KR20010021509A

KR20010021509A - 식물에서 폴리케티드의 생산

Info

Publication number: KR20010021509A
Application number: KR1020007000041A
Authority: KR
Inventors: 베트라취메리씨.
Original assignee: 추후제출; 코산 바이오사이언시즈, 인코포레이티드
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-07-10
Publication date: 2001-03-15
Anticipated expiration: 2018-07-10
Also published as: AU8403398A; NZ501998A; US6262340B1; WO1999002669A3; AU744751B2; AU744751C; WO1999002669A2; JP2001509379A; CN1188520C; US20020002712A1; KR100540287B1; EP1007689A2; CA2294616A1; IL133716A0; CN1263557A

Abstract

본발명은 기능적이 폴리케티드 합성효소(PKS)를 발현할 수 있는 발현시스템을 포함하도록 변형된 유전적으로 변화된 식물 및 식물세포를 제공한다. 추가로 본발명은 PKS 를 제조하는 방법 및 이들 식물 및 식물세포를 사용하여 폴리케티드를 제조하는 방법을 제조한다.

Description

식물에서 폴리케티드의 생산{PRODUCTION OF POLYKETIDES IN PLANTS}

폴리케티드는 크고 구조적으로 다양한 군의 천연산물이다. 폴리케티드는 항생제 및 약리특성을 포함하는 광범위한 생물적 활성을 가진다. 예컨대, 폴리케티드는 테트라사이클린 및 에리쓰로마이신과 같은 항생제 특성; 다우노마이신을 포함하는 항암제; 예컨대 FK506가 라파마이산과 같은 면역억제제; 모네신 및 아베르멕틴과 같은 수의학산물; 및 스피노신(살충제) 및 소라펜(항곰팡이제)등 농업에 사용되는 화합물로 대표된다. 폴리케티드는 특히 사상균인 액티노미세테스군에 풍부한다.

폴리케티드 합성효소는 지방산 합성효소(FAS)에 관련된 다기능효소이다. PKS는 아실티오에스테르, 예컨대 아세틸, 프로피오닐, 말로닐 또는 메틸말로닐사이에 반복된 (탈카르복시성) 클라이센(Claisen) 축합을 통해 폴리케티드의 생합성을 촉매한다. 각각의 축합반응뒤에, 이들 효소는 합성되는 폴리케티드 사슬의 베타-케토상에서 케토환원, 탈수 및 에노일환원으로 이루어지는 환원사이클중 모두 또는, 일부분을 촉매하거나, 또는 아무것도 촉매하지 않음으로써 산물에 구조적인 다양성을 도입한다. 각 구체적 산물의 특성을 갖는 탄소사슬이 형성된 후에, 황분해 또는 아실전이에 의해서 산물이 합성효소로 부터 유리된다. 따라서 PKS는 주어진 폴리케티드를 함께 생산하는 다수의 효소패밀리로 이루어진다. 사슬길이, 사슬구성단위의 선택, 및 환원주기상의 조절된 다양성 및 각각의 폴리케티드로 유전적으로 프로그램이 자연에 존재하는 폴리케티드에서 보이는 다양성에 기여하게 된다. PKS에 의한 촉매반응결과의 폴리케티드는 항생제 활성을 제공하기 위해서 종종 추가의 변형, 예컨대 글리코실화를 필요로 한다.

세가지의 일반적인 PKS 클래스가 존재한다. 유형 I로 알려진 "복합체" 또는 "모듈"은 에리쓰로마이신과 같은 매크로리드(macrolide)에 대한 PKS로 대표된다. "모듈" PKS는 탄소사슬의 조합과 변형의 각 단계에 작용하는 한 세트의 분리된 활성자리를 가지는 수개의 큰 다기능단백질의 조합체이다(Cortes, J., et al., Nature (1990) 348:176; Donadio, S., et al., Science (1991) 252:675; MacNeil, D.J.,et al., Gene (1992) 115:119). 이들 클래스간에 구조적 다양성, PKS의 활성자리 유형 및 수의 다양성이 존재한다. 이 클래스의 PKS는 PKS의 1차서열의 활성자리의 집단과 수와, 폴리케티드 골격간에 1:1관계를 나타낸다. (도 1참조)

유형 II 또는 "방향족" PKS라 불리우는 두번째 클래스의 PKS는 방향족 화합물에 대한 합성효소로 대표된다. "방향족" PKS는 일반적으로 3개이상의 분리된 오픈리딩프레임에 의해 코딩되며 반복적으로 사용되는 단일세트의 활성자리를 가진다(상기문헌, M.J., et al, EMBO J. (1989) 8:2727; Sherman, D.H., et al., EMBO J.(1989) 8:2717; Fernandez-Moreno, M.A., et al., J. Biol. Chem. (1992) 267: 19278)(도 2참조).

"곰팡이"PKS로 알려져 있는 세번째 클래스의 PKS는 단일 오픈리딩프레임에 의해서 코딩되는 하나의 다기능단백질이다. 일반적인 "곰팡이"PKS는 페닐실륨 파툴럼에서 특성화되는 6-메틸살리실산 합성효소(MSAS)이다. 또한 상기 유전자는 아스퍼질라스 니둘란스(Aspergillus nudulans) 및 콜렉토트리컴 라게나륨(Collectotrichum lagenarium)에서 부터 분리할 수 있으며, PKS는 아스퍼질라스 니둘란스의 산물로서 노르솔로린산을 갖는다(Fujii, I.,et al., Mole Gen Genet (1996) 253:1-10). 따라서 곰팡이 PKS는 방향족 및 모듈클래스에 딱 맞지 아니하여 세번째 군을 이루게 된 것이다(도 3참조).

스트렙토미세스는 방향족 폴리케티드의 풍부한 생산자인 액티노미세테스이다. 이제가지 연구된 각각의 스트렙토미세스 방향족 PKS에 있어서, 탄소사슬조합은 3개 오픈리딩프레임의 산물을 필요로 한다. ORF1은 케토합성효소(KS) 및 아실트랜스퍼라제(AT) 활성자리를 코딩하고; ORF2는 ORF1에 유사하나 KS 및 AT 모티브가 없으며; ORF3는 분리된 아실담체단백질(ACP)을 코딩한다.

예컨대, 스트렙토미세스 코리콜러(Streptomyces coelicolor)는 푸른-염료 폴리케티드, 즉 액티노르호딘을 생산한다. 액티노르호딘 유전자 집단(act)이 클로닝되었다. 상기 유전자집단은 항생제의 분비에 관련된 단백질 및 유전자 집단의 전사를 특이적으로 활성화시키는 하나 이상의 단백질뿐만 아니라, 상기 PKS효소, 시클라제 및 액티로르호딘을 생산하는 이후 변형반응에 관련된 일련의 재단 효소(tailoring)를 코딩한다. 폴리케티드 생합성의 출발자단위(아세틸 CoA) 및 연장자단위(말로닐 CoA)의 제공을 위한 다른 유전자뿐만 아니라, 항생제 생합성의 광범위한 조절에 필요한 다른 유전자도 게놈의 다른위치에 존재한다. 스트렙토미세스 코리콜러의 act유전자 집단은 스트렙토미세스 파르불러스에서 액티노르호딘을 제조하는데 사용되었다. Malpartida, F., et al., Nature (1984) 309:462.

Bartel등의 J.Bacteriol (1990) 172:4816-4826에서, act I, III, IV, 및 VII의 4개 유전자 좌위로 이루어지는 스트렙토미세스 코리콜러 act유전자 집단으로 형질전환된 스트렙토미세스 갈리아우스(Streptomyces galilaeus)를 사용하여 알로에사포나린 II를 재조합적 생산에 대해 개시하고 있다. 기본 act 유전자 세트를 포함하고 그라나티신, 옥시테트라시클린, 테트라세노마이신 및 프레놀리신 PKS에서 유래된 ACP유전자를 가지는 혼성 PKS도 또한 기능적 합성효소를 생산하도록 고안되었다. Khosla, C., et al., J Bacteriol (1993) 175:2197-2204.

Hopwood, D.A., 등의 Nature (1985) 314:642-644는 재조합 기술을 사용하여 혼성 폴리케티드의 생산을 기재하고 있다. Sherman, D.H.등의 J. Bacteriol. (1992) 174:6184-6190은 여러가지 성분의 act PKS유전자집단이 결핍된 스트렙토미세스 코리코러스를 스트렙트미세스 비올라세루버의 대응 그라나티신(gra)유전자로 형질전환을 보고하고 있다.

이종 기능적, 즉 폴리케티드를 생산할 수 있는 PKS의 재조합 생산을 스트렙토미세스에서 달성하였고, 혼성형태의 방향족 PKS를 이들 숙주세포에서 발현하였다. 예컨대, Khosla, C. et al., J Bacteriol (1993) 175:2194:2204; Hopwood, D.A., et al., Nature (1985) 314:642-644; Sherman, D.H. et al., J Bacteriol (1992) 174:6184-6190. 추가로, 모듈 PKS효소의 재조합적 생산은 WO95/08548 PCT공보에 기재된 바와 같이 달성하였다. 그러나, Roberts, G.A.등의 Eur J Biochem(1993) 214:305-311에서 PKS 촉매자리를 코딩하는 유전자를 운반하는 단일벡터를 E.coli로 형질전환하였으나, PKS는 기능적이지 못했으며, 이는 아마도 아실운반단백질의 포스포판테테닐화의 결핍때문인 것같다.

스트렙토미세스 숙주에서 기능적 폴리케티드 합성효소의 재조합생산이 또한 1998년 1월 15일에 공개된 PCT출원 공보 WO98/01546, WO98/01571에 기재되어 있다.

다수의 폴리케티드 합성효소가 클로닝되었으며, 아브로멕틴(미국특허 제 5,252,474), 스피라마이신(미국특허 제 5,098,837); 및 실로신(1997년 2월 19일레 공개된 유럽특허출원공보 791,655)의 생산에 대한 PKS가 포함된다.

미국특허 제 5,716,849는 소라펜 생산의 PKS집단을 코딩하는 뉴클레오티드의 서열분석과 회수를 기재하고 있다. 이는 본명세서의 참고문헌으로 병합되며, 박테리아, 효모 및 식물에서 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 소라펜 PKS의 발현을 예언적으로 기재하고 있다. 이러한 기재는 생산된 PKS단백질이 폴리케티드 합성에 기능적임을 나타내나, 실제발현과 기능에 대해서는 언급이 없었다.

기능적인 PKS을 위해서는, 홀로-ACP 합성성분을 얻도록 번역된 아포-PKS가 효소적으로 포스포판테닐화되어야 함을 알려져 있다. Carreras, C.W., et al.,Biochemistry (1997) 36:11757-11761. 아포-PKS에서 홀로-ACP를 포함하는 PKS로 전환에는 적절한 포스포판네닐 트랜스퍼라제(PPT)가 필요하다. 아포-지방산 합성효소집단을 홀로-형태로 변환시킬 수 있는 PPT효소가 일반적인 PKS아포효소의 전환에는 효과적이지 못하다는 것도 인식되어왔다. Lambalot, R.H., et al, Chem and Biol (1996) 3:923-936. E.coli에서 기능적인 PKS를 얻기위해서는 PPT활성의 제공이 필요함은 Cox, R.J. et al., FEBS LETT (1997) 405:267-272에 기재되어 있다. 추가로, 본명세서에 참고문헌으로 병합된 WO98/27203는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 PPT효소(홀로-ACP합성효소), 구체적으로 설팍턴트(surfactant) 홀로-ACP합성효소(Sfp) 및 페닐실륨 파툴럼의 6-MSAS를 포함하는 융합단백질을 사용하여 효모에서 기능적인 6-MSAS의 재조합적 생산을 기술하고 있다. Sfp유전자의발현과 함께, 6-MSAS에 대한 발현시스템을 포함하도록 변형된 E.coli에서 6-MSAS의 생산은 또한 구체화된 조건하에서 설명되고 있다.

본발명은 PKS생산 및 결과적인 폴리케티드의 생산을 위한 단일 또는 다중벡터시스템을 포함하도록 형질전환된 식물을 제공하는 것이다. 기능적 PKS의 생산 및 발현을 위한 식물의 용도로 PKS 및 포리케티드의 대량생산을 위한 적합한 근원을 제공하고; 추가로, 생산된 폴리케티드는 이를 생산하는 식물에, 병충해내성등과 같은 바람직한 특성을 부여할 수 있다.

본발명은 폴리케티드(polyketide)합성 및 트랜스제닉 식물의 제조에 관한 것이다. 구체적으로, 본발명은 하나 이상의 기능적인 폴리케티드 합성효소(Synthase)(PKS) 및 폴리케티드를 발현하는 식물세포 및 식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

도 1은 모듈 PKS의 전형으로서 에리쓰로마이신 PKS의 조직을 나타내는 개략도이다.

도 2는 수개의 전형적인 방향족 PKS의 조성물을 나타내는 개략도이다.

도 3은 곰팡이 6-MSAS의 조직을 나타내는 개략도이다.

본발명은 재조합 기술 및 식물숙주/벡터 시스템을 이용하여 새로운 PKS 및 공지의 PKS를 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다. 특히, 본발명은 다양한 폴리케티드의 생산을 차례대로 촉매하는 PKS를 제조하는 식물 숙주/벡터 시스템의 용도에 의존한다. 그러한 폴리케티드는 적절한 제제로 또는 이들이 생산되는 식물자체로 다음 용도에 유용하다: 항생제; 항종양제; 면역억제제; 다양한 다른 약물학적 목적; 및 농업용(예컨대, 항곰팡이제 또는 살충제).

일례에서, 본발명은 유전적으로 조작된 식물세포, 식물 및 재조합 PKS을 생산하도록 변형된 식물부분을 제공한다. 구체적으로, 본발명은 다음으로 이루어진 유전적으로 가공된 식물세포, 식물부분 및 식물을 제공한다:

(a) 폴리케티드 합성을 촉매할 수 있는 PKS를 코딩하는 PKS유전자 집단과

(b) PKS유전자 집단에 작동가능하도록 연결된 하나이상의 조절서열에 의해서 유전자집단내의 유전자가 유전적으로 가공된 식물세포, 식물의 부분 또는 식물에서 전사되고 번역될 수 있어 기능적 PKS을 생산하는, PKS유전자 집단에 작동가능하도록 연결된 하나이상의 조절서열.

특히 바람직한 구체예에서, 식물세포, 식물의 일부 또는 식물은 추가로 아실 운반단백질(ACP)아포단백질을 홀로-ACP로 전환시키는 포스포판테테닐 트랜스퍼라제(PPT)효소를 함유하도록 변형된다. 이들 PPT효소는 아래에 추가로 기재된 것과 같이 다양한 근원에서 얻을 수 있다.

본발명은 추가로 PKS 유전자 집단이 발현되고 기능적으로 활성인 조건하에서상기 식물세포, 식물일부 또는 식물, 등을 배양함으로써 기능적인 재조합 PKS 및 폴리케티드를 생산하는 방법을 제공하고, 임의로 PKS가 기능적으로 활성이며 폴리케티드를 생산하는 조건하에서 상기 식물, 식물 세포 등을 배양하는 방법을 제공한다.

추가의 일례에서, 본발명은 다음으로 이루어지는 조합 폴리케티드 라이브러리를 제조하는 방법을 제공한다.

(a) 폴리케티드 합성효소(PKS)유전자, 모듈, 활성자리 또는 이들의 일부분의 임의의 조합 및 이들 유전자에 작동가능하도록 연결된 하나이상의 조절서열을 포함하는 벡터의 집단을 제공하며,

(b) 상기 벡터집단로 숙주식물세포 또는 식물을 형질전환시키며;

(c) 상기 유전자집단내에서 상기 유전자가 전사되고 번역될 수 있는 조건하에서 상기 숙주식물세포 또는 식물의 집단을 배양하으로써, PKS조합 라이브러리 및 결과적인 폴리케티드를 생산.

본발명은 추가로 숙주식물에서 PKS효소 및 상기 숙주식물에서 결과적인 폴리케티드의 생산을 위한 재조합 물질을 제공한다.

미국특허 제 5,712,146은(본명세서에 참고문헌으로 병합됨) 모듈 PKS 및 방향족 PKS를 위한 다양한 재조합 발현시스템을 기재하고 있다. 이에 더하여, 위 문헌에서 인용하고 있는 PCT/US9723014는(본명세서에 참고문헌으로 병합됨) 홀로-ACP을 제공함으로써 아포-PKS 효소를 기능적인 것으로 전환하는 PPT효소활성에 대한 적합한 발현시스템뿐만 아니라, E.coli및 효모에서 기능적인 PKS의 생산에 유용한 다양한 PKS의 다중 벡터시스템을 기재하고 있다.

본발명은 식물숙주세포 또는 식물의 적합한 생장주기 단계에서 상당량의 PKS 및 폴리케티드를 생산하는 방법을 제공한다. 생산된 폴리케티드는 이들의 유형에 따라 다수의 질병을 치료하기 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 예컨대, 본발명의 방법에 의해 생산된 수개의 폴리케티드는 살충제나 항곰팡이제와 같은 농업에서 사용뿐만 아니라, 면역억제제, 항종양제, 바이러스,박테리아 및 기생적 감염의 치료를 위해 사용될 수 있다. 또한 식물세포에서 폴리케티드를 재조합적으로 생산하는 능력은 PKS의 특징화 및 이들의 작용기작, 그외에도 식물숙주에 유용한 성질을 제공하는데 강력한 도구를 제공할 것이다.

일반적인 PKS 발현시스템

상기한 미국특허 제 5,712,146는 알려진 다양한 PKS 발현시스템과 재조합 DNA기술을 이용하여 어떻게 유전적으로 조작하는 지를 상세히 기재하고 있다. 하나이상의 PKS를 발현하는 재조합 식물 및 식물세포를 생산하기 위해서 이러한 개시를 다음에 기재한 변형과 함께 본발명에 적용할 수 있다. 요컨대, 방향족, 모들 및 곰팡이 PKS 시스템의 비제한적인 요약을 도 1,2,3,에 각각 나타내고 있으며 이하에서 자세히 설명하겠다.

생산된 효소에서 촉매자리의 반복적인 사용으로 방향족 PKS 시스템을 특징화하였다. 방향족 PKS 시스템에서, 최소 PKS의 효소는 3개 오픈리딩프레임(ORF)에 코딩된다. 도 1에서 나타내고 있는 바와 같이, 액티노르호딘PKS는 6개 분리된 ORF에서 코딩된다. 최소 PKS를 위해서는, 첫번째 ORF는 케토합성효소(KS), 및 아실트랜스퍼라제(AT)를 포함하고; 두번째 ORF는 사슬길이인자(CLF)를 코딩하고; 세번째 ORF는 아실 운반 단백질(ACP)를 코딩한다. 추가의 ORF는 아로마타제(ARO), 시클라제(CYC), 및 케토리덕타제(KR)을 코딩하다. KS/AT, CP 및 CLF 요소는 두개 탄소 단위의 단일 축합에 필수적이기 때문에, KS/AT, CP 및 CLF의 조합은 최소 PKS를 구성한다. 반면에, grs PKS 는 5개의 별개의 ORF를 가지며, 이는 3개 ORF에 KS/AT, CP 및 CLF, KR은 4번째에, ARO는 다섯번째에 존재한다.

한편, 모듈 PKS 시스템에서는, 각각의 촉매자리가 오직 한번만 사용되며 전체 PKS는 일련의 모듈로서 코딩된다. 최소 모듈은 적어도 KS, AT, 및 ACT를 포함한다. 임의의 부가적인 활성은 도 2에 나타낸 것처럼 KR, DH, 에노일리덕타제(ER) 및 티오에스터라제(TE)를 포함한다.

6-메틸 살리실산 합성효소(6-MSAS)를 코딩하는 곰팡이 PKS는 방향족 PKS와 비슷하나, 도 3에 나타낸 바와 같이 촉매자리가 반복적으로 사용되기 때문에 모든 그의 활성(KS/AT, 데히드라제(DH), KR 및 ACP)에 단지 하나의 ORF만을 가진다.

본발명은 식물세포, 식물의 부분 및 완전한 식물에서 방향족, 모듈 및 곰팡이 PKS 시스템에 관련된 효소적 활성에 대한 발현시스템을 제조하는데 사용될 수 있다.

예를 들면, 목적 PKS서브유니트를 발현하는 생물체에서 이 유전자를 발현하는 세포에서 유래된 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝하거나, 이 유전자를 포함하는 것으로 알려진 벡터로부터 유전자를 유도하는 등의 재조합 방법을 사용하여 목적 PKS서브유니트를 얻을 수 있다. 그런 다음, 상기 유전자를 분리하고 원한다면 다른 바람직한 PKS서브유니트와 결합할 수 있다. 문제의 상기 유전자가 이미 적합한 발현벡터로 존재하는 것인 경우에, 원하면 그자체로 예컨대 다른 PKS서브유니트와 결합될 수 있다. 원하는 특별한 아미노산 서열을 위한 적합한 코돈을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 고안할 수 있다. 일반적으로, 상기 서열이 발현될 목적 식물숙주용으로 바람직한 코돈을 선택할 수 있다. 표준방법으로 제조한 중첩되는 올리고뉴클레오타이드로부터 완전한 서열을 조합하고 식물숙주세포로 전달하기 위한 완전한 코딩 서열로 조합한다. 예로 Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al., (1984) Science 223: 1299; Jay et al., (1984) J Biol Chem 259:6311를 참조.

추가로, 생산된 PKS단백질이 상기 아미노산 서열을 포함하여 자연에 존재하는 형태의 기질 특이성 및 활성을 가지거나, 원하는 특성이 유지되는 한 이들 단백질의 변형된 형태를 사용할 수 있다. 미국특허 제 5,712,146에 기재된 바와 같이, 자연 PKS서브유니트 서열에 변이를 도입하여, 그러한 변이가 확인할 수 있는 폴리케티드의 합성을 총체적으로 촉매할 수 있도록 다른 PKS와 함께 기능할 수 있다면 자연 PKS서열의 자리에 그러한 변이를 만들 수 있다. 변이를 포함하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 제조하고 변형 서열을 제한효소분해법으로 PKS 서브유니트를 코딩하는 유전자로 삽입하는 등의 종래의 기술을 사용하여 천연 서열에 그러한 변이를 도입할 수 있다.(Kunkel, T.A. Proc Natl Acad Sci USA (1985) 82/448; Geisselsoder et al., BioTechniques (1987) 5:786을 참조)

혹은, 잘못 짝지은(mismatch) 이중사슬의 해리온도이하의 온도에서 천연 뉴클레오타이드 서열(일반적으로 RNA서열에 대응하는 cDNA서열)에 혼성화하는 잘못짝지은 프라이머( 일반적으로 10-20 뉴클레오타이드 길이)을 사용하여 상기 변이에 영향을 미칠 수 있다. 프라이머 길이 및 상대적으로 좁은 제한범위내의 염기조성을 유지함으로써 그리고 중앙에 변이염기를 유지함으로써 상기 프라이머를 특이적으로제조할 수 있다(Zoller et al, Methods Enzymol 91983) 100:461). DNA폴리머라제, 클론된 산물 및 연장된 프라이머 사슬의 분리에서 유래된 변이된 DNA를 포함하는 클론을 사용하여 프라이머 연장을 수행하고 선택한다. 혼성 프로브로서 변이된 프라이머를 사용하여 선택한다. 또한 상기 기술은 다수의 점돌연변이의 생성에도 적용할 수 있다. 예로 Dalbadie-Mcfarland, et al., Proc Natl Acad Sci USA (1982) 79:6409를 참조. 또한 PCR 돌연변이야기법도 바람직한 변이를 수행하기 위해서 사용될 수 있다.

미국특허제 5,712,146은 추가로 사상균에서 발현을 위한 단일 및 다중벡터 혼성 방향족 또는 모듈 PKS 시스템의 구조물을 개시하고 있으며, 여기서 예를 들면 액티노르호딘의 오픈리딩프레임은 택일적 방향족 시스템의 오픈리딩프레임을 갖는 발현벡터에 포함된다. 1998년 5월 6에 출원된 미국출원번호 제 09/073,538는(본명세서에 참고문헌으로 병합됨) 순환(permutation), 특히 모듈 PKS 집단에서 자세히 기술하여, 이로써 다수의 공지 및 신규한 폴리케티드를 재조합 숙주세포를 제조할 수 있다. 본발명 및 본명세서에 기재된 실시예는 기능적인 PKS 및 결과적인 폴리케티드의 생산을 위한 적절한 PKS숙주로 작용할수 있는 식물세포숙주 및 식물의 적합성을 설명함으로써 이들 발명으로 확장한다.

PKS 집단에 존재하는 활성에 더하여, 기능적인 PKS를 얻기 위한 번역후변형도 필요하다. 특히 ACP기능은 포스파테닐 부분을 제공하는데 필수적이다. 상기 홀로-ACP합성효소는 이러한 활성화에 필요하다. 본발명의 바람직한 일례에서, 홀로- ACP 합성효소가 재조합 발현시스템을 이용하는 식물세포, 식물의 일부분 또는 완전한 식물에 제공된다.

따라서, 본발명을 실시하는 바람직한 방식은 PKS효소와 함께 아포-PKS를 생체내에서 활성을 갖는 홀로-PKS로 전환하는 이종 홀로-ACP를 발현하느 ㄴ것이다. Kealey et al., Proc Natl Acad Sci USA(1998) 95:505-509(본명세서에 참고문헌으로 병합됨)에 기재된 바 대로, 이종 홀로-ACP합성효소가 제공되지 않는다면, 효모숙주에서 P. 팔투럼의 6-MSAS에 의한 폴리케티드 산물을 거의 없거나 완전히 없다. 홀로-ACP합성효소을 발현하는 별개의 벡터를 도입함으로써, 홀로-ACP합성효소 및 PKS 모두를 발현하는 단일벡터를 도입함으로써, 또는 홀로 ACP-합성효소 및 PKS간에 융합된 단백질을 코딩하는 단일 유전자를 도입함으로써 상기 기능이 제공된다.

본발명을 실행하는 바람직한 일례는 바실러스 서브틸리스의 Sfp효소 및 술파신(surfacin)의 생산에 필요한 포스포판테테닐 트랜스퍼라제(PPTase)의 용도이다. PKS유전자를 포함하는 별개의 벡터 또는 PKS유전자를 포함하는 동일벡터에서 재조합 Sfp 유전자를 병합할 수 있다. 추가로, Sfp단백질의 코딩서열을 PKS코딩서열에 융합하여 PKS 및 Sfp 두 기능을 단일 키메릭 단백질의 일부로 할 수 있다.

본발명의 용도를 갖는 다른 PPTase는 에테로백신 합성에 필요한 EntD 의 E.coli(Gehring,et al., Biochem (1997) 36:8495-8503 및 그래미시딘 합성에 필요한 바실러스 브레브스의 Gsp(Borchert et al., J Bacteriol (1994) 176:2458-2462)이다. 단독의 PPTase는 다수의 PKS를 번역후 변형을 가지에 충분할 수 있고, 특별한 PPTase가 개별 PKS에 필요하도록 다른 PPTase가 기질특이성이 제한될 수 있다. E.coli에서 적어도 3개 다른 PPTase가 동정되었다. entD-코딩 PPTase는 엔테로백틴 합성효소에 특이적이고, ACPS는 지방산 합성에 필수적이다(Lambalot, et al., 상기문헌).

본방법에 사용된 PKS발현시스템은 단일벡터에 존재하거나 다수의 벡터에서 제공될 수 있다. 다수의 벡터를 사용할 경우에, 상기 벡터는 변형된 세포에서 기능적인 PKS발현시스템을 형성도록 결합하거나, 폴리케티드 합성에 필요한 각각의 효소활성을 제공하기 위해서 PKS시스템의 각요소를 별개로 발현하도록 제조할 수도 있다. 이러한 두 접근은 모두 미국특허 제 5,712,146 및 PCT출원 US97/23014에 기재되어 있다. 단일벡터시스템에서, 단일벡터는 PKS의 모든 효소적 요소를 포함한다. 다수 벡터 시스템에서, PKS발현시스템의 촉매활성은 다른 벡터로 분리되어 져서, 식물숙주세포로 도입된 후에 단일 PKS발현시스템을 형성하도록 재조합되거나, PKS를 형성하도록 별개의 발혈조절요소를 사용하여 발현될 수도 있다. 단일 벡터접근이 기능적으로 활성인 PKS의 더욱 효과적이기는 하지만, 다수 벡터접근은 다른 효소적 활성을 갖는 각각 하나, PKS라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있는 잇점을 가진다. 다수 벡터가 사용될 경우에, 몇몇예에서 완전한 발현시스템을 얻기위해서 교차배양(cross-bred)될 수 있는 다른 식물에서 다양한 부분의 집단을 위해 벡터를 제공할 수 있다. 추가로, 상기 집단의 성분들 및 번역후 효소는 융합 단백질을 얻도록 하나의 리딩프레임에서 코딩될 수 있다. 홀로-ACP 합성효소뿐만 아니라 도듈 PKS집단을 제공하는 융합은 상기 참고문헌 PCT출원에 기재되어 있다.

방향족 PKS시스템의 제조를 위한 벡터를 제조함에 있어서, 예컨대 도 2에서 나타낸 바와 같이, 별개의 리딩프레임을 단일의 벡터에 도입하거나, 적합하게 제조된다면, 각각의 리딩프레임중 재조합 또는 식물숙주세포에서 발현의 조절에 영향을 미치기 위한 적합한 서열로 함께 각각의 리딩프레임을 하나 이상의 발현벡터에 분포시킬 수 있다. 모듈 시스템의 경우에, 단일모듈 또는 하나이상의 모듈이 단일 벡터 또는 다수벡터의 발현시스템의 일부분으로 존재하여, 상기 식물세포가 바람직한 전체 PKS 시스템을 포함하도록 변형되는데 사용될 수 있다.

PKS 코딩서열에 더하여, 포스포판테테닐화를 위해서 다른 단백질 발현시스템을 식물숙주에 도입하는 것이 바람직하다. 상기한 바와 같이, PKS집단 발현시스템 또는 PPT효소를 운반하는 벡터를 PKS의 모든 부분 또는 일부분과 융합단백질로 생산할 수 있기 때문에, 적합한 PPT효소에 대한 발현시스템은 동일하거나 상이한 벡터상에 존재할 수 있다.

식물에서 발현을 위해서, 구체적으로 PKS 및 번역후 가공 효소 발현시스템을 변형하여 식물에서 바람직한 코돈을 이용하거나, 치사 스플라이싱자리를 제거하거나, GC/AT함량을 변화시킬 수 있다. 코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않는 적합한 뉴클레오타이드 서열의 변화는 본기술분야에서 이해된다.

폴리케티드에 번역후 변형을 야기하는 글리코실화 효소와 같은 추가적인 효소를 또한 적합한 재조합 발현시스템을 통해 숙주에 도입할 수 있다.

일례에서, 3개 별개의 벡터를 사용하여 모듈 PKS를 생산한다. 각 벡터는 두연장자(extender) AT(하나는 메틸말로닐 CoA에서 유래한 것이고 다른 하나는 말로닐 CoA에서 유래한 것임) 및 상기한 KR, DH DR의 4 조합을 사용하여 64개 다른 오픈리딩프레임을 제조할 수 있다. 따라서, 모듈 NO.1은 연장자 유니트로서 말로닐 CoA를 사용하였다; 모듈 NO. 2는 메틸말로닐 CoA를 사용하였고; 반대 서열을 사용하거나 두 연장자는 말로닐 CoA를 사용하거나 둘다는 메틸말로닐 CoA를 사용할 수 있다. 이 결과 4개 별개 유형의 연장자 조합이 생기며, 그들 각각은 4 KR/DH/ER변이체에 의해서 증식된다. 각각의 별개 벡터는 동일한 세트의 가능성을 제거하고; 하나의 플라스미드는 로딩기능을 수행하고 하나는 티오에스터라제 기능을 가져야 한다. 따라서, 192 플라스미들 제조함으로써, 신규 폴리케티드 합성의 상한은 64 x 64 X 64 또는 262,144분자이고 다수의 신규 폴리케티드를 얻는데 효과적인 방법이다.

식물에서 외부 DNA발현을 위한 발현유니트

상기에서 제공된 바와 같이, 본발명은 외부에서 제공된 PKS 코딩 DNA분자를 식물세포 또는 이로부터 재생된 식물에서 발현하기 위해서 발현유니트(또는 발현벡터, 시스템 또는 모듈)를 사용한다. 식물용 발현유니트/시스템/벡터를 제조하는 방법은 본 기술분야에서 알려져 있고 PKS코딩 서열을 발현용으로 쉽게 변화시킬 수 있다. 일반적으로 상기한 바와 같이, 그러한 유니트는 PKS코딩 모듈 및 하나이상의 발현조절요소를 사용한다. 사용된 조절요소의 선택은 변형시킬 식물, 원하는 바현에 대한 조절수준, 또는 사용될 형질전환시스템에 의존적일 것이다. 전문가는 알려진 방법 및 본명세서에서 제공된 예싱에 따라 본방법에서 용이하게 적합한 식물/벡터/발현 시스템을 사용할 것이다. 실시예에서, 수개의 적합한 식물발현 벡터의 제조를 기술할 것이다.

PKS코딩 서열의 발현을 조절하기위해서 사용된 발현 조절 요소는 일반적으로 이종 발현조절요소일 것이며, 이는 정상적으로 PKS코딩서열과 관련이 없다. 그러나, 정상적으로 PKS 코딩서열과 관련된 동종 조절요소가 식물숙주에서 활성적이라며, 사용할 수 있다. 다양한 이종 발현조절요소가 본기술분야에서 알려져 있으며, 본발명용으로 발현유니트를 제조하는데 사용할 수 있다. 예컨대, 전사개시영역은 다양한 오핀개시영역, 이를 테면 옥토핀, 만노핀, 노팔린 및 Ti플라스미드에서 발견되는 것등을 포함할 수 있다. 마직막으로, 프로리페라(prolifera) 프로모터, 열매-특이적 프로모터와 같은 식물프로모터을 사용할 수 있다. PKS 생산이 조직이나 식물기관, 예컨대 잎조직, 종자 또는 자실체에 특이적이도록 식물세포성장 또는 발달 단계에서 활성적인 프로모터가 가장 바람직할 것이다.

일반적으로 구성적인 프로모터(예컨대, CaMV, Nos프로모터), 기관 특이적 프로모터(예컨대 토마토의 E8 프로모터), 또는 유도성 프로모터를 본기술분야에서 알려진 표준기술을 사용하여 PKS코딩영역에 접합할 수 있다. 추가로 보충요소, 예컨대 전사종결인자 및/또는 인핸서 요소를 사용함으로써 발현유니트를 최적화할 수 있다.

따라서 식물에서 발현을 위해서, 발현유니트는 일반적으로 PKS코딩서열뿐만 아니라 식물프로모터 영역, 전사개시자리 및 전사종료서열을 포함할 것이다. 실시예에서 나타낸 바와 같이, 이미 존재하는 벡터에 삽입여부를 용이하게 분석하기 위해서 발현유니트의 5' 및 3'말단에 유일한 제한효소자리를 일반적으로 도입한다.

이종 프로모터 유도 발현시스템의 제조에 있어서, 상기 프로모터를 이종 전사개시자리와 동일한 거리에 두는 것이 바람직하다. 왜냐하면 그것이 전사개시자리로부터 자연적인 세팅이기 때문이다. 그러나 본기술분야에서 알려진 바와 같이, 이 거리의 약간의 변화는 프로모터 기능의 손실없이 가능할 것이다.

프로모터서열에 더하여, 발현시스템/유니트는 또한 효과적인 종료를 위해서 구조유전자의 하류에 전사종요영역을 포함할 수 있다. 프로모터 서열과 동일한 유전자로부터 종료 영역을 얻거나, 다른 유전자로부터 얻을 수 있다. 만약 PKS코딩서열에 의해서 코딩되는 mRNA가 효과적으로 가공된다면, RNA의 폴리아데닐화를 지시하는 DNA가 일반적으로 벡터구조물에 추가된다. 폴리아데닐화 서열은 아그로박테리움 옥토핀 합성효소 신호(Gielen et al., EMBO J 3:835-846) 또는 노팔린 합성효소 신호(Depicker et al., Mol and Appl Genet 1:561-573 (1982)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

결과적인 발현 유니트를 고등식물 형질전환에 적합한 벡터에 접합시키거나 제조한다. 또한 상기 벡터는 일반적으로 배양물에서 형질전환된 식물세포를 동정할 수 있도록 선택표지 유전자를 포함할 수 있다. 보통, 표지유전자는 항생제 내성을 코드할 것이다. 이들 표지는 G418, 히그로마이신, 블레오마이산, 카나마이산, 및 젠타마이신에 대한 내성을 포함한다. 식물세포를 형질전환시킨 후에, 벡터를 가진 이들 세포를 구체적인 항생제를 함유하는 배지에서 성장여부로 동정할 것이다. 박테리아 또는 파지숙주에서 벡터가 클로닝될 수 있도록 박테리아 또는 바이러스 기원의 복제서열은 일반적으로 또한 벡터에 포함될 것이며, 광범위한 숙주범위를 갖는 원핵세포의 복제기원이 포함되는 것이 바람직하다. 박테리아에 대한 선택표지가 또한 원하는 구조물을 갖는 박테리아세포를 선택하기 위해서 포함되어야 한다. 적합한 진핵생물의 선택표지는 카나마이신 또는 테트라마이신과 같은 항생제 내성을 포함할 것이다.

본기술분야에서 알려진 바와 같이, 추가적 기능을 코딩하는 다른 DNA서열이 벡터에 존재한다. 예를 들면, 아그로박테리움의 경우에, 식물염색체로 전달을 위해서 T-DNA서열이 또한 포함될 것이다.

본발명의 특히 바람직한 일례에서, 폴리케티드를 생산하는 식물숙주세포의 표면에서 나타나거나 내부에 존재하는 폴리케티드-반응성 수용체를 도입함으로써 식물세포 또는 식물을 자가-선별하도록 만들 수 있다. 이 "오토크라인(autocrine)"시스템은 상기 수용체를 활성화하는 것에 대해 콜로니가 자가선별되도록 하는 것이다. 그러한 시스템은 예컨대 Broach, J.R., et al, Nature(1996) 384: 본문헌 7:14-16에 기재되어 있다.

그러나, 오토크라인 시스템은 수용체에 한정될 필요는 없으며, 형질전환된 식물세포의 내부에서 발현되고 Fields의 미국특허 제 5,283,173에서 기재된 것과 유사한 방식으로 그의 상호작용을 생산된 폴리케티드와 관련하여 측정가능한 단백질을 포함한다.

따라서,폴리케티드 기능에 대해 "식물세포-기재 탐지시스템"을 만들기 위해서 식물세포를 변형할 수 있다. 폴리케티드의 기능은 세포표면 또는 세포내부에서 생산된 수용체에 관한 작동근과 길항근 활성을 포함하거나, 또는 상기 폴리케티드는 라파마이신 및 FK506과 유사하게 단백질-단백질 상호작용 저해제 또는 교차-결합 인자를 선택할 수 있도록 두 하이브리드 상호작용 선별에 대한 작동근 또는 길항근일 수 있다.

효소적 활성의 분획화

폴리케티드 합성효소는 폴리케티드 산물의 합성에서 다양한 아실 CoA 전구체를 이용할 수 있다. 이들은 많은 생합성경로에서 일반적으로 사용되는 아세틸CoA, 말로닐 CoA, 프로피오닐 CoA 및 메틸말로닐CoA을 포함한다. 추가로, 합성의 개시전구체로서 또는 합성주기의 후기에 연장자 전구체로서 더욱 특이적인 아실CoA를 사용할 수 있다. 일반적으로 사용되는 전구체의 풍부함은 식물에서 잘 이해되지 않는다. 그러나, 이들 전구체 수준은 여러가지 세포분획간에 다양할 수 있다. 어떠한 특이적인 PKS로 폴리케티드 산물의 합성은 분획마다 다양할 것으로 예상된다. 분해기능과 합성기능의 일반적인 자리인 어떠한 하위세포 분획이 폴리케티드 합성을 위한 자리로 사용될 수 있으며, 예컨대 세포질, 색소체, 퍼옥시좀, 미토콘드리아, 등을 포함한다.

비록 어떠한 분획이 PKS와 함께 사용될 지라도, PKS와 함께 발현될 수 있는다른 기능에 따라서 몇몇 분획은 특이적 전구체로 합성하는데 더욱 바람직할 수 있다. 예를 들면, 아세틸 CoA 및 말로닐 CoA만을 전구체 요구하는 PKS-촉매반응에 있어서(예, 곰팡이 PKS), 바람직한 분획은 세포질 및 색소체이고, 가장 바람직한 분획은 색소체이다. 색소체는 지방산 합성의 자리이고, 세포의 어떠한 분획의 아세틸 CoA 및 말로닐 CoA를 함유하는 것으로 예상된다. Nawrath, et al., Proc Natl Acad Sci USA(1994) 91:12760-12764에서 세포질활성이 아니라 색소체-표적화 효소활성을 사용하여 식물세포에서 폴리히드록시부틸레이트의 이종합성이 5 내지 10배 증가속도를 보고하고 있다. 폴리히드록시부틸레이트 이종합성에 필요한 유일한 전구체는 아세틸 CoA이다.

다른 분획에서 프로피오일 CoA 및 메틸말로닐 CoA의 활용은 식물세포에서 현재 알려져 있지 아니하다. 말로닐 CoA가 피너스 스트로버스에서 C-메티화 칼콘의합성에 필요하다는 것에 기초하여 몇몇 식물세포에 존재한다는 보고가 있다(Schroder J., et al. Biochemistry (1998) 37:8417-8425, 본명세서에 참고문헌으로 병합됨). 홀수 사슬길이 지방산및 어떠한 아미노산의 분해대사동안 생성되는 프로피오닐 CoA는 산화성 분획, 예컨대 미토콘드리아 또는 퍼옥시좀에 존재할 것이다. 식물발달의 몇몇 단계동안에, 이들 분획은 지방산 대사를 통해 아세틸CoA를 높은 수준으로 폼할할 것이다. 이러한 분획은 생합성에 관련되지 않기 때문에, 말로닐CoA가 상당한 수준으로 존재하지 않을 것으로 예상된다.

진핵생물, 구체적으로 식물세포에서 유전자 산물을 특정 하위세포분획으로 표적화하는 것을 광범위하게 연구하였다. 예를 들면, 미국특허 제 5,728,925 및 5,717,084(본명세서에 참고문헌으로 병합됨)은 단백질이 엽록체로 표적화될 수 있음을 기재하고 있다. 세포질 단백질의 N-말단에 운반펩티드를 부착함으로써 일반적으로 엽록체로의 표적화가 이루어질 수 있다. 색소체에 대한 운송펩티드로 기능하는 다른 서열의 범위 및 이들 서열의 일반적인 특징은 본기술분야에서 잘 알려져 있다.

또한, 퍼옥시좀으로 단백질을 표적화하는 방법도 본기술분야에서 잘 알려져 있으며, 세로질에서 합성되는 단백질의 특이적 서열을 이용한다. 두개의 다른 유형의 표적화 신호, 즉 유형 1또는 유형 2의 PTS를 사용하여 퍼옥시좀의 매트릭스로 표적화되는 단백질이 표적화된다. PTS1은 극말단 C-말단에 존재하는 비절단 트리펩티드 모티프 예컨대, SKL(단일아미노산 명명)이며, 작은 염기성-소수성 아미노산 모티프를 사용하는 다른 트리펩티드를 가지고 있다(Gietl. C. Physiol Plant (1996) 97:599-608; Olsen, et al., Ann Rev Plant Physiol and Plant Mol Biol (1995) 46:123-46). PTS2는 몇몇 퍼옥시좀의 매트릭스-목적화 단백질의 N-말단 영역에서 발견되며 R-L/I/Q-X₅-H/Q-L형태의 몇몇 노나펩티드(nonapeptide)이다.

미토콘드리아로 단백질을 표적화하는 방법이 본기술분야에서 잘 알려져 있다. 미토콘드리아-표적화 단백질을 N-말단 프리서열을 갖는 세포질 전구체로 합성된다. 이 프리서열이 수용체 단백질과 상호작용하여 외막, 아마도 내막 및 다양한 미토콘드리아의 하위분획으로 상기 단백질을 인도하는 과정이 개시된다. 전구체 폴리펩티드를 미토콘드리아 및 엽록체로 표적화하는 서열이 또한 본기술분야에 알려져 있다(WO95/08633). 미토콘드리아 및 다른 분획으로 들어가기 위해서는, 큰 단백질이 풀려지기 위한 부가적인 기능의 향상된 발현(예, 샤퍼론(Chaperon))이 요구된다. 예를 들면, mhsp 70은 미토콘드리아의 내부에 존재하여 단백질이 미토콘드리아의 외막을 통과하는 것을 돕는다(Matuouschek, et al., EMBO J (1997) 16:6727-6736). 미토콘드리아-입수 자극인자(MSF)와 같은 기능은 미토콘드리아 입수 수용체와 관련되기 전에 세포질에서 단백질의 언폴딩(unfolding)과정에 관련된다(Komiya et al., EMBO J (1997) 16:4267-4275)

전구체 생성

전구체 이용가능성은 폴리케티드 산물의 합성에 제한적일 수 있다. 구체적인 폴리케티드 산물의 생산수준을 증가시키기 위해서는, 구체적인 전구체의 합성을 증가시키는데 필요한 효소를 코딩하는 추가적인 유전자 구조물이 필요한다. 예를 들면, 말로닐 CoA효소의 양을 증가시키기 위해서는, 아세틸 CoA에서 메틸말로닐 CoA로의 전환을 촉매하는 아세틸 CoA 카르복실라제(ACC)가 적합한 분획에서 발현되어야 한다. 식물에서 ACCase는 또한 프로피오닐 CoA에서 메틸말로닐 CoA로 전환에도 관여한다는 것이 보고되었다. ACCase활성의 이용은 적합한 기질, 아세틸 CoA 및 말로닐 CoA의 이용가능성에 의존적이다. 아세틸 CoA가 생성되는 분획(및 조직)에서 적합한 수준으로 ACCase가 발현될 때, ACCase는 적합한 폴리케티드의 기질로서 아세틸 CoA와 말로닐 CoA의 균형있는 양을 제공할 수 있다. 혹은, 아세틸 CoA 및 프로피오닐 CoA가 모두 존재할 때, ACCase의 적절한 발현은 적합한 양의 아세틸 CoA , 프로피오일CoA, 말로닐 CoA 및 메틸말로닐 CoA의 합성을 제공할 수 있다.

메틸말로닐CoA의 향상된 합성을 특이적으로 제공하기 위해서는, 원하는 분획에서 프로피오닐CoA 카르복실라제 활성이 발현될 수 있다. 프로피오닐-CoA 카르복실라제 활성을 갖는 효소가 스트렙토미세스 코리콜러 A3(2)(Bramwell. et al. Microbiology (1996) 142(Pt3):649-655)에서 확인되었으며, 이종다이머 효소의 한 서브유니트가 클로닝되었다. 다른 두 카르복실라제의 적합한 발현수준을 통해, 다양한 범위의 폴리케티드 생합성 경로에 적합한 전구체 수준을 다른 분획에서 확립할 수 있다.

식물은 일반적으로 아미노산을 에너지원으로 사용하지 않기때문에, 프로피오닐 CoA의 수준이 폴리케티드 합성을 위해서 향상될 필요가 있다. 프로피오닐 CoA는 아미노산의 분해대사에서 생성되기 때문에, 세포내 아미노산 수준의 향상을 가져오는 특정 아미노산의 합성은 아미노산 분해대사경로를 통해 증가된 흐름을 지시할 것이다. 생합성 경로는 종종 피드백 조절하에 있기 때문에, 생합성 효소의 피드백 조절자리의 파괴는 세포내의 아미노산 농도를 증가시킨다. 식물세포에서 증가된 아미노산은 피드백 저해를 경감시키는 아세토락테이트 합성요소를 변이시킴으로써 설명된다.

Schroder, et al., Biochemistry (1998) 37:8417-8425는 기질로서 메틸말로닐 CoA가 필요하고 세포질 분획에서 일어나는 피너스 스트로버스에서 생합성을 설명한다. 이 반응은 C-메틸플라본 생합성의 일부이다. 다른 몇몇 식물에서 C-메틸플라본을 생산하며, C-메틸플라본은 박테리아 및 곰팡이의 PKS과 무관한 PKS에 의해 생산되는 칼콘의 유도체이다. 구조적 분석에 기초하여, 메틸말로닐 CoA는 이들 다른 C-메틸플라본의 합성에서 기질이다. 분명히, 어떤 식물은 메틸말로닐 CoA를 합성할 수 있다. 본기술분야에서 알려진 방법에 기초하여, 메틸말로닐 CoA의 합성에 대한 유전자를 확인할 수 있으며, 메틸말로닐 CoA의 제공을 위해 이들을 바람직한 식물숙제에 도입할 수 있다. 게다가 C-메틸 플라본 생산자로부터 프로피오닐 CoA의 합성에 대한 유전자를 얻을 수도 있다.

조직 유형 및 발달단계

어떠한 발달단계 동안 또는 특정 조직유형에서, 식물은 분화된 대사기능을 이용한다. 어떤 경우에, 대사적 로드를 제공하기 위해서 기질 농도가 증가된다. 예를 들면, 기름종자의 발달동안 및 성숙하는 동안, 지방산이 매우 높은 속도로 합성되고, 아세틸 CoA 및 말로닐 CoA의 증가된 흐름이 수반된다. 폴리케티드의 목적인 약학적 또는 농업적 용도라면, 기름종자가 폴리케티드 합성의 바람직한 표적자리가 될 수 있다. 원하는 표적조직에서 특이적으로 높게 발현되는 적합한 프로모터로서 번역후 변형에 필요한 PKS 효소 및 폴리케티드 합성에 필요한 다른 효소를 프로그램할 수 있다. 그러한 조직 및 발단단계-특이적 프로모터는 본기술분야에서 잘 알려져 있다.

보조기능

적합한 수준의 생합성 기질을 갖는 식물 하위세포 분획에 있어서 기능적인 PKS는 폴리케티드 산물의 합성을 제공할 것이다. 대부분의 1차적인 폴리케티드 산물은 생물학적으로 활성이지 않다. 일반적으로 추가적인 생합성 효소가 1차 폴리케티드를 생물학적으로 활성인 분자로 전환하는데 필요하다.

1차 폴리케티드를 생물학적으로 활성인 분자로 전환하는데 필요한 광범위한 보조기능이 기술되어 었다. 이는 고리화반응, 산화반응, 환원반응, 메틸화반응(산소 또는 탄소원자에서), 탈카르복시반응, 탈수반응, 불포화반응 및 접합반응을 포함한다. 필요한 단계수는 예컨대 10반응이상이 1차 폴리케티드 산물을 잠재적인 미토톤신 아플라톡신으로 전환하는데 필요하다(Brown, et al., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:1418-1422).

일례로서, 밀베마이신(milbemycin) 및 아베르메긴(avermectin)은 살진드기성, 살선충류성(nematodical) 활성을 갖는 폴리케티드이다. 이들 화합물은 스트렙토미세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) 및 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스 subsp(Streptomyces hygroscopicus subsp.). 오레올라크리모수스(aureolactimosus)의 모듈 PKS에 의해서 생성된다. 밀베마이신 및 아베르멕틴모두에 대한 1차 폴리케티드 산물은 예상된 분자량이 450, 700, 610 및 540kDa인 4개 다른 단백질에 위치하는 12모듈을 필요로 한다(Ikeda, H., et al., Chem Rev (1997) 97(7):2591-2609). 이들 모듈은 개시자 아실 CoA특이젓 및 아베트멕틴의 C22-23에 이중결합이 있다는 점에만 차이가 있다. 이들 클래스의 폴리케티드 산물간에 주요한 차이로는, 밀베마이신 합성이 마베르멕틴(아세틸CoA 및 프로피오닐CoA)보다 아실CoA에서 더 자주 시작하며, 밀베마이신은 아베르멕틴 아글리콘의 C13히드록시에 부착된 이당류 부분이 없다는 것이다. 밀베마이신의 합성은 푸란고리를 형성하거나 C5 케토기의 환원을 위한 부가적인 기능을 필요로 한다. 아베르멕틴의 합성은 이당류 및 폴리케티드 핵에 부착에 필요한 추가적인 기능을 필요로 한다. 밀베마이산의 합성에 필요한 모든 유전자들을 생산하는 생명체로부터 분리하여 이종 발현 식물세포의 제공을 위해 가공하였다.

두번째 일례에서, 스트로빌루린 A는 바시디오미세테스(예, 스트로빌루러스 테나셀러스)가 생산하는 곰팡이의 폴리케티드 산물이다. 비록 완전한 생합성 경로가 밝혀지지 않았지만, 수개의 추가적인 효소가 PKS핵에 더하여 필요하다: 출발분자로서 시나밀 CoA에서 벤조일 CoA로 전환하는 하나 또는 두 효소,C1 COOH에서 C3로 재배열하는 효소, C-메틸트랜스퍼라제 및 두가지 O-메틸트랜스퍼라제.

박테리아 및 곰팡이 폴리케티드 산물 모두의 합성에 필요한 생합성 유전자는 일반적으로 생성 생물체의 게놈에 모여있다. 이는 스트렙토미세테스의 폴리케티드 산물(Chater, K., et al., EMBO J (1985) 4:1893), 이외에도 사상균 폴리케티드 산물(예, 아플라톡신, Brown et al., 이전에 인용한 책)에 대해 잘 문헌화되어 있다. 어떠헌 특성화되지 않은 생산 생명체로부터 PKS를 포함하는 게놈 클론을 동정하기 위해서 이종 PKS프로브를 사용한다. PKS 집단은 이들의 뉴클레오타이드 서열이 매우 다양하기 때문에, PKS유전자의 보존된 영역으로 표적화된 프라이머를 사용하여 PCR를 통해 동종 PKS 프로브가 필요하다. 큰 게놈클론(람다 파지, 코스미드, BASs 또는 본기술분야에서 알려진 다른 벡터를 사용)은 혼성화에 의해서 직접적으로 탐지된 PKS에 더하여 보조유전자도 포함할 것이다.

식물세포의 형질전환

예컨대 상기에서 언급한 것과 같이 적합한 벡터를 얻은 경우, 바람직한 발현 유니트를 포함하는 트랜스제닉 식물을 제조한다. 실시예에서 기재된 바와 같이, 한가지 형질전환방법은 PKS를 코딩하는 DNA벡터를 종자형성기관을 포함하는 식물세포로 도입하는데 있어서 진공 침입에 의존적이다(Bechtold, N.,Ellis, J., and Pelletier, G. (1993) C.R. Acad. Sci., Paris/Life Science 316:1194-1199). 진공침입법에 있어서, 진공하에서 형질전환된 아그로박테리움을 함유하는 용액에 전체 식물을 접촉시킨다. 상기 식물을 성장시켜 종자를 형성하도록 한다. 상기 종자를 모아서 도입된 벡터의 존재를 확인한다. 이 방법의 장점은 배양된 식물세포로 부터 식물체를 재생시키기 위한 체새포 배발생을 필요로 하지 않는 다는 것이다.

또다른 형질전환 방법에서, 벡터를 마이크로피펫을 사용하여 벡터를 직접 식물세포로 미세주입하여 재조합 DNA을 식물세포로 기계적으로 전이시킨다(Crossway, Mol Gen Genetics (1985) 202:179-185). 또다른 방법에 있어서, 폴리에틸렌 글리콜를 사용하여 식물세포로 유전물질을 전이시키거나(Krens, et al, Nature (1982) 296:72-74) 또는 작은 입자나 비드내의 매트릭스내부에 또는 표면에 핵산을 갖는 작은 입자로 고속탄도 관통을 사용한다(Klein et al., Nature (1987) 327:70-73). 또다른 방법에 있어서, 원형질체를 도입할 DNA를 갖는 다른 것과 융합한다. 이러한 것들은 미니셀, 셀, 리소좀, 또는 다른 지질-표면체일 수 있다(Fraley, et al., Proc Natl Acad Sci USA (1982) 79:1859-1863).

또한, 전기천공법(electroporation)으로 DNA를 식물세포로 도입할 수 있다(From et al., Proc Natl Aca Sci USA(1985) 82:5824). 이 기술에서, 발현벡터를 포함하는 플라스미드의 존재하에서 식물원형질체를 전기천공한다. 강한 장의 전기충격은 생체막을 역으로 통과하여 플라스미드를 도입할 수 있게 한다. 전기천공된 식물 원형질체는 세포벽을 재생하고 분열하고 재생산한다.

박테리아 감염-매개 형질전환을 위해서는, 미리 DNA로 형질감염된 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조젠으로 식물세포가 감염되어야 한다. 아그로박테리움은 그램 음성 리조비아시에 패밀리의 대표적인 속이다. 그 종은 근두암종(아그로박테리움 투메파시엔스) 및 털이 있는 뿌리질병(아그로박테리움 리조젠)의 원인이다. 근두암종 및 털뿌리에서 상기 식물세포는 오직 박테리아에 의해서 대사되는 오핀이로 알려진 아미노산 유도체를 생성하도록 유도된다. 오핀발현의 원인인 박테리아 유전자는 키메릭 발현 카세트의 조절요소의 편리한 근원이다. 추가로, 오핀의 존재여부의 분석을 사용하여 형질전환된 조직인지를 확인할 수 있다.

아그로박테리움 투메파시엔스의 Ti 플라스미드 또는 Ri플라스미드를 사용하여 적합한 식물세포에 PKS 코딩 유전자 서열을 도입할 수 있다. 아그로박테리움의 감염에 의해 식물세포로 Ti 또는 Ri 플리스미드를 도입하고 식물게놈으로 안정적으로 병합된다(St., J., Science (1987) 237:1176-1183). Ti 및 Ri 플리스미드는 형질전환된 세포를 생산하는데 필수적인 두 영역을 포함한다. 이들중 하나는 전이DNA(T-DNA)로서 식물의 핵으로 전이되어 종양이나 뿌리 형성을 유도한다. 다른 하나는 병원성영역(vir)으로서 전이에 필수적이지만 그 자체는 전이되지 않는다. vir영역이 다른 플라스미드상에 존재하는에도 상기 T-DNA가 식물세포로 전이될 수 있다(Hoekema, et al., Nature (1983) 303:179-180). 그의 전이능력에 영향없이 이종 DNA를 삽입함으로써 전이된 DNA영역의 크기를 증가시킬 수 있다. 따라서 질병을 야기하는 유전자가 결실되도록 변형된 Ti 또는 Ri 플리스미드을 벡터로 사용하여 본발명의 유전자 구조물을 적합한 식물세포로 전이시킬 수 있다.

재조합 Ti 및 Ri 플리스미드의 제조는 본기술분야에서 잘 알려져 있으며, 일반적으로 하나이상의 공통 박테리아 벡터, 예컨대 pBR322를 사용하는 방법을 따른다(예컨대, Koncz, C., and Schell, J. (1986), Molecular and General Genetics 204:383-396). 천연 플라스미드 및 때때로 외부 서열로부터 제조된 보조 유전자 요소를 추가적으로 사용할 수 있다. 이들은 "셔틀 벡터"(Fruvkum and Ausubel, Nature (1981) 298:85-88), 프로모터(Lawton et al., Plant Mol Biol (1987) 9:315-324) 및 선택인자로서 항생제 내성에 대한 구조유전자(Fraley et al., Proc Natl Acad Sci USA (1983) 80:4803-4807)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

현재 사용되는 Ti 및 Ri 플리스미드는 두 클래스가 있다. 한 클래스는 "공동병합(cointergrate)"라고 불리는 것으로서 목적 유전자를 함유하는 셔틀벡터를 유전적 재조합방법으로 식물형질전환에 필요한 시스-작용성 요소 및 트랜스-작용성 요소를 모두 포함하고 있는 비종양성 Ti 플리스미드로 삽입하는 것이며, 예로는 Block et al., EMBO J (1984) 3:1681-1689에 기재된 pMLJ1셔틀벡터 및 Zambryski et al., EMBO J (1983) 2:2143-2150에 기재된 비종양성 Ti 플리스미드 pGV3850이 있다. 두번째 클라스는 "이성분 시스템"으로서 형질전환에 필요한 시스-작용성 요소를 포함하는 셔틀벡터에 목적 유전자가 삽입된다. 다른 필요한 기능은 비종양성 Ti 플라스미드, 예컨대 Bevan, Nucleic acid Research (1984) 12:8711-8721 에 기재된 pBIN19 셔틀벡터 및 Hoekma, et al. Nature (1983) 303: 179-180에 기재된 비종양성 Ti 플라스미드 PAL4404에 의해 트랜스로 제공된다. 이들 벡터의 일부는 시판되고 있다.

아그로박테리움으로 식물세포를 형질전환하는 일반적인 방법은 두가지가 있다: 배양된 원형질체와 함께 아그로박테리움을 배양, 또는 아그로박테리움으로 완전한 세포 또는 조직의 형질전환. 첫번째는 원형질체의 배양과 후속적으로 배양된 원형질체로부터 식물의 재생이 가능한 확립된 배양시스템이 필요하다. 두번째 방법은 (a)완전한 식물조직, 예컨대 떡잎를 아그로박테리움으로 형질전환시키고, (b) 형질전환된 세포 또는 조직을 완전한 식물로 재생하는 것이 필요하다.

대부분 쌍떡잎식물종은 아그로박테리움에 대한 천연 식물숙주로서 아그로박테리움에 의해 시험관내에서 형질전환가능하다. 외떡잎식물은 특히 곡류는 아그로박테리움에 대한 천연 숙주가 아니다. 아그로박테리움으로 이들을 형질전환시키려는 시도는 최근까지 성공적이지 못하였다(Hooykas-Van Slogteren et al., Nature (1984) 311:763-764). 그러나, 아그로박테리움에 의해 어떠한 외떡잎식물은 형질전환될 수 있는 증거가 현재 있다. 신규한 시험적 접근을 사용하여, 곡류종, 예컨대 호밀(De la Peza, et al., Nature (1987) 325:274-276), 옥수수(Rhodes et al, Science (1988) 240: 204-207), 및 벼(Shimamoto,et al., Nature (1989) 338:274-276)는 현재 형질전환될 수 있다.

상기한 바와 같이, 일반적으로 형질전환 벡터에서 선택표지를 포함시키거나 성공적인 박테리아 감염의 증거로서 형질전환된 세포 또는 식물를 확인하였다.

형질전환된 식물의 재생

또한 PKS코딩 서열을 포함하도록 형질전환된 식물세포를 알려진 기술을 사용하여 재새할 수 있다. 예를 들면, 배양된 원형질체로부터 식물재생은 Evans et al., Handbook of Plant Cell Cultures, Vol.A:(MacMillans Publishing Co. New Your, 1983); and Vasil I.R.(ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad, Press, Orlando, Vol. 1, 1984 and Vol. II, 1986에 기재되어 있다. 실질적으로 모든 식물종을 배양된 세포 또는 조직에서 부터 재생할 수 있으며, 이는 사탕수수, 사탕무우, 면화, 과수 및 콩과식물을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

재생방법은 식물종마다 다양하나, 일반적으로 형질전환된 이식체를 포함하는 형질전환된 원형질체 현탁액 또는 페트리 플레이트를 먼저 제공한다. 유합(callus) 조직을 형성하고 유합조직으로부터 지맥을 형성하고 뿌리를 유도한다. 혹은, 유합조직에서 체세포 배형성을 유도한다. 배양배지는 일반적으로 다양한 아미노산과 옥신 및 사이토키닌과 같은 식물호르몬을 포함한다. 특히 옥수수나 자주개자리와 같은 종의 경우에 배지에 글루탐산 및 프롤린을 첨가하는 것이 이롭다. 효과적인 재생은 배지, 유전형 및 배양경과에 의존적이다. 이러한 변수가 조절된다면, 재생과정은 반복가능하고 재현가능하다.

상기 절차를 사용하여, 다양한 식물을 형질전환시키고 재생할 수 있다. 다음에 아라비돕시스(arabidopsis)와 담배를 예로 들어 설명한다. 다른 유용한 종으로는 완두콩, 후추, 피튜니아, 밀 및 면화이다. 이 열거는 비제한적이며, 어떠한 원하는 고등식물도 숙주로서 이용할 수 있다.

다음의 실시예는 단지 예시적이며 본발명이 이에 한정하려는 의도는 아니다.

실시예 1: 6-MSAS에 대한 발현벡터의 제조

발현벡터 pBI121 로 폴리케티드 합성효소 유전자의 클로닝을 용이하게 하기 위해서 합성 폴리링커를 제조하였다. 이 폴리링커는 SacI, BamHI, NdeI, XbaI, EcoRI, AvrII,SpeI, SnaBI 및 Asp718 제한효소자리를 포함한다:

5'-CGGATCCATATGAACCTCTAGAGAATTCATAGACTAGTCCTAGGTACGTAG-3'

3'-TCGAGCCTAGGTATACTTGGAGATCTCTTAAGTATCTGATCAGGATCCATGCATCCATG-5'

이 폴리링커는 BlueScript (Stratagene)의 SacI/Asp718자리로 클로닝되어 클로닝벡터 131a를 제조하였다.

BamHI, AvrII, SpeI SnaBI제한효소를 포함하는 합성폴리링커를 고안하였다:

5'-GATCCATCCACTAGTCCTAGGTAC-3'

3'-GTAGGTGATCAGGATCCATG-5'

이 폴리링커는 pBI121(Clontech)의 BamHI/SnaBI자리로 클로닝되어 클로닝벡터 131b를 제조하였다.

페니실룸 파툴럼 6-메틸살리실산 합성효소에 대한 유전자를 포함하는 5.5-kbp NdeI/XbaI단편을 pDB102(E.coli SCS 110으로부터 분리됨)로부터 분리하여 131a의 NdeI/XbaI 자리로 클로닝되었다. 이 중간체 플라스미드의 BamHI/SpeI단편을 131b의 BamHI/SpeI자리로 클로닝하여 6-MSAS에 대한 발현시스템을 함유하는 발현벡터 131c를 생산하였다.

실시예 2: ery A-1에 대한 발현벡터의 제조

DEBS 티오에스테르와 융합된 사카로폴리스포라 에리쓰라에아의 eryAI유전자를 포함하는 11.2kbp NdeI/EcoRI단편을 pCJT75로부터 분리하여 벡터131a의 NdeI/EcoRI자리로 클로닝하였다(Kao, C.M., et al., J Am Chem Soc (1995) 117:9105-06). 이 중간체 플라스미드의 BamHI/AvrII단편을 131b의 BamHI/AvrII 자리로 클로닝하여 eryA-1에 대한 발현벡터 131b를 생산하였다.

실시예 3: grsA에 대한 발현벡터의 제조

바실러스 브레비스의 grsA유전자를 포함하는 2-kbp NcoI/HindIII단편을 pQE60-PheAT로부터 분리하여 131a의 NcoI/HindIII자리로 클로닝하였다. 이 중간체 플라스미드의 XbaI/SpeI단편을 131b의 XbaI/SpeI자리로 클로닝하여 grsA에 대한 발현벡터 131e를 제조하였다.

실시예 4: 진공침입 식물성장을 사용하는 Arabidopsis의 형질전환

1.볼트가 막 나타나는 단계에 대한 적합한 유전자형의 식물의 성장

바람직하게도, 3.5" 포트에서 12-15식물을 배양하였다. 파종후 이 포트를 나일론 창문 스크린으로 덮을 수 있다. 식물은 스크린을 통해 자랄 것이므로 침입을 위해 포트를 뒤집었을 때에 먼지가 덜 떨어진다.

2. 다수의 두번째 볼트의 성장을 촉진시키는 나탄난 볼트을 깍기

예를 들면 가위를사용하여 생성되는 볼트를 절단하여 다수의 두번째 볼드의 성장을 촉진시킨다.

3. 진공침입

적합한 PKS발현벡터, 131c, 131d 또는 131e를 운반하는 아그로박테리움의 액체배양물은 하룻밤 배양하였다. 진공침입 절차를 수행하기전에 2일 또는 3일체 25ml 하룻밤(LB +항생제)를 시작하였고 접종배양물로 사용하였다. 이 배양물을 침임하기전날에 400ml의 LB + 항생제에 첨가하였다..

4. 약 24시간배양후에, 원심분리(예를들면, GSA 로터에서 5K rpm 10분간,바람직하게는 실온에서)하여 세포를 수확하고 3 부피 침입배지에 재현탁하였다(OD 600 약 0.8).[바람직하게는, 먼저 세포를 작은 부피로 재현탁하고 OD 600 0.8이 되게 희석한다]. Arabidopsis 판을 형질전환시키는 준비가 된 진공탱크를 충진하기 위해서 약 2리터의 박테리아가 필요하다.

5. 접시 또는 비커에 아그로박테리움(침입배지: 1/2 X Murashige & Skoog 염, 또는 MS 염 + 유기; 1X B5 비타민; 5.0% 수크로스; 0.44μM 벤질아미노푸린(DMSO에 1 mg/ml 스톡리터당 10μL))을 첨가하고 식물을 액체용액으로 뒤집는다.

6. 벨병속에 비커를 둔다. 잎 및 줄기의 표면에 거품이 생길때 까지 진공을 유도한 후에, 빠르게 진공을 방출한다. 필요한 시간 및 진공압력은 실험실마다 다양할 것이다. 좋은 침입은 일정하게 어둡고 물을 먹은 조직으로 분명히 보인다.

7. 비커에서 식물을 제거하고 플라스틱 랩이나 돔으로 덮어 수분을 유지한다. 그 다음날, 덮개를 제거한다.

침입한 직후에 직접광으로부터 식물을 보호하기 위해서 밤까지 큰 습도 돔으로 덮어둔다. 가능한한 부생식물(saprophytes)의 성장을 최소화하기 위해서 습도돔을 제거한다.

8. 각각의 포트와 함께 및 이웃 포트와 별개로 볼트를 유지하면서 약 4주간 성장시킨다.

형질전환체의 선택

9. 식물상의 장각과가 매우 건조할 때, 종자를 수확한다(모든 종자를 하나의 포트에서 유래됨)

카나마이신 선택에 대해

10. 4개의 선별판(1/2 X Murashige & Skoog; 0.8% 아가)에 붓고; 오토클레이브살균, 냉각한 후에 첨가: 1X B5 비타민; 항생제(예컨대 Km 50μg/ml); 플락스틱 150 X 15mm 페트리디쉬가 편리한다(Murashige, T. et al, (1962) Physiologia Plantarum 15:473-497)

11. 종자를 멸균한다. 다양한 멸균방법을 사용할 수 있다. 예를 들면; 에탄올 또는 이소프로판올에서 1분처리후에 50% 블리치/50%물/0.05% 트윈스에서 5분간처리, 멸균수로 3회 헹굼.

12. 실온 멸균 0.1% 아가로즈에서 재현탁함으로써 종자를 깔로 선택 플레이트에 편다. 플레이트가 뒤집어질때 종자가 더이상 흐르지 않을 때까지 라미나 흐름 후드에서 플레이트를 건조한다. 매 500-1000 종자마다 1ml의 아가로스를 사용한다.

150 X 15mm 플레이트당 2000 내지 4000 종자를 깐다. 더 높은 밀도는 항생제 선택의 효과가 적게한다.

13. 저온에서 2일밤동안 플레이트를 춘화처리한다. 성장 챔버로 플레이트를 이동시킨다.

14. 약 7일후에, 연장되고 선택배지로 건강한 푸른 두번째 잎 및 뿌리를 갖는 진녹색 식물로서 형질전환체를 확인할 수 있어야 한다.

15. 묘목을 토양에 이식, 성장 및 종자를 모은다. 잡아당기기 전에 뿌리둘레의 아가를 파괴함으로써, 심기전에 뿌리로 부터 부착된 아가를 제거함으로써, 이식후에 물로 토양을 포화시킴으로써, 그리고 첫날 또는 이튿날을 돔(고습도를 위함)존재하에 식물을 성장시킴으로써 이식성공율을 높일 수 있다. 만약 뿌리가 부서진다면, 이식전 며칠동안 묘목을 새로운 선택배지에 두어라.

실시예 5: 추가적인 발현벡터의 제조

바실러스 서브틸리스의 Sfp에 대한 코딩서열을 포함하는 700bp NcoI/XbaI단편을 pKOS 018-88A로부터 분리하고 pUC 레플리콘, 암피실린 내성 유전자, e35S 프로모터(Kay, R., et al., Science (1987) 236:1299-1302) 및 Nco자리에서 종료되는 Cab22L 리더 및 XbaI자리에서 시작하는 노팔린 합성효소 3' 단편를 포함하는 4.1kbp NcoI-XbaI단편과 접합하였다. 얻어진 발현벡터 pBH 1000은 키메릭 e35S-Sfp-nos3'유전자를 포함한다.

키메릭 e35S-Sfp-nos3'유전자를 포함하는 1.7kbp BamHI/BglII 단편을 pBH1000으로부터 분리하여 pACYC184 레플리콘(Chang,A.C.Y. et al.,J Bacteriol (1979) 134:1141-1156), pVS1 레플리콘(Itoch, Y., et al., Plasmid (1984) 11:206-220), Tn 1721의 tetA 유전자(Waters, S.H., et al., Nucleic Acid Research (1983) 11:6089-6105) 및 담배의 아세토락테이트 합성효소의 변형된 형태(surB, Lee, K., et al., EMBO J (1988) 7:1241-1248)를 둘러싼 T-DNA 경계단편(van den Elzen, P., et al., Plant Mol Biol (1985) 5:149-154), 클로닝 자리 및 lacZalpha 유전자 단편. 얻어진 이성분 벡터 pBH1001은 키메릭 e35S-Sfp-nos3'유전자를 함유하고 추가의 DNA단편 삽입을 위한 단일 BamHI자리를 보유하고 있다.

DEBS1 + TE(DEBS 티오에스터라제(Kao, C.M., et al., (1995)상기문헌)의 코딩서열과 융합된 eryAI코딩서열)의 전체 코딩서열을 포함하는 11.2kbp NdeI/AvrII단편을 pKOSo18-97로부터 분리하였다. 이 단편을 pUC 레플리콘, 암피실린 내성 유전자, e35S 프로모터 및 NdeI자리에서 종료되는 Cab22L 리더 및 XbaI자리에서 시작되는 오토핀 합성효소 3'단편(DeGrever H., et al, J Mol Appl Genet (1983) 1:499-511)을 포함하는 4.2kbp NdeI/XbaI단편과 접합하였다. 얻어진 플라스미드 pBH1006은 키메릭 e35S-DEBS1+TE-ocs3'키메릭 유전자를 포함한다.

키메릭 e35S-DEBS1+TE-ocs3' 유전자를 포함하는 12.6kbp BamHI/BglII단편을 pBH1006으로부터 분리하였다. 이 단편을 T-DNA경계부위에 이미 포함된 pBH1006의 BamHI자리에 삽입하였다. 얻어진 이성분 벡터 pBH 1008은 e35S-Sfp-nos3'과 e35S-DEBS1+TE-ocs3'키메릭 유전자를 모두 포함한다.

pUC레플리콘과 BglII자리에서 종료되는 암피실린내성 유전자 및 NdeI자리에서 시작되는 ocs3'말단에 연결된 DEBS1+TE 코딩유전자를 포함하는 14.2kbp를 pBH1006으로부터 분리하였다. 이 단편을 pER 5526에서 분리된 e35S-Cab22L 리더-엽록체 운송 펩티드(ctp) 서열을 포함하는 1kbp SphI(블런트말단)/BglII단편에 연결하였다. 얻어진 플라스미드 pBH1009는 키메릭 e35S-ctp-DEBS1+TE-ocs3'유전자를 포함한다.

e35S-ctp-DEBS1+TE-ocs3'유전자를 포함하는 12.9kbp BamHI/BglII단편을 pBH1009로부터 분리하였다. 이 단편을 pAR4741의 BamHI자리에 삽입하였다. 얻어진 이성분 벡터 pBH1011은 키메릭 e35S-ctp-DEBS1+TE-ocs3'유전자를 포함하고 추가의 단편삽입을 위한 BamHI자리를 보유한다.

pUC레플리콘 및 암피실린 내성 유전자 및 NcoI자리에서 시작하는 nos3'에 연결된 Sfp코딩서열을 포함하는 3.9kbp NcoI(블런트말단)/BglII단편을 pBH1000에서 분리하였다. 이 단편을 pER5526에서부터 분리된 e35S-Cab22L 리더-ctp서열을 포함하는 1kbp SphI(블런트 말단)/BglII단편에 연결하였다. 얻어진 플라스미드 pBH1010은 키메릭 e35S-ctp-Sfp-nos3'유전자를 포함한다.

키메릭 e35S-ctp-Sfp-nos3'유전자를 포함하는 2.0kbp BamHI/BalII단편을 pVH1010에서 분리하였다. 이 단편을 pBH1011의 BamHI자리에 삽입하였다. 얻어진 이성분 벡터 pBH1012은 키메릭 e35S-ctp-DEBS1+TE-ocs3'을 포함하고 추가의 단편삽입을 위한 BamHI자리를 보유한다.

페닐실륨 파툴럼의 MSAS코딩유전자를 포함하는 5.5kbp NdeI/XbaI단편을 pKOS12-71d로부터 분리하였다. 이 단편을 pUC레플리콘, 암피실린 내성 유전자, e35S-NdeI에서 종료하는 cab22L 리더 및 XbaI에서 시작하는 ocs3'말단을 포함하는 NdeI/XbaI단편에 연결하였다. 얻어진 플라스미드 pSG5540은 키메릭 e35S-MSAS-ocs3'을 포함한다.

페닐실륨 파툴럼의 MSAS단백질과 바실러스 서브틸리스의 Sfp단백질의 융합단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 6kbp NdeI/XbaI 단편을 pKOS14-69로부터 분리하였다. 이 단편을 pUC레플리콘 및 암피실린 내성 유전자, e35S-NdeI자리에서 종료하는 Cab22L 및 XbaI자리에서 시작하는 ocs3'말단을 포함하는 NdeI/XbaI단편에 연결하였다. 얻어진 플라스미드 pSG5541는 키메릭 e35S-MSASSfp-ocs3'유전자를 포함한다.

e35S-MSASSfp-ocs3'유전자를 이성분 벡터 pWTT2144의 HindIII 및 KpnI자리사이에 삽입하였다. 두 별개의 단편을 pSG5540으로부터 분리하고; 하나는 5.1kbp HindIII/AatII 단편이고, 다른 하나는 1.95kbp AatII/KpnI단편이었다. 이들 단편을 HindII/KpnI분해된 pWTT2144으로 연결되었다. 얻어진 이성분 벡터 pSG5574는 키메릭 e35S-MSAS-ocs3'유전자를 포함한다.

e35S-MSASSfp-ocs3'유전자를 이성분 벡터 pWTT2144의 HindII 및 KpnI자리사이에 삽입하였다. 두 별개의 단편을 pSG5541로부터 분리하였다; 하나는 5.1kbp HindIII/AatII단편이고, 다른 하나는 2.5kbp AatII/KpnI단편이었다. 이들 단편을 HindIII/KpnI절단 pWTT2144와 연결하였다. 얻어진 이성분 벡터 pSG5575는 키메릭 e35S-MSASSfp-ocs3' 유전자를 포함한다.

MSAS코딩 서열을 포함하는 5.5kbp NdeI(블런트 말단)/XbaI단편을 pSG5540으로부터 분리하였다. 이 단편을 pUC레플리콘, 암피실린 내성 유전자, e35S-NdeI에서 종료하는 cab22L 리더-SphI에서 종료하는 ctp서열 및 XbaI에서 시작하는 ocs3'말단을 포함하는 NdeI/XbaI단편에 연결하였다. 얻어진 플라스미드 pSG5581는 키메릭 e35S-ctp-MSAS-ocs3'을 포함한다.

MSASSfp코딩서열을 포함하는 6.0kbp NdeI(블런트말단)/XbaI단편을 pSG5541로부터 분리하였다. 이 단편을 pUC레플리콘, 암피실린 내성 유전자, e35S-NdeI에서 종료하는 cab22L 리더 및 XbaI에서 시작하는 ocs3'말단을 포함하는 NdeI/XbaI단편에 연결하였다. 얻어진 플라스미드 pSG5582은 키메릭 e35S-ctp-MSASSfp-ocs3'을 포함한다.

상기 e35S-ctp-MSAS-ocs3'유전자를 이성분 벡터 pWTT2244의 HindIII 및 KpnI자리 사이에 삽입하였다. 두 별개의 단편을 pSG5581로부터 분리하였다; 하나는 5.1kbp HindIII/AatII단편이고, 다른 하나는 1.90kbp AatII/KpnI단편이었다. 이들 단편을 HindIII/KpnI절단 pWTT2144와 연결하였다. 얻어진 이성분 벡터 pSG5583는 키메릭 e35S-ctp-MSAS-ocs3' 유전자를 포함한다.

상기 e35S-ctp-MSASSfp-ocs3'유전자를 이성분 벡터 pWTT2214의 HindIII 및 KpnI자리 사이에 삽입하였다. 두 별개의 단편을 pSG5582로 부터 분리하였다; 하나는 5.1kbp HindIII/AatII단편이고, 다른 하나는 2.5kbp AatII/KpnI단편이었다. 이들 단편을 HindIII/KpnI절단 pWTT2144와 연결하였다. 얻어진 이성분 벡터 pSG5584는 키메릭 e35S-ctp-MSASSfp-ocs3' 유전자를 포함한다.

실시예 6: 담배 현탁배양의 형질전환

배양의 확립

호르몬이 없는 Murashige 및 Skoog(MS) 배지상에서 경정배양으로 멸균 담배식물(변이 Petitie Havana)를 배양하였다. 이들 식물에서 잎디스크를 취하고 2mg/l 인돌아세트산(IAA) 및 0.5mg/l벤질아미노푸린(BA)가 보충된 아가-고형화된 MS배지(1%아가)에서 배양하였다. 잎디스크가 있는 페트리 디쉬를 28℃에서 3주간 16시간 광기간으로 배양하였으며, 그 시간동안 미분환세포(유엽)는 절단가장자리에서 형성되었다. 상기 유엽을 디스크에서 제거하여 유일한 식물호르몬으로서 0.2mg/l 2,4-D를 포함하는 액상 MS배지로 옮겼다.

이들 세포현탁 배양물을 130rpm으로 흔들면서 상기 잎디스크와 동일한 조건하에서 배양하였다. 이 조건하에서, 배양물은 약 2일의 배증시간으로 단일세포 및 작은 집단으로 자랐으며, 50ml의 액체배지에 대해 분산된 세포부피(SCV) 약 2ml로 첨가함으로써 이동시켰다. 배양물은 또한 2mg/l IAA 및 0.5mg/lBA와 함께 배양되었다.그러나, 이조건하에서는 현탁액은 매우 천천히1

현탁배양물의 형질전환

현탁배양법은 화학적 전구체를 주입하고 식물세포에서 효소가 어떻게 전구체를 전환하는 가를 이해하는데 이상적인 시스템이다.

예컨대, DEBS1-티오에스터라제를 코딩하는 유전자등, PKS의 발현시스템 유전자를 포함하고, 바람직하게는 홀로-ACP합성효소 및 제초제 클로로설푸론에 대한 내성을 제공하는 ALS유전자를 함께 포함하는 이원자 플라스미드를 운반하는 아그로박테리움 투메파시엔스 균주를 함께 배양함으로써 상기 현탁액을 형질전환시켰다.

액상배지에서 아그로박테리움 세포와 현탁액 세포를 혼합함으로써 형질전환이 이루어졌다. 이전과 동일하나 24℃ 암조건하에서 아그로박테리움/담배 세포 혼합물을 계속해서 흔들거나, 여과지상에 상기 혼합물을 모으고 담배 잎디스크에 사용된 것과 동일한 조성물의 고체배지에 공동배양한 담배세포를 이동시킴으로써 공동배양과 선별을 할 수 있다. 둘가지 경우에, 100μM의 아세토시링론을 공동배양 배지에 첨가하였다.

공동배양에 사용된 배지와 동일한 조성물에 50μg/l의 클로로설푸론과 500mg/l의 카르베니실린을 첨가함으로써, 아그로박테리움 의 배양물에 행한 역선택(counterselection) 및 형질전환된 세포의 선택은 행한다. 액상 형질전환의 경우에, 제초제 및 항생제 함유 배지에 재현탁하기전에 대부분의 박테리아를 신선한 배지로 세척함으로써 제거한다. 고체 형질전환의 경우에, 형질전환된 유엽을 현탁배양을 재확립하기 위한 선택 및 역선택이 있거나 없는 액체배지로 이동시킨다.

목적 유전자를 갖는 형질전환된 세포현탁액(제초제 내성)은 4-5주간의 선택및 역선택후에 분석 및/또는 주입연구를 위한 준비가 되었다. 형질전환된 현탁액은 T-DNA가 다수의 다른 임의 좌위로 병합되는 혼합된 형질전환 사건으로 구성된다. 이들 형질전환된 현탁액를 사용하여 폴리케티드를 생산할 수 있다.

상기 방법을 사용하여, 발현 시스템, 실시예 5의 pBH1008를 포함하도록 변형된 식물세포를 얻었다. pBH1008은 35S 프로모터의 조절하에 있는 DEBS1+TE에 대한 발현시스템과 Sfp의 발현시스템을 각기 별개의 발현시스템을 포함한다.

유사하게, 동일한 방법을 사용하나 pBH1008대신에 pBH1012식물세포를 형질전환시켜 DEBS1 +TE 및 엽록체 표적화를 위한 Sfp에 대한 발현시스템을 포함하게 한다.

실시예 7: 폴리케티드 합성효소 유전자의 담배로 형질전환방법

16시간빛조사, 27℃에서 TCMA(1/2 MS염, B5 비타민, 100mg/l m-이노시톨, 600mg/l MES, 20g/l의 수크로스, pH5.6 및 7g/l TC아가로 고형화)배지에서 시험관내에서 배양한 담배식물이 잎외식편의 근원이다. 잎에서 주맥을 제거한 후에, 이들은 2x2mm로 절단하여 외식편을 제조하였다. 5 x 10⁷세포로 희석한 LBA4404 세포의 하룻밤 배양물과 적합한 이성분벡터를 포함하는 minAsuc배지상에 외식편을 표류시켰다. 수분후에, 0.5mg/l BAP, 2mg/l IAA 100μM 아세토시링곤이 보충된 TCMA기초 배지를 포함하는 플레이트에 외식편을 이동시켰다. 이 배지상에서 여과지 디스크와함께 24℃ 암조건하에서 2일간 공동배양하였다. 0.5mg/l BAP, 2mg/l IAA, 25μM 아클로로설푸론(25mg/l의 젠네티신)이 보충된 TCMA기초 배지를 포함하는 플레이트에 외식편을 이동하였다. 시험관애 슈와 동일한 조건하에서 상기 외식편을 배양하고 3주후에 대부분의 외식편에서 트랜스제닉 슈트가 형성되었다.

상기 방법을 사용하여, pSG5574, pSG5575, 및 실시예 5의 pBH1008의 발현시스템을 포함하도록 변형된 식물을 얻었다. pSG5574는 35S프로모터의 조절하에서 MSAS의 발현시스템을 포함한다. pSG5575는 35S 프로모터의 조절하에서 MSAS 및 Sfp의 사이에 융합단백질에 대한 발현시스템을 포함한다.

동일한 방법을 사용하나 상기 이름의 플라스미드, pSG5584는 ctp 서열과 함께 35S 프로모터의 조절하에 있는 MSAS-Sfp 융합체의 발현시스템을 포함하며, 융합 단백질에 의해서 엽록체를 지시하는 식물이 얻어진다. 유사하게도, pSG5578(Sfp의 발현시스템 포함) 및 pSG5583(MSASS의 발현시스템 포함)의 공동형질전환은 엽록체에서 이들 단백질을 포함하는 식물을 제공하여, 폴리케티드 생성을 가능하게 한다.

Claims

적어도 최소한의 방향족 폴리케티드 합성효소(PKS)를 생산하는데 유효한 하나이상의 발현시스템을 포함하도록 변형된 식물세포, 식물의 부분 또는 식물로서, 상기 최소 방향족 PKS는 케토합성효소(ketosynthase)/아실 트랜스퍼라제(acyltransferase)(KS/AT) 촉매영역, 사슬길이인자(chain-length factor, CLF) 촉매영역 및 아실운반단백질(acyl carrier protein, ACP)활성을 포함하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 1 항에 있어서, 홀로-ACP합성효소(holo-acyl carrier protein synthase)를 생산는데 유효한 하나이상의 발현시스템을 포함하도록 변형된 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 2 항에 있어서, PKS에 대한 상기 발현시스템 및 홀로-ACP합성효소에 대한 발현시스템이 별개의 벡터에 있는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 2 항에 있어서, PKS에 대한 상기 발현시스템 및 홀로-ACP합성효소에 대한 발현시스템이 동일한 벡터에 있는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 2 항에 있어서, PKS에 대한 상기 발현시스템 및 홀로-ACP합성효소에 대한 발현시스템이 상기 PKS 및 홀로-ACP합성효소를 포함하는 융합 단백질에 대한 발현시스템으로 이루어지는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 1 항에 있어서, 상기 KS/AT 코딩 뉴클레오타이드 서열, CLF 코딩서열 및 ACP-코딩 뉴클레오타이드 서열이 동일한 방향족 폴리케티드 합성효소(PKS)에서 유래된 것인, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 1 항에 있어서, 하나이상의 상기 KS/AT 코딩 뉴클레오타이드 서열, CLF 코딩서열 및 ACP-코딩 뉴클레오타이드 서열이 상이한 방향족 폴리케티드 합성효소(PKS)에서 유래된 것인, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 1 항에 있어서, 추가로 폴리케티드에 대한 세포-기재된 탐지 시스템에 대한 발현시스템을 포함하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 2 항에 있어서, 추가로 폴리케티드에 대한 세포-기초한 탐지 시스템에 대한 발현시스템을 포함하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
적어도 최소한의 모듈 폴리케티드 합성효소(PKS)이상을 생산하는데 유효한 하나이상의 발현시스템을 포함하도록 변형된 식물세포, 식물의 부분 또는 식물로서, 상기 최소 PKS는 KS촉매영역, AT촉매영역, 및 ACP활성을 포함하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 10 항에 있어서, 추가로 홀로-ACP합성효소를 생산하는데 유효한 하나이상의 발현시스템을 포함하도록 변형된, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 11 항에 있어서, PKS에 대한 발현시스템 및 홀로-ACP 합성효소에 대한 발현시스템이 별개의 벡터에 존재하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 11 항에 있어서, PKS에 대한 발현시스템 및 홀로-ACP 합성효소에 대한 발현시스템이 동일한 벡터에 존재하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 11 항에 있어서, PKS에 대한 상기 발현시스템 및 홀로-ACP합성효소에 대한 발현시스템이 상기 PKS 및 홀로-ACP합성효소를 포함하는 융합 단백질에 대한 발현시스템으로 이루어지는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 10 항에 있어서, 상기 PKS의 모듈들이 상이한 폴리케티드 합성효소에서 유래된 것인, 식물세포,식물의 부분 또는 식물.
제 10 항에 있어서, 하나이상의 모듈을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 KR활성을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하며;

상기 하나이상의 모듈을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 KR 및 DH활성을 코딩하며;

상기 하나이상의 모듈을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 KR, DH, 및 ER 활성을 코딩하며; 및/또는

상기 하나이상의 모듈을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 티오에스터라제(TE)활성을 코딩하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 10 항에 있어서, 추가로 폴리케티드에 대한 세포-기초한 탐지 시스템에 대한 발현시스템을 포함하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 11 항에 있어서, 추가로 폴리케티드에 대한 세포-매개된 탐지 시스템에 대한 발현시스템을 포함하는, 식물세포,식물의 부분 또는 식물.
적어도 최소한의 곰팡이 폴리케티드 합성효소(PKS)을 생산하는데 유효한 하나이상의 발현시스템을 포함하도록 변형된 식물세포, 식물의 부분 또는 식물로서, 상기 최소 PKS는 케토합성효소/아실 트랜스퍼라제(KS/AT) 촉매영역, 및 아실운반담백질(ACP)활성을 포함하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 19 항에 있어서, 추가로 홀로-ACP 합성효소를 생산하는데 효과적인 하나이상의 발현시스템을 포함하도록 변형된, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 20항에 있어서, PKS에 대한 상기 발현시스템 및 홀로-ACP합성효소에 대한 발현시스템이 별개의 벡터에 있는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 20 항에 있어서, PKS에 대한 상기 발현시스템 및 홀로-ACP합성효소에 대한 발현시스템이 동일한 벡터에 있는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 20 항에 있어서, PKS에 대한 상기 발현시스템 및 홀로-ACP합성효소에 대한 발현시스템이 상기 PKS 및 홀로-ACP합성효소를 포함하는 융합 단백질에 대한 발현시스템인, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 19 항에 있어서, 상기 KS/AT 코딩 뉴클레오타이드 서열, 및 ACP-코딩 뉴클레오타이드 서열이 동일한 곰팡이 폴리케티드 합성효소(PKS)에서 유래된 것인, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 19 항에 있어서, 하나이상의 상기 KS/AT 코딩 뉴클레오타이드 서열, CLF 코딩서열 및 ACP-코딩 뉴클레오타이드 서열이 상이한 곰팡이 폴리케티드 합성효소(PKS)에서 유래된 것인, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 19 항에 있어서, 추가로 폴리케티드에 대한 세포-기초한 탐지 시스템에 대한 발현시스템을 포함하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
제 20 항에 있어서, 추가로 폴리케티드에 대한 세포-기초한 탐지 시스템에 대한 발현시스템을 포함하는, 식물세포, 식물의 부분 또는 식물.
기능적인 PKS가 생산되는 조건하에 제 2항의 식물세포, 식물의 부분 또는 식물을 배양하는 것으로 이루어지는, 기능적인 폴리케티드 합성효소를 생산하는 방법.
기능적인 PKS가 생산되는 조건하에 제 11항의 식물세포,식물의 부분 또는 식물을 배양하는 것으로 이루어지는, 기능적인 폴리케티드 합성효소를 생산하는 방법.
기능적인 PKS가 생산되는 조건하에 제 20항의 식물세포,식물의 부분 또는 식물을 배양하는 것으로 이루어지는, 기능적인 폴리케티드 합성효소를 생산하는 방법.
기능적인 PKS가 생산되는 조건하에 제 2항의 식물세포,식물의 부분 또는 식물을 배양하는 것으로 이루어지는, 폴리케티드를 생산하는 방법.
기능적인 PKS가 생산되는 조건하에 제 11항의 식물세포,식물의 부분 또는 식물을 배양하는 것으로 이루어지는, 폴리케티드를 생산하는 방법.
기능적인 PKS가 생산되는 조건하에 제 20항의 식물세포,식물의 부분 또는 식물을 배양하는 것으로 이루어지는, 폴리케티드를 생산하는 방법.