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KR20000029575A - 장기이식후의만성거부반응의검사방법및뇨중성분의측정방법 - Google Patents

장기이식후의만성거부반응의검사방법및뇨중성분의측정방법 Download PDF

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KR20000029575A
KR20000029575A KR1019997000634A KR19997000634A KR20000029575A KR 20000029575 A KR20000029575 A KR 20000029575A KR 1019997000634 A KR1019997000634 A KR 1019997000634A KR 19997000634 A KR19997000634 A KR 19997000634A KR 20000029575 A KR20000029575 A KR 20000029575A
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KR
South Korea
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mmp
chronic rejection
precursor
urine
test method
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Application number
KR1019997000634A
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English (en)
Inventor
코야마이사무
야스무라타다키
네모토큐이치
마에타카코
사이가칸
타카기히사코
이소다아츄코
타나베토시오
Original Assignee
다께다 가즈히꼬
니폰 가야꾸 가부시끼가이샤
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Publication date
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Priority claimed from JP17516597A external-priority patent/JPH1094400A/ja
Application filed by 다께다 가즈히꼬, 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 filed Critical 다께다 가즈히꼬
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Abstract

인간의 뇨나 혈액 등의 검체중의 삼산화질소(NO3), 매트릭스메탈로프로테인아제-2(MMP-2) 또는 그 전구체를 검출함으로써, 신장이식 등의 장기이식후의 만성거부반응을 검사한다.

Description

장기이식후의 만성거부반응의 검사방법 및 뇨중 성분의 측정방법{Method for examining chronic rejection reactions following organ transplantation and method for determining urine components}
위이식환자에서의 만성거부반응의 검진에 있어서는, 일반적으로 신장생검(renal biopsy)이 행해지고 있다. 그러나, 정기적인 신장생검은 환자에게 고통을 줌과 동시에 신장기능 저하를 가져올 가능성이 있다. 더욱이, 만성거절의 진행은 완만하고, 자각증상이 없으며, 고통을 수반하는 신장생검은 많은 환자에게 거부된다.
한편, 만성거부반응에 의해 신장기능이 저하되기 때문에, 만성거부반응 진행의 지표로서 신장기능검사가 행해지고 있다. 이 검사에 있어서는 사구체의 이상을 반영하는 「단백질 투과성 항진의 지표」로서 뇨단백, 뇨중알부민, 뇨중트랜스페린 등이, 또한, 「사구체여과치(GFR) 저하의 지표」로서 혈중크레아티닌, 혈중요소질소(BUN), 혈중β2-미크로글로불린, 혈중α1-미크로글로불린 등이 측정되고 있다. 그러나, 만성거부반응의 진행에 의한 이것들의 검사치의 변화는 완만하고, 검사치의 이상이 확인되는 때에는 만성거부반응은 말기증상을 보이고 있다. 지금까지 뇨나 혈액 등의 체액중 내인성물질의 농도를 측정함으로써 만성거부반응의 조기발견을 가능하게 하는 것과 같은 검사방법은 알려져 있지 않다. 현재 이와 같이 간편한 검사방법이 없기 때문에, 자각증상이 없는 만성거부반응을 보인 환자는 적절한 처치를 하지 않고 말기증상이 되어 신장기능을 상실하는 경우가 많다.
본 발명은 장기이식후 만성거부반응의 조기발견을 가능하게 하는 간편한 검사방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 체외로 꺼낸 체액을 계측함에 의한 장기이식후의 만성거부반응의 발증을 검정하기 위한 검사방법에 관한 것이며, 상세하게는 체액중의 삼산화질소(NO3), 매트릭스메탈로프로테인아제-2(이하「MMP-2」라고 한다) 또는 그 전구체를 검출함으로써 장기이식후의 만성기에 출현하는 거부반응(만성거부반응)을 검정하기 위한 검사방법, 및 뇨중의 MMP-2 또는 그 전구체의 측정방법에 관한 것이다.
제 1 도는 신장이식환자의 뇨중 MMP-2 전구체농도의 히스토그램을 나타내며, 제 2 도는 신장이식환자의 뇨중 MMP-2 전구체농도를 크레아티닌농도에 의해 보정한 경우의 히스토그램을 나타낸다.
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
본 발명은 장기이식후의 만성거부반응에 의해 체액중에 특이적으로 분비된 내인성물질을 측정함으로써, 장기이식후의 만성거부반응을 조기에 또한 간편하게 측정할 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 체액(검체)으로서는, 예를 들어, 뇨, 혈청, 혈장 등의 혈액 등 인간 등의 체액을 들 수 있다. 뇨검체로서는 MMP-2 또는 그 전구체 등의 검출하는 물질이 안정되게 유지될 수 있게 채뇨되거나 채뇨후 보존된 것이라면 무엇이라도 좋고, 또한, 채뇨시기와 방법도 MMP-2 또는 그 전구체 등의 임상적 의의를 손상하지 않는 범위라면 특히 제한되는 것은 없으며, 통상의 방법으로 채뇨된 것이나 보존된 것은 어느것이나 사용할 수 있다. 예를 들어, 축뇨시의 안정성을 유지하기 위해서 항균제 등을 첨가한 용기로 채뇨하는 경우가 있지만, 첨가한 항균제 등이 측정에 간섭을 미치지 않는 한, 이러한 검체도 사용할 수 있다. 또한, 장기이식으로서는 신장이식, 간이식, 심장이식, 췌장이식 등을 열거할 수 있고 특히 한정되지 않지만, 신장이식의 경우가 특히 바람직하다.
내인성물질로서는 삼산화질소(NO3)나 매트릭스메탈로프로테인아제(MMP)-2 또는 그 전구체 등을 들 수 있다.
검체중의 NO3량를 측정(정량 등)하는 방법은 공지(예를 들어 Griess법)이고, 본 발명에 있어서의 NO3량의 측정도 공지방법에 따라서 실행할 수 있다. 예를 들어, 시판되고 있는 초산성질소, 아초산성질소 자동측정장치를 사용하여 고속액체크로마토그라피(HPLC)로 정량할 수가 있다. 또한, 96구멍 등의 마이크로플레이트를 사용하여 마이크로플레이트 판독기 등에 의해 측정할 수도 있고, 시판의 NO 비색측정 키트, NO 형광측정 키트 등을 사용할 수 있다. 그외에도, NO3를 정량할 수 있는 장치라면 어느것이나 사용할 수가 있다.
NO3는 건강한 정상인이나 만성거부반응을 일으키고 있지 않는 장기이식환자의 혈청 등에도 존재하지만, 만성거부반응을 일으키고 있는 장기이식환자의 경우는 혈청 등에 존재하는 NO3의 량이 유의하게 상승한다. 따라서, 컷오프치를 적당한 값으로 정함으로써, 만성거부반응을 일으키고 있는지 아닌지를 정밀도 좋게 판정할 수 있다. 컷오프치는 사용하는 검체의 종류나 이식장기의 종류에 따라서 다르고, 그것들의 종류에 따라서 적의 결정되지만, 신장이식환자의 혈청을 검체로서 사용하는 경우, 50∼l20μM(해당 혈청중의 NO3농도)의 범위내에서 컷오프치를 정하는 것이 바람직하다.
MMP-2는 그 전구체인 프로MMP-2(proMMP-2)로서 세포밖으로 방출되어, 세포밖에서 MMP-2로 변환된다. 본 발명에 있어서, MMP-2의 전구체란 그것이 분해됨에 따라 MMP-2로 될 수 있음을 말하며, 구체적으로는 프로MMP-2를 의미한다. 이 프로MMP-2는 TIMP (메탈로프로테인아제의 조직 인히비터: Tissue inhibitor of metalloproteinase)-2, TIMP-1 등의 인히비터와 복합체를 형성하고 있어도 좋고, 본 발명에 있어서의 전구체에는 복합체의 형으로 존재하는 프로MMP-2도 포함되며, 프로MMP-2의 존재양식은 특히 한정되지 않는다.
검체중의 MMP-2 또는 그 전구체를 검출(정량 등)하는 방법은 공지이고, 본 발명에 있어서의 MMP-2 또는 그 전구체의 검출(정량 등)도 공지방법에 따라서 실행할 수 있다. 예를 들어, MMP-2 또는 그 전구체에 특이적인 계에서 MMP-2 또는 그 전구체를 측정하고, 「단백질농도」 또는 「효소활성치」 등으로서 MMP-2 또는 그 전구체의 농도 등을 구함으로써 실시할 수가 있다. MMP-2 또는 그 전구체의 농도 등을 구하는 경우, MMP-2 또는 그 전구체에 특이적인 방법이라면 어떠한 방법을 이용하여도 좋고, 특히 한정되지 않지만, 간편하고 또한 고감도로 재현성이 좋은 방법이 바람직하다.
보다 구체적으로 나타내면, 「단백질농도」를 구하는 방법으로서는 MMP-2 또는 그 전구체에 특이성을 갖는 항체를 이용하여 면역학적으로 측정하는 방법이 있다. 또한, 「효소활성치」를 구하는 방법으로서는, MMP-2에 특이성이 높은 기질을 이용하여 생화학적으로 측정하는 방법이 있다.
생화학적으로 효소활성을 측정하는 방법에 있어서, MMP-2에 선택성이 높은 기질로서는 검체중에 존재하는 MMP-2이외의 효소, 예를 들어, 세린프로테인아제, 펩티다아제, 에스테라아제 등의 효소류로 가수분해되기 어렵고, MMP-2로 용이하게 가수분해되는 기질, 예를 들어, 젤라틴, 콜라겐, 또는 이것들의 특징적 구조부분을 갖는 합성기질을 들 수 있지만, 바람직한 기질로서는 (7-메톡시쿠마린-4-일)아세틸-L-프롤릴-L-로이실-글리실-L-로이실-L-[N-(2,4-디니트로페닐)-L-2,3-디아미노프로피오니트릴]-L-알라닐-L-아르기닌아미드(MCA) 또는 N-아세틸-L-프롤릴-L-로이실-글리실-L-로이실-L-로이실글리실에틸에스테르 등을 들 수 있다.
MMP-2의 효소활성을 측정하는 방법으로서는 MMP-2에 의한 기질의 가수분해산물을 직접 측정하여도 좋지만, 해당 가수분해산물의 어느 것인가를 고감도이며 특이적으로 검출할 수 있는 계와 조합하여 간접적으로 측정하여도 좋다.
이 방법에 의한 MMP-2 전구체의 검출(정량 등)은 공지방법(예를 들어 트립신 또는 4-아미노페닐수은초산(APMA)에 의한 처리)에 의해 MMP-2 전구체를 분해하고 MMP-2를 생성시켜서, 생성된 MMP-2의 효소활성을 측정함으로써 실행할 수가 있다.
면역측정법으로서는 공지의 모든 방법을 사용할 수 있다. 고상(固相)을 이용하는 일반적인 면역측정법으로서는 샌드위치측정법, 경합법 또는 억제법(binding inhibition assay)을 사용할 수 있다. 특수한 방법으로서는 효소-기질의 결합성을 이용하여 항체를 대신해서 기질을 고상에 고정하여 사용하는 측정계나, 표식항체를 사용하지 않고서 고상화항체로의 MMP-2 또는 그 전구체의 결합을 표면 세포질유전자(SPR)로 직접 검출하는 방법등이 있다. 구체적으로는 일본 특허공개 소60-2187호 공보, 일본 특허공고 평7-34014호 공보, 일본 특허공개 평6-213888호 공보, 일본 특허공개 평7-159402호 공보 등에 개시되어 있다. 또한, 라텍스나 혈구를 이용한 응집반응이나 비탁(比濁)법, 또는 웨스턴블로트(western blotting)법으로의 측정도 들 수 있다. 이들 방법은 그 측정원리에 있어서 상위는 있지만, 어느 방법으로도 측정할 수 있다. 일반적으로는 불용성담체에 고정된 항체와 표식항체에 의한 샌드위치측정법이 적합하다.
면역측정법에 사용하는 항체는 폴리클로날항체라도 모노클로날항체라도 좋다. 항체가 유래하는 동물의 종도 묻지 않는다. 샌드위치측정법과 같이 2종의 항체를 사용하는 경우, 고상화항체와 표식항체에 의해서 샌드위치복합체가 형성되는 조합이라면, 고상화항체와 표식항체에 같은 종의 항체를 사용하여도 다른 종의 항체의 조합이어도 좋다. 항체에 표식하는 물질로서는 방사성물질, 효소, 형광물질 등이나 비오틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 만성거부반응의 검사방법에서는 MMP-2 또는 그 전구체의 측정치(「단백질농도」나 「효소활성치」 등) 자체 또는 그 상승의 정도를 직접 만성거절의 판정에 사용하여도 좋지만, 다른 마커와의 비를 구하여 상대화하고, MMP-2 또는 그 전구체와의 인덱스로서 판정에 사용하여도 좋다. 예를 들어, 뇨를 검체로 한 경우, 뇨중의 크레아티닌농도로 보정하는 방법(뇨중의 MMP-2 또는 그 전구체의 농도를 뇨중의 크레아티닌농도로 나누는 방법)등을 들 수 있다. 본 발명의 검사방법을 실시함에 있어서, 거의 정상인 장기기능을 갖는 장기이식환자의 적어도 90% 이상이 정상이라고 판단되는 범위로 컷오프를 설정하여 검사하는 것이 바람직하다. 또한, 장기이식환자의 NO3또는 MMP-2 또는 그 전구체를 정기적으로 측정하고, 측정치 혹은 인덱스의 상승의 정도로부터 만성거부반응의 발증을 판단하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명은 검체중의 MMP-2 또는 그 전구체를 정량하지않고, 이하의 실시예에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 젤라틴 등의 기질을 포함하는 폴리아크릴아미드겔속에서 전기영동을 행하여 젤라틴 등의 기질의 분해에 의한 밴드가 생기는지 여부를 보는 것에 의한 방법등의 방법에 의해서도 실행할 수가 있다.
이하, 실시예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예만에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
신장생검으로 만성거부반응으로 진단된 신장이식환자(A), 신장생검 등으로 만성거부반응을 일으키고 있지 않다고 진단된 거의 정상적인 신장기능(혈청크레아티닌치;1.2㎎/㎗이하)의 신장이식환자(B) 및 건강한 정상인(C)의 혈청을 검체로서, 초산성N, 아초산성N 자동측정장치(TCI-NOX1000, 동경화성공업(주))를 이용하여 NO3량을 측정하였다. 그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 만성거부반응으로 진단된 신장이식환자의 혈청 NO3농도는 정상적인 신장기능을 보인 신장이식 환자의 혈청 NO3농도, 건강한 정상인의 혈청 NO3농도보다 유의하게 높은 수치였다. 혈중 NO3가 만성거부반응이 유효한 마커로 되어있는 것을 나타내고 있다.
표 1
신장이식 환자 및 건강한 정상인의 혈청 NO3농도(μM)
검체 검체수(n) 평균치±표준편차 (범위)
A의 혈청(만성거절반응)B의 혈청(비만성거절반응)C의 혈청(건강한 정상인) 15247 238.2±133.335.8±21.631.6±15.0 (74.3-536.5)(4.3-83.7)(15.4-59.6)
* p＜0.01 비만성거부반응 또는 건강한 정상인과의 비교(T-검정)
실시예 2 (자이모그램;생화학적인 MMP-2 활성의 검출)
뇨검체에 같은 량의 8% SDS, 40% 글리세롤을 포함하는 0.5M 트리스완충액(pH 6.8)을 가하여 잘 혼합하였다. 1㎎/㎖ 젤라틴을 포함하는 8% 폴리아크릴아미드겔을 제작후, 상기 혼합물을 폴리아크릴아미드겔속에서 전기영동한다. 영동종료후, 겔을 2.5% 트라이톤 X-100을 포함하는 10mM 트리스완충액(pH 8.0)으로 실온에서 30분 2회 진탕하면서 세정하였다. 이어서, 0.5mM 염화칼슘, 10μM 염화아연을 포함하는 50mM 트리스완충액(pH 8.0)으로 교환하여, 37℃에서 16시간 인큐베이트하였다. 겔을 1% 쿠마지 블루 R-250, 5% 초산, 10% 메탄올로 30분간 염색후, 5% 초산, 10% 메탄올로 탈색하였다.
젤라틴 분해효소(MMP-2)가 존재하는 장소와 일치하여, 푸른 백그라운드중에 투명한 밴드가 보였다.
실시예 3
신장생검 및 혈청 크레아티닌치(2.0 ㎎/㎗ 이상)에 의해 만성거절로 진단된 1년 이상전에 신장이식을 받은 환자 및 혈청 크레아티닌치가 1.5㎎/㎗ 이하로, 신장이식후 1년 이내의, 신장생검 등에 의해 만성거절을 일으키고 있지 않다고 진단된 거의 정상인 신장기능의 환자(대조군)의 뇨를 검체로서, 실시예 2 방법으로 MMP-2 활성을 검출하였다. 그 결과, 만성거절환자의 뇨검체로 10예중 8예로 분자량 70kD의 MMP-2가 검출된 데 대하여, 대조군의 환자에서 검출된 것은 14예중 1예였다.
이것은 MMP-2의 농도 상승이 만성거절의 유효한 마커로 되어있는 것을 나타내고 있다.
실시예 4 (면역측정법에 의한 뇨중의 MMP-2 전구체농도의 측정)
MMP-2 전구체 분자상의 다른 부위를 인식하는 2종의 모노클로날항체를 이용한 혈청을 대상으로 하는 후지약품공업사 제조의 MMP-2측정 키트(proMMP-2 및 이것과 TIMP-2와의 복합체를 검출하였고, MMP-2는 검출되지 않는다)를 사용하였다. 그러나, 혈청중에 비교해서 뇨중의 MMP-2 전구체농도가 낮기 때문에, 그 조작조건을 변경하여 측정하였다. 즉 시험관에 뇨 또는 키트첨부의 표준액을 150㎕ 채취하여 1% 소 혈청알부민과 10mM EDTA를 포함하는 30mM 인산생리식염수 pH 7.0을 가하여 잘 혼합한 후, 항체결합비즈를 넣어 실온에서 2시간 반응시켰다. 반응액을 아스피레이터로 흡인 제거하여, 키트첨부의 표식항체액을 300㎕ 가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 반응액를 아스피레이터로 흡인 제거하고, 비즈를 별도의 시험관에 옮긴 후, 키트첨부의 발색액을 300㎕ 가하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 키트첨부의 정지액 1500㎕를 가하고 반응을 정지하였다. 정제수를 대조군으로 하여 반응액의 파장 492nm의 흡광도를 측정하여, 표준액으로부터 얻어진 흡광도를 바탕으로 작성한 검량선으로부터 뇨검체중의 MMP-2 전구체농도를 구하였다. 또한, 동시에 뇨중의 크레아티닌농도를 통상의 방법에 의해 측정하여 크레아티닌으로 보정한 뇨중의 MMP-2 전구체농도를 산출하였다.
실시예 5
신장생검 및 혈청 크레아티닌치에 의해 만성거절로 진단된 1년 이상전에 신장이식을 받은 환자 8예(발증군) 및 혈청 크레아티닌치가 1.5㎎/㎗ 이하로, 신장이식후 1년 이내의, 신장생검 등에 의해 만성거절을 일으키고 있지 않다고 진단된 거의 정상인 신장기능의 환자 36예(대조군)의 뇨를 검체로서, 실시예 4 방법으로 MMP-2 전구체농도를 측정하였다. 크레아티닌보정하지 않은 경우와, 보정한 경우의 히스토그램을 제 1 도 및 제 2 도에 나타낸다. 크레아티닌보정을 하지 않은 경우에 컷오프치를 1ng/㎖로 하면 대조군의 92%는 음성으로 판정되며, 신장이식만성거절로 진단된 환자는 100% 양성으로 판정되었다. 크레아티닌보정을 한 경우, 컷오프치를 5㎍/g·크레아티닌으로 하면 대조군의 95%는 음성이 되며, 신장이식만성거절로 진단된 환자는 100% 양성으로 판정되었다. 또한, 컷오프치를 1㎍/g·크레아티닌으로 하여도 대조군의 89%는 음성으로 판정되었다.
실시예 6
2예의 신장이식환자에 대해서 신장이식만성거절의 발증전 및 발증후의 뇨를 검체로서, 실시예 4 의 방법으로 MMP-2 전구체농도(크레아티닌보정치)를 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다. MMP-2 전구체농도는 발증후 크게 상승하고 있고, MMP-2 전구체의 농도의 상승이 신장이식만성거절의 발증을 판정하는 데 도움이 되는 것을 나타내고 있다.
표 2
발증전(㎍/g·크레아티닌) 발증후(㎍/g·크레아티닌)
환자 1환자 2 1.30.6 14.629.4
NO3및 NO2는 NO 래디컬의 생체내에서의 최종 대사체이다. NO 래디컬은 염증, 장기상해시에 백혈구나 마크로파지 등으로부터 생성된다. 그 때문에 임상적으로도 염증, 장기상해에 기인하는 허혈성 심장질환, 쇼크, 이식후의 급성거부반응, 세균감염시 등에 검출된다. 그러나, 이식후의 만성거부반응에 있어서는 그 보고가 없다. 그래서, 만성적 진행에 의한 거부반응에 대하여 NO3의 생체내에서의 생성이 보이는지 안보이는지, 체액중의 NO3가 만성거부반응 검사의 마커(marker)가 될 수 있는지 없는지에 대해서 검토하여 체액중의 NO3가 만성거부반응 검사의 마커가 될 수 있는 것을 발견하였다.
또한, MMP-2는 기저막을 구성하는 콜라겐을 분해하는 효소로, 조직의 수복이나 재생시에 활동한다. 또한 암에 있어서는, 암세포의 기저막으로의 침윤시에 콜라겐을 분해하는 효소로서 활동한다고 생각되고 있다. 본 발명자 등은 예의 검토한 결과, MMP-2 또는 그 전구체는 건강한 정상인의 뇨 등의 체액이나, 만성거부반응을 일으키고 있지 않는 신장이식환자의 뇨 등의 체액에는 누출되지 않거나, 누출되더라도 아주 적은 양밖에 누출되지 않지만, 장기이식후의 만성거절환자에서는 이 뇨 등의 체액중 MMP-2 또는 그 전구체의 양이 현저하게 증대하는 것을 발견하였다. 본 발명은 장기이식후의 만성거부반응의 발증에 따라 혈액이나 뇨 등의 에책중에 분비되는 NO3나 MMP-2 또는 그 전구체 등의 내인성물질의 농도가 현저하게 증대한다고 하는 발견에 근거하여, 체액중의 이들 내인성물질을 검정함에 의한 장기이식후의 거부반응을 검사하는 방법, 그것에 사용하는 검사용 키트, 및 뇨중의 MMP-2 또는 그 전구체의 측정방법을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은
(1) 체외로 꺼낸 체액을 계측함에 의한 장기이식후의 만성거부반응의 발증을 조기에 검정하기 위한 검사방법,
(2) 체액중의 NO3, MMP-2 또는 그 전구체를 검출하는 것을 특징으로 하는 장기이식후의 만성거부반응의 검사방법,
(3) 체액중의 NO3를 검출하는 것을 특징으로 하는 상기 (2)기재의 검사방법,
(4) 체액중의 MMP-2 또는 그 전구체를 검출하는 것을 특징으로 하는 상기 (2)기재의 검사방법,
(5) 체액이 인간의 뇨 또는 혈액인 상기 (2), (3) 또는 (4)기재의 검사방법,
(6) 뇨검체중의 MMP-2 또는 그 전구체를 검출하는 것을 특징으로 하는 상기 (2)기재의 검사방법,
(7) 장기이식이 신장이식인 상기 (2), (3), (4), (5) 또는 (6)기재의 검사방법,
(8) 뇨검체중의 MMP-2 전구체농도로서 0.1에서 10.0ng/㎖의 범위 사이에 신장이식 만성거부반응의 유무를 판정하기 위한 컷오프(cut-off)치를 설정하는 상기 (6)기재의 검사방법,
(9) 컷오프치를 0.5에서 5.0ng/㎖의 범위 사이에 설정하는 상기 (8)기재의 검사방법,
(10) 뇨검체중의 MMP-2 전구체농도 및 크레아티닌농도를 측정하여, 크레아티닌농도로 보정함에 의해 얻어지는 인덱스가 0.1에서 20.0㎍/g·크레아티닌의 범위 사이에 신장이식 만성거부반응의 유무를 판정하기 위한 컷오프치를 설정하는 상기 (6)기재의 검사방법,
(11) 컷오프치를 0.5에서 10.0㎍/g·크레아티닌의 범위 사이에 설정하는 상기 (10)기재의 검사방법,
(12) 검출이 면역측정법에 의한 검출인 상기 (2) 및 (4)∼(11)중 어느 하나에 기재된 검사방법,
(13) 면역측정법이 효소면역측정법인 상기 (12)기재의 검사방법,
(14) 면역측정법이 샌드위치법인 상기 (12) 또는 (13)기재의 검사방법,
(15) 뇨중의 MMP-2 또는 그 전구체를 면역측정법으로 측정하는 뇨중 MMP-2 또는 그 전구체의 측정방법,
(16) 체외로 꺼낸 체액을 계측함에 의한 장기이식후의 만성거부반응의 발증을 조기에 검사하기 위한 키트,
(17) 체액중의 3산화질소(N03), 또는 매트릭스메탈로프로테인아제(MMP)-2 또는 그 전구체를 검출함에 의한 장기이식후의 만성거부반응의 발증을 검사하기 위한 키트,
(18) 뇨 또는 혈액중의 MMP-2 또는 그 전구체를 검출함에 의한 장기이식후의 만성거부반응의 발증을 검사하기 위한 키트,
(19) 검사가 면역측정법인 상기 (18)기재의 키트,
(20) 체액을 계측함에 의한 장기이식후의 만성거부반응을 조기에 진단하는 방법,
(21) 체액중의 삼산화질소(N03), 또는 매트릭스메탈로프로테인아제(MMP)-2 또는 그 전구체를 검출하는 것을 특징으로 하는 장기이식후의 만성거부반응의 진단방법,
(22) 체액이 뇨 또는 혈액인 상기 (21)기재의 진단방법,
에 관한다.
본 발명의 검사방법을 실시함으로써 혈청, 뇨 등의 체액(검체)중의 NO3, MMP-2 또는 그 전구체의 농도의 상승 등으로부터 만성거부반응의 조기발견이 가능해진다.

Claims (22)

  1. 체외로 꺼낸 체액을 계측함에 의한 장기이식후의 만성거부반응의 발증을 조기에 검정하기 위한 검사방법.
  2. 체액중의 삼산화질소(N03), 매트릭스메탈로프로테인아제(MMP)-2 또는 그 전구체를 검출함을 특징으로 하는 장기이식후의 만성거부반응의 검사방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 체액중의 N03를 검출함을 특징으로 하는 검사방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 체액중의 MMP-2 또는 그 전구체를 검출함을 특징으로 하는 검사방법.
  5. 제 2 항, 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 체액이 인간의 뇨 또는 혈액인 검사방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 뇨검체중의 MMP-2 또는 그 전구체를 검출함을 특징으로 하는 검사방법.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중의 어느 한항에 있어서, 장기이식이 신장이식인 검사방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 뇨검체중의 MMP-2 전구체농도로서 0.1에서 10.0ng/㎖의 범위 사이에 신장이식후의 만성거부반응의 유무를 판정하기 위한 컷오프(cut-off)치를 설정하는 검사방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 컷오프치를 0.5에서 5.0 ng/㎖의 범위 사이에 설정하는 검사방법.
  10. 제 6 항에 있어서, 뇨검체중의 MMP-2 전구체농도 및 크레아티닌농도를 측정하고, 크레아티닌농도로 보정함에 의해 얻어지는 인덱스가 0.1에서 20.0㎍/g·크레아티닌의 범위 사이에 신장이식후의 만성거부반응의 유무를 판정하기 위한 컷오프치를 설정하는 검사방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 컷오프치를 0.5에서 10.0㎍/g·크레아티닌의 범위 사이에 설정하는 검사방법.
  12. 제 2 항, 제 4 항 내지 제 11 항 중의 어느 한항에 있어서, 검출이 면역측정법에 의한 검출인 검사방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 면역측정법이 효소면역측정법인 검사방법.
  14. 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서, 면역측정법이 샌드위치법인 검사방법.
  15. 뇨중의 MMP-2 또는 그 전구체를 면역측정법으로 측정하는 뇨중 MMP-2 또는 그 전구체의 측정방법.
  16. 체외로 꺼낸 체액을 계측함에 의한 장기이식후의 만성거부반응의 발증을 조기에 검사하기 위한 키트.
  17. 체액중의 3산화질소(N03), 매트릭스메탈로프로테인아제(MMP)-2 또는 그 전구체를 검출함에 의한 장기이식후의 만성거부반응의 발증을 검사하기 위한 키트.
  18. 뇨 또는 혈액중의 MMP-2 또는 그 전구체를 검출함에 의한 장기이식후의 만성거부반응의 발증을 검사하기 위한 키트.
  19. 제 18항에 있어서, 검사가 면역측정법으로 수행되는 키트.
  20. 체액을 계측함에 의한 장기이식후의 만성거부반응을 조기에 진단하는 방법.
  21. 체액중의 삼산화질소(N03), 매트릭스메탈로프로테인아제(MMP)-2 또는 그 전구체를 검출함을 특징으로 하는 장기이식후의 만성거부반응의 진단방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 채액이 뇨 또는 혈액인 진단방법.
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