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KR20010099682A - 단일가닥 ｄｎａ의 효소 합성 - Google Patents

단일가닥 ｄｎａ의 효소 합성 Download PDF

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KR20010099682A
KR20010099682A KR1020017004474A KR20017004474A KR20010099682A KR 20010099682 A KR20010099682 A KR 20010099682A KR 1020017004474 A KR1020017004474 A KR 1020017004474A KR 20017004474 A KR20017004474 A KR 20017004474A KR 20010099682 A KR20010099682 A KR 20010099682A
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KR
South Korea
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sequence
vector
reverse transcriptase
interest
nucleic acid
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Application number
KR1020017004474A
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Inventor
마이클 제이. 스킬런
챨스 에이. 콘라드
조나단 에프. 엘리스톤
Original Assignee
추후보충
인진, 인크.
조나단 에프. 엘리스톤
사이토제닉, 인크.
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Publication date
Application filed by 추후보충, 인진, 인크., 조나단 에프. 엘리스톤, 사이토제닉, 인크. filed Critical 추후보충
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Abstract

본 발명은 진핵세포에서 벡터-기재 시스템에 의한 단일가닥 cDNA (ss-cDNA)의 제조 방법 및 조성물에 관한 것이다. 벡터는 숙주 세포가 원하는 서열 ("관심 서열")을 코딩하는 ssDNA를 제조하는데 필요한 모든 신호 장치 및 효소 작용을 포함한다. ssDNA의 생체 내 합성을 위한, 벡터에 포함되는 성분들이 기재되어 있다. 여기에는 (1) 역전사효소 유전자, (2) 원하는 ssDNA 관심 서열에 대한 주형을 제공하는 유전 물질, 및 (3) 역전사효소 분자에 의한 역전사에 대한 프라이머 부위를 제공하는 관심 서열을 코딩하는 유전 물질에 근접한 곳에 위치한 제2 유전 물질이 있다. 벡터는 또한 적절한 프로모터(들)/인핸서(들)를 포함한다. 본 명세서에 또한 상기 성분들이 혼입되는 벡터의 제작 방법이 기재되어 있다.

Description

단일가닥 ＤＮＡ의 효소 합성 {Enzymatic Synthesis of ssDNA}
본 발명은 벡터 시스템에 의해 세포로 전달된 유전 물질(genetic element) 세트로부터 효모, 원핵세포 및 진핵세포에서 단일가닥 DNA (ssDNA)를 제조하는 것에 관한 것이다. 세포에서 생성되는 ssDNA는 ssDNA의 의도 작용을 방해할 수 있는 최소 벡터 서열을 갖는다.
사이에 끼인 및(또는) 측면에 위치한 벡터 서열을 포함하지 않는, 진핵세포에서 단일가닥 데옥시리보핵산 (ssDNA) 종을 제조하는 방법은 공지되어 있지 않다. 과학 및 특허 문헌에는 cDNA-제조용 벡터의 개시물이 포함되어 있지 않으나 (문헌 [A. Ohshima, et al., 89 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1016-1020 (1992); S. Inouye, et al., 3 Current Opin. Genet. Develop. 713-718 (1993); O. Mirochnitchenko, et al., 269 J. Biol. Chem. 2380-2383 (1994); J.-R. Mao, et al., 270 J. Biol. Chem. 19684-19687 (1995)]; 및 미국 특허 제5,436,141호 참조), ssDNA 생성물의 의도 작용을 방해할 수 있는 사이에 끼인 벡터 서열 없이 진핵세포에서 ssDNA를 제조할 수 있지 않은 것으로 나타났다. 그러므로, 본 발명의 목적은 연속적 및(또는) 사이에 끼인 뉴클레오티드 벡터 서열이 감소되거나 제거된 ssDNA의 시험관 내 또는 생체 내 합성을 지시하는 DNA 제작물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 살아있는 유기체에 치료학적 효과를 주기 위한 단백질이 결합하는 앱타머 (aptamer)로서 사용하기 위한, ssDNA 및(또는) dsDNA의 생체 내 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 핵산 서열, 및 세포, 조직 또는 유기체에서 원하는 효과를 주기 위한 이러한 서열의 살아있는 세포내로의 도입 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따라서, 관심 서열, 및 관심 서열에 대하여 3' 위치에 위치한 역전사효소의 프라이머 결합 부위를 포함하는 핵산 제작물 (construct)을 포함하는 세포내로의 전달용 유전물질 세트가 제공된다.
본 발명의 유전물질 세트는 안정한 단일가닥 핵산 서열의 생체 내 및 시험관 내 합성을 지시하는 효과적 시스템을 제공한다. 단일가닥 핵산 서열은 세포, 조직 또는 유기체에 원하는 효과를 제공하는데 사용될 수 있다. 관심 단일가닥 핵산 서열이 세포내에서 생성될 수 있기 때문에 세포로 단일가닥 핵산 서열을 전달하면서 발생되는 선행 기술의 문제점이 극복되거나 적어도 완화된다.
관심 서열에 대해 3'쪽에 위치한 프라이머 결합 부위를 갖는 핵산 제작물의 배열 때문에 본 발명의 핵산 제작물을 사용하여 제조될 수 있는 관심 서열의 크기 또는 유형에 대한 제한은 없으며, 상기 제작물은 표적 세포로의 임의의 원하는 경로에 의해 전달용 벡터내로 쉽게 혼입될 수 있다.
역전사는 세포에서 내생적인 역전사효소에 의해 수행될 수 있거나 (예, 사람 면역결핍 바이러스 또는 원숭이 면역결핍 바이러스에 의한 감염의 경우), 바람직하게는 유전 물질 세트가 추가로 역전사효소 유전자를 포함할 수 있다.
유전 물질 세트가 역전사효소 유전자를 포함하는 경우, 역전사효소 유전자는 바람직하게는 관심 서열 및 프라이머 결합 부위와 다시스트론 (polycistron)으로 전사된다.
바람직하게는, 역전사효소 유전자는 관심 서열 및 프라이머 결합 부위와 동일한 핵산 제작물상에 위치하고, 보다 바람직하게는 역전사효소 유전자는 상기 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위에 대하여 5' 쪽에 위치한다.
역전사효소 유전자는 역전사효소 또는 역전사효소/RNAse H 다단백질 (polyprotein)을 코딩할 수 있다.
역전사효소/RNAse H 다단백질을 코딩하는 유전자는 적합하게는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus), 사람 면역결핍 바이러스, 또는 원숭이 면역결핍 바이러스로부터 유도될 수 있다.
유전 물질 세트가 역전사효소 유전자를 포함하는 경우, 프라이머 결합 부위는 바람직하게는 역전사효소 유전자에 의해 코딩되는 역전사효소에 대해 특이적이다. 이와는 달리, 프라이머 결합 부위는 바람직하게는 내생성 역전사효소에 대해 특이적이다.
바람직하게는, 프라이머 결합 부위는 전달 RNA (tRNA)와 상보적이다.
바람직하게는, 본 발명의 유전 물질 세트는 또한 상기 관심 서열 및(또는) 상기 역전사효소 유전자 각각에 대한 프로모터, 및 임의로 인핸서 (enhancer)를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 프로모터 및(또는) 인핸서는 진핵세포 프로모터 및(또는) 인핸서이다.
프로모터는 구성적, 유도성, 광범위한 스펙트럼 또는 조직-특이적 프로모터일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 유전 물질 세트는 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위에 대하여 3' 쪽에 위치하는 폴리아데닐화 꼬리 서열을 추가로 포함한다. 폴리A 꼬리는 mRNA 전사물의 안정성을 제공한다.
바람직하게는, 관심 서열은 안티센스 서열이다. 즉, 본 발명은 특히 유전자 작용을 조절함으로써 병적 상태를 치료하는 안티센스 치료요법의 분야에서 광범위한 용도를 갖는다.
관심 서열은 또한 앱타머 (즉, 올리고뉴클레오티드가 아닌 표적, 예를 들어 단백질에 결합하는 올리고뉴클레오티드)일 수 있다. 즉, 다시 본 발명은 광범위한 치료학적 용도를 갖는 것으로 보여질 수 있다.
바람직하게는, 핵산 제작물은 DNA이다.
바람직하게는, 상기 기재된 것 중 어느 하나에 따른 유전 물질 세트는 1개 이상의 벡터에 혼입된다.
예를 들어, 역전사효소 유전자가 제2 벡터에 혼입되는 경우 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위는 제1 벡터에 혼입될 수 있다.
이와는 달리, 역전사효소 유전자, 관심 서열 및 프라이머 결합 부위는 단일 벡터에 혼입될 수 있다. 후자의 경우에, 역전사효소 유전자는 바람직하게는 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위에 대하여 5' 쪽에 위치한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따라서, 세포내 전달용 1개 이상의 벡터에 혼입되는
(a) 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위; 및
(b) 역전사효소 유전자를 포함하는, 세포내 전달용으로 적합한 유전 물질 세트가 제공된다.
본 발명의 핵산 제작물은 시판되는 포유동물 및 사람의 치료용 전달 벡터에 혼입될 수 있으며, 표적 세포에 따라 임의의 수행가능한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따라서,
(a) 관심 서열에 대한 삽입 부위, 및 삽입 서열에 대하여 3' 쪽에 위치한 프라이머 결합 부위; 및
(b) 역전사효소 유전자를 포함하는 벡터가 또한 제공된다.
바람직하게는, 역전사효소 유전자는 삽입 부위 및 3' 프라이머 결합 부위에 대하여 5' 쪽에 위치한다.
본 발명의 다른 면에 따라서, 관심 서열의 삽입 부위 및 3' 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 벡터, 및 역전사효소 유전자를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 시스템이 제공된다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템은 플라스미드 또는 변형 바이러스 구조물이다.
바람직하게는, 역전사효소 유전자는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.
본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템은 관심 서열을 벡터내로 스플라이싱 (splicing)하는 공지된 분해 및 라이게이션 (ligation) 기술을 이용하여 안티센스, 센스, 삼중나선 또는 임의의 다른 단일가닥 뉴클레오티드 관심 서열을 세포내로 전달하는데 이롭게 사용될 수 있다. 상기 기재된 벡터 또는 벡터 시스템은 숙주 세포가 원하는 서열을 갖는 단일가닥 핵산 분자를 제조하는데 필요한 모든 신호 장치 및 효소 작용을 제공한다.
본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템은 또한 사용자의 요구사항 및 사용될 역전사효소의 특이성에 따라 다른 프라이머 결합 부위가 사용될 수 있도록 프라이머 결합 부위가 제거되거나 교체되도록 고안될 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템에 의해 안정하게 형질전환되거나 트랜스펙션되는 숙주 세포, 특히 본 발명의 벡터 또는 벡터 시스템에 의해 안정하게 형질전환되거나 트랜스펙션되는 진핵세포를 제공한다. 진핵세포에는 효모 또는 식물 세포, 또는 포유동물 세포가 있다.
본 발명에 따라서, 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 시스템, 및 삽입 부위에 대한 제한 엔도뉴클레아제를 포함하는, 단일가닥 핵산 서열 제조용 키트가 추가로 제공된다.
본 발명의 다른 면에 따라서, 본 발명에 따른 벡터 또는 벡터 시스템, 벡터/벡터 시스템을 위한 용기, 및 벡터/벡터 시스템의 사용을 위한 지시사항을 포함하는, 단일가닥 핵산 서열 제조용 키트가 제공된다.
본 발명에 따라서, 관심 서열, 및 관심 서열에 대하여 3' 쪽에 위치한 프라이머 결합 부위를 포함하는 핵산 제작물을 표적 세포내로 도입하는 단계, 핵산 구조물을 mRNA로 전사시키는 단계, 및 mRNA를 cDNA로 역전사시키는 단계를 포함하는, 관심 단일가닥 핵산 서열의 생체 내 또는 시험관 내 제조 방법이 추가로 제공된다.
바람직하게는, 상기 방법은 mRNA의 역전사에 의해 형성되는 mRNA/cDNA 헤테로이중나선 (heteroduplex)로부터 mRNA를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
역전사는 표적 세포내로 도입된 역전사효소 유전자에 의해 발현되는 역전사효소에 의해, 또는 표적 세포에서 내생성인 역전사효소에 의해 (예, 표적 세포가 사람 면역결핍 바이러스 또는 원숭이 면역결핍 바이러스에 의해 감염된 경우) 수행될 수 있다.
mRNA 전사물은 RNAse H에 의해 mRNA/cDNA 헤테로이중나선으로부터 제거될 수 있다. 바람직하게는, RNAse H는 표적 세포내로 도입된 역전사효소/RNAse H 다단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현된다.
단일가닥 핵산 서열이 본 발명의 시험관 내 방법에 의해 제조되는 경우, 상기 방법은 mRNA 전사물, mRNA/cDNA 헤테로이중나선 및(또는) 단일가닥 cDNA를 표적 세포로부터 단리하는 추가 단계를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명의 생체 내 또는 시험관 내 방법에 의해 제조되는 단일가닥 cDNA 전사물, 억제성 핵산 분자 (예, 안티센스 서열 또는 앱타머), mRNA 전사물 및(또는) 헤테로이중나선 분자를 제공한다.
억제성 핵산 분자는 mRNA 전사물로부터 합성된 단일가닥 DNA, 또는 mRNA 전사 그 자체일 수 있으며, 이는 상보적 핵산 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 억제성 핵산 분자는 유전자 작용 조절에 특히 유용하다. 억제성 핵산 분자는 또한 RNA 또는 DNA-결합 단백질에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 또는 통상적으로 RNA 또는 DNA에 결합하지 않는 생체분자, 예를 들어 트롬빈, 브래디키닌 또는 PGF2α에 결합하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명에 따라서 제약학상 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명에 따른 유전 물질 세트, 벡터 또는 벡터 시스템, 또는 숙주 세포를 포함하는 제약 조성물이 추가로 제공된다.
본 발명에 따라서 또한 치료 요법, 특히 억제성 핵산 분자를 표적 세포로 전달하는데 사용하기 위한 본 발명에 따른 유전 물질 세트, 벡터 또는 벡터 시스템, 또는 숙주 세포가 제공된다. 본 발명의 유전 물질 세트, 벡터 및 벡터 시스템, 및 숙주 세포는 유전자 발현의 조절에 의한 병적 상태 완화에 특히 유용하다.
본 발명의 추가 면에 따라서, 유전자 발현의 조절에 의한 병적 상태 완화, 특히 억제성 핵산 분자의 표적 세포로의 전달에 의한 병적 상태 완화용 의약의 제조를 위한 본 발명에 따른 유전 물질 세트, 벡터 또는 벡터 시스템, 또는 숙주 세포의 용도가 제공된다. 다른 용도가 또한 개시되어 있다.
본 발명의 유전 물질 세트, 벡터, 벡터 시스템 및 숙주 세포는 광범위한 질환 또는 질병, 특히 비정상적 또는 변화된 유전자 발현에 의해 야기되는 질환 또는 질병, 또는 유전자 발현의 조절에 의해 완화될 수 있는 질환 또는 질병의 예방 또는 치료학적 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 유전 물질 세트, 벡터, 숙주 세포, 키트 및 방법은 단일가닥 핵산 분자, 또는 숙주 세포에서 예정된 또는 원하는 임의의 뉴클레오티드 염기 조성물을 제조하는데 사용될 수 있으며, 임의의 생체 내 또는 시험관 내 시스템에 적합하고 사용가능하다.
바람직한 실시양태에 따라서, 본 발명의 핵산 제작물은 인공적으로 합성된, 재조합, 키메라 및(또는) 이종 생성물이고, 관심 서열은 도입될 숙주 세포에 대해 이물질일 수 있다.
하기 설명에서 언급되는 도 1A는 관심 서열, 및 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위를 코딩하는 유전 물질을 포함하는 플라스미드의 개략도이다.
도 1B는 역전사효소 유전자를 포함하는 플라스미드의 개략도이다.
도 1C는 관심 서열, 프라이머 결합 부위 및 역전사효소 유전자를 코딩하는 유전 물질을 포함하는 플라스미드의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 방법의 한 실시양태를 예시하는 개략도이다.
벡터 (본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 관심 핵산 서열을 전달하고(하거나) 다루는데 사용되는 플라스미드 또는 변형 바이러스 구조물, 임의의 다른 적합한 비히클 (vehicle)을 말함)는 생체 내에서 ssDNA를 제조하도록 고안되었다. 벡터는 숙주 세포가 원하는 서열 ("관심 서열")을 코딩하는 ssDNA를 제조하는데 필요한 모든 신호 장치 및 효소 작용을 제공한다. ssDNA의 시험관 내 또는 생체 내 합성을 위한, 벡터내로의 혼입에 의한 세포내로 전달되기에 적합한 유전 물질 세트가 기재되어 있다. 여기에는 (1) 역전사효소 유전자, (2) 원하는 관심 ssDNA 서열에 대한 주형을 제공하는 유전 물질, 및 (3) 역전사효소 분자에 의한 역전사를 위한 프라이머 부위를 제공하는 관심 서열을 코딩하는 유전 물질에 근접한 곳에 위치한 제2 유전 물질이 포함된다. 벡터는 또한 적절한 프로모터(들)/인핸서(들)를 포함한다. 또한, 유전 물질이 혼입되는 벡터의 제작 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.
카세트 (cassette)의 제1 성분인 역전사효소 유전자에 대하여, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 (MoMuLV)로부터 얻은 역전사효소 유전자는 하기 실시예에서 유리하게 사용되었다. 다른 많은 레트로바이러스 역전사효소 유전자는 본 발명의 카세트에 사용될 수 있으며, 이는 역전사효소 유전자가 진핵세포에서의 발현을 위한 사이토메갈로바이러스(CMV) 또는 로우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터와 같은 적절한 상부 프로모터/인핸서에 의해 조절되는 경우에 바람직하다.
역전사효소 유전자는 또한 바람직하게는 하부 폴리아데닐화 신호 서열을 포함하여 역전사효소 유전자로부터 제조된 mRNA가 mRNA 안정성을 위한 3' 폴리(A) 꼬리를 포함하도록 한다. 당 분야의 숙련가들에게 공지되 바와 같이 다수의 폴리(A) 꼬리가 이용가능하며, 발현되는 진핵세포 유전자의 제조에 통상적으로 사용된다. 세포에서 제조되는 역전사효소는 하기 기재된 관심 서열을 포함하는 유전 물질을 코딩하는 주형으로부터 전사된 1차 mRNA 전사물로부터 상보적 DNA (cDNA)를 합성한다. 세포내 내생성 RNAse H 활성과 함께 역전사효소의 RNAse H 활성은 헤테로이중나선 RNA/cDNA 혼성물의 mRNA 성분을 분해하여 생체 내에서 ssDNA를 제조한다.
카세트에 포함된 제2 성분은 표적 세포에서 ssDNA의 합성을 위한 주형을 제공하는 핵산 서열을 코딩한다. 관심 서열을 포함하는 것이 이 물질이다. 상기 역전사효소 유전자의 경우에, 이 유전 물질은 바람직하게는 유전 물질의 상부에 위치하는, SV-40 프로모터와 같은 적절한 광범위한 스펙트럼 또는 조직-특이적 프로모터(들)/인핸서(들), 또는 프로모터(들)/인핸서(들)의 조합물에 의해 조절된다. 본 명세서를 통해서 당 분야의 숙련가들은 또한 많은 조직-특이적 또는 광범위한 스펙트럼 프로모터들/인핸서들, 또는 프로모터들/인핸서들의 조합물이 역전사효소 유전자 및 관심 서열을 조절하는데 사용될 수 있다는 것을 인지하게 될 것이다. 모든 이용가능한 프로모터들/인핸서들의 목록이 본 발명을 예증하는데 필요하지는 않지만 프로모터들/인핸서들은 구성적이거나 유도성일 수 있으며, 본 명세서의 목록에 있는 CMV 또는 RSV (비세포 유형 특이적) 또는 GFAP (조직 특이적) 프로모터들/인핸서들, 및 다른 많은 바이러스 또는 포유동물 프로모터들이 포함될 수 있다. 본 발명과 연관하여 사용하기에 적절한 대표적 프로모터들/인핸서들에는 HSVtk [McKnight et al., 217 Science 316, 1982], 사람 베타-글로불린 [Breathnach et al., 50 Ann. Rev. of Biochem. 349, 1981], 베타-액틴 [Kawamoto et al., 8 Mol. Cell Biol. 267, 1988], 래트 성장호르몬 [Larsen et al., 83 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8283, 1986], MMTV [Huang et al., 27 Cell 245 1981], 아데노바이러스 5 E2 [Imperiale, et al., 4 Mol. Cell. Biol. 875, 1984], SV40 [Angel et al., 49 Cell 729, 1987], a-2-매크로글로불린 [Kunz, et al., 17 Nucl. Acids Res. 1121, 1989], MHC 클래스 I 유전자 H-2kb [Blanar et al., 8 EMBO J. 1139, 1989] 및 갑상선 자극 호르몬 [Chatterjee et al., 86 Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 9114, 1989]이 있으나 이에 제한되지 않는다.
진핵세포에서 발현되는 경우, 관심 서열은 역전사효소에 의한 cDNA 합성의 개시를 위한 프라이머-결합 부위 (PBS)를 코딩하는 유전 물질의 하부에 존재한다. PBS는 진핵세포 표적 세포내에 존재하는 전달 RNA (tRNA)에 대하여 상보적인 서열이다. 본 명세서에 기재된 현재 바람직한 유전 물질 세트에 포함되는 PBS는 MoMuLV의 실제 18 뉴클레오티드 서열 영역으로부터 취해진다. 그러나, 유전 물질 세트에 포함되는 역전사효소에 맞는 임의의 PBS는 본 목적을 위해 사용될 수 있다. 관심 서열의 다수 복사본(각각 그에 상응하는 PBS를 포함함)은 본 발명의 방법, 원한다면, 예를 들어 표적 세포내로의 다양한 유전자 영역으로 안티센스 서열을 전달하는데 사용하기 위한 방법에 따라서 세포로 전달용 벡터내로 혼입될 수 있다.
유전 물질로부터 전사된 mRNA 1차 전사물은 관심 서열을 합성하고 프로세싱 (processing)하기 위해 상기 기재된 역전사효소에 의해 사용되는 주형으로서 작용하며, 이는 상기 지시한 바와 같이 원하는 임의의 ssDNA일 수 있다. mRNA 1차 전사물은 관심 서열에 대해 하부에 존재하는 프라이머 결합 부위 (PBS)를 포함한다. PBS는 오로지 "프라이머 tRNA"에 의해 인지된다. 당 분야의 숙련가들에게 tRNA는 세포에서 내생성이다. 각각의 tRNA는 아미노산을 코딩하는 mRNA 전사물상의 유일한 서열(즉, 코돈)을 인식할 수 있으며, 특정 아미노산에 공유결합할 수 있다 (즉, tRNA는 특정 아미노산에 결합하는 경우 "충전됨(charged)"). 그러나, "프라이머 tRNA"는 mRNA 전사물 PBS에 결합하고 아미노산과 공유결합(즉, "비충전됨(uncharged)")하지 않는 경우 역전사효소에 의한 ssDNA 합성을 개시하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 실시예에서 사용되는 MoMuLV 역전사효소는 또한 PBS의 유일한 서열을 인식하고 결합하는 비충전된 라이신 tRNA을 인식하고 사용한다. 그러므로, 벡터에 혼입된 각각의 PBS는 프라이머 tRNA에 의해 인식되는 유일한 서열을 포함해야 하며, 프라이머 tRNA는 사용되는 특정 역전사효소에 의해 인식되는 것이어야 한다.
벡터는 본 발명의 유전 물질 세트를 운반하고(하거나) 관심 서열의 발현 수준을 증가시키며 세포의 확인을 수월하게 하는 다른 특수화된 유전 물질을 함유하는 것이 바람직하다. 특수화된 유전 물질은 벡터가 원핵세포 시스템에서 형질전환되고 증폭될 수 있도록 선택가능한 마커(marker) 유전자를 포함한다. 예를 들어, 가장 통상적으로 사용되는 선택가능한 마커는 세균 (예를 들어, 대장균 (E. coli))에게 암피실린, 클로람페니콜, 카나마이신(네오마이신) 또는 테트라사이클린과 같은 항생제에 내성을 부여하는 유전자이다. 또한, 벡터는 뒤이은 트랜스펙션, 확인 및 진핵세포 시스템에서의 발현을 위한 특수화된 유전 물질을 포함하는 것이 바람직하다. 진핵세포에서의 발현의 경우, 다중 선택법 (예, 중국 햄스터 난소: CHO)은 세포에게 항생제 또는 다른 약물에 대한 저항성을 주거나, 또는 형태학적 변화와 같은 세포의 표현형 변화, 접촉 억제 손실, 또는 증가된 성장률을 변화시키는데 사용될 수 있다. 진핵세포 시스템에서 사용되는 선택가능한 마커에는 제오신(Zeocin), G418, 아미노글라이코사이드 항생제에 대한 내성 마커, 또는 β-gal 또는 녹색 형광 단백질과 같은 표현형 선택 마커가 있으며 이에 제한되지 않는다.
이중나선 형성 후 "스템 (stem)" 부분을 형성하는 관심 서열의 측면에 위치하는 역방향 탄뎀 (tandem) 반복의 첨가에 의해 선형 ssDNA가 무손상 스템-루프 (stem-loop) ssDNA 구조로 형성될 수 있다는 것은 본 설명에 의해 당 분야의 숙련가들에게 또한 명백할 것이다. 스템-루프 구조는 선형 ssDNA 형태와 같은 많은 응용에서 유사하게 작용할 수 있다. 이러한 ssDNA 구조는 이중가닥 형태의 ssDNA의 "말단"을 유지시킴으로써 세포내 뉴클레아제에 더 내성이 있을 수 있다.
스템 (이중나선 DNA)이 특정 DNA-결합 단백질에 의해 인식되고 결합되는 예정된 서열(들) (즉, "앱타머")를 포함하도록 고안될 수 있다는 것은 당 분야의 숙련가들에게 또한 명백할 것이다. 다른 용도 중에서, 이러한 스템 구조는 세포내에서 특정 유전자 발현을 조절하는 선택된 단백질(들)의 양을 결정하는 경쟁물질로서 사용된다. 예를 들어, 세포내 본 발명의 ssDNA 스템-루프에서 "스템"은 아데노바이러스 E1a와 같은 선택된 전사인자에 대한 결합 부위를 포함한다. 아데노바이러스 E1a는 다른 종양유전자처럼 세포-코딩된 전사인자의 활성에 영향을 미침으로써 여러 아데노바이러스 및 세포 유전자의 유전자 발현을 조절하여 정상 세포를 형질전환된 세포로 변화시킨다 [Jones et al., Genes Dev. 2, 267-281 (1988)]. 스템의 이중나선 구조는 단백질이 프로모터가 결합하는 것을 방해하며 특정 해로운 유전자의 발현을 억제하도록 인자를 "감는(bind up)" 작용을 한다. 당 분야의 숙련가들에게 이중나선 스템 구조가 임의로 다중 결합 부위, 예를 들어, 특정 유전자의 발현을 능동적으로 조절하는 다양한 전사인자에 의해 인식되는 부위를 포함할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 예를 들어, 아데노바이러스 E1a는 12-O-테트라데카노일포르볼 13-아세테이트 (TPA)에 의해, 다른 많은 미토겐(mitogen)에 의해, 그리고ras, mos, src및trk종양유전자에 의해 전사를 유도하는 프로모터 물질인 포르볼 에스테르-반응 물질을 통해 콜라게나제 유전자의 전사를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 상기 메카니즘은 전사인자 집단 AP-1의 작용을 억제하는 것을 포함한다 [Offringa et al., 62 Cell 527-538 (1990)].
다른 면에서 본 발명에 따라서 제조되는 DNA 전사물의 루프 부분의 복합 2차 ssDNA 구조를 제작하는데 본 발명이 이용된다는 것이 당 분야의 숙련가에 의해 인지될 것이다. 이러한 2차 구조는 여러 임의의 작용을 제공하도록 설계된다. 예를 들어, 관심 서열에는 임의로 단일가닥 cDNA 전사물의 루프 부분에 혼입되어 아데노연관 바이러스의 긴 말단 반복 또는 레트로트랜스포손에서 발견되는 것과 같은 구조처럼 소위 "클로버 잎" 또는 "십자형"으로 불리는 형태를 형성하는 서열이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 올바른 조건하에서, 이러한 구조는 부위-특이적 방법으로 숙주 게놈내로 삽입된다.
본 발명의 유전 물질 세트가 혼입되는 벡터는 시판되는 포유동물 및 사람 치료용 다중 전달 벡터로 혼입되기에 알맞기 때문에 다중 전달 경로는 선택된 벡터에 따라 특정 표적 세포에 적합하다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 현재 환자의 세포를 형질전환하고 게놈내로 DNA를 도입하기 위해 가장 흔하게 사용되는 방법이다. 간접 방법에서, 신규 유전 정보를 운반하는 바이러스 벡터는 몸으로부터 제거된 표적 세포를 감염시키는데 사용되며, 이들 세포는 그 후 재이식된다 (즉, 생체 외). 출생후 동물내로의 직접적 생체 내 유전자 전달은 바이러스 피막(envelope) 수용체단백질을 함유하는 리포솜내로 캡슐화된 DNA 및 프로테오리포솜내에 잡힌 DNA의 제형에 대해 보고되어 있다 [Nicolau et al., Proc. Natl. Acad Sci USA 80: 1068-1072 (1983); Kaneda et al., Science 243: 375-378 (1989); Mannino et al., Biotechniques 6: 682-690 (1988)]. 인산칼슘 공침전 DNA에서의 양성 결과가 기재되어 있다 [Benvenisty and Reshef, Proc. Natl. Acad Sci USA 83: 9551-9555 (1986)]. 이러한 시스템에는 정맥내, 근육내 및 피하 주사 뿐만 아니라 직접 종양내 및 강내 주사가 있다. 유전 물질 세트는 선택된 벡터내로 혼입되는 경우 또한 경점막, 직장, 경구 또는 흡입형 전달 방법을 통해 투여될 수 있다.
본 발명의 유전 물질 세트가 혼입되는 벡터는 역방향 탄뎀 반복의 존재 또는 부재하에 벡터내로 특정 관심 서열을 스플라이싱하기 위해 공지된 분해 및 라이게이션 기술을 이용하여 안티센스, 센스, 삼중나선 또는 임의의 다른 단일가닥 뉴클레오티드 관심 서열을 전달하는데 유리하게 사용된다. 본 명세서를 통해서 당 분야의 숙련가들은 또한 진핵세포 내에서 발현에 사용되는 상기 기재된 신호가 특정 관심 서열에 따라 당 분야에 공지된 방법으로 변형될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 관심 서열이 발현되기를 원하는 시스템의 관심 서열에 이로운 발현 특성을 주도록 프로모터를 변화시키는 것이 가장 바람직한 변화이다. 많은 가능한 프로모터 및 다른 신호가 있으며, 이는 관심 서열이 선택되는 특정 표적 세표에 의존적이고, 특정 표적 세포 및 관심 서열에 바람직할 수 있는 모든 잠재적 인핸서, 유도성 및 구성적 프로모터 시스템 및(또는) 폴리(A) 꼬리 시스템을 목록화하는 것을 불가능하다.
본 발명은 또한 생체 내 또는 시험관 내에서 치료학에 사용하기 위한 억제성 핵산을 제조하는데 이용된다. 억제성 핵산은 mRNA 주형로부터 합성되는 ssDNA 또는 mRNA 주형 그 자체일 수 있으며, 이는 특이적으로 상보적 핵산 서열에 결합할 수 있다. 적절한 표적 서열에 결합함으로써 RNA--RNA, DNA--DNA, 또는 RNA-DNA 이중나선 또는 삼중나선이 형성된다. 보다 통상적으로, 이들 핵산은 대개 센스 또는 유전자 코딩 가닥에 상보적이기 때문에 종종 "안티센스"라 불리지만, "센스" 서열이 또한 치료를 목적으로 세포에서 사용된다. 예를 들어, RNA 또는 DNA에 통상적으로 결합하지 않는 생체분자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드의 확인은 크기, 구조 및 조성이 다양한 많은 생체분자를 증명하였다. 이들 분자에는 (1) 혈전 형성의 과정에서 피브리노겐을 피브린으로 전환시키는 다기능 조절 단백질인 트롬빈; (2) 혈압 조절 및 저혈압과 연관되어 있는 노나펩티드 키닌인 브래디키닌 (bradykinin); (3) 호르몬 활성을 나타내는 프로스타글란딘 또는 지방산 유도체인 PGF2.알파가 있다. 또한, 자연 생물학적 작용이 주로 세포외에서 일어나는 생체분자와 올리고뉴클레오티드의 상호작용이 입증되었다 (미국 특허 제5,840,867호). 그러므로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "억제성 핵산"은 "센스" 및 "안티센스" 핵산 모두를 말한다.
표적 핵산에 결합함으로써, 억제성 핵산은 표적 핵산의 작용을 억제한다. 이 억제 효과는 예를 들어 DNA 전사, 프로세싱 또는 mRNA에 폴리(A) 추가, DNA 복제, 번역을 억제하거나, 또는 RNA 분해 촉진과 같은 세포의 억제 메카니즘을 촉진하는 결과를 가져온다. 억제성 핵산 방법은 유전자 발현을 변형시키는 많은 다른접근법을 포함한다. 항헤르페스 바이러스 억제성 핵산의 예가 CMV에 대한 활성이 있는 ISIS 2922 (캘리포니아주의 카스바드(Carlsbad) 소재 ISIS Pharmaceuticals)이다 (문헌 [Biotechnology News 14:5] 참조). 이들 다른 유형의 억제성 핵산 기술이 문헌 [Helene, C. and Toulme, J. (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049: 99-125](이후 "Helene 및 Toulme"이라 함)에 기재되어 있다.
요약해서, 억제성 핵산 치료요법 접근법은 (1) 표적 DNA 서열 접근법, (2) 표적 RNA 서열 (mRNA 전구체 및 mRNA를 포함함) 접근법, (3) 표적 단백질 접근법 (센스 가닥 접근법), 및 (4) 표적 핵산의 절단 또는 화학적 변형을 일으키는 접근법으로 분류될 수 있다. 제1 접근법은 여러 카테고리를 고려한다. 핵산은 이중 나선 DNA의 주요 그루브에 결합하여 "삼중나선(triplex)" 구조를 형성하도록 고안된다. 이와는 달리, 억제성 핵산은 단일가닥 DNA의 영역에 결합하여 복제 또는 전사 중에 이중 나선 DNA가 개방되도록 고안된다. 보다 통상적으로, 억제성 핵산은 mRNA 또는 mRNA 전구체에 결합되도록 고안된다. 억제성 핵산은 mRNA 전구체의 성숙을 방해하는데 사용된다. 억제성 핵산은 RNA 프로세싱, 스플라이싱 또는 번역을 방해하도록 고안될 수 있다. 제2 접근법에서, 억제성 핵산은 mRNA에 표적이 된다. 이 접근법에서, 억제성 핵산은 코딩된 단백질의 번역을 특이적으로 방해하도록 고안된다. 제2 접근법을 이용하여, 억제성 핵산은 특정 단백질을 코딩하는 mRNA의 번역을 억제함으로써 특정 세포 작용을 선택적으로 억제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, c-myc mRNA의 영역에 상보적인 억제성 핵산은 c-myc 원종양유전자를 과발현시키는 사람 전골수세포성 백혈병 세포계(cell line)인 HL60에서 c-myc 단백질이 발현되는 것을 억제한다 [Wickstrom E. L., et al. (1988) PNAS 85: 1028-1032 and Harel-Bellan, A., et al. (1988) Exp. Med. 168: 2309-2318]. Helene 및 Toulme의 문헌에 기재된 바와 같이, mRNA를 표적으로 하는 억제성 핵산은 코딩될 단백질(들)의 번역을 억제하는 여러 다른 메카니즘에 의해 수행되는 것으로 보여져 왔다.
세포내로 도입된 억제성 핵산은 또한 Helene 및 Toulme의 문헌에 기재된 바와 같이 mRNA 번역을 포함하는 효소 또는 결합 단백질을 트랩핑하거나 경쟁하는 유전자 또는 mRNA의 "센스" 가닥을 고안하는 제3 접근법을 이용할 수 있다. 최근, 억제성 핵산은 표적 유전자 또는 mRNA의 화학적 불활성 또는 절단을 유도하는데 사용되고 있다. 화학적 불활성화는 세포내 억제성 핵산과 표적 핵산 사이의 교차연결을 유도함으로써 일어난다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 클로닝된 역전사효소 유전자를 갖는 플라스미드 뿐만 아니라 키트의 사용자에 의해 특정 관심 서열이 삽입되는 다중 클로닝 부위 (multiple cloning site, MCS)를 포함하는 키트(kit) 형태를 제공하며, 이는 사용자가 의도하는 결과에 따라 상기 기재된 역방향 탄뎀 반복을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. MCS는 프라이머 결합 부위를 코딩하는 유전 물질로부터 상부에 위치한다. 그 후 얻어진 플라스미드는 이를 유지시키는 세포 배양액으로부터 정제되고, 동결건조되거나 또는 그렇지 않으면 포장되고 사용자에게 운반되기 위해 보존된다. 키트는 바람직하게는 또한 적합한 반응 완충액과 함께 관심 서열이 크로닝되는 MCS에 대한 제한 엔도뉴클레아제(들), 플라스미드내로 관심서열을 삽입하기 위한 리가제 및 다른 효소, 및 플라스미드의 지도를 포함한다.
다른 언급이 없다면, 표준 기술은 문헌 [Seabrook, et al. (1989), J. Seabrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.), Cold Spring Harbor Press (1989)(이후 "Maniatis, et al. (1989)"이라 함)]에 기재되어 있으며, 하기 실시예에서 이용되었다. ssDNA의 생체 내 제조 방법을 예시하기 위해 여러 실험 고안물이 제시되어 있다.
하기 실시예는 예시하기 위해서만 제공되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
재료
플라스미드 pcDNA3.1/Zeo+를 인비트로젠 코포레이션 (Invitrogen Corp., 캘리포니아주의 샌디에고)로부터 구입하고, 플라스미드 PBK-RSV를 스트라타젠 (Statagene, 캘리포니아주의 라졸라)으로부터 구입하였다. 올리고데옥시리보뉴클레오티드 (ODN)를 미드랜드 서티피드 리에이전트 캄파니 (Midland Certified Reagent Co., 텍사스주의 미드랜드)에 의해 합성하였다. 중합효소 연쇄반응 (PCR)을 베링거 만하임 코포레이션 (Boehringer Mannheim Corp., 인디애나주의 인디애나폴리스)로부터 구입한 Taq DNA 중합효소를 이용하여 로보-기울기 열순환기(Robo-gradient thermal cycler, 캘리포니아주의 라졸라 소재 스트라타젠)에서 수행하였다. 제한 엔도뉴클레아제 및 T4 DNA 리가제를 베링거 만하임 코포레이션 (인디애나주의 인디애나폴리스)으로부터 얻었다. 사용한 ODN은 첨부된 서열 목록에 기재되어 있다.
실시예 1
진핵 세포에서 ssDNA의 생체 내 합성
ssDNA가 무손상 세포에서 제조될 수 있는가를 결정하기 위하여 하기 생체 내 실험을 고안하였다. 이들 숙주 세포에서 플라스미드내로 클로닝될 유전 물질의 발현을 조절하기 위하여, 사용되는 플라스미드는 RSV 프로모터를 포함하였다. 그러나, 본 명세서를 통해서 당 분야의 숙련가들은 상기 목록에 있는 임의의 진핵세포 프로모터가 본 목적을 위해 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
플라스미드 구조물
단일가닥 DNA로서 발현되는 서열을 포함하는 플라스미드 및 클로닝 벡터 pssXB를 통상적인 중간체 제작물로부터 제작하였다. 이들 조작을 위한 숙주 균주는 XL1-Blue MRF'(캘리포니아주의 라졸라 소재 스트라타젠)였다.
제1 클로닝 단계에서, 통상적인 중간체를 얻기 위하여 벡터 pcDNA3.1Zeo+ (캘리포니아주의 샌디에고 소재 인비트로젠)를 제한효소NheI 및ApaI으로 분해하였다. 적합한NheI 및ApaI 말단을 가지며, 합성 단일가닥 올리고데옥시뉴클레오티드 ODN-PMMV(+) 및 ODN-PMMV(-) (표 I 참조)를 어닐링(annealing)함으로써 형성되는 이중가닥 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 분해된 pcDNA3.1Zeo+로 라이게이션하여 pcPMMV를 형성시킨다. 이 삽입물은 몰리니 마우스 백혈병 바이러스 (MoMuLV) 역전사효소 프로모터 영역을 포함한다. 삽입물은 또한 pcPMMV에서 유일한 2개의NotI 부위를 포함한다. 이 제작물에 그리고 제작물로부터 유도되는 플라스미드에 위치하는 (+)로 지칭되는 가닥은 pcDNA3.1/Zeo(+)의 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터로부터 RNA로 전사된다.
MoMuLV 역전사효소에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드 pssDNA-발현-A (pssXA)는 벡터 pBK-RSV (캘리포니아주의 라졸라 소재 스트라타젠)로부터 또한 숙주 균주로서 XL-1 Blue MRF'를 이용하여 제작되었다. MoMuLV를 발현하는 마우스 세포계를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC #CRL-1858)으로부터 얻었다. 바이러스 RNA를 단리하고 ODN-RT(-) (표 1)로부터 역전사시켰다. 그 후 역전사물을 제조자의 지시사항에 따라 프로메가 (Promega, 위스콘신주의 매디슨) 제조의 키트, 프라이머 ODN-RT (+) 및 ODN-RT (-)를 이용하여 PCR 증폭시키고,SacI 및HindIII (이들 제한 엔도뉴클레아제에 부위는 각각 5' 및 3' 프라이머에 존재함)로 분해하였다. 얻어진 2.4 kb 생성물은 위치 2546과 4908 사이의 MoMuLV 게놈 서열을 포함한다. 성숙 바이러스 역전사효소 펩티드는 위치 2337과 4349 사이의 서열에 의해 코딩되나 [Petropoulos, C.J. Retroviral taxonomy, protein structure, sequences and genetic maps. In: Retroviruses, 757, Appendix 2, Coffin, J.M. (Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA 1997), 아미노 말단이 잘린 펩티드는 전체 활성을 유지한다 [Sun, et al. (1998)].
lac프로모터 영역을 제거하는XbaI 및NheI로 pBRK-RSV 벡터를 분해하였다. 어닐링된 올리고데옥시뉴클레오티드 ODN-N>S (+) 및 ODN-N>S (-)에 의해 형성된 링커(linker)를 사용하여NheI 말단을SacI 말단으로 전환시켰다.HindIII 부위를 통해 역전사효소 암플리머(amplimer)를 라이게이션시키고, 이어서 이 제작물을 pBK-RSV의SacI와XbaI 부위 사이를 라이게이션시켜 pBK-RSV-RT를 얻었다.
당 분야의 숙련가들은 본 발명을 포함하는 유전 물질 세트가 또한 예를 들어, 융합 플라스미드가 ss-cDNA-코딩 유전 물질을 코딩하도록 하는 pc3.1DNA/Zeo-유도 플라스미드 및 pBK-RSV-유도 플라스미드의 융합, Mo-MuLV-RT 유전자와 PBS의 융합에 의해 제조된 단일 플라스미드로부터 발현되다는 것을 인지할 것이다. pBK-RSV-RT/MboL은 NsiI에 의해 분해되어, 사이에 끼인 his-pro 링커 및 관련 조절 유전자와 Mo-MuLV-RT 유전자를 포함하는 5.3 kb 단편을 방출한다. 5.3 kb DNA 단편은 내부 EcoRI 부위를 포함하는 링커로 라이게이션되고 EcoRI에 의해 분해된다. pc3.1/Zeo/N-M, 및 시험 서열을 포함하는 유도 플라스미드는 사이토메갈로바이러스 인핸서/프로모터 (P CMV)의 pc3.1DNA/Zeo상의 유일한 부위를 인식하는 BglII에 의해 분해된다. BglII 말단은 내부 EcoRI 부위를 포함하는 서열 15 및 서열 16으로 라이게이션된다. EcoRI에 의한 분해 후, 5.3 kb 단편은 pc3.1/Zeo/N-M 및 유도체로 라이게이션되어 플라스미드를 형성한다.
조직 배양 연구
제조자의 지시사항을 이용하여 리포펙탄트 (lipofectant, 베링거 만하임 코포레이션)를 사용하여 안정하고 일시적인 트랜스펙션을 수행하였다. 모든 플라스미드 제작물을 Cos-7, U251 및 HeLa 세포계로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 후 24 내지 48시간에 PCR에 의해 그리고 돗-블롯(dot-blot) 분석에 의해 ssDNA에 대한 분석을 수행하였다. Silver 등에 의해 개발된 RT-PCR 분석 [Silver, J., et al. 21 Nucleic Acids Res. 3593-4 (1993)]을 이용하여 역전사효소 활성을 분석하였다.트리아졸 시약 (Gibco Life Technologies, 메릴랜드주의 게이터스버그)을 이용하여 초기 48-72시간에 트랜스펙션된 세포로부터 ss-cDNA를 단리하였다. 내부 단편에 대한 PCR 기재 분석법에 의해 그리고 변성 단일가닥 겔 전기영동에 뒤이은 나일론 블롯팅 및 내부 비오딘-표지된 프로브와의 프로빙에 의해 특정 ss-cDNA 종을 분석하였다.
상기 기재된 실험들은 진핵세포 역전사효소 반응 및 여러 cDNA 프라이밍 반응을 이용하는 다중 단계 반응에 의한 ssDNA의 생체 내 제조 방법을 제시한다. 임의의 관심 뉴클레오티드 서열은 원핵세포 또는 진핵세포에서 이 방법에 의해 생성된다. 상기 세포들은 실제로 2개의 플라스미드 (하나는 도 1A에 나타낸 관심 서열 및, 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위를 코딩하는 유전 물질을 운반하고, 다른 하나는 도 1B에 나타낸 역전사효소에 대한 유전자를 운반함)에 의해 공트랜스펙션되었다. 그러나, 당 분야의 숙련가들은 관심 서열 및 역전사효소에 대한 PBS를 코딩하는 유전 물질을 포함하는 단일 플라스미드, 및 역전사효소에 대한 유전자가 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다(도 1C).
실시예 2
형질전환된 세포 내의 역전사효소 활성
pBK-RSV-RT 제작물을 함유하는 세포의 추출물 내의 역전사효소 활성의 존재를 측정하기 위해, 하기 분석법을 사용한다. 이 분석법은 브롬 모자이크 바이러스 RNA 게놈의 DNA 복사물을 제조하기 위해 형질전환된 세포의 단백질 추출물 내의 역전사효소 활성에 의존한다 (Silver, et al., 1993). 이 바이러스의 복제 주기는DNA 중간체를 필요로하지 않으며, 증폭 생성물이 선행하는 역전사 없이 제조될 수 있는 가능성을 제거한다.
실시예 3
형질전환된 포유동물 세포 내의 단일가닥 DNA 존재의 증명
형질전환된 세포 내의 단일가닥 DNA를 검출하기 위해 PCR 법을 사용한다. 단일가닥 DNA를 포함하는 것으로 가정되는 RNA 추출 공정으로부터 수득된 생성물을, 예상 단일가닥 DNA 분자 (그렇지 않으면 존재하지 않음)에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에서 주형으로서 사용된다. 예상 크기의 밴드는 비처리된 RNA/ssDNA 제제들 및 RNAse A로 처리된 상기 제제들로부터 제조한다. S1 뉴클레아제, 즉 매우 특이적인 단일가닥 DNA 엔도뉴클레아제로 처리된 제제를 사용하면 증폭 생성물이 생성되지 않는다.
실시예 4
도파민 수용체 이상에 관련된 병적 상태의 진단 및 치료를 위한 제약 제제 및 방법
도파민성 신경계의 이상 활성은 파키슨병, 헌팅턴병, 지연성 운동장애, 특정 형태의 정신분열병, 및 근긴장이상 및 운동장애를 포함하는 다수의 행동 및 운동 장애를 의미한다. 도파민계의 기능장애는 도파민계의 감소 또는 증가된 활성에 의해, 또는 외부 또는 내부 환경을 변화시킴으로써 조절되는 계의 무능력에 의해 발생할 수 있다.
상기 언급한 장애로 고통받는 환자를 위해, 도파민 수용체를 코딩하는 핵산의 발현 조절 서열에 특이적으로 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생성하는 관심 서열을 포함하도록 플라스미드를 제작한다. 플라스미드가 도파민 수용체를 발현하는 세포에 도입되어 억제성 뉴클레오티드를 생성하는 조건 하에 플라스미드를 투여한다. 억제성 뉴클레오티드는 상기 RNA 분자의 발현 조절 서열에 특이적으로 결합함으로써, 1종 이상의 도파민 수용체 아형의 발현을 선택적으로 조절하고, 이들 발현과 관련된 병적 상태를 완화시킨다. 효능은 미국 특허 제5,840,708호에 기재된 방법에 따라 시험한다.
실시예 5
카포시(Kaposi) 육종 관련 헤르페스 바이러스 (KSHV) 비리온(virion) 단백질 26(VP26)에 대한 억제성 뉴클레오티드
카포시 육종 관련 헤르페스 바이러스(KSHV)는 카포시 육종(KS)을 일으키는 것으로 믿어지는 신규 사람 헤르페스 바이러스(HHV8)이다. 카포시 육종은 후천성 면역 결핍증(AIDS) 환자에게 발생하는 가장 일반적인 신생물이다. 대략 15 내지 20%의 AIDS 환자가 면역적격 개체에게서 거의 발생하지 않는 상기 신생물을 발전시킨다. AIDS 관련 KS (AIDS-KS)가 감염성 병인을 갖는다는 역학적 증거가 제안된다. 게이 및 양성애 AIDS 환자들은 혈우병 AIDS 환자보다 대략 20 배 이상 KS를 발전시키기 쉬우며, KS는 AIDS인 게이 남성들의 특정 성 습관과 연관된다. KS는 이성 또는 비경구적인 HIV 전달을 통해 감염된 성인 AIDS 환자, 또는 수직 HIV 전달을 통해 감염된 소아 AIDS 환자 중에는 일반적이지 않다. KS를 일으키는 것으로 이미 추정된 약제에는 사이토메갈로바이러스, B형 간염 바이러스, 사람 유두종바이러스, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스(EBV), 사람 헤르페스 바이러스 6, 사람 면역결핍 바이러스 (HIV) 및 미코플라스마 침투물이 있다. 비감염성 환경 약제, 예컨대 아질산 흡입제가 또한 KS 종양발생의 역할을 하는 것으로 제안되었다. 그러나, 광범위한 조사가 임의의 이들 약제와 AIDS-KS 간의 병인론적 연관성을 증명하지는 않았다.
비리온 단백질 26(VP26)은 대부분의 헤르페스 바이러스 중의 뉴클레오캡시드 구조의 성분이다. 이 구조는 바이러스 게놈이 하나의 감염된 세포에서 다른 세포로 퍼져나갈 때 바이러스 게놈에 대한 운반 메카니즘으로서 작용한다. 원래의 감염 바이러스의 일부로서, 이는 면역계에 의해 주요 항원으로서 인식되며, 따라서 환자 혈청 중에서 헤르페스 바이러스에 대한 항체를 스크리닝하는데 사용되며, 백신으로서 사용될 수 있다.
감염된 환자를 위해, 상기 기재된 방법을 사용하여 관심 서열을 포함하도록 플라스미드를 제작한다. 관심 서열은 미국 특허 제5,840,708호에 기재된 바와 같이 KSHV 비리온 단백질 26을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 또는 안티센스 또는 삼중나선 올리고뉴클레오티드 분자이다. 플라스미드는 플라스미드가 감염된 세포에 도입되어 억제성 뉴클레오티드를 생성하는 조건 하에 투여한다. 억제성 뉴클레오티드는 상기 RNA 분자의 발현 조절 서열 또는 코딩 서열에 특이적으로 결합함으로써, KSHV 비리온 단백질 26의 발현을 선택적으로 조절하고, 발현과 관련된 병적 상태를 완화시킨다.
실시예 6
종양의 성장, 전이 및(또는) 혈관생성을 제어하는 IL-8 및(또는) IL-8 수용체의 발현을 조절하기 위한 억제성 뉴클레오티드
인터류킨-8 (IL-8, 호중구 활성화 단백질-1 또는 NAP-1)은 염증성 반응, 조직 상해, 성장 조절 및 세포 부착과 광범위하게 연관된 관련 사이토카인의 C-X-C 케모카인 집단의 구성원이다. [Cerretti, D.P., et al., Molecular Characterization of Receptors for Human Interleukin-8, GRO/Melanoma Growth-Stimulatory Activity and Neutrophil Activating Peptide-2, Molecular Immunology, 30(4), 359-367 (1993); and Koch, A.E., et al., In situ expression of cytokines and cellular adhesion molecules in the skin of patients with systemic sclerosis, Pathobiology, 61(5-6), 239-46 (1993)]. IL-8은 또한 혈관생성에 강력한 자극적인 효과를 갖는 것으로 나타났다 (예를 들어, 문헌 [Koch, A.E., Interleukin-8 as a Macrophage-Derived Mediator of Angiogenesis, Science, 258, 1798-1800 (1992)] 참조).
IL-8은 단핵구/마크로파지, 진피 섬유아세포, 혈관 내피 세포, 각질형성세포 및 사구체 세포 (mesangeal)를 포함하는 다양한 정상 사람 체세포에 의해 제조되는 것으로 공지되어 있다. [Yasumoto, K., et al., Tumor Necrosis Factor Alpha and Interferon Gamma Synergistically Induce Interleukin 8 Production in a Human Gastric Cancer Cell Line Though Acting Concurrently on AP-1 and NF-kB-like Binding Sites of the Interleukin-8 Gene, J. of Biological Chemistry, 267(31), 22506-11(1992)]. 외관상, 상기 세포는 정상 성장 및 항상성의 조건 하에서가 아닌, 긴장시에만, IL-8을 제조한다. IL-8 제조를 유도하는 인자에는 염증, IL-1, TNF, LPS 및 트롬빈이 있다. IL-8은 또한 종양 세포에 의해 통상 분비되는 것으로 공지되어 있다. 성장에 대한 IL-8의 효과 때문에, IL-8이 흑색종 및 기타 암의 전이에 상당한 역할을 하는 것으로 추정된다.
IL-8은 세포막 IL-8 수용체에 대한 리간드이며, IL-8 및 IL-8 수용체 간의 상호작용이 IL-8 작용에 요구되는 것으로 생각된다. 지금까지 2종의 IL-8 수용체 유전자, 즉 IL-8 수용체 A형 및 B형이 확인되었다. 2종의 유전자 모두 소위 7회 막통과 도메인이라 불리는 G-단백질 커플링 수용체 집단에 속한다. 수용체 A는 IL-8에 의해 활성화되는 것으로 나타나며, 수용체 B는 IL-8 뿐만 아니라, 흑색종 성장 자극 활성 (MGSA)을 포함하는 C-X-C 집단에 속하는 다른 사이토카인에 의해 활성화되는 것으로 나타났다.
암 및 기타 종양 세포에 존재하는 IL-8 수용체 B의 역할 및 기능이 완전히 해명되지는 않는다. 그러나, IL-8R B의 활성화가 (1) 흑색종 및 종양형성성 섬유아세포의 성장 조절의 메카니즘에 관여하며; (2) 석면에 의한 폐 세포의 형질전환과 관련되며, (3) 흑색종의 전이 가능성과 관련된다는 증거가 있다.
다양한 종양 성장 인자에 반응성인 세포에 대한 IL-8의 성장 자극 효과가 주어지면, 생체 내 암의 IL-8 또는 IL-8 수용체의 발현을 조절하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이 유리하다. 특히, 폐암 및 흑색종이 각각 그 자신의 성장 인자를 제조하기 때문에 폐암 및 흑색종에 대해 효과적인 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이 유리하다.
폐암에는 2종 이상의 주요 유형, 즉 소세포 폐암 (SCLC) 및 비-소세포 폐암 (NSCLC)이 있다. SCLC는 대략 폐암의 1/4을 차지하며, 신경내분비 마커를 발현하며, 일반적으로 림프절, 뇌, 뼈, 폐 및 간으로 조기에 전이한다. NSCLC는 나머지 유형의 폐암의 대부분을 포함하며, 선종, 편평세포 암종, 및 대세포 암종이 있다. NSCLC는 상피유사 성장 인자 및 수용체를 특징으로 하며, 국소적으로 침입성이다.
정상 멜라닌 세포와 달리 흑색종 세포는 외인성 성장 인자 없이 증식할 수 있다. 이 독립성은 TGF-ANG., TGF-, 혈소판-유도 성장 인자 A 및 B 사슬, 기초 섬유아세포 성장 인자, IL-8, IL-6, IL-1, 과립구 마크로파지 콜로니 자극 인자, 및 MGSA를 포함하는 자가분비 성장 자극을 위한 사이토카인 및 성장 인자의 제조를 명백히 나타낸다. [Guo Y, et al., Inhibition of Human Melanoma Growth and Metastasis in Vivo by Anti-CD44 Monoclonal Antibody. Cancer Res., 54, 1561-1565 (1994)].
임의의 상기 질병으로 고통받는 환자를 위해, 상기 기재된 방법을 사용하여 관심 서열을 포함하도록 플라스미드를 제작한다. 관심 서열은 미국 특허 제5,849,903호에 기재된 바와 같이 단리된 핵산 분자이다. 성장, 전이 및(또는) 혈관생성을 제어하기 위해, 플라스미드는 플라스미드가 세포에 도입되어 억제성 뉴클레오티드를 생성하는 조건 하에 투여한다 (예, 흡입, 또는 고형 종양으로의 직접 투여). 억제성 뉴클레오티드는 상기 RNA 분자의 발현 조절 서열 또는 코딩 서열에 특이적으로 결합함으로써, IL-8 수용체의 발현을 선택적으로 조절하고, 발현과 관련된 병적 상태를 완화시킨다.
실시예 7
사이토메갈로바이러스 감염의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제
사이토메갈로바이러스 (CMV)는 자연 중에 편재하며, 자궁내 감염의 가장 일반적인 원인이다. 선천적 감염은 감염된 산모의 신생아에게 일반적이다. 일부 모집단의 경우, 어린이의 10%가 분만기 감염을 나타낸다. 적은 비율의 신생아에게서, 감염은 다수의 기관을 포함하는 악성이다. 세망내피 및 중추 신경계의 현저한 관련이 대표적이며, 감염은 정신 지체의 주요 원인이다. 면밀한 시험 결과, 출생전 심하게 감염된 성인의 50%가 신경정신의학적 질병 또는 난청을 나타낼 수 있음이 증명된다. 외부신경 기관이 통상 예비 만성 이환상태이지만, 바이러스는 수년동안 신장에서 검출될 수 있다.
상기 기재된 방법을 사용하여, 억제성 뉴클레오티드를 코딩하는 관심 서열을 포함하도록 플라스미드를 제작한다. 사이토메갈로바이러스 DNA 또는 RNA의 선택된 서열과 특이적으로 혼성화가능한 뉴클레오티드 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 미국 특허 제5,442,049호에 기재되어 있다. 플라스미드는 플라스미드가 세포에 도입되어 억제성 뉴클레오티드를 생성하는 조건 하에 투여한다. 억제성 뉴클레오티드는 상기 RNA 분자의 발현 조절 서열 또는 코딩 서열에 특이적으로 결합함으로써, CMV의 복제를 선택적으로 조절하고, CMV 감염과 관련된 병적 상태를 완화시킨다. 이 플라스미드는 CMV에 의한 질병의 심각도를 감소시키기 위해 예방학적으로 또는 치료학적으로 사용한다.
실시예 8
단순포진 바이러스 타입 1의 오픈 리딩 프레임 UL5, UL8, UL9, UL20, UL27, UL29, UL30, UL42, UL52 및 IE175 중 하나에 상응하는 유전자로부터 유도된 RNA 또는 DNA와 특이적으로 혼성화가능한 올리고뉴클레오티드
올리고뉴클레오티드는 단순포진 바이러스 타입 1 (HSV-1), 단순포진 바이러스 타입 2 (HSV-2), 사이토메갈로바이러스, 사람 헤르페스 바이러스 6, 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 또는 수두대상포진 바이러스 (VZV)종의 하나로부터의 DNA, 또는 더욱 바람직하게는 RNA와 특이적으로 혼성화가능하도록 고안된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 미국 특허 제5,514,577호에 개시된 바와 같은 제약학상 허용되는 담체 내의 제약 조성물로서 편리하며 바람직하게 소개되어 있다.
임의의 상기 감염으로 고통받는 환자를 위해, 상기 기재된 방법을 사용하여 관심 서열을 포함하도록 플라스미드를 제작한다. 관심 서열은 미국 특허 제5,514,577호에 기재된 바와 같은 단리된 핵산 분자이다. 플라스미드는 플라스미드가 세포에 도입되어 억제성 뉴클레오티드를 생성하는 조건 하에 투여한다(예, 흡입, 또는 고형 종양으로의 직접적 주사). 억제성 뉴클레오티드는 단순포진 바이러스 타입 1 (HSV-1), 단순포진 바이러스 타입 2 (HSV-2), 사이토메갈로바이러스, 사람 헤르페스 바이러스 6, 엡스타인 바 바이러스 (EBV) 또는 수두대상포진 바이러스 (VZV)종의 하나로부터의 RNA 분자의 발현 조절 서열 또는 코딩 서열에 특이적으로 결합함으로써, 바이러스 감염을 선택적으로 조절하고, 감염과 관련된 병적 상태를 완화시킨다.
실시예 9
원종양유전자, 특히 c-myb 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 항신생물제 및 면역억제제로서 상기 올리고뉴클레오티드의 용도
원종양유전자 c-myb는 조류골수아세포증 바이러스 형질전환 유전자 v-myb의 정상 세포 상동체이다. c-myb 유전자는 조혈세포내에서 주로 발현되는 핵 단백질을 코딩한다. 즉, 원종양유전자는 정상 비종양 세포의 생존을 위해 요구되는 단백질을 코딩한다. 유전자가 적절한 방법으로 변화되는 경우, 종양유전자가 될 가능성이 있다. 종양유전자는 그것의 세포 내에서의 발현이 정상의 종양 세포로의 형질전환에 일부 기능을 제공하는 유전자이다. 그 예는 단리되고, 클로닝되고, 서열화된 사람 c-myb 유전자이다 [Majello et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 9636-9640 (1986)].
플라스미드를 상기 기재된 방법을 사용하여 억제성 뉴클레오티드를 코딩하는 관심 서열을 포함하도록 제작한다. DNA 또는 RNA의 선택된 서열과 특이적으로 혼성화가능한 뉴클레오티드 염기의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 미국 특허 제5,098,890호에 기재되어 있다. 플라스미드를 플라스미드가 세포에 도입되고, 항신생물제 또는 면역억제제로서 작용하는 억제성 뉴클레오티드를 생성하도록 하는 조건 하에 환자에게 투여한다.
실시예 10
인터류킨-1 베타 자극 세포 내의 ICAM-1 유전자 발현에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드
ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1 발현의 억제제가 염증성 성분을 갖는 각종 염증성질병(들), 예컨대 천식, 류마티스성 관절염, 동종이식 거부반응, 염증성 장질환, 각종 피부질환 및 건선에 대한 활성을 갖는 소염제의 신규한 치료학적 부류를 제공할 것이 요망되었다. 또한, ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1의 억제제가 라이노바이러스 (rhinovirus) 감염에 인한 감기, AIDS, 카포시 육종 및 일부 암 및 이들의 전이의 치료에 또한 효과적일 수 있다. 현재까지, 세포 부착 분자 ELAM-1, VCAM-1 및 ICAM-1의 발현을 효과적으로 저해하는 어떠한 치료제도 공지되어 있지 않다. 동물 모델에서 ICAM-1에 대한 중화 단클론성 항체의 사용이, 확인되는 경우, 상기 억제제가 천식에 대한 치료학적 잇점을 갖는다는 증거를 제공한다 [Wegner et al., Science 1990, 247, 456-459, renal allografts; Cosimi et al., J. Immunol. 1990, 144, 4604-4612, and cardiac allografts; Isobe et al., Science 1992, 255, 1125-1127]. ICAM-1 분자의 가용성 형태를 사용하는 것이 또한 배양액 내의 세포의 라이노바이러스 감염을 예방하는데에 효과적이었다 [Marlin et al., 344 Nature 70-72 (1990)].
세포간 부착 분자에 영향을 주는 일반적인 약제에는 합성 펩티드, 단클론성 항체 및 부착 분자의 가용성 형태가 있다. 현재까지, VCAM-1 또는 ELAM-1과의 상호작용을 차단하는 합성 펩티드는 확인되지 않았다. 단클론성 항체가 ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1의 발현으로 인한 급성 염증 반응의 치료에 유용함을 증명할 수 있다. 그러나, 만성 치료의 경우, 숙주 동물이 단클론성 항체에 대한 항체를 발전시킴으로써 그 유용성을 제한한다. 또한, 단클론성 항체는 염증 부위에 접근하는데에 어려움이 있을 수 있는 큰 단백질이다. 세포 부착 분자의 가용성 형태는 그들의 제조 비용 및 낮은 결합 친화도 외에 단클론성 항체와 동일한 여러 제한으로 인해 불리하다. 따라서, 세포간 부착 분자를 효과적으로 억제하는 분자에 대한 요구가 오랫동안 있었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1의 효과를 차단하는데에 사용된 일반적인 약제의 많은 위험을 피한다.
PCT/US90/02357 (Hession et al.)에는 ELAM-1를 포함하는 내피 부착 분자 (ELAM) 및 VCAM-1 및 VCAM-1b를 코딩하는 DNA 서열이 개시되어 있다. (1) 백혈구가 내피 세포에 결합하는 것을 억제하기 위한 치료제로서 사용될 수 있는 이들 분자에 대해 반응성인 단클론성 항체 제제의 제조; (2) 백혈구 상의 ELAM 리간드에 결합하고, 또한 내피 세포 상의 ELAM에 결합하여 백혈구가 내피 세포에 결합하는 것을 억제하기 위한 ELAM 펩티드의 제조; (3) 염증을 검출하기 위한 ELAMS에 결합하는 분자 (예컨대, 항-ELAM 항체, 또는 리간드 또는 그의 단편과 같은 마커)의 사용; (4) 안티센스 핵산으로 mRNA를 마스킹함으로써 또는 리보자임으로 mRNA를 절단함으로써 특이 mRNA의 번역을 차단하기 위해 안티센스 핵산 및 리보자임을 사용하여 번역 수준에서 ELAM 또는 ELAM 리간드 발현에 개입하는 핵산 분자를 제조하기 위한 ELAM 및 ELAM 리간드 DNA 서열의 사용을 포함하는 상기 DNA 서열에 대한 다수의 용도가 제공된다.
상기 기재된 방법을 사용하여, ICAM-1, VCAM-1 또는 ELAM-1에 대한 억제성 뉴클레오티드를 코딩하는 관심 서열을 포함하도록 플라스미드를 제작한다. ICAM-1, VCAM-1 또는 ELAM-1 DNA 또는 RNA의 선택된 서열과 특이적으로 혼성화가능한 뉴클레오티드 염기의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 미국 특허 제5,843,738호에기재되어 있다. 플라스미드를 플라스미드가 세포에 도입되고 억제성 뉴클레오티드를 생성하는 조건 하에 환자에게 투여한다. 억제성 뉴클레오티드는 상기 RNA 분자의 발현 조절 서열 또는 코딩 서열에 특이적으로 결합함으로써, ICAM-1, VCAM-1 또는 ELAM-1의 발현을 선택적으로 조절하고, ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1 발현과 관련된 병적 상태를 완화시킨다. 상기 플라스미드는 ICAM-1, VCAM-1 및 ELAM-1으로 인한 염증의 심각도를 감소시키기 위해 예방적으로 또는 치료적으로 사용한다.
실시예 11
표적 분자에 특이적으로 결합하는 단백질 결합 올리고뉴클레오티드(앱타머)
생체분자 표적화 및 앱타머 개발을 이용한 합리적인 약물 고안 분야를 올리고뉴클레오티드를 특이 단백질에 결합시켜 그 기능을 방해하도록 이용한다. 미국 특허 제5,840,867호에 생체분자 표적, 예컨대 일반적으로 단백질, 특히 트롬빈에 대한 앱타머가 기재되어 있다. 개시된 신규 화합물 및 방법을 생물공학적 진단학 및 치료학에서 광범위하게 응용할 수 있다.
단백질 및 기타 분자의 검출 및 단리의 종래 방법은 상기 물질들을 특이적으로 결합하는 항체 등을 사용하였다. 그러나, 최근 일반적으로 핵산에 결합하는 비-올리고뉴클레오티드 표적에 대해 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드의 새로운 고안이 기재되어 있다 (문헌 [Blackwell, T.K., et al., Science (1990) 250: 1104-1110; Blackwell, T.K., et al., Science (1990) 250: 1149-1152; Tuerk, C., and Gold, L., Science (1990) 249: 505-510; Joyce, G.F., Gene (1989) 82:83-87] 참조). 상기 올리고뉴클레오티드를 본 명세서에서 "앱타머"라 지칭한다. 터크 및골드(Tuerk and Gold)의 문헌에는 "지수적 강화에 의한 리간드의 계통적 진화"라고 지칭된 방법의 사용이 기재되어 있다. 이 방법에서, 특정 위치에서 완전히 임의추출된 RNA의 풀(pool)을 니트로셀룰로스 필터 상에 고정되어 있는 목적 핵산-결합 단백질에 의한 결합을 위해 선택한다. 이어서, 결합된 RNA를 회수하고, 연속 시험관 내 전사에 적격인 이중가닥 DNA로서 증폭한다. 이어서, 새로이 전사된 RNA를 상기 절차를 통해 재순환하여 동족 단백질에 의해 결합되는 컨센서스 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 풍부하게 한다. 이와 같이 수득된 올리고뉴클레오티드는 이어서, 추가 연구를 위해 서열화될 수 있다. 터크 및 골드는 이 절차를 T4 DNA 중합효소의 RNA 결합 영역에 의해 결합된 RNA 올리고뉴클레오티드를 확인하는데에 적용하였다.
RNA 또는 DNA에 정상적으로 결합하지 않는 생체분자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드의 확인은 크기, 구조 및 조성이 매우 광범위한 다수의 생체분자를 증명하였다. 이들 분자에는 (1) 혈전 형성의 과정에서 피브리노겐을 피브린으로 전환시키는 다기능 조절 단백질인 트롬빈; (2) 혈압 조절 및 저혈압과 연관되어 있는 노나펩티드 키닌인 브래디키닌 (bradykinin); (3) 호르몬 활성을 나타내는 프로스타글란딘 또는 지방산 유도체인 PGF2.알파가 있다. 또한, 자연 생물학적 작용이 주로 세포외에서 일어나는 생체분자와 올리고뉴클레오티드의 상호작용이 입증되었다,
플라스미드를 상기 기재된 방법을 사용하여 트롬빈에 대한 앱타머를 코딩하는 관심 서열을 포함하도록 제작한다. 트롬빈에 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 염기의 서열을 갖는 앱타머가 미국 특허 제5,840,867호에 기재되어 있다. 플라스미드를 플라스미드가 세포에 도입되고 앱타머를 생성하는 조건 하에 환자에게 투여한다. 이와는 달리, 세포를 환자로부터 제거하고, 플라스미드를 세포에 트랜스펙션하고, 이어서 세포가 환자에게 되돌아가도록 생체 외 투여를 수행한다. 앱타머는 트롬빈에 특이적으로 결합함으로써, 트롬빈의 생물학적 활성을 선택적으로 조절하고, 트롬빈 존재와 관련된 병적 상태를 완화시킨다. 이 플라스미드는 예방적으로 또는 치료적으로 사용된다.
본 명세서에 설명된 도면 및 특정 예를 참고로 기재하였지만, 당 분야의 숙련가들은 특정 요소들이 그들이 목적하는 개별 결과를 성취하기 위해 작용하는 방법을 변경시키지 않고, 본 명세서에서 설명된 상기 요소들을 임의로 변경할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 카세트는 3가지 주요 성분, 즉 관심 서열 및 프라이머 결합 부위, 및 역전사효소 유전자를 포함하는 유전 물질로 이루어지는 것으로 기재되며, 이들 성분들은 각각 본 명세서에 기재된 적절한 프로모터와 함께 제공된다. 당 분야의 숙련가들은 예를 들면, 카세트의 역전사효소 유전자로서의 용도가 기재된 MoMuLV 역전사효소 유전자가 다른 역전사효소 유전자로 대체될 수 있으며, CMV 프로모터 외의 프로모터가 유리하게 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않는 상기 모든 변경 및 변형은 하기 비제한적인 청구의 범위의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (52)

  1. 관심 서열을 포함하는 핵산 제작물; 및 관심 서열에 대하여 3' 쪽에 위치하는 역전사효소에 대한 프라이머 결합 부위를 포함하는, 세포내로의 전달용 유전 물질 (genetic element) 세트.
  2. 제1항에 있어서, 역전사효소 유전자를 추가로 포함하는 유전 물질 세트.
  3. 제2항에 있어서, 역전사효소 유전자가 관심 서열 및 프라이머 결합 부위와 다시스트론 (polycistron)으로 전사되는 유전 물질 세트.
  4. 제2 또는 3항에 있어서, 역전사효소 유전자가 관심 서열 및 프라이머 결합 부위와 동일한 핵산 제작물 상에 위치하는 유전 물질 세트.
  5. 제2 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 역전사효소 유전자가 상기 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위에 대하여 5' 쪽에 위치하는 유전 물질 세트.
  6. 제2 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 역전사효소 유전자가 역전사효소/RNAse H 다단백질 (polyprotein)을 코딩하는 유전 물질 세트.
  7. 제6항에 있어서, 역전사효소/RNAse H 다단백질을 코딩하는 유전자가 몰로니 마우스 백혈병 바이러스, 사람 면역결핍 바이러스 또는 원숭이 면역결핍 바이러스로부터 얻어지는 유전 물질 세트.
  8. 제2 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 역전사효소 유전자에 의해 코딩되는 역전사효소에 대해 특이적인 유전 물질 세트.
  9. 제1항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 내생성 역전사효소에 대해 특이적인 유전 물질 세트.
  10. 제1 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 전달 RNA (tRNA)에 상보적인 유전 물질 세트.
  11. 제1 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 서열 및(또는) 상기 역전사효소 유전자 각각에 대한 프로모터, 및 임의로 인핸서 (enhancer)를 추가로 포함하는 유전 물질 세트.
  12. 제11항에 있어서, 프로모터 및(또는) 인핸서가 진핵세포 프로모터 및(또는) 인핸서인 유전 물질 세트.
  13. 제11 또는 12항에 있어서, 프로모터가 구성적, 유도성, 광범위한 스펙트럼 또는 조직 특이적 프로모터인 유전 물질 세트.
  14. 제1 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위에 대하여 3' 쪽에 위치하는 폴리아데닐화 꼬리 서열을 추가로 포함하는 유전 물질 세트.
  15. 제1 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 서열이 안티센스 서열인 유전 물질 세트.
  16. 제1 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 서열이 앱타머(aptamer)인 유전 물질 세트.
  17. 제1 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 제작물이 DNA인 유전 물질 세트.
  18. 제1 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 벡터에 혼입되는 유전 물질 세트.
  19. 제2 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위가 제1 벡터에 혼입되고, 역전사효소 유전자가 제2 벡터에 혼입되는 유전 물질 세트.
  20. 제2 내지 17항 중 어느 한 항에 있어서, 역전사효소 유전자, 관심 서열 및 프라이머 결합 부위가 단일 벡터에 혼입되는 유전 물질 세트.
  21. 제20항에 있어서, 역전사효소 유전자가 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위에 대하여 5' 쪽에 위치하는 유전 물질 세트.
  22. 1개 이상의 세포내 전달용 벡터에 혼입되는
    (a) 관심 서열 및 3' 프라이머 결합 부위; 및
    (b) 역전사효소 유전자를 포함하는, 세포내로의 전달용으로 적합한 유전 물질 세트.
  23. (a) 관심 서열의 삽입 부위, 및 삽입 부위에 대하여 3' 쪽에 위치한 프라이머 결합 부위; 및
    (b) 역전사효소 유전자를 포함하는 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 역전사효소 유전자가 삽입 부위 및 3' 프라이머 결합 부위에 대하여 5' 쪽에 위치하는 벡터.
  25. 관심 서열의 삽입 부위 및 3' 프라이머 결합 부위를 포함하는 제1 벡터, 및 역전사효소 유전자를 포함하는 제2 벡터를 포함하는 벡터 시스템.
  26. 제23 내지 25항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터가 플라스미드 또는 변형 바이러스 제작물인 벡터 또는 벡터 시스템.
  27. 제23 내지 26항 중 어느 한 항에 있어서, 역전사효소 유전자가 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되는 벡터 또는 벡터 시스템.
  28. 제23 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 벡터 시스템에 의해 안정하게 형질전환되거나 트랜스펙션되는 숙주 세포.
  29. 제28항에 있어서, 진핵세포인 숙주 세포.
  30. 제23 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 벡터 시스템, 및 삽입 부위에 대한 제한 엔도뉴클레아제를 포함하는, 단일가닥 핵산 서열 제조용 키트.
  31. 제23 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 벡터 시스템, 벡터/벡터 시스템의 용기, 및 벡터/벡터 시스템의 사용에 대한 지시사항을 포함하는, 단일가닥핵산 서열 제조용 키트.
  32. 관심 서열, 관심 서열에 대하여 3' 쪽에 위치한 프라이머 결합 부위를 포함하는 핵산 제작물을 표적 세포내로 도입하는 단계, 핵산 제작물을 mRNA로 전사시키는 단계, 및 mRNA를 cDNA로 역전사시키는 단계를 포함하는, 관심 단일가닥 핵산 서열의 생체 내 또는 시험관 내 제조 방법.
  33. 제32항에 있어서, mRNA의 역전사에 의해 생성된 mRNA/cDNA 헤테로이중나선 (heteroduplex)으로부터 mRNA를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제32 또는 33항에 있어서, 역전사가 표적 세포내로 도입된 역전사효소 유전자에 의해 발현되는 역전사효소에 의해 수행되는 방법.
  35. 제32 또는 33항에 있어서, 역전사가 표적 세포에서 내생성인 역전사효소에 의해 수행되는 방법.
  36. 제33 내지 35항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 전사물이 RNAse H에 의해 mRNA/cDNA 헤테로이중나선으로부터 제거되는 방법.
  37. 제36항에 있어서, RNAse H가 표적 세포내로 도입된 역전사효소/RNAse H 다단백질을 코딩하는 유전자로부터 발현되는 방법.
  38. 제32 내지 37항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 전사물, mRNA/cDNA 헤테로이중나선 및(또는) 단일가닥 cDNA를 표적 세포로부터 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  39. 제32 내지 38항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 제조되는 단일가닥 cDNA 전사물.
  40. 제32 내지 38항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 제조되는 억제성 핵산 분자.
  41. 제40항에 있어서, 안티센스 서열 또는 앱타머인 억제성 핵산 분자.
  42. 제32 내지 38항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 제조되는 mRNA 전사물.
  43. 제32 내지 38항 중 어느 한 항의 방법에 의해서 제조되는 헤테로이중나선 분자.
  44. 제약학상 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 제1 내지 22항 중 어느 한 항에 따른 유전 물질 세트를 포함하는 제약 조성물.
  45. 제약학상 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 제23 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 벡터 시스템을 포함하는 제약 조성물.
  46. 제약학상 허용되는 보조제, 희석제 또는 담체와 함께 제28 또는 29항에 따른 숙주 세포를 포함하는 제약 조성물.
  47. 치료 요법, 특히 억제성 핵산 분자를 표적 세포로 전달하는데 사용하기 위한 제1 내지 22항 중 어느 한 항에 따른 유전 물질 세트.
  48. 치료 요법, 특히 억제성 핵산 분자를 표적 세포로 전달하는데 사용하기 위한 제23 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 벡터 시스템.
  49. 치료 요법, 특히 억제성 핵산 분자를 표적 세포로 전달하는데 사용하기 위한 제28 또는 29항에 따른 숙주 세포.
  50. 유전자 발현의 조절에 의한 병적 상태 완화, 특히 억제성 핵산 분자의 표적 세포로의 전달에 의한 병적 상태 완화용 의약의 제조를 위한 제1 내지 22항 중 어느 한 항에 따른 유전 물질 세트의 용도.
  51. 유전자 발현의 조절에 의한 병적 상태 완화, 특히 억제성 핵산 분자의 표적 세포로의 전달에 의한 병적 상태 완화용 의약의 제조를 위한 제23 내지 27항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 벡터 시스템의 용도.
  52. 유전자 발현의 조절에 의한 병적 상태 완화, 특히 억제성 핵산 분자의 표적 세포로의 전달에 의한 병적 상태 완화용 의약의 제조를 위한 제28 또는 29항에 따른 숙주 세포의 용도.
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