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KR20040052455A - 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의한자기집합체의 형성 방법, 자기집합체 및 유전자의 검출방법 - Google Patents

유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의한자기집합체의 형성 방법, 자기집합체 및 유전자의 검출방법 Download PDF

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KR20040052455A
KR20040052455A KR10-2003-7008920A KR20037008920A KR20040052455A KR 20040052455 A KR20040052455 A KR 20040052455A KR 20037008920 A KR20037008920 A KR 20037008920A KR 20040052455 A KR20040052455 A KR 20040052455A
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KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotide
probe
assembly
forming
self
Prior art date
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Withdrawn
Application number
KR10-2003-7008920A
Other languages
English (en)
Inventor
미츠구 우스이
마리 미츠카
치카코 하키이
Original Assignee
산코 준야쿠 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 산코 준야쿠 가부시키가이샤 filed Critical 산코 준야쿠 가부시키가이샤
Publication of KR20040052455A publication Critical patent/KR20040052455A/ko
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

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Abstract

특수한 기기나 번잡한 조작을 이용하지 않고, 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체를 형성시키는 방법 및 그 자기집합체의 형성 방법에 의해 형성된 자기집합체 및 그 자기집합체의 형성 방법을 이용하여, 저가격으로 간편히 증폭된 특정의 유전자를 검출하는 방법을 제공한다. 올리고뉴클레오티드의 자기집합반응에 의한 자기집합체의 형성 방법에 있어서, 해당 올리고뉴클레오티드로서 유전자 증폭 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법을 사용하여 자기집합체를 형성시키고, 형성된 자기집합체를 검출하는 것에 의해, 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 검출한다.

Description

유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법, 자기집합체 및 유전자의 검출 방법 {METHOD OF FORMING SELF-ASSEMBLY BY OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIZED BY GENE AMPLIFICATION REACTION AND METHOD OF DETECTING SELF-ASSEMBLY AND GENE}
최근, 미량의 표적(target) 유전자의 검출을 목적으로 유전자를 증폭하는 각종 유전자 증폭법이 개발되어 있다. 그 중에서도 내열성 핵산합성효소를 사용하는 Polymerase chain reaction 법 (미국특허 제4,683,195호, 제4,683,202호, 이하, "PCR 법"이라 함)이나 내열성 핵산연결효소를 사용하는 Ligase chain reaction 법(미국특허 제5,792,607호, 이하, "LCR 법"이라 함), 및 쇄치환형 핵산합성효소를 사용하는 Strand Displacement Amplification 법 (일본특허 제2076096호, 이하, "SDA 법"이라 함)이나 Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids 법 (WO 00/56877, 이하, "ICAN 법"이라 함)은 여러가지 핵산을 합성하는 효소의 특성을 이용하여 개발된 유전자의 증폭방법이다.
이들 유전자증폭방법은 유전자의 특정 부위만을 반복하여 복제하는 반응이며, 그 특정 부위로 이루어지는 유전자단편이 증폭되는 것이다.
그 때문에 유전자증폭방법에 의한 증폭 산물은 직접 쇠사슬모양의 유전자 단편이기 때문에, 간편하게 검출하는 것이 곤란해서, 현재 시판되고 있는 유전자진단 키트에 있어서의 유전자의 검출법에 있어서는, 주로 EIA(Enzyme Immuno Assay)와의 조합에 의한 검출, 또는 미리 형광물질을 유전자에 표식하여 표적유전자를 검출하고 있다.
그러나, EIA나 형광물질을 유전자에 표식한 측정에서는, 특수한 기계와 시약이 필요하고, 조작도 번잡해서 판정할때까지 1시간 이상의 시간을 필요로 하고 있어, 기존의 유전자증폭방법에 의해 증폭된 유전자를 간편하고 동시에 저렴하게 검출할 수 있는 방법이 요망되고 있었다.
한편, 본 출원인은 효소를 사용하지 않는 신규한 등온핵산증폭법(프로브(probe) 자기집합체의 제작방법)을 이미 제안하였다(미국특허 제6,261,846호, 일본특허 제3267576호 및 EP1,002,877A). 이 방법은 3개소의 영역으로부터 구성되는 한쌍의 프로브(HoneyComb Probe, 이하 "HCP"라 함)를 사용하는 방법이며, 제 1 프로브와 제 2 프로브의 각각의 3개소의 영역은 서로 상보적인 염기서열을 갖고, 양자를 반응시켰을 경우, 영역의 1개소와만 하이브리다이즈(Hybridize)하도록 각 영역의 염기서열을 연구한 것이다. 이 연구에 의해, 복수의 한쌍의 프로브를 반응시킨 경우, 서로 하이브리다이즈해서 프로브의 자기집합체를 형성시키는 것이 가능하다(Probe alternation link self-assemblyreaction, 이하, "PALSAR 법"이라 함).
본 발명은 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 이용한 자기집합체의 형성 방법, 형성된 자기집합체 및 그것을 이용한 유전자의 검출 방법에 관한 것이다.
도1은, 본 발명에서 이용한 PALSAR법에 의한 한쌍의 HCP를 사용한 자기집합체의 형성 방법의 일예를 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 HCP, (b)는 HCP의 결합 태양의 일예, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도2는, 본 발명에서 이용한 PALSAR법에 의한 한쌍의 HCP를 사용한 자기집합체의 형성 방법의 다른 예를 나타내는 모식도이며, (a),(b)는 각각 상보영역의 1개소 다른 한쌍의 HCP, (c)는 상기 HCP로부터 형성되는 다이머, (d)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도3은, 본 발명에서 이용한 PALSAR법에 의한 n=1의 경우의 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브를 이용한 자기집합체의 형성 방법의 일예를 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (b)는 한쌍의 가교 프로브, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도4는, 본 발명에서 이용한 PALSAR법에 의한 n=1의 경우의 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브를 이용한 자기집합체의 형성 방법의 다른 예를 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (b)는 한쌍의 가교 프로브, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도5는, 본 발명에서 이용한 PALSAR법에 의한 n≥2의 경우의 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브를 이용한 자기집합체의 형성 방법의 일예를 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브로부터 형성된 4조의 다이머 프로브 및 4조의 한쌍의 가교 프로브, (b)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도6은, 본 발명에서 이용한 PALSAR법에 의한 n≥2의 경우의 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브를 이용한 자기집합체의 형성 방법의 다른 예를 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브로부터 형성된 4조의 다이머 프로브 및 4조의 한쌍의 가교 프로브, (b)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도7은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제1예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 유전자단편, (b)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도8은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제1예의 제2의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 유전자단편, (b)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도9는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제1예의 제3의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 유전자단편, (b)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도10은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성방법의 제1예의 제4의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 유전자단편, (b)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도11은, 효소에 의해 절단된 한쌍의 유전자단편을 이용한 자기집합체의 형성 방법의 제1예를 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 유전자단편, (b)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도12는, 효소에 의해 절단된 한쌍의 유전자단편을 이용한 자기집합체의 형성 방법의 제2예를 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 유전자단편, (b)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도13은, 효소에 의해 절단된 한쌍의 유전자단편을 이용한 자기집합체의 형성 방법의 제3예를 나타내는 모식도이며, (a)는 한쌍의 유전자단편, (b)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (c)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도14는, 유전자단편과 미리 제작해 둔 가교 프로브에 의한 자기집합체의 형성 방법을 나타내는 모식도이며, (a)는 단일가닥의 유전자단편, (b)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (c)는 미리 제작해 둔 가교 프로브, (d)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도15는, 증폭용 RNA 프로브를 이용한 유전자증폭에 의해 증폭된 유전자단편 및 RNase H를 이용한 자기집합체의 형성 방법의 예를 나타내는 모식도이며, (a)는증폭용 RNA 프로브를 사용한 DNA의 증폭을 나타낸다.
도16은, 증폭용 RNA 프로브를 이용한 유전자증폭에 의해 증폭된 유전자단편 및 RNase H를 이용한 자기집합체의 형성 방법의 예를 나타내는 모식도이며, (b)는 증폭용 RNA 프로브를 이용해서 증폭된 한쌍의 유전자단편, (c)는 RNase H 처리후의 한쌍의 유전자단편, (d)는 한쌍의 다이머 형성용 프로브, (e)는 자기집합체의 형성을 각각 나타낸다.
도17은, 본 발명에서 사용한 올리고뉴클레오티드의 메틸화한 염기를 나타낸다.
도18은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제2예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (a)는 표적 유전자, (b)는 절단되어 있는 메틸화한 다이머 형성용 프로브를 각각 나타낸다.
도19는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제2예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (c)는 표적 유전자와 절단된 다이머 형성용 프로브의 하이브리다이제이션, (d)는 절단된 다이머 형성용 프로브의 연결 반응을 각각 나타낸다.
도20은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제2예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (e)는 연결된 다이머 형성용 프로브에 대한 핵산분해 효소에 의한 처리, (f)는 미반응의 다이머 형성용 프로브에 대한 핵산분해 효소에 의한 처리를 각각 나타낸다.
도21은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의제2예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (g)는 연결된 다이머 형성용 프로브에 있어서의 자기집합체의 형성, (h)는 분해된 다이머 형성용 프로브에 있어서의 자기집합체의 미형성을 각각 나타낸다.
도22는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (a)는 표적 유전자, (b)는 메틸화한 증폭용 프로브를 각각 나타낸다.
도23은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (c)는 표적 유전자와 메틸화한 증폭용 프로브의 하이브리다이제이션, (d)는 DNA 합성을 각각 나타낸다.
도24는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (e)는 합성된 DNA와 증폭용 프로브의 하이브리다이제이션, (f)는 DNA 합성을 각각 나타낸다.
도25는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (g)는 합성 프로브, (h)는 핵산분해 효소에 의한 분해를 각각 나타낸다.
도26은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (i)는 핵산분해 효소에 의해 분해된 합성 프로브, (j)는 합성 프로브의 가교 프로브로서의 사용, (k)는 합성 프로브의 HCP로서의 사용을 각각 나타낸다.
도27은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의제3예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (l) 및 (m)은 분해된 합성 프로브와 미반응 프로브의 하이브리다이제이션, (n)은 핵산분해 효소에 의한 처리를 각각 나타낸다.
도28은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제2의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (a)는 표적 유전자, (b)는 한 쪽만 메틸화한 증폭용 프로브를 각각 나타낸다.
도29는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제2의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (c)는 표적 유전자와 증폭용 프로브의 하이브리다이제이션, (d)는 DNA 합성을 각각 나타낸다.
도30은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제2의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (e)는 합성된 DNA와 증폭용 프로브의 하이브리다이제이션, (f)는 DNA 합성을 각각 나타낸다.
도31은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제2의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (g)는 합성 프로브, (h)는 핵산분해 효소에 의한 분해를 각각 나타낸다.
도32는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제2의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (i)는 핵산분해 효소에 의해 분해된 합성 프로브, (j)는 합성 프로브의 가교 프로브로서의 사용, (k)는 합성 프로브의 HCP로서의 사용을 각각 나타낸다.
도33은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의제3예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (l)은 분해된 합성 프로브와 미반응 프로브의 하이브리다이제이션, (m)은 핵산분해 효소에 의한 처리를 각각 나타낸다.
도34는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제4예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (a)는 표적 유전자, (b)는 메틸화한 키메라형 증폭용 프로브를 각각 나타낸다.
도35는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제4예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (c)는 표적 유전자와 메틸화한 키메라형 증폭용 프로브의 하이브리다이제이션, (d)는 RNase H에 의한 처리를 각각 나타낸다.
도36은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제4예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (e)는 쇄치환형 효소에 의한 DNA의 합성, (f)는 합성 프로브, (g)는 미반응의 프로브를 각각 나타낸다.
도37은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제4예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (h)는 합성 프로브, (i)는 핵산분해 효소에 의한 분해를 각각 나타낸다.
도38은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제4예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (j)는 핵산분해 효소에 의해 분해된 합성 프로브, (k)는 합성 프로브의 가교 프로브로서의 이용, (l)은 합성 프로브의 HCP로서의 이용을 각각 나타낸다.
도39는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제4예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (m) 및 (n)은 분해된 합성 프로브와 미반응 프로브의 하이브리다이제이션, (o)는 핵산분해 효소에 의한 처리를 각각 나타낸다.
도40은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제5예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (a)는 표적 유전자, (b)는 키메라형 증폭용 프로브를 각각 나타낸다.
도41은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제5예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (c)는 표적 유전자와 키메라형 증폭용 프로브의 하이브리다이제이션, (d)는 RNase H에 의한 처리를 각각 나타낸다.
도42는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제5예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (e)는 쇄치환형 효소에 의한 DNA의 합성, (f)는 합성 프로브, (g)는 미반응 프로브를 각각 나타낸다.
도43은, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제5예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (h)는 합성 프로브, (i)는 핵산분해 효소에 의한 분해를 각각 나타낸다.
도44는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제5 예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (j)는 핵산분해 효소에 의해 분해된 합성 프로브, (k)는 합성 프로브의 가교 프로브로서의 이용, (l)은 합성 프로브의 HCP로서의 이용을 각각 나타낸다.
도45는, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제5예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이며, (m) 및 (n)은 분해된 합성 프로브와 미반응 프로브의 하이브리다이제이션, (o)는 핵산분해 효소에 의한 처리를 각각 나타낸다.
도46은, 실시예1~16의 결과를 나타내는 사진이다.
도47은, 실시예17 및 비교예1의 변성 PAGE 전기영동법의 결과를 나타내는 사진이다.
도48은, 실시예17 및 비교예1의 아가로즈-겔(agarose-gel) 전기영동법의 결과를 나타내는 사진이다.
도49는, 실시예18 및 비교예2의 PAGE 전기영동법의 결과를 나타내는 사진이다.
도50은, 실시예18의 아가로즈-겔 전기영동법의 결과를 나타내는 사진이다.
도51은, 실시예19 및 비교예3의 PAGE 전기영동법의 결과를 나타내는 사진이다.
도52는, 실시예19의 형광 현미경에 의한 결과를 나타내는 사진이다.
도53은, 비교예4의 형광 현미경에 의한 결과를 나타내는 사진이다.
도54는, 비교예5의 형광 현미경에 의한 결과를 나타내는 사진이다.
본 발명은 상기 사정을 감안한 것으로, EIA에 의한 측정과 같이 특수한 기계나 시약을 이용하지 않고, 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체를 형성시키는 방법, 및 그 자기집합체의 형성 방법에 의해 형성된 자기집합체, 및 그 자기집합체의 형성 방법을 이용하여, 저렴한 가격으로 간편히 증폭된 특정한 유전자를 검출하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기의 문제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은 다양한 올리고뉴클레오티드의 자기집합체의 형성 방법에 대해서 연구를 거듭해 왔다. 그 결과, 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 올리고뉴클레오티드를 자기집합체의 형성을 위한 올리고뉴클레오티드로서 이용하는 것을 발견하였다. 증폭된 올리고뉴클레오티드는 자기집합 반응에 의해 용이하게 집합체를 형성할 수 있기 때문에, 특별한 기기를 사용하지 않고 유전자를 검출하는 것이 가능하게 되었다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법은, 올리고뉴클레오티드의 자기집합 반응에 의한 자기집합체의 형성 방법이며, 해당 올리고뉴클레오티드로서 유전자증폭 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 한다.
상기한 자기집합체의 형성 방법의 일례로서, 서로 상보적인 염기서열 영역이 n (n≥3) 개소의 수로 구성되는 한쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브(이하, "HCP"라고 칭하는 경우가 있다)의 복수쌍을 사용하여, 서로 다르게 교차하도록 하이브리다이제이션(Hybridization)시키는 것에 의해, 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여 자기집합체를 형성시키는 것이 가능하다.
상기한 한쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브의 적어도 한쪽은, 상기한 n (n≥3) 개소의 영역을 함유하는 유전자 증폭 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 가능하다.
상기한 한쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브의 구성은 1대1로 하이브리다이제이션하는 때에 반드시 n (n≥3) 개소의 상보적인 부분중에서, 1개소씩이 특이적으로 하이브리다이제이션하도록 구성된다.
또한, 상기한 한쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브의 복수쌍은 해당 염기서열 영역이 적어도 1개소 다른 m (m≥2) 종의 한쌍의 프로브를 사용하는 것이 가능하다.
상기한 자기집합체의 형성 방법의 다른 예로서, No.1 및 No.2의 한쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 올리고뉴클레오티드를 3' 측영역, 중앙영역, 및 5' 측영역의 3개의 영역으로 나누고, 각 올리고뉴클레오티드의 중앙영역을 서로 상보적인 염기서열로 하고, 3' 측영역 및 5' 측영역을 서로 비상보적인 염기서열로 한 복수쌍의 다이머(dimer) 형성용 프로브를 포함하는 제1번째 계로부터 제(2n-1)번째(n≥1)의 계까지 차례로 n개 형성된 다이머 형성용 프로브 함유계와,
No.1 및 No.2의 한쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 올리고뉴클레오티드를 3' 측영역 및 5' 측영역의 2개의 영역으로 나누고, 각 올리고뉴클레오티드의 3' 측영역 및 5' 측영역을 서로 비상보적인 염기서열로 한 복수쌍의 가교 프로브를 각각포함하는 제2번째 계로부터 제2n번째 계까지 차례로 n개 형성된 가교 프로브 함유계를 갖고,
상기 가교 프로브를, 상기 다이머 형성용 프로브로부터 형성되는 다이머를 가교 하는 것이 가능한 염기서열로 하고,
상기 프로브를 하이브리다이제이션시키는 것에 의해, 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여, 자기집합체를 형성시킬 수 있다.
상기 복수쌍의 다이머 형성용 프로브 및 복수쌍의 가교 프로브의 적어도 1개를, 유전자증폭 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 가능하다.
상기 자기집합체의 형성 방법의 다른 예에 있어서, n=1의 경우, 제1계의 다이머 프로브와 제2계의 가교 프로브의 상보적인 염기서열의 조합은, 2종류 존재한다. n=1의 경우의 일예로서, 상기 프로브의 염기서열을,
제1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제2계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3'측영역,
제1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제2계의 No. 2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
제2계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제1계의 No. 2-올리고뉴클레오티드의 3'측영역,
제2계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제1계의 No. 1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역
을 각각 상보적인 염기서열로 한 것을 사용할 수 있다.
n=1의 경우의 다른 예로서, 상기 프로브의 염기서열을,
제1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제2계의 No. 1-올리고뉴클레오티드의 3'측영역,
제1계의 No. 2- 올리고뉴클레오티드의 5'측영역과 제2계의 No. 1-올리고뉴클레오티드의 5'측영역,
제1계의 N o. 2- 올리고뉴클레오티드의 3'측영역과 제2계의 No. 2-올리고뉴클레오티드의 3'측영역,
제1계의 No. 1- 올리고뉴클레오티드의 5'측영역과 제2계의 No. 2-올리고뉴클레오티드의 5'측영역
을 각각 상보적인 염기서열로 한 것을 사용할 수 있다.
상기 자기집합체의 형성 방법의 다른 예에 있어서, n≥2의 경우, 제1, 제3, ··, 제(2n-1)계의 다이머 형성용 프로브와 제2, 제4, ··, 제2n계의 가교 프로브의 상보적인 염기서열의 조합은 2종류 존재한다. n≥2의 경우의 일예로서, 상기 프로브의 염기서열을,
제(2n-3)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제(2n-2)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
제(2n-3)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제(2n-2)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
제(2n-2)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제(2n-1)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
제(2n-2)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제(2n-1)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
다이머 형성용 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 가교 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
다이머 형성용 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 가교 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
가교 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제1번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
가교 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제1번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역
을 각각 상보적인 염기서열로 한 것을 사용할 수 있다.
n≥2의 경우의 다른 예로서, 상기 프로브의 염기서열을,
제(2n-3)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제(2n-2)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
제(2n-3)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제(2n-2)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
제(2n-2)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제(2n-1)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
제(2n-2)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제(2n-1)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
다이머 형성용 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 가교 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
다이머 형성용 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 가교 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
가교 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제1번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
가교 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제1번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역
을 각각 상보적인 염기서열로 한 것을 사용할 수 있다.
상기 프로브의 하이브리다이제이션을, 미리 상기 다이머 형성용 프로브로부터 다이머를 형성시킨 후, 상기 가교 프로브와 해당 다이머를 하이브리다이제이션시키는 것이 바람직하다.
상기 복수쌍의 다이머 형성용 프로브는, 상기 중앙영역이 다른 m(m≥2)종의 다이머 형성용 프로브를 사용할 수 있다.
상기 한쌍의 다이머 형성용 프로브의 3' 측영역 및/또는 5' 측영역을 서로 동일한 염기서열로 할 수 있다.
상기 가교 프로브의 적어도 하나를, 상기 가교 프로브의 2개의 영역을 함유하는 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다.
상기 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드로서, 각각 제(2n-1)계의 올리고뉴클레오티드의 5' 영역 및 3' 영역과 상보적인 영역을 2개소씩 갖는 적어도 4개소의 영역으로 이루어지는 서로 상보적인 유전자 단편을 사용할 수 있다.
상기 HCP, 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브와 같은 자기집합체 형성에 사용할 수 있는 올리고뉴클레오티드·프로브(이하, 단지 "프로브"라 칭하는 경우가 있다)는, DNA, RNA, PNA 또는 LNA의 어느 것으로부터 선택되는 염기로 구성된다.
상기 프로브의 상보적 염기서열 영역의 말단부에, 적어도 1개의 G(구아닌) 또는 C(시토신)을 배치시켜, 상기 프로브가 하이브리다이즈한 경우에 적어도 1개의 G-C 결합을 상보적 염기서열 영역의 말단부에 형성시키는 것에 의해, 염기의 적층 (stacking of base)에 의해 염기의 π전자의 특수한 상호작용을 발생시켜, 보다 안정한 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체를 형성시킬 수 있다.
상기 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 올리고뉴클레오티드로서, 제1에, 내열성 핵산 합성 효소를 사용한 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 것이 사용될 수 있다.
상기 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 올리고뉴클레오티드로서, 제2에, 내열성 핵산 연결 효소를 사용한 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 것을 사용할 수 있다.
상기 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 올리고뉴클레오티드로서, 제3에, 쇄치환형 핵산 합성 효소를 사용한 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 것을 사용할 수 있다.
상기 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 올리고뉴클레오티드로서, 2가닥의 DNA 및/또는 RNA로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 단편을 사용할 수 있다.
또한, 상기 유전자 증폭 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드로서, 단일가닥의 DNA 및/또는 RNA로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 단편을 사용할 수 있다.
상기 유전자 증폭 반응에 사용할 수 있는 증폭용의 프로브(이하, "증폭용 프로브"라고 칭하는 경우가 있다.)로서, DNA, RNA, 또는 DNA와 RNA로 구성되는 키메라형 프로브를 들 수 있다.
상기 유전자 증폭 반응에 사용하는 증폭용 프로브는, 한쌍의 증폭용 프로브의 적어도 한쪽에 메틸화된 염기를 가지는 증폭용 프로브를 이용하는 것이 바람직하다. 메틸화된 염기의 위치는, 증폭용 프로브의 5' 말단 ~ 5' 말단주변이나 3'말단 ~ 3' 말단주변이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 각 말단에서부터 5염기 이내이다. 본 발명에 있어서, 5' 말단 및 5' 말단주변을 5' 말단측, 3' 말단 및 3' 말단주변을 3' 말단측이라고 칭한다. 한쌍의 증폭용 프로브는, 한쪽의 프로브만이 메틸화된 것을 사용해도 좋고, 양쪽의 프로브가 메틸화된 것을 이용해도 좋다. 또한, 5' 말단측 및 3' 말단측을 함께 메틸화해도 좋고, 어느쪽의 말단측만을 메틸화한 것을 이용해도 좋다. 또한 DNA와 RNA로 이루어진 키메라프로브를 증폭용 프로브로서 사용하는 경우, DNA영역 및/또는 RNA영역의 말단측을 메틸화한 것을 이용하는 것도 가능하고, 본 발명에 포함되는 것이다.
상기 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드에, 표적 유전자와 상보적인 영역을 가지는 올리고뉴클레오티드를 미리 해당 상보적 영역에서 절단하고,연결(ligation)반응에 의해 연결된 것을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 핵산분해효소로 분해하는 것이 바람직하다.
상기 핵산분해효소로서 , 엑소뉴클레아제(exonuclease), RNase H, 제한 효소등을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 자기집합체는, 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법을 사용해서 형성되는 것이다.
본 발명의 유전자의 검출 방법은, 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법을 사용해서 자기집합체를 형성시켜, 형성된 상기 자기집합체를 검출하는 것에 의해, 상기 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것을 특징으로 한다.
상기 유전자 증폭 반응에 있어서 증폭되는 표적 유전자에 2가닥의 DNA 및/또는 RNA를 사용하는 것이 가능하다.
상기 유전자 증폭 반응에 있어서 증폭되는 표적 유전자에 단일가닥의 DNA 및/또는 RNA를 사용하는 것이 가능하다.
상기 유전자 증폭 반응에 있어서 증폭되는 표적 유전자에 1염기다형을 사용하는 것이 가능하다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하에 본 발명의 실시의 형태를 첨부 도면에 근거해서 설명하지만, 이들의실시의 형태는 예시적으로 나타내는 것으로, 본 발명의 기술사상으로부터 일탈하지 않는 한 다양한 변형이 가능하다.
본 발명은, 유전자증폭 방법으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 등온에서 효소부재의 조건하에서 자기집합 반응을 시키므로써, 2가닥의 자기집합체를 형성시키는 것이다.
사용하는 프로브의 개수는, 특별히 한정되지는 않지만, 102~1015개의 범위에서 사용할 수 있다. 반응 완충액의 조성, 농도는 특별히 한정되지 않고, 핵산증폭에 상용되는 통상의 완충액을 적당하게 사용할 수 있다. pH도 상용의 범위가 적합하고, 바람직하게는 pH7.0~pH9.0의 범위의 것을 사용할 수 있다. 반응 온도는 40~90℃, 바람직하게는 55~70℃이다. 이들 조건은 특별히 한정되지 않는다.
프로브를 구성하는 핵산은, 보통 DNA 또는 RNA로 구성되지만, 핵산 유사체도 관계 없다. 핵산 유사체로서, 예를 들면, 펩티드 핵산(PNA, WO 92/20702)이나 Locked Nucleic Acid (LNA, Koshkin AA 등. Tetrahedron 1998.54,3607-3630., Koshkin AA 등. J. Am. Chem. Soc. 1998.120,13252-13253., Wahlestedt C 등. PNAS. 2000.97,5633-5638.)를 들 수 있다. 또한, 프로브는 보통, 같은 종류의 핵산으로 구성되지만, 예를 들면 DNA 프로브와 RNA 프로브가 한쌍이 되어도 관계 없다. 즉, 프로브의 핵산의 종류는 DNA, RNA 또는 핵산 유사체(예를 들면 PNA나 LNA등)로부터 선택할 수 있다. 또한, 하나의 프로브내에서의 핵산 조성은 1종류, 예를 들면 DNA만으로 구성될 필요는 없고, 필요에 따라서, 예를 들면, DNA와 RNA로 구성되는프로브(키메라프로브)를 사용하는 것도 가능하며, 본 발명에 포함된다.
또한, 프로브의 각 영역의 길이는 염기수로 해서, 적어도 5염기이며, 바람직하게는 적어도 8염기, 더욱 바람직하게는 10염기~100염기, 더욱 바람직하게는 10~40염기다.
상기 유전자 증폭 방법은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, PCR법, SDA법, ICAN법, NASBA법, TMA법, 3SR법, LCR법 등의 기존의 유전자 증폭법에 의해 증폭된 2가닥 혹은 단일가닥의 DNA 및/또는 RNA를 자기집합 반응용의 올리고뉴클레오티드로서 사용할 수 있다.
도1은 PALSAR법에 의한 한쌍의 HCP(No.1 프로브 및 No.2 프로브)를 이용한 자기집합체의 형성 방법의 일예를 나타내는 모식도이다. 도1에 있어서, No.1 프로브는 Ⅹ1 영역, Ⅹ2 영역 및 Ⅹ3 영역을 갖고, No.2 프로브는 Ⅹ'1 영역, Ⅹ'2 영역 및 Ⅹ'3 영역을 가지고 있다 [도1(a)]. 이 No.1 프로브와 No.2 프로브는 양자를 하이브리다이제이션시켰을 때, Ⅹ1 영역은 Ⅹ'1 영역과만 결합하고, Ⅹ2 영역은 Ⅹ'2 영역과만 결합하고, Ⅹ3 영역은 Ⅹ'3 영역과만 결합하는 것과 같은 구성으로 되어 있고, 3개의 결합 패턴으로 한쌍의 프로브가 엇갈리게 하이브리다이제이션한다[도1(b)].
3개의 결합 패턴으로 엇갈리게 하이브리다이제이션한 한쌍의 HCP의 복수쌍은, 도1(c)에 모식적인 일예를 나타낸 것 같이, PALSAR법의 원리에 따라서, 올리고뉴클레오티드의 자기집합에 의해, 2가닥의 자기집합체를 형성시킬 수 있다.
도1은, 상보적인 염기서열 영역이 3개소로 이루어지는 HCP에 대해서 설명하는데, 상보적인 염기서열 영역을 4개소 이상 가지는 HCP를 사용한 경우에 대해서도 동일하게 자기집합체를 형성시킬 수 있다.
상기 HCP를 이용한 자기집합체의 형성 방법에 있어서, 다른 상보적 영역을 가지는 2종 이상의 HCP를 사용할 수도 있다. 도2는 상보적인 영역이 3개소로 이루어지는 2종의 한쌍의 HCP (No.3 및 No.4 프로브, No.5 및 No.6 프로브)로부터 형성된 자기집합체의 검출 방법의 일예를 나타낸다. 도2에 있어서, No.3 프로브는 Ⅹ 영역, α영역 및 Z 영역을 가지고, No.4 프로브는 Ⅹ' 영역, α' 영역 및 Z' 영역을 가지고 있다[도2(a)]. 또한, No.5 프로브는 Ⅹ 영역, β 영역 및 Z 영역을 가지고, No.6 프로브는 Ⅹ' 영역, β' 영역 및 Z' 영역을 가지고 있다[도2(b)]. 도2에서 나타낸 바와 같이, 2조의 HCP는 상보 영역이 1개소 다른 HCP이다. 각 프로브는 양자를 하이브리다이제이션시켰을 때, Ⅹ 영역은 Ⅹ' 영역과만 결합하고, Z 영역은 Z' 영역과만 결합하고, α영역은 α' 영역과만 결합하고, β영역은 β' 영역과만 결합하도록 하는 구성으로 되어 있다. 2조의 HCP는 각각 α영역과 α' 영역 혹은 β영역과 β' 영역이 하이브리다이즈하여, 다이머를 형성할 수 있고, 이들 다이머[도2(c)]로부터, PALSAR법의 원리를 따라서, 올리고뉴클레오티드의 자기집합에 의해, 2가닥의 자기집합체를 형성시킬 수 있다[도2(d)].
도3은 PALSAR법에 의한 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브를 이용한 자기집합체의 형성 방법의 일예를 나타내는 모식도다. 도3에 나타낸 바와 같이, 제1계의 한쌍의 다이머 형성용 프로브는 한쌍의 올리고뉴클레오티드를 3개의 영역으로 나누어, 중앙 영역을 서로 상보적인 영역으로 하는 동시에, 3' 측영역 및 5' 측영역을 서로 비상보적인 염기서열로 하여, 다이머 프로브를 형성한다[도3(a)]. 제2계의 한쌍의 가교 프로브는 한쌍의 올리고뉴클레오티드를 3' 측영역 및 5' 측영역의 2개의 영역으로 나누어, 각 영역을 서로 비상보적인 염기서열로 하고, 3' 측영역은 다이머 형성용 프로브의 3' 측영역과, 5'측영역은 다이머 형성용 프로브의 5' 측영역과 각각 상보적인 염기서열로 한다[도3(b)]. 제1계의 다이머 프로브에 대하여, 제2계의 가교 프로브가 가교하도록 하이브리다이제이션시키는 것에 의해, 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여, 2가닥의 자기집합체를 형성한다[도3(c)].
도4는 PALSAR법에 의한 다이머 형성용 프로브와 가교 프로브를 사용한 자기집합체의 형성 방법의 다른 예를 나타내는 모식도이다. 다이머 형성용 프로브와 가교 프로브의 5' 측영역 및 3' 측영역의 상보적 영역의 조합으로서는, 도3의 조합을 도4에 나타낸 것 같이 변경하는 것도 가능하다.
도3 및 도4에 있어서, 제1계로 이루어지는 다이머 형성용 프로브와 제2계로 이루어지는 가교 프로브를 사용한 자기집합체의 형성 방법에 대해서 설명했지만, 도5 및 도6에 나타낸 것 같이, 제1, 3, ··(2n-1)계로 이루어지는 다이머 형성용 프로브와 제2, 4, ··2n계로 이루어지는 가교 프로브를 사용한 자기집합체를 형성시키는 것도 가능하다. 도5는 n≥2의 경우의 자기집합체의 형성 방법의 일예를 나타낸 도면이며, 도6은 n≥2의 경우의 자기집합체의 형성 방법의 다른 예를 나타낸 도면이다.
상기 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브를 이용한 자기집합체의 형성 방법에 있어서, 비상보적인 염기서열로는, 서로 하이브리다이즈하지 않는 염기서열이면, 어떠한 것이라도 좋고, 동일한 염기서열도 비상보적인 염기서열에 포함되는 것이다.
상기 다이머 형성용 프로브의 구성은, 각 계의 다이머 형성용 프로브가 1종류의 것이라도 좋고, 1개의 계에 중앙영역이 다른 몇종류의 다이머 형성용 프로브를 포함하고 있어도 좋고, 특별히 한정되지는 않는다. 또한 서로 완전히 상보성이 없는 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브의 세트를, 2조 이상 동시에 행해도 좋다.
상기 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브를 이용한 자기집합체의 형성 방법에 있어서, 다이머 형성용 프로브로부터 다이머를 형성시키는 시기는, 다이머 형성전의 다이머 형성용 프로브와 가교 프로브를 동시에 반응시켜도 좋고, 미리 다이머 형성용 프로브에 의해 다이머를 형성시킨 후에 가교 프로브와 반응시켜도 좋고, 특별히 한정되지 않지만, 미리 다이머를 형성시킨 후, 가교 프로브와 반응시켜, 자기집합체를 형성시키는 쪽이 보다 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법은, 상기 자기집합체의 형성 방법에 있어서, 유전자증폭 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드를 적어도 하나, 프로브로서 사용하는 것이다.
본 발명의 유전자증폭 방법으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제1예는, 상기 PALSAR법에 있어서, 내열성 핵산합성 효소 또는 쇄치환형 핵산합성 효소 등의 기존의 유전자 증폭법에 의해 증폭된 유전자를 프로브로서 사용하는 것이다. 이하, 증폭된 유전자를 가교 프로브로서 사용하는 경우에대해서 상술한다.
도7은 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제1예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 도7에 나타낸 것 같이, 기존의 유전자 증폭법에 의해 증폭된 서로 상보적인 한쌍의 유전자 단편을 사용하여, 자기집합체를 형성시킬 수 있다. 우선, 도7(a)에 나타낸 바와 같이, 서로 상보적인 유전자 단편을 4개의 영역(A~D영역 및 A'~D'영역)으로 나눈다. 더욱이, 한쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 5' 측의 2영역(A영역 및 B영역, C'영역 및 D'영역)을 선택하고, 선택한 2영역 중 5' 측에 위치하는 영역(A영역, D'영역)을 가교 프로브의 5' 측영역에, 3' 측에 위치하는 영역(B영역, C'영역)을 가교 프로브의 3' 측영역으로 해서, 거기에 대응하는 한쌍의 다이머 형성용 프로브를 도7(b)에 나타낸 바와 같이 제작한다. 유전자 단편에는 각각, 3' 측영역에 다이머 형성용 프로브의 각 영역과 하이브리다이즈하지 않는 여분의 배열(C영역 및 D영역, A'영역 및 B'영역, 이하 "태그(tag)"라 칭하는 경우도 있다)이 존재하지만, 한쌍의 유전자 단편은 한쌍의 다이머 형성용 프로브로 이루어지는 다이머 프로브에 가교하도록 하이브리다이즈하고, PALSAR법의 원리에 따라, 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여, 2가닥의 자기집합체가 형성된다 [도7(c)].
도8은 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제1예의 제2의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 도8(a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이, 한쌍의 유전자 단편에 대하여, 각 3' 측의 2영역(C영역 및 D영역, A'영역 및 B'영역)을 한쌍의 가교 프로브의 5' 측영역 및 3' 측영역으로서 사용할 수 있다.이 경우, 유전자 단편에는 각각, 5' 측영역에 다이머 형성용 프로브의 각 영역과 하이브리다이즈하지 않는 여분의 배열(A영역 및 B영역, C'영역 및 D'영역)이 존재한다. 이 한쌍의 유전자단편은 한쌍의 다이머 형성용 프로브로 이루어지는 다이머 프로브에 가교하도록 하이브리다이즈하고, PALSAR법의 원리를 따라, 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여, 2가닥의 자기집합체가 형성된다 [도8(c)].
도9는 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제1예의 제3의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 도9(a) 및 (b)에 나타낸 바와 같이, 한쌍의 유전자 단편에 대하여, 인접하지 않는 2영역(A영역 및 B영역, D'영역 및 C'영역)을 한쌍의 가교 프로브의 5' 측영역 및 3' 측영역으로서 사용할 수 있다. 이 경우도 도9(c)에 나타낸 바와 같이, 한쌍의 유전자 단편이 한쌍의 다이머 형성용 프로브로 이루어지는 다이머 프로브에 가교하도록 하이브리다이즈하고, PALSAR법의 원리를 따라, 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여, 2가닥의 자기집합체가 형성된다.
또한, 기존의 유전자 증폭법에 의해 증폭된 한쌍의 유전자 단편을 5영역 이상으로 나누어, 그 중의 2영역씩을 다이머 프로브와 가교하는 2영역으로서 사용하는 것도 가능하다.
도10은 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제1예의 제4의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 도10(a)에 나타낸 바와 같이, 서로 상보적인 유전자단편을 5개의 영역(A~E영역 및 A'~E'영역)으로 나눈다. 더욱이, 한쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 5' 측의 2영역(A영역 및 B영역, C'영역 및 D'영역)을 선택하고, 선택한 2영역 중 5' 측에 위치하는 영역(A영역, D'영역)을 가교 프로브의 5' 측영역에, 3' 측에 위치하는 영역(B영역, C'영역)을 가교 프로브의 3' 측영역으로 해서, 거기에 대응하는 한쌍의 다이머 형성용 프로브를 도10(b)에 나타낸 바와 같이 제작한다. 유전자 단편에는 각각 3' 측영역에 다이머 형성용 프로브의 각 영역과 하이브리다이즈하지 않는 여분의 배열(E, C 및 D영역, A', B' 및 E'영역)이 존재하지만, 한쌍의 유전자 단편은 한쌍의 다이머 형성용 프로브로 이루어지는 다이머 프로브에 가교하도록 하이브리다이즈하고, PALSAR법의 원리를 따라, 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여, 2가닥의 자기집합체가 형성된다[도10(c)].
상기한 바와 같이, 서로 상보적인 한쌍의 유전자 단편을 PALSAR법의 가교 프로브로서 사용하는 것이 가능하다. 유전자 단편의 각 영역 중, 어느 2영역을 다이머 프로브와 하이브리다이즈하는 영역으로 할지는 특별히 한정되지 않고, 2영역이 인접하고 있어도 좋고, 인접하지 않아도 좋다. 또한, 유전자 단편의 말단에 반드시 존재하지 않아도 좋다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법에 있어서, 기존의 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 유전자 단편을 미리 효소 등을 사용하여 다이머 형성용 프로브와 비상보적인 영역을 절단해 두고, 절단된 한쌍의 유전자 단편을 가교 프로브로서 사용하여, PALSAR법의 원리를 따라, 자기집합체를 형성시키는 것이 바람직하다.
절단된 유전자 단편에 의한 자기집합체의 형성 방법을 도11~도13에 나타낸다. 도11 및 도12는 각각 도7 및 도10의 한쌍의 유전자 단편을 절단했을 경우의 자기집합체의 형성 방법을 나타낸다. 도13은 다이머 형성용 프로브와 가교 프로브의 상보적 영역을 도4에 나타나는 조합으로 한 경우에서의, 한쌍의 유전자 단편을 절단한 경우의 자기집합체의 형성 방법을 나타낸다. 다이머 프로브에 가교하지 않는 여분의 영역을 절단하는 것에 의해, 자기집합체의 형성 효율을 향상시킬 수 있다.
유전자 단편의 절단 방법은 특별히 한정되지는 않지만, 제한 효소나 RNase H등의 효소를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법에 있어서, 다이머 형성용 프로브로부터 다이머 프로브를 형성시키는 시기는, 다이머 형성전의 다이머 형성용 프로브와 유전자 단편을 동시에 반응시켜도 좋고, 미리 다이머 형성용 프로브에 의해 다이머 프로브를 형성시킨 후에 유전자 단편과 반응시켜도 좋고, 특별히 한정되지는 않지만, 미리 다이머 프로브를 형성시킨 후, 자기집합체를 형성시키는 쪽이 보다 바람직하다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법은, 상기 다이머 형성용 프로브로부터 형성되는 다이머 프로브와 같은 다이머 프로브와 가교 프로브를 가교하도록 하이브리다이제이션시켜, 자기집합체를 형성시키는 자기집합체의 형성 방법을 포함하는 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법에 사용하는 한쌍의 유전자 단편은, 2개 모두 유전자 증폭 반응에 의해 증폭된 유전자 단편일 필요는 없고, 예를 들면, 도14에 나타낸 바와 같이, 가교 프로브로서 사용하는 한쌍의 유전자 단편 중, 한 쪽을 기존의 유전자 증폭법에 의해 증폭된 유전자 단편[도14(a)]을 이용하고, 다른 한쪽을 미리 제작해 둔 유전자 단편[도14(c)]을 이용하는 것도 가능하다. 이들 한쌍의 유전자 단편과 그것에 대응하는 한쌍의 다이머 형성용 프로브[도14(b)]를 하이브리다이제이션시키는 것에 의해, 자기집합체가 형성된다[도14(d)]. 사용하는 유전자 단편은, 상기한 바와 같이, 각각 다이머 프로브와 가교하도록 하이브리다이즈하는 2영역을 포함하는 것이면 특별히 한정되지는 않는다. 도14(a)에 있어서, 바람직한 예로서, 다이머 프로브와 각각 가교하는 A영역과 B영역, 또한 어느 것과도 하이브리다이즈하지 않는 Y영역으로 이루어지는 단일가닥의 유전자 단편을 나타내지만, Y영역은 어떠한 배열이라도 좋고, 특별히 한정되지는 않는 것이다. 상기한 바와 같이, 여분인 태그를 포함하는 유전자 단편의 경우는 그대로 사용해도 좋지만, 그 영역을 절단 후, 자기집합체를 형성시키는 것이 보다 바람직하다.
기존의 유전자 증폭법에서는, 대과잉의 프라이머 등의 증폭용 프로브를 이용해서 유전자 증폭을 행하기 때문에, 증폭 후의 용액에는 증폭된 유전자 단편과 함께, 과잉의 증폭용 프로브가 존재한다. 이 과잉의 증폭용 프로브 존재 하에서는, 자기집합체 형성의 효율이 저하하는 등의 문제가 생기기 쉽다. 이 증폭용 프로브를 제거하고, 자기집합체 형성의 효율을 높이는 방법으로서, 엑소뉴클레아제(예를 들면, Exonuclease I나 Exonuclease VII 등) 혹은 RNA로 이루어지는 증폭용 프로브 및 RNase H를 사용하는 것이 바람직하다. 증폭용 RNA 프로브 및 RNase H를 사용했을 경우, 자기집합체 형성 반응의 프로브로서 사용할 수 있는 표적 유전자로서, 내열성 DNA 합성 효소로 증폭된 유전자 단편이나, 쇄치환형 DNA 합성 효소로 증폭된유전자 단편을 적당하게 사용할 수 있다. 내열성 DNA 합성 효소로서는, KOD Dash (TOYOBO 회사제) 등을 적당하게 사용할 수 있다. 도15 및 도16에, 내열성 DNA 합성 효소, 증폭용 RNA 프로브 및 RNase H를 이용한 자기집합체의 형성 방법의 모식도를 나타낸다.
도15(a)에 나타낸 바와 같이, 한쌍의 증폭용 RNA 프로브를 이용해서 DNA를 증폭하면, DNA(A', B'영역, C, D영역)와 RNA(Ⅹ영역, Y영역)로 이루어지는 한쌍의 유전자 단편이 증폭된다[도15(a) 및 도16(b)]. 이 증폭 후의 용액에 RNase H를 첨가해서 반응시키는 것에 의해, 유전자 단편의 RNA 영역 부분과 증폭용 RNA 프로브가 가수분해 된다. 도16(c)에 나타낸 바와 같이, RNase H 처리 후의 한쌍의 유전자 단편을 2영역으로 나누는 것에 의해, 서로 비상보적인 2영역으로 이루어지는 한쌍의 가교 프로브가 형성된다. RNase H 처리 후의 한쌍의 유전자 단편에 상보적 영역이 남지 않도록 증폭용 RNA 프로브를 구성하는 것이 바람직하지만, 특별히 한정되는 것은 아니고, 서로 상보적인 영역을 포함하는 경우도 본 발명에 포함된다. 상기 한쌍의 가교 프로브가 미리 제작해 둔 가교 프로브에 대응하는 다이머 프로브[도16(d)]에 가교하도록 하이브리다이즈하여, 자기집합체를 형성한다[도16(e)]. 상기 방법에 의해, 증폭용 프로브를 제거하고, 또한 다이머 프로브에 가교하지 않는 여분의 배열을 삭제하여, 자기집합체 형성의 효율을 높일 수 있다.
본 발명의 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제2예는, 상기 PALSAR법에 있어서, 내열성 핵산연결 효소에 의해 연결된 말단측의 염기가 메틸화되어 있는 올리고뉴클레오티드(이하, "메틸화 프로브"라 칭하는 경우가 있다)를 프로브로서 사용하는 것이다. 표적 유전자와 상보적인 영역을 가지는 메틸화 프로브를 사용하고, 표적 유전자와 상보적인 영역을 미리 절단해 두고, 표적 유전자의 존재 하에서 내열성 리가제(ligase) 효소에 의해 절단된 유전자를 연결 반응시킨다. 연결 반응 후는 엑소뉴클레아제를 사용해서 자기집합 반응의 경합 물질이 되는 미반응의 메틸화 프로브를 분해하는 것을 특징으로 한다. 유전자 증폭 반응으로 사용하는 올리고뉴클레오티드의 메틸화한 염기를 도17에 나타낸다. 이하, 증폭된 유전자를 다이머 형성용 프로브로서 사용하는 경우에 관한 일례를 상술한다.
도18~도21은 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제2예의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 도18에 나타낸 바와 같이, 제1계의 다이머 형성용 프로브와 제2계의 가교 프로브를 이용한 자기집합체의 형성 방법에 있어서, 도18(a) (b) 에 나타낸 바와 같이, 표적 유전자[도18(a)]로부터, 표적 유전자와 상보적인 영역(α' 및 β'영역, α및 β영역)을 중앙 영역에 가지는 다이머 형성용 프로브를 제작하고, 5' 말단측과 3' 말단측의 염기를 메틸화하고, 더욱이 표적 유전자와 상보적인 중앙 영역을 미리 절단해 둔다[도18(b)]. 도19(c)에 나타낸 바와 같이, 절단된 다이머 형성용 프로브는, 표적 유전자와 하이브리다이제이션한 후, 도19(d)에 나타낸 바와 같이, 내열성 리가제 효소에 의해, 다이머 형성용 프로브가 연결된다. 이 일련의 반응을 써멀 사이클러(thermal cycler)에 의해 반복하여, 연결된 다이머 형성용 프로브를 증가시킨다. 그 후, 핵산분해 효소,예를 들면 Exonuclease VII 등의 엑소뉴클레아제를 가하면, 표적 유전자가 존재하고, 다이머 형성용 프로브가 연결되어 있을 경우, 도20(e)에 나타낸 바와 같이, 연결된 다이머 형성용 프로브의 양 말단의 염기는 메틸화되어 있기 때문에 분해되지 않지만, 표적 유전자가 존재하지 않고, 다이머 형성용 프로브가 절단된 채로 존재할 경우, 연결되지 않고 있는 다이머 형성용 프로브[도20(f)]는 절단되어 있는 부분이 메틸화되어 있지 않기 따문에 완전히 분해되어버리고, 자기집합체도 형성되지 않는다[도21(h)]. 연결된 다이머 형성용 프로브는 별도로 준비한 가교 프로브를 가하는 것에 의해 자기집합체를 형성할 수 있다[도21(g)]. 따라서, 자기집합체의 형성을 확인하는 것에 의해, 자기집합체의 존재를 확인할 수 있다.
본 발명의 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예는, 상기 PALSAR법에 있어서, 말단측의 염기가 메틸화된 증폭용 프로브 및 내열성 핵산합성 효소를 사용해서 증폭된 올리고뉴클레오티드를 프로브로서 사용하는 것이다. 적어도 한쪽의 증폭용 프로브의 3' 말단측의 염기를 메틸화하고, 5' 말단측의 염기를 인산화하여, 내열성 DNA 합성 효소에 의한 유전자 증폭용의 프로브로서 사용한다. 유전자 증폭 후는 엑소뉴클레아제를 사용해서 자기집합 반응의 경합 물질이 되는 과잉으로 존재하는 증폭용 프로브를 분해하는 것을 특징으로 한다. 이하에, 증폭된 유전자(이하, "합성 프로브"라 칭하는 경우도 있다)를 가교 프로브 혹은 HCP로서 사용하는 경우에 관해서 설명한다.
도22~도27은, 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제1의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 도22(a)에 나타낸 표적 유전자의 실선부분과 상보적으로 3' 말단측의 염기가 메틸화된 프로브[도22(b)]를 준비한다. 다음에 표적 유전자에 메틸화한 증폭용 프로브를 어닐링(annealing)[도23(c)] 시켜, 내열성 DNA 합성 효소에 의해 DNA를 합성시킨다 [도23(d)]. 이 일련의 반응을 써멀 사이클러에 의해 반복하고[도24(e),(f)], 증폭된 합성 프로브를 증가시켜[도25(g)], 핵산 분해 효소, 예를 들면 T7 Gene 6 Exonuclease 등의 엑소뉴클레아제를 첨가하는 것에 의해, 도25(h)에 나타낸 바와 같이 증폭된 합성 프로브는 5' 측에서부터 메틸화되어 있는 염기 앞까지 분해된다. 분해된 합성 프로브[도26(i)]는, 한쌍의 가교 프로브[도26(j)] 혹은 2종의 한쌍의 HCP의 한쪽[도26(k)]으로서 사용하는 것이 가능해서, 별도로 준비한 다이머 형성용 프로브, 또는 다른 한쪽의 HCP를 첨가하는 것에 의해 자기집합체를 형성할 수 있다.
또한, 도27(1),(m)에 나타낸 바와 같이, 분해된 합성 프로브는 더욱 미반응 프로브와 하이브리다이제이션시킨 후, 효소 처리를 하는 것에 의해, 보다 완전히 5' 측에서부터 메틸화되어 있는 염기 전까지 분해할 수 있다[도27(n)].
도28~도33은, 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제3예의 제2의 실시 형태를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 도28은 메틸화된 증폭용 프로브를 이용한 내열성 DNA 합성 효소에 의한 유전자 증폭과 자기집합체의 형성이다. 도28(a)에 나타낸 표적 유전자의 실선부분과 상보적이며, 또한 한쪽의 3' 말단측의 염기만이 메틸화된 증폭용 프로브[도28(b)]를 준비한다. 다음에 표적 유전자에 증폭용 프로브를 어닐링[도29(c)]시켜, 내열성 DNA 합성 효소에 의해 DNA를 합성시킨다[도29(d)]. 이 일련의 반응을 써멀 사이클러에 의해반복하고[도30(e),(f)], 증폭된 합성 프로브를 증가시키고[도31(g)], 핵산분해 효소, 예를 들면 T7 Gene 6 Exonuclease 등의 엑소뉴클레아제를 첨가하는 것에 의해, 도31(h)에 나타낸 바와 같이 증폭된 프로브는 5' 측에서부터 메틸화되어 있는 염기 전까지 분해된다. 분해된 합성 프로브[도32(i)]는, 한쌍의 가교 프로브의 한쪽[도32(j)] 혹은 한쌍의 HCP의 한쪽[도32(k)]으로서 사용하는 것이 가능해서, 별도로 준비한 다른 한쪽의 가교 프로브 및 한쌍의 다이머 형성용 프로브, 또는 다른 한쪽의 HCP를 첨가하는 것에 의해 자기집합체를 형성할 수 있다.
또한, 도33(1)에 나타낸 바와 같이, 분해된 합성 프로브는 또한 미반응 프로브와 하이브리다이제이션시킨 후, 효소처리를 하는 것에 의해, 미반응 프로브를 보다 완전히 분해할 수 있다[도33(m)].
본 발명의 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제4예는, 상기 PALSAR법에 있어서, DNA와 RNA로 구성되는 키메라형 프로브이며, 또한 RNA와 인접하는 DNA의 3' 말단측의 염기가 메틸화된 프로브를 증폭용 프로브로서 사용하고, 쇄치환형 DNA 합성 효소에 의해 증폭된 유전자(합성 프로브)를 프로브로서 사용하는 것이다. 적어도 한쪽의 증폭용 프로브의 3' 측의 염기를 RNA, 5' 측의 염기를 DNA로 하고, 동시에 3' 말단측의 염기를 메틸화해서 쇄치환형 DNA 합성 효소에 의한 유전자 증폭용의 프로브로서 사용하고, 유전자 증폭후는 엑소뉴클레아제를 사용해서 자기집합 반응의 경합 물질이 되는 과잉으로 존재하는 증폭용 프로브를 분해하는 것을 특징으로 한다. 이하에, 증폭된 유전자를 가교 프로브 혹은 HCP로서 사용하는 경우에 대해서 설명한다.
도34~39는, 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제4 예의 실시 형태의 하나의 예를 원리적으로 나타내는 모식도이다. 표적 유전자[도34(a)]의 실선부분과 상보적이며, DNA와 RNA로 구성되고, RNA와 인접하는 DNA의 3' 말단측의 염기만이 메틸화된 증폭용 프로브[도34(b)]를 준비한다. 다음으로 표적 유전자에 상기 증폭용 프로브를 어닐링[도35(c)]시키고, RNase H에 의해 RNA 부분을 절단하고[도35(d)], 쇄치환형 DNA 합성 효소에 의해 DNA를 합성시킨다[도36(e)]. 이 일련의 반응을 등온에서 반복하여, 증폭된 합성 프로브를 증가시키고[도36(f), 도37(h)], 핵산분해 효소, 예를 들면 T7 Gene 6 Exonuclease 등의 엑소뉴클레아제를 첨가하는 것에 의해, 도37(i)에 나타낸 바와 같이 증폭된 합성 프로브는 5' 측에서부터 메틸화되어 있는 염기 전까지 분해된다. 분해된 합성 프로브[도38(j)]는, 한쌍의 가교 프로브[도38(k)] 혹은 2종의 한쌍의 HCP의 한쪽[도38(l)]으로서 사용하는 것이 가능해서, 별도로 준비한 한쌍의 다이머 형성용 프로브, 또는 다른 한쪽의 HCP를 첨가하는 것에 의해 자기집합체를 형성할 수 있다.
또한, 도39(m),(n)에 나타낸 바와 같이, 분해된 합성 프로브는 또한 미반응 프로브와 하이브리다이제이션시킨 후, 효소처리를 하는 것에 의해, 미반응 프로브를 보다 완전히 분해할 수 있다[도39(o)].
본 발명의 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제5예는, 상기 PALSAR법에 있어서, DNA와 RNA로 구성되는 키메라형 프로브를 증폭용 프로브로서 사용하고, 쇄치환형 DNA 합성 효소에 의해 증폭된 유전자를 프로브로서 사용하는 것이다. 적어도 한쪽의 증폭용 프로브의 3' 측의염기를 RNA, 5' 측의 염기를 DNA로 하여 쇄치환형 DNA 합성 효소에 의한 유전자 증폭용의 프로브로서 사용한다. 유전자 증폭후는 엑소뉴클레아제를 사용해서 자기집합 반응의 경합 물질로 되는 과잉으로 존재하는 증폭용 프로브를 분해하는 것을 특징으로 한다. 이하에, 증폭된 유전자(합성 프로브)를 가교 프로브 혹은 HCP로서 사용하는 경우에 대해서 설명한다.
도40~45는, 상기 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법의 제5 예의 실시 형태의 하나의 예를 원리적으로 나타내는 모식도이다. [도40(a)]에 나타낸 표적 유전자의 실선부분과 상보적이며, DNA와 RNA로 구성된 증폭용 프로브[도40(b)]를 준비한다. 다음으로 표적 유전자에 상기 증폭용 프로브를 어닐링[도41(c)]시키고, RNase H에 의해 RNA 부분을 절단하고[도41(d)], 쇄치환형 DNA 합성 효소에 의해 DNA를 합성시킨다[도42(e)]. 이 일련의 반응을 등온에서 반복하여, 증폭된 합성 프로브를 증가시키고[도42(f), 도43(h)], 핵산분해 효소, 예를 들면 T7 Gene 6 Exonuclease 등의 엑소뉴클레아제를 첨가하는 것에 의해, 도43(i)에 나타낸 바와 같이 증폭된 합성 프로브는 5' 측으로부터 RNA의 부분까지 분해된다. 분해된 합성 프로브[도44(j)]는, 한쌍의 가교 프로브[도44(k)] 혹은 2종의 한쌍의 HCP의 한쪽[도44(l)]으로서 사용하는 것이 가능해서, 별도로 준비한 한쌍의 다이머 형성용 프로브, 또는 다른 한쪽의 HCP를 첨가하는 것에 의해 자기집합체를 형성할 수 있다.
또한, 도45(m),(n)에 나타낸 바와 같이, 분해된 합성 프로브는 또한 미반응 프로브와 하이브리다이제이션시킨 후, 효소처리를 하는 것에 의해, 미반응 프로브를 보다 완전히 분해할 수 있다[도45(o)].
상기 방법에 의해 형성된 자기집합체는, 일반적인 아가로즈겔 전기영동법 등에 의해, 간단히 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 형성되는 자기집합체의 염기의 쌓임이 규칙적인 고차구조를 취하기 때문에, 260nm에서의 자외부의 흡수대의 강도가 감소하는「하이포크로미즘(hypochromism)」이라고 하는 담색효과를 발현시켜 자기집합체의 상태를 확인하는 것도 가능하다.
또한, 핵산과 결합하는 성질을 가진 형광물질을 첨가하여, 그 형광강도의 변화로부터 자기집합체의 상태를 확인하는 것도 가능하다. 예를 들면, 자기집합체는, 올리고뉴클레오티드의 2중가닥에 삽입해서 형광을 발생하는 색소를 첨가하고, 세파이드사의 Ⅰ-CORETM(Smart CyclerTM) 등을 사용해서 형광의 발광 상태를 관찰하는 것에 의해 검출 가능하다.
상기한 바와 같이, 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법은, 표적 유전자가 존재하는 경우에만 자기집합체가 형성되기 때문에, 형성된 자기집합체를 검출하는 것에 의해, 표적 유전자를 검출하는 것이 가능하다.
이하에, 본 발명의 실시예를 제시해서 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것이 아님은 물론이다.
(실시예 1~6)
이하에, 실시예 1~6에 있어서 사용된 올리고뉴클레오티드·프로브를 나타낸다.
[1] 가교 프로브 ―1 (밑줄부; 여분의 배열(태그)]
5'-TTGGATCAACCCGCTCAATG CCTGGAGATTTGGGCGTGCC -CCCGCAAGACTGCTAGCCGA GTAGTGTTGGGTCGCGAAAG-3'
[2] 가교 프로브 ―2 (밑줄부; 여분의 배열(태그)]
3'-AACCTAGTTGGGCGAGTTAC GGACCTCTAAACCCGCACGG- GGGCGTTCTGACGATCGGCT CATCACAACCCAGCGCTTTC-5'
[3] 가교 프로브 ―3
5'-TTGGATCAACCCGCTCAATG CCTGGAGATTTGGGCGTGCC-3'
[4] 가교 프로브 ―4
3'-GGGCGTTCTGACGATCGGCT CATCACAACCCAGCGCTTTC-5'
[5] 다이머 형성용 프로브 ―1
5'-GTAGTGTTGGGTCGCGAAAG - GCTCACAGTTAAGCCGTGAG - CCCGCAAGACTGCTAGCCGA-3'
[6] 다이머 형성용 프로브 ―2
5'-CATTGAGCGGGTTGATCCAA - CTCACGGCTTAACTGTGAGC - GGCACGCCCAAATCTCCAGG-3'
(실시예 1~14)
(1) 목적
기존의 유전자 증폭법으로 증폭된다고 예상되는 다이머 프로브와 하이브리다이즈하지 않는 여분의 배열(태그)을 가지는 유전자 단편을 가교 프로브로서 사용한 경우에 있어서, 다이머 프로브와의 자기집합체 형성이 가능한 지를 조사하였다.
(2) 재료
(a) 가교 프로브로서, 기존의 유전자증폭법에서 증폭된다고 가정한, 서로 상보적인 배열을 가지는 80염기의 합성 올리고뉴클레오티드 2개(가교 프로브-1 및 가교 프로브-2) 및 이들에 대응하는 다이머 형성용 프로브(다이머 형성용 프로브-1 및 다이머 형성용 프로브-2)를 작성하였다. 각 프로브는 각각 100pmo1/㎕ 로 조제하였다.
(b) 실시예 1~7은, 완충액으로서 2M-CaCl2용액을 사용하였다. 실시예 8~14는, 완충액으로서 20 ×SSC 용액(3M-NaCl, 0.3M-C6H5O7Na3·2H2O, 실시예 8~14에 있어서 20 ×SSC 용액은 3M-NaCl로서 취급하였다)을 사용하였다.
(3) 방법
(a) 반응액의 조제
가교 프로브-1, 가교 프로브-2, 다이머 형성용 프로브-1 및 다이머 형성용 프로브를 각각 0.5㎕ 첨가하고, 완충액(2M-CaCl2용액 또는 3M-NaCl 용액) 및 멸균 재증류수를 가해서 합계 20㎕의 반응액을 조제하였다. 완충액 및 멸균 재증류수는, 반응액 중의 완충액의 농도가 각각 1.2M (실시예 1, 8), 1.OM (실시예 2, 9), 0.8M(실시예 3, 10), 0.6M (실시예 4, 11), 0.4M (실시예 5, 12), 0.2M (실시예 6, 13), 0.05M (실시예 7, 14)이 되도록 첨가하였다.
(b) 자기집합체 형성 반응
써멀 사이클러(퍼킨엘머사제)를 이용하고, 상기의 각 반응액을 우선 94℃/30초에서 반응시키고, 그 후 70℃/1시간에서 반응시키는 것에 의해 자기집합체 형성 반응을 수행하였다.
(c) 아가로즈 겔 전기영동법에 의한 자기집합체의 확인
자기집합체 형성 반응후의 반응액 8㎕에 2㎕의 1oading buffer를 첨가하고, 2% Nusieve 3:1 agarose gel (Bio Whittaker Molecular Applications 사제)에서 100V, 30분간 전기영동을 수행하였다. 분자 사이즈 마커로서 DNA Molwxule Weight Marker XV (베링거·맨하임 (주) 제)를 사용하였다.
(실시예 15 및 16)
(1) 목적
기존의 유전자 증폭법으로 증폭하고, 효소 등으로 다이머 프로브와 하이브리다이즈하지 않는 여분의 배열(태그)을 삭제한 유전자 단편을 가교 프로브로서 사용한 경우에 있어서, PALSAR법을 따라서, 자기집합체가 형성되는 지를 조사하였다.
(2) 재료
(a) 가교 프로브로서, 실시예 1~14에 있어서 사용한 합성 올리고뉴클레오티드로부터 태그를 제거한, 서로 비상보적인 한쌍의 올리고뉴클레오티드(가교 프로브-3 및 가교 프로브-4)를 합성하여, 가교 프로브로서 사용하였다. 다이머 형성용 프로브로서, 실시예 1~14에 있어서 사용한 다이머 형성용 프로브-1 및 다이머 형성용 프로브-2를 이용했다. 각 프로브는 각각 100pmo1/㎕로 조제했다.
(b) 완충액은, 실시예 15에서는 2M-CaCl2용액을, 실시예 16에서는 3M-NaCl 용액을 각각 사용했다.
(3) 방법
(a) 반응액의 조제
가교 프로브-3, 가교 프로브-4, 다이머 형성용 프로브-1 및 다이머 형성용 프로브를 각각 0.5㎕ 첨가하고, 완충액 및 멸균 재증류수를 가해서 합계 20㎕의 반응액을 조제했다. 완충액 및 멸균 재증류수는 반응액 중의 완충액의 농도가 1.2M이 되도록 첨가하였다.
(b) 자기집합체 형성 반응
실시예 1~14와 같은 순서 및 조건에서, 자기집합체의 형성 반응을 수행하였다.
(c) 아가로즈 겔 전기영동법에 의한 자기집합체의 확인
실시예 1~14와 같은 순서 및 조건에서, 자기집합체의 확인을 하였다.
(4) 결과
실시예 1~16의 결과를 도46에 나타내었다. 여분의 배열(태그)을 가지는 가교 프로브의 경우, 실시예 1~7의 CaCl2용액 중에서의 반응(레인 1~7)과, 실시예 8~14의 20 ×SSC 용액 중에서의 반응(레인 9~15)을 비교해 보면, CaCl2용액 중에서만자기집합체 형성이 보여졌다. 특히 자기집합체 형성이 현저한 CaCl2용액 농도는 0.8M(레인 3)부근인 것을 알았다. 여분의 배열(태그)을 삭제한 실시예 15(레인 8) 및 실시예 16(레인 16)에서는, 완충액에 의하지 않고, 모두 자기집합체 형성이 관찰되었다. 이들 결과에 의해, 여분의 배열(태그)을 삭제한 가교 프로브쪽이 자기집합체 형성의 효율은 좋지만, 서로 상보적인 배열이며, 여분의 배열(태그)을 가지는 가교 프로브에 있어서도 다이머 프로브와의 자기집합체 형성이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 이것에 의해, 기존의 유전자 증폭법과 자기집합체 형성 반응을 조합시킨 계에 응용이 가능하다는 것이 나타난다.
(실시예 17 및 비교예 1)
이하에 실시예 17 및 비교예 1에 있어서 사용한 올리고뉴클레오티드·프로브를 나타내었다. 다만, □은 메틸화된 염기를 나타낸다.
(1) 목적
표적 유전자와의 하이브리다이제이션에 의존해서 연결되는 다이머 형성용 프로브와, 그 연결된 다이머 형성용 프로브와 가교 프로브를 사용한 자기집합체의 형성에 의한 표적 유전자의 확인을 행하였다.
(2) 재료
(a) 표적 유전자로서, MRSA의 PBPgene 유래의 합성 올리고뉴클레오티드인 표적 유전자-A 및 표적 유전자-B를 사용하였다. 표적 유전자는 각각 1pmo1/㎕로 조제했다.
(b) 중앙영역에 표적 유전자-A 및 B와 상보적인 영역을 가지는 한쌍의 다이머 형성용 프로브 및 대응하는 한쌍의 가교 프로브(가교 프로브-5, 6)를 제작하고, 상기 한쌍의 다이머 형성용 프로브의 5' 말단 및 3' 말단을 각각 메틸화하고, 중앙영역을 각각 절단하고, 절단 부위의 5' 말단을 인산화한 프로브(메틸화 프로브-1~4)를 제작했다. 프로브는 각각 50pmo1/㎕로 조제했다.
(c) 완충액으로서 20 ×SSC (3M-NaCl, 0.3M-C6H507Na3·2H2O, pH7.0)을 사용하였다.
(3) 방법
(a) 반응액의 조제
0.2㎖ 튜브에, 표적 유전자 A 및 B를 각각 1㎕, 메틸화한 프로브-1~4를 각각 1㎕, 내열성 리가제 효소(Tsc-Ligase, 일본 로슈사제)를 1㎕, 리가제에 첨부된 10×incubation buffer를 2㎕ 첨가하고, 멸균 증류수로 20㎕의 반응액으로 만들었다(실시예 37). 또한, 대조군으로서, 상기 반응액에 대하여, 표적 유전자를 첨가하지 않은 반응액도 제작하였다(비교예 1).
(b) 메틸화 프로브의 내열성 리가제 효소에 의한 유전자 증폭 방법
써멀 사이클러(퍼킨엘머사제)를 이용하여, 상기의 각 반응액을 95℃에서 3분간 반응시킨 후, 94℃ 15초간 →63℃ 4분간 40사이클을 수행하고, 리게이션(ligation) 반응에 의한 다이머 형성용 프로브의 증폭을 행하였다. 다음에, 99℃ 10분간 반응시킨 리가제를 실활시킨 후, 빙냉을 행하여 형성시킨 다이머 형성용 프로브를 1가닥으로 하였다.
(c) 엑소뉴클레아제에 의한 처리
상기 반응후의 반응액에 엑소뉴클레아제(Exonuclease VII, usb 사제)를 1㎕ 첨가하고, 37 ℃에서 60분간 반응시켰다. 대조군으로서, 엑소뉴클레아제 대신에 멸균 증류수를 첨가한 경우에 대해서도 동일하게 행하였다. 반응후의 반응액을 6%변성 폴리아크릴아미드(7M Urea)를 사용해서 변성 PAGE 전기영동법을 행하였다.
(d) 자기집합체의 형성 방법.
써멀 사이클러(퍼킨엘머사제)를 사용하여, 상기 반응 후의 각 반응액에 20×SSC (최종농도:10 ×SSC)를 첨가하여, 94℃/30초에서 반응시킨 후, 70℃/1시간으로 반응시키는 것에 의해 자기집합체의 형성 반응을 행하였다.
(e) 아가로즈 겔 전기영동법에 의한 자기집합체의 확인
자기집합체 형성 반응 후의 반응액 8㎕에 2㎕의 loading buffer를 첨가하고 , 2% Nusieve 3:1 agarose gel(Bio Whittaker Molecular Applications사제)에서 100V, 30분간 전기영동을 행하였다. 분자 사이즈 마커로서, DNA 마커(λHindⅢ digest)를 사용하였다.
(4) 결과
실시예 17 및 비교예 1의 변성 PAGE 전기영동법의 결과를 도47에 나타내었다. 도47의 레인1(실시예 17, 효소미처리)에 나타낸 바와 같이, 표적 유전자가 존재할 경우, 절단된 다이머 형성용 프로브가 연결되어, 화살표 (a)의 위치의 밴드가 검출되었다. 도47의 레인3(실시예17, 효소처리)에 나타낸 바와 같이, 연결된 다이머 형성용 프로브는 엑소뉴클레아제를 처리해도 분해되지 않기 때문에, 레인1과 같은 (a)의 위치에 밴드가 검출되었다. 한편, 도47의 레인2(비교예 1, 효소미처리)와 레인4(비교예 1, 효소처리)에 나타낸 바와 같이, 표적 유전자가 존재하지 않을 경우에는, 절단된 다이머 형성용 프로브는 연결되지 않고, (a)의 위치에 밴드는 검출되지 않았다.
또한, 레인1 및 2에 있어서, 화살표(b)의 위치에서 검출된 연결되지 않은 메틸화 프로브는, 엑소뉴클레아제 처리에 의해 분해되기 때문에, 레인3 및 4에 있어서 그 밴드는 검출되지 않았다.
실시예 17 및 비교예 1의 아가로즈 겔 전기영동법의 결과를 도48에 나타내었다. 연결된 다이머 프로브는 가교 프로브를 반응시키는 것에 의해 자기집합체를 형성하였다(도48, 레인1, 실시예 17). 또한, 연결되지 않은 미반응 프로브의 다이머 프로브에서는 가교 프로브와 반응시켜도 자기집합체는 형성되지 않았다(도48, 레인2, 비교예1).
(실시예 18 및 비교예 2)
이하에, 실시예 18 및 비교예 2에서 사용한 올리고뉴클레오티드·프로브를 나타내었다. 다만, □는 염기의 메틸화를 나타낸다.
(1) 목적
메틸화된 증폭용 프로브를 사용한, 내열성 DNA 합성효소에 의한 유전자 증폭과 자기집합체의 형성에 의한 증폭된 유전자를 확인하였다.
(2) 재료
(a) 주형(template) DNA로서 사용한 Mycobacterium tuberculosis의 IS6110 영역의 염기서열의 일부를 표적 유전자로서 사용하였다.
(b) 표적 유전자를 증폭시키는 증폭용 프로브로서, 각각 3' 말단을 메틸화한 한쌍의 증폭용 프로브-1 및 2(실시예 18), 메틸화되어 있지 않은 한쌍의 증폭용 프로브-3 및 4(비교예 2)를 제작했다. 다이머 형성용 프로브로서, 증폭되는 합성 프로브를 가교 프로브로서 사용하도록 구성된 한쌍의 다이머 형성용 프로브-3 및 4를 제작하였다. 프로브는 각각 50pmo1/㎕로 조제했다.
(c) 완충액으로서 20 ×SSC (3M-NaCl, 0.3M-C6H507Na3·2H2O, pH7.0)를 사용하였다.
(3) 방법
(a) 반응액의 조제
0.2㎖ 튜브에, 주형 DNA를 1㎕, 증폭용 프로브-1 및 2를 각각 0.5㎕, 10 ×P CR버퍼(10 × Ex Taq Buffer:보주조사제)를 5㎕, dNTP 혼합물(dNTP Mixture (각 2.5mM):보주조사제)을 4㎕, Taq 폴리머라제(polymerase)(TaKaRa Ex Taq (5units/μ):보주조사제)를 0.1㎕ 첨가하고, 멸균 증류수로 50㎕의 PCR 반응액으로 만들었다(실시예 18). 대조군으로서, 상기 반응용액에 있어서, 증폭용 프로브-1 및 2 대신에 증폭용 프로브-3 및 4를 첨가한 PCR 반응액도 제작하였다(비교예 2).
(b) PCR반응
써멀 사이클러(퍼킨엘머사제)를 사용하여, 상기 각 PCR 반응액을 94℃에서 1분간 처리한 후, 94℃ 30초간 →60℃ 2분간을 35사이클 수행하였다.
(c-1) 엑소뉴클레아제에 의한 처리(1)
별개의 0.2㎖ 튜브에 상기 PCR 반응후의 반응액을 10㎕ 옮기고, 엑소뉴클레아제(T7 Gene 6 Exonuclease, 아머샴 파마시아 바이오테크사제)를 0.1㎕, 5 ×T7 Gene 6 Exonuclease Buffer(아머샴 파마시아 바이오테크사제)를 2㎕ 첨가하고, 멸균 증류수를 가해서 합계 13㎕의 반응액으로 만들었다. 이 반응액을 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 85℃에서 15분 가열을 행해, 엑소뉴클레아제를 실활시켰다. 대조군으로서, 엑소뉴클레아제 대신 멸균 증류수를 첨가한 경우에 대해서도 동일하게 행하였다. 엑소뉴클레아제에 의한 처리 후, 반응액 10㎕를, 16% 폴리아크릴아미드겔(29:1, 바이오래드사제)을 이용해서 전기영동을 수행하였다. 전기영동후, 겔을 에티디움브로마이드(EtBr)로 염색하였다.
(c-2) 엑소뉴클레아제에 의한 처리(2)
상기 PCR 반응 후의 실시예 18의 반응액에 대하여, 상기 엑소뉴클레아제 처리(1)의 반응 조건을 37℃/30분간 →85℃/15분간의 반응에서 37℃/30분간 →57℃/30분간 →37℃/30분간 →85℃/15분간의 반응으로 변경한 이외에는 같은 조건 및 같은 순서로 엑소뉴클레아제 처리를 행하였다.
(d) 자기집합체의 형성 반응
상기 엑소뉴클레아제 처리(1) 및 (2)후의 실시예 18의 각 반응액에, 다이머 형성용 프로브-3 및 4를 각 1㎕ 첨가하고, 20 ×SSC를 최종농도가 10 ×SSC가 되도록 첨가하고, 94℃에서 30초간 처리한 후, 60℃ 1시간의 자기집합체 형성 반응을 행하였다.
(e) 아가로즈 겔 전기영동법에 의한 자기집합체의 확인
실시예 17과 같은 순서 및 같은 조건에서, 자기집합체의 확인을 하였다.
(4) 결과
실시예 18 및 비교예 2의 PAGE 전기영동법의 결과를 도49에 나타내었다.
도49에 있어서, 레인1은 10bp DNA Ladder marker, 레인2는 대조군으로 사용한 40mer의 1가닥 올리고뉴클레오티드, 레인3은 대조군으로 사용한 60mer의 1가닥 올리고뉴클레오티드, 레인4는 비교예 2(효소미처리), 레인5는 실시예 18(효소미처리), 레인6은 비교예 2(효소처리), 레인7은 실시예 18(효소처리)을 각각 나타낸다.
도49의 레인5 및 레인7에 나타낸 바와 같이, 메틸화된 증폭용 프로브를 사용한 실시예 18에서는, PCR 반응에 의해 원하는 증폭 산물인 합성 프로브의 밴드가 40bp의 위치에서 검출되었고, 더욱이 엑소뉴클레아제 처리를 행한 결과, 40bp의 밴드가 분해되어 새롭게 20bp의 위치에서 밴드가 검출되었다. 이 20bp의 밴드는 엑소뉴클레아제 처리에 의해 20mer로 분해된 합성 프로브와 20mer의 미반응의 증폭용 프로브와의 하이브리드이다. 이것에 의해, 메틸화된 증폭용 프로브를 사용한 증폭 산물을 엑소뉴클레아제 처리하므로써 상보가닥이 분해되어, 원하는 20mer의 한쌍의 가교 프로브를 얻을 수 있음을 알았다.
한편, 도49의 레인4 및 레인6에 나타낸 바와 같이, 대조군인 비메틸화 프로브를 증폭용 프로브로서 사용한 비교예 2에서는, PCR 반응에 의해 원하는 증폭 산물 밴드가 40bp의 위치에서 검출되었지만, 엑소뉴클레아제 처리를 행하면 40bp의 밴드가 분해될 뿐, 새롭게 다른 크기의 밴드는 검출되지 않았다.
실시예 18의 아가로즈 겔 전기영동의 결과를 도50에 나타내었다. 레인1 [엑소뉴클레아제 처리(2)]에 있어서, 합성 프로브의 상보가닥이 되는 미반응의 증폭용 프로브가 제거되었기 때문에, 합성 프로브와 다이머 형성용 프로브에 의한 자기집합체의 형성이 확인되었다.
한편, 합성 프로브와 미반응의 증폭용 프로브가 하이브리드를 형성한 상태에서 다이머 형성용 프로브를 첨가한 레인2 [엑소뉴클레아제 처리(1)]에 있어서는, 자기집합체의 형성은 확인되지 않았다.
(실시예 19 및 비교예 3~5)
이하에 실시예 19에서 사용한 DNA 및 RNA로 이루어지는 올리고뉴클레오티드·프로브를 나타내었다. 단, □은 RNA를 가리킨다.
(1) 목적
키메라화된 증폭용 프로브(DNA 및 RNA로 이루어지는 프로브)를 사용한 쇄치환형 핵산합성 효소에 의한 유전자증폭과 자기집합체의 형성에 의한 증폭된 유전자의 확인을 행했다.
(2) 재료
(a) 주형 DNA로서 사용한Mycobacterium tuberculosis의IS6110 영역의 염기서열의 일부를 표적 유전자로서 사용하였다.
(b) 표적 유전자를 증폭시키는 증폭용 프로브로서, 각각 3' 측의 3 염기를 RNA로 한 한쌍의 증폭용 키메라 프로브-1 및 2(실시예 19)를 제작했다. 다이머 형성용 프로브로서, 실시예 18과 동일하게, 다이머 형성용 프로브-3 및 4를 사용하였다. 프로브는 각각 50pmo1/㎕로 조제했다.
(c) 완충액으로서 20 ×SSC(3M-NaCl, 0.3M-C6H507Na3·2H2O, pH7.0)을 사용하였다.
(3) 방법
(a) 반응액의 조제
0.2㎖ 튜브에, 주형 DNA를 1㎕, 증폭용 키메라 프로브-1 및 2를 각각 0.25㎕, 트리스계 버퍼(0.1M 트리스 염산 버퍼, pH7.5)를 7.5㎕, dNTP 혼합물(dNTP Mixture(각 2.5mM):보주조사제)을 1㎕, Bcapolymerase(22U/㎕:보주조사제)를 0.15㎕, BSA(20mg/㎖ :보주조사제)를 0.2㎕, 10% 글리세롤을 6.5㎕, DMSO를 1㎕, MgCl2(50mM)를 5㎕, RNase H(60U/㎕:보주조사제)를 0.5㎕ 가하고, 멸균 증류수로 25㎕의 반응액으로 만들었다.
대조군으로서, 주형 DNA 대신 멸균 증류수를 1㎕ 가한 반응액도 제작하였다(비교예 3).
(b) 증폭 반응
써멀 사이클러(퍼킨엘머사제)를 이용하여, 상기의 반응액을 60℃에서 60분간 반응시킨 후, 95℃에서 5분 가열하여, 효소를 실활시켰다. 이 반응 용액을 「합성 프로브」용액으로 하였다.
(c) 아크릴아미드겔 전기영동법에 의한 증폭 산물의 검출
상기 합성 프로브 용액 8㎕를, 16% 폴리아크릴아미드겔(29:1, 바이오래드사제)을 사용해서 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 겔을 에티디움브로마이드로 염색했다.
(d) 자기집합체의 형성 반응
0.2㎖ 튜브에, 다이머 형성용 프로브-3 및 4를 각각 1㎕, 20 ×SSC를 12㎕
가하고, 멸균 증류수로 20㎕로 하였다.
이 반응 용액을 94℃에서 30초간 처리한 후, 60℃에서 18시간 반응시키고, 이것을 「다이머 프로브」용액으로 하였다.
그 다음, 자기집합체의 형성 반응으로서, 다른 0.2㎖ 튜브에 합성 프로브 용액을 5㎕, 다이머 프로브 용액을 10㎕, 20 ×SSC를 5㎕ 가하고, 60℃에서 18시간 반응시켰다.
대조군으로서, 합성 프로브 용액만(비교예 4) 및 다이머 프로브 용액만(비교예 5)의 반응도 수행하였다.
(e) 형광현미경에 의한 확인
상기 (d) 자기집합체의 형성 반응 용액 5㎕에, 에티디움브로마이드(10mg/㎖)를 1/1000로 희석하여 5㎕를 가하여, 30분간 방치하였다.
이것을 슬라이드 글라스 위에 3㎕ 적하하여, 형광현미경으로 관찰하였다.
(4)결과
1: 아크릴아미드겔 전기영동법에 의한 증폭 산물의 검출
도51에 실시예 19 및 비교예 3의 아크릴아미드겔 전기영동법의 결과를 나타내었다. 레인M은 10bp DNA Ladder marker, 레인1은 비교예 3, 레인2 및 3은 실시예 19를 각각 나타낸다. 그 결과, 실시예 19의 표적 DNA를 첨가한 경우만 40bp와 20bp의 증폭 산물 밴드가 검출되었다. 이 20bp의 밴드는 증폭된 40bp의 합성 프로브가, 함께 존재하는 RNase H에 의해 RNA부분이 분해되어 잘려져 나온 20mer의 합성 프로브와 20mer의 미반응 프로브와의 하이브리드이다.
2: 형광 현미경에 의한 확인
도52~54에 실시예 19 및 비교예 4, 5의 형광 현미경에 의한 결과를 각각 나타내었다. 다이머 프로브와 합성 프로브의 혼합 용액을 반응시킨 경우(실시예 19)만, 슬라이드 글라스 위에 입자상의 자기집합체를 확인할 수 있었다.
이상 상술한 바와 같이, 본 발명의 유전자 증폭 반응에 의해 얻을 수 있는 합성 프로브에 의한 자기집합체의 형성 방법에 따르면, EIA에 의한 특수한 기기나 시약을 이용하지 않고, 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체를 형성시킬 수 있고 , 본 발명의 유전자의 검출 방법에 의해, 특수한 기기나 번잡한 조작을 이용하지 않고, 저가격으로 간편히 특정한 유전자를 검출할 수 있다. 본 발명의 자기집합체는 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법에 의해 효율적으로 형성되는 것이다.
<110> Sanko Junyaku Co., Ltd. Sanko Junyaku Co., Ltd. <120> Method For Forming Self-Assembled Materials With Oligonucleotides Synthesized By Gene Amplification Reaction And Method For Detecting Gene. <130> 76206-PCT-KR <150> JP 2001-342709 <151> 2001-11-08 <150> JP 2002-132402 <151> 2002-05-08 <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized bridge probe-1 <400> 1 ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc cccgcaagac tgctagccga 60 gtagtgttgg gtcgcgaaag 80 <210> 2 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized bridge probe-2 <400> 2 ctttcgcgac ccaacactac tcggctagca gtcttgcggg ggcacgccca aatctccagg 60 cattgagcgg gttgatccaa 80 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized bridge probe-3 <400> 3 ttggatcaac ccgctcaatg cctggagatt tgggcgtgcc 40 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized bridge probe-4 <400> 4 ctttcgcgac ccaacactac tcggctagca gtcttgcggg 40 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized dimmer forming probe-1 <400> 5 gtagtgttgg gtcgcgaaag gctcacagtt aagccgtgag cccgcaagac tgctagccga 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized dimmer forming probe-2 <400> 6 cattgagcgg gttgatccaa ctcacggctt aactgtgagc ggcacgccca aatctccagg 60 60 <210> 7 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized target gene-A <400> 7 aacatgaaaa atgattatgg ctcaggtact gctatccacc ctcaaacagg tgaattatta 60 gcacttgtaa gcacaccttc 80 <210> 8 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized target gene-B <400> 8 gaaggtgtgc ttacaagtgc taataattca cctgtttgag ggtggatagc agtacctgag 60 ccataatcat ttttcatgtt 80 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized methylated probe-1 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> methyl group attached at 5' end <400> 9 gtgctgactt aaccggatac gattatggct caggtactgc t 41 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized methylated probe-2 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at 5' end <220> <221> misc_feature <222> (39) <223> methyl group attached at 3' end <400> 10 atccaccctc aaacaggtgg attggtactg cgagatagg 39 <210> 11 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized methylated probe-3 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> methyl group attached at 5' end <400> 11 gacgctttct gcgtgtatag cacctgtttg agggtggata 40 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized methylated probe-4 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at 5' end <220> <221> misc_feature <222> (40) <223> methyl group attached at 3' end <400> 12 gcagtacctg agccataatc ctagaacgga tcgtacttcg 40 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized bridge probe-5 <400> 13 ctatacacgc agaaagcgtc cgaagtacga tccgttctag 40 <210> 14 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized bridge probe-6 <400> 14 gtatccggtt aagtcagcac cctatctcgc agtaccattc 40 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized amplifying probe-1 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at 5' end <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> methyl group attached at 3' end <400> 15 cggaagctcc tatgacaatg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized amplifying probe-2 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at 5' end <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> methyl group attached at 3' end <400> 16 gttgatcgtc tcggctagtg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized amplifying probe-3 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at 5' end <400> 17 cggaagctcc tatgacaatg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized amplifying probe-4 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at 5' end <400> 18 gttgatcgtc tcggctagtg 20 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized dimmer forming probe-3 <400> 19 tatgacaatg gatcctagac cggaagctcc 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized dimmer forming probe-4 <400> 20 tcggctagtg gtctaggatc gttgatcgtc 30 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized amplifying chimera probe-1 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at 5' end <220> <221> misc_RNA <222> (18)..(20) <223> Combined DNA/RNA <400> 21 cggaagctcc tatgacaaug 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized amplifying chimera probe-2 <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> phosphoric acid attached at 5' end <220> <221> misc_RNA <222> (18)..(20) <223> Combined DNA/RNA <400> 22 gttgatcgtc tcggctagug 20

Claims (39)

  1. 올리고뉴클레오티드의 자기집합 반응에 의한 자기집합체의 형성 방법으로서, 해당 올리고뉴클레오티드로서 유전자 증폭 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 자기집합체의 형성 방법이, 서로 상보적인 염기서열 영역이 n(n≥3)개소의 수로 구성되는 한쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브의 복수쌍을 사용하여, 서로 다르게 교차하도록 하이브리다이제이션시키는 것에 의해, 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여 자기집합체를 형성시키는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 한쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브의 적어도 한쪽이, 상기 n(n≥3)개소의 영역을 함유하는 유전자 증폭 방법에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  4. 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 한쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브의 구성이, 1:1로 하이브리다이제이션하는 때에 반드시 n(n≥3)개소의 상보적인 부분중에서, 1개소씩이 특이적으로 하이브리다이제이션하도록 구성되는 것을 특징으로 하는 한쌍의 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  5. 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 한쌍의 올리고뉴클레오티드·프로브의 복수쌍의 구성이, 해당 염기서열 영역이 적어도 1개소 다른 m(m≥2)종의 한쌍의 프로브로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  6. 제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드·프로브가 DNA, RNA, PNA 또는 LNA 중 어느 하나로부터 선택되는 염기로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  7. 제 2항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드·프로브의 상보적 염기서열 영역의 말단에, 적어도 1개의 G(구아닌) 또는 C(시토신)을 배치시키고, 상기 프로브가 하이브리다이즈 한 경우에 적어도 1개의 G-C 결합을 상보적 염기서열 영역의 말단에 형성시키는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 자기집합체의 형성 방법이, No.1 및 No.2의 한쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 올리고뉴클레오티드를 3' 측영역, 중앙영역, 및 5' 측영역의 3개의 영역으로 나누고, 각 올리고뉴클레오티드의 중앙영역을 서로 상보적인 염기서열로 하고, 3' 측영역 및 5' 측영역을 서로 비상보적인 염기서열로 한 복수쌍의 다이머 형성용 프로브를 포함하는 제1번째 계로부터 제(2n-1)번째(n≥1)의 계까지 차례로 n개 형성된 다이머 형성용 프로브 함유계와,
    No.1 및 No.2의 한쌍의 올리고뉴클레오티드의 각 올리고뉴클레오티드를 3' 측영역 및 5' 측영역의 2개의 영역으로 나누고, 각 올리고뉴클레오티드의 3' 측영역 및 5' 측영역을 서로 비상보적인 염기서열로 한 복수쌍의 가교 프로브를 각각 포함하는 제2번째의 계로부터 제2n번째의 계까지 차례로 n개 형성된 가교 프로브 함유계를 갖고,
    해당 가교 프로브를, 해당 다이머 형성용 프로브로부터 형성되는 다이머를 가교하는 것이 가능한 염기서열로 하고,
    해당 프로브를 하이브리다이제이션시키는 것에 의해, 올리고뉴클레오티드가 자기집합하여, 자기집합체를 형성시키는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 프로브의 적어도 1개가, 유전자 증폭반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  10. 제 8항에 있어서, n=1이고, 상기 프로브의 염기서열을,
    제1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제2계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3'측영역,
    제1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제2계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
    제2계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제1계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3'측영역,
    제2계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역
    을 각각 상보적인 염기서열로 하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  11. 제 8항에 있어서, n=1이고, 상기 프로브의 염기서열을,
    제1계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제2계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    제1계의 No.2- 올리고뉴클레오티드의 5'측영역과 제2계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
    제1계의 No.2- 올리고뉴클레오티드의 3'측영역과 제2계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    제1계의 No.1- 올리고뉴클레오티드의 5'측영역과 제2계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역
    을 각각 상보적인 염기서열로 하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  12. 제 8항에 있어서, n≥2이고, 상기 프로브의 염기서열을,
    제(2n-3)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제(2n-2)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    제(2n-3)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제(2n-2)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
    제(2n-2)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제(2n-1)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    제(2n-2)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제(2n-1)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
    다이머 형성용 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 가교 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    다이머 형성용 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 가교 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
    가교 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제1번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    가교 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제1번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역
    을 각각 상보적인 염기서열로 하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  13. 제 8항에 있어서, n≥2이고, 상기 프로브의 염기서열을,
    제(2n-3)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제(2n-2)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    제(2n-3)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제(2n-2)번째 계
    의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
    제(2n-2)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제(2n-1)번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    제(2n-2)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제(2n-1)번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
    다이머 형성용 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 가교 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    다이머 형성용 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 가교 프로브의 최후의 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역,
    가교 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역과 제1번째 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 3' 측영역,
    가교 프로브의 최후의 계의 No.2-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역과 제1번째 계의 No.1-올리고뉴클레오티드의 5' 측영역
    을 각각 상보적인 염기서열로 하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  14. 제 8항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브의 하이브리다이제이션이, 미리 다이머 형성용 프로브로부터 다이머를 형성시킨 후, 상기 가교 프로브와 해당 다이머를 하이브리다이제이션시키는 것임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  15. 제 8항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복수쌍의 다이머 형성용 프로브는, 상기 중앙영역이 다른 m(m≥2)종의 다이머 형성용 프로브로 이루어지는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  16. 제 8항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 한쌍의 다이머 형성용 프로브의 3' 측영역 및/또는 5' 측영역을 서로 동일한 염기서열로 하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  17. 제 8항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가교 프로브의 적어도 하나가, 상기 가교 프로브의 2개의 영역을 함유하는 유전자 증폭 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드가, 각각 제(2n-1)계의 올리고뉴클레오티드의 5' 영역 및 3' 영역과 상보적인 영역을 2개소씩 갖는, 적어도 4개소의 영역으로 이루어지는 서로 상보적인 유전자 단편인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  19. 제 8항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브가, DNA, RNA, PNA 또는 LNA의 어느 것으로부터 선택되는 염기로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  20. 제 8항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다이머 형성용 프로브 및 가교 프로브의 상보적 염기서열 영역의 말단부에, 적어도 1개의 G(구아닌) 또는 C(시토신)을 배치시켜, 상기 프로브가 하이브리다이즈한 경우에 적어도 1개의 G-C 결합을 상보적 염기서열 영역의 말단부에 형성시키는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 내열성 핵산 합성 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  22. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 내열성 핵산 연결 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  23. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 쇄치환형 핵산 합성 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  24. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드가, 2가닥의 DNA 및/또는 RNA로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 단편인 것을 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  25. 제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드가, 단일가닥의 DNA 및/또는 RNA로 이루어지는 올리고뉴클레오티드 단편인 것을 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 사용되는 증폭용 프로브가 DNA인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  27. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 사용되는 증폭용 프로브가 RNA인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  28. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 사용되는 증폭용 프로브가 DNA와 RNA로 구성되는 키메라형인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  29. 제 26항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 사용되는 한쌍의 증폭용 프로브의 적어도 한쪽의 5' 말단측 및/또는 3' 말단측의 염기를 메틸화하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드가, 표적 유전자와 상보적인 영역을 가지는 올리고뉴클레오티드를 미리 해당 상보적 영역에서 절단하고, 리게이션반응에 의해 연결시킨 것임을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  31. 제 1항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 핵산분해효소로 분해하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 핵산분해효소로서 엑소뉴클레아제를 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  33. 제 31항에 있어서, 상기 핵산분해효소로서 RNase H를 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  34. 제 31항에 있어서, 상기 핵산분해효소로서 제한 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  35. 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 있어서 증폭되는 표적 유전자에 2가닥의 DNA 및/또는 RNA를 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  36. 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 있어서 증폭되는 표적 유전자에 단일가닥의 DNA 및/또는 RNA를 사용하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  37. 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 증폭 반응에 있어서 증폭되는 표적 유전자가 1염기다형인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법.
  38. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법을 사용하여 형성되는 것을 특징으로 하는 자기집합체.
  39. 제 1항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드에 의한 자기집합체의 형성 방법을 사용하여 자기집합체를 형성시키고, 형성된 자기집합체를 검출하는 것에 의해, 상기 유전자 증폭 반응으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 검출하는 것을 특징으로 하는 유전자의 검출방법.
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