KR20000005408A - 콜레스테롤 및 기타 지질 흡수 억제제로서의 양친매성 분자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 의약, 구체적으로 장으로부터 콜레스테롤과 기타 다른 식이성 지질 흡수의 억제제로서 특정 분자의 용도에 관한 것이다. 콜레스테롤 생합성은 적합한 억제제, 예컨대 스타틴에 의해 억제될 수 있다. 하지만, 유전성이든지 식이에 의한 것이든지 간에 콜레스테롤과잉혈증, 일반적으로 지질과잉혈증은 체내 콜레스테롤이 내인성 생합성 뿐만 아니라 음식 섭취로부터 얻어지기 때문에 콜레스테롤 생합성 억제제만을 사용하여 적당하게 처리할 수 없다. 이 문제는 장으로부터 콜레스테롤 및 기타 다른 지질의 흡수를 억제하는 양친매성 영역을 가진 1종 이상의 분자를 제공하여 처리한다. 또한, 비만증은 이와 같은 방식으로 치료 또는 예방하며, 아테롬성동맥경화증도 마찬가지이다. 양친매성 영역을 가진 적합한 분자의 예로는 천연 또는 변형 아포단백질 및 기타 다른 단백질과 약 15개 이상의 아미노산으로 구성된 양친매성 α-나선을 가진 펩티드도 포함된다.

Description

콜레스테롤 및 기타 지질 흡수 억제제로서의 양친매성 분자

콜레스테롤은 야누스적인 면을 갖는 분자이다. 콜레스테롤은 여전히 그 정확한 기능이 파악되지 않기는 하나, 한편으로는 세포의 혈장막을 이루는 필수 성분이며 또 한편으로는 그것이 너무 많이 존재하여 혈액 콜레스테롤의 농도가 높으면, 동맥 벽에 침적하여 아테롬성 동맥경화 플라크를 형성하며 결국에는 심근 경색 및 발작을 일으킨다. 서구의 공업화된 국가들에서는, 아테롬성 동맥경화증에 의한 사망율이 어떠한 기타 질병에 의한 것 보다 더 높다.

동물 세포 콜레스테롤의 대략 ⅔는 세포내의 새로운 합성에 의해 제공된다. 나머지 ⅓은 식사를 통해 장 내 상피 세포에 의해 흡수된다. 콜레스테롤은 물 및 혈액과 같은 수성 매체 중에 녹지 않으므로 안정한 형태로 분산되어야 한다. 이 공정은 유화로 언급되며, 얻어진 안정한 입자들은 혈청 지단백질(lipoprotein)로 공지되어 있다. 콜레스테롤의 가장 중요한 혈액 내 운반 매체는 저밀도 지단백질(LDL) 입자이다. 참고문헌[Brown 등., Science 232 34-47(1986)]. 전술한 콜레스테롤을 합성하는 세포의 성능에 의해 또는 선택적으로 수용체 매개의 세포내 취입(endocytosis)으로 공지된 메카니즘에 의해 혈류로부터 LDL입자를 내재화시키는 세포를 통해서 세포의 콜레스테롤에 대한 요구가 처리된다. 혈액내 LDL의 높은 농도와 아테롬성 동맥경화증의 발달, 다시 말하면 심근 경색 및 발작 간에는 명료하고도 우연적인 관계가 존재한다. LDL의 이중적인 역할은 강조할 필요가 있다. 즉, LDL입자는 한편으로는 세포에 콜레스테롤을 공급하며, 다른 한편으로는 동맥 벽에 콜레스테롤을 침적시키고 아테롬성 경화증을 발달시킨다.

LDL의 높은 혈액내 농도는 유전자 질환, 소위 유전적인 콜레스테롤과잉혈증(FH) 또는 고지방 식사에 기인하는 것이다. 콜레스테롤과잉혈증에서의 LDL 수용체의 중추적인 역할은 전술한 브라운 및 골드스테인의 연구에 의해 강조되어왔다. 참고문헌[Brown 등., Science 232 34-47(1986)]. 두 경우 모두, 세포 표면의 LDL 수용체 수는 현저히 감소된다. FH의 경우에는, 물려받은 유전자적 결함으로 인해 LDL 수용체가 단지 부분적으로만 작용하거나 또는 심지어 전혀 기능하지 않으며, 고지방의 콜레스테롤이 풍부한 식사의 경우에는 LDL 수용체의 합성이 전사 과정에서 억제된다. 어떠한 경우에도, 선천적인 것이건 후천적인 것이건 관계 없이 궁극적으로 동일한 결과(소위, LDL 수용체 결핍)가 얻어진다. 결과적으로, LDL 입자는 순환에 의해 더 이상 제거되지 않으므로 혈액내 농도가 높아져서 아테롬성 동맥경화증이 발달된다.

이형접합성 FH를 겪는 환자는 총괄하여 스타틴(statin)으로 불리는 한 부류의 약물, 예를 들면 Zocor^TM로서 Merck에서 시판하는 심바스타틴으로 치료되어 왔다. 이 부류의 화합물은 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 환원효소를 억제하는데, 이 효소는 콜레스테롤 합성의 속도 제한 효소로서, 세포의 생합성 경로를 저해한다. 스타틴은 수지, 즉 담즙염 격리제(예, 콜레스티라민)로서 표현되는 수지와 함께 종종 투여된다. 후자의 화합물은 경구적으로 그리고 다량으로 투여되며, 이들은 혈액내 콜레스테롤 농도를 낮추는 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 효과를 달성하기 위해서는 다량을 사용해야 하므로, 그리고 이러한 투여량은 바람직하지 않은 부작용을 일으키므로, 이들 부류의 화합물은 환자들에게 인기 있지 않으며 널리 사용되지 않아 왔다. 그럼에도 불구하고 브라운 및 골드스테인은 이형접합성 FH를 겪고있는 환자를 스타틴 및 수지(예, 콜레스티라민)로 함께 치료하면 이형접합성 FH를 갖는 환자중의 LDL 수용체 수를 정상 수준으로 증가시킬 수 있다는 것을 알아내었다.

1988년, 미국 국립 콜레스테롤 교육 프로그램은 혈액내 총 콜레스테롤 및 LDL 콜레스테롤 농도를 분류하여, 콜레스테롤과잉혈증으로 분류된 환자에게 식이 요법을 추천하였다. 식이 요법외에도 혈액내 콜레스테롤의 농도를 낮추는 예방학적 접근법은 매우 환영받고 있다.

장 내의 콜레스테롤 흡수를 감소 또는 억제시킨다는 생각, 다시말하면 이런 방법으로 콜레스테롤의 혈액 내 농도를 저하시킨다는 생각은 오래전부터 있었다. 약학 분야에서는 이를 위해 더욱 많은 노력을 하여왔으나, 이제까지 별 성공을 거두지 못하였다. 한 예로서, 보충식으로서 투여되는 사포닌은 실험 동물의 혈액내 콜레스테롤 농도를 감소시키며 콜레스테롤과잉혈증의 치료에 매우 유용한 것으로 알려졌다. 참고문헌[Harwood 등., Journal of Lipid Research 34 377-395(1993)]. 그러나, 이러한 접근법은 사포닌 공급의 어려움으로 인해 실패하였다. 실질적으로, 천연 공급원으로부터 순수한 사포닌을 대량으로 생성하는 것은 불가능하다. 또한, 사포닌의 합성 유사체와 대체물을 사용하는 접근법도 적어도 현재까지 별로 실효를 거두지 못하고 있다.

1990년, 본 발명자들은 장내 상피 세포의 쇄자연 막("BBM")에 의한 콜레스테롤 흡착이 단백질-매개적 과정임을 보고하였다. 참고문헌[Thurnhofer 등., Compassi et al., Biochemistry 29 2142-2148(1990)]. 이는 또한 콜레스테롤의 에스테르[참고문헌:Compsaai 등., Biochemistry 34 16473(1995)] 및 기타의 식이 지질[참고문헌: Thurnhofer 등., Biochim. Biophys. Acta. 1024 249-262(1990)]에 대해서도 마찬가지이다. 본 발명자들은 교본에서 문서화된 보편적인 견해와 다른 사실을 발견하였고, 지질 흡수가 농도 구배를 따라 식이성 지질의 확산을 비롯한 수동 과정이라는 논문을 검토하였다. 본 발명자들은 새로운 방법으로 장 내에서 콜레스테롤 흡수를 방해하고 억제할 수 있다는 것을 발견하였다. 1990년 전에는 이러한 목적을 위하여 취해진 접근법들은 구체적이지 않은 것들이었다. 그 예로는 콜레스티라민 또는 식물 사포닌과 같은 중합체로 치료하는 것이다. 이 화합물들은 콜레스테롤과 기타 식이성 지질을 흡착부위로 운반하는 장 내의 담즙염과 상호 작용하는 것으로서 이 상호작용에 의해 콜레스테롤 및 기타 지질은 지질 흡착에 용이하지 않게 된다. 이들 시약은 이러한 종류의 상호 작용에 다량으로 요구되며 이는 반응이 특이적이지 않다는 것을 나타낸다. 대조적으로 BBM 내의 콜레스테롤 흡착이나, 더욱 일반적으로 지질 흡착을 촉매하는 단백질을 사용하면, 상기 접근법은 달라지는 데, 이는 특이적으로 분류할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 지질 흡착과 관련있는 단백질(들)과 특이적으로 상호작용하여 지질 흡착을 억제하는 시약을 발견하거나 또는 디자인하는 것이다.

공지되어 있으며, 그 기능이 확립되었으나, 그에 대한 어떠한 장내 의학적 용도가 제시되지 않은 일군의 단백질이 콜레스테롤 흡수 또는 기타 지질 흡수 억제제로서 작용할 수 있다는 것을 발견하였다. 이 단백질은 아포단백질이다.

아포 단백질이 본 발명에서 유용한 것으로 보이는 이유는 그 구조내에 양친매성 α-나선들이 존재하기 때문이며, 따라서 단백질의 양친매성 α-나선의 관련 특징(특히, 크기, 기하 구조 및 극성)을 공유하는 하나 이상의 양친매성 영역을 함유하는 기타 분자들도 본 발명에 유용하다는 것을 발견하였다.

본 발명은 의약에 대한 특정 분자의 용도에 관한 것이며, 구체적으로 장으로부터 콜레스테롤 및 기타 식이성 지질 흡수 억제제로서의 용도에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 콜레스테롤과잉혈증을 비롯한 지질과잉혈증에 적용되며 비만증에 대한 처방에 사용된다.

도 1은 부분 정제된 스테롤 흡수 억제제 단백질의 PBE94에 대한 크로마토포커싱을 나타낸 것이며, 이때의 조건은 실시예 1에 기재되어 있다. 활성 피크는 분획 28에서 용출되었다. 단백질 농도는 피어스 BCA^*단백질 분석 시약을 사용하여 측정하였다. 정사각형은, 단백질의 양을 나타내며, 마름모형은 억제 활성을 나타낸다.

도 2는 실시예 1에 기재된 PBE94 칼럼으로부터 용출된 분획의 SDS 15% PAGE 겔을 나타낸 것이다. 전기 영동은 제조업자의 지시에 따라 Mini-Protean II Dual Slab Cell에서 수행하였다. 겔은 은으로 염색하였다. 겔의 각 측면에 표준 단백질의 전기 영동에 의한 이동부 및 이들의 분자 질량(kDa)을 함께 제시하였다. Ap: PBE94 칼럼에 장입된 부분 정제된 스테롤 흡수 억제제 단백질. FT: 통과 분획(flow through fraction) 11-42: PBE94 칼럼으로부터 용출된 분획. 각 레인에 존재하는 45 k와 66 k 사이의 이중 밴드는 은으로 염색된 인공 산물이다.

도 3은 실시예 3에 기재된 조건하에서 공여체를 1 mol% 방사능표지된 콜레스테롤을 함유하는 에그 PC SUV로 하고 수용체를 래빗 BBMV로 하여 콜레스테롤 흡수에 대한 여러 형태의 아포단백질 A-1의 효과를 나타내는 막대 히스토그램이다. 막대는 무억제 반응 시의 콜레스테롤 흡수에 상대적인 콜레스테롤 흡수 억제율을 나타낸다. 3회 측정치의 표준 편차는 막대 상부에 진한 부분으로 나타내었다. Apo A-I : 인간 아포단백질 A-1. Apo A-1/DMPC: DMPC 이중층에 재병입된 인간 아포단백질 A-1(2.5 ㎎ DMPC/아포 A-1 ㎎). 분획 28-PBE94 : PBE94 크로마토포커싱 칼럼의 분획 28에서 용출된 정제된 억제제. HDL₃: 밀도가 d = 1.125 내지 1.21 g/㎖인 인간 고밀도 지단백질.

도 4A는 공여체로서 1 mol%의 콜레스테릴 올레이트와 미량의 [³H]-콜레스테릴 올레일 에테르를 함유하는 에그 PC SUV로부터 수용체로서 래빗 BBMV로 흡수되는, 증가량의 억제제 단백질에 대한 콜레스테릴 올레이트 흡수의 용량 응답 반응을 도시한 것이다. 마름모형 : 인간 아포단백질 A-1에 의한 억제반응. 정사각형 : 분획 28-PBE94에 의한 억제반응. 오차 막대는 3회의 별도 측정치의 표준 편차를 나타낸다.

도 4B는 도 4A와 유사한 방식이되, 인간 아포 A-1, 인간 아포 A-2 및 양 HDL의 농도 증가 함수로 나타낸 억제 효과를 도시한 것이다.

도 5는 억제제 무첨가(●) 및 60 μM Ac-18A-NH₂의 존재(■)하에 정상인의 십이지장으로부터 제조되는 BBMV의 콜레스테롤 흡수성을 도시한 것이다. [¹⁴C] 콜레스테롤 1 mol%를 함유하고 지질이 0.01 ㎎/㎖인 인지질 부형제와 지질이 0.25 ㎎/㎖인 BBMV를 항온처리하고 실시예 7에 기재된 바와 같이 콜레스테롤 흡수율을 측정하였다. 공여체와 수용체의 소포 현탁액에 Ac-18A-NH₂를 첨가하였다. 데이터 점들은 3회 측정한 평균값 ± 표준 편차를 나타낸다. 점선은 단일지수식 컴퓨터 부합점을 나타낸다.

도 6은 정상 BBMV(●)와 무베타지단백혈증성 BBMV(○)에 의한 단백질 매개의 콜레스테롤 흡수시 Ac-18A-NH₂농도 증가 효과를 도시한 것이다. 인지질 소포로부터의 [¹⁴C] 콜레스테롤 흡수는 천연 BBMV와 프로테이나제 K 처리된 BBMV를 사용하여 증가량의 Ac-18A-NH₂존재하에 측정하였다. 천연 BBMV와 프로테이나제 K 처리된 BBMV에 의한 콜레스테롤 흡수 간의 차이를 단백질 매개의 콜레스테롤 흡수라 한다. 실험 조건은 실시예 7에 기재한 바와 같고, 항온처리 시간은 20분이다. 정상 BBMV의 데이터 점은 3회 측정치의 평균값 ± 표준 편차를 나타내며, 점선은 문헌[Rodbard et al., Methods Enzymol. 37 3-22(1975)]에 기재된 실험 데이터에 부합되는 곡선을 나타낸 것이다.

그러므로, 본 발명은 제1 양태로서 장으로부터 콜레스테롤 또는 기타의 지질을 흡수하는 것을 억제하기 위한 약제를 제조하는 데 1개 이상의 양친매성 영역, 특히 양친매성 나선을 포함하는 분자를 사용하는 방법을 제공한다.

본 발명은 제2 양태로서, 지질과잉혈증, 특히 콜레스테롤과잉혈증 및/또는 비만을 치료 또는 예방하기 위한 장내 투여용 약제를 제조하는 데 1개 이상의 양친매성 영역, 특히 양친매성 나선을 포함하는 분자를 사용하는 방법을 제공한다.

상기 또는 각각의 양친매성 구간은 적어도 13, 14 또는 15 아미노산 잔기로 이루어진 단백질성 양친매성 나선의 관련 특징(특히, 크기, 기하 구조 및 극성)을 공유한다.

그러므로, 본 발명은 장으로부터 콜레스테롤 또는 기타의 지질 흡수를 억제하는 방법을 제공할 수 있다. 이 방법은 환자 또는 전체에게 1개 이상의 양친매성 영역, 특히 양친매성 나선을 함유하는 분자를 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 지질과잉혈증, 특히 콜레스테롤과잉혈증 및/또는 비만을 치료 또는 억제하는 방법을 제공할 수 있다. 이 방법은 환자 또는 검체에게 1개 이상의 양친매성 영역, 특히 양친매성 나선을 함유하는 분자의 유효량을 장내 투여하는 것을 포함한다.

특히, 몇 개의 양친매성 α-나선을 함유하는 특정한 단백질성 분자가 아포단백질이다.

전술한 바와 같이, 저밀도 지단백질(LDL)은 혈액내 콜레스테롤의 가장 중요한 운반 매체이다. LDL은 일군의 지단백질중 하나이다. 이는 밀도 증가에 따라, 유미지립, 유미지립 잔유물, 매우 낮은 밀도의 지단백질(VLDL), 중간 밀도의 지단백질(IDL), 저밀도의 지단백질 및 고밀도의 지단백질(HDL)로 분류된다. 각각의 지단백질은 그것의 고유 기능을 갖는다. 예를 들면, 전술한 바와 같이, LDL은 혈액내 콜레스테롤 운반시에 중요하며, HDL은 세포 및 혈관내 콜레스테롤의 스캐빈저로 여겨지며, 이러한 점에서 이들의 역할은 잘 확립되어 있다. 지단백질은 극성 지질 및 아포단백질(아포지단백질로도 언급되며 때로는 apo로 약칭됨)의 외피로 둘러싸인 소수성 지질의 코어로 이루어진 입자이다. 10 개의 주된 아포단백질-- A-1, A-2, A-4, B-48, B-100, C-1, C-2, C-3, D 및 E --을 분리하였으며 이는 간 및 장에 의해 합성되고 분비된다. 골드맨 & 길맨의 문헌[The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, 8판, 1992]에는 다양한 지단백질내에 존재하는 아포단백질의 분포를 다음과 같이 수록하였다.

지단백질 분류	주 아포단백질
유미지립	A-1, A-2, A-4, B-48
유미지립 잔유물	B-48, E
VLDL	B-100, C, E,
IDL	B-100, E
LDL	B-100
HDL	A-1, A-2

원칙적으로, 어떠한 아포단백질도 본 발명에는 유용한 것으로 여겨진다. 아포단백질 A 및 C(apo A 및 apo C)는 시험관내 BBM 모델에서 특히 유효한 것으로 알려져 왔다. B 아포단백질은 그것의 큰 크기 및 탈지질화 형태로 상대적인 용해도 결핍때문에 덜 바람직할 수 있다.

본 발명은 인간의 질환을 치료 또는 예방하는 데 특정한 용도를 갖고 있으나, 이는 또한 기타의 동물(특히, 포유류)에게도 적용될 수 있다. 임의의 특정 종(인간을 포함함)으로부터 얻은 아포단백질은 그 종의 동물을 치료하는 데 가장 적당할 수 있으나, 아포단백질의 교차종을 사용하는 것도 본 발명의 범주에 든다.

천연 아포단백질(모든 대립 변종을 포함) 및 그것의 변종을 사용하는 것은 본 발명의 범주에 든다. 변종은 첨가 돌연변이체, 결실 돌연변이체 및 치환 돌연변이체를 포함한다. 돌연변이체는 일반적으로 적어도 콜레스테롤(및 더욱 일반적으로는 지질) 흡수 억제의 관점에서 보존 돌연변이체일 수 있으며 일반적으로는 천연 서열과 상당한 아미노산 상동성을 보여준다. 상당한 아미노산 상동성은 최적의 정합을 기준으로 선호도 증가 순서로서 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 심지어는 99% 이상의 상동성을 포함할 수 있다. 비간섭 아미노산 서열을 첨가할 수 있으며, 필수적이지 않은 아미노산 서열은 삭제할 수 있다. 간단히 말하면, 적당한 변종은 그것의 2차 구조가 장으로부터 지질, 특히 콜레스테롤 흡수를 억제할 수 있는 천연 아포단백질 구조와 충분히 복제성이거나 모방성인 단백질을 포함한다.

천연 아포단백질의 양친매성 α-나선의 특징에 상응하는 특징(크기, 기하 구조 및 극성)을 갖는 1개 이상의 양친매성 영역을 포함하는 기타의 분자를 본 발명에서는 아포단백질의 변종으로 간주할 수 있다. 그러나, 그것이 속하는 화합물 부류를 기준으로 하여 적당한 양친매성 영역을 함유하는 다양한 비 아포단백질 분자를 고려하는 것이 더욱 간편하다.

이러한 부류 중 가장 가변적인 것은 하나의 양친매성 나선, 또는 다수개의 양친매성 나선을 형성할 수 있는 천연 또는 합성 펩티드 및 단백질의 부류이다. 양친매성 나선은 나선을 형성하는 아미노산 측쇄의 성질 및 배열에 의해 소수성 면과 친수성 면을 갖는다. 부류 A 양친매성 나선에서는, 친수성 면내의 양이온 잔기는 소수성 면에 가까이 있으며 음이온 잔기는 소수성 면으로부터 떨어져 있다. 부류 R 양친매성 나선에서는, 친수성 배열은 역위되어, 친수성 면 내의 음이온 잔기는 소수성 면에 가까이 있으며 양이온 잔기는 소수성 면으로부터 떨어져 있다. 천연 아포단백질은 부류 A의 양친매성 나선을 함유하고 있다. Apo A-1은 그것들 중 8개를 갖는다. 이러한 이유로, 부류 A 양친매성 나선을 1개 이상 함유하는 화합물이 바람직하다.

펩티드 또는 단백질의 우선성 α-나선에서는, 하나의 회전점은 3.6개의 아미노산으로 이루어진다. 하나의 회전 높이는 5.4 Å이며, 18 개의 아미노산으로 이루어지는 α-나선 길이는 약 27Å이며 15개의 아미노산으로 이루어진 α-나선의 길이는 약 22.5 Å이다. 이 α-나선의 펩티드 백본은 약 5Å(±0.5Å) 직경의 추상적인 (대략, 원형단면을 갖는) 원통의 표면을 따라 이루어진다. 아미노산 잔기의 외부적으로 돌출된 측쇄를 고려하면, 상기 원통의 직경은 약 5Å 내지 약 8Å이다. 그 측쇄는 극성이거나, 하전되거나 또는 비극성일 수도 있으며, 원통의 장축에 대략 수직으로 돌출된다. 원통 표면의 약 1/2은 하전된 아미노산 잔기 및 극성의 아미노산 잔기로 덮여있으며, 나머지 1/2은 비극성 잔기로 덮여 있다. 지적한 바와 같이, 양친매성 α-나선(경우에 따라, 부류 A 또는 부류 R로 존재할 수 있음)은 원통의 축에 평행하게 배향된 대향하는 극성 및 비극성 면을 갖는다.

본 발명에 유용한 펩티드 및 단백질은 EP-A-0162414호 및 US-A-4643988호에 개시된 것을 포함하며 이들의 내용은 법으로 허용되는 범위 까지 본 명세서에서 참고로 인용한다. 양친매성 나선을 형성할 수 있는 바람직한 펩티드 및 단백질은 하기 화학식 I로 표기되는 서열을 포함한다.

A₁-B₁-B₂-C₁-D-B₃-B₄-A₂-C₂-B₅-B₆-A₃-C₃-B₇-C₄-A₄-B₈-B₉

상기 서열 중,

A₁, A₂, A₃및 A₄각각은 아스파르트산 또는 글루탐산, 또는 그것의 동족체 또는 유사체를 나타낸다.

B₁, B₂, B₃, B₄, B₅, B₆, B₇, B₈및 B₉각각은 트립토판, 페닐알라닌, 알라닌, 류신, 티로신, 이소류신, 발린 또는 α-나프틸알라닌, 또는 그것의 동족체 또는 유사체를 나타낸다.

C₁, C₂, C₃및 C₄각각은 리신 또는 아르기닌을 나타낸다.

D는 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 또는 히스티딘, 또는 그것의 동족체 또는 유사체를 나타낸다.

이들 펩티드는 이상적인 양친매성 나선을 만드는 아미노산 잔기의 특이적인 배열을 보여준다. 음으로 하전된 잔기, 양으로 하전된 잔기, 및 소수성 잔기의 그 특이적인 배치는 양친매성 나선의 형성에 중요하며, 따라서 펩티드가 목적한 대로 기능하는데 있어서 중요하다. 천연 아포지단백질에서 볼 수 있는 하전된 잔기의 배치와는 반대인 양성 잔기 및 음성 잔기를 함유하는 유사체는 지질과 거의 결합하지 않거나 전혀 결합하지 않는다. 전술한 펩티드의 18-잔기 서열에서, 양으로 하전된 잔기(화학식 I의 "C"기)는 4 위치, 9 위치, 13 위치 및 15 위치에 있어야 하며, 음으로 하전된 잔기 (화학식 I의 "A"기)는 1 위치, 8 위치, 12 위치 및 16 위치에 있어야 한다. 소수성 잔기(화학식 I의 "B"기)는 2 위치, 3 위치, 6 위치, 7 위치, 10 위치, 11 위치, 14 위치, 17 위치 및 18 위치에 있어야 한다. 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 또는 히스티딘 잔기는 위치 5("D")에 있는 것이 바람직하다. 특정한 기능적인 위치, 예를 들면 양으로 하전된 위치를 차지하도록 선택된 특이적인 잔기는 펩티드의 활성에 부당한 역효과를 미치지 않는 한 다양하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 잔기인 아스파르트산 및 글루탐산은 음으로 하전된 잔기가 요구하는 서열로 임의의 위치에서 상호변화할 수 있다. 유사하게, 리신 또는 아르기닌은 양으로 하전된 임의의 위치에 배치될 수 있다. 바람직한 소수성 잔기는 트립토판, 페닐알라닌, 알라닌, 류신, 이소류신, 발린 및 α-나프틸알라닌이다.

몇 개의 바람직한 펩티드에서, 많은 소수성 잔기 위치는 α-나프틸알라닌이 차지한다. 특히 바람직한 양태는 하기 서열의 것들을 포함한다. :

Asp-Trp-αNal-Lys-Ala-Phe-αNal-Asp-Lys-αNal-Ala-Glu-Lys-αNal-Lys-Glu-Ala-Phe (18naA) 또는

Ac-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH₂(AC-18A-NH₂).

후자의 펩티드는, 벤카타칼라패티 외 다수의 문헌 [PROTEINS: Structures, Function, and Genetics 15 349-359 (1993)]에서 다루고 있는 주제로서, 상기 문헌은 법에 허용되는 최대한도로 본문에 참고 인용하고 있다. 상응하는 비차폐 펩티드(18A)도 역시 본 발명의 바람직한 화합물이다.

사용된 아미노산은 천연 형태일 수 있거나, 또는 특이적인 바람직한 품질을 가진 합성 아미노산을 사용할 수도 있다. 예를 들어, 합성 아미노산 α-나프틸알라닌은 천연 아미노산보다 훨씬 큰 소수성을 나타내보이며, 본 발명의 펩티드에 특히 유용하다. 마찬가지로, 치환된 아미노산인 디메틸 리신은 비치환된 리신보다 고도의 양하전을 띠며, 특정의 실시 형태에서 바람직하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드에 필요한 천연 아미노산의 유용한 유사체 또는 동족체의 대체도 고려해볼 수 있다. 본 발명에 사용하기에는 아미노산의 D-형태 또는 L-형태가 적당하다. D-아미노산의 하나의 잠재적 잇점은, 장에서 펩티드 및 이것을 함유한 단백질의 효소적 가수분해 경향이 적다는 점이다. 전술된 바와 같이, C-말단 또는 N-말단 아미노산은 적절히 차폐시키거나, 또는 비간섭 방식으로 유도체화시킬 수 있는데, 예를 들어 N-말단 아미노산은 아세틸화시킬 수 있고, C-말단 아미노산은 아미드화시킬 수 있다. 바람직한 펩티드 Ac-18A-NH₂와 같이 이러한 방식에 의한 N-말단 및/또는 C-말단의 차폐는 지질의 존재 하에 α-나선구조를 안정화시킬 수 있다.

전술한 바람직한 펩티드의 작용성 양친매성 나선구조는 18개의 아미노산 서열로 구성되나, 18개 잔기 펩티드의 양 말단중 어느 하나의 말단에 대한 첨가는 나선구조 형성능에 실질적인 영향을 미치지 않는다면 수행될 수도 있다. 예를 들어, 연장 트리펩티드를, 양친매성 기본 펩티드 쇄의 각 말단에 부가하여 나선 말단의 효과를 최소화시킬 수도 있다. 여러 개의 양친매성 나선형 도메인도 역시 유용한 것으로 입증될 수 있다. 예를 들어 프롤린에 의해 연결된 2개의 18 잔기 펩티드로 구성된 37개의 잔기 펩티드도 역시 인지질과 원반상 복합체를 형성하고 HDL의 천연 아포단백질을 대체할 수 있는 능력을 나타내 보인다.

그러나, 본 발명의 도식에서, 18개의 잔기 단위는 통상 적절한 나선구조의 형성에 있어 중요한 것으로 추측된다. 예를 들어, 서열 중 10번째 위치의 아미노산을 삭제하면 극성-비극성 계면이 100。 만큼 회전할 것이며, 결과적으로 HDL의 천연 아포단백질을 대체하는 능력이 실질적으로 결여된 펩티드가 생성될 것이다. 그럼에도 불구하고, 양친매성 나선구조의 일부(예, 잔기 A₄-B₈-B₉)가 삭제된 유용한 작용성 분자가 존재한다. 일례를 들면 Ac-15A-NH₂로서, 이것은 Ac-18A-NH₂의 15개의 N-말단 아미노산을 포함하며, 구조는 Ac-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu- Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH₂(Ac-15A-NH₂)이다. Ac-15A-NH₂는, 쇄자면 막 소포 모델을 통해 측정한 결과, Ac-18A-NH₂가 나타내는 콜레스테릴 올레이트 흡수 억제 활성의 85%이다.

상기 펩티드는, 단순하고 복잡한 저분자량 단백질의 합성에 현재 이용되는 다수의 방법 중 임의의 방법을 통해 합성할 수도 있다. 통상적으로, 이들 방법은 아미노산을 연속 첨가하여 점점 보다 큰 분자를 형성시키는 단계식 합성법이다. 아미노산은, 1개의 아미노산의 카르복실기와 또다른 아미노산의 아미노기 사이의 축합을 통해 펩티드 결합을 형성하여 서로 결합한다. 이러한 반응을 제어하기 위해서는, 1개의 아미노산의 아미노기와 나머지 아미노산의 카르복실기를 차폐시킬 필요가 있다. 차폐기는, 형성된 펩디드 결합의 가수분해 또는 라세미화를 통해, 폴리펩티드에 유해한 영향을 미치지 않으면서 용이하게 제거되도록 선택해야 한다. 특정의 아미노산은 부가의 작용기(예, 티로신의 히드록실기)를 갖는다. 이러한 부가의 작용기도 용이하게 제거되는 차폐 인자로 차폐시키므로써, 펩티드 결합의 형성에 바람직한 축합 반응에 방해가 되지 않도록 하는 것이 통상적이다.

폴리펩티드의 합성 방법으로는 다수의 방법이 있으며, 차폐 인자 역시 다수가 고안되어 있다. 이들 방법의 대부분은 본 발명의 펩티드에 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드의 합성에 바람직한 방법은 메리필드(Merrifield) 법이다. 이 방법에서는, 아미노산을 에스테르 결합에 의해 수지 입자에 결합시키고, 성장하는 쇄에 보호된 아미노산을 연속적으로 첨가하여 연속 방식으로 펩티드를 형성시킨다. 일반적인 방법은 잘 공지되어 있으며, 많은 문헌, 예를 들어 메리필드, 알.비의 문헌 [Jour. Amer. Chem. Soc. 96 2986-2993, (1964)]에 기재되어 있다.

그러나, 공지된 방법을 변형시키면, 산 공여체로서 포름산을 대신 사용하는 전이 수소화 방법을 통해 고형 지지체로부터 펩티드를 방출시키는 통상의 HF 단계를 생략할 수 있다. 이 방법에 의하면 거의 순수한 펩티드의 방출이 이루어지며, 또한 리신의 ε-NH₂기로부터 보호기가, 티로신으로부터 벤질 에스테르가 제거된다.

본 발명에서 예상할 수 있는 또다른 가능성은, 예를 들어 당업계에 잘 공지된 방법을 통해 비펩티드 결합으로 아미노산 잔기를 결합시키는 것이다. 이 방법에 의하면, 장에서 효소적 가수분해가 감소할 것이다.

보다 통상적으로, 본 발명에 유용한 천연 아포단백질은, 천연 원료(예, 혈청)로부터 분리를 통해 제조할 수 있거나, 또는 전술한 바와 같이 재조합 DNA 기술 또는 펩티드 합성 기술 등의 기타 다른 방법을 통해 제조할 수도 있다. 아포단백질은 단백질 동종성(제조시 다른 단백질은 존재하지 않는다는 의미)이 이루어질 때까지 분리되는 것이 바람직하나 필수적인 것은 아니며, 또한 이들은 전체 동종성(유효량의 다른 분자가 전혀 존재하지 않는다는 의미)이 되도록 분리될 수도 있으나, 역시 필수적인 것은 아니다. 일부 지질은 생체내 아포단백질과 천연적으로 결합되어 있으므로, 단백질 동종성으로의 분리가 최적의 방법이다. 아포 A-1의 지질화된 형태는 탈지된 분자보다 큰 활성을 갖는 것으로 밝혀졌으며, 이러한 이유로 인해 바람직하다. 지질화는 자연적인 과정일 수 있으며, 이러한 경우 아포단백질은 그 천연 지단백질의 대응물로서 투여할 수도 있다. 그러나, 부분 지질화된 (또는 탈지된) 아포 단백질 및 다른 지질화된 아포단백질(비천연 지단백의 특성과 결합되어 있음)도 역시 유용하다.

임의의 적당한 숙주에서 아포단백질을 생성시키는 데에는 재조합 DNA 기술을 사용할 수도 있다. 일부 아포단백질의 단백질 및 DNA 서열은 이미 밝혀졌으며, 하기에는 포괄적인 것이 아닌 대표적인 리스트를 제시하였다.

래트의 아포 D: 스프레이어(Spreyer) 외 다수의 문헌 [EMBO J 9(8) 2479- 2484(1990)],

래트의 아포 A-4: 보거스키(Boguski) 외 다수의 문헌 [Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81(16) 5021-5025 (1984)],

래트의 아포 A-1: 보거스키 외 다수의 문헌 [Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 82 992-996 (1985)],

인간의 아포 E (ε-4 대립유전자): 다스(Das) 외 다수의 문헌 [J. Biol. Chem. 260(10) 6240-6247(1985)],

인간의 아포 E (ε-2 및 ε-3 대립유전자): 재니스(Zanis) 외 다수의 문헌 [J. Biol. Chem. 259(9) 5495-5499(1984)],

인간의 아포 C-2: 웨이(Wei) 외 다수의 문헌 [J. Biol. Chem. 260(28) 15211-15211(1985) 및 (오자) 261(8) 3910(1986)],

인간의 아포 B-100: 크노트(Knott) 외 다수의 문헌 [Science 230(4721) 37-43(1985)],

인간의 아포 A-1: 쇼울더(Shoulders) 외 다수의 문헌 [Nucleic Acids Res. 11(9) 2827-2837(1983)],

인간의 아포 C-3: 프로터(Protter) 외 다수의 문헌 [DNA 3(6) 449-456 (1984)],

인간의 아포 A-4: 엘셔바기(Elshourbagy) 외 다수의 문헌 [J. Biol. Chem. 262(17) 7973-7981(1987)], 및

인간의 아포 A-2: 크노트 외 문헌 [Nucleic Acids Res. 13(17) 6387-6398(1985)].

상기 참고 문헌의 전문은 질문 "아포"를 사용하여 NIH ENTREZ 분자 생물학 데이터베이스로부터 입수할 수 있다. 기존의 서열 정보는, 표준 방법을 통해 아직 클로닝되지 않은 아포단백질 중 임의 단백질의 유전자(cDNAs 또는 게놈 상태로) 클로닝을 가능하게 해준다.

재조합 아포단백질, 다른 단백질 또는 펩티드의 형질 발현은, 미생물(예, 에스케리챠 콜리 등의 세균, 또는 사카로마이세스 세레비시애 등의 진균류), 곤충 또는 포유 동물 여부와 무관하게 임의의 적당한 숙주에서 이루어질 수 있다. 사용된 숙주에 따라, 임의의 해독후 변형(예, 글리코실화)의 성질 및 정도는, 천연 상태와 다르거나 또는 변형이 이루어지지 않은 것으로 입증될 수 있다. 임의의 작용성 아포단백질은 해독후 입증된 변성이 이루어졌는 지의 여부와 무관하게 본 발명에 유용하다.

본 발명의 실행시에는 1종 이상의 다른 분자를 투여할 수도 있다. 실제로, 특정의 천연 지단백(예, 유미지립, 유미지립 잔여물, VLDL, IDL, LDL 및 HDL)을 투여하는 경우, 1종 이상의 아포단백질을 제공할 수 있다. 예를 들어, 전술한 바와 같이 아포 A-1 및 아포 A-2는 HDL 중에 함께 투여할 수도 있으며, 아포 A-1, A-2, A-4 및 B-48은 유미지립 중에 함께 투여할 수도 있다.

본 발명은 펩티드 및 단백질의 용도에만 국한되는 것이 아님을 알 수 있을 것이다. 그보다는 본 발명은 적당한 크기, 형태 및 극성도를 가지거나, 또는 그러한 영역을 가진 임의의 분자의 용도까지도 포괄한다. 당, 지질 또는 다른 생물학적 물질 계열의 분자인 합성 펩티드 유사체 또는 다른 유기 분자도 유용할 수 있다.

본 발명에 유용한 분자는 임의의 용이한 경로를 통해 종종 약학적 또는 수의학적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여할 수 있도록 조제될 수 있다. 이로써 제조된 제제가 본 발명의 제3 특징을 이룬다.

비경구 투여용 제제는 대개 무균성일 것이다. 비경구 투여용 약학 제제로는 수성 및 비수성 무균 주사액이 있으며, 이들은 산화방지제, 완충제, 세균 발육 저지제 및 제제가 의도한 수용체의 혈액과 등장 상태를 이루게 하는 용질을 함유할 수 있다. 현탁제 및 농축제를 함유할 수도 있는 수성 및 비수성 살균 현탁액도 또한 본 발명의 영역 내에 포함된다. 상기 제제는 단위 용량 또는 다회 용량의 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알 내에 함유될 수 있으며, 사용 직전에 무균 액체 담체(예, 주사용 수)만을 첨가하면 되는 동결 건조 조건에서 저장할 수 있다. 즉석용 주사액 및 현탁액은 살균 분말, 과립 및 정제 형태로부터 제조할 수도 있다.

그러나, 본 발명에 유용한 분자는, 장으로부터의 흡수를 차단하거나 또는 적어도 방해하는 작용을 하기 때문에, 장내 투여, 특히 경구 투여하는 것이 바람직하다.

경구 및 다른 장내 투여용 제제는 무균성일 필요가 없으며, 단위 투여 형태 또는 다회 투여 형태로 제공할 수도 있다. 경구 제제는 고형물 형태(예, 분말, 과립, 정제, 캡슐(예, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐) 또는 로젠지), 액상 형태(예, 시럽 및 엘릭시르)일 수도 있다. 필요에 따라 충전제 및/또는 담체도 함유될 수 있으며, 약학 제제 분야의 당업자들은 필요에 따라 그러한 추가 또는 대안적 부형제(예, 향료)를 제공할 수 있을 것이다. 경구 투여용 제제는, 위 또는 소장의 인접부에서 아포단백질(들)이 분해되는 것을 방지 또는 약화시키면서 소장까지 전달되도록, 장에 대한 내성을 지니도록 조제할 수도 있다. 정제 또는 캡슐은, 예를 들어 통상의 방법을 통해 장내 코팅할 수 있다. 액상 제제는, 적당한 제제(예, 중쇄 트리글리세리드)와 공동 투여하거나 또는 이것을 함유시켜 효과적인 장 내성을 제공할 수도 있다.

경구 조성물 이외의 장내 조성물로는 좌약 형태의 직장 조성물이 있다. 좌약은 통상 좌약 기제(예, 코코아 버터)를 함유할 것이다. 또한, 활성 성분(들)을 함유한 특정의 제제는 약학 제제 분야의 당업자에 의해 일반적인 방식으로 제조될 수 있다.

예방 또는 치료시 투여되는 아포단백질 또는 다른 활성 분자의 양은 의사의 지시에 따른다. 관례적인 임상 실험을 통해 적정 량을 결정할 것이다. 본 발명에서는 효과적인 투여량만을 투여한다. 그러나, 시험관내 실험의 지침에 의하면, 장내에서의 국소 농도가 1∼5 μM가 되도록 투여할 것을 시사하고 있으며, 이러한 기준에 준하여 아포 A-1를 1∼10 μM로 투여할 수 있으며, 적정 투여량은 2∼5 μM 인 것으로 추측된다. 다른 활성 분자는 상기 범위, 또는 효과적이며 허용적인 것으로 판단된 다른 투여량으로 투여할 수 있다.

본 발명은, 임의의 원인(유전성 또는 식사)에 의한 콜레스테롤 과잉혈증 또는 다른 지질과잉혈증의 예방 또는 치료에 유용하다. 경구 투여가 이들 모두에 바람직할 것이다. 따라서, 본 발명은 동맥경화증의 경구 투여(또는 다른 장내 투여) 형 치료법 또는 예방법을 제공한다.

콜레스테롤의 공급은 내인성 콜레스테롤 및 외인성 콜레스테롤의 장을 통한 흡수 간의 균형에 따라 좌우되므로, 콜레스테롤 생합성 억제제를 함께 투여하는 것이 적당할 수도 있다. 콜레스테롤의 생합성 억제제는 심지어 아포 단백질 또는 본 발명에 유용한 다른 단백질과 함께 투여할 수도 있으나 필수적인 것은 아니고, 이 억제제는 별도로 또는 순차적으로 투여할 수도 있으며, 따라서 이것은 상기 거론된 방법 등의 임의의 용이한 방법을 통해 각각 조제할 수도 있다. 본 발명의 제4 특징에 따르면, 전술한 바와 같이 양친매성 영역을 가진 분자를 함유한 제품, 및 고콜레스테롤 혈증 또는 다른 고지혈증의 예방 또는 치료 및/또는 비만의 예방 또는 치료시 함께, 별도로 또는 순차적으로 투여하기 위한 콜레스테롤 생합성 억제제를 제공한다.

콜레스테롤 생합성 억제제는 HMG-CoA 환원효소 억제제일 수 있다. 그러한 화합물의 일례가 스타틴(statin)이다. 특정의 HMG-CoA 환원효소 억제제로는 천연 발효 생성물 콤팩틴 및 메비놀린(로바스타틴으로도 칭함)이 있으며, 이들 중 몇 개의 예를 들면 디히드로콤팩틴, 디히드로메비놀린, 엡타스타틴, 미국 특허 출원 제4293496호에 개시된 메비놀린의 반합성 유사체, 미국 특허 출원 제4444784호, 제4661483호, 제4668699호 및 제4771071호에 개시된 화합물(심바스타틴 포함), 및 WO-A-9100280 및 WO-A-9115482에 개시된 화합물이 있다. 필요에 따라 1종 이상의 콜레스테롤 생합성 억제제를 사용할 수도 있다.

필요에 따라 담즙산 차단제(예, 콜레스트리라민)이 존재할 수도 있거나, 또는 적어도 추가로 투여할 수도 있다. 그러나, 그러한 차단제를 사용할 경우 본 발명의 잇점 중 하나가 억제되거나 또는 적어도 감소하기 때문에, 그러한 차단제는 종종 제공되지 않을 수도 있다.

본 발명의 각 특성에 대한 바람직한 양태는 서로 필요한 변형을 가하여 구성할 수 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 참고된 모든 특허 및 참고 문헌은 법에서 허용하는 한 최대한 본문에 참고 인용한다.

이제부터는 하기 실시예를 통해 본 발명을 설명할 것이다. 실시예에서는 다양한 약어를 사용하였으며, 이들의 의미는 다음과 같다.

아포 A-1 아포지단백질 A-1(또는 A-I)

아포 A-2 아포지단백질 A-2(또는 A-II)

BBM 쇄자연 막

BBMVs 쇄자연 막 소포

DMPC 디미리스토일 포스파티딜콜린

EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산 2나트륨염

FH 유전적 콜레스테롤 과잉혈증

HDL 고밀도 지단백질

LDL 저밀도 지단백질

PAGE 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법

PC 포스파티딜콜린

rpm 분당 회전수

SDS 나트륨 도데실 설페이트

SUVs 소형 단엽 소포

Tris 트리스[히드록시메틸]아미노메탄

실시예는 하기 첨부된 도면에 관한 것이다.

재료: 나트륨 덱스트란 설페이트, 페닐 SEPHAROSE(등록상표명) 6 Fast Flow(low sub), SEPHADEX(등록상표명) G-50, PBE^TM94 및 POLYBUFFER(등록상표명) 74는 파마시아(스위스 듀벤도르프 소재)에서 구입하였고, 에그 PC 및 디미리스토일 PC는 리피드 프로덕츠(영국 너트필드 소재)에서 구입하였으며, 마우스 모노클로널 항-인간 아포지단백질 A-1 항체(비결합형) 및 BCA^TM단백질 분석 시약은 피어스(스위스 로잔느 소재) 제품, 콜레스테롤(순도 ≥99%) 및 나트륨 타우로콜레이트(순도 ≥ 97%)는 플루카(스위스 북스) 제품, 콜레스테릴 올레이트(순도 ≥ 98%), 올레산(순도 ∼ 99%) 및 염소 항-마우스 면역글로불린 G(알칼리성 포스파타제 결합형)는 시그마(스위스 북스) 제품, 모든 방사능화학제품은 아머샴(영국, 북스), 폴리프로필렌 ECONO-COLUMNS^TM(0.7^*4㎝), MINI-PROTEIN(등록상표명) II Dual Slab Cell, 저분자량 범위의 기준물질 및 30% 아크릴아미드/비스 용액은 바이오래드 레보레이토리즈(스위스 글래트브루그) 제품을 사용하였다. 기타 모든 화학제품은 최상품을 사용하였다. 물은 2차 증류수만을 사용하였다. 동결된 양 혈청은 바슬 인스티튜트 오브 임뮤놀로지(스위스 바슬)에서 입수하여, 사용 전까지 -80℃에 보관하였다. 인간 아포단백질 A-1 및 A-2와 인간 HDL₃은 미국 펜실베니아주 필라델피아에 소재하는 더 메디칼 콜리지 오브 펜실베니아에서 연구중인 엠.씨.필립스 박사에게서 얻었다.

실시예 1: 콜레스테롤 흡수 억제제 분리

스테롤 흡수 활성 억제는 공여체로서 1 mol% [³H] 콜레스테롤을 함유하는 에그 PC SUV와 수용체로서 래빗 BBMV를 사용하여 교환 반응으로 측정하였다. 래빗 BBMV는 문헌[Hauser et al., Biochimica et Biophysica Acta 602 567-577(1980)]에 기재된 바에 따라 제조하였다. 콜레스테롤과 콜레스테릴 올레일 에테르를 각각 미량으로 함유하는 에그 PC의 SUV는 전술한 바와 같이[Thurnhofer et al., Biochimica et Biophysica Acta 1024 249-262(1990)]에 기재된 바와 같이 트리스/NaCl(50 mM 트리스, pH = 7.4, 150 mM NaCl, 0.2% NaN₃) 중에 분산시킨 지질 분산액을 팁 초음파처리하여 제조하였다. 트리스/NaCl 중에 분산된 공여체와 수용체의 분산액을 Beckman AIRFUGE^TM로 4℃에서 2분 동안 100000g로 원심분리하였다. 수용체 분산액으로부터 얻은 펠릿을 트리스/NaCl에 최종 농도가 1.7 ㎎ 단백질/㎖가 되게 재현탁시키고 동일 완충액으로 다양한 억제 활성 양을 만들었다. 이 현탁액을 공여체 분산액의 상청액 일정량(상부 80%)과 혼합하였다(0 시간). 이 혼합물 중에 존재하는 공여체의 최종 농도는 0.2 ㎎ 총 지질/㎖이었다. 이 혼합물을 25 ℃에서 20분동안 항온처리하였고, 이 시료를 2배 부피의 트리스/NaCl로 희석하여 교환 반응을 정지시켰으며, 상기 에어퓨즈를 이용하여 4℃에서 2분동안 100,000g로 원심분리함으로써 공여체와 수용체를 분리하였다. 공여체 소포를 함유하는 상청액 중에 나타나는 방사능활성과 BBMV(수용체)를 함유하는 펠렛 중에 나타나는 방사능활성을 Beckman LS 7500 신틸레이션 계수기로 측정하였다. 그 결과는 억제 활성 부재시 수용체가 흡수하는 스테롤에 대한 억제 활성 존재시 수용체가 흡수하는 스테롤의 비율(%)로서 나타냈다.

억제 활성은 양 혈청에서 분리하였다. 혈청은 다음과 같이 덱스트란 설페이트를 이용하여 분획화하였다. 혈청 100 ㎖를 해동시켜, 0.15 M NaCl 중의 나트륨 덱스트란 설페이트 10% 용액 0.5 ㎖ 및 1 M MnCl₂5 ㎖와 실온에서 혼합하였다. 다른 표시가 없는 한, 모든 조작은 실온에서 실시하였다. 침전이 즉시 시작되었고, 이 시료를 6000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 종료시켜 상청액 S1과 펠렛 P1을 얻었다. S1을 회수하였고, 10% 덱스트란 설페이트 용액 6 ㎖와 1M MnCl₂15 ㎖를 첨가하였다. 이 혼합물을 2 시간동안 항온처리한 후, 20000g에서 30분동안 원심분리하였다. 상청액(S2)은 버렸다. 얻은 펠렛(P2)을 0.1% 덱스트란 설페이트와 0.1M MnCl₂를 함유하는 트리스/NaCl에 재현탁시키고 전술한 바와 같이 원심분리하여 세척하였다. 상청액(S3)은 버리고 1% NaCl을 함유하는 2% 구연산 나트륨 10 ㎖에 펠렛(P3)을 분산시킨 후 교반하에 1M NaOH를 적가하여 pH를 8로 조정하였다. 얻어지는 혼탁한 분산액을 6000 rpm에서 10분동안 원심분리하여 MnO를 제거하였다. 상청액(S4)을 회수하였다. P1은 10% NaHCO₃2㎖로 재용해시켰다. MnCO₃가 형성되었고, 이것은 MSE 스윙 아웃 원심분리기로 500 g에서 2분동안 원심분리하여 제거한다. 상청액(S5)은 50 mM 트리스(pH 7.4) 100 ㎖와 2 M MgCl₂2.5 ㎖를 첨가하여 침전시키고 6000 rpm에서 10 분동안 원심분리하여 회수하였다. 얻은 펠렛(P6)을 5% NaCl 2 ㎖로 재현탁시키고 전술한 바와 같이 2회 이상 재침전시켰다. 최종 펠렛(P7)을 10% 구연산 나트륨 1.5 ㎖에 재현탁시키고 1% NaCl을 함유하는 트리스(pH 7.4)에 대하여 투석하여 Mg²⁺를 제거하였다. S2, S4 및 투석한 P7은 1% BaCl₂, 1% NaCl에 대하여 투석하고 6000g에서 10분동안 원심분리하여 침전된 덱스트란 설페이트 바륨 염을 제거하고 트리스/NaCl에 대하여 투석하였다. 단백질 농도과 억제 활성을 측정하였고 결과를 표 1에 요약하였다.

시료	단백질(㎎)	억제(au)	비활성 (억제/단백질 ㎎)
혈청	9724(100)	4180000(100)	430
S2	7035(72)	370000(9)	53
S4	667(7)	1260000(30)	1889
P7	39(0.4)	138000(3)	3540
수율(%)	80	42

표 1 - 주해. 양 혈청의 덱스트란 설페이트 분획: 양 혈청은 본 실시예에서 전술한 바와 같이 덱스트란 설페이트로 연속 분획화하였다. 단백질 농도는 피어스 (Pierce) BCA^TM단백질 분석 시약으로 측정하였다. 억제 활성은 억제제 부재하의 흡수에 대한, 억제제 존재하의 수용체에 의한 스테롤 흡수의 비율로서 나타내며, 임의 유닛(au)으로 표현한다. 괄호 안의 값은 양 혈청에 상대적인 동량에 대한 %이다.

대부분의 억제 활성을 함유하는 S4는 소수성 상호작용 크로마토그래피로 추가 정제하였다. 칼럼(내경 = 2.8 ㎝)을 페닐 세파로스 6 파스트 플로우 40 ㎖로 채우고 2 M NaCl을 함유하는 50 mM 트리스(pH 7.4)로 평형화시켰다. 크로마토그래피 실험을 통해 사용된 유속은 4 ㎖/min으로 하였다. S4(단백질 600 ㎎)에 고체 NaCl을 충분히 첨가하여 NaCl 농도를 2 M로 만들었다. 동일 완충액을 사용하여 통과(flow-through) 단백질을 유출시켰다. NaCl 농도를 0.15 M로 낮추어 칼럼을 연속 세정하고(분획 1), 물(분획 2)과 15% 에탄올(분획 3)로 용출시켰다. 단백질 농도와 억제 활성을 측정하고 그 결과를 표 2에 요약한다.

분획	단백질(㎎-%)	억제(au)	비활성 (억제/단백질 ㎎)
S4	600(100)	11334400(100)	1889
통과	362(59)	28289(2)	78
분획 1	72(12)	31148(2)	44
분획 2	35(6)	955172(72)	27290
분획 3	4(0.6)	162750(12)	40688
수율(%)	78	88

표 2 - 주해. S4의 소수성 상호작용 크로마토그래피: 양 혈청의 덱스트란 설페이트 분획에서 얻고 스테롤 흡수 억제 활성이 증강된 분획 S4는 본 실시예에서 전술한 바와 같은 페닐 세파로스 6 파스트 플로우를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피로 더 정제하였다. 단백질 농도는 피어스 BCA^*단백질 분석 시약으로 측정하였다. 억제 활성은 억제 활성 부재하의 흡수에 대한, 억제 활성 존재하의 수용체에 의한 스테롤 흡수의 비율로서 나타내며, 임의 유닛(au)으로 표현한다. 괄호 안의 값은 분획 S4에 상대적인 동량에 대한 %이다.

분획 2는 크로마토포커싱으로 최종 정제하였다. 칼럼(내경 ∼ 1 ㎝)은 20 ㎖의 PBE 94로 채우고 25 mM 이미다졸-HCl(pH 7.3)으로 평형화하였다. 이 크로마토그래피 실험을 통한 유속은 0.5 ㎖/min으로 하였다. 분획 2(단백질 34 ㎎)를 장입하고, 280 nm에서의 흡광도가 기준선(분획 PBE-FT)에 도달할 때까지 칼럼을 세척하였다. 단백질은 물을 사용하여 1:8로 희석하고 HCl로 pH 4.0으로 평형화시킨 POLYBUFFER 74로 형성되는 선형 pH 구배로 용출시켰다. 분획 8 ㎖를 수거하였다. 분획의 단백질과 억제 활성 측정 전에, 폴리프로필렌 ECONO-COLUMN을 채우고 트리스/NaCl로 평형화시킨 SEPHADEX G-50 2.0 ㎖에 상기 분획 0.5 ㎖를 장입하여 Polybuffer 74를 제거하였다. 단백질과 억제 활성의 회수율은 각각 100% 및 82%였다(도 1). 분획은 도 2에 도시한 바와 같이 SDS-PAGE 분석되었다.

실시예 2: 아포단백질 A-1로서 정제된 억제제의 특성

실시예 1에 기재된 바와 같이 PBE94 칼럼(분획 28-PBE94)에서 얻은 분획 28의 물리적 특성은 표 3에 요약하였다.

단백질	등전점	분자량(kDa)
분획 28-PBE94	5.40	28.2(SDS-PAGE)27.57(MS)
인간 아포 A-1	5.52	28.3
래빗 아포 A-1	5.50	25 ∼ 27

표 3 - 주해. 정제 억제제(분획 28-PBE94)의 일부 물리적 특성 : 분획 28-PBE94의 등전점은 PBE94 칼럼에서 용출되는 pH로서 측정하고, 분자량은 SDS-PAGE 또는 질량분광분석기(MS)로 측정하였다. 비교용으로서, 문헌[Chapman, Academic Press, Inc. San Diego. New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto 70-143(1986)]에 기재된 인간 및 래빗의 아포 A-1에 대한 값을 사용하였다.

양 아포 A-1의 특성에 대해서는 아직 보고된 바 없어, 비교용으로서 인간과 래빗의 아포 A-1에 대해 보고된 물리적 특성을 사용하였다[Chapman, Academic Press, Inc. San Diego. New York, Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto 70-143(1986)]. 분획 28-PBE94의 N-말단 아미노산 분석 결과, 분획 28-PBE94의 처음 29개 아미노산은 래트 아포 A-1과 79.3% 동일하고, 래빗 아포 A-1과 69.0% 동일하며, 소 아포 A-1과 86.2% 동일하고, 인간 아포 A-1과 65.0% 동일하였다. 웨스턴 블로팅 실험에서 분획 28-PBE94는 마우스 모노클로널 항-인간 아포 A-1 항체와 교차반응하였다. 분획 28-PBE94는 단백질 1 ㎎당 총 콜레스테롤(유리 콜레스테롤 및 에스테르화된 콜레스테롤) 0.26 ㎎을 함유하며, 밀도가 d=1.21 g/㎖인 NaBr 용액에서 원심분리시 부유하는 것으로 나타났다. 이것이 고밀도 지단백질의 부유 밀도이다. 문헌[Nichols et al., Biochimica et Biophysica Acta 446 226-239(1976)]에 기재된 바에 따라 분획 28-PBE94는 구아니딘 HCl 처리한 후, 분획 28-PBE94를 탈지질화한 결과, 인간 아포 A-1과 동일한 양태를 나타내었다. 그 억제 활성이 단백질에 의한 억제 활성인지를 증명하기 위하여, 분획 28-PBE94와 대조군으로서 인간 아포 A-1을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키거나 또는 5분 가열과 5분 얼음상에서의 냉각 처리를 4회 반복하였다. 변성 단백질은 원심분리로 제거하고, 상청액에 남아있는 단백질과 억제 활성을 측정하였다(표 4).

	단백질(%)	억제율(%)
인간 아포 A-1	0	7.5±1.3
TCA 침전후
가열/냉각후	27	18.7±5.1
분획 28-PBE94	0	13.1±4.8
TCA 침전후
가열/냉각후	66	50.3±3.1

표 4 - 주해. 억제 활성의 변성: 억제 활성은 본 실시예에서 전술한 바와 같이 10% TCA에 노출시키거나 또는 4회 가열/냉각 사이클로 처리하여 변성시켰다. 그 결과는 변성 단백질을 원심분리로 제거한 후 상청액 중에 남아있는 단백질, 및 스테롤 흡수 억제 활성의 비율로서 나타냈다.

실시예 3: 래빗 BBMV의 콜레스테롤 흡수에 대한 아포 A-1과 아포 A-2의 효과

공여체로서 SUV에 대한 래빗 BBMV의 스테롤(유리 콜레스테롤 또는 에스테르화된 콜레스테롤) 흡수율을 실시예 1에 기재된 바와 같이 각각 20 ㎍의 인간 아포 A-1, DMPC 이중층 중으로 재병입시킨 인간 아포 A-1(2.5 ㎎ DMPC/아포 A-1 ㎎), 분획 28-PBE94 및 인간 HDL₃존재하에 측정하였다. 도 3은 (a) 인간 아포 A-1; (b) 문헌[Brouillette & Anantharamaiah Biochim, Biophys. Acta 1256 103-109(1995)]에 기재된 바와 같이 인간 아포 A-1과 DMPC(1 : 2.5 = 중량비)로부터 복원된 지단백 복합체; (c) 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 정제된 양 아포 A-1; 및 (d) 밀도 범위 d = 1.125 ∼ 1.21 g/㎖인 인간 HDL₃존재하에 콜레스테롤 흡수 억제율을 나타내는 막대 히스토그램이다. 콜레스테롤 흡수율은 억제제의 존재 또는 부재하에 공여체로서 1 mol%의 방사능표지된 콜레스테롤을 함유하는 에그 PC의 SUV와 수용체로서 래빗 소장 BBMV를 사용하여 25 ℃에서 측정하였다. 공여체와 수용체는 모두 50 mM 트리스 완충액(pH 7.4), 0.15 M NaCl, 0.2% NaN₃중에 분산시킨 후 각각 최종 농도가 0.05 ㎎의 총 지질/㎖ 및 1.7 ㎎의 단백질/㎖이 되게 혼합하였다. 이러한 모든 시료에서 아포 A-1의 양은 20 ㎍ 단백질/㎖로 일정하게 유지하였다. 아포 A-1 존재하에 억제율은 억제제 부재하에 측정한 콜레스테롤 흡수율(%)로 나타내었다. 각 막대의 상부에 표시된 검은색 부분은 3회 측정값의 표준 편차이다.

도 4A는 증가량의 분획 28-PBE94(정사각형)와 인간 아포 A-1(마름모형) 존재하에 스테롤 흡수의 억제율을 도시한 것이다. 공여체로서 1 mol% 콜레스테릴 올레이트와 미량의 [1,2-³H₂(N)]-콜레스테릴 올레일 에테르(37 Ci/mmol, 영국 아머샴)를 함유하는 에그 포스파티딜콜린의 소형 단엽 소포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하고 수용체로서 BBMV를 래빗 소장으로 제조하였다(실시예 1 참조). 공여체와 수용체는 모두 트리스/NaCl 완충액(0.05 M 트리스 HCl pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.02% NaN₃)에 분산시키고, 이와 동일한 완충액에 인간 아포 A-1 또는 양의 HDL을 용해시킨 용액을 0 시간째 혼합하여(총 부피 0.1 ㎖), 공여체와 수용체의 최종 농도를 각각 총 지질 0.05 ㎎/㎖ 및 단백질 1.7 ㎎/㎖로 만들었다. 25 ℃에서 20 분동안 억제제 존재하에 공여체와 수용체의 현탁액을 항온처리한 후, 반응을 트리스/NaCl 완충액 2 부피로 희석하여 정지시켰다. 공여체와 수용체를 에어퓨즈로 4 ℃에서 2분동안 115,000g로 원심분리하여 분리하고, 공여체 소포를 함유하는 상청액과 BBMV를 함유하는 펠렛 중의 방사능활성을 BECKMAN^TMLS 7500 신틸레이션 계수기로 측정하였다. 인간 HDL을 탈지질화(Scanu & Edelstein, Anal.Biochem. 44 576-588(1971)] 및 Q-세파로스^TM상에서의 이온 교환 크로마토그래피[Weisweiler, Clin.Chim.Acta. 169 249-254(1987)]하여 정제된 인간 아포A-1과 아포A-2를 제조하였다. 아포A-1과 아포A-2의 순도는 PHAST^TM전기 영동 시스템(파마시아 제품)을 사용하여 8 내지 25% 구배 겔을 이용한 SDS-PAGE로 검측하였다. 두 단백질 모두 상부장입된 겔에서 단일 밴드를 나타내었다. 단백질은 사용하기에 앞서 3 M 구아니딘 HCl중에 가용화하고 트리스/NaCl 완충액에 대하여 투석하였다.

도 4B는 증가량의 인간 아포 A-1, 인간 아포 A-2, 양의 HDL 및 인간 LDL의 함수로서 억제제 효과를 나타낸 것이다. 실험 조건은 도 4A에 기재한 바와 같다. 억제 활성의 부재하에 측정한 BBMV의 콜레스테롤 흡수 활성을 100%라고 하고 억제제 존재하에 관찰된 활성 손실을 %로 나타내었다. 실험 결과는 문헌[Rodbard & Frazier, Methods Enzymol. 37 3-22(1975)]의 방법에 따라 맞추어 실선을 작도하였다. 양 HDL(◆), 인간 아포 A-1(■), 인간 아포 A-2(△), 양 LDL(▲).

IC₅₀은 억제율 50%가 관찰되는 억제제 농도이다. IC₅₀값은 도 4B에 나타낸 그래프의 굽힘점으로부터 얻었고, 그 결과를 하기 표 5에 기재한다.

억제제	IC-50(㎍/㎖)
양의 HDL아포 A-I아포 A-IILDL	172566143

실시예 4: 아포 A-1과 래빗 BBMV의 예비항온처리 효과

스테롤 흡수 억제가 단지 공여체와 상호작용하는 아포 A-1(분획 28-PBE94 형태의 지질 유리 형태 또는 부분 탈지질화 형태)에 의한 것이 아님을 입증하기 위해, 단백질 농도가 1.7 ㎎/㎖인 래빗 BBMV를 0.46 μM 인간 아포 A-1 또는 0.59 μM 분획 28-PBE94와 5분동안 항온처리하였다. 분산액을 베크만 에어퓨즈에서 4℃하에 100000g에서 2분동안 원심분리한 후, 상청액은 제거하고 래빗 BBMV 및 결합된 억제제 단백질을 함유하는 펠렛을 동량의 트리스/NaCl 중에 재현탁시켰다. 공여체 SUV를 첨가하고 콜레스테롤 흡수는 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하였다. 0.46 μM 인간 아포 A-1 또는 0.59 μM 분획 28-PBE94 존재하의 흡수 억제율은 대조군으로서 측정하였다. 흡수율 측정 이전에 억제제 단백질에 노출시킨 래빗 BBMV는 대조 시료에서 측정한 억제 활성의 30 ± 4%의 활성을 나타내었다.

실시예 5: 공여체로서 혼합 담즙염 미셀을 사용한 스테롤 흡수의 억제

담즙염 미셀은 소장 중에 존재하는 가장 중요한 지질 운반체인 바, 공여체로서 혼합 담즙염 미셀을 사용하여 스테롤 흡수 억제를 측정하였다. 50 mM 타우로콜레이트, 6 mM 올레산 및 20 μM 방사능표지된 콜레스테롤로 만들어진 공여체 미셀을 다음과 같이 제조하였다. 상기 지질들을 전술한 농도하에 2:1의 클로로포름:메탄올 중에 혼합하고, 유기 용매를 회전 증발하여 제거하였다. 얻어지는 지질 막을 고진공하에 1시간 이상동안 건조하였다. 건조 막을 적당량의 트리스/NaCl 중에 분산시켜 목적하는 미셀 농도를 얻었다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조한 수용체 래빗 BBMV는 1.56 μM 인간 아포 A-1 또는 1.98 μM 분획 28-PBE94와 혼합하였다. 공여체 혼합 미셀을수용체/억제제 분산액에 5 mM 타우로콜레이트, 0.6 mM 올레산 및 2 μM 방사능표지된 콜레스테롤의 최종 농도로 첨가하고 그 혼합물을 25 ℃에서 10분동안 항온처리하였다. 반응은 혼합물을 베크만 에어퓨즈로 4 ℃하에 2분 동안 100000g로 원심분리하여 정지시켰다. 펠렛과 상청액의 방사능활성을 측정하고 그 결과를 실시예 2에 기재된 바와 같이 평가하였다. 아포 A-1과의 항온처리는, 공여체로서 SUV를 사용하여 동일한 억제제 농도에서 측정한 억제 활성의 12%를 나타냈고, 분획 28-PBE94와의 항온처리는, 공여체로서 SUV를 사용하여 동일한 억제제 농도에서 측정한 억제 활성의 23%를 나타냈다.

실시예 6 : 쇄자연막에서 콜레스테릴 올레이트 흡수에 대한 각종 천연 아포단백질과 변형 아포단백질의 IC₅₀값

천연(인간) 아포 단백질 아포 A-I, 아포 A-II, 아포 A-III, 아포 A-IV, 아포 C-I, 아포 C-II, 아포 C-III₁, 아포 C-III₂및 아포 E와 변형 아포단백질 Ac-18A-NH₂의 IC₅₀값을 측정하였다. Ac-18A-NH₂는 다음과 같으며, 문헌[Venkatachalapathi et al., PROTEINS: STRUCTURE, FUNCTION, and genetics 15 349-259(1993)]에 개시되어 있다.

Ac-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH₂

완충액(0.05 M 트리스 pH 7.4, 0.15 M NaCl) 84.5 ㎕중에 용해시킨 억제제 적당량을 에펜도르프 튜브에 넣고, 동일한 완충액에 분산시킨 공여체 분산액 5 ㎕ 및 수용체 분산액[즉, 쇄자연 막 소포(BBMV)] 10.5 ㎕와 반응 기점에서 혼합하였다. 공여체 소포의 최종 농도는 총 지질 0.1 ㎎/㎖이고, 수용체의 최종 농도는 단백질 2 ㎎/㎖이었다. 얻어지는 혼합물을 25 ℃에서 20분동안 항온처리하고, 항온처리액 60 ㎕를 에어퓨즈 튜브 중에 함유된 빙냉 완충액 120 ㎕에 첨가하여 반응을 정지시켰다. 이와 같이 희석된 분산액을 에어퓨즈 중에서 4 ℃하에 2분동안 100000g로 즉시 원심분리하여 BBMV로부터 공여체 소포를 분리하였다. 2개의 공여체(상청액) 60 ㎕ 일정량을 베크만 LS 7500 액체 신틸레이션 계수기로 계수하여 공여체 중에 존재하는 방사능활성을 측정하였다.

공여체 소포의 제조

콜레스테롤 올레이트 1 mol%와 미량의³H-콜레스테롤 올레일 에테르를 함유하는 소형 단엽 에그 포스파티딜콜린(PC) 소포는 CHCl₃/CH₃OH(2:1, 부피비) 중에 적당량의 지질을 용해시키고, 그 용액을 회전 증발기로 건조시킨 뒤 잔류물을 진공하에 건조시켜 제조하였다. 건조된 지질막을 적당한 부피의 완충액에 수동 진탕으로 분산시켰다. 그 지질 분산액을 문헌[Brunner et al., J.Biol.Chem.253 7538-7546(1978)]에 기재된 바와 같이 팁 초음파 처리하였다. 이와 같이 처리된 완충액 중의 공여체 분산액을 에어퓨즈로 4℃하에 2 분동안 100000g로 원심분리하였다. 원심분리 후 공여체 분산액의 상부 80% 만을 지질 흡수 실험에 사용하였다.

BBMV 분산액의 제조

문헌[Hauser et al., Biochim.Biophys.Acta 602 567-577(1980)]에 기재된 바와 같이 동결된 래빗 소장으로부터 BBMV를 제조하였다. IC₅₀값을 측정하는 흡수 실험에 사용하기에 앞서, BBMV를 세척하여 BBM으로부터 해리된 임의의 유리 단백질을 제거하였다. 이러한 제거과정은 BBMV 분산액을 에어퓨즈 튜브에서 완충액으로 1:1 희석한 뒤, 희석된 분산액을 에어퓨즈로 4℃하에 2분동안 100000g로 원심분리하여 실시하였다. 상청액은 조심스럽게 버리고, 펠렛은 BBMV 분산액의 원래 부피에 해당하는 양의 완충액에 재현탁시킨 뒤 분산액을 균질화하였다.

아포지단백질 용액의 제조

완충액 중의 아포지단백질 용액은 아포지단백질을 3 M 구아니딘 HCl중에 약 1 ㎎/㎖로 용해시키고 얻어지는 용액을 컷오프가 8kDa인 투석관을 사용하여 완충액에 대하여 철저하게 투석하여 만들었다.

IC₅₀값은 하기 표 6에 나타낸다.

쇄자연막에서 콜레스테릴 올레이트 흡수율의 IC₅₀값

아포지단백질	IC50(㎍/㎖)	IC50(μM)
아포 A-1아포 A-2아포 A-4아포 C-1아포 C-2아포 C-31아포 C-32아포 E	14±366±532±412±219±14.8±0.84.2±0.295±7	0.5±0.13.8±0.30.7±0.11.8±0.42.1±0.10.6±0.10.5±0.12.9±0.2
Ac-18A-NH2	35±2	16±1
Ac-D W L K A F Y D K V A E K L K E A F-NH2

실시예 7: Ac-18A-NH₂에 대한 추가 실험

소포 제조

인간 복부의 생검 시료인 습윤 조직 20 내지 30 ㎎을 각각 완충액(12 mM 트리스-HCl pH 7.2, 300 mM 만니톨, 5 mM EGTA, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드) 200 ㎕에 현탁시키고, 액체 질소 중에 동결시킨 후, 사용전까지 -80 ℃에 보관하였다. BBMV는 문헌[Booth et al., Lancet 1 1066-1069(1985)]에 상세하게 기재된 바와 같이 Mg⁺²침전법[Hauser et al., Biochim.Biophys.Acta 602 567-577(1985)]으로 제조하였다. BBMV의 프로테이나제 K 처리는 문헌[Thurnhofer and Hauser, Biochim.Biophys.Acta 1024 249-262(1990)]에 기재된 바와 같이 실시하였다. 단백분해 처리는 단백질 함량과 BBMV의 슈크라제 비활성을 ∼60% 감소시켰다. 소형 단엽 인지질 소포는 팁 초음파처리로 제조하였다[Schulthess, Biochemistry 33 4500-4508(1994)].

동력학적 실험

동력학적 실험은 다음과 같은 공지 절차에 따라 실시하였다[Compassi, Biochemistry 34 16473-16482(1995) 및 Tso et al., Am.J.Physiol. 241 G487-497(1981)].

(I) 1 mol% [¹⁴C] 콜레스테롤을 함유하는 에그 PC 소형 단엽 소포와 BBMV를 모두 10 mM 트리스-HCl, pH 7.2, 0.15M NaCl, 5 mM EDTA 중에 분산시켜 실온에서 항온처리하였다. 소정 시간 후, 인지질 소포와 BBMV를 베크만 에어퓨즈로 2 분동안 115000 g로 원심분리하여 분리하였다. 펠렛과 상청액 중에 존재하는 방사능활성은 베크만 LS 7500 액체 신틸레이션 계수기로 일정량을 계수하여 측정하였다. 콜레스테롤 흡수의 가능한 기작으로서 에그 PC 소형 단엽 소포와 BBMV가 융합된다는 것은 종래 연구[Thurnhofer and Hauser, Biochemistry 29 2142-2148(1990); Compassi, Biochemistry 34 16473-16482(1995) 및 Schulthess, J.Lipid.Res.37 2405-2419(1996)]에 상세하게 기재된 바와 같이 가능성이 없어졌다.

(II) 이와 유사하게, 공여체로서 1 mol% [¹⁴C] 콜레스테롤을 함유하는 에그 PC 소형 단엽 소포와 수용체로서 에그 PC/에그 PA(85:15, 몰비)의 소형 단엽 소포를 실온에서 항온처리하였다. 소정의 시간 후, 항온처리 혼합물의 일정량을 DEAE 세파로스 C1-CB 칼럼을 통해 여과시켜 음으로 하전된 소포를 보유하게 하였다. 순수한 에그 PC 소포를 용출시키고 그 방사능활성을 측정하였다.

그 결과를 표 5에 기재하였다.

실험 데이터는 단일 지수 교환 반응에 유효한 하기 수학식에 따라 컴퓨터 산정한다: X = X_∞+ [X₀- X_∞] e^-k1^[(a+b)/a]t, 여기에서 X₀, X 및 X_∞는 각각 0 시간, t 시간 및 평형일 때 공여체 중에 존재하는 표지된 지질의 분획을 나타낸다. K₁은 반응의 허위 1차 속도 상수이며, a 및 b는 수용체 및 공여체 각각의 지질 수집물이다[McKay, Nature 142 997-998(1938) 및 Mutsch et al., Biochemistry 25 2134-2140(1986)].

또한, 동력학 측정은 억제제 존재하에 실시하였는데, 즉 합성 펩티드 또는 아포지단백질을 공여체와 수용체 소포의 억제제에 첨가하였다. 천연 BBMV와 프로테이나제 K 처리된 BBMV에 의한 콜레스테롤 흡수는 증가량의 Ac-18A-NH₂존재하에 측정하였으며, 천연 BBMV와 프로테이나제 K 처리된 BBMV 사이의 콜레스테롤 흡수 차이를 도 6에 단백질 매개의 콜레스테롤 흡수라고 표시하였다. IC₅₀값은 문헌[Methods Enzymol. 37 3-22(1975)]에 따라 측정하였다.

결과

인간 십이지장 BBMV에 의한 콜레스테롤 흡수는 펩티드 조성이 Ac-Asp-Trp-Leu-Lys-Ala-Phe-Tyr-Asp-Lys-Val-Ala-Glu-Lys-Leu-Lys-Glu-Ala-Phe-NH₂(Ac-18A-NH₂)인 양친매성 펩티드 존재하에 측정하였다. 이 펩티드는 부류 A에 속하는 양친매성 α-나선을 형성하며 아포지단백질 A-1(아포 A-1)의 일부 성질과 유사한 것으로 나타났다[Methods Enzymol. 128 627-647(1986)]. H₂N-말단의 아세틸화 및 카르복실 말단의 아미드화는 용액일 때와 지질에 결합되었을 때 모두 펩티드의 나선성을 증가시키는 것으로 밝혀진 바 있다[Proteins 15 349-359(1993)]. Ac-18A-NH₂는 단백질 매개의 콜레스테롤 흡수를 효과적이며 완전하게 억제하는 것으로 나타났다(도 3 및 도 4). 단백질 매개의 콜레스테롤 흡수를 50% 감소시키는 데 필요한 Ac-18A-NH₂의 농도(IC₅₀)는 23 ± 1 μM인 것으로 측정되었다(도 6). 정상의 BBMV와 무베타지단백혈증 BBMV에 대해서도 유사한 억제율이 관찰되었다(도 6). 이와 반대로, Ac-18A-NH₂는 수동 콜레스테롤 전이에 어떤 억제 효과도 나타내지 않았다. 따라서, 60 μM 농도(도 3의 정사각형)에서 Ac-18A-NH₂에 의해 억제될 수 없는 천연 BBMV에 의한 잔류 콜레스테롤 흡수 활성은 수동 콜레스테롤 흡수 때문이다. 프로테이나제 K-처리된 BBMV에 의한 콜레스테롤 흡수의 경우에도 실험적 오차 한도내에서 동일하였으며 반감기가 6.7 ± 1.4 h인 것으로 나타났다. 이와 유사하게, 프로테이나제 K 처리된 BBMV에 의한 콜레스테롤 흡수와 인지질 소포 간의 콜레스테롤 전이에 대해서는 Ac-18A-NH₂가 억제 효과를 나타내지 않는 것으로 나타났다(표 7).

인간 소장 쇄자연막 소포에 의한 [14C] 콜레스테롤 흡수와 Ac-18A-NH2에 의한 흡수 억제
공여체(0.01 ㎎지질/㎖)	수용체(0.25 ㎎지질/㎖)	콜레스테롤 흡수 반감기(*)	억제율 IC50(**)
에그 PC 소포	정상인 BBMV	1.0 ± 0.2 h	23 ± 1 μM
에그 PC 소포	무베타지단백혈증 BBMV	1.1 ± 0.2 h	23 ± 3 μM
에그 PC 소포	프로테이나제 K 처리된 정상 BBMV	7.4 ± 1.2 h	억제 안됨
에그 PC 소포	에그 PC/에그 PA 소포	7.8 ± 1.6 h	억제 안됨
(*) 4회 실험의 평균값 ± 표준 편차(도 1 참조); 무베타지단백혈증 BBMV에 대해서는 실험 오차가 얻어짐.(**) 단백질 매개의 콜레스테롤 흡수를 50% 감소시키는 데 필요한 억제제 농도. 용량 응답 곡선의 부합점으로부터 오차가 얻어짐(도 6 참조).

억제에 주영향을 미치는 구조적 기본이 양친매성 α-나선구조라는 것은 펩티드 Ac-Asp-Trp-Leu-Ala-Lys-Asp-Tyr-Phe-Lys-Lys-Ala-Leu-Val-Glu-Glu-Phe-Ala- Lys-NH₂가 불활성이라는 관찰을 통해 알 수 있었다. 이 펩티드는 Ac-18A-NH₂와 동일한 아미노산 조성을 갖고 있으나 그 아미노산 서열이 펩티드의 양친매성 성질이 없는 무작위적인 배열이라는 의미의 "불규칙 Ac-18A-NH₂"이다.

시험관내에서 관찰되는 억제 효과의 생물학적 관련성은 생체내 실험, 즉 스프라그-돌리(Sprague-Dawly) 래트의 소장에서 나타내는 콜레스테롤 흡수가 양친매성 구조에 의해 80% 이상 억제될 수 있다는 관찰을 통해 확인하였다. 아포 A-1 단백질은 인간의 혈청으로부터 충분량을 정제할 수 있는 바, 아포 A-1을 음식에 첨가하여 억제제로서 사용하였다. 이와 같은 실험적 증거를 바탕으로, 본 발명은 콜레스테롤 흡수에 대한 억제 효과가 특정한 양친매성 분자에만 제한되는 것이 아님을 제안한다. 양친매성 화합물의 화학적 성질은 2차적인 문제이며, 그 화합물의 기하 형태와 극성이 중요한 결정인자이다. 본원에 제시된 결과는 지질, 단백질 또는 탄수화물과 같은 임의 부류의 생물학적 화합물에 속하는 양친매성 분자가 쇄자연막에 의한 콜레스테롤 흡수를 억제하는 바 중요한 의미를 갖는다.

실시예 8

다양한 길이를 가진 양친매성 나선구조 펩티드의 억제 효과

Ac-15A-NH₂, Ac-12A-NH₂및 Ac-9A-NH₂의 활성(억제 효과)을 측정하였다. 이 펩티드의 아미노산 서열은 다음과 같다.

Ac-18A-NH₂: CH₃CO-DWLKAFYDKVAEKLK-EAF-NH₂

Ac-15A-NH₂: CH₃CO-KAFYDKVAEKLKEAF-NH₂

Ac-12A-NH₂: CH₃CO-YDKVAEKLKEAF-NH₂

Ac-9A-NH₂: CH₃CO-VAEKLKEAF-NH₂

이상과 같이, 하나의 아미노산으로부터 다른 아미노산(상단에서 하단으로)으로 가면서 3개의 아미노산이 N-말단으로부터 제거되었다. 전술한 4개 펩티드의 억제 효과는 120 ㎍ 펩티드/㎖로서 비슷하였다. BBMV에 의한 지질 흡수는 하기 기술되는 바와 같이 각각 120 ㎍ 펩티드/㎖ 존재하에 측정하였다.

트리스/NaCl 완충액에 분산된 공여체 및 수용체 입자는 베크만 에어퓨즈에서 4℃하에 2분동안 115000 g로 원심분리하였다. 수용체 분산액에서 얻은 펠렛은 트리스/NaCl 완충액 중에 재현탁시켰다. 동일한 완충액에 용해시킨 다양한 양의 억제제를 수용체 분산액에 첨가하고, 억제제를 함유하거나 함유하지 않는 수용체 분산액을 공여체 분산액의 원심분리로 얻은 상청액 중 상부 80%와 반응 기점에서 혼합하였다. 공여체의 최종 농도는 총 지질 0.05 ㎎/㎖이고 수용체의 최종 농도는 단백질 5 ㎎/㎖ 였다. 얻어지는 분산액을 23 ℃에서 항온처리하고 소정의 시간 경과 후 항온처리액을 트리스/NaCl 완충액 2 부피로 희석하여 스테롤 흡수를 정지시켰다. BBMV는 베크만 에어퓨즈에서 4 ℃하에 2분동안 115000 g로 원심분리하여 공여체로부터 분리하였다. 공여체를 함유하는 상청액과 BBMV(수용체)를 함유하는 펠렛 중의 방사능활성은 베크만 LS 7500 신틸레이션 계수기로 측정하였다.

결과는 억제율%로 표시하며 하기 표 8에 요약한 바와 같다.

	펩티드	콜레스테릴올레이트 흡수 억제율%
1234	Ac-18A-NH2Ac-15A-NH2Ac-12A-NH2Ac-9A-NH2	10085200

펩티드 1과 2에서 유용한 억제 효과가 관찰되었다.

서열 목록

(1) 일반 정보 :

(i) 출원인 :

(A) 성명 : 보펠리 다리오

(B) 스트리트 : 15 애비뉴 536

(C) 도시 : 멘로 파크

(D) 주 : 캘리포니아

(E) 국가 : 미국

(F) 우편번호(ZIP) : 94025

(A) 성명 : 하우저 헬뭇

(B) 스트리트 : 헤르만-힐트브루너베그 25

(C) 도시 : 우에리콘 8713

(D) 주 : 우에리콘

(E) 국가 : 스위스

(F) 우편번호(ZIP) : 없음

(ii) 발명의 명칭 : 콜레스테롤 및 기타 다른 지질 흡수 억제제로서의 양친 매성 분자

(iii) 서열의 수 : 6

(iv) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체 유형 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : IBM PC 호환기종

(C) 작동 체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Version #1.30(EPO)

(v) 현 출원 데이터 :

출원번호 : WO PCT/IB97/00379

(2) 서열 번호 1 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 18 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 3

(D) 기타 정보 : /주 = "Xaa = "알파-나프틸알라닌"

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 7

(D) 기타 정보 : /주 = "Xaa = "알파-나프틸알라닌"

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 10

(D) 기타 정보 : /주 = "Xaa = "알파-나프틸알라닌"

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 14

(D) 기타 정보 : /주 = "Xaa = "알파-나프틸알라닌"

(xi) 서열 :

(2) 서열 번호 2 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 18 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 1

(D) 기타 정보 : /주 = "N-말단 아미노산이 아세틸화됨"

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 18

(D) 기타 정보 : /주 = "C-말단 아미노산이 아미드화됨"

(xi) 서열 :

(2) 서열 번호 3 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 15 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 1

(D) 기타 정보 : /주 = "N-말단 아미노산이 아세틸화됨"

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 15

(D) 기타 정보 : /주 = "C-말단 아미노산이 아미드화됨"

(xi) 서열 :

(2) 서열 번호 4 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 18 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 1

(D) 기타 정보 : /주 = "N-말단 아미노산이 아세틸화됨"

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 18

(D) 기타 정보 : /주 = "C-말단 아미노산이 아미드화됨"

(xi) 서열 :

(2) 서열 번호 5 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 12 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 1

(D) 기타 정보 : /주 = "N-말단 아미노산이 아세틸화됨"

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 12

(D) 기타 정보 : /주 = "C-말단 아미노산이 아미드화됨"

(xi) 서열 :

(2) 서열 번호 6 에 대한 정보 :

(i) 서열 특성 :

(A) 길이 : 9 아미노산

(B) 서열형 : 아미노산

(C) 쇄의 수 : 1본쇄

(D) 형태 : 직쇄상

(ii) 서열의 종류 : 펩티드

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 1

(D) 기타 정보 : /주 = "N-말단 아미노산이 아세틸화됨"

(ix) 서열의 특징

(A) 명칭/키 : 변형 부위

(B) 존재위치 : 9

(D) 기타 정보 : /주 = "C-말단 아미노산이 아미드화됨"

(xi) 서열 :

Claims (53)

1. 장(腸)으로부터 콜레스테롤이나 기타 다른 지질의 흡수를 억제하기 위한 약제 제조에 1개 이상의 양친매성 영역을 함유하는 분자의 용도.
2. 지질과잉혈증, 구체적으로 콜레스테롤과잉혈증 및/또는 비만증을 치료하거나 예방하는데 장 투여하기 위한 약제 제조에 1개 이상의 양친매성 영역을 함유하는 분자의 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분자가 1개 이상의 양친매성 α-나선을 함유하는 펩티드 또는 단백질인 것을 특징으로 하는 용도.
4. 제3항에 있어서, 분자가 아포단백질인 것을 특징으로 하는 용도.
5. 제4항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 A인 것을 특징으로 하는 용도.
6. 제5항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 A-1인 것을 특징으로 하는 용도.
7. 제5항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 A-2인 것을 특징으로 하는 용도.
8. 제5항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 A-4인 것을 특징으로 하는 용도.
9. 제4항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 B인 것을 특징으로 하는 용도.
10. 제9항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 B-48인 것을 특징으로 하는 용도.
11. 제9항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 B-100인 것을 특징으로 하는 용도.
12. 제4항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 C인 것을 특징으로 하는 용도.
13. 제12항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 C-1인 것을 특징으로 하는 용도.
14. 제12항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 C-2인 것을 특징으로 하는 용도.
15. 제12항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 C-3인 것을 특징으로 하는 용도.
16. 제4항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 D인 것을 특징으로 하는 용도.
17. 제4항에 있어서, 아포단백질이 아포단백질 E인 것을 특징으로 하는 용도.
18. 제3항에 있어서, 분자가 천연 아포단백질의 변형체인 것을 특징으로 하는 용도.
19. 제3항에 있어서, 펩티드 또는 단백질이 1개 이상 내지 8개 이하의 양친매성 나선을 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
20. 제3항, 제18항 또는 제19항에 있어서, 분자가 하기 화학식 1로 표시되는 서열을 가진 1개 이상의 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.

    화학식 1

    A₁-B₁-B₂-C₁-D-B₃-B₄-A₂-C₂-B₅-B₆-A₃-C₃-B₇-C₄-A₄-B₈-B₉

    상기 식 중에서,

    A₁, A₂, A₃및 A₄각각이 아스파르트산이나 글루탐산, 또는 이의 동족체 또는 유사체를 나타내고;

    B₁, B₂, B₃, B₄, B₅, B₆, B₇, B₈및 B₉각각이 트립토판, 페닐알라닌, 알라닌, 류신, 티로신, 이소류신, 발린 또는 α-나프틸알라닌, 또는 이의 동족체 또는 유사체이며;

    C₁, C₂, C₃및 C₄각각이 리신 또는 아르기닌을 나타내고;

    D가 세린, 트레오닌, 알라닌, 글리신 또는 히스티딘이나 이의 동족체 또는 유사체를 나타내며;

    잔기 A₄, B₈및 B₉는 선택적이다.
21. 제20항에 있어서, 분자가 Ac-18A-NH₂또는 Ac-15A-NH₂이거나 이 중 어느 하나에 상응하는 비차폐형 또는 차폐형인 것을 특징으로 하는 용도.
22. 제4항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 아포단백질이 천연 공급원으로부터 분리된 것임을 특징으로 하는 용도.
23. 제22항에 있어서, 아포단백질이 단백질 동종성 (기타 다른 단백질이 존재하지 않는다는 의미)로 정제된 것임을 특징으로 하는 용도.
24. 제22항에 있어서, 아포단백질이 전체 동종성(유효량의 기타 다른 단백질이 전혀 존재하지 않는다는 의미)으로 정제된 것임을 특징으로 하는 용도.
25. 제3항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 펩티드 또는 단백질이 재조합 DNA 기법이나 펩티드 합성법으로 제조된 것임을 특징으로 하는 용도.
26. 제4항에 있어서, 아포단백질(들)이 지단백질 형태인 것을 특징으로 하는 용도.
27. 제26항에 있어서, 지단백질이 유미지립을 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
28. 제26항에 있어서, 지단백질이 유미지립 잔유물을 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
29. 제26항에 있어서, 지단백질이 VLDL을 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
30. 제26항에 있어서, 지단백질이 IDL을 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
31. 제26항에 있어서, 지단백질이 LDL을 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
32. 제26항에 있어서, 지단백질이 HDL을 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
33. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분자가 비펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 잔기를 일부분 이상 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
34. 제3항에 있어서, 일부분 이상의 아미노산이 D-아미노산인 것을 특징으로 하는 용도.
35. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분자가 합성 펩티드유사체를 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
36. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분자가 당 및/또는 지질 부를 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
37. 제1항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 기재된 1개 이상의 분자와 약학적 또는 수의학적 허용성 담체를 함유하며, 장 투여용으로 제조된 약학 조성물.
38. 제37항에 있어서, 단위 투여량 형태인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 경구 투여용으로 제조된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
40. 제37항 내지 제39항중 어느 하나의 항에 있어서, 고형제로 제조된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 장 내성적으로 조제된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
42. 제37항에 있어서, 직장 투여용으로 조제된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
43. 제37항 내지 제42항 중 어느 하나의 항에 있어서, 콜레스테롤 생합성 억제제를 함유하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
44. 제43항에 있어서, 콜레스테롤 생합성 억제제가 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 환원효소의 억제제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
45. 제44항에 있어서, HMG-CoA 환원효소 억제제가 스타틴인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
46. 제45항에 있어서, 스타틴이 심바스타틴인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
47. 콜레스테롤과잉혈증, 또는 기타 다른 지질과잉혈증, 예방 또는 치료법 및/또는 비만증의 예방 또는 치료에 혼합 투여, 분리 투여, 또는 연속 투여하기 위한 제1항 내지 제36항 중 어느 하나의 항에 기재된 분자와 콜레스테롤 생합성 억제제를 함유하는 제품.
48. 제47항에 있어서, 콜레스테롤 생합성 억제제가 3-히드록시-3-메틸글루타릴 조효소 A(HMG-CoA) 환원효소의 억제제인 것을 특징으로 하는 제품.
49. 제48항에 있어서, HMG-CoA 환원효소 억제제가 스타틴인 것을 특징으로 하는 제품.
50. 제49항에 있어서, 스타틴이 심바스타틴인 것을 특징으로 하는 제품.
51. 1개 이상의 양친매성 영역을 함유하는 분자의 유효량을 환자 또는 검체에게 장 투여하는 것을 포함하여, 지질과잉혈증 또는 콜레스테롤과잉혈증을 치료 또는 예방하는 방법.
52. 1개 이상의 양친매성 영역을 함유하는 분자의 유효량을 환자 또는 검체에게 장 투여하는 것을 포함하여, 비만증을 치료 또는 예방하는 방법.
53. 아포단백질의 유효량을 환자 또는 검체에게 장 투여하는 것을 포함하여 아테롬성동맥경화증을 치료 또는 예방하는 방법.