KR102855663B1 - 3d 프린팅을 이용한 신속 면역진단 키트와 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3D 프린팅을 이용한 신속 면역진단 키트와 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 유기용매에 녹지 않는 섬유성 멤브레인을 포함하므로, 3D 프린팅 방식을 이용하여 면역진단 키트를 매우 빠르고 간단하게 제작할 수 있다.

Description

3D 프린팅을 이용한 신속 면역진단 키트와 그 제조방법 {Rapid immunodiagnostic kit using 3D print and Method for preparing the same}

본 발명은 3D 프린팅을 이용한 신속 면역진단 키트와 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 항체(antibody)의 고정이 가능하면서 유기용매(photocurable organic solvent)에 녹지 않는 섬유성 멤브레인을 포함하여 3D digital light processing (DLP) 프린팅, 포토리소그래피 (photolithography) 등의 적용이 가능한 면역진단 키트와 그 제조 방법에 관한 것이다.

현재 사용되고 있는 종이 기반의 면역진단장치 (paper-based lateral flow immunoassay kit)는 임신 진단, 코로나바이러스 검출 등 스크리닝 검사 또는 신속한 질병 현장진단에 사용되고 있다. 하지만 상용화된 면역진단장치의 경우, 검출 패드, 금-항체 결합 패드, 시료 패드, 흡수 패드 등 다양한 종류의 멤브레인이 필요하고 별도의 외장이 필요하다는 단점이 있다. 따라서 다수의 멤브레인을 접착제를 이용하여 부착시키고 별도의 조립과정이 필요하여 제작과정이 복잡하다.

최근 3D digital light processing (DLP) 프린팅은 자동화, 대량생산이 가능하다는 장점이 있어 많은 분야에 사용되고 있다. 다양한 3D 프린팅 방법으로 면역진단 장치의 외장을 출력하거나, 전기화학적 센서의 전극을 출력한 것을 보고되어 있다. 또한, 3D digital light processing (DLP)과 혈장분리패드(plasma seperation membrane)을 사용하여 혈액속의 포도당을 검출하는 진단장치가 개발되어 있지만, 효소반응을 사용한 검출 방법을 기반으로 하여 항원-항체 반응을 사용한 면역진단법보다 민감도가 떨어진다는 단점이 있다.

특히, 가장 상용화된 종이 기반 측방유동면역진단 장치 (paper-based lateral flow immunoassay)는 3D DLP 프린팅 방식으로는 제작된 바 없다. 단백질 결합력이 높아 항체 고정이 용이하여 검출 패드로 사용되고 있는 니트로섬유소막 (nitrocellulose membrane)이 유기용매에 녹아내려 DLP 3D 프린팅이나 포토리소그래피 등에 사용하기 불가능하였다.

대한민국 공개 특허공보 제2003-0065341호(2003.08.06. 공개)

본 발명자들은 DLP 3D 프린팅이나 포토리소그래피 등을 이용한 신속 진단키트의 제조방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 소수성 고분자를 코팅하고 플라즈마 처리한 섬유성 멤브레인을 이용하면 유기용매에도 섬유성 멤브레인의 구조가 파괴되지 않음을 규명하고, 제작된 진단키트가 민감하게 항원/항체를 검출할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 3D 프린팅을 이용한 신속 면역진단 키트와 그 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 3D 프린팅을 이용한 신속 면역진단 키트의 제조방법을 제공한다:

(a) 섬유성 멤브레인에 소수성 고분자를 코팅하는 단계;

(b) 상기 코팅된 소수성 고분자에 플라즈마 표면처리를 수행하는 단계;

(c) 시료내의 항체 또는 항원을 검출하기 위한 항원 또는 항체를 멤브레인에 결합시키는 단계; 및

(d) 3D 프린팅 방식으로 면역진단 키트의 하우징을 프린트하는 단계.

본 발명의 상기 신속 면역진단 키트는 측방유동 분석을 이용한 면역진단키트이다.

본 명세서에서 "측방유동 분석"은 시료에 포함된 목표 분석물, 예를 들면 특정 핵산 또는 단백질을 정량 또는 정성적으로 검사하는 방법으로, 예를 들면 일정한 서열의 항원 또는 항체에 결합하는 특정 항체 및/또는 항원이 특정 위치에 결합되어 있는 니트로섬유소 막(전개용 매질)을 포함하는 스트립이 이용된다. 스트립은 크로마토그래피 방법으로 시료를 이동시켜 서열 특이적 결합반응 또는 항원 항체 반응을 통해 시료 중의 특정 핵산 또는 단백질의 검출에 사용된다.

측방유동분석을 위해서는 상술한 바와 같이 시료를 전개시키고, 반응물을 검출하는 스트립과 상기 스트립이 장착되는 하우징 또는 카트리지를 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것을 포함한다.

본 발명에서, 상기 (a) 단계의 소수성 고분자는 상기 섬유성 멤브레인에 코팅되어 3D 프린팅시 사용되는 유기용매에 의하여 상기 섬유성 멤브레인의 3차원 구조가 파괴되는 것을 예방할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 소수성 고분자는 파릴렌(parylene) A, 파릴렌 B, 또는 파릴렌 C일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 소수성 고분자는 기상 증착법에 의해 상기 섬유성 멤브레인에 코팅되는 것이고, 구체적으로는 물리적 기상 증착법, 또는 화학적 기상 증착법에 의해 코팅되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 섬유성 멤브레인은 니트로섬유소 멤브레인(nitrocellulose membrane)이다. 상기 섬유성 멤브레인이 상술한 시료를 전개시키고 반응물을 검출하는 스트립을 구성한다.

본 발명의 상기 (b) 단계에 따르면, 상기 섬유성 멤브레인에 코팅된 소수성 고분자는 플라즈마 표면 처리가 수행된다.

상기 플라즈마 표면 처리는 상기 소수성 고분자에 친수성 치환기를 도입하여 친수성을 향상시킨다. 상기와 같이 부분적으로 친수성 치환기가 도입되면 항체와 같은 단백질의 결합 또는 고정시키는 데 용이해지므로, 상기 (c) 단계와 같이 시료내의 항체 또는 항원을 검출하기 위한 항원 또는 항체를 멤브레인에 결합시키는 단계를 수행할 수 있다.

본 발명에서 이용되는 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실 시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조 에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다. 상기 동물은 인간, 마우스, 랫트, 염소, 닭, 소, 돼지, 말 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 플라즈마는 산소 플라즈마이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 상술한 바와 같이, (d) 3D 프린팅 방식으로 면역진단 키트의 하우징을 프린트하는 단계를 포함한다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 3D 프린팅 방식은 3D 디지털 광 처리(3D digital light processing) 프린팅 방식 또는 포토리소그래피 방식일 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 3D 프린팅 기술은 i3DP(Inkjet 3D printing), SLA(Stereolithography apparatus), 2PP(Two-photon polymerization), FDM(Fused deposition modeling) 방법 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 면역진단 키트는, 상기 (a) 및 (b) 단계에 의해 섬유성 멤브레인에 소수성 고분자가 코팅되어 3D 프린팅 공정에서 사용되는 유기용매가 섬유성 멤브레인에 직접 접촉되는 것을 막는다. 따라서, 유기용매가 섬유성 멤브레인의 3차원 구조를 파괴하는 것을 예방할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 본 발명의 신속 면역진단 키트의 제조방법은 (e) 혈구 및 혈장 분리 모듈을 결합하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 혈구 및 혈장 분리 모듈은 3D 프린팅 방식으로 프린트된 것이다.

본 발명의 신속 면역진단 키트는 항체 또는 항원의 존재 여부를 판단하기 위한 면역진단에 사용될 수 있다. 본 발명의 신속 면역진단 키트의 시료로는 혈액시료(전혈, 혈장, 혈청)가 사용될 수 있고, 혈액시료의 경우 혈구가 포함되어 있어, 혈액시료 내 포함되어 있는 면역진단 키트의 타겟 항체 또는 항원이 면역진단 키트의 섬유성 멤브레인을 통하여 측방으로 흐르는 흐름을 방해할 수 있다.

따라서, 상기 혈구 및 혈장 분리 모듈을 시료를 투입하는 위치에 결합시키는 경우 혈구와 혈장을 분리하여 혈장내에 포함된 타겟 항체 또는 항원의 검출 효율을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 신속 면역진단 키트를 제공한다:

(a) 시료내의 항체 또는 항원을 검출하기 위한 항원 또는 항체를 결합시킨 섬유성 멤브레인; 및

(b) 혈구 및 혈장 분리 모듈.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 분리 모듈은 유리섬유 멤브레인을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 섬유성 멤브레인은 소수성 고분자로 코팅된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 섬유성 멤브레인에 코팅된 소수성 고분자는 플라즈마 표면처리된 것이다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 섬유성 멤브레인에 결합된 항원 또는 항체는 나노입자 또는 형광입자를 포함할 수 있다.

상기 나노입자는 금속나노입자 (e.g. 금나노입자), 자성 나노입자, 실리카 나노입자 및 라텍스 나노입자로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 형광입자는 광원제공시 발광하는 입자를 의미하며, 알렉사 플루오르 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(II)), FITC(fluorescein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxy-tetramethylrhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 상기 항체 또는 항원은 검출하고자 하는 타겟 항원 또는 타겟 항체에 따라서 당업자에 의하여 자유롭게 선택될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 면역진단 키트는 SARS-CoV-2 바이러스의 유무를 검출하기 위한 키트의 경우, 상기 멤브레인의 테스트 라인에 SARS-CoV-2 NP(Nucleocapsid protein)가 결합되어 있을 수 있다. 인간의 검체 시료(예컨대 혈액) 내에 포함된, SARS-CoV-2 NP에 특이적으로 결합하는 인간 항체가 상기 SARS-CoV-2 NP에 결합하면, 금나노 입자와 결합된 마우스 유래 항-인간 항체(예컨대 마우스 항-인간 IgM)가 테스트라인의 SARS-CoV-2 NP에 결합한 인간 항체를 검출할 수 있다. 컨트롤 라인에는 염소유래 항-마우스 IgG 항체가 결합되어 있을 수 있다. 인간의 검체 시료내 SARS-CoV-2 NP에 특이적으로 결합하는 인간 항체가 존재하는지 여부와 관계 없이 상기 염소유래 항-마우스 IgG 항체는 금나노 입자와 결합된 마우스 유래 항-인간 항체(예컨대 마우스 항-인간 IgM)와 결합하여 발색될 수 있다.

본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 본 발명의 면역진단 키트는 멤브레인에 항-인간 IgG/IgM 항체를 결합시켜두고, 인간의 검체 시료를 키트에 투입하였을 때 인간 항체가 결합된다. 상기 인간 항체가 SARS-CoV-2 항원에 특이적인 것이면, 검체시료 투입부에 있던 금나노입자에 결합시킨 SARS-CoV-2 항원 접합체가 상기 인간 항체와 결합하여 발색될 수 있다.

본 발명의 상기 신속 면역진단 키트는 양성 신호의 검출을 위하여 광학분석기를 이용할 수 있다.

본 발명의 상기 양태에 따른 신속 면역진단 키트는 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 신속 면역진단 키트의 제조방법에 의하여 제조된 것과 상응하는 것이므로 양 발명 간에 중복되는 구성의 대한 설명은 상호교환적으로 적용될 수 있다.

본 발명자들은 상술한 바와 같이 유기용매에 용해되지 않으면서 항체/단백질를 고정할 수 있는 종이 기반 멤브레인을 개발하였다. 기존 면역진단 장치에 사용되고 있는 니트로섬유소 막 (nitrocellulose membrane)은 유기용매에 녹아 다공성 구조가 파괴되기 때문에 3차원의 미세구조를 제작하는 photolithography나 3D digital light processing 등에 사용할 수 없었다.

본 발명자들은 기존의 니트로섬유소막에 기상증착 방법으로 소수성 물질을 코팅하여 유기용매에 녹지 않게 하였다. 또한 본 발명의 일 구현예와 같이 해당 멤브레인에 산소 플라스마 (oxygen plasma)를 5분 이상 처리하여 반영구적으로 지속되는 단백질 결합기를 생성하여 항체 고정이 가능하게 하였다. 또한, 개발된 멤브레인을 사용하여 3차원 형상의 측방유동 면역진단장치 (Three-dimensional lateral flow immunoassay kit)를 제작하였다.

본 발명의 일 구현예에 따른 바와 같이, 3D digital light processing 프린팅 기술을 이용하여 면역진단 장치에 3차원 구조를 출력할 수 있으므로, 시료 저장부와 속도 조절 구조를 단일 종이에 한꺼번에 출력할 수 있다. 본 발명의 제조방법을 이요하면 면역진단장치 제작에 필요한 멤브레인의 수를 줄이고 대량 생산이 용이하다.

또한, 본 발명의 신속 면역진단 키트의 혈구 및 혈장 분리 모듈은 혈구의 크기보다 공극의 크기가 작은 유리섬유로 제작한 멤브레인을 사용하여 전혈 속 시료를 사용한 검출 진단도 가능하게 하여 혈장, 혈구의 분리 없이 사용자가 바로 진단할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명은 3D 프린팅을 이용한 신속 면역진단 키트와 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 키트는 유기용매에 녹지 않는 섬유성 멤브레인을 포함하므로, 3D 프린팅 방식을 이용하여 면역진단 키트를 매우 빠르고 간단하게 제작할 수 있다.

도 1은 유기용매에 녹지 않는 단백질 고정 종이 멤브레인의 제작하기 위하여, 파릴렌 C를 니트로섬유소막에 코팅하고, 산소플라즈마 처리하는 공정을 나타낸 도이다.
도 2는 유기용매에 녹지 않도록 처리한, 단백질 고정 종이 멤브레인과 3D digital light processing 프린팅을 사용한 3차원의 종이 기반 측방유동 면역진단 장치 제작 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 유리섬유 멤브레인을 사용한 분리 모듈 제작 방법 및 금-항체 결합 입자 고정 방법을 나타낸 모식도이다.
도 4는 3차원의 종이 기반 측방유동 면역진단 장치와 분리 모듈의 모식도를 나타낸 도이다.
도 5는 Parylene C 코팅 정도에 따른 유기용매에 대한 니트로섬유소막의 다공성 미세구조 유지 정도를 비교하여 나타낸 도이다.
도 6은 산소 플라즈마 처리 시간에 따른 Parylene C 코팅 니트로섬유소막 (P-NC)의 물 접촉각 (water contact angle) 측정하여 나타낸 도이다.
도 7은 산소 플라즈마를 처리한 파릴렌 C 코팅 니트로섬유소막 (P-NC)의 항체 고정화 테스트 및 mouse IgG 검출 테스트 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 3D digital light processing 프린팅으로 P-NC 위에 3차원으로 출력된 측방유동 면역진단 장치와 분리 모듈의 이미지를 나타낸 것이다.
도 9는 혈장 분리 모듈을 사용한 전혈 (whole blood) 속 혈장 분리결과를 나타낸 도이다.
도 10는 P-NC 위에 3차원으로 출력된 측방유동 면역진단 장치를 통한 항원 (human IgG) 검출 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 파릴렌 C 코팅 니트로섬유소막을 이용하여 항체의 검출을 위한 면역진단 장치를 만드는 두 가지 방법에 대하여 나타낸 도이다.
도 12는 두 가지 방법을 이용하여 본 발명의 면역진단 키트를 이용하여 항체 검출용 키트를 제조하고 타겟 항체를 스파이킹한 PBS 시료로 검출 민감도를 비교하여 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 항원에 금나노입자를 접합시킨 방법으로 제조한 본 발명의 면역진단 키트를 이용하여 혈액 시료에서 타겟 항체를 검출한 결과와 시그널/노이즈 비를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1: 유기용매에 녹지 않는 단백질 고정 종이 멤브레인의 제작 방법

도 1은 유기용매에 녹지 않는 단백질 고정 종이 멤브레인의 제작하기 위하여, 파릴렌 C를 니트로섬유소 막(nitrocellulose membrane)에 코팅하고, 산소 플라즈마를 처리하는 공정을 나타낸 도이다.

본 발명자들은 유기용매에 용해되지 않으면서 항체를 고정할 수 있는 종이 기반의 멤브레인을 개발하였다. 100 μm 두께의 폴리에스터(polyester) 뒷면에 225-255 μm 두께의 니트로섬유소막이 붙어 있는 멤브레인에 물리적 기상 증착 (physical vapor deposition, PVD) 방법으로 소수성 물질인 Parylene C를 코팅하였다. 구체적으로는, 600 mg의 다이클로로-다이-p-자일릴렌 (Parylene C) 파우더를 밀폐된 챔버에 넣고 100℃에서 10분, 120℃에서 10분, 150℃에서 45분간 증발시켰다. 다음으로 690℃에서 1시간 동안 열분해(pyrolysis)를 진행하여 반응성 자유라디칼로 변환시켰다. 진공 상태에서 반응성 자유라디칼 상태인 Parylene C를 니트로섬유소막에 증착시켰다. 제작된 Parylene C 로 코팅된 니트로섬유소막(Parylene C coated nitrocellulose membrane, P-NC)에 산소 플라스마 (oxygen plasma)를 100 W의 파워, 0.05 Torr의 조건에서 5분간 처리하여 멤브레인 표면에 반영구적으로 지속하는 단백질 결합기를 생성하였고, 표면의 친수성을 회복시켜 항체 고정이 가능하도록 변경하였다. Parylene C 코팅된 니트로섬유소막은 미세 종이 구조가 Parylene C로 코팅되어 유기용매에 녹지 않게 변형되었으며, 그 결과 유기용매를 사용하는 3D digital light processing printing, photolithography 등에 사용할 수 있으며 항체와 같은 단백질을 결합시킬 수 있었다.

실시예 2: 유기용매에 녹지 않는 단백질 고정 종이 멤브레인과 3D digital light processing 프린팅을 사용한 3차원의 종이 기반 측방유동 면역진단 장치 제작 방법

본 발명자들은 유기용매에 녹지 않는 단백질 고정 종이 멤브레인과 3D digital light processing 프린팅을 사용하여 3차원 형상의 종이 기반 측방유동 면역진단 장치를 제작하였다.

도 2는 유기용매에 녹지 않도록 처리한, 단백질 고정 종이 멤브레인과 3D digital light processing 프린팅을 사용한 3차원의 종이 기반 측방유동 면역진단 장치 제작 방법을 나타낸 모식도이다. 도 2를 참조하며 설명하면, 파릴렌 C 코팅 니트로섬유소 막(Parylene C coated nitrocellulose membrane, P-NC)에 주사기 펌프를 사용하여 25 μL/min의 유속으로 항원과 특이적으로 결합하는 검출용 항체를 실험 라인 (test line)에, anti-rabbit IgG는 대조 라인 (control line)에 각각 분사한 후 건조하였다. 다음으로 항체가 고정된 P-NC 위에 3D 구조의 측방유동 면역진단 장치의 구조를 출력하였다.

도 3은 유리섬유 멤브레인을 사용한 분리 모듈 제작 방법 및 금-항체 결합 입자 고정 방법을 나타낸 모식도이다. 도 3을 참조하여 설명하면, 항체-금나노 입자 결합체 보관과 시료 저장 및 혈액 분리를 동시에 할 수 있는 분리 모듈 (separation module)도 따로 출력하였다. 출력된 측방유동 면역진단 장치와 분리 모듈은 1% 농도의 소혈청알부민 (bovine serum albumin) 용액을 1시간 처리하고 37℃에서 2시간 건조하여 단백질과 금-나노 입자의 비특이적 결합을 방지하였다. 항원과 특이적으로 결합하는 항체와 rabbit IgG 항체를 각각 금나노 입자와 결합한 후 이를 분리 모듈에 10 μL 떨어뜨린 후 건조하였다.

상술한 P-NC 위에 출력한 3차원 형상의 종이 기반 측방유동 면역진단 장치와 분리 모듈의 모식도는 도 4에 나타낸 바와 같다. 도 4에 예시적으로 나타낸 바와 같이, 분리 모듈과 측방유동 면역진단 장치의 하우징을 서로 결합가능한 크기로 제작하고, 분리 모듈과 측방유동 면역진단 장치를 조립하였다. 이후 이하의 실시예에서 시료 (혈액, 혈장)를 분리 모듈부에 떨어뜨려 목표 항원을 검출하는 시험을 수행하였다.

실시예 3: 파릴렌 C 코팅 정도에 따른 유기용매에 대한 니트로섬유소막의 다공성 미세구조 유지 정도

본 발명자들은 파릴렌 C의 코팅량에 따른 유기용매에 대한 니트로섬유소막의 다공성 미세구조 유지정도를 확인하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로 i) 파릴렌 C 코팅을 하지 않은 경우, ii) 400 mg의 파릴렌 C를 코팅한 경우, 및 iii) 600 mg의 파릴렌 C를 코팅한 경우로 나누었고, 유기용매인 N-Methyl-2-pyrrolidone를 처리하였고, 유기용매 처리 전과 후의 니트로섬유소막의 구조를 현미경으로 관찰하였다. 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 기존의 니트로섬유소막 (NC)은 다공성의 구조를 가지고 있지만, 유기용매 처리 시 모두 녹아내린 것을 알 수 있었다. 400 mg의 Parylene C를 코팅한 경우 유기용매 처리 시 니트로섬유소막의 구조가 일부분 녹아내려 다공성 구조가 막히는 것을 볼 수 있었다. 그러나, 600 mg의 Parylene C를 코팅한 경우 유기용매를 처리하여도 니트로섬유소 막의 구조가 녹아내리지 않아 다공성 구조를 유지하여 측방유동 진단장치를 위한 멤브레인으로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다. 해당 멤브레인은 P-NC (Parylene C coated nitrocellulose membrane)로 명명하였다.

실시예 4: 플라즈마 처리 시간에 따른 니트로섬유소 막의 물 접촉각 측정

본 발명자들은 산소 플라즈마 처리 시간에 따른, 파릴렌 C로 코팅된 니트로 섬유소 막에서의 물 접촉각을 측정하였다. 구체적으로 상기 실시예 3에서와 같이 파릴렌 C 600 mg으로 니트로섬유소 막을 코팅하고, 산소 플라즈마를 시간대 별로 처리하고, 각각의 접촉각을 측정하였다. 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이 산소 플라즈마를 처리하기 전에는 약 120°의 소수성 접촉각을 보였지만, 산소 플라즈마 처리 시간에 따라 접촉각이 감소하여 5분 이상의 처리 시간에서 약 23°의 친수성 접촉각을 보였다. 산소 플라즈마를 처리한 Parylene C를 코팅한 니트로섬유소막의 친수성은 21일이 지나도 거의 일정하게 유지되었다.

실시예 5: 본 발명의 면역진단 키트의 제작 및 조립

실시예 5-1. 항체 고정화 테스트 및 mouse IgG 검출 테스트

본 발명자들은 파릴렌 C를 코팅하고 산소 플라즈마를 처리한 니트로섬유소 막에 항체를 고정화시키고 면역진단 장치를 프린팅한 후, 항원 검출 시험을 수행하였다.

도 7은 산소 플라즈마를 처리한 파릴렌 C 코팅 니트로섬유소막 (P-NC)의 항체 고정화 테스트 및 mouse IgG 검출 테스트 결과를 나타낸 도이다.

도 7의 좌측 스트립은 산소 플라즈마를 처리한 Parylene C 코팅 니트로섬유소막에 다양한 종류의 항체 (mouse IgG, rabbit IgG)를 고정하고 해당 항체에 특이적으로 결합하는 항체 (anti-mouse IgG, anti-rabbit IgG)에 금나노입자를 결합시켜 흘려주어 멤브레인에 항체 결합기가 생성되었음을 보여준다. 검출 항체가 멤브레인에 잘 고정되어 흘려준 항체-금나노 입자가 검출부에 특이적으로 결합해 붉은 선을 나타낸 것을 확인하였다.

또한, 도 7의 우측 스트립은 Parylene C 코팅 니트로섬유소막에 3D digital light processing 프린팅으로 구조를 제작한 후 측방면역 진단키트를 제작해 테스트한 결과를 나타낸 것이다. 테스트 결과, 항원으로 사용한 mouse IgG를 1 μg/mL의 농도까지 검출할 수 있었다. 하지만 Parylene C 코팅 니트로섬유소막과 항체-금나노 입자간의 비특이적 결합으로 상단부에 많은 양의 항체-금나노 입자가 남아있게 되어 도 8, 도 9와 같은 구조로 분리 모듈을 분리하였다.

실시예 5-2. 혈장 분리 모듈의 제작

도 8은 3D digital light processing 프린팅으로 P-NC 위에 3차원으로 출력된 측방유동 면역진단 장치와 분리 모듈을 나타낸 것이다. 도 8에 예시된 바와 같이, 40 mm Х 11 mm 크기로 제작하고, 분리 모듈 (separation module)을 결합할 수 있는 4.3 mm 지름의 결합부를 가지도록 하였다. 85 mm Х 25 mm 면적의 P-NC 멤브레인에 프린팅을 하면, 총 4개의 측방유동 면역진단 장치를 한 번에 프린팅 할 수 있다.

도 9는 혈장 분리 모듈을 사용하여 전혈 속 혈장을 분리한 결과이다. 본 발명자들은 전혈 중에서 혈장과 혈구를 분리하기 위하여, 혈구의 size (7.8 μm) 보다 작은 pore 인 1.2 μm의 유리섬유 멤브레인을 사용하였으며, 총 두 개의 유리섬유 멤브레인을 연속하여 출력하여 수용할 수 있는 혈액의 void volume과 혈구 분리층의 두께를 높였다. 전혈 10 μL를 넣은 후 100 μL의 running buffer를 추가로 넣어 혈장의 분리를 진행한 결과, 그림 10 과 같이 15 분 후, 혈구는 분리 모듈 상단에, 분리된 혈장은 검출 모듈을 타고 흘러간 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 본 발명의 파릴렌 C 코팅 니트로섬유소막을 이용한 면역진단 장치의 항원 검출 실험

도 10는 P-NC 위에 3차원으로 출력된 측방유동 면역진단 장치를 통한 항원 (human IgG) 검출 실험 결과이다. 실험 결과, Phosphate buffer saline (PBS) 안에 포함된 human IgG를 1 ng/mL의 농도까지 검출할 수 있었다. 분리 모듈이 유리섬유 (glass fiber)인 경우 항체-금 나노 입자의 비특이적 결합이 감소하여 더욱 진한 대조, 실험 라인의 신호를 얻을 수 있었다.

실시예 7: 본 발명의 파릴렌 C 코팅 니트로섬유소막을 이용한 면역진단 장치의 항체 검출 실험

본 발명자들은 파릴렌 C 코팅 니트로섬유소막을 이용한 면역진단 장치의 항체 검출 실험을 아래와 같이 수행하였다. 검출대상 항체는 SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(Nucleocapsid protein)이었고, 제작 방법은 하기 표 1 및 도 11에 나타낸 바와 같이 두 가지 방법으로 제조하였다.

검출 방법	접합/고정	단백질 명칭
방법 1: 타겟 항체에 결합하는 항체와 금나노입자를 접합	금나노입자와	마우스 유래 항-인간 IgG
	니트로섬유소막 위	Nucleocapsid-His (his-sars2-n)
방법2: 뉴클레오캡시드 단백질(항원)을 금나노입자와 접합	금나노입자와	Nucleocapsid-His (his-sars2-n)
	니트로섬유소막 위에	마우스 유래 항-인간 IgG
타겟 항체	타겟항체로 스파이킹 된 PBS	항-SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 hIgG1 antibody (Invivogen)

도 11은 본 발명의 파릴렌 C 코팅 니트로섬유소막을 이용하여 항체의 검출을 위한 면역진단 장치를 만드는 두 가지 방법에 대하여 나타낸 도이다.

상기 표 1, 도 11과 같이 두 가지 방법으로 제조한 면역진단 키트를 이용하여 타겟항체를 PBS에 스파이킹 시킨 시료를 이용하여 검출 실험을 수행하였고, 결과를 각각 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 타겟항체와 결합하는 항체에 금나노입자를 접합시키는 방법 1보다는, 항원을 금나노입자와 접합시키는 방법인 방법 2가 더 높은 민감도를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

이에 따라, 방법 2의 방식으로 면역진단 키트를 제조하고, 타겟항체를 PBS에 스파이킹 시킨 시료와, 항-SARS-CoV-2 특이적 항체를 포함하는 혈액 시료를 각각 이용하여 항체 검출 실험을 수행하였다. 결과는 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 타겟항체를 포함하는 PBS 시료에서는 시료의 흐름 속도가 빨랐으나, 타겟항체를 포함하는 혈액 시료에서는 시료의 흐름속도가 매우 느렸고, 시그널의 크기가 PBS 시료에 비해 다소 감소하는 현상이 관찰되었다. 그러나, 시그널/노이즈 비(signal/noise ratio)를 측정하였을 때에 백그라운드 시그널이 크지 않았다는 점에서 본 발명의 혈장 분리 모듈과 결합된 진단 키트의 검출 효율이 우수함을 확인할 수 있었다. 시그널/노이즈 비는 다음 식에 의해 측정되었다.

식

시그널/노이즈 비 = (시그널-백그라운드 노이즈)/백그라운드 노이즈

Claims (11)

1. 다음 단계를 포함하는 3D 프린팅을 이용한 신속 면역진단 키트의 제조방법:
   (a) 섬유성 멤브레인에 소수성 고분자를 코팅하는 단계;
   (b) 상기 코팅된 소수성 고분자에 플라즈마 표면처리를 수행하는 단계;
   (c) 시료내의 항체 또는 항원을 검출하기 위한 항원 또는 항체를 멤브레인에 결합시키는 단계;
   (d) 3D 프린팅 방식으로 면역진단 키트의 하우징을 멤브레인에 직접 프린트하는 단계; 및
   (e) 유리섬유 멤브레인을 포함하는 혈구 및 혈장 분리 모듈을 결합하는 단계,
   여기에서 상기 3D 프린팅 방식은 유기용매를 사용하는 3D 디지털 광 처리(3D digital light processing) 프린팅 방식임.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 혈구 및 혈장 분리 모듈은 3D 프린팅 방식으로 프린트된 것인, 면역진단 키트의 제조방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 소수성 고분자는 파릴렌(parylene) A, 파릴렌 B, 또는 파릴렌 C인, 면역진단 키트의 제조방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 섬유성 멤브레인은 니트로섬유소 멤브레인(nitrocellulose membrane)인, 면역진단 키트의 제조방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 플라즈마는 산소 플라즈마인, 면역진단 키트의 제조방법.
   
7. 삭제
8. 다음을 포함하는 신속 면역진단 키트:
   (a) 소수성 고분자로 코팅된 섬유성 멤브레인에 플라즈마 표면처리를 수행한 후에 항원 또는 항체가 결합된, 섬유성 멤브레인; 및
   (b) 유리섬유 멤브레인을 포함하는 혈구 및 혈장 분리 모듈,
   상기 섬유성 멤브레인에 결합된 항원 또는 항체는 시료내의 항체 또는 항원을 검출하기 위한 것임.
   
9. 삭제
10. 삭제
11. 제8항에 있어서, 상기 섬유성 멤브레인에 코팅된 소수성 고분자는 플라즈마 표면처리된 것인, 신속 면역진단 키트.