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KR20020073127A - 형질전환에 의하여 생성된 융합 단백질 - Google Patents

형질전환에 의하여 생성된 융합 단백질 Download PDF

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KR20020073127A
KR20020073127A KR1020027003529A KR20027003529A KR20020073127A KR 20020073127 A KR20020073127 A KR 20020073127A KR 1020027003529 A KR1020027003529 A KR 1020027003529A KR 20027003529 A KR20027003529 A KR 20027003529A KR 20020073127 A KR20020073127 A KR 20020073127A
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KR
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fusion protein
transgenic
protein
antibody
latex
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KR1020027003529A
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에지마이클디
폴록단
에셀라드얀
메아데하리엠
리박수잔나엠
Original Assignee
겐자임 트랜스제닉스 코포레이션
아스트라제네카 유케이 리미티드
더 거번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카 애즈 레프리젠티드 바이 더 세크러터리 오브 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 써비시즈
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Publication date
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Abstract

본 발명은 트랜스제닉 융합 단백질의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 융합 단백질의 발현을 제공하는 트랜스유전자를 포함한 트랜스제닉 동물을 제공하는 단계; 트랜스유전자가 발현되도록 하는 단계; 및 트랜스제닉 동물의 유액으로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다.

Description

형질전환에 의하여 생성된 융합 단백질{TRANSGENICALLY PRODUCED FUSION PROTEINS}
치료적 및 진단적 용도로서 개발되는 재조합 단백질이 점점 증가하고 있다. 그러나, 이러한 다수의 단백질은 통상적 방법을 사용하여 요구되는 양 및/또는 기능적 형태로 제조하기 어렵거나 비용이 많이 들 수 있다. 통상적 방법은 박테리아, 효모, 또는 포유동물 세포(예, COS 세포)와 같이 숙주 세포내에 특정 단백질을 제조할 수 있는 유전자를 삽입하는 단계 및 배양 배지에서 상기 세포를 성장시키는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 소정의 단백질을 합성한다. 통상적 박테리아 또는 효모 시스템은 기능적 형태의 다수의 복잡한 단백질을 제조할 수 없을 것이다. 포유동물 세포는 복잡한 단백질을 재생시킬 수 있지만 일반적으로 성장시키기에 어렵고 비용이 많이 들며, 단지 mg/L 양으로만 단백질을 생성할 수 있다. 박테리아, 효모 또는 포유동물 시스템을 사용하는 한계에 있어서 면역글로불린-효소 융합 단백질과 같이 복합 단백질을 특히 응용할 수 있으며, 이는 적절한 후번역 개질 및 조립을 통하여 기능성 형태가 된다.
기금
본원에서 설명된 연구는 국립암기구, 국립건강기구의 연방 기금으로 계약번호 NO1-CO-60000로 일부 보조되었다.
관련출원
본 출원은 본원에서 참고로 통합되는 1998년 9월 18일자로 출원된 가명세서 60/101,083호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 분야
본 발명은 형질전환에 의하여 생성된 융합 단백질(예, 면역글로불린-효소 융합 단백질), 융합 단백질을 암호화하는 핵산, 및 융합 단백질 및 핵산을 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
도1은 항체 및 항체 안지오제닌 융합 단백질의 유전자를 도시한다.
도2A는 트랜스페린 수용체 항체(E6) 및 안지오제닌-효소 융합(CH2 Ang)에 대한 트랜스제닉 발현 벡터의 구조를 도시한다. 하기 DNA는 마우스의 유선에서 발현하는 개질된 염소 β-카세인 유전자(DiTullio et al., 1992)의 엑손 2와 7사이에융합되어 있다: 항-인간 트랜스페린 수용체 모노클로날 항체 E6(1)의 중쇄; 이전에 상술된 안지오제닌(Ang) 암호화 유전자의 5' 말단에 CH2 도메인에서 융합된 동일한 중쇄[Rybak et al., 1992](II); E6 항체(III)의 경쇄. 열린 박스, 중쇄; 닫힌 빗금 박스, 경쇄; 줄친 박스, Ang.
도2B는 E6 IgG 항체 또는 CH2 Ang 융합 단백질을 생산하는 수유 암컷으로부터 수집한 유액의 환원 조건하에서 항-안지오제닌 또는 항-IgG 항체를 사용한 웨스턴 분석을 도시한다. PBS의 동등한 부피로 희석된 유액 15 ul를 겔에 도포하였다.
도2C는 환원 또는 비환원 조건하에서 정제된 E6 항체 또는 CH2Ang의 웨스턴 분석을 도시한다. 블롯은 표시된 항체 0.3 u E6, 레인 1 및 2: 4 ug E6, 레인 3: 0.7 및 0.2 ug CH2Ang, 레인 4 및 5로 각각 분석하였다.
도3은 안지오제닌-항체 융합(CH2Ang)의 융합 또는 안지오제닌이 mRNA 번역에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다. 안지오제닌 또는 융합 단백질은 BMV mRNA 및 [35S] 메티오닌을 함유하는 용출 혼합물에 첨가하였다. 단백질 합성은 문헌[Newton et al., 1996]에서 설명된 신규하게 합성된 단백질내로 표지의 통합을 측정함으로써 결정하였다. 2-3 실험에서 얻은 자료를 풀화시켜 ±SEM 플롯하였다. 이 결과를 모조제로 처리된 대조 반응의 백분율로 나타낸다. IC50은 단백질 합성의 50% 저해를 야기하는데 필요한 Ang 융합 단백질 또는 Ang의 농도이며 용량 반응 커브로부터 결정한다. 진한 원, Ang; 개방 원, CH2 Ang.
도4는 배양된 세포에서 안지오제닌-항체 융합의 세포독성 효과를 나타내는용량 반응 커브를 도시한다. SF539 및 MDA-MB-231]mdr세포에 대한 CH2Ang 생체내 독성은 단백질 합성 저해에 의하여 평가된다. 세포독성 분석은 상기 방법에서 설명된대로 세포 단백질내로 [14C] 류신의 삽입을 측정함으로써 수행하였다. 이 분석은 혈청의 존재에서 수행되며, [14C] 류신으로 펄스시키기 전에 류신-및-혈청-없는 배지로 교환된다. IC50은 3일후 단백질 합성의 50% 저해를 야기하는데 필요한 안지오제닌 융합 단백질의 농도이며, 이는 용량 반응 커브로부터 직접 측정하였다. SEM은 이것이 표시보다 클 경우이다. 진한 표시. SF539 인간 교종 세포; 개방 표시, MDA-MB-23]md1인간 유방암 세포.
발명의 요약
일반적으로, 본 발명은 면역글로불린-효소 융합 단백질과 같은 트랜스제닉 융합 단백질을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본 방법은 면역글로불린-효소 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 발현을 제공하는 트랜스유전자를 포함하는 염소 또는 소와 같은 트랜스제닉 동물을 제공하는 단계; 트랜스유전자가 발현되는 단계; 및 바람직하게는 트랜스제닉 동물의 유액(milk)으로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함한다(설명된 구체예는 유액내 발현에 관한 것이지만, 기타 프로모터 예를 들면 기타 조직 특이적 프로모터, 예를 들면 근육, 머리카락, 뇨, 혈액 또는 난 특이적 프로모터를 기타 조직 또는 생성물에서 융합 단백질을 생성하는데 사용할 수 있다.)
바람직한 구체예에서 트랜스유전자는 제1 성분이 제2 성분에 융합된 것을 포함한다. 제1 성분은 표적화 분자의 서브유니트, 예를 들면 종양 항원(예, 태아성암항원(CEA), 트랜스페린 수용체, TAG-72, 표피 성장 인자 수용체)에 특이적인 Ig의 서브유니트와 같은 Ig 서브유니트를 포함할 수 있다. 제2 성분은 효소; Ig 서브유니트 이외의 폴리펩티드 또는 이것의 단편; Rnase, 예를 들면 RnaseA, 예컨대 안지오제닌; 또는 카르복시펩티다아제 B 효소일 수 있다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 융합 단백질이 반추동물(예, 염소 또는 소)과 같은 트랜스제닉 포유동물의 유선에서 제조된다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 융합 단백질은 반추동물(예, 염소 또는 소와 같은 낙농 동물)과 같은 포유동물의 유액내로 분비된다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 융합 단백질은 적어도 약 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3 mg/ml, 5 mg/ml 또는 그 이상의 농도로 트랜스제닉 포유동물의 유액에서 분비된다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 융합 단백질이 유선 특이적 프로모터, 예를 들면 유액 특이적 프로모터, 예를 들면 유액 혈청 단백질 또는 카세인 프로모터의 조절하에서 제조된다. 유액 특이적 프로모터는 카세인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산 단백질 프로모터 또는 락트알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터는 염소 β카세인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 융합은 일반식 R1-L-R2; R2-L-R1; R2-R1; 또는 R1-R2을 갖는다. 여기서 R1은 면역글로불린부이고, L은 펩티드 링커이고, R2는 효소부이다. 바람직하게는 R1 및 R2는 직접 융합되거나 또는 펩티드 링커에 의하여 연결되는 것처럼 공유적으로 연결된다.
바람직한 구체예에서 트랜스제닉 융합 단백질은 다음을 추가로 포함한다:
융합 단백질의 분비를 지시하는 신호 서열, 예를 들면 분비된 단백질로부터의 신호(예, 유액으로 분비된 단백질로부터의 신호 또는 면역글로불린 신호); 및
(임의적으로) 융합 단백질의 분비(예, 트랜스제닉 포유동물의 유액으로)를 가능하게 하는 분비 단백질(예, 유액으로 분비되는 단백질 또는 면역글로불린)의 아미노 말단 암호 영역의 충분한 부분을 암호화하는 서열.
바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 모노클로날 항체 서브유니트, 예를 들면 인간, 뮤린(예, 마우스) 모노클로날 항체 서브유니트 또는 이들의 단편, 예를 들면 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. 모노클로날 항체 서브유니트 또는 이들의 항원 결합 단편은 단일쇄 폴리펩티드, 중쇄 및 경쇄의 이량체, 또는 중쇄 2개 및 경쇄 2개의 사량체일 수 있다. 바람직하게는, 모노클로날 항체가 인간 항체 또는 이것의 단편, 예를 들면 이것의 항원 결합 단편이다. 예를 들면, 인간 항체는 불사 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들면 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의하여 제조될 수 있다. 항체는 다양한 이소형일 수 있다. 예를 들면 IgG(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgA sub.sec., IgD, 또는 IgE를 포함한다. 항체는 IgG 이소형이 바람직하다. 항체는 전장일 수 있고(예, IgG1 또는 IgG4 항체) 또는 항원-결합부만 포함할 수 있다(예,Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편).
바람직한 구체예로서, 융합 단백질의 면역글로불린 서브유니트는 재조합 항체, 예를 들면 키메라 항체, 인간화 항체, 서브유니트 또는 이들의 항원 결합 단편이고, 예를 들면 비인간 항체(예, 뮤린)로부터 유래한 가변부 또는 적어도 상보성 결정 부위(CDR)을 가지며, 나머지 부분(들)은 인간에서 기원한 것이다.
바람직한 구체예로서, 융합 단백질의 면역글로불린 서브유니트는 일가이다(예를 들면 한쌍의 중쇄 및 경쇄 또는 이들의 항원 결합 부분을 포함한다). 다른 구체예로서, 융합 단백질은 이가 항체이다(예를 들면, 두쌍의 중쇄 및 경쇄 또는 이들의 항원 결합 부분을 포함한다).
바람직한 구체예로서, 트랜스제닉 융합 단백질은 면역글로불린 중쇄 또는 이들의 단편, 예를 들면, 이들의 항원 결합 단편을 포함한다. 바람직하게는 면역글로불린 중쇄 또는 이들의 단편(예, 이들의 항원 결합 단편)이 효소에 펩티드 링커와 같은 결합에 의하여 연결되거나 또는 직접 융합된다. 면역글로불린 중쇄-효소 융합 단백질은 효소 활성을 갖는 기능성 복합체, 예를 들면 디-, 트리-, 테트라-, 또는 다량체 복합체로 조립가능하다.
바람직한 구체예로서, 트랜스제닉 융합 단백질은 면역글로불린 중쇄 또는 이것의 단편(예, 이것의 항원 결합 단편) 및 경쇄 또는 이것의 단편(예, 이것의 항원 결합 단편)을 포함한다. 바람직하게는, 면역글로불린 중쇄는 효소에 예를 들면 펩티드 링커에 의하여 연결되거나 또는 직접 연결된다. 바람직하게는, 면역글로불린-효소 융합 단백질은 효소 활성을 갖는 기능성 복합체, 예를 들면 디-, 트리-, 테트라-, 또는 다량체 복합체로 조립가능하다.
바람직한 구체예로서, 융합 단백질의 효소는 Rnase, 예를 들면 RnaseA, 예를 들면 안지오제닌, 또는 카르복시펩티다아제 B 효소이다. 진단적 용도로서, 효소는 고추냉이 과산화효소일 수 있다.
바람직한 구체예로서, 트랜스제닉 융합 단백질은 펩티드 링커를 포함하며, 이 펩티드 링커는 다음과 같은 특징을 하나 이상 갖는다: a) 면역글로불린 단백질 및 효소 단백질을 서로 상대적으로 회전가능하게 함; b) 프로테아제에 의한 절단에 저항함; c) 면역글로불린 또는 효소와 상호작용하지 않음; d) 융합 단백질이 효소 활성을 갖는 복합체(예, 디-, 트리-, 테트라-, 또는 다량체 복합체)를 형성하도록 함; 및 e) 융합 단백질이 활성 복합체로 폴딩 및/또는 조립되는 것을 촉진함.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 융합 단백질은 펩티드 링커를 포함하고 이 펩티드 링커는 5 내지 60, 바람직하게는 10 내지 30의 아미노산 길이이다; 펩티드 링커는 20 아미노산 길이이다; 펩티드 링커는 17 아미노산 길이이다; 펩티드 링커내 각 아미노산은 Gly, Ser, Asn, Thr 및 Ala로 구성된 군에서 선택된다; 펩티드 링커는 Gly-Ser 인자를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 트랜스제닉 융합 단백질은 펩티드 링커를 포함하고, 이 펩티드 링커는 식(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)y(여기서, y는 1,2,3,4,5,6,7 또는 8임)을 갖는 서열을 포함한다. 이 펩티드 링커는 식(Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3을 갖는 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이 펩티드 링커는 식((Ser-Gly-Gly-Gly-Gly)3-Ser-Pro)을 갖는 서열을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 트랜스제닉 융합 단백질은 이량체, 삼량체, 사량체 또는 고도의 중합성 복합체로 조립된다.
바람직한 구체예로서, 트랜스제닉 융합 단백질을 암호화하는 트랜스유전자는 다음을 포함하는 핵산 구조체이다:
(a) 임의적으로, 인설레이터(insulator) 서열;
(b) 프로모터, 예를 들면 유단백질 프로모터와 같은 유방 상피세포 특이적 프로모터;
(c) 융합 단백질의 분비를 지시할 수 있는 신호 서열, 예를 들면 유액 특이적 단백질로부터의 신호을 암호화하는 뉴클레오티드 서열, ;
(d) 임의적으로, 비분비 단백질이 트랜스제닉 포유류의 유액으로 분비되도록, 유액으로 분비되는 단백질과 같은 분비 단백질의 아미노 말단 암호 영역의 충분한 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
(e) 융합 단백질, 예를 들면 본원에서 상술된 단백질과 같은 면역글로불린-효소 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
(f) 임의적으로, 포유동물 유전자, 예를 들면 유방 상피세포 특이적 유전자(예, 유단백질 유전자)에서 유래하는 3' 비번역 영역.
바람직한 구체예로서, 트랜스유전자의 인자 (존재하면) a, b, c, (존재하면)d 및 f가 동일한 유전자에서 유래하고; 트랜스유전자의 상기 인자 (존재하면) a, b, c, (존재하면) d 및 f가 2 이상의 유전자에서 유래한다. 예를 들면, 신호 서열, 프로모터 서열 및 3' 비번역 서열은 유방 상피세포 특이적 유전자, 예를 들면 유액 혈청 단백질 또는 카세인 유전자(예, β카세인 유전자)로부터 유래할 수 있다. 신호 서열, 프로모터 서열 및 3' 비번역 서열은 염소 β카세인 유전자로부터 유래하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 트랜스유전자의 프로모터는 유방 상피세포 특이적 프로모터, 예를 들면, 유액 혈청 단백질 또는 카세인 프로모터(예, β카세인 유전자)이다. 유액 특이적 프로모터는 카세인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산 단백질 프로모터 또는 락토알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터는 염소 β카세인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 트랜스유전자에 의하여 암호화되는 신호 서열은 세포의 외부 또는 세포막 내부로 단백질의 발현을 지시하는 아미노 말단 서열이다. 신호 서열은 트랜스제닉 동물의 유액과 같은 유액으로 분비되는 단백질에서 유래하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 트랜스유전자의 3' 비번역 영역은 폴리아데닐화 부위를 포함하고, 유액 혈청 단백질 유전자 또는 카세인 유전자와 같은 유방 상피세포 특이적 유전자로부터 얻는다. 3' 비번역 영역은 카세인 유전자(예, β카세인 유전자), 베타 락토글로불린 유전자, 유장산 단백질 유전자 또는 락트알부민 유전자로부터 얻을 수 있다. 3' 비번역 영역은 염소 β카세인 유전자에서 유래하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 트랜스유전자, 예를 들면 상술한 바와 같은 트랜스유전자는 트랜스제닉 동물의 생식세포 및/또는 체세포내로 통합된다.
또다른 구체예로서, 본 발명은 다음을 포함하는 핵산 구조체, 바람직하게는 분리된 핵산 구조체를 특징으로 한다:
(a) 임의적으로, 인설레이터 서열;
(b) 프로모터, 예를 들면 유단백질 프로모터와 같은 유방 상피세포 특이적 프로모터;
(c) 유액 특이적 단백질로부터의 신호와 같은 융합 단백질의 분비를 지시할 수 있는 신호 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열;
(d) 임의적으로, 비분비 단백질이 트랜스제닉 포유류의 유액으로 분비되도록, 유액으로 분비되는 단백질과 같은 분비 단백질의 아미노 말단 암호 영역의 충분한 부분을 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
(e) 본원에서 개시된 융합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열; 및
(f) 임의적으로, 유방 상피세포 특이적 유전자(예, 유단백질 유전자)와 같은 포유동물 유전자로부터의 3' 비번역 영역.
바람직한 구체예로서, 상기 프로모터는 유방 상피세포 특이적 프로모터, 예를 들면, 유액 혈청 단백질 또는 카세인 프로모터(예, β카세인 유전자)이다. 유액 특이적 프로모터는 카세인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산 단백질 프로모터 또는 락트알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터는 염소 β카세인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 신호 서열은 세포의 외부 또는 세포막 내부에서 단백질의 발현을 지시하는 아미노 말단 서열이다. 신호 서열은 유액 특이적 단백질에서 유래하는 것이 바람직하다. 신호 서열은 트랜스제닉 포유류와 같이 트랜스제닉 동물의 유액으로 암호화된 융합 단백질의 분비를 지시하는 것이 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 3' 비번역 영역은 폴리아데닐화 부위를 포함하고, 유액 혈청 단백질 유전자 또는 카세인 유전자와 같은 유방 상피세포 특이적 유전자와 같은 포유류 유전자로부터 얻는다. 3' 비번역 영역은 카세인 유전자(예, β카세인 유전자), 베타 락토글로불린 유전자, 유장산 단백질 유전자 또는 락트알부민 유전자로부터 얻을 수 있다. 3' 비번역 영역은 염소 β카세인 유전자에서 유래하는 것이 바람직하다.
또다른 양태에서, 본 발명은 분리된 숙주 세포와 같은 숙주 세포를 특징으로 한다. 상기 숙주 세포는 본 발명의 핵산(예, 본원에서 설명된 핵산 구조체와 같은 트랜스유전자)을 포함한다.
또다른 양태에서, 본 발명은 본원에서 설명된 면역글로불린-효소 융합 단백질과 같은 융합 단백질의 유효량 및 약학적 허용 담체를 갖는 약학 조성물 또는 영양학 조성물을 특징으로 한다.
바람직한 구체예로, 상기 조성물은 유액을 포함한다.
또다른 구체예로, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 트랜스유전자(예를들면 본원에서 설명된 면역글로불린-효소 융합 단백질을 암호화하는 트랜스유전자)를 포함하는 트랜스제닉 동물을 특징으로 한다.
바람직한 트랜스제닉 동물로 포유류; 조류; 파충류; 유대류; 및 양서류를 포함한다. 적절한 포유류는 반추동물; 유제동물; 가축동물; 및 낙농동물을 포함한다. 특히 바람직한 동물은 마우스, 염소, 양, 낙타, 토끼, 소, 돼지, 말, 황소 및 라마를 포함한다. 적절한 조류는 닭, 거위 및 칠면조를 포함한다. 트랜스제닉 단백질은 트랜스제닉 동물의 유액으로 분비되는 경우, 동물이 매년 적어도 1 리터, 및 더욱 바람직하게는 적어도 10 리터 또는 100 리터의 유액을 생산할 수 있어야 한다. 바람직하게는 트랜스제닉 동물은 염소, 소 또는 양과 같은 반추동물이 바람직하다. 트랜스제닉 동물은 염소가 가장 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 트랜스제닉 동물은 본원에서 설명된 융합 단백질과 같은 융합 단백질을 암호화하는 트랜스유전자를 포함하는 생식세포 및 체세포를 갖는다.
바람직한 구체예로서, 트랜스제닉 동물에서 발현되는 융합 단백질은 유방 특이적 프로모터, 예를 들면, 유액 혈청 단백질 또는 카세인 프로모터와 같은 유액 특이적 프로모터의 조절하에 있다. 유액 특이적 프로모터는 카세인 프로모터, 베타 락토글로불린 프로모터, 유장산 단백질 프로모터 또는 락트알부민 프로모터일 수 있다. 프로모터로 염소 β카세인 프로모터가 바람직하다.
바람직한 구체예로서, 트랜스제닉 동물은 포유류이고, 면역글로불린-효소 융합 단백질이 적어도 약 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.5 mg/ml, 2 mg/ml, 3mg/ml, 5 mg/ml 또는 이상의 농도로 트랜스제닉 동물의 유액으로 분비된다.
또다른 양태로서, 본 발명은 표적 항원의 표면에 발현된 비정상 세포 또는 질병 세포를 선택적으로 죽이거나 또는 용해시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:
형질전환에 의하여 생성된 융합 단백질(예컨대, 본원에서 설명된 형질전환에의하여 생성된 면역글로불린-효소 융합 단백질로서, 상기 융합 단백질의 면역글로불린은 표적 항원을 인식함)과 비정상 세포 또는 질병 세포를 접촉시키는 단계.
용어 펩티드, 단백질 및 폴리펩티드는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 정제된 제제, 폴리펩티드의 실질적으로 순수한 제제, 또는 본원에서 사용된 분리된 폴리펩티드는 트랜스제닉 동물 또는 유체(예, 유액 또는 기타 물질, 예를 들면 트랜스제닉 동물에 의하여 생성된 난)중의 단백질, 지질 또는 핵산처럼 그것을 발현하는 세포 또는 유기체에서 발생하는 적어도 하나의 기타 단백질, 지질 또는 핵산으로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 폴리펩티드는 항체와 같은 물질 또는 이것을 분리하는데 사용되는 겔 매트릭스(예, 폴리아크릴아미드)로부터 분리되는 것이 바람직하다. 폴리펩티드는 정제된 제제의 적어도 10, 20, 50, 70, 80 또는 95 건조 중량%로 구성하는 것이 바람직하다. 제제는 단백질 서열 결정하기에 충분한 폴리펩티드(즉, 폴리펩티드의 적어도 1, 10 또는 100 ug; 폴리펩티드의 적어도 1, 10 또는 100 mg)를 포함하는 것이 바람직하다.
실질적으로 순수한 핵산은 핵산이 유래되는 유기체의 자연 발생적 게놈에서 직접적으로 인접한(5' 말단에서 하나 그리고 3'말단에서 하나) 암호 서열 하나 또는 둘다와 또는 핵산이 유래하는 유기체에서 발생하는 핵산 서열이 실제로 없는 서열 중 하나 또는 둘다인 핵산이다. 이 용어는 자가복제하는 플라스미드 또는 바이러스와 같은 벡터내로 또는 원핵세포 또는 진핵세포의 게놈 DNA내로 통합되거나 또는 기타 DNA 분자에 독립적인 분리된 분자(예, cDNA 또는 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의하여 생성되는 게놈 DNA 단편)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 또한 실질적으로 순수한 DNA는 추가적 융합 단백질 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 트랜스유전자는 트랜스제닉 유기체의 게놈내로 도입된 핵산 서열(하나 이상의 융합 단백질 폴리펩티드를 암호화)을 의미한다. 트랜스유전자는 하나 이상의 전사 조절 서열 및 기타 핵산, 예를 들면 융합 단백질을 암호화하는 핵산의 최적 발현 및 분비에 필요한 인트론을 포함한다. 트랜스유전자는 인헨서 서열을 포함할 수 있다. 융합 단백질 서열은 조직 특이적 프로모터, 예를 들면, 트랜스제닉 포유류의 유액내 단백질을 분비하는 유선 특이적 프로모터 서열, 뇨 특이적 프로모터 또는 난 특이적 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스제닉 세포"는 트랜스유전자를 포함하는 세포를 의미하다.
본원에서 사용된 바와 같이, "트랜스제닉 유기체"는 트랜스제닉 동물 또는 식물을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "트랜스제닉 동물"은 동물 세포의 하나 이상,바람직하게는 실제 전부가 공지의 형질전환 기술과 같은 인간의 조정에 의하여 도입된 트랜스유전자를 함유한 비인간 동물이다. 트랜스유전자는 재조합 바이러스의 감염 또는 미세 주입과 같은 의도적인 유전자 조작에 의하여 직접적으로 또는 세포의 전구체내 도입에 의하여 간접적으로 세포내로 도입시킬 수 있다.
포유류는 유선을 가지고 유액을 생성하는, 인간을 제외한 모든 동물로서 정의된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "낙농 동물"은 유액을 생성하고 설치류보다 큰 비인간 동물을 의미한다. 바람직한 구체예로서 낙농 동물은 소 또는 염소처럼 대량의 유액을 생산하고 수유 기간이 길다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상"은 인간 및 비인간 동물을 포함한다. 본 발명의 용어 "비인간 동물"이란 척추동물, 예를 들면, 포유류 및 비인간 영장류, 반추동물, 조류, 양서류, 파충류 및 설치류(예, 마우스와 래트)와 같은 비-포유류를 포함한다. 이 용어는 또한 토끼를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "트랜스제닉 식물"은 식물, 바람직하게는 다세포 또는 고등 식물이며, 여기서 하나 이상, 바람직하게는 거의 모든 식물 세포가 공지의 형질전환 기법과 같은 인간 조정에 의하여 도입된 트랜스유전자를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "식물"은 식물 전체 또는 식물 일부, 식물 세포 또는 식물 세포 군을 의미한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물류는 외떡잎식물과 쌍떡잎식물과 같이 트랜스제닉 기법으로 변형될 수 있는 고등 식물의류만큼 넓은 것이 일반적이다. 이는 배수체, 이배체 및 반수체를 포함하는 다양한 배수성 수준의 식물을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "영양(nutraceutical)제"는 음식물 또는 음식 일부을 의미하며, 이는 융합 단백질을 포함한다. 영양제는 질병의 예방, 치료 또는 치유를 포함하는 의학적 또는 건강적 이익을 제공할 수 있다. 트랜스제닉 단백질은 종종 적어도 100 ug/kg, 바람직하게는 적어도 1 mg/kg, 더욱 바람직하게는 적어도 10 mg/kg의 농도로 영양분에 존재할 것이다. 영양제는 트랜스제닉 동물의 유액을 포함할 수 있다.
본원에서 설명된 바와 같이, 용어 "면역글로불린" 및 "항체"는 이황화 결합에 의하여 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 당단백질을 의미한다. 각 중쇄는 중쇄 가변부(HCVR 또는 VH로 약칭) 및 중쇄 불변부로 구성된다. 중쇄 불변부는 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변부(LCVR 또는 VL로 약칭) 및 경쇄 불변부로 구성된다. 경쇄 불변부는 한 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 골격구조 영역(FR)이라고 명하는 더 보존적인 영역이 산재된 상보성 결정 부위(CDR)라고 불리는 고가변성 영역으로 추가적으로 분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변부는 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 포함한다. 항체의 불변부는 면역계의 다양한 세포(예, 작동인자(effector) 세포) 및 통상적 보체계의 제1 성분(Clq)를 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 중재할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분"(또는 단순히 "항체 부분")은 항원(예, 표적 항원)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의하여 수행될 수 있음이 증명되었다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"내에 포함되는 결합 단편의 예는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 일가 단편; (ii) F(ab')2단편, 힌지 영역에 이황화 결합에 의하여 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 부위(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편, VL 및 VH의 2개의 도메인은 분리된 유전자에 의하여 암호화되지만, 이들은 VL 및 VH 영역이 짝을 이루어 일가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로 제조할 수 있는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다[단일쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 참조예, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883]. 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원 결합 부분"내에 포함되는 것으로 의도된다. 상기 항체 단편은 당업자에 공지된 통상적 기술을 사용하여 얻는다. 또한 단편은 고유 항체로서 동일한 방법으로 용도에 대하여 스크린한다.
용어 "모노클로날 항체"는 본원에서 사용된 바와 같이 단일 분자 조성물의항체 분자를 의미한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 나타낸다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열로부터 유래한 가변부 및 불변부를 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 의미한다. 한 구체예에서, 인간 모노클로날 항체는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들면 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의하여 생성된다. 이는 불멸 세포에 융합된 인간 중쇄 트랜스유전자 및 경쇄 트랜스유전자를 포함하는 게놈을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의하여 제조, 발현, 제작 또는 분리된 모든 인간 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이는 인간 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 동물(예, 마우스)로부터 분리된 항체; 숙주 세포로 형질감염시킨 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체, 재조합된, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 또는 인간 면역글로불린 유전자 서열을 기타 DNA 서열로 스플라이싱하는 방법을 포함하는 기타 수단에 의하여 제조, 발현, 작제 또는 분리된 항체를 포함한다. 상기 재조합 인간 항체는 인간 생식세포계 면역글로불린 서열로부터 유래하는 가변부 및 불변부를 갖는다. 그러나, 특정 구체예에서, 상기 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 이용될 경우는 생체내 체세포 돌연변이)될 수 있으며, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포계 VH 및 VL 서열에 관련되고 이로부터 유래된 서열이지만, 생체내 인간 항체 생식세포계 레퍼토리내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.
핵산이 또다른 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우 핵산은 "작동적으로 연결"된다. 예를 들면 프로모터 또는 인헨서는 이것이 서열의 전사에 영향을 주는 경우 암호 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 전사 조절 서열에 있어서, 작동적 연결의 의미는 연결된 DNA 서열이 연속적이고 2개의 단백질 암호 영역의 연결이 필요한 경우에 해독 프레임내에 연결되는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "벡터" 또는 "구조체"는 이것에 연결된 또다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산을 의미한다. 벡터의 또다른 유형은 "플라스미드"이다. 이것은 추가적 DNA 단편이 결찰될 수 있는 원형의 이중쇄 DNA 루프를 의미한다. 벡터의 또다른 유형은 바이러스 벡터이다. 이는 바이러스 게놈내로 추가적 DNA 단편이 결찰될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제를 할 수 있다(예, 박테리아 복제 개시점을 가진 박테리아 벡터 및 에피좀성 포유류 벡터). 기타 벡터(예, 비에피좀성 포유류 벡터)는 숙주 세포내로 도입시 숙주 세포의 게놈내로 통합될 수 있으므로, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 이들이 작동적으로 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 "재조합 발현 벡터"(또는 단순히 "발현 벡터")라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터의 형태이다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터(예, 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-결합 벡터)와 같이 발현 벡터의 상기 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용된 용어 "재조합 숙주 세포"(또는 단순히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐 아니라 이러한 세포의 자손도 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 특정 변형은 돌연변이 또는 환경적 영향에 의하여 후대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모 세포와 동일하지는 않지만 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위에 포함될 수 있다.
본 발명의 기타 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명확하게 설명된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 부분적으로는 트랜스제닉에 의하여 제조된 융합 단백질을 제공한다. 한 구체예에서, 융합 단백질은 독소(예, 효소의 서브유니트)에 융합된 면역글로불린 서브유니트(예, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄)를 포함한다. 상기 면역글로불린-효소 융합 단백질은 바람직하지 않은 세포, 예를 들면 종양 세포에 대하여 세포독성제(예, 효소)를 표적화하도록 작용한다. 예를 들면, 하기 실시예에 기술된 융합 단백질(즉, Rnase A 또는 카르복시펩티다아제와 같은 효소에 융합된 태아성암항원(CEA)에 대한 항체)은 종양 세포에 표적화를 위하여 사용될 수 있다. 면역글로불린-효소 융합이 종양 부위에 국소화되도록 충분한 시간을 허용한 후에, 비독성 전구체 약물을 투여할 수 있다. 상기 전구체 약물은 종양 부위에 국소화된 표적화 효소의 활성에 의하여 고도의 세포독성 약물로 전환되며, 이는 환자에게 용인할 수 없는 독성을 야기하지 않으면서 약물의 치료적 수준이 달성가능하다.
면역글로불린의 생성
세포상에 세포 표면 단백질(예, 수용체)과 같은 표적 항원에 대한 모노클로날 항체는 표준 체세포 혼성화 기법[Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)]과 같은 통상적 모노클로날 항체 방법을 포함하는 다양한 기법에 의하여 생성될 수 있다. 체세포 혼성화 방법이 바람직하지만, 원칙적으로 모노클로날 항체를 생성하는 다른 방법은 예컨대 B 림프구의 바이러스 또는 종양원성 형질전환을 사용할 수 있다.
하이브리도마 제조에 바람직한 동물계는 뮤린계이다. 마우스에서의 하이브리도마 생성은 매우 잘 수립된 방법이다. 면역화 프로토콜 및 융합을 위한 면역화 비장세포의 분리 기법은 당업계에 공지되어 있다. 융합 짝(예, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 방법이 공지되었다.
인간 단백질에 대하여 형성된 인간 모노클로날 항체(mAbs)는 마우스계 보다는 완전한 인간 면역계를 보유하는 트랜스제닉 마우스를 사용하여 생성할 수 있다. 목적하는 항원으로 면역화된 이러한 트랜스제닉 마우스의 비장세포는 인간 단백질로부터 에피토프에 대한 특이적 친화성을 갖는 인간 mAbs를 분비하는 하이브리도마를 생성하는데 사용된다[참조 문헌: Wood et al., 국제 출원 WO 91/00906, Kucherlapati et al. PCT 공개공보 WO 91/10741; Lonberg et al., 국제 출원 WO 92/03918; Kay et al., 국제 출원 92/03917; Lonberg, N. et al., 1994 Nature 368:856-859; Green, L.L. et al. 1994 Nature Genet. 7:13-21; Morrison S. L. et al. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Bruggeman et al., 1993 YearImmunol 7:33-40; Tuaillon et al., 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman et al., 1991 Eur J Immunol 21:1323-1326].
모노클로날 항체는 또한 재조합 DNA 기술의 당업자에게 공지된 기타 방법에 의하여 생성할 수 있다. "조합적 항체 디스플레이(combinational antibody display)" 법으로 명명되는 대안적 방법은 특정 항원 특이성을 갖는 항체 단편을 동정하고 분리하도록 개발되었다. 이는 모노클로날 항체를 생성하는데 사용할 수 있다[조합적 항체 디스플레이의 설명에 대한 참조 문헌: Sastry et al., 1989 PNAS 86:5728; Huse et al., 1989 Science 246:1274; 및 Orlandi et al. 1989 PNAS 86:3833]. 상술된 면역원으로 동물을 면역화시킨 후에 생성된 B-세포 풀의 항체 레퍼토리를 클로닝한다. 올리고머 프라이머의 혼합물 및 PCR을 사용함으로써 면역글로불린 분자의 다양한 집단의 가변부의 DNA 서열을 얻는 방법은 공지되었다. 예를 들면, 5' 리더(신호 펩티드) 서열 및/또는 골격구조1(FR1) 서열에 상응하는 혼합된 올리고뉴클레오티드 프라이머뿐 아니라 보존된 3' 불변부 프라이머에 대한 프라이머가 다수의 뮤린 항체에서 유래한 경쇄 및 중쇄 가변부의 PCR 증폭을 위하여 사용할 수 있다[문헌; Larrick et al., 1991, Biotechniques 11:152-156]. 유사한 기법인 인간 항체 유래의 인간 경쇄 및 중쇄 가변부를 증폭시키는데 사용할 수 있다[문헌; Larrick et al., 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:106-110].
구체예로서, 표준 방법을 사용하여 말초혈 세포, 골수 또는 비장 제제와 같은 B 림프구로부터 RNA를 분리한다[미국 특허 제4,683,202호; Orlandi, et al,PNAS (1989)86:3833-3837; Sastry et al.,PNAS(1989)86:5728-5732; and Huse et al. (1989)Science 246:1275-1281]. 제1 스트랜드 cDNA는 신호 서열에 대한 프라이머뿐 아니라 중쇄(들)및 각 κ및 λ경쇄의 불변부에 대하여 특이적인 프라이머를 사용하여 합성하였다. 가변부 PCR 프라이머를 사용하여, 중쇄 및 경쇄 양쪽의 가변부를 각각 또는 배합되어 증폭시키고, 디스플레이 패키지를 생성하는데 추가적 조작을 위하여 적절한 벡터내로 결찰시킨다. 증폭 프로토콜에 사용하는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 유일하거나 축퇴이거나 축퇴 위치에서 이노신을 통합할 수도 있다. 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열은 프라이머에 혼입되어, 발현을 위하여 지정된 해독 프레임에서 벡터내로 증폭된 단편의 클로닝을 허용할 수도 있다.
면역-유도된 항체 레퍼토리로부터 클로닝된 V-유전자 라이브러리는 바람직하게는 섬유상 파지에서 유래하는 디스플레이 패키지의 집단에 의하여 발현되어 항체 디스플레이 라이브러리를 형성할 수 있다. 디스플레이 패키지는 매우 널리 다양화된 항체 디스플레이 라이브러리를 샘플링, 각 친화성 분리 단계후 신속한 선별 및 정제된 디스플레이 패키지로부터 항체 유전자의 용이한 분리가 가능한 시스템을 포함하는 것이 이상적이다. 파지 디스플레이 라이브러리[예, 파마시아 재조합 파지 항체계, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 스트라타젠 SurfZAPTM파지 디스플레이 키트, 카탈로그 번호 240612] 생성용 상업적 시판 키트뿐 아니라, 다양화된 항체 디스플레이 라이브러리 생성에 특히 유용한 방법 및 시약을 예를 들면 문헌[Ladner et al. 미국 특허 제5,223,409호; Kang et al. 국제 공보 WO 92/18619; Dower etal. 국제 공보 WO 91/17271; Winter et al. 국제 공보 WO 92/20791; Makland et al. 국제 공보 WO 92/15679; Breitling et al. 국제 공보 WO 93/01288; McCafferty et al. 국제 공보 WO 92/01047; Garrard et al. 국제 공보 WO 92/09690; Ladner et al. 국제 공보 WO 90/02809; Fuchs et al. (1991)Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989)Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993)EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992)J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991)Nature 352:624-628; Gram et al. (1992)PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991)Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991)Nuc Acid Res 19:4133-4137; and Barbas et al. (1991)PNAS 88:7978-7982]에서 발견할 수 있다.
특정 구체예에서, 중쇄 및 경쇄의 V 영역 도메인은 단일쇄 Fv 단편을 형성하기 위한 가연성(flexible) 링커에 의하여 연결된 동일한 폴리펩티드에서 발현될 수 있다. scFV 유전자는 소정의 발현 벡터 또는 파지 게놈내로 클로닝할 수 있다. 일반적으로 문헌[McCafferty et al.,Nature(1990)348:552-554]에 개시된 바와 같이, 가연성(Gly4-Ser)3링커에 의하여 연결된 항체의 완전한 VH및 VL도메인은 디스플레이 패키지를 항원 친화성에 기초하여 분리할 수 있는 단일 쇄 항체를 생성하는데 사용할 수 있다. 항원과 면역반응성인 분리된 scFV 항체는 주제 방법에서 사용하기 위한 약학 제제로 제형화될 수 있다.
일단 디스플레이 패키지(예, 섬유상 파지)의 표면상에 나타나면, 항체 라이브러리는 표적 항원, 이것의 펩티드 단편으로 스크린하여 표적 항원에 특이성을 갖는 항체를 발현하는 패키지를 동정하고 분리한다. 선택된 항체를 암호화하는 핵산은 디스플레이 패키지로부터(예, 파지 게놈에서) 회수할 수 있고 표준 재조합 DNA 기법에 의하여 기타 발현 벡터내로 서브클로닝할 수 있다.
표면 단백질에 대한 고도의 친화성을 갖는 특이적 항체 분자는 라이브러리의 스크린을 포함하는 방법과 같이 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다[Ladner, R.C.,et al.,미국 특허 제5,233,409호; Ladner, R.C.,et al.,미국 특허 제5,403,484호]. 또한, 이러한 라이브러리의 방법은 항체의 구조적 결정기를 의태하는 결합 결정기를 얻기 위하여 스크린하는데 사용될 수 있다.
특히, 특정 항체 분자의 Fv 결합 표면은 단백질-단백질 상호작용의 원칙에 따라 이것의 표적 리간드와 상호작용한다. 따라서 VH및 VL(VL은 κ및 λ쇄 유형일 수 있음)의 서열 데이터가 당업자에 공지된 단백질 조작 기술을 위한 기본이다. 결합 결정기를 포함하는 단백질 표면의 자세한 정보는 NMR 연구 또는 결정학 데이터로부터 얻는 기타 항체로부터 이미 결정된 3차원 구조를 사용하여 모델링 과정에 의하여 항체 서열 정보로부터 획득할 수 있다. 참조예[Bajorath, J. and S. Sheriff, 1996,Proteins: Struct., Funct., and Genet. 24 (2), 152-157; Webster, D.M. and A. R. Rees, 1995, "Molecular modeling of antibody-combining sites,"in S. Paul, Ed.,Methods in Molecular Biol. 51,Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, pp 17-49; and Johnson, G., Wu, T.T. andE.A. Kabat, 1995, "Seqhunt: A program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences," inMethods in Molecular Biol.51, op. cit.,pp 1-15].
한 구체예에서, 다양화된 펩티드 라이브러리는 펩티드 디스플레이 라이브러리를 형성하는 디스플레이 패키지의 집단에 의하여 발현된다. 디스플레이 패키지는 매우 다양화된 펩티드 디스플레이 라이브러리의 샘플링, 각 친화성 분리 단계후 신속한 선별 및 정제된 디스플레이 패키지로부터 펩티드-암호화 유전자의 용이한 분리를 가능하게 하는 시스템을 포함하는 것이 이상적이다. 펩티드 디스플레이 라이브러리는 예컨대, 신속하게 증식할 수 있고 비교적 조작하기 쉬워서 다수의 클론을 제작할 수 있는 원핵생물 및 바이러스일 수 있다. 바람직한 디스플레이 패키지는 식물성 박테리아 세포, 박테리아 포자를 포함하며, 박테리아 바이러스(특히 DNA 바이러스)가 가장 바람직하다. 그러나, 본 발명은 또한 가능한 디스플레이 패키지로서 효모 및 이들의 포자를 포함하는 진핵세포의 용도를 포함한다. 파지 디스플레이 라이브러리는 상술되어 있다.
다른 방법으로 표적 항원과 같은 적절한 "수용체"를 사용한 친화성 크로마토그래피를 포함한다. 상기 방법은 통상적 기법(예, 매스 크로마토그래피 및 NMR)에 의하여 리간드 또는 분리된 결합제의 동정을 수반한다. 가용성 수용체는 리간드 결합을 표시하기 위하여 검출가능한 표지(예, 플루오로포어, 비색 효소, 방사성동위원소, 또는 냉광 화합물)와 접합하는 것이 바람직하다. 이와는 다른 방법으로, 고정된 화합물은 선택적으로 방출되어, 막을 통하여 확산되어 수용체와 상호작용할 수 있다.
화합물의 조합적 라이브러리는 라이브러리의 각 일원의 정체(identity)를 암호화하는 "태그"와 함께 합성될 수 있다[참조 문헌: W.C. Stillet al.,국제 출원 WO 94/08051]. 일반적으로, 상기 방법은 고형 지지체 또는 화합물에 부착되는 용이하게 검출가능한 불활성 태그의 사용을 특징으로 한다. 활성 화합물을 검출하는 경우, 상기 화합물의 정체는 독특한 수반 태그의 동정에 의하여 결정된다. 상기 태그화 방법은 라이브러리내 모든 화합물의 총 세트중에 매우 낮은 수준에서 동정할 수 있는 화합물의 대형 라이브러리의 합성을 가능하게 한다.
용어 개질된 항체는 또한 항체의 일부를 결실, 부가 또는 치환시킴으로써 개질된 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화된 항체와 같은 항체를 포함하도록 의도한다. 예를 들면, 항체는 힌지부를 결실시킴으로써 개질시켜, 일가 항체를 생성할 수 있다. 임의의 개질은 항체가 적어도 하나의 항원 결합 영역에 특이적인 한, 본 발명의 범위내에 있다.
키메라 마우스-인간 모노클로날 항체(즉, 키메라 항체)는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기법에 의하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 뮤린(또는 기타 종) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변부를 암호화하는 유전자는 뮤린 Fc를 암호화하는 영역을 제거하기 위하여 제한 효소에 의하여 절단되고, 인간 Fc 불변부를 암호화하는 유전자의 균등 부분으로 치환한다[참조예, 국제 특허 공보 PCT/US86/02269; Akira, et al., 유헙 특허 출원 184,187; Taniguchi, M., 유럽 특허 출원 171,496; Morrison et al., 유럽 특허 출원 173,494; Neuberger et al., 국제 출원 WO 86/01533; Cabilly et al. 미국 특허 4,816,567; Cabilly et al., 유헙 특허 출원 125,023;Better et al. (1988Science240:1041-1043); Liu et al.(1987)PNAS84:3439-3443; Liu et al., 1987,J. Immunol. 139:3521-3526;Sun et al. (1987)PNAS84:214-218; Nishimura et al., 1987,Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985)Nature314:446-449; and Shaw et al., 1998,J. Natl Cancer Inst.80:1553-1559].
키메라 항체는 인간 Fv 가변부 유래의 균등 서열로 항원 결합 항원에 직접 관여하지 않는 Fv 가변부의 서열을 대체함으로써 더욱 인간화될 수 있다. 인간화 키메라 항체의 일반적 개관은 문헌[Morrison, S. L., 1985,Science229:1202-1207 and by Oi et al., 1986,Bio Techniques4:214]에 의하여 제공된다. 상기 방법은 적어도 하나의 중쇄 또는 경쇄로부터 얻어진 면역글로불린 Fv 가변부의 전체 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열의 분리, 조작 및 발현을 포함한다. 상기 핵산의 원료는 당업자에게 공지되었고, 예를 들면 7E3 및 항-GPIIbIIIa항체 생성 하이브리도마로부터 얻을 수 있다. 키메라 항체를 암호화하는 재조합 DNA 또는 이것의 단편은 적절한 발현 벡터내로 클로닝할 수 있다. 적절한 인간화된 항체는 CDR 치환에 의하여 대안적으로 생성될 수 있다[미국 특허 5,225,539; Jones et al. 1986Nature321:552-525; Verhoeyan et al. 1988Science239:1534; and Beidler et al. 1988J. Immunol. 141:4053-4060].
특정 인간 항체의 모든 CDR은 비인간 CDR의 적어도 일부에 의하여 대체될 수 있거나 또는 CDR의 일부만이 비인간 CDR에 의하여 대체될 수 있다. Fc 수용체에 대한 인간화된 항체의 결합에 필요한 CDR의 수를 대체할 필요가 있다.
항체는 임의의 방법에 의하여 인간화될 수 있다. 상기 방법은 비인간 항체에서 유래되는 CDR을 사용하여 인간 항체의 CDR의 적어도 일부를 대체할 수 있다. Winter는 본 발명의 인간화 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 방법을 설명하였다[영국 특허 출원 GB 2188638A, 1987, 3, 26 자 출원, 이 내용은 본원에 명백하게 포함됨]. 인간 CDR은 올리고뉴클레오티드 위치-지정된 돌연변이유발법을 사용하여 비인간 CDR로 대체할 수 있다.
특정 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 키메라 및 인간화 항체는 본 발명의 범위에 포함된다. 특히, 바람직한 인간화 항체는 항원에 대한 결합을 향상시키기 위하여 골격구조 영역에서 아미노산 치환을 갖는다. 예를 들면, 마우스 CDR을 갖는 인간화 항체에서, 인간 골격구조 영역에 위치하는 아미노산은 마우스 항체내 상응 위치에 위치하는 아미노산으로 대체될 수 있다. 이러한 치환은 일부의 경우에서 항원에 대한 인간화 항체의 결합을 향상시키는 것으로 알려졌다. 아미노산이 추가, 결실 또는 치환된 항체는 개질된 항체 또는 변경된 항체로서 본원에서 의미한다.
표적 항원
바람직한 구체예로서, 본 발명의 융합 단백질의 한 성분은 표적, 예컨대, 항체, 리간드 또는 효소와 같이 표적에 대한 높은 친화성을 갖는 폴리펩티드와 같은 표적화 제제이다. 따라서, 본 발명의 융합 단백질은 바람직하지 않은 세포 가까이에 융합 단백질의 제2 성분을 선택적으로 지정(예, 위치화)하는데 사용될 수 있다.
예를 들면, 제1 성분은 표적 항원과 상호작용하는(예, 표적 항원에 결합하는) 면역글로불린일 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 항원은 예를 들면 이상증식 세포(예, 암 세포)와 같은 비정상 세포의 표면상에 존재한다. 예시적으로, 표적 항원은 태아성암항원(CEA), TAG-72, her-2/neu, 표피세포 성장 인자 수용체, 트랜스페린 수용체 등을 포함한다. 표적 항원은 태아성암항원이 바람직하다.
본원에서 사용된 용어 "표적 세포"는 본 발명의 융합 단백질에 의하여 표적화될 수 있는 대상(예, 인간 또는 동물)에서 임의의 바람직하지 않은 세포를 의미한다. 예시적 표적 세포는 암종 또는 선암종-유래 세포와 같은 종양 세포(예, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암 및 자궁내종양을 포함한다[Thor, A.et al. (1997)Cancer Res46: 3118; Soisson A.P.et al. (1989)Am.J. Obstet. Gynecol.:1258-63]. 용어 "암종"은 호흡계암, 위장관계암, 생식비뇨계암, 고환암, 유방암, 난소암, 전립선암, 내분비계암 및 흑색종을 포함한다. 예시적 암종은 자궁경부, 폐, 전립선, 유방, 머리 및 목, 대장 및 난소의 조직으로부터 형성된 것을 포함한다. 용어는 또한 암종성 또는 육종성 조직으로 구성된 악성 종양을 포함하는 암육종을 포함한다. "선암종"은 여기에 종양 세포가 인식가능한 과립 구조를 형성하거나 또는 과립 조직에서 유래된 암종을 의미한다. 용어 "육종"은 당업계에서 인식된 중간엽 유도의 악성 종양을 의미한다.
융합 단백질의 생성
융합 단백질의 성분은 서로 연결될 수 있으며, 바람직하게는 링커 서열에 의하여 연결될 수 있다. 링커 서열은 각 일원이 2차 및 3차 구조로 적절하게 폴딩하도록 충분한 거리로 융합 단백질의 제1 및 제2 성분을 분리해야 한다. 바람직한 링커 서열(1)은 가용성 신장된 배치를 채택해야 하고, (2) 기능성 제1 및 제2 성분과 상호작용할 수 있는 정렬된 2차 구조를 발전시키는 성향을 나타내서는 안되며, (3) 기능성 단백질 도메인과의 상호작용을 촉진시킬 수 있는 최소의 소수성 또는 하전 특성을 가져야 한다. 가용성 단백질 영역내에 통상적 표면 아미노산은 Gly, Asn 및 Ser를 포함한다. Gly, Asn 및 Ser을 함유하는 아미노산 서열의 퍼뮤태이션(permutation)은 링커 서열에 대한 상기 기준을 만족할 것으로 기대될 것이다. 기타 가까운 중성 아미노산, 예를 들면 Thr 및 Ala는 링커 서열에서 사용될 수 있다.
긴 또는 짧은 링커 서열이 사용될 수 있지만, 20개 아미노산의 링커 서열 길이는 기능성 단백질 도메인의 적절한 분리를 제공하는데 사용될 수 있다. 제1 및 제2 성분을 분리하는 링커 서열의 길이는 5 내지 500 아미노산 길이일 수 있고, 바람직하게는 5 내지 100 아미노산 길이일 수 있다. 바람직하게는 링커 서열은 약 5 내지 30 아미노산 길이이다. 바람직하게는, 링커 서열은 5 내지 20 아미노산이며, 약 10 내지 20 아미노산이 유리한다. 제1 및 제2 부분의 링커로서 유용한 아미노산 서열은 (SerGly4)y(여기서, y는 8이상) 또는 Gly4SerGly5Ser를 포함하며 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 링커 서열은 식 (SerGly4)4를 갖는다. 또다른 바람직한 링커는 서열 (Ser-Ser-Ser-Ser-Gly)3-(Ser-Pro)을 갖는다.
제1 및 제2 성분은 링커 서열없이 직접 융합될 수 있다. 링커 서열은 융합된단백질이 기능성 도메인을 분리하고 입체적 방해를 막는데 사용될 수 있는 비필수 N- 또는 C- 말단 아미노산 영역을 갖는 경우에 불필요하다. 바람직한 구체예에서 제1 성분의 C-말단은 제2의 N-말단에 직접 융합될 수 있으며, 그 반대도 가능하다.
재조합체 생성
본 발명의 융합 단백질은 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 사용하여 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 표준 DNA 합성 방법에 의하여 합성할 수 있다.
융합 단백질을 암호화하는 핵산은 일차 또는 불멸 세포주의 세포와 같은 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 재조합 세포는 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 예를 들면 상동성 재조합에 의하여 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 대부분의 경우에, 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 재조합 발현 벡터내로 삽입될 수 있다.
융합 단백질을 암호화하는 핵산은 발현에 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택된 하나 이상의 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 여결된"은 융합 단백질의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(들)에 연결되는 것을 의미한다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인헨서 및 기타 발현 조절 인자(예, 폴리아데닐화 신호)를 의미한다. 이러한 조절 서열은 문헌[Goeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic press, San Diego, CA (1990)]에 설명된다. 상기 문헌의 내용은 본원에서 참고로 통합된다. 조절 서열은 다수 유형의 숙주 세포내 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 지시하는 것, 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것(예, 조직-특이적 조절 서열) 및 조절가능한 방식으로 발현을 지시하는 것(예, 유도제의 존재에서만)을 포함한다. 당업자는 발현 벡터의 설계가 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 의도하는 융합 단백질의 발현 등에 의하여 상기 인자에 따라 달라질 수 있음을 인식할 것이다. 융합 단백질 발현 벡터는 숙주 세포내로 도입되어 핵산에 의하여 암호화되는 융합 단백질을 생성할 수 있다.
재조합 발현 벡터는 원핵세포 또는 진핵세포에서 융합 단백질이 발현되도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 이.콜리와 같은 박테리아 세포, 곤충 세포(예, 바큘로바이러스 발현계), 효모 세포 또는 포유류 세포내에서 발현될 수 있다. 일부 적절한 숙주 세포는 문헌[Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), Examples of vectors for expression in yeast S. cerevisiae include pYepSecl (Baldariet al., (1987)EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982)Cell 30:933-943), pJRY88(Schultzet al.,(1987)Gene 54:113-123), and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Baculovirus vectors available for expression of fusion proteins in cultured insect cells (e.g.,Sf9 cells) include the pAc series (Smithet al., (1983)Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165) and the pVL series (Lucklow, V.A., and Summers, M.D., (1989)Virology 170:31-39)]에서 추가로 설명된다.
포유류 발현 벡터의 예는 pCDM8[Seed, B., (1987)Nature 329:840) andpMT2PC (Kaufmanet al. (1987),EMBO J. 6:187-195]를 포함한다. 포유류 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 바이러스 조절 인자에 의하여 종종 제공된다. 예를 들면, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시토메갈로바이러스 및 시미안 바이러스 40에서 유래한다.
상술된 조절 제어 서열뿐 아니라, 재조합 발현 벡터는 추가적 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 재조합 발현 벡터는 벡터를 삽입한 숙주 세포를 동정하도록 선택적 마커 유전자를 암호화할 수 있다. 또한, 숙주 세포, 특히 포유류 숙주 세포로부터 융합 단백질의 분비를 용이하게 하기 위하여, 재조합 발현 벡터는 융합 단백질의 아미노 말단을 암호화하는 서열에 작동적으로 연결된 신호 서열을 암호화할 수 있으므로, 발현시에 융합 단백질은 그것의 아미노 말단에 융합된 신호 서열과 함께 합성된다. 이러한 신호 서열은 융합 단백질을 세포의 분비 경로로 보내고 이어서 절단되어, 숙주 세포로부터 성숙한 융합 단백질(즉, 신호 서열이 없는 융합 단백질)을 방출시킨다. 포유류 숙주 세포로부터 단백질 또는 펩티드의 분비를 용이하게 하는 신호 서열의 사용은 당업계에 공지되었다. 벡터 DNA는 통상적 형질전환 또는 형질감염 기법에 의하여 원핵세포 또는 진핵세포내로 도입될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션, 전기침공, 미세주입 및 바이러스 매개된 형질감염과 같은 외부 핵산을 숙주 세포내로 도입하기 위한 당업계에 인식된 다양한 기법을 의미한다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염하기 위한 적절한 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ndEdition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)] 및 기타 실험 매뉴얼에서 발견할 수 있다.
종종 포유류 세포의 작은 분획만이 외부 DNA를 이들의 게놈내로 삽입한다. 이러한 삽입체를 동정 및 선택하기 위하여, 선택가능한 마커(예, 항생제에 내성)를 암호화하는 유전자는 융합 단백질을 암호화하는 유전자와 함께 숙주 세포내로 도입될 수 있다. 바람직한 선택가능한 마커는 G418, 히그로마이신 및 메토트렉세이트와 같은 약물에 내성을 부여하는 것을 포함한다. 선택가능한 마커를 암호화하는 핵산은 융합 단백질을 암호화하는 것과 동일한 벡터에서 숙수 세포내로 통합될 수 있거나 또는 분리된 벡터에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질전환된 세포는 약물 선택에 의하여 동정될 수 있다(예, 선택가능한 마커 유전자를 통합한 세포는 생존할 수 있지만 그 외의 세포는 죽을 것이다).
재조합 발현 벡터는 T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합 효소를 사용하여 시험관내에서 전사 및 번역될 수 있다.
트랜스제닉 포유류
비인간 트랜스제닉 동물을 생성하는 방법은 본원에서 설명된다. DNA 구조체는 포유동물의 생식세포주에 도입하여 트랜스제닉 포유류를 제조할 수 있다. 예를 들면, 구조체의 하나 또는 수개의 카피를 표준 형질전환 기법에 의하여 포유류 배아의 게놈내로 삽입할 수 있다.
트랜스제닉 포유류의 유액내에 트랜스제닉 단백질을 발현시키는 것이 종종 바람직하다. 대량의 유액을 생산하고 긴 수유 기간을 갖는 포유류가 바람직하다.바람직한 포유류는 소, 양, 낙타 또는 염소(예, 알파인, 사아넨 및 토겐버그 종 염소같은 스위스 기원의 염소)와 같은 반추동물이다. 기타 바람직한 동물은 황소, 토끼 및 돼지를 포함한다.
예시적 구체예로서, 트랜스제닉 비인간 동물은 비인간 동물의 생식세포내로 트랜스유전자를 도입함으로써 생성된다. 트랜스유전자는 다양한 발달 단계에서 배아 표적 세포내로 도입될 수 있다. 다른 방법은 배아성 표적 세포의 발달 단계에 따라 사용된다. 사용된 임의의 동물의 특정 계(들)는 가능한한 우수한 일반적 건강 상태, 우수한 배아 수율, 배아내에서 우수한 전핵 가시성 및 우수한 재생 적합성에 대하여 선별하여야 한다.
배아내로 융합 단백질 트랜스유전자의 도입은 미세주입, 전기침공 또는 리포펙션과 같은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질 트랜스유전자는 수정된 포유류 난(들)의 전핵내로 구조체를 미세주입함으로써 포유류내에 도입되어 구조체의 하나 이상의 카피가 발생 포유류의 세포내에 유지되도록 만들 수 있다. 수정된 난내로 트랜스제닉 구조체를 도입한 후, 난을 상이한 시간동안 시험관내에서 항온배양하거나 또는 대리모 숙주내에서 재이식하거나 또는 양쪽 모두를 할 수 있다. 통상적 방법은 종에 따라 다르지만 약 1 내지 7일동안 시험관내에서 배아를 항온배양하고, 이후 대리모 숙주내로 재이식하는 것이다.
형질전환에 의하여 조작된 배아의 자손은 조직의 단편의 서던 블롯에 의하여 구조체의 존재를 시험할 수 있다. 게놈내로 안정하게 통합된 외인성 클론 구조체의하나 이상의 카피를 갖는 배아는 형질전환에 의하여 추가된 구조체를 보유하는 영구적 트랜스제닉 포유류를 수립하는데 사용될 수 있다.
형질전환에 의하여 변형된 포유류의 새끼는 자손의 게놈내로 구조체가 삽입되었는지 여부를 출생후 분석할 수 있다. 이는 자손에서 유래한 염색체 물질상에 융합 단백질 또는 이것의 단편을 암호하는 DNA 서열에 상응하는 프로브를 혼성화시킴으로써 수행된다. 게놈내에 구조체의 적어도 하나의 카피를 함유하는 것으로 발견된 상기 포유류 자손을 성장시켰다. 이 자손의 암컷 종은 이들의 유액내 또는 이와 함께 바람직한 단백질을 생성할 것이다. 트랜스제닉 포유류는 이들의 유액내 바람직한 단백질을 생성하는데 사용하는 기타 트랜스제닉 자손을 생성하기 위하여 양육될 것이다.
트랜스제닉 암컷은 웨스턴 블롯 또는 효소 분석과 같은 공지의 분석 기법을 사용하여 유액내로의 단백질 분비에 대하여 시험될 수 있다.
기타 트랜스제닉 동물
융합 단백질은 다양한 트랜스제닉 동물로부터 발현될 수 있다. 트랜스제닉 돼지의 생성을 위한 프로토콜은 문헌[White and Yannoutsos,Current Topices in Complement Research: 64th Forum in Immunology,pp. 88-94; 미국 특허 5,523,226; 미국 특허 5,573,933; PCT 출원 WO 93/25071; 및 PCT 출원 WO 95/04744]에서 발견할 수 있다. 트랜스제닉 마우스의 생성에 대한 프로토콜은 문헌[ Bader and Ganten,Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,Supp. 3:S81-S87, 1996. A protocol for the production of atransgenic cow can be found inTransgenic Animal Technology, A Handbook,1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Inc. A protocol for the production of a transgenic sheep can be found inTransgenic Animal Technology, A Handbook,1994, et., Cari A. Pinkert, Academic Press, Inc. A protocol for the production of a transgenic rabbit can be found in Hammer et al.,Nature315:680-683, 1985 and Taylor and Fan,Frontiers in Bioscience2:d298-308, 1997]에서 발견될 수있다.
트랜스제닉 동물의 유액내 트랜스제닉 단백질의 생성
유액 특이적 프로모터
유용한 전사 프로모터는 카세인, 베타 락토글로불린과 같은 유단백질을 암호화하는 유전자를 조절하는 프로모터를 포함하는 유방 상피세포내에서 우선적으로 활성되는 프로모터이다[Clark et al., (1989)Bio/Technology 7: 487-492), whey acid protein (Gorton et al. (1987)Bio/Technology 5: 1183-1187), and lactalbumin (Soulier et al. (1992)FEBS Letts. 297:13]. 임의의 포유류 종의 알파, 베타, 감마 또는 카파 카세인 유전자 프로모터는 유방 발현을 제공하는데 사용된다; 바람직한 프로모터는 염소 베타 카세인 유전자 프로모터이다[DiTullio, (1992)Bio/Technology 10:74-77]. 유액-특이적 단백질 프로모터 또는 유방 조직에서 특이적으로 활성화되는 프로모터는 cDNA 또는 게놈 서열로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는 이들은 게놈 기원이다.
DNA 서열 정보는 적어도 하나, 종종 수개의 유기체에서 상술된 유선 특이적유전자에 대하여 알려져 있다[Richards et al.,J. Biol. Chem.256, 526-532 (1981) (α-lactalbumin rat); Campbell et al.,Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697 (1984)(rat WAP);Jones et al.,J.Biol, Chem.260, 7042-7050(1985)(rat β-casein); Yu-Lee & Rosen,J. Biol. Chem.258, 10794-10804 (1983)(rat γ- casein); Hall,Biochem. J.242, 735-742 (1987)(α-lactalbumin human); Stewart,Nucleic Acids Res. 12, 389 (1984)(bovine αsl and κcasein cDNAs); Gorodetsky et al.,Gene66, 87-96 (1988) (bovine βcasein); Alexander et al., Eur.J. Biochem.178 395-401 (1988)(bovine κcasein); Brignon et al.,FEBS Lett.188, 48-55 (1977)(bovine αS2 casein); Jamieson et al.,Gene61, 85-90 (1987), Ivanov et al.,Biol. Chem.Hoppe-Seyler 369, 425-429 (1988), Alexander et al.,Nucleic AcidsRes. 17, 6739 (1989)(bovine βlactoglobulin); Vilotte et al.,Biochimie69, 609-620 (1987)(bovine α-lactalbumin)]. 다양한 유단백질 유전자의 구조 및 기능은 문헌[Mercier & Vilotte,J. Dairy Sci.76, 3079-3098 (1993)]에 의하여 검토되었다. 추가적 플랭킹(flanking) 서열이 발현을 최적화시키는데 유용하다면, 이 서열은 프로브로서 기존의 서열을 사용하여 클로닝할 수 있다. 다른 유기체에서 유래한 유선 특이적 조절 서열은 프로브로서 공지된 동족의 뉴클레오티드 서열 또는 동족 단백질에 대한 항체를 사용하여 상기 유기체로부터 라이브러리를 스크린함으로써 얻을 수 있다.
신호 서열
유용한 신호 서열은 진핵세포 단백질 또는 원핵세포 단백질의 분비를 유도하는 유액-특이적 신호 서열 또는 기타 신호 서열이다. 바람직하게는 신호 서열은 유액-특이적 신호 서열, 즉 유액으로 분비되는 생성물을 암호화하는 유전자로부터 선택된다. 더욱 바람직하게는, 유액-특이적 신호 서열은 본 발명의 발현계에서 사용되는 유액-특이적 프로모터와 관련이 있다. 신호 서열의 크기는 본 발명에 중요하지 않다. 요구되는 것은 예컨대, 유방 조직에서 소정의 재조합 단백질을 분비시키는데 충분한 크기의 서열이다. 예를 들면, 카세인(예, 알파, 베타, 감마 또는 카파 카세인), 베타 락토글로불린, 유장산 단백질 및 락트알부민을 암호하는 유전자에서 유래된 신호 서열이 본 발명에서 유용하다. 바람직한 신호 서열이 염소 β-카세인 신호 서열이다.
면역글로불린과 같은 기타 분비된 단백질 또는 간세포, 신장세포 또는 췌장세포에 의하여 분비되는 단백질에서 유래한 신호 서열이 유용할 수 있다.
인설레이터(insulator) 서열
본 발명의 DNA 구조체는 하나 이상의 인설레이터 서열을 추가로 포함한다. 용어 "인설레이터", "인설레이터 서열" 및 "인설레이터 인자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 인설레이터 인자는 작용의 범위내에서 위치하는 유전자의 전사를 인설레이트하지만 음성적으로 또는 양성적으로 유전자 발현을 방해하지 않는 조절 인자이다. 바람직하게는 인설레이터 서열은 전사되는 DNA 서열의 임의의 측에 삽입된다. 예를 들면, 인설레이터는 프로모터로부터 5'에 약 200 bp 내지 약 1 kb에 위치할 수 있고, 목적하는 유전자의 3' 말단에 프로모터로부터 적어도 약 1 kb 내지 5 kb에 위치할 수 있다. 목적하는 유전자의 3'말단 및 프로모터로부터 인설레이터서열의 거리는 구조체에 사용되는 프로모터, 인헨서 및 목적 유전자의 상대적 크기에 따라 당업자에 의하여 결정될 수 있다. 또한, 하나 이상의 인설레이터 서열은 트랜스유전자의 3' 말단 또는 프로모터로부터 5'에 위치할 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 인설레이터 서열이 프로모터 5'에 위치할 수 있다. 트랜스유전자의 3' 말단에 위치한 인설레이터(들)는 목적 유전자의 3' 말단 또는 3'조절 서열의 3'말단(예, 3' 비번역 영역(UTR) 또는 3' 플랭킹 서열)에 위치할 수 있다.
바람직한 인설레이터는 치킨 β-글로빈 유전자좌의 5' 말단을 포함하고 치킨 5' 구성적 고감도 위치에 상응하는 DNA 단편이다[PCT 공보 94/23046에 개시, 본원에서 참고로 통합됨].
DNA 구조체
융합 단백질은 유방 상피세포에 특이적인 프로모터(예, 카세인 프로모터, 염소 베타 카세인 프로모터), 유액 특이적 신호 서열(예컨대 카세인 신호 서열, β-카세인 신호 서열) 및 융합 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 구조체로부터 발현된다.
구조체는 비분비 단백질을 암호화하는 DNA 서열의 하류 3' 비번역 영역을 포함한다. 상기 영역은 발현계의 RNA 전사체를 안정화시킬 수 있으므로, 발현계로부터 소정의 단백질의 수율을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 구조체에 유용한 3' 비번역 영역중에 폴리 A 신호를 제공하는 서열이 존재한다. 이러한 서열은 예컨대 SV40 소형 t 항원, 카세인 3' 비번역 영역 또는 공지된 기타 3' 비번역 서열로부터 유래할 수 있다. 바람직하게는, 3' 비번역 영역은 유액 특이적 단백질로부터 유래한다.3'비번역 영역의 길이는 중요하지 않지만, 폴리 A 전사체의 안정화 작용은 발현 서열의 RNA를 안정화시키는데 중요한 것처럼 보인다.
구조체는 신호 서열을 암호화하는 DNA 서열 및 프로모터간에 5'비번역 영역을 포함할 수 있다. 이러한 비번역 영역은 주어진 프로모터와 동일한 조절 영역으로부터 유래할 수 있으나 다른 유전자로부터 유래할 수 있다. 예를 들면, 이들은 기타 합성, 반합성 또는 천연 원료로부터 유래할 수 있다. 또한 이들의 특정 길이는 중요하지 않지만, 발현의 수준을 향상시키는데 유용한 것으로 보인다.
구조체는 유방 상피 세포에서 우선적으로 발현되는 유전자의 N-말단 암호 영역의 약 10%, 20%, 30% 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, N-말단 암호 영역은 사용된 프로모터(예, 염소 β-카세인 N-말단 암호 영역)에 상응할 수 있다.
선행 방법은 구조체를 제조하고, 트랜스제닉 동물내에 구조체를 위치시키기 전에 배양된 세포내에 생성물을 생산하는 능력에 대하여 이를 시험하는 것을 포함할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명자들은 이러한 프로토콜이 정상적인 비분비 단백질이 예를 들어 트랜스제닉 동물의 유액에서 분비될 수 있는지를 결정하는데 있어 예측성이 떨어짐을 발견하였다. 따라서, 트랜스제닉 마우스와 같은 트랜스제닉 동물에서 구조체를 직접 시험하는 것이 바람직할 것이다. 왜냐하면 CHO 세포에 분비되지 않는 일부 구조체가 트랜스제닉 동물의 유액으로 분비되기 때문이다.
유액으로부터 정제
트랜스제닉 융합 단백질은 비교적 고농도 및 대량으로 유액에서 생성될 수 있으며, 재생가능한 원료로부터 용이하게 회수되는 정상적으로 처리된 펩티드를 연속적으로 고농도로 산출할 수 있다. 유액으로부터 단백질을 분리하는 방법이 당업계에 다수 공지되어 있다.
유단백질은 공정의 조합에 의하여 분리한다. 가공하지 않은 유액은 먼저 지방을 제거하여 분류한다(예를 들면, 탈지, 원심분리, 침전)[H.E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982), acid precipitation (미국 특허 4,644,056) 또는 enzymatic coagulation with rennin or chymotrypsin (Swaisgood, 상기문헌)]. 다음에, 주요 유단백질을 목적하는 특정 단백질이 용이하게 정제될 수 있는 많은 침전물 또는 맑은 용액내로 분획할 수 있다.
USSN 08/648,235는 접선 플로우 여과에 의하여 전체 유액 또는 유액 분획으로부터 생물학적 활성인 가용성 유액 성분, 예를 들면 펩티드를 분리하는 방법을 개시한다. 이전의 분리 방법과는 달리, 이것은 전체 유액의 제1 분획에서 지방 및 카세인 미셀을 제거할 필요가 없으므로, 회수 및 생활성의 유실을 피할 수 있고 공정을 단순화시킬 수 있다. 이러한 방법은 오염물질을 제거하고 목적 성분을 더욱 정제하기 위하여 추가적 정제 단계와 함께 사용할 수 있다.
트랜스제닉 동물의 난에서 트랜스제닉 단백질의 생성
융합 단백질은 트랜스제닉 동물내 조직, 분비물 또는 기타 생성물(예를 들면, 난)에서 생성될 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 공지의 방법[Sang et al., Trends Biotechnology, 12:415-20, 1994]을 사용하여 트랜스제닉 동물(바람직하게는 트랜스제닉 칠면조, 오리, 기러기, 아메리카타조, 구이니아 가금, 공작, 엽조,뇌조, 비둘기 및 더욱 바람직하게는 트랜스제닉 치킨)의 난에서 생성할 수 있다. 난황-단백질 유전자 및 알부민-단백질 유전자와 같은 난에서 특이적으로 발현되는 단백질을 암호화하는 유전자는 융합 단백질의 발현을 지시하도록 개질될 수 있다.
난 특이적 프로모터
유용한 전사 프로모터는 난에서 우선적으로 활성화되는 프로모터이며, 오브알부민, 리소자임 및 아비딘과 같은 난 단백질을 암호화하는 유전자를 조절하는 프로모터를 포함한다. 치킨 오브알부민, 리소자임 또는 아비딘 유전자에서 유래한 프로모터가 바람직하다. 난-특이적 단백질 프로모터 또는 난 조직에서 특이적으로 활성화되는 프로모터들은 cDNA 또는 게놈 서열에서 유래할 수 있다. 바람직하게는, 난-특이적 프로모터는 게놈 기원이다.
난 특이적 유전자의 DNA 서열은 당업계에 공지되었다[Burley et al., "The Avian Egg", John Wiley and Sons, p. 472, 1989, 본원에서 참고로 통합됨]. 추가적 플랭킹 서열은 발현을 최적화시키는데 유용한 경우, 상기 서열은 프로브로서 기존의 서열을 사용하여 클로닝할 수 있다. 다른 유기체 유래의 난 특이적 조절 서열은 프로브로서 공지된 동족 뉴클레오티드 서열 또는 동족 단백질에 대한 항체를 사용하여 상기 유기체로부터 라이브러리를 스크린하여 얻을 수 있다.
트랜스제닉 식물
융합 단백질은 트랜스제닉 유기체, 예를 들면 트랜스제닉 식물, 즉 핵의 게놈 또는 기생 게놈내로 삽입된 DNA 트랜스유전자를 갖는 트랜스제닉 식물에서 발현될 수 있다[참고문헌Methods in EnzymologyVol. 153 ("Recombinant DNA Part D")1987, Wu and Grossman Eds., Academic Press and European Patent Application EP 693554].
외부 핵산은 일부 방법에 의하여 식물 세포 또는 원형질내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 핵산은 미세피펫을 사용하여 식물 세포로 직접 미세주입에 의하여 기계적으로 이전될 수 있다[Paszkowski et al. (1984)EMBOJ. 3:2712-22]. 외부 핵산은 세포에 의하여 흡수된 유전 물질과 함께 침전 복합체를 형성하는 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 식물 세포내로 이전할 수 있다[Fromm et al. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82:5824]. 이러한 기법에서, 식물 원형질체는 적절한 유전자 구조체를 함유하는 플라스미드 또는 핵산의 존재하에서 전기침공된다. 높은 장세기의 전기적 충격은 가역적으로 생체막을 투과시켜서 플라스미드를 도입할 수 있다. 전기침공된 식물 원형질은 세포벽을 재형성, 분열 및 식물 칼러스를 형성한다. 형질전환된 유전자를 갖는 형질전환된 식물 세포의 선택은 표현형 마커를 사용하여 수행할 수 있다.
컬리플라워 모자이크 바이러스(CaMV)는 외부 핵산을 식물 세포로 도입하기 위한 벡터로서 사용할 수 있다[Hohn et al. (1982) "Molecular Biology of Plant Tumors," Academic Press, New York, pp. 549-560; Howell, U.S. Pat. No. 4,407,956]. CaMV 바이러스 DNA 게놈은 모 박테리아 플라스미드내로 삽입하여 박테리아로 증식될 수 있는 재조합 DNA 분자를 제조한다. 재조합 플라스미드는 소정의 DNA 서열의 도입에 의하여 추가로 개질될 수 있다. 재조합 플라스미드의 개질된 바이러스 일부는 모 박테리아 플라스미드로부터 절단되어 식물 세포 또는 식물을 접종하는데 사용한다.
소형 입자에 의한 고속 탄도 관통은 식물 세포내로 외부 핵산을 도입하는데 사용될 수 있다. 핵산은 소형 비드 또는 입자의 매트릭스내에 또는 표면상에 위치시킨다[Klein et al. (1987)Nature327:70-73]. 통상적으로 신규한 핵산 단편의 일회 도입을 요구하지만, 상기 방법은 복수의 도입을 가능하게 한다.
핵산은 식물 세포, 외식체(explant), 분열조직 또는 종자를 핵산으로 형질전환된 아그로박테리움 투머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)로 식물 세포를 감염시켜 식물 세포내로 도입할 수 있다. 적절한 조건하에서, 형질전환된 식물 세포는 성장하여 발아, 뿌리를 형성하고 식물로 발달한다. 핵산은 예컨대, 아그로박테리움 투머파시엔스의 Ti 플라스미드에 의하여 식물 세포내로 도입될 수 있다. Ti 플라스미드는 아그로박테리움 투머파시엔스에 의하여 감염시 식물 세포로 이전되고 식물 게놈으로 안정적으로 통합된다[Horsch et al. (1984) "Inheritance of Functional Foreign Genes in Plants,"Science233:496-498;Fraley et al. (1983)Proc. Natl. Acad. Sci USA80:4803].
원형질체가 분리되고 배양되어 완전한 식물로 재생될 수 있는 식물은 형질전환되면 이전 외부 유전자를 함유하는 전체 식물을 회수할 수 있다. 일부 적절한 식물은 예를 들면, 속 프라가리아(Fragaria), 로터스(Lotus), 메디카고(Medicago), 오노브리키스(Onobrychis), 트리폴리움(Trifolium), 트리고넬라(Trigonella), 비그나(Vigna), 시트루스(Citrus), 리넘(Linum), 게라니움(Geranium), 마니호트(Manihot), 다우쿠스(Daucus), 아라비돕시스(Arabidopsis),브라시카(Brassica), 라파너스(Raphanus), 시나피스(Sinapis), 아트로파(Atropa), 캅시쿰(Capsicum), 히오스시아머스(Hyoscyamus), 리코퍼시콘(Lycopersicon), 니코티아나(Nicotiana), 솔라넘(Solanum), 페투니아(Petunia), 디지탈리스(Digitalis), 마조라나(Majorana), 시오호리움(Ciohorium), 헬리안투스(Helianthus), 락투카(Lactuca), 브로무스(Bromus), 아스파라거스(Asparagus), 안터리눔(Antirrhinum), 헤레로칼리스(Hererocallis), 네메시아(Nemesia), 펠라고니엄(Pelargonium), 파니컴(Panicum), 펜니세텀(Pennisetum), 라눈쿨러스(Ranunculus), 세네시오(Senecio), 살피그로시스(Salpiglossis), 쿠쿠미스(Cucumis), 브로와아리아(Browaalia), 글리신(Glycine), 롤리움(Lolium), 지아(Zea), 트리티컴(Triticum), 소르검(Sorghum) 및 다투라(Datura) 유래의 종을 포함한다.
배양된 원형질체로부터 식물의 재생은 문헌[Evans et al., "Protoplasts Isolation and Culture,"Handbook of Plant Cell Cultures1:124-176 (MacMillan Publishing Co. New York 1983); M.R. Davey, "Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplasts," protoplast (1983)-Lecture Proceedings, pp. 12-29, (Birkhauser, Basal 1983); P.J. Dale, "Protoplast Culture and Plant Regeneration of Cereals and Other Recalcitrant Crops," Protoplasts (1983)-Lecture Proceedings, pp. 31-41, (Birkhauser, Basel 1983); and H. Binding, "Regeneration of Plants,"Plant Protoplasts, pp. 21-73, (CRC Press, Boca Raton 1985]에 설명된다.
원형질체로부터의 재생은 식물의 종에 따라 다양하지만, 외인성 서열의 카피를 함유하는 형질전환 원형질체의 현탁액을 먼저 제조하는 것이 일반적이다. 특정 종에서는 이후 원형질 현탁액으로부터 천연 배아로서 숙성 및 발아 단계로 배아 형성이 유도될 수 있다. 배양 배지는 옥신 및 시토키닌과 같은 다양한 아미노산 및 호르몬을 함유할 수 있다. 또한 특히 옥수수 및 자주개자리와 같은 종에서는 배지에 글루탐산 및 프롤린을 첨가하는게 유리할 수 있다. 새싹 및 뿌리는 일반적으로 동시에 발달한다. 효율적 재생은 배지, 배양의 경과 과정 및 유전자형에 따라 좌우된다. 이러한 3개의 변수가 조절된다면, 충분히 재생가능하고 반복가능할 것이다.
무성적으로 증식된 작물에서, 성숙한 트랜스제닉 식물은 꺾꽂이에 의하여 또는 생성물 특징에 대한 시험과 같은 시도를 위한 복수의 동일한 식물을 생성하는 조직 배양 기법에 의하여 증식할 수 있다. 소정의 트랜스제닉 식물을 선택할 수 있으며 신규한 변종이 얻어지므로 사업적 용도로 무성적으로 번식된다. 종자 번식에 의한 작물에서, 성숙한 트랜스제닉 식물은 동종접합성 근교배 식물을 생성하기 위하여 자가 교배될 수 있다. 상기 근교배 식물은 새로 도입된 외부 유전자 활성 수준에 대하여 유전자를 함유한 종자를 생성한다. 이러한 종자는 성장하여 선택된 표현형을 갖는 식물을 생성할 수 있다. 이러한 방법에서 선택된 근교계는 또다른 근교계와 교배하여 하이브리드를 생성할 수 있다.
트랜스제닉 식물에서 얻어진 일부, 예를 들면 꽃, 종자, 잎, 가지, 열매 등은 이러한 일부가 형질전환된 세포를 포함한다면 본 발명의 범위에 속한다. 자손 및 변종 및 재생된 식물의 돌연변이는 이러한 일부가 도입된 DNA 서열을 포함하는경우에만 본 발명의 범위에 속한다. 자손 및 변종 및 재생된 식물의 돌연변이는 발명의 범위에 속한다.
트랜스제닉 식물 또는 식물 색소의 선택은 색상 변화(예, 백색꽃, 가변적 색소 생성, 및 꽃에서 균일한 색상 양태 또는 불규칙 양태)와 같은 시각적 분석에 기초할 수 있으나, 효소 활성 또는 생성물 양의 생화학적 분석을 포함하지 않을 것이다. 트랜스제닉 식물 또는 식물 세포는 목적하는 식물 일부를 갖는 식물로 성장하고 유전자 활성이 시각적 외관(플라보노이드 유전자에서) 또는 생화학적 분석(노던 블롯); 웨스턴 블롯; 효소 분석 및 분광기를 포함하는 플라보노이드 화합물 분석에 의하여 모니터된다[참조예, Harborne et al., (Eds.), (1975) The Flavonoids, Vols:1 and 2, [Acad. Press]]. 적절한 식물이 선택되고 추가로 평가된다. 유전자적으로 조작된 식물을 재생하는 방법은 미국 특허 5,283,184, 미국 특허 5,482,852 및 유럽특허출원 EP 693 554에 설명된다. 상기 특허는 본원에 참고로 통합된다.
본 발명의 구체예는 다음의 실시예에 의하여 예시되며 이에 한정되어서는 안된다. 본원을 통하여 인용된 모든 참고문헌의 내용(문헌 참조, 발행된 특허, 공개된 특허 출원 및 공동 특허 출원 등)은 본원에서 참고로 통합된다.
실시예 1 : 항체-카르복시펩티다제 B 융합체의 생성 및 시험
F(ab')2-효소 융합 단백질을 염소 베타-카제인 발현 벡터 BC350에 서브클로닝하였다. 3 구조체[213(MF21q3-13, Fd-효소 융합 유전자), LC(LC3, 경쇄), 및 141(MF141-4, C-말단 류신을 가진 프로 도메인)] 각각에 대해, 박테리아 플라스미드 서열로부터 발현 카세트를 분리하였다. 이어서 3개의 트랜스유전자를 마우스 접합체에 함께 미세주사하였다. F(ab')2-효소 융합 단백질 항체의 3개 서브유니트 모두를 보유한 일곱개의 트랜스제닉 마우스 계(lines)와 트랜스유전자 LC와 213만을 보유한 세개의 마우스 계를 분석하였다. 조상과 제1세대 암컷으로부터 유액 샘플을 모으고, ELISA 및 효소 활성 분석에 대해 시험하였다. 3개의 트랜스 유전자를 보유한 일곱개의 계 중 네개는 1mg/ml보다 우수한 정도로(가능하게는 최대 4-6mg/ml) F(ab')2-효소 융합 단백질을 발현하는 반면, LC와 213 트랜스유전자만을 보유한 세 계는 0.1mg/ml보다 못한 정도로 발현한다.
변형된 사람 카르복시펩티다제 B 효소에 융합된 인간화된 항-태아성암 항원(CEA)F(ab')2, 806.077을 포함하는 인간화된 항체 단편-효소 융합 단백질(F(ab')2-CPB)을 발현하는 트랜스제닉 마우스를 생성하였다. 이들 트랜스제닉 마우스는 세 개의 염소 베타-카제인 유선 발현 구조체를 함께 미세주사함으로써 생성되었다. 한 구조체, 141(MF141-4, C-말단 류신을 가진 프로 도메인)은 CPB의 프로-도메인을 발현하였으며, 다른 두 구조체, LC와 213은(각각 경쇄와 Fd-효소 융합 유전자) 항체-CPB 융합체를 발현하였다. CPB 프로-도메인의 인 트랜스(in trans)발현은 이전에 수행된 실험에서 성숙한 CPB에 기초한 융합 단백질의 적절한 접힘을 위해 필요한 것으로 나타났다.
재료 및 방법
제한 효소는 뉴 잉글랜드 바이로랩(비벌리, 매사츄세츠)에서 구입하였다. 나일론 막(마그나그래프 나일론 이전 막)은 마이크론 세파스레이션 인크.(MSI, Westboro, MA 10581)로부터 구입하였다. 알파32P-dATP는 NEN 라이프 사이언스 프로덕츠, 인크.(보스톤, 매사츄세츠)에서 구입하였다. 서열 결정은 시쿼젠 컴파니(워체스터, 매사츄세츠)가 수행하였다. MF21q3-13 Fd-효소 융합 유전자를 함유한 플라스미드 213, 806.077 경쇄 암호 영역을 함유한 LC, 및 141은 제네카 파마슈티칼스로부터 구입하였다. CD1 마우스는 찰스 리버 랩(윌밍턴, 매사츄세츠)로부터 구입하였다.
주사 단편의 제조
플라스미드 DNA는 마이클.디.에지 박사(제네카 파마슈티칼스)로부터 입수하였으며 발현 카세트(각 100㎍)는 SalI으로 완전히 분해하여 벡터 백본으로부터 분리하였다. 이어서 분해물을 아가로즈 젤에서 1X TAE(Maniatis et al.,1982)를 전개 완충액으로 사용하여 전기영동하였다. 발현 카세트에 해당하는 DNA 단편을 함유한 젤 영역을 UV광(장파)하에서 확인하였다. 목적 DNA 를 함유한 밴드를 잘라내고, 투석 백에 옮긴 후, DNA를 1X TAE에서 전기 용출시켜 분리한다. 이 과정은 각 발현 카세트에 적용되었다.
전기 용출 후, DNA 단편을 농축하고 "Wizard DNA clean-up system"(Promega, Cat #A7280)을 이용하여 제공된 프로토콜에 따라 세척한 후, 미세주사 완충액(10mM Tris pH7.5 EDTA 0.2mM) 125ml에 용출시켰다. 단편 농도를 비교 아가로즈 젤 전기영동으로 평가하였다. 미세주사 단편 스톡의 유추 농도는 다음과 같았다: LC, 15ng/ml; 141, 180ng/ml, 및 213, 270ng/ml. 스톡을 전핵 주사 바로 직전에 미세주사 완충액에 함께 희석하여 각 단편의 최종 농도가 0.5ng/ml이 되도록 하였다.
미세주사
CD1 암컷 마우스를 과배란시키고 수정란을 난관으로부터 취하였다. 이어서 미세주사 완충액에 희석된 DNA를 수컷 전핵에 미세주사하였다. 미세주사된 배아를 CZB 배지에서 밤새 배양하거나 또는 유사임신 수용체 CD1 암컷 마우스의 난관으로즉시 옮겼다. 20 내지 30개의 2-세포 또는 40 내지 50개의 1-세포 배아를 각 수용체 암컷에 옮기고 만삭까지 진행시켰다.
조상 동물 동정
이소프로판올로 침전시켜 게놈 DNA를 꼬리 조직으로부터 분리하고 닭 베타-글로빈 인설레이터(insulator) DNA 서열의 존재에 대해 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 분석하였다. 이 서열은 염소 베타-카제 벡터(GBC 350)의 일부이다. PCR 반응을 위해, 약 250ng의 게놈 DNA를 2.5유니트의 Taq 폴리머라제를 함유한 50㎕의 PCR 완충액(20mM Tris pH 8.3, 50mM KCl 및 1.5mM MgCl2, 100㎛ 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트, 및 600nM 농도의 각 프라이머)에 희석시키고 하기의 온도 프로그램을 이용하여 처리한다.
1 사이클 94℃ 60sec
5 사이클 94℃ 30sec
58℃ 45sec
74℃ 45sec
30 사이클 94℃ 30sec
55℃ 30sec
74℃ 30sec
프라이머 세트 :
GBC 332와 GBC 386, 앰플리콘은 206bp이다.
GBC 332: TGTGCTCCTCTCCATGCTGG (서열 번호 : )
GBC 386: TGGTCTGGGGTGACACATGT (서열 번호 : )
트랜스제닉 조상 동물의 서던 블롯 분석:
인설레이터 PCR에 대해 양성인 각 조상 마우스로부터의 게놈 DNA(총 24㎍, 8㎍/lane)를 제한 효소 EcoRI으로 완전히 분해하였다. 분해된 DNA를 세 벌로 전기영동하여 표준 방법(Maniatis et al.,1982)에 따라 나일론 막으로 옮겼다. VK(pSP72중의 LC10, 72bp 프로브), ProL(pSP72 중의 pMF141-4, 345bp 프로브) 및 fd-CPB(pSP72중의 pMF213-20, 1861bp 프로브) 플라스미드(마이클 디.에지, 제네카 파마슈티칼스에 의해 제공됨)를 각각 SalI, XhoI, 및 XhoI 으로 잘라 각 발현 카세트에 대해 특이적인 프로브를 분리하였다. 프라임-잇"II 키트(Stratagene, LaJolla CA 92037)로부터의 시약을 이용하여 제조자의 지시에 따라 각 프로브를 표지시키고, 표준 프로토콜을 따라 42℃에서 50% 포름아미드에서 한 세트의 나일론 필터에 하이브리드화시켰다. 60℃에서 0.2X SSC, 0.1% SDS로 세척하였다.
마우스 유액 짜기
암컷 마우스가 그들의 새끼를 자연적으로 출산하도록 하고, 출산 후 7일째와 9일째에 유액을 짰다. 유액짜기 전 약 1시간동안 마우스를 그들의 새끼로부터 분리시켰다. 한 시간의 유지 기간 후, 멸균 인산염 완충 염수중의 5 i.U 옥시토신을 25게이지 바늘을 이용하여 복강 주사하여 마우스가 유액을 분비하도록 유도하였다. 옥시토신이 효과를 나타내도록 1 내지 5분의 대기 기간을 가졌다. 두 개의 18게이지 바늘이 삽입되어 있는 고무 마개로 밀봉된 15ml 원뿔형 튜브로 이루어진 흡입및 수집 시스템이 유액짜기에 이용되었으며, 이때 바늘의 중심 끝은 사람 가슴 펌프에 연결된 고무 튜브에 삽입된다. 마우스를 우리 꼭대기에 놓고 그들의 꼬리만을 잡았으며 달리 제한하거나 감금하지 않았다. 다른 바늘의 중심 끝을 마우스의 유액꼭지위에 놓고(한번에 하나) 15ml 원뿔형 튜브에 놓인 각각의 에펜돌프 튜브내에 유액을 모았다. 에펜돌프 튜브를 각 샘플 수집 후 교환하였다. 유액짜기는 150㎕ 이상의 유액이 얻어질 때까지 계속되었다. 수집 후, 마우스를 그들의 새끼에게 돌려보냈다.
마우스 배아의 미세주사
단편을 1708개의 마우스 배아에 함께 주입하였으며, 이중 945개를 31 마리의 수용체 암컷으로 옮겼다. 이들 암컷중에서, 27마리가 만삭까지 새끼를 배고 있었으며 172 마리의 새끼를 낳았으며, PCR 분석 결과 그 중 20마리는 트랜스제닉으로 확인되었다. 주입된 배아 중에서, 1.2%가 트랜스제닉으로 나타났고, 태어난 새끼중에서 11.6%가 트랜스제닉으로 나타났다.
조상 마우스 계의 서던 블롯 분석
인설레이터 PCR로 확인된 20마리의 트랜스제닉 조상을 서던 블롯 하이브리드화 분석으로 추가 분석하여 세 가지 모두에 대해 양성인 것을 결정하였으며(35, 63, 73, 81, 86, 92, 120, 169) 약한 혼성이었다. 이들은 매우 민감한 PCR 분석을 이용하여 명확히 양성이었으나, 서던 하이브리드화를 이용하여서는 동등한 양성 신호이 검출될 수 없었다. 여섯 마리의 다른 조상들(5, 76, 121, 128, 131 및 161)은 적어도 하나의 트랜스유전자에 대해 명확히 양성이었으나, 다른 트랜스 유전자중적어도 하나에 대해서는 명확히 음성이거나 혼성이었다. 마지막으로, 여섯 마리의 조상(25, 67, 89, 106, 161, 166)이 각 트랜스유전자의 적어도 한 카피를 나타내는 하이브리드화 신호을 보여주었다.
표 1: 베타-카제인-F(ab')2-효소 융합 단백질 트랜스제닉 조상 동물로부터의 서던 하이브리드화 자료의 요약. 공지량의 EcoRI 분해된 미세주사 단편으로 얻어진 신호과 비교하여 카피 수를 대략 결정함(und는 서던에 의해 검출되지 않음을 의미함)
조상 동물 LC 트랜스유전자추정 카피수 141 트랜스유전자추정 카피수 213 트랜스유전자추정 카피수
5 2 und 2-3
25 4 4 2
35 und. und. und.
63 und. und. und.
67 2-3 2-3 3
73 und. und. <1
76 und. 1-2 1
81 und. und. und.
86 und. und. und.
89 > 10 > 10 > 10
92 und. und. <1
106 3 2-3 1
120 und. und. und.
121 <1 1 1
128 <1 und. <1
131 <1 und. <1
152 2-3 2-3 2-3
161 und. 1 <1
166 2-3 3 3-5
169 und. und. und.
마우스 계의 사육
조상 동물의 서던 블롯 분석 후, 10계를 사육을 위해 선택하였다: 5, 25, 67, 76, 89, 106, 121, 128, 152, 및 166. 표 2는 각 계의 사육을 요약하며, 표 3은 PCR 양성 F1 자손의 서던 블롯 분석을 요약한다. 이 분석으로부터, #121을 제외한 모든 조상 동물은 그들의 트랜스제닉 통합체를 다음 세대로 전달하였다. 다른 계들(5, 25, 76, 128, 표2 참고) 또한 낮은 백분율의 트랜스유전자 양성 자손을 가지면서 생식세포계 모자이크 교잡의 신호를 보여주었다.
서던 분석은 또한 조상 동물 중 일부가 트랜스유전자의 일부에 대해 다중의 통합을 가질 수도 있음을 제안하였다. 예를 들어, 조상 166의 자손인 200과 201은 트랜스유전자 LC와 141에 대해 다른 카피수를 갖는 것으로 나타났으며, 트랜스 유전자 213에 대해서는 같은 카피수를 가졌다. 한 가지 설명은 166 조상 동물이 다른 염색체상에 둘 이상의 통합 부위를 가져, 하나는 LC와 141 트랜스유전자만 함유하고 다른 하나는 세 트랜스유전자 모두를 함유하는 것일 수 있다. 200은 통합 부위 둘다를 물려받은 반면, 201은 세 트랜스유전자 모두를 가진 부위만을 물려받았을 수도 있다(다른 시나리오도 또한 가능하다). 다중 통합은 서던 블롯 분석에 의해 확인하기 어려우며, 특히 3개의 다른 트랜스유전자가 관련될 때 그러하다. 하지만, 큰 동물에서는, FISH(형광성 인 시추 하이브리드화)와 핵형 분석은 다중 통합 상황을 가려내도록 한다.
요약하자면, 두 조상(5, 76)은 이중 트랜스유전자 통합(LC와 213)을 그들의 자손에게 전달하였으며, 6개의 계(25, 67, 89, 106, 152 및 166)는 세 트랜스유전자 모두를 다음 세대에 전달하였다. 다른 조상 128은 LC와 213에 대하여 이중 트랜스제닉이었으며, 트랜스제닉 자손(232)를 가졌다. 하지만, 이 자손은 분석하지 않았다(이것은 128의 사육 지연으로 늦게 태어났다). 이 계는 128 유액의 단백질 분석이 융합 단백질의 생성을 보여주지 않았기 때문에 더 이상 연구하지 않았다.
표 2. 트랜스제닉 조상의 사육. 모든 자손을 인설레이터 PCR 분석으로 분석하였다.
조상 동물(성) PCR 양성 자손/새끼(암컷만 분석됨) 선택된 F1 트랜스제닉 암컷의 ID 번호
5 (F) 2/10 217,219
25 (F) 1/7 204
67(M) 1/3 177
76(F) 1/6 212
89(F) 2/5 178,179
106(M) 1/5 186
121(M) 0/5 없음
128(F) 1/8 232
152(M) 2/4 194,195
166(F) 2/6 200,201
표 3: 베타-카제인-F(ab')2-효소 융합 단백질 트랜스제닉 F1으로부터의 서던 하이브리드화 자료의 요약. 공지량의 EcoRI 분해된 미세주사 단편으로 얻어진 신호과 비교하여 카피 수를 대략 결정함(und는 서던에 의해 검출되지 않음을 의미함)
조상 부모 트랜스제닉 F1 Lc 트랜스유전자 카피수 141 트랜스유전자 카피수 213 트랜스유전자 카피수
5 217,219 2 0 2
25 204 3 3 33-4
67 177 1 1-2? 1-2?
76 212 2 0 2
89 178,179 >10 > 10 > 10
106 186 3 3-4 2-3
152 194,195 4-5 4 4-5
166 200,201 1 (2003-4 (201) 1 (2004 (200) 4-5(200과 201 둘다)
트랜스제닉 마우스 유액 샘플 분석 :
마우스 유액 샘플을 조상 암컷 및 F1 트랜스제닉 암컷으로부터 모았다. 효소 분석에 의한 간섭을 피하기 위해 유액을 PBS 로 희석하지 않기로 했다. 샘플을 시험때까지 -20℃에 동결시켰다. 하기 표4에 분석을 요약한다.
표 4 : 인간화된 항체 단편-효소 융합 단백질(Fab')2-CPB를 발현하는 마우스의 유액에 실시한 ELISA와 활성 분석의 요약(NA, 적용할 수 없음).
조상(성,트랜스유전자) F1 (트랜스유전자) ELISA 수준(mg/ml) 효소 분석(mg/ml)
5 (F, LC-213) 217,219 (LC-213) 0.092낮음 0.025낮음
25 (F, LC-213-141) 204 (LC-213-141) 1.5*1.5 - 2 1.2*1.5 - 2
67 (M, LC-213-141) 177 (LC-213-141) NA음성 NA음성
76 (F, LC-213) 212 (LC-213) 음성음성 음성음성
89 (F, LC-213-141) 178,179 (LC-213-141) 1.5 - 21.5 - 2 1.5 - 21.5 - 2
106 (M, LC-213-141) 186 (LC-213-141) NA4 - 6 NA4 - 6
128 (F, LC-213) 낮음 낮음
152 (M, LC-213-141) 195 (LC-213-141) Na4 - 6 NA4 - 6
166 (F, LC-213-141) 200,201 (LC-213-141) 음성음성 음성음성
* 25의 두번째 유액짜기에서 수집된 유액에서 실시된 분석이 일정하게 더 높은 값을 나타냈다.
변형된 사람 카르복시펩티다제 B 효소에 융합된 인간화된 항-CEA F(ab')2, 806.077의 경쇄 및 중쇄 암호 영역, 및 CPB의 프로-도메인(C-말단 류신을 가짐)의 암호 영역에 염소 베타 카제인 조절 서열을 연결시킨 구조체를 생성시켰다. CPB 프로-도메인을 발현하는 트랜스유전자가 있는 트랜스제닉 마우스 계와 없는 트랜스제닉 마우스 계를 생성하였다. 모든 3 구조체에 대해 트랜스제닉인 마우스가, 예상된 효소 활성을 가지고, 트랜스제닉 마우스의 유액에서 높은 농도(최대 4-6 mg/ml)로 (Fab')2-CPB 융합체를 생산할 수 있음(4/6 삼중 트랜스제닉 계가 1mg/ml보다 높은 정도로 발현함)이 입증되었다. 하지만, CPB 프로-도메인 발현의 부재는 활성 융합단백질의 낮은 분비 수준과 관계있는 것으로 보인다. 하지만, 단지 3개의 이중 트랜스제닉 계만이 분석되었기 때문에(단지 조상과 F1만) 이 결과는 조심스럽게 생각되어야 한다.
요약하면, C-말단 글루탐산과 아스파르트산의 가수분해에 특이적인 사람 췌장 카르복시펩티다제 B(HCPB)의 변이체를 사람 유전자의 부위-지시된 돌연변이에 의해 제조하고 이.콜리의 원형질막 주위 공간에서 발현시켰다. 효소의 S1' 포켓의 벽(lining)의 잔기를 변화시킴으로써, 정상적인 C-말단 염기성 잔기 대신 C-말단 산성 아미노산 잔기 앞에서 가수분해할 수 있는 변이체를 생성하도록 기질 특이성을 변화시킬 수 있었다. 이것은 정상적으로는 기질의 염기성 측쇄와 상호작용하는 S1' 특이성 포켓의 염기에서 Asp253을 Lys 또는 Arg으로 돌연변이시켜 이루어졌다. 그 결과 얻어진 효소는 원하는 바뀐 극성을 가졌으며 효소 활성은 잔기 251에서의 추가 돌연변이로 크게 향상되었다. [G251T,D253K]HCPB 이중 돌연변이는 기질 히푸릴-L-글루탐산(hipp-Glu)에 대해 단일 돌연변이보다 100배 더 활성을 가졌다. Ala248에서 추가 변화를 보유한 삼중 돌연변이 [D253K]JCPB는 위치 251이 Asn일 때 hipp-Glu 기질에 대해 증가된 활성을 가졌다. 사람 효소의 극성이 바뀐 이들 돌연변이는 암의 항체-지시된 효소 프로드러그 치료에 사용될 가능성을 갖는다.
실시예 2 : 항-트랜스페린 수용체 항체/안지오제닌 융합 구조체의 생성 및 시험
이 실시예는 트랜스제닉 마우스의 유선에서 항-트랜스페린 수용체 항체/안지오제닌 융합 단백질의 발현을 보여준다. 사람 트랜스페린 수용체(E6)에 대해 형성된 키메라 마우스/사람 항체는 사람 혈관생성 리보뉴클레아제, 안지오제닌(Ang)를 위한 유전자에 그 CH2 도메인으로 융합되었다. 이는 마우스의 유선에서 발현되고 마우스 유액으로 분비되었다. 유액에서의 발현 정도는 대략 0.8g/L였다. 키메라 단백질은 항체 결합 활성을 보유했으며 안지오제닌이 없는 것에 상응하는 단백질 합성 억제 활성을 보유했다. 생체외에서 사람 종양 세포에 특이적으로 세포독성을 나타냈다.
재료 및 방법
트랜스제닉 마우스
트랜스제닉 마우스는 표준 공지 과정(Roberts et al.,1992;DiTullio et al.,1992;Gutierrez et al.,1996)을 따라 생성되었다. 조상 마우스를 사육하여 유액을 분비하는 암컷을 생산하고 유액을 수집하여 전술한 대로 동일 부피의 인산염 완충 염수로 희석하였다. 유액을 -70℃에서 저장하였다.
유액의 분획
E6IG 항체를 함유한 유액을 단백질 A 세파로즈 칼럼에 가하고, pH를 중성으로 조절하기 위해 염기화된 1M 트리스를 함유하는 튜브내로 0.1M 글리신,pH3.0으로 용출시켰다. 융합 단백질(CH2Ang)을 함유하는 유액을 0.2M EDTA 만들고 20분동안 얼음에서 처리한 뒤 에피퓨지에서 4℃에서 10분동안 원심분리하였다. 탈지유를 지방층으로부터 조심스럽게 분리하여 다시 원심분리한 후 평형화된 TSK 3000 칼럼(Toso Haas Corp.,PA)에서 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제하고 0.1M 인산 완충액, pH 7.4로 용출시켰다. 유속은 0.5ml/min이고 1분 분획들을 수집하였다. 안지오제닌에 대한 항체와 반응하는 물질 대부분이 컬럼의 공극 부피내로 용출되었다. 이 물질을 모으고, 아르기닌 분말을 최종 농도 1M로 첨가하였다. 4℃에서밤새 배양한 후, 샘플을 전술한 대로 TSK 3000 컬럼에서 다시 크로마토그래피하였다. CH2Ang 함유 유액은 1M 아르기닌으로 두번째 처리 및 크기 컬럼에서의 재크로마토그래피가 필요했다.
단백질 결정
다음 흡광 계수를 이용하여 단백질을 결정하였다 : E6IgG 항체, E1%/28Onm=14.0; CH2Ang, E1%/280nm = 10.0
단백질 합성 분석
96-웰 마이크로타이터 플레이트에 10% 태아소 혈청이 보충된 둘베코 최소 필수 배지에 웰당 2500 세포로 세포를 도말하였다. 총 10㎕ 부피로 첨가하였으며, 플레이트를 3일동안 37℃에서 항온처리한 후 [14C]-류신 0.1mCi를 2-4시간동안 첨가하였다. 세포를 PHD 세포 수집기를 이용하여 유리 섬유 필터상에 수집하고, 에탄올로 건조시키고 계수하였다. 결과는 가짜로 처리된 웰에서의 [14C]-류신 통합의 퍼센트로 나타낸다.
실시예 3 : 트랜스제닉 마우스의 유액에서 항인체 트랜스페린 수용체 항체 및 항체-안지오제닌 융합 단백질의 발현
트랜스제닉 마우스를 생산하기 위해 이용된 DNA 구조체는 도1과 2A에 예시된다. 개시된 연구에서 사용된 키메라 항트랜스페린 수용체 항체는 처음에는 사람 종양 괴사 인자(Hoogenboom et al.,1991)에 융합되고 이어서 사람 리보뉴클레아제, 안지오제닌(Ang, Rybak et al.,1992)에 융합되었다. Ang 유전자는 항체의 CH2 도메인의5' 영역의 처음 세 아미노산 잔기뒤에 융합되어 힌지 영역이 영향을 받지 않게 하고 중쇄의 이량체화를 가능하게 하였다. 목표는 환자에 투여될 때 면역원성 부작용을 덜 유발할 수 있는 인간화된 면역독소성 단백질을 만드는 것이었다. 생체내 포유류 세포 발현 시스템은 중요한 기능적 연구를 낳지 못했으며, 특히 항체가 사람 Rnase, 안지오제닌 Ang에 융합될 때 그러했다. Ang는 RNase A 수퍼군의 일원이다. 이 군의 모든 일원은 작은(12-14kDa) 염기성 리보뉴클레오라이틱 효소이며 췌장 및 다른 기관에서 발견된다. 포유류와 양서류의 체액 및 조직. 이들 RNase는 혈관생성 유도와 같은 RNA 생리 작용을 남겨둘 수 있지만, 숙주 방어 작용과 항바이러스 효과가 다양한 RNase 일원에 대해 개시되었다. RNase는 자연 방어 시스템의 일부일 수도 있으므로, 이들은 다양한 항체와 화학적 결합체 및 재조합 융합 단백질을 만들기 위해 이용되어 왔다. 이들 연구는 RNase에 기초한 치료가 암과 AIDS 치료에 유용할 수도 있음을 나타내므로, 사람 트랜스페린 수용체에 대한 키메라 항체를 이용한 원래의 RNase 연구는 트랜스제닉 동물 유액에서 복잡한 단백질을 생산하기 위해 새로 개발된 기술을 이용하여 다시 개척되었다. 이 연구에서 사용된 유전적 구조체의 분자적 상세 사항은 상기에 나타난다. 로마 숫자는 도2 패널 A에 나타난 것에 상응하며 염소 β-카제인 유전자의 엑손 2와 7 사이에 클론된 DNA로 확장한다.
사람 트랜스페린 수용체에 대한 키메라 항체인 E6 항체의 전체 중쇄를 암호하는 DNA는 수유하는 트랜스제닉 마우스의 유액에서 고농도로 발현되는 변형된 염소 β-카제인 유전자(도 2A, I)의 엑손 2와 7사이에서 이용되었다. 항체-효소 융합체를 암호하는 두번째 트랜스유전자는 사람 RNase, 안지오제닌(Ang) 유전자를 항체의CH2 도메인(도 1과 도2A,II)에 연결시킴으로써 제조되었다. 이들 유전자 및 동일한 항체의 경쇄를 암호하는 유전자는 모두 별도로 클로닝되었으며, 적절한 쌍들(중쇄(H) 및 경쇄(L);CH2Ang와 L쇄)은 원핵 DNA없이 정제되고 마우스 배아에 함께 주입된 후 이 배아는 표준 방법(Roberts et al.,1992)으로 재이식되었다. 트랜스제닉 마우스는 생성된 후손의 꼬리에서 얻은 DNA의 PCR 및 서던 블롯 분석으로 확인하였다.
조상 마우스는 수유하는 트랜스제닉 암컷을 생산하기 위해 사육되었다. 유액을 모으고, PBS로 희석하고 항체 쇄 및 Ang의 존재에 대해 분석하였다. 사람 Ang만에 대해 생성된 폴리클로날 항체는 융합 단백질(Fig.2B, 좌측 패널)의 예상된 M(43kDa;항체 중쇄, 29kDa;Ang, 14kDa)의 밴드와 반응하였다. 하지만, 항-IgG 항혈청은 키메라 E6 항체(도 2B, 우측 패널)의 H 및 L 쇄 둘다와 강하게 반응하였다. 항체 융합 단백질의 L쇄는 항-IgG 항혈청으로 명확하게 관찰되는 반면, CH2Ang의 절단된 H쇄는 거의 검출할 수 없어 CH2 도메인에의 안지오제닌의 융합이 H쇄에 대한 항혈청의 결합을 방해함을 제안하였다.
키메라 IgG 항체는 단백질 A 세파로즈에서의 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 도2C, 레인 1과 2에 나타난 것처럼, 환원 조건하에서 젤 전기영동에 의한 최종 정제 산물의 웨스턴 분석은 경쇄(28kDa) 및 중쇄 단백질(대략 55kDa)의 존재를 보여주었다. 비환원 조건하에서의 웨스턴 분석(도 2C, 레인 3)은 트랜스제닉 항체가 IgG와 Fab 형태(각각 168 및 84kDa)의 혼합물로 존재함을 보여주었다. 소량의 유리 중쇄(55kDa) 또한 나타났다.
CH2Ang 융합 단백질을 함유한 유액을 유사하게 수집하고 PBS로 희석하였다. 단백질 A 세파로즈는 안지오제닌 융합 단백질에 결합하지 못했다. 동일한 CH2 항체 단편을 TNF에 융합시켰을 때 유사한 결과가 얻어졌으며 이는 CH2-CH3 연결부 근처인 것으로 생각되는 단백질 A 결합 부위의 결실때문으로 생각된다(Hoogenboom et al.,1991). 트랜스제닉 항체-Ang 융합 단백질의 특성은 웨스턴 블롯으로 결정하였다. 쇄간 이황화 결합을 환원시킨 후, H쇄 Ang 융합체(43kDa)과 경쇄(28kDa)은 해리되었다(도 2C, 레인 2). 비환원 조건하에서 항-IgG 항체를 이용한 웨스턴 분석(도2C, 레인 5)은 트랜스제닉 항체-효소 융합 단백질이 F(ab)2와 Fab 형태(각각 142 및 71 kDa)의 혼합물로 존재함을 보여주었다. 항-Ang 항혈청으로 분석할 경우 동일한 결과가 얻어졌다. 후자를 생각할 때 경쇄는 중쇄-Ang 융합체와 관련됨을 보여준다.
실시예 4 : 항체-안지오제닌 융합 단백질의 생물학적 규명
안지오제닌은 그 리보뉴클레오리틱 활성에 의존하는 기작에 의해 토끼 세망세포 분해물의 해독 능력을 강력하게 저해한다(St.Clair et al.,1987). 도2는 [35S]메티오닌이 산침전가능한 단백질내로 통합되는 것을 측정할 때 분해물에의 Ang 또는 CH2Ang의 첨가가 단백질 합성을 저해함을 보여준다. 비융합 Ang 또는 CH2Ang의 IC50S(40nM)는 활성 부위 잔기의 배향이 Ang를 이 배향으로(NH2-말단) CH2 항체 도메인에 융합시킴으로써 영향받지 않는다는 것을 나타내면서 이 분석에서는 구별할 수 없었다.
융합 단백질의 항체 부분은 경쟁 결합 실험(표5)에 의해 규명되었다. 사람 트랜스페린 수용체에의 유액-유래 E6 항체(IgG)의 결합을 시험하여 하이브리도마 세포로부터 처음에 정제된 동일 항체와 비교하였다(Heyligen et al., 1985). 두 항체가 [125I]표지된 모 항체를 대체하는 능력은 동일하였다(둘 중 하나에 의한 50% 대체는 0.8nM임). CH2Ang 융합 단백질은 E6 천연 항체보다 175배 덜 활성이었다(140nM CH2Ang 대 0.8nM E6).
사람 종양 세포에 대한 Ang 융합 단백질의 세포 독성 효과는 [14C]류신이 새로 합성된 단백질에 통합되는 정도를 측정하여 평가하였다. 전형적인 투여량 반응 곡선이 도3에 나타난다. CH2Ang는 SFS39 사람 glioma 세포와 MDA-MB-231mdrl유방암 세포의 단백질 합성을 각각 15nM 및 45nM의 IC50S로 저해하였다. 기타 사람 종양 세포주에 대한 세포독성은 표2에서 비교된다. IC50S는 15 내지 70nM 범위였다. 항원 음성 세포주(마우스 NIH3T3 세포, 자료는 제시하지 않음)에서 활성이 관찰되지 않았으며 다섯 배 몰 과량의 비융합 키메라 항체가 대략 50%정도 세포독성을 역전시켰기 때문에 세포독성은 융합 단백질에 특이적이었다. CH2Ang는 가짜 처리된 세포의 99%까지 단백질 합성을 저해한 반면, 5배 몰 과량의 항체 존재시 단백질 합성은 가짜 처리된 세포의 45%로 감소하였다. 비융합 항체(Rybak et al.,1992) 또는 유리 Ang(Newton et al.,1996) 어느 것도 세포독성이 아니므로, 융합 단백질의 두 도메인은 세포독성을 나타내기 위하여 공유적으로 연결되어야 한다.
안지오제닌은 닭 배아 융모요막과 토끼 각막 분석(Fett et al.,1985)에서의 안지오제닉 활성을 따라 종양 세포 조절된 배지로부터 안지오제닌을 분리하였다. 리보뉴클레아제에의 상동성 및 혈관 생성 활성에 관련된 뚜렷한 뉴클레오리틱 활성은, Ang가 세포 특이적 표적 제제로 종양 세포에 표적화될 때 증가된 종양 세포 사멸을 촉진할 수 있는 독특한 생물학적 특성을 낳는다. 혈관 생성 활성은 Ang이 융합 단백질로 발현될 때 유지된다(Newton et al., 1996). 안지오제닌은 또한 사람 대장 암세포(Soncin et al.,1994)상의 세포 표면 프로테오글리칸에 결합한다. 따라서, 항체에 의한 종양 부위에의 국소화는 Ang의 종양 세포 결합 특성에 의해 증가될 수 있으며, 증가된 혈관생성은 종양 혈관화를 증가시켜 종양 관통을 상당히 도울 수 있다(Newton et al.,1996). 또한, Ang의 안타고니스트는 종양 성장을 방지한다(Piccoli et al.,1998;Olson et al., 1995). 따라서 Ang 활성은 다양성발현성이며, 그들의 실현은 Ang가 노출되는 세포 환경에 의해 지배된다. 예를 들어, 세포질 단백질 합성 기계의 표적화는 세포독성을 야기하는 반면(St.Clair et al.,1987;Rybak et al.,1991), 내피 세포의 핵으로의 Ang의 세포내 이입과 핵으로의 이동은 혈관생성을 유발하는 것으로 보고되었다(Moroianu and Riordan, 1994).Ang의 이러한 생물학적 특성은 이 단백질을 각각 중화하거나 특이적으로 표적화함으로써 세포활동억제(항혈관생성) 및 세포독성(항종양 세포) 치료 전략 둘다를 고안할 독특한 기회를 수용한다.
암(Rybak et al.,1991;Rybak et al.,1992;Newton et al.,1992;Newton et al.,1994;Newton et al.,1996;Jinno et al.,1996;Zewe et al.,1997;Deonarian &Epenetos, 1998)과 심장혈관 질환(Haber,1994;Collen, 1997)의 사람 효소계 다도메인 표적화 치료의 실현은 임상전 특성규명 및 임상 이용을 위한 시약을 생산할 수 있는 발현 시스템을 개발하는데 의존한다. 트랜스제닉 마우스의 유액에서 이중쇄 항체 Ang 융합 단백질의 발현이 이루어졌으며 본 연구에서 나타난다. 유사한 융합 단백질이, 저 생산자의 선별로 이끄는 분비동안 퇴행성 수송에 기인하여 배양된 골수종 세포로부터 매우 낮은 정도로 발현되었기 때문에(Rybak et al.,1992) Ang가 트랜스제닉 마우스에서 성공적으로 발현될 수 있을지는 명확하지 않았다. 주목할만하게도, 유선의 자연환경에서 발현 효율은 세포 배양 시스템에 걸쳐 160,000 배 증가되었다(유액과 골수종 세포에서 각각 0.8g/L 대 5㎍/L). 따라서, 생물학적 규명을 위해 충분한 양의 Ang 융합 단백질을 정제하는 것이 가능했다. 이 작업의 결과 중 하나는 융합 단백질의 Ang의 배향의 중요성이 처음으로 입증되었다는 것이다. 단일쇄 항체 Ang 융합 단백질에서 Ang는 C-말단에서 항체의 N-말단에 융합되었다(Newton et al.,1996). 이어서, Ang의 C-말단 영역의 마지막 세 아미노산 잔기가 활성 중심 하위부위에 기여하는 것으로 알려졌다(Russo et al.,1996). CH2 융합 단백질의 Ang와 유리 Ang는 토끼 세망세포 분해물 분석에서 성능이 동등했던 반면, 단일쇄 융합 단백질의 Ang는 분해물 분석에서 단백질 합성을 저해하는 데 있어 유리 Ang보다 두배 덜 효과적이었다(Newton et al.,1996).
항체-효소 융합 단백질이 유선에서 고농도로 발현될 수 있다는 것은 처음 입증된 것이다. 특히, 항체-Ang 융합체가 유선에서 발현될 수 있다는 입증은 유방암을 위한 트랜스제닉 마우스 모델의 개발을 함축한다. 다른 유액 특이적 유전자로부터의프로모터가 종양의 개시를 모방하는 수유동안 트랜스유전자의 발현을 야기하기 위해 이용되어 왔다(Amundadottier et al.,1996). 본 연구의 결과는 유액 특이적 프로모터가 활성 면역독소의 발현을 야기할 수 있음을 보여주므로, 조작된 종양을 표적으로 하는 Ang 융합 단백질의 발현이 질병의 진전을 막거나 바꿀 수 있는지를 시험하기 위해 이중 트랜스제닉 계통이 개발될 수 있다. 설치류 대응물이 이용가능하므로(Bond et al.,1993), 이들 결과는 특히 Ang에 관계된다.
요약하면, 이들 결과는 복잡한 이종성 융합 단백질이 포유류 세포 배양(Rybak et al.,1992) 및 이.콜리 발현 시스템(Newton et al.,1996)보다 대량으로, 그리고 더 우수한 생물학적 특성을 가지고 마우스의 유선에서 발현될 수 있음을 처음으로 입증한다. 이 결과는 이들 융합 단백질을 치료제로서 생산하는 가능성뿐만 아니라 유방암을 위한 새로운 동물 모델을 만드는 가능성에도 영향을 준다.
하기의 약자가 본원에서 사용된다. Ang - 사람 안지오제닌; E6 - 항트랜스페린 수용체 IgG 모노클로날 항체; RNase - 리보뉴클레아제; H 쇄 - 중쇄; L 쇄 - 경쇄; CH2Ang - E6 중쇄의 CH2 도메인에 융합된 안지오제닌; IC50'- 단백질 합성을 50%만큼 억제하는 융합 단백질의 농도.
표 5. E6과 Ang 융합 단백질의 사람 트랜스페린 수용체에의 결합
구조체 공급원 결합 차이(배)
EC50(nM)
E6 하이브리도마 0.8 1
E6 유액 0.8 1
CH2aNG 유액 140 175
Ch2Ang의 세포독성
세포주 CH2Ang
IC50(nM)
As539 15
HS578T 70
MDAOMB-23[mdr] 45
MALME 40
ACHN 30
실시예 7: 트랜스제닉 염소의 생성과 규명
하기 개시된 내용은 트랜스제닉 염소를 생산하는 주요 단계를 간략히 설명한다.
염소 종 및 사육:
스위스 기원 염소, 예를 들어 알파인, 사넨, 및 토겐부르그 계통이 트랜스제닉 염소 생산에 바람직하다.
염소 과다 배란:
6mg의 피하 노르게스토멧 귀 이식물에 의해 공여체의 발정기 시기를 0일에 동기화시켰다(Syncromate-B, CEVA Laboratories, Inc.,Overland Park, KS). 프로스타글란딘을 처음 7 내지 9일후에 투여하여 내인성 프로게스테론의 합성을 정지시킨다. 이식물 주입후 13일째에 시작하여, 총 18mg의 소포-자극 호르몬(FSH-Schering Corp.,Kenilworth, NJ)을 3일에 걸쳐 하루에 두번씩 근육내 주사한다. 14일째에 이식물을 제거한다. 이식물 제거 후 24시간에 공여체 동물을 2일주기에 걸쳐 가임성수컷과 여러번 교배시킨다.(Selgrath et al.,Theriogenology,1990.pp1195-1205)
배아 수집:
교배 후 이틀째(또는 이식물 제거 후 72시간)에 배아 수집을 위한 수술을 행한다. 수술 36시간 전에 음식과 물로부터 과배란된 암컷을 제거한다. 암컷에게 0.8mg/kg 디아제팜(Valium(상표명))IV를 투여하고, 이어서 5.0mg/kg 케타민(Keteset),IV를 즉시 투여한다. 할로탄(2.5%)을 기관내관을 통해 2L/min 산소에서 수술동안 투여한다. 정중선 개복수술을 통해 생식관을 외부로 노출시킨다. 위축 황체, 직경 6mm 이상의 미파손 난포 및 난소낭을 계수하여 과배란 결과를 평가하고 난관 세척에 의해 수집될 배아의 수를 예측한다. 도관을 난관의 소공에 놓고 3.0 Prolene의 단일 임시 결찰로 유지시켰다. 20게이지 바늘을 자궁난관 이행부로부터 약 0.5cm에서 자궁에 위치시킨다.10 내지 20ml의 멸균 인산염 완충 염수로 도관화된 난관을 세척하고 페트리 디쉬에 모은다. 이 과정을 반대편에서 반복하고 이어서 생식관을 복부에 놓는다. 봉합전에, 멸균 염수 글리세롤 용액 10-20ml을 복부 강에 부어 부착을 막는다. 백색 선조를 2.0 폴리디옥산 도는 수프라미드의 간단한 단속 봉합으로 봉합하고 피부는 멸균 상처 클립으로 닫는다.
수정된 염소 난자를 PBS 난관 세척물로부터 입체현미경상에 모으고, 이어서 시그마에서 구입한 10% 태아소 혈청(FBS)을 함유한 햄스 F12 배지(시그마, St.Louis,MO)에서 세척한다. 전핵이 보이는 경우에는, 배를 즉시 미세주사한다. 전핵이 보이지 않는 경우에는, 전핵이 보일 때까지, 배를 단기 배양을 위한 10% FBS 함유 햄스 F12에서 37℃에서 가습 가스 챔버(공기 중에 5% 이산화탄소 함유)에 놓을 수있다(Selgrath, et al.,Theriogenology,1990,pp.1195-1205).
미세주사 과정:
단세포 염소 배아를 유리 억제 슬라이드상의 오일하에서 배지 미세방울에 놓는다. 두 개의 가시적인 전핵을 보유한 수정란을 노르마스키 옵틱을 이용하여 고정단을 가진 제이스 수직 현미경상의 불꽃 처리된 유지 마이크로피펫에 고정시킨다. 주사 완충액(Tris-EDTA)중의 목적 DNA 구조체, 예를 들어 염소 베타-카제인 유전자의 조절 요소에 작동적으로 연결된 사람 에리트로포이에틴 유사체-사람 혈청 알부민(면역글로불린-효소-hSA) 융합 단백질 유전자를 함유한 BC355 벡터를 미세 유리 미세주사바늘을 이용하여 전핵에 미세주사한다(Selgrath et al.,Theriogenology,1990:pp.1195-1205).
배아 발생:
미세 주사 후, 생존 배아를 10% FBS 함유 햄스 F12 배양액에 놓고, 이어서 수용체 동물이 배아 이전을 위한 준비가 될 때까지 37℃에서 공기중에 5% CO2를 함유한 가습 가스 챔버에서 항온처리한다(Selgrath et al.,Theriogenology,1990:pp.1195-1205).
수용체의 준비:
6mg 노르게스토메트 귀 이식물에 의해 수용체 동물에서 발정기 동기화를 유도한다(Syncromate-B). 이식물 삽입 후 13일에, 시그마에서 구입한 임신한 암말 혈청 고나도트로핀(PMSG)을 과배란시키지 않을 정도(400 I.U)로 한번 동물에게 주사한다. 수용체 암컷을 정관절제한 수컷과 교배시켜 발정기 동기화를 확실히한다(Selgrath et al.,Theriogenology,1990:pp.1195-1205).
배아 이전:
하나의 공여체 암컷으로부터의 모든 배아를 함께 유지하고 가능할 때 하나의 수용체로 옮긴다. 외과 수술은 상기에 기술한 배아 수집을 위한 것과 동일하나, 단 난관이 도관화되지 않으며, 배아는 유리 마이크로피펫을 이용하여 섬모를 통하여 10% FBS 함유 햄스 F12 최소 부피로 난관 강내로 이전된다. 난소에 6 내지 8 이상의 배란점을 갖는 동물은 수용체로서 부적합한 것으로 취급한다. 절개 봉합과 수술후 치료는 공여체 동물의 경우와 동일하다(참고, 예,Selgrath et al.,Theriogenology,1990:pp.1195-1205)
임신과 분만의 모니터링:
임신은 직립 발정기 첫날 후 45일에 초음파에 의해 결정한다. 110일에 두번째 초음파 검사를 수행하여 임신을 확인하고 태아 스트레스를 평가한다. 130일에 임신한 수용체 암컷을 테타누스 독소 및 클로스트리듐 C&D로 예방접종한다. 셀레늄과 비타민 E(Bo-Se)를 근육내 주사하고 이베르멕틴을 피하투여한다. 145일에 암컷을 깨끗한 우리로 옮기고 약 147일에 분만을 유도하기 전에 이 환경에 순응시켰다. 147일에 PGF2a(Lutalyse, Upjohn Company, Kalamazoo Michigan) 40mg으로 분만을 유도하였다. 이 주사는 두 번 투여량으로 근육내 주사되어, 20mg 투여 한번 그리고 이어서 4시간 후 20mg 투여가 이루어졌다. 암컷은 147일에 루탈리제(Lutalyse)의 첫번째 주사 후 낮과 밤동안 주기적으로 관찰되었다. 이틀째 아침부터는 매 30분마다 관찰이 이루어진다. 분만은 처음 주사후 30시간과 40시간 사이에서 일어났다. 분만후, 암컷의 유액을 짜서 초유를 모으고 태반의 통과를 확인한다.
F 0 동물의 트랜스제닉 특성의 확인
트랜스제닉 F0동물을 선별하기 위해, 두 개의 다른 세포주로부터 게놈 DNA를 분리하여 어떤 모자이크 트랜스제닉도 소실되는 것을 방지한다. 모자이크 동물은 모든 세포에 트랜스유전자 적어도 한 카피를 갖지 않는 임의의 염소로 정의한다. 그래서, 귀 조직 샘플(중배엽)과 혈액 샘플을 2일된 F0동물로부터 얻어 게놈 DNA를 분리한다(Lacy et al.,A Laboratory Manual,1986,Cold Spring Harbor,NY;and Herrman and Frishauf,Methods Enzymology,1987.152:pp.180-183). 사람 면역글로불린-효소-hSA 융합 단백질 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응(Gould, et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,1989.132:pp6-13) 및 임의 프라임된 면역글로불린-효소 또는 hSA cDNA 프로브(Feinberg and Vogelstein, Anal.Bioc.,1983. 132:pp.6-13)를 이용한 서던 블롯 분석(Thomas, Proc.Natl.Acad.Sci.,1980. 77:5201-5205)에 의해 DNA 샘플을 분석한다. 분석 감도는 체세포의 10%에서 트랜스유전자 한 카피를 검출하는 것으로 추정된다.
생산 집단의 생성 및 선별
전술한 과정은 트랜스제닉 조상(F0)염소뿐만 아니라 다른 트랜스제닉 염소 생산을 위해 이용될 수 있다. 트랜스제닉 조상 F0염소는 예를 들어 암컷이면 유액을 생산하도록 사육되고, 수컷이면 트랜스제닉 암컷 자손을 생산하도록 사육된다. 이 트랜스제닉 조상 수컷은 비트랜스제닉 암컷과 교배되어 트랜스제닉 암컷 자손을 생산할 수 있다.
트랜스유전자 및 관련 특성의 전달
염소 계통에서 목적 트랜스유전자의 전달은 귀 조직 및 혈액에서 PCR과 서던 블롯 분석에 의해 분석된다. 예를 들어, 조상 수컷과 세 마리의 트랜스제닉 자손의 서던 블롯 분석은 세대간에 카피수에 있어서 어떤 재배열이나 변화도 보여주지 않는다. 서던 블롯은 면역글로불린-효소 융합 단백질 cDNA 프로브로 프로브된다. 블롯을 Betascope 603에서 분석하고 카피수를 트랜스유전자를 염소 베타 카제인 내인성 유전자와 비교하여 결정한다.
발현 정도의 평가
트랜스제닉 동물의 유액에서 트랜스제닉 단백질의 발현 정도는 효소 분석 또는 웨스턴 블롯을 이용하여 결정된다.

Claims (17)

  1. 융합 단백질의 발현을 제공하는 트랜스유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물을 제공하는 단계, 상기 트랜스유전자가 발현되도록 하는 단계, 및 트랜스제닉 동물의 유액으로부터 융합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 트랜스제닉 융합 단백질을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 면역글로불린 서브유니트와 효소를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 제2 성분에 융합된 제1 성분을 포함하며, 제1 성분은 표적화 분자의 서브유니트를 포함하고 제2 성분은 세포 독소를 암호하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 종양 항원에 특이적인 Ig의 서브유니트를 포함하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 종양 항원이 태아성암 항원(CEA), 트랜스페린 수용체, TAG-72, 표피 세포 성장 인자 수용체 군으로부터 선택되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 Rnase를 포함하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 Rnase가 RnaseA인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 안지오제닌을 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질이 카르복시펩티다제 B 효소를 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 트랜스제닉 포유류의 유선에서 제조되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 적어도 약 0.5㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 트랜스제닉 포유류의 유액으로 분비되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 적어도 약 1.0㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 트랜스제닉 포유류의 유액으로 분비되는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 융합 단백질의 면역글로불린 서브유니트가 인간화된 항체인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 트랜스제닉 융합 단백질을 암호하는 트랜스유전자가 (a) 임의로, 인설레이터(insulator) 서열, (b) 유방 상피 세포 특이적 프로모터, (c) 유액 특이적 단백질로부터의 신호와 같은 융합 단백질의 분비를 지시할 수 있는 신호 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열, (d) 임의로, 융합 단백질이 트랜스제닉 포유류의 유액으로 분비되도록, 유액으로 분비되는 단백질과 같은 분비 단백질의 아미노 말단 암호 영역의 충분한 부분을 암호하는 뉴클레오티드 서열, (e) 융합 단백질을 암호하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 (f) 임의로, 포유류 유전자로부터의 3' 비번역 영역을 포함하는 핵산 구조체인 방법.
  15. (a) 임의로, 인설레이터 서열, (b) 유방 상피 세포 특이적 프로모터, (c) 유액 특이적 단백질로부터의 신호와 같은 융합 단백질의 분비를 지시할 수 있는 신호 서열을 암호하는 뉴클레오티드 서열, (d) 임의로, 융합 단백질이 트랜스제닉 포유류의 유액으로 분비되도록, 유액으로 분비되는 단백질과 같은 분비 단백질의 아미노 말단 암호 영역의 충분한 부분을 암호하는 뉴클레오티드 서열, (e) 제1항의 융합 단백질을 암호하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열, 및 (f) 임의로, 유방 상피 세포 특이적 유전자(예, 유단백 유전자)와 같은 포유류 유전자로부터의 3' 비번역 영역을 포함하는 분리된 핵산 구조체.
  16. 청구항에 기재된 융합 단백질을 암호하는 트랜스유전자를 포함하는 트랜스제닉 동물.
  17. 제16항에 있어서, 적어도 약 0.5㎎/㎖ 또는 그 이상의 농도로 융합 단백질을 유액으로 분비할 수 있는 트랜스제닉 동물.
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