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KR20020028547A - 경구용 장티푸스백신 장용코팅과립조성물 및 그의 제조방법 - Google Patents

경구용 장티푸스백신 장용코팅과립조성물 및 그의 제조방법 Download PDF

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KR20020028547A
KR20020028547A KR1020000059599A KR20000059599A KR20020028547A KR 20020028547 A KR20020028547 A KR 20020028547A KR 1020000059599 A KR1020000059599 A KR 1020000059599A KR 20000059599 A KR20000059599 A KR 20000059599A KR 20020028547 A KR20020028547 A KR 20020028547A
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KR
South Korea
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typhoid
beads
granules
sodium alginate
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KR1020000059599A
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Inventor
김홍진
박동우
김희준
김용석
Original Assignee
우재영
일양약품주식회사
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Publication date
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Abstract

본 발명은 약독화된 장티푸스균의 변이주 (Salmonella typhiTy21a)인 ATCC-33459 를 배양후 동결건조시 안정화제를 사용함으로써 생존율을 월등히 높였으며, 위산에 의한 사멸을 막기위해 새로운 방법으로 장용코팅을 하여 장내도달율을 극대화한 과립상의 경구용 장티푸스백신 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

Description

경구용 장티푸스백신 장용코팅과립조성물 및 그의 제조방법{Composition of enteric-coated granules of oral typhoid vaccine and process for preparing the same}
장내세균 감염의 일종인 장티푸스는 주요한 법정전염병으로서 장티푸스균에 의해 설사와 발열을 일으킴으로서 후진국에서는 매년 10억 인구 이상에서 발병하고 그 중 수 백만명 이상이 사망하는 질병이다. 따라서, 지난 수 십년간 이러한 질병에 대한 백신개발이 커다란 발전을 하여왔는데, 크게 비경구용 사균백신과 경구용 생균백신으로 분류된다. 사균백신은 병원균이 사멸된 상태이므로 생균백신에 비해 항체생성효과가 훨씬 뒤떨어지며, 주사로 적용해야하는 어려움 때문에 점차 경구용 생균백신의 사용이 늘어나고 있다. 특히, 장티푸스균은 환자의 대소변에 오염된 물 또는 음식물을 통해 경구로 소화기계에 전염되어 발병하기 때문에 사균백신을 주사에 의하여 혈중에서 항체가 생성되도록 하는 것 보다는 생균백신을 경구로 투여하므로써 소장에 있는 점막조직중 임파성조직의 하나인 Peyer's patch부위에 생성된 항체가 집중되도록 하기 때문에 백신의 효과가 경구투여 생균백신이 월등히 우수하다. 그러나, 경구용 생균백신을 투여시 가장 큰 문제점은 위장을 통과할 때 위산에의하여 대부분 사멸하기 때문에 장내도달율이 낮아 백신의 효과를 거의 나타내지 못한다는 것이다. 따라서, 이러한 문제점을 해결하기 위해 종래의 방법으로는 위산을 중화하기위해 중탄산나트륨(NaHCO3)을 먼저 투여한 후 백신을 복용하는 방법과 백신을 캅셀에 충전한 후 캅셀 표면을 장용코팅하는 방법이 사용되고 있으나, 위산의 중탄산나트륨에 의한 중화법은 복용방법이 불편할 뿐아니라 복용자나 복용시점에 따라 위산의 중화정도나 중화시간이 생균백신에 영향을 주지 않을 정도로 일정한 효과를 나타내지 못한다는 단점이 있으며, 장용코팅 캅셀화 방법은 캅셀을 장용성 고분자물질로 코팅시 높은 온도에 장시간 노출됨에 따른 생균의 사멸과 열풍에 의해 캅셀자체가 함유하고 있는 약 12%의 수분이 건조됨에 따라 캅셀이 부서지는 경향이 높고 보존시 안정성이 단축되며 복용시 위내에서 위의 운동에 의해 캅셀이 부서지거나 캅셀 상, 하부의 결합부위에서 코팅시 미세공이 다빈도로 발생하여 위장통과시 이 미세공으로 위산이 침투됨으로써 생균백신의 장내도달율이 낮다는 단점이 있다.
본 발명에서는 종래의 위산에 대한 생균백신의 보호방법에서 오는 단점을 보완하기 위하여 동결건조시 새로운 안정화제 첨가와 새로운 장용코팅과립 제조방법을 사용하여 본 발명을 완성하였다.
경구용 장티푸스 생균백신으로 사용되는 Ty21a는 야생균과는 다르게 Vi polysaccharide가 부족하며 UDP-glucose-epimerase가 부족한 변이주로 약독화되어 환경의 변화에 대한 내성이 약하므로, 배양한 후 원심분리하고 균체의 동결건조시급속한 냉동으로 인하여 사멸이 심하게 일어나므로 냉해를 입지 않도록 안정화제의 선정이 중요하다. 동결건조시 안정화제의 사용은 원래의 구조를 유지하도록 해서 활성상실을 감소시키고 원상 복구시 활성 회복도를 증가시키므로 본 발명에서는 Ty21a를 배양한 후 원심분리하여 얻은 균체를 1차 안정화제로서 8% 백당용액에 현탁시키고, 2차 안정화제로서 다가알콜류를 넣고 여기에 다시 장용성 코팅물질인 알긴산나트륨을 추가하여 균등히 녹인 후, 다가양이온용액에 점적 또는 스프레이하여 미세 과립 또는 비드를 제조함으로써 동결건조시 안정화하였다. 이는 다가알콜당류와 균체 단백질 사이의 수소결합이 탈수과정에서 단백질사이의 거리를 증가시켜서 세포간 응집에 의한 용균(lysis) 방지역할을 하는 것으로 보인다.
장용코팅을 실온에서 짧은 시간내에 완료하는 새로운 장용코팅 기법을 활용함으로써 장용코팅 제조 공정중 장티푸스균(Ty21a)이 거의 사멸하지 않는, 직접 균을 장용코팅하는 새로운 제조방법을 확립하였다.
보다 상세히 설명하면 경구용 장티푸스 생균백신 제조용 균주로는 장티푸스균의 약독화된 변이주인Salmonella typhiTy21a로서 국제기관에 기탁되어 있는 ATCC-33459 균주를 사용하여 단일 콜로니를 뇌하수침출액 (Brain Heart Infusion : BHI)배지 100㎖에 접종하고 30℃에서 18시간 진탕배양한 것을 6000g에서 10분간 원심분리하여 균체를 모으고, 1차 안정화제(백당 8%용액) 50㎖에 현탁시킨다. 이 현탁액 0.1㎖를 앰플에 넣고 동결건조를 하여 진공 밀봉하고 종균으로 사용한다. 종균 앰플은 냉장고에 보존하면서 필요시 개봉하여 생균백신 생산용 종균으로 사용한다. 종균 앰플을 개봉하여 접종용배지 (BHI)에 접종하여 30℃에서 18시간 진탕배양하고 배양액 일정량을 생산량에 따라 생산용배지에 접종하여 대량 배양한 다음, 6000g로 10분간 원심분리하여 균체를 모으고 1차 안정화제 (백당 8%용액)에 현탁시킨 후, 이 장티푸스균 현탁액을 기준으로 백당과 만니톨을 각각 0.1∼2.0M의 농도로 2차 안정화제로서 추가하고 알긴산나트륨을 넣어 0.1∼5.0(w/v)%가 되도록 하여 녹인 후, 장티푸스균 현탁액과 동일한 부피의, 백당과 만니톨을 각각 0.1∼2.0M의 농도로 포함하는 0.1∼2.0M의 염화칼슘(CaCl2)용액 (pH7.0)에 점적 또는 스프레이하여 나트륨이온(Na+)과 칼슘이온(Ca2+)의 이온교환이 일어남으로서 물에 난용성인 알긴산칼슘막 또는 코팅이 최외각에 형성된다. 경화시간 즉, 염화칼슘 용액중에 담가두는 시간은 5∼30분이며, 생성된 막은 인공위액에서 2시간이상 안정하고, 인공장액에서 서서히 붕해되어 4시간이내에 완전히 붕해되는 장용성 코팅이다. 생성된 비드 또는 과립을 여과하여 얻고 멸균정제수로 세척한 후, 0∼4℃에서 1∼2시간동안 저온 적응시키고 동결건조용 팬에 얇게 펴고 -20∼-70℃에서 1∼4시간동안 동결시킨 다음, 동결건조기에서 12∼24시간동안 진공으로 건조한다. 건조가 완료된 후 상법에 따라 생존한 균수를 측정하여 1g당 2×109개가 되는지 확인한 후 일정량씩 캅셀이나 알루미늄호일에 충전하여 최종제품으로 한다.
상기의 1차 안정화제로서는 백당 8%용액 대신에 유당 8%용액을 사용할수 있다.
상기의 2차 안정화제로서는 백당과 만니톨 대신에 포도당(dextrose),과당(fructose), 글리세린, 유당, 갈락토스, 맥아당(maltose), 솔비톨, 자일리톨(xylitol), 트레할로스(trehalose), 아도니톨(adonitol)등을 단독으로 또는 2가지 이상 혼합하여 사용할 수 있으며, 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1∼2.0M의 농도로 사용되며 바람직하게는 0.2∼0.5M의 농도로 사용하는 것이다.
상기의 알긴산나트륨은 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1∼5.0(w/v)%의 농도로 사용되며 바람직하게는 1.0∼1.5(w/v)%로 사용하는 것이다.
상기의 장티푸스균 현탁액에는 비드 또는 과립의 붕해시간등을 조절하여 속방형이거나 서방형이 될수있도록 첨가제로 천연 또는 합성 고분자물질로서 아라비아검(Arabic gum), 로우커스트검(Locust bean gum), 잔탄검(Xanthan gum), 젤란검(Gellan gum), 구아검(Guar gum), 트라가칸트검(Tragacanth gum), 한천, 펙틴, 카라기난(Carrageenan), 젤라틴, 키틴 또는 키토산, 카보폴류, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 하이드록시 에칠셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴록사머류, 폴리비닐알코올류등을 단독으로 또는 2가지 이상 혼합하여 사용할 수 있으며, 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1∼20.0(w/v)%로 사용되며 바람직하게는 0.5∼2.0(w/v)%로 사용하는 것이다.
상기의 장티푸스균 현탁액에는 비드 또는 과립의 모양 또는 구조를 유지하기 위해 벤토나이트, 탄산칼슘, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 미결정셀룰로오스, 콜로이드성이산화규소, 크로스카멜로오스나트륨, 크로스포비돈류, 포비돈류, 사이클로덱스트린, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 산화마그네슘, 스테아린산 마그네슘, 폴리에칠렌글리콜류, 전분글리콘산나트륨, 전분, 탈크, 산화티탄등을 구조성물질로서 단독으로 또는 2가지 이상 혼합하여 사용할수 있으며, 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1∼20.0(w/v)%로 사용하며 바람직하게는 1.0∼5.0(w/v)%로 사용하는 것이다.
상기의 장티푸스균 현탁액에는 동결건조시 산화반응에 의해 장티푸스균이 사멸될 가능성이 있으므로, 항산화제로서 초산토코페롤, 베타카로틴, 아스코르빈산 및 그의 염, 구연산(Citric acid)등을 단독으로 또는 2가지 이상 혼합하여 사용할수 있으며, 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.01∼10.0(w/v)%로 사용되며 바람직하게는 0.1∼1.0(w/v)%로 사용하는 것이다.
상기의 염화칼슘용액 대신에 젖산칼슘(Calcium lactate), 염화마그네슘(MgCl2), 염화스트론튬(SrCl2), 염화바륨(BaCl2), 염화알루미늄(AlCl3)등의 다가 양이온용액을 결합액으로 사용할 수 있으며, 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1∼2.0M의 농도로 사용되며 바람직하게는 0.2∼0.4M의 농도로 사용하는 것이다.
상기의 다가 양이온용액에는 장티푸스균 현탁액에 사용되는 2차 안정화제로 쓰이는 물질들을 동일한 농도로 첨가할 수 있다.
상기의 다가 양이온용액의 pH는 구연산 (citric acid), 염산, 주석산(tartaric acid), 인산 (phosphoric acid), 말레인산 (maleic acid)등으로 pH 7.0±0.1로 맞추며 일반여과지 또는 0.45㎛필터로 여과할수 있다.
[실시예]
본 발명의 내용이 실시예를 통하여 보다 상세히 설명되나, 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재될 뿐이며, 본 발명의 보호범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1>
약독화된 장티푸스 변이주(Salmonella typhiTy21a) 인 ATCC-33459종균을 100㎖의 BHI배지에 접종하고 30℃에서 18시간 진탕배양한 후, 본 배양액 량의 2% 정도를 접종하고 본 배양을 실시하여 배양액의 종말점은 610nm에서 OD값이 2.5∼3.0일때로 하였다. (생균수는 5.2×1010/㎖이었다.) 배양액을 6000g로 10분간 원심분리하여 균체를 모으고 백당 8%용액에 현탁한 후, 이 현탁액을 기준으로 백당과 만니톨을 각각 0.5M이 되도록 첨가하고, 알긴산나트륨을 넣어 1.2 (w/v)%의 알긴산나트륨 수용액이 되도록 녹인후 장티푸스균 현탁액과 동일한 부피의, 백당과 만니톨을 각각 0.5M 함유하는 0.4M 염화칼슘용액 (pH7.0)에 점적 또는 스프레이하여 비드 또는 과립을 제조하고 여과한 후, 멸균정제수로 세척하고 0∼4℃에서 1시간 적응시키고, 동결건조용 팬에 고르게 얇게 펴고 -20℃에서 4시간 동결시킨후 24시간동안 동결건조하여 장용코팅된 미세과립 또는 비드를 제조한다. 실시예 1의 조성은 다음과 같다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
백 당 5.1g (0.5M)
만 니 톨 2.7g (0.5M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 백당 5.1g, 만니톨 2.7g 포함)
<실시예 2>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
백 당 5.1g (0.5M)
만 니 톨 2.7g (0.5M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
아라비아 검 0.6g (2.0%)
염화칼슘(0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 백당 5.1g, 만니톨 2.7g 포함)
<실시예 3>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
백 당 5.1g (0.5M)
만 니 톨 2.7g (0.5M)
알긴산나트륨 0.42g (1.4%)
아라비아 검 0.3g (1.0%)
건조비타민E 50%분말 0.3g (1.0%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 백당 5.1g, 만니톨 2.7g 포함)
<실시예 4>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
백 당 5.1g (0.5M)
솔 비 톨 2.7g (0.5M)
알긴산나트륨 0.42g (1.4%)
아라비아 검 0.6g (2.0%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 백당 5.1g, 솔비톨 2.7g 포함)
<실시예 5>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
트레할로스 (trehalose) 5.7g (0.5M)
글 리 세 린 1.4g (0.5M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
탈 크 0.3g (1.0%)
미결정셀룰로오스 0.3g (1.0%)
젖산칼슘 (0.2M) 1.30g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 트레할로스 5.1g, 글리세린 2.7g 포함)
<실시예 6>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
아도니톨 (adonitol) 2.3g (0.5M)
유 당 5.1g (0.5M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
옥수수 전분 0.6g (2.0%)
아스코르빈산 30㎎ (0.1%)
젖산칼슘 (0.2M) 1.30g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 아도니톨 2.3g, 유당 5.1g 포함)
<실시예 7>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
글 리 세 린 0.83g (0.3M)
자 일 리 톨 1.37g (0.3M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
잔탄 검(Xanthan gum) 0.15g (0.5%)
미결정셀룰로오스 0.6g (2.0%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 글리세린 0.83g, 자일리톨 1.37g 포함)
<실시예 8>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
백 당 5.1g (0.5M)
만 니 톨 2.7g (0.5M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
한 천 0.15g (0.5%)
콜로이드성 이산화규소(Aerosil) 0.3g (1.0%)
베타카로틴 30㎎ (0.1%)
젖산칼슘 (0.2M) 1.30g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 백당 5.1g, 만니톨 2.7g 포함)
<실시예 9>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
트레할로스 (trehalose) 5.7g (0.5M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
한 천 0.15g (0.5%)
산 화 티 탄 0.3g (1.0%)
구 연 산 (citric acid) 30㎎ (0.1%)
젖산칼슘 (0.2M) 1.30g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 트레할로스 5.7g 포함)
<실시예 10>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
솔 비 톨 1.6g (0.3M)
자일리톨 1.4g (0.3M)
알긴산나트륨 0.30g (1.0%)
펙 틴 0.15g (0.5%)
스테아린산마그네슘 0.6g (2.0%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 솔비톨 1.6g, 자일리톨 1.4g포함)
<실시예 11>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
백 당 5.1g (0.5M)
글리세린 0.83g (0.3M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
펙 틴 0.15g (0.5%)
인산일수소칼슘 0.3g (1.0%)
아스코르빈산 나트륨 30㎎ (0.1%)
젖산칼슘 (0.2M) 1.30g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 백당 5.1g, 글리세린 0.83g포함)
<실시예 12>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
만 니 톨 2.7g (0.5M)
아도니톨 (adonitol) 2.3g (0.5M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
펙 틴 0.30g (1.0%)
미결정셀룰로오스 0.6g (2.0%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 만니톨 2.7g, 아도니톨2.3g포함)
<실시예 13>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
트레할로스 (trehalose) 3.4g (0.3M)
유 당 3.1g (0.3M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
젤 라 틴 0.15g (0.5%)
탈 크 0.3g (1.0%)
초산토코페롤 50%분말 0.3g (1.0%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 트레할로스 3.4g, 유 당 3.1g포함)
<실시예 14>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
백 당 5.1g (0.5M)
만 니 톨 2.7g (0.5M)
알긴산나트륨 0.36g (1.2%)
젤 라 틴 0.15g (0.5%)
저치환도히드록시프로필셀룰로오스 0.6g (2.0%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 백당5.1g, 만니톨 2.7g포함)
<실시예 15>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
글리세린 0.83g (0.3M)
솔 비 톨 1.6g (0.3M)
알긴산 나트륨 0.36g (1.2%)
히드록시프로필셀룰로오스 0.6g (2.0%)
산 화 티 탄 0.3g (1.0%)
젖산칼슘 (0.2M) 1.30g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 글리세린 0.83g, 솔비톨 1.6g포함)
<실시예 16>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
트레할로스 (trehalose) 3.4g (0.3M)
아도니톨 (adonitol) 2.3g (0.5M)
알긴산 나트륨 0.36g (1.2%)
히드록시프로필셀룰로오스(HPC) 0.3g (1.0%)
폴리에칠렌글리콜 6000 0.6g (2.0%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정.트레할로스 3.4g, 아도니톨 2.3g 포함)
<실시예 17>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
자일리톨 2.3g (0.5M)
알긴산 나트륨 0.36g (1.2%)
히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 0.3g (1.0%)
벤토나이트 0.3g (1.0%)
탄 산 칼 슘 0.3g (1.0%)
베타카로틴 30㎎ (0.1%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 자일리톨 2.3g 포함)
<실시예 18>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
백 당 5.1g (0.5M)
글리세린 1.4g (0.5M)
알긴산 나트륨 0.42g (1.4%)
히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC) 0.15g (0.5%)
미결정셀룰로오스 0.6g (2.0%)
젖산칼슘 (0.2M) 1.30g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 백당5.1g, 글리세린1.4g포함)
<실시예 19>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스 현탁액 30㎖ (백당 8%용액)
글리세린 1.4g (0.5M)
트레할로스 (trehalose) 3.4g (0.3M)
알긴산 나트륨 0.36g (1.2%)
폴록사머 (poloxamer 188) 0.15g (0.5%)
옥수수 전분 0.6g (2.0%)
아스코르빈산 30㎎ (0.1%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 글리세린 1.4g, 트레할로스 3.4g 포함)
<실시예 20>
다음과 같은 조성으로 실시예 1에 기술된 바와 동일한 방식으로 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립을 제조하였다.
장티푸스균 현탁액 30㎖ (유당 8%용액)
아도니톨 (adonitol) 2.3g (0.5M)
유 당 3.1g (0.3M)
알긴산 나트륨 0.36g (1.2%)
폴록사머 (poloxamer 188) 0.15g (0.5%)
탈 크 0.6g (2.0%)
염화칼슘 (0.4M) 1.33g/멸균정제수 30㎖ (인산으로 pH 7.0으로 조정. 아도니톨 2.3g, 유 당 3.1g 포함)
실험예 1 (생존율시험)
상기의 실시예 1 내지 20의 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립에 대하여 생존율을 측정하였다. 즉, 대한약전 일반시험법중 용출시험법의 용출시험장치 1을 이용하여 pH 3.0의 인공위액에서 비드 또는 과립을 30분동안 300rpm으로 교반한 후, 인공장액 (pH 6.8 인산완충액)으로 옮겨 용출시험장치 2로 2시간동안 500rpm으로 교반한 후, 이 용출액 적량을 취하여 생균수를 측정한다 (A). 따로 인공장액에서 용출시험장치 2로 2시간동안 500rpm으로 교반한 후, 이 용출액 적량을 취하여생균수를 측정한다 (B).
생존율 (%) = A / B ×100
생존율시험의 결과는 하기의 표 1에 기재된 바와 같다.
표 1의 결과에서 장티푸스백신 경구용 비드 또는 과립은 위액에서의 불안정성을 극복하였고, 모두 g당 109이상의 높은 생균수와 생존율을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 장티푸스백신 비드 또는 과립은 경구투여가 가능하며 위산에의한 불안정성을 극복하였으며, 장내에 장티푸스백신의 높은 도달율을 가능하게 하는 제제라고 생각된다.
실험예 2 (항체생성확인시험)
실험예 1에서 생존율과 생균수가 다른 실시예보다 우수하였던 실시예 2, 실시예 3, 실시예 4, 실시예 9, 실시예 10에 대하여 Ty21a 항체생성확인시험 (ELISA TEST)을 수행하였으며, 그 결과는 하기의 표 2에 기재하였다.
즉, 장티푸스균주의 항체검출법으로 시험하였으며, Blank는 RPMI 1640배지에 10% FBS를 첨가한 것으로 하였으며, 대조군은 생리식염수를 0.2㎖씩 48시간 간격으로 3회 마우스에 경구투여하였다. 검체는 미세장용코팅된 비드를 48시간 간격으로 3회 마우스에 경구투여(1×107Cells/0.2㎖) 하였으며, 혈액샘플은 대조군과 검체 모두 마지막 경구투여로부터 10일후 0.7㎖씩 채취하여 분석하였다. OPD substrate 첨가후의 반응시간은 13분으로 하였다. 항체생성시험결과 미세장용코팅된 비드는 대조군에 비하여 5 ∼10배의 항체생성율을 보였다.
실험예 3 (공격시험)
실시예 3에따라 제조된 장티푸스백신 경구용과립을 48시간 간격으로 3회 흰쥐 20마리에 경구투여한 후, 마지막 경구투여로부터 4주후 야생 장티푸스균을 흰쥐 15마리에 복강주사한다. 따로 인산염완충용액 (pH 7.4)을 48시간 간격으로 3회 흰쥐 10마리에 경구투여한 후 마지막 경구투여로부터 4주후 야생 장티푸스균을 흰쥐 5마리에 복강주사한다. 최종 생존개체수는 야생장티푸스균을 복강주사한 날로부터 10일후에 생존한 개체수로 한다. 그 시험결과는 하기의 표 3에 기재된 바와 같이 백신투여후 야생장티푸스균 투여시 생존율이 대조군에서는 0%인 반면 시험군에서는 93%의 높은 결과를 나타냈다.
본 발명은 기존의 경구용 장티푸스백신 장용성 캅셀제가 어린이에게 복용불가하며 기존의 캅셀제는 제조시 캅셀이 장용성 고분자물질로 코팅될 때 높은 온도에 장시간 노출됨에 따른 생균의 사멸과 열풍에 의해 캅셀자체가 함유하고 있는 약 12%의 수분이 건조됨에 따라 캅셀이 부서지는 경향이 높고 보존시 안정성이 단축되며 복용시 위내에서 위의 운동에 의해 캅셀이 부서지거나 캅셀 상, 하부의 결합부위에서 코팅시 미세공이 다빈도로 발생하여 위장통과시 이 미세공으로 위산이 침투됨으로써 생균백신의 장내도달율이 저조한 캅셀제의 단점을 극복한 새로운 경구용 장티푸스 백신 장용성비드 또는 과립제 제조방법에 관한 것으로써 경구투여시 약독화된 생백신을 위산으로부터 보호하여 생존장내도달율을 높임으로써 소장의 점막조직중 임파조직의 하나인 Peyer's patch 부위에서 항체생성율이 높아짐에 따라 백신 효과가 월등히 증대되었고, 장티푸스 발병율이 높은 연령층인 어린이에게도 복용이가능해졌다.

Claims (11)

  1. 약독화된 장티푸스균의 변이주(Salmonella typhi Ty21a)인 ATCC-33459 를 배양한 장티푸스균 현탁액에 0.1 내지 10.0(w/v)%의 알긴산나트륨을 도입하고, 동결건조시의 안정화제를 0.1 내지 5.0M의 농도로 단독으로 또는 2가지 이상 혼합하여 첨가하고, 천연 또는 합성고분자물질의 첨가제를 0.1 내지 50.0(w/v)%의 농도로 단독으로 또는 2가지 이상 혼합하여 첨가하고, 항산화제를 0.01 내지 20.0(w/v)%의 농도로 단독으로 또는 2가지 이상 혼합하여 첨가한 후, 이를 0.05 내지 5.0M의 다가 양이온용액에 미세 분무하거나 점적하여 비드를 제조한 후 0~4℃에서 1 내지 5시간동안 저온적응시키고, -20 ~ -70℃에서 1내지 24시간동안 동결시키고 1내지 48시간동안 동결건조하여 제조한 경구용 장티푸스백신 장용코팅 과립 또는 비드
  2. 제 1항에 있어서, 알긴산나트륨을 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1 내지 5.0(w/v)%의 농도로 사용하여 과립 또는 비드를 제조하는 방법
  3. 제 1항에 있어서, 동결건조시의 안정화제로서 백당, 만니톨, 포도당(dextrose), 과당(fructose), 글리세린, 유당, 갈락토스, 맥아당(maltose), 솔비톨, 자일리톨, 트레할로스(trehalose), 아도니톨(adonitol)등을 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1 내지 2.0M의 농도로 단독으로 또는 2가지 이상 혼합사용하여 과립 또는 비드를 제조하는 방법
  4. 제 1항에 있어서, 알긴산나트륨 수용액에 첨가제로서 천연 또는 합성고분자물질로서 아라비아검(Arabic gum), 로우커스트검(Locust bean gum), 잔탄검 (Xanthan gum), 젤란검(Gellan gum), 구아검(Guar gum), 트라가칸트검(Tragacanth gum), 한천, 펙틴, 카라기난(Carrageenan), 젤라틴, 키틴 또는 키토산, 카보폴류, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 하이드록시에칠셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴록사머류, 폴리비닐알코올류등을 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1 내지 20.0(w/v)%의 농도로 단독으로 또는 2가지 이상 혼합사용하여 과립 또는 비드를 제조하는 방법
  5. 제 1항에 있어서, 알긴산나트륨 수용액에 구조성물질로서 벤토나이트, 탄산칼슘, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 미결정셀룰로오스, 콜로이드성이산화규소, 크로스카멜로오스나트륨, 크로스포비돈류, 포비돈류, 사이클로텍스트린, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오스, 산화마그네슘, 스테아린산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜류, 전분글리콘산나트륨, 전분류, 탈크, 산화티탄등을 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1 내지 20.0 (w/v)%의 농도로 단독으로 또는 2가지 이상 혼합사용하여 과립 또는 비드를 제조하는 방법
  6. 제 1항에 있어서, 알긴산나트륨 수용액에 항산화제로서 초산토코페롤, 베타카로틴, 아스코르빈산 및 그의 염, 구연산등을 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.01내지 10.0(w/v)%와 농도로 단독으로 또는 2가지 이상 혼합사용하여 과립 또는 비드를 제조하는 방법
  7. 제 1항에 있어서, 다가 양이온용액으로 염화칼슘, 젖산칼슘, 염화마그네슘, 염화스트론튬, 염화바륨, 염화알루미늄등을 장티푸스균 현탁액을 기준으로 0.1 내지 2.0M의 농도로 사용하여 과립 또는 비드를 제조하는 방법
  8. 제 1항에 있어서, 다가 양이온용액에 제 3항의 안정화제등을 첨가하여 과립 또는 비드를 제조하는 방법
  9. 제 1항에 있어서, 다가 양이온용액의 pH를 구연산, 염산, 주석산, 인산, 말레인산등으로 pH 7.0±0.1로 맞추고 일반여과 또는 0.45㎛ 여과후 과립 또는 비드의 제조에 사용하는 방법
  10. 제 1항에 있어서, 제조한 과립 또는 비드를 여과하여 멸균정제수로 세척하고 0∼4℃에서 1∼2시간동안 저온 적응시키고 -20 ~ -70℃에서 1∼4시간동안 동결시키고, 12∼24시간동안 동결건조하여 최종의 제품을 만드는 방법
  11. 제 10항에 있어서, 과립 또는 비드의 동결건조시에 제 3항에서 사용된 안정화제의 수용액에 담그고 이를 동결건조하여 최종의 제품을 만드는 방법
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