대부분의 GMP를 회수하기 위해 작은 자석(b)의 사용을 가능하게 한다.
도 22 는 사전 ATPS 농축단계를 사용하지 않거나(상부) 사용하여(하부) Tf를 검출하기 위해 사용되는 LFA 스트립의 이미지를 도시한다.
도 23a-d는 (a) PEG 단독, (b) 염 단독 또는 (c) 1:1 ATPS를 함유하는 용액 중의 PGNP 및 PP 빨대의 이미지를 도시한다. PGNP는 단지 ATPS의 존재하에 PP 빨대에서 매우 분할되었다. (d) PP 빨대는 (c)로부터 추출되었고, 이 도면은 빨대가 후속 검출 검정을 위한 농축된 PGNP를 용이하게 수집하기 위해 인출할 수 있음을 도시한다.
도 24는 사전 ATPS 농축 단계를 사용하지 않고(상부) 및 사용하여(하부) 트랜스페린(Tf)을 검출하기 위해 사용된 LFA 스트립의 이미지를 도시한다.
도 25는 제안된 휴대용 장치의 개략적 대표도를 도시한다.
도 26은 ATPS를 사용하여 LFA의 검출 한계를 향상시키기 위한 접근법에서 DGNP 및 이들의 역할의 개략도를 도시한다.
도 27은 LFA의 경쟁 시험에 대한 양성 및 음성 결과의 개략적 대표도를 도시한다.
도 28a-c는 가변적인 % w/w 인산칼륨 용액에서 (a) 시트레이트 캡핑되거나 벗겨진 금 나노입자 (b) PEG화된 금 나노입자, 및 (c) 덱스트란 코팅된 금 나노입자의 정규화된 가시광선 범위 흡광도 스펙트럼(400-700nm)을 도시한다.
도 29a-c는 (a) 0분, (b) 30분 및 (c) 12시간에 본 PEG-염 ATPS 중의 DGNP의 분할 거동을 도시한다.
도 30은 PEG/염 ATPS에서 12시간 이내의 다양한 시점에 실험적으로 측정된 Tf 농도 인자를 도시한다. 오차 막대는 3회 측정으로부터 표준 편차를 나타낸다.
도 31a-b는 PEG/염 ATPS를 사용하는 사전 농축 단계를 사용하지 않고(a) 및 사용하여(b) Tf를 검출하기 위해 사용된 LFA 스트립의 이미지를 도시한다.
도 32는 MATLAB를 사용하는 LFA 정량화의 결과를 도시한다. 오차 막대는 3개의 LFA 시험 스트립을 사용하는 측정으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 33a-d는 각각 상부 PEG 풍부 및 하부 PEG 결핍 상으로 매우 분할되는 브릴리언트 블루 FCF 염료 및 덱스트란 코팅된 금 나노입자를 도시한다. (a) 25 ℃에서, 혼합된 1:1 용적비 ATPS 상은 (b) 2개의 동일 용적 상을 형성하기 위해 분리된다. (c) 25 ℃에서, 혼합된 9:1 용적비 ATPS 상은 (d) 거대한 PEG 풍부 상 및 작은 PEG 결핍 상으로 분리된다. 동일량의 브릴리언트 블루 FCF 및 덱스트란 코팅된 금 나노입자를 두 ATPS에 첨가했다. 9:1 용적비의 ATPS의 짙은 자주색 색상은 하부 PEG 결핍 상 중의금 나노입자 농도가 상당히 증가했음을 나타낸다.
도 34a-b는 종이 멤브레인이 그것이 유동할 때 ATPS 상 분리가 일어나도록 한다는 것을 도시한다. PEG 풍부 도메인은 종이 멤브레인의 선단 부근에 유지된 반면, PEG 결핍 도메인은 리딩 전면으로 신속하게 이동했다. (a) 1:1 용적비 ATPS 상이 분리되고, 5분 이내에 종이 멤브레인을 통해 유동했다. (b) 9:1 용적비 ATPS도 또한 분리되고, 5분 이내에 멤브레인을 통해 유동했지만, 상 분리는 리딩 전면이 300초에 덜 구별되기 때문에 덜 효율적이었다.
도 35a-b는 3-D 종이 웰이 추가로 향상된 ATPS 상 분리를 가능하게 함을 도시한다. 염료와 혼합 ATPS를 첨가 후, PEG 풍부 도메인은 웰의 상부 층에 유지된 반면, 농축된 금 나노입자를 함유하는 PEG 결핍 도메인은 하부 층으로 신속하게 유동했다. (a) 1:1 용적비 ATPS는 3-D 종이 웰에서 향상된 상 분리를 나타냈고, PEG 결핍 상은 5분 이내에 멤브레인을 통해 유동했다. (b) 9:1 용적비 ATPS는 또한 개선된 상 분리를 가졌고, PEG 결핍 상은 명백하게 가시적이었다. 다음과 대조적으로: 도 34, 리딩 전면은 충분히 정의되고, 덱스트란 코팅된 금 나노입자의 농도를 의미하는 짙은 자주색색상을 갖는다.
도 36a-c는 3-D 종이 웰이 Tf 검출을 위해 PEG/염 ATPS 및 LFA와 조합되었음을 도시한다. (a) 종이 웰 장치는 니트로셀룰로즈 종이 상에서 Tf 경쟁 검정과 조합했다. Tf를 함유하지 않는 샘플은 가시 시험 및 대조 라인과 함께 (b) 1:1 또는 (c) 9:1 용적비 ATPS 용액을 사용할 때 정확하게 진단되었다.
도 37a-b는 3-D 종이 웰을 갖는 1:1 용적비 PEG/염 ATPS가 Tf의 검출 한계에서 2배 개선을 가능하게 하는 반면, 9:1 용적비 ATPS는 10배 개선을 가능하게 한다. (a) 통상적인 LFA는 1ng/μL에서 Tf를 검출하였지만, 0.5ng/μL에서 Tf를 검출할 수 없어 잘못된 음성 결과를 유도하였다. 3-D 종이 웰을 갖는 1:1 용적비 ATPS는 0.5ng/μL에서 Tf를 성공적으로 검출했다. (b) 통상적인 LFA는 1ng/μL에서 Tf를 검출하였지만, 0.1ng/μL에서 Tf를 검출할 수 없어 잘못된 음성 결과를 유도하였다. 3-D 종이 웰을 갖는 9:1 용적비 ATPS는 0.1ng/μL에서 Tf를 성공적으로 검출했다.
도 38은 예시적인 ATPS-LFA 시스템을 도시한다.
도 39는 LFA 샌드위치 검정의 개략도를 도시한다. 양성 결과(상부)는 시럼 라인 및 대조 라인에서 두 개의 밴드로 표시되는 반면, 음성 결과(하부)는대조 라인에서 단일 밴드로 표시된다.
도 40a-c는 37°C에서 (a) 10분, (b) 30분 및 (c) 24시간 동안 배양 후 수성 이상 PEG-염시스템을 도시한다. 백색 종이는 각 상의 혼탁도를 가시화하는 것을 돕기 위해 문자 “X”로 채워졌다. 화살표는 거시적 계면의 위치를 나타낸다.
도 41은 PEG/염 ATPS에서 다양한 시점에 M13의 실험적으로 결정된 농도 인자를 도시한다. 오차 막대는 3회 측정으로부터 표준 편차를 나타낸다.
도 42는 PEG/염 ATPS에서 다양한 용적비로 M13의 실험적으로 결정된 농도 인자를 도시한다. 기호는 실험 데이터에 상응하고, 오차 막대는 3회 측정으로부터 표준 편차를 나타낸다. 실선은 방정식(6)으로부터의 예측에 상응한다.
도 43a-f PEG/염 ATPS를 사용하는 사전 농축 단계 없이 M13을 검출하기 위한 LFA. 패널 (A)는 M13이 첨가되지 않은 음성 대조군을 도시한다. 잔류 용액은 (b) 1x1010, (c) 3.2x109, (d) 1x109, (e) 3.2x108, 및 (f) 1x108 pfu/mL의 농도에서 M13을 함유했다.
도 44a-f: 사전 농축 단계를 사용하여 M13을 검출하기 위한 LFA. 패널 (A)는 M13이 첨가되지 않은 음성 대조군을 도시한다. 잔류 용액은 초기에 (b) 1x109, (c) 3.2x108, (d) 1x108, (e) 3.2x107, 및 (f) 1x107 pfu/mL의 농도에서 M13을 함유했다.
도 45 사전 농축 단계를 사용하고(■) 사용하지 않는(▲) M13에 대한 LFA 신호 강도. 오차 막대는 적어도 3회 측정으로부터 표준 편차를 나타낸다.
도 46은 PBS 중의 ATPS-LFA 시스템의 개략도를 도시한다.
도 47은 경쟁 기반 LFA 및 양성 및 음성 결과 해석의 개략적 대표도를 도시한다.
도 48a-d는 ATPS (a) GNP의 개략도 및 각 성분의 기능에서 분할 거동에 영향을 미치는 GNP의 표면 변형을 도시한다. 본 PEG-염 ATPS에서 GNP의 분할 거동이 맞춤될 수 있음을 입증하기 위해, 다양한 양의 PEG를 이들의 분할 거동을 조작하기 위해 GNP에 접합시켰다: (b) 접합 동안 5000:1 PEG:GNP의 몰 비를 사용하여, 생성되는 GNP는 PEG 풍부 상 부 상에서 우선적으로 분할된다. (c) 접합 동안 1000:1 PEG:GNP의 몰 비를 사용하여, GNP는 PEG 결핍 하부 상에서 분할되지만 고염 농도를 갖기 때문에 응집된다. 이러한 응집된 GNP는 후속 검출 검정에 사용될 수 없었다. (d) 접합 동안 3000:1 PEG:GNP의 몰 비를 사용하여, 생성되는 GNP는 계면예서 극도로 분할된다. (b), (c) 및 (d)를 위해, 액체-공기 계면의 최상부에서 관찰된 적색은 반사에 기인하고 나노프로브의 존재에 기인하지 않는다.
도 49는 PEG/염 ATPS 계면 추출 단계를 사용하는 사전 농축 단계를 사용하지 않고(상부 패널) 및 사용하여(하부 패널) PBS에서 Tf를 검출하기 위한 LFA의 결과를 도시한다.
도 50은 PEG/염 ATPS 계면 추출 단계를 사용하는 사전 농축 단계를 사용하지 않고(상부 패널) 및 사용하여(하부 패널) FBS에서 Tf를 검출하기 위한 LFA의 결과를 도시한다.
도 51은 PEG/염 ATPS 계면 추출 단계를 사용하는 사전 농축 단계를 사용하지 않고(상부 패널) 및 사용하여(하부 패널) 합성 뇨에서 Tf를 검출하기 위한 LFA의 결과를 도시한다.
도 52는 미셀 ATPS를 사용하여 표적 분석물의 동시 농도 및 검출을 도시한다.
도 53a-b는 PBS에서 1:9 용적비 트리톤 X-114 시스템의 상 분리를 달성하기 위해 필요한 시간의 비교를 도시한다. 브릴리언트 블루 FCF 염료 및 체리색 BSA-GN는 각각 하부, 미셀 풍부 상 및 상부, 미셀 결핍 상을 위한 비색 지시제였다. (a) 25 ℃에서, 트리톤 X-114 ATPS는 시험관에서 8시간에 거시적인 상 분리 평형을 달성했다. (b) 3-D 종이 심지가 혼합 ATPS에 적용되었을 때, 미셀 풍부 도메인이 심지의 하부 부근에 잔류되고 미셀 결핍 도메인이 보다 자유롭게 심지를 유동시킬 수 있었기 때문에, 상 분리가 30초에 심지 내에서 이미 관찰되었다. 심비 배출시, 명확한 상은 서로 분리된 대로 잔류하고, 미셀 풍부 상은 리딩 전면에서 작은 용적내에서 농축된 대로 잔류하여 180초(3분)에 보다 완전한 분리를 나타낸다.
도 54a-b는 종이 심지 및 트리톤 X-114 미셀 ATPS를 LFA와 통합시킴을 예시한다. (a) 통합 진단 스트립은 고정된 시험 및 대조군 라인 성분을 함유하는 검출 영역에 이어지는, 상 분리가 발생하는 농축 영역으로 구성된다. (b). 진정한 음성 시험은 pLDH를 함유하지 않는 용액을 분석할 때 20분 이내에 확인되었다.
도 55는 종이 기본 1:9 용적비 미셀 ATPS가 25 ℃에서 PBS 중의 pLDH의 검출 한계의 10배 개선을 달성했다는 것을 도시한다. 표준 LFA는 10 ng μL-1 에서 pLDH를 검출했지만, 1 ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출할 수 없었다. 통합 진단 스트립은 1 ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출했다.
도 56은 종이 기반 9:1 용적비 미셀 ATPS가 25 ℃에서 희석되지 않은 FBS에서 pLDH의 검출 한계의 10배 개선을 달성했다는 것을 도시한다. 표준 LFA는 10 ng μL-1 에서 pLDH를 검출했지만, 1 ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출할 수 없었다. 통합 진단 스트립은 1 ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출했다.
도 57a-d는 (a) 유리 섬유 상의 PEG 4600 및 인산칼륨, (B) 유리 섬유 상의 PPG 425 및 인산칼륨, (c) 셀룰로즈 상의 PEG 8000 및 덱스트란 9000 및 (d) 유리 섬유 상의 PEG 4600 및 덱스트란 35000을 사용하는 상 분리 결과를 도시한다.
도 58a-b는 (a) 리딩 유체인 염 상 또는 (b) 리딩 유체인 PEG 상을 유도하는 상이한 종이 형태 상의 상 분리를 나타낸다.
도 59a-d는 소수성 중합체(예: 를 배치함을 포함하여 중합체 ATPS 성분을 탈수시키기 위한 상이한 설계를 도시한다 (a) LFA의 협소한 영역, (b) LFA의 광범위한 영역의 중심, (c) LFA의 협소한 영역으로부터 LFA의 광범위한 영역으로 연장되는 LFA의 영역 및 (d) 주로 LFA의 광범위한 영역에 PEG) 상.
도 60은 탈수된 중합체 ATPS-LFA 시스템 상의 상 분리의 시간 경과 이미지를 도시한다.
도 61은 탈수된 중합체 ATPS-LFA 시스템 상의 상 분리의 시간 경과 이미지를 도시한다.
도 62은 탈수된 나노프로브 세그먼트가 검출 멤브레인의 너비보다 더 넓은(너비는 유동평면 이내이지만 유동 방향에 수직인 치수로서 정의된다) 설계를 도시한다.
도 63a-b는 (a) ATPS를 사용하지 않거나 (b) ATPS를 사용하여 광범위한 설계 LFA에서 성공적인 상 분리를 도시한다.
도 64는 검출 멤브레인 내에서 유동을 극적으로 늦추는 중합체 ATPS의 PEG 풍부 상의점도로 인해 계속 유동할 수 없는 실험의 이미지이다.
도 65는 검출 멤브레인 내의 유동을 극적으로 늦추는 PEG 풍부 상은 PEG를 함유하지 않는 블랭크 스페이서를 잔류시킴으로써 해결될 수 있음을 도시한다.
도 66은 뒤에 남겨지는 나노프로브의 양을 감소시키기 위해 유체의 공급원으로부터LFA 멤브레인까지 일정한 경사를 갖는 탈수된 LFA 설계를 도시한다.
도 67은 PEG/염 ATPS를 사용하는 탈수된 ATPS-LFA 시스템을 예시한다.
도 68은 탈수된 중합체 ATPS 성분을 함유하는 종이 패드를 갖는 3D 종이 웰 설계를 예시한다.
도 69a-b는 웰이 (a) LFA의 시작 말단에 존재하거나 (b) LFA의 시작 말단에 존재하지 않는 탈수된 중합체 ATPS 성분을 함유하는 종이 패드를 갖는 3D 종이 웰 LFA 상의 분리를 도시한다.
도 70은 일부 길이의 수평 종이에 의해 분리된 2개의 상이한 3D 웰이 존재하는 예시적인 2-웰 구성 설계를 도시한다. 제1 웰은 탈수된 ATPS 성분을 함유한다. 제2 웰은 상 분리를 위한 더 많은 시간 및 공간을 가능하게 한다.
도 71은 MF1 종이가 PEG-염 용액 중의 혈액 샘플과 호환성이 있다는 것을 도시한다.
도 72는 MF1 종이 상에서 혈액 샘플의 여과가 느려질 수 있음을 도시한다.
도 73a-b는 여과지 상에서 (a) 3층 3-D 웰 또는 (b) 5층 3-D 웰을 사용하는 혈액 샘플 및 PEG-염 용액 상 분리의 결과를 도시한다.
도 74는 종이 상에서 3-D 웰을 사용하는 혈액 샘플 및 PEG-염 용액 상 분리의 결과를도시한다.
도 75는 여과 및 농축 종이의 층을 포함하는 3-D 웰을 사용하는 혈액 샘플 및 PEG-염용액 상 분리의 결과를 도시한다.
도 76은 샌드위치 포맷 LFA를 사용하는 바이러스 수송 배지(VTM) 중의 씨. 트라초마티스(C. trachomatis)의 검출을 도시한다.
도 77은 샌드위치 포맷 LFA 및 미셀 ATPS를 사용하는 에스. 뮤탄스(S. mutans)의 검출을 도시한다.
도 78은 샌드위치 포맷 LFA 및 PEG/염 ATPS를 사용하는 에스. 뮤탄스의 검출을 도시한다.
도 79는 경쟁 포맷 LFA 및 PEG/염 ATPS를 사용하는 트로포닌의 검출을 도시한다.
도 80a-c는 종이 멤브레인 상에 혼합 ATPS를 첨가하는 개략적 예시(a) 및 결과를 도시하고, 여기서 ATPS의 두 상은 종이를 통해 유동하기 바로 직전에 유리 내부에서 완전히 분리하는 것이 가능했다. 자주색 덱스트란 코팅된 금 나노입자(빈 화살표)를 함유하는 PEG 결핍 상은 종이를 통해 신속하게 유동하는 것으로 관찰된 반면, 블루 염료(실선 화살표)를 함유하는 PEG 풍부 상은 종이 멤브레인의 시작 부분에 유지되었다. 종이 맴브레인 내에서 발생되는 향상된 상 분리는 (b) 1:1 용적비 ATPS 또는 (c) 9:1 용적비 ATPS를 사용할 때 명백했다.
도 81은 9:1 용적 트리톤-X-PBS ATPS 및 3-D LFA를 사용하여 0.1 ng/mL에서 FBS 샘플 중의 pLDH의 검출을 도시한다.
도 82는 동시 농축 및 검출을 위한 혼합된 ATPS 용액 또는 하나의 상에서 프로브-분석물 복합체의 상 분리 및 농축 후 ATPS의 하나의 상 중의 LFA에 첨가된 프로브-분석물 복합체의 개략적인 예시를 도시한다.
상기 요약 뿐만 아니라 다음 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독될 때 더욱 잘 이해될 수 있다. 도면은 예시적이고 제한적이지 않은 것으로 의도된다. 본 개시는 본원에 제시된 정확한 배열, 실시예 및 수단에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다.
도 1 (상부) 전형적인 측방-유동 면역검정 시험 스트립의 개략도. LFA에 의해 사용된 두 개의 예시적 메커니즘이 제시된다: 샌드위치 검정(하부 좌측) 및 경쟁 검정(하부 우측).
도 2는 ATPS와 포획 프로브를 사용하는 분석물 농도를 위한 개략적 대표도이다. 프로브는 표적 분석물을 포획하고, 극도로 상 중의 하나로 분할한다. 이어서, 농축된 프로브를 함유하는 상을 LFA를 통한 후속 분석을 위해 수집할 수 있다
도 3은 ATPS와 자기 포획 프로브를 사용하는 분석물 농도를 위한 개략적 대표도를 도시한다. 프로브는 표적 분석물을 포획하고, 상 중의 하나로 분할한다. 자기 프로브를 보다 적은 용적으로 추가로 농축시키는 자석을 적용한다.
도 4는 ATPS로부터 농축된 분석물을 LFA 시험 스트립으로 이동시키기 위해 피스톤 및 플런저를 사용하는 휴대용 장치의 하나의 예시적이지만 비제한적인 설계를 도시한다. 이 장치는 농축 챔버 및 검출 챔버로 구성된다. 이 실시예에서, 분석물을 ATPS의 하부 벌크 상에서 농축시킨다. 샘플을 수집하기 위해, (1) 플런저를 압축시킨다. 샘플을 ATPS 용액과 혼합한다. 후속적으로 (2), 용액을 인출하기 위해, 장치의 선단을 샘플에 삽입한 후, (3) 플런저를 방출시키고, (4) PEN 장치를 캡으로 밀봉시킨다. (5) 분석물을 하부 벌크 상에서 농축시킨 후, 검출 단계는 (6) 플런저를 “TEST” 위치에서 회전시키고(이는 피스톤을 저하시키고), (7) 농축된 분석물을 체크 밸브를 통해 검출 챔버로 유도함으로써 개시한다. (8) 피스톤의 이동을 보장하기 위해 홈에서 포획 잠금을 조절하고, 조절된 양의 용적만이 검출 챔버로 유도된다.
도 5는 LFA 시험 스트립을 농축된 분석물을 함유하는 상부 상에 기계적으로 삽입하는 휴대용 장치의 하나의 예시적이고 비제한적인 설계를 도시한다. ATPS 용액과 예비혼합된 샘플을 유인하기 위해, 장치의 측면 위의 (1) 버튼을 누른다. 상분리를 완료하고 분석물을 상부 벌크 상에서 농축시킨 후, 검출 단계는 스트립의 샘플 패드가농축된 분석물과 접촉되도록 LFA 시험 스트립을 저하시키는 (2) 검출 버튼을 누름으로써 개시된다. 최종적으로, (3) 결과는 결과 윈도우를 통해 해석될 수 있다.
도 6a-d 는 밀봉 웰(A)을 시행하기 위한 휴대용 장치의 예시적이지만 비제한적인설계를 도시한다. ATPS 용액은 웰에서 혼합된다. 상 분리가 완료된 후, 웰의 유동은 웰의 하부에서 밀봉부를 천공함으로써 포획될 수 있고, 농축된분석물을 함유하는 하부 상은 검출을 향해 유동한다. 이 접근법은 분석물을 상부 또는 하부 상에서 농축시키는 장치에 도입할 수 있다. 분석물이 하부 상에서 농축되면, 웰은 검출을 향한 하부 상의 유동을 포획하는 장치 챔버에서 함몰된다. 대안적으로, 웰은 아래로부터 적재될 수 있고, 웰에 첨가된 버튼은 장치 상에 도입된다. 이 버튼이 눌렸을 때, 이는 시험 스트립이 웰과 접촉되도록 할 수 있다. 도 6b 및 도 6c는 다음의 결과를 도시한다: 1:1 용적 PEG: 염 ATPS 및 9:1 용적 PEG: 시험 스트립 상 염 ATPS. 도 6d는 웰을 천공시키고 LFA를 통해 ATPS 용액(들)의 유동을 포획하기 위한 예시적인 메카니즘을 예시한다: 웰(하부 패널)과 접촉된 버튼을 함몰시키거나 웰 자체(상부 패널)을 함몰시킨다.
도 7은 휴대용 장치의 하나의 예시적이지만 비제한적인 설계를 도시한다. 이 장치는 다음에 제시된 장치와 유사하다: 도 4, 그러나 자기 프로브를 사용한다. 하부 상의 형성 동안, 펜의 캡 부근의 자석은 추가로 자기 프로브를 보다 작은 용적으로 농축시킨다. 펜의 버튼이 함몰되면, 자기 입자는 검출을 개시하는 체크 밸브를 통해 플러슁된다.
도 8은 계면에서 농축 현상의 개략적 대표도를 도시한다. 프로브 및 ATPS의 특정 특성에 기인하여, 프로브는 계면예서 분할되고 매우 농축된다. 이어서, 계면은 LFA를 통해 후속 분석을 위해 수집할 수 있다.
도 9는 고체-액체 계면 농도의 관찰을 도시한다. 프로브는 PEG-염 ATPS을 함유하는 튜브의 폴리프로필렌 벽에 존재하는 것으로 밝혀졌다.
도 10a-b: (a) PEG-염 ATPS 중 폴리프로필렌 스틱을 사용하는 분석물-프로브 복합체의 실험적 수집을 도시한다. (b) 고체-액체 계면 농도의 개략적 대표도를 도시한다. 프로브는 균질한 용액 중의 표적 분석물에 결합한다. 튜브의 벽이 유리이기 때문에, 프로브는 우선적으로 TPS에 삽입된 폴리프로필렌 수집기에 부착된다. 농축된 프로브를 함유하는 수집기는 제거될 수 있고, 프로브는 후속적 LFA를 통해 검출을 위해 재현탁될 수 있다. 이러한 입자는 2-상 시스템이 존재할 경우에만 고체 프로필렌에 부착된다는 것을 주의한다.
도 11은 고체-액체 계면 농도를 사용하는 휴대용 장치의 개략적 대표도를 도시한다. ATPS 샘플은 농도 웰 및 프로브를 수집하기 위해 삽입된 수집 스틱에 첨가된다. 프로브가 수집 스틱에 부착된 후, 이는 프로브를 재현탁시키고 검출을 위해 LFA를 향한 유동을 포획하는 검출 웰로 이동한다.
도 12a-c는 (a) 종이가 그것이 유동할 때 ATPS 상 분리가 일어나도록 한다는 것을도시한다. 중합체-염 ATPS가 이 실시예에 사용된다. 소수성 및 보자 점성의 상의 벌크한 성분은 뒤에 지연되는 반면, 농축된 표적 분석물을 함유하는친수성 및 덜 점성의 상은 종이를 통해 신속하게 유동한다. (b) 1:1 중합체-염 ATPS 상은 종이에서 분리되고, 5분 이내에 종이를 통해 유동한다. (c) 9:1 PEG-염 ATPS는 또한 5분 이내에 종이를 통해 유동하지만, 중합체 결핍 상 중의 포획 프로브는 보다 적은 용적으로 인해 쉽게 볼 수 없다.
도 13a-c 는 (A) 종이 웰이 보다 효율적인 ATPS 상 분리를 가능하게 한다는 것을 도시한다. 소수성 및 보다 점성인 상의 벌크 성분은 종이에 의해 보유되고, 웰의 상부 층에 잔류하는 반면, 표적 분석물을 함유하는 친수성 및 덜 점성인 상은 신속하게 하부 층으로 유동한다. 분석물의 수집을 향상시키기 위해, 상의 정합성을 유지시키면서 작동 완충제의 첨가를 멤브레인 상에서 종이 웰로부터 플러슁하기 위해 적용할 수 있다. 도 13b는 1:1 PEG-염 ATPS 상이 종이의 층에서 분리되고, 검출용 멤브레인을 통해 유동한다는 것을 도시한다. 도 13c는 9:1 PEG-염 ATPS가 고농도에서 거대한 PEG 분자를 함유하는 PEG 풍부 상으로 인해 더욱 느리게 멤브레인을 통해 유동한다는 것을 도시한다. 이어서, 농축된 염 상은 리딩 엣지가 된다.
도 14a-d는 (A) 3D 종이 웰의 변동을 도시하고, 여기서 본 발명자들은 농도 웰 및혼합 웰을 모두 사용한다. 검정을 시작하기 위해, ATPS 용액과 혼합된 샘플을 농도 웰에 적용한다. (B) 이어서, 완충제를 상 분리를 촉진시키기 위해 농도 웰에 첨가한다. (C) 농축된 분석물이 혼합 웰에 도달하면, (D) 또 다른 완충제를 유동을 촉진시키고 농축된 분석물이 LFA 시험 스트립 하류에 도달하도록 하기 위해 혼합 웰에 첨가한다.
도 15a-b는 성분이 샘플 용액으로 재수화된 후 상 분리를 유도할 수 있는 종이스트립 내에서 ATPS를 위해 필요한 성분을 탈수시키는 방법을 증명한다(a). 이 실험에서, 샘플 용액은 중합체 풍부 상을 선호하는 블루 염료, 및 중합체 결핍 상을 선호하는LFA를 위한 레드 비색 나노입자 지시제로 구성된다. FG는 유리 섬유 종이를 의미한다. (b) 탈수된 ATPS 성분을 포함하지 않는 대조군 상태.
도 16a-e는 탈수된 PEG-염 ATPS 성분을 사용하는 상이한 종이 장치 구조를 예시한다. (a) 별도의 PEG 및 염 세그먼트를 갖는 간단한 구조. (b) 조합된 PEG 및 염 세그먼트를 갖는 간단한 구조. (c) 농축 효율을 향상시키기 위해 복수의 반복 세그먼트를 도입하는 예. (d) PEG 세그먼트가 장치의 직접 유동 경로에 존재하지 않는 실시예 c의 반복. (e) 유동 경로의 말단에서 상 분리 부위를 배치하는 구조의 예. 이 개략도에 도시되지 않은 LFA 시험 스트립은 장치의 하류 영역에 배치된다.
도 17a-b는 (A) 크기 배제에 기초하여 목적하는 분석물을 제외한 PEG 풍부 상을 형성하는 탈수된 PEG 세그먼트에서 용액을 인출함으로써 리등 유체를 추가로 농축시키기 위해 사용될 수 있는 PEG-염 용지-유일 진단 내에서 탈수된 PEG 세그먼트를 오프셋팅하는 방법을 예시하는 개략도; 및 (B) 농축 효과를 증명하는 실험을 도시한다.
도 18a-b 는 (A) 농축된 분석물을 함유하는 지체 상을 LFA 시험 스트립을 향해 구동시키기 위해 작동 완충제를 도입하는 개략적 대표도; 및 (B) 농축된 분석물을 함유하는 리딩 상을 LFA 시험 스트립을 향해 구동시키기 위해 작동 완충제를 도입하기 위한 예시적인 대안 설계를 도시한다.
도 19는 상이한 종이 재료를 갖는 3D 종이 웰을 사용하는 유동 재라우팅 설계의 개략적 대표도를 도시한다. 중합체 풍부 상은 더욱 소수성이고, 우선적으로 더욱 소수성 종이로 유동하는 반면, 중합체 결핍상은 친수성 종이를 통해 더욱 우선적으로 유동한다. LFA 시험 스트립은 검출을 위한 이 장치의 하류 영역에 부착될 수 있다.
도 20은 농축 용량을 향상시키기 위해 자기 프로브의 사용을 도입하는 종이 장치레이아웃의 상이한 예를 예시한다. 여기서, 자석의 위치는 표적 분석물에 결합되어 있는 입자 상에서 작용하는 힘을 제공한다. 이는 LFA 검출 영역을 갖는 종이의 측면에서 입자를 효율적으로 농축시킨다.
도 21a-c는 GMP가 하부 PEG 불량 상에서 극도로 분할되는 것으로 밝혀졌음을 도시한다(a). 이는 ATPS 용액(c)으로부터 신속하게 대부분의 GMP를 회수하기 위해 작은 자석(b)의 사용을 가능하게 한다.
도 22 는 사전 ATPS 농축단계를 사용하지 않거나(상부) 사용하여(하부) Tf를 검출하기 위해 사용되는 LFA 스트립의 이미지를 도시한다.
도 23a-d는 (a) PEG 단독, (b) 염 단독 또는 (c) 1:1 ATPS를 함유하는 용액 중의 PGNP 및 PP 빨대의 이미지를 도시한다. PGNP는 단지 ATPS의 존재하에 PP 빨대에서 매우 분할되었다. (d) PP 빨대는 (c)로부터 추출되었고, 이 도면은 빨대가 후속 검출 검정을 위한 농축된 PGNP를 용이하게 수집하기 위해 인출할 수 있음을 도시한다.
도 24는 사전 ATPS 농축 단계를 사용하지 않고(상부) 및 사용하여(하부) 트랜스페린(Tf)을 검출하기 위해 사용된 LFA 스트립의 이미지를 도시한다.
도 25는 제안된 휴대용 장치의 개략적 대표도를 도시한다.
도 26은 ATPS를 사용하여 LFA의 검출 한계를 향상시키기 위한 접근법에서 DGNP 및 이들의 역할의 개략도를 도시한다.
도 27은 LFA의 경쟁 시험에 대한 양성 및 음성 결과의 개략적 대표도를 도시한다.
도 28a-c는 가변적인 % w/w 인산칼륨 용액에서 (a) 시트레이트 캡핑되거나 벗겨진 금 나노입자 (b) PEG화된 금 나노입자, 및 (c) 덱스트란 코팅된 금 나노입자의 정규화된 가시광선 범위 흡광도 스펙트럼(400-700nm)을 도시한다.
도 29a-c는 (a) 0분, (b) 30분 및 (c) 12시간에 본 PEG-염 ATPS 중의 DGNP의 분할 거동을 도시한다.
도 30은 PEG/염 ATPS에서 12시간 이내의 다양한 시점에 실험적으로 측정된 Tf 농도 인자를 도시한다. 오차 막대는 3회 측정으로부터 표준 편차를 나타낸다.
도 31a-b는 PEG/염 ATPS를 사용하는 사전 농축 단계를 사용하지 않고(a) 및 사용하여(b) Tf를 검출하기 위해 사용된 LFA 스트립의 이미지를 도시한다.
도 32는 MATLAB를 사용하는 LFA 정량화의 결과를 도시한다. 오차 막대는 3개의 LFA 시험 스트립을 사용하는 측정으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
도 33a-d는 각각 상부 PEG 풍부 및 하부 PEG 결핍 상으로 매우 분할되는 브릴리언트 블루 FCF 염료 및 덱스트란 코팅된 금 나노입자를 도시한다. (a) 25 ℃에서, 혼합된 1:1 용적비 ATPS 상은 (b) 2개의 동일 용적 상을 형성하기 위해 분리된다. (c) 25 ℃에서, 혼합된 9:1 용적비 ATPS 상은 (d) 거대한 PEG 풍부 상 및 작은 PEG 결핍 상으로 분리된다. 동일량의 브릴리언트 블루 FCF 및 덱스트란 코팅된 금 나노입자를 두 ATPS에 첨가했다. 9:1 용적비의 ATPS의 짙은 자주색 색상은 하부 PEG 결핍 상 중의금 나노입자 농도가 상당히 증가했음을 나타낸다.
도 34a-b는 종이 멤브레인이 그것이 유동할 때 ATPS 상 분리가 일어나도록 한다는 것을 도시한다. PEG 풍부 도메인은 종이 멤브레인의 선단 부근에 유지된 반면, PEG 결핍 도메인은 리딩 전면으로 신속하게 이동했다. (a) 1:1 용적비 ATPS 상이 분리되고, 5분 이내에 종이 멤브레인을 통해 유동했다. (b) 9:1 용적비 ATPS도 또한 분리되고, 5분 이내에 멤브레인을 통해 유동했지만, 상 분리는 리딩 전면이 300초에 덜 구별되기 때문에 덜 효율적이었다.
도 35a-b는 3-D 종이 웰이 추가로 향상된 ATPS 상 분리를 가능하게 함을 도시한다. 염료와 혼합 ATPS를 첨가 후, PEG 풍부 도메인은 웰의 상부 층에 유지된 반면, 농축된 금 나노입자를 함유하는 PEG 결핍 도메인은 하부 층으로 신속하게 유동했다. (a) 1:1 용적비 ATPS는 3-D 종이 웰에서 향상된 상 분리를 나타냈고, PEG 결핍 상은 5분 이내에 멤브레인을 통해 유동했다. (b) 9:1 용적비 ATPS는 또한 개선된 상 분리를 가졌고, PEG 결핍 상은 명백하게 가시적이었다. 다음과 대조적으로: 도 34, 리딩 전면은 충분히 정의되고, 덱스트란 코팅된 금 나노입자의 농도를 의미하는 짙은 자주색색상을 갖는다.
도 36a-c는 3-D 종이 웰이 Tf 검출을 위해 PEG/염 ATPS 및 LFA와 조합되었음을 도시한다. (a) 종이 웰 장치는 니트로셀룰로즈 종이 상에서 Tf 경쟁 검정과 조합했다. Tf를 함유하지 않는 샘플은 가시 시험 및 대조 라인과 함께 (b) 1:1 또는 (c) 9:1 용적비 ATPS 용액을 사용할 때 정확하게 진단되었다.
도 37a-b는 3-D 종이 웰을 갖는 1:1 용적비 PEG/염 ATPS가 Tf의 검출 한계에서 2배 개선을 가능하게 하는 반면, 9:1 용적비 ATPS는 10배 개선을 가능하게 한다. (a) 통상적인 LFA는 1ng/μL에서 Tf를 검출하였지만, 0.5ng/μL에서 Tf를 검출할 수 없어 잘못된 음성 결과를 유도하였다. 3-D 종이 웰을 갖는 1:1 용적비 ATPS는 0.5ng/μL에서 Tf를 성공적으로 검출했다. (b) 통상적인 LFA는 1ng/μL에서 Tf를 검출하였지만, 0.1ng/μL에서 Tf를 검출할 수 없어 잘못된 음성 결과를 유도하였다. 3-D 종이 웰을 갖는 9:1 용적비 ATPS는 0.1ng/μL에서 Tf를 성공적으로 검출했다.
도 38은 예시적인 ATPS-LFA 시스템을 도시한다.
도 39는 LFA 샌드위치 검정의 개략도를 도시한다. 양성 결과(상부)는 시럼 라인 및 대조 라인에서 두 개의 밴드로 표시되는 반면, 음성 결과(하부)는대조 라인에서 단일 밴드로 표시된다.
도 40a-c는 37°C에서 (a) 10분, (b) 30분 및 (c) 24시간 동안 배양 후 수성 이상 PEG-염시스템을 도시한다. 백색 종이는 각 상의 혼탁도를 가시화하는 것을 돕기 위해 문자 “X”로 채워졌다. 화살표는 거시적 계면의 위치를 나타낸다.
도 41은 PEG/염 ATPS에서 다양한 시점에 M13의 실험적으로 결정된 농도 인자를 도시한다. 오차 막대는 3회 측정으로부터 표준 편차를 나타낸다.
도 42는 PEG/염 ATPS에서 다양한 용적비로 M13의 실험적으로 결정된 농도 인자를 도시한다. 기호는 실험 데이터에 상응하고, 오차 막대는 3회 측정으로부터 표준 편차를 나타낸다. 실선은 방정식(6)으로부터의 예측에 상응한다.
도 43a-f PEG/염 ATPS를 사용하는 사전 농축 단계 없이 M13을 검출하기 위한 LFA. 패널 (A)는 M13이 첨가되지 않은 음성 대조군을 도시한다. 잔류 용액은 (b) 1x1010, (c) 3.2x109, (d) 1x109, (e) 3.2x108, 및 (f) 1x108 pfu/mL의 농도에서 M13을 함유했다.
도 44a-f: 사전 농축 단계를 사용하여 M13을 검출하기 위한 LFA. 패널 (A)는 M13이 첨가되지 않은 음성 대조군을 도시한다. 잔류 용액은 초기에 (b) 1x109, (c) 3.2x108, (d) 1x108, (e) 3.2x107, 및 (f) 1x107 pfu/mL의 농도에서 M13을 함유했다.
도 45 사전 농축 단계를 사용하고(■) 사용하지 않는(▲) M13에 대한 LFA 신호 강도. 오차 막대는 적어도 3회 측정으로부터 표준 편차를 나타낸다.
도 46은 PBS 중의 ATPS-LFA 시스템의 개략도를 도시한다.
도 47은 경쟁 기반 LFA 및 양성 및 음성 결과 해석의 개략적 대표도를 도시한다.
도 48a-d는 ATPS (a) GNP의 개략도 및 각 성분의 기능에서 분할 거동에 영향을 미치는 GNP의 표면 변형을 도시한다. 본 PEG-염 ATPS에서 GNP의 분할 거동이 맞춤될 수 있음을 입증하기 위해, 다양한 양의 PEG를 이들의 분할 거동을 조작하기 위해 GNP에 접합시켰다: (b) 접합 동안 5000:1 PEG:GNP의 몰 비를 사용하여, 생성되는 GNP는 PEG 풍부 상 부 상에서 우선적으로 분할된다. (c) 접합 동안 1000:1 PEG:GNP의 몰 비를 사용하여, GNP는 PEG 결핍 하부 상에서 분할되지만 고염 농도를 갖기 때문에 응집된다. 이러한 응집된 GNP는 후속 검출 검정에 사용될 수 없었다. (d) 접합 동안 3000:1 PEG:GNP의 몰 비를 사용하여, 생성되는 GNP는 계면예서 극도로 분할된다. (b), (c) 및 (d)를 위해, 액체-공기 계면의 최상부에서 관찰된 적색은 반사에 기인하고 나노프로브의 존재에 기인하지 않는다.
도 49는 PEG/염 ATPS 계면 추출 단계를 사용하는 사전 농축 단계를 사용하지 않고(상부 패널) 및 사용하여(하부 패널) PBS에서 Tf를 검출하기 위한 LFA의 결과를 도시한다.
도 50은 PEG/염 ATPS 계면 추출 단계를 사용하는 사전 농축 단계를 사용하지 않고(상부 패널) 및 사용하여(하부 패널) FBS에서 Tf를 검출하기 위한 LFA의 결과를 도시한다.
도 51은 PEG/염 ATPS 계면 추출 단계를 사용하는 사전 농축 단계를 사용하지 않고(상부 패널) 및 사용하여(하부 패널) 합성 뇨에서 Tf를 검출하기 위한 LFA의 결과를 도시한다.
도 52는 미셀 ATPS를 사용하여 표적 분석물의 동시 농도 및 검출을 도시한다.
도 53a-b는 PBS에서 1:9 용적비 트리톤 X-114 시스템의 상 분리를 달성하기 위해 필요한 시간의 비교를 도시한다. 브릴리언트 블루 FCF 염료 및 체리색 BSA-GN는 각각 하부, 미셀 풍부 상 및 상부, 미셀 결핍 상을 위한 비색 지시제였다. (a) 25 ℃에서, 트리톤 X-114 ATPS는 시험관에서 8시간에 거시적인 상 분리 평형을 달성했다. (b) 3-D 종이 심지가 혼합 ATPS에 적용되었을 때, 미셀 풍부 도메인이 심지의 하부 부근에 잔류되고 미셀 결핍 도메인이 보다 자유롭게 심지를 유동시킬 수 있었기 때문에, 상 분리가 30초에 심지 내에서 이미 관찰되었다. 심비 배출시, 명확한 상은 서로 분리된 대로 잔류하고, 미셀 풍부 상은 리딩 전면에서 작은 용적내에서 농축된 대로 잔류하여 180초(3분)에 보다 완전한 분리를 나타낸다.
도 54a-b는 종이 심지 및 트리톤 X-114 미셀 ATPS를 LFA와 통합시킴을 예시한다. (a) 통합 진단 스트립은 고정된 시험 및 대조군 라인 성분을 함유하는 검출 영역에 이어지는, 상 분리가 발생하는 농축 영역으로 구성된다. (b). 진정한 음성 시험은 pLDH를 함유하지 않는 용액을 분석할 때 20분 이내에 확인되었다.
도 55는 종이 기본 1:9 용적비 미셀 ATPS가 25 ℃에서 PBS 중의 pLDH의 검출 한계의 10배 개선을 달성했다는 것을 도시한다. 표준 LFA는 10 ng μL-1 에서 pLDH를 검출했지만, 1 ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출할 수 없었다. 통합 진단 스트립은 1 ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출했다.
도 56은 종이 기반 9:1 용적비 미셀 ATPS가 25 ℃에서 희석되지 않은 FBS에서 pLDH의 검출 한계의 10배 개선을 달성했다는 것을 도시한다. 표준 LFA는 10 ng μL-1 에서 pLDH를 검출했지만, 1 ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출할 수 없었다. 통합 진단 스트립은 1 ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출했다.
도 57a-d는 (a) 유리 섬유 상의 PEG 4600 및 인산칼륨, (B) 유리 섬유 상의 PPG 425 및 인산칼륨, (c) 셀룰로즈 상의 PEG 8000 및 덱스트란 9000 및 (d) 유리 섬유 상의 PEG 4600 및 덱스트란 35000을 사용하는 상 분리 결과를 도시한다.
도 58a-b는 (a) 리딩 유체인 염 상 또는 (b) 리딩 유체인 PEG 상을 유도하는 상이한 종이 형태 상의 상 분리를 나타낸다.
도 59a-d는 소수성 중합체(예: 를 배치함을 포함하여 중합체 ATPS 성분을 탈수시키기 위한 상이한 설계를 도시한다 (a) LFA의 협소한 영역, (b) LFA의 광범위한 영역의 중심, (c) LFA의 협소한 영역으로부터 LFA의 광범위한 영역으로 연장되는 LFA의 영역 및 (d) 주로 LFA의 광범위한 영역에 PEG) 상.
도 60은 탈수된 중합체 ATPS-LFA 시스템 상의 상 분리의 시간 경과 이미지를 도시한다.
도 61은 탈수된 중합체 ATPS-LFA 시스템 상의 상 분리의 시간 경과 이미지를 도시한다.
도 62은 탈수된 나노프로브 세그먼트가 검출 멤브레인의 너비보다 더 넓은(너비는 유동평면 이내이지만 유동 방향에 수직인 치수로서 정의된다) 설계를 도시한다.
도 63a-b는 (a) ATPS를 사용하지 않거나 (b) ATPS를 사용하여 광범위한 설계 LFA에서 성공적인 상 분리를 도시한다.
도 64는 검출 멤브레인 내에서 유동을 극적으로 늦추는 중합체 ATPS의 PEG 풍부 상의점도로 인해 계속 유동할 수 없는 실험의 이미지이다.
도 65는 검출 멤브레인 내의 유동을 극적으로 늦추는 PEG 풍부 상은 PEG를 함유하지 않는 블랭크 스페이서를 잔류시킴으로써 해결될 수 있음을 도시한다.
도 66은 뒤에 남겨지는 나노프로브의 양을 감소시키기 위해 유체의 공급원으로부터LFA 멤브레인까지 일정한 경사를 갖는 탈수된 LFA 설계를 도시한다.
도 67은 PEG/염 ATPS를 사용하는 탈수된 ATPS-LFA 시스템을 예시한다.
도 68은 탈수된 중합체 ATPS 성분을 함유하는 종이 패드를 갖는 3D 종이 웰 설계를 예시한다.
도 69a-b는 웰이 (a) LFA의 시작 말단에 존재하거나 (b) LFA의 시작 말단에 존재하지 않는 탈수된 중합체 ATPS 성분을 함유하는 종이 패드를 갖는 3D 종이 웰 LFA 상의 분리를 도시한다.
도 70은 일부 길이의 수평 종이에 의해 분리된 2개의 상이한 3D 웰이 존재하는 예시적인 2-웰 구성 설계를 도시한다. 제1 웰은 탈수된 ATPS 성분을 함유한다. 제2 웰은 상 분리를 위한 더 많은 시간 및 공간을 가능하게 한다.
도 71은 MF1 종이가 PEG-염 용액 중의 혈액 샘플과 호환성이 있다는 것을 도시한다.
도 72는 MF1 종이 상에서 혈액 샘플의 여과가 느려질 수 있음을 도시한다.
도 73a-b는 여과지 상에서 (a) 3층 3-D 웰 또는 (b) 5층 3-D 웰을 사용하는 혈액 샘플 및 PEG-염 용액 상 분리의 결과를 도시한다.
도 74는 종이 상에서 3-D 웰을 사용하는 혈액 샘플 및 PEG-염 용액 상 분리의 결과를도시한다.
도 75는 여과 및 농축 종이의 층을 포함하는 3-D 웰을 사용하는 혈액 샘플 및 PEG-염용액 상 분리의 결과를 도시한다.
도 76은 샌드위치 포맷 LFA를 사용하는 바이러스 수송 배지(VTM) 중의 씨. 트라초마티스(C. trachomatis)의 검출을 도시한다.
도 77은 샌드위치 포맷 LFA 및 미셀 ATPS를 사용하는 에스. 뮤탄스(S. mutans)의 검출을 도시한다.
도 78은 샌드위치 포맷 LFA 및 PEG/염 ATPS를 사용하는 에스. 뮤탄스의 검출을 도시한다.
도 79는 경쟁 포맷 LFA 및 PEG/염 ATPS를 사용하는 트로포닌의 검출을 도시한다.
도 80a-c는 종이 멤브레인 상에 혼합 ATPS를 첨가하는 개략적 예시(a) 및 결과를 도시하고, 여기서 ATPS의 두 상은 종이를 통해 유동하기 바로 직전에 유리 내부에서 완전히 분리하는 것이 가능했다. 자주색 덱스트란 코팅된 금 나노입자(빈 화살표)를 함유하는 PEG 결핍 상은 종이를 통해 신속하게 유동하는 것으로 관찰된 반면, 블루 염료(실선 화살표)를 함유하는 PEG 풍부 상은 종이 멤브레인의 시작 부분에 유지되었다. 종이 맴브레인 내에서 발생되는 향상된 상 분리는 (b) 1:1 용적비 ATPS 또는 (c) 9:1 용적비 ATPS를 사용할 때 명백했다.
도 81은 9:1 용적 트리톤-X-PBS ATPS 및 3-D LFA를 사용하여 0.1 ng/mL에서 FBS 샘플 중의 pLDH의 검출을 도시한다.
도 82는 동시 농축 및 검출을 위한 혼합된 ATPS 용액 또는 하나의 상에서 프로브-분석물 복합체의 상 분리 및 농축 후 ATPS의 하나의 상 중의 LFA에 첨가된 프로브-분석물 복합체의 개략적인 예시를 도시한다.
상세한 설명
관리 시점(POC) 또는 사용 시점에 수행되는 것을 가능하게 하고 의료, 소비자 및 다른 용도에 유용한 도구를 제공하는 방법, 장치, 키트 및/또는 시스템이 본원에 제공된다. 본원에 제공된 시험 (검정 장치 및/또는 시스템)은 신속하고, 간단하고, 사용하기에 용이하며, 존재하는 경우, 약간의 임상 진단 훈련을 갖는 개인에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 시험은 매우 민감하고 신뢰 가능하다. 특정 구현예에서, 장치 및 방법은 예기치 않게 놀라운 감도, 예를 들면, 이전 LFA 검정의 검출 한계에 비해 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 실험실 기반 검정의 감도에 접근하거나 충족시키고, 특정 경우에는 이를 초과하는 적어도 약 10배 내지 약 100배 개선을 제공하기 위해 LFA와 함께 수성 다상 시스템의 농축 능력을 사용한다.
I. 장치
측방 유동 검정(LFA) 및 수성 2-상 시스템(ATPS)를 사용하는 (예를 들면, 제공하기 위해 구성되어 있는) 샘플에서 표적 분석물을 검출 및/또는 정량화하기 위한 장치가 본원에 개시되고, 여기서 ATPS는 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로 분리되는 혼합 상 용액을 포함하고, LFA는 표적 분석물을 검출하기 위한 시험 라인 및 대조군 라인을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 상의 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로의 분리는 LFA 내에서 발생한다. 일부 구현예에서, 혼합 상의 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로의 분리는 LFA 내에서 발생하지 않는다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 제2 상 용액보다 더 신속하게 LFA를 통해 유동하고, 리딩 유체로서 칭명되는 반면, 제2 상 용액은 지체 유체로서 칭명된다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액은 제1 상 용액보다 더 신속하게 LFA를 통해 유동하고 리딩 유체로서 칭명되는 반면, 제1 상 용액은 지체 유체로서 칭명된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 리딩 유체로 분할되고/농축된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 지체 유체로 분할되고/농축된다.
구성 및 작동
일부 구현예에서, 장치는 장치에 ATPS 및/또는 샘플을 장치에 투여하기 위한 포트를 포함한다. 일부 구현예에서, 장치는 ATPS를 포함하는 제1 성분 및 LFA를 포함하는 제2 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 성분 및 제2 성분은 별개의 성분이 제공된다. 일부 구현예에서, 제1 성분 및 제2 성분은 사용자에 의해 함께 결합된다. 일부 구현예에서, 제1 성분은 ATPS에 접속되어 있는 제1 포트를 갖는다. 일부 구현예에서, 제1 성분은 ATPS를 위한 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 포트는 챔버에 접속되어 있다. 일부 구현예에서, 제1 포트는 샘플 및/또는 표적 분석물을 제1 성분에 투여하기 위해 구성되어 있다. 일부 구현예에서, 제1 포트는 ATPS 또는 이의 성분을 제1 성분에 투여하기 위해 구성되어 있다. 일부 구현예에서, 제2 포트는 샘플 및/또는 표적 분석물을 제2 성분에 투여하기 위해 구성되어 있다. 일부 구현예에서, 제2 포트는 ATPS 또는 이의 성분을 제2 성분에 투여하기 위해 구성되어 있다.
일부 구현예에서, 장치는 다중 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 성분은 샘플 및/또는 ATPS 용액을 유지시키고 상 분리가 발생하도록 하는제1 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 성분은 LFA를 수용하고 상 분리가 일어난 후 표적 분석물의 LFA로의 적용을 촉진시키는 제1 챔버(예 검출 챔버)를 포함한다. 일부 구현예에서, 추가의 챔버는 압력차를 사용하거나 진공을 생성시키는 것과 같이 유동을 촉진시키기 위해 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 장치는 ATPS로부터 표적 분석물을 수집하고, 그들을 기계적 성분을 사용하여 LFA로 수송한다.
일부 구현예에서, ATPS 및 LFA는 통합되고(ATPS-LFA), 즉 ATPS 성분은 직접 또는 커넥터를 통해 LFA 성분에 결합된다. 특정 구현예에서, ATPS 및 LFA는, 예를 들면, 사용자에 의해 함께 조립되는 별개의 성분으로서 제공되거나, 그들은 단일 통합 유닛으로서 제공된다. 일부 구현예에서, 장치는 ATPS과 LFA 사이의 접속부를 포함한다(예: ATPS-LFA 커넥터). ATPS-LFT 커넥터의 예시적이지만 비제한적인 예는 튜브, 포트, 밸브, 깔때기, 게이트, 펌프, 홀, 채널, 필터, 이들의 조합 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 통합 장치는 LFA 상에 탈수된 ATPS 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 장치는 단일 포트를 포함하고, 여기서 단일 포트는 ATPS-LFA에 접속되어 있다. 일부 구현예에서, 단일 포트는 샘플 및/또는 표적 분석물을 ATPS-LFA에 투여하기 위해 구성되어 있다. 일부 구현예에서, 단일 포트는 ATPS 또는 이의 성분을 ATPS-LFA에 투여하기 위해 구성되어 있다. 일부 구현예에서, 포트는 튜브, 깔때기, 밸브, 주사기, 빨대, 채널, 플런저, 피스톤, 펌프, 이들의 조합 등으로부터 선택된 구조를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 장치는 LFA 스트립을 포함한다. 일부 구현예에서, 장치는 LFA 스트립을 ATPS에 삽입하기 위해 구성되어 있다. 일부 구현예에서, ATPS 및 LFA는 단일 하우징에 함유된다.
일부 구현예에서, 장치는 샘플 및/또는 표적 분석물을 ATPS에 전달하는 작동기를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 장치는 용액을 LFA로 전달하는 작동기를 추가로 포함한다.
휴대능
일부 구현예에서, 장치는 휴대용 장치이다. 일부 구현에에서, 장치는 중량이 약 100온스 미만, 약 90온스 미만, 약 80온스 미만, 약 70온스 미만, 약 60온스 미만, 약 50온스 미만, 약 40온스 미만, 약 32온스 미만, 약 24온스 미만, 약 16온스 미만, 약 8온스 미만, 약 4온스 미만, 약 2온스 미만 또는 약 1온스 미만이다. 일부 구현예에서, 복수의 장치가 휴대용 용기에 포장된다. 일부 구현예에서, 장치의 최대 길이는 약 1인치, 약 2인치, 약 3인치, 약 4인치, 약 6인치, 약 7인치, 약 8인치, 약 9인치, 약 10인치, 약 12인치, 약 14인치, 약 16인치, 약 18인치, 약 19인치, 약 20인치, 약 24인치, 약 26인치, 약 28인치 또는 약 30인치이다. 일부 구현예에서, 장치는 그것이 편리하게 수송되고/되거나 저장될 수 있도록 전개될 때 이의 비율보다 작은 비율로 접힌다.
도 4 피스톤 및 플런저 시스템을 사용하여 ATPS를 LFA와 조합시킬 수 있는 휴대용 장치를 예시한다. 하나의 예시적 구현예에서, 농축 및 검출 챔버는 체크 밸브, 또는 LFA 스트립이 비농축 샘플과 조기에 접촉하지 않음을 보장하는 유사한 메커니즘에 의해 접속된다. 피스톤 및 플런저 시스템은 샘플을 농축 챔버로 유인하기 위해 사용될 수 있다. 농축은 장치로 샘플링하기 전에 샘플을 분석물 추출전 ATPS 용액과 예비혼합함으로써 발생할 수있거나, 농축은 ATPS 용액을 농축 챔버 내부에 액체로서 또는 탈수된 형태로 예비 적재함으로써 장치 내부에서 발생할 수 있다. 상 분리가 발생한 후, 사용자는 농축 챔버로부터 농축된 분석물의 소정 용적을 체크 밸브를 통해검출 챔버로 재유도하기 위하 피스톤/플런저를 사용하여 검출 공정을 개시할 수 있다. 체크 밸브의 위치는 분석물이 존재하는 목적하는 벌크 상(상부 또는 하부 상)의 LFA 스트립으로의 수송을 위해 변형될 수 있다.
도 5 LFA 스트립에 적용하기 위한 상부 벌크 상의 수집을 입증하는 장치 설계를 예시한다. 예시된 구현예에서, ATPS 용액과 예비혼합된 샘플은 장치로 인출된다. 상 분리 후, 사용자는 LFA 시험 스트립(들)이 ATPS의 상부 상에서 농축된 분석물과 접촉되도록 하기 위해 버튼을 누름으로써 검출 단계를 개시할 수 있다. 다양한 구현예에서, ATPS 용액 성분은 장치에 액체 또는 탈수된 형태로서 예비적재 제공될 수 있다.
도 6 휴대용 카세트 장치의 예시적이지만 비제한적인 예를 제공한다. 샘플 및 ATPS 용액은 먼저 카세트 장치 상의 샘플 웰에 적재될 수 있다. 웰은 샘플을 적재한 후 카세트에 부착될 수 있는 분리 가능한 성분으로서 설계될 수 있다. 상 분리가 발생한 후, 검출 단계는 LFA 시험 스트립 또는 샘플 웰의 기계적 변위에 의해 개시될수 있다.
도 7 자기 포획 프로브가 휴대용 장치에서 ATPS 및 LFA의 통합을 위해 적용될 수 있는 하나의 구성을 예시한다. 다음에 제시된 장치와 유사하다: 도 4, 예시된 장치는 외부 자석에 의해 수집된 농축된 분석물을 검출 챔버로 수송하기 위해 플런저 및 피스톤 시스템을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 장치는 전력 공급원(예: 전기)을 필요로 하지 않는다.
검출 시간
일부 구현예에서, 장치는 검출 시간을 갖는다. 일부 구현예에서, 검출 시간은 상 분리 시간을 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 시간은 유동 시간을 포함한다.
일부 구현예에서, 검출 시간(예: 장치에 샘플의 적용과 대조군/시험 등에서 표적 분석물의 검출 사이의 시간)은 약 2시간 미만, 약 1.5시간 미만, 약 1시간 미만 또는 약 반시간 미만이다. 일부 구현예에서, 검출 시간은 약 30분 미만, 약 25분 미만, 약 20분 미만, 약 15분 미만, 약 10분 미만 또는 약 5분 미만이다. 일부 구현예에서, 검출 시간은 약 5분 미만, 약 4분 미만, 약 3분 미만, 약 2분 미만 또는 약 1분 미만이다. 일부 구현예에서, 검출 시간은 약 30초 미만, 약 20초 미만 또는 약 10초 미만이다.
일부 구현예에서, 상 분리 시간(예: 제1/제2 상 용액이 ATPS의 혼합 상 용액으로부터분리되는데 걸리는 시간)은 약 2시간 미만, 약 1.5 시간 미만, 약 1시간 미만 또는 약 0.5시간 미만이다. 일부 구현예에서, 검출 시간은 약 30분 미만, 약 25분 미만, 약 20분 미만, 약 15분 미만, 약 10분 미만 또는 약 5분 미만이다. 일부 구현예에서, 상 분리 시간은 약 5분 미만, 약 4분 미만, 약 3분 미만, 약 2분 미만 또는 약 1분 미만이다. 일부 구현예에서, 상 분리 시간은 약 30초 미만, 약 20초 미만 또는 약 10초 미만이다.
일부 구현예에서, 유동 시간(예: 표적 분석물을 함유하는 용액이 샘플 패드로부터 LFA의 시험 라인 및 대조군 라인으로 주행하는데 걸리는 시간)은 약 2시간 미만, 약 1.5시간 미만, 약 1시간 미만 또는 약 0.5시간 미만이다. 일부 구현예에서, 유동 시간은 약 30분 미만, 약 25분 미만, 약 20분 미만, 약 15분 미만, 약 10분미만 또는 약 5분 미만이다. 일부 구현예에서, 검출 시간은 약 5분 미만, 약 4분 미만, 약 3분 미만, 약 2분 미만 또는 약 1분 미만이다. 일부 구현예에서, 유동 시간은 약 30초 미만, 약 20초 미만 또는 약 10초 미만이다.
검출 한계
일부 구현예에서, 장치는 검출 한계를 갖고, 여기서 검출 한계는 검출되기 위해 샘플에 존재해야하는 표적 분석물의 최소량이다.
일부 구현예에서, 샘플 중의 표적 분석물의 최소량은 약 0.01 ng/ml, 약 0.05 ng/ml, 약 0.1 ng/ml, 약 0.15 ng/ml, 약 0.20 ng/ml, 약 0.25 ng/ml, 약 0.3 ng/ml, 약 0.35 ng/ml, 약 0.40 ng/ml, 약 0.45 ng/ml, 약 0.5 ng/ml, 약 0.55 ng/ml, 약 0.60 ng/ml, 약 0.65 ng/ml, 약 0.7 ng/ml, 약 0.75 ng/ml, 약 0.80 ng/ml, 약 0.85 ng/ml, 약 0.9 ng/ml, 약 0.95 ng/ml 또는 약 1 ng/ml이다. 일부 구현예에서, 샘플 중의 표적 분석물의 최소량은 약 1 ng/ml, 약 10 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 100 ng/ml, 약 110 ng/ml, 약 120 ng/ml, 약 130 ng/ml, 약 140 ng/ml, 약 150 ng/ml, 약 160 μg/ml, 약 170 ng/ml, 약 180 ng/ml, 약 190 ng/ml, 약 200 ng/ml, 약 250 ng/ml, 약 300 ng/ml, 약 350 ng/ml, 약 400 ng/ml, 약 450 ng/ml, 약 500 ng/ml, 약 550 ng/ml, 약 600 ng/ml, 약 650 ng/ml, 약 700 ng/ml, 약 750 ng/ml, 약 800 ng/ml, 약 850 ng/ml, 약 900 ng/ml, 약 980 ng/ml 또는 약 1000 ng/ml이다.
일부 구현예에서, 분석물의 최소량은 약 1 μg/ml, 약 2 μg/ml, 약 3 μg/ml, 약 4 μg/ml, 약 5 μg/ml, 약 6 μg/ml, 약 7 μg/ml, 약 8 μg/ml, 약 9 μg/ml, 약 10 μg/ml, 약 11 μg/ml, 약 12 μg/ml, 약 13 μg/ml, 약 14 μg/ml, 약 15 μg/ml, 약 16 μg/ml, 약 17 μg/ml, 약 18 μg/ml, 약 19 μg/ml 또는 약 20 μg/ml이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물의 최소량은 약 10 μg/ml, 약 20 μg/ml, 약 30 μg/ml, 약 40 μg/ml, 약 50 μg/ml, 약 60 μg/ml, 약 70 μg/ml, 약 80 μg/ml, 약 90 μg/ml 또는 약 100 μg/ml이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물의 최소량은 약 10 μg/ml이다.
일부 구현예에서, 표적 분석물의 최소량은 1조당 약 1부, 1조당 약 10부 또는 1조당 약 100부이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물의 최소량은 10억당 약 1부, 10억당 약 10부, 10억당 약 100부, 10억당 약 1000부, 10억당 약 10,000부 또는 10억당 약 100,000부이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물의 최소량은 천당 약 1부, 천당 약 10부 또는 천당 약 100부이다.
일부 구현예에서, 표적 분석물은 세포 상에 존재하거나 세포로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 샘플은 표적 분석물이 검출되는 세포 상에 존재하거나 세포로부터 유래되기 위해 세포의 최소 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 세포의 최소 농도는 샘플 1ml당 약 1 세포, 샘플 1ml당 약 10 세포, 샘플 1ml당 약 20 세포, 샘플 1ml당 약 30 세포, 샘플 1ml당 약 40 세포, 샘플 1ml당 약 50 세포, 샘플 1ml당 약 60 세포, 샘플 1ml당 약 70 세포, 샘플 1ml당 약 80 세포, 샘플 1ml당 약 90 세포 또는 샘플 1ml당 약 100 세포이다.
일부 구현예에서, 세포의 최소 농도는 약 1x100 세포/mL, 약 1x101 세포/mL, 약 1x102 세포/mL, 약 1x103 세포/mL, 약 1x104 세포/mL, 약 1x105 세포/mL, 약 1x106 세포/mL, 약 1x107 세포/mL, 약 1x108 세포/mL 또는 약 1x109 세포/mL이다. 일부 구현예에서, 세포의 최소 농도는 약 1x106 세포/mL이다.
일부 구현예에서, 표적 분석물은 바이러스 입자이고, 바이러스 상에 존재하거나 바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 샘플은 표적 분석물이 검출되는 바이러스 상에 존재하거나 바이러스로부터 유래되도록 바이러스 입자의 최소 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 샘플 중 바이러스 입자의 최소 농도는 약 1x100 pfu/mL, 약 1x101 pfu/mL, 약 1x102 pfu/mL, 약 1x103 pfu/mL, 약 1x104 pfu/mL, 약 1x105 pfu/mL, 약 1x106 pfu/mL, 약 1x107 pfu/mL, 약 1x108 pfu/mL, 약 1x109 pfu/mL, 약 1x1010 pfu/mL, 약 1x1011 pfu/mL 또는 약 1x1012 pfu/mL이다.
일부 구현예에서, 샘플 중 바이러스 입자의 최소 농도는 약 1x106 pfu/mL, 2x106 pfu/mL, 3x106 pfu/mL, 4x106 pfu/mL, 5x106 pfu/mL, 6x106 pfu/mL, 7x106 pfu/mL, 8x106 pfu/mL, 9x106 pfu/mL, 약 1x107 pfu/mL, 약 2x107 pfu/mL, 약 3x107 pfu/mL, 약 4x107 pfu/mL, 약 5x107 pfu/mL, 약 6x107 pfu/mL, 약 7x107 pfu/mL, 약 8x107 pfu/mL, 약 9x107 pfu/mL, 약 1x108 pfu/mL, 약 2x108 pfu/mL, 약 3x108 pfu/mL, 약 4x108 pfu/mL, 약 5x108 pfu/mL, 약 6x108 pfu/mL, 약 7x108 pfu/mL, 약 8x108 pfu/mL, 약 9x108 pfu/mL, 약 1x109 pfu/mL, 약 2x109 pfu/mL, 약 3x109 pfu/mL, 약 4x109 pfu/mL, 약 5x109 pfu/mL, 약 6x109 pfu/mL, 약 7x109 pfu/mL, 약 8x109 pfu/mL, 약 9x109 pfu/mL, 약 1x1010 pfu/mL, 약 2x1010 pfu/mL, 약 3x1010 pfu/mL, 약 4x1010 pfu/mL, 약 5x1010 pfu/mL, 약 6x1010 pfu/mL, 약 7x1010 pfu/mL, 약 8x1010 pfu/mL, 약 9x1010 pfu/mL 또는 약 1x1011 pfu/mL이다. 일부 구현예에서, 샘플 중 바이러스 입자의 최소 농도는 약 1x107 pfu/mL이다. 일부 구현예에서, 샘플 중 바이러스 입자의 최소 농도는 약 1x108 pfu/mL이다. 일부 구현예에서, 샘플 중 바이러스 입자의 최소 농도는 약 1x109 pfu/mL이다.
온도
일부 구현예에서, 물론 온도는 장치 재료의 연소/용해/인화점 이하 및 장치의 성분이 휘발하고 승화하거나 파괴되는 온도 이하 및 검정을 수행할 때 장치의 성분의 어는점 이상이어야 하지만, 장치는 장치 주변의 온도와 무관하게 작동한다. 일부 구현예에서, 장치는 실온에서 작동한다. 일부 구현예에서, 장치는 약 -50℃ 내지 약 60 ℃의 온도에서 작동한다. 일부 구현예에서, 장치는 약 -10℃ 내지 약 45℃의 온도에서 작동한다. 일부 구현예에서, 장치는 약 10℃ 내지 약 30℃의 온도에서 작동한다.
수성 2-상 시스템
(
ATPS)
특정 구현예에서, 장치는 본원에 제공된 이러한 장치를 사용하는 수성 2-상 시스템(ATPS) 방법 및 검정을 지지하기 위해 구성되어 있다. 일부 구현예에서, ATPS는 상 용액을 포함한다. 용어 “상 용액”은 일반적으로 ATPS의 제1 상 용액 또는 제2 상 용액을 의미한다. 일부 구현예에서, 상 용액은 혼합 용액(예를 들면, 제1/제2 상 용액 포함)으로 존재한다. 일부 구현예에서, 상 용액은 그것이 ATPS의 혼합 용액으로부터 분할된 후 제1/제2 상 용액이다. 일부 구현예에서, 상 용액은 그것이 LFA에서 혼합 용액으로부터 분할된 후 제1/제2 상 용액이다. 이는 혼합 상태(예를 들면, 제1 상 용액 포함)로 존재하는 동안 제2 상 용액을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 상 용액은 LFA 중의 리딩 유체이다. 일부 구현예에서, 상 용액은 LFA 중의 지체 유체이다.
일부 구현예에서, ATPS는 초기에 혼합된 두 개의 수용액, 제1 상 용액 및 제2 상 용액(예: 혼합 상 용액)을 포함한다. 일부 구현예에서, 혼합 상 용액은 균질한 용액이다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액 및 제2 상 용액은 비혼화성이다. 일부 구현예에서, 비혼화성은 온도의 변화 및/또는 염과 같은 상이한 성분의 농도의 변화에 의해구동된다. 일부 구현예에서, 제1/제2 상 용액은 미셀, 염 및/또는 중합체와 같은 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, ATPS와 접촉된 표적 분석물은 이의 물리적 및 화학적 특성, 예를 들면, 크기, 형상, 소수성 및 전하에 기초하여 제2 상 용액에 비해 제1 상 용액으로 우선적으로 분배되고 분할되고/되거나 농축되거나, 또는 반대이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물(예: 포유동물 세포, 세균 또는 바이러스의 성분)은 주로 (또는 극도로) ATPS의 제1 또는 제2 상 용액으로 분할되고, 따라서 ATPS에서 농축된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 제1 상 용액과 제2 상 용액 사이의 용적비를 조정함으로써 농축된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 분석물이 분할되는 상의 용적을 감소시킴으로써 농축된다. 예로써, 일부 구현예에서, 표적 분석물은, 분석물이 극도로 분할되는 상의 용적이 총 용적의 1/10이기 때문에, 예를 들면, 제1 상 용액 대 제2 상 용액의 1:9 용적비를 사용함으로써 제1 상 용액에서 10배까지 농축된다.
일부 구현예에서, 다른 농도는 다른 비를 사용함으로써 수득된다. 따라서, 일부 구현예에서, 제1 상 용액 대 제2 상 용액의 비는 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9 및 약 1:10의 비로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액 대 제2 상 용액의 비는 약 1:20, 약 1:30, 약 1:40, 약 1:50, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90 및 약 1:100의 비로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액 대 제2 상 용액의 비는 약 1:200, 약 1:300, 약 1:400, 약 1:500, 약 1:600, 약 1:700, 약 1:800, 약 1:900 및 약 1:1000의 비로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 상 용액 대 제1 상 용액의 비는 약 1:1, 약 1:2, 약 1:3, 약 1:4, 약 1:5, 약 1:6, 약 1:7, 약 1:8, 약 1:9 및 약 1:10의 비로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액 대 제1 상 용액의 비는 약 1:20, 약 1:30, 약 1:40, 약 1:50, 약 1:60, 약 1:70, 약 1:80, 약 1:90 및 약 1:100의 비로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액 대 제1 상 용액의 비는 약 1:200, 약 1:300, 약 1:400, 약 1:500, 약 1:600, 약 1:700, 약 1:800, 약 1:900 및 약 1:1000의 비로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 분석물은 제1 상 용액과 제2 상 용액 사이에 실질적으로 균일하게 분할되어 분석물의 농축을 방지한다. 이러한 시스템에서, 표적 분석물의 농축은 추가의 성분, 예를 들면, 표적 분석물을 포획하는 프로브를 도입함으로써 달성되고, 여기서 프로브는 하나의 상으로 주로 분할되어 농축을 가능하게 하는 표적 분석물의 분할 거동을 향상시킨다. 일부 구현예에서, 농축된 분석물을 함유하는 제1/제2 상 용액을 수집하고, LFA에 적용한다. 이러한 추가의 성분의 사용은 실질적으로 균일한 분할 시스템에 제한되지 않는다. 심지어 분석물이 주로 하나의 상으로 분할되는 경우, 일부 구현예에서, 이러한 분할은 상기한 바와 같은 추가의 성분(예: 프로브)을 사용함으로써 향상되는 것으로 이해된다.
일부 구현예에서, 제1/제2 상 용액은 미셀 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 미셀 용액은 비이온성 계면활성제를 포함한다. 일부 구현예에서, 미셀 용액은 세제를 포함한다. 일부 구현예에서, 미셀 용액은 트리톤-X을 포함한다. 일부 구현예에서, 미셀 용액은 비제한적인 예로써 Igepal CA-630 및 Nonidet P-40와 같은 트리톤-X와 유사한 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 미셀 용액은 본질적으로 트리톤-X로 이루어진다.
일부 구현예에서, 미셀 용액은 약 0.01센티포아즈 내지 약 5000센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 4500센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 4000센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 3500센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 3000센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 2500센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 2000센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 1500센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 1000센티포아즈 또는 약 0.01센티포아즈 내지 약 500센티포아즈의 점도(실온에서, 약 25℃)를 갖는다. 일부 구현예에서, 미셀 용액은 약 0.01센티포아즈 내지 약 450센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 400센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 350센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 300센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 250센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 200센티포아즈, 약 0.01센티포아즈 내지 약 150센티포아즈 또는 약 0.01센티포아즈 내지 약 100센티포아즈의 점도(실온에서, 약 25℃)를 갖는다.
일부 구현예에서, 제1/제2 상 용액은 중합체(예: 중합체 용액)를 포함한다. 특정 구현예에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 다양한 구현예에서, PEG는 1000 내지 100,000의 분자량을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, PEG는 PEG-4600, PEG-8000 및 PEG-20,000, PEG로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 중합체는 폴리프로필렌 글리콜(PPG)이다. 다양한 구현예에서, PPG는 100 내지 10,000의 분자량을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, PPG는 PPG 425로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 중합체는 덱스트란이다. 다양한 구현예에서, 덱스트란은 1000 내지 1,000,000의 분자량을 가질 수 있다. 특정 구현예에서, 덱스트란은 덱스트란 6000, 덱스트란 9000, 덱스트란-35,000 및 덱스트란-200,000으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 중합체 용액은 약 0.01% w/w, 약 0.05% w/w, 약 0.1% w/w, 약 0.15% w/w, 약 0.2% w/w, 약 0.25% w/w, 약 0.3% w/w, 약 0.35% w/w, 약 0.4% w/w, 약 0.45% w/w, 약 0.5% w/w, 약 0.55% w/w, 약 0.6% w/w, 약 0.65% w/w, 약 0.7% w/w, 약 0.75% w/w, 약 0.8% w/w, 약 0.85% w/w, 약 0.9% w/w, 약 0.95% w/w 또는 약 1% w/w인 중합체 용액으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 중합체 용액은 약 1% w/w, 약 2% w/w, 약 3% w/w, 약 4% w/w, 약 5% w/w, 약 6% w/w, 약 7% w/w, 약 8% w/w, 약 9% w/w, 약 10% w/w, 약 11% w/w, 약 12% w/w, 약 13% w/w, 약 14% w/w, 약 15% w/w, 약 16% w/w, 약 17% w/w, 약 18% w/w, 약 19% w/w, 약 20% w/w, 약 21% w/w, 약 22% w/w, 약 23% w/w, 약 24% w/w, 약 25% w/w, 약 26% w/w, 약 27% w/w, 약 28% w/w, 약 29% w/w, 약 30% w/w, 약 31% w/w, 약 32% w/w, 약 33% w/w, 약 34% w/w, 약 35% w/w, 약 36% w/w, 약 37% w/w, 약 38% w/w, 약 39% w/w, 약 40% w/w, 약 41% w/w, 약 42% w/w, 약 43% w/w, 약 44% w/w, 약 45% w/w, 약 46% w/w, 약 47% w/w, 약 48% w/w, 약 49% w/w 및 약 50% w/w인 중합체 용액으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 중합체 용액은 약 10% w/w, 약 20% w/w, 약 30% w/w, 약 40% w/w, 약 50% w/w, 약 60% w/w, 약 70% w/w, 약 80% w/w 또는 약 90% w/w인 중합체 용액으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 중합체 용액은 약 10% w/w 내지 약 80% w/w인 중합체 용액으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 중합체 용액은 약 10% w/w 내지 약 25% w/w인 중합체 용액으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1/제2 상 용액은 염을 포함한다(예를 들면, 제1/제2 상 용액은 염 용액이다). 일부 구현예에서, 표적 분석물 및/또는 프로브-분석물 복합체는 염 용액으로 분할된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물 및/또는 프로브-분석물 복합체는 염 용액으로 분할되고, 여기서 염용액은 코스모트로픽 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 분석물 및/또는 프로브-분석물 복합체는 염 용액으로 분할되고, 여기서 염용액은 카오트로픽 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 염은 마그네슘 염, 리튬 염, 나트륨 염, 칼륨 염, 세슘 염, 아연 염 및 알루미늄염으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 브로마이드 염, 요오디드 염, 플루오라이드 염, 카보네이트 염, 설페이트 염, 시트레이트 염, 카복실레이트 염, 보레이트 염 및 포스페이트 염으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염은 인산칼륨이다. 일부 구현예에서, 염은 황산알루미늄이다.
일부 구현예에서, 염 용액은 약 0.01% w/w, 약 0.05% w/w, 약 0.1% w/w, 약 0.15% w/w, 약 0.2% w/w, 약 0.25% w/w, 약 0.3% w/w, 약 0.35% w/w, 약 0.4% w/w, 약 0.45% w/w, 약 0.5% w/w, 약 0.55% w/w, 약 0.6% w/w, 약 0.65% w/w, 약 0.7% w/w, 약 0.75% w/w, 약 0.8% w/w, 약 0.85% w/w, 약 0.9% w/w, 약 0.95% w/w 또는 약 1% w/w인 염 용액으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염 용액은 약 1% w/w, 약 2% w/w, 약 3% w/w, 약 4% w/w, 약 5% w/w, 약 6% w/w, 약 7% w/w, 약 8% w/w, 약 9% w/w, 약 10% w/w, 약 11% w/w, 약 12% w/w, 약 13% w/w, 약 14% w/w, 약 15% w/w, 약 16% w/w, 약 17% w/w, 약 18% w/w, 약 19% w/w, 약 20% w/w, 약 21% w/w, 약 22% w/w, 약 23% w/w, 약 24% w/w, 약 25% w/w, 약 26% w/w, 약 27% w/w, 약 28% w/w, 약 29% w/w, 약 30% w/w, 약 31% w/w, 약 32% w/w, 약 33% w/w, 약 34% w/w, 약 35% w/w, 약 36% w/w, 약 37% w/w, 약 38% w/w, 약 39% w/w, 약 40% w/w, 약 41% w/w, 약 42% w/w, 약 43% w/w, 약 44% w/w, 약 45% w/w, 약 46% w/w, 약 47% w/w, 약 48% w/w, 약 49% w/w 및 약 50% w/w인 염 용액으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염 용액은 약 0.1% w/w to 약 10%인 염 용액으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 염 용액은 약 1% w/w to 약 10%인 염 용액으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1/제2 상 용액은 물과 비혼화성인 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 비극성 유기 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 오일을 포함한다. 일부 구현예에서, 용매는 펜탄, 사이클로펜탄, 벤젠, 1,4-디옥산, 디에틸 에테르, 디클로로메탄, 클로로포름, 톨루엔 및 헥산으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제1 상 용액은 미셀 용액을 포함하고, 제2 상 용액은 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액은 미셀 용액을 포함하고, 제1 상 용액은 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 미셀 용액을 포함하고, 제2 상 용액은 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액은 미셀 용액을 포함하고, 제1 상 용액은 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 미셀 용액은 트리톤-X 용액이다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 제1 중합체를 포함하고, 제2 상 용액은 제2 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1/제2 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 중합체를 포함하고, 제2 상 용액은 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액은 중합체를 포함하고, 제1 상 용액은 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 제2 상 용액은 인산칼륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액은 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 제1 상 용액은 인산칼륨을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 염을 포함하고, 제2 상 용액은 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 코스모트로픽 염을 포함하고, 제2 상 용액은 카오트로픽 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액은 코스모트로픽 염을 포함하고, 제1 상 용액은 카오트로픽 염을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 상 용액은 표 1의 성분 1로부터 선택되고, 제2 상 용액은 표 1의 성분 2로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액은 표 1의 성분 1로부터 선택되고, 제2 상 용액은 표 1의 성분 2로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 표 1의 성분은 완충제에 현탁되거나 용해된다. 일부 구현예에서, 표 1의 성분은 샘플이 유래된 생물학적 시스템에 적합한 완충제에 현탁되고/용해된다. 일부 구현예에서, 표 1의 성분은 생리 식염수 용액에 현탁되고/용해된다. 일부 구현예에서, 표 1의 성분은 PBS에 현탁되고/용해된다. 일부 구현예에서, 표 1의 성분은 물에 현탁되고/용해된다.
표 1. 예시적인 수성 이상 추출 시스템
일부 구현예에서, 장치는 ATPS와 접촉되어 배치되도록 구성된 수집기를 추가로 포함하고, 여기서 표적 분석물은 수집기와 제1 상 용액 및/또는 제2 상 용액의 계면에서 분할된다. 일부 구현예에서, 수집기는 플라스틱, 메조다공성 재료, 실리카, 폴리프로필렌, 자석, 자기 입자, 상자성 입자, 세공을 갖는 재료, 홈이 있는 재료 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 재료를 포함한다. 일부 구현예에서, 수집기는 폴리프로필렌을 포함한다. 일부 구현예에서, 수집기는 표적 분석물 수집을 증가시키도록 최적화된다. 일부 구현예에서, 수집기는 표면적을 최대화하기 위한 세공을 포함한다. 일부 구현예에서, 세공의 너비는 약 1 μm, 약 5 μm, 약 10 μm, 약 15 μm, 약 20 μm, 약 25 μm, 약 30 μm, 약 35 μm, 약 40 μm, 약 45 μm, 약 50 μm, 약 55 μm, 약 60 μm, 약 65 μm, 약 70 μm, 약 75 μm, 약 80 μm, 약 85 μm, 약 90 μm, 약 95 μm 또는 약 100 μm이다. 일부 구현예에서, 세공의 너비는 약 100 μm, 약 200 μm, 약 300 μm, 약 400 μm, 약 500 μm, 약 600 μm, 약 700 μm, 약 800 μm, 약 900 μm 또는 약 1mm이다. 일부 구현예에서, 세공의 깊이는 약 1 μm, 약 5 μm, 약 10 μm, 약 15 μm, 약 20 μm, 약 25 μm, 약 30 μm, 약 35 μm, 약 40 μm, 약 45 μm, 약 50 μm, 약 55 μm, 약 60 μm, 약 65 μm, 약 70 μm, 약 75 μm, 약 80 μm, 약 85 μm, 약 90 μm, 약 95 μm 또는 약 100 μm이다. 일부 구현예에서, 세공의 깊이는 약 100 μm, 약 200 μm, 약 300 μm, 약 400 μm, 약 500 μm, 약 600 μm, 약 700 μm, 약 800 μm, 약 900 μm 또는 약 1mm이다.
측방 유동 검정(LFA)
특정 구현예에서, 본원에 기재된 장치 및 시스템은 샘플에서 표적 분석물을 검출하기 위한 측방유동 검정(LFA)를 제공하기 위해 구성되어 있고, 여기서 LFA는 수성 2-상 시스템(ATPS)과 함께 사용된다. 일부 구현예에서, LFA는 ATPS 또는 이의 성분이 배치되어 있는 다공성 매트릭스를 포함하고, 여기서 다공성 매트릭스는 ATPS 또는 이의 성분이 유체 상에 존재할 때 ATPS 또는 이의 성분이 다공성 매트릭스를 통해 유동하도록 하기 위해 구성되어 있거나 또는 유동하도록 하기에 충분한 다공성을 갖는다. 이러한 다공성 LFA 장치는 본원에서 종이 또는 종이 유체 장치로서 칭명되고, 이들 용어는 상호교환적으로 사용된다. 상기 주시된 바와 같이, 본원에 사용된 종이는, 특정 구현예에서, 본원에 기재된 LFA 장치에서 이러한 종이의 사용이 예상되지만, 목재 펄프 또는 다른 섬유상 식물 물질로부터의 박판에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 다공성 매트릭스는 ATPS의 혼합 상 용액, 제1 상 용액 및/또는 제2 상 용액, 및/또는 표적 분석물이 LFA를 통해 유동하도록 하기에 충분히 다공성이다. 일부 구현예에서, 다공성 매트릭스는 혼합 상 용액, 제1 상 용액 및/또는 제2 상 용액, 및/또는 표적 분석물이 LFA를 통해 수직으로 및/또는 수평으로 유동하기에 충분히 길고/길거나 충분히 깊다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 제1 속도로 다공성 매트릭스를 통해 유동하고, 제2 상 용액은 제2 속도로 다공성 매트릭스를 통해 유동하고, 여기서, 제1 속도 및 제2 속도는 상이하다. 일부 구현예에서, LFA 다공성 매트릭스는 소결된 유리 세라믹, 광물, 셀룰로즈, 유리 섬유, 니트로셀룰로즈, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 나일론, 전하 변형된 나일론, 폴리에테르설폰 및 이들의 조합으로부터 선택된 재료를 포함한다.
유동에 따른 농축물
ATPS에서 사전 상 분리는 정체 조건하에 수행되었다. 그러나, 본 발명자들은 최근에 ATPS가 용액이 본 발명자들이 “유동에 따른 농축물”로서 칭명한 종이를 통해 유동할 때 상 분리할 수 있음을 발견하였다. 이 발견은 종이가 농축 공정을 상당히 촉진시키는 것으로 발견되었기 때문에 흥미롭고 재미있었다. 이 중요한 현상에 기초하여, 본 발명자들은 조합된 ATPS 및 LFA 진단을 위한 필요 성분을 완전히통합하기 위해 종이 유체 장치를 설계했다. 상이한 조건하에 상이한 유형의 종이를 통해 유동할 때 ATPS를 조사하는 것은 더 복잡한 종이 유체 검출 장치를 개발하도록 하는데 중요했다. 본 발명자들은 중합체-염 ATPS 및 미셀 ATPS와 같은 상이한 ATPS를 사용하는 본 실험 데이터로부터, 균일한 ATPS 용액을 특정 종이 재료에 적용할 때, 상 분리 및 분석물 농축이 용액을 유동할 때 발생한다는 것을 알 수 있다. 본 발명자들은 또한, 이 현상이 심지어 가변적인 용적비, 예를 들면, 하부 상의 용적으로 나누어진 상부 상의 용적을 갖는 ATPS를 제조할 때 보존된다는 것을 입증했다(참조: 에를 들면, 도 12).
일부 구현예에서, LFA는 종이를 포함한다. 일부 구현예에서, 종이는 유체가 그것을 통해 유동하도록 하는 다공성 재료의 시트를 포함한다. 일부 구현예에서, 종이는 유체가 그것을 통해 유동하도록 하는 다공성 재료의 복수의 시트를 포함한다. 일부 구현예에서, 종이는 셀룰로즈, 유리 섬유, 니트로셀룰로즈, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 전하변형된 나일론, 폴리에테르 설폰 등으로부터 선택된 재료를 포함한다. 일부 구현예에서, 종이는 HI-FLOW PLUS® 멤브레인이다.
일부 구현예에서, 종이는 엮은 종이이다. 일부 구현예에서, 종이는 와트만지이다. 일부 구현예에서, 와트만지는 와트만 S17, 와트만 MF1, 와트만 VF1, 와트만 융합 5, 와트만 GF/DVA, 와트만 LF1, 와트만 CF1 및 와트만 CF4로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 종이는, 표적 분석물이 LFA(예: ‘유동에 따른 농축물’-기반 장치)를 통해 유동할 때 표적 분석물을 농축시킨다. 일부 구현예에서, 종이는 표적 분석물이 LFA를 통해 수평으로 유동할 때 표적 분석물을 농축시킨다. 일부 구현예에서, 종이는 표적 분석물이 LFA를 통해 수직으로 유동할 때 표적 분석물을 농축시킨다. 일부 구현예에서, 종이는 표적 분석물이 중력에 기인하여 LFA를 통해 수직으로 유동할 때 표적 분석물을 농축시킨다. 일부 구현예에서, 종이는 표적 분석물이 모세관 작용에 기인하여 LFA를 통해 수직으로 유동할 때표적 분석물을 농축시킨다. 일부 구현예에서, 종이는 상 용액이 “리딩 유체”가 되는 것에 영향을 미치는 특성을 갖는다. 비제한적인 예로써, PEG-염 ATPS를 사용할 때, 용액을 유리 섬유 종이에 첨가하는 것은 염 상이 리딩 용액이 되도록 하는 반면, 셀룰로즈 종이를 사용하는 것은 PEG 상이 리딩 용액이 되도록 한다. 일부 구현예에서, 종이 내에서 상 분리는 상 분리를 가속화한다. 또한, 비제한적인 예로써, 미셀 ATPS는 전형적으로 정치 ATPS에서 상을 분리하는데 수시간이 소요되지만, 종이 스트립에 적용되는 경우, 이 상 분리는 수분에 발생한다. 이는 전통적으로 공정에서 속도 결정 단계인 ATPS를 당해 신속한 종이 진단 검정을 위한 보다 현실적인 옵션이 되도록 함으로써 진단 공정을 가속화한다. 일부 구현예에서, ‘유동에 따른 농축물’ 장치는 PEG-염 ATPS을 포함한다. 일부 구현예에서, ‘유동에 따른 농축물’ 장치는 미셀 ATPS를 포함한다. 일부 구현예에서, ‘유동에 따른 농축물’ 장치의 LFA는 유리 섬유 종이를 포함한다. 일부 구현예에서, ‘유동에 따른 농축물’ 장치의 LFA는 니트로셀룰로즈 종이를 포함한다.
일부 구현예에서, LFA는 다음을 포함한다: 혈액 세포 또는 다른 입자를 제거하는 필터; 표적 분석물을 포함하는 샘플이 LFA에 적용되는 샘플 패드, 표적 분석물이 결합하고 검출되는 검출 영역(예: 시험 라인 및 대조군 라인) 및 LFA에 적용된 과량의 샘플 및/또는 용액을 흡수하는 흡수 패드(예: 건조 수신지)(참조: 예를 들면, 도 1 상부). 일부 구현예에서, 대조군 라인 및/또는 시험 라인은 자체가 라인이 아니라 영역 또는 반점이다.
일부 구현예에서, LFA는 LFA 스트립을 포함한다. 용어 “LFA” 및 “LFA 스트립”은 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, LFA 스트립은 이의 너비 및 깊이보다 더 큰 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, LFA는 직사각형이다. 일부 구현예에서, LFA는 원형, 타원형, 사각형, 다각형 및 불규칙한 형상으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 형상을 갖는다. 일부 구현예에서, LFA는 복수의 루트 및/또는 접합부를 포함한다. 일부 구현예에서, LFA 스트립은 샘플 패드, 검출 영역 및 흡수 패드를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출 영역은 샘플과 흡수 패드 사이에 배치되고, 흡수 패드는 샘플을 샘플 패드로부터 검출 영역을 향해 떨어져 있는 표적 분석물로 위킹(wicking)한다.
샌드위치 검정
일부 구현예에서, LFA는 샌드위치 검정을 제공하거나 실행하도록 구성되어 있다(참조: 예를들면, 도 1, 하부 좌측). 일부 구현예에서, 샌드위치 검정은 표적 분석물에 결합하는 포획 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 장치는 프로브를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브는 검출가능한 특성(비색, 형광, 방사성 등)을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브는 표적 분석물과 상호작용하는 결합 잔기(예: 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브를 샘플에 첨가하고, 프로브-분석물 복합체를 형성하기 위해 표적 분석물에 결합한다. 일부 구현예에서, 프로브-분석물 복합체는 샘플 패드에 적용되고, 흡수 패드를 통해 LFA를 통해 유동한다. 일부 구현예에서, 프로브-분석물 복합체의 표적 분석물은 포획 잔기에 결합한다. 일부 구현예에서, 포획 잔기는 시험 라인에 고정되고, 프로브-분석물 복합체는 시험 라인에서 고정된다. 일부 구현예에서, 프로브는 비색적이고, 시험 라인은 프로브-분석물 복합체가 시험 라인에서 축적될 때 강한 색상(예: 검출가능한 신호)을 나타내어 양성 결과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 샘플에는 어떤 표적 분석물도 존재하지 않고, 프로브-분석물 복합체의 프로브는 포획 잔기와 상호작용하지 않고, 시험 라인의 부재는 음성 결과를 나타낸다. 일부 구현예에서, LFA는 프로브 및/또는 결합 잔기와 직접 상호작용하는 대조군 라인 상에서 프로브 포획 잔기를 포함하고, 따라서, 샘플에 표적 분석물의 존재와 무관하게, 프로브/결합 잔기는 프로브 포획 잔기에 결합하고 대조군 라인 위에 축적된다. 일부 구현예에서, 프로브 포획 잔기는 결합 잔기에 결합하는 2차 항체이고, 여기서 결합 잔기는 표적 분석물에 결합하는 1차 항체이다. 일부 구현예에서, 프로브는 고정화되고 대조군 라인에서 검출되어 유효 시험을 나타낸다. 일부 구현예에서, 양성 결과(예를 들면, 표적 분석물이 샘플에 존재한다)는 시험 라인 및 대조군 라인에서 검출가능한 신호에 의해 나타난다. 일부 구현예에서, 음성 결과는 대조군 라인에서 검출가능한 신호에 의해 나타난다.
경쟁 검정
일부 구현예에서, LFA는 경쟁 검정을 제공하도록 구성되어 있다(참조: 예를 들면, 도 1, 하부 우측). 일부 구현예에서, 프로브를 샘플에 첨가하고, 프로브-분석물 복합체를 형성하기 위해 표적 분석물에 결합한다. 일부 구현예에서, LFA는 시험 라인에 고정된 표적 분석물을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브는 샘플 중의 표적 분석물에 의해 포화되고, 프로브는 시험 라인에 고정된 표적 분석물에 결합하지 않는다. 일부 구현예에서, 시럼 라인 위에 검출가능한 신호의 부재는 양성 결과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 샘플 중에 어떤 표적 분석물도 존재하지 않고, 프로브는 시험 라인 위의 표적 분석물에 결합하여 음성 결과는 나타낸다. 일부 구현예에서, LFA는 프로브와 직접 상호작용하는 대조군 라인에 프로브 포획 잔기를 포함하고, 샘플 중 표적 분석물의 존재와 무관하게, 프로브는 프로브 포획 잔기에 결합하고 대조군 라인에 축적된다. 일부 구현예에서, 프로브는 고정화되고 대조군 라인에서 검출되어 유효 시험을 나타낸다. 일부 구현예에서, 양성 결과(예를 들면, 표적 분석물이 샘플에 존재한다)는 시험 라인에서 검출가능하지 않는 신호에 의해, 대조군 라인에서 감출가능한 신호에 의해 나타난다. 일부 구현예에서, 음성 결과는 시험 라인 및 대조군 라인 둘 다에서 검출가능한 신호에 의해 나타난다.
웰
일부 구현예에서, 샘플 패드는 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, 웰은 적어도 ATPS의 일부, 적어도 제1 상 용액의 일부, 적어도 제2 상 용액의 일부, 표적 분석물의 재현탁된 용액 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용액을 함유하기에 충분한 용적을 갖는다.
특정 구현예에서, 웰의 용적은 약 1 μL 내지 약 10 μL의 범위이다. 특정 구현예에서, 웰의 용적은 약 1 μL 내지 약 100 μL의 범위이다. 특정 구현예에서, 웰의 용적은 약 1 μL 내지 약 1000 μL의 범위이다. 특정 구현예에서, 웰의 용적은 약 1 μL 내지 약 5000 μL의 범위이다. 특정 구현예에서, 웰의 용적은 약 1 mL 내지 약 10 mL의 범위이다. 특정 구현예에서, 웰의 용적은 약 1 mL 내지 약 100 mL의 범위이다. 특정 구현예에서, 웰의 용적은 약 1 mL 내지 약 1000 mL의 범위이다.
일부 구현예에서, 재현탁된 용액은 ATPS로부터 농축된/추출된 표적 분석물을 재현탁시키기 위한완충제를 포함한다.
일부 구현예에서, 웰은 LFA의 코너, 말단, 중앙, 접합부, 오프-센터 및 굴곡부로부터 선택된 LFA의위치에 배치된다. 일부 구현예에서, 웰은 염 패드, 프로브 패드, 중합체 패드 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나이상의 패드를 포함한다. 일부 구현예에서, 웰은 복수의 패드를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1/제2 상 용액은 그것이 복수의 패드를 통해 유동할 때 분리되고/되거나 표적분석물은 농축된다. 일부 구현예에서, 제1/제2 상 용액은 그것이 복수의 패드를 통해 수직으로 유동할 때 분리되고/되거나 표적 분석물은 농축된다. 일부 구현예에서, 제1/제2 상 용액은 그것이 중력으로 인해 복수의 패드를 통해 수직으로 유동할때 분리되고/되거나 표적 분석물은 농축된다. 일부 구현예에서, 제1/제2 상 용액은 그것이 모세관 작용에 기인하여 복수의 패드를 통해 수직으로 유동할 때 분리되고/되거나 표적 분석물은 농축된다. 일부 구현예에서, 웰은 종이 웰이다. 일부 구현예에서, 종이 웰은 LFA에 사용된 전형적인 종이 스트립과 비교하여 보다 큰 용적의 샘플을 유지하는 3차원 종이 구조이다. 일부 구현예에서, 종이 웰은 상 분리가 발생하고 리딩 유체에서 후속적인 분석물 농축을 가능하게 하는 종이 재료로 구성된다. 일부 구현예에서, 리딩 유체의 유동은 분석물 검출을 가능하게 하는 흡수 패드를 향해 유도된다(참조: 예를 들면, 도 13).
일부 구현예에서, 장치는 웰 중의 중력을 사용하는 유동 및 거시적 상 분리를 추가로 촉진하면서 “유동할 때 농축” 메커니즘을 사용한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액 및 제2 상 용액이 상 용액의 점도차 뿐만 아니라 종이 재료에 대한 친화성의 차이에 기인하여 상이한 속도로 유동할 수 있기 때문에, 웰은 상 분리를 촉진시키기에 충분한 단면적을 제공한다. 일부 구현예에서, 웰은, 상 용액(들)이 웰을 통해 이동하여 리딩 유체에 나타날 때 상 분리 및/또는 표적 분석물의 농축을 향상시키거나 촉진시킨다. 일부 구현예에서, LFA 시험 스트립은 하류 위치에서 웰에 직접 접속되고, 따라서, 리딩 유체 중의농축된 분석물은 먼저 LFA 스트립과 접촉되고, 검출 단계는 농축 공정과 동시에 발생하여 추가로 총 검정 시간을 감소시킨다.
일부 구현예에서, LFA는 복수의 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, LFA는 혼합 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, LFA는 농축 웰을 포함한다. 일부 구현예에서, ATPS는 상 분리 및/또는 표적 분석물의 농축이 발생하는 농축 웰에 적용된다. 일부 구현예에서, 농축된 분석물은 상 분리 후 웰로부터 제거되고 농축 웰에 적용된다. 일부 구현예에서, 농축 웰은 농축 웰 및/또는 LFA에서 상 분리를 향상시키고/촉진시키는 작동 완충제를 포함한다(참조: 예를 들면, 도 14).
일부 구현예에서, 장치는 다공성 매트릭스 내 및/또는 위에 웰의 내용물을 방출시키기 위한 작동기를 포함한다. 일부 구현예에서, 작동기는 웰을 천공시키기 위한 메커니즘을 포함한다.
LFA 중의 탈수된 ATPS
일부 구현예에서, ATPS 또는 이의 성분은 적어도 다공성 매트릭스의 제1 부분 위 및/또는 내에서 탈수된다. 일부 구현예에서, 샘플을 장치에 적용하면 ATPS를 수화시켜 ATPS 또는 이의 성분을 유체 상으로 변환시킨다. 탈수는 사용자가 단지 샘플(예: 타액)을 장치에 첨가하는 것을 필요로 할 때 장치를 보다 사용자 친화적으로 만들 수 있다. 일부 구현예에서, 사용자는 단지 표적 분석물의 존재/부재를 검출하기 위해 샘플의 용액을 스트림에 적용해야 한다. 일부 구현예에서, 샘플의 용액은 LFA를 통해 유동하고, ATPS는 재가용화되어 LFA 내의 상 분리 및 표적 분석물의 후속적 농축을 유발한다(참조: 예를 들면, 도 15).
일부 구현예에서, 소정의 ATPS에 필요한 모든 성분은 균일한 용액을 형성하기 위해 혼합하고, 종이에 적용한 다음, 탈수시킨다. 샘플 용액이 탈수된 종이 스트립에 첨가되는 경우, ATPS 성분은 샘플이 유동할 때 재수화되어 상분리를 유도한다. 농축된 분석물을 함유하는 상이 덜 점성이고, 잠재적으로 중합체 또는 미셀을 덜 함유하는 일부 ATPS에서, 그 상은 보다 신속하게 유동하고, 농축된 분석물은 리딩 유체에서 나타나고, 검출을 개시하기 위해 LFA에 도달한다. 추가로, 탈수된 ATPS 성분 세그먼트 길이 및 농도는 상이한 적용을 위해 조정될 수 있다.
일부 구현예에서, ATPS는 LFA 상에서 탈수된다. 일부 구현예에서, 제1 ATPS 성분은 LFA 상에서 탈수된다. 일부 구현예에서, 제2 ATPS 성분은 LFA를 탈수시킨다. 일부 구현예에서, 혼합 상 용액은 LFA 상에서 탈수된다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액 성분 및/또는 제1 ATPS 성분은 LFA의 제1 부분 위에서 탈수된다. 일부 구현예에서, 제2 상 용액 성분 및/또는 제2 ATPS 성분은 LFA의 제2 부분 위에서 탈수된다. 일부 구현예에서, 제1 부분 및 제2 부분은 동일하다. 일부 구현예에서, 제1 부분 및 제2 부분은 상이하다. 비제한적인 예로써, PEG-염 ATPS에서, PEG 및 염 용약은 상이한 종이 부분 또는 세그먼트에서 별도로 탈수된다(참조: 예를 들면, 도 16). 일부 구현예에서, LFA의 상이한 부분 위에서 제1/제2 상 용액 및/또는 ATPS 성분을 탈수시키면제1/제2 상 용액 성분 또는 ATPS 성분의 보다 균일한 농도를 제공한다. 일부 구현예에서, 상이한 부분 위에서 제1/제2 상 용액 성분 및/또는 ATPS 성분을 탈수시키면제1 상 용액 또는 ATPS 성분이 수화 후 제1 방향으로 유동하고 제2 상 용액 및/또는 ATPS 성분이 수화 후 제2 유동 방향으로 유동하도록 하고, 여기서 제1 방향 및 제2 방향은 상이하다. 일부 구현예에서, 표적 생성물은 제2 방향에서가 아니라 제1 방향에서 농축된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 제1 방향에서가 아니라 제2 방향에서 농축된다. 일부 구현예에서, 상이한 부분 위에서 제1/제2 상 성분 및/또는 ATPS 성분을 탈수시키면 샘플을제1/제2 방향으로 유동시킬 필요 없이 표적 분석물이 제1/제2 방향으로 유동하도록 한다(참조: 예를 들면, 도 16d, 16e, 및 17). 일부 구현예에서, 상이한 부분 위에서 제1/제2 상성분및/또는 ATPS 성분을 탈수시키면 표적 분석물이 보다 신속하게 유동하도록 하여 보다 빨리 검출을 유도한다. 일부 구현예에서, 상이한 부분 위에서 제1/제2 상 성분 및/또는 ATPS 성분을 탈수시키면 증가된결과 신뢰성을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 상이한 부분 위에서 제1/제2 상 성분 및/또는 ATPS 성분을 탈수시키면 제1/제2 상 용액 성분 및/또는 ATPS 성분(예: 의 응집을 방지한다 PEG-염 ATPS). 일부 구현예에서, 제1/제2 상 성분 및/또는 ATPS 성분은 복수의 세그먼트에서 탈수된다. 일부 구현예에서, 제1/제2 상 성분 및/또는 ATPS 성분은 복수의 세그먼트에서 탈수되고, 여기서 제1/제2 상 성분 및/또는 ATPS 성분은 염 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1/제2 상 성분 및/또는 ATPS 성분은 복수의 세그먼트에서 탈수되고, 제1/제2 상 성분 및/또는 ATPS 성분은 소수성 중합체(예: 를 포함하지 않는다 PEG). 일부 구현예에서, 탈수된 PEG는 PEG 풍부 상이 검출 멤브레인 내에서 유동을 늦추기 때문에 검출 영역 주위에 위치되지 않는다(참조: 예를 들면, 도 64). 일부 구현예에서, LFA 스트립은 PEG 또는 염을 함유하지 않는 검출 영역 근처에 블랭크 스페이서를 포함한다(참조: 예를 들면, 도 65).
일부 구현예에서, 프로브는 프로브 완충제에 제공된다. 일부 구현예에서, 프로브 완충제는 LFA 상에서 탈수된다. 일부 구현예에서, LFA는 프로브 및 탈수된 프로브 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브 완충제는 LFA를 통해 프로브-분석물 복합체의 유동을 개선시킨다.
일부 구현예에서, ATPS 성분을 탈수시키면 ATPS 성분이 액체 형태로 첨가되는 장치와 비교하여 검출 한계를 개선시킨다. 일부 구현예에서, 액체 형태 ATPS 성분의 첨가는 환자로부터 샘플 용액을 희석시킨다. 일부 구현예에서, ATPS 성분을 탈수하면 유동 동안 별개의 제1 상 용액 및/또는 별개의 제2 상 용액이 개발되도록 하여 시험 라인 및 대조군 라인에 도달하는 리딩 유체의 전면에서 표적 분석물 또는 프로브-분석물 복합체를 작은 용적으로 농축시킨다. 일부 구현예에서, 리딩 유체의 전면에서 표적 분석물 및/또는 프로브-분석물 복합체는 검출에 필요한 시간을 감소시킨다.
LFA 설계/구조
일부 구현예에서, LFA 스트립은 제1 말단으로부터 제2 말단으로 변하지 않는 너비를 갖는다. 일부 구현예에서, 너비는 LFA 내에서 길이의 평면에서 유동 방향에 수직인 치수로서 정의된다. 일부 구현예에서, LFA 스트립의 제1 부분은 제1 너비를 갖고, LFA 스트립의 제2 부분은 제2 너비를 갖고, 여기서 제1 너비 및 제2 너비는 상이하다. 일부 구현예에서, 제1 너비는 제2 너비보다 큰 반면, 다른 구현예에서 제1 너비는 제2 너비보다작다. 특정 구현예에서, LFA 스트립은 2개 이상의 너비를 포함하고, 예를 들면, 스트립은 연속적으로 협소할 수 있거나 3개 이상의 위치에서 점진적 협소화를 나타낼 수 있다는 것이 예상된다. 일부 구현예에서, 제1 부분은 샘플 패드를 포함하고, 제2 부분은 검출 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 부분은 탈수된 프로브 완충제를 포함하고, 제2 부분은 검출 영역을 포함한다(참조: 예를 들면, 도 62). 제1 부분이 탈수된 프로브 완충제를 포함하고 제2 부분이 검출 영역을 포함하는 일부 구현예에서, 검출 한계는 LFA 스트립에 비해 향상되고, 여기서 샘플 패드를 포함하는 부분의 너비는 검출 영역을 포함하는 부분과 동일한 너비이다. 일부 구현예에서, 보다 넓은 샘플 패드 세그먼트는 샘플 중의 더 많은 표적 분석물이 LFA 스트립의 너비가 변하지 않는 LFA 스트립에 비해 프로브에 결합하도록 한다. 일부 구현예에서, 보다 넓은 샘플 패드 세그먼트는 더 큰 용적의 샘플, 따라서 더 많은 표적 분석물이 LFA 스트립의 너비가 변하지 않는 LFA 스트립에 비해 프로브에 결합하도록 한다. (참조: 예를 들면, 도 63).
일부 구현예에서, LFA는 슬로프(예: LFA의 길이에 따라 LFA의 깊이의 변화)를 포함한다. LFA가 슬로프를 포함하지 않는 일부 구현예에서, 프로브-분석물 복합체의 일부는 샘플 패드에 잔류된다. LFA가 슬로프를 포함하는 일부 구현예에서, 슬로프를 갖지 않는 LFA보다 더 많은 프로브 분석물 복합체가 LFA를 통해 유동한다(참조: 예를 들면, 도 66).
일부 구현예에서, LFA는 프로브/프로브 완충제를 비교적 빠른 속도로 재가용화시키는 것에 비해, 샘플이 프로브 상에서 결합 부위를 보다 완전히 포화시키기 위해 큰 용적을 갖도록 하는 것을 프로브가 가능하게 하도록 비교적 느린 속도로 재가용화된 탈수된 프로브 및/또는 프로브 완충제를 포함하는 부분을 포함하여 경쟁 검정에서 향상된 검출 한계를 유도한다. 일부 구현예에서, 탈수된 ATPS 또는 이의 성분은 프로브 및 표적 분석물이 ATPS 또는 이의 성분에 도달하기 전에 서로 결합하는 시간을 제공하기 위해 탈수된 프로브 및/또는 프로브 완충제를 포함하는 부분으로부터 하류에 배치된다. 일부 구현예에서, ATPS (성분)은 프로브-분석물 복합체를 보다 작은 용적으로 농축시킨다. 일부 구현예에서, 보다 작은 용적은 다른 구현예에서보다 시험 및 대조군 라인에 대해 유동하는많은 프로브-분석물 복합체를 함유하고, 여기서 프로브-분석물 복합체의 모두가 큰 용적에 대해 분포되기 때문에 시험 및 대조군 라인에 도달하는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 장치의 감도 및/또는 신뢰성은 프로브-분석물 복합체를 보다 적은 리딩 상으로농축시킴으로써 증가된다. 일부 구현예에서, 검출 시간은 프로브-분석물 복합체를 보다 적은 리딩 상으로 농축시킴으로써 감소된다. 참조: 예를 들면, 도 67, 이는 PEG/염 ATPS를 사용하는 하나의 가능한 설계의 다이아그램을 도시한다.
일부 구현예에서, LFA는 다음에 도시된 구조에 따라서 구성되어 있다: 도 16. 일부 구현예에서, LFA는 다음에 도시된 구조에 따라서 구성되어 있다: 도 20. 일부 구현예에서, LFA는 다음에 도시된 구조에 따라서 구성되어 있다: 도 62-70.
일부 구현예에서, LFA는 자기/상자성 입자를 포함하거나 이들과 복합체화되는 프로브와 함께 사용되도록 설계되어 있다. 일부 구현예에서, LFA는 ATPS 제1 및 제2 상 용액의 유동을 분할하기 위해 사용된 종이 스트립의 말단에서 포크와 함께 종이 스트립을 포함한다. 일부 구현예에서, LFA 검출 영역은 포크의 갈래에 위치되고, 자석은 갈래 근처 또는 갈래에 위치된다(참조: 예를 들면, 도 20). 자석은 진단 감도의 증가를 유도하는 LFA 검출 영역으로 유동하는 유체에서 프로브/프로브-분석물 복합체를 농축시킨다. 반대로, 일부 구현예에서, 프로브는 자석 또는 자기장을 포함하고, 장치는 갈래 부근 또는 갈래에위치되어 있는 자기 입자 또는 상자성 입자를 포함한다.
일부 구현예에서, LFA는 3D 구조를 포함한다. 일부 구현예에서, LFA는 3D 구조를 유도하는 다공성 매트릭스의 층을 포함한다. 일부 구현예에서, 3D 구조는 ATPS를 LFA와 통합시킨다. 일부 구현예에서, ATPS는 긴 상 분리 시간을 갖고(예: 미셀 ATPS), 상 분리 시간은 3D 구조를 사용함으로써(예를 들면, LFA 스트립의 높이를 증가시킴으로써) 개선된다. 일부 구현예에서, 혼합 상 용액은 상 용액이 LFA를 통해(예를 들면, 다공성 매트릭스의 층을 통해) 수직으로 유동할 때 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로 분리된다.
일부 구현예에서, LFA는 두께(예: 높이, 깊이 또는 수직 치수)를 갖는다. 일부 구현예에서, 두께는 약 0.1 mm 내지 약 30 cm이다. 일부 구현예에서, 두께는 약 0.1 mm 내지 약 1 mm, 약 0.1 mm 내지 약 10 mm 또는 약 0.1 mm 내지 1 cm이다. 일부 구현예에서, 두께는 약 1 mm 내지 약 10 mm, 약 1 mm 내지 약 1 cm, 약 1 mm 내지 약 1.5 cm, 약 1 mm 내지 약 3 cm, 약 1 mm 내지 약 3.5 cm, 약 1 mm 내지 약 4 cm, 약 1 mm 내지 약 4.5 cm, 약 1 mm 내지 약 5 cm, 약 1 mm 내지 약 5.5 cm, 약 1 mm 내지 약 6 cm, 약 1 mm 내지 약 6.5 cm, 약 1 mm 내지 약 7 cm, 약 1 mm 내지 약 7.5 cm, 약 1 mm 내지 약 8 cm, 약 1 mm 내지 약 8.5 cm, 약 1 mm 내지 약 9 cm, 또는 약 1 mm 내지 약 9.5 cm, 또는 약 1 mm 내지 약 10 cm이다. 일부 구현예에서, 두께는 약 0.5 cm 내지 약 5 cm이다.
다중 경로
일부 구현예에서, LFA는 제1 경로 및 제2 경로, 또는 적어도 제1 경로 및 제2 경로를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 상 용액은 우선적으로 제1 경로를 통해 유동하고, 제2 상 용액은 우선적으로 제2 경로를 통해 유동한다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 종이를 통해 유동 동안 리딩 유체에서 농축되지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, LFA는 리딩 유체가 적시에 검출 영역을 통해 통과하는 제1 유체이도록 유동을 재지시하도록 설계되어 있다. 일부 구현예에서, 유동을 재지시하는 것은 새로운 유동 경로를 도입함을 포함한다. 일부 구현예에서, 유동을 재지시하는 것은 3D 종이 구조를 도입함을 포함한다. 일부 구현예에서, 유동을 재지시하는 것은 유체의 상에 따르는 우선적 유동이 존재하는 다중 경로 루트를 제공하거나 통합함을 포함한다. 일부 구현예에서, 유동을 재지시하는 것은 유동을 재지시하기 위해 상기 방법을 조합함을 포함한다. 일부 구현예에서, 유동을 재지시하는 것은 상 분리를 향상시키고/시키거나 표적 분석물이 검출 영역을 통해 유동하도록 지시한다.
일부 구현예에서, LFA는 작동 완충제를 함유하는 LFA 세그먼트 및 샘플이 LFA에 적용된 후 도입되는 건조 수신지를 함유하는 LFA 세그먼트를 포함함으로써 유동을 재지시하도록 구성되어 있다. 일부 구현예에서, LFA는 작동 완충제를 함유하는 LFA 세그먼트 및 샘플이 LFA를 통해 유동하기 시작한 후 도입되는 건조 수신지를 함유하는 LFA 세그먼트를 포함함으로써 유동을 재지시하도록 구성되어 있다. 일부 구현예에서, 표적은 지체 유체에서 농축되고, 그러한 경우, 작동 완충제는 지체 유체(리딩 유체를 제조하는)를 검출 영역으로 재라우팅한다(참조: 예를 들면, 도 오류! 참조원은 발견되지 않음.A). 일부 구현예에서, 작동 완충제 및 건조 수신지 세그먼트는 농축된 분석물을 함유하는 리딩 상을검출 영역으로 밀어낸다(도 18b).
일부 구현예에서, 복수의 표적 분석물이 존재하고, 장치는 제1 표적 분석물을 제1 상 용액으로, 제2 표적 분석물을 제2 상 용액으로 분할하도록 구성되어 있고, 여기서 LFA는 제1 방향 영역에 제1 상 용액을 위한 제1 루트를 포함하고, LFA는 제2 검출 영역에 제2 상 용액을 위한 제2 루트를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 루트는 다공성 매트릭스의 제1 형태로 이루어지고, 제2 루트는 다공성 매트릭스의 제2 형태로 이루어지고, 여기서 다공성 매트릭스의 제1 형태 및 다공성 매트릭스의 제2 형태는 상이하다(예: 상이한 다공성, 전하, 소수성, 3차원 구조 등). 일부 구현예에서, 다공성 매트릭스의 제1 형태는 다공성 매트릭스의 제2 형태보다 더 소수성/친수성이다(참조: 예를 들면, 도 19). 일부 구현예에서, 중합체 풍부 상 용액은 보다 소수성 스트림을 통해 우선적으로 유동할 수 있는반면, 농축된 분석물을 함유하는 중합체 결핍 상 용액은 보다 친수성 종이를 통해 유동할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 하류 LFA 성능에 영향을 미칠 수 있는 오염물질을 함유할 수 있는 중합체 풍부 상을 “정제시킴”으로써 농축된다. 일부 구현예에서, 복수의 표적 분석물 중의 표적 분석물 중의 하나 이상은 ATPS의 상이한 상으로분할한다.
일부 구현예에서, 프로브는 자기 입자를 포함하고, 프로브-분석물 복합체는 하나 이상의 자석에의해 재지시된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자석은 LFA의 특정 위치(예: 검출 영역)에서/를 향해 프로브를 농축시키기 위해 종이 스트립을 따라 배치된다. 또는, 일부 구현예에서, 프로브는 자석을 포함하고, 프로브-분석물 복합체는 하나 이상의 자기/상자성 입자에 의해 재지시된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 자기/상자성 입자는 LFA의 특정 위치(예: 검출 영역)에서/를 향해 프로브를 농축시키기 위해 종이 스트립을 따라 배치된다.
프로브
특정 구현예에서, 본우너에 기재된 시스템 및/또는 장치는 포함하고/하거나 본원에 기재된 방법은프로브를 사용하고, 여기서 프로브는 프로브-분석물 복합체를 형성하기 위해 표적 분석물에 결합하는 결합 잔기를 포함한다. 본원에 사용된 용어 “표적 분석물” 및 “프로브-분석물 복합체”는 다르게 구체화되지 않는 한 상호교환적으로 사용된다.
일부 구현예에서, 표적 분석물 단독은 우선적으로 제1 상 용액 또는 제2 상 용액 또는 제1 상 용액과 제2 상 용액의 계면으로 분할된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물 단독은 극도로 제1 상 용액 또는 제2 상 용액 또는 제1 상 용액과제2 상 용액의 계면으로 분할된다.
일부 구현예에서, 표적 분석물 단독은 우선적으로 제1 상 용액 또는 제2 상 용액 또는 제1 상 용액과 제2 상 용액의 계면으로 분할되지 않는다. 일부 구현예에서, 표적 분석물 단독은 극도로 제1 상 용액 또는 제2 상 용액 또는 제1 상 용액과제2 상 용액의 계면으로 분할되지 않는다.
일부 구현예에서, 프로브-분석물 복합체는 우선적으로 제1 상 용액 또는 제2 상 용액 또는 제1 상 용액과 제2 상 용액의 계면으로 분할되어 (프로브-분석물 복합체의) 표적 분석물이 우선적으로 제1 상 용액 또는 제2 상 용액 또는 제1 상 용액과 제2 상 용액의 계면으로 분할되도록 한다.
일부 구현예에서, 프로브-분석물 복합체는 극도로 제1 상 용액 또는 제2 상 용액 또는 제1 상 용액과 제2 상 용액의 계면으로 분할되어 (프로브-분석물 복합체의) 표적 분석물이 극도로 제1 상 용액 또는 제2 상 용액 또는 제1 상 용액과 제2 상 용액의 계면으로 분할되도록 한다.
일부 구현예에서, 구 “우선적으로 분할된다"는, 표적 분석물 (또는 프로브-분석물 복합체)의 ATPS의 제1/제2 상 용액으로의 분할과 관련하여 사용될 때, 더 많은 양의 표적 분석물이 ATPS의 또 다른 상 용액에서보다 바람직한 상 용액에 배치된다는 것을 나타낸다.
일부 구현예에서, 구 “극도로 분할된다"는, 표적 분석물 (또는 프로브-분석물 복합체)의 ATPS의 제1/제2 상 용액으로의 분할과 관련하여 사용될 때, 약 90% 이상의 표적 분석물이 ATPS의 또 다른 상 용액에서보다 바람직한 상 용액에 배치된다는 것을 나타낸다.
일부 구현예에서, 보다 많은 양의 표적 분석물은 제1 상 용액으로 분할된다. 일부 구현예에서, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 약 99% 초과의 표적 분석물은 제1 상 용액으로 분할된다. 일부 구현예에서, 약 99% 초과, 약 99.1% 초과, 약 99.2% 초과, 약 99.3% 초과, 약 99.4% 초과, 약 99.5% 초과, 약 99.6% 초과, 약 99.7% 초과, 약 99.8% 초과, 약 99.9% 초과의 표적 분석물은 제1 상 용액으로 분할된다.
일부 구현예에서, 보다 많은 양의 분석물이 제2 상 용액으로 분할된다. 일부 구현예에서, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 약 99% 초과의 표적 분석물이 제2 상 용액으로 분할된다. 일부 구현예에서, 약 99% 초과, 약 99.1% 초과, 약 99.2% 초과, 약 99.3% 초과, 약 99.4% 초과, 약 99.5% 초과, 약 99.6% 초과, 약 99.7% 초과, 약 99.8% 초과, 약 99.9% 초과의 표적 분석물이 제2 상 용액으로 분할된다.
일부 구현예에서, 보다 많은 양의 분석물이 제1 상 용액과 제2 상 용액의 계면으로 분할된다. 일부 구현예에서, 약 50% 초과, 약 55% 초과, 약 60% 초과, 약 65% 초과, 약 70% 초과, 약 75% 초과, 약 80% 초과, 약 85% 초과, 약 90% 초과, 약 95% 초과, 약 98% 초과, 약 99% 초과의 표적 분석물이 계면으로 분할된다. 일부 구현예에서, 약 99% 초과, 약 99.1% 초과, 약 99.2% 초과, 약 99.3% 초과, 약 99.4% 초과, 약 99.5% 초과, 약 99.6% 초과, 약 99.7% 초과, 약 99.8% 초과, 약 99.9% 초과의 표적 분석물이 계면으로 분할된다.
일부 구현예에서, 프로브-분석물 복합체는 LFA에의 적용을 추출하고/하거나 수집한다(참조: 예를 들면, 도 2).
일부 구현예에서, 프로브 및/또는 프로브-분석물 복합체는 용액에 재현탁된다(예: 재현탁된 용액). 일부 구현예에서, 재현탁된 용액은 물을 포함한다. 일부 구현예에서, 재현탁된 용액은 식염수를 포함한다. 일부 구현예에서, 재현탁된 용액은 완충제를 포함한다. 일부 구현예에서, 재현탁된 용액은 인산화 완충 식염수(PBS) 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 아세트산을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 트리스를 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 붕산을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충제는 보레이트 완충제이다. 일부 구현예에서, 완충제는 붕산리튬 완충제이다. 일부 구현예에서, 완충제는 붕산나트륨 완충제이다.
일부 구현예에서, 재현탁된 용액은 약 2, 약 2.5, 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5, 약 5.5, 약 6, 약 6.5, 약 7, 약 7.5, 약 8, 약 8.5, 약 9, 약 9.5, 약 10, 약 10.5, 약 11, 약 11.5 또는 약 12의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 재현탁된 용액은 약 9의 pH를 갖는다.
일부 구현예에서, 장치는 1개의 프로브를 포함하거나 이를 사용하도록 구성되고/되거나 장치에서 실행되는 검정은 이를 사용한다. 일부 구현예에서, 장치는 적어도 2개의 상이한 프로브 또는 적어도 3개의 상이한 프로브 또는 적어도 4개의 상이한 프로브 또는 적어도 5개의 상이한 프로브 또는 적어도 7개의 상이한 프로브 또는 적어도 10개의 상이한 프로브 또는 적어도 15개의 상이한 프로브 또는 적어도 20개의 상이한 프로브를 포함하거나 이를 사용하도록 구성되고/되거나 장치에서 실행되는 검정은 이를 사용한다.
일부 구현예에서, 프로브는 합성 중합체, 금속, 광물, 유리, 석영, 세라믹, 생물학적 중합체, 플라스틱 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재료를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브는 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론(DELRIN®), 폴리테트타플루오로에틸렌(TEFLON®), 덱스트란 및 폴리비닐 클로라이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리에틸렌은 폴리에틸렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 폴리프로필렌은 폴리프로필렌 글리콜이다. 일부 구현예에서, 프로브는 콜라겐, 셀룰로즈 및 키틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물학적 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브는 금, 은, 백금, 티탄, 스테인레스 강, 알루미늄, 및 이의 합금으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브는 나노입자(예: 금 나노입자, 은 나노입자 등)를 포함한다.
일부 구현예에서, 프로브는 코팅을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 코팅은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 코팅은 폴리프로필렌을 포함한다. 일부 구현예에서, 코팅은 폴리프로필렌 글리콜을 포함한다. 일부 구현예에서, 코팅은 덱스트란을 포함한다. 일부 구현예에서, 코팅은 친수성 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 코팅은 혈청 알부민을 포함한다. 일부 구현예에서, 코팅은 제1 상 용액 또는 제2 상 용액에 대한 친화성을 갖는다.
일부 구현예에서, 샘플 중의 표적 분석물의 양은, 분석물이 LFA에 의한 검출을 가능하게 하도록 실질적으로 농축될 필요가 있도록, 매우 적다. 특정 구현예에서, 실질적인 농도는 계면에서 달성되는데, 분석물 농축 정도는 분석물이 분할되거나 농축되는 상의 용적에 의존하고, 계면에서 “용적”은 벌크 상에 비해 매우 적기 때문이다.
일부 구현예에서, 프로브는 표적 분석물을 계면을 향해 구동하기 위해 우선적으로 (또는 극도로) 계면에서 분할한다. 일부 구현예에서, 프로브는 이들의 표면 화학에 기인하여 우선적으로 (또는 극도로) 계면에서 븐분할하고, 여기서 표면 화학. 비제한적 예로써, 폴리에틸렌 글리콜-인산칼륨(PEG/염) 시스템과 같은 중합체-염 ATPS 시스템의 계면에서 프로브-분석물 복합체를 구동하기 위해, 프로브는 PEG-풍부 상과의 PEG-PEG 상호작용을 촉진시키기 위해 PEG에 접합시키고( 또는 PEG화하고) 및/또는 PEG- 결핍 상과 친수성 상호작용을 촉진시키기 위해 친수성 단백질로 장식한다. 표적에 결합할 수 있는 특이적 항체 또는 다른 분자로 장식된 이러한 최적화된 프로브를 사용하여, 표적 분석물을 포획하고 계면에서 수집한다. 계면의 용적이 매우 작기 때문에, 분석물은 매우 농축시키고 후속적 LFA에 적용한다(도 8).
일부 구현예에서, PEG/염 ATPS의 계면에서 분할할 수 있는 금 나노프로브(GNP)가 제조되고, 작동 조건은 GNP/분석물의 매우 높은 회수와 함께 신속한 상 분리 시간을 가능하게 하도록 최적화된다. 비제한적인 예로써, 트랜스페린(Tf) 검출의 100배 개선은 ATPS로부터 계면 추출과 조합 후 LFA를사용하여 증명되었다(실시예 5 참조).
일부 구현예에서, 프로브-분석물 복합체는 ATPS 중의 고체-액체 계면에서 분할된다. 일부 구현예에서, 고체는 ATPS를 함유하는 챔버의 벽이다. 일부 구현예에서, 고체는 수집기이다. 일부 구현예에서, 고체는 고체 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 고체 중합체는 폴리에틸렌, 셀룰로즈, 키틴, 나일론, 폴리옥시메틸렌(DELRIN®), 폴리테트라플루오로에틸렌(TEFLON®), 폴리비닐 클로라이드 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 고체 중합체는 폴리프로필렌을 포함한다(참조: 예를 들면, 도 9). 일부 구현예에서, 프로브-분석물 복합체를 고체에 고착시키고, 고체-액체 계면에서 적은 용적으로 존재하고 벌크 상의 용적에 의해 희석되지 않기 때문에 매우 농축시킨다. 일부 구현예에서, 벌크 상은 농축된 분석물을 파괴하지 않고 제거하고, LFA에의 후속적 적용과 함께 세척하여 수집한다(도 10). 일부 구현예에서, 이 접근법은 분석물을 상당히 농축시키고, 외부 힘(예: 자석)을 사용하지 않고 수집을 가능하게 한다. 또는, 프로브는 자기 재료를 포함하고, 이 접근법은 자석과 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 이러한 프로브는 극단적인 분석물 농도를 위해 계면에서 농축되도록 변형된다. 상기 언급한 바와 같이, 이 접근법은 자석의 사용을 통해 ATPS에 의해 비특이적으로 농축되는 다른 오염물질로부터 표적 분석물의 추가의 분리를 제공할 수 있다. 일부 구현예에서, ATPS 농도는, 자기 프로브가 먼저 특정 위치(계면)에서 매우 적은 용적으로 농축되기 때문에 자기 프로브가 보다 효율적으로 작동할 수 있도록 한다. 따라서, 농축된 분석물을 수집하기 위해 보다 작은 자석 또는 약한 자기장이 필요하다. 일부 구현예에서, ATPS 계면 농도와 자기 프로브의 조합은 현재의 최첨단에 비해 보다 효과적이고 신속하고 저렴한 장치의 개발을 가능하게 한다.
결합 잔기
일부 구현예에서, 결합 잔기는 표적 분석물에 결합하는 분자이다. 일부 구현예에서, 결합 잔기는 표적 분석물에 특이적으로 결합하는 분자이다. 일부 구현예에서, "특이적으로 결합한다"는 분자가 우선적으로 표적 분석물에 결합하거나 다른 분자들에 대해서보다 표적 분석물에 대해 더 큰 친화성으로 결합한다는 것을 나타낸다. 비제한적인 예로써, 항체는 그것이 발생된 항원에 선택적으로 결합한다. 또한, 비제한적인 예로써, DNA 분자는 엄격한 조건하에 비관련 서열이 아니라 실질적으로 상보적인 서열에 결합한다. 일부 구현예에서, “특이적 결합”은 분자의 이종 집단(예:단백질 및 기타 생물학적 제제) 중의 표적 분석물의 존재의 결정적인 요인인 결합 반응을 의미할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 잔기는 이의 특별한 표적 분석물에 결합하고, 샘플에 존재하는 다른 분자에 상당량으로 결합하지 않는다.
일부 구현예에서, 결합 잔기는 항체, 렉틴, 단백질, 당단백질, 핵산, 단량체성 핵산, 중합체성 핵산, 압타머, 압타자임, 소분자, 중합체, 렉틴, 탄수화물, 다당류, 당, 지질 및 이의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 결합 잔기는 표적 분석물을 쌍으로 결합할 수 있는 분자이다.
일부 구현예에서, 결합 잔기는 항체 또는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab‘, Fab‘-SH, F(ab')2, Fv, Fv’, Fd, Fd’, scFv, hsFv 단편, 카멜로이드 항체, 디아바디, 및 이하 기재된 다른 단편을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다.
일부 구현예에서, "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 코딩되는 하나 이상의 폴리펩티드로 이루어진 단백질을 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 “항체” 및 “면역글로불린”은 다르게 구체화되지 않는 한 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 유전자는 면역글로불린 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 유전자는, 비제한적인 예로써, 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 또는 뮤 불변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 유전자는 면역글로불린 가변 영역 유전자이다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 유전자는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄는 카파 경쇄, 람다 경쇄 또는 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 유전자는 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 경쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 이는 또한 각각 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE에 상응한다.
일부 구현예에서, 면역글로불린은 사량체를 포함한다. 일부 구현예에서, 사량체는 폴리펩티드 쇄의 두 개의 동일한 쌍으로 구성되고, 각 쌍은 하나의 “경”쇄(약 25 kDa) ?? 하나의 "중"쇄(약 50-70 kDa)를 갖는다. 일부 구현예에서, 각 쇄의 N-말단은 주로 항원 인식에 책임이 있는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄(VL) 및 가변 중쇄(VH)는 각각 이러한 경쇄 및 중쇄를 의미한다.
일부 구현예에서, 항체는 순수한 면역글로불린을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 다양한 펩티다제에 의한 소화로 생성된 다수의 충분히 특성화된 단편으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 펩티다제는 펩신이다. 일부 구현예에서, 펩신은 자체가 디설파이드 결합에 의해 VH-CH1에 결합된 경쇄인 Fab의 이량체, F(ab)'2를 생성하기 위해 힌지 영역에서 디설파이드 결합을 소화시킨다. 일부 구현예에서, F(ab)'2는 힌지 영역에서 디설파이드 결합을 파괴하기 위해 완만한 조건하에 환원되어 (Fab')2 이량체를 Fab' 단량체로 변환시킨다. 일부 구현예에서, Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 갖는 Fab로 이루어진다. 일부 구현예에서, Fab' 단편은 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 사용함으로써 신생 합성된다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 전체 항체의 변형에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 재조합 DNA 방법론을 사용하여 신생 합성된다. 일부 구현예에서, 항체는 단일 쇄 항체(단일 폴리펩티드 쇄로서 존재하는 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 연속 폴리펩티드를 형성하기 위해 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 (직접 또는펩티드 링커를 통해) 함께 결합되어 있는 단일 쇄 Fv 항체(sFv 또는 scFv)를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 단일 쇄 Fv 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 직접 결합되거나 펩티드-코딩 링커에 의해 결합된 VH- 및 VL-코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는 공유 결합된 VH-VL 헤테로다이머를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 및 VL은 단일 폴리펩타이드 쇄로서 각각에 결합되고, VH 및 VL 도메인은 비공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, Fab는 파지 상에서 나타나고, 여기서 쇄 중의 하나(중쇄 또는 경쇄)는 g3 캡시드 단백질에 융합되고, 상보성 쇄는 가용성 분자로서 주변 세포질로 보내진다. 일부 구현예에서, 두 쇄는 동일한 또는 상이한 레플리콘 상에서 코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, 각 Fab 분자 중 두 개의 항체 쇄는 번역후 조립되고, 이량체는, 예를 들면, g3p에 대한 쇄 중의 하나의 결합을 통해 파지 입자로 도입된다. 일부 구현예에서, 항체는 파지 상에 표시되었다.
일부 구현예에서, 결합 잔기는 압타머를 포함한다. 일부 구현예에서, 압타머는 핵산으로부터 형성된 항체-유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 압타머는 일부 검정, 예를 들면, 재구성이 직접 검출되는 나노-CHEM-FET에서 검출되는 표지의 결합을 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 결합 잔기는 압타자임을 포함한다. 일부 구현예에서, 압타자임은 핵산으로부터 형성된 효소 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 압타자임은 단지 제2의 특이적 분석물의 존재하에서만 특이적 분자를 포획하기위해 구성을 변경시키는 기능을 한다.
용어 “소분자” 또는 “작은 유기 분자”는 일반적으로 의약품에 사용되는 유기 분자에 필적하는 크기의 분자를 의미한다. 이 용어는 생물학적 거대분자(예: 단백질, 핵산 등)를 제외한다. 바람직한 소분자는 최대 약 5000 Da, 더욱 바람직하게는 최대 2000 Da, 가장 바람직하게는 최대 약 1000 Da으로 크기가 다양하다.
일부 구현예에서, 항체 단편은 순수한 항체의 단백질분해성 소화를 통해 유도된다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성된다. 일부 구현예에서, Fab, Fv 또는 ScFv 항체 단편은 내부 발현되고 이. 콜리(E. coli)로부터 분비되어 이들 다량의 용이한 생산을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 항체 파지 라이브러리로부터 단리된다. 일부 구현예에서, Fab'-SH 단편은 이. 콜리로부터 직접 회수되고, F(ab')2 단편을 형성하기 위해 화학적으로 커플링될 수 있다. 일부 구현예에서, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리된다. 일부 구현예에서, Fab 및 F(ab')2 단편은 생체내 반감기를 증가시켰다. 일부 구현예에서, Fab 및 F(ab')2 단편은 회수 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함한다. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 특정 구현예에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편이다. 일부 구현예에서, Fv 또는 sFv는 불변 영역이 없는 순수한 결합 부위를 갖고; 따라서, 이들은 생체내 사용 동안 감소된 비특이적 결합에 적합하다. 일부 구현예에서, 항체 단편은 "선형 항체"이다. 일부 구현예에서, 선형 항체 단편은 단일특이적이다. 일부 구현예에서, 선형 항체 단편은 이중특이적이다.
일부 구현예에서, 항체 단편은 디아바디이다. 일부 구현예에서, 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 두 개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다.
일부 구현예에서, 항체 단편은 단일-도메인 항체이다. 일부 구현예에서, 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 일부 또는 모두 또는 경쇄 가변도메인의 일부 또는 모두를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구현예에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다.
일부 구현예에서, 프로브는 검출가능한 표지를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로브는 검출가능한 특성을 갖는다. 검출가능한 표지/검출가능한 특성은 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 전기적, 광학적 또는 화학적 순단에 의한 임의의 조성을 포함한다. 예시적인 유용한 표지는 다음을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다: 형광 나노입자(예: 양자 점(Qdots)), 형광 염료(예: 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 그린 형광성 단백질 등, 참조: 예를 들면, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA), 방사성 표지(예: 3H, 125I, 35S, 14C, 32P, 99Tc, 203Pb, 67Ga, 68Ga, 72As, 111In, 113mIn, 97Ru, 62Cu, 64lCu, 52Fe, 52mMn, 51Cr, 186Re, 188Re, 77As, 90Y, 67Cu, 169Er, 121Sn, 127Te, 142Pr, 143Pr, 198Au, 199Au, 161Tb, 109Pd, 165Dy, 149Pm, 151Pm, 153Sm, 157Gd, 159Gd, 166Ho, 172Tm, 169Yb, 175Yb, 177Lu, 105Rh, 111Ag 등), 효소 (예: 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제 및 ELISA에 통상적으로 사용되는 다른 것들), 다양한 비색 표지, 자기 또는 상자성 표지(예: 자기 및/또는 상자성 나노입자), 스핀 표지, 방사성-불투명 표지 등.
대안적으로 또는 추가로, 프로브는 검출가능한 표지를 포함하는 또 하나의 입자에 결합한다. 대안적으로 또는 추가로, 프로브는 검출가능한 특성을 갖는 또 하나의 입자에 결합한다. 일부 구현예에서, 프로브는 검출 영역(예: 시험 라인, 대조군 라인)에서 검출가능한 신호를 제공한다. 일부 구현예에서, 검출가능한 표지/특성은 비색 표지/특성, 형광 표지/특성, 효소 표지/특성, 컬러리제닉 표지/특성 및 방사성 표지/특성으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로브는 금 나노입자이고, 검출가능한 특성은 색상이다. 일부 구현예에서, 색상은 오렌지색, 적색 및 자주색으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 프로브는 자기 및/또는 상자상 입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 철, 니켈, 코발트 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 재료를 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 알니코, 알루미늄-니켈-코발트 합금을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 희토류 금속의 합금을 포함한다. 일부 구현예에서, 희토류 금속은 스칸듐, 이트륨, 란탄, 세륨, 프라세오디뮴, 네오디뮴, 프로메튬, 사마륨, 유로퓸, 가돌리늄, 테르븀, 디스프로슘, 홀뮴, 에르븀, 툴륨, 이테르븀, 루테튬 또는 이들의 조합체로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자기 성분은 희토류 광물을 포함한다. 일부 구현예에서, 희토류 광물은 자철석을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 철을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 강자성 재료를 포함한다. 일부 구현예에서, 강자성 재료는 연질 강자성 재료이다. 일부 구현예에서, 연질 강자성 재료는 어닐링된 철을 포함한다. 일부 구현예에서, 연질 강자성 재료는 아연, 니켈, 망간 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 연질 강자성 재료는 망간-아연 페라이트(MnaZn(1-a)Fe2O4) 및 니켈-아연 페라이트(NiaZn(1-a)Fe2O4)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 강자성 재료는 경질 강자성 재료이다. 일부 구현예에서, 경질 강자성 재료는 알니코 또는 페라이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 경질 강자성 재료는 스트론튬 페라이트, SrFe12O19 (SrOㆍ6Fe2O3), 바륨 페라이트, BaFe12O19 (BaOㆍ6Fe2O3) 및 코발트 페라이트, CoFe2O4 (CoOㆍFe2O3)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자기 성분은 페라이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 페라이트는 헤마타이트(Fe2O3)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자기 성분은 페라이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 페라이트는 마그네타이트(Fe3O4)로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 Fe3O4를 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 Fe2O3을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 본질적으로 Fe3O4로 이루어진다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 본질적으로 Fe2O3으로 이루어진다.
일부 구현예에서, 자기 입자는 구, 정육면체, 타원형, 막대, 캡슐 형상, 정제 형상, 정체 랜덤 형상으로부터 선택된 형상이지만, 이에 국한되지 않는다.
일부 구현예에서, 자기 입자는 약 1 nm 내지 약 100 μm의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 약 20 nm 내지 약 1 μm의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 약 10 nm 내지 약 50 nm의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 약 100 nm 내지 약 750 nm의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 약 500 nm의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 약 1 μm 내지 약 15 μm의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 약 2 μm 내지 약 10 μm의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 약 1 μm 내지 약 5 μm의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 약 1 μm의 평균 직경을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 입자는 이의 가장 넓은 지점에서 약 0.5 μm 내지 약 20 μm의 평균 직경을 포함한다.
도 21은 ATPS에서 분석물을 농축시키기 위해 자기 프로브를 사용하는 방법에 대한 하나의 예시적이지만 비제한적인 예를 도시한다. 표적 분석물에 특이적인 항체 (또는 다른 결합 잔기)를 사용하여, 표적은 포획하고 ATPS 중 벌크 상 중의 하나에서 자기 프로브로 농축시킨다. 다양한 유형의 분자를 함유하는 복합체 샘플에서, ATPS는 표적 분석물 또는 프로브와 유사한 물리화학적 특성을 갖는 분자를 비특이적으로 농축시킬 수 있다. 그러나, 자석 또는 외부 자기장의 사용을 통해, 자기 포획 프로브에 결합되어 있는 표적 분석물의추가의 농축 및 단리가 검출 전에 달성된다.
일부 구현예에서, 장치는 자기 재료를 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 재료는 자기장의 공급원이다. 일부 구현예에서, 자석은 마그네타이트, 자철석, 코발트, 니켈, 망간, 알루미늄, 가돌륨, 디스프로슘, 세라믹(예: 페라이트) 및 알니코로부터 선택된 물질을 포함한다. 일부 구현예에서, 자석은 광석을 포함한다. 일부 구현예에서, 자석은 철광석을 포함한다. 일부 구현예에서, 자석은 희토류 자석을 포함한다. 일부 구현예에서, 희토류 자석은 사마륨-코발트 자석 및 네오디뮴-철-붕소 자석(NIB)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 자석은 약 0.1가우스, 약 0.2가우스, 약 0.3가우스, 약 0.4가우스, 약 0.5가우스, 약 0.6가우스, 약 0.7가우스, 약 0.8가우스, 약 0.9가우스 또는 약 1가우스의 자계 강도를 포함한다. 일부 구현예에서, 자석은 약 1가우스, 약 2가우스, 약 3가우스, 약 4가우스, 약 5가우스, 약 6가우스, 약 7가우스, 약 8가우스, 약 9가우스 또는 약 10가우스의 자계 강도를 포함하고, 일부 구현예에서, 자석은 약 10가우스, 약 20가우스, 약 30가우스, 약 40가우스, 약 50가우스, 약 60가우스, 약 70가우스, 약 80가우스, 약 90가우스, 약 100가우스, 약 110가우스, 약 120가우스, 약 130가우스, 약 140가우스, 약 150가우스, 약 160가우스, 약 170가우스, 약 180가우스, 약 190가우스, 약 200가우스, 약 250가우스, 약 300가우스, 약 350가우스, 약 400가우스, 약 450가우스 또는 약 500가우스의 자계 강도를 포함한다. 일부 구현예에서, 자석은 약 100가우스의 자계 강도를 포함한다.
일부 구현예에서, 자석은 표적 분석물의 제1 상 용액 또는 제2 상 용액으로의 분할을 촉진시키고/시키거나 증가시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, 자석은 LFA를 통해 표적 분석물의 유동을 촉진시키고/시키거나 증가시키도록 구성된다. 일부 구현예에서, 자석은 장치에 부착가능하고/하거나 장치로부터 분리가능하다. 일부 구현예에서, 자석은 수집기 내/위에 제공된다.
일부 구현예에서, 장치는 적어도 1개의 표적 분석물 또는 적어도 2개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 3개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 4개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 5개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 7개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 10개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 15개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 20개의 상이한 표적 분석물과 상호작용하는 하나 이상의 프로브를 사용하고/하거나 포함하도록 구성된다.
표적 분석물/샘플
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 장치, 시스템 및/또는 방법은 하나 이상의 표적 분석물(들)을 검출하고/하거나 정량화한다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 단백질, 항원, 생체 분자, 당 잔기, 지질, 핵산, 스테롤, 작은 유기 분자 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 식물, 동물, 바이러스, 진균, 원생동물 및 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유기체로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 표적 분석물은 생물학적 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 핵산, 단백질, 지질, 소분자, 대사산물, 당, 항체, 항원, 효소 및이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 당은 락토즈이다.
용어 "단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 단백질은 아미노산 잔기의 중합체를 의미한다. 일부 구현예에서, 단백질은 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 천연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체 뿐만 아니라 천연 발생 아미노산 중합체이다.
용어 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, 핵산은 함께 공유결합된 적어도 두 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 핵산은 일본쇄이다. 일부 구현예에서, 핵산은 이본쇄이다. 일부 구현예에서, 핵산은 삼본쇄이다. 일부 구현예에서, 핵산은 포스포디에스테르 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 핵산 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 유사체는 포스포디에스테르 결합 이외의 결합 및/또는 포스포디에스테르 결합에 추가하여 골격, 예를 들면, 비제한적인 예로써, 포스포르아미드, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 O-메틸포스포로아미디트를 갖는다. 일부 구현예에서, 핵산 유사체는 양성 골격, 비이온성 골격 및 비-리보스 골격으로부터 선택된 골격을 갖는 핵산 유사체로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 카보사이클릭 당을 함유한다. 일부 구현예에서, 핵산은 이의 리보스-포스페이트 골격의 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 변형은 표지와 같은 추가의 잔기의 첨가를 촉진시키기 위해 수행된다. 일부 구현예에서, 이러한 변형은 생리학적 환경에서 이러한 분자들의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 수행된다.
일부 구현예에서, 생물학적 분자는 바이러스로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 바이러스 입자이다. 일부 구현예에서, 바이러스 입자는 바이러스로부터 유래되고, 여기서 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 면역결핍 바이러스, 호흡기 바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스, 유두종 바이러스, 수두 바이러스, 파르보 바이러스, 아스트로 바이러스, 칼리씨 바이라스, 피코르나 바이러스, 플라비바이러스, 토가바이럿, 헤페바이러스, 레트로바이러스, 오르토믹소바이러스, 아레나비아러스, 분야바이러스, 필로바이러스, 파라믹소바이러스, 랩도바이러스 및 레오바이러스로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 로타바이러스, 오르비바이러스, 콜티바이러스, 마르부르크 바이러스, 풍진 바이러스, 노르워크 바이러스, 리노바이러스, 엡스타인 바 바이러스 및 사이토메갈로바이러스로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 천연두 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 간염 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 광견병 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 호흡기 합포체 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 유행성 이하선염 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 홍역 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 에볼라 바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 폴리오바이러스이다. 일부 구현예에서, 바이러스는 계절 H1N1, 돼지 H1N1, H3N2 인플루엔자로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 바이러스는 박테리오파지이다. 일부 구현예에서, 박테리오파지는 M13 박테리오파지이다.
일부 구현예에서, 생물학적 분자는 세균으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 생물학적 분자는 세균 입자이다. 일부 구현예에서, 세균은 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 클라미디아(Chlamydia), 마이코박테리움(Mycobacterium), 및나이세리아(Neisseria)로부터 선택된 속의 것이다. 일부 구현예에서, 세균은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)이다. 일부 구현예에서, 세균은 바실루스(Bacillus), 보르데텔라(Bordetella), 보르렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 클라미도필라(Chlamydophila), 클로스트리듐(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 에쉐리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 헤모필루스(Haemophilus), 헬리코박터(Helicobacter), 레지오넬라(Legionella), 렙토스피라(Leptospira), 리스테리아(Listeria), 마이코박테리움(Mycobacterium), 마이코플라스마(Mycoplasma), 나이세리아(Neisseria), 슈도모나스(Pseudomonas), 리케치아(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 시겔라(Shigella), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio) 및 예르시니아(Yersinia)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속의 것이다. 일부 구현예에서, 세균은 스트렙토코쿠스 뉴모이애(Streptococcus pneumoiae)이다. 일부 구현예에서, 세균은 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis)이다. 일부 구현예에서, 세균은 나이세리아 고노르호애(Neisseria gonorrhoeae)이다. 일부 구현예에서, 세균은 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)이다.
일부 구현예에서, 세균은 스타필로코쿠스 오레우스(Staphylococcus aureus)이다. 일부 구현예에서, 세균은 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus)이다. 일부 구현예에서, 세균은 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)이다. 일부 구현예에서, 세균은 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)이다. 일부 구현예에서, 세균은 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)이다. 일부 구현예에서, 세균은 헬리코박터 피로리(Helicobacter pylori)이다.
일부 구현예에서, 세균은 경구 세균이다. 일부 구현예에서, 경구 세균은 치주 질환을 유발한다. 일부 구현예에서, 경구 세균은 포피로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis), 박테로이데스 포시투스(Bacteroides forsythus), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 프레보텔라 인터미디어(Prevotella intermedia), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 마이크로애로필 박테리아 악티노마이세스 악티노마이세템코미탄스(Microaerophile bacteria Actinomyces actinomycetemcomitans), 캄필로박터 렉투스(Campylobacter rectus), 에이케넬라 코로덴스(Eikenella corrodens)및 유박테리움 종(Eubacterium species)으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 샘플 또는 표적 분석물은 원생동물로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 원생동물은 아베마성 감염, 편모충증, 톡소플라즈마증, 크립토스포리디오시스증, 트리코모나스증, 샤자스 질환, 레슈마니아증, 수면병, 아베마 이질, 아베마 각막염 및 기본 아메바 수막뇌염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환을 야기한다. 일부 구현예에서, 원생동물은 말라리아를 일으키는 것으로 공지된 플라스모듐 속(genus Plasmodium)의 것이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 플라스모듐 락테이트 데하이드로겐제(pLDH)이다.
일부 구현예에서, 표적 분석물은 식품 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 식품 알레르겐은 식물 생체분자이다. 일부 구현예에서, 식물 생체분자는 식물 단백질이다. 일부 구현예에서, 식물 단백질은 글루텐이다. 일부 구현예에서, 식품 알레르겐은 식물 생체분자이다. 일부 구현예에서, 식물 생체분자는 식물 단백질이다. 일부 구현예에서, 식물 단백질은 글루텐이다. 일부 구현예에서, 식품 알레르겐은 동물 생체분자이다. 일부 구현예에서, 동물 생체분자는 다당류이다. 일부 구현예에서, 다당류는 락토즈이다.
일부 구현예에서, 표적 분석물은 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 생물학적 샘플(예: 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 눈물/안약, 면봉으로 수집된 체액)에 존재하고/하거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 단백질은 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 단백질은 질환 또는 상태의 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 트로포닌 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 트랜스페린 또는 이의 단편이다.
일부 구현예에서, 장치는 샘플에서 복수의 분석물을 검출하고/정량화하도록 구성된다. 일부 구현예에서, ATPS는 유사한 물리화학적 특성을 갖는 복수의 분석물을 농축시킨다. 일부 구현예에서, LFA는 복수의 표적 분석물을 시험할 수 있다. 일부 구현예에서, LFA는 복수의 시험 라인을 포함한다. 일부 구현예에서, LFA는 제1 표적 분석물에 특이적인 제1 포획 잔기를 간는 제1 시험 라인 및 제1 표적 분석물에 특이적인 제2 포획 잔기를 갖는 제2 시험 라인을 포함하고, 여기서 제1 포획 잔기 및 제2 포획 잔기는 상이하다. 장치는 약 1개의 시험 라인, 약 2개의 시험 라인, 약 3개의 시험 라인, 약 4개의 시험 라인, 약 5개의 시험 라인, 약 6개의 시험 라인, 약 7개의 시험 라인, 약 8개의 시험 라인, 약 9개의 시험 라인 또는 약 10개의 시험 라인을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 표적 분석물은 샘플에 존재한다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 샘플로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 샘플로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 샘플로부터 정제된다.
일부 구현예에서, 샘플은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 생물학적 유기체로부터 조직/유체; 식품 샘플; 화학적 샘플; 약물 샘플; 환경 샘플; 및 이들의 조합.
일부 구현예에서, 식품 샘플은 너트, 낙농 제품, 밀 제품, 대두 제품 및 계란 제품으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 식품 샘플은 콩이다. 일부 구현예에서, 식품 제품은 과일이다.
일부 구현예에서, 샘플은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다: 혈액 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플, 눈물/안 유체 샘플, 면봉 샘플 및 이들의 조합.
일부 구현예에서, 샘플은 세균, 바이러스, 원생동물, 조류, 진균, 약물, 병원체, 독소, 환경 오염물질및 이의 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공급원으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 샘플은 세균전 제제이다. 일부 구현예에서, 샘플은 물 샘플이다. 일부 구현예에서, 물 샘플은 물 시험 시설로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 물 샘플은 물 정제 시설로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 샘플은 빌딩, 무생물 구조 또는 화학적 용액으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 샘플은 카펫, 페인트, 보존 목재, 탈취제, 세정 제품, 화장품, 의류품, 곤충 퇴치제, 공기 청정제, 바닥, 벽, 천장, 리놀륨, 플라스틱, 곤층 스프레이 및 치과 젤/페스트로부터 유도된다.
II. 방법
샘플에서 하나 이상의 표적 분석물(들)을 검출하는 방법이 본원에 개시된다. 샘플을 본원에 개시된 장치 중의 임의의 하나에 적용하는 단계 및 측방 유동 검정에서 표적 분석물(들)을 정량화하는 단계를 포함하는, 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물(들)을 정량화하는 방법도 또한 제공된다. 샘플에서 표적 분석물을 농축시키는 방법도 또한 제공된다. 다양한 구현예에서, 방법은 샘플을 본원에 개시된 장치 중의 임의의 하나에 적용하는 단계 및 측방 유동 검정에서 표적 분석물의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함한다. 다양한 구현예에서, 방법은 샘플을 본원에 개시된 장치 중의 임의의 하나에 적용하는 단계; 및 표적 분석물(들)을 수성 2-상 시스템으로 및/또는 측방 유동 검정에서 농축시키는 단계를 포함한다. 샘플에서 하나 이상의 표적 분석물(들)을 분할하고/분리하는 방법이 본원에 개시된다. 다양한 구현예에서, 방법은 샘플을 본원에 개시된 장치 중의 임의의 하나에 적용하는 단계; 및 표적 분석물을 수성 2-상 시스템으로 및/또는 측방 유동 검정에서 분할하고/분리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법(들)은 샘플을 ATPS에 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법(들)은 샘플을 LFA에 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 샘플을 LFA에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 LFA 및 ATPS는 통합된다.
일부 구현예에서, 방법은 샘플을 ATPS에 적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 샘플을 LFA에 적용하는 단계를 포함하고, 여기서 ATPS는 LFA 상에서 탈수된다.
일부 구현예에서, 표적 분석물은 ATPS의 상 용액 또는 계면에서 농축시킨다. 일부 구현예에서, 방법은 농축된 표적 분석물을 상 용액으로부터 추출시키는 단계 및 이를 LFA에적용하는 단계를 포함한다. 일부 구현에에서, 방법은, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 ATPS를 수집기와 접촉시키는 단계를 포함하고, 여기서 표적 분석물, 프로브 및/또는 프로브-분석물 복합체는 수집기에 대한 친화성을 갖고, 수집기와 상호작용한다. 일부 구현예에서, 방법은 표적 분석물을 그것이 검출 웰로 삽입될 때 수집기 상에서 검출하는 단계를 포함한다(도 11).
일부 구현예에서, 방법은 샘플로부터 표적 분석물을 추출하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 분석물을 추출하는 단계는 ATPS의 사용을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 분석물을 추출하는 단계는 샘플을 파괴하고, 용해시키고, 분쇄하고, 블렌딩하고, 민싱하고, 교반하고, 원심분리하거나 절단하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 고체 식품으로부터 식품 알레르겐을 시험하기 위해, 샘플을 먼저 분쇄한다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 추출 완충제를 사용하여 분쇄된 샘플로부터 추출된다. 일부 구현예에서, 분쇄된 샘플은 샘플로부터 표적 분석물을 추출하기 위해 ATPS 용액과 혼합한다.
일부 구현예에서, 방법은 샘플 및/또는 표적 분석물을 프로브와 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 샘플 및/또는 표적 분석물을 ATPS 및/또는 LFA에 적용하기 전에 프로브-분석물 복합체를 생성하기 위해 샘플 또는 표적 분석물을 프로브와 혼합하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 샘플 및/또는 표적 분석물을 ATPS 및/또는 LFA에 적용하기 전에 프로브-분석물 복합체를 세척하는 단계를 추가로 포함한다.
용도
일부 양상에서, 본원에 기재된 방법 및 장치는 샘플에서 표적 분석물을 검출시키기 위해 사용된다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 방법 및 장치는 샘플에서 표적 분석물을 정량화하기 위해 사용된다. 일부 양상에서, 본원에 기재된 방법 및 장치는 샘플에서 표적 분석물을 검출하고 정량화하기 위해 사용된다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 방법은 상태 또는 질환을 진단하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 장치의 LFA에 대한 결과를 관찰하는 단계 및 결과에 기초하여 진단을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 특정 예에서, 검정 결과는 진단에 결정적인 반면, 다른 문맥에서, 검정 결과는 감별 진단의 문맥에서 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 상태 또는 질환을 진단하는 단계는 추가의 장치를 사용하는 추가의 시험 단계를 필요로 한다.
감염성 질환
일부 구현예에서, 상태 또는 질환은 감염성 질환이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 호흡기 감염이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 인플루엔자이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 열대병이다.
일부 구현예에서, 감염성 질환은 통상적 감기, 자궁경부암, 헤르페스, 천연두, 수두, 대상 포진, 간염, 광견병, 유행성 이하선염 및 소아마비로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 결핵이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 에볼라이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 말라리아이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 홍역이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 백일해이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 파상풍이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 뇌막염이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 매독이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 B형 감염이다.
성 감염증
일부 구현예에서, 상태 또는 질환은 성 감염증이다. 일부 구현예에서, 성 감염증은 클라미디아, 임질, 헤르페스(HSV-1, HSV-2), 인간 유두종 바이러스감염, 매독, B형 간염, C형 간염, A형 간염, 세균성 질염, 게, 옴, 트리코모나스증, 아메바증, 크립토스포리디오시스증, 람블 편모충증, 칸디다증 및 세균성 이질로부터 선택된다.
치주 질환
일부 구현예에서, 상태 또는 질환은 치주 질환이다. 일부 구현예에서, 치주 질환은 치은염이다. 일부 구현예에서, 치주 질환은 치주염이다. 일부 구현예에서, 치주 질환은 구강에서 세균 스트렙토코쿠스 뮤탄스의 존재로 야기된다.
알레르겐/독소
일부 구현예에서, 표적 분석물은 액체 또는 식품 샘플 중의 오염 물질이다. 일부 구현예에서, 표적 분석물은 액체 또는 식품 샘플 중의 알레르겐이다. 일부 구현예에서, 알레르겐은 유제품 알레르기, 계란 알레르기, 대두 알레르기, 밀 알레르기, 조개알레르기 및 너트 알레르기로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 너트 알레르기는 땅콩 알레르기이다. 일부 구현예에서, 상태 또는 질환은 식품 또는 식품 성분에 대한 불내성 또는 감도이다. 일부 구현예에서, 상태 또는 질환은 글루텐에 대한 불내성이다.
일부 구현예에서, 표적 분석물은 환경 독소이다. 환경 독소는 농약 및 제초제로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 환경 독소는 금형 및 진균으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 환경 독소는 폴리염화 비페닐(PCB) 및 프탈레이트로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 환경 독소는 휘발성 유기 화합물, 다이옥신, 석면, 중금속, 클로로포름 및 염소로부터 선택된다.
본원에서 예상된 다양한 구현예는 다음 중의 하나 이상 및 이들의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 국한되지 않는다:
구현예 1: 샘플에서 표적 분석물을 검출 및/또는 정량화하기 위한 장치로서, 상기 장치는 다음을 포함하는, 장치: a: 측방 유동 검정(LFA); 및 b: 수성 2-상 시스템(ATPS), 여기서, ATPS는 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로 분리되는 혼합 상 용액을 포함한다.
구현예 2: 구현예 1에 있어서, 상기 혼합 상의 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로의 분리가 LFA에서 일어나는, 장치.
구현예 3: 구현예 1에 있어서, 상기 혼합 상의 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로의 분리가 LFA 내에서 발생하지 않는, 장치.
구현예 4: 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 분석물이 혼합 상 용액과 접촉되고, 상기 표적 분석물이 제1 상 용액 또는 제2 상 용액으로 분할되는, 장치.
구현예 5: 구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 분석물이 혼합 상 용액과 접촉되고, 상기 표적 분석물이 제1 상 용액과 제2 상 용액의 계면에서 분할되는, 장치.
구현예 6: 구현예 4 또는 5에 있어서, 상기 표적 분석물이 분할시 농축되는, 장치.
구현예 7: 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 미셀 용액을 포함하고, 상기 제2 상 용액이 중합체를 포함하는, 장치.
구현예 8: 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 미셀 용액을 포함하고, 제2 상 용액이 염을 포함하는, 장치.
구현예 9: 구현예 7 또는 8에 있어서, 상기 미셀 용액이 게면활성제를 포함하는, 장치.
구현예 10: 구현예 9에 있어서, 상기 계면활성제가 이온성 계면활성제, 쯔비터 이온을 포함하는 계면활성제 및 비이온성 계면활성제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 장치.
구현예 11: 구현예 7 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 미셀 용액이 트리톤-X를 포함하는, 장치.
구현예 12: 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 제1 중합체를 포함하고, 상기 제2 상 용액이 제2 중합체를 포함하는, 장치.
구현예 13: 구현예 12에 있어서, 상기 제1/제2 중합체가 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 덱스트란으로부터 선택되는, 장치.
구현예 14: 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 중합체를 포함하고, 상기 제2 상 용액이 염을 포함하는, 장치.
구현예 15: 구현예 14에 있어서, 상기 제1 상 용액이 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 상기 제2 상 용액이 인산칼륨을 포함하는, 장치.
구현예 16: 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 표 1의 성분 1로부터 선택되고, 상기 제2 상 용액이 표 1의 성분 2로부터 선택되는, 장치.
구현예 17: 구현예 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 분석물이 단백질, 항원, 생체 분자, 작은 유기 분자, 당 잔기, 지질, 핵산, 스테롤 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 장치.
구현예 18: 구현예 17에 있어서, 상기 표적 분석물이 식물, 동물, 바이러스, 원생동물, 진균 및 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 유기체로부터 유래되는, 장치.
구현예 19: 구현예 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 프로브를 추가로 포함하고, 상기 프로브가상기 표적 분석물과 상호작용하는, 장치.
구현예 20: 구현예 19에 있어서, 상기 장치가 적어도 1개의 표적 분석물 또는 적어도 2개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 3개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 4개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 5개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 7개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 10개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 15개의 상이한 표적 분석물 또는 적어도 20개의 상이한 표적 분석물과 상호작용하는 하나 이상의 프로브를 포함하는, 장치.
구현예 21: 구현예 19 또는 20에 있어서, 상기 장치가 적어도 2개의 상이한 프로브 또는 적어도 3개의 상이한 프로브 또는 적어도 4개의 상이한 프로브 또는 적어도 5개의 상이한 프로브 또는 적어도 7개의 상이한 프로브 또는 적어도 10개의 상이한 프로브 또는 적어도 15개의 상이한 프로브 또는 적어도 20개의 상이한 프로브를 포함하는, 장치.
구현예 22: 구현예 19에 있어서, 상기 프로브가 합성 중합체, 금속, 광물, 유리, 석영, 세라믹, 생물학적 중합체, 플라스틱 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 장치.
구현예 23: 구현예 19에 있어서, 상기 프로브가 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 셀룰로즈, 키틴, 나일론, 폴리옥시메틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리비닐 클로라이드 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중합체를 포함하는, 장치.
구현예 24: 구현예 19에 있어서, 상기 프로브가 덱스트란, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물학적 중합체를 포함하는, 장치.
구현예 25: 구현예 19에 있어서, 상기 프로브가 금, 은, 백금 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속을 포함하는, 장치.
구현예 26: 구현예 19에 있어서, 상기 프로브가 나노입자를 포함하는, 장치.
구현예 27: 구현예 19에 있어서, 상기 나노입자가 금 나노입자인, 장치.
구현예 28: 구현예 17 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 코팅을 포함하는, 장치.
구현예 29: 구현예 28에 있어서, 상기 코팅이 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 중합체를 포함하는, 장치.
구현예 30: 구현예 28에 있어서, 상기 코팅이 덱스트란을 포함하는, 장치.
구현예 31: 구현예 28에 있어서, 상기 코팅이 친수성 단백질을 포함하는, 장치.
구현예 32: 구현예 28에 있어서, 상기 코팅이 혈청 알부민을 포함하는, 장치.
구현예 33: 구현예 28 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 코팅이 상기 제1 상 용액 또는 상기 제2 상 용액에 대해 친화성을 갖는, 장치.
구현예 34: 구현예 28 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 표적 분석물에 결합하는 결합 잔기를 추가로 포함하는, 장치.
구현예 35: 구현예 34에 있어서, 상기 결합 잔기가 항체, 렉틴, 단백질, 당단백질, 핵산, 소분자, 중합체, 지질 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 장치.
구현예 36: 구현예 34에 있어서, 상기 결합 잔기가 항체 또는 항체 단편인, 장치.
구현예 37: 구현예 18 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 자기 입자를 포함하는, 장치.
구현예 38: 구현예 37에 있어서, 자석을 추가로 포함하는, 장치.
구현예 39: 구현예 38에 있어서, 상기 자석이 표적 분석물의 제1 상 용액 또는 제2 상 용액으로의 분할을 촉진시키고/시키거나 증가시키도록 구성되는, 장치.
구현예 40: 구현예 38에 있어서, 상기 자석이 LFA를 통한 표적 분석물의 유동을 촉진시키고/시키거나 증가시키도록 구성되는, 장치.
구현예 41: 구현예 38 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 자석이 장치에 부착가능하고/하거나 분리가능한, 장치.
구현예 42: 구현예 1 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 ATPS와 접촉되어 배치되도록 구성된 수집기를 추가로 포함하고, 상기 표적 분석물이 수집기와 제1 상 용액 및/또는 제2 상 용액의 계면에서 분할되는, 장치.
구현예 43: 구현예 42에 있어서, 상기 수집기가 플라스틱, 메조다공성 재료, 실리카, 폴리프로필렌, 자석, 세공을 갖는 재료, 홈이 있는 재료 및 이들의 조합으로부터 선택된 재료를 포함하는, 장치.
구현예 44: 구현예 19 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 검출가능한 표지를 포함하는, 장치.
구현예 45: 구현예 44에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 비색 표지, 형광 표지, 효소 표지, 컬러리제닉 표지, 방사성 표지 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 장치.
구현예 46: 구현예 1 내지 45 중 어느 한 하나에 있어서, 상기 LFA가 다공성 매트릭스를 포함하는, 장치.
구현예 47: 구현예 46에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 혼합 상 용액, 제1 상 용액, 제2 상 용액 및/또는 표적 분석물이 LFA를 통해 유동하도록 하기에 충분히 다공성인, 장치.
구현예 48: 구현예 46 또는 47에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 혼합 상 용액, 제1 상 용액, 제2 상 용액 및/또는 표적 분석물이 LFA를 통해 수직으로 및/또는 수평으로 유동하기에 충분한 길이 및/또는 깊이인, 장치.
구현예 49: 구현예 46 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 제1 속도로 다공성 매트릭스를 통해 유동하고, 상기 제2 상 용액이 제2 속도로 다공성 매트릭스를 통해 유동하고, 상기 제1 속도와 상기 제2 속도가 상이한, 장치.
구현예 50: 구현예 46 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 셀룰로즈, 유리 섬유, 니트로셀룰로즈, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 나일론, 전하 변형된 나일론, 폴리에테르설폰 및 이들의 조합으로부터 선택된 재료를 포함하는, 장치.
구현예 51: 구현예 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 LFA가 표적 분석물 포획 잔기를 포함하고, 상기표적 분석물 포획 잔기가 상기 표적 분석물과 상호작용하는, 장치.
구현예 52: 구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 LFA가 사용될 때 경쟁 검정을 제공하도록 구성되는, 장치.
구현예 53: 구현예 1 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 상기 LFA가 표적 분석물을 포함하는, 장치.
구현예 54: 구현예 53에 있어서, 상기 LFA가 사용될 때 샌드위치 검정을 제공하도록 구성되는, 장치.
구현예 55: 구현예 18 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 LFA가 프로브 포획 잔기를 포함하고, 상기 프로브 포획 잔기가 프로브 또는 이의 성분과 상호작용하는, 장치.
구현예 56: 구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액의 성분 및/또는 상기 제2 상 용액의 성분이 LFA 스트립 위 및/또는 내에서 탈수되고, 상기 샘플의 첨가시, 상기 혼합 상 용액이 제1 상 용액 및 제2 상 용액으로 분할되는, 장치.
구현예 57: 구현예 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 LFA가 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 용액을 함유하기에 충분한 용적을 갖는 웰을 포함하는, 장치: 상기 ATPS의 적어도 일부; 상기 제1 상 용액의 적어도 일부; 상기 제2 상 용액의 적어도 일부; 상기 표적 분석물의 재현탁된 용액; 및 이들의 조합.
구현예 58: 구현예 57에 있어서, 상기 충분한 용적이 약 1nl 내지 약 5ml인, 장치.
구현예 59: 구현예 57에 있어서, 상기 웰이 코너, 말단, 중심, 접합부, 오프-센터 및 굴곡부로부터 선택된 LFA의 위치에 배치되는, 장치.
구현예 60: 구현예 56 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 웰이 패드를 포함하는, 장치.
구현예 61: 구현예 60에 있어서, 상기 패드가 염 패드, 완충제 패드, 필터 패드, 계면활성제 패드, 프로브 패드, 중합체 패드 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 장치.
구현예 62: 구현예 1 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 LFA가 다음에 도시된 구조로부터 선택된 구조에 따라 구성되는, 장치: 도 16, 20 및 62 내지 70.
구현예 63: 구현예 1 내지 62 중 어느 하나에 있어서, 상기 LFA가 복수의 경로 루트를 포함하는, 장치.
구현예 64: 구현예 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 LFA가 건조 수신지를 포함하는, 장치.
구현예 65: 구현예 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 작동 완충제를 포함하는, 장치.
구현예 66: 구현예 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가, 샘플을 상기 장치에 투여하기 위한 포트를 포함하는, 장치.
구현예 67: 구현예 66에 있어서, 상기 포트가 상기 ATPS에 접속되는, 장치.
구현예 68: 구현예 66에 있어서, 상기 ATPS 및 상기 LFA가 통합되고, 상기 포트가 상기 LFA에 접속되는, 장치.
구현예 69: 구현예 66 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 포트가 튜브, 깔때기, 밸브, 주사기, 빨대, 채널, 플런저, 피스톤, 펌프 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구조를 포함하는, 장치.
구현예 70: 구현예 1 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 전력 공급원을 필요로 하지 않는, 장치.
구현예 71: 구현예 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 ATPS 및 상기 LFA가 상기 장치의 사용 전에 통합되는, 장치.
구현예 72: 구현예 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 ATPS 및 상기 LFA가 상기 장치의 사용 전에 분리되는, 장치.
구현예 73: 구현예 72에 있어서, 상기 장치가 LFA를 ATPS에 삽입하도록 구성되는, 장치.
구현예 74: 구현예 72 또는 73에 있어서, 상기 장치가 다음을 포함하는, 장치: a: 상기 ATPS를 함유하기 위한 챔버를 포함하는 제1 성분; 및 b: 상기 LFA를 포함하는 제2 성분.
구현예 75: 구현예 1 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 샘플 및/또는 표적 분석물을 ATPS로 전달하는 작동기를 포함하는, 장치.
구현예 76: 구현예 1 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치는 용액을 LFA에 전달하는 작동기를 포함하는, 장치.
구현예 77: 구현예 76에 있어서, 상기 용액이 혼합 상 용액, 제1 상 용액, 제2 상 용액 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 장치.
구현예 78: 구현예 1 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 상기 ATPS 및 상기 LFA가 단일 하우징에 함유되는, 장치.
구현예 79: 구현예 1 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 휴대용 장치인, 장치.
구현예 80: 다음을 포함하는, 샘플에서 표적 분석물을 검출하고/하거나 정량화하는 방법: a: 상기 샘플을 구현예 1 내지 78 중 어느 하나에 따르는 장치에 적용하는 단계; 및 b: LFA 상에서 상기 표적 분석물의 존재 또는 부재를 검출하고/하거나 상기 표적 분석물을 정량화하는 단계.
구현예 81: 구현예 80에 있어서, 상기 방법이 샘플을 ATPS에 적용하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 82: 구현예 80에 있어서, 상기 방법이 샘플을 LFA에 적용하는 단계를 포함하고, 상기 LFA 및 상기ATPS가 통합되는, 방법.
구현예 83: 구현예 80 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 표적 분석물을 ATPS에서 농축시키는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 84: 구현예 80 내지 83 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 표적 분석물을 LFA에서 농축시키는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 85: 구현예 80 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 생물학적 유기체로부터의 조직/유체, 식품 샘플, 화학적 샘플, 약물 샘플, 환경 샘플 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
구현예 86: 구현예 80 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플, 면봉 샘플, 혈청 샘플, 혈장 샘플, 소변 샘플, 타액 샘플 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
구현예 87: 구현예 80 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 샘플이 세균, 바이러스, 원생동물, 조류, 진균, 약물, 병원체, 포유동물, 독소, 환경 오염물질 및 이의 성분, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 공급원으로부터 유래되는, 방법.
구현예 88: 구현예 80 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 분석물이 생물학적 분자를 포함하는, 방법.
구현예 89: 구현예 88에 있어서, 상기 생물학적 분자가 핵산, 단백질, 대사산물, 지질, 소분자, 당, 항체, 항원, 효소 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
구현예 90: 샘플에서 표적 분석물을 검출하기 위한 종이 유체 장치로서, 상기 종이 유체 장치는 다공성 매트릭스를 포함하고, 상기 다공성 매트릭스가 다음과 같은, 종이 유체 장치: a: ATPS 또는 이의 성분을 수용하고/하거나 함유하도록 구성되고, b: 상기 ATPS 또는 이의 성분이 유체 상에 존재하는 경우, 상기 ATPS 또는 이의 성분이 상기 다공성 매트릭스를 통해 유동하도록 구성되고, 유동하도록 하기에 충분한 다공성을 갖는다.
구현예 91: 구현예 90에 있어서, 상기 장치가 ATPS 또는 이의 성분을 함유하는, 종이 유체 장치.
구현예 92: 구현예 90 또는 91에 있어서, 상기 ATPS 또는 이의 성분이 제1 상 용액, 제2 상 용액 및 혼합 상용액으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 상기 혼합 상 용액이 상기 제1 상 용액과 상기 제2 상 용액의 혼합물을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 93: 구현예 91 또는 92에 있어서, 상기 ATPS 또는 이의 성분이 다공성 매트릭스의 적어도 제1 부분위/내에서 탈수되는, 종이 유체 장치.
구현예 94: 구현예 93에 있어서, 상기 다공성 매트릭스의 제1 부분이 상기 다공성 매트릭스의 제2 부분과 상이한 너비를 갖는, 종이 유체 장치.
구현예 95: 구현예 94에 있어서, 상기 장치가, 장치에 샘플의 적용이 ATPS를 수화시키고, 이에 의해 유체 상에 ATPS 또는 이의 성분을 제공하도록 구성되는, 종이 유체 장치.
구현예 96: 구현예 92 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 상기 혼합 상 용액, 상기 제1 상 용액, 상기 제2 상 용액, 상기 샘플, 프로브 및 이들의 조합으로부터 선택된 용액을 함유하기 위한 웰을 추가로 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 97: 구현예 96에 있어서, 상기 웰이 다공성 매트릭스 내 및/또는 위에 웰의 내용물을 방출시키기 위한 작동기를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 98: 구현예 96 또는 97에 있어서, 상기 웰이 패드를 포함하는, 장치.
구현예 99: 구현예 98에 있어서, 상기 패드가 염 패드, 완충제 패드, 필터 패드, 계면활성제 패드, 프로브 패드, 중합체 패드 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 장치.
구현예 100: 구현예 92 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 사용시, 상기 제1 상 용액 및 상기 제2 상 용액이 상이한 속도로 다공성 매트릭스를 통해 유동하는, 종이 유체 장치.
구현예 101: 구현예 92 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 사용시, 상기 제1 상 용액 및 상기 제2 상 용액이 상이한 방향으로 다공성 매트릭스를 통해 유동하는, 종이 유체 장치.
구현예 102: 구현예 92 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 미셀 용액을 포함하고, 상기 제2 상 용액이 중합체를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 103: 구현예 92 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 미셀 용액을 포함하고, 상기 제2 상 용액이 염을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 104: 구현예 102 또는 103에 있어서, 상기 미셀 용액이 계면활성제를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 105: 구현예 104에 있어서, 상기 계면활성제가 비이온성 계면활성제, 쯔비터 이온을 포함하는 계면활성제 및 이온성 계면활성제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 종이 유체 장치.
구현예 106: 구현예 105에 있어서, 상기 미셀 용액이 트리톤-X를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 107: 구현예 93 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 중합체를 포함하고, 상기 제2 상 용액이 중합체를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 108: 구현예 92 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 중합체를 포함하고, 상기 제2 상 용액이 염을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 109: 구현예 108에 있어서, 상기 제1 상 용액이 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 상기 제2 상 용액이 인산칼륨을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 110: 구현예 92 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 상 용액이 표 1의 성분 1로부터 선택되고, 상기 제2 상 용액이 표 1의 성분 2로부터 선택되는, 종이 유체 장치.
구현예 111: 구현예 90 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 다음에 도시된 구조로부터 선택된 구조에 따라 구성되는, 종이 유체 장치: 도 16, 20 및 62 내지 70.
구현예 112: 구현예 90 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 제1 경로 및 제2 경로를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 113: 구현예 112에 있어서, 상기 제1 용액이 상기 제1 경로를 통해 우선적으로 유동하고, 상기 제2 상 용액이 상기 제2 경로를 통해 우선적으로 유동하는, 종이 유체 장치.
구현예 114: 구현예 90 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 프로브-분석물 복합체를 생성하기 위해표적 분석물에 결합하는 프로브를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 115: 구현예 90 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 분석물이 프로브-분석물 복합체 중 프로브에 결합되어 있는, 종이 유체 장치.
구현예 116: 구현예 114 또는 115에 있어서, 상기 프로브가 자기 입자를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 117: 구현예 116에 있어서, 상기 장치가 자기 입자를 다공성 매트릭스의 일부로 유인하도록 배향된 자기장을 추가로 포함하고, 자기 입자 상의 자기장의 힘이 다공성 매트릭스의 일부를 향한 프로브-분석물 복합체의 유동을 향상시키는, 종이 유체 장치.
구현예 118: 구현예 114 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리옥시메틸렌, 폴리테트라플루오로에틸렌(TEFLON®), 덱스트란, 폴리비닐 클로라이드 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중합체를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 119: 구현예 114 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 셀룰로즈 및 키틴으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 생물학적 중합체를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 120: 구현예 114 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 금, 은, 티탄, 스테인레스 강, 알루미늄, 백금 및 이들의 합금, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 금속을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 121: 구현예 114 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 나노입자를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 122: 구현예 121에 있어서, 상기 나노입자가 금 나노입자인, 종이 유체 장치.
구현예 123: 구현예 114 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 코팅을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 124: 구현예 123에 있어서, 상기 코팅이 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로부터 선택된 중합체를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 125: 구현예 123에 있어서, 상기 코팅이 덱스트란을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 126: 구현예 123에 있어서, 상기 코팅이 친수성 단백질을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 127: 구현예 123에 있어서, 상기 코팅이 혈청 알부민을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 128: 구현예 123 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 상기 코팅이 상기 제1 상 용액 또는 상기 제2 상 용액에 대한 친화성을 갖는, 종이 유체 장치.
구현예 129: 구현예 114 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 표적 분석물에 결합하는 결합 잔기를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 130: 구현예 129에 있어서, 상기 결합 잔기가 항체, 렉틴, 단백질, 대사산물, 당단백질, 핵산, 소분자, 중합체 및 지질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 종이 유체 장치.
구현예 131: 구현예 129에 있어서, 상기 결합 잔기가 항체 또는 항체 단편인, 종이 유체 장치.
구현예 132: 구현예 114 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로브가 검출가능한 표지를 포함하는, 종이유체 장치.
구현예 133: 구현예 132에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 비색 표지, 형광 표지, 효소 표지, 컬러리제닉 표지, 방사성 표지 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 종이 유체 장치.
구현예 134: 구현예 90 내지 133 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 건조 수신지를 포함하고, 상기 제1 상용액 또는 상기 제2 상 용액이 상기 건조 수신지를 향해 다공성 매트릭스를 통해 우선적으로 유동하는, 종이 유체 장치.
구현예 135: 구현예 90 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 상기 장치가 작동 완충제를 포함하고, 제1 상 용액및/또는 상기 제2 상 용액이 상기 작동 완충제와 접촉시 다공성 매트릭스를 통해 보다 신속하게 유동하는, 종이 유체 장치.
구현예 136: 구현예 90 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 셀룰로즈, 유리 섬유, 니트로셀룰로즈, 폴리비닐리덴 플루오라이드, 나일론, 전하 변형된 나일론, 폴리에테르설폰 및 이들의 조합으로부터 선택된 재료를 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 137: 구현예 90 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 프로브 포획 잔기를 포함하고, 사용시, 상기 프로브 포획 잔기는 상기 프로브 또는 이의 성분과 상호작용하는, 종이 유체 장치.
구현예 138: 구현예 90 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 표적 분석물 포획 잔기를 포함하고, 사용시 상기 표적 분석물 포획 잔기는 상기 표적 분석물 또는 이의 성분과 상호작용하는, 종이 유체 장치.
구현예 139: 구현예 138에 있어서, 상기 LFA가, 상기 종이 유체 장치가 사용되는 경우 샌드위치 검정을 제공하도록 구성되는, 종이 유체 장치.
구현예 140: 구현예 90 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 표적 분석물을 포함하는, 종이 유체 장치.
구현예 141: 구현예 140에 있어서, 상기 LFA가 상기 종이 유체 장치가 사용되는 경우 경쟁 검정을 제공하도록 구성되는, 종이 유체 장치.
구현예 142: 구현예 90 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 상기 다공성 매트릭스가 표적 분석물이 다공성 매트릭스를 통해 유동할 때 상기 표적 분석물을 농축시키도록 구성되는, 종이 유체 장치.
구현예 143: 구현예 90 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 상기 종이 유체 장치가 대조군 분석물을 추가로 포함하고, 상기 대조군 분석물과 상기 표적 분석물의 다공성 매트릭스 상의 비교가 상기 표적 분석물의 정량화를 제공하는, 종이 유체 장치.
구현예 144: 샘플에서 표적 분석물을 검출하거나 정량화하는 방법으로서, 상기 방법이 다음을 포함하는, 방법: a: 상기 샘플을 구현예 90 내지 143 중 어느 하나에 따르는 장치에 적용하는 단계; 및 b: 상기 표적 분석물의 존재 또는 부재를 검출하고/하거나 표적 분석물을 정량화하는 단계.
실시예
이하의 구체적이고 비제한적인 실시예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다. 추가의 정교화 없이, 당업자는, 본원의 설명에 기초하여, 본 발명을 이의 최대 정도로 사용할 수 있다는 간주된다. 본원에 인용된 모든 공보는 그들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
실시예 1.
자석 또는 고체를 2-상 시스템에서 농축시키기 위해 PEG화 금 나노프로브를 사용한 ATPS
두 접근법은 수성 2-상 시스템(ATPS)을 LFA의 감도를 향상시키기 위한 측방 유동 면역검정(LFA)과 통합시키기 위해 조사했다. 제1 접근법은 ATPS 용액으로부터 표적 단백질을 포획할 수 있는 자기 나노프로브를 수집하기 위해 자석을 사용했다. 제2 접근법은, 그들이 ATPS 및 폴리프로필렌 표면 사이의 고체-액체 계면에서 분할되어 주사기 또는 자석을 사용하지 않고 신속하고 용이한 수집을 가능하게 하도록 나노프로브의 표면 화학이조작된 새롭게 발견된 현상을 사용했다.
효율적으로 자기 나노입자를 회수하기 위해, 필요한 자기 나노입자의 크기는 자기장에 반응하기에 충분히 커야하는 것으로 추측되었다. 그러나, 입자의 크기가 너무 크면, 입자는 LFA 시험 스트립을 통한 이동 곤란함을 겪을 수 있다.
이 문제를 해결하기 위해, 금 코팅된 자기 나노프로브(GMP)와 함께 ATPS가 샘플 용액에서 표적 생체 분자를 먼저 포획하기 위해 사용되었다. 약한 자기장에 반응할 수 있는 용액 또는 거대한 나노프로브에서 입자를 수집하기 위해 고가의 벌키한 자석을 사용하는 것을 피하기 위해, ATPS는 ATPS의 두 벌크 상 중 하나에서 GMP를 먼저 수동적으로 작은 용적으로 농축시키기 위해 사용되었다. 후속적으로, 저가의 휴대용 자석이 GMP와 포획된 생체 분자를 신속하게 회수하기 위해 사용되었다. GMP 상의 금 코팅이 LFA의 비색 지시제로서 작용하기 때문에, GMP는 LFA 스트립에 직접 적용했다.
GMP의 자기 추출을 향상시키기 위해 ATPS를 사용하는 것 이외에, ATPS의 상 분리가 GMP 및 자기력의 사용으로부터 이득을 얻었음이 밝혀졌다. PEG-염 ATPS 상은 시간 순으로 완전히 분리된다. 거시적 PEG 결핍 상에서 PEG 풍부 도메인의 최소한의 유입 결과로서 하부 PEG 결핍 상에서 나노프로브의 농도가 일정하게 잔류하기 때문에, 농축된 샘플의 추출이 시스템이 평형에 도달하기 전에 발생할 수 있지만, 후속적 LFA를 위해 추출될 하부 상의 충분한 용적을 달성하기 위해 여전히 30분이 필요했다. 또는, ATPS 중의 GMP는 상 분리가 유발되었을 때 극도로 거의 즉시 PEG 결핍 도메인으로 분할되었다. GMP를 함유하는 PEG 결핍 도메인은, 가능하게는 그들이 자기장에 반응할 때 그들과 함께 PEG 결핍 도메인을 드래그하는 GMP에 기인하여 자력의 존재하에 서로 찾아 보다 용이하게 병할될 수 있다. 중력과 함께, 이 힘은 PEG 결핍 도메인의 병합을 추가로 촉진시켜 가속화된 상 분리를 유도하고단지 10분 이내에 추출하기 위한 하부 상의 충분한 용적을 수득하였다.
이 연구에서, 유동 문제 없이 LFA 시험 스트립을 통해 이동하기에 충분히 작은 GMP가 먼저 제조되었다. 이어서, 이러한 GMP는 다음을 수득하는 PEG-염 ATPS 용액에서 모델 단백질, 트랜스페린(Tf)을 포획하기 위해 사용되었다: 9:1 (상부 상: 하부 상) 용적 비. 작은 자석(1/8'' 직경 x 1/32'' 두께)을 상 분리를 촉진시키기 위해 용액에 배치했다. GMP 및 포획된 단백질을 10분 후 회수하고, 작은 자석을 제거하고, GMP-Tf 복합체를 검출용 LFA에 직접 적용했다.
상기 접근법이 자기 나노프로브와 함께 ATPS를 사용하여 Tf를 효율적으로 농축시키고 검출하였지만, 작은 자석은 여전히 필요했다. 다음 접근법은 외부 자기장을 사용하지 않고 표적-나노프로브 복합체를 추출하는 가능성을 탐구했지만, PEG화 금 나노프로브(PGNP)의 표면 화학은 ATPS와 폴리프로필렌(PP) 표면 사이의 고체-액체 계면에서 극도로 분할되도록 조작되었다. 이러한 독특한 현상은, PGNP가 중합체 또는 염으로만 구성된 수용액이 사용되었을 때 고체-액체 계면에서 분할되지 않았기 때문에, ATPS-특이적인 것으로 밝혀졌다. 또한, 이 현상은 또한 PGNP가 유리 표면에서가 아니라 본 ATPS 중의 폴리프로필렌(PP) 표면에서극도로 분할되기 때문에, 재료 특이적인 것으로 밝혀졌다.
PP-ATPS 고체-액체 계면으로서 표적-PGNP 복합체의 수집을 촉진시키기 위해, 항-Tf 항체로 장식된 PGNP를 Tf를 함유하는 ATPS 용액에 첨가한 다음, 시판되는 PP 빨대를 ATPS에 침수시켰다. PGNP는 ATPS에서 먼저 표적 단백질을 포획한 다음, PP 표면에서 우선적으로 분할된다. 10분 후, PP 빨대는 여전히 표면에 흡착된 단백질-GNP 복합체의 상당량과 함께 ATPS로부터 제거했다. 이는 주사기를 사용하여 농축된 Tf-PGNP를 수동으로 추출할 필요성을 효율적으로 제거했다.
이 연구에서, PGNP는 ATPS 중 PP-액체 계면에서 분할되었다. 이어서, 이러한 PGNP는 1:1 용적 비를 수득한 PEG-염 ATPS 용액에서 Tf를 포획하기 위해 사용했다. PP 빨대를 ATPS 용액에 침수시키고, PGNP 및 포획된 단백질은 뺄대를 용액으로부터 당겨서 10분 후에 회수했다. 빨대 상의 PGNP-Tf 복합체는 작동 완충제로 세척하고, 검출용 LFA에 직접 적용했다. PP-ATPS 계면과 관련된 최소 용적 및 빨대로부터 PGNP를 세척 제거하기 위해 필요한 소용적에 기인하여, PGNP를 극도로 농축시키고, LFA 중의 Tf의 검출 한계는 50배까지 개선시켰다.
LFA 스트립을 제조하기 위해, 경쟁 메커니즘을 사용하는 LFA 시험을 실시하였다. 경쟁 검정에서, 목적하는 표적은 시험 라인을 형성하기 위해 니트로셀룰로즈 멤브레인 위에 고정시킨다. 나노프로브(GMP 또는 PGNP) 상의 1차 항체에 대한 고정된 2차 항체가 대조군 라인을 구성한다. LFA에서, 샘플이 먼저 나노프로브와 접촉하면, 표적 분자가 샘플에 존재하는 경우, 그들은 나노프로브 상에 장식된 그들의 특이적 항체에 결합한다. 샘플에 존재하는 표적 분자가 나노프로브 상의 항체를 포화시키면, 이러한 나노프로브는 더 이상시험 스트립 상의 고정된 표적 분자에 결합할 수 없다. 그 결과, 나노프로브는 시험 라인에서 시각적 밴드를 형성하지 않고, 이는 양성 결과를 나타낸다. 한편, 샘플이 나노프로브 상의 항체를 포화시킬 수 있는 농도로 표적 분자를 함유하지 않는 경우, 나노프로브 상의 이러한 항체는 시험 스트립 상의 고정된 표적 분자에 결합하여 시험 라인에서 시각적 밴드를 형성할 수 있다. 이는 음성 결과를 나타낸다. 또한, 샘플에 표적 분자의 존재와 무관하게, 나노프로브 상의 항체는 대조군 라인 상의 고정된 2차 항체에 결합하여, 충분한 샘플이 시험 라인을 통해 위킹되어 대조군 라인에 도달했음을 나타낸다. 가시성 대조군 라인의 존재는 유효 시험을 나타낸다.
GNP를 제조하기 위해, 50nm의 직경을 갖는 산화철 자석 나노입자를 금으로 코팅했다. 간단하게, 산화철 입자는 0.01 M 나트륨 시트레이트로 희석시키고, 10분 동안 교반했다. 후속적으로, 1% w/v 염화금 용액의 4회 첨가를 10분 간격으로 교반하면서 산화철 나노입자 용액에 적용했다. 용액은 염화금의 첨가 후 검은색에서 밤색으로 변했다. 이어서, 금 코팅된 자기 나노입자는 자석을 사용하여 회수했다.
수집기는 음용 빨대의 끝에 작은 네오디뮴 자석(1/8'' 직경 x 1/32'' 두께, KJ Magnetics, Philadelphia, PA)을 배치함으로써 구축되었다. 자석은 용액에서 GMP와 직접적 접촉을 피하기 위해 파라필름으로 감쌌다.
GMP가 PEG-염 ATPS의 하부, PEG 결핍 상에서 극도로 분할되는지를 확인하기 위해, 30μL의 GMP를 9:1 용적비를 수득한 2mL ATPS 용액에 첨가했다. 자석의 존재가 상 분리를 촉진시키는지를 확인하기 위해, 분할 실험은 자기 수집기를 사용하거나사용하지 않고 수행했다. 하부 상의 용적은 10분 및 30분에 각 실험에 대해 측정했다.
이어서, GMP가 ATPS 및 LFA와 함께 도입될 수 있는지를 시험했다. 먼저, Tf의 다양한 농도로 스파이킹된 2mL의 9:1 ATPS 용액을 제조했다. 30 μL의 GMP를 각 용액에 적용한 다음, 자기 수집기를 첨가했다. 용액을 25oC 수욕에 배치하고, 10분 동안 배양했다. 배양 기간 후, 수집기를 용액으로부터 제거하고, 50 μL의 작동 완충제를 함유하는 튜브로 옮겼다. 작은 자석을 빨대로부터 제거하고, 빨대 상에서 수집된 GMP는 수초 동안 작동 완충제 중에서 빨대를 진탕시켜 세척 제거했다. 이어서, 빨대를 제거하고, LFA 시험 스트립을 수집된 GMP를 함유하는 작동 완충제에 침지시켰다. 10분 후, 시험 스트립을 튜브로부터 제거하고, 시험 스트립의 이미지를 다음을 사용하여 촬영했다: 캐논 EOS 1000D 카메라 (Canon U.S.A., Inc., Lake Success, NY).
직경이 약 25 내지 30nm인 입자 크기를 갖는 투명한 체리색 용액을 생성하기 위해 노출된 금 나노입자를 제조했다. PGNP를 제조하기 위해, 320mg의 염소 항-Tf 항체를 30분 동안 20mL의 콜로이드성 금 용액으로 배양한 다음, 다음에 대한 5000:1의 몰 비를 사용하여 티올화-PEG2000을 첨가했다: PEG: NP 및 추가의 배양 30분. 콜로이드성 금의 표면에 대한 다른 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 2mL의 10% 소 혈청 알부민(BSA) 용액을 혼합물에 첨가하고, 추가의 15분 동안 혼합했다. 생성된느 용액을 배양 기간 동안 진탕기 상에서 완만하게 혼합했다. 유리 비결합 항체, PEG 및 BSA를 제거하기 위해, 혼합물을 후속적으로 4oC 및 9,000 g에서 30분 동안 원심분리시켰다. PGNP의 펠렛은 1% BSA 용액으로 세척하고, 이 세척 단계를 2회 반복했다. 최종적으로, 회수된 PGNP를 pH 9.0에서 3mL의 0.1M 붕산나트륨 완충제에 재현탁시켰다.
1:1 용적비를 수득하고 가변적인 Tf 농도가 함유된 PEG-염 ATPS 용액을 유리 튜브에서 먼저 제조했다. 5μL의 GNP 용액을 최종 용적 1mL로 Tf-ATPS 용액에 첨가했다. ATPS 용액을 충분히 혼합하고, PP 빨대를 각 ATPS 용액에 삽입했다. 이어서, 용액을 15분 동안 25oC에서 배양했다. 각 혼합물을 위해, PP 빨대를 ATPS 용액으로부터 조심스럽게 제거했다. PP-ATPS 계면의 총 용적이 약 1μL이었음을 가정하여, 50μL의 총 용적을 달성하기 위해 ATPS 용액에 함침된 빨대의 부분으로부터 흡착된 Tf-GNP 복합체를 세척하기 위해 49μL의 시험 완충제를 사용했다. 빨대의 내부 및 외부 표면 모두를 총 10초 동안 세척했다. 이어서, LFA 시험 스트립을 샘플 패드가 혼합물과 접촉되도록 수직으로 침지시켰다. 10분 후, 스트립을 혼합물로부터 인취하고, 시험 스트립의 이미지는 다음을 사용하여 즉시 촬영했다: 캐논 EOS 1000D 카메라(Canon, U.S.A., Inc., Lake Success, NY).
이 연구에서 개발된 GMP는 다음 4개의 기능을 달성했다: (1) 샘플에서 표적 단백질을 포획하고; (2) ATPS의 벌크 상 중 하나에서 극도로 분할하고; (3) 저렴한 휴대용 자석에 의해 수집되고; (4) 추출되고 LFA 종이 스트립에 적용된 후, 직접 LFA용 비색 지시제로서 기능한다. 기능 (2) 및 (3)은 GMP을 PEG-염 ATPS 용액에 배치함으로써 입증되었다. 다음에 도시된 바와 같다: 도 21a, GMP와 PEG 풍부 상 중의 PEG 분자의 더 큰 수 사이에서 작동하는 반발성 입체 배제-용적 상호작용에 기인하여, GMP가 하부 PEG 결핍 상에서 극도로 분할된다는 것이 관찰되었다. 이는 GMP를 작은 용적으로 농축시키는 것을 가능하게 하고, 이는 훨씬 더 작고 더 가벼운 자석을 사용하여 이들의 수집을 가능하게 했다(도 21b). 또한, 이러한 GMP는 이들이 자석에 근접해 존재할 때 매우 반응성이었기 때문에, 입자는 신속하게 회수되어 후속적 검출을 위해 옮겨질 수 있었다(도 21c). 마지막으로, 이 접근법을 사용함으로써, GMP는 매우 작은 용적으로 수집될 수 있었고, 이는 표적단백질의 극단적인 농도를 가능하게 했다.
GMP가 ATPS와 함께 사용될 때 LFA의 감도를 향상시킬 수 있었는지를 확인하기 위해, 사전 농축단계를 사용하거나 사용하지 않는 예비 LFA 연구를 수행했다(도 22).
ATPS와 LFA를 통합시키기 위한 제2 접근법은 ATPS와 폴리프로필렌(PP) 고체 사이의 고체-액체 계면에서 PEG화 금 나노프로브(PGNP)를 구동시키기 위한 것이었다. 제1 접근법과 유사하지만, 이 접근법은 더 이상 외부 자석을 필요로 하지 않는다. 이 메커니즘은 ATPS를 필요로 한다. 다음에 도시된 바와 같다: 도 23a 및 b, PEG 단독 또는 염 단독 수용액이 사용될 때, PGNP는 고체-액체 계면에서 분할되지 않았다. 실제로, PGNP는 고체-액체 계면에 대한 선호 없이 각 수용액에 걸쳐 균일하게 분산되는 것으로 나타났다. PGNP가 상 분리된 ATPS의 존재하에서만 고체-액체 계면에서 분할되는 것으로 밝혀졌기 때문에, 1:1 용적비를 갖는 ATPS가 ATPS 상이 다른 용적비를 갖는 ATPS와 비교될 때 가장 빨리 분리되기 때문에 이 연구에 사용되었다. 도 23c는 10분 후 PP 빨대 상의 PGNP의 극도의 분할 거동을 입증한다. PP 빨대는 또한 농축된 표적-PGNP 복합체의 용이한 추출을 가능하게 했다. 빨대가 철회된 후, 수집된 PGNP는 작동 완충제를 사용하여 용이하게 세척 제거하고, LFA에 직접 적용했다(도 23d).
LFA 결과는 다음에 나타낸다: 도 24. 각 시험은 유체가 스트립을 통해 완전히 유동되었음을 나타내고, 시험의 유효성을 확인한 대조군 라인의 존재를 나타냈다. Tf가 부재한 음성 대조군을 위해, 시험 라인을 나타내고, 따라서 진정한 음성 결과를 나타냈다. 높은 Tf 농도(10ng/μL)에서, 시험 라인은 나타나지 않았고, 따라서 진정한 양성 결과를 나타냈다. 그러나, 사전 농축 단계가 없는 경우에 낮은 Tf 농도에서, 가시성 시험 라인이 나타나서 PGNP 상에 장식된 항체를 포화시키기 위한 샘플에 불충한 양의 Tf가 존재했음을 시사했다. 따라서, 이러한 시험은 거짓 음성 결과는 나타냈다. 이 접근법을 사용하는 LFA 결과는 상부 패널에 나타낸다(도 24 상부). 거짓 음성 결과가 사전 농축 없이 LFA 연구에서 1ng/μL에서 나타났기 때문에, 이는 Tf에 대한 LFA의 검출 한계가 10ng/μL였다는 것을 나타냈다.
LFA의 성능을 향상시키기 위해, 단일 LFA 시험에 사용된 것과 동일량의 PGNP를 1ng/μL의 Tf 농도를 갖는 ATPS 용액에 배치시켰다. 이 ATPS 용액의 용적을 LFA 스트립에 사용된 용적과 비교하여 50배까지 증가시킴으로써, PGNP는 50배 더 많은 Tf와 상호작용할 수 있었고, 따라서 높은 수준의 포화를 달성할 수 있었다. 그러나, PGNP가 또한 50배 희석되었기 때문에, 그들은 검출 전에 농축되고 수집될 필요가 있다. PP 빨대를 ATPS 용액에 배치함으로써, PGNP는 빨대의 표면에서 극도로 분할되었다. ATPS 용액을 실온에서 10분 동안 배양한 후, PP 빨대는 용액으로부터 제거했다. 고체 표면 상 물질이 전형적으로 회수되지 않는 다른 흡착 현상과 달리, PGNP는 빨대를 작동 완충제로 세정함으로써 용이하게 회수되었다. 이어서, PGNP를 함유하는 이 완충제를 LFA에 직접 적용했다. 이 접근법을 사용하는 LFA 결과는 하부 패널에 나타낸다(도 24 하부). 0.2ng/μL가 진정한 양성 결과를 입증한 최저 농도이기 때문에, Tf에 대한 LFA의 검출 한계는 10ng/μL로부터 0.2ng/μL로 50배 개선으로 향상되었다. 휴대용 장치는 이러한 두 접근법을 사용하고, 사용자가 최소 단계로 검정을 작동시킬 수 있도록 한다(도 25).
실시예 2
ATPS 및 덱스트란 코팅된 금 나노입자
전통적인 시트레이트 캡핑되거나 노출된 금 나노입자는 전형적으로 표면 시트레이트 이온의 음전하로부터 생성되는 정전기적 반발 상호작용에 기인하여 수용액에서 응집되지 않는다. 그러나, 이들은 높은 이온 강도의 용액에서 응집되고, 여기서 반 데르 바알스(van der Waals) 인력 상호작용은 정전기적 반발 상호작용보다 더 커진다. 덱스트란 코팅된 금 나노입자는 환원제 및 안정화제 둘 다로서 시트레이트 대신 덱스트란을 사용함으로써 성공적으로 제조했다. 덱스트란 코팅된 금 나노입자의 안정성은 전통적인 시트레이트 캡핑된 금 나노입자 및 통상 사용된 PEG 코팅된 금 나노입자와 비교했다. PEG-염 ATPS의 상 분리 거동은 실온에서 DGNP의 신속한 추출이 가능하도록 최적화되었다. DGNP의 분할 거동은 후속적으로 PEG-염 ATPS에서 조사했다. 철 수송을 위한 통상적인 혈청 단백질인 트랜스페린(Tf)이 모델 단백질 바이오마커로서 선택되었다. Tf에 대한 LFA의 검출 한계는 DGNP를 사용하는 사전 농축 ATPS 단계를 사용하거나 사용하지 않고결정했다. LFA의 정성적 결과는 시각적으로 해석하고, LFA 결과의 추가의 정량적 확인을 위해 컴퓨터 이미지 분석도 또한 수행했다.
전통적 시트레이트 캡핑되거나 노출된 금 나노입자가 제조되었다. 간단하게, 10mL의 ddH2O를 교반하면서 100oC로 가열했다. 가열돈 용액이 비등하기 시작할 때, 100μL의 1% w/v 염화금(III) 용액을 첨가했다. 용액을 교반하고 1분 동안 비등시키고, 이후 25μL의 6% w/v 나트륨 시트레이트 용액을 첨가했다. 용액은 신속하게 짙은 자주색에서 투명하고 짙은 체리색으로 변했고, 이 후 이를 실온으로 냉각시키고, 4oC에서 저장했다.
PEG-코팅된 (PEG화) 금 나노입자를 제조하기 전에, 이미 제조된 노출된 금 나노입자 용액의 농도를 결정했다. 임의의 소정의 PEG:금 나노입자 몰 비를 위해 필요한 PEG의 양을 결정하기 위해 사용되는 이 농도는 1cm의 경로 길이로 비어 법칙(Beer’s Law)을 사용하여 계산하였다:
여기서, C는 몰 농도 단위의 금 나노입자의 농도이고, A는 금 나노입자의 피크 흡광도 값이고, ε은 M-1cm-1 단위의 몰 흡광 계수이고, l은 cm 단위의 경로 길이이다. ε 값을 결정하기 위해, 나노입자의 직경은 먼저 제타사이저 나노 ZS 입자 분석기(Malvern Instruments Inc, Westborough, Massachusetts)를 사용하는 동적 광 산란(DLS)에 의해 정량화했다. 이어서, 몰 흡광 계수는 비비인터네셔날 라이프 사이언시즈(BBInternational Life Sciences)(Madison, WI)에 의해 제공된 데이터 시트로부터 판독했고, 이는 ε 값을 금 나노입자의 직경과 상관시켰다. 이어서, 금 나노입자의 피크 흡광도 값은 UV-가시 분광광도계(Thermo Fisher Scientific, Madison, Wisconsin)를 사용하여 정량화하고, 농도는 다음을 사용하여 결정했다: Eq. (1).
메톡시-폴리에틸렌 글리콜(PEG)-티올 (MW 5000, Nanocs Inc., New York, NY)은 금 나노입자 표면을 PEG 층으로 장식하기 위해 사용되었다. 간단하게, 5mL의 노출된 금 나노입자 용액은 먼저 1N NaOH 용액을 사용하여 pH 9.0로 조정했다. 메톡시-PEG-티올을 다음으로 입자 용액에 첨가했다: 50,000:1 PEG: 금 나노입자 표면이 완전히 코팅되었음을 보장하기 위한 나노입자 몰 비. 이어서, 혼합물을 실온에서 30분 동안 반응시켜 PEG 상의 티올 그룹이 금 나노입자와 배위 결합을 형성하도록 했다. 유리 PEG는 30분 동안 9000 g에서 원심분리하여 제거했다. 생성되는 PEG화 금 나노입자를 500μL의 ddH2O에 재현탁시켰다.
덱스트란 코팅된 금 나노입자가 제조되었다. 간단하게, 12g의 덱스트란 (MW 15,000 - 25,000)을 다음에 용해시킨다: 160mL의 초순수 멸균수 (Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA), 용액을 교반하면서 100oC로 가열했다. 가열된 용액이 비등하기 시작할 때, 2.16mL의 1% w/v 염화금(III) 용액을 첨가했다. 용액을 교반하고, 용액의 색이 자주색으로 바뀔 때까지 20분 동안 비등시켰다. 이어서, 용액을 실온으로 냉각시키고, 4oC에서 저장했다. 과량의 덱스트란은 후속적으로 9000 g에서 30분 동안 원심분리시켜 제거했다.
노출된(즉, 시트레이트 캡핑된), PEG화 및 덱스트란 코팅된 금 나노입자 용액을 다양한 농도의 스톡 인산칼륨 용액과 별도로 혼합했다. 혼합 용액을 실온에서 30분 동안 배양했다. 각 샘플의 흡광도 스펙트럼은 UV-가시 분광광도계를 사용하여 결정했다. 임계 응집 농도(CCC)는 피크 흡광도 파장 부근의 GNP 용액의 흡광도 스펙트럼이 세기가 상당히 감소되는 염 농도로서 동정되었다.
스톡 인산칼륨 용액 (5:1 이염기성: 일염기성)은 둘베코 인산염 완충된 생리 식염수(PBS)(Invitrogen, pH 7.4, 1.47 mM KH2PO4, 8.10 mM Na2HPO4, 138 mM NaCl, 2.67 mM KCl 및 0.495 mM MgCl2 함유)에서 제조했다. 후속적으로, 수톡 폴리에틸렌 글리콜 (MW 8000, VWR, Brisbane, CA) 용액을 PBS에서 제조했다. 스톡 용액을 사용하여, PBS 중의 2mL PEG-염 ATPS 용액은 9:1의 PEG 풍부(염 결핍):PEG 결핍(염 풍부) 용적비를 수득하는 PEG 및 염의 특정 농도에서 제조했다. 이 용적비는 ATPS 용액을 실온에서 최소 12시간 동안 배양한 후 측정했다.
요오드-125 (125I)를 염소 항-Tf 항체(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)의 티로신 잔기를 방사성 표지하기 위해 사용했다. 간단하게, Na125I (MP Biomedicals, Irvine, CA)는 IODO-BEADS (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)로 활성화되었다. 후속적으로, 활성화된 125I를 염소 항-Tf 항체와 15분 동안 반응시켰다. 방사성 표지된 항체는 세파덱스 G15 크기 배제 컬럼을 사용하여 유리 125I로부터 정제하였다. 방사성 표지된 항체의 비활성 및 농도는 포스포텡스텐산 검정에 의해 결정되었다.
덱스트란 코팅된 금 나노프로브(DGNP)를 제조하기 위해, 10mL의 이미 제조된 덱스트란 코팅된 금 나노입자 용액을 먼저 1N NaOH을 사용하여 pH 9.0으로 조정했다. 후속적으로, 80μg의 염소 항-Tf 항체를 덱스트란 코팅된 금 나노입자 용액에 첨가했다. 이어서, 혼합물을 실온에서 30분 동안 반응시켜 항체가 입자와 배위 결합을 형성하도록 하였다. 유리 비결합 항체는 9000 g에서 30분 동안 원심분리시켜 제거했다. 회수된 DGNP는 BSA가 비특이적 결합을 방지하기 위해 DGNP 상의 임의의 유리 표면을 피복할 수 있도록 1% 소 혈청 알부민(BSA) 용액으로 추가로 세척했다. 과량의 BSA 및 추가의 비결합 항체는 9000 g에서 30분 동안 원심분리로 제거했다. 회수된 DGNP는 1mL의 0.1M 붕산나트륨 완충제(pH 9.0)에 재현탁시켰다.
PEG-염 ATPS 중의 DGNP의 분할 거동을 연구하기 위해, ATPS 용액의 각 상 중의 DGNP의 농도를 정량화했다. 방사성 표지된 DGNP는 방사성 표지된 염소 항-Tf 항체를 덱스트란 코팅된 금 나노입자 상에 접합시킴으로써 제조되었다. 각 분할 실험을 위해, 200μL의 방사성 표지된 DGNP 용액을 각각 2ml의 최종 용적으로 3개의 동일한 PBS 중의 PEG-염 ATPS 용액에 첨가했다. 혼합물을 25 ℃에서 30분, 2시간, 4시간 및 12시간 동안 배양했다. PEG-풍부 염 결핍 상부 상 및 PEG 결핍 염 풍부 하부 상을 조심스럽게 추출시키고, 각 상의 용적을 측정했다. 각 상 중의 방사성 표지된 DGNP의 양은 코브라 시리즈 오토-감마 카운터(Cobra Series Auto-Gamma Counter)를 사용하여 DGNP에 접합된 방사성 표지된 항체의 방사능을 측정함으로써 정량화했다.
경쟁 LFA가 이 연구에 사용되었고, 상세한 개략도는 다음에서 발견될 수 있다: 도 27. 우선, 시험 라인을 형성하기 위해 Tf 단백질을 니트로셀룰로즈 멤브레인에 고정시켰다. DGNP 상에서 1차 항체에 결합할 수 있는 2차 항-IgG 항체를 또한 대조군 라인을 형성하기 위해고정된 Tf 단백질의 하류에 고정시켰다. Tf 단백질이 샘플 용액에 존재하지 않으면, DGNP는 스트립 상에 인쇄된 Tf에 결합하여 시험 라인에서 가시 밴드를 형성한다. 한편, Tf 단백질이 샘플에 존재하면, 그들은 먼저 DGNP의 표면에서 그들의 특이적 항체에 결합한다. DGNP가 Tf 단백질로 포화되면, DGNP는 스트립 상에 인쇄된 Tf를 바이패싱하여 시험 라인에서 가시 밴드의 부재를 유도한다. 과량의 DGNP는 여전히 대조군 라인에 결합하여, 유체가 실제로 스트립을 통해 유동했고 결과가 유효하다는 것을 나타낸다. 요약하면, 음성 시험은 시험 라인에서 하나 및 대조군 라인에서 하나로, 두 개의 가시 밴드에 의해 나타난 반면, 양성 시험은 대조군 라인에서 하나의 가시 밴드에 의해서만 나타냈다.
PEG-염 ATPS 예비 농축 단계 없는 LFA는 ATPS와 조합 전에 수행했다. 이 연구에서, 가변 농도의 Tf를 함유하는 PBS 용액을 제조하고, 각 Tf 농도를 3회 시험했다. 각 LFA 스트립을 위해, 10μL의 상응하는 Tf 용액을 시험 스트립을 통한 샘플의 유동을 보조하기 위해 사용된 30μL의 시험 완충제(0.2% BSA, 0.3% 트윈20, 0.2% 나트륨 아지드, 0.1% 폴리에틸렌 글리콜, 0.1M 트리즈마 염기, pH 8) 및 10μL의 DGNP 용액과 혼합했다. 샘플 패드가 혼합물과 접촉되도록 LFA 시험 스트립을 각 혼합물에 수직으로 침지시켰다. 10분 후, 스트립을 혼합물로부터 인출하고, 결과는 시각적으로 판독하고, MATLAB를 사용하여 정량화했다.
PEG-염 ATPS 예비농축 단계를 갖는 LFA를 후속적으로 수행했다. 이러한 실험에서, 가변적인 Tf 농도를 함유하는 ATPS 용액을 먼저 제조하고, 각 Tf 농도를 3회 시험했다. 하부 상의 용적이 약 200μL였기 때문에, LFA 시험이 ATPS 단계 없이 수행될 때와 유사한 DGNP 농도를 달성하기 위해 100μL의 DGNP 용액을 최종 용적 2mL로 Tf/ATPS 용액에 첨가했다. ATPS 용액을 충분히 혼합하고, 25oC에서 30분 동안 배양했다. 각 혼합물을 위해, 20μL의 PEG 결핍 하부 상을 추출시키고, ATPS 단계가 없는 연구에서 사용된 용적과 일치하도록 30μL의 시험 완충제와 혼합했다. LFA 시험 스트립을 샘플 패드가 혼합물과 접촉되도록 수직으로 침지시켰다. 10분 후, 스트립을 혼합물로부터 인출하고, 결과는 시각적으로 판독하고, MATLAB를 사용하여 정량화했다.
맞춤 MATLAB 스크립트는 생성되는 이미지를 정량적으로 분석하기 위해 작성되었다. LFA 시험이 완료된 직후, 시험 스트립의 이미지는 다음을 사용하여 촬영했다: 캐논 EOS 1000D 카메라 (Canon U.S.A., Inc., Lake Success, NY). 이미지 사이의 일관성을 보장하기 위해, 조명을 조절하고, 각 스트립을 동일한 방식으로 배향시켰다. 이러한 이미지를 크롭핑하고, 8-비트 그레이스케일 매트릭스로 변환시켰다. 강도는 유동에 수직인 축 및 시험 및 대조군 라인에 평행인 축에 따라 평균하고, 1차원 강도 맵을생성했다. 두 개의 최대 값은 대조군 및 시험 라인으로서 동정되고, 이러한 두 라인 사이의 거리는 (강력한시험 및 대조군 라인을 갖는) 음성 대조군을 사용하여 교정하였다.
샘플 데이터의 세트로부터 시험 라인 강도를 수득하기 위해, 대조군 라인의 위치를 동정하고, 시험 라인 위치는 사전에 교정된 거리를 사용하여 결정했다. 시험 라인 영역은 이 시험 라인 위치를 중심으로 하는 15 픽셀-폭 영역으로서 설정했다. 이어서, 이 측정을 위한 기준은 시험 라인의 양 측면에 위치된 두 개의 25 픽셀-폭 영역으로부터의 신호를 평균함으로써 결정되었다. 제1 기준 영역은 시험 라인 위치의 25 픽셀 상류에서 시작하여 25 픽셀 하류를 계속하는 반면, 나머지는 시험 라인 위치의 25 픽셀 하류에서 시작하여 25 픽셀 하류를 계속했다. 이어서, 시험 라인 강도는 시험 라인에 결합되어 있는 모든 DGNP의 효과를 포획하기 위해 시험라인 영역의 곡선하 면적으로서 계산했다.
노출된, PEG화 및 덱스트란 코팅된 금 나노입자 샘플의 임계 응집 상수(CCC) 값은 덱스트란 코팅이 PEG-염 ATPS 용액에서 금 나노입자에 필요한 입체 안정성을 제공하는지의 여부를 결정하기 위해 측정하였다. 금 나노입자의 흡광도 스펙트럼의 피크 흡광도 파장은 약 535nm였다. 따라서, 금 나노입자의 각 형태에 대한 535nm 부근의 흡광도 스펙트럼은 인산칼륨 농도 범위에걸쳐 관찰되었는데, 이는 인산칼슘이 PEG-염 ATPS의 염 성분이기 때문이다. 결과는 다음에 나타낸다: 도 28. 각 플롯을 위해, 피크 흡광도 값은 1.0의 값 (또는 100% 정규화된 흡광도)을 할당하고, 그 플롯의 나머지 흡광도 값은 따라서 조정했다. 이러한 플롯으로부터, 노출된 금 나노입자의 CCC는 0.3 내지 0.4% w/w 인산칼륨이었고; PEG화 금나노입자의 CCC는 7.5 내지 10% w/w 인산칼륨이었고; 덱스트란 코팅된 금 나노입자의 CCC는 30% w/w 초과의 인산칼륨이었음이 결정되었다. 이러한 결과는, 덱스트란 코팅된 금 나노입자가 인산칼륨 염 용액에서 심지어 PEG화 금 나노입자보다 더 안정했다는 것을 나타냈다. 또한, 30% w/w 인산칼륨이 하부 상 인산칼륨 농도(약 10% w/w)보다 크기 때문에, 덱스트란 코팅된 금 나노입자가 본 PEG-염 ATPS 용액에서 안정하고 기능적으로 잔류할 것으로 기대되었다. 이는 본원에 기재된 연구에서 이들의 성공적인 사용으로 확인되었다.
방사성 표지된 DGNP의 분할 거동은 먼저 다음을 포함하는 PEG-염 ATPS 용액에서 시각적으로 관찰하였다: 9:1 PEG 풍부: PEG 결핍 용적비. 초기에, DGNP를 함유하는 PEG-염 ATPS 용액은 불투명하고 연한 자주색을 나타냈다(도 29a). 이어서, 짙은 자주색이었던 하부 상이 나타나 DGNP가 PEG 결핍 하부 상에서 극도로 분할된다는것을 나타낸다(도 29b). 경시적으로, 하부 상은 DGNP 풍부, PEG 결핍 도메인이 ATPS 용액의 하부로 이동할 때 용적이 성장했다. 대조적으로, DGNP는 상부 상이 매우 약간의 자주색을 가질 때 상부 PEG 풍부 상에서 최소한의 분할을 나타냈다. 12시간 평형 시간 후, 상부 및 하부 상의 용적은 더 이상 변하지 않았고, 상부 상은 투명하게 나타났고, 모든 DGNP 풍부, PEG 결핍 도메인이 ATPS 용액의 하부에 도달했음을 시사한다(도 29c). 약 30분 후, 하부 상의 색상 강도는 경시적으로 변하지 않았고, 하부 상에서 DGNP 농도가 30분내지 12시간 동안 비교적 일정하게 잔류했다는 것을 시사한다.
이어서, 두 상 사이에서 방사성 표지된 DGNP의 분할 거동은 이하에서 정의된 분할 계수(KDGNP)에 의해 정량화하였다:
여기서, CDGNP, 상부 및 CDGNP, 하부는 각각 상부 및 하부 상에서 DGNP의 농도이다. KDGNP 값은 0.00605 ± 0.00010인 것으로 측정되었고, 이는 비교적 큰 DGNP가 PEG 결핍 하부 상에서 극도로 분할되어야 한다는 생각과 일치했다.
DGNP가 예측 방식으로 PEG-염 ATPS에서 농축될 수 있음을 증명하기 위해, 농도 계수, 또는 DGNP의 농도배 개선을 9:1 PEG-염 ATPS 용액에서 측정하였다. 농도 계수는 초기 DGNP 농도, CDGNP, 초기에 의해 나누어진 하부 상에서 DGNP의 농도, CDGNP, 하부로서 정의된다.
농도 계수의 표현은 ATPS 용액에서 DGNP에 대한 몰 균형 방정식으로 개시함으로써 도출될 수 있다:
여기서, V상부 및 V하부는 각각 상부 및 하부 상의 용적이다. 다음 방정식을 조합한다: (2) 및 (3), 다음 방정식을 재배열한다: (4), 다음을 수득한다:
DGNP의 분할 계수가 V하부/V상부보다 작기 때문에, 농도 계수는 다음과 같이 추가로 간략화될수 있다:
이는 농도 계수가 단지 극도의 KDGNP 값에 대한 용적비의 함수임을 의미한다. 따라서, 9:1의 용적비, 또는 전체 용액의 용적의 1/10인 하부 상 용적으로, 농도 계수 10이 기대된다. 이는 DGNP에 대한 분할 실험에 의해 확인되었고, 여기서 CDGNP, 하부는 12시간 배양 후 측정되었다. 그러나, 관리 시점 적용에서 ATPS가 거시적 상 분리 평형을 달성하기 위해 12시간을 대기하는 것은 바람직하지 않기 때문에, 그리고 하부 상에서 DGNP 농도가 30분 후 시간에 독립적이었기 ??문에, 농도 계수는 이전 시점에서 측정했다. 도 30은 ATPS 용액에서 농도 계수가 30분 내지 12시간 동안 비교적 일정하게 유지된다는 것을 도시한다. 그 결과, 하부 상은 LFA 적용을 위해 30분에 추출하였다.
DGNP가 LFA용 비색 지시제로서 사용될 수 있음을 증명하기 위해, LFA는 사전 농축 ATPS 단계 없이 Tf의 검출에 대해 수행하였다. 이 연구의 결과는 다음에 나타낸다: 도 31a. 밴드가 LFA 스트립 상에서 관찰되었기 때문에, DGNP가 비색 지시제로서 기능적이었다고 결론을내렸다. 각 시험은, 우체가 스트립을 통해 완전히 유동했고 시험의 유효성을 확인하였음을 나타내는 대조군 라인의 존재를 보여주었다. 어떤 Tf도 존재하지 않은 음성 대조군의 경우, 시험 라인의 출현은 진정한 음성 결과를 나타냈다. 높은 Tf 농도가 사용되면(3.16 ng/μL 및 1.0 ng/μL), 시험 라인은 부재하여 진정한 양성 결과를 나타냈다. 그러나, 0.316 ng/μL와 같은 저농도에서, 가시적 시험 라인이 나타났고, 따라서 거짓 음성 결과를 나타낸다. 이는, 사전 농축 단계 없이 Tf에 대한 LFA의 검출 한계는 1 ng/μL이었음을 시사했다.
9:1 PEG-염 용적비 용액은 LFA의 검출 한계가 Tf로 포화된 DGNP를 농축시킴으로써 10배 개선될 수있었음을 증명하기 위해 사용하였다. 이 연구의 결과는 다음에 나타낸다: 도 31b. ATPS 용액을 실온에서 30분 동안 배양 후, PEG 결핍 하부 상 중의 농축된 DGNP를 추출하고 LFA에 적용했다. 이전 실험과 유사하게, 대조군 라인 및 시험 라인 모두는 Tf의 부재하에 나타나 유효한 음성 결과를 나타낸다. 어떤 시험 라인도 높은 Tf 농도(0.316 ng/μL 및 0.1 ng/μL)에서 나타나지 않은 반면, 가시 시험 라인은 최초로 0.0316 ng/μL에서 나타났고, 사전 농축 단계를 갖는 Tf에 대한 LFA의 검출 한계가 0.1 ng/μL이었음을 나타낸다. 이는 DGNP 및 PEG-염 ATPS가 사용되었을 때 LFA의 검출 한계의 10배 개선에 상응하였다.
LFA 결과의 시각적 해석을 추가로 확인하기 위해, 시험 스트립의 이미지를 촬영했고, 시험 라인의강도를 정량화했다. 사전 농축 단계가 사용된 경우, 각 LFA에 대한 시험 라인 신호는 동일한 Tf 농도를 시험할 때 더약해져서 Tf가 농축되었고 DGNP를 포화시켰음을 나타내고, 여기서 포화된 DGNP는 시험 라인에 결합할 수 없어서 양성 결과를 나타낸다. 대조군 라인 및 시험 라인 신호 강도 둘 다는 ATPS와 조합하거나 조합하지 않은 음성 대조군과 유사했다. 이는, 두 실험에서 LFA 스트립을 주행하는 DGNP의 양이 유사했다는 것을 나타냈다. LFA 패널의 MATLAB 분석은 또한 검출 한계의 개선을 입증했다(도 32). 구체적으로, 도 32의 두 곡선은 대략적으로 동일한 시험 라인 신호에 대한 초기 Tf 농도에서 10배 차이로 분리된다.
실시예 3.
LFA에 혼합된 PEG-염 ATPS의 직접 첨가
이 실시예에서, 다음 세대와의 감도, 속도 및 사용 용이성, ATPS 상 분리 및 하류 검출 기능 둘 다를 포함하는 올인원 장치가 최적화되었다. ATPS의 상 분리 후 농축된 샘플을 적용하는 대신, 종이 기반 장치에 혼합 ATPS의 직접 첨가가 가능해졌다. 용액은 그것이 검출 영역을 향해 유동할 ?? 이의 두 상으로 분리되어 농축 및 검출 단계가 동시에 발생하도록 하고, 추가로 전체적인 시간-대-결과를 감소시킨다. 종이 멤브레인이 ATPS의 거시적인 상 분리를 가속화한다는 것이 제안된다. 추가로 이 현상을 활용하기 위해, 종이 장치를 수직으로 확장시켜 유동 단면적을 증가시키고, 거시적 분리에 대한 모세관 작용 및/또는 중력의 영향을 사용하였다. 상 분리를 촉진시키는 것 이외에, 이 3-D 성분은 또한 더 큰 농도배 개선을 선도하는 샘플의 보다 크고 보다 묽은 용적을 처리하는 능력을 갖는다. 3-D 종이 구조 내의 신규 ATPS 및 LFA는 전체적인 시간-대-결과를 감소시키고 사용 용이성을 유지하면서 모델 단백질 Tf의 검출 한계의 10배 개선을 성공적으로 수득했다. 이 장치는 전통적인 LFA 시험에 비해 상당한 개선을 제공하고, 낮은 특징적 바이오마커 수준으로다양한 질환을 검출하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 새로운 플랫폼 기술은 매우 민감하고, 저가이고 신속하고 장비 무료이고, 따라서 자원 부족 영역 내에서 진단 의료의 현재 상태를 혁신할 수 있는 가능성을 갖는다.
중합체-염 ATPS 용액 용적비의 결정
모든 재료, 화학약품 및 시약은, 다르게 언급되지 않는 한 다음으로부터 구입했다: 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)(St. Louis, MO). 폴리에틸렌 글리콜 8000 (PEG, VWR, Brisbane, CA) 및 인산칼륨 염 (5:1 이염기성 대 일염기성 비)을 둘베코 인산염 완충된 생리 식염수(PBS; Invitrogen, Grand Island, NY, pH 7.4, 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, 137.92 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 및 0.49 mM MgCl2 포함)에 용해시켰다. 평형 용적비(하부 상의 용적으로 나누어진 상부 상의 용적)는 동일 타이 라인에 따라 PEG 및 염의 w/w 조성을 변화시킴으로써 수득되었다. 1:1 및 9:1 용적비 ATPS가 발견되었고 추가 실험에 사용되었다.
항체 장식 덱스트란 코팅된 금 나노프로브(DGNP)의 제조
덱스트란-코팅된 금 나노입자를 합성했다. 간단하게, 6g의 덱스트란 (Mw. 류코노스톡 속(Leuconostoc spp)으로부터 15,000 - 25,000)을 80mL의 여과된 초순수 멸균수에 용해시켰다(Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA). 용액을 교반하고 비등하게 가열한 후, 1080μL의 1% w/v 염화금(III) 수화물 용액을 첨가했다. 반응 혼합물의 색은 적자색으로 바뀌었고, 교반하고 약 20분 동안 비등시켰다. 새로 형성된 덱스트란 코팅된 금 나노입자는 유리 덱스트란을 제거하기 위해 원심분리하고, 70mL의 물에 재현탁시켰다. 기능화 DGNP를 형성하기 위해, 덱스트란 코팅된 금 나노입자 용액의 pH를 1.5M NaOH를 사용하여 9.0으로 조정했다. 덱스트란 코팅된 금 나노입자 용액 1ml마다, 8μg의 항-Tf 항체(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)를 첨가했다. 반응 혼합물은 항체와 덱스트란 코팅된 금 나노입자 사이에 배위 결합의 형성을 촉진시키기 위해 30분 동안 진탕기 상에 배치시켰다. 유리 항체는 원심분리시켜 제거했다. 펠렛을 pH 9.0에서 100μL의 0.1M 붕산나트륨 완충제에 재현탁시켰다.
ATPS의 가시화
ATPS의 두 상을 가시화하기 위해, 표면 플라스몬 공명에 기인하여 자주색인 덱스트란 코팅된 금나노입자 및 브릴리언트 블루 FCF 염료 (The Kroger Co., Cincinnati, OH)는 1:1 및 9:1 용적비에 대해 PEG 및 염의 사전 결정 농도를 함유하는 3g의 총 PBS 용액에 참가했다. 이러한 용액은 와동을 통해 충분히 혼합하고, 25 °C에서 배양했다. ATPS가 평형에 도달했을 때 용액의 사진을 촬영했다. 모든 이미지는 다음을 사용하여 포착했다: 캐논 EOS 1000D 카메라(Canon U.S.A., Inc., Lake Success, NY).
이어서, ATPS의 두 상을 그들이 종이 멤브레인을 따라 유동할 때 가시화했다. 유리 섬유 종이의 2개의 8 x 30 mm 스트립을 VersaLASER 3.50 (Universal Laser Systems, Scottsdale, AZ)을 사용하여 레이저 절단했다. 후속적으로, 브릴리언트 블루 FCF 염료 및 덱스트란 코팅된 금 나노입자를 함유하는 50mg의 혼합 ATPS (1:1 또는 9:1 평형 용적비에 상응)를 피펫을 사용하여 스트립의 한 말단에 적가했다. 생성되는 유동의 이미지를 0초, 30초, 105초 및 300초에 포착했다. 비디오는 또한 통상의 스마트폰의 8-메가픽셀 카메라로 촬영했다(Apple Inc., Cupertino, CA).
3-D 종이 웰 내에서 ATPS의 상 분리를 가시화하기 위해, 브릴리언트 블루 FCF 염료 및 덱스트란코팅된 금 나노입자를 함유하는 혼합 ATPS 140mg을 종이 웰에 첨가했다. 3-D 종이 웰은 유리 섬유의 8 x 60 mm 레이저 절단 스트립의 한쪽 가장자리 위에 유리 섬유의 9개의 8 x 10 mm 레이저 절단 스트립을 적층시킴으로써 형성되었다. 혼합 ATPS를 3-D 종이 웰에 적용한 후, 50μL의 작동 완충제 (0.2% 소 혈청 알부민(BSA), 0.3% 트윈20, 0.1M 트리즈마 염기, pH 8)를 3-D 종이 웰에 첨가했다. 작동 완충제는 종이 웰로부터 장치의 나머지로의 샘플의 유동을 보조하기 위해 첨가했다. 비디오를 촬영하고, 이미지는 0초 및 30초, 작동 완충제의 첨가시 및 유동의 완료 후 포착했다.
Tf의 검출
Tf의 검출을 위한 LFA 시험
경쟁 검정 포맷을 사용하는 LFA 시험 스트립을 조립했다. 간단하게, 항-Tf 항체로 장식된 DGNP를 먼저 샘플 용액에 첨가하고, DGNP/Tf 복합체를 형성하기 위해 샘플에 존재하는 임의의 Tf에 결합하도록 했다. LFA로 Tf의 검출 한계를 확인하기 위해, 30μL의 작동 완충제와, PBS 중의 Tf의 공지된 양 15μL 및 5μL의 DGNP로 이루어진 샘플 용액 20μL를 시험관에서 혼합했다. LFA 시험 스트립은 샘플에 침수된 샘플 패드를 갖는 튜브에 수직으로 삽입하고, 유체는 흡수 패드를 향해 스트립을 통해 위킹했다. Tf가 존재하면, LFA 스트립을 통해 이동하는 DGNP/Tf 복합체는 시험 라인에 고정된 Tf에 결합할수 없어 대조군 라인에서 단일 밴드의 존재로 양성 결과를 나타낸다. 대안적으로, Tf가 존재하지 않으면, DGNP 상의 항체는 시험 라인 상의 Tf에 결합할 수 있다. 이러한 프로브가 적자색을 나타내기 때문에, DGNP가 시험 라인에서 축적될 때 가시 밴드가 형성되어 음성 결과를 나타낸다. Tf의 존재와 무관하게, DGNP 상의 항체는 대조군 라인에 고정된 2차 항체에 항상 결합한다. 대조군 라인의 밴드는 샘플이 유효한 시험을 나타내는 스트립을 통해 완전히 유동하였음을 의미한다. 따라서, 음성 결과는 두 밴드에 의해 나타난다: 시험 라인에서 1개 및 대조군 라인에서 1개. 대조적으로, 양성 결과는 대조군 라인에서 단일 밴드로 나타난다. 각 Tf 농도는 3회 시험했다. 대표적인 LFA 스트립은 10분 후 조절된 조명 환견에서 캐논 EOS 1000D 카메라로 이미지화했다.
3-D 종이 웰을 사용한 Tf의 검출
종이 기반 장치의 LFA 성분은 상기한 설정으로부터 약간 변형시켰다. 구체적으로, 셀룰로즈 샘플 패드를 시험 및 대조군 라인을 함유하는 니트로셀룰로즈 멤브레인에접속된 5 x 20 mm 유리 섬유 종이로 교환시켰다. 샘플 패드의 개시시에, 유리 섬유의 복수 스트립으로 구성된 3-D 종이 웰이 사용되었다. 1:1 용적비 ATPS를 사용하는 실험을 위해, 웰은 유리 섬유 종이의 5개 (4개 5 x 7 mm 스트립+ 하부 샘플 패드) 층으로 구성되었다. 시험을 시작하기 위해, 공지된 농도의 Tf를 함유하는 40μL의 혼합된 1:1 용적비 ATPS를 종이 웰에 첨가한 다음, 50μL의 작동 완충제를 첨가했다. 이미지는 10분 후 포착했다. 9:1 용적비 ATPS를 사용하는 실험을 위해, 종이 20개 층 (19개 5 x 7 mm 스트립 + 하부 샘플 패드)을 종이 웰을 형성하기 위해 사용했다. 공지된 농도의 Tf를 함유하는 200μL의 혼합된 9:1 용적비 ATPS를 종이 웰에 첨가하고, 10분 동안 배양한 다음, 100μL의 작동 완충제를 첨가했다. 또 다른 10분 후, 이미지는 조절된 조명 환경하에 캐논 EOS 1000D 카메라로 포착했다. 각 Tf 농도는 3회 시험했다.
ATPS의 가시화
ATPS와 LFA의 통합은 이의 이점을 희생하지 않고 전통적인 LFA의 검출 한계를 상당히 개선시킬 수 있었다. 이를 달성하기 위해, 종이 멤브레인을 통해 유동할 때 상이 가시화될 수 있는 ATPS를 동정하는 것이 우선 필요했다. 구체적으로, 상부에 더욱 소수성인 PEG 풍부 상을 형성하고, 하부에 더욱 치밀하고 친수성인 PEG 결핍 상을 형성하는 PEG-염 ATPS가 사용되었다. ATPS에서 생체 분자 분할은 주로 상대적 친수성 (생체 분자는 그들이 최고 인력 상호작용을 경험하는 상을 선호하는 경향이 있기 때문에) 및 크기 (큰 생체 분자는 전형적으로 PEG 풍부 상에서 더 큰 수의 PEG 분자로 경험하는 더 큰 입체 배제-용적 반발 상호작용에 기인하여 PEG 풍부 상에 잔류하지 않기 때문에)에 의해 결정된다. 브릴리언트 블루 FCF 염료를 혼합된 ATPS에 첨가하고, 그것이 작고 소수성이기 때문에, 염료는PEG 풍부 상에서 극도로 분할된다. 자주색 덱스트란 코팅된 금 나노입자를 또한 혼합 ATPS에 첨가하고, 그들은 크고(동적 광 산란에 의해 측정된 약 50nm 직경), 친수성이기 때문에, PEG 결핍 상에서 극도로 분할된다. 1:1 용적비 ATPS의 이미지 및 9:1 용적비 ATPS의 이미지는 상 분리 전후에 촬영했다(도 33). 브릴리언트 블루 FCF 및 덱스트란 코팅된 금 나노입자의 양은 1:1 및 9:1 용적비 ATPS 사이에서 일정하게 유지시켰다. 그 결과, 상 분리 후, 9:1 용적비 ATPS의 상부 상은 용적이 더 커졌고, 따라서 1:1 용적비 ATPS의 상부 상과 비교하여 블루 염료로 덜 농축되었다. 추가로, 9:1 용적비 ATPS의 하부 상은 용적이 더 작아졌고, 1:1 용적비 ATPS보다 더 짙은 자주색 음영을 표시하여 하부 상을 축소하는 것이 ATPS 내에서 덱스트란 코팅된 금 나노입자를 효율적으로 농축시킬 수 있음을 입증한다. 하부 상의 용적이 총 샘플 용액의 용적의 1/10로 되기 때문에 9:1 용적비 ATPS 샘플이 나노입자를 10배로 농축시킨다고 기대되었다. 용적비가 더욱 극단적으로 될 때, 더 큰 농도배 개선이 달성가능하지만, 시스템은 또한 분리하기위한 추가의 시간을 필요로 한다는 것을 주의한다.
종이에서 ATPS의 가시화
혼합 ATPS를 종이 멤브레인에 첨가 후, 자주색 덱스트란 코팅된 금 나노입자를 함유하는 PEG 결핍 상은 종이를 통해 신속하게 유동하는 것으로 관찰되었다. 한편, 블루 염료를 함유하는 PEG 풍부 상은 종이 멤브레인의 시작 부분에 유지시켰다(도 34). 이 결과는, ATPS의 두 상이 종이를 통해 유동이 유발되기 전에 유리 웰 내부에서 안전히 분리되도록 하는 경우와 유사했다(도 80). 종이 멤브레인 내에서 발생하는 개선된 상 분리는 1:1 용적비 ATPS를 사용할 때 명백했다(도 34a), 1:1 용적비 ATPS 상은 종이 내에서 거의 즉시 분리되었다. 다음에 도시된 바와 같다: 도 33, ATPS를 사용하여 달성된 자주색 덱스트란-코팅된 금 나노입자의 배-농도는 용적비의 함수이다. 구체적으로, 입자가 PEG 결핍 상에서 극도로 분할되기 때문에, 1:1 용적비는 이들이 유동의 리딩 전면으로서 초기 용적의 절반을 유동할 때 입자의 2배 농도를 수득한다. 종이 멤브레인에서 상 분리 거동의 하나의 가능한 설명은, PEG 풍부 도메인이 종이와 더 많은 상호작용을 경험하여 그들이 덜 이동하도록 한다는 것이다. 또한, PEG 풍부 도메인은 또한 더 점성이고, 따라서 구불구불한 종이 네트워크를 통해 주행하는 더 큰 어려움을 경험할 수 있다. 대조적으로, PEG 결핍 도메인은 종이와 적게 상호작용하고, 덜 점성이어서 종이 네트워크를 통해 신속하게 주행하도록 하고, 리딩 전면에서 합체된다. 9:1 용적비 ATPS의 경우, PEG 결핍 도메인은 총 용적의 1/10만을 구성하여 그들이 PEG 풍부 도메인에 앞서 합체되고 유동하는 것을 더 어렵게 한다. 구체적으로, 거시적 상 분리가 종이에서 발생하는데 필요한 시간은 유체가 종이를 위킹하는데 걸리는 시간보다 더 길었고, 양호한 분리는 관찰되지 않았다(도 34b).
1:1 및 9:1 용적비 ATPS를 모두 사용할 때, 일부 PEG 결핍 도메인은 유동의 리딩 전면에서 그것을 하지 않았다는 것이 또한 관찰되었다. 이는, PEG 결핍 도메인 모두는 아니지만 PEG 풍부 도메인으로부터 탈출할 수는 있었고, 시험관에서 측정된 평형 용적비가 종이 멤브레인 상의 위킹 거리와 일치하지 않는 이유를 설명했다는 것을 나타냈다. LFA를 개선시키기 위해, PEG 결핍 도메인의 대부분은 거시적 PEG 결핍 상에 도달하고, 검출 영역에 도달하기 전에 거시적 PEG 풍부 상으로부터 분리될 필요가 있다. 따라서, 상 분리 현성을 추가로 개선시키기 위해 추가의 성분이 필요했다.
3-D 종이 웰 장치에서 ATPS의 가시화
3-D 종이 구조를 사용하는 종이 웰은 상 분리 거동을 추가로 개선시키도록 설게되었다. 3-D 종이 웰을 사용하면, 통상 시험관에서 상 분리를 구동하는 중력이 종이 내에서 ATPS 상 분리를 또한 보조할 수 있도록 한다. 3-D 종이 구조는 또한 유동 방향에 대해 수직인 단면적을 증가시킨다. 따라서, 더 많은 용적은 종이를 통해 동시에 위킹할 수 있어, 더 많은 PEG 풍부 도메인이 보다 쉽게 합체하기 위해 종이 및 PEG 결핍 도메인과 이들의 상호작용에 의해 역 유지되도록 한다. 다음에 도시된 바와 같다: 도 35, 3-D 종이 웰은 이전에 나타낸 2-D 종이 멤브레인에 비해 더 큰 상 분리 효율에 기여했다. PEG 풍부 도메인은 종이 웰의 상부 층에 잔류하는 반면, 덱스트란 코팅된 금 나노입자를 함유하는 PEG 결핍 도메인은 종이 웰의 하부 층을 향해 유동했다. 추가로, PEG 결핍 도메인은 종이 웰을 출발한 최초였고, PEG 풍부 도메인으로부터 효율적으로 분리되었다. 작동 완충제는 또한 유체 유동을 추가로 구동하고 종이 웰을 통해 임의의 잔류하는 PEG 결핍 도메인의 플러슁을 보조하기 위해 첨가했고, 이러한 첨가가 미래에 자동화될 수 있음이 구상된다. 유동은, 9:1 용적비 ATPS를 사용할 때 (용액은 390초 후 스트립의 말단에 도달하지 않는다) 더 점성인 PEG 풍부 상의 큰 용적이 존재하기 때문에, 더 느려졌다는 것을 주의한다.
3-D 종이 웰 장치를 사용하는 Tf의 검출
3-D 종이 웰 장치 내에서 개선된 ATPS 상 분리 및 유동 거동을 가시화한 후, LFA가 검출 한계를개선시키기 위해 이 기술과 조합될 수 있는지 의문을 제기하였다. 브릴리언트 블루 FCF 염료는 더 이상 사용되지 않았고, 기능화 항-Tf DGNP가 덱스트란 코팅된 금 나노입자 대신에 사용되었다. DGNP는 ATPS에서 덱스트란 코팅된 금 나노입자와 유사하게 분할되지만, 샘플에서 표적 바이오마커를 포획하고 LFA용 비색 지시제로서 기능할 수 있다.
ATPS 및 3-D 종이 웰장치가 도입되지 않은 LFA 전용 대조군에 대한 검출 한계가 동정되었다. 경쟁 포맷에서 대조군에 대한 LFA의 검출 한계를 개선시키기 위해, DGNP 상에 장식된 항체가 더 많은 Tf에 결합될 필요가 있다. 이는 동일 수의 DGNP를 더 큰 수의 Tf 분자에 노출시킴으로써 달성될 수 있고, Tf의 고정된 농도의 경우, 용액의 총 용적을 증가시킬 필요가 있다. DGNP가 총 용적의 증가로 포화될 수 있지만, 그들은 용적의 배-증가로 희석된다. LFA 스트립 각각이 DGNP를 희석시킴에 기인하여 단지 20μL의 샘플만을 처리할 수 있기 때문에, 무효 시험은 충분하지 않은 DGNP가 대조군 라인에 결합될 때의 결과이다. 그러나, ATPS 및 3-D 종이 웰 장치를 사용할 때, Tf 분자로 포화된 DGNP는 PEG 결핍 상에서 극도로 분할되고, 따라서 유효 시험이 결과이도록 유동의 리딩 전면에서 농축될 수 있다. 따라서, 샘플 용적은 대조군과 비교할 경우, DGNP를 2배로 농축시켜 동일수의 DGNP가 검출 영역으로 진입하는 것을 유도할 것으로 기대되는 1:1 용적비 ATPS를 사용할 경우 40μL로 2배 증가되었다. 유사하게, 샘플 용적은 DGNP를 10배로 농축시킬 것으로 기대되는 9:1 용적비 ATPS를 사용할 경우 200μL로 10배 증가되었다. DGNP를 함유하는 1:1 및 9:1 용적비 ATPS의 하부 상만이 검출 영역을 통해 통과해야 하기 때문에, 장치의 용적 처리 능력은 3-D 종이 웰을 포함하는 층의 수를 변경함으로써 미세 조정했다. 샘플 용적에 이러한 증가를 제공하기 위해, 1:1 용적비 ATPS 용액 내에서 Tf의 검출용으로 사용된 3-D 종이 웰은 종이 5개 층으로 구성되는 반면, 9:1 용적비 ATPS 용액의 경우 종이 20개 층으로 증가되었다(도 36b&c), 증가된 용적을 제공하기 위해. 층 수의 상당한 증가에도 불구하고, 9:1 용적비 ATPS를 위한 3-D 종이 웰은 다임과 비교할 때 상대적으로 여전히 작게 잔류했다.
DGNP를 함유하는 ATPS 용액이 종이 웰에 첨가된 경우, DGNP는 그들이 장치를 통해 위킹될 때 용액의 리딩 전면에서 신속하게 농축된다. DGNP는 종이 웰에 잔류하는 용액의 나머지에 앞서 장치의 검출 영역에 도달한다. 경쟁 검정의 경우, 시험 라인의 존재는 음성 결과를 나타내는 반면, 시험 라인의 부재는 양성 결과를 나타낸다. 모델 단백질 Tf를 함유하지 않는 음성 대조군을 사용할 때, 25분 미만에, 1:1 및 9:1 용적비 ATPS를 사용하는 두 설정은 각각 두 시험 및 대조군 라인에서 가시 밴드를 렌더링하여 Tf의 부재 및 유효 시험을 나타낸다(도 36). 3-D 종이 웰이 음성 대조군 ATPS 샘플에서 Tf의 부재를 정확하게 평가하기 위해 LFA와 조합될 수 있음을 확인한 후, Tf 농도는 1:1 및 9:1 용적비 ATPS 용액을 사용할 경우 검출 한계를 찾기 위해 변화시켰다 이러한 실험은 통상의 LFA에 비해 각각 Tf의 검출 한계의 2배 및 10배 개선을 입증했다(도 37). 3-D 종이 웰을 사용하는 9:1 용적비 ATPS 실험의 경우, 샘플은 DGNP가 표적 단백질을 포획하고, 작동 완충제의 첨가 전에 거시적으로 상 분리하기에 충분한 시간을 허용하도록 추가의 10분 동안 장치 내에서 배양했다. DGNP가 혼합 ATPS에서 더 농축되기 때문에 이 배양 기간은 1:1 용적비 ATPS에 필요하지 않아서DGNP가 전체 용액을 더 용이하게 프로빙하게 한다. 이러한 실험 결과는, 통상의 LFA는 1 ng/μL의 농도 (어떤 시험 라인도 나타나지 않는 농도)에서 Tf를 검출하는 반면, 이러한 3-D 종이 기반 진단 장치는 1:1 용적비 ATPS가 사용되었을 때 Tf를 0.5 ng/μL에서 검출할 수 있었음(검출 한계 2배 개선)을 보여주었다. 유사하게, 3-D 종이 기반 진단 장치는 9:1 용적비 ATPS가 사용되었을 때 0.1 ng/μL에서 Tf를 검출할 수 있었다(검출 한계 10배 개선). 이러한 결과는, 목적하는 용적비를 갖는 ATPS 용액이 LFA를 사용하는 바이오마커 검출을 상당히예측가능하게 개선시키기 위해 적합한 크기의 3-D 종이 웰과 조합될 수 있음을 시사한다.
실시예 4.
PEG-염 ATPS에서 M13 박테리오파지의 검출
필요 시점(PON) 설정에서 ATPS와 LFA의 조합의 실행 가능성을 증가시키기 위해, 시스템에 다음과 같은 변형이 수행되었다: (1) 폴리에틸렌 그리콜(PEG) 및 인산칼륨 (염) ATPS를 보다 짧은 상 분리 시간으로 조사하고, (2) 추출 시간의 상당한 추가 감소를 허용하는 생체 분자 분할의 운동 거동을 시험하고, (3) 금 표면에 PEG를 장식하여 LFA용으로 사용된 금 나노프로브 지시제와 PEG-염 ATPS의 염 풍부 상 사이의 적합성을 보장하고, (4) 관찰된 LFA 신호 강도를 정량화하기 위해 맞춤 MATLAB 스크립트를 생성했다. 이러한 변화를 요약하는 시각적 표현은 다음에 도시된다: 도 38.
박테리오파지 M13의 배양
에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)(E. coli) 세균, 균주 ER2738 (American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA)을 8mL의 루리아 브로쓰에서 배양했다(Sigma Aldrich, St. Louis, MO), 37°C, 인큐베이터 진탕기에서 6시간. 모델 바이라스 박테리오파지 M13 (ATCC)를 배양하기 위해, 소량의 동결 M13을 세균 배양물에 첨가했다. 이어서, 세균 배양물은 37°C에서 14시간 동안 인큐베이터 진탕기에 배치시켰다. 용액은 펠렛 중의 세균으로부터 상청액 중의 M13을 단리시키기 위해 15분 동안 4°C 및 6000 g에서 원심분리했다. 상청액을 용액으로부터 추출하고, 0.22 μm 주사기 필터(Millipore, Billerica, MA)를 통해 여과시켰다. 이 스톡 M13 용액의 희석은 플라크 검정에 의해 결정된 M13의 농도를 사용하여 계산했고, 따라서 M13의 농도는 플라크 형성 단위/mL (pfu/mL)로 보고된다. 모든 시약 및 재료는, 다르게 언급되지 않는 한 다음으로부터 구입했다: 시그마-알드리치 (St. Louis, MO).
PEG-염 시스템의 용적비 발견
중합체-염 ATPS를 위해, 폴리에틸렌 글리콜 8000 (PEG, VWR, Brisbane, CA) 및 인산칼륨 (5:1 이염기성: 일염기성)을 둘베코 PBS (Invitrogen, Grand Island, NY, pH 7.4, 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, 137.92 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 및 0.49 mM MgCl2 함유)에 용해시켰다. 최종 용액은 루리아 브로쓰를 함유하는 M13 샘플을 포함하는 실험과 일치되도록 2% (w/w) 루리아 브로쓰를 함유하는 최종 질량 5g으로 제조했다. 평형 용적비(거시적 하부 상에 의해 나누어진 거시적 상부 상의 용적)는 계면 및 용액의 상부에서 튜브의 외부를 마킹함으로써 최소 12시간 (웰 후 평형) 후 측정했다. 이어서, 튜브를 비우고, 건조시키고, 저울로 칭량했다. 물을 마크까지 첨가하고, 두 상의 용적을 물의 밀도로서 1g/mL을 사용하여 결정했다. 상이한 평형 용적비는 초기 PEG 농도, 초기 염 농도를 변경하고 온도를 37°C에서 일정하게 유지시킴으로써 밝혀졌다. 이러한 용적비가 생체 분자의 유사한 분할을 보장하기 위해 동일한 타이 라인에서 선택되었고, 사용된 특이적 작동 조건은 표 2에 기재된다는 것을 유의해야 한다.
표 2. PEG-염 ATPS의 시험된 비율
M13의 분할 및 농축
각 농축 실험을 위해, 4개의 동일한 5g PEG-염 용액을 제조했다. 이러한 용액 중, 3개는 농축 단계를 위해 사용된(n=3) 반면, 1개는 초기 M13 농도를 나타내는 대조군으로서 사용되었다. 각 용액이 상 분리 전에 하나의 상에 존재했다는 것을 보장하기 위해, 모든 용액은 4°C에서 평형화하고, 균질성으로 혼합했다. 이어서, M13은 전반적인 초기 농도 1x108 pfu/mL를 수득하기 위해 4개 용액에 첨가했다. M13 농도가 시간에 따라 어떻게 변하는지를 결정하기 위해, 9:1 용적비 용액을 37°C 수욕에서 30분, 1시간, 4시간 및 24시간 동안 배양했다. M13 농도가 용적비에 따라 어떻게 변하는지를 결정하기 위해, 9:1, 6:1, 3:1 및 1:1 용적비 용액을 37°C 수욕에서 30분 동안 배양했다. 각 실험에서, 용액 중 3의 하부 상을 주사기를 사용하여 조심스럽게 회수했다. 대조군 용액은 시험 용액과 동일한 조건을 모방하기 위해 동일한 배양 단계를 경험했다. 그러나, 배양 후, 대조군은 4°C로 다시 한번 평형화하고, ATPS에서 M13의 초기 농도를 나타내기 위해 분액을 회수하기 전에 균질성으로 혼합했다. 추출된 하부 상 및 대조군 용액의 M13 농도는 플라크 검정으로 결정했다.
금 나노프로브의 제조
콜로이드성 금 나노입자를 제조했다. 이어서, 금 나노입자의 직경은 제타사이저 나노 SZ 입자 분석기를 사용하는 동적 광 산란(DLS)을 사용하여 결정했다(Malvern Instruments Inc., Westborough, MA). 후속적으로, 금 나노입자의 농도는 비어 법칙을 사용하여 결정했다. 흡광도 값은 피크 흡광도였고, 몰 흡수 계수는 비비인터내셔날 라이프 사이언시즈에 의해 제공된 데이터 시트로부터 취했다(참조: 표 3).
표 3. 금 나노입자 특성
금 나노입자의 정량화 후, M13의 코트 단백질 pVIII에 대한 마우스 모노클로날 항체(Abcam Inc., Cambridge, MA)를 금 나노프로브를 형성하기 위해 콜로이드성 금 1mL당 항-M13 16μg의 비율로 나노입자 용액에 첨가했다. 용액의 pH는 항체와 금 사이의 배위 결합을 촉진시키기 위해 0.1M NaOH를 사용하여 9.0으로 조정하였고, 이 용액을 진탕기 상에서 30분 동안 혼합했다. 금 나노프로브를 LFA에 앞서 PEG 결핍, 염 풍부 상에 첨가할 때 입체 콜로이드성 안정화를 제공하기 위해, PEG-2000-SH (Nanocs, Boston, MA) 분자는 5000개의 PEG-2000-SH 분자 대 1개의 금 나노프로브의 몰 비로 금 나노프로브에 결합되었다. 용액은 추가의 30분 동안 혼합했다. 비특이적 결합을 방지하기 위해, 100μL의 10% 소 혈청 알부민(BSA) 용액을 잔류하는 과량의 표면을 차단하기 위해 1mL의 콜로이드성 금 용액에 첨가하였고, 이 용액을 30분 동안 혼합했다. 최종적으로, 용액은 유리 항체, PEG 및 BSA를 제거하기 위해 4°C 및 8600 g에서 30분 동안 원심분리했다. 장식된 금 나노프로브를 pH 9.0에서 150μL의 0.1M 붕산나트륨 완충제에 재현탁시켰다.
ATPS와 LFA의 조합
ATPS 사전 농축 단계를 LFA와 조합하기 위해, 가변적인 M13 농도를 9:1 용적비 PEG-염 용액에 첨가했다. 37°C에서 30분 배양 후, 농축된 하부 상을 주사기를 사용하여 추출했다. 사전 농축 단계를 사용하거나 사용하지 않고 수행된 면역검정의 일관성을 위해, M13은 초기에 M13을 함유하지 않아 대조군 용액을 형성하는 9:1 용액의 하부 상 샘플에 첨가하였다. 후속적으로, 30μL의 하부 상 샘플 및 10μL의 항-M13 장식된 콜로이드성 금 프로브 용액을 30μL의 작동 완충제와 함께 혼합했다. 시험 스트립을 통해 샘플의 유동을 보조하는 작동 완충제 용액은 0.2% w/v BSA, 0.3% w/v 트윈 20, 0.2% w/v 나트륨 아지드, 0.1% PEG-8000, 및 pH 8로 조정된 ddH2O 중 및 0.1M 트리즈마 염기로 구성되었다. 항체가 M13에 결합되도록 하기 위해, 생성되는 용액을 혼합하고, LFA 스트립을 첨가하기 전에 5분 동안 배양했다. LFA 스트립은 다음에 개략적으로 도시된 바와 같이 샌드위치 검정을 실시하기 위해 조립하였다: 도 39. 10분 후, LFA 스트립을 제거하고, 결과는 LFA 스트립 상에서 시험 라인 및 대조군 라인을 시각적으로 조사함으로써 수득되었다.
LFA의 정량적 분석
LFA 스트립의 사진은 시험이 완료된 직후 조절된 조명 환경에서 캐논 DSLR 카메라로 촬영했다. LFA 결과를 정량화하기 위해, 맞춤 MATLAB 스크립트를 작성하였다. 절단된 이미지는 8비트 그레이스케일 매트릭스로 변환시켰다. 후속적으로, 매트릭스를 대조군 라인을 함유하는 하나의 생성 매트릭스 및 시험 라인을 함유하는나머지로 이등분했다. 각각의 1/2 매트릭스를 위해, 최소 강도(가장 짙은 점)를 대조군 또는 시험 라인에 수직인 벡터에따라 배치했다. 이러한 최소치의 평균 위치는 대조군 또는 시험 라인의 길이에 걸쳐 15픽셀 높이 직사각형 영역의 중심으로서 사용되었다. 후속적으로, 대조군 라인 영역에서 모든 픽셀의 평균 그레이스케일 강도(I대조군)를 계산하였다. 동일한 절차를 시험 라인 영역 의 평균 그레이스케일 강도(I시험)를 수득하는 시험 라인을 함유하는 이미지의 나머지 절반에 적용했다. 시험 라인의 15 픽섹 너비 및 50 픽셀 상류인 제3 참조 영역의 평균 그레이스케일 강도(I참조)를 다음과 같이 시험 및 대조군 라인의 강도를 정규화하기 위해 사용하였다:
대조군 라인의 경우,
시험 라인의 경우. 강도의 높은 값은 백색 영역에 상응한다는 것에 주의한다.
생체 분자 분할
트리톤 X-114 미셀 ATPS는 LFA 바이러스 검출 한계의 10배 개선을 달성하기 위해 LFA와 조합할 수 있다. 트리톤 X-114 미셀 시스템은 두 상의 용적을 평형화하는데 6시간 이상이 소요된다. 대조적으로, 이 연구에서 중합체-염 ATPS는 보다 신속한 상 분리를 갖는다. 또한, 9:1 용적비에 대해 초기 추출 시간 30분을 사용했다.
수소 결합 상호작용에 상당히 참여하는 중합체인 PEG 및 염으로 구성된 수용액은 거시적 상 분리를 경험할 것이다. PEG 풍부, 염 결핍 상은 상부에서 형성되는 반면, PEG 결핍, 염 풍부 상은 하부에서 형성된다. 거대한 친수성 생체 분자는 하부 PEG 결핍 상에서 극도로 분할된다. 이 예를 위해, 에볼라 및 마르부르크 바이러스와 크기 및 형상이 유사한 모델 바이러스 박테리오파지 M13을 조사했다. M13이 900nm의 길이 및 비교적 친수성 단백질 쉘을 갖기 때문에, PEG 풍부 상에서의 것들에 비해 그 상에서 PEG 중합체와 더 적은 반발성 입체 배제-용적 상호작용을 경험함으로 인해 하부 PEG 결핍 상에서 극도로 분할할 것으로 기대되었다. 수성 2-상 미셀 시스템에서, M13은 M13 바이러스 입자가 또한 적은 배제-용적 상호작용을 경험한 거시적 미셀 결핍 상에서 극도로 분할된다.
용액이 가열되고, 상 분리가 먼저 시작되면, PEG 풍부 (M13 결핍) 도메인 및 PEG 결핍 (M13 풍부) 도메인이 전체 용액에 걸쳐 형성된다. 이러한 거시적 도메인 중 바이러스 농도는 매우 신속하게 이들의 평형 값에 도달하는 것으로 가정되고, 유사 도메인은 서로 합체하기 시작한다. 이러한 도메인이 더 크게 성장함에 따라, 이들의 밀도차는 PEG 풍부 도메인의 상승과 PEG 결핍 도메인의 침몰을 유발하는 불균일한 중력 및 부력을 생성한다. 이는 거시적 상부, PEG 풍부 (M13 결핍) 상 및 거시적 하부, PEG 결핍 (M13 풍부) 상의 형성을 유도한다. 이 공정의 동역학 및 동반되거나 포획된 도메인의 효과는 이하 추가로 설명된다.
바이러스가 거시적 하부 상에서 극도로 분할할 것으로 기대되기 때문에, 유일한 관심은 추출시 하부 상 중의 생체 분자 농도에 있었다. 이어서, 농도 계수는 초기 전체 농도, C바이러스,초기에 의해 나누어진 거시적 하부 상에서 바이러스의 농도, C바이러스,하부로서 정의된다.
농도 계수에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 하나의 잠재적인 우려는 거시적 하부 상에 동반된 PEG 풍부 (M13 결핍) 도메인의 존재이다. 평형 전에, 모두는 아니지만, 도메인은 이들 각각의 거시적 상으로 주행하기에 충분한 시간을 가졌다. 그러나, 평형 용적비 9:1을 사용할 때, 이것은 문제가 아니다. 9:1 용적비에서 PEG 풍부 도메인과 관련된 더 큰 용적에 기인하여, 그들이 합체되어 연속 상을 형성하는 것은 더 용이하다. PEG 풍부 도메인은 거시적 하부 상이 매우 작기 때문에 거시적 상부 상에 도달하기 위해 주행하기에 더 짧은 거리를 갖는다. 그 결과, 거시적 하부 상에 PEG 풍부 (M13 결핍) 도메인의 최소한의 동반이 존재하고, 생체 분자의 농도는 이의 평형 값에 근접할 것으로 기대된다. 그러나, PEG 결핍 (M13 풍부) 도메인의 동반은 거시적 상부 상에서 여전히 기대된다. PEG 결핍 도메인과 관련된 작은 용적에 기인하여, 이러한 도메인을 합체하는 것은 더 어렵다. 그들은 또한 거시적 하부 상에 도달하기 위해 더 점성인 PEG 풍부 거시적 상을 통해 추가의 거리를 주행해야 한다. 그러나, 주된 관심사가 하부 상 중의 생체 분자의 농도이고, 단지 소용적이 LFA에 필요하기 때문에, 30분에 추출할 수 있고, 여전히 평형 예측 농도 계수에 도달할 수 있다.
시간 함수로서 9:1 용적비 용액의 상 분리는 육안으로 시험했다. 초기에, PEG 풍부 및 PEG 결핍 도메인이 전체 용액에 걸쳐 형성된다. PEG 풍부 도메인은 신속하게 합체되어 연속 상을 형성한다. 용액은, 동반된 PEG 결핍 도메인이 광이 산란되게 하기 때문에, 혼탁하게 나타난다(도 40a). PEG 결핍 도메인은 이들의 큰 밀도에 기인하여 합체되어 하부로 침몰되기 때문에, 거시적 하부, PEG 결핍 상은 하부 위로부터 형성된다. 30분 후, 투명한 거시적 하부, PEG 결핍 상으로부터 분리되는 혼탁한 거시적 상부, PEG 풍부 상이 존재한다(도 40b). 상부 상이 동반된 PEG 결핍 (M13 풍부) 도메인을 함유하지만, 주요 관심사는 그것이 농축된 생체 분자를 함유하기 때문에 하부 상의 혼탁도에 있다. 긴 시간 후, PEG 결핍 도메인 모두 또는 대부분은 하부 거시적 상으로 주행하고, 시스템은 두 개의 투명한 상에 의해 나타낸 바와 같이 거의 평형이다(도 40c). 30분에 하부 상은, 상당한 동반 PEG 풍부 (M13 결핍) 도메인의 부재로 인해, 이미 투명하여 그 상에서 바이러스의 측정 농도가 이미 이의 평형 값을 반영해야 한다는 것을 시사하고 있음을 주의한다.
30분에 하부 상을 추출하기 위해, 거시적 하부, PEG 결핍 (M13 풍부) 상이 상당한 PEG 풍부 (M13 결핍) 도메인을 함유하지 않았다는 확인이 요구되었다. 따라서, 농도 계수는 하부 상에서 M13의 측정 농도가 심지어 짧은 시간 후에 이의 평형 값과 동일했음을 나타내기 위해 시간 함수로서 결정했다. 구체적으로, M13 분할 실험은 다음에 사용된 것들과 동일한 온도 및 초기 PEG 및 염 농도를 사용하여 수행하였다: 도 40 (즉, 9:1 평형 용적비를 수득하는 조건), 하부 상을 30분, 1시간, 4시간 및 24시간에 추출시켰다(웰 후 평형). 다음에 도시된 바와 같다: 도 41, 농도 계수는 30분 내지 24시간의 추출 시간의 함수로서 일정하게 잔류되어 거시적 하부, PEG 결핍 (M13 풍부) 상에서 PEG 풍부 (M13 결핍) 도메인의 동반이 실제로 최소임을 입증한다. 따라서, 후속 연구를 위해, 짧은 시간이 PON 적용에 필요하기 때문에 30분 추출 시간이 사용되었다.
ATPS에서 M13의 분할
방정식 (9)에서 농도 계수는 용적비의 함수인 것으로 나타날 수 있다. 단일 균일 상 중의 바이러스의 초기 몰과 두 개의 생성되는 상 중의 바이러스의 몰의 합을 동일시하는 몰 균형을 사용하여, 다음 식을 수득했다:
여기서, C바이러스,상부는 거시적 상부 상 중의 바이러스의 농도이고, V상부 및 V하부는 각각 상부 및 하부 상의 용적이다. 방정식 (10)을 재배열하면 농도 계수에 대한 다음 식을 수득한다:
9:1 용적비 ATPS를 사용하여, M13 분할 계수는 0.0001 미만인 것으로 측정되었다(하부 상 중의 평형 농도에 의해 나누어진 상부 상 중의 평형 농도). 이러한 측정 분할 계수는 V하부/V상부 값 1/9보다 작기 때문에, 이 식은 다음과 같이 근사치화될 수 있다:
따라서, 용적비의 함수로서의 농도 계수에 대해 선형 관계가 예측된다. 생체 분자가 하부 상에서 극도로 분할되기 때문에 농도 계수는 용적비가 증가함에 따라 증가하고, 용적비의 증가는 M13이 극도로 분할되는 상의 수축에 상응한다. 구체적으로, 9:1 용적비가 사용되면, M13이 극도로 분할되는 상의 용적이 초기 용적의 1/10이기 때문에, M13은 10배로 농축될 것으로 기대된다. 후속적으로, 짧은 시간이 PON 적용에 필요하기 때문에, 이는 30분 추출 시간을 사용하여 시험하였다. M13 분할 실험은 37°C에서 9:1, 6:1, 3:1 및 1:1 평형 용적비를 수득하는 PEG 및 염의 초기 농도를 사용하여 실행했다. 도 42는 용적비의 함수로서의 농도 계수를 시험한 실험 결과를 도시한다. 실험 데이터가 모델 예측과 일치했는지를 통계적으로 결정하기 위해, 결정 계수 또는 R-제곱 값을 계산했다. R-제곱 값은 0.858인 것으로 밝혀졌고, 실험 데이터가 충분히 합당하게 예측 값과 일치한다는 것을 시사하고, 추가로 단순한 모델이 심지어 30분 추출에도 적합하다는 것을 확인한다.
LFA를 통해 M13의 검출
M13이 ATPS를 통해 30분 내에 농축될 수 있다는 것을 입증한 후, 콜로이드성 금 프로브 및 LFA 스트립을 제조했다. 금 프로브의 표면에 장식된 PEG는 입체 안정성을 제공하고, 추출된 염 풍부 상의 환경에서 금 프로브의 응집을 방지했다. 도 43은 사전 농축 단계를 경험하지 않은 샘플을 사용하는 LFA의 결과를 도시한다. M13 농도는 로그 스케일에 따라 일정한 간격의 점에서 선택되었다. 다각형 항-IgG 항체를 함유하는 대조군 라인 또는 상부 밴드의 존재는 그것이 샘플이 전체 스트립을 통해 유동했음을 확인하기 때문에 유효 시험을 나타낸다. M13의 코팅 단백질 pVIII에 대한 항체를 함유하는 시험 라인 또는 하부 밴드의 존재는 M13의 존재를 나타낸다. 다음에 도시된 바와 같이, 음성 대조군: 도 43a, 어떠한 M13도 함유하지 않고, 기대한 가시 시험 라인은 존재하지 않는다. 잔류하는 패널 중, 시험 라인의 강도는 다음에 제시된 최고 M13 농도에 대해 가장 크다: 도 43b, 라인 강도는 M13 농도가 감소함에 따라 감소한다. 시험 라인은 3.2x108 pfu/mL에서 더 이상 가시성이 아니다(도 43e), 약 1x109 pfu/mL의 검출 한계를 나타낸다(도 43d).
LFA에 앞서 M13의 농축
1x109 pfu/mL에서 확립된 검출 한계와 함께, 검출 한계의 가능한 개선은 ATPS를 사용함으로써 조사했다. 방정식 (12)에 기초로 약 10배 농도 계수를 수득할 것으로 예측된 9:1 용적비 용액을 사용했다. 37°C에서 30분 배양 후, 하부 상을 추출하고, 샘플을 LFA를 위해 제조했다. 도 44는 사전 농축 단계를 사용하는 LFA의 결과를 도시한다. 다시, 시험 라인은 M13을 함유하지 않는 음성 대조군에 대해 부재이다(도 44a). 잔류하는 패널 중, 초기 M13 농도는 도 6에 제시된 것보다 10배 미만이지만, LFA 시험 라인 강도는 사전 농축 단계를 갖지 않는 샘플의 강도와 일치한다. 시험 라인 강도는 3.2x107 pfu/mL에서 더 이상 가시성이 아닐 때까지 M13 농도가 감소함에 따라 감소된다(도 7e), 약 1x108 pfu/mL의 검출 한계를 나타낸다(도 44d). 이는, ATPS 농축 단계가 적용될 때 검출 한계의 10배 개선을 나타냈다.
LFA 스트립의 육안 해석으로부터의 결론을 확인하기 위해, LFA 이미지를 그레이스케일로 변환하였고, 시험 라인 강도는 본 맞춤 MATLAB 스크립트를 사용하여 배경에 대해 시험했다. 결과는 다음에 나타낸다: 도 45, ATPS 농축 단계 사용 및 비사용. 두 곡선은 대략적으로 동일한 시험 라인 신호에 대해 초기 M13 농도에서 10배 차이로 분리되고, 추가로 본 발명의 10배 농도 개선을 확인한다는 것을 주의한다.
실시예 5.
PEG-염 ATPS의 계면 추출에 의한 생물학적 혈청 중의 트랜스페린의 검출
단일 ATPS 단계를 사용하는 생체 분자의 농축은 표적 생체 분자를 두 벌크 상 사이의 계면을 향해 구동시켜 최적화했다. 계면 영역은 용적비와 무관하게 형성할 수 있는 매우 작은 용적 영역을 나타내기 때문에, 이러한신규 접근법은 긴 상 분리 시간을 갖는 극도의 용적비(1보다 더 크거나 더 작은 용적비)에 대한 의존성 없이 표적의 농축을 가능하게 한다. 대신, 가장 빨리 평형에 도달할 수 있는 용적비가 선택되었고, 이는 인산염 완충 생리 식염수(PBS)에서 추출 시간을 10분 이내로 감소시키고, 이전 접근법에 비해 상당한 개선이다. 이 접근법은, 계면의 용적이 두 거시적 벌크 상보다 더 작기 때문에, 단일 ATPS 단계에서 달성될 수 있는 최대 배-농도를 향해 이동하고, 따라서 생체 분자는 더욱 더 극도로 농축될 수 있다. 마지막으로 그러나 역시 주요한 것이지만, 샘플 용적을 증가시키면 바람직하게 계면에서 농축된다음, LFA로 검출될 수 있는 표적 생체 분자의 총 수를 증가시킨다. 이는 또한 극도의 용적비를 사용하여 벌크 상에서 표적 분자를 농축시키기 위해 사실이지만, 샘플 용적을 증가시키면 상 분리 시간을 증가시킨다. 제안된 계면 추출 접근법에서, 극도의 용적비는 더 이상 필요하지 않다. 도 46은 그림으로 계면 추출을 두 개의 벌크 상 중 하나의 추출과 비교한다.
계면을 향해 표적 생체 분자를 구동시키기 위해, GNP를 포함하는 포획 메커니즘을 사용했다. 입자 표면에 장식된 특이적 항체와 함께, GNP는 먼저 샘플 중의 표적 단백질을 포획했다. GNP의 표면 화학은 입자가 상 분리시 계면에서 분할되도록 최적화했다. 이어서, GNP에 의해 포획된 단백질은 계면에서 추출시켰다. 계면의 용적이 매우 작기 때문에, 단백질은 매우 농축되었고, 후속적으로 LFA 검출 스트립에 적용했다. 이 실시예는 PEG-염 ATPS의 계면에서 분할할 수 있었던 제조된 GNP의 요약을 제공한다. 이어서, 상이 가장 빨리 분리되고 또한 GNP의 가장 큰 회수를 가능하게 하는 용적비를 조사했다. 후속적으로, 모델 단백질 트랜스페린(Tf)을 사용하여, ATPS 계면 추출 단계와 조합된 Tf를 위한 LFA의 100배 개선을 입증하였다. 이어서, 연구는 현실 세계 적용에 접근하기 위해 확장했고, 소 태아 혈청(FBS) 및 합성 뇨 뿐만 아니라 혈액 샘플링에 바람직한 작은 용적을 위한 시스템을 재최적화했다. 데이터는, 심지어 더 복잡한 시스템에서, ATPS 계면 추출이 15 내지 25분 이내에 수행될 수 있고, Tf를 위한 LFA의 검출 한계의 100배 개선을 유도할 수 있음을 나타낸다.
이 실시예는 계면에서 국부화되고 또한 LFA의 비색 지시제로서 기능할 수 있는 나노프로브의 개발을 제공한다. 이 접근법은 표적 생체 분자를 농축시키고 수집하기 위해 기능화된 자기 또는 금 입자를 사용하는 이전에 연구된 추출 방법과 상이하고, 여기서 이러한 접근법은 관리 시점 장치에 적합하지 않은 장치를 필요로 했다. 이 방법은 LFA의 검출 한계를 100까지 개선시켜 실험실 기반 및 종이 기반 면역검정의 감도차를줄이는 효과적이고 신속한 접근법이다. 향상된 감도를 갖는 개선된 LFA는 진단 분야에서 상당한 영향을 부여하여 현재 사용가능하지 않은 관리 시점 용액을 제공하기 위해 가까이 이동한다. 한편, 이 접근법이 LFA 검출을 개선시킬 수 있음이 증명되었고, 이 농축 절차는 또한 다른 검출 방법에 적용될 수 있다.
항-Tf 항체의 방사성 표지
모든 시약 및 재료는, 다르게 언급되지 않는 한 다음으로부터 구입했다: 시그마-알드리치 (St. Louis, MO). 요오드-125 (125I)는 염소 항-인간 Tf 폴리클로날 항체 (카탈로그 # A80-128A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)를 방사성 표지하기 위해 사용되었다. 간단하게, Na125I (MP Biomedicals, Irvine, CA)는 IODO-BEADS (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)로 활성화되었다. 후속적으로, 활성화 125I를 15분 동안 염소 항-Tf 항체와 반응시켰다. 방사성 표지된 단백질을 정제하고, 유리 125I는 세파덱스(Sephadex) G10 크기-배제 컬럼을 사용하여 제거했다. 포스포텡스텐산 검정은 방사성 표지된 단백질의 방사능 및 농도를 정량화하기 위해 사용했다.
GNP의 제조
노출된 금 나노입자는 직경 약 25 내지 30nm의 입자 크기를 갖는 투명한 체리색 용액을 초래하기 위해 제조했다. GNP를 제조하기 위해, 320mg의 염소 항-Tf 항체를 30분 동안 20mL의 콜로이드성 금 용액으로 배양한 후, PEG:GNP에 대한 3000:1의 몰 비 및 추가 배양 30분을 사용하여 티올화-PEG5000을 첨가했다. 콜로이드성 금의 표면에 대한 다른 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 2mL의 10% 소 혈청 알부민(BSA) 용액을 혼합물에 첨가하고, 추가의 10분 동안 혼합했다. 생성된느 용액을 배양 기간 동안 진탕기 상에서 완만하게 혼합했다. 유리 (결합되지 않은) 항체, PEG 및 BSA를 제거하기 위해, 혼합물을 후속적으로 4oC 및 9,000 g에서 30분 동안 원심분리했다. GNP의 펠렛은 1% BSA 용액으로 2회 세척했다. 최종적으로, 회수된 GNP는 pH 9.0에서 2mL의 0.1M 붕산나트륨 완충제에 재현탁시켰다.
GNP의 분할
방사성 표지된 항-Tf 항체로 장식된 GNP는 가장 빠르고 가장 높은 GNP 회수를 수득할 수 있는 용적비를 결정하기 위해 상이한 조건에서 ATPS에서 분할하였다. 각 분할 실험을 위해, 둘베코 인산염 완충된 생리 식염수(PBS; Invitrogen, pH 7.4, 이온 강도 154 mM) 중의 3개의 동일한 PEG-염 용액을 총 용적 5000 μL로 제조했다. 3개의 상이한 용적비(1:1, 6:1 및 1:6)를 갖는 PEG-염 ATPS 용액은 특정 농도의 PEG 및 인산칼륨을 사용하여 제조했다. 후속적으로, 방사성 표지된 항-Tf 항체로 장식된 10μL의 GNP를 각 ATPS 용액에 첨가했다. 용액은, 용액이 균질했음을 보장하기 위해, 0oC에서 평형화했다. 0oC에서 평형이 달성되면, 용액은 상 분리를 유도하기 위해 37oC 수욕에서 배양하고, GNP는 두 개의 공존하는 상 사이에서 분할하는 것으로 밝혀졌다. 계면에서 GNP는 피펫을 사용하여 조심스럽게 인출했고, 30μL의 계면 용액은 계면에서 전체는 아니지만 대부분의 GNP가 수집되었음을 보장하기 위해 인출했다. 두 개의 공존하는 상은 또한 피펫을 사용하여 별도로 인출했다. 계면 및 두 개의 공존하는 상 중의 GNP의 양은, GNP가 방사성 표지된 항-Tf 항체에 결합되어 있기 때문에, 코브라 시리즈 오토-감마 카운터(Cobra Series Auto-Gamma Counter)를 사용하여 각 영역에서 방사능의 양을 측정함으로써 정량화했다. 3개의 영역 각각에서 GNP의 정량화된 양은 질량 저울을 사용하여 계면에서 GNP의 회수율을 계산하기 위해 사용했다.
LFA 시험 스트립의 제조
경쟁 메커니즘을 사용하는 LFA 시험을 이 연구에서 시행했다(도 47). 경쟁 검정에서, 목적하는 표적은 시험 라인을 형성하기 위해 니트로셀룰로즈 멤브레인 위에 고정시킨다. GNP 상의 1차 항체에 대한 고정된 2차 항체는 대조군 라인을 구성한다. LFA를 수행할 때, 샘플은 먼저 GNP와 접촉하고, 표적 분자가 샘플에 존재하는 경우, 그들은 GNP 상에 장식된 이들의 특이적 항체에 결합한다. 샘플에 존재하는 표적 분자가 GNP 상의 항체를 포화시키는 경우, 이러한 GNP는 시험 스트립 상의 고정된 표적 분자에 더 이상 결합할 수 없다. 그 결과, GNP는 시험 라인에서 가시 밴드를 형성하지 않고, 이는 양성 결과를 나타낸다. 한편, 샘플이 GNP 상의 항체를 포화시킬 수 있는 농도로 표적 분자를 함유하지 않는 경우, GNP 상의 이러한 항체는 시험 스트립 상의 고정된 표적 분자에 결합할 수 있고 시험 라인에 가시 밴드를 형성할 수 있다. 이는 음성 결과를 나타낸다. 또한, 샘플 중의 표적 분자의 존재에 상관 없이, GNP 상의 항체는 대조군 라인 위의 고정된 2차항체에 결합하여 충분한 샘플이 시험 라인을 통해 위킹되고 대조군 라인에 도달했다는 것을 나타낸다. 가시성 대조군 라인의 존재는 유효 시험을 나타낸다.
사전 농축 없이 Tf를 사용하는 LFA의 실행
가변 농도의 Tf를 함유하는 Tf 스톡 용액을 PBS에서 제조했다. 후속적으로, 20μL의 각 Tf 스톡 용액을 시험 스트립을 통해 샘플의 유동을 보조하기 위해 사용된 20μL의 시험 완충제 (0.2% BSA, 0.3% 트윈20, 0.2% 나트륨 아지드, 0.1% PEG, 0.1 M 트리즈마 완충제, pH 8) 및 10μL의 GNP 현탁액에 첨가했다. 다양한 농도의 Tf를 갖는 총 5개 샘플 용액(각각 50μL)을 제조했다(0 (음성 대조군), 0.001, 0.01, 0.1 및 1ng/μL). 시험 스트립은 각 샘플 용액에 수직으로 침지시켰고, 여기서 샘플 패드는 용액과 접촉된다. 10분 후, 시험 스트립을 인출했고, 각 스트립의 이미지는 다음에 의해 즉시 촬영했다: 캐논 EOS 1000D 카메라 (Canon U.S.A., Inc., Lake Success, NY).
FBS (HyClone, 특성화됨, pH 7.4)에서 실행된 실험에서, GNP의 용적이 작은 용적 실험에 적합하게축소될 수 있도록 더 농축된 GNP 현탁액을 사용했다. FBS 스톡 용액 중의 Tf의 농도는 5μL의 Tf 스톡 용액을 5μL의 GNP 현탁액에 이어, 40μL의 시험 완충제에 첨가함으로써 PBS 실험에 사용된 동일한 최종 Tf 농도를 달성하기 위해 조정했다. 유사하게, 실험은 합성 뇨를 사용하여 수행했다.
ATPS 계면 추출과 Tf용 LFA의 조합
용적비 1:1은 분할 GNP 실험으로부터의 발견에 기초하여 PBS에서 수행된 연구를 위해 사용했다. 항-Tf 항체를 사용함으로써, GNP는 샘플에서 먼저 Tf를 포획하고, 이어서 계면에서 농축된 전체 Tf-GNP 복합체였다. 다양한 농도의 Tf가 또한 ATPS 용액에서 스파이킹되었다는 것 외에는, GNP의 분할 섹션에 기재된 것과 유사한 프로토콜을 사용했다. 간단하게, 10μL의 GNP 현탁액은 1:1 용적비를 수득하고 다양한 Tf 농도(0 (음성 대조군), 0.001, 0.01 및 0.1ng/μL)을 함유한 4990μL의 Tf-스파이킹된 ATPS 용액에 첨가했다. 용액은, 용액이 균질했음을 보장하기 위해, 0oC에서 평형화했다. 평형이 달성되면, 용액을 상 분리를 유발하기 위해 37oC 수욕에 배치시켰다. 10분 후, 농축된 GNP 및 Tf를 함유한 30μL의 계면 용액을 인출했다. 이 계면 용액은 50μL의 샘플 용액을 형성하기 위해 20μL의 시험 완충제와 혼합했다. LFA 시험 스트립은 각 샘플 용액에 수직으로 침지시켰고, 여기서 샘플 패드는 용액과 접촉된다. 10분 후, 시험 스트립을 인출했고, 각 스트립의 이미지는 캐논 EOS 1000D 카메라로 즉시 촬영했다.
FBS 및 합성 뇨에서 수행된 연구를 위해, PEG 및 인산칼륨 농도는 1:1 용적비를 달성하기 위해 먼저 조정될 필요가 있다. FBS 중 ATPS는 또한 더 천천히 상 분리되고, PBS 시스템에 사용된 10분 배양 대신, 용액을 25분 동안 37oC 수욕에서 정치시켰다. 또한, 전술된 바와 같이, 용적을 감소시켰다. 따라서, 검출 한계는 5000μL (LFA 단독 실험에 사용된 50μL Tf 스톡 용액보다 100배 더 많은 용적)를 사용하여 증가시킨다는 것을 나타내기 보다는, FBS 및 합성 뇨에서 실행된 연구는 1000μL (LFA 단독 실험에 사용된 10μL Tf 스톡 용액보다 100배 더 많은 용액)를 사용하여 등가의 개선을 나타냈다. 이전에 PBS에 대해 기재된 프로토콜은 5μL의 더 농축된 금 현탁액이 995μL의 FBS 또는 합성 뇨 중의 Tf-스파이킹된 ATPS 용액에 첨가되도록 적은 용적을 위해 변형시켰다. 20μL의 계면 영역을 추출한 다음, 30μL의 금 완충제를 첨가했다. 각 LFA 스트립은 인출하여 이미지화하기 전에 15분 동안 현탁액에 침지시켰다.
ATPS 계면 추출을 종이 기반 LFA 검출 검정과 조합하기 위해, 이 실시예에서 개발된 GNP는 3가지 기능을 포함했다. 첫째, GNP의 표면 위 장식된 특이적 항체는 샘플에 존재하는 표적 단백질을 포획했다. 둘째, GNP의 표면에서 PEG 및 단백질의 최적화된 형성은 GNP가 벌크 상에서가 아니라 계면에서 분할되도록 했다. 마지막으로, GNP는 LFA용 비색 지시제로서 직접 기능하고, 따라서 후속적 검출 검정이 여분의 세척 또는 다른 제조단계 없이 즉시 실행되도록 했다. GNP의 개략도는 다음에 도시된다: 도 48a. GNP는 3개의 주성분을 갖는다: PEG 중합체, 금 나노입자, 및 항-Tf 항체. 각 성분 자체는 나노입자를 두 벌크 상 중 하나로 구동시킨다. 먼저, 장식된 PEG는 입자 표면의 중합체와 상부 상 중의 풍부한 중합체 사이의 양호한 PEG-PEG 상호작용에 기인하여 나노 입자를 상부 PEG 풍부 상으로 구동시킨다(도 48b). 구체적으로, PEG:GNP의 몰 비를 증가시키면 결합된 PEG의 형태를 “브러시” 형태와 더욱 밀접하게 닮도록 변화시켜 PEG-PEG 상호작용을 증가시키기 위해 노출된 표면적의 양을 확대시킨다. 한편, 금 나노입자의 큰 크기는 나노입자가 PEG 중합체와 더 적은 반발성 배제-용적 상호작용을경험하는 하부 PEG 결핍 상에서 분할되도록 한다. GNP 상의 친수성 단백질 (항-Tf Ab 및 BSA)는 GNP의 소수성을 증가시키고, 또한 이는 상부 PEG 풍부 상보다 더 친수성인 하부 PEG 결핍 상에서 분할되도록 한다. 그러나, 하부 PEG 결핍 상이 또한 염 풍부하기 때문에, 나노입자는 충분한 입체 안정성을 제공하기 위해 나노입자의 표면에 충분한 PEG가 존재하지 않을 때 응집한다(도 48c). 조합에서, GNP의 3개 성분은 궁극적으로 GNP를 ATPS 중의 계면으로 구동시키기 위해 다양하고섬세하게 균형을 이룰 수 있다(도 48d).
경쟁 LFA에서, 샘플 중의 표적 단백질의 성공적인 검출은 표적에 의해 포회되는 GNP 상의 항체에 의존한다. 항체가 포화되지 않으면, GNP는 시험 라인을 형성하기 위해 LFA 상에 고정된 표적에 결합할 수 있어 거짓 음성 결과를 나타낸다. 저농도의 표적을 갖는 샘플을 검출하기 위한 하나의 방법은 샘플 용적을 증가시키는 것이다. 그것은 표적 분자의 총 수를 증가시키고, 이는 또한 잠재적으로 GNP의 소정의 고정량에 대한 항체의 포화를 유도할 것이다. 그러나, 단지 작은 용적이 LFA 시험 스트립을 통해 유동할 수 있기 때문에, 그리고 GNP가 이 접근법에서 희석되기 때문에, 충분하지 않은 GNP가 시험 스트립을 통해 유동하면, 대조군 라인은 가시성이 아니어서 무효 결과를 나타낸다. ATPS 계면 추출의 사용이 작은 용적의 표적 단백질로 포화된 GNP를 수집하기 위한 신속하고 효과적인 수단을 제공하기 때문에, 이 접근법은 훨씬 더 큰 샘플 용적이 분석되도록 함으로써 저농도의 표적 단백질의 검출을 초래할 수 있다.
3개의 용적비를 가장 짧은 배양 기간 내에 대부분의 GNP를 회복할 수 있는 최적의 용적비를 결정하기 위해 시험했다. 결과는 표 4에 나타낸다.
표 4. 상이한 용적비에 대한 GNP의 회복
1:1 용적비 상이 가장 빨리 분리되었고, GNP의 가장 큰 회복을 가능하게 했다. 상 분리가 온도를 증가시킴으로써 유발될 때, 거시적 PEG 풍부 및 PEG 결핍 도메인이 형성되고, 유사한 도메인은 서로 발견하여 합체한다. 도메인이 합체할 때, 그들은 주행하고, 결국 두 상 사이의 계면 장력 및 밀도차에 기인하여 상부에 거시적 PEG 풍부, 염 결핍 상을, 하부에 거시적 PEG 결핍, 염 풍부 상을 형성한다. 1:1 용적비 상이 6:1 또는 1:6 용적비보다 더 빨리 분리되는데, 이는 도메인이 상당량의 각 상이 존재할 때 서로 발견하고 합체하기에 더 용이한 시간을 갖기 때문이다. 더 불균일한 용적비의 경우, 더 작은 용적 상의 도메인은 합체 어려움을 경험한 도메인에 기인하여 더 큰 연속 상에 동반될 수 있다. 또한, 6:1 용적비 상은, PEG 풍부 상이 6:1 용적비를 위한 연속 상이고, PEG 결핍 도메인이 서로 발견하고 더 점성인 PEG 풍부 연속 상 중의 이들의 각각의 거시적 상으로 이동하는 더 큰 어려움을 경험하기 때문에, 1:6 용적비보다 더 느리게 분리한다.
표 5: 상이한 용적비에 대한 GNP의 회복
GNP는 어느 하나의 도메인에서 분할되지 않기 때문에, 그들은 도메인이 합체될 때 도메인 사이에 잔류한다. 결국, GNP는 상 분리가 완료될 때 계면에서 적색 박막으로서 나타난다. GNP의 회복은, 동반이 이 용적비에서 최소화되고, 따라서 동반된 도메인과 연속 상 사이에 존재하는 계면에서 GNP가 덜 손실되기 때문에, 1:1 용적비를 사용할 때 효율적이다. 1:1 용적비 상이 최고 GNP 회복을 수득하면서 가장 빨리 분리되기 때문에, 이는 후속 실험에 사용하였다.
ATPS 계면 추출 단계를 도입함으로써, LFA의 개선을 입증하기 위해, 모델 단백질 트랜스페린(Tf)을사용하였다. Tf는 철 수송용 혈청 단백질이다. LFA에서 Tf의 검출 한계를 확립하기 위해, 임의의 사전 농축 단계 없이 다양한 Tf 농도를 사용하는 일련의 LFA 시험을 수행하였다. 샘플이 GNP 상에 장식된 항-Tf 항체를 포화시키기에 충분한 Tf 분자를 함유하면, 이러한 항-Tf 항체는 시험 라인에서 니트로셀룰로즈 상의 고정된 Tf에 결합하지 않았고, 따라서 시험 라인에서 가시 밴드를 형성하지 않았다. 이는, 샘플을 1ng/μL의 Tf 농도로 시험할 때 관찰되었던 양성 결과를 나타냈다(도 49, 상부 패널). 한편, 항-Tf 항체를 포화시키는 샘플에 Tf가 불충분하거나 전혀 존재하지 않으면, 이러한 항-Tf 항체는 니트로셀룰로즈 멤브레인 상의 고정된 Tf에 성공적으로 결합하고, 따라서 시험 라인에 가시 밴드를 형성했다. 이는 1ng/μL 미만의 Tf 농도로 샘플을 시험할 때 관찰된 음성 결과를 나타낸다. 1ng/μL가 진정한 양성 결과를 나타낸 최저 Tf 농도이기 때문에, 이는 사전 농축 단계 없이 LFA를수행할 때 Tf에 대해 약 1ng/μL의 검출 한계를 나타냈다.
ATPS 계면 추출 단계가 Tf의 검출 한계를 LFA를 사용하여 100배까지 개선시킬 수 있음을 결정하기 위해, GNP의 동일량을 LFA의 검출 한계의 100배 미만인 Tf 농도(0.01ng/μL)로 ATPS 용액에 적용했다. 샘플 용적은 Tf 분자의 총 수를 동일하게 유지시키기 위해 50μL에서 5000μL로 100배 증가시켰다. 제한된 양의 샘플(50μL)만이 LFA 시험 스트립에 적용될 수 있기 때문에, 이러한 큰 샘플 용액 중의 희석된 GNP는 농축되어 LFA에 적용될 필요가 있다. 표적 단백질로 포화된 이러한 GNP를 회복하기 위해, 용액은 계면에서 10분 이내에 GNP를 수집하기 위해 37oC 수욕에 배치시켰다. 이어서, GNP를 추출하고, LFA 시험 스트립에 직접 적용했다. 이러한 연구의 결과는 다음의 하부 패널에 나타낸다: 도 49. 진정한 양성 결과는 검출 한계에서 100배 개선을 나타내는 0.01ng/μL에서 수득했다. 이러한 접근법을 사용하는 0.001ng/μL에서 거짓 음성 결과의 시험 라인 강도는 샘플을 동일한 Tf 농도와 비교할 때 사전 농축 단계 없는 것보다 약해서, GNP가 시험 라인에 결합하는 것을 어렵게 하기 위해 더 많은 Tf가 포획되었다는 것을 나타낸다. 시험 라인 강도는 또한 Tf 농도가 감소됨에 따라 증가했고, 이는 항체를 포화시키기 위해 사용가능한 Tf의 양이 감소될 때 예상되었다.
ATPS 계면 농도의 유효성을 연구하기 위해, FBS로 제조된 적은 용적의 ATPS 용액을 환자로부터인출된 작은 샘플 혈액을 모방하기 위해 시험했다. FBS의 보다 복잡한 조성에 기인하여, PBS 중의 ATPS와 함께 사용된 절차는 FBS 시스템을 위해 재최적화했다. FBS의 높은 단백질 함량은 1:1 용적비를 형성하기 위해 상이한 농도의 PEG 및 염을 필요로 하는 ATPS의 용적비를 변경했다. FBS에서 수행된 실험이 또한 더 작은 샘플 용적을 사용하기 때문에, GNP의 용적은 스케일 다운해야 했고, 더 농축된 GNP 스톡이 제조되었다. 또한, ATPS를 위한 배양 시간은 FBS가 상 분리 공정을 늦출 때 10분에서 25분으로 연장했다. 추가로, FBS를 포함하는 복합체 혼합물에 기인하여, LFA 시험 시간은 10분에서 15분으로 연장했다. 혈청이 더 복잡한 매트릭스를 나타냄에도 불구하고, 도 50은 ATPS 계면 추출과 조합된 LFA가 여전히 사전 농축 없는 LFA와 비교하여 검출 한계의 100배 개선을 수득했음을 도시한다. LFA를 위한 샘플 10μL를 사용하고, LFA를 위한 샘플 1000μL를 ATPS 계면 추출과 조합했다. 유사한 최적화 공정을 합성 뇨 시스템에 대해 수행했고, 결국 다음에 나타낸 바와 같이, 검출 한계의 유사 100배 개선을 입증했다: 도 51.
실시예 6.
트리톤-X-114 ATPS 및 3-D LFA를 사용하는 말라리아 바이오마커의 검출
트리톤 X-114 ATPS는 종이 설정이 이 미셀 시스템의 분리 공정을 향상시킬 수 있는지를 결정하기 위해 3-D 종이 구조에 적용하였다. 트리톤 X-114 미셀 시스템 상은 PEG-포스페이트 염 ATPS보다 훨씬 더 느리게 분리되어 적어도 8시간 내지 약 3분의 상 분리 시간의 훨씬 더 큰 감소를 초래하고, 종이의 이러한 상 분리 현상을 미셀 ATPS로 확장한다. 이어서, 종이 기반 설계는 사용자 개입 없이 농축시키는 동시에 질환 바이오마커를 검출하는 올-인-원 종이 기반 진단 스트립을 형성하기 위해 LFA와 통합하였다. 이를 입증하기 위해, 진단 스트립은 인산염 완충된 생리 식염수(PBS) 및 희석되지 않은 소 태아 혈청(FBS)의 용액에서 말라리아 바이오마커 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum) 락테이트 데하이드로게나제(pLDH)를 검출하기 위해 사용했다. 강력한 한단계 자동화 진단 스트립은 농축되고, 20분 이내에 pLDH를 검출하여 전통적인 LFA 설정과 비교했을 때 pLDH 검출 한계의 10배 개선을 입증한다. 이 플랫폼 기술은 상기 제한을 극복하고, 자원 결핍 설정 내에서 말라리아 및 다른 질환을 진단검정의 현재 상태를 변환시키기 위해 사용될 수 있다. 재료 및
금 나노프로브(항-pLDH GNP)의 제조
평균 유체역학적 직경 24nm를 갖는 금 나노입자의 용액을 제조했고, 이는 짙은 체리색 용액으로서 나타났다. 금 나노입자의 크기는 제타사이저 나노 ZS 입자 분석기(Malvern Instruments Inc, Westborough, Massachusetts)를 사용하여 동적 광 산란 측정에 의해 수득했다.
나노입자를 형성한 후, 1mL의 금 나노입자 용액의 pH는 먼저 1.5N NaOH를 사용하여 pH 9로 조정했다. 후속적으로, 16μL의 마우스 모노클로날 항-피.팔시파룸/피.비박스 LDH 항체 (BBI Solutions, Cardiff, UK)를 0.5mg/mL의 농도로 콜로이드성 금 용액에 첨가하고 진탕기 상에서 30분 동안 혼합했다. 콜로이드성 금 나노입자의 표면에 다른 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 200μL의 10% w/v 소 혈청 알부민 (BSA) 용액을 혼합물에 첨가하고, 진탕기 상에서 20분 동안 혼합했다. 유리된 비결합 항체를 제거하기 위해, 혼합물을 4°C 및 12,000rpm에서 30분 동안 원심분리한 다음, 콜로이드성 금 나노입자의 펠렛을 200μL의 1% w/v BSA 용액에 재현탁시켰다. 원심분리 및 재현탁 단계를 2회 더 반복했고, 제3의 원심분리 후, 금 나노입자의 펠렛을 pH 9.0에서 100μL의 0.1M 붕산나트륨 완충제에 재현탁시켰다. 항-pLDH 항체로 기능화된 금 나노입자는 이후 항-pLDH 금 나노프로브(항-pLDH GNP)로서 칭명된다. 항체로 기능화되지 않은 BSA 코팅된 금 나노입자를 가시화 목적으로 사용했고, 이후 BSA-GN로서 칭명된다.
트리톤 X-114 ATPS의 제조 및 가시화
트리톤 X-114 ATPS의 평형 용적비(하부 상의 용적에 의해 나누어진 상부 상의 용적)는 트리톤 X-114의 초기 w/w 농도를 변화시켜 발견했다(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 둘베코 인산염 완충된 생리 식염수(PBS; Invitrogen, Grand Island, NY, pH 7.4, 1.47 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2HPO4, 137.92 mM NaCl, 2.67 mM KCl, 및 0.49 mM MgCl2 함유) 및 FBS (Invitrogen, Grand Island, NY)의 용액 중. 이러한 용액은 상 분리되었고, 온도 조절된 수욕에서 25 ℃에서 평형에 도달했다. 트리톤 X-114/PBS 용액 중의 BSA-GN은 상부 상에서 유리한 분할을 나타낸 반면, 트리톤 X-114/FBS 용액 중의 BSA-GN은 하부 상에서 유리하게 분할된다. 결과적으로, 트리톤 X-114/PBS를 위한 1:9 용적비(즉, 하부 상의 용적으로 나누어진상부 상의 용적) 및 트리톤 X-114/FBS 중의 9:1 용적비를 위한 조건을 발견하고, 추가의 실험에 사용했다. 이러한 용적비는 나노입자의 10배 농축을 가능하게 했다.
PBS 중의 미셀 ATPS의 두 상을 가시화하기 위해, 100μL의 BSA-GN 및 4μL의 브릴리언트 블루 FCF 염료(The Kroger Co., Cincinnati, OH)를 PBS 중의 1:9 용적비에 대해 트리톤 X-114의 이전에 결정된 농도를 함유하는 2.5g의 용액에 첨가했다. 이러한 용액은 와동을 통해 충분히 혼합하고, 25 ℃에서 배양했다. 용액의 사진은 8시간에 평형에 도달할 때까지 매시간 촬영했다. 평형은 용액이 이의 흐린 외관을 손실할 때 확립되었고, 모든 가시 도메인은 이들 각각의 상으로이동하고, 측정된 계면 높이는 안정하게 유지되었다. 체리색 BSA-GN 및 블루색 염료는 각각 미셀 결핍 상 및 미셀 풍부 상의 비색 지시제였다. 모든 이미지는 다음을 사용하여 포착했다: 캐논 EOS 1000D 카메라(Canon U.S.A., Inc., Lake Success, NY), 조절된 조명 환경에서.
3-D 종이 윅 내에서 PBS 중의 미셀 ATPS의 상 분리를 가시화하기 위해, 2μL의 브릴리언트 블루 FCF 염료 및 10μL의 BSA-GN를 함유하는 200mg의 혼합된 균질 용액을 와동시킨 다음, 25 ℃에서 수욕에 배치시켰다. 3-D 종이 윅은 유리 섬유의 5 × 40 mm 스트립의 하나의 가장자리 위에 3개의 5 × 15 mm 유리 섬유 종이 시트를 적층시킴으로써 형성되었다. 제조된 용액을 25 ℃에서 5분 동안 배양한 후, 3-D 종이 윅을 용액에 수직으로 배치시켜 종이 스택이 용액을 흡수하도록 했다. 종이 스트립의 이미지는 0초, 30초, 60초 및 180초에 포착했다.
LFA 단독에 의한 pLDH의 검출
경쟁 검정 포맷을 사용하는 LFA 시험 스트립을 조립했다. 고정된 피. 팔시파룸 L-락테이트 데하이드로게나제(pLDH; MyBioSource, San Diego, CA, USA)는 시험 라인을 구성했고, 1차 항-pLDH 항체에 특이적인 고정된 염소 항-마우스 IgG 2차 항체(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX)는 대조군 라인을 구성했다. 충분한 pLDH가 샘플에서 GNP를 포화시키기 위해 존재하면, LFA 스트립을 통해 이동하는 pLDH-GNP 복합체는 시험 라인 상에 고정된 pLDH에 결합하지 않아 시험 라인에 가시성 착색 밴드의 부재를 유도한다. pLDH가 존재하지 않으면, GNP 상의 비점령된 항체는 고정된 pLDH에 결합하고, 착색 밴드가 시험 라인 영역에서 형성된다. pLDH의 존재와 상관 없이, GNP 상의 항체는 대조군 라인에 고정된 2차 항체에 결합하여 가시 라인을 형성하여 스트립을 통한 성공적인 샘플 유동을 나타낸다. 따라서, 음성 결과는 두 개의 착색 밴드(하나의 시험 라인 및 하나의 대조군 라인)에 의해 동정된반면, 양성 결과는 대조군 라인에서 단지 하나의 착색 밴드에 의해 동정된다.
LFA만으로 pLDH의 검출 한계를 확인하기 위해, 항-pLDH GNP를 샘플 용액에 첨가하고, pLDH-GNP 복합체를 형성하기 위해 샘플에 존재하는 pLDH에 결합하도록 했다. PBS 또는 FBS 중의 10μL의 항-pLDH GNP 및 10μL의 공지된 농도의 pLDH로 이루어진 20μL의 샘플 용액을 시험관에서 30μL의 작동 완충제(0.2% BSA, 0.3% 폴리옥시에틸렌소르비탄 모모라우레이트(트윈 20), 0.1 M 트리스 완충제, pH 8)와 혼합했다. LFA 시험 스트립을 샘플 용액에 수직으로 삽입하였고, 이는 흡수 패드를 향해 상향으로 모세관 작용에 의해 스트립을 통해 위킹했다. 두 PBS 및 FBS 샘플로부터 시험 스트립의 이미지를 조절된 조명 환경에서 20분 후 촬영했다.
3-D 종이 기반 LFA 및 ATPS에 의한 pLDH의 검출
LFA 시험 스트립의 설계는 3-D 종이 윅을 첨가하여 약간 변형시켰다. 구체적으로, 니트로셀룰로즈 멤브레인에 접속되어 있는 셀룰로즈 샘플은 5 × 20mm 유리 섬유 패드로 교체했다. 이 유리 섬유 패드의 상부에, 5 × 15 mm 유리 섬유 시트의 3개의 추가의 스트립을 총 4층의 유리 섬유 종이를 형성하기 위해 적층시켰다. 유리 섬유 층은 다음으로 포장했다: 스카치 테이프 접착제(3M, St. Paul, MN, USA).
PBS 샘플 중 pLDH의 검출을 위해, 10μL의 항-pLDH GNP 및 공지된 농도의 pLDH를 함유하는 충분히 혼합된 1:9 용적비 ATPS 200μL를 시험관에 첨가했다. 용액은 용액이 혼탁해져 상 분리의 개시를 나타냄을 보장하고, GNP가 용액에서 pLDH를 포획하도록 하기 위해 25 ℃에서 5분 동안 배양했다. 이어서, 3-D 윅 변형 LFA 스트립을 혼합 ATPS에 배치하고, 유체가 흡수 패드를 향해 3-D 윅을 통해 통과하도록 했다. 생성되는 검출 영역의 이미지는 20분 후 포착했다.
FBS 샘플 중 pLDH의 검출은 200 μL의 혼합된 9:1 용적비 ATPS가 대신 제조되었다는 것을 제외하고, 매우 유사한 프로토콜을 따랐다. 배양 시간 및 라인을 개발한 시간을 포함하는 시험 조건은 PBS 샘플을 위한 조건과 일치했다. 검출 영역의 이미지는 또한 20분 후에 포착했다.
시험관에서 트리톤 X-114 ATPS 상 분리
특정 온도 이상의 PBS의 용액에서, 트리톤 X-114 미셀 ATPS는 상부 미셀 결핍 상 및 하부 미셀 풍부 상을 형성한다. 용액에 존재하는 분자는 이들의 물리적 및 화학적 특징, 예를 들면, 소수성 및 크기에 기초하여 두 상 사이에서 분할한다. 친수성 BSA-GN은 나노입자와 미셀 풍부 상 중의 더 크고 더 풍부한 미셀 사이의 반발성 입체 배제된 용적 상호작용에 의해 큰 부분에서 구동된 미셀 결핍 상에서 극도로 분할되었다. 특이적 항체로 기능화된 나노입자는 표적 분자와 복합체를 형성할 수 있고, 이러한 복합체는 또한 미셀 결핍 상에서 극도로 분할된다. 이들의 표면 플라스몬 공명에 기인하여 체리색을 나타내는 비기능화 BSA-GN은 상 분리 후 생성되는 미셀 결핍 상을 가시화하기 위해 사용했다. 대조적으로, 브릴리언트 블루 FCF 염료는 작고, 소수성이고, 따라서 이는 미셀 풍부 상에서 극도로 분할되었다. 혼합된 ATPS 용액에 첨가한 경우, 블루 착색 염료는 상 분리 후 생성되는 미셀 풍부 상을 가시화하기 위해 사용했다.
상 분리를 달성하기 위해 필요한 시간은 상이한 두 상 시스템 사이에서 변한다. 예를 들면, PEG-포스페이트 염 ATPS 상은 대부분 2-상 시스템에 대해 신속하게 분리되고, 트리톤 X-114 미셀 ATPS는 두 상 사이의 작은 밀도차 및 계면 장력에 기인하여 거시적 상 분리 평형을 달성하기에 충분히 더 긴 양의 시간을 필요로 한다. 상 분리 시간은 또한 더욱 극도의 용적비, 예를 들면, 1:9 또는 9:1로 증가시키는데, 이는 하나의상이 비례적으로 훨씬 작아지고, 그 상의 거시적 도메인은 합체 어려움을 경험한다. PBS 중의 1:9 용적비 ATPS의 이미지는 특정 시점에 25 ℃에서 촬영했고; 완전한 거시적 상 분리 평형은 약 8시간 후까지 달성되지 않았다(도 53a). 생성되는 미셀 결핍 상 용적은 총 용액 용적의 1/10인 것으로 측정되어 1:9 용적비를 확인했다.
트리톤 X-114 ATPS 상 분리를 향상시키기 위해 종이 멤브레인 사용
복수 층의 종이가 종이에서 상 분리를 향상시키기 위한 필수 요소임을 가정하였다. 따라서, 얇고 긴밀하게 결합된 종이 스트립의 복수 층으로 이루어진 "3-D 종이 윅"은 트리톤 X-114 ATPS의 상 분리 공정을 증가시키도록 설계되었다. 3-D 윅이 PBS 중의 혼합 ATPS 용액에 똑바로 배치될 때, 용액은 스트립까지 수직으로 유동했다. 거의 스트립의 첨가 직후에, GNP를 함유하는 미셀 결핍 상은 블루 착색 염료를 함유하는 느리게 이동하는 미셀 풍부 상에 앞서 신속하게 유동했다(도 53b). 분리는 약 30초 후 스트립의 3-D 윅 부분 내에서 이미 관찰되었고, 더 완전한 분리는 유체가 이미 윅을 떠난 후 180초(3분)에 나타났다는 것을 주의한다.
이러한 실험은, 윅의 추가의 층이 거시적 상 도메인의 합체를 보조하고 더 큰 용적이 소정의 시간에 종이를 통해 위킹되도록 하기 위해 유동 방향에 수직인 단면적의 증가 제공한다는 것을 나타낸다. 또한, 덜 점성인 미셀 결핍 도메인은 다공성 종이에서 더 신속하게 전방으로 이동하여 합체될 것으로 기대되는 반면, 미셀 풍부 도메인은 역으로 유지되고 이들의 큰 점도 및 종이 재료와의 잠재적인 유리한 상호작용에 기인하여 더 느리게 이동할 것으로 기대된다. 그 결과, 시험관에서 시간 순으로 발생되는 것으로 나타난 두 상의 거시적 분리는 단지 종이 멤브레인에서 겨우 몇 분 이내에 목격된다. 3-D 종이 윅의 추가의 이점은 더 큰 용적의 ATPS 용액의 처리이다. 일반적으로, 3D 윅 중의 층의 수는 큰 용적의 용액을 수용하기 위해 증가시킨다. 최적화된 인자는 스트립 길이, 너비 및 스트립의 수를 포함한다. 설계는 윅의 길이에 대해 완전한 상 분리를 달성하고, 윅을 떠나기 위해 주행하는 분리된 미셀 결핍 상에 필요한 길이를 최소화할 수 있었다. 이러한 종이 기반 구조는 분리시키기 위해 더욱 더 긴 시간을 필요로 하는 많은 다른 2-상 시스템을 향상시키기 위해 잠재적으로 사용될 수 있다.
FBS에서 트리톤 X-114 ATPS 상 분리의 향상
PBS 용액과 대조적으로, 대신 FBS 샘플에서 형성된 트리톤 X-114 ATPS는 상부 미셀 풍부 상 및 하부 미셀 결핍 상을 생성했다. 이는 FBS에서 발견된 추가의 단백질 및 염에 의해 초래된 밀도차에 기인할 수 있다. 대신 GNP가 하부 상에서 극도로 분할되기 때문에, 총 용적의 1/10 또는 환언하면, 9:1 용적비를 갖는 농축된 하부 상을 생성하기 위해 초기 트리톤 X-114 농도를 조정하는 것이 필요했다.
두 상의 배향은 혈청에서 반전되기 때문에, 반전된 배향은 3-D 종이 윅에서 상 분리 효과를 결정하기 위해 연구했다. 사실, 3-D 윅이 FBS 중의 혼합 ATPS에 배치될 때, PBS 실험의 결과와 매우 유사한 결과가 관찰되었다. 따라서, 밀도차가 시험관에서 FBS 중의 미셀 결핍 상을 하부로 구동하지만, 미셀 결핍 상은 여전히 3-D 윅까지 유동하는 더 빠른 상이 잔류한다. 따라서, 미셀 결핍 상은 시험관 중의 상대적 상 밀도에 의해 결정된 상 배향과 무관하게 리딩 전면이다. 따라서, 더 점성인 미셀 풍부 상은 지속적으로 느리게 이동하고, 다공성 멤브레인에 의해 역으로 유지되어 점도 효과가 종이에 도입된 미셀 ATPS의 유동 거동에서 임의의 밀도 효과을 지배한다는 것을 나타낸다.
PBS에서 pLDH의 LFA 기반 검출의 개선
농축된 GNP를 함유하는 미셀 결핍 상이 3-D 종이 윅을 떠날 때 리딩 전면에서 유동하기 때문에, 윅은 LFA 종이 스트립의 니트로셀룰로즈 기반 검출 영역의 상류에 부착시켰다. 그렇게 하면 농축 단계에서 검출 단계로 원활하게 전이되게 했고, 주사기 추출의 필요성을 제거했다. 통합된 종이 기반 진단 스트립을 위한 설계는 다음에 도시된다: 도 54a. 유리 섬유 종이 스트립의 복수 층으로 이루어진 3-D 윅(농축 영역)은 고정된 대조군 및 시험 라인(검출 영역)을 갖는 니트로셀룰로즈 멤브레인에 접속된 다음, 이를 유체 유동을 구동시키기 위해 싱크로서 사용된 흡수 패드에 접속된다. 모든 성분은 접착제 배면에 고정시키고, 3-D 윅은 혼탁한 ATPS 용액에 수직으로 침지시킨다.
pLDH 검출 시험에서, 브릴리언트 블루 FCF 염료는 더 이상 사용되지 않았고, 기능화 항-pLDH GNP를 BSA-GN 대신 사용했다. 항-pLDH GNP는 BSA-GN과 매우 유사한 분할 거동을 나타내지만, pLDH를 포획하고 LFA에서 비색 지시제로서 기능할 수 있다.
먼저, ATPS 및 3-D 종이 윅을 도입하지 않은 LFA-단독 대조군에 대한 검출 한계는 20μL의 총 샘플 용적을 사용하여 동정하였다. LFA-단독 대조군이 10ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출할 수 있었지만, 1ng μL-1에서 pLDH를 성공적으로 검출할 수 없었기 때문에, 이의 검출 한계는 10ng μL-1인 것으로 결정되었다. 저농도의 pLDH를 검출함으로써 검출 한계의 개선을 나타내기 위해, LFA-단독 대조군에 사용된 동일 수의 GNP를 저농도의 pLDH를 함유하는 용액의 총 용적을 증가시킴으로써 동일 수의 pLDH 분자에 노출시켰다. 용적 증가가 전형적으로 GNP를 희석시키고, 소정의 기간에 검출 영역으로 들어오는 GNP 양의 축소를 유도하기 때문에, ATPS 및 3-D 윅의 첨가는 GNP를 리딩 전면에서 작은 용적으로 농축시킬 것으로 기대된다. 효과적으로, GNP는 저농도에서 동일량의 pLDH에 노출되지만, 이어서 LFA-단독 대조군에 의해 처리된 것과 유사한 용적으로 농축된다. GNP를 10배로 농축시킬 것으로 기대된 1:9 ATPS를 사용할 경우, 총 샘플 용적은 LFA-단독 대조군과 비교할 경우, 검출 영역에 동일량의 GNP가 들어오는 것을 보장하기 위해 10배(200μL로) 증가시켰다.
도 54b는 용액에 pLDH를 함유하지 않는 음성 대조군 시험에서 변형된 LFA 장치의 사용을 입증한다. 변형된 LFA 스트립은 PBS 중의 항-pLDH GNP를 함유하는 ATPS 용액에 침지되는 경우, GNP는 60초 마크에서 암적색 색상에 의해 입증된 바와 같이 3-D 윅 세그먼트 중의 용액의 리등 전면에서 신속하게 농축된다. 용액은 추가의 작동 완충제를 사용하지 않고 니트로셀룰로즈 멤브레인을 교차하여 용이하게 유동했다. GNP는 신속하게 검출 영역에 도달한 반면, 용액의 대부분은 종이 윅에 잔류했다. 가시 밴드는 20분 이내에 대조군 및 시험 라인 영역 모두에서 나타나서 유효한 음성 시험을 나타낸다.
유효한 음성 시험이 확인되면, pLDH 농도를 1:9 용적비 용액에서 통합된 장치의 검출 한계를 결정하기 위해 변화시켰다. 이러한 실험 결과는, 통상적인 LFA가 (진정한 양성 결과를 생성하는) 10ng μL-1의 농도에서 pLDH를 검출하는 반면, 트리톤 X-114 ATPS와 LFA를 통합하는 진단 스트립은 1.0ng μL-1에서 pLDH를 검출할 수 있었고, 이는 검출 한계의 10배 개선이다(도 55).
FBS에서 pLDH의 LFA 기반 검출의 개선
이러한 실험은 9:1 용적비를 생성하기 위해 변형된 작동 조건을 사용하여 FBS 샘플에서 반복했다. 다시 한번, 3-D 종이 기반 진단 장치는 1.0ng/μL에서 FBS 중의 pLDH를 성공적으로 검출함으로써 10배 검출 한계 개선을 입증한 반면, LFA-단독 대조군은 1.0ng/μL가 아니라 10ng/μL에서 FBS 중의 pLDH를 성공적으로 검출했다(도 56). FBS 샘플에서 통합된 종이 기반 장치를 사용하는 실험은 니트로셀룰로즈 기반 검출 영역을 통해더 느린 유체 유동을 입증했다. 이는 트리톤 X-114의 큰 초기 농도 및 샘플의 전체 점도를 증가시킨 다른 혈청 성분의 존재에 기인할 가능성이 있었다. 대조군 및 시험 라인 신호가 20분 이내에 완전히 개발되었지만(도 56), 10여분의 분이 제공되는 경우에만 전체 미셀 결핍 상은 검출 영역을 지나 유동하여 배경 소음의 감소를 유도한다(도 81). PBS에서 상기 시험의 경우와 마찬가지로, FBS에서 모든 시험은 완충제에서 임의의 사전 희석, 추출 단계 또는 유동을 보조하기 위한 작동 완충제 첨가를 필요로 하지 않았다.
혈청에서 말라리아 pLDH이 LFA 검출의 개선을 입증함으로써, 장치는 잠재적으로 말라리아 신속 진단 시험 (RDT)의 현재 상태를 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 말라리아 RDT의 증가하는 생산 및 사용에도 불구하고, 그들은 대부분의 경우 결과를 확인하기 위해 혈액 필름 현미경과 같은 추가의 방법과 함께 사용될 필요가 있다. 제한된 감도 및 사용 용이성의 변동은 LFA가 원격 말라리아-영향 받는 설정에서 신뢰가능한 독립적인 분석으로서 사용되는 것을 방지하는 두 가지 인자이다. 통합된 종이 기반 장치는 이러한 두 문제를 처리할 가능성을 갖는다. 장치의 통합된 농도 성분은 상당한 감도 개선을 가능하게 한다. 또한, 이러한 RDT 중 다수가 샘플 완충제에서 희석 및 유체 유동을 보조하기 위한 작동 완충제의사용을 필요로 하기 때문에, 이 진단 장치는 이러한 단계를 제거함으로써 사용자 편의 개선을 입증한다.
실시예 7. LFA 종이 의 비교
점도는 상이 리딩 전면에서 나타나는 것을 결정하는데 역할을 할 수 있다.
ATPS 성분과 종이 재료 사이의 상호작용(소수성, 배제된-용적, 정전)은 상이 리딩 전면에서 나타나는 것을 결정하는데 역할을 할 수 있다(유리 섬유 상에서, PPG 풍부 상은 PPG/염 ATPS에서 주도하는 반면, PEG 풍부 상은 PEG/염 ATPS에서 지연되고; PPG는 PEG보다 더 소수성이다).
종이 상의 상이한 ATPS는 종이가 상 분리 공정을 향상시키는 방법을 처리하기 위해 조사했다. 먼저, 상 분리가 종이에서 관찰되었는지를 결정했다. 그렇다면, 리딩 전면에서 나타난 상이 주시되었다. 리딩 전면은 LFA 중의 시험 라인에 도달하는 상에 상응하기 때문에, 농축된 표적 분자 및 나노프로브를 함유하는 이 상을 갖는 것이 바람직하다.
표 6. ATPS 시스템과 LFA 종이 유형의 조합
종이에서 상 분리는 상이한 ATPS에 따라 달라졌다(예: PEG/염 vs. PPG/염).
상이한 종이 재료는 상 분리 거동을 변화시켰다(예: 유리 섬유 vs. 셀룰로즈 중의 PEG/염).
일부 경우에, 더 점성인 상은 뒤에 지연되었다(예를 들면, 유리 섬유 재료의 경우, 더점성인 PEG 풍부 상은 PEG/염 시스템을 위해 지연되는 반면, 더 점성인 덱스트란 풍부 상은 PEG/덱스트란 시스템을 위해 지연된다). 그러나, 이것은 항상 그렇지는 않았다.
이 실시예에서, ATPS 중의 중합체를 농도를 변경하면, 상이 주도하는 순서를 변경하는 것으로 보이지 않았다.
이 실시예에서, 중력은 종이 위에서 유동하는 상의 순서를 변경하는 것으로 보이지 않았다(예를 들면, 염 풍부 상은 그것이 튜브에서 상 분리할 때 PEG/염 ATPS 중의 하부 상이지만, 염 풍부 상은 종이가 수직으로 또는 수평으로 배향되는지와는 관계 없이 유리 섬유 상에서 리딩 전면일 것이다).
종이가 ATPS의 상 분리를 촉진시키고 향상시키는 방법을 조사하기 위해, 동일한 유형의 ATPS(PEG/염)를 상이한 유형의 종이에 적용했다. 상이한 결과가 관찰되었다.
관찰
충분히 혼합된 ATPS를 다양한 유형의 종이에 적용하면 유사한 결과가 수득되지 않았다는 것이 관찰되었다. 대신, 상 분리 속도는 상 분리 정도와 같이 크게 변했다. 더욱 놀랍게도, 특정 종이 유형은 상이 리딩 유체에 등장하는 순서를 전환할 수 있었다. 다음을 참조한다: 도. 58 및 결과를 위해 표 7.
표 7. ATPS & LFA의 조합
실시예 8. LFA 종이 제조를 위한 일부 방법
용매 중의 공지된 농도의 용질을 (대략 1-2mm의 높이를 갖는 유리 섬유 종이) 1cm2당 (용매) 40uL의 값으로 마이크로피펫에 의해 종이에 첨가했다. 액적은 종이에 대해 균일하게 분포된 지점에서 첨가했다. 첨가 후, 종이는 종이 내에 유체를 균일하게 분포시키는 것을 보조하기 위해 (피펫 팁을 사용하여) 원통형 물체에 부드럽게 롤링했다.
용액은, 액적을 형성하는 비-흡수성 표면(예: 폴리-프로필렌)에 피펫팅했다. 종이 세그먼트는 종이 세그먼트의 지점, 가장자리 또는 표면에서 액적과 접촉시켰다. 이 방법은 탈수의 독특한 특정 설계를 제조하는 데 유용하다. 이러한 설계의 예는 다음을 참조한다: 도 59a-d.
실시예 9.
PEG 풍부 상을 갖는 혈액 샘플을 LFA 종이에 적용
제1 실험은 ATPS의 두 상이 전방으로 유동하는 것을 가능하게 하도록 종이의 막힘 없이 혈액 샘플을 다시 유지할 수 있는 종이를 발견하기 위해 수행했다. 하기 실험이 성공적으로 수행되었고, 이는 적혈구 세포를 여과하는데 사용된 MF1 종이를 사용한ATPS 농축 시스템의 통합을 가능하게 했다.
1:1 PEG-염 용액을 제조했다. 상부 PEG 풍부 상을 제거했다. PEG 풍부 상은 전체 혈액 샘플과 함께 여과지 스트립 상에 적용했다.
PEG 풍부 상은 여전히 여과지를 통해 이동할 수 있었다. 혈액은 여과지를 응고시키지 않는다. MF1은 ATPS에 유일하게 적합했다. 다음을 참조한다: 도. 71.
적혈구 세포를 여과시킬 수 없거나 ATPS 상이 통과할 수 없는 다른 종이 유형을 조사했다. LF1 및 S17에서, 혈액은 여과되지 않았다. MF1에서, 혈액은 여과되었지만, 유동은 느렸다. 다음을 참조한다: 도. 72.
제2 실험은, 혈액 세포를 다시 유지하면서, 상 분리 및 종의 위의 혈장의 농축을 가능하게 하는 종이 구성 및 유형을 수득하기 위해 수행했다. 하기는, ATPS 상을 통과시키면서, 적혈구 세포를 여과하는 3D 종이 웰 설계의 능력에 대한 2가지 증명이다.
먼저, PEG-염 ATPS를 갖는 혈액 샘플을 3-D 종이 웰을 갖는 종이에 적용했다. 9:1 PEG-염 ATPS를 제조하고, 소용적의 전체 혈액 샘플을 PEG-염 용액에 도입했다. 유동 스트립은 개시 시점에서 상이한 양의 종이 성분을 갖는 3-D 종이 웰로 제조했다. 블루 염료를 PEG 풍부 상을 가시화하기 위해 사용하고, 액체가 스트립을 위킹했는지를 확인한다. 이제 전체 혈액 샘플을 함유하는 PEG-염 용액을 3-D 웰에 적용했다. 분리 및 농도를 관찰했다.
블루 액체 전면은 전방으로 유동하는 것으로 관찰되었다. 혈액은 3-D 웰에서 뒤에 잔류했다. 다음을 참조한다: 도. 73.
둘째, PEG-염 ATPS를 갖는 혈액 샘플은 3-D 종이 웰을 갖는 여과지에 적용했다. 9:1 PEG-염 ATPS을 제조하고, 소용적의 전체 혈액 샘플을 PEG-염 용액에 도입했다. 블루 염료는 PEG 풍부 상을 가시화하기 위해 사용했다. 금 나노입자는 염 풍부 상을 가시화하기 위해 사용했다. 이제 전체 혈액 샘플을 함유하는 PEG-염 용액을 3-D 웰에 적용하고, 분리 및 농도를 관찰했다.
PBS가 금 나노입자 대신에 첨가된 조건을 또한 수행했다.
블루 액체 전면은 웰을 통해 위킹하는 것으로 관찰되었다. 적혈구 세포 체류 이외에 상 분리를 시사하는 대조군 스트립과 비교하여 ATPS 스트립에서 보다뚜렷한 블루 상이 존재했다. 다음을 참조한다: 도. 74.
샘플을 ATPS 성분과 접촉시키고 표적을 리딩 유체에서 농축시키기 전에 혈액 세포가 여과되도록 하는 구성이 바람직했다. 이러한 대체 구성은 적혈구 세포가 상 분리 거동에 영향을 미치는 시나리오에 유용할 것이다. 이러한 목적으로 성공적인 한 가지 실험 설정은 3-D 종이 웰 내에서 여과 및 농축 종이 유형을 층상화하는 것이다. 혈액은 PEG 상을 먼저 전송하면서 다시 유지된다는 것이 관찰되었다. 다음을 참조한다: 도. 75.
실시예 10. 클라미디아 트라코마티스 의 ATPS-LFA 검출
ATPS 및 LFA는, 수득된 면봉 샘플의 저장에 사용되는 바이러스 수송 배지의 용액에서 클라미디아 트라코마티스를 검출하기 위해 사용된 단일 종이-기반 진단 장치에 도입했다.
항-씨. 트라코마티스 DGNP의 제조
1mL 덱스트란-코팅된 금 나노입자(DGNP) 용액의 pH는 먼저 1.5N NaOH를 사용하여 pH 9로 조정했다. 이어서, 16μg의 마우스 모노클로날 클라미디아 트라코마티스 항체를 콜로이드성 금 용액에 첨가하고, 진탕기 상에서 30분 동안 혼합했다. 콜로이드성 금 나노입자의 표면에 다른 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 200μL의 10% w/v 소 혈청 알부민 (BSA) 용액을 혼합물에 첨가하고, 진탕기 상에서 20분 동안 혼합했다. 유리 비결합된 항체를 제거하기 위해, 혼합물을 30분 동안 4°C 및 9,000 rpm에서 원심분리한 다음, DGNP의 펠렛을 200μL의 1% w/v BSA 용액에 재현탁시켰다. 원심분리 및 재현탁 단계는 2회 더 반복하고, 제3 원심분리 후, DGNP의 펠렛을 pH 9.0에서 100μL의 0.1M 붕산나트륨 완충제에 재현탁시켰다.
LFA를 사용한 검출
샌드위치 검정 포맷을 사용한 LFA 시험 스트립은 본 발명자들의 이전 연구와 유사한 방식으로 조립했다. 이러한 포맷에서, 고정된 클라미디아 트라코마티스 항체는 시험 라인을 구성했고, 제1 클라미디아 트라코마티스 항체에 특이적인 고정된 제2 항체는 대조군 라인을 구성했다.
LFA를 사용한 씨. 트라코마티스의 검출 한계를 확인하기 위해, DGNP를 샘플 용액에 첨가하고, 샘플에 존재하는 씨. 트라코마티스를 결합하게 했다. 샘플 용액은 DGNP로 이루어져 있고, 바이러스 수송 배지(BD, Franklin Lakes, NJ) 중의 공지된 농도의 씨. 트라코마티스를 시험관에서 혼합했다. LFA 시험 스트립을 샘플 용액에 수직으로 삽입하였고, 이는 흡수 패드를 향해 상향으로 모세관 작용에 의해 스트립을 통해 위킹했다. PBS 및 FBS 샘플 둘 다로부터 시험 스트립의 이미지는 조절된 조명 환경에서 10분 후에 촬영했다.
씨. 트라코마티스 항원은 바이러스 수송 배지의 용액에서 검출되었다. 다음을 참조한다: 도. 76. 사용된 접합체는 씨. 트라코마티스 항원 상의 지다당류(LPS)에 대해 특이적 항체와 함께 덱스트란-코팅된 금 나노프로브(DGNP)였다. 통상의 LFA 샌드위치 포맷을 사용하여, 설정의 검출 한계는 대략 10 μg/mL인 것으로 결정되었다. 후속 단계는 적합한 ATPS를 사용하여 바이오마커를 농축시키고, 농축된 샘플을 LFA에 적용하고, 통합된 시스템의 검출 한계를 확립하는 것일 수 있다.
PBS에서 씨. 트라코마티스 항원의 검출 한계는 또한 동일한 LFA 설정을 사용하여 10 μg/mL인 것으로 결정되었다.
Abcam의 항-MOMP 항체와 복합체화된 DGNP를 사용한 항원의 검출이 또한 시험되었다. 이들은 PBS 또는 VTM 용액에서 항체를 성공적으로 검출하는 것으로 나타나지 않았고, 따라서 무시되었다.
실시예 11.
스트렙토코쿠스 뮤탄스의 ATPS-LFA 검출
ATPS 및 LFA는, 충치(구멍)를 유도할 수 있는 우성 세균인 스트렙토코쿠스 뮤탄스를 검출하기 위해 사용된 단일 종이-기반 진단 장치에 도입했다.
항-에스. 뮤탄스 DGNP의 제조
1mL 덱스트란-코팅된 금 나노입자(DGNP) 용액의 pH는 먼저 1.5N NaOH를 사용하여 pH 9로 조정했다. 이어서, 16μg의 마우스 모노클로날 에스. 뮤탄스 항체를 금 용액에 첨가하고, 진탕기 상에서 30분 동안 혼합했다. 콜로이드성 금 나노입자의 표면에 다른 단백질의 비특이적 결합을 방지하기 위해, 200μL의 10% w/v 소 혈청 알부민 (BSA) 용액을 혼합물에 첨가하고, 진탕기 상에서 20분 동안 혼합했다. 유리 비결합된 항체를 제거하기 위해, 혼합물을 30분 동안 4°C 및 9,000 rpm에서 원심분리한 다음, DGNP의 펠렛을 200μL의 1% w/v BSA 용액에 재현탁시켰다. 원심분리 및 재현탁 단계는 2회 더 반복하고, 제3 원심분리 후, DGNP의 펠렛을 pH 9.0에서 100μL의 0.1M 붕산나트륨 완충제에 재현탁시켰다.
LFA를 사용한 검출
샌드위치 검정 포맷을 사용한 LFA 시험 스트립은 본 발명자들의 이전 연구와 유사한 방식으로 조립했다. 이 포맷에서, 고정된 에스. 뮤탄스 항체는 시험 라인을 구성했고, 1차 항체에 특이적인 고정된 2차 항체는 대조군 라인을 구성했다.
LFA를 사용한 에스. 뮤탄스의 검출 한계를 확인하기 위해, DGNP를 샘플 용액에 첨가하고, 샘플에 존재하는 에스. 뮤탄스에 결합하게 했다. 샘플 용액은 DGNP로 구성되고, 공지된 농도의 에스. 뮤탄스를 시험관에서 혼합했다. LFA 시험 스트립을 샘플 용액에 수직으로 삽입하였고, 이는 흡수 패드를 향해 상향으로 모세관 작용에 의해 스트립을 통해 위킹했다. 시험 스트립의 이미지는 조절된 조명 환경에서 10분 후에 촬영했다.
ATPS와 함께 LFA를 사용한 검출
1:9 트리톤 X-114 미셀 ATPS 샘플 용액을 제조하였고, 이는 공지된 농도의 에스. 뮤탄스로 구성되어 있다. ATPS 샘플 용액을 8시간 동안 25 ℃에서 배양하여 상 분리가 발생하도록 하였다. 농축된 에스. 뮤탄스를 함유하는 상부 미셀 결핍 상을 추출하고, 항-에스. 뮤탄스 DGNP와 함께 배양했다. LFA 시험 스트립을 생성되는 혼합물에 수직으로 삽입하고, 시험 스트립의 이미지는 조절된 조명 환경에서 10분 후에 촬영했다.
9:1 PEG/인산칼륨 ATPS 샘플 용액을 제조하였고, 이는 공지된 농도의 에스. 뮤탄스로 구성되었다. ATPS 샘플 용액을 25 ℃에서 30분 동안 배양하여 상 분리가 발생하도록 했다. 농축된 에스. 뮤탄스를 함유하는 하부 PEG 결핍 상을 추출하고, 항-에스. 뮤탄스 DGNP와 함께 배양했다. LFA 시험 스트립을 생성되는 혼합물에 수직으로 삽입하고, 시험 스트립의 이미지는 조절된 조명 환경에서 10분 후에 촬영했다.
에스. 뮤탄스는 LFA를 사용하여 성공적으로 검출되었다(참조: 도 77 & 78). 통상의 LFA 샌드위치 포맷을 사용하여, 설정의 검출 한계는 대략 1x107 세포/mL인 것으로 결정되었다. 1x107 내지 1x106 세포/mL의 검출 한계의 10배 개선이 또한 입증되었다.
후속 단계는 3D 웰 또는 3D 윅 포맷으로 종이에 ATPS 및 LFA를 도입하고, 동시적인 원활한 농도 및 검출을 달성하는 것이다.
실시예 12.
트로포닌의 ATPS-LFA 검출
ATPS 및 LFA는 심근 경색에 대한 바이오마커 트로포닌을 검출하기 위해 사용되는 단일 종이-기반 진단 장치에 도입했다.
항-트로포닌 DGNP의 제조
항-트로포닌 항체를 제외하고는 실시예 11과 동일한 절차가 사용된다.
LFA를 사용한 검출
경쟁 검정 포맷을 사용한 LFA 시험 스트립은 본 발명자들의 이전 연구와 동일한 방식으로 조립했다. 이 포맷에서, 고정된 트로포닌은 시험 라인을 구성했고, DGNP 상의 1차 항체에 특이적인 고정된 2차 항체는 대조군 라인을 구성했다.
LFA를 사용한 트로포닌의 검출 한계를 확인하기 위해, DGNP를 샘플 용액에 첨가하고, 샘플에 존재하는 트로포닌에 결합하도록 했다. DGNP 및 공지된 농도의 트로포닌을 함유하는 샘플 용액을 시험관에서 혼합했다. LFA 시험 스트립을 샘플 용액에 수직으로 삽입하였고, 이는 흡수 패드를 향해 상향으로 모세관 작용에 의해 스트립을 통해 위킹했다. PBS 샘플로부터 시험 스트립의 이미지는 조절된 조명 환경에서 10분 후에 촬영했다.
ATPS와 함께 LFA를 사용한 검출
9:1 PEG/인산칼륨 ATPS 샘플 용액을 제조하였고, 이는 공지된 농도의 트로포닌으로 구성되었다. ATPS 샘플 용액을 25 ℃에서 30분 동안 배양하여 상 분리가 발생하도록 했다. 농축된 트로포닌을 함유하는 하부 PEG 결핍 상을 추출하고, 항-트로포닌 DGNP와 함께 배양했다. LFA 시험 스트립을 생성되는 혼합물에 수직으로 삽입하고, 시험 스트립의 이미지는 조절된 조명 환경에서 10분 후에 촬영했다.
트로포닌 은 LFA를 사용하여 성공적으로 검출되었다(참조: 도 79). 통상의 LFA 경쟁 포맷을 사용하여, 설정의 검출 한계는 대략 1ng/μL인 것으로 결정되었다. 1 내지 0.1ng/μL의 검출 한계에 대한 10배 개선이 성공적으로 입증되었다.
실시예 13.
탈수 방법
액체 적용
이 방법은 액체 용액을 적용하는 것을 포함했고, 이는 탈수 전에 종이에 용질로서 탈수되는 목적하는 성분을 함유한다.
용매 중의 공지된 농도의 용질을 (대략 1-2mm의 높이를 갖는 유리 섬유 종이) 1cm2당 (용매) 40uL의 값으로 마이크로피펫에 의해 종이에 첨가했다. 액적은 종이에 대해 균일하게 분포된 지점에서 첨가했다. 첨가 후, 종이를 원통형 물체(본 발명자들은 피펫 팁을 사용함)로 온화하게 롤링하여 종이 내에 액체를 균일하게 분포시키는 것을 보조한다. 용액은, 액적을 형성하는 비-흡수성 표면(예: 폴리-프로필렌)에 피펫팅했다. 종이 세그먼트는 종이 세그먼트의 지점, 가장자리 또는 표면에서 액적과 접촉시켰다. 이 방법은 탈수의 독특한 특정 설계를 작성할 때에 바람직했다. 이러한 설계의 예는 다음에서 제시된다: 도 59a-d.
실패한 방법: 전체 종이 세그먼트를 용매에 침지시키는 것은 종이를 과포화시켜 실험의 감소된 견뢰도를 제공하고, 이는 불균일한 탈수에 기인하는 것 같다. 추가로, (대략 1-2 mm의 높이를 갖는 유리 섬유 종이) 1cm2당 (용매) 60μL 초과를 첨가하면, 이는 또한 종이 세그먼트를 과포화시켰다.
동결건조
이 방법은 목적하는 결과가 성분들을 재용해시키는 것인 경우에 바람직했다. 동결건조기는 최근 탈수 전에 해동되는 것이 중요한 것으로 밝혀졌다. 이렇게 하지 못하는 것은 종이 내의 성분의 불균일한 탈수 위험을 증가시켰다(예를 들면, 덱스트란-코팅된 금 나노프로브(DGNP)는 종이의 가장자리 근처에 보다 큰 분포를 가질 것이다).
플래쉬 동결 및 동결건조
종이 세그먼트는, 종이를 액체 질소에 침지시키거나 액체 질소를 종이에 부어 넣음으로써 액체 질소를 사용하여 플래쉬 동결시켰다. 이어서, 동결된 종이 세그먼트는 동결된 액체가 승화되는 동결건조기에 신속하게 넣었다. 이 방법을 시도하는 이유는 (액체 상태 용액의 증발 동안 이동하는 용질과 대조적으로) 탈수 공정에 걸쳐 보다 많은 조절을 보장하기 위해 탈수 공정 동안 용질의 이동을 감소시키기 위해 시도했다. 그러나, 이 공정은 예상치 않은 유동 패턴 및 상 분리 거동을 초래했다. 하기는 예상치 않은 데이터의 시간 경과 이미지 데이터이다(참조: 도 60).
진공 챔버
종이 세그먼트를 동결건조기 대신에 진공 챔버에 위치시키는 것을 제외하고는 상기 기재된 ‘동결건조’와 유사하다. 진공 챔버의 보다 낮은 압력은 보다 덜 일정한 실험 결과를 입증했고, 이는 탈수 동안 불균질한 용질 분포에 기인하는 것 같다.
베이킹
종이 세그먼트는 25℃ 이상의 온도(전형적으로 60℃)에서 오븐 챔버에 위치시켰다. 이 방법은 목적하는 목표가 이의 이동성을 방지하면서 용질을 재탈수시키는 것인 경우에 바람직할 수 있다. 이렇게 관찰된 효과에 대한 한 가지 가능한 설명은 베이킹 방법 동안의 보다 높은 온도가 용질과 종이 사이의 공유 결합 또는 강력한 상호작용을 유도할 수 있다는 것이다.
불균일한 탈수의 결과로서 불균일한 상 분리를 초래하는 탈수 방법에서 실패한 시도는 다음을 참조한다: 도 61.
Claims (28)
- 하기를 포함하는, 샘플에서 표적 분석물을 검출 및/또는 정량화하기 위한 장치:
a. 다공성 매트릭스를 포함하는 측방 유동 검정 (LFA); 및
b. 수성 2-상 시스템 (ATPS), 여기서, ATPS 는 제 1 상 용액 및 제 2 상 용액으로 분리되는 혼합 상 용액을 포함하고, 상기 제 1 상 용액의 성분 및 제 2 상 용액의 성분은 모두 상기 다공성 매트릭스에 배치되어 상기 다공성 매트릭스 내에서 상기 ATPS 를 형성하고, 제 1 상 용액은 미셀 용액을 포함함. - 제 1 항에 있어서, 상기 장치는 상기 다공성 매트릭스 내에서 발생하는 혼합 상의 제 1 상 용액 및 제 2 상 용액으로의 분리를 제공하도록 구성된, 장치.
- 제 1 항 및 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분석물은 혼합 상 용액과 접촉되고, 표적 분석물은 제 1 상 용액 또는 제 2 상 용액으로 분할되는, 장치.
- 제 1 항 및 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 분석물은 혼합 상 용액과 접촉되고, 표적 분석물은 제 1 상 용액과 제 2 상 용액의 계면에서 분할되는, 장치.
- 제 1 항 및 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 상 용액은 하나 이상의 계면활성제를 포함하고, 제 2 상 용액은 중합체를 포함하는, 장치.
- 제 1 항 및 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 상 용액은 하나 이상의 계면활성제를 포함하고, 제 2 상 용액은 염을 포함하는, 장치.
- 제 1 항 및 제 2 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 상 용액의 성분 및/또는 제 2 상 용액의 성분은 상기 다공성 매트릭스 위 및/또는 내에서 탈수되고, 샘플의 첨가시 혼합 상 용액은 제 1 상 용액 및 제 2 상 용액으로 분할되는, 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 측방 유동 검정은 세균인 표적 분석물을 검출 및/또는 정량하도록 구성된, 장치.
- 제 8 항에 있어서, 상기 표적 분석물은 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 클라미디아(Chlamydia), 마이코박테리움(Mycobacterium) 및 나이세리아(Neisseria) 로부터 선택된 속의 세균을 포함하는, 장치.
- 제 9 항에 있어서, 상기 표적 분석물은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 를 포함하는, 장치.
- 제 1 항에 있어서, 상기 제 1 상 용액은 비이온성 계면활성제를 포함하는, 장치.
- 제 11 항에 있어서, 상기 제 1 상 용액은 세토마크로골, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 코크아미드, 데실 글루코사이드, IGEPAL, 이소세테쓰, 라우릴 글루코사이드, 모노라우린, 노니데트, 노녹시놀, NP-40, 옥틸 글루코사이드, 올레일 알콜, 폴록사머, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 폴리소르베이트, 폴리글리세롤, 소르비탄, 스테아릴 알코올, 트리톤-X 및 트윈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 계면활성제를 포함하는, 장치.
- 제 12 항에 있어서, 상기 계면활성제는 트리톤 X-114 용액을 포함하는, 장치.
- 제 1 항에 있어서, 제 2 상 용액은 염을 포함하는, 장치.
- 제 14 항에 있어서, 제 2 상 용액은 인산칼륨을 포함하는, 장치.
- 제 1 항에 있어서, 제 1 상 용액은 트리톤 X-114 용액을 포함하고, 제 2 상 용액은 인산칼륨을 포함하는, 장치.
- 하기 단계를 포함하는, 샘플에서 표적 분석물을 검출하고/하거나 정량화하는 방법:
i) 샘플을 하기를 포함하는 장치에 적용하는 단계:
a. 다공성 매트릭스를 포함하는 측방 유동 검정 (LFA); 및
b. 수성 2-상 시스템 (ATPS), 여기서, ATPS 는 제 1 상 용액 및 제 2 상 용액으로 분리되는 혼합 상 용액을 포함하고, 상기 제 1 상 용액의 성분 및 제 2 상 용액의 성분은 모두 상기 다공성 매트릭스에 배치되어 상기 다공성 매트릭스 내에서 상기 ATPS 를 형성하고, 제 1 상 용액은 미셀 용액을 포함함; 및
ii) 표적 분석물의 존재 또는 부재를 검출하고/하거나 표적 분석물을 정량화하는 단계. - 제 17 항에 있어서, 혼합 상의 제 1 상 용액 및 제 2 상 용액으로의 분리는 상기 다공성 매트릭스 내에서 발생하는, 방법.
- 제 17 항에 있어서, 표적 분석물은 혼합 상 용액과 접촉되고, 표적 분석물은 상기 다공성 매트릭스에서 제 1 상 용액 또는 제 2 상 용액으로 분할되는, 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 표적 분석물은 세균을 포함하는, 방법.
- 제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 분석물은 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 클라미디아(Chlamydia), 마이코박테리움(Mycobacterium) 및 나이세리아(Neisseria) 로 이루어진 군으로부터 선택된 속의 세균을 포함하는, 방법.
- 제 21 항에 있어서, 상기 표적 분석물은 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 를 포함하는, 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 제 1 상 용액은 비이온성 계면활성제를 포함하는, 방법.
- 제 23 항에 있어서, 상기 제 1 상 용액은 세토마크로골, 세토스테아릴 알코올, 세틸 알코올, 코크아미드, 데실 글루코사이드, IGEPAL, 이소세테쓰, 라우릴 글루코사이드, 모노라우린, 노니데트, 노녹시놀, NP-40, 옥틸 글루코사이드, 올레일 알콜, 폴록사머, 펜타에틸렌 글리콜 모노도데실 에테르, 폴리소르베이트, 폴리글리세롤, 소르비탄, 스테아릴 알코올, 트리톤-X 및 트윈으로 이루어진 군으로부터 선택되는 계면활성제를 포함하는, 방법.
- 제 24 항에 있어서, 상기 계면활성제는 트리톤 X-114 용액을 포함하는, 방법.
- 제 23 항에 있어서, 제 2 상 용액은 염을 포함하는, 방법.
- 제 26 항에 있어서, 제 2 상 용액은 인산칼륨을 포함하는, 방법.
- 제 23 항에 있어서, 제 1 상 용액은 트리톤 X-114 용액을 포함하고, 제 2 상 용액은 인산칼륨을 포함하는, 방법.
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