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KR102802134B1 - 신규한 omni-50 crispr 뉴클레아제 - Google Patents

신규한 omni-50 crispr 뉴클레아제 Download PDF

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KR102802134B1
KR102802134B1 KR1020217037743A KR20217037743A KR102802134B1 KR 102802134 B1 KR102802134 B1 KR 102802134B1 KR 1020217037743 A KR1020217037743 A KR 1020217037743A KR 20217037743 A KR20217037743 A KR 20217037743A KR 102802134 B1 KR102802134 B1 KR 102802134B1
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데이비드 바람
리오 이즈하
아사엘 헤르만
리앗 록카
나다브 마르바크-바
누릿 메론
조셉 조지슨
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에멘도바이오 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 서열번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 비-자연 발생 조성물을 제공한다.

Description

신규한 OMNI-50 CRISPR 뉴클레아제
본 출원은 2020년 3월 18일에 출원된 U.S. 가출원 번호 62/991,285, 2020년 1월 10일에 출원된 62/959,672, 2019년 11월 6일에 출원된 62/931,630, 2019년 9월 9일에 출원된 62/897,806, 및 2019년 4월 30일에 출원된 62/841,046의 이익을 청구하며, 그 내용이 본원에 참조로 포함된다.
본 출원을 통해, 괄호에 나타내는 것을 포함하여, 다양한 공보가 참조된다. 이의 전문이 본 출원에서 언급되는 모든 공보의 개시는 본 발명에 관련된 분야 및 본 발명에서 채택될 수 있는 당분야에서의 특성의 추가적인 설명을 제공하기 위해 본 출원 내에 참조로 본원에 포함된다.
서열 목록에 대한 참조
본 출원은 "200430_91116-A-PCT_SequenceListing_AWG.txt"로 명명된 파일로 제시되는 뉴클레오티드 서열을 참조로 포함하며, 이는 186킬로바이트 크기이고, MS-Windows와 호환성 운영 시스템을 갖는, IBM-PC 머신 포맷으로 2020년 4월 29일에 생성되었고, 본 출원의 일환으로 2020년 4월 30일에 출원된 텍스트 파일에 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 특히, 게놈 편집을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
박테리아 및 고세균 적응 면역성의 CRISPR(클러스터링된 정규 배치 단편 회문나선 반복체, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) 시스템은 단백질 조성 및 게놈 유전자위 구조의 커다란 다양성을 나타낸다. CRISPR 시스템은 연구 및 게놈 조작을 위해 중요한 도구가 되었다. 그럼에도 불구하고, CRISPR 시스템의 여러 상세사항은 결정되지 않았고 CRISPR 뉴클레아제의 적용 가능성은 서열 특이성 요건, 발현, 또는 전달 난제에 의해 제한될 수 있다. 상이한 CRISPR 뉴클레아제는 크기, PAM 부위, 온-표적 활성, 특이성, 절단 패턴(예로 무딘(blunt), 엇갈린 말단), 및 절단 후 인델(indel) 형성의 돌출 패턴과 같은 다양한 특징을 갖는다. 상이한 특징 세트가 상이한 적용에 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 CRISPR 뉴클레아제는 다른 CRISPR 뉴클레아제가 PAM 부위의 제한으로 인해 표적화할 수 없는 특정 게놈 유전자위를 표적화할 수 있다. 또한, 현재 사용 중인 일부 CRISPR 뉴클레아제는 사전-면역성을 나타내며, 이는 생체내 적용 가능성을 제한할 수 있다. 문헌(Charlesworth 등, Nature Medicine (2019) 및 Wagner 등, Nature Medicine (2019))을 참고한다. 따라서, 신규한 CRISPR 뉴클레아제의 발견, 조작, 및 개선이 중요하다.
발명의 요약
게놈 조작, 후성적 조작, 게놈 표적화, 세포의 게놈 편집, 및/또는 시험관내 진단을 위해 이용될 수 있는 조성물 및 방법이 본원에서 개시된다.
개시된 조성물은 게놈 DNA 서열을 변형하기 위해 이용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 게놈 DNA는 관심 세포 또는 세포들에 존재하는 선형 및/또는 염색체 DNA 및/또는 플라스미드 또는 다른 염색체외 DNA 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 관심 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 관심 세포는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 방법은 게놈 DNA 서열 내 사전-결정된 표적 부위에서 이중-가닥 절단(DSB)을 생성하여, 게놈 내 표적 부위(들)에서 DNA 서열의 돌연변이, 삽입, 및/또는 결실을 초래한다.
따라서, 일부 구현예에서, 조성물은 클러스터링된 정규 배치 단편 회문나선 반복체(CRISPR) 뉴클레아제를 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 CRISPR-연관 단백질이다.
일부 구현예에서, 조성물은 에자키엘라 페루엔시스(Ezakiella peruensis) 균주 M6.X2로부터 유래되는 CRISPR 뉴클레아제와 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85% 동일성을 갖는 클러스터링된 정규 배치 단편 회문나선 반복체(CRISPR) 뉴클레아제를 포함한다. 각각의 가능성은 별도 구현예를 나타낸다.
OMNI-50 뉴클레아제
본 발명의 구현예는, 표 1에 제공된 바와 같이, "OMNI-50" 뉴클레아제로 명명되는 CRISPR 뉴클레아제를 제공한다.
본 발명은 세포 내로 (i) 서열번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열로서, 서열번호: 12 또는 13의 핵산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는, 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물 및 (ii) DNA-표적화 RNA 분자, 또는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA-표적화 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는, 포유류 세포의 게놈 내 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 하기:
a) 직접 반복 서열에 연결된 가이드 서열 부분을 포함하는 하나 이상의 RNA 분자로서, 가이드 서열이 표적 서열과 혼성화할 수 있는, 분자, 또는 하나 이상의 RNA 분자를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
b) 서열번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자
를 포함하는 CRISPR 연관 시스템을 포함하는 비-자연 발생 조성물을 제공하며, 하나 이상의 RNA 분자는 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 3'이고, 하나 이상의 RNA 분자는 RNA-가이드 뉴클레아제와 복합체를 형성한다.
본 발명은 또한 하기:
a) 서열번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자; 및
b) 하기 중 적어도 하나를 포함하는, 하나 이상의 RNA 분자, 또는 하나 이상의 RNA 분자를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 폴리뉴클레오티드:
i) CRISPR 뉴클레아제와 상호작용할 수 있는/이에 결합할 수 있는 뉴클레아제-결합 RNA 뉴클레오티드 서열; 및
ii) 표적 DNA 서열 내 서열과 상보적인 서열을 포함하는 DNA-표적화 RNA 뉴클레오티드 서열
을 포함하는 비-자연 발생 조성물을 제공하며, CRISPR 뉴클레아제는 하나 이상의 RNA 분자와 복합체화하여 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 복합체를 형성할 수 있다.
도 1a: 각각의 뉴클레아제에 대한 sgRNA의 설계에서 가능한 요소의 확인을 위해 사용되는 전체 듀플렉스 RNA 요소(crRNA:tracrRNA 키메라)의 예측된 이차 구조의 일례. 도 1b~1c: 단일 뉴클레아제와 함께 사용하기 위해 설계된, 2개의 상이한 sgRNA, V1(도 1b) 및 V2(도 1c)의 영역 간 구조에서의 변화 일례. 상이한 위치에서의 상부 줄기부에서 듀플렉스를 단축함으로써, crRNA 및 tracrRNA가 테트라-루프 'gaaa'와 연결되어, sgRNA 스캐폴드를 생성하였다.
도 2a: 무세포 시험관내 TXTL 시스템에서 OMNI-50 sgRNA V1에 대한 8 bp 서열을 따라 모든 가능한 PAM 위치의 축합된 4N 윈도우 라이브러리. 결실 검정 결과에 기반하여 PAM 부위에 대해 생성된 서열 모티프. 활성은 2개의 가장 크게 결실된 서열의 평균에 기반하여 추정하였고 1 - 결실 스코어로 계산되었다. 도 2b: OMNI-50 sgRNA V2에 대한 8 bp 서열을 따라 모든 가능한 PAM 위치에 대해 생성된 서열 모티프.
도 3: 포유류 세포에서 OMNI-50의 발현. OMNI-50 또는 SpCas9 뉴클레아제를 Hek293T 세포에서 일시적으로 전달감염시켰다. 세포를 수확하고 72 h째에 용해시키고, 용해액을 사용하여 HA-태그에 대한 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 포유류 세포에서 OMNI-50 발현을 시험하였다. SpCas9-HA를 동일한 방식으로 전달감염시키고 양성 대조군으로 작용하였다. GAPDH를 사용하여 로딩량을 표준화하였다.
도 4a: 인간 세포에서의 내인성 정확도. OMNI-50 또는 SpCas9 뉴클레아제를 sgRNA 발현 플라스미드와 함께 DNA 전달감염에 의해 포유류 세포 시스템에서 발현시켰다. 세포 용해액을 부위 특이적 게놈 DNA 증폭 및 NGS를 위해 사용하였다. 인델의 백분율을 섹션 vii, ELANEg35_OMNI-50 또는 ELANEg62_OMNI-50을 사용하는 HeLa 세포주에서의 표적 대 오프-표적 편집에 기재된 바와 같이 측정하고 분석하였다. 두 경우 모두에서 게놈 온 및 오프 표적 서열이 아래 차트에 주지되며, PAM 서열은 밑줄쳐 표시한다. 각각의 실험은 3회의 독립적 반복을 나타낸다. 도 4b: OMNI-50 또는 SpCas9 표적화 ELANEg35의 RNP 도입에 용해, 부위 특이적 DNA 증폭 및 NGS가 뒤따랐다. 온 및 오프 표적 서열 둘 다의 편집 수준을 두 번째 시스템에 나타낸다.
도 5a ~ 도 5d: RNP로서의 OMNI-50 활성 검정. OMNI-50 뉴클레아제를 과발현시키고 정제하였다. 정제된 단백질을 합성 sgRNA와 복합체화하여 RNP를 형성하였다. 시험관내 검정을 위해(도 5a 및 도 5b) RNP를 대응하는 표적 및 PAM 서열(표 5에 기재됨)을 함유하는 선형 DNA 주형과 인큐베이션하였다. 선형 주형의 절단에 의해 활성을 확인하였다. 생체내 검정을 위해(도 5c 및 도 5d), U2OS 세포를 RNP로 전기천공하고 활성을 NGS에 의한 인델 빈도의 측정에 의해 결정하였다. 도 5a: 상이한 스페이서 길이(17~23 bp)의 가이드 35(표 10)를 이용한 OMNI-50 RNP의 활성 검정. 도 5b: 스페이서 길이 20 ~ 23 nt를 갖는 감소하는 양의 RNP(4 pmol, 2 pmol, 1.2 pmol, 0.6 pmol 및 0.2 pmol)를 100 ng DNA 표적 주형과 인큐베이션하였다. 도 5c: U2OS 세포에서 RNP로서의 OMNI-50에 대한 활성 검정: 스페이서 길이 17 ~ 23 bp를 갖는 RNP를 U2OS 세포주 내로 전기천공하고 편집 수준(인델)을 NGS에 의해 측정하였다. 도 5d: U2OS 세포에서 RNP로서의 OMNI-50에 대한 활성 검정: ELANE g35 sgRNA V1~V4를 이용한 RNP를 U2OS 세포주 내로 전기천공하고 편집 수준(인델)을 NGS에 의해 측정하였다.
도 6: iPSC에서 RNP로서의 OMNI-50에 대한 활성 검정. 스페이서 길이 17 ~ 23 nt를 갖는 RNP(표 10)를 iPSC 세포주 내로 전기천공하고 편집 수준(인델)을 NGS에 의해 측정하였다.
도 7. 내인성 포유류 세포 맥락에서의 OMNI-50 뉴클레아제 활성. OMNI-50 뉴클레아제를 sgRNA 발현 플라스미드와 함께 DNA 전달감염에 의해 포유류 세포 시스템에서 발현시켰다. 세포 용해액을 부위 특이적 게놈 DNA 증폭 및 NGS를 위해 사용하였다. 인델의 백분율을 측정하고 분석하여 편집 수준을 결정하였다. 가이드 RNA 없이 OMNI-50 뉴클레아제로 전달감염된 세포는 비교 및 배경 결정을 위한 음성 대조군으로 작용하였다. 상이한 게놈 위치에서의 편집 수준을 나타낸다.
도 8: OMNI-50 뉴클레아제의 도식적 표시. OMNI-50 뉴클레아제는 도메인 A~F로 도식에 나타낸, 몇몇 기능적 도메인을 포함한다. 도메인 A는 3개의 하위도메인, A1, A2, 및 A3을 포함하며, 흰색 상자로 도식에 나타낸다. 도메인 B는 가로선으로 도식에 나타낸다. 도메인 C는 3개의 하위도메인, C1, C2, 및 C3을 포함하며, 연한색 상자로 도식에 나타낸다. 도메인 B는 사선으로 도식에 나타낸다. 도메인 E는 진한색 상자로 도식에 나타낸다. 도메인 F는 점으로 표시한 상자로 도식에 나타낸다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시되는 조성물은 클러스터링된 정규 배치 단편 회문나선 반복체(CRISPR) 뉴클레아제 및/또는 이를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3에 나타낸 바와 같은 CRISPR 뉴클레아제와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 또는 82% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열은 서열번호: 11~13으로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 에자키엘라 페루엔시스 균주 M6.X2로부터 유래되는 CRISPR 뉴클레아제와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 75% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 각각의 가능성은 별도 구현예를 나타낸다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시되는 조성물은 CRISPR 뉴클레아제 또는 변이체 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 작제물 또는 벡터 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제 또는 변이체 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 관심 세포에서 작동 가능한 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 일부 구현예에서, 관심 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서 관심 세포는 포유류 세포이다. 일부 구현예에서, 조작된 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열은 특정 유기체로부터의 세포에서 사용하기 위해 최적화된 코돈이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열은 대장균을 위해 최적화된 코돈이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열은 진핵 세포를 위해 최적화된 코돈이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 서열은 포유류 세포를 위해 최적화된 코돈이다.
일부 구현예에서, 조성물은 서열번호: 3과 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90% 동일성을 갖는 CRISPR 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 재조합 핵산을 포함한다. 각각의 가능성은 별도 구현예를 나타낸다.
조성물의 하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 75%, 80%, 85, 90%, 95%, 또는 97% 동일성을 갖거나 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열은 서열번호: 11, 12, 및 13으로 구성되는 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열과 적어도 75%, 80%, 85, 90%, 95%, 또는 97% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에 따르면, 서열번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조작된 또는 비-자연 발생 조성물이 제공된다. 각각의 가능성은 별도 구현예를 나타낸다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 조작되거나 비-자연 발생이다. CRISPR 뉴클레아제는 또한 재조합일 수 있다. 이러한 CRISPR 뉴클레아제는 여러 원천으로부터의 유전 물질을 함께 가져오기 위해 실험실 방법(분자 클로닝)을 사용하여 생산되어, 다른 경우 생물학적 유기체에서 확인되지 않았을 서열을 생성한다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 CRISPR 뉴클레아제는 하나 이상의 RNA 분자와 복합체화되는 경우 SpCas9 뉴클레아제에 비해 표적 부위에 대해 증가된 특이성을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 CRISPR 뉴클레아제 및 하나 이상의 RNA 분자의 복합체는 SpCas9 뉴클레아제에 비해 적어도 유지되는 표적 부위의 온-표적 편집 활성 및 감소된 오프-표적 활성을 나타낸다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 DNA-표적화 RNA 분자(gRNA)와 상호작용할 수 있는 RNA-결합 부분 및 부위-유도 효소 활성을 나타내는 활성 부분을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 조성물은 DNA-표적화 RNA 분자 또는 DNA-표적화 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하며, 여기서 DNA-표적화 RNA 분자는 표적 영역 내 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, DNA-표적화 RNA 분자 및 CRISPR 뉴클레아제는 함께 자연 발생하지 않는다.
하나의 구현예에서, DNA-표적화 RNA 분자는 서열 GUUUGAGAG를 포함하는 crRNA 반복 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, DNA-표적화 RNA 분자는 서열번호: 41~43 및 서열번호: 149~154로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 포함하는 tracrRNA 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, DNA-표적화 RNA 분자는 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 하기:
a) 직접 반복 서열에 연결된 가이드 서열 부분을 포함하는 하나 이상의 RNA 분자로서, 가이드 서열이 표적 서열과 혼성화할 수 있는, 분자, 또는 하나 이상의 RNA 분자를 인코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
b) 서열번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자;
를 포함하는 CRISPR 연관 시스템을 포함하는 비-자연 발생 조성물을 제공하며, 하나 이상의 RNA 분자는 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 3'이고, 하나 이상의 RNA 분자는 RNA-가이드 뉴클레아제와 복합체를 형성한다.
하나의 구현예에서, 조성물은 CRISPR 뉴클레아제(tracrRNA)와 복합체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자 또는 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 RNA 분자를 인코딩하는 서열을 포함하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 조성물은 상동성 유도 복구(HDR)를 위한 공여체 주형을 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, 조성물은 세포의 게놈 내 표적 영역을 편집할 수 있다.
조성물의 하나의 구현예에서 CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3과 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80% 동일성을 가지며, DNA-표적화 RNA 분자 내 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 37~45, 87~88, 149~154, 및 GUUUGAGAG로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 구현예에 따르면, 하기:
(a) RNA-결합 부분; 및
부위-유도 효소 활성을 나타내는 활성 부분
을 포함하는, CRISPR 뉴클레아제, 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, CRISPR 뉴클레아제가 서열번호: 3과 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80% 동일성을 갖는, 뉴클레아제, 또는 폴리뉴클레오티드; 및
(b) 하기:
i) 표적 DNA 서열 내 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA-표적화 RNA 서열; 및
ii) CRISPR 뉴클레아제의 RNA-결합 부분과 상호작용할 수 있는, 단백질-결합 RNA 서열
을 포함하는 하나 이상의 RNA 분자 또는 하나 이상의 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 비-자연 발생 조성물이 제공되며, DNA 표적화 RNA 서열 및 CRISPR 뉴클레아제는 함께 자연 발생하지 않는다. 각각의 가능성은 별도 구현예를 나타낸다.
일부 구현예에서, DNA-표적화 RNA 서열 및 단백질-결합 RNA 서열을 포함하는 단일 RNA 분자가 제공되며, 여기서 RNA 분자는 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있고 DNA 표적화 모듈로 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 최대 1000 염기, 900 염기, 800 염기, 700 염기, 600 염기, 500 염기, 400 염기, 300 염기, 200 염기, 100 염기, 50 염기의 길이를 갖는다. 각각의 가능성은 별도 구현예를 나타낸다. 일부 구현예에서, DNA-표적화 RNA 서열을 포함하는 제1 RNA 분자 및 단백질-결합 RNA 서열을 포함하는 제2 RNA 분자는 염기쌍 형성에 의해 상호작용하거나 대안적으로 함께 융합되어 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성하고 DNA 표적화 모듈로 작용하는 하나 이상의 RNA 분자를 형성한다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3과 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80% 동일성을 가지며, RNA 분자는 서열번호: 37~45, 87~88, 149~154 및 GUUUGAGAG로부터 선택되는 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 하기:
a) 서열번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자; 및
b) 하기:
i) CRISPR 뉴클레아제와 상호작용할 수 있는/이에 결합할 수 있는 뉴클레아제-결합 RNA 뉴클레오티드 서열; 및
ii) 표적 DNA 서열 내 서열과 상보적인 서열을 포함하는 DNA-표적화 RNA 뉴클레오티드 서열
중 적어도 하나를 포함하는, 하나 이상의 RNA 분자, 또는 하나 이상의 RNA 분자를 인코딩하는 하나 이상의 DNA 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 비-자연 발생 조성물을 제공하며, 여기서 CRISPR 뉴클레아제는 하나 이상의 RNA 분자와 복합체화하여 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 복합체를 형성할 수 있다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제 및 하나 이상의 RNA 분자는 표적 DNA 서열의 절단을 실시하기 위해 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 CRISPR 복합체를 형성한다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제 및 하나 이상의 RNA 분자 중 적어도 하나는 함께 자연 발생하지 않는다.
하나의 구현예에서:
a) CRISPR 뉴클레아제는 RNA-결합 부분 및 부위-유도 효소 활성을 나타내는 활성 부분을 포함하며;
b) DNA-표적화 RNA 뉴클레오티드 서열은 표적 DNA 서열 내 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
c) 뉴클레아제-결합 RNA 뉴클레오티드 서열은 CRISPR 뉴클레아제의 RNA-결합 부분과 상호작용하는 서열을 포함한다.
하나의 구현예에서, 뉴클레아제-결합 RNA 뉴클레오티드 서열 및 DNA-표적화 RNA 뉴클레오티드 서열은 단일 가이드 RNA 분자(sgRNA) 상에 있으며, 여기서 sgRNA 분자는 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성하고 DNA 표적화 모듈로 작용할 수 있다.
하나의 구현예에서, 뉴클레아제-결합 RNA 뉴클레오티드 서열은 제1 RNA 분자 상에 있으며 DNA-표적화 RNA 뉴클레오티드 서열은 단일 가이드 RNA 분자 상에 있고, 여기서 제1 및 제2 RNA 서열은 염기쌍 형성에 의해 상호작용하거나 함께 융합되어 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성하고 표적화 모듈로 작용하는 하나 이상의 RNA 분자 또는 sgRNA를 형성한다.
하나의 구현예에서, sgRNA는 최대 1000 염기, 900 염기, 800 염기, 700 염기, 600 염기, 500 염기, 400 염기, 300 염기, 200 염기, 100 염기, 50 염기의 길이를 갖는다.
하나의 구현예에서, 조성물은 상동성 유도 복구(HDR)를 위한 공여체 주형을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, (a) CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3과 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80% 동일성을 갖거나, (b) CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자는 서열번호: 11, 12, 또는 13에 나타낸 핵산 서열과 적어도 95% 서열 동일성의 서열을 포함하고, PAM은 NGG이다. 적합한 PAM 서열의 비제한적 예에는 GGG, AGG, 및 TGG가 포함된다. 상기 구현예에서, DNA-표적화 RNA 분자 내 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 37~45, 87~88, 149~154 및 GUUUGAGAG로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 NAG 또는 NGA의 서열을 갖는 PAM을 이용한다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 야생형 CRISPR 뉴클레아제의 아미노산 서열 대비 1~10, 10~20, 20~30, 30~40, 40~50, 50~60, 60~70, 70~80, 80~90, 90~100, 100~110, 110~120, 120~130, 130~140, 또는 140~150 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함한다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 야생형 CRISPR 뉴클레아제 대비 적어도 2%, 5%, 7% 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 35% 증가된 특이성을 나타낸다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 적어도 2%, 5%, 7% 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 35% 증가된 활성을 나타낸다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 야생형 CRISPR 뉴클레아제 대비 변경된 PAM 특이성을 갖는다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 비-자연 발생이다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 조작된 것이며 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 조작된 것이며 핵 편재 서열(NLS), 세포 침투 펩티드 서열, 및/또는 친화도 태그 중 하나 이상을 포함한다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 진핵 세포의 핵 내에서 검출 가능한 양으로 CRISPR 뉴클레아제를 포함하는 CRISPR 복합체의 축적을 유도하기 충분한 강도의 하나 이상의 핵 편재 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 조성물을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는 무세포 시스템 또는 세포의 게놈 내 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 세포는 진핵 세포이다.
또 다른 구현예에서, 세포는 원핵 세포이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 RNA 분자는 RNA 뉴클레아제(tracrRNA)와 복합체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 분자를 포함하는 RNA 서열 또는 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 아미노-말단에서 또는 근처에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 NLS, 카복시-말단에서 또는 근처에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 NLS, 또는 아미노-말단에서 또는 근처에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 NLS 및 카복시-말단에서 또는 근처에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 NLS의 조합을 포함한다. 하나의 구현예에서 1~4개 NLS가 CRISPR 뉴클레아제와 융합된다. 하나의 구현예에서, NLS는 CRISPR 뉴클레아제의 개방-해독틀(ORF) 내에 위치한다.
발현된 단백질의 아미노-말단에서 또는 근처에서, 카복시-말단에서 또는 근처에서, 또는 ORF 내에서 NLS와 융합시키는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다. 일례로서, NLS를 CRISPR 뉴클레아제의 아미노-말단으로 융합시키기 위해, NLS의 핵산 서열은 NLS-융합 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 상에서 CRISPR 뉴클레아제의 시작 코돈 직후에 배치된다. 반대로, NLS를 CRISPR 뉴클레아제의 카복시-말단으로 융합시키기 위해, NLS의 핵산 서열은 CRISPR 뉴클레아제의 마지막 아미노산을 인코딩하는 코돈 뒤에 및 정지 코돈 앞에 배치된다.
CRISPR 뉴클레아제의 ORF를 따른 임의의 위치에서의 NLS, 세포 침투 펩티드 서열, 및/또는 친화도 태그의 임의의 조합이 본 발명에서 고려된다.
본원에서 제공되는 CRISPR 뉴클레아제의 아미노산 서열 및 핵산 서열에는 CRISPR 뉴클레아제의 인접한 아미노산 또는 핵산 서열을 단속하기 위해 삽입된 NLS 및/또는 TAG가 포함될 수 있다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 NLS는 일렬 반복된다.
하나의 구현예에서, 하나 이상의 NLS는 NLS의 가장 가까운 아미노산이 N- 또는 C-말단으로부터 폴리펩티드쇄를 따라 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개 이상의 아미노산 이내인 경우 N- 또는 C-말단의 인근인 것으로 간주된다.
논의된 바와 같이, CRISPR 뉴클레아제는 핵 편재 서열(NLS), 세포 침투 펩티드 서열, 및/또는 친화도 태그 중 하나 이상을 포함하도록 조작될 수 있다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 하나 이상의 RNA 분자와 복합체화된 경우 야생형 CRISPR 뉴클레아제 대비 표적 부위에 대해 증가된 특이성을 나타낸다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제 및 하나 이상의 RNA 분자의 복합체는 야생형 CRISPR 뉴클레아제 대비 표적 부위의 적어도 유지된 온-표적 편집 활성 및 감소된 오프-표적 활성을 나타낸다.
하나의 구현예에서, 조성물은 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오티드산 분자에 작동 가능하게 연결된 이종성 프로모터를 포함하는 재조합 핵산 분자를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자는 비-자연 발생이거나 조작된 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 임의의 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 시스템을 포함하는 비-자연 발생 또는 조작된 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 대상체의 게놈 내 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열의 변형을 포함하는, 게놈 돌연변이와 연관된 질환을 겪는 대상체의 치료를 위한 본 발명의 임의의 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 세포 내로 (i) 서열번호: 3의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는 CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 조성물로서, 서열이 서열번호: 12 또는 13으로 구성되는 군으로부터 선택되는 핵산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖는, 조성물 및 (ii) DNA-표적화 RNA 분자, 또는 표적 DNA 내 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA-표적화 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 포함하는, 포유류 세포의 게놈 내 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 방법은 생체외 수행된다. 일부 구현예에서, 방법은 생체내 수행된다. 일부 구현예에서, 방법의 일부 단계는 생체외 수행되며 일부 단계는 생체내 수행된다. 일부 구현예에서 포유류 세포는 인간 세포이다.
하나의 구현예에서, 방법은 세포 내로 (iii) 뉴클레아제-결합 RNA 서열을 포함하는 RNA 분자 또는 CRISPR 뉴클레아제와 상호작용하는 뉴클레아제-결합 RNA를 포함하는 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, DNA 표적화 RNA 분자는 CRISPR 뉴클레아제와 활성 복합체를 형성하기 적합한 crRNA 분자이다.
하나의 구현예에서, 뉴클레아제-결합 RNA 서열을 포함하는 RNA 분자는 CRISPR 뉴클레아제와 활성 복합체를 형성하기 적합한 tracrRNA 분자이다.
하나의 구현예에서, DNA-표적화 RNA 분자 및 뉴클레아제-결합 RNA 서열을 포함하는 RNA 분자는 단일 가이드 RNA 분자 형태로 융합된다.
하나의 구현예에서, 방법은 세포 내로 (iv) 프로토스페이서 서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 분자를 도입하는 단계를 추가로 포함한다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 하나 이상의 RNA 분자와 복합체를 형성하며 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 3'에서 이중 가닥 절단을 실시한다.
하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 하나 이상의 RNA 분자와 복합체를 형성하며 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 5'에서 이중 가닥 절단을 실시한다.
일부 구현예에서, (a) CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3과 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 85%, 80% 동일성을 갖거나, (b) CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산 분자는 서열번호: 11, 12, 또는 13에 나타낸 핵산 서열과 적어도 95% 서열 동일성의 서열을 포함하고, PAM은 NGG이다. 적합한 PAM 서열의 비제한적 예에는 GGG, AGG, 및 TGG가 포함된다. 상기 구현예에서, DNA-표적화 RNA 분자에서 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 37~45, 87~88, 149~154 및 GUUUGAGAG로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 NAG 또는 NGA의 서열을 갖는 PAM을 이용한다.
본원에서 기재된 임의의 방법의 하나의 구현예에서, 방법은 대상체의 게놈 내 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 변형하는 단계를 포함하는, 게놈 돌연변이와 연관된 질환을 겪는 대상체를 치료하기 위한 것이다.
하나의 구현예에서, 방법은 먼저 게놈 돌연변이와 연관된 질환을 겪는 대상체를 선택하는 단계 및 대상체로부터 세포를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 본원에서 기재된 임의의 방법에 의해 수득되는 변형된 세포 또는 세포들을 제공한다. 하나의 구현예에서 이들 변형된 세포 또는 세포들은 자손 세포를 생성할 수 있다. 하나의 구현예에서 이들 변형된 세포 또는 세포들은 이식 후 자손 세포를 생성할 수 있다.
본 발명은 또한 이들 변형된 세포 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 또한, 세포를 약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합하는 단계를 포함하는, 이를 제조하는 시험관내 또는 생체외 방법이 제공된다.
DNA-표적화 RNA 분자
본 발명의 구현예에서, DNA-표적화 RNA 서열은 가이드 서열 부분을 포함한다. RNA 분자의 "가이드 서열 부분"은 특정 표적 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 나타내며, 예로, 가이드 서열 부분은 가이드 서열 부분의 길이에 따라 표적화되는 DNA 서열과 전체 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 부분은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 뉴클레오티드 길이, 또는 대략 17~24, 18~22, 19~22, 18~20, 17~20, 또는 21~22개 뉴클레오티드 길이이다. 가이드 서열 부분의 전체 길이는 가이드 서열 부분의 길이에 따라 표적화되는 DNA 서열과 전체 상보적이다. 가이드 서열 부분은 CRISPR 복합체의 DNA 표적화 부분으로 작용하는 가이드 서열 부분을 갖는 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 RNA 분자의 일부일 수 있다. 가이드 서열 부분을 갖는 RNA 분자가 CRISPR 분자와 동시간대에 존재하는 경우, RNA 분자는 CRISPR 뉴클레아제를 특정 표적 DNA 서열로 표적화할 수 있다. 각각의 가능성은 별도 구현예를 나타낸다. RNA 분자는 임의의 요망되는 서열을 표적화하도록 맞춤 설계될 수 있다.
본 발명의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 20개 이하의 뉴클레오티드, 및/또는 24개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 가이드 서열 부분을 포함하는 RNA 분자와 함께 사용되는 경우의 그 절단 활성에 비해, 21~23개 뉴클레오티드를 갖는 가이드 서열 부분을 포함하는 RNA 분자와 함께 사용되는 경우에 더 큰 절단 활성을 갖는다. 본 발명의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 20개 이하의 뉴클레오티드, 및/또는 23개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 가이드 서열 부분을 포함하는 RNA 분자와 함께 사용되는 경우의 그 절단 활성에 비해, 21~22개 뉴클레오티드를 갖는 가이드 서열 부분을 포함하는 RNA 분자와 함께 사용되는 경우에 더 큰 절단 활성을 갖는다. 하나의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 22개 뉴클레오티드를 갖는 가이드 서열 부분을 포함하는 RNA 분자와 함께 사용되는 경우에 그 가장 큰 절단 활성을 갖는다.
하나의 구현예에서, 이러한 CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 95% 동일성을 갖거나 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열은 서열번호: 11~13 중 어느 하나와 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 하나의 구현예에서, 이러한 CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 100%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 또는 82% 동일성을 갖거나 CRISPR 뉴클레아제를 인코딩하는 서열은 서열번호: 11~13 중 어느 하나와 적어도 100%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 또는 82% 서열 동일성을 갖는다.
CRISPR 뉴클레아제의 특징적인 표적화된 뉴클레아제 활성은 그 특이적 도메인의 다양한 기능에 의해 부여된다. 본 출원에서 OMNI-50 도메인은 도 8 OMNI-50 도식에서 제시된 바와 같이 도메인 A, 도메인 B, 도메인 C, 도메인 D, 도메인 E, 및 도메인 F로 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 도메인 A는 3개의 하위도메인: 하위도메인 A1, 하위도메인 A2, 및 하위도메인 A3을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 하위도메인 A1은 서열번호: 3의 1~10 내의 아미노산 위치에서 시작되며 45~55 내의 아미노산 위치에서 끝나고; 하위도메인 A2는 서열번호: 3의 736~746 내의 아미노산 위치에서 시작되며 784~794 내의 아미노산 위치에서 끝나고; 하위도메인 A3은 서열번호: 3의 957~967 내의 아미노산 위치에서 시작되며 1091~1101 내의 아미노산 위치에서 끝난다. 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘을 사용하여 생성된 국소 정렬의 선호되는 분석에 기반하여, 하나의 구현예에서 하위도메인 A1은 서열번호: 3의 아미노산 1 내지 50으로 확인되었으며, 하위도메인 A2는 서열번호: 3의 아미노산 741 내지 789로 확인되었고, 하위도메인 A3은 서열번호: 3의 아미노산 962 내지 1096으로 확인되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 도메인 B는 서열번호: 3의 46~56 내의 아미노산 위치에서 시작되며 78~88 내의 아미노산 위치에서 끝난다. 스미스-워터만 알고리즘을 사용하여 생성된 국소 정렬의 선호되는 분석에 기반하여, 하나의 구현예에서 도메인 B는 서열번호: 3의 아미노산 51 내지 83으로 확인되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 도메인 C는 3개의 하위도메인: 하위도메인 C1, 하위도메인 C2, 및 하위도메인 C3, 또는 대안적으로 2개의 하위도메인: 하위도메인 Ca 및 하위도메인 Cb를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 하위도메인 C1은 서열번호: 3의 79~89 내의 아미노산 위치에서 시작되며 155~165 내의 아미노산 위치에서 끝나고; 하위도메인 C2는 서열번호: 3의 156~166 내의 아미노산 위치에서 시작되며 294~304 내의 아미노산 위치에서 끝나고; 하위도메인 C3은 서열번호: 3의 295~305 내의 아미노산 위치에서 시작되며 732~742 내의 아미노산 위치에서 끝난다. 스미스-워터만 알고리즘을 사용하여 생성된 국소 정렬의 선호되는 분석에 기반하여, 하나의 구현예에서 하위도메인 C1은 서열번호: 3의 아미노산 84~160으로 확인되었으며, 하위도메인 C2는 서열번호: 3의 아미노산 161~299로 확인되었고, 하위도메인 C3은 서열번호: 3의 아미노산 300~737로 확인되었다. 본원에서 사용된 바와 같이, 하위도메인 Ca는 서열번호: 3의 79~89 내의 아미노산 위치에서 시작되며 473~483 내의 아미노산 위치에서 끝나고; 하위도메인 Cb는 서열번호: 3의 474~484 내의 아미노산 위치에서 시작되며 732~742 내의 아미노산 위치에서 끝난다. 스미스-워터만 알고리즘을 사용하여 생성된 국소 정렬의 분석에 기반하여, 하나의 구현예에서 하위도메인 Ca는 서열번호: 3의 아미노산 84~478로 확인되었으며, 하위도메인 Cb는 서열번호: 3의 아미노산 479~737로 확인되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 도메인 D는 서열번호: 3의 785~795 내의 아미노산 위치에서 시작되며 956~966 내의 아미노산 위치에서 끝난다. 스미스-워터만 알고리즘을 사용하여 생성된 국소 정렬의 선호되는 분석에 기반하여, 하나의 구현예에서 도메인 D는 서열번호: 3의 아미노산 790 내지 961로 확인되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 도메인 E는 서열번호: 3의 1092~1102 내의 아미노산 위치에서 시작되며 1191~1201 내의 아미노산 위치에서 끝난다. 스미스-워터만 알고리즘을 사용하여 생성된 국소 정렬의 선호되는 분석에 기반하여, 하나의 구현예에서 도메인 E는 서열번호: 3의 아미노산 1097 내지 1196으로 확인되었다.
본원에서 사용된 바와 같이, 도메인 F는 서열번호: 3의 1192~1202 내의 아미노산 위치에서 시작되며 1360~1370 내의 아미노산 위치에서 끝난다. 스미스-워터만 알고리즘을 사용하여 생성된 국소 정렬의 선호되는 분석에 기반하여, 하나의 구현예에서 도메인 F는 서열번호: 3의 아미노산 1197 내지 1370으로 확인되었다.
각각의 OMNI-50 뉴클레아제 도메인의 활성이 본원에 기재되며, 각각의 도메인 활성은 뉴클레아제의 유리한 특성의 양태를 제공한다.
구체적으로, OMNI-50 도메인 A는 DNA 가닥 절단에 참여하는 뉴클레아제 활성 부위를 함유한다. 도메인 A는 표적화 RNA 분자가 DNA 표적 부위에서 결합하는 DNA 가닥을 절단한다.
도메인 B는 표적 DNA 부위에 대한 OMNI-50 결합 시 DNA 절단 활성의 개시에 연루된다.
도메인 C는 표적화 RNA 분자에 결합하고 표적 부위 인식을 위한 특이성 제공에 참여한다. 도메인 C는 하위도메인 C1, 하위도메인 C2, 및 하위도메인 C3을 포함하며, 이는 각각 도메인 C 활성의 특이적인 기능적 양태에 참여한다. 예를 들어, C3은 DNA 표적 부위의 감지에 연루되며; C2는 뉴클레아제 도메인(예로 도메인 D)의 활성화 조절에 연루되고; C1은 표적 부위에서 뉴클레아제 도메인의 잠금에 연루된다. 따라서, 도메인 C는 오프-표적 서열의 절단 제어에 참여한다.
도메인 D는 DNA 가닥 절단에 참여하는 뉴클레아제 활성 부위를 함유한다. 도메인 D는 DNA 표적 부위에서 결합하는 표적화 RNA 분자에 의해 변위되는 DNA 가닥을 절단한다.
도메인 E는 토포이소머라제 도메인과 구조적으로 유사하다.
도메인 F는 PAM 부위 조사 및 인식 양태를 포함하는, PAM 부위 특이성의 제공에 연루된다.
다른 CRISPR 뉴클레아제 도메인 및 이의 일반적 기능의 추가 설명은, 특히 본원에 참조로 포함되는, 문헌(Mir 등, ACS Chem. Biol. (2019), Palermo 등, Quarerly Reviews of Biophysics (2018), Jiang and Doudna, Annual Review of Biophysics (2017), Nishimasu 등, Cell (2014) 및 Nishimasu 등, Cell (2015))에서 확인될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태에서, OMNI-50 도메인 또는 하위도메인과 유사성을 갖는 아미노산 서열은 펩티드가 OMNI-50 도메인 또는 하위도메인 활성의 유리한 특성을 나타내도록, 비-자연 발생 펩티드, 예로 CRISPR 뉴클레아제의 설계 및 제조에서 이용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 이러한 펩티드, 예로 CRISPR 뉴클레아제는 OMNI-50 뉴클레아제의 도메인 A 또는 그 3개의 하위 도메인 중 어느 하나, 도메인 B, 도메인 C 또는 그 3개의 하위 도메인 중 어느 하나, 도메인 D, 도메인 E, 또는 도메인 F 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 100%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 또는 82% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 펩티드는 OMNI-50 뉴클레아제의 도메인 A 또는 그 3개의 하위 도메인 중 어느 하나, 도메인 B, 도메인 C 또는 그 3개의 하위 도메인 중 어느 하나, 도메인 D, 도메인 E, 또는 도메인 F 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 100%, 99.5%, 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 또는 82% 동일성을 갖는 펩티드 아미노산 서열 외부에서 전장 OMNI-50 아미노산 서열(서열번호: 3)에 비해 광범위한 아미노산 가변성을 나타낸다. 하나의 구현예에서, 펩티드는 2개의 도메인 서열 간에 개재 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 개재 아미노산 서열은 1~10, 10~20, 20~40, 40~50 또는 최대 100개 아미노산 길이이다. 하나의 구현예에서, 개재 서열은 링커 서열이다.
본 발명의 하나의 양태에서, 펩티드에서 본원에 기재되는 OMNI-50 뉴클레아제의 도메인 중 어느 하나를 인코딩하는 아미노산 서열은 원래의 OMNI-50 도메인 서열 대비 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 치환, 즉 원래의 아미노산과 유사한 화학적 특성을 갖는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들어, 양으로 하전된 아미노산은 대안적인 양으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있으며, 예로 아르기닌 잔기는 라이신 잔기로 치환할 수 있고, 또는 극성 아미노산은 상이한 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 보존적 치환은 보다 관용 가능하며, OMNI-50 뉴클레아제의 도메인 중 어느 하나를 인코딩하는 아미노산 서열은 이러한 치환을 10%만큼 함유할 수 있다. 아미노산 치환은 급격한 치환, 즉 원래의 아미노산과 상이한 화학적 특성을 갖는 아미노산으로의 치환일 수 있다. 예를 들어, 양으로 하전된 아미노산은 음으로 하전된 아미노산으로 치환될 수 있으며, 예로 아르기닌 잔기는 글루탐산 잔기로 치환될 수 있고, 또는 극성 아미노산은 비-극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 아미노산 치환은 반-보존적 치환일 수 있거나, 아미노산 치환은 임의의 다른 아미노산으로일 수 있다. 치환은 원래의 OMNI-50 도메인 기능 대비 활성을 변경할 수 있으며, 예로 촉매성 뉴클레아제 활성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시되는 조성물은 CRISPR 뉴클레아제를 포함하는 비-자연 발생 조성물을 포함하며, 여기서 CRISPR 뉴클레아제는 OMNI-50 뉴클레아제의 도메인 A, 도메인 B, 도메인 C, 도메인 D, 도메인 E, 또는 도메인 F 중 적어도 하나의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 각각의 암니오산 서열은 OMNI-50 뉴클레아제의 도메인 A, 도메인 B, 도메인 C, 도메인 D, 도메인 E, 또는 도메인 F의 아미노산 서열 중 어느 하나에 대응한다. 따라서, CRISPR 뉴클레아제에는 OMNI-50 뉴클레아제의 임의의 도메인 A, 도메인 B, 도메인 C, 도메인 D, 도메인 E, 또는 도메인 F에 대응하는 아미노산 서열의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 도메인 A를 포함한다:
a) 서열번호: 3의 아미노산 1 내지 50과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 A1;
b) 서열번호: 3의 아미노산 741 내지 789와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 A2; 또는
c) 서열번호: 3의 아미노산 962 내지 1096과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 A3.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3의 아미노산 51 내지 83과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 도메인 B를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 도메인 C를 포함한다:
a) 서열번호: 3의 아미노산 84 내지 160과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 C1;
b) 서열번호: 3의 아미노산 161 내지 299와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 C2; 또는
c) 서열번호: 3의 아미노산 300 내지 737과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 C3.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 하기 중 적어도 하나를 포함하는 도메인 C를 포함한다:
a) 서열번호: 3의 아미노산 84 내지 478과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 Ca; 및
b) 서열번호: 3의 아미노산 479 내지 737과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 Cb.
일부 구현예에서, 도메인 C는 서열번호: 3의 아미노산 84 내지 737과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3의 아미노산 790 내지 961과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 도메인 D를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3의 아미노산 1097 내지 1196과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 도메인 E를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 서열번호: 3의 아미노산 1197 내지 1370과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 도메인 F를 포함한다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제는 도메인 A, 도메인 B, 도메인 C, 도메인 D, 도메인 E, 및 도메인 F를 포함하며, 여기서
a) 도메인 A는 하기:
i. 서열번호: 3의 아미노산 1 내지 50과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 A1;
ii. 서열번호: 3의 아미노산 741 내지 789와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 A2; 및
iii. 서열번호: 3의 아미노산 962 내지 1096과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 A3
을 포함하고;
b) 도메인 B는 서열번호: 3의 아미노산 51 내지 83과 적어도 97% 서열 동일성을 가지고;
c) 도메인 C는 서열번호: 3의 아미노산 84 내지 737과 적어도 97% 서열 동일성을 가지고;
d) 도메인 D는 서열번호: 3의 아미노산 790 내지 961과 적어도 97% 서열 동일성을 가지고;
e) 도메인 E는 서열번호: 3의 아미노산 1097 내지 1196과 적어도 97% 서열 동일성을 가지고;
f) 도메인 F는 서열번호: 3의 아미노산 1197 내지 1370과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제 서열은 적어도 100~250, 250~500, 500~1000, 또는 1000~2000개 아미노산 길이이다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시되는 조성물은 펩티드를 포함하는 비-자연 발생 조성물을 포함하며, 여기서 펩티드는 OMNI-50 뉴클레아제의 도메인 A, 도메인 B, 도메인 C, 도메인 D, 도메인 E, 또는 도메인 F 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 도메인 A의 아미노산 서열은 하기 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다:
a) 서열번호: 3의 아미노산 1 내지 50과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 A1;
b) 서열번호: 3의 아미노산 741 내지 789와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 A2; 또는
c) 서열번호: 3의 아미노산 962 내지 1096과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 A3.
일부 구현예에서, 도메인 B의 아미노산 서열은 서열번호: 3의 아미노산 51 내지 83과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 도메인 C의 아미노산 서열은 하기 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다:
a) 서열번호: 3의 아미노산 84 내지 160과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 C1;
b) 서열번호: 3의 아미노산 161 내지 299와 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 C2; 또는
c) 서열번호: 3의 아미노산 300 내지 737과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 C3.
일부 구현예에서, 도메인 C의 아미노산 서열은 하기 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다:
a) 서열번호: 3의 아미노산 84 내지 478과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 Ca; 및
b) 서열번호: 3의 아미노산 479 내지 737과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 하위도메인 Cb.
일부 구현예에서, 도메인 C의 아미노산 서열은 서열번호: 3의 아미노산 84 내지 737과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 도메인 D의 아미노산 서열은 서열번호: 3의 아미노산 790 내지 961과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 도메인 E의 아미노산 서열은 서열번호: 3의 아미노산 1097 내지 1196과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 도메인 F의 아미노산 서열은 서열번호: 3의 아미노산 1197 내지 1370과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 아미노산 서열은 적어도 100~250, 250~500, 500~1000, 또는 1000~2000개 아미노산 길이이다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시되는 조성물은 OMNI-50 뉴클레아제의 도메인 A, 도메인 B, 도메인 C, 도메인 D, 도메인 E, 또는 도메인 F 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 비-자연 발생 조성물을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시되는 조성물은 OMNI-50 뉴클레아제의 도메인 A, 도메인 B, 도메인 C, 도메인 D, 도메인 E, 또는 도메인 F 중 적어도 하나의 아미노산 서열과 적어도 97% 서열 동일성을 갖는 비-자연 발생 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시되는 방법은 본원에서 기재되는 구현예 중 어느 하나의 조성물을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 무세포 시스템 또는 세포의 게놈 내 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유류 세포 또는 식물 세포이다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시되는 방법은 대상체의 게놈 내 표적 부위에서 뉴클레오티드 서열을 변형하는 단계를 포함하는, 게놈 돌연변이와 연관된 질환을 겪는 대상체의 치료를 위한 본원에서 기재되는 조성물 중 어느 하나의 사용을 포함한다.
본 발명의 일부 양태에 따르면, 개시되는 방법은 돌연변이 장애와 연관된 대립유전자로 본원에서 기재되는 조성물 중 어느 하나를 표적화하는 단계를 포함하는, 돌연변이 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다.
일부 구현예에서, 돌연변이 장애는 임의의 신생물, 연령-관련 황반 변성, 정신분열병, 신경학적, 신경변성, 또는 운동 장애, 취약 X 증후군, 시크리타제-관련 장애, 프리온-관련 장애, ALS, 중독, 자폐증, 알츠하이머병, 호중구감소증, 염증-관련 장애, 파킨슨병, 혈액 및 응고 질환 및 장애, 세포 조절이상 및 종양학 질환 및 장애, 염증 및 면역-관련 질환 및 장애, 대사성, 간, 신장 및 단백질 질환 및 장애, 근육 및 골격 질환 및 장애, 피부학적 질환 및 장애, 신경학적 및 신경세포 질환 및 장애, 및 눈 질환 및 장애로부터 선택되는 질환 또는 장애에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 돌연변이 장애는 베타 지중해빈혈 또는 낫 적혈구 빈혈이다.
일부 구현예에서, 질환과 연관된 대립유전자는 BCL11A이다.
질환 및 치료법
본 발명의 특정 구현예는 유전자 편집, 치료 방법, 또는 치료법의 형태로서 질환 또는 장애와 연관된 특정 유전적 유전자위로 뉴클레아제를 표적화한다. 예를 들어, 유전자의 편집 또는 녹아웃을 유도하기 위해, 본원에서 개시되는 신규한 뉴클레아제는 맞춤 설계된 가이드 RNA 분자를 사용하여 유전자의 병리적 돌연변이체 대립유전자로 특이적으로 표적화될 수 있다. 가이드 RNA 분자는 바람직하게는 먼저 뉴클레아제의 PAM 요건을 고려함으로써 설계되며, 이는 본원에서 나타낸 바와 같이 유전자 편집이 수행되는 시스템에 또한 의존한다. 예를 들어, 표적 부위로 OMNI-50 뉴클레아제를 표적화하도록 설계되는 가이드 RNA 분자는 OMNI-50 PAM 서열 "NGG" 인근 영역과 상보적인 스페이서 영역을 함유하도록 설계된다. 가이드 RNA 분자는 추가로 바람직하게는 뉴클레아제의 특이적 활성을 증가시키고 오프-표적 효과를 감소시키기 위해 충분하고 바람직하게는 최적의 길이의 스페이서 영역(즉 표적 대립유전자와 상보성을 갖는 가이드 RNA 분자의 영역)을 함유하도록 설계된다. 예를 들어, OMNI-50 뉴클레아제를 표적화하도록 설계되는 가이드 RNA 분자는 높은 온-표적 절단 활성을 위해 22 nt 스페이서를 함유하도록 설계될 수 있다.
비제한적 예로서, 가이드 RNA 분자는 뉴클레아제에 의해 유도되는 DNA 손상 시 비-상동 말단 연결(NHEJ) 경로가 유도되고 틀이동 돌연변이의 도입에 의해 돌연변이체 대립유전자의 침묵화를 야기하도록, 돌연변이체 대립유전자의 특정 영역, 예로 시작 코돈 근처로 뉴클레아제를 표적화하도록 설계될 수 있다. 가이드 RNA 분자 설계에 대한 상기 접근은 우성 음성 돌연변이의 효과를 변경하고 이에 따라 대상체를 치료하는 데 특히 유용하다. 별도의 비제한적 예로서, 가이드 RNA 분자는 뉴클레아제에 의해 유도되는 DNA 손상 시 상동성 유도 복구(HDR) 경로가 유도되고 돌연변이체 대립유전자의 주형 매개 교정을 야기하도록, 돌연변이된 대립유전자의 특정 병리적 돌연변이를 표적화하도록 설계될 수 있다. 가이드 RNA 분자 설계에 대한 상기 접근은 돌연변이된 대립유전자의 홑배수체부족 효과를 변경하고 이에 따라 대상체를 치료하는 데 특히 유용하다.
질환 또는 장애를 치료하기 위한 변경에 대해 표적화될 수 있는 특정 유전자의 비제한적 예가 아래에서 본원에 제시된다. 돌연변이 장애를 유도하는 특정 질환-연관 유전자 및 돌연변이는 문헌에 기재되어 있다. 이러한 돌연변이는 질환 연관된 유전자의 대립유전자로 CRISPR 조성물을 표적화하도록 DNA-표적화 RNA 분자를 설계하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 CRISPR 조성물은 DNA 손상을 유도하고 DNA 복구 경로를 유도하여 대립유전자를 변경하고 이에 따라 돌연변이 장애를 치료한다.
ELANE 유전자에서의 돌연변이는 호중구감소증과 연관된다. 이에 따라, 비제한적으로, ELANE를 표적화하는 본 발명의 구현예는 호중구감소증을 겪는 대상체를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.
CXCR4는 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1) 감염을 위한 공동-수용체이다. 따라서, 비제한적으로, CXCR4를 표적화하는 본 발명의 구현예는 HIV-1을 겪는 대상체를 치료하거나 대상체에서 HIV-1 감염에 대한 내성을 부여하는 방법에서 사용될 수 있다.
프로그래밍된 세포사 단백질 1(PD-1) 손상은 종양 세포의 CAR-T 세포 매개된 사멸을 증강시키며 PD-1은 다른 암 치료법에서의 표적일 수 있다. 따라서, 비제한적으로, PD-1을 표적화하는 본 발명의 구현예는 암을 겪는 대상체를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 하나의 구현예에서, 치료는 PD-1 결핍으로 본 발명에 따라 변형된 T 세포를 이용한 CAR-T 세포 치료법이다.
또한, BCL11A는 헤모글로빈 생산의 억제에서 역할을 담당하는 유전자이다. 글로빈 생산은 BCL11A를 억제함으로써 지중해빈혈 또는 낫 적혈구 빈혈과 같은 질환을 치료하기 위해 증가될 수 있다. 예를 들어, PCT 국제 공개 번호 WO 2017/077394A2; U.S. 공개 번호 US2011/0182867A1; Humbert 등 Sci. Transl. Med. (2019); 및 Canver 등 Nature (2015)을 참고한다. 따라서, 비제한적으로, BCL11A의 증강제를 표적화하는 본 발명의 구현예는 베타 지중해빈혈 또는 낫 적혈구 빈혈을 겪는 대상체를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 구현예는 또한 아래의 표 A 또는 표 B에 기재된 임의의 질환 또는 장애를 연구하거나, 변경하거나, 치료하기 위한 임의의 질환-연관 유전자의 표적화를 위해 사용될 수 있다. 실제로, 유전적 유전자위와의 연관된-임의의 질환은 적절한 질환-연관 유전자를 표적화하기 위해 본원에서 개시되는 뉴클레아제, 예를 들어, U.S. 공개 번호 2018/0282762A1 및 유럽 특허 번호 EP3079726B1에 기재된 것들을 사용함으로써 연구되거나, 변경되거나, 치료될 수 있다.
[표 A]
[표 B]
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 본 발명이 관련되는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재되는 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 구현예의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 물질이 후술된다. 상충 시, 정의를 포함하여, 특허 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법, 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 반드시 제한하려는 것이 아니다.
달리 언급되지 않는 한 논의에서, 본 발명의 하나의 구현예의 특성 또는 특성들의 특징적 조건 또는 관계를 수식하는 "실질적으로" 및 "약"과 같은 형용사는 조건 또는 특징이 의도되는 적용을 위한 구현예의 작동을 위해 허용 가능한 관용성 내에서 정의됨을 의미하는 것으로 이해된다. 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서의 단어 "또는"은 배타적이기보다는 포괄적인 "또는"으로 간주되며, 이것이 결합시키는 항목의 적어도 하나 및 임의의 조합을 시사한다.
상기 및 본원에서 다른 곳에서 사용되는 바와 같은 용어 하나의("a" 및 "an")는 "하나 이상의" 열거되는 성분을 나타내는 것으로 이해되어야 한다. 당업자에게는 구체적으로 달리 언급되지 않는 한 단수의 사용에 복수가 포함됨이 명확할 것이다. 따라서, 용어 하나("a," "an") 및 "적어도 하나"는 본 출원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본 발명의 교시를 더 잘 이해하고 달리 나타내지 않는 한, 어떠한 방식으로도 교시 범위를 제한하지 않는 목적으로, 양, 백분율 또는 비율을 표시하는 수치, 및 명세서 및 청구범위에서 사용되는 다른 수치 값은 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부되는 청구범위에서 나타내는 수치 파라미터는 수득하고자 하는 요망되는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 최소한, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고되는 유효 숫자의 수치의 견지에서 그리고 일반적인 반올림 기법을 적용하여 고려되어야 한다.
수치 범위가 본원에서 인용되는 경우, 본 발명은 달리 언급되지 않는 한, 상한 및 하한 사이 및 이를 포함하는 각각의 정수를 고려하는 것으로 이해된다.
본 출원의 기재 및 청구범위에서, 각각의 동사 "포함한다", "포함된다" 및 "갖는다" 그리고 이의 접합부는 동사의 목적어 또는 목적어들이 반드시 동사의 목적어 또는 목적어들의 성분, 요소 또는 부분의 전체 기재가 아님을 나타내기 위해 사용된다. 본원에서 사용된 바와 같은 다른 용어는 이의 당분야에서 널리 알려진 의미에 의해 정의되는 것임을 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환적으로 사용된다. 이들은 데옥시리보뉴엘레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이의 유사체인, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고, 알려지거나 알려지지 않은, 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 결합 분석으로부터 정의된 유전자위들(유전자위), 엑손, 인 아이언(in Iron), 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은-헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분기형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은, 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지화 성분과의 접합에 의한 것과 같이, 중합 후 추가 변형될 수 있다.
용어 "뉴클레오티드 유사체" 또는 "변형된 뉴클레오티드"는 뉴클레오시드(예로, 시토신(C), 티민(T) 또는 우라실(U), 아데닌(A) 또는 구아닌(G))의 질소성 염기 내에 또는 상에, 뉴클레오시드의 당 모이어티(예로, 리보스, 데옥시리보스, 변형된 리보스, 변형된 데옥시리보스, 6-원 당 유사체, 또는 개방쇄 당 유사체), 또는 포스페이트 내에 또는 상에, 하나 이상의 화학적 변형(예로, 치환)을 함유하는 뉴클레오티드를 나타낸다. 본원에서 기재되는 각각의 RNA 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 하기 뉴클레오티드 식별자가 언급되는 뉴클레오티드 염기(들)를 나타내기 위해 사용된다:
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "표적화 서열" 또는 "표적화 분자"는 특이적 표적 서열에 혼성화할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 분자를 나타내며, 예로, 표적화 서열은 표적화 서열의 길이에 따라 표적화되는 서열과 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 표적화 서열 또는 표적화 분자는 CRISPR 복합체의 표적화 부분으로 작용하는 표적화 서열을 갖는 CRISPR 뉴클레아제와 복합체를 형성할 수 있는 표적화 RNA 분자의 일부일 수 있다. 표적화 서열을 갖는 분자가 CRISPR 분자와 동시간대에 존재하는 경우, RNA 분자는 특정 표적 서열로 CRISPR 뉴클레아제를 표적화할 수 있다. 각각의 가능성은 별도 구현예를 나타낸다. 표적화 RNA 분자는 임의의 요망되는 서열을 표적화하도록 맞춤 설계될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "표적화하다"는 표적화되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산과 표적화 서열 또는 표적화 분자의 우선적 혼성화를 나타낸다. 용어 "표적화하다"는 표적화되는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산의 우선적 표적화가 존재하지만, 온-표적 혼성화에 부가하여 비의도적인 오프-표적 혼성화가 또한 일어날 수 있는, 가변적인 혼성화 효율을 포괄함이 이해된다. RNA 분자가 서열을 표적화하는 경우, RNA 분자 및 CRISPR 뉴클레아제 분자의 복합체가 뉴클레아제 활성에 대한 서열을 표적화함이 이해된다.
복수의 세포에 존재하는 DNA 서열을 표적화하는 맥락에서, 표적화는 하나 이상의 세포 내 서열과 RNA 분자의 가이드 서열 부분의 혼성화를 포괄하며, 또한 복수의 세포에서 모든 세포보다 적은 세포 내 표적 서열과 RNA 분자의 혼성화를 포괄하는 것으로 이해된다. 따라서, RNA 분자가 복수의 세포 내 서열을 표적화하는 경우, RNA 분자 및 CRISPR 뉴클레아제의 복합체는 하나 이상의 세포 내 표적 서열과 혼성화하는 것으로 이해되며, 또한 모든 세포보다 적은 세포 내 표적 서열과 혼성화할 수 있는 것으로 이해된다. 따라서, RNA 분자 및 CRISPR 뉴클레아제의 복합체는 하나 이상의 세포 내 표적 서열과의 혼성화에 관해 이중 가닥 절단을 도입하며 또한 모든 세포보다 적은 세포 내 표적 서열과의 혼성화에 관해 이중 가닥 절단을 도입할 수 있는 것으로 이해된다. 본원에서 사용되는 용어 "변형된 세포"는 이중 가닥 절단이 표적 서열과의 혼성화, 즉 온-표적 혼성화의 결과로서 RNA 분자 및 CRISPR 뉴클레아제의 복합체에 의해 영향받는 세포를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "야생형"은 당업자에 의해 이해되는 당분야의 용어이며 이것이 돌연변이체 또는 변이체 형태와 구별되어 자연에서 발생하는 바와 같은 유기체, 균주, 유전자 또는 특징의 전형적 형태를 의미한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 또는 뉴클레오티드의 서열이 야생형 서열을 나타내는 경우, 변이체는, 예로, 치환, 결실, 삽입을 포함하는, 그 서열의 변이체를 나타낸다. 본 발명의 구현예에서, 조작된 CRISPR 뉴클레아제는 표 1에 나타낸 임의의 CRISPR 뉴클레아제의 CRISPR 뉴클레아제에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형(예로, 치환, 결실, 및/또는 삽입)을 포함하는 변이체 CRISPR 뉴클레아제이다.
용어 "비-자연 발생" 또는 "조작된"은 상호 교환적으로 사용되며 인간 조작을 시사한다. 이 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 나타내는 경우, 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 이들이 자연적으로 연관되고 자연에서 확인되는 바와 같은 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없음을 의미할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산"에는 글리신 및 D 또는 I 둘 다의, 광학 이성질체, 및 아미노산 유사체 및 펩티드모사체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "게놈 DNA"는 관심 세포 또는 세포들에 존재하는 선형 및/또는 염색체 DNA 및/또는 플라스미드 또는 다른 염색체외 DNA 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 관심 세포는 진핵 세포이다. 일부 구현예에서, 관심 세포는 원핵 세포이다. 일부 구현예에서, 방법은 게놈 DNA 서열 내의 사전-결정된 표적 부위에서 이중-가닥 절단(DSB)을 생성하여, 게놈 내 표적 부위(들)에서 DNA 서열의 돌연변이, 삽입, 및/또는 결실을 초래한다.
"진핵" 세포에는 비제한적으로 진균 세포(예컨대 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유류 세포 및 인간 세포가 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "뉴클레아제"는 핵산의 뉴클레오티드 서브유닛 간 포스포디에스테르 결합을 절단할 수 있는 효소를 나타낸다. 뉴클레아제는 천연 원천으로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 천연 원천은 임의의 살아있는 유기체일 수 있다. 대안적으로, 뉴클레아제는 포스포디에스테르 결합 절단 활성을 보유하는 변형된 또는 합성 단백질일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "PAM"은 표적화된 DNA 서열의 인근에 위치하며 CRISPR 뉴클레아제에 의해 인식되는 표적 DNA의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. PAM 서열은 뉴클레아제 정체에 따라 상이할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "돌연변이 장애" 또는 "돌연변이 질환"은 돌연변이에 의해 유도되는 유전자의 기능이상에 관련되는 임의의 장애 또는 질환을 나타낸다. 돌연변이 장애로 발현되는 기능이상 유전자는 그 대립유전자 중 적어도 하나에 돌연변이를 함유하며 "질환-연관 유전자"로 나타낸다. 돌연변이는 질환-연관 유전자의 임의의 부분에, 예를 들어, 조절, 코딩, 또는 비-코딩 부분에 있을 수 있다. 돌연변이는 치환, 삽입, 또는 결실과 같은 임의의 클래스의 돌연변이일 수 있다. 질환-연관 유전자의 돌연변이는 열성, 우성 음성, 기능-획득, 기능-상실, 또는 유전자 산물의 홑배수체부족을 야기하는 돌연변이와 같은 임의의 유형의 돌연변이의 기전에 따라 장애 또는 질환으로 발현될 수 있다.
당업자는 본 발명의 구현예가 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 옆의 관심 표적 게놈 DNA 서열과 연합하기 위해서와 같이, 뉴클레아제, 예로 CRISPR 뉴클레아제와 복합체화할 수 있는 RNA 분자를 개시함을 이해할 것이다. 이어서 뉴클레아제는 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에서 이중-가닥 절단을 생성한다.
본 발명의 구현예에서, CRISPR 뉴클레아제 및 표적화 분자는 표적 DNA 서열에 결합하여 표적 DNA 서열의 절단을 실시하는 CRISPR 복합체를 형성한다. CRISPR 뉴클레아제는 추가적인, 별도의 tracrRNA 분자 없이, CRISPR 뉴클레아제 및 RNA 분자를 포함하는 CRISPR 복합체를 형성할 수 있다. 대안적으로, CRISPR 뉴클레아제는 CRISPR 뉴클레아제, RNA 분자, 및 tracrRNA 분자 간에 CRISPR 복합체를 형성할 수 있다.
용어 "단백질 결합 서열" 또는 "뉴클레아제 결합 서열"은 CRISPR 뉴클레아제와 결합하여 CRISPR 복합체를 형성할 수 있는 서열을 나타낸다. 당업자는 CRISPR 뉴클레아제와 결합하여 CRISPR 복합체를 형성할 수 있는 tracrRNA가 단백질 또는 뉴클레아제 결합 서열을 포함함을 이해할 것이다.
CRISPR 뉴클레아제의 "RNA 결합 부분"은 RNA 분자에 결합하여 CRISPR 복합체를 형성할 수 있는 CRISPR 뉴클레아제의 부분, 예로 tracrRNA 분자의 뉴클레아제 결합 서열을 나타낸다. CRISPR 뉴클레아제의 "활성 부분" 또는 "활성이 있는 부분"은 DNA 분자에서, 예를 들어 DNA-표적화 RNA 분자와의 복합체로 있는 경우, 이중 가닥 절단을 실시하는 CRISPR 뉴클레아제의 부분을 나타낸다.
RNA 분자는 염기쌍 형성을 통해 tracrRNA와 혼성화하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기 위해 tracrRNA 분자와 충분히 상보적인 서열을 포함할 수 있다(U.S. 특허 번호 8,906,616 참고). 본 발명의 구현예에서, RNA 분자는 tracr 메이트(mate) 서열을 갖는 부분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 표적화 분자는 tracrRNA 분자의 서열을 추가로 포함할 수 있다. 이러한 구현예는 함께 단일 가이드 RNA(sgRNA)를 형성하는, RNA 분자의 가이드 부분(gRNA 또는 crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)의 합성 융합물로서 설계될 수 있다(Jinek 등, Science (2012) 참고). 본 발명의 구현예는 또한 별도의 tracrRNA 분자 및 가이드 서열 부분을 포함하는 별도의 RNA 분자를 이용하여 CRISPR 복합체를 형성할 수 있다. 이러한 구현예에서 tracrRNA 분자는 염기쌍 형성을 통해 RNA 분자와 혼성화할 수 있고 본원에서 기재되는 본 발명의 특정 적용에서 유리할 수 있다.
본 발명의 구현예에서 RNA 분자는 RNA 분자의 구조를 추가 정의할 수 있는 "교통반점(nexus)" 영역 및/또는 "헤어핀" 영역을 포함할 수 있다(Briner 등, Molecular Cell (2014) 참고).
본원에서 사용되는 용어 "직접 반복 서열"은 뉴클레오티드 서열의 특정 아미노산 서열의 2개 이상의 반복을 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, CRISPR 뉴클레아제"와 상호작용" 또는 "에 결합"할 수 있는 RNA 서열 또는 분자는 RNA 서열 또는 분자가 CRISPR 뉴클레아제와 CRISPR 복합체를 형성하는 능력을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "작동 가능하게 연결된"은 이의 의도되는 방식으로 기능하도록 허용하는 2개의 서열 또는 분자 간 관계(즉, 융합, 혼성화)를 나타낸다. 본 발명의 구현예에서, RNA 분자가 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 경우, RNA 분자 및 프로모터는 둘 다 이의 의도되는 방식으로 기능하는 것이 허용된다.
본원에서 사용되는 용어 "이종성 프로모터"는 촉진되는 분자 또는 경로와 함께 자연 발생하지 않는 프로모터를 나타낸다.
본원에서 사용된 바와 같이, 서열 또는 분자는 분자의 서열 간 X%의 염기 또는 아미노산이 동일하고 동일한 상대 위치에 있는 경우, 또 다른 서열 또는 분자와 X% "서열 동일성"을 갖는다. 예를 들어, 제2 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 제1 뉴클레오티드 서열은 동일한 상대 위치에서, 다른 서열과 동일한, 적어도 95%의 염기를 가질 것이다.
핵 편재 서열
용어 "핵 편재 서열" 및 "NLS"는 이것이 핵막 장벽을 통해 세포의 세포질로부터 연관되는 단백질의 수송을 유도하는 아미노산 서열/펩티드를 나타내기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 용어 "NLS"는 특정 펩티드의 핵 편재 서열뿐만 아니라 핵막 장벽을 통해 세포질 폴리펩티드의 전위를 유도할 수 있는 이의 유도체를 포괄하려는 것이다. NLS는 폴리펩티드의 N-말단, C-말단, 또는 N- 및 C-말단 둘 다에 부착되는 경우, 폴리펩티드의 핵 전위를 유도할 수 있다. 또한, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 따라 무작위 배치된 아미노산 측쇄에 대해 그 N- 또는 C-말단에 의해 커플링된 NLS를 갖는 폴리펩티드가 전위될 것이다. 전형적으로, NLS는 단백질 표면 상에 노출된 양으로 하전된 라이신 또는 아르기닌의 하나 이상의 짧은 서열로 구성되지만, 다른 유형의 NLS도 알려져 있다. NLS의 비제한적 예에는 하기로부터 유래되는 NLS 서열이 포함된다: SV40 바이러스 큰 T-항원, 핵플라스민(nucleoplasmin), c-myc, hRNPAl M9 NLS, 임포틴(importin)-알파로부터의 IBB 도메인, 근종 T 단백질, 인간 p53, 마우스 c-abl IV, 인플루엔자 vims NS1, 간염 바이러스 델타 항원, 마우스 Mx1 단백질, 인간 폴리(ADP-리보스) 폴리머라제, 및 스테로이드 호르몬 수용체 (인간)글루코코르티코이드. 이러한 NLS 서열은 서열번호: 69~84로 기재된다.
전달
본원에서 기재되는 CRISPR 뉴클레아제 또는 CRISPR 조성물은 단백질, DNA 분자, RNA 분자, 리보핵단백질(RNP), 핵산 벡터, 또는 이의 임의의 조합으로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA 분자는 화학적 변형을 포함한다. 적합한 화학적 변형의 비제한적 예에는 2'-0-메틸(M), 2'-0-에틸, 3'포스포로티오에이트(MS) 또는 2'-0-메틸, 3 '티오PACE(MSP), 슈도유리딘, 및 1-메틸 슈도-유리딘이 포함된다. 각각의 가능성은 본 발명의 별도 구현예를 나타낸다.
본원에서 기재되는 CRISPR 뉴클레아제 및/또는 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 선택적으로 추가적인 단백질(예로, ZFP, TALEN, 전사 인자, 제한 효소) 및/또는 가이드 RNA와 같은 뉴클레오티드 분자는 임의의 적합한 수단에 의해 표적 세포로 전달될 수 있다. 표적 세포는 임의의 환경에서의, 예로 단리되거나 단리되지 않은, 배양 중에 유지된, 시험관내, 생체외, 생체내 또는 식물내, 임의의 유형의 세포, 예로, 진핵 또는 원핵 세포일 수 있다.
일부 구현예에서, 전달될 조성물에는 뉴클레아제의 mRNA 및 가이드의 RNA가 포함된다. 일부 구현예에서, 전달될 조성물에는 뉴클레아제의 mRNA, 가이드의 RNA 및 공여체 주형이 포함된다. 일부 구현예에서, 전달될 조성물에는 CRISPR 뉴클레아제 및 가이드 RNA가 포함된다. 일부 구현예에서, 전달될 조성물에는 CRISPR 뉴클레아제, 가이드 RNA 및 예를 들어, 상동성 유도 복구를 통한 유전자 편집을 위한 공여체 주형이 포함된다. 일부 구현예에서, 전달될 조성물에는 뉴클레아제의 mRNA, DNA-표적화 RNA 및 tracrRNA가 포함된다. 일부 구현예에서, 전달될 조성물에는 뉴클레아제의 mRNA, DNA-표적화 RNA 및 tracrRNA 그리고 공여체 주형이 포함된다. 일부 구현예에서, 전달될 조성물에는 CRISPR 뉴클레아제 DNA-표적화 RNA 및 tracrRNA가 포함된다. 일부 구현예에서, 전달될 조성물에는 CRISPR 뉴클레아제, DNA-표적화 RNA 및 tracrRNA 그리고 예를 들어, 상동성 유도 복구를 통한 유전자 편집을 위한 공여체 주형이 포함된다.
임의의 적합한 바이러스 벡터 시스템이 RNA 조성물을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 통상적인 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법이 세포(예로, 포유류 세포, 식물 세포 등) 및 표적 조직에 핵산 및/또는 CRISPR 뉴클레아제를 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 시험관내 세포에 인코딩 핵산 및/또는 CRISPR 뉴클레아제 단백질을 투여하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산 및/또는 CRISPR 뉴클레아제는 생체내 또는 생체외 유전자 치료법 용도를 위해 투여된다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템에는 네이키드 핵산, 및 리포좀 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산이 포함된다. 유전자 치료법 절차의 검토를 위해, 문헌(Anderson, Science (1992); Nabel and Felgner, TIBTECH (1993); Mitani and Caskey, TIBTECH (1993); Dillon, TIBTECH (1993); Miller, Nature (1992); Van Brunt, Biotechnology (1988); Vigne 등, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer and Perricaudet, British Medical Bulletin (1995); Haddada 등, Current Topics in Microbiology and Immunology (1995); 및 Yu 등, Gene Therapy 1:13-26 (1994))을 참고한다.
핵산 및/또는 단백질의 비-바이러스 전달 방법에는 전기천공, 지질감염, 마이크로주입, 바이올리스틱(biolistics), 입자 총 가속화, 바이로좀, 리포좀, 면역리포좀, 다중양이온 또는 지질:핵산 콘주게이트, 인공 비리온, 및 핵산의 제제-증강 흡수가 포함되거나 박테리아 또는 바이러스(예로, 아그로박테리움(Agrobacterium), 리조비움 종(Rhizobium sp.) NGR234, 시노리조보이움멜리로티(Sinorhizoboiummeliloti), 메조리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 담배 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 컬리플라워 모자이크 바이러스 및 카싸바 베인 모자이크 바이러스에 의해 식물 세포로 전달될 수 있다. 예로, 문헌(Chung 등 Trends Plant Sci. (2006))을 참고한다. 예로, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용하는 초음파천공이 또한 핵산의 전달을 위해 사용될 수 있다. 단백질 및/또는 핵산의 양이온성-지질 매개 전달이 또한 생체내 또는 시험관내 전달 방법으로서 고려된다. 문헌(Zuris 등, Nat. Biotechnol. (2015) , Coelho 등, N. Engl. J. Med. (2013); Judge 등, Mol. Ther. (2006); 및 Basha 등, Mol. Ther. (2011))을 참고한다.
추가적인 예시적 핵산 전달 시스템에는 Amaxa® Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Md.), BTX Molecular Delivery Systems(Holliston, Mass.) 및 Copernicus Therapeutics Inc.,(예를 들어 U.S. 특허 번호 6,008,336 참고)에 의해 제공되는 것들이 포함된다. 지질감염은 예로, U.S. 특허 번호 5,049,386, U.S. 특허 번호 4,946,787; 및 U.S. 특허 번호 4,897,355)에 기재되어 있으며 지질감염 시약은 상업적으로 판매된다(예로, Transfectam.TM., Lipofectin.TM. 및 Lipofectamine.TM. RNAiMAX). 폴리뉴클레오티드의 효율적인 수용체-인식 지질감염에 적합한 양이온성 및 중성 지질에는 PCT 국제 공개 번호 WO/1991/017424 및 WO/1991/016024에 개시된 것들이 포함된다. 전달은 세포(생체외 투여) 또는 표적 조직(생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하는, 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 잘 알려져 있다(예로, Crystal, Science (1995); Blaese 등, Cancer Gene Ther. (1995); Behr 등, Bioconjugate Chem. (1994); Remy 등, Bioconjugate Chem. (1994); Gao and Huang, Gene Therapy (1995); Ahmad and Allen, Cancer Res., (1992); U.S. 특허 번호 4,186,183; 4,217,344; 4,235,871; 4,261,975; 4,485,054; 4,501,728; 4,774,085; 4,837,028; 및 4,946,787 참고).
추가적인 전달 방법에는 EnGeneIC 전달 비히클(EDV) 내로 전달될 핵산 패키징의 사용이 포함된다. 이들 EDV는 이중특이적 항체를 사용하여 표적 조직으로 특이적으로 전달되며 여기서 항체의 하나의 아암(arm)은 표적 조직에 대한 특이성을 가지며 다른 아암은 EDV에 대한 특이성을 갖는다. 항체는 EDV를 표적 세포 표면으로 가져간 후 EDV가 세포내이입에 의해 세포 내로 들어간다. 일단 세포 안에 들어가면, 내용물이 방출된다(MacDiamid 등, Nature Biotechnology (2009) 참고).
핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용은 신체내 특정 세포로의 바이러스 표적화 및 핵으로의 바이러스 페이로드 수송을 위해 고도로 진화된 공정의 장점을 취한다. 바이러스 벡터는 환자에 직접 투여될 수 있거나(생체내) 이들은 시험관내 세포를 처리하기 위해 사용될 수 있고 변형된 세포가 환자에 투여된다(셍채외). 핵산의 전달을 위한 통상적인 바이러스 기반 시스템에는 비제한적으로 유전자 전달을 위한 재조합 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관, 백시니아 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터가 포함된다. 그러나, RNA 바이러스가 본원에서 기재되는 RNA 조성물의 전달을 위해 바람직하다. 추가적으로, 높은 형질도입 효율이 여러 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관찰되었다. 본 발명의 핵산은 비-통합 렌티바이러스에 의해 전달될 수 있다. 선택적으로, 렌티바이러스를 이용한 RNA 전달이 이용된다. 선택적으로 렌티바이러스에는 뉴클레아제의 mRNA, 가이드의 RNA가 포함된다. 선택적으로 렌티바이러스에는 뉴클레아제의 mRNA, 가이드의 RNA 및 공여체 주형이 포함된다. 선택적으로, 렌티바이러스에는 뉴클레아제 단백질, 가이드 RNA가 포함된다. 선택적으로, 렌티바이러스에는 뉴클레아제 단백질, 가이드 RNA 및/또는 예를 들어, 상동성 유도 복구를 통한 유전자 편집을 위한 공여체 주형이 포함된다. 선택적으로 렌티바이러스에는 뉴클레아제의 mRNA, DNA-표적화 RNA, 및 tracrRNA가 포함된다. 선택적으로 렌티바이러스에는 뉴클레아제의 mRNA, DNA-표적화 RNA, 및 tracrRNA, 그리고 공여체 주형이 포함된다. 선택적으로, 렌티바이러스에는 뉴클레아제 단백질, DNA-표적화 RNA, 및 tracrRNA가 포함된다. 선택적으로, 렌티바이러스에는 뉴클레아제 단백질, DNA-표적화 RNA, 및 tracrRNA, 그리고 예를 들어, 상동성 유도 복구를 통한 유전자 편집을 위한 공여체 주형이 포함된다.
상기 언급된 바와 같이, 본원에서 기재되는 조성물은 비-통합 렌티바이러스 입자 방법, 예로 LentiFlash® 시스템을 사용하여 표적 세포로 전달될 수 있다. 이러한 방법은 표적 세포로의 RNA의 전달이 표적 세포 내부에서 본원에서 기재되는 조성물의 어셈블리를 초래하도록, 표적 세포 내로 mRNA 또는 다른 유형의 RNA를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 또한 PCT 국제 공개 번호 WO2013/014537, WO2014/016690, WO2016185125, WO2017194902, 및 WO2017194903을 참고한다.
레트로바이러스의 친화성은 외래 외피 단백질을 포함시킴으로써 변경되어, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확장시킬 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입시키거나 감염시킬 수 있는 레트로바이러스 벡터이며 전형적으로 높은 바이러스 역가를 생산한다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6~10 kb의 외래 서열에 대한 패키징능을 갖는 시스-작용 장형 말단 반복체로 이루어진다. 최소 시스-작용 LTR이 벡터의 복제 및 패키징을 위해 충분하며, 이어서 이는 표적 세포 내로 치료 유전자를 통합시켜 영구적인 트랜스유전자 발현을 제공하기 위해 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터에는 쥣과 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이의 조합에 기반한 것들이 포함된다(예로, Buchscher Panganiban, J. Virol. (1992); Johann 등, J. Virol. (1992); Sommerfelt 등, Virol. (1990); Wilson 등, J. Virol. (1989); Miller 등, J. Virol. (1991); PCT 국제 공개 번호 WO/1994/026877A1 참고).
적어도 6개의 바이러스 벡터 접근이 현재 임상 시험에서 유전자 전달을 위해 이용 가능하며, 이는 형질도입 제제를 생성하기 위해 헬퍼 세포주 내로 삽입된 유전자에 의한 결함 벡터의 보완이 연루되는 접근을 이용한다.
pLASN 및 MFG-S는 임상 시험에서 사용된 레트로바이러스 벡터의 예들이다(Dunbar 등, Blood (1995); Kohn 등, Nat. Med. (1995); Malech 등, PNAS (1997)). PA317/pLASN은 유전자 치료법 시험에서 사용된 최초의 치료 벡터였다(Blaese 등, Science (1995)). 50% 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키징된 벡터에서 관찰되었다(Ellem 등, Immunol Immunother. (1997); Dranoff 등, Hum. Gene Ther. (1997).
패키징 세포는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하기 위해 사용된다. 이러한 세포에는 아데노바이러스, AAV를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 psi.2 세포 또는 PA317 세포가 포함된다. 유전자 치료법에서 사용되는 바이러스 벡터는 보통 바이러스 입자 내로 핵산 벡터를 패키징하는 생산체 세포주에 의해 생성된다. 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 내로의 후속 통합(적용 가능한 경우)을 위해 요구되는 최소 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 인코딩하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 누락된 바이러스 기능은 패키징 세포주에 의해 트랜스로 공급된다. 예를 들어, 유전자 치료법에서 사용되는 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 게놈 내로의 통합을 위해 요구되는 AAV 게놈으로부터의 역방위 말단 반복체(ITR) 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 세포주에서 패키징되며, 이는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap을 인코딩하지만, ITR 서열은 없는 헬퍼 플라스미드를 함유한다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 벡터의 복제 및 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 부재로 인해 유의미한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스로의 오염은, 예로, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다. 추가적으로, AAV는 배큘로바이러스 시스템을 사용하여 임상 규모로 생산될 수 있다(U.S. 특허 번호 7,479,554 참고).
여러 유전자 치료법 적용에서, 유전자 치료법 벡터는 특정 조직 유형으로 고도의 특이성을 가지고 전달되는 것이 요망된다. 따라서, 바이러스 벡터는 리간드를 바이러스의 외부 표면 상의 바이러스 피막 단백질과의 융합 단백질로 발현함으로써 주어진 세포 유형에 대해 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 리간드는 관심 세포 유형의 세포 상에 존재하는 것으로 알려진 수용체에 대해 친화도를 갖도록 선택된다. 예를 들어, 문헌(Han 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995))에서는 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 인간 heregulin을 발현하도록 변형될 수 있고, 재조합 바이러스가 인간 표피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정 인간 유방암 세포를 감염시킨다는 것을 보고하였다. 상기 원리는 다른 바이러스-표적 세포 페어로 연장될 수 있고, 여기서 표적 세포는 수용체를 발현하고 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 예를 들어, 필라멘트성 파지는 실질적으로 모든 선택된 세포성 수용체에 대해 특이적 결합 친화도를 갖는 항체 단편(예로, FAB 또는 Fv)을 디스플레이하도록 조작될 수 있다. 상기 기재는 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리가 비-바이러스 벡터에 적용될 수 있다. 이러한 벡터는 특정 표적 세포에 의한 섭취를 선호하는 특정 섭취 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.
유전자 치료법 벡터는 후술되는 바와 같이, 전형적으로 전신 투여(예로, 정맥내, 복강내, 근육내, 진피하, 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해, 개별 환자에 대한 투여에 의해 생체내 전달될 수 있다. 대안적으로, 벡터는 개별 환자로부터 외식된 세포(예로, 림프구, 골수 흡입물, 조직 생검)와 같은 생체외 세포 또는 범용 공여체 조혈 줄기 세포로 전달되고, 보통 벡터를 포함한 세포에 대한 선택 후에, 환자 내로의 세포의 재임플란트가 뒤따를 수 있다. 일부 구현예에서, 생체내 및 생체외 mRNA의 전달, 및 RNP 전달이 이용될 수 있다.
진단, 연구, 또는 유전자 치료법을 위한 생체외 세포 전달감염(예로, 숙주 유기체 내로의 전달감염된 세포의 재-주입을 통한)은 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직한 구현예에서, 세포는 대상 유기체로부터 단리되고, RNA 조성물로 전달감염되고, 대상 유기체(예로, 환자) 내로 다시 재-주입된다. 생체외 전달감염에 적합한 다양한 세포 유형은 당업자에게 잘 알려져 있다(예로, 환자로부터 세포를 어떻게 단리하고 배양하는지의 논의에 대해, Freshney, "Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (6th edition, 2010)) 및 여기서 인용된 참고문헌 참고).
적합한 세포에는 비제한적으로 진핵 및 원핵 세포 및/또는 세포주가 포함된다. 이러한 세포 또는 이러한 세포로부터 생성된 세포주의 비제한적 예에는 COS, CHO(예로, CHO--S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NSO, SP2/0-g14, HeLa, HEK293(예로, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포, 임의의 식물 세포(분화 또는 미분화)뿐만 아니라 스포돕테라푸기페르다(Spodopterafugiperda(Sf))와 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia) 및 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)와 같은 진균 세포가 포함된다. 특정 구현예에서, 세포주는 CHO-K1, MDCK 또는 HEK293 세포주이다. 추가적으로, 일차 세포가 단리되고 뉴클레아제(예로 ZFN 또는 TALEN) 또는 뉴클레아제 시스템(예로 CRISPR)으로의 처리 후 치료받을 대상체 내로의 재도입을 위해 생체외 사용될 수 있다. 적합한 일차 세포에는 말초혈 단핵 세포(PBMC), 및 비제한적으로 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포와 같은 다른 혈액 세포 하위세트가 포함된다. 적합한 세포에는 또한 예로서, 배아 줄기 세포, 유도된 다능성 줄기 세포, 조혈 줄기 세포(CD34+), 신경세포 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포와 같은 줄기 세포가 포함된다.
하나의 구현예에서, 줄기 세포는 세포 전달감염 및 유전자 치료법을 위한 생체외 절차에서 사용된다. 줄기 세포를 사용하는 장점은 이들이 시험관내 다른 세포 유형으로 분화될 수 있거나 이들이 골수에 이식될 포유류(예컨대 세포의 공여체) 내로 도입될 수 있다는 것이다. 시험관내 CD34+ 세포를 GM-CSF, IFN-감마 및 TNF-알파와 같은 사이토카인을 사용하여 임상적으로 중요한 면역 세포 유형으로 분화시키는 방법이 알려져 있다(비제한적 예로서, Inaba 등, J. Exp. Med. (1992) 참고).
줄기 세포는 알려진 방법을 사용하여 형질도입 및 분화를 위해 단리된다. 예를 들어, 줄기 세포는 CD4+ 및 CD8+(T 세포), CD45+(범 B 세포), GR-1(과립구), 및 Iad(분화 항원 제시 세포)와 같이, 원치 않는 세포에 결합하는 항체로 골수 세포를 팬닝함으로써 골수 세포로부터 단리된다(비제한적 예로서, Inaba 등, J. Exp. Med. (1992) 참고). 변형된 줄기 세포가 또한 일부 구현예에서 사용될 수 있다.
특히, 본원에서 기재되는 CRISPR 뉴클레아제는 유사분열-후 세포 또는 활발히 분열 중이 아닌 임의의 세포, 예로, 정지된 세포에서 게놈 편집에 적합할 수 있다. 본 발명의 CRISPR 뉴클레아제를 사용하여 편집될 수 있는 유사분열-후 세포의 예에는 비제한적으로 근육세포, 심근세포, 간세포, 골세포 및 신경세포가 포함된다.
치료 RNA 조성물을 함유하는 벡터(예로, 레트로바이러스, 리포좀 등)가 또한 생체내 세포의 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 대안적으로, 네이키드 RNA 또는 mRNA가 투여될 수 있다. 투여는 비제한적으로 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하는, 분자를 혈액 또는 조직 세포와의 궁극적 접촉으로 도입하기 위해 보통 사용되는 임의의 경로에 의한다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법이 이용 가능하며 당업자에게 잘 알려져 있고, 특정 조성물을 투여하기 위해 하나를 초과하는 경로가 사용될 수 있지만, 특정 경로가 종종 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
면역 세포(예로, T-세포) 내로의 트랜스유전자의 도입에 적합한 벡터에는 비-통합 렌티바이러스 벡터가 포함된다. 예를 들어, U.S. 특허 공개 번호 2009/0117617을 참고한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 부분적으로 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 후술되는 바와 같이, 약학 조성물의 매우 다양한 적합한 제형물이 이용 가능하다(예로, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참고).
상동 재조합에 의한 DNA 복구
용어 "상동성-유도 복구" 또는 "HDR"은, 예를 들어, DNA에서 이중-가닥 및 단일-가닥 절단의 복구 동안, 세포 내 복구 DNA 손상의 복구를 위한 기전을 나타낸다. HDR은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하며 이중-가닥 또는 단일 절단이 일어난 서열(예로, DNA 표적 서열)을 복구하기 위해 "핵산 주형"을 사용한다(핵산 주형 또는 공여체 주형이 본원에서 상호 교환적으로 사용됨). 이는, 예를 들어, 핵산 주형으로부터 DNA 표적 서열로의 유전 정보의 전달을 초래한다. HDR은 핵산 주형 서열이 DNA 표적 서열과 상이하고 핵산 주형 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 일부 또는 전부가 DNA 표적 서열 내로 포함되는 경우, DNA 표적 서열의 변경(예로, 삽입, 결실, 돌연변이)을 초래할 수 있다. 일부 구현예에서, 전체 핵산 주형 폴리뉴클레오티드, 핵산 주형 폴리뉴클레오티드의 일부, 또는 핵산 주형의 카피가 DNA 표적 서열 부위에서 통합된다.
용어 "핵산 주형" 및 "공여체"는 게놈 내로 삽입되거나 카피되는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 핵산 주형은 예로, 하나 이상의 뉴클레오티드의, 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 표적 핵산에서 주형에 부가될 것이거나 변화의 주형이 될 것이거나 표적 서열을 변형하기 위해 사용될 수 있다. 핵산 주형 서열은 임의의 길이, 예를 들어 2 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이(또는 그 사이 또는 초과의 임의의 정수 값), 바람직하게는 약 100 내지 1,000개 뉴클레오티드 길이(또는 그 사이의 임의의 정수), 보다 바람직하게는 약 200 내지 500개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 핵산 주형은 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산일 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 주형은 예로, 하나 이상의 뉴클레오티드의, 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 표적 핵산, 예로, 표적 위치의 야생형 서열에 대응한다. 일부 구현예에서, 핵산 주형은 예로, 하나 이상의 리보뉴클레오티드의, 리보뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이는 표적 핵산, 예로, 표적 위치의 야생형 서열에 대응한다. 일부 구현예에서, 핵산 주형은 변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다.
예를 들어, 돌연변이체 유전자의 교정을 위한 또는 야생형 유전자의 증가된 발현을 위한, 외인성 서열("공여체 서열", 공여체 주형" 또는 "공여체"로도 불림)의 삽입이 또한 수행될 수 있다. 공여체 서열이 전형적으로 이것이 배치되는 게놈 서열과 동일하지 않음은 용이하게 자명할 것이다. 공여체 서열은 관심 위치에서 효율적인 HDR을 허용하기 위해 상동성인 2개 영역이 측면에 있는 비-상동 영역을 함유할 수 있다. 추가적으로, 공여체 서열은 세포성 염색질 내 관심 영역과 상동성이 아닌 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 공여체 분자는 세포성 염색질과 상동성인 몇몇, 불연속 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보통 관심 영역에 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열은 공여체 핵산 분자에 존재하고 관심 영역 내 서열과 상동성인 영역이 측면에 있을 수 있다.
공여체 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥일 수 있고 선형 또는 원형 형태로 세포 내에 도입될 수 있다. 예로, U.S. 특허 공개 번호 2010/0047805; 2011/0281361; 2011/0207221; 및 2019/0330620을 참고한다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여체 서열의 말단은 당업자에게 알려진 방법에 의해 보호될 수 있다(예로, 핵산말단 분해로부터). 예를 들어, 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 선형 분자의 3' 말단에 부가되고/되거나 자가-상보성 올리고뉴클레오티드가 하나의 또는 양 말단으로 결찰된다. 예를 들어, 문헌(Chang and Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1987); Nehls 등, Science (1996))을 참고한다. 분해로부터 외인성 폴리뉴클레오티드를 보호하기 위한 추가적인 방법에는 비제한적으로 말단 아미노기(들)의 부가 및 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드간 결합의 사용이 포함된다.
따라서, 복구를 위해 공여체 주형을 사용하는 본 발명의 구현예는 선형 또는 원형 형태로 세포 내에 도입될 수 있는 DNA 또는 RNA, 단일-가닥 및/또는 이중-가닥 공여체 주형을 사용할 수 있다. 본 발명의 구현예에서 유전자-편집 조성물은 (1) 복구 전에 유전자에서 이중 가닥 절단에 영향을 미치기 위한 가이드 서열을 포함하는 RNA 분자 및 (2) 복구를 위한 공여체 RNA 주형을 포함하며, 가이드 서열을 포함하는 RNA 분자는 제1 RNA 분자이고 공여체 RNA 주형은 제2 RNA 분자이다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 분자 및 주형 RNA 분자는 단일 분자의 일부로서 연결된다.
공여체 서열은 또한 올리고뉴클레오티드일 수 있고 내인성 서열의 유전자 교정 또는 표적화된 변경을 위해 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 벡터 상에서 세포로 도입될 수 있거나, 세포 내로 전기천공될 수 있거나, 당분야에 알려진 다른 방법을 통해 도입될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 내인성 유전자 내의 돌연변이된 서열(예로, 베타 글로빈 내 낫(sickle) 돌연변이)을 '교정'하기 위해 사용될 수 있거나 내인성 유전자위 내로 요망되는 목적을 갖는 서열을 삽입하기 위해 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 복제 기원, 프로모터 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 공여체 폴리뉴클레오티드는 네이키드 핵산으로, 리포좀 또는 폴록사머와 같은 제제와 복합체화된 핵산으로 도입될 수 있거나, 재조합 바이러스(예로, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여체는 일반적으로 그 발현이 통합 부위에서 내인성 프로모터, 즉 공여체가 삽입되는 내인성 유전자의 발현을 유도하는 프로모터에 의해 유도되도록 삽입된다. 그러나, 공여체가 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성적 프로모터 또는 유도성 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있음이 자명할 것이다.
공여체 분자는 내인성 유전자의 전부, 일부가 발현되거나 전혀 발현되지 않도록 내인성 유전자 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기재된 바와 같은 트랜스유전자는 내인성 서열의 일부(트랜스유전자에 대해 N-말단 및/또는 C-말단)가 발현되거나 전혀 발현되지 않도록, 예를 들어 트랜스유전자와의 융합물로서, 내인성 유전자위 내로 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, 트랜스유전자(예로, 내인성 유전자와 같은 추가적인 코딩 서열을 갖거나 갖지 않음)는 임의의 내인성 유전자위, 예를 들어 세이프-하버(safe-harbor) 유전자위, 예를 들어 CCR5 유전자, CXCR4 유전자, PPP1R12c(AAVS1로도 알려짐) 유전자, 알부민 유전자 또는 Rosa 유전자 내로 통합된다. 예로, U.S. 특허 번호 7,951,925 및 8,110,379; U.S. 공개 번호 2008/0159996; 20100/0218264; 2010/0291048; 2012/0017290; 2011/0265198; 2013/0137104; 2013/0122591; 2013/0177983 및 2013/0177960 및 U.S. 가출원 번호 61/823,689를 참고한다).
내인성 서열(내인성 또는 트랜스유전자의 일부)이 트랜스유전자와 함께 발현되는 경우, 내인성 서열은 전장 서열(야생형 또는 돌연변이체) 또는 부분적 서열일 수 있다. 바람직하게는 내인성 서열은 기능적이다. 이들 전장 또는 부분적 서열의 기능의 비제한적 예에는 트랜스유전자(예로, 치료 유전자)에 의해 발현되는 폴리펩티드의 혈청 반감기 증가 및/또는 담체로서의 작용이 포함된다.
또한, 발현을 위해 요구되지는 않지만, 외인성 서열에는 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터(insulator), 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 인코딩하는 서열 및/또는 폴리아데닐화 신호가 포함될 수 있다.
특정 구현예에서, 공여체 분자는 단백질을 인코딩하는 유전자(예로, 세포에 또는 개체에 부재하는 단백질을 인코딩하는 서열 또는 단백질을 인코딩하는 유전자의 대안적 버전을 코딩함), 조절 서열 및/또는 마이크로RNA 또는 siRNA와 같은 구조적 핵산을 인코딩하는 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
상기 구현예에 있어서, 본원에서 개시되는 각각의 구현예는 각각의 다른 개시되는 구현예에 적용 가능한 것으로 고려된다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 RNA 분자 또는 조성물이 본 발명의 임의의 방법에서 이용될 수 있음이 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 모든 제목은 단순히 구성을 위한 것이며 어떠한 방식으로든 본 개시를 제한하려는 것이 아니다. 임의의 개별 섹션의 내용은 모든 섹션에 동일하게 적용 가능하다.
본 발명의 추가적인 목적, 장점, 및 신규한 특성은 하기 실시예의 조사 시 당업자에게 자명해질 것이며, 이는 제한하려는 것이 아니다. 추가적으로, 본원에서 상기 묘사된 바와 같으며 아래의 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 각각의 다양한 구현예 및 양태는 하기 실시예에서 실험적 지지를 구한다.
명확성을 위해 별도 구현예의 맥락에서 기재되는, 본 발명의 특정 특성이 또한 단일 구현예에서 조합되어 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간결성을 위해, 단일 구현예의 맥락에서 기재되는 본 발명의 다양한 특성은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 하위-조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기재된 구현예에서 적합한 바와 같이 제공될 수 있다. 다양한 구현예의 맥락에서 기재되는 특정 특성은 구현예가 이들 요소 없이 작동되지 않는 경우가 아닌 한, 이들 구현예의 필수적 특성으로 간주되어서는 안 된다.
일반적으로, 본원에서 사용되는 명명, 및 본 발명에서 이용되는 실험실 절차에는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기법이 포함된다. 이러한 기법은 문헌에서 자세히 설명되어 있다. 예를 들어, 모두 참조로 포함되는 Sambrook 등, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" (1989); Ausubel, R. M. (Ed.), "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III (1994); Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등 (Eds.), "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols.1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); U.S. 특허 번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 나타낸 방법론; Cellis, J. E. (Ed.), "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III (1994); Freshney, "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" Third Edition, Wiley-Liss, N. Y. (1994); Coligan J. E. (Ed.), "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III (1994); Stites 등 (Eds.), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (Eds.), "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); Clokie and Kropinski (Eds.), "Bacteriophage Methods and Protocols", Volume 1: Isolation, Characterization, and Interactions (2009)을 참고한다. 다른 일반 참고문헌은 본 문헌을 통해 제공된다.
본 발명의 보다 완전한 이해를 촉진하기 위해 실시예가 아래에서 제공된다. 하기 실시예는 본 발명의 제조 및 실시의 예시적 방식을 예시한다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 개시된 특정 구현예에 제한되지 않으며, 이는 단지 예시 목적을 위한 것이다.
실험 상세사항
본 발명의 보다 완전한 이해를 촉진하기 위해 실시예가 아래에 제공된다. 하기 실시예는 본 발명을 제조 및 실시의 예시적 방식을 예시한다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 개시되는 특정 구현예에 제한되지 않으며, 이는 단지 예시 목적을 위한 것이다.
CRISPR 반복체(crRNA), 트랜스활성화 crRNA(tracrRNA), 뉴클레아제 폴리펩티드, 및 PAM 서열은 환경 샘플의 상이한 메타게놈 서열 데이터베이스로부터 예측하였다. CRISPR 반복체, tracRNA 서열, 및 뉴클레아제 폴리펩티드 서열이 예측된 박테리아 종/균주를 표 1에 제공한다.
OMNI-50 뉴클레아제 폴리펩티드의 작제
OMNI-50 뉴클레아제 폴리펩티드의 작제를 위해, OMNI-50 뉴클레아제의 개방 해독틀을 인간 세포주 발현을 위해 코돈 최적화하였다. 최적화된 ORF를 박테리아 플라스미드 pb-NNC 내로 및 포유류 플라스미드 pmOMNI 내로 클로닝하였다(표 4).
sgRNA의 예측 및 작제
OMNI-50 뉴클레아제에 있어서, sgRNA를 뉴클레아제가 확인된 박테리아 게놈 내 CRISPR 반복체 어레이 서열(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(tracrRNA)의 검출에 의해 예측하였다. 천연 성숙-전 crRNA 및 tracrRNA 서열을 컴퓨터내에서 테트라-루프 'gaaa'와 연결하고 듀플렉스의 이차 구조 요소를 RNA 이차 구조 예측 도구를 사용함으로써 예측하였다.
전체 듀플렉스 RNA 요소(즉 crRNA-tracrRNA 키메라)의 예측된 이차 구조를 OMNI-50 뉴클레아제에 대해 다양한 버전을 갖는 sgRNA의 설계를 위한 가능한 tracr 서열의 확인을 위해 사용하였다(예를 들어, 도 1a 참고). 상이한 위치에서 상부 줄기부에서의 듀플렉스를 단축함으로써, crRNA 및 tracrRNA를 테트라-루프 'gaaa'와 연결함으로써, 가능한 sgRNA 스캐폴드를 생성하였다(예를 들어, 도 1b 참고; OMNI-50 sgRNA 설계를 표 2에 기재함). OMNI-50에 대해 가능한 설계된 스캐폴드의 적어도 2개 버전을 합성하고 22 nt 범용 고유 스페이서 서열(T2, 서열번호: 56)의 하류에 연결하고, 구성적 프로모터 하의 박테리아 발현 플라스미드 내로 및 U6 프로모터 하의 포유류 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다(각각 pbGuide 및 pmGuide, 표 4).
잠재적인 전사 및 구조적 제약을 극복하고 인간 세포 환경 맥락에서 sgRNA 스캐폴드의 유연성을 평가하기 위해, 몇몇 버전의 sgRNA를 시험하였다. 각각의 경우에서, 변형은 가능한 sgRNA의 뉴클레오티드 서열에서의 작은 변이를 나타낸다(도 1c, 표 2)
(서열번호: 55)
(서열번호: 56)
TXTL에 의한 시험관내 결실 검정
시험관내 PAM 서열의 결실을 Maxwell 등, Methods (2018)에 따라 추적하였다. 간략하게, T7 프로모터 하에 OMNI-50 뉴클레아제 및 sgRNA를 발현하는 선형 DNA를 T7 폴리머라제를 발현하는 선형 작제물과 함께 TXTL 혼합물(Arbor Bioscience)에 첨가하였다. TXTL 혼합물에 의한 RNA 발현 및 단백질 번역은 RNP 복합체의 형성을 초래한다. 선형 DNA를 사용하였으므로, 분해로부터 DNA를 보호하기 위해 RecBCD 억제제인 Chi6 서열을 첨가하였다. sgRNA 스페이서를 잠재적 PAM 서열의 8N 무작위화 세트가 측면에 있는 표적화 프로토스페이서를 함유하는 플라스미드 라이브러리(pbPOS T2 라이브러리, 표 4)를 표적화하도록 설계한다. 절단된 라이브러리 및 비-표적화 gRNA를 발현하는 대조군 라이브러리(T1) 모두에 대해 필요한 어댑터 및 지표를 부가하기 위해 PCR 사용 시 고처리량 서열분석에 의해 라이브러리로부터의 PAM 서열의 결실을 측정하였다. 심층 서열분석 후, 시험관내 시스템에 의한 기능적 DNA 절단을 시사하는 OMNI 뉴클레아제에 의한 대조군에서의 이의 발생 대비 동일한 PAM 서열을 갖는 결실된 서열의 분율에 의해 시험관내 활성을 확인하였다(도 2, 표 3). OMNI-50을 2개의 sgRNA 버전(V1 및 V2)으로 시험하였다. 두 경우 모두에서, 분석으로부터 NGG의 명확한 PAM이 추정되었다(도 2). 일부 활성이 또한 NAG 및 NGA PAM 서열로 관찰되었다.
포유류 시스템에서의 PAM 라이브러리
PAM 서열 선호는 뉴클레아제의 내재적 특성으로 간주되므로, 어느 정도까지는, 세포성 환경, 게놈 조성, 및 게놈 크기에 의해 영향받을 수 있다. 인간 세포성 환경은 각각의 이들 특성에 관해 박테리아 환경과 크게 상이하므로, 인간 세포성 맥락에서 PAM 선호에서의 잠재적 차이를 해결하기 위해 "미세 조정" 단계를 도입하였다. 상기 목적을 위해, PAM 라이브러리를 인간 세포주에서 작제하였다. 상기 검정에서, PAM 라이브러리를 불변 표적 서열에 이어 6N의 신장물로서 바이러스 벡터를 사용하여 세포로 도입하였다(표 4 참고). OMNI-50 및 라이브러리 불변 표적 부위를 표적화하는 sgRNA의 도입 시, NGS 분석을 사용하여 편집된 서열 및 이와 연관된 PAM을 확인하였다. 이어서 농축된 편집된 서열을 사용하여 PAM 공통부를 정의하였다. 상기 방법론을 적용하여 포유류 세포에서 OMNI-50 뉴클레아제의 최적화된 PAM 요건을 결정한다(표 3, "포유류 요건"). OMNI-50 PAM은 시험관내 TXTL에서 확인된 것과 동일한 것으로 확인되었다.
포유류 세포에서 최적화된 DNA 서열에 의해 코딩되는 OMNI-50 뉴클레아제의 발현
첫 번째로, 포유류 세포에서 OMNI-50을 인코딩하는 각각의 최적화된 DNA 서열의 발현을 검증하였다. 상기 목적을 위해, P2A 펩티드에 의해 mCherry에 연결된 HA-태그 OMNI-50 뉴클레아제 또는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus Pyogenes) Cas9(SpCas9)를 코딩하는 발현 벡터(pmOMNI, 표 4)를 Jet-optimus™ 전달감염 시약(polyplus-전달감염)을 사용하여 Hek293T 세포 내로 도입하였다. P2A 펩티드는 OMNI 뉴클레아제 및 mCherry가 발현 시 분리되도록 세포에서 재조합 단백질의 전달을 유도할 수 있는 자가-절단 펩티드이다. mCherry는 발현 벡터로부터 OMNI의 전사 효율의 표시인자로서 작용한다. OMNI-50 단백질의 발현은 항-HA 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 검정에 의해 확인하였다(도 3).
내인성 게놈 표적에 대한 인간 세포 내 활성
OMNI-50을 또한 인간 세포 내 특정 게놈 위치 상에서 편집을 촉진하는 그 능력에 대해 검정하였다. 상기 목적을 위해, OMNI-P2A-mCherry 발현 벡터(pmOMNI, 표 4)를 인간 게놈 내 특정 위치를 표적화하도록 설계된 sgRNA(pmGuide, 표 4)와 함께 HeLa 세포 내로 전달감염시켰다. 72 h째에, 세포를 수확하였다. 마커로서 mCherry 형광을 사용하여 FACS에 의해 전달감염 효율의 정량을 위해 세포의 절반을 사용하였다. 세포의 나머지 절반을 용해시키고, 이의 게놈 DNA를 사용하여 대응하는 추정 게놈 표적을 PCR 증폭시켰다. 앰플리콘으로 NGS를 거치고 생성 서열을 사용하여 각각의 표적 부위에서 편집 이벤트의 백분율을 계산하였다. 절단 부위 주위의 짧은 삽입 또는 결실(인델)은 뉴클레아제-유도 DNA 절단 후 DNA 말단 복구의 전형적인 결과이다. 편집%의 계산은 각각의 앰플리콘 내 인델-함유 서열의 분율로부터 추정하였다. 모든 편집 값을 각각의 실험에 대해 수득된 전달감염 및 번역 효율에 대해 표준화하고 mCherry 발현 세포의 백분율로부터 추정하였다. 표준화 값은 발현된 뉴클레아제의 세포 집단 내 유효 편집 수준을 나타낸다.
OMNI-50의 게놈 활성을 각각 상이한 게놈 위치를 표적화하도록 설계된 11개의 고유 sgRNA 패널을 사용하여 평가하였다. 이들 실험의 결과를 표 6에 요약한다. 표(6열, "편집%")에서 알 수 있듯이, OMNI-50은 시험된 모든 표적 부위에서 음성 대조군(9열, "음성 대조군에서의 편집%")에 비해 높고 유의미한 편집 수준을 나타낸다. OMNI-50은 시험된 11/11 부위에서 높고 유의미한 편집 수준을 나타낸다.
인간 세포에서의 내인성 정확도
뉴클레아제의 내인성 정확도는 그 절단 특이성의 측정이다. 고-정확도 뉴클레아제는 의도되지 않는 표적의("오프-표적") 최소 절단 또는 절단 부재를 가지며 의도되는 표적 상의("온-표적") 절단을 촉진하는 뉴클레아제이다. CRISPR 뉴클레아제에 있어서, 표적은 가이드 RNA의 스페이서 요소에 대한 서열 상보성에 기반하여 획득된다. 오프-표적화는 스페이서 서열 및 의도되지 않는 표적 간 유사성으로부터 초래된다. 인간 세포 내 게놈 수준에서의 OMNI-50의 내인성 정확도를 온-표적 영역 및 사전-검증된 오프-표적 영역 모두에 대한 PCR 증폭, NGS, 및 인델 분석 후, 상기 섹션에 기재된 바와 같이 활성 검정을 수행함으로써 측정하였다. OMNI-50에 대한 내인성 정확도의 측정을 도 4a에 나타낸다. 상기 예에서, OMNI-50 정확도를 독립적으로 2개의 가이드 RNA를 사용하여 측정하였고, 각각의 경우 SpCas9의 나란한 측정을 참조를 위해 제공한다. 첫 번째 부위를 chr19 상의 ELANE 유전자 상류의 정의된 온-표적 부위 및 Chr15 상의 오프-표적 부위를 갖는 ELANE g35 gRNA를 사용하여 표적화하였다(표 6). 도 4a에서 알 수 있듯이, OMNI-50에 의해 수득된 온-표적/-오프-표적 편집 효율비는 41:0인 반면 SpCas9 온/오프 비는 6.8:1이다(각각 40.9%/0%; 18.6%/2.7%). 두 번째 부위를 ELANE g62 gRNA에 의해 표적화하였다(표 6). 상기 gRNA 스페이서 서열은 chr19 상의 ELANE 유전자에 정의된 온-표적 부위 및 Chr1 상의 오프-표적 부위를 갖는다. 상기 경우에서, OMNI-50에 의해 수득된 온/오프 비는 SpCas9에 의해 수득된 1.7:1 비에 비해 72:1이었다(각각 38.9%/0.6%; 43.1%/25.8%). 이들 결과는 OMNI-50이 이들 특정 gRNA를 사용하는 SpCas9와 대조적으로 유의미하게 더 높은 내인성 정확도를 가짐을 실증한다. 내인성 정확도를 이후 U2OS 세포주 내로의 RNP 전기천공에 의해 제2 시스템에서 시험하였다(도 4b). ELANE g35에 있어서, OMNI-50에 의해 수득된 온/오프 표적 편집 효율비는 9:1이었던 반면 SpCas9 온/오프 비는 1:1이다(각각 91%/10%; 93%/91%). 이들 2개의 별도 시스템에서, OMNI-50 정확도가 SpCas9보다 우수하였다.
가이드-seq 비편향 분석 방법을 사용하는 오프-표적 평가
OMNI-50의 특이성을 추가 평가하기 위해, 오프-표적 수를 가이드-seq를 사용하여 몇몇 부위에 걸쳐 시험하였다. SpCas9에 대한 오프-표적 카운트는 수 개부터 수백 개로 부위에 걸쳐 변화한 반면, OMNI-50 오프-표적 카운트는 시험된 모든 부위에서 20개 미만이었다. SpCas9 또는 OMNI-50을 사용하여 10개 초과의 판독을 갖는 부위에 대해 확인된 오프-표적의 수 비교는 OMNI-50의 높은 특이성을 시사한다. 시험된 6개 부위 중 5개에서, SpCas9 오프-표적의 수는 OMNI-50에 비해 상당히(2 내지 20-배) 더 큰 반면, 6개 부위 중 1개에서만 오프-표적 카운트가 두 뉴클레아제 간에 필적한다(표 9).
OMNI-50 단백질의 정제
OMNI-50 개방 해독틀을 박테리아 발현 플라스미드(T7-NLS-OMNI-NLS-HA-His-태그, pET9a, 표 4) 내로 클로닝하고 C43 세포(Lucigen)에서 발현시켰다. 세포를 log상 중간까지 Terrific 배양액 중에 성장시킨 후 온도를 18℃로 낮췄다. 발현을 16~20 h 동안 1 mM IPTG로 0.6 OD에서 유도한 후 세포를 수확하고 -80℃에서 냉동하였다. 세포 페이스트를 EDTA-비함유 완전 프로테아제 억제제 칵테일 세트 III(Calbiochem)이 보충된 용해 완충액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸 pH 8.0, 1 mM TCEP) 중에 재현탁하였다. 세포를 초음파분쇄를 사용하여 용해시키고 청정화된 용해액을 Ni-NTA 수지와 인큐베이션하였다. 수지를 중력 칼럼 상으로 로딩하고, 세척 완충액(50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 50 mM 이미다졸 pH 8.0, 1 mM TCEP)으로 세척하고, OMNI-50 단백질을 100~500 mM 이미다졸이 보충된 세척 완충액으로 용출하였다. OMNI-50 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축하고, 센트리콘(Amicon Ultra 15 ml 100 K, Merck) 상으로 로딩하고, GF 완충액(50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.4 M 아르기닌)으로 완충액을 교환하였다. 농축된 OMNI-50 단백질을 50 mM 트리스-HCl pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.4 M 아르기닌으로 HiLoad 16/600 Superdex 200 pg-SEC, AKTA Pure(GE Healthcare Life Sciences) 상에서 SEC에 의해 추가 정제하였다. OMNI-50 단백질을 함유하는 분획을 풀링하고, 농축하고, 10 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 1 mM TCEP의 최종 보관 완충액으로 센트리콘(Amicon Ultra 15 ml 100 K, Merck) 상으로 로딩하였다. 정제된 OMNI-50 단백질을 10 mg/ml 원액으로 농축하고, 액체 질소 중에 급속-냉동하고, -80℃에서 보관하였다.
RNP 활성 검정에 의한 가이드 최적화
OMNI-50의 합성 sgRNA를 3' 및 5' 말단에서 3개의 2'-O-메틸 3'-포스포로티오에이트와 함께 합성하였다(Agilent). 가이드 35의 상이한 스페이서 길이(17~23 nt)를 갖는 OMNI-50 RNP의 활성 검정이 본원에서 기재된다(표 5, 도 5a). 간략하게, 4 pmol의 OMNI-50 뉴클레아제를 6 pmol의 합성 가이드와 혼합하였다. 실온에서 10분 인큐베이션 후, RNP 복합체를 100 ng의 온-표적 주형과 반응시켰다. 22 nt 이상의 스페이서만 온-표적 주형의 거의 전체 절단을 나타낸다. 스페이서 길이 20 - 23 nt를 갖는 감소량의 RNP(4, 2, 1.2, 0.6 및 0.2 pmol)를 100 ng의 DNA 표적 주형(도 5b)과 반응시켰다. 22 nt 이상인 길이의 스페이서는 더 낮은 RNP 농도에서도 더 우수한 절단 활성을 나타낸다.
스페이서 길이 최적화를 또한 포유류 세포 맥락에서 수행하였다. 100 uM 뉴클레아제를 상이한 스페이서 길이(17~23 nt, 표 5)를 갖는 120 uM의 합성 가이드 및 100 uM Cas9 전기천공 증강제(IDT)와 혼합함으로써 RNP를 어셈블리하였다. 실온에서 10분 인큐베이션 후, RNP 복합체를 200,000 사전-세척 U2OS, iPSC, 또는 HSC 세포와 혼합하고 제조업체의 프로토콜에 따라, 각각 DN100 또는 CA137 프로그램으로 Lonza SE 또는 P3 세포주 4D-Nucleofector™ X 키트를 사용하여 전기천공하였다. 72 h째에 세포를 용해시키고 이의 게놈 DNA를 PCR 반응에서 사용하여 대응하는 추정 게놈 표적을 증폭하였다. 앰플리콘으로 NGS를 거친 후 생성 서열을 사용하여 편집 이벤트의 백분율을 계산하였다. 도 5c, 도 6, 및 표 10에서 알 수 있듯이, 17~19 nt의 스페이서는 낮은 편집 수준을 나타내며, 20 nt 스페이서는 중간 편집 수준을 나타내고, 21~23 nt의 스페이서는 가장 높은 편집 수준을 나타낸다.
U2OS 세포주를 사용하여, 상이한 tracer RNA 서열 변이를 시험하였다(표 2). 상이한 sgRNA 버전을 20 nt 스페이서로 시험하였다. 도 5d에서 알 수 있듯이, sgRNA V1, V2, 또는 V3을 사용하는 RNP 어셈블리는 유사한 편집 수준을 초래한다. 그러나, sgRNA V4를 사용하는 RNP 어셈블리는 유의미하게 더 높은 편집 수준을 초래한다.
5개 게놈 부위에 걸쳐 21 nt 및 22 nt 스페이서를 사용하여 HSC에서 수득된 결과 비교는 22 nt 스페이서가 효율적인 편집을 위해 약간 선호됨을 제시한다(도 6 및 표 10).
RNP로서의 OMNI-50의 활성
포유류 세포에서 RNP로서의 OMNI-50 단백질의 활성을 먼저 U2OS 세포주에서 시험하였고, 이후 3개의 일차 세포 시스템: iPSC, HSC, 및 T 세포에서 시험하였다. 표 7에서 알 수 있듯이, 편집이 모든 시스템에서 관찰되었다.
OMNI-50을 2개 유전자 상에서 T-세포 내 편집 활성에 대해 시험하였다(별첨 표 7). OMNI-50을 TRAC를 표적화하는 34개의 가이드 및 B2M을 표적화하는 26개의 가이드로 시험하였다. 시험된 TRAC 가이드의 64%(22/34)는 활성인 것으로 확인되었으며, 편집 수준은 5% 내지 84% 범위였다. 유사하게, B2M 가이드의 57%는 활성이었고, 편집 수준은 5% 내지 61% 범위였다. 이들 결과를 별첨 표 7에 요약한다.
각각의 19개 가이드 레퍼토리에서 TRAC 및 B2M 유전자 둘 다에서 높은 편집이 관찰되었다. 멀티플렉스화 및 추가 최적화에 대한 잠재력을 고려하면, 적절한 전략으로 OMNI-50에 의한 두 유전자의 전체 녹-아웃이 가능하다.
U2OS 세포, iPSC 및 HSC에서, ELANE 유전자를 표적화하는 가이드를 OMNI-50으로 시험하였다. 시험된 모든 5개 가이드는 U2OS 세포 및 HSC 둘 다에서 22% 초과 편집을 나타내었다. iPSC에서는 ELANE g35만 53%의 편집 수준으로 시험되었다. 상기 결과는 다른 시스템으로 수득된 결과에 비해 더 낮다.
멀티플렉스화
또한 2개 RNP 집단을 혼합하고 혼합물을 일차 T 세포 내로 전기천공함으로써 OMNI-50을 멀티플렉스 편집에 대해 시험하였다. gRNA #32를 TRAC에 대해 사용하였고, gRNA #15를 B2M에 대해 사용하였다(스페이서 서열은 표 8에 기재함). 72 h째에 세포를 수확하고 NGS에 의한 편집에 대해 시험하였다. TRAC 유전자는 50% 편집으로 측정되었고 B2M 유전자는 25% 편집으로 측정되었다. 이들 결과는 멀티플렉스 시험과 나란히 수행된 단일 RNP를 이용한 편집 수준과 유사하였다(표 8).
표 1. OMNI-50 뉴클레아제 서열: 표 1은 OMNI-50 뉴클레아제가 동정된 유기체, 그 단백질 서열, 그 DNA 서열, 및 그 인간 최적화된 DNA 서열(들)을 기재한다.
*결실 스코어 - 2개의 가장 많이 결실된 부위로부터의 비의 평균
[표 4 별첨]
표 6. 포유류 세포에서 내인성 맥락에서의 뉴클레아제 활성: OMNI-50 뉴클레아제를 sgRNA 발현 플라스미드와 함께 DNA 전달감염에 의해 포유류 세포 시스템(HeLa)에서 발현하였다. 세포 용해액을 부위 특이적 게놈 DNA 증폭 및 NGS를 위해 사용하였다. 인델의 백분율을 측정하고 분석하여 편집 수준을 결정하였다. 각각의 sgRNA는 tracrRNA(표 2 참고) 및 본원에서 상세히 나타낸 스페이서로 이루어진다. 3' 게놈 스페이서 서열은 OMNI-50 뉴클레아제에 관련된 PAM을 함유한다. 전달감염 효율(전달감염%)을 상술된 바와 같이, mCherry 신호의 유세포 측정 정량에 의해 측정하였다. 전달감염 효율을 사용하여 편집 수준을 표준화하였다(표준화 인델%). 모든 시험은 3회씩 수행하였다. OMNI 뉴클레아제만(즉, 가이드 없이) 전달감염된 세포가 음성 대조군으로 작용하였다.
표 7. RNP로서의 OMNI-50 활성: OMNI-50 RNP를 합성 sgRNA(Agilent)와 어셈블리하고 세포 내로 전기천공하였다. 몇몇 세포 유형을 다양한 sgRNA로 시험하였다. 세포성 시스템, 유전자 명칭, 및 스페이서 서열을 NGS에 의해 측정되는 편집 수준 다음에 나타낸다.
표 8. 일차 T 세포에서의 OMNI-50 멀티플렉스화: OMNI-50의 멀티플렉스화를 활성화된 일차 T 세포 내로 전기천공에 의해 수행하여, TRAC 또는 B2M 유전자를 표적화하거나, 조합 표적화하였다. 처음 2개 열은 5명의-공여체 은행으로부터 무작위 선택된 2명의 공여체 상에서 별도로 각각의 유전자를 나타낸다. 마지막 2개 열은 전기천공이 멀티플렉스로서 수행되었을 때 각각의 유전자에 대해 동일한 분석을 나타낸다. 편집 활성을 앰플리콘 기반 NGS 후의 인델 카운트에 의해 결정하였다. 2회 결과의 표준 편차를 또한 나타낸다. TRAC gRNA만의 사용은 B2M 유전자 상에 효과를 갖지 않았고 반대도 마찬가지였다(나타내지 않음).
표 9. 비편향 생화학 검정(가이드 seq)에 의한 OMNI-50 오프-표적 분석: SpCas9 또는 OMNI-50 뉴클레아제의 오프-표적 부위 카운트를 2회 반복으로 나타낸다. 상기 분석에 있어서, 10회 이상 판독을 갖는 증폭 부위만을 분석하였으며, 더 낮은 판독 횟수를 갖는 부위는 배경 노이즈를 감소시키기 위해 폐기하였다. 앰플리콘 기반 NGS 후 인델 카운트에 의해 결정된 온-표적 부위에서의 편집 수준뿐만 아니라 ODN 통합을 또한 나타낸다.
표 10. OMNI-50 스페이서 최적화. RNP를 상이한 길이의 sgRNA를 이용하여 OMNI-50 단백질에 대해 어셈블리하였다. RNP를 U2OS, HSC, 및 iPSC 세포 내로 전기천공하고, 앰플리콘 기반 NGS 후 인델 카운트에 의해 활성을 결정하였다. OMNI-50을 2회 반복으로 ELANE g35 상에서 시험하였다(표준 편차를 나타냄). 표 10 별첨은 21 nt 대 22 nt 스페이서의 상세한 비교가 HSC 내 5개의 상이한 게놈 부위에 걸쳐 수행되었음을 나타낸다.
[표 10 - 별첨]
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AC2005 <400> 5 atgggatata caataggact tgatcttggt gtggcttcat taggatgggc tgtagtcaat 60 gatgaatatg aggtattaga atcatgctca aatatttttc ctgcagcaga atctgcaaat 120 aatgttgaaa gacgaggctt taggcaggga agaaggttgt caaggcgtcg caggaccaga 180 attagtgatt tcagaaaact gtgggagaag agtggtttcg aggttccttc aaatgaattg 240 aacgaggtgc ttcagtatag gattaaaggc atgaatgata aattatcaga agatgagctt 300 tatcatgttc ttttaaatag cctgaaacat aggggaattt cgtatttgga tgatgcagat 360 gatgaaaatg catctgggga ttatgctgca agcattgctt ataacgaaaa tcaattaaag 420 acaaaattgc cttgtgagat tcagtgggag cgctataaga aatatggtgc ttataggggg 480 aatattacta tccaagaagg tggggaaccg cttactctta gaaatgtatt cacaacaagt 540 gcgtatgaaa aagaaattca gaagctatta gacgtacaat ctatgtcaaa tgagaaagta 600 acaaaaaagt ttattgatga atacttaaaa atcttttcaa gaaaaagaga atattatatt 660 gggccgggta acaaaaaatc cagaacagat tatggtgtat acactacaca aaaaaatgaa 720 gatggtactt atcatactga gcagaatctt tttgataaat tgattggaaa gtgtagtgta 780 tatcctgatg agagaagagc tgccggggct acttatactg cacaggaatt taatctttta 840 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21 <210> 119 <211> 133 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 119 caguccgggc ugggagcggg uguuugagag uuauguaaga aauuacauga cgaguucaaa 60 uaaaaauuua uucaaaccgc cuauuuauag gccgcagaug uucugcauua ugcuugcuau 120 ugcaagcuuu uuu 133 <210> 120 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 120 aguccgggcu gggagcgggu 20 <210> 121 <211> 132 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 121 aguccgggcu gggagcgggu guuugagagu uauguaagaa auuacaugac gaguucaaau 60 aaaaauuuau ucaaaccgcc uauuuauagg ccgcagaugu ucugcauuau gcuugcuauu 120 gcaagcuuuu uu 132 <210> 122 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 122 guccgggcug ggagcgggu 19 <210> 123 <211> 131 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 123 guccgggcug ggagcgggug uuugagaguu auguaagaaa uuacaugacg aguucaaaua 60 aaaauuuauu caaaccgccu auuuauaggc cgcagauguu cugcauuaug cuugcuauug 120 caagcuuuuu u 131 <210> 124 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 124 uccgggcugg gagcgggu 18 <210> 125 <211> 130 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 125 uccgggcugg gagcgggugu uugagaguua uguaagaaau uacaugacga guucaaauaa 60 aaauuuauuc aaaccgccua uuuauaggcc gcagauguuc ugcauuaugc uugcuauugc 120 aagcuuuuuu 130 <210> 126 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 126 ccgggcuggg agcgggu 17 <210> 127 <211> 129 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 127 ccgggcuggg agcggguguu ugagaguuau guaagaaauu acaugacgag uucaaauaaa 60 aauuuauuca aaccgccuau uuauaggccg cagauguucu gcauuaugcu ugcuauugca 120 agcuuuuuu 129 <210> 128 <211> 128 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 128 aguccgggcu gggagcgggu guuugagagu uaugugaaaa caugacgagu ucaaauaaaa 60 auuuauucaa accgccuauu uauaggccgc agauguucug cauuaugcuu gcuauugcaa 120 gcuuuuuu 128 <210> 129 <211> 130 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 129 aguccgggcu gggagcgggu guuugagagu uauguagaaa uacaugacga guucaaauaa 60 aaauuuauuc aaaccgccua uuuauaggcc gcagauguuc ugcauuaugc uugcuauugc 120 aagcuuuuuu 130 <210> 130 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 130 agtccgggct gggagcgggt ggggagca 28 <210> 131 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 131 gtcaagcccc agaggccaca gggacaga 28 <210> 132 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 132 agtcctggct gggagcaggt ggggagag 28 <210> 133 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 133 gccaagcctc agaggccaca gggcagca 28 <210> 134 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 134 ccaagtgata aacacgagga tggcaaga 28 <210> 135 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 135 aactggtacc gcatgagccc cagcaacc 28 <210> 136 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 136 catcaggctc tcagctcagc ctgagtgt 28 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ttgacctcca tagaagacac 2160 cgactctaga ggatccacta gtccagtgtg gtggaattct gcagatatca aagcttgcca 2220 ccatgcatac aatggaagag cagagccttg gtctcnnnnn ngcgggtctg gtggcgctag 2280 cgtgtccaag ggcgaggagc tgttcaccgg cgtggtgccc atcctggtgg agctggacgg 2340 cgacgtgaac ggccacaagt tcagcgtgag cggcgagggc gaaggggacg ctacttacgg 2400 caaactgact ctcaagttta tctgtactac cgggaagctc cctgtccctt ggcctacact 2460 ggtcacaact ctcacatatg gggtccagtg cttcagcaga taccccgacc acatgaagca 2520 gcacgacttc ttcaagagcg ccatgcccga gggctacgtg caggagagaa ccatcttctt 2580 caaggacgac ggcaactaca agaccagagc tgaggtcaag tttgagggtg acaccctggt 2640 gaacagaatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc tgggccacaa 2700 gctggagtac aactacaaca gccacaacgt gtacatcatg gctgataaac agaagaatgg 2760 gattaaggtg aacttcaaga tcagacacaa catcgaggac ggcagcgtgc agctggccga 2820 ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg acaaccacta 2880 cctgagcacc cagagcgctc tcagtaagga ccctaatgag aagagagacc acatggtgct 2940 gctggagttc gtgaccgccg ccggcatcac cctgggcatg 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ctgtgctaga catgaggtct a 21 <210> 161 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 8 <400> 161 acttcaagag caacagtgct g 21 <210> 162 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 9 <400> 162 aagagcaaca gtgctgtggc c 21 <210> 163 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 10 <400> 163 gctggggaag aaggtgtctt c 21 <210> 164 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 15 <400> 164 ataggcagac agacttgtca c 21 <210> 165 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 17 <400> 165 tagagtctct cagctggtac a 21 <210> 166 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRACR gRNA 18 <400> 166 gtctctcagc tggtacacgg c 21 <210> 167 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 19 <400> 167 cagctggtac acggcagggt c 21 <210> 168 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 20 <400> 168 agctggtaca cggcagggtc a 21 <210> 169 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 21 <400> 169 tacacggcag ggtcagggtt c 21 <210> 170 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 23 <400> 170 ctttcaaaac ctgtcagtga t 21 <210> 171 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 25 <400> 171 tccgaatcct cctcctgaaa g 21 <210> 172 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 26 <400> 172 aatcctcctc ctgaaagtgg c 21 <210> 173 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 27 <400> 173 atcctcctcc tgaaagtggc c 21 <210> 174 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 29 <400> 174 ctgctcatga cgctgcggct g 21 <210> 175 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 30 <400> 175 agattaaacc cggccacttt c 21 <210> 176 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 31 <400> 176 aacccggcca ctttcaggag g 21 <210> 177 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TRAC gRNA 32 <400> 177 gccactttca ggaggaggat t 21 <210> 178 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 1 <400> 178 tactctctct ttctggcctg g 21 <210> 179 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 2 <400> 179 gcatactcat ctttttcagt g 21 <210> 180 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 3 <400> 180 cgctactctc tctttctggc c 21 <210> 181 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 4 <400> 181 gcgcgagcac agctaaggcc a 21 <210> 182 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 6 <400> 182 gctcgcgcta ctctctcttt c 21 <210> 183 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 7 <400> 183 agagtagcgc gagcacagct a 21 <210> 184 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 15 <400> 184 tcacagccca agatagttaa g 21 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 16 <400> 185 cacagcccaa gatagttaag t 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 18 <400> 186 gacaaagtca catggttcac a 21 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 19 <400> 187 aagtcacatg gttcacacgg c 21 <210> 188 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 20 <400> 188 aggcatactc atctttttca g 21 <210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 21 <400> 189 ggcatactca tctttttcag t 21 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 22 <400> 190 catactcatc tttttcagtg g 21 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 23 <400> 191 tcagtaagtc aacttcaatg t 21 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M gRNA 26 <400> 192 acgtgagtaa acctgaatct t 21 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELANEg35_OMNI-50 <400> 193 agtccgggct gggagcgggt 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELANEg38_OMNI-50 <400> 194 acagcgggtg tagactccga 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELANEg39_OMNI-50 <400> 195 cagcgggtgt agactccgag 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELANEg58_OMNI-50 <400> 196 gctgcgggaa agggattccc 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ELANEg62_OMNI-50 <400> 197 gtcaagcccc agaggccaca 20

Claims (59)

  1. 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 클러스터링된 정규 배치 단편 회문 반복체(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR) 뉴클레아제를 포함하는, 비-자연 발생 조성물로서,
    조성물이
    a) CRISPR RNA(crRNA) 분자 및 트랜스활성화 CRISPR RNA(tracrRNA) 분자
    (여기서, crRNA 분자, tracrRNA 분자, 및 CRISPR 뉴클라아제는 함께 자연 발생하지 않음); 또는
    b) 단일 가이드 RNA(sgRNA) 분자
    를 추가로 포함하고,
    여기서, crRNA 분자 또는 sgRNA 분자는 표적 영역 내의 서열에 상보적인 가이드 서열 부분을 포함하며; 그리고
    (i) crRNA 분자가 GUUUGAGAG의 서열을 포함하는 반복 서열 부분을 추가로 포함하거나;
    (ii) tracrRNA 분자가 서열번호: 41 내지 43, 및 149 내지 154로부터 선택된 하나 이상의 서열을 추가로 포함하거나;
    (iii) sgRNA 분자가 GUUUGAGAG의 서열을 포함하는 반복 서열 부분 또는 서열번호: 41 내지 43, 및 149 내지 154로부터 선택된 하나 이상의 서열을 추가로 포함하는,
    조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 가이드 서열 부분은 21개 또는 22개 뉴클레오티드로 이루어진, 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, crRNA 분자가 GUUUGAGAG의 서열을 포함하는 crRNA 반복 서열 부분을 포함하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, tracrRNA 분자가 서열번호: 41 내지 43, 및 149 내지 154로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는, 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 표적 영역이 NGG, NAG, 및 NGA로부터 선택된 프로토스페이서 인접 모티프(Protospacer Adjacent Motif; PAM) 위치에 인접한, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, CRISPR 뉴클레아제가 핵 편재 서열(nuclear localization sequence; NLS)을 추가로 포함하는, 조성물.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 공여체 주형(donor template) 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제1항에 있어서, crRNA 분자, tracrRNA 분자, crRNA 분자와 tracrRNA 분자 모두, 또는 sgRNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
  18. 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CRISPR 뉴클레아제를 포함하는, 비-자연 발생 조성물로서,
    조성물이
    (i) 뉴클레아제-결합 RNA 뉴클레오티드 서열 부분; 및
    (ii) 표적 DNA 서열 내의 서열에 상보적인 17개 내지 24개 뉴클레오티드의 서열로 이루어진 가이드 서열 부분
    을 포함하는 단일 가이드 RNA(sgRNA) 분자를 추가로 포함하고,
    여기서, CRISPR 뉴클레아제가 sgRNA 분자와 복합체화하여 표적 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 복합체를 형성할 수 있고;
    표적 DNA 서열이 NGG, NAG, 및 NGA로부터 선택된 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 위치에 인접하며;
    sgRNA 분자가 서열번호: 37, 38, 40, 44, 45, 87, 또는 88로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는,
    조성물.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 제18항에 있어서, sgRNA 분자가 50개 내지 200개 염기의 길이를 갖는, 조성물.
  23. 세포의 게놈 내 표적 부위의 뉴클레오티드 서열을 표적화하거나 변형하는 시험관내 방법으로서, 서열번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 클러스터링된 정규 배치 단편 회문 반복체(CRISPR) 뉴클레아제를 인코딩하는 핵산 분자를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고,
    a) crRNA 분자 및 tracrRNA 분자; 또는
    b) sgRNA 분자
    를 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하고,
    여기서, crRNA 분자 또는 sgRNA 분자는 표적 영역 내의 서열에 상보적인 가이드 서열 부분을 포함하며; 그리고
    (i) crRNA 분자가 GUUUGAGAG의 서열을 포함하는 반복 서열 부분을 추가로 포함하거나;
    (ii) tracrRNA 분자가 서열번호: 41 내지 43, 및 149 내지 154로부터 선택된 하나 이상의 서열을 추가로 포함하거나;
    (iii) sgRNA 분자가 GUUUGAGAG의 서열을 포함하는 반복 서열 부분 또는 서열번호: 41 내지 43, 및 149 내지 154로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는,
    방법.
  24. 삭제
  25. 제23항에 있어서, 공여체 주형 분자를 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 삭제
  27. 포유동물 세포의 게놈 내 표적 부위의 뉴클레오티드 서열을 표적화하거나 변형하는 시험관내 방법으로서, 제18항의 조성물을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  28. 제27항에 있어서, 가이드 서열 부분은 21개 또는 22개 뉴클레오티드로 이루어진, 방법.
  29. 삭제
  30. 제27항에 있어서, 공여체 주형 분자를 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
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  39. 제1항의 조성물을 포함하는, 돌연변이 장애를 갖는 대상체를 치료하기 위한 약학 조성물.
  40. 삭제
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