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KR20010030888A - 조합적인 안티센스 라이브러리 - Google Patents

조합적인 안티센스 라이브러리 Download PDF

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KR20010030888A
KR20010030888A KR1020007003582A KR20007003582A KR20010030888A KR 20010030888 A KR20010030888 A KR 20010030888A KR 1020007003582 A KR1020007003582 A KR 1020007003582A KR 20007003582 A KR20007003582 A KR 20007003582A KR 20010030888 A KR20010030888 A KR 20010030888A
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KR
South Korea
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oligonucleotide
bases
binding
coupling
antisense
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR1020007003582A
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English (en)
Inventor
릴라이티모시
밥디. 브라운
일레제이. 아놀드
릴레제이. 아놀드
Original Assignee
오아시스 바이오사이언시즈 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 오아시스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 filed Critical 오아시스 바이오사이언시즈 인코포레이티드
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Abstract

제1 올리고뉴클레오티드 아날로그 및 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그로 구성되는 조합적인 라이브러리로서, 상기 아날로그들은 커플링되어 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하여, RNase를 활성화하는 안티센스 분자를 형성하거나, 폴리뉴클레오티드를 절단하는 리보자임을 형성하는 것을 특징으로 한다.

Description

조합적인 안티센스 라이브러리{COMBINATORIAL ANTISENSE LIBRARY}
안티센스 기술은, DNA 및/또는 RNA 전사 또는 번역이, 표적 뉴클레익산에 결합하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 조절될 수 있다는 것에 근거한 것이다. 왓슨-크릭 염기쌍을 알아냄으로써, 표적 뉴클레익산에 매우 높은 정합성을 갖는 안티센스 분자들을 디자인하는 것이 가능하다. 표준("천연")염기들 및 백본들을 갖는 올리고뉴클레오티드들은, RNase H를 활성화시킴으로써 유전자 발현을 효율적으로 억제할 정도로 충분한 에너지로 결합하기 위해서는, 적어도 17염기를 가지고 있어야 한다.
그러나, 비록 서열이 알려진 DNA와 RNA가 주어진 경우에도, 최적의 효과적인 안티센스 분자를 디자인하는 것은 여전히 어렵다. 이것은 뉴클레익산들이 생체 내에서는 다양한 2, 3차 구조를 형성하고, 대부분 꼬여 있거나(coiled, supercoiled), 접혀있거나 단백질에 의하여 방해받고 있기 때문이다. 표적 서열의 어떤 부분은 안티센스 분자가 결합하여 혼성화를 이루는 것이 좀 더 쉬운 반면, 어떤 부분은 본질적으로 감추어져 있거나 이용불가능하다. 전형적으로 20-50개의 올리고뉴클레오티드들이 유전자당 하나 또는 그 이상의 활성이 있는 안티센스 부위를 발견하기 위해 테스트된다.
pre-mRNA 또는 mRNA 서열들에서 안티센스 부위를 선정하기 위한 표준적인 방법은, 대규모 표적 확인 프로그램에 안티센스를 신속하고 대량으로 적용하기에 충분치 않다. 올리고뉴클레오티드들은 각 표적 유전자내의 각 표적 부위에 대해서 "맞춤 합성"되어야 한다. 근사적으로 10만의 인간 유전자들 각각을 성공적으로 표적화하려면 수백만 또는 수십억개의 전형적인 올리고뉴클레오티드 라이브러리가 필요하다. 수백만의 안티센스 올리고뉴클레오티드들의 정돈된 라이브러리는 현재 이용가능한 화학적, 물리적, 유기학적 도구를 넘어선 수준의 것이다.
본 발명은 일반적으로 유기화학 및 생물분석의 분야에 속한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 적합한 안티센스 서열들 및 올리고뉴클레오티드 아날로그들의 최적화된 라이브러리들의 결정방법들 및 조성물들에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 올리고뉴클레오티드 구조물을 도시한 것이고,
도 2는 복수의 올리고머들을 갖는 안티센스 구조물을 도식적으로 나타낸 것이고,
도 3은 앵커(anchor) 올리고뉴클레오티드, 클리버(cleaver) 올리고뉴클레오티드 및 표적 RNA으로 구성된 복합체를 도시한 것이다.
정의
여기서 '안티센스'란, 특정한 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 인식하거나 결합시킬 수 있으며, 유전자의 발현을 저해하도록 디자인된 분자이다. 안티센스 분자들은 전형적으로(그러나 필수적은 아니다), RNA 분자상의 표적 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그를 포함한다. 이러한 결합은 중합효소의 작용, RNA 프로세싱(processing)을 방해하거나, 뉴클리에이즈의 회복 및/또는 활성화를 포함하여 다양한 방식으로 번역을 방해한다.
여기서 '리보자임'이란, 폴리뉴클레오티드를 촉매적으로 절단할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그를 가리킨다.
'올리고뉴클레오티드'란, DNA, RNA 또는 DNA/RNA 혼성체로 구성된 분자를 가리킨다.
'올리고뉴클레오티드 아날로그'란, 올리고뉴클레오티드같은 구조, 예컨대 백본 및 일련의 염기를 갖고있는 분자를 말하는 것으로서, 여기에서 백본 및/또는 하나나 그 이상의 염기들은 자연발생적인 DNA및 RNA에서 발견되는 구조들과는 다른 것들일 수 있다. '비자연적' 올리고뉴클레오티드 아날로그들은, 자연적인 DNA에서 발견되지 않는 적어도 하나의 염기 또는 백본구조를 포함한다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 아날로그들에는, 제한없이, DNA, RNA, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들, 펩티드 뉴클레익산(PNAs), 메톡시에틸포스포로티오에이트, 데옥시이노신 또는 데옥시 5-니트로인돌 함유 올리고뉴클레오티드들 등이 있다.
여기서 '올리고머'란, 바인딩 도메인과 적어도 하나의 커플링 모이어티를 포함하는 본 발명의 구성성분을 말한다. 이러한 올리고머는 선택적인 굴절성 링커에 의해 커플링 모이어티들에 결합될 수 있다. 올리고머들은 일반적으로 화학식 Y-L1-R-L2-X로서 표현되며, 여기서 R은 바인딩 도메인, L1과 L2는 각각 선택적인 굴절성 링커, X는 커플링 모이어티, 그리고 Y는 선택적인 제2 커플링 모이어티이다. 올리고머들은 탐지가능한 레이블들을 더 포함할 수 있다. 개별 올리고머는 활성을 보이기에는 너무 짧으나 커플링되었을 때 활성을 나타낼 수 있다.
'라이브러리'는, 다른 안티센스 분자들을 형성하도록 모일 수 있는 성분들의 수집물을 지칭한다. 본 발명의 실행시, 라이브러리는 적어도 두 셋트들의 올리고머들을 포함하며, 제1 셋트의 올리고머들은 제2 셋트의 올리고머들과 커플링할 수 있도록, 바람직하게는 첨가와 동시에 커플링할 수 있도록 디자인된다.
여기서 '백본'은, 일반적으로 규정된 간격들로 부착된 복수개 염기들을 지지할 수 있는 선형분자를 가리킨다. 이러한 백본은 바람직하게는, 지지된 염기들과 표적 폴리뉴클레오티드 염기들간의 혼성화가 용이한 방향으로 염기를 지지할 것이다.
'비자연 염기'는, A, C, G, T, 및 U을 제외한 염기로서, 자연염기 또는 비자연 염기에 특이적으로 결합할 수 있는 모이어티들 뿐 아니라, 축퇴(degenerate) 염기들과 유니버설(universal) 염기들을 포함한다.
'유니버설 염기'는, 어떠한 염기로도 대체될 수 있는 염기를 지칭한다. 유니버설 염기는 혼성화에 기여할 필요가 없으나, 혼성화를 방해하여서는 안 된다. 유니버설 염기의 예에는 제한이 없으며, 이노신(inosine), 5-니트로인돌(5-nitroindole) 및 4-니트로벤지미다졸(4-nitrobenzimidazole)등이 있다.
'축퇴 염기'는 임의의 퓨린 또는 피리미딘과도 염기쌍을 형성할 수 있지만, 퓨린들과 피리미딘들 모두와는 염기쌍을 형성할 수 없는 모이어티들을 말한다. 축퇴 염기의 예에는 제한이 없으며, 6H, 8H-3, 4-디하이드로피리미도[4,5-c][1,2] 옥사진-7-온("P",피리미딘 모방체) 및 2-아미노-6-메톡시아미노퓨린("K", 퓨린 모방체)등이 있다.
"표적 폴리뉴클레오티드"는, 예를 들어 생체 세포에서 발견되는 바 대로의, DNA 또는 RNA를 말하며, 안티센스 분자가 결합하거나 반응시키고자 하는 대상이다.
여기서 '극성(polarity)이란, 선형분자 또는 스트랜드의 방향성을 지칭한다. 예컨대, 5'-〉3'이 한쪽의 극성이라면, 3'-〉5'가 반대극성이다. 모든 선형 분자들이 원래부터 정의된 극성을 갖고 있는 것은 아니다.
'굴절성 링커'란, 바인딩 도메인을 커플링 모이어티에 공유결합적으로 결합시켜주는 모이어티를 말한다. 적합한 굴절성 링커들은 전형적으로 1 또는 2원자들의 사슬로 된 선형분자들이며, 더욱 전형적으로는, 1내지 12 탄소원자(및 또는 다른 백본 원자)들 길이의 유기 중합체 사슬이다. 굴절성 링커들의 예는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아마이드, 폴리에스테르 등을 포함한다.
여기에서 '커플링 모이어티'는 두 분자를 합치기 위하여 다른 커플링 모이어티와 반응할 수 있는 반응성 화학그룹을 지칭한다. 본 발명에서 사용되는 커플링 모이어티들은, 어떠한 표적 분자가 없더라도 결합할 수 있어야 하고, 바람직하게는 (라이브러리가 준비되고 사용되는 조건하에서) 제1 커플링 모이어티가 오직 제2 커플링 모이어티와만 반응하고, 그 분자의 임의의 다른 부분이나 제1 커플링 모이어티들과는 반응하지 않는 것이어야 한다. 유사하게, 제2 커플링 모이어티는 제1 커플링 모이어티들과만 반응하여야 하고, 다른 제2 커플링 모이어티(또는 그 분자들의 임의의 다른 부분)와는 반응하지 않아야 한다. 예컨대, 커플링 모이어티들의 예는 상보적인 올리고뉴클레오티드들(바람직하게는 표적 폴리뉴클레오티드의 어떠한 부분과도 혼성화하지 않는 것으로 선택된 것), 상보적인 올리고뉴클레오티드 아날로그들(특별히 자연염기들과 혼성화하지 않는 염기들을 채용한 것), 및 알킬 할라이드들, 알킬 술포네이트들, 활성 에스테르들, 케톤들, 알데히드들, 아민들, 하이드라진들, 설피드릴들, 알콜들, 포스페이트들, 티오포스페이트들, 마이클 첨가 수용체들, 디에노필들, 디엔들, 디폴라필들, 니트릴들, 티오세미카바자이드들, 이미데이트들, 이소시아네이트들, 이소티오시아네이트들, 알킨들 및 알켄들과 같이 친전자성인 것, 친핵성인 것 등을 포함한다. 여기서 안티센스 구조물들은 2이상의 구성부들(예컨대, 3 또는 4개의 분자가 모여 최종 구성체를 형성함)을 포함하며, 상기 커플링 모이어티들은 제1 및 제2 커플링 모이어티들끼리만, 그리고 제3 및 제4 커플링 모이어티들끼리만 반응하는 식이 바람직하다.
여기서 쓰인 '스템(stem)'이란, 두 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그 커플링 모이어티들을 커플링함으로써 형성되는 구조를 지칭한다.
'활성'이란, 본 발명의 안티센스 분자가, 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화되었을 때 표적 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역을 저해할 수 있는 능력을 지칭한다. 바람직하게는 이러한 저해는 안티센스가 혼성화시에, 뉴클리에이즈를 회복시킴 및/또는 뉴클리에이즈의 기질로서 작용하기 때문에 일어난다. "저해"는 감지가능한 정도의 '방해(inhibition)'를 포함한다.
'하이드로카빌(hydrocarbyl)'이란, 탄소와 수소로 구성되고 1내지 약 12개의 탄소원자들을 포함하는 모이어티이다. 하이드로카빌그룹의 예에는 제한이 없으며 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 2-부틸, t-부틸, 헥실 등을 포함한다.
발명의 요약
본 발명은 안티센스 및 리보좀 서열들을 준비하고 테스팅하는 새로운 방법을 제공한다.
본 발명의 일면은, 2개의 올리고 아날로그들을 포함하는 조성물로서, 각 올리고 아날로그는, 바인딩 도메인들과 커플링 모이어티들을 가지고 있으며, 바인딩도메인들은 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있고, 커플링 모이어티들은 표적 분자가 없이도 서로 커플링(coupling)할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은, 화학식 R1-L1-X-A-Y-L2-R2의 화합물로서, 여기서 R1은 RNA에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그; R2는 RNA에 결합가능한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그; L1및 L2는 각각 독립적인 링킹 모이어티 또는 결합; X와 Y는 각각 커플링 모이어티이고; A는, 공유결합, 금속결합, 비공유결합 등으로 구성된 그룹에서 선택된 링크를 포함하는 것으로서, 상기 화합물은 표적 폴리뉴클레오티드에 결합될 때, 뉴클리에이즈를 활성화하거나 절단 작용을 촉매한다.
본 발명의 또 다른 일면은 표적 폴리뉴클레오티드를 자르는 방법으로서, 표적 RNA분자를 제공하는 단계; 상기 표적 RNA 분자를 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그 및 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그에 접촉시키는 단계로서, 상기 제 1 올리고뉴클레오티드는, 표적 폴리뉴클레오티드의 제 1 부위와 결합가능한 제1 바인딩도메인 및 제2 커플링 모이어티와 결합가능한 제1 커플링 모이어티를 포함하고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 부위에 결합가능한 제2 바인딩 도메인 및 상기 제1 커플링 모이어티와 결합가능한 제2 커플링 모이어티를 포함하고, 상기 제1 및 제2 바인딩 도메인은 상기 표적 RNA 분자에 동시적으로 결합할 수 있는 것임;및 상기 표적 RNA를 절단할 수 있는 RNase의 존재하에 상기 표적 RNA 분자, 상기 제1 및 제2 아날로그를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 일면은, 표적 RNA를 자르는 방법으로서, 표적 RNA분자를 제공하는 단계; 상기 표적 RNA 분자를 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그 및 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그에 접촉시키는 단계로서, 상기 제 1 올리고뉴클레오티드 아날로그는, 표적 폴리뉴클레오티드의 제 1 부위와 결합할 수 있는 제1 바인딩 도메인 및 제2 커플링 모이어티와 결합할 수 있는 제1 커플링 모이어티를 포함하고, 상기 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그는 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 부위에 결합가능한 제2 바인딩 도메인 및 상기 제1 커플링 모이어티와 결합가능한 제2 커플링 모이어티를 포함하되, 상기 제1 및 제2 바인딩 도메인들은 상기 표적 RNA 분자에 동시에 결합가능한 것임;및 상기 표적 RNA를 절단할 수 있는 RNase의 존재하에 상기 표적 RNA 분자, 상기 제1 및 제2 아날로그를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 일면은, 한 셋트의 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그들 및 한 셋트의 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그들을 포함하는 안티센스 라이브러리로서, 상기한 각 제1 아날로그는 제1 커플링 모이어티와 제1 바인딩 도메인을 포함하되, 상기 제1 바인딩 도메인은 제1 백본과, 표적 뉴클레익산과 염기쌍을 이룰 수 있는 복수의 제1 염기들을 포함하며; 상기한 각 제2 아날로그는 상기 제1 커플링 모이어티와 특이적으로 결합할 수 있는 제2 커플링 모이어티와 제2 바인딩 도메인을 포함하되, 상기 제2 바인딩 도메인은 제2 백본과, 표적 뉴클레익산과 염기쌍을 이룰 수 있는 복수의 제2 염기들을 포함하고; 여기서 제2 아날로그에 커플링된 제1아날로그로 구성된 안티센스 아날로그가 표적 뉴클레익산에 결합하여 뉴클리에이즈(nuclease)에 대한 기질로 작용할 수 있는 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 일면은, 화학식 2(R1-L1-X)의 화합물 복수개와 화학식 3(Y-L2-R2)의 화합물 복수개를 포함하는 안티센스 전구체 화합물들의 라이브러리로서, R1과 R2는 각각, mRNA에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그이고; L1과 L2는 각각 링킹 모이어티 또는 결합이고; X와 Y는 각각 커플링 모이어티이고; 상기 화학식 2와 3의 화합물은 표적 폴리클레오티드에 결합되었을 때, 뉴클리에이즈를 회복시키거나 활성화시키는 화합물을 형성하도록 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 화학식 4 (GG-R1-CUGAUGA-L1-X)의 화합물 복수개와 화학식 5(Y-L2-GAA-R2)의 화합물 복수개를 포함하는 리보자임 전구체 화합물들의 라이브러리로서, R1과 R2는 각각 RNA에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그이고; L1과 L2는 각각 링킹 모이어티 또는 결합이고; X와 Y는 각각 커플링 모이어티이고; 상기 화학식 4와 화학식 5의 상기 화합물들은 리보자임(ribozyme)을 형성하도록 결합될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일면은 주어진 mRNA에 대한 최적의 안티센스 부위를 결정하는 방법으로서; 복수의 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그들을 선택하는 단계로서, 상기 제1 아날로그들은, 제1 커플링 모이어티들 및 상기 mRNA에 상보적인 제1 바인딩 도메인들을 포함하며; 각 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그에 대한 단일의 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그를 선택하는 단계로서, 상기 제1 커플링 모이어티들에 결합할 수 있는 제2 커플링 모이어티 및, 상기 제1 바인딩 도메인이 상보적인 부분에 가까운 위치에서 상기 RNA와 상보적인 제2 바인딩 도메인을 포함하며; 복수의 안티센스 프로브(probe)들을 제공하기 위하여, 상기 제1 커플링 모이어티들 및 제2커플링 모이어티들을 커플링하는 단계; 절단결과물을 만들기 위하여 상기 mRNA를 RNase존재 하에 상기 안티센스 프로브들을 접촉시키는 단계;및 상기 절단 결과물에 대응하는 안티센스 프로브를 결정하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 일면은 주어진 표적 RNA에 대한 최적의 리보자임 절단 부위를 결정하는 방법으로서, 복수의 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그들을 선택하는 단계로서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그는, 제1 커플링 모이어티 및 상기 표적 RNA에 상보적인 제1 바인딩 도메인을 포함하며; 복수의 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그들을 선택하는 단계로서, 제2 아날로그는, 상기 제1 커플링 모이어티에 결합가능한 제2 커플링 모이어티 및, 상기 제1 바인딩 도메인이 상보적인 부위에 근접한 위치에서 RNA에 상보적인 제2 바인딩 도메인을 포함하며; 복수개의 리보자임들을 제공하기 위하여 상기 제1 커플링 모이어티들 및 제2 커플링 모이어티들을 커플링하는 단계; 절단 결과물을 형성하기 위하여, 상기 표적 RNA을 상기 리보자임들과 접촉시키는 단계;및 상기 절단 결과물에 대응하는 리보자임을 결정하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 목적은, 용이한 수의 선합성된(pre-synthesized) 성분들을 이용하여, 안티센스 또는 리보자임 분자를 신속하게 준비하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 원하는 바에 따라 안티센스 또는 리보자임 분자들을 형성하기에 적합한 성분들의 라이브러리를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 주어진 표적에 대하여 적당한 안티센스 또는 리보자임 서열을 결정하는 방법들을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 표적 폴리뉴클레오티드 서열을 모를 때, 안티센스 또는 리보자임의 서열을 결정하는 방법들을 제공하는 것이다.
일반적인 방법
제1 올리고뉴클레오티드 아날로그들 한 셋트와 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그들 한 셋트로 구성된, 기형성된 올리고뉴클레오티드 아날로그의 라이브러리를 제공함에 있어서, 각 아날로그들은 제1 올리고뉴클레오티드가 제2 올리고뉴클레오티드에 커플링되어 안티센스 분자를 형성하도록 하는 커플링 모이어티들을 가진다. 올리고뉴클레오티드 아날로그들은 커플링 되었을 때, 표적 뉴클레익산에 혼성화되었을 때 (ds) RNA 또는 RNA/DNA 혼성체를 인식하는 엔도뉴클리에이즈에 대한 기질로서 작용하도록 선택된다. 바인딩 도메인들은 안티센스 분자가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하여 뉴클리에이즈를 회복시키고 활성화시키는 것을 보장할 수 있을 만큼 충분히 길어야 한다. 그러나 완전한 라이브러리를 구성하는데 필요한 분자의 수는 대표되는 서열의 길이에 따라서 지수함수적으로 늘어날 것이다.
개념적으로, 안티센스 분자를 둘 또는 그 이상으로 나눔으로써, 필요한 안티센스 분자들의 복수개의 후보들을 합성하는 것 대신에, 포괄적인 안티센스 라이브러리를 미리 준비해둘 수 있다. 4 염기들을 사용할 때 모든 가능한 17mer 올리고뉴클레오티드의 완벽한 라이브러리는, 417(즉, 약 1.7×1010)개의 분자들을 요구한다. 안티센스 분자들을 적어도 두 성분으로, 예컨대 8mer들의 라이브러리 및 9mer들의 라이브러리로 제공함에 의하여, 필요로 하는 라이브러리의 크기는 약 48+49, 즉 327,650분자들까지 줄어들 수 있다. 라이브러리의 필요로 하는 복잡도(complexity)는 자연염기들 중 일부를 하나나 그 이상의 축퇴 염기나 유니버설 염기로 치환함으로써 훨씬 감소될 수 있다. 따라서, 예컨대, 9mer의 라이브러리를 5개 유니버설 염기와 4자연염기에 의해 구성할 때, 구성성분의 숫자는 44(256)개까지 떨어지고, 따라서 전체 라이브러리의 크기는 48+44, 약 66,000분자들까지 감소된다. 라이브러리 복잡도는 안티센스 분자를 다시 셋 또는 그 이상의 분절들로 나눔에 의하여도 감소될 수 있다. 예컨대, 18mer 라이브러리는 418, 즉 약 6.9×1011분자를 요구하지만, 조립되어 18mer들을 형성하는 제1, 제2, 제3의 헥사머들로 구성되 라이브러리는 겨우 46+46+46, 즉 12,288분자들만을 함유하며, 이는 현재의 합성기술로 달성되기에 충분하다. 만약, 예컨대, 가운데 헥사머 셋트가 유니버설 염기들로 대신된다면, 라이브러리 복잡도는 1/3만큼 줄어든다. 이러한 크기의 라이브러리들은, 긴 올리고머를 합성하는 방법인 전통적인 방법에 의존할 것도 없이, 신속하게 합성 및 유지될 수 있는 것이다. 따라서 본 발명의 하나의 실시예는 적어도 두 셋트 이상의 올리고머들을 포함하는 라이브러리로서, 각 셋트로부터 선택되어진 올리고머들이 필요에 따라 커플링되는 것이다.
라이브러리 크기는, AT-rich 분자들;또는 AG-rich영역들, poly-C, (GGN)n, (GGGN)n, 및 TAT 모티프들 등과 같은 인공품과 같이 결합 능력이 떨어져 안티센스 분자로써 기능하기 힘들다고 생각되는 서열을 제외함에 의하여 더욱 줄일 수 있다.
도 1은 RNA-아날로그 복합체(100)으로서 RNA(101)가 올리고뉴클레오티드 아날로그에 혼성화된 것을 도식적으로 표현한 것으로서, 올리고뉴클레오티드 아날로그는, RNA의 인접영역(101 및 111)과 혼성화하는 제1 '앵커' 도메인(102)와 제2 '클리버' 도메인(103)을 포함한다. '클리버' 도메인은 뉴클리에이즈 기질로서도 작용한다. 제1 및 제2 도메인들은 제1 및 제2 커플링모이어티들(106 및 107)에 의해 각각 연결되고, 커플링 모이어티들은 제1 및 제2 바인딩 도메인들(102 및 103)에 굴절성 링커들 (104 및 105)에 의해 연결된다.
도 2는 복수의 올리고머들을 갖는 RNA-안티센스 분자 복합체(200)을 도시한 것이다. 바인딩 도메인들(205, 206, 207)은 커플링 모이어티들(이 그림에서는 상보적인 올리고뉴클레오티드들(208, 209, 210, 211)로서, 굴절성 링커(212)에 의하여 바인딩 도메인들에 연결됨)에 의해 서로 커플링된다. 표적 부위들(202, 203, 204)은 아주 근접하거나, 근접하거나 또는 약간 떨어질 수 있다. 이러한 바인딩 도메인들은 모두 같은 길이일 필요는 없다.
적어도 한 개의 바인딩 도메인은 약 3개 내지 24개의 염기들로 구성되며, 바람직하게는 약 6개 내지 8개의 염기로 구성된다. 만약 필요하다면, 한 도메인이 표적 특이성의 대부분을 제공하게 하고, 다른 도메인은 주로 뉴클리에이즈의 기질을 제공하게 할 수 있다. 예를 들어서, 6mer의 바인딩 도메인들의 한 셋트로서, 각 바인딩 도메인은 단지 하나의 6mer 서열과만 결합가능한, 그러한 6mer의 바인딩 도메인들의 한 셋트와, 8mer의 바인딩 도메인의 한 셋트로서, 염기들 중 4개 염기는 서열-특이적이고 나머지 4개는 축퇴되거나 유니버설한 그러한 8mer의 바인딩 도메인 한 셋트를 가지도록 라이브러리가 구성될 수 있다. 제1 셋트는 46(4096) 가능서열들(원치않는 서열들을 제거하기에 전)인 반면, 제2 셋트는 단지 44(256)서열들(원치않는 서열을 제거하기 전)(4 특이염기들과 4 유니버설 염기들을 가정할 때)에 불과하다. 제1 및 제2 셋트로부터 올리고머들을 선택하여 결합함에 의하여, 단지 4,352분자들을 사용하여 410(106)의 다른 서열들을 생성할 수 있다. 대조적으로, 14mer들에 대한 완전한 라이브러리는 414(2.7×108) 분자들을 요한다.
올리고머들은 표준적인 올리고뉴클레오티드 합성방법들을 이용하여 합성될 수 있다. 예컨대, AccuTag reactor들(Irori, La Jolla, CA)을 가지고 모으고 쪼개는 방법들을 사용하는 조합적인 합성기술들을 적용할 수도 있다.
올리고뉴클레오티드들은 고체 지지체들 위에서 생성되어 저장되거나, 또는 용액상태로 절단된 후, 필요할 때까지 저장될 수 있다. 올리고뉴클레오티드들은 절단가능한 링커들에 의해 고체 지지체들에 부착되어 합성될 수 있다. 만약 필요하다면, 세포배양조건 하에서 절단될 수 있는 링커들을 사용할 수도 있다(즉, 이 링커들은 세포에 손상을 입히지 않고, 세포들의 존재하에 잘라내어질 수 있다). 적당한 링커들에는 광표지(photolabile) 링커(Glen Research), β-제거, 산화에 의해 절단 되는 링커 및 효소적 활성(예를 들어 RNases, 에스테레이즈, 프로테아제 등)에 의하여 잘라지는 링커들을 포함한다. 이것은 건조상태로 올리고머들을 보관 및 분배하였다가 필요할 때 결합하여 사용하는 것을 가능하도록 한다.
올리고머 합성은, 어떤 라이브러리 성분들에 대해서는 3'-〉5'방향으로, 다른성분들에 대해서는 5'-〉3'방향으로 행해질 수 있다. 커플링 모이어티들이 올리고뉴클레오티드들이거나 올리고뉴클레오티드 아날로그들인 경우에, 커플링 모이어티들을 마지막으로 합성하여, 합성이 실패한 결과 불완전한 스템이 만들어짐으로써 커플링할 수 없는 경우가 생기지 않도록 하는 것이 바람직하다.
바인딩 도메인들 내에 사용된 올리고머들은 자연 뉴클레익산들(DNA 및/또는 RNA)와 혼성화할 수 있는 분자가 될 수 있는 것이면 어떠한 백본이라도 사용할 수 있다. 적당한 백본들의 예에는 포스포디에스테르들 및 데옥시 포스포디에스테르들, 포스포로티오에이트들 및 데옥시 포스포로티오에이트들, 2'-O-치환 포스포디에스테르들 및 데옥시 아날로그들, 2'-O-치환 포스포로티오에이 및 데옥시 아날로그들, 모폴리노들, 펩티드 뉴클레익산(Nielsen et al., US 5,539,082), 2'-O-알킬 메틸포스포네이트들, 3'-아미데이트들, MMI, 알킬 에테르들(Cook et al., US 5,223,618) 및 Cook et al., US 5,378,825, Sanghvi et al., US 5,489,677, Cook et al., US 5,541,307 등에서 설명된 다른 것 등이 있다. RNase 활성이 요구될 경우에는, 올리고머의 적어도 한 부분이 RNase의 기질로서 작용될 수 있는 백본이 사용된다.
적당한 염기의 예로는 제한이 없으며, 다음과 같은 것들이 있다.
Nucleoside base cleaver/anchor complexity Commercial?
/ stem (pairs with_)
deoxy adenosine cleaver normal yes
deoxy guanosine cleaver normal yes
deoxy cytidine cleaver normal yes
thymidine cleaver normal yes
deoxy diaminopurine cleaver normal, (U) yes
deoxy propynyl C cleaver normal, (G) yes
deoxy propynyl U cleaver normal, (A) yes
deoxy 5-nitroindole cleaver universal yes
deoxy P cleaver generic (A＆G) yes
deoxy K cleaver generic (U＆C) yes
deoxy 3-nitropyrrole cleaver universal yes
deoxy 4-nitrobenzimidazole cleaver universal
deoxy nebularine cleaver universal yes
deoxy inosine cleaver universal yes
deoxy 2-aminopurine cleaver generic (U＆C) yes
2'-OMe adenosine anchor normal yes
2'-OMe guanosine anchor normal yes
2'-OMe cytidine anchor normal yes
2'-OMe uridine anchor normal yes
2'-OMe diamino purine anchor/stem normal, (U) yes
2'-OMe inosine anchor universal yes
2'-OMe 2-aminopurine anchor generic (U＆C) yes
2'-OMe nebularine anchor universal
2'-OMe 5-nitroindole anchor universal
2'-OMe propynyl C anchor/stem normal yes
2'-OMe propynyl U anchor/stem normal yes
2'-OMe P anchor generic (G＆A)
2'-OMe K anchor generic (U＆C)
2'-OMe 4-nitrobenzimidazole anchor universal
2'-OMe 3-nitropyrrole anchor universal
2'-F adenosine anchor normal yes
2'-F guanosine anchor normal yes
2'-F cytidine anchor normal yes
2'-F uridine anchor normal yes
2'-F diaminopurine anchor/stem normal (U)
2'-F inosine anchor universal
2'-F-2-amino purine anchor/stem generic (U＆C)
2'-F nebularine anchor universal
2'-F 5-nitroindole anchor universal
2'-F propynyl C anchor/stem normal
2'-F propynyl U anchor/stem normal
2'-F P anchor generic (G＆A)
2'-F K anchor generic (U＆C)
2'-F 4-nitrobenzimidazole anchor universal
2'-F 3-nitropyrrole anchor universal
PNA-A anchor/stem normal yes
PNA-G anchor/stem normal yes
PNA-C anchor/stem normal yes
PNA-T anchor/stem normal yes
PNA-5-nitroindole anchor universal
PNA propynyl C anchor/stem normal
PNA-propynyl U anchor/stem normal
PNA-2-aminopurine anchor generic (U＆C)
PNA-diaminopurine anchor/stem normal
PNA-nebularine anchor universal
PNA-inosine anchor universal
PNA-P anchor generic (G＆A)
PNA-K anchor generic (U＆C)
PNA-4-nitrobenzimidazole anchor universal
PNA-3-nitropyrrole anchor universal
morpholino-A anchor/stem normal yes
morpholino-G anchor/stem normal yes
morpholino-C anchor/stem normal yes
morpholino-U anchor/stem normal yes
morpholino-5-nitroindole anchor universal
morpholino-propynyl C anchor/stem normal
morpholino-propynyl U anchor/stem normal
morphoiino-2-aminopurine anchor generic (U＆C)
morpholino-diaminopurine anchor/stem normal
morpholino-nebularine anchor universal
morpholino-inosine anchor universal
morpholino-P anchor generic (G＆A)
morpholino-K anchor generic (U＆C)
morpholino-4-nitrobenzimidazole anchor universal
morpholino-3-nitropyrrole anchor universal
phosphoramidate-A anchor/stem normal yes
phosphoramidate-C anchor/stem normal yes
phosphoramidate-G anchor/stem normal yes
phosphoramidate-U anchor/stem normal yes
phosphoramidate-5-nitroindole anchor universal
phosphoramidate-propynyl C anchor/stem normal
phosphoramidate-propynyl U anchor/stem normal
phosphoramidate-2-aminopurine anchor generic (C＆U)
phosphoramidate-diaminopurine anchor/stem normal
phosphoramidate-nebularine anchor universal
phosphoramidate-inosine anchor universal
phosphoramidate-P anchor generic (G＆A)
phosphoramidate-K anchor generic (U＆C)
phosphoramidate-4- anchor universal
nitrobenzimidazole
phosphoramidate-3-nitropyrrole anchor universal
2'-O-methoxyethyl adenosine anchor normal
2'-O-methoxyethyl guanosine anchor normal
2'-O-methoxyethyl cytidine anchor normal
2'-O-methoxyethyl uridine anchor normal
2'-O-methoxyethyl diaminopurine anchor/stem normal (U)
2'-O-methoxyethyl inosine anchor universal
2'-O-methoxyethyl 2-aminopurine anchor generic (U＆C)
2'-O-methoxyethyl nebularine anchor universal
2'-O-methoxyethyl 5-nitroindole anchor universal
2'-O-methoxyethyl propynyl C anchor/stem normal
2'-O-methoxyethyl propynyl U anchor/stem normal
2'-O-methoxyethyl P anchor generic (G＆A)
2'-O-methoxyethyl K anchor generic (IJ＆C)
2'-O-methoxyethyl 4-nitro- anchor universal
benzimidazole
2'-O-methoxyethyl 3-nitropyrrole anchor universal
deoxy Rp MP-AG dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-GA dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-AC dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-CA dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-AT dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-TA dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-AA dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-GG dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-CC dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-TT dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-GC dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-CG dimer anchor/stem noffnal
deoxy Rp MP-GT dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-TG dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-CT dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-TC dimer anchor/stem normal
deoxy Rp MP-5-nitroindole dimer anchor universal
deoxy Rp MP-KP dimer anchor generic
deoxy Rp MP-PK dimer anchor generic
deoxy Rp MP-KK dimer anchor generic
deoxy Rp MP-PP dimer anchor generic
2'-OMe Rp MP-AG dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-GA dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-AC dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-CA dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-AT dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-TA dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-AA dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-GG dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-CC dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-TT dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-GC dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-CG dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-GT dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-TG dimer anchor/stem non-nal
2'-OMe Rp MP-CT dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-TC dimer anchor/stem normal
2'-OMe Rp MP-5-nitroindole dimer anchor universal
2'-OMe Rp MP-KP dimer anchor generic
2'-OMe Rp MP-PK dimer anchor generic
2'-OMe Rp MP-KK dimer anchor generic
2'-OMe Rp MP-PP dimer anchor generic
RiboPyranoysl A stem self/normal
RiboPyranoysl G stem self/norrnal
RiboPyranoysl C stem self/normal
RiboPyranoysl U stem self/normal
MMI-AG dimer anchor/stem normal
MMI-GA dimer anchor/stem normal
MMI-AC dimer anchor/stem normal
MMI-CA dimer anchor/stem normal
MMI-AT dimer anchor/stem normal
MMI-TA dimer anchor/stem normal
MMI-AA dimer anchor/stem normal
MMI-CC dimer anchor/stem normal
MMI-GG dimer anchor/stem normal
MMI-TT dimer anchor/stem normal
MMI-GC dimer anchor/stem normal
MMI-CG dimer anchor/stem normal
MMI-GT dimer anchor/stem normal
MMI-TG dimer anchor/stem normal
MMI-CT dimer anchor/stem normal
MMI-TC dimer anchor/stem normal
커플링 모이어티들은, 공유 또는 비공유 상호작용에 의해 다른 셋트들로부터의 두 올리고머들이 결합되도록 선택되어져야 한다. 바람직하게는, 커플링 모이어티들는 라이브러리 내의 한 셋트 중의 올리고머들 상에 존재하는 모이어티들끼리 서로 커플링하지 않고, 다른 셋트의 올리고머들 상의 모이어티들과 용이하게 결합하여, 궁극적으로 올리고머들이 의도된 방향으로 커플링할 수 있도록 보장되어야 한다. 한 실시예에서, 커플링 모이어티들은 상보적인 올리고뉴클레오티드들이다. 상보적인 부분들은 몇 개의 비상보적인 염기에 의해 분리되는데, 이는 선천적인 굴절성 링커를 제공한다. 상보적인 올리고뉴클레오티드들은 같은 극성 또는 방향성으로 바인딩 도메인에 부착될 수 있으며, 또는 반대의 극성 또는 방향성으로 제공될 수도 있다.
예컨대, 바인딩 도메인의 방향성이 5'-〉3'이면, 상보적인 커플링모이어티들 올리고뉴클레오티드는 3'-〉5'의 방향성을 가지고 부착될 수 있어서, 커플링 모이어티들이 의도에 어긋나게 표적 폴리뉴클레오티드와 결합하거나(또는 방해)하는 가능성을 줄인다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 올리고뉴클레오티드는 자연염기들과 혼성화하지 않는 비자연염기들을 포함한다.
커플링모이어티들들은, 예컨대, 축중합, 시클로첨가, 또는 친핵-친전자적 첨가에 의한 공유결합적 상호작용에 의해 결합될 수 있다. 발명의 한 실시예에서, 어떤 커플링 모이어티는 설퍼히드릴기이고, 이에 상보적인 커플링 모이어티는 숙신이미딜기이다. 또 다른 예에서, 어떤 커플링 모이어티가 아민 또는 히드라진 모이어티들인 경우, 이에 상보적인 커플링 모이어티는 카보닐기(알데히드, 케톤, 활성 에스테르)이다. 또 다른 예에서, 어떤 커플링 모이어티가 말레이미딜기일 경우. 이에 상보적인 커플링 모이어티는 설퍼히드릴이다. 또 다른 예에서, 어떤 커플링 모이어티는 리보오스상의 인접 OH기들에 결합가능한 아릴-디하이드록시보론이다.
또 따른 예에서, T. Ibata et al., Bull Chem Soc Japan(1992)65:2998-3007에서 기술된 바와 같이, 어떤 커플링 모이어티들가 옥사졸 유도체일 경우, 이에 상보적인 커플링 모이어티는 디케토트리아졸을 포함한다.
두 셋트 이상의 올리고머들(예컨대, 안티센스 분자가 서로 커플링 된 세 개 또는 그 이상의 올리고머들을 포함함)을 가진 라이브러리에서, 올리고머들이 의도된 순서대로 조합되도록, orthogonal한 커플링 모이어티들을 선택할 수 있다.
예컨대, 제1 및 제2 의 올리고머들 사이의 커플링 모이어티들은 설포히드릴기들과 말레이미드기들이고, 제2 및 제3 의 올리고머들 사이의 커플링 모이어티들은 디엔과 디엔노필기들일 수 있다. 적당한 커플링 모이어티들의 예는 제한이 없이, 알킬 할라이드들, 알킬 설포네이트들, 활성 에스테르들, 케톤들, 알데하이드들, 아민들, 히드라진들, 설피드릴들, 알콜들, 포스페이트들, 티오포스페이트들, Michael 첨가 수용체들, 디에노필들, 디엔들, 디폴라로필들, 니트릴들, 알킨들, 티오세미카바자이드들, 이소티오시아네이트들, 이소시아네이트들, 이미데이트들, 및 알켄들 등을 포함한다.
굴절성 링커들은, 표적 뉴클레익산의 인접 부위들에 결합가능한 두 바인딩 도메인사이에 커플링 모이어티들을 끼움으로써 야기될 수 있는 응력을 감소시키기 위해 선택적으로 이용될 수 있다. 굴절성 링커는 바람직하게는 유연하고, 친수성이고, 커플링 모이어티들 덩어리가, 혼성화, 복합체 상에서의 RNase 인식 및/또는 RNase 활성을 저해하지 않을 정도의 충분한 길이여야 한다. 필수적이지는 않으나, 각 바인딩 도메인과, 그것의 커플링 모이어티간에 굴절성 링커를 두는 것이 바람직하다. 적어도 바인딩 도메인과, RNase 기질로서 기능하는 커플링 모이어티간에는 링커를 두는 것이 바람직하고 각 올리고머에 굴절성 링커를 두는 것이 더욱 바람직하다. 링커는 바인딩 도메인의 말단 염기에 연결될 수 있고, 또는 말단으로부터 하나나 그 이상의 염기에 연결될 수 있다. 적합한 굴절성 링커들은 전형적으로 적어도 1 또는 2원자들의 사슬로 된 선형 분자이며, 더욱 전형적으로는, 1내지 12탄소원자(및/또는 다른 백본 원자)들 길이의 유기중합체 사슬이다. 굴절성 링커들은 표적 서열에 비상보적인 부수적인 염기들을 포함할 수 있다. 예컨대, 굴절성 링커들은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아미드, 폴리에스테르 등을 포함한다.
개개의 올리고머들은 생체 내 또는 생체 외에서 조합될 수 있다. 커플링 모이어티들은, 세포내 환경조건 하에서 동시에 결합할 수 있도록 선택되는 것이 바람직하다. 따라서 생채내의 약품 형성을 위하여, 분리된 상태의 올리고머들을 개별적으로 투입할 수 있다. 다른 방법으로는, 투입에 앞서 생체 외에서 올리고머들을 결합시킬 수 있다. 흡수율을 높이기 위해 리포펙틴(Lipofectin), 리포펙트아민(Lipofectamine), 리포펙테이스(Lipofectace)등의 트랜스펙션제를 이용할 수 있다.
다양한 본 발명에 의한 구조물의 활성은, 예를 들어서 아래 실시예들에서 나타난 것과 같은 표준적인 분석법에 의해 알아볼 수 있다. 일반적으로, 서열을 알고 있는 표적 폴리뉴클레오티드를 준비하고, 복합체를 형성하도록 표적 서열에 결합되도록 선택된 본 발명체인 올리고머들과 표적을 접촉시키고, 원하는 표적 뉴클리에이즈로 상기 복합체를 절단하고, 절단이 일어나면 결과물들을 분석한다.
본 발명의 라이브러리는 미리 마련될 수 있다. 만약 표적 뉴클레오티드의 서열이 제공되면, 이 서열에 상응하는 올리고머들이 라이브러리로부터 선택되어, 복수개의 안티센스제를 형성하도록 결합되고, 이 안티센스제는 표적을 발현하는 복수개의 실험세포들에 적용된다. 이 안티센스는 개별적으로 또는 혼합물들의 형태로 적용될 수 있다. 활성은 절단된 표적 폴리뉴클레오티드들을 직접 감지함으로써(예컨대, 레벨링 된 프로브와의 혼성화, PCR증폭, 겔 상에 가시화 등), 또는 호스트 셀의 표현형에 미친 영향(예컨대, 선택된 단백질 발현 또는 발현의 부족)을 감지함으로써 결정될 수 있다.
한편, 표적 서열을 알 수 없는 경우에는, 복수개의 안티센스제들을 조합하여 경험적으로 어떤 서열이 활성을 보이고 있는지를 결정하는 방법이 있다.
예컨대, 알려진 세포에 의하여 발현되는 알려지지 않은 서열의 단백질이 있다고 가정한다. 라이브러리의 각 세트에서, 올리고뉴클레오티드들의 각 조합으로 구성된 복수개의 안티센스 분자들을 만들 수 있다. 예컨대 다음과 같은 조합을 생각할 수 있다.
Oligo1a - Oligo2a Oligo1a - Oligo2b Oligo1a - Oligo2c …
Oligo1b- Oligo2a Oligo1b - Oligo2b Oligo1b - Oligo2c …
Oligo1c - Oligo2a Oligo1c - Oligo2b Oligo1c - Oligo2c …
각 조합을 조사하기에는 안티센스 분자들이 너무 많기 때문에, 시험을 위한 안티센스 분자들을 풀링(pooling)하는 것이 바람직하다. 예컨대, 만약 제1 셋트가 약 4,000개의 헥사머 서열들을 함유하고(어느 염기도 축퇴 혹은 유니버설 염기가 아니다), 제2 셋트가 약 250개의 옥타머 서열들(4개의 유니버설 염기들 및 4개의 특이 염기들)로 구성된 경우, 완전한 라이브러리는 약 106가지의 조합들을 함유할 것이다. 이러한 분자들은 예를 들어 모든 헥사머 서열들의 혼합물에 각 개별 옥타머 서열을 커플링함에 의하여 쉽게 풀링되어, 결과적으로 각 4,000조합을 가지는 풀들로 나눌 수 있다. 그런 다음, 각 풀을 확인되지 않은 단백질을 발현하는 것으로 알려진 세포들에 대하여 실험을 하여, 단백질 발현을 조절하는 풀들을 확인한다. 활성 풀들은 다시 세분되고(예컨대, '활성' 옥타머를 200개의 개별 헥사머에 커플링하여, 각 200개의 조합의 200개의 군을 만듬), 다른 수단에 의하여 활성 안티센스 분자가 밝혀질 때까지 반복시험한다.
본 발명에 의한 올리고머들과 방법들은 리보자임들 및 리보자임들의 라이브러리들을 만드는데에도 응용될 수 있다. 리보자임 활성에 필요한 최소한의 서열은 F. Benseler et al., J Am Chem Soc. (1993)115:8483-84에서 설명된 바와 같고, 이는 본 명세서에 참조된다. 해머헤드(Hammerhead) 리보좀 분자들은 기질 폴리뉴클레오티드와 혼성화되는 엔드 도메인들("I" and "III"), 촉매적 부분 및 분자들끼리 지지시킬 수 있으며 다양한 다른 구조에 의해 치환될 수 있는 스템 루프 구조("II")를 포함한다. 이러한 분자들은 상기한 바와 같은 커플링 모이어티들로 Ⅱ 도메인 스템 루프를 대신함에 의하여 본 발명의 올리고머로부터 조립될 수 있다. 따라서, 예컨대, 제1 셋트의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그로서 5'-GGNNNNNCUGAUGA-cpl(SEQ ID NO: 1) (도메인 Ⅰ, 촉매적 모이어티의 제1 부분, 및 제1 커플링 모이어티)를 갖고, 제2 셋트의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그로서 5'-cp2-GAANNNNN (SEQ ID NO:2) (제2 커플링 모이어티, 및 촉매적 모이어티의 제2 부분, 도메인 Ⅲ)를 갖는 올리고머들의 라이브러리를 만들 수 있다. 여기서 염기"N"들은 표적 기질에 혼성화되도록 선택된다. 이러한 리보자임들은, 서열이 알려진 표적 폴리뉴클레오티드의 적정한 절단부위를 결정하기 위해 미리 조합될 수 있으며, 또는 서열이 알려지지 않은 표적을 방해하기 위하여 효과적인 분자들을 결정하기 위하여 상기에서 설명한 조합방식으로 조립될 수 있다.
다음의 실시예들은 이 기술에 있어 숙련된 자를 위한 가이드로써 제시된 것이고, 본 발명을 어떠한 식으로든 제한하고자 함이 아니다. 모든 산물은 제조자의 지시에 따라 사용되며, 모든 실험들은 특별한 언급이 없는 한 표준상태 하에서 행해진다.
모든 반응물들은 건조상태( 〈30 ppm water)이다. DNA 합성반응물들(산화제, 테트라, 캡핑제, 프로필 링커 지지체, 2'-deoxy, 2'-OMe 및 spacer 9 아미다이트)은 Glen Research (Sterling, VA)에서 구입되었다. 수용상태의 아미다이트는 Perseptive Biosystems사의 Trap-paks를 이용하여 건조시킨다. 보호된 아미노산들, PyBOP, 및 클로로트리틸클로라이드 레진은 NovaBiochem으로부터 얻을 수 있다.
실시예 1
(클리버 합성-혼성화 모티프)
(A)디메톡시 트리틸기(dimethoxy trityl group;DMT) 보호 프로필 링커를 가진 고체 지지체를 Perseptive Expedite synthesizer와 호환 가능한 DNA합성기에 위치시킨다(프로필 링커의 개시농도는 1μ몰이다). DMT기는 디블럭제(디클로로메탄(DCM)내의 2.5% 디클로로아세트산)으로 제거한다. RNA합성 표준 프로토콜들이 2'-OMe β-시아노에틸 아미다이트들(건조 아세토니트릴 0.1M)에 적용되었다. 아미다이트들은 테트라졸(건조 아세토니트릴내에의 0.45M)로 활성화되었다. 커플링 시간은 2'-OMe 아미다이트에 대하여 전형적으로 15분까지였다. 클리버 올리고뉴클레오티드들의 스템 부분을 합성하기 위해, 2'-OMe 포스포나이트 매개체를 산화제(THF/피리미딘/물 68/20/2내의 0.02M 아이오딘)로 처리한다. 각 산화단계 후에 두 캡핑제 혼합물(CAP A -THF내의 acetic anhydride, 및 CAP B = THF내의 N-methylimidazole)로 처리하여 캡핑과정(5'-OH기에 아세틸그룹을 위치시키는 과정)을 실시한다. 사이클을, 원하는 염기 서열을 얻기 위하여 다양한 아미다이트를 적용하면서, 15회 정도 반복하였다. 스페이서 9(Glen Research, cat# 10- 1909-90)는 수작업으로 끼워넣었다. 스페이서 9는 확실한 커플링을 위해 두 차례 커플링된다. 수작업에 의한 커플링은, 올리고뉴클레오티드의 처음 부분을 포함하는 지지체를 함유하는 컬럼을 디블럭 용액을 담고 있는 주사기에 부착함에 의하여 수행한다. 용액은 오렌지 칼라가 없어질 때까지 흘려보낸다. 컬럼을 건조 아세토니트릴(3×10ml)로 세척한다. 100㎕의 활성제를 함유하는 주사기는 컬럼의 한 끝에 부착되고 100㎕의 아미다이트(0.1M 용액)을 함유하는 다른 주사기는 컬럼의 다른 끝에 부착된다. 주사기는 지지체의 이면 및 정면으로 활성화제 및 아미다이트의 혼합물을 교대로 주입하도록 한다. 아미다이트의 커플링 과정을 반복한다. 그런 다음, 지지체를 아세토니트릴(10㎖)로 세척하고 산화제 용액(3㎖)으로 처리하였다. 그런 다음 지지체를 아세토니트릴(10㎖)로 다시 세척하고 캡핑용액(동량의 캡 A와 캡 B가 금방 혼합된 것)을 지지체로 흘려 보냈다. 지지체는 건조 아세토니트릴(10㎖)로 다시 세척하였다. 스페이서 9의 트리틸 그룹을 디블럭 용액으로 제거하고, 지지체를 중합기 상의 칼럼에 위치시키기 전에 아세토니트릴 10ml로 세척한다. 그런 다음,데옥시포스포로티오에이트의 일부분이 생성되었다. 이것은 2'-데옥시-β-시아노에틸 포스포아미다이트를 스페이서 9 링커에 커플링시킴으로써 수행되었다. Expedite의 표준적인 커플링 사이클이 사용되었다. 2'-OMe에 대하여 위에서 기술한 이 사이클의 예외는, 커플링 시간이 전형적으로 짧고, 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 연결을 만들기 위해 요오드 산화제 대신에 Beaucage 황화제(Glen Research cat# 40-4036-10)가 사용되었다는 것이다. 트리틸 그룹은 마지막 염기에 남아 있도록 하였다. 지지체는 농축 NH4OH내에서 55℃에서 16시간 동안 처리한다. 용액을 speed vac에서 농축시키고, 나머지는 0.1M 트리에틸 암모늄 아세테이드(TEAA) 100㎕ 수용액 내로 회수되었다. 이것을 HPLC 컬럼(C-18, Kromasil, 5㎛, 직경 4.3 mm, 길이 250 mm)에 적용시키고, CH3CN 그레디언트(용매 A: 0. 1M TEAA, 용매 B: 0.1M TEAA와 50% 아세토니트릴)로 1ml/min의 유속으로 30분이상 용리시킨다. 80%의 순도를 가진 부분들을 얻어서 모으고 농축시킨다. 결과물을 물 속의 80%아세트산에서 회수하여 트리틸 그룹을 제거하고 다시 역상 컬럼에 적용시킨 후, 상기한 바와 같이 정제한다. 90%이상의 순도를 가진 부분들을 얻어서 모으고 농축한다.
(B)RNase L을 회복시키는데 유용한 올리고뉴클레오티드는, 스페이서 9 후에 사용되는 데옥시 아미다이트를 2'-OMe 포스포아미다이트로 대신하는 것을 제외하면, 상기 (A)에서와 같은 방법으로 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 올리고뉴클레오티드는, 스페이서의 3'측에 2'-OMe 디에스테르 부분을, 스페이서의 5'측에 2'-OMe 포스포로티오에이트를 갖게된다. 올리고뉴클레오티드 2'-5' 아데노신에 부착된 링커는 Torrence et al., US 5,583,032, and US 5,677,289에서 기술된 바와 같이 올리고뉴클레오티드의 5' 끝에 부착한다. 이 산물의 정제는 Terrence et al.에서 설명되었다.
(C)로다민이 표지된 클리버: 로다민표지 클리버는, 트리틸기가 마지막 염기에서 제거되고, 그 염기가 보호된 아민링커(Perkin-Elmer cat. #402872)와 결합한다는 것을 제외하면, 상기한 (A)에서와 같이 합성된다. 올리고뉴클레오티드의 보호해제는 (A)에서 기술된 바와 같다. 올리고뉴클레오티드를 10M의 NH4OAc에서 회수한 후 EtOH를 첨가하여 70% 에탄올성 수용액을 만들어 올리고뉴클레로티드를 석출한다. 석출된 올리고뉴클레오티드는 펠릿형태이고, 이를 100mM NaHCO3로 회수한다. 로다민의 이소티오시아네이트 유도체(Molecular Probes cat. # X491)를 첨가한 후, 혼합액을 4시간동안 교반한다. 혼합액을 (A)에서와 같이 정제한다.
실시예2
(앵커 합성-혼성화 모티프)
(A)스페이서 "9"앞에 첨가되는(3'-〉5' 합성) 2'-OMe 아미다이트들이 Beaucage에 의해 산화되어 포스포로티오에이트 결합이 형성된다는 점을 제외하면, 실시예 1(A)와 동일하게 올리고뉴클레오티드가 준비되었다. 2'-OMe 아미다이트는 스페이스 9 연결 후에 사용되고 아이오딘 산화제에 의해 산화되어 포스포디에스테르 결합을 형성한다, 결과물인 올리고뉴클레오티드를 실시예 1에서와 같이 정제한다.
(B)형광표지된 앵커: 형광표지된 앵커는, 트리틸 그룹이 마지막 염기에서 제거되고, 그 염기에 보호 아민링커(Perkin-Elmer cat. #402872)를 결합시킨다는 점을 제외하면, 상기 (A)와 동일한 방법으로 합성된다. 올리고뉴클레오티드의 보호해제는 (A)에서 기술된 바와 같다. 올리고뉴클레오티드를 10M의 NH4OAc로 회수한 후 EtOH를 첨가하여 70% 에탄올성 수용액을 만들어 올리고뉴클레로티드를 석출한다. 석출된 올리고뉴클레오티드는 펠릿형태이고, 이를 100mM NaHCO3로 회수한다. 형광염색된 이소티오시아네이트의 유도체(Molecular Probes cat. #F-1907)를 가하고 그 혼합액을 4시간동안 교반한다. 혼합액을 상기 (A)에서와 같이 정제한다.
실시예 3
(피라노실 RNA스템을 갖는 클리버들)
피라노실 RNA단량체를 2-OMe β-시아노에틸 아미다이트로 대체한다는 것을 제외하면, 상기 실시예 1과 같은 방법으로 클리버 올리고뉴클레오티드들을 얻는다. 합성과 보호해제의 조건들은 Pitsch et al., Heiv Chimica Acta(1993) 76:2161-2183에서 기술된 바와 같다.
실시예 4
(피라노실 RNA스템을 갖는 앵커들)
앵커 올리고뉴클레오티드들은, 2'-OMe 단량체들 및 포스포디에스테르 합성조건을 피라노실 RNA 단량체 및 스페이서 9 링커 후의 합성조건들로 대체하는 것을 제외하면, 상기 실시예 2와 같은 방법으로 앵커 올리고뉴클레오티드를 얻는다. 정제는 실시예 2와 같다.
실시예 5
(클리버 합성-혼성화 모티프)
히스티딘 6 합성: 2-클로로트리틸클로라이드 레진의 현탁액에 N-α-Fmoc-N-7-π-t-부톡시메틸-L-히스티딘(0.6당량의 Fmoc-His(Bum)-OH)을, 가용성을 제공할 정도로 충분한 양의 디메틸아세트아미드와 함께 첨가하였다. 디이소프로필아민(4당량)을 첨가하고, 혼합액을 30분간 강하게 교반시킨다. 산물을 거른 후, 레진을 3X DCM/MeOH/DIPEA(17:2:1)로 세척한다음, DCM세척 3회, DMF 세척 2회, 다시 DCM세척 2회, 최종적으로 MeOH 세척 2회를 행한다. 레진을 vacuo내에서 KOH로 건조시켜 잔여 MeOH를 제거한다. 히스티딘의 로딩은 DMF내의 20%의 피페리딘으로 Fmoc를 방출함에 의하여 분광학적으로 확인할 수 있다. 최초의 Fmoc는 Fmoc-히스티딘 레진을 5% 피페리딘 함유 DCM/DMA(1:1)로 10분간 처리한 후, 20% 피페리딘 함유 DMA로 15분간 처리하여 제거한다. 자유아민기는 Fmoc-His(Bum)-OH(2.5 당량), PyBOP(2.5당량), DIPEA(5당량) 함유 DMA로 처리한다. 커플링을 30분간 진행한 후, 레진을 필터링하고, DMA로 세척한다. Fmoc을 다시 20% 피페리딘 함유 DMA로 처리하여 제거한다. 커플링사이클을 3회정도 반복하여 레진이 결합된 His-헥사머를 만든다. 헥사머를 레진으로부터 제거하고 Bum 보호기를 95% 액상 트리프르오로아세트산으로 제거한다. 결과물을 50분의 용액 A로부터 용액 B(A: 0.1%TFA/H2O; B: CH3CN/H2O/TFA 90/10/0.1)의 그레디언트를 이용, RP-HPLC(C-18, Kromasil, 5 ㎛, 직경 4.3 mm, 길이 250 mm)로 정제한다. 90%이상의 순도를 갖는 부분을 모으고 speed vac으로 농축시킨다. 이 구조는 양이온 질량분석기[M+H] 802로 확인되었다.
Z-ACPID의 합성: Z-(아미노-1-카르복시펜틸)이미노디아세트산(Z-ACPID)를 Hochuli et al.. J Chromatog(1987)411:177-84의 공정에 따라 합성한다.
ACPID의 합성: H2O:EtOH 1:3 내의 Z-보호 NTA(2.0 g)현탁액을 투명해질 때까지 가열한다. 여기에 10% Pd/C(2.0 g) 및 20 ml의 시클로핵센을 첨가한다. 혼합액을 reflux로 2시간 가열한다. Pd/C을 걸러내고, 걸러진 것을 vacuo에서 고체폼(foam)으로 만든다. 이 구조는 음이온 질량분석기[M-H] 261로 확인되었다. 수득량은 900mg이었다.
ACPID 유도체 클리버: 디메톡시 트리틸기(dimethoxy trityl group;DMT) 보호 프로필 링커를 가진 고체 지지체를 Perseptive Expedite synthesizer와 호환 가능한 DNA합성기에 위치시킨다(프로필 링커의 개시농도는 1μ몰이다). DMT기는 디블럭제(2.5% 디클로로아세트산 함유 디클로로메탄(DCM))으로 제거한다. DNA합성 표준 프로토콜이 3'O-DMT-5'-O-β-시아노에틸 아미다이트(건조 아세토니트릴 0.1M, 물 30ppm 이하)에 적용되었다. 아미다이트들은 테트라졸(건조 아세토니트릴 0.45M, 물 30ppm이하)로 활성화시킨다. 포스포나이트 중간체를 Beaucage제로 처리하여 포스포티오에이트 링크를 형성한다. 각 산화단계후에, 두 캡핑제들(CAP A = acetic anhydride 함유 THF, 및 CAP B = N-methylimidazole 함유 THF)의 혼합물로 처리하여 캡핑과정(5'-OH기에 아세틸그룹을 부가하는 과정)을 실시한다. 사이클을 다양한 아미다이트에 적용, 12회정도 반복하여 원하는 서열을 얻는다. 마지막 3'-OH기에 보호 디설파이드를 올리고뉴클레오티드에 부여하는 티올 모디파이어(thiol modifier, C6 S-S, Glen Research 10-1936)가 결합된다. DMT를 DCA로 제거한다. 지지체를 과량의 트리스-카복시에틸 포스핀(TCEP, Pierce cat. #20490)으로 처리후, 세척하여 잔여 TCEP를 제거한다. 산물인 설피드릴을 과량의 숙신이미딜 4-(p-말리이미도페닐)부티레이트(SMPB, Pierce cat. #22315)로 처리한다. 지지체를 세척하여 SMPB잔량을 제거한다. 결과물인 NHS 에스테르를 과량의 ACPID((아미노-1-카복시펜틸)이미노디아세트산)와 반응시킨다. 산물인 금속 킬레이팅 올리고뉴클레오티드 결합체를 세척하여 잔여 ACPID를 제거한다. 지지체를 농축 암모늄 히드록사이드내에서 16시간동안 55℃에서 처리한다. 용액은 speed vac에서 농축되고, 나머지는 0.1M의 액상 트리메틸 아세데이트 100㎕로 회수된다. 이것을 HPLC컬럼(C-18, Kromasil, 5㎛, 직경 4.3 mm, 길이 250 mm)에 적용시키고, 아세토니트릴 그레디언트(용매 A: 0. 1M TEAA; 용매 B: 0.1M TEAA 및 50% 아세토니트릴)로 1ml/min꼴의 유속으로 30분이상 용리시킨다. 90%이상의 순도를 가진 부분을 얻어 모으고 농축한다.
His6 유도체 앵커: 디메톡시 트리틸기(DMT) 보호 프로필 링커를 가진 고체 지지체를, Perseptive Expedite synthesizer와 호환 가능한 DNA합성기에 위치시킨다(프로필 링커의 개시농도는 1μ몰이다). DMT기는 디블럭제(2.5% 디클로로아세트산 함유 디클로로메탄)으로 제거한다. RNA합성 표준 프로토콜들이 5-O-DMT-2'-OMe-3'-O-β-시아노에틸 아미다이트(건조 아세토니트릴 0.1M, 물 30ppm 이하)에 적용된다. 아미다이트는 테트라졸(탈수 아세토니트릴 0.45M, 물 30ppm이하)로 활성화시킨다. 커플링 시간은 2'-OMe 아미다이트에 대해서는 전형적으로 15분에 이른다. 포스포나이트 중간체를 Beaucage제로 처리하여 포스포티오에이트 링크를 형성한다. 각 산화단계 후에 두 캡핑제 혼합물(CAP A = acetic anhydride 함유 THF, 및 CAP B = n-methylimidazole 함유 THF)로 처리하여 캡핑과정(5'-OH기에 아세틸그룹을 부가하는 과정)을 실시한다. 사이클은, 다양한 염기들로 적용, 8회정도 반복하여 원하는 서열을 얻는다. 마지막 3'-OH 기에, 보호 디설파이드를 올리고뉴클레오티드에 부여하는 티올 모디파이어(C6 S-S, Glen Research 10-1936)를 커플링한다. DMT를 DCA로 제거한다. 지지체를 과량의 트리스-카르복시에틸 포스핀(TCEP, Pierce cat. #20490)으로 처리후 , 세척하여 잔여 TCEP를 제거한다. 산물인 설포히드릴을 과량의 숙신이미딜4-(p-말리이미도페닐)부티레이드(SMPB, Pierce cat. #22315)로 처리한다. 지지체를 세척하여 SMPB잔량을 제거한다. 산물인 NHS 에스테르를 과량의 히스티딘 헥사머와 반응시킨다. 산물인 올리고히스티딘 올리고뉴클레오티드 결합체를 세척하여 잔여 히스티딘을 제거한다. 지지체를 농축 암모늄 히드록사이드내에서 55℃에서 16시간동안 처리한다. 용액을 speed vac에서 농축, 나머지는 0.1M의 액상 트리메틸 아세데이트 100㎕로 회수된다. 이것을 HPLC컬럼(C-18, Kromasil, 5㎛, 직경 4.3 mm, 길이 250 mm)에 적용시키고, 아세토니트릴 그레디언트(용매 A: 0. 1M TEAA, 용매 B: 0.1M TEAA와 50% 아세토니트릴)로 1ml/min의 유속으로 30분이상 용리시킨다. 90%이상의 순도를 가진 부분을 얻어 모아서 농축한다.
His6 유도체 클리버: 올리고뉴클레오티드를 합성시, NHS 에스테르와 결합시키기 위해 ACPID 대신 히스티딘 헥사머를 사용하는 것을 제외하면, 상기 기술된 ACPID클리버와 같은 방식으로 합성한다.
ACPID 유도체 앵커: 올리고뉴클레오티드를 합성시, NHS에스테르와 결합시키기 위해 히스티딘 헥사머 대신에 ACPID분자를 사용하는 것을 제외하면, 상기의 히스티딘 6 앵커와 같은 방식으로 합성한다.
His 클리버 올리고뉴클레오티드로 ACPID 앵커 올리고뉴클레오티드 연결: ACPID 앵커 올리고뉴클레오티드를 10당량의 0.1N NiSO4용액으로 처리한다. 혼합액을 G-25겔 여과 스핀 컬럼에 통과시키고 잔여 니켈을 제거한다. His6 클리버 용액을 니켈 하전된 ACPID 앵커 올리고뉴클레오티드에 첨가한다. 폴리아크릴아미드 겔(19%)로 His6 니켈 킬레이트를 통한 앵커와 클리버의 연결이 확인된다.
His 앵켜 올리고뉴클레오티드로 ACPID 클리버 올리고뉴클레오티드 연결: ACPID클리버 올리고뉴클레오티드를 10당량의 0.1N NiSO4용액으로 처리한다. 혼합액을 G-25겔 여과 스핀 컬럼에 통과시켜 잔여 니켈을 제거한다. His6 앵커 용액을 니켈 하전된 ACPID 앵커 올리고뉴클레오티드에 첨가한다. 폴리아크릴아미드 겔(19%)로 His6 니켈 킬레이트를 통한 앵커와 클리버의 연결이 확인된다.
유니버설 염기를 함유하는 클리버들의 합성: 유니버설 염기들(5-니트로인돌, 이노신)을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방식은, 자연염기를 변조된 단량체로 치환하는 것을 제외하면 실시예 1과 동일하다.
실시예 6
(분석)
물질: 다음의 프라이머들을 이용하여, SEAP(secreted alkaline phosphatase)의 암호화 부분 dsDNA조각을 준비하기 위하여, PCR이 사용되었다.
프라이머들:
P3 (SEQ ID NO:3) 5'-cgaaattaaatcgactcactat-3'
P3.1 (SEQ ID NO:4)
3'-gctttaattatgctgagtgatatcccgaagcttagcgcttaagcgggtggtacgacg-
acgacgacgacgacgacccggac-5'
P4 (SEQ ID NO:5) 3'-tagggtcaactcctcctcttgg-5'
P5 (SEQ ID NO:6)
3'-tacgacgacgacgacgacgacgacccggactccgatgtcgagagggacccgtagta-
gggtcaactcctcctcttgg-5'
이들 프라이머들은 서열(SEQ ID NO:7) 5'-gggcttcgaatcgcgaattcgcccaccatgc-
tgctgctgctgctgctgctgggcctgaggctacagctctccctgggcatcatcccagttgaggaggagaacc를 갖고 있는 SEAP RNA 조각에 기초한 것이다.
PCR 증폭은 제조자(Life Technologies, Cat. No. 10198-018)에 의해 추천된 반응조건하에서 실시한다. 프라이머들 P3.1과 P5는 10nM, 프라이머들 P3 및 P4는 0.50μM에서 사용되었다. PCR은 94℃에서 5분, 52℃에서 30초간 30회, 72℃에서 1분간, 94℃에서 45초간, 그런 다음 72℃에서 10분간 행한다.
그런 다음, SEAP dsDNA는 RiboMaxTM라지 스케일 RNA 키트(Promega, Cat. No. P1300)를 이용하여 ssRNA로 전사된다. SEAP DNA 농도는 30μg/ml였다. 전사 반응은 DNase I을 가하고 37℃에서 15분간 배양하는것으로써 종결된다. DNA 조각들과 자유로운 뉴클레오타이드 조각을 EtOH/ NaOAc에서 석출한 후 70% 에탄올로 세척한다. RNA는 재현탁되고 RNase H 활성도 분석에 사용하기 위해 약 2㎕로 희석되었다.
분석: 테스트용 올리고뉴클레오티드들(각 20μM), SEAP RNA(2μM 용액 10㎕) 및 Tris/EDTA 버퍼(10mM 트리스-HCI, pH 7.4, 1mM EDTA, "TE", qs to 2㎕)를 500㎕ 용량의 얇은 벽 반응튜브들에 첨가하여 40℃에서 열평형상태에 이르도록 3내지 5분간 배양한다. RNase H 버퍼(10X:200mM 트리스-HCI, pH 7.4-7.5, 1000mM KCI,100mM MgCl2·6H2O, 0.5mM DTT, 25% w/v 자당), RNase H(0.4내지 0.6 U, Promega, Cat. No. M4281), 및 물(qs to 20 ㎕)이 모여 칵테일을 형성하고, 이를 40℃에서 3-5분간 배양한다. 그런 다음, 8㎕의 칵테일을 각 반응튜브에 가하고 식지 않도록 가능한 신속하게 휘젓는다. 반응은 40℃에서 30분간 MJ Research PCT-100 온도제어기에서 배양한다. 각 반응마다 20㎕ FDE 샘플버퍼((90% v/v formamide, IO% v/v 10X TBE buffer, 0.5% w/v bromophenol blue, 25 mM EDTA) (I X TBE: 89 mM 트리스 base, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0)를 가하여 반응들을 중지시키고, 90℃에서 3내지 5분간 가열하였다.
탐지: 각 샘플(8내지 10㎕)을 변성용 15% 폴리아크릴아미드 겔에서, 200v로 1시간동안 또는 염색약 선단이 겔의 바닥에 이를 때까지 전기영동시킨다. 겔은 8 cm x 8 cm x 1mm의 전기영동 카세트 내(Novex, Cat. No. NC2010)에서 전개되었다. 겔은 전개 직전에 집어넣는다. 간단하게, 중합되지 않은 변성용 겔 믹스(10ml)에서 진공하에 가스를 제거하고, 10%암모늄 퍼설페이트(35㎕, BioRad)와 TEMED(12㎕, BioRad)를 결합하여 각 카세트에 집어넣는다. 중합후에, 전류가 겔당 4 내지 5mA에서 안정될 때까지 250-300V로 전기영동한다.
겔내의 뉴클레익산 밴드들을 가시화하는 방법은 다음과 같다. 겔을 1:10,000로 희석된 CyberGoIdTM(Molecular Probes, Cat. No. S-11494) 함유 1X TBE에 5내지 10분간 담근다. 1X TBE에 다시 5-10분간 담그고, 단파 UV투사기 상에서 조사시킨다. 이 CyberGoldTM형광을, CyberGREENTM필터 및 Polaroid Type 667 3000 ASA 흑백필름을 가지는 Polaroid MP-4카메라를 사용하여 사진을 찍는다.
이중가닥 DNA 래더(20 bp and 100 bp, GenSura, San Diego)가 표준크기로서 사용되었다. 표준래더들은 겔 상에 올려지기 전까지는 가열되지 않으므로 변성되지 않은 상태이다. 이중가닥 DNA 조각들을 변성용, 비변성용 겔 모두에서 전개시킨다.
밴드 쉬프트: 표적 RNA가 부존재해도 올리고뉴클레오티드간에 높은 친화성이 있다는 것을 입증하기 위하여 앵커/클리버 쌍을 가지고 겔 상의 밴드쉬프트를 실시하였다.
다양한 앵커 및 클리버 올리고뉴클레오티드들을 1X RNase H 버퍼, 15% 글리세롤 및 6% FDE와 혼합하고, 65℃에서 30초간 가열한다. 각 올리고뉴클레오티드의 최종농도는 6.6μM이다. 실온으로 식힌 후, 샘플을 1M의 urea와 1X TBE를 함유한 비변성용 15% (19:1)아크릴 아미드 상에 직접 전개시킨다. 밴드 쉬프트 실험을 위한 비변성용겔을 준비, 전개, 가시화하는 방법은 변성용 겔 대신 비변성용 겔을 사용하는 것을 제외하고는, 변성용 겔 실험의 경우와 같다.
비변성, 제한 조건들하의 겔 쉬프트 분석에 의하여, 형광 표지된 올리고뉴클레오티드들 1015, 1065를 포함하는 상보적인 클리버, 앵커 이중가닥(1015=로다민, 1065=형광, 및 1000/1016, 1015/1010, 1015/1013, 1015/1012, 1015/1014 및 1015/1016 쌍들)은 표적 RNA없이도 상호 효과적으로 혼성화한다는 것이 입증되었다. 성분들은 표 1과 같다. 이중가닥 형성은 표준크기에 비해 겔 내의 강력한 이동성에 의해 입증된다.
클리버 및 앵커 분자들
올리고# 클리버 또는 앵커 SEQ ID NO: Sequence*
1000 cleaver 8 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaauucgc
1010 anchor 9 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaauu
1012 anchor 10 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcg
1013 anchor 11 5'-GCUGGUUGAGUACUC9gguggg
1014 anchor 12 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggug
1015 cleaver 13 5'-RGCAGCAGCAT+GAGUACUCAACCAGC
1016 anchor 14 5'-FGCUGGUUGAGUACUC+ggugggcgaa
여기서 "ACGT"는 PS DNA를, "ACGT"는 2'-OMe RNA를, "acgt"는 2'-OMe PS RNA를, "9"는 Glen Research 링커 #9를 가리킨다.
표적 RNA 부존재시의 이중가닥 형성
클리버/앵커 열변성조건에서의상대 이동도 비열변성조건에서의 상대 이동도
1015 25 25
1015/1010 25/27 44
1015/1012 25/23 39
1015/1013 25/21 37
1015/1014 25/19 35
1016 25 25
1016/1000 25/27 41
1016/1015 25/25 39
형광표지된 올리고뉴클레오티드들(1015 및 1016)단독, 및 비표지된 올리고뉴클레오티드들과 결합된 상태의 올리고뉴클레오티드를 가시화하기위한 CyberGold 염색의 전후에, 겔들을 사진 찍는다. 양 사진들은 CyberGold 형광염색에 의해 드러나는 DNA표준 래더들을 제외하면 동일하다.
녹는점 분석: 클리버와 앵커를 결합시키는 15염기 2'-O-methyl RNA 이중가닥 스템의 녹는점이 UV spectroscopy에 의해 밝혀졌다. 온도제어기가 있는 Carey 3E (Varian) 분광학계를 이용하여 MP 버퍼(150mM NaCl, 10 mM Na2HP04, 0.1mM EDTA, pH 7.4)하의 앵커/클리버 쌍 1000/1010 및 1000/1013의 흡광도를 모니터한다.
75℃에서의 260nm에서 0.1 AU의 흡광도 증가는 이중가닥 스템의 녹는점이 75℃임을 가리킨다. 이와 같이 녹는점이 높은 것은 복합체가 매우 오랫동안 살아있음을 가리킨다. 며칠후에 이 수치는 떨어진다.
이 결과들은 15염기 2'-OMe RNA 스템이 GeneLead 앵커들과 클리버들을 서로 결합시켜서, 안정하고 기능적인 안티센스분자를 제공한다는 것과, 표적 RNA의 존재 또는 부존재시 연합이 발생한다는 것을 증명한다. 75℃의 녹는점을 가지므로, 이중가닥 스템은 세포 트랜스펙션 동안, 그리고 안티센스가 표적 RNA에 대하여 특이적으로 작용하는 동안, GeneLead 라이브러리 멤버 분자들을 수용액상에서 서로 결합시킬 수 있다.
실시예 7
(활성도)
클리버와 앵커 올리고뉴클레오티드들을 길이가 작아지도록 합성한 후, SEAP에 대한 RNase H의 활성을 테스트하였다. 다음의 올리고뉴클레오티드들이 마련되었다.
Oligo# SEQ ID NO: Sequence
1000*15 5'-CAGCAGCAGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1006*16 5'-GCAGCAGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1007*17 5'-AGCAGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1008*18 5-CAGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1009*19 5'-GCAT9GAGUACUCAACCAGC
1034*20 5'-CAGCAT-GAGUACUCAACCAGC
1001**21 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaauucgc
1010**22 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaauu
1011**23 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaa
1012**24 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcg
1013**25 5'-GCUGGUUGAGUACUC9gguggg
1014**26 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggug
1035**27 5'-GCUGGUUGAGUACUC-ggugggcg
1045**28 5'-GCUGGUUGAGUACUC9ggugggcgaauucgcl
여기서, "ACGT"는 포스포로티오에에이트 디옥시리보뉴클레익산, "ACGT"는 2'-O-메틸 리보뉴클레익산, "9"는 Glen Research linker #9, "1"은 CPG상의 Glen Research 프로필 링커,*는 클리버 올리고를,**는 앵커 올리고를 가리킨다.
RNase H 활성과 클리버의 크기
클리버# 클리버바인딩길이 앵커# 앵커바인딩 길이 앵커가 없는RNA절단 앵커가 있는 RNA절단
1000 12 1001 15 +++++ +++++
1006 10 1001 15 +++ ++++
1007 8 1001 15 ++ +++
1008 6 1001 15 - +
1009 4 1001 15 - -
모든 클리버 올리고뉴클레오티드들은 1001 앵커과 결합시 절단효과가 상승하였다. 클리버 1008은 앵커와 결합시만 활성이 있다. 클리버 1009는 1001 앵커분자의 존재, 부존재시에 활성이 없다. 1000/1001 복합체는 도 3에 도시된 바와 같다.
RNase H 활성-앵커 크기
클리버 # 클리버바인딩길이 앵커 # 앵커바인딩길이 앵커가 없는RNA절단 앵커가 있는 RNA절단
1007 8 - NA ++ NA
1007 8 1010 12 NA +++
1007 8 1011 10 NA +++
1007 8 1012 8 NA +++
1007 8 1013 6 NA ++++
1007 8 1014 4 NA +++
이 결과는 길이 8의 클리버는, 수반하는 앵커의 길이와 상관없이 절단을 자극할 수 있다는 것을 보여준다. 그러나 절단 효과는 길이 6의 앵커에서 최대를 보인다.
클리버(6 염기들)과 앵커(8 염기들)은 9원자수 링커가 있는 것과 없는 것으로 준비하여 RNase 활성을 조사하였다.
Oligo# SEQ ID NO: Sequence
1019 29 5'-AGCABBBB9GAGUACUCAACCAGC
1020 30 5'-AGCAGCBB9GAGUACUCAACCAGC
1021 31 5'-BBBBGCAT9GAGUACUCAACCAGC
1022 32 5'-KKPKKPKP9GAGUACUCAACCAGC
1023 33 5'-KKPKGCAT9GAGUACUCAACCAGC
여기서 "ACGTBK"는 PS DNA를, "ACGT"는 2-OMe RNA를, "9"는 Glen Research 링커 #9를 가리킨다. 결과는 아래의 표 5와 같다.
링커들을 갖고 있는 올리고뉴클레오티드들의 RNase H 활성
클리버 # 링커(y/n) 앵커 # 링커(y/n) 앵커가 없는RNA절단 앵커가 있는 RNA절단
1008 Y 없음 NA - NA
1008 Y 1012 Y NA ++++
1008 Y 1035 N NA ++
1034 N 없음 NA - NA
1034 N 1012 Y NA +++
1034 N 1035 N NA +
이 결과들은 굴절성 링커와 결합되었을때 활성이 증가한다는 것을 보여준다, 클리버와 앵커가 모두 링커를 가질 때 최대의 활성을 볼 수 있다. 하나의 링커를 가지고 있는 복합체의 경우, 링커는 앵커부위에 있을 때 최대의 효과를 나타낸다.
클리버들과 앵커들은 변성된 염기를 갖고 있는 것으로 준비되었다.
"유니버설 염기들"("B")는 어떠한 자연 염기와도 수소결합하지 않지만 이중가닥 구조에서 유지될 수 있다, "축퇴 염기"들은 퓨린 또는 피리미딘(각각, "K", 및 "P") 어느 한쪽의 염기와만 수소결합하여 이중가닥을 형성한다. 클리버 및/또는 앵커상의 자연염기들에 대한 유니버설 및 축퇴 염기의 수를 바꾸어, 수많은 숫자의 표적 RNA 서열들과 결합할 수 있는 올리고들을 만들 수 있다.
길이 6 내지 8 클리버의 활성
앵커 # 앵커바인딩길이 클리버# 클리버바인딩길이 앵커가 없는RNA절단 앵커가 있는 RNA절단
없음 NA 1007 8 ++ NA
1010 12 1007 8 NA +++
1013 6 1007 8 NA +++++
1014 4 1007 8 NA +++
없음 NA 1008 6 - NA
1010 12 1008 6 NA +
1013 6 1008 6 NA ++
1014 4 1008 6 NA -
이 결과는, 길이 8의 염기들을 갖고 있는 클리버들이 6 염기의 클리버보다 절단에 더욱 효과적이고, 6 염기 길이의 앵커가 4 염기 또는 12 염기의 앵커보다 더욱 효과적이라는 사실을 보여준다.
비-자연염기들의 올리고의 활성
클리버 # N/B/P-K 앵커 # RNA 절단 효과 라이브러리 크기
1007 8/0/0 없음 ++ 65,536
1007 8/0/0 1013 ++++ 65,536
1019 4/4/0 없음 - 256
1019 4/4/0 1013 + 256
1020 6/2/0 없음 ++ 4096
1020 6/2/0 1013 ++++ 4096
1021 4/4/0 없음 - 256
1021 4/4/0 1013 - 256
1022 0/0/8 없음 - 256
1022 0/0/8 1013 - 256
1023 4/0/4 없음 - 1024
1023 4/0/4 1013 - 1024
1052 6*/0/6 1012 ++ 262,144
*프로피닐 피리미딘 염기들과 디아미노퓨린이 사용됨
표 7에서 모든 클리버는 8개의 염기들을, 앵커는 6개의 염기들을 갖고 있다. "N"은 자연염기들의 숫자를, "B"는 유니버설 염기들의 숫자, "P-K"는 축퇴 퓨린/피리미딘 염기를 가리킨다. '라이브러리 크기'는 크기와 조성의 면에서 가능한 모든 올리고를 구성하는 분자들의 갯수를 말한다.
이 결과는, 두 개의 유니버설 염기들을 가지고 있는 클리버 1020가, 앵커 올리고들의 존재와 상관없이, 자연염기만 갖고 있는 클리버 1007만큼 효과적으로 결합한다는 사실을 알 수 있다. 상응하는 라이브러리들의 크기가 2개의 유니버설 염기를 포함함으로써 감소되었다는 사실에 주목해야 한다.
유니버설 염기 "B"를 포함하는 클리버 올리고뉴클레오티드들로서 표 8의 서열을 갖는 것이 합성되어 RNase H 활성을 테스트하였다. 결과는 표 9에 나와 있다.
올리고들
클리버 # 서열 고유#(SEQ ID NO) 서열*
1033 34 5℃AGCAT9ggugggcgl
1025 35 5'GCAT9ggugggcgaauul
1026 36 5'AGCABBBB9ggugggcgaauul
1027 37 5'GCBB9ggugggcgaauul
*C, G, A, T = 포스포로티오에이트 DNA: c, g, u, a = 2'-O-Me 포스포로티오에이트 RNA; "9" = Glen Research Liner #9, "1"= Glen Research 프로필 링커
B를 포함하는 클리버 올리고뉴클레오티드들
클리버# 2'O-Me/RNaseH/유니버설 염기들 앵커# RNA 절단
1033 8/6/0 None ++
1025 12/4/0 None -
1026 12/8/4 None +++
1027 12/2/2 None -
1019 6/8/4 1013 +
1020 6/8/2 1013 ++++
RNase H 인식부위와 1033의 2'-OMe RNA 바인딩 부위사이에 존재하는 굴절성 링커의 존재는, 안티센스 활성을 제거하지 않는다. 이 링커는 표적 절단 부위와 표적 부위를 결합하여 단일의 활성 안티센스분자를 만드는, 다른 방식의 모델로서 작용할 수 있는 것으로 보인다. 클리버와 앵커, 두 짧은 클리버들 및 다른 라이브러리-기반 올리고뉴클레오티드 구조들의 결합방법들(예컨대, 킬레이션, 합성후 공유결합)을 대치할 수 있을 것이다.
1033의 RNase H 활성은, 1025에 대조할 때, 확실하게 RNase H 인식에 대한 길이의 의존성을 보여준다. 비록 분자의 총길이가 1025보다 길더라도, 1033보다 활성이 적다. 핵심적인 차이는, 짧은 올-포스포로티오에이트(PS)부위의 길이에 있는 것처럼 보인다. 분자 끝 부분의 4-염기 PS 부위는 너무 짧아서 효과적으로 절단되지 못한다. 따라서, 1027은 2개의 유니버설 염기들 때문이 아니라, RNase H 기질인 PS 부위가 4 염기 길이 밖에 안되기 때문에 활성이 없는 것으로 보인다.
1033(단일 선형 안티센스 분자)의 RNase H 활성을 1020/1013 쌍과 비교하면, RNase H 기질 부위의 길이에 대한 의존성을 알 수 있다. 2개의 유니버설 염기들과 구조를 서로 지탱하는 이중가닥 스템을 갖는, 1020/1013 짝은, 유니버설 염기와 이중가닥 스템구조가 없으며, SEAP표적 mRNA에 대한 풋프린트 길이가 동일한 1033보다 현저하게 활성이 높다.
1020에 포함된 두 개의 유니버설 염기들은 모든 PS RNase H 인식부위를 충분히, 전체 8 염기까지 늘려주고 있어서, 표적 RNA가 1033의 기질 부위 6염기에 혼성화된 RNA보다 더욱 효과적으로 절단된다. 이러한 결과들은, 유니버설 염기를 포함시키는 것이 안티센스 라이브러리의 컴플렉시티를 감소시킬 수 있는 매우 중요한 단계라는 것을 도식적으로 증명한다. 1033의 PS부위의 6 염기는 이러한 선형의 링커 포함 올리고뉴클레오티드에 기초한 임의의 라이브러리에 4,096 factor를 제공한다. RNase H 기질 활성도를 증진시키기 위해, 두 개의 자연염기를 PS 부위에 첨가하는 것은 42만큼, 전체적으로는 65,536 factor를 증가시킨다. 두 개의 유니버설 염기와 2'-OMe 이중가닥 스템 커플러(coupler)를 함유하는 1020/1013쌍이 선형 분자에 비하여 활성이 높다는 것은 놀라운 사실이다.
실시예8
(세포내 활성도)
인간 세포내에서의 활성을 검증하기 위하여 프로테인 키나아제 C 알파(PKCα)가 표적 유전자로 선택되었다. PKCα는 대부분의 인간 암 타입들에서 과발현되는 정상적인 인간 유전자로서, 모든 안티센스 표적 유전자들 중에서 보편화된 것중의 하나이다.
이 실시예에서 준비된 올리고뉴클레오티드는 표 10에 리스트되어 있다.
올리고뉴클레오티드들
올리고 # SEQ ID NO: 클리버/앵커 서열
1040 38 클리버 5'GTTCTCGCTGGT9GAGUACUCAACCAGCl
1041 39 앵커 5'GCUGGUUGAGUACUC9gaguuuca
1042 40 대조구클리버 5'TGTGTTACCATC9GAGUACUCAACCAGCl
1043 41 대조구앵커 5'GCUGGUUGAGUACUC9gguugcgu
1058 42 ISIS3521안티센스 5'GTTCTCGCTGGTGAGTTTCA
1059 43 ISIS4189안티센스 5'GGTTTTACCATCGGTTCTGG
1061 44 BCL2 4미스매치대조구 5'TCTACCCGCGTCCGGCAT
*C, G, A, T = 포스포로티오에이트 DNA; c, g, u, a = 2'-O-Me 포스포로티오에이트 RNA; C, G, A, T = 2'-OMe RNA; "9" = Glen Research 링커 #9, "1" = Glen Research 프로필 링커
올리고 1040(12 mer의 RNase H-기질 클리버)은 1041(8mer, 비(non)-RNase H-기질 앵커)과 혼성화하여 PKCα에 대한 활성 안티센스 구조를 만든다. 올리고들 1042와 1043은 각각 대조구 클리버와 앵커로서, 서로 혼성화하여 어떠한 알려진 유전자와도 매치되지 않는 구조를 형성하나, 대조구인 20mer의 올-포스포로티오에이드인 1059(ISIS4189)와 동일한 염기조성을 갖는다. 올리고 1058 (ISIS3551)은 통상적인 20mer의 올-포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 안티센스 메카니즘을 통하여 PKCα의 발현을 억제조절하는 것으로 잘 알려져 있다. 올리고 1061은 BCL2 유전자에 대란 4 염기 미스매치 대조구인, 통상적인 18mer의 올-포스포로티오에이트이다.
PKCα를 과다발현시키는 것으로 알려진 세포라인인, 인간의 방광암 라인(T-24, ATCC HTB-4)이 실험들에서 사용되었다. T-24는, 10%세럼(Gemini Bio-Products, #100-107), 페니실린-스트렙토마이신(50 IU/ml, 50 ㎍/ml, Mediatech #30-001-LI)을 가지는 McCoy's 5A배지(Mediatech, # 10-050-CV)에서 75cm2플라스크(Falcon, 3084)내 35℃, 5% CO2인표준적인 방법으로 배양된다. 안티센스 실험들을 위하여 웰당 75,000셀씩 12 웰 플레이트에 접종시킨 후 고착시켜 오버나잇 한 후 감염시킨다.
올리고뉴클레오티드들을, 카티오닉 지질 함유 세포내 감염제(cytofection agent, 리포펙트ACETM, GibcoBRL, #18301-010)로 T-24셀로 감염시킨다. 카티오닉 지질 함유 시토펙틴제는 T-24내에서, 형광 레벨링된 올리고뉴클레오티드의 핵이동을 효과적으로 시행할 수 있도록 한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드들 및 통상적인 올-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들을 각각 400nM 농도로 한 세럼제한 배지 Opti-MEMⅠ(Gibco-BRL,#11058-021) 1.5㎖에 희석시킨다. 올리고뉴클레오티드 함유용액은 지질과 올리고뉴클레오티드의 무게비가 5:1이 되도록 리포펙트ACE를 함유한 동일부피의 Opti-MEM I와 혼합시킨다. 올리고뉴클레오티드의 최종농도는 200nM이 된다. 올리고뉴클레오티드/지질 복합체를 실온에서 20분간 배양한 후 조직배양세포에 첨가한다.
세포들을 포스페이트 버퍼 살린((PBS, Mediatech,#21-030-LV))으로 세척하여 세럼포함 배지를 헹구어 낸 다음, 감염 혼합물(1ml)을 12개의 웰-플레이트 각각에 둔다. 모든 감염은 3회 행해진다. 이 세포들은 총 완전한 세포 RNA를 수확하기 전 22시간동안 올리고뉴클레오티드/지질 복합체가 회수되도록 한다. Mock감염은 Opti-MEM I으로만 처리된 세포들로 구성된다.
세포질 RNA의 분리: 22시간 동안의 안티센스 처리 후에, 총 RNA가 세포로부터 수확된다. 표준방법에 따라서, 트립신화제(Trypsin/ EDTA, Mediatech #25-052-LI)에 의하여 세포들이 플레이트들로부터 분리된다. 세포들의 삼중복제그룹들이 모아지고, 총 세포질 RNA가, 제조자의 프로토콜들에 따라서 RNeasy 키트 (QIAGEN, #74104)를 이용하여 분리된다. RNA를 DNase I 처리하고 표준방법들에 따라서 UV로 정량분석한다.
PKCα RNA를 탐지하기 위한 Polymerase Chain Reactions(PCR):
역전사효소/PCR(RT-PCR)을, GibcoBRL의 SuperScript One-Step RT-PCR 키트(Cat. No. 10928-026)를 이용하여 시행한다. Oxford Biomedical Research로부터의 PKCα-특이적 프라이머(#EZ-60A and EZ-60B) 및 총 100ng의 RNA 입력을 이용하여, PKCα를 탐지하기 위한 RT-PCR 반응을 독립적으로 두 번 수행하였다.
대조구로서 멀티플렉스(multiplex) RT-PCRs(MP RT-PCRs)을 동량의 RNA가 각 PKCαRT-PCR에 들어갔는지를 확인하기 위해 실시하였다. 프라이머들, 시약들, 및 프로토콜은 Maxim Biotech(#APO-MO52-G)의 것을 사용한다. 대조구 MP RT-PCRs은 BAX와 LICE유전자를 모든 샘플들에 대하여 동일하게 증폭시켰으며, 이에 의해 동량의 초기 RNA가 PKCαRT-PCRs에 가해졌다는 것을 확인할 수 있었다.
모든 RT-PCR 반응들은 다음 순서에 따라, PTC-100 thermocycler (MJResearch)에서 실시한다: 단계 1, 50℃ 에서 35 분; 단계 2, 94℃에서 2 분; 단계 3, 55℃ 에서 30 초; 단계 4, 72℃ 에서 1 분; 단계 5, 94℃에서 30 초; 단계 6, 단계 3으로 복귀, 이를 33회 반복한다; 단계 7, 72℃ 에서 IO 분; 단계 8, 끝. 모든 RT-PCR 산물들을 4% 수퍼 분석 아가로스 TBE 겔(Apex, #20-105)상에 전개하고 CyberGold(Molecular Probes,#S-11494)로 염색한다. 겔을 폴라로이드형 667필름으로 사진촬영한다. 결과는 표 11과 같다.
세포내의 RNAse H 활성
처리 제1 올리고 제2 올리고 PKCα BAX LICE
Mock처리 - - ++++ ++++ +++
클리버단독 1040 - ++++ ++++ +++
앵커단독 - 1041 ++++ ++++ +++
앵커+클리버 1040 1041 + ++++ +++
대조구 1042 1043 ++++ ++++ +++
통상적인안티센스 1058 - + ++++ +++
통상적인 대조구 1059 - ++++ ++++ +++
통상적인대조구 1061 - ++++ ++++ +++
본 발명의 올리고뉴클레오티드 구조물들은, 앵커+클리버 대 상기한 통상적인 안티센스에서 증명된 바와 같이, 통상적인 20mer 포스포티오에이트 올리고뉴클레외드들만큼의 활성을 보여준다. 클리버(1040)과 앵커(1041)중 어느 것도 단독주입시에는 활성이 없으나, 상호 조립되었을 때 활성을 보인다는 것에 주목해야 한다. 대조구 GeneLead 구성체(1042+1043)는 PKCα,BAX 또는 LICE 및 어떠한 다른 대조구 올리고뉴클레오티드에 대해서도 비-특이적인 활성을 보이지 않는다.
이 결과는 GeneLead 구조물들이 통상적인 안티센스 분자들만큼 활성을 보인다는 것을 말해준다. 나아가 GeneLead 구조물들은 미리 합성된 라이브러리의 성분들로부터 조합될 수 있는바, 이는 통상적인 안티센스 분자들로는 쉽게 달성될 수 없는 것이다.
실시예 9
(조직배양세포내 인간 Bcl2유전자에 대한 활성 )
GeneLeadTM의 인간 세포내의 활성을 알아보기 위해 B-cell Lymphoma-Associated Gene 2 (BCL2)을 선택하여 실험하였다. (BCL2는, 대부분의 인간 암세포 타입에서 과발현되는 또 다른 '보통' 인간 유전자이다. BCL2 단백질은 세포소멸을 조절하는 단백질 큰 패밀리들 중의 하나이다.BCL2의 과다발현은 세포의 화학치료, 방사선치료에 대한 저항성을 야기시키는 것으로 알려져 있다.
올리고머들: 다음과 같이 BCL2를 표적으로 하는 안티센스를 합성하였다.
1060 BCL2 18-base antisense 5'TCTCCCAGCGTGCGCCAT (SEQ ID NO:45)
1061 BCL2 4 mismatch control 5'TCTACCCGCGTCCGGCAT (SEQ ID NO:46)
1062 BCL2 GeneLeadCleaver 5'TCTCCCAGCGTG9GAGUACUCAACCAGCl (SEQ ID NO:47)
1063 BCL2 GeneLead Cleaver 5'TCTCCCAGCGBB9GAGUACUCAACCAGCl (SEQ ID NO:48)
1066 BCL2 GeneLead Anchor 5'GCUGGUUGAGUACUC9cgccatl (SEQ ID NO:49)
여기서, NNNN = 포스포로티오에이트 데옥시리보뉴클레익산(PS DNA), NNNN = 2'-O-메틸 리보뉴클레익산(2'-OMe RNA), nnnn = 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 리보뉴클레익산(2'-OMe PS RNA), NNNN = C-5 프로피닐-변조포스포로티오에이트 데옥시리보뉴클레익산(프로피닐), 9 = Glen Research linker #9, 1 = CPG상의 Glen Research 프로필 링커(Cat. No.**), F = 형광염색 표지(Cat. No. F- 1907), R = 로다민 표지(Cat. No. X-491).
1062(12mer의 RNase H-기질 클리버) 및 1063 (6-염기 C-5 프로피닐 변조 "tack"을 RNase H-기질부위의 5' 엔드 끝에 가진, 12mer의 RNaseH-기질 클리버)를 모두 1066(6mer의 비-RNase H-기질 앵커)에 혼성화시켜 BCL2에 대한 활성 GeneLead 안티센스 구성체들을 만든다.
1060(임상적으로 G3139로 널리 알려진 올리고뉴클레오티드에 기초한 것임)는 통상적인 18mer의 올-포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 1060은, 오픈 리딩 프레임의 최초 6개 코돈들을 통하여, BCL2 pre-mRNA에 혼성화된다.
조직배양: 이 실험을 위해 선택된 셀라인은 T-24(American Type Culture Collection #HTB-4)로서, BCL2를 과다발현시키는 것으로 알려진 인간의 방광암 라인이다.
T-24는, 10%세럼(Gemini Bio-Products, #100-107), 페니실린-스트렙토마이신(50 IU/ml, 50 ㎍/ml, Mediatech #30-001-LI)을 가지는 McCoy's 5A배지(Mediatech, # 10-050-CV)에서, 75cm2플라스크(Falcon, 3084)내 35℃, 5% CO2인표준적인 방법으로 배양된다.
안티센스 실험들을 위하여 웰당 75,000셀씩 12 웰 플레이트에 접종시킨 후 고착시켜 오버나잇 한 후 감염시킨다.
올리고뉴클레오타이드의 T-24 셀로의 감염: 올리고뉴클레오티드들을 카티오닉 지질 함유 세포내 감염제(LipofectACETM, GibcoBRL, cat. No. 18301-010)를 이용하여 T-24셀들로 감염시킨다. LipofectACE는 T-24내의 형광 레벨링된 GeneLead 구성체의 핵이동을 효과적으로 시행할 수 있는 것으로 보여졌다.
GeneLead 및 통상적인 올-포스포로티오에이트 올리고뉴클레오드들을 세럼제한 배지 Opti-MEMⅠ(Gibco-BRL, cat. No. 11058-021)에 400nM농도로 희석시킨다. 올리고뉴클레오티드 함유용액은, 최종적인 지질과 올리고뉴클레오티드의 무게비가 5:1이 되도록, 리포펙트ACE가 함유된 동일부피의 Opti-MEM I와 혼합시킨다.
올리고뉴클레오티드의 최종농도는 200nM이 된다. 올리고뉴클레오티드/지질 복합체들을 실온에서 20분간 배양한 후 조직배양세포에 첨가한다.
세포들을 포스페이트 버퍼 살린(PBS, Mediatech, cat. No. 21-030-LV)으로 세척하여 세럼포함 배지를 헹구어 낸 다음, 감염 혼합물(1ml)을 12개의 웰-플레이트 각각에 둔다. 모든 감염은 3중복제로 행해진다.
이 세포들은, 총 세포 RNA를 수확하기 전 24시간동안 올리고뉴클레오티드/지질 복합체들이 회수되도록 한다. Mock감염은 Opti-MEM I으로만 처리된 세포들로만 행해진다.
세포질 RNA의 분리: 22시간 동안의 안티센스 처리 후에, 총 RNA가 세포들로부터 수확된다. 표준 방법에 따라 트립신화제(Trypsin/ EDTA, Mediatech cat. No. 25-052-LI)을 이용, 세포들을 플레이트로부터 분리한다. 삼회복제된 세포들의 그룹들이 모여지고, RNeasy 프로토콜과 RNeasy 키트 (QIAGEN, #74104)의 스핀컬럼에 따라서 총 세포질 RNA가 분리된다. RNA를 DNase I 처리하고 UV로 정량분석하였다.
BCL2 RNA를 탐지하기 위한 Polvmerase Chain Reactions(PCR):
역전사효소/PCR(RT-PCR)을 GibcoBRL의 SuperScript One-Step RT-PCR 키트(Cat. No.10928-026)를 이용하여 시행한다. BCL2를 탐지하기 위한 RT-PCR반응은 BCL2-특이적 프라이머들을 이용하였으며 프라이머는 다음으로부터 얻어진다; upstream 5'ggtgccacctgtggtccacctg 및 downstream 5℃ttcacttgtggcccagatagg(양 프라이머는 모두 정상 DNA이다) 및 0.1g의 입력 총 RNA. β-액틴에 대한 대조구 RT-PCR 반응을 다음과 같은 프라이머들로 실험하였다; upstream 5'gagctgcgtgtggctcccgagg 및 downstream 5℃gcaggatggcatggggggcatacccc(양 프라이머는 모두 정상 DNA이다) 및 0.1g의 입력 총 RNA.
모든 BCL2 및 β-액틴에 대한 RT-PCR반응을 다음의 순서에 따라 PTC- 100 thermocycler (MJResearch)에서 실시한다: 단계 1, 50℃ 에서 35 분; 단계 2, 94℃에서 2 분; 단계 3, 60℃ 에서 30 초; 단계 4, 72℃ 에서 1 분; 단계 5, 94℃에서 30 초; 단계 6, 단계 3으로 복귀, 이를 35회 반복한다; 단계 7, 72℃ 에서 1O 분; 단계 8, 끝.
모든 RT-PCR 산물들을 4% 수퍼 분석 아가로스 TBE 겔(Apex,Cat. NO.20-105)상에 전개하고 CyberGold(Molecular Probes,#S-11494)로 염색하였다. 겔을 폴라로이드형 667필름으로 사진촬영하였다.
감소된 표적 유전자 발현(BCL2)은 유니버설 염기들을 가진 GeneLead 구조체들이 활성이 있으며 세포들에 대해 특이성을 갖는다는 사실을 확인시킨다.
레인 처리 클리버올리고 앵커올리고 All-PS올리고 BCL2mRNA수준 β-액틴mRNA수준
1 Mock - - - ++++ ++++
2 통상적인안티센스 - 1060 + ++++
3 통상적인대조구 - - 1061 ++++ ++++
4 클리버단독 1062 - ++++ ++++
5 GeneLead결합 1062 1066 - + ++++
6 클리버단독 1063 - - +++ ++++
7 GeneLead결합 1063 1066 - + ++++
8 앵커단독 - 1066 - ++++ ++++
결과
안티-BCL2 GeneLead 구조물들은 대조구에 비교할 때 BCL2 RNA 수준을 현저하게 떨어뜨린다. 레인 5(올리고 1062+1066) 및 7(1063+1066)을 레인 1(Mock처리) 및 3(통상적인 대조구)에 비교해보라.
어떠한 올리고뉴클레오티드들과 GeneLead 구조물들도 대조구 β-액틴 유전자에 대한 활성을 보이지 않았다.
이것은 매우 중요한 사실이다. 왜냐하면 이것은, (a) 오직 6 염기의 앵커를 가지고(1066, 레인 5 및 7) (b)클리버 서열(1063 단독 및 1063+1066, 레인 6 및 레인 7)의 자연 염기를 대신하는 두 개의 니트로인돌 유니버설 염기들,"B"를 가지는 GeneLead의 활성을 입증하는 것이고 (c)GeneLead의 활성이 일반적이이고 다른 인간 표적 유전자에 대해서도 쉽게 관찰될 수 있다는 것을 입증하는 것이기 때문이다.
유니버설 염기로서 니트로인돌을 함유하는 클리버에 결합된 6 염기 길이의 짧은 앵커(1063+1066)가, 세포들 내에서 효과적인 안티센스 활성을 가지는 GeneLead 구조물을 형성할 수 있다는 실험결과는, SEAP-표적 GeneLead 올리고뉴클레오티드들을 가지고 수행한 우리의 cell-free작업의 유효성을 명백하게 확인시킨다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 조합적인 안티센스 라이브러리를 수적으로 단순화하기 위하여, 올리고뉴클레오티드를 2 또는 그 이상의 기능적 단위들로 나누고, 유니버설 염기를 끼워넣는 원리들은, 살아있는 인간세포들 내에서 수행될 수 있다.
이러한 개념들은 진단학, 리보자임 응용, 면역-자극(CpG 올리고뉴클레오티드들)등에, 올리고뉴클레오티드의 이용을 증진시키기 위하여 용이하게 적용될 수 있다.
참고문헌들
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Sarah N. McCurdy et al. "An Improved Method for the Synthesis of N3'-P5' Phosphoramidate Oligonucleotides" Tetrahedron Lett(1997) 38(2): 207-10

Claims (65)

  1. 표적 폴리뉴클레오티드와 결합가능한 제1 바인딩 도메인(binding domain) 및 제2 커플링 모이어티(coupling moiety)와 결합가능한 제1 커플링 모이어티를 포함하는, 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그와;
    표적 폴리뉴클레오티드와 결합가능한 제2 바인딩도메인 및 상기 제1 커플링 모이어티들와 결합가능한 제2 커플링 모이어티를 포함하는, 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그를 포함하는 조성물로서, 상기 제1 및 제2 커플링 모이어티들은 표적 폴리뉴클레이티드 없이도 커플링(coupling)할 수 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바인딩 도메인들은, 각각 독립적으로 약 3내지 24의 염기들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바인딩 도메인들은, 백본(backbone) 및 복수의 염기들을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 백본은 리보뉴클레익산, 데옥시리보뉴클레익산, DNA 포스포로티오에이트(phosphorothioate), RNA포스포로티오에이트, 2'-O-하이드로카빌 리보뉴클레익산, 2'-O-하이드로카빌 DNA, 2'-O-하이드로카빌 RNA 포스포로티오에이트, 2'-0-하이드로카빌 DNA 포스포로티오에이트, 2'-F-포스포로티오에이트, 2'-F-포스포디에스테르, 2'-메톡시에틸 포스포로티오에이트, 2-메톡시에틸 포스포디에스테르, 데옥시 MMI, 2'-O-하이드로카빌 MMI, 데옥시-메틸포스포네이트, 2'-O-하이드로카빌메틸포스포네이트, 모폴리노(morpholino), 4'-티오 DNA, 4'-티오 RNA, 펩티드 뉴클레익산, 3'-아미데이트, 데옥시 3'-아미데이트, 및 2'-O-하이드로카빌 3'-아미데이트로 이루어진 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바인딩 도메인은, 각각 독립적으로 백본 및 복수의 뉴클레오티드 염기들로 구성되고, 상기 뉴클레오티드 염기들은 자연 뉴클레오티드 염기들, 비자연 뉴클레어티드 염기들, 유니버설 뉴클레오티드 염기들, 축퇴(degenerate) 뉴클레오티드 염기들의 그룹 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바인딩 도메인들 중 적어도 하나는, 뉴클리에이즈(nuclease)를 활성화하거나 회복시킬 수 있는 것임을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 뉴클리에이즈는 RNase H임을 특징으로 하는 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 뉴클리에이즈는, RNase P 및 RNase L로 구성된 그룹에서 선택된 것임으로 특징으로 하는 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그 및 상기 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그가 커플링될 때 리보자임(ribozyme)을 형성하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1 바인딩 도메인 및 상기 제1 커플링 모이어티는, 굴절성 링커에 의해 서로 모여지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제2 바인딩 도메인 및 제2 커플링 모이어티는, 굴절성 링커에 의해 서로 모여지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 바인딩 도메인 및 상기 제1 커플링 모이어티는, 굴절성 링커에 의해 서로 모여지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 굴절성 링커는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 굴절성 링커는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 굴절성 링커는, 1내지 약10개의 에틸렌 글리콜 단량체들을 가지는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 굴절성 링커는, 1내지 약10개의 에틸렌 글리콜 단량체들을 가지는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것임을 특징으로 하는 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 커플링 모이어티들은, 올리고뉴클레오티드 이중결합체, 올리고뉴클레오티드 아날로그 이중결합체, 및 단백질-리간드 쌍들로 이루어지는 그룹에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 커플링 모이어티들은, 비공유결합 상호작용에 참여하도록 선택되어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제1 및 제2 커플링 모이어티들은, 히스티딘 올리고머 및 금속 이온결합 모이어티들를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 제1 및 제2 커플링 모이어티들은, 페난쓰롤린 모이어티 및 Zn 복합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제1항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티와 결합할 수 있는 제3 바인딩 도메인(binding domain) 및 제4 커플링 모이어티(coupling moiety)와 결합가능한 제3 커플링 모이어티들을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드 아날로그를 더 포함하되, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그 또는 상기 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그가 제4 커플링모이어티를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 표적 폴리뉴클레오티와 결합가능한 제4 바인딩도메인 및 제6커플링 모이어티와 결합가능한 제5 커플링 모이어티를 포함하는 제4 올리고뉴클레오티드 아날로그를 더 포함하되, 상기 제1, 제2 또는 제3 올리고뉴클레오티드 아날로그가 제6 커플링 모이어티를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  23. 다음의 화학식1 (R1-L1-X-A-Y-L2-R2)의 화합물.
    여기서, R1은 RNA에 결합가능한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그;
    R2는 RNA에 결합가능한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그;
    L1및 L2는 각각 독립적인 링킹 모이어티 또는 결합;
    X와 Y는 각각 독립적인 커플링 모이어티;
    A는, 공유결합, 금속결합, 비공유결합으로 구성된 그룹으로부터 선택된 링크이고,
    뉴클리에이즈를 활성화하거나, 표적 폴리뉴클레오티드에 결합되었을 때, 절단작용을 촉매하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  24. 제23항에 있어서, R2는 RNase H를 생체 내에서 활성화시킬 수 있는 것임을 특징으로 하는 화합물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 화합물은 리보자임을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 제23항에 있어서, X와 Y는 한 쌍의 상보적인 올리고뉴클레오티드들 또는 상보적인 올리고뉴클레오티드 아날로그들을 포함하는 것임을 특징으로 하는 화합물.
  27. 제26항에 있어서, X와 Y는, R1및 R2와는 반대의 극성을 가지고 R1및 R2에 커플링되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  28. 제23항에 있어서, A는 금속이온을 포함하고, X와 Y는 상기 금속이온에 동시에 결합할 수 있는 리간드들을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. 제28항에 있어서, X와 Y중에 적어도 하나는 히스티딘 올리고머를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  30. 제23항에 있어서, R1및 R2의 적어도 하나는, 유니버설 염기들과 축퇴 염기들로 이루어진 그룹에서 선택된 복수의 올리고뉴클레오티드 염기들을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  31. 제30항에 있어서, R2는, 유니버설 염기들과 축퇴 염기들로 이루어진 그룹에서 선택된 약 1 내지 20 올리고뉴클레오티드 염기들을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  32. 제23항에 있어서, L2는 링킹 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  33. 제32항에 있어서, 상기 링킹 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  34. 제32항에 있어서, L1은 링킹 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 링킹 모이어티는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  36. 표적 RNA 분자를 절단하는 방법으로서,
    표적 RNA분자를 제공하는 단계;
    표적 RNA 분자를 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그에 접촉시키는 단계로서, 제 1 올리고뉴클레오티드는, 표적 폴리뉴클레오티드의 제 1 부위와 결합가능한 제1 바인딩 도메인 및 제2 커플링 모이어티와 결합가능한 제1 커플링 모이어티를 포함하고, 제2 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 부위에 결합가능한 제2 바인딩 도메인 및 상기 제1 커플링 모이어티와 결합가능한 제2 커플링 모이어티를 포함하되, 상기 제1 및 제2 바인딩 도메인들은 상기 표적 RNA분자에 동시적으로 결합할 수 있는 것임;및
    상기 표적 RNA를 절단할 수 있는 RNase 존재하에, 상기 표적 RNA 분자, 제1 및 제2 아날로그를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 RNA 분자 절단 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 제1 및 제2 바인딩 도메인들은 각각 독립적으로 3 내지 24개의 염기들을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 RNA 분자 절단 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 제1 부위와 제2 부위는 겹치지 않는 것을 특징으로 하는 표적 RNA 분자 절단 방법.
  39. 제36항에 있어서, 상기 제2 바인딩 도메인 및 상기 제2 커플링 모이어티는, 굴절성 링커에 의해 모여지는 것을 특징으로 하는 표적 RNA 분자 절단 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 제1 바인딩 도메인 및 상기 제1 커플링 모이어티는, 굴절성 링커에 의해 모여지는 것을 특징으로 하는 표적 RNA 분자 절단 방법.
  41. 제36항에 있어서, 상기 배양은 세포내 배양인 것을 특징으로 하는 표적 RNA 분자 절단 방법.
  42. 표적 폴리뉴클레오타이드를 절단하는 방법으로서,
    표적 RNA분자를 제공하는 단계;
    표적 RNA 분자를 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그에 접촉시키는 단계로서, 제1 올리고뉴클레오티드는, 표적 폴리뉴클레오티드의 제1 부위와 결합가능한 제1 바인딩 도메인 및 제2 커플링 모이어티와 결합가능한 제1 커플링 모이어티를 포함하고, 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 제2 부위에 결합가능한 제2 바인딩 도메인 및 제1 커플링 모이어티와 결합가능한 제2 커플링 모이어티를 포함하되, 상기 제1 및 제2 바인딩 도메인들은 상기 표적 RNA분자에 동시적으로 결합하고, 상기 제1 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드 부위들은 뉴클레오티드에 의해 서로 분리되고, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그들은 함께 리보자임을 형성하는 것임; 및
    상기 표적 RNA 분자, 제1 및 제2 아날로그를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드 절단 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그는 화학식 (5'-GGNNNNNCUGAUGA-X), 상기 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그는 화학식 (5'-Y-GAANNNNN)의 화합물을 포함하는 것으로서, 여기서 X와 Y는 서로 커플링할 수 있는 커플링 모이어티들이고, NNNNN은 상기 제1 및 제2 표적 폴리뉴클레오티드 부위에 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드 염기들 또는 올리고뉴클레오티드 염기 아날로그들임을 특징으로 하는 표적 폴리뉴클레오티드 절단 방법.
  44. 한 셋트의 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그들 및 한 셋트의 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그들을 포함하는 안티센스 라이브러리로서,
    제1 아날로그는 제1 커플링 모이어티들와 제1 바인딩 도메인을 포함하되, 상기 제1 바인딩 도메인은 제1 백본과 표적 뉴클레익산과 염기쌍을 이룰 수 있는 복수개의 제1 염기를 포함하며;
    제2 아날로그는, 상기 제1 커플링 모이어티와 결합할 수 있는 제2 커플링 모이어티와, 제2 바인딩 도메인을 포함하되 상기 바인딩 도메인은 제2 백본과 표적 뉴클레오티드와 염기쌍을 이룰 수 있는 복수개의 염기들을 포함하며;
    제2 아날로그에 커플링된 제1 아날로그는 표적 뉴클레오티드에 결합가능하고 엔도뉴클리에이즈 기질로 작용할 수 있는 것임을 특징으로 하는 안티센스 라이브러리.
  45. 제44항에 있어서, 상기 제1 아날로그 단독, 및 제2 아날로그 단독으로는, 상기 아날로그들이 결합했을 때에 비하여 생물학적 활성이 현저히 떨어지는 것을 특징으로 하는 안티센스 라이브러리.
  46. 제44항에 있어서, 상기 제1 바인딩 도메인은 약 4내지 12염기들로 구성되고, 상기 제2 바인딩 도메인은 약 6 내지 16염기들로 구성되는 것을 특징으로 하는 안티센스 라이브러리.
  47. 제46항에 있어서, 상기 제1 바인딩 도메인은 약 6내지 8염기들로 구성되고, 상기 제2 바인딩 도메인은 약 6 내지 8염기들로 구성되는 것을 특징으로 하는 안티센스 라이브러리.
  48. 제47항에 있어서, 제2 바인딩 도메인 염기들의 50%까지가 축퇴 염기들 및 유니버설 염기들로 구성되는 그룹에서 선택된 것임으로 특징으로 하는 안티센스 라이브러리.
  49. 제47항에 있어서, 제1 바인딩 도메인의 염기들의 50%까지가 축퇴 염기들 및 유니버설 염기들로 구성되는 그룹에서 선택된 것임으로 특징으로 하는 안티센스 라이브러리.
  50. 화학식2 (R1-L1-X)의 복수개의 화합물들과 화학식3 (Y-L2-R2)의 복수개의 화합물들을 포함하는 안티센스 전구체 라이브러리로서,
    R1및 R2는, 각각 독립적으로, RNA에 결합가능한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그;
    L1및 L2는, 각각 독립적인 링킹 모이어티 또는 결합;
    X와 Y는 각각 독립적인 커플링 모이어티이고;
    표적 폴리뉴클레오티드에 결합되는 경우, 뉴클리에이즈를 회복 및/또는 활성화시키는 화합물을 형성하도록, 상기 화학식 2와 3의 화합물들이 서로 커플링될 수 있는 것을 특징으로 하는 안티센스 전구체 라이브러리.
  51. 제50항에 있어서, 상기 제1 및 제2 커플링 모이어티들은 표적 뉴클레오티드가 없어도 커플링할 수 있는 것을 특징으로 하는 안티센스 전구체 라이브러리.
  52. 제50항에 있어서, 상기 X와 Y는, 알킬 할라이드, 알킬 술포네이트, 활성 에스테르, 케톤, 알데하이드, 아민, 하이드라진, 술피드릴, 알콜, 포스페이트, 티오포스페이트, 마이클(Michael) 첨가 수용체들, 디에노필, 디엔, 디폴라로필, 니트릴, 알킨, 티오세미카바자이드, 이소티오시아네이트, 이소시아네이트, 이미데이트, 및 알켄으로 구성되는 그룹에서 선택된 커플링 모이어티들을 포함하는 것을 특징으로 하는 라이브러리.
  53. 제50항에 있어서, 1,000개 이상의 화학식2에 의한 화합물들과 1,000개 이상의 화학식3에 의한 화합물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 안티센스 전구체 라이브러리.
  54. 제53항에 있어서, 1,000개 이상의 화학식2에 의한 화합물들과 1,000개 이상의 화학식3에 의한 화합물들을 포함하는 것을 특징으로 하는 안티센스 전구체 라이브러리.
  55. 제50항에 있어서, 상기 R1및 R2는, 각각 독립적으로 3 내지 24개의 염기들을 포함하는 것을 특징으로 하는 안티센스 전구체 라이브러리.
  56. 제55항에 있어서, 상기 R1및 R2는, 약 50%까지에 이르는 염기가 축퇴 염기들 및 유니버설 염기들인 것임으로 특징으로 하는 안티센스 전구체 라이브러리.
  57. 제56항에 있어서, 상기 R1및 R2는, 각각 독립적으로 5내지 10개의 염기들을 포함하는 것을 특징으로 하는 안티센스 전구체 라이브러리.
  58. 제57항에 있어서, 상기 R1및 R2는, 각각 8개의 염기들로 구성되고, 그 중 4개의 염기들이 표적 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 염기쌍을 이루는 것을 특징으로 하는 안티센스 전구체 라이브러리.
  59. 제58항에 있어서, 상기 라이브러리는, 화학식2 또는 화학식3 중 하나의 화합물들 약 1,000 내지 8,000개, 및 다른 화학식 화합물들 약 100 내지 1,000개를 포함하는 것을 특징으로 하는 안티센스 전구체 라이브러리.
  60. 화학식4 (GG-R1-CUGAUGA-L1-X)의 복수개의 화합물들과 화학식5 (Y-L2-GAA-R2)의 복수개의 화합물들을 포함하는 리보자임 전구체의 라이브러리로서,
    R1과 R2는 각각 독립적으로 RNA에 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 아날로그이고;
    L1과 L2는 각각 독립적으로 링킹 모이어티 또는 결합;
    X와 Y는 커플링 모이어티이고;
    상기 화학식4와 화학식5의 화합물들이 결합되어 리보자임을 형성하는 것을 특징으로 하는 리보자임 전구체 라이브러리.
  61. 주어진 mRNA 상의 최적의 안티센스 부위를 결정하는 방법으로서;
    복수의 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그를 선택하는 단계로서, 제1 아날로그들은 제1 커플링 모이어티 및 상기 mRNA에 상보적인 제1 바인딩 도메인을 포함하는 것임;
    각 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그에 대한 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그를 선택하는 단계로서, 제2 아날로그는, 상기 제1 커플링 모이어티에 결합가능한 제2 커플링 모이어티 및 상기 제1 바인딩 도메인에 근접한 위치에서 상기 RNA에 상보적인 제2 바인딩 도메인을 포함하는 것임;
    상기 제1 커플링 모이어티들 및 제2커플링 모이어티들을 커플링하여 복수의 안티센스 프로브들을 제공하는 단계;
    RNase존재 하에 상기 mRNA를 상기 안티센스 프로브들과 접촉시켜 절단결과물을 형성하는 단계; 및
    상기 절단결과물에 상응하는 안티센스 프로브를 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그들은, 이미 존재하는 올리고뉴클레오티드 아날로그들의 라이브러리로부터 선택된 것임을 특징으로 하는, 주어진 mRNA 상의 최적의 안티센스 부위를 결정하는 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 제2 바인딩 도메인들은, 축퇴 염기들 및 또는 유니버설 염기들로 구성되는 그룹에서 선택된 약 1 내지 4개의 올리고뉴클레오티드 염기들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 주어진 mRNA 상의 최적의 안티센스 부위를 결정하는 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 제1 바인딩 도메인은 축퇴 염기들 및 또는 유니버설 염기들로 구성되는 그룹에서 선택된 약 1 내지 4개의 올리고뉴클레오티드 염기들을 포함하는 것을 특징으로 하는, 주어진 mRNA 상의 최적의 안티센스 부위를 결정하는 방법.
  65. 주어진 표적 RNA상의 최적의 리보자임 절단 부위를 결정하는 방법으로서,
    복수의 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그들을 선택하는 단계로서, 제1 올리고 아날로그는 제1 커플링 모이어티 및 상기 RNA에 상보적인 제1 바인딩 도메인을 포함하는 것임;
    각 제1 올리고뉴클레오티드 아날로그에 대한 제2 올리고뉴클레오티드 아날로그를 선택하는 단계로서, 제2 아날로그는, 상기 제1 커플링 모이어티에 결합가능한 제2 커플링 모이어티 및, 상기 제1 바인딩 도메인에 근접한 위치에서 상기 RNA에 상보적인 제2 바인딩 도메인을 포함하는 것임;
    상기 제1 커플링 모이어티들 및 제2 커플링 모이어티들을 커플링하여 복수의 리보자임들을 제공하는 단계;
    상기 표적 RNA을 상기 리보자임들과 접촉시켜 절단결과물을 형성하는 단계; 및
    상기 절단 결과물에 대응하는 리보자임을 결정하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
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