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KR20040066788A - 프스포다이에스터레이즈 활성 및 뇌에서프스포다이에스터레이즈 1ｂ 매개되는 신호의 조절 - Google Patents

프스포다이에스터레이즈 활성 및 뇌에서프스포다이에스터레이즈 1ｂ 매개되는 신호의 조절 Download PDF

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KR20040066788A
KR20040066788A KR10-2004-7003040A KR20047003040A KR20040066788A KR 20040066788 A KR20040066788 A KR 20040066788A KR 20047003040 A KR20047003040 A KR 20047003040A KR 20040066788 A KR20040066788 A KR 20040066788A
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KR
South Korea
Prior art keywords
activity
pde1b
dopamine
receptor
intracellular signaling
Prior art date
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Ceased
Application number
KR10-2004-7003040A
Other languages
English (en)
Inventor
파울 그린가드
데이비드 레파스케
그렛첸 스나이더
Original Assignee
더 락커펠러 유니버시티
칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 락커펠러 유니버시티, 칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터 filed Critical 더 락커펠러 유니버시티
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Abstract

본 발명은 도파민 D1 세포내 신호전달 경로를 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로에서 포스포다이에스테라제이즈 1B (PDE1B)의 활성을 조절하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또 본 발명은 PDE1B 조절을 통하여 DARPP-32, 및 GluRI AMPA 수용체를 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 분자의 활성을 조절하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한 본발명은 PDE1B의 활성을 조절하는 화합물의 검색 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한 본발명은 PDE1B의 생성을 감소시키는 약제 또는 PDE1B의 저해제 그러나 이에 한정되지 않는 PDE1B 조절자를 투여하여 PDE1B 관련 질병 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로를 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병의 증상을 치료 또는 개선하는 방법에 관한 것이다.

Description

프스포다이에스터레이즈 활성 및 뇌에서 프스포다이에스터레이즈 1Ｂ 매개되는 신호의 조절{PHOSPHODIESTERASE ACTIVITY AND REGULATION OF PHOSPHODIESTERASE 1B-MEDIATED SIGNALING IN BRAIN}
싸이클릭 뉴크레오타이드 및 칼슘은 베이설 신경절 또는 선조체(striatum)으로 알려진 뇌의 영역내에 신호전달 경로의 주된 세컨 메신저이다.
NMDA-type 글루타메이트 수용체 활성화 및/또는 도파민 D2수용체 활성화는카르모쥬린 의존성 키나제 II(CaMKII) 및 칼시뉴린(calcineurin)와 같은 이펙터들의 활성화 및 카르모쥬린 의존성 포스포다이에스테라제(CaM-PDEs)의 활성화를 잠재적으로 이끌어 증가된 세포내 칼슘 농도을 야기한다(Greengard, P.등 1999 Neuron 23: 435-447; Kotter, R. 1994. Prog. Neurobiol. 44：163-196). 도파민 Dl 또는 D2 수용체 활성화는 각각 아데니릴 사이클레이즈 활성화( 및 증가된 사이클릭 AMP) 또는 저해( 및 감소된 사이클릭 AMP)을 야기한다. 도파민 D1 수용체 활성화 후 세포내 cGMP 농도 또한 증가하고 D2 수용체 활성화 후 불변 또는 저해된다. 싸이클릭 뉴크레오타이드는 DARPP-32(도파민 및 싸이클릭 AMP-조절되는 인단백질; dopamine and cAMP-regulated phosphoprotein) 및 사이클릭 AMP 응답 배열 결합 단백질(CREB)와 같은 다운스트림의 신호 전달 경로 요소를 인산화하는 프로틴 키나제 A(PKA;cAMP-의존성 프로틴 키나제) 및/또는 프로틴 키나제 G(PKG; cGMP-의존성 프로틴 키나제)를 활성화한다. 이들 신호전단 경로는 포스포다이에스테라제(PDE)에 의해 싸이클릭 뉴크레오타이드의 그들의 5'-모노포스페이트를 가수분해하여 다운-레귤레이트된다. 따라서 싸이클릭 AMP 및/또는 싸이클릭 GMP를 가수분해하는 칼슘-조절되는 포스포다이에스테라제는 베이설 신경절(선조체)에서 도파민-조절되는 및 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 세포내 신호전달 경로 사이에 유력한 인터페이스이다.
해마-중재된 학습 및 기억와 관련된 주된 형태의 적응성인 장기 (long-term) 협동작용(potentiation) 및 장기 디프레션은 PKA(아벨 T.등 1997, Cell 88：615-626; Skoulakis, E.M.C.등 1993, Neuron 11：197-208), CaMKII(바흐 M.B.등 1995. Cell 81：905-915; Mayford M. 등, 1995. Cell 81：891-904), CREB(Bourtchuladze, R 등 1994. Cell 79：59-68; Guzowski, J.F.등 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94：2693-2698; Yin, J.C.P.등 1994. Cell 79：49-58),및 칼시뉴린(Mansuy, I.M.등 1998. Cell 92：39-49)의 활성화를 포함한 환상 뉴크레오타이드 및 칼슘/카르모쥬린 신호 전달 캐스케이드에 의해 조절된다. 드로소필라 돌연변이체는 후각 컨디셔닝 패러다임에서 달라진 세포내 싸이클릭 AMP 레벨 또는 달라진 싸이클릭 AMP 신호전달 경로와 수반되는 학습결함을 보인다((Qui, Y.및 RL.데이비스. 1993. Genes Dev. 7：1447-1458; 리빙스턴, M.S.등 1984, Cell 37：205-215; Skoulakis, E.M.C.등 1993. Neuron 11： 197-208; 데이비스, RL.등 1995. Mol. Cell. Biochem. 149/150; 271-278). 또 cGMP의 활성은 리트로그레이드 신호 전달의 일산화 질소 경로를 통하여 학습 및 기억에 관련이 있다(GalIy, J.A.등 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：3547-3551; Garthwaite, J. 1991. Trends Neurosci. 14; 60-67).
열 PDE 계열이 동정되었지만 단지 계열 I만이 칼슘 및 싸이클릭 뉴크레오타이드 신호전달 경로 사이의 상호작용의 유력한 포인트로 작용한다는 것이 알려졌다. 공지된 세 CaM-PDE 유전자들인 PDE1A, PDE1B 및 PDE1C는 모두 중추신경계 조직에서 발현된다. PDE1A는 해마 및 소뇌의 CA1에서 CA3층에서 고수준, 선조체에서 저수준 발현되는 뇌에서 발현된다(Borisy, F.F. 등 1992. J. Neurosci. 12:915-923; Yan, C.등. 1994. J. Neurosci. 14:973-984). PDE1B는 주로 선조체, 덴테이트 잘이러스, 후각계 및 소뇌에서 주로 발현되고, 그것의 발현은 고수준의 도파민작용성 신경분포(innervation)를 갖는 뇌 영역과 상관관계가 있다(Furuyama, T. 등 1994. Mol. Brain Res. 26:331-336; Polli, J.W 및 R.L. Kincaid. 1994. J. Neurosci. 14: 973-984). PDEIC는 주로 후각 표피, 소뇌 과립 세포 및 선조체에서 발현된다(Yan, C.등 1995. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：9677-9681; Yan,C.등 1996. J. Biol. Chem. 271:25699-25706). 비록 발현패턴에 대해서는 심도있게 연구하였지만, 뇌에서 CaM-PDE들에 대한 생리적 역할은 밝혀지지 않았다.
따라서 신경계에서 포스포다이에스테라제이즈의 조절과 관련된 질병 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 새로운 조성물 또는 약제를 개발하는데 사용하는 새로운 검색 방법을 제공하는 것이 당업계에는 필요하다. 더욱이 포스포다이에스터레이즈에 의해 조절되는 세포내 신호전달 경로의 변형 또는 조절장애에 적어도 부분적으로 기인하는 그런 질병 또는 이상의 치료제를 개발할 필요성이 있다. 본 발명은 이런 방법 및 조성물을 제공한다.
배경기술 또는 본 출원의 다른 부분에서의 참고문헌의 인용 또는 확인은 그런 참고문헌이 본 발명에 종래 기술로서 사용된다고 하는 자인으로 간주해서는 안된다.
본 발명은 도파민 D1 세포내 신호전달 경로를 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로에서 포스포다이에스테라제이즈 1B (PDE1B)의 활성을 조절하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또 본 발명은 PDE1B 조절을 통하여 DARPP-32, 및 GluRI AMPA 수용체를 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 분자의 활성을 조절하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한 본발명은 PDE1B의 활성을 조절하는 화합물의 검색 방법 및 조성물에 관한 것이다. 또한 본발명은 바람직하게는 PDE1B의 생성을 감소시키는 약제 또는 PDE1B의 저해제 그러나 이에 한정되지 않는 PDE1B 조절자를 투여하여 PDE1B 관련 질병 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로를 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병의 증상을 치료 또는 개선하는 방법에 관한 것이다.
도 lA-C는 제 3세대 역교배의 후손의 PDE1B 및 서던 및 노던 블럿 분석에 타겟 분석이다. A는 일부분의 내생적인(endogenous) PDE1B 유전자의 개략도 및 타겟팅 벡터로 상동적 재조합의 결과. 중심 촉매 도메인을 코딩하는 3.1 kb의 부분은 2.9 kb의 HPRT 유전자를 가지는 대체물로 나누었다. 분열은 3.7에서 2.2 kb로 StuI 절편에서 크기 이동을 야기하고, 3.7에서 10.6 kb로 NdeI/Kpn I 절편에서 크기 이동을 야기한다. PDE1B 유전자의 상단 바는 타겟팅 벡터에 포함된 지노믹 DNA 서열을 나타낸다. PDE1B 유전자의 하단 바는 ES 세포 및 및 마우스 지노믹 DNA의 서던 블럿에 사용된 지노믹 DNA 서열을 나타낸다.번호를 붙여진 두꺼운 수직선은 엑손을 나타낸다. 얇은 수직선은 제한 효소 부위를 나타낸다. S, StuI; N, NdeI;X, XbaI;A, AccI; K, KpnI. B는 야생형(W), 잡종성(H), 및 널(null) 유전형을 나타내는 StuI 처리된 마우스 지노믹 DNA의 제 3세대 역교배 마우스의 후손의 서던 블럿이다. 모든 블럿들은 PDE1B 엑손 3 프로브로 프로브되었다. C는 각각의 유전자형의 마우스 브레인 전체 RNA를 중심 촉매 작용 도메인에 해당하는 cDNA 프로브, K-17(Repaske 등, 1992, J Biol Chem 267：18683-18688)로 하이브리다이즈하여 노던 블럿에 의해 분석하였다. 예상된 약 3.0 kb의 전사 산물이 WT 및 PDE1B +/- 마우스(상단)에서만 관찰되었다. 같은 노던 블럿상의 메틸렌 블루로 염색한 리보좀 밴드는 동일한 RNA 로딩(최하부)를 나타낸다. 자세한 것은 실시예를 참조.
도2는 수평 활성을 나타낸다. PDE1B-/-, PDE1B +/-), 및 WT 마우스(결합된수컷 및 암컷)에 대한 평균 ± SEM 수평 활성을 나타낸다. 화살표는 메타엠페타민 투여(1 mg/kg)시간을 나타낸다.카운트는 3분 간격 당 포토 빔 방해(interruption)의 총수를 나타낸다. PDE1B-/-가 메타엠파타민 챌린지 전(F(2.120)= 8.55;P < 0.0003) 및 후(F(2.120)= 11.18;p < 0.0001의)에 WT에 비하여 과민반응하였다. *p < 0.05; **p < 0.01. n = +/+, 71; +/-, 114; -/-, 49. 자세한 것은 실시예를 참조.
도 3A-B는 총 거리(total distance)에서 성적(sex) 차이이다. 3분 블럭의 활성 기구의 수컷(상단) 및 암컷(하단)에 의해 진행된 평균± SEM 거리를 나타낸다. 화살표는 메타엠페타민 투여(1 mg/kg)시간을 나타낸다. 수컷 PDE1B -/-가 아니라 암컷 PDE1B -/-마우스가 WT 마우스와 비교하여 전(pre) 메타엠파타민 챌린지 기간 동안 과민반응을 하였다(F(2.120)= 3.07; p< 0.05); 이 성적 차이는 챌린지 후 기간까지 계속되지 않았다. n = +/+, 71; +/-, 114; -/-, 49. 자세한 것은 실시예를 참조.
도 4 A-D는 WT 및 PDE1B -/- 마우스내의 PKA 중재된 기질의 인산화를 나타낸다. A는 WT 및 PDE1B -/- 마우스에서 온 아데니릴 사이클레이즈 활성화제 포르스코린 처리한 슬라이스(For) 및 대조군(Con) 선조체 슬라이스 내의 phospho-Thr34-DARPP-32의 레벨을 보여주는 면역블럿이다. B는 프로스코린에 대한 phospho-Thr34-DARPP-32의 배수 증가를 나타낸다(*p < 0.05(WT 포르스코린과 비교한); Mann-Whitney U 검정; n = 처리군 당 3 마우스). C는 WT 및 PDE1B -/- 마우스에서 온 비치료(Con) 및 D1-작용제 처리된(D1) 선조체 슬라이스내의 phospho-Thr34 및 전체DARPP-32(왼쪽) 및 phospho-Ser845 및 전체 GluRl(오른쪽)의 레벨을 보여주는 면역블럿이다. D는 D1 작용제로 배양 시 phospho-Thr34-DARPP-32(왼쪽) 및 phospho-Ser845-GluRl(오른쪽)의 레벨의 평균±SEM 증가(*p < 0.05(비처리된 대조군과 비교한 ); †p < 0.05(D1처리된 WT 슬라이스와 비교된); Mann-Whitney U 검정; n = 처리군 당 3 마우스). 자세한 것은 실시예를 참조.
도 5A-B는 모리스 워터 미로의 공간 학습을 나타낸다.+는 각각의 유전자형의 마우스에 대한 프랫폼에 도착하는 경로 길이(평균SEM)를 의미한다. PDEIB-/- 및 PDEIB +/- 마우스는 WT 마우스와 비교하여 상당히 증가된 경로 길이(F(2.112)= 8.38; p< 0.0004)를 보였다. 데이터는 모두 6일에 걸친 평균 날 당 4회의 시도의 평균을 보여준다. **p < 0.01(야생형 마우스와 비교한). n = +/+, 55; +/-, 101; -/-, 66. 자세한 것은 실시예를 참조.
도 6은 모리스 워터 미로의 공간 학습: 숨겨진 플랫폼 태스크의 인식을 나타낸다. 데이터는 각각 세 유전자형에 대한 일 당 4회의 시도의 평균을 보여준다. 3-6일에서 PDEIB-/- 및 PDEIB +/- 마우스는 WT 마우스와 비교하여 상당히 증가된 경로 길이(F(10,560)= 2.01; p< 0.004)를 보였다. *p < 0.05 및 **p < 0.01(야생형 마우스와 비교한). 채워진 다이아몬드, +/+, (n = 55); 음영을 붙여진 정방형, +/- (n = 101); 열린 삼각형, -/-, (n = 66). 자세한 것은 실시예를 참조.
도 7 A-B는 모리스 워터 미로의 공간 학습: 프로브 시도 수행을 나타낸다. 경로 길이(평균 ±SEM)는 2 프로브 시도 및 성별에 걸친 평균된 표적 환(A) 및 외측의 환(B)내의 전체 수영 시간의 퍼센트로 표현된다. *p < 0.01(야생형 마우스와 비교한). 자세한 것은 실시예를 참조.
본 발명은 포스포다이에스테레이즈(PDE) 활성, 특히 포스포다이에스테레이즈 1 B(PDE1B) 활성이 뇌에서 운동활성, 학습 및 기억의 조절자로 작용한다는 발명자들에게 있어서 놀라운 발견에 기초한다. 본 발명에 의하면, PDE1B은 도파민 D 1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 바람직하게는 신경계에서 세포내 신호전달 경로의 조절을 위한 치료적인 표적으로 사용될 수가 있다.
바람직한 실시예에서, 포스포다이에스테레이즈 1B는 예를 들어 PDE1B 관련 질병 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료를 위한 치료적인 표적으로서 사용될 수가 있다.특정의 실시예에서 PDEIB는 파킨슨병의 치료를 위한 치료적인 표적으로서 사용될 수가 있다.
본 발명은 도파민 D1 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하기 위해 충분한 양의 화합물로 세포 또는 조직에 접촉(contact)하는 것을 포함하는 세포 또는 조직에서 PDE1B 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 여기서 상기 화합물로 상기 세포 또는 조직의 접촉은 PDE1B 활성의 조절을 야기한다. 특정의 실시예에서 상기 화합물은 PDE1B와 결합한다. 다른 실시예에서 상기 화합물은 PDE1B의 발현을 변화한다. 다른 실시예에서 DARPP-32의 phospho-Thr34(이하에서, "phospho-Thr34") 또는 GluRl AMPA 수용체의 phospho-Ser845(이하에서 "phospho-Ser845")의 인산화는 조절된다.
본 발명은 PDE1B 활성을 조절하는 여기서 PDE1B 활성은 DARPP-32 및/또는GluRl AMPA 수용체의 인산화를 조절하는 약제를 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 PDE1B 관련 질병 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병치료방법을 제공한다.
본 발명은 PDE1B 활성을 조절하는 유효량의 본 발명의 화합물을 인간(예를 들어 환자) 또는 동물에게 투여하여 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병치료방법을 제공한다.한 실시예에서 약제는 PDElB 활성을 촉진 또는 증가시킨다. 어떤 실시예에서는 약제는 PDE1B 활성의 조절을 통하여 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 촉진(또는 증가) 또는 저해(또는 감소)시킨다.
특정의 실시예에서 본 발명은 PDE1B 활성을 조절하는 여기서는 DARPP-32의 34번째 쓰레오닌 및/또는 GluRl AMPA 수용체의 845번째 세린에서의 인산화가 조절되는 약제를 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병치료방법을 제공한다. 특정 실시예에서 약제는 PDE1B와 결합하여 PDElB의 활성을 조절한다.
한 실시예에서 그러한 치료가 필요한 대상은 DARPP-32, GluRl AMPA 수용체 및 PDElB 및/또는 도파민 D 1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는데 충분한 양의 본 발명의 화합물이 투여된다.
본 발명은 (a) 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계; (b) 테스트 화합물로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로내에서 PDElB 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 최조 및 두번째 레벨은 PDElB 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 특정의 실시예에 서 DARPP-32의 phospho-Thr34(이하에서, "phospho-Thr34") 또는 GluRl AMPA 수용체의 phospho-Ser845(이하에서 "phospho-Ser845")의 인산화는 조절된다.
다른 실시예에서 PDElB 활성의 차이는 DARPP-32 또는 GluRl AMPA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 다른 실시예에서 PDElB 활성의 차이는 ARPP-16, ARPP-19, ARPP-21, CREB, cAMP, cGMP, CKl, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B, PP-1, 칼슘 채널, Na/K ATPase 또는 NMDA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
본 발명은 또 (a) 세포 또는 조직의 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계; (b) 테스트 화합물로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 최조 및 두번째 레벨의 차이는 상기 경로의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
일 실시예에서 DARPP-32의 phospho-Thr34(이하에서, "phospho-Thr34") 또는 GluRl AMPA 수용체의 phospho-Ser845(이하에서 "phospho-Ser845")의 인산화는 조절된다.
본 발명은 또 (a) 테스트 화합물로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 PDElB 활성의 대조레벨의 차이는 상기 경로의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 일 실시예에서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 상기 대조군 레벨의 차이는 DARPP-32 또는 GluRl AMPA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 다른 실시예에서 PDElB 활성의 차이는 ARPP-16, ARPP-19, ARPP-21, CREB, cAMP, cGMP, CKl, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B, PP-1, 칼슘 채널, Na/K ATPase 또는 NMDA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 또 다른 실시예에서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 상기 대조군 레벨의 차이는 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
본 발명은 또 (a) 테스트 화합물로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 대조레벨의 차이는 상기 경로의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 일 실시예에서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 상기 대조군 레벨의 차이는 DARPP-32 또는 GluRl AMPA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 다른 실시예에서 PDElB 활성의 차이는 ARPP-16, ARPP-19, ARPP-21, CREB, cAMP, cGMP, CKl, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B, PP-1, 칼슘 채널, Na/K ATPase 또는 NMDA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 또 다른 실시예에서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 상기 대조군 레벨의 차이는 도파민 D1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다
본 발명은 또 (a) 유력(potential) 약제로 세포 또는 조직내에서 PDE1B 및Thr34-탈인산화된 DARPP-32에 접촉하는 단계; 및 (b) Thr34-탈인산화된 DARPP-32의 인산화의 양을 검출하는 단계를 포함하는 그런 치료가 필요한 환자에서 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력을 테스트하기 위한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 유력(potential) 약제 존재 하에서 Thr34-탈인산화된 DARPP-32의 인산화 증가가 검출되면 상기 약제을 동정하였다.일 실시예에서 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력이 테스트되었다.
본 발명은 또 (a) 유력(potential) 약제로 세포 또는 조직 PDE1B 및 Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체 내에서 접촉하는 단계; 및 (b) Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체의 인산화의 양을 검출하는 단계를 포함하는 그런 치료가 필요한 환자에서 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력을 테스트하기 위한 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 유력(potential) 약제 존재 하에서 Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체의 인산화 증가가 검출되면 상기 약제을 동정하였다. 일 실시예에서 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력이 테스트되었다.
본 발명은 또 (a) 세포 또는 조직내에서 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계; (b) 유력 약제로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 능력을 테스트하기 위한 약제를 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 최조 및 두번째레벨의 차이는 상기 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 유력 약제의 능력의 지표이다. 일 실시예에서 상기 방법은 (d) 상기 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로가 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 세포 또는 조직내에서 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계; (b) 유력 약제로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 능력을 테스트하기 위한 약제를 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 최조 및 두번째 레벨의 차이는 상기 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 유력 약제의 능력의 지표이다. 일 실시예에서 상기 방법은 (d) 상기 세포내 신호전달 경로가 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명은 또 (a) 유력 약제로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 대조레벨의 차이는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 일 실시예에서 상기 방법은 (c) 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성이 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명은 또 (a) 유력 약제로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 능력을 테스트하기 위한 약제를 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 대조레벨의 차이는 상기 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 일 실시예에서 상기 방법은 (d) 상기 세포내 신호전달 경로의 활성이 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계; (b)상기 유력 치료용 약제에 대한 상기 동물의 반응을 측정하는 단계; (c) 상기 동물의 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서 상기 동물은 마우스이다. 또 다른 실시에에서 상기 이상은 파킨슨병이다.
본 발명은 또한 (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계; (b) 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로와 상호작용하는 뉴로트랜스미터의 투여에 대한 상기 동물의 반응을 측정하는 단계; (c) 상기 동물의 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서 상기 동물은 마우스이다. 또 다른 실시에에서 상기 이상은 파킨슨병이다.
본 발명은 또한 (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계; (b) 도파민 투여에 대한 상기 동물의 반응을 측정하는 단계; (c) 상기 동물의 도파민 투여에 대한 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서 상기 동물은 마우스이다. 또 다른 실시에에서 상기 이상은 파킨슨병이다.
본 발명은 또한 (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계; (b) 상기 동물의 (i) 수평 운동 활성을 위한 테스트 기간 동안 탐구(exploratory) 행위의 표시(exhibition); (ii) 메타앰피타민 치료제의 투여 후에 과민활성의 표시; (iii) 모리스(Morris) 워터 미로(maze)의 포착(acquisition)에서 경로 길이; (iv) 상기 동물로부터 온 선조체(striatal) 슬라이스내의 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 레벨의 변화; 및 (v) 상기 동물로부터 온 핵 횡(accumbens) 슬라이스내의 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 레벨의 변화로 구성된 군으로부터 선택된 반응을 측정하는 단계; (c) 상기 동물의 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서 상기 동물은 마우스이다. 또 다른 실시에에서 상기 이상은 파킨슨병이다.
본 발명은 또한 본 발명의 검색방법에 의해 동정된 화합물을 테스트하는 동물 모델을 제공한다. 여기서 상기 화합물은 본 발명의 동물 모델을 사용한 기능적 용도용으로 테스트하였다. 한 바람직한 실시예에서 본 발명은 PDE1B-결핍, 예를 들어 널(null) 또는 "넉아웃" 마우스인 동물 모델을 제공한다. 일 실시예에서 본 발명은 그것의 내생적(endogenous) PDE1B 유전자내 동종접합성 파괴를 포함하는 트랜스제닉 넉아웃 마우스를 제공한다. 여기서 상기 파괴는 기능적 PDE1B 단백질의 발현을 저해하고, 야생형 PDE1B 유전자를 갖는 마우스에 관하여 넉아웃 마우스의 표현형은 cAMP 또는 cGMP 가수분해에 대해 분석할 때 PDE1B 효소활성의 결여를 포함한다. 일 실시예에서 그 파괴는 PDE1B 촉매 자리의 타겟된 파괴를 포함한다. 다른 실시예에서 야생형 PDE1B 유전자를 갖는 마우스에 관하여 넉아웃 마우스의 표현형은 수평 운동 활성을 위한 처음 30분의 테스트 기간 동안 더 현저한 탐구(exploratory) 행위의 표시(exhibition), 메타앰피타민 치료제의 투여 후 더현저한 과민활성의 표시, 모리스(Morris) 워터 미로(maze)의 포착(acquisition)에서 현저하게 더 긴 경로 길이의 표시, D1 수용체 작용제(agonist)의 투여에 대한 증가된 레벨의 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 상기 마우스로부터 온 선조체 슬라이스의 표시 및 (v) D1 수용체 작용제(agonist)의 투여에 대한 증가된 레벨의 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 상기 마우스로부터 온 핵 횡(accumbens) 슬라이스내의 표시로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 표현형을 더욱 포함한다.
정의
본 특허명세서에서 사용된 "조절하다(modulate)" 또는 "조절(modulation)"은 그것의 일반적인 의미를 갖고, "증가하다", "저해하다" 및 "모방하다(mimic)"의 단어들의 의미를 포함한다. 활성의 "조절"은 활성의 증가 또는 감소일 수 있다.
본 특허명세서 사용된 "작용제(agonist)"는 약리학적 효과를 생산하기 위하여 직접 또는 간접적으로 수용체를 통하거나 수용체상에 작용하는 화합물인 반면에 길항제(antagonist)는 수용체의 자극화를 막고 결과적인 약리학적 효과를 억제하는 화합물이다.
본 특허명세서 사용된 조절 화합물의 "유효량"은 본 발명에 기재된 것과 같은 분석 방법을 사용한 연구 데이터에 기초하여 당업자에 의해서 결정될 수 있는 양이다. 그러한 데이터는 이하에서 설명할 IC50 결정 결과를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 특허명세서 사용된 "DARPP-32"은 "도파민-및-사이클릭 AMP(cAMP)-조절 인단백질(PhosphoProtein)"로 서로 바꿔 쓸 수 있고, 신선조체(neostriatum)에서 중간 크기의 신경 뉴런에 선택적으로 풍부한 32 킬로 달톤의 원형질 단백질이다. 인간, 마우스, 레트 및 소 DARPP-32 아미노산 서열은 1999년 10월 15일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 번호 09/419,379("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling") 및 2000년 10월 13일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국특허출원 번호 09/687,959("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling")에 공지되어 있고, 레퍼런스에 의해 그들의 전체를 여기에 삽입하였다(서열목록 1-4 참조).
본 특허명세서 사용된 "Thr75 DARPP-32"는 유사 약어인 "Thr75 DARPP32", "thr75DARPP-32", "Theronine-75 DARPP-32" 및 "threonine-75 DARPP-32"로 서로 바꿔 쓸 수 있고, AAB30129.1의 GenBank Accession을 갖는 Brene 등(J. Neurosci.
14：985-998(1994))에 공지된 DARPP-32의 아미노산 서열에서 75번째 아미노산 잔기를 나타내고, Cdk5에 의해 인산화 될 수가 있고, 프로틴포스파테이즈 2 A(PP2A)에 의해 탈인산화되는 쓰레오닌 잔기이다.
본 특허명세서 사용된 "Thr75 DARPP-32"는 인간 DARPP-32의 아미노산 배열 내의 75번째의 아미노산잔기를 나타낸다.
별도로 명시하지 않는 한 그 단어는 또한 또다른 생물종(예를 들면 쥐, 소 등)에서 온 DARPP-32의 대응하는 아미노산 잔기까지 포함할 수가 있다. 이들 서열은 당업자에 주지되었고, 통상적인 방법을 사용하여 해당 아미노산 잔기를 동정할수 있다.
본 특허명세서 사용된 "인(phospho)-Thr75 DARPP-32" 또는 상기에서 언급한 유사 약어는 Thr75 DARPP-32의 인산화된 형태를 나타낸다.
본 특허명세서 사용된 "DARPP-32의 Cdk5 인산화될 수 있는 절편"은 탈인산화된 형태로 있을 때 Cdk5에 의해 인산화될 수 있고, 프로틴포스파테이즈 2 A(PP2A)에 의해 탈인산화될 수 있는 쓰레오닌 잔기를 포함하는 DARPP-32의 단백질 절편이다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간의 DARPP-32에서 쓰레오닌 잔기는 바람직하게는 Thr75 DARPP-32이다. 그런 절편은 약 5 에서 100 사이 잔기일 수 있고, 더욱 바람직하게는 약 lO 에서 50 사이 잔기일 수 있다. 예를 들어 특정의 실시예에서 그 펩타이드 절편은 Thr75를 포함하는 서열번호 1의 5개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시예에서 그 펩타이드 절편은 Thr75를 포함하는 서열번호 1의 7개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시예에서 그 펩타이드 절편은 Thr75를 포함하는 10에서 25개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 모든 그 펩타이드 절편은 융합 펩타이드 또는 단백질의 일부분일 수 있다. DARPP-32의 Cdk5 인산화될 수 있는 절편은 당업계의 통상적인 방법인 예를 들면 더 큰 Thr75-DARPP-32 단백질 절편 또는 전장 DARPP-32 단백질로부터 절단(예를 들면 프로테이즈로), 또는 그 인산화된 절편을 탈인산화하거나, 탈인산화된 절편을 절단(예를 들면 프로테이즈로)하여 제조될 수 있다. 따라서 그 절편들은 하기 서술하는 표준 단백질 합성 또는 재조합 DNA 기술 또는 전통적인 단백질분해 방법을 통해서 합성될 수 있다.
본 특허명세서 사용된 "Thr34 DARPP-32"는 유사 약어인 "Thr34 DARPP32", "thr34DARPP-32", "Theronine-34 DARPP-32" 및 "threonine-34 DARPP-32"로 서로 바꿔 쓸 수 있고, AAB30129.1의 GenBank Accession을 갖는 Brene 등(J. Neurosci.14：985-998(1994))에 공지된 DARPP-32의 아미노산 서열에서 34번째 아미노산 잔기를 나타내고, cAMP 의존 프로틴 키네이즈(PKA)에 의해 인산화 될 수가 있고, 프로틴포스파테이즈 2 B(PP2B)에 의해 탈인산화되는 쓰레오닌 잔기이다.
본 특허명세서 사용된 "Thr34 DARPP-32"는 인간 DARPP-32의 아미노산 배열 내의 34번째의 아미노산잔기를 나타낸다. 별도로 명시하지 않는 한 그 단어는 또한 또다른 생물종(예를 들면 쥐, 소 등)에서 온 DARPP-32의 대응하는 아미노산 잔기까지 포함할 수가 있다. 이들 서열은 당업자에 주지되었고, 통상적인 방법을 사용하여 해당 아미노산 잔기를 동정할 수 있다.
본 특허명세서 사용된 "인(phospho)-Thr34 DARPP-32" 또는 상기에서 언급한 유사 약어는 Thr34 DARPP-32의 인산화된 형태를 나타낸다.
본 특허명세서 사용된 "DARPP-32의 PKA 인산화될 수 있는 절편"은 탈인산화된 형태로 있을 때 PKA에 의해 인산화될 수 있는 한 쓰레오닌 잔기를 포함하는 DARPP-32의 단백질 절편이다.
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 인간의 DARPP-32에서 쓰레오닌 잔기는 바람직하게는 Thr34 DARPP-32이다. 그런 절편은 약 5 에서 100 사이 잔기일 수 있고, 더욱 바람직하게는 약 lO 에서 50 사이 잔기일 수 있다. 예를 들어 특정의 실시예에서 그 펩타이드 절편은 Thr34를 포함하는 서열번호 1의 5개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시예에서 그 펩타이드 절편은 Thr34를 포함하는 서열번호 1의 7개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시예에서 그 펩타이드 절편은 Thr34를 포함하는 10에서 25개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 모든 그 펩타이드 절편은 융합 펩타이드 또는 단백질의 일부분일 수 있다. DARPP-32의 PKA인산화될 수 있는 절편은 당업계의 통상적인 방법인 예를 들면 더 큰 Thr34-DARPP-32 단백질 절편 또는 전장 DARPP-32 단백질로부터 절단(예를 들면 프로테이즈로), 또는 그 인산화된 절편을 탈인산화하거나, 탈인산화된 절편을 절단(예를 들면 프로테이즈로)하여 제조될 수 있다. 따라서 그 절편들은 하기 서술하는 표준 단백질 합성 또는 재조합 DNA 기술 또는 전통적인 단백질분해 방법을 통해서 합성될 수 있다.
본 특허명세서 사용된 "Ser845 GluR1AMPA 수용체"는 유사 약어인 "Ser845 -GluR1AMPA 수용체", "ser845GluR1 AMPA 수용체", 및 "Ser-845 GluR1 AMPA 수용체"로 서로 바꿔 쓸 수 있고, NP _000818의 GenBank Accession 번호를 갖는 성숙(mature) GluR1 AMPA 수용체 단위체(즉 Puckett 등(1991, Molecular cloning and chromosomal localization of one of the human glutamate receptor genes, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(17),7557-7561)에 공지된 전단백질(preprotein) 서열의 ser 863)의 아미노산 서열에서 845번째 아미노산 잔기를 나타내고, PKA에의해 인산화 될 수가 있다.
본 특허명세서 사용된 "Ser845 GluR1AMPA 수용체"는 인간 성숙 GluR1 AMPA 수용체 단위체의 아미노산 배열 내의 845번째의 아미노산잔기를 나타낸다. 별도로 명시하지 않는 한 그 단어는 또한 또다른 생물종(예를 들면 쥐, 소 등)에서 온 DARPP-32의 대응하는 아미노산 잔기까지 포함할 수가 있다. 이들 서열은 당업자에 주지되었고, 통상적인 방법을 사용하여 해당 아미노산 잔기를 동정할 수 있다.
본 특허명세서 사용된 "인(phospho)-Ser845 GluR1 AMPA 수용체" 또는 상기에서 언급한 유사 약어는 Ser845 GluR1AMPA 수용체의 인산화된 형태를 나타낸다.
본 특허명세서 사용된 "Ser845 GluR1 AMPA 수용체의 PKA 인산화될 수 있는 절편"은 탈인산화된 형태로 있을 때 PKA에 의해 인산화될 수 있는 한 세린 잔기를 포함하는 GluR1 AMPA 수용체의 단백질 절편이다.
서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 인간의 GluR1 AMPA 수용체에서 세린 잔기는 바람직하게는 성숙 형태(전단백질(preprotein) 서열의 ser 863)의 GluR1 AMPA 수용체이다. 그런 절편은 약 5 에서 100 사이 잔기일 수 있고, 더욱 바람직하게는 약 lO 에서 50 사이 잔기일 수 있다. 예를 들어 특정의 실시예에서 그 펩타이드 절편은 Ser845를 포함하는 서열번호 7의 5개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시예에서 그 펩타이드 절편은 Ser845를 포함하는 서열번호 7의 7개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 또 다른 실시예에서 그 펩타이드 절편은 Ser845를 포함하는 10에서 25개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 모든 그 펩타이드 절편은 융합 펩타이드 또는 단백질의 일부분일 수 있다. GluR1 AMPA 수용체의 PKA 인산화될 수있는 절편은 당업계의 통상적인 방법인 예를 들면 더 큰 GluR1 AMPA 수용체 단백질 절편 또는 전장 GluR1 AMPA 수용체 단백질로부터 절단(예를 들면 프로테이즈로), 또는 그 인산화된 절편을 탈인산화하거나, 탈인산화된 절편을 절단(예를 들면 프로테이즈로)하여 제조될 수 있다. 따라서 그 절편들은 하기 서술하는 표준 단백질 합성 또는 재조합 DNA 기술 또는 전통적인 단백질분해 방법을 통해서 합성될 수 있다.
당업자에게 명백한 바와 같이, DARPP-32 및 GluRl AMPA를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 물질 분자의 인산화 및 탈인산화될 수 있는 다른 절편은 상기 기재된 통상적인 방법을 사용한 당업계에 주지된 방업에 따라 용이하게 제조될 수 있다.
상기에 기재한 바와 같이, DARPP-32 또는 DARPP-32 인산화될 수 있는 절편의 인산화 속도 및/또는 양이 당업계에서 표준 통계 방법에 의해 결정되어 통계학적으로 유효한 양의 증가 또는 감소된 때 본 특허명세서는 키네이즈 반응에서 DARPP-32 또는 DARPP-32 인산화될 수 있는 절편의 인산화의 속도 및/또는 양이 "상당히 변화"하였다고 한다. 또 다른 실시예에서 상당한 변화는 대조 반응에 비하여 적어도 약 10-25%이다. 바람직하게는 유력(potential) 조절자의 존재내에서 관찰되는 특정 분자(예를 들면 CK1 또는 Cdk5)에 의한 DARPP-32의 인산화의 속도의 상당한 변화는 반응의 미카엘리스 상수(예를 들면 최대 반응속도 또는 Km)과 상관관계가 있는 일부 지점이다. 예를 들면, 저해제의 경우, KI가 결정될 수가 있다. 따라서 일부 실시예에서, 조절자로 유력 조절자의 동정을 가능케하기 위해 반응 혼합물에서 여러 농도의 조절자를 연구하는 것이 바람직하다.
상기에 기재한 바와 같이, DARPP-32 또는 DARPP-32 탈인산화될 수 있는 절편의 탈인산화 속도 및/또는 양이 당업계에서 표준 통계 방법에 의해 결정되어 통계학적으로 유효한 양의 증가 또는 감소된 때 본 특허명세서는 포스페테이즈 반응에서 DARPP-32 또는 DARPP-32 탈인산화될 수 있는 절편의 탈인산화 속도 및/또는 양이 "상당히 변화"하였다고 한다. 또 다른 실시예에서 상당한 변화는 대조 반응에 비하여 적어도 약 10-25%이다. 바람직하게는 유력(potential) 조절자의 존재내에서 관찰되는 특정 분자(예를 들면 PP2C, PP2B 또는 PP2A)에 의한 DARPP-32의 탈인산화 속도의 상당한 변화는 반응의 미카엘리스 상수(예를 들면 최대 반응속도 또는 Km)과 상관관계가 있는 일부 지점이다. 예를 들면, 저해제의 경우, KI가 결정될 수가 있다. 따라서 일부 실시예에서, 조절자로 유력 조절자의 동정을 가능케하기 위해 반응 혼합물에서 여러 농도의 조절자를 연구하는 것이 바람직하다.
본 특허명세서 사용된 "PDE1B 관련된 질병"은 "phosphodiesteraselB 관련 질병", "PDE1B 질병" 또는 유사단어로 서로 바꾸어 사용될 수 있다. PDE1B 관련된 질병은 파킨슨 병, 헌팅톤 병, 주의력 결핍 장애(ADD), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 신경 변성 질병, 트렛트(Tourette) 증후군, 틱 장애, 렛슈(Lesch)- 니안스(Nyans) 질환, 통증, 긴장이상(dystonias), 물질 또는 의약품 남용, 정신분열증, 스키조에펙티브 질환, 우울증, 감정(affective) 질환, 조울병, 강박 신경장애, 섭식 장해, 구토, 패닉 장애, 염려증, 편두통, 간대성근경련, 월경전 증후군(PMS), 심리적 외상 후 스트레스 장해, 카르시노이드 증후군, 알츠하이머 병, 스트로크,간질, 휴면 또는 서커디안(circadian) 리듬 무질서(예를 들면 불면증), 성 병, 스트레스 병, 고혈압 및 암을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
PDE1B 관련된 질병은 또한 흥분 세포, 조직, 기관(예를 들면 뉴런, 뇌, 중추 신경계 등)에서 PDE1B에 의해 중재되는 신경전달을 포함하지만 이에 한정되지 않는 신호 전달 경로의 이상 또는 조절장애에 관련된 질병(예를 들면 파킨슨 병) 또는 조건(예를 들면 코카인에 대한 중독)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. PDE1B 관련 질병은 PDE1B 관련 질병의 증상을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서 영향을 받는 경로는 DARPP-32의 하나 이상의 특정 쓰레오닌 및/또는 세린 잔기의 인산화 및/또는 탈인산화의 촉진 및/또는 저해에 관련된 조절장애의 상응하는 치료를 수반하는 DARPP-32의 인산화 및/또는 탈인산화를 포함한다(예를 들면, Greengard 등, Neuron 23：435-447(1999);Bibb 등 Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 6809-6814(2000): 및 1999년 10월 15일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 번호 09/419,379("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling") 및 2000년 10월 13일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국특허출원 번호 09/687,959("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling")를 참조하고, 그것의 각각은 레퍼런스에 의해 그들의 전체를 여기에 삽입하였다.
다른 실시예에서 영향을 받는 경로는 GluR1 AMPA 수용체의 하나 이상의 특정 세린 잔기의 인산화 및/또는 탈인산화의 촉진 및/또는 저해에 관련된 조절장애의상응하는 치료를 수반하는 cAMP 의존 PKA에 의한 GluR1 AMPA 수용체의 인(phospho)-Ser845의 인산화를 포함한다(예를 들면, Kaneyama, K. 등, 1998.뉴런 21：1163-1175). 또 다른 실시예에서 영향을 받는 경로는 도파민 경로의 마지막 지점으로 AMPA 수용체의 GluR1 단위체를 포함한다. 또 다른 실시예에서 영향을 받는 경로는 당업자에게서 명백한 바와 같이 몇가지 타입의 칼슘 채널, Na/K ATPase, NMDA 수용체, CREB의 인산화를 포함하나 이에 한정되지 않는 도파민 작용성 세포내 신호 전달 경로의 생물학적 효과에 대한 다른 최종 지점을 포함한다.
본 특허명세서 사용된 "도파민 D 1 세포내 신호전달 경로"는 "D1 수용체 세포내 신호전달 경로", "도파민 D 1 세포내 신호전달 케스케이드", "도파민 D 1 신호전달 케스케이드", 또는 유사 단어로 사로 바꾸어 사용될 수 있다.
본 특허명세서 사용된 "도파민 D 1 세포내 신호전달 경로 이상"은 "D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상" 또는 유사 단어로 사로 바꾸어 사용될 수 있다. 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로 이상은 파킨슨 병, 헌팅톤 병, 주의력 결핍 장애(ADD), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 신경 변성 질병, 트렛트(Tourette) 증후군, 틱 장애, 렛슈(Lesch)- 니안스(Nyans) 질환, 통증, 긴장이상(dystonias), 물질 또는 의약품 남용, 정신분열증, 스키조에펙티브 질환, 우울증, 감정(affective) 질환, 조울병, 강박 신경장애, 섭식 장해, 구토, 패닉 장애, 염려증, 편두통, 간대성근경련, 월경전 증후군(PMS), 심리적 외상 후 스트레스 장해, 카르시노이드 증후군, 알츠하이머 병, 스트로크, 간질, 휴면 또는 서커디안(circadian) 리듬 무질서(예를 들면 불면증), 성 병, 스트레스 병, 고혈압및 암을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로 이상은 또한 흥분 세포, 조직, 기관(예를 들면 뉴런, 뇌, 중추 신경계 등)에서 도파민 D 1 수용체에 의해 중재되는 신경전달을 포함하지만 이에 한정되지 않는 신호 전달 경로의 이상 또는 조절장애에 관련된 질병(예를 들면 파킨슨 병) 또는 조건(예를 들면 코카인에 대한 중독)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로 이상은 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로 이상의 증상을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서 영향을 받는 경로는 DARPP-32의 하나 이상의 특정 쓰레오닌 및/또는 세린 잔기의 인산화 및/또는 탈인산화의 촉진 및/또는 저해에 관련된 조절장애의 상응하는 치료를 수반하는 DARPP-32의 인산화 및/또는 탈인산화를 포함한다(예를 들면, Greengard 등, Neuron 23：435-447(1999);Bibb 등 Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 6809-6814(2000): 및 1999년 10월 15일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 번호 09/419,379("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling") 및 2000년 10월 13일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국특허출원 번호 09/687,959("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling")를 참조하고, 그것의 각각은 레퍼런스에 의해 그들의 전체를 여기에 삽입하였다.
다른 실시예에서 영향을 받는 경로는 GluR1 AMPA 수용체의 하나 이상의 특정 세린 잔기의 인산화 및/또는 탈인산화의 촉진 및/또는 저해에 관련된 조절장애의상응하는 치료를 수반하는 cAMP 의존 PKA에 의한 GluR1 AMPA 수용체의 인(phospho)-Ser845의 인산화를 포함한다(예를 들면, Kaneyama, K. 등, 1998.뉴런 21：1163-1175).
본 특허명세서 사용된 "작은 유기 분자"는 3 킬로 달톤 이하의 분자량, 바람직하게는 1.5 킬로 달톤 이하의 분자량을 갖는 유기 화합물(또는 무기 화합물(예를 들어 금속)과 복합체를 형성하는 유기 화합물)이다. 작은 유기 분자는 혈관­뇌 장벽을 통과할 수 있는 것이 바람직하다.
본 특허명세서 사용된 "약(about)"은 10에서 15% 내, 바람직하게는 5에서 10% 범위내인 것을 의미한다. 예를 들면 약 60 아미노산 잔기는 51에서 69 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 57에서 63 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 포스포다이에스테레이즈(PDE) 활성, 특히 포스포다이에스테레이즈 1 B(PDE1B) 활성이 뇌에서 운동활성, 학습 및 기억의 조절자로 작용한다는 발명자들에게 있어서 놀라운 발견에 기초한다. 본 발명에 의하면, PDE1B은 도파민 D 1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 바람직하게는 신경계에서 세포내 신호전달 경로의 조절을 위한 치료적인 표적으로 사용될 수가 있다.
바람직한 실시예에서, 포스포다이에스테레이즈 1B는 예를 들어 PDE1B 관련 질병 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료를 위한 치료적인 표적으로서 사용될 수가 있다.특정의 실시예에서 PDE1B는 파킨슨병의 치료를 위한 치료적인 표적으로서 사용될 수가 있다.
도파민(DA)의 자체의 활성화 및 도파민 작용성 신경 전달을 촉진하는 약제는 세포 표면 수용체에 작용한다. 본 발명의 측면에서, 어떠한 특정의 이론에도 속박 되는 것을 바라지 않고, 도파민 Dl 수용체가 도파민 Dl 수용체 세포내 신호전달 경로를 통한 DARPP-32의 인산화를 중재한다. 본 발명에 따르면 도파민 Dl 수용체 활성화는 아데니릴 사이클레이즈 활성화(및 증가된 cAMP)를 이끈다. cAMP는 프로틴 키네이즈 A(PKA;cAMP-의존 프로 틴키네이즈)를 활성화하고, 그것은 DARPP-32(도파민 및 cAMP-조절되는 phosphoprotein-32), ARPP-16(DARPP-16), ARPP-19(DARPP-19), ARPP-21(DARPP-21), cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB), AMPA 수용체(예를 들면 GluR1 AMPA 수용체), cAMP, cGMP, CK1, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B 및 PP1을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로내의 다운 스트림 성분을 인산화(또는 이들 성분의 인산화를 조절)한다. 이들 세포내 신호전달 경로들은 cAMP를 그것의 5'-모노포스페이트로 가수분해하는 PDE1B를 포함하나 이에 한정되지 않는 포스포다이에스터레이즈(PDEs)에 의해 다운-레귤레이트되거나 길항된다.
본 발명의 다른 관점에서, 도파민 D2 수용체 활성화는 아데니릴 사이크레이즈 저해(그리고, 감소된 cAMP)를 야기한다. cGMP의 세포내 농도 또한 D2 수용체 활성화 후에 불변 또는 저해된다. cGMP는 프로틴 키네이즈 G(PKG;cGMP-의존 프로 틴키네이즈)를 활성화하고, 그것은 DARPP-32(도파민 및 cAMP-조절되는 phosphoprotein-32), ARPP-16(DARPP-16), ARPP-19(DARPP-19), ARPP-21(DARPP-21), cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB), AMPA 수용체(예를 들면 GluR1 AMPA 수용체), cAMP, cGMP, CK1, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B 및 PP1을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로내의 다운 스트림 성분을 인산화한다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 칼슘 조절된 PDE1B는 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 도파민 조절된 세포내 신호전달 경로 및 또 다른 세포내 신호전달 경로 사이에 활성을 조절하는 인터페이스이다. 본 발명의 또 다른 관점에서, PDE1B는 DARPP-32의 인산화를 중재하는 다른 cAMP- 또는 cGMP-커플 입력(A2a, D2, 오피에이트, 일산화 질소, 글루타메이트 등)으로부터 온 신호전달을 조절한다.
게다가 일부 관점에서, PDE1B는 AMPA 수용체, 칼슘 채널, Na/K ATPase, NMDA 수용체 및 CREB을 포함하나 이에 한정되지 않는 최종 지점 단백질의 PKA 및 PKG에 의한 직접 인산화를 조절하여 cAMP- 또는 cGMP- 커플 입력(A2a, D2, 오피에이트, 일산화 질소, 글루타메이트 등) 뿐 아니라 Dl 수용체에서온 DARPP-32-독립적인 신호전달을 조절한다. 따라서 본 발명에 의하면, PDE1B 중재되는 사이클린 뉴크레오타이드 가수분해의 불활성화에 의한 cAMP 신호전달의 증가는 DARPP-32 및 이들 관련된 세포 내 신호전달 경로의 활성 조절을 통한 도파민작용성 기능에서 중요한 역할을 한다. 따라서 본 발명에 의하면 PDE1B 활성의 조절은 또한 이들 상호 관련된 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절할 수 있다.
본 발명을 명료하게 하기 위해 비한정적인 본 발명의 상세한 설명을 이하 세부적으로 나누어 기재한다.
PDE1B 활성의 조절 방법
본 발명은 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하기 위해 충분한 양의 화합물로 세포 또는 조직에 접촉(contact)하는 것을 포함하는 세포 또는 조직에서 PDE1B 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 여기서 상기 화합물로 상기 세포 또는 조직의 접촉은 PDE1B 활성의 조절을 야기한다.
특정의 실시예에서 상기 화합물은 PDE1B와 결합하여 PDE1B의 활성을 조절한다. 결합은 당업계에서 주지된 방법에 따라 표준 공지 생리학적 조건에서 측정할 수 있다.
다른 실시예에서 DARPP-32의 phospho-Thr34 또는 GluRl AMPA 수용체의 phospho-Ser845의 인산화는 PDE1B의 조절을 통하여 조절된다.
또 다른 실시예에서 칼슘 채널, Na/K ATPase, NMDA 수용체 및 CREB을 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로의 다운 스트림 엘리먼트의 인산화는 PDE1B의 조절을 통하여 조절된다.
또한 본 발명은 도파민 D 1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는데 충분한 양의 화합물을 (예를 들면 인간, 환자 또는 동물)에게 투여하는 것을 포함하는 DARPP-32(도파민 및 cAMP-조절되는 phosphoprotein-32), ARPP-16(DARPP-16), ARPP-19(DARPP-19), ARPP-21(DARPP-21), cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB), AMPA 수용체(예를 들면 GluR1 AMPA 수용체), cAMP, cGMP, CK1, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B 및 PP1,칼슘 채널, Na/K ATPase, NMDA 수용체 를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 분자의 활성 조절하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서 화합물은 본 발명의 방법에 의해 동정되고, 여기서 그 화합물은 PDE1B 활성을 조절하고, 여기서 PDE1B 활성의 조절은 세포 또는 조직에서 상기 세포내 신호전달 분자 활성의 조절을 야기한다. 특정 실시예에서 상기 화합물은 PDE1B와 결합하여 PDE1B의 활성을 조절한다. 또 다른 특정 실시예에서 상기 화합물은 PDE1B의 발현을 조절한다. 일 실시예에서 세포내 신호전달 분자는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 다운스트림이다.
특정 실시예에서, 세포내 신호전달 분자는 흥분 세포(예를 들어 뉴런)이다.
본 발명의 특정 실시예에서, PDE1B 활성은 증가된다. 다른 특정 실시예에서 PDE1B 활성은 감소된다. 일 실시예에서, PDE1B 활성은 PDE1B 발현을 포함한다. 발현(예를 들어 유전자 발현, 단백질의 발현)은 당업계에서 주지된 방법에 따라 표준공지 생리학적 조건에서 측정할 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 PDE1B 활성을 조절하는데 충분한 양의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 세포 및 조직 내 DARPP-32(도파민 및 cAMP-조절되는 phosphoprotein-32), ARPP-16(DARPP-16), ARPP-19(DARPP-19), ARPP-21(DARPP-21), cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB), AMPA 수용체(예를 들면 GluR1 AMPA 수용체), cAMP, cGMP, CK1, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B 및 PP1,칼슘 채널, Na/K ATPase, NMDA 수용체 를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 분자의 인산화 의존 활성화를 조절하는 방법을 제공한다, 여기서 PDE1B의 활성의 조절은 상기 세포 또는 상기 조직 내 상기 분자의 인산화 의존 활성화의 변화를 야기한다.
본 발명에서 세포 또는 조직은 흥분 세포(예를 들면 감각성 뉴런, 운동뉴런(motorneuron) 또는 중간뉴런(interneuron);신경교 세포(glial cell); 일차 배양 세포(예를 들면 뉴런 세포 또는 신경교 세포의 일차 배양); 뉴런 또는 신경교 세포주에서 온 세포(들); 분리된 세포(들), 전체 세포(들) 또는 자연 세포(들); 투과된(permeabilized) 세포(들); 깨진 세포 조제물; 분리 및/또는 정제된 세포 조제물; 세포 추출물 또는 정제된 효소 조제물; 조직 또는 기관(예를 들면 뇌, 뇌 구조, 뇌 절편, 척수, 척수 절편, 중추 신경계, 말초신경계 또는 신경); 조직 절편 및 한 전체 동물를 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에서 뇌 구조는 선조체(striatum), 기저 신경절(basal ganglia), 측좌핵(nucleus accumbens) 또는 다른 포유류의 그러한 해부학적 및/또는 기능적 균등물(counterpart)이다.
일 실시예에서 in vitro에서 대상의 세포 또는 조직에서 PDE1B 활성을 조절하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시예에서 대상의 세포 또는 조직에서 PDE1B 활성은 in situ 또는 in vivo에서 조절된다. in vitro, in situ 및 in vivo 적용은 상기에 기재된 어느 세포 또는 조직내의 활성을 조절하는 것을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
5.2PDE1B 활성을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법
본 발명은 세포 또는 조직에서 PDE1B 활성을 조절하는 약제, 약, 또는 화합물을 동정하는 in vivo, in situ 및 in vitro 방법을 제공한다. 하나의 측면에서 그 방법은 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병을 치료하는 활성을 테스트될 약제를 동정하는 것을 포함한다. 그러한 방법은 단독으로 또는 서로 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 (a) 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계; (b) 테스트 화합물로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 최조 및 두번째 레벨은 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
본 발명의 관점에서, 본 발명의 방법에 따라 결정된 PDElB 활성의 차이는 도파민 D 1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로의 인산화-의존 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
본 발명의 또 다른 관점에서, PDElB 활성의 차이는 DARPP-32(도파민 및 cAMP-조절되는 phosphoprotein-32), ARPP-16(DARPP-16), ARPP-19(DARPP-19), ARPP-21(DARPP-21), cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB), AMPA 수용체(예를 들면 GluR1 AMPA 수용체), cAMP, cGMP, CK1, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B 및 PP1,칼슘 채널, Na/K ATPase, NMDA 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 분자의 인산화 의존 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 (a) 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계; (b) 테스트 화합물로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로내에서 PDElB 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 최조 및 두번째 레벨은 PDElB 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
일 실시예에서, PDElB 활성의 차이는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 또 다른 실시예에서PDElB 활성의 차이는 DARPP-32(도파민 및 cAMP-조절되는 phosphoprotein-32), ARPP-16(DARPP-16), ARPP-19(DARPP-19), ARPP-21(DARPP-21), cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB), AMPA 수용체(예를 들면 GluR1 AMPA 수용체), cAMP, cGMP, CK1, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B 및 PP1,칼슘 채널, Na/K ATPase, NMDA 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 분자의 인산화 의존 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
본 발명에서 대조 레벨은 테스트 화합물과 접촉되지 않은 비교 세포 또는 조직에서 측정된 분리된 베이스라인 레벨 또는 테스트 화합물로 세포 또는 조직을 접촉하기 전에 세포 또는 조직내에서 측정된 레벨을 의미한다.
본 발명은 또 (a) 테스트 화합물로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 PDElB 활성의 대조레벨의 차이는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 일 실시예에서 PDElB 활성의 조절은 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 조절을 조절한다. 또 다른 실시예에서, PDElB 활성의 차이는 DARPP-32(도파민 및 cAMP-조절되는 phosphoprotein-32), ARPP-16(DARPP-16), ARPP-19(DARPP-19), ARPP-21(DARPP-21), cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB), AMPA 수용체(예를 들면 GluR1 AMPA 수용체), cAMP, cGMP, CK1, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B 및 PP1,칼슘 채널, Na/KATPase, NMDA 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 분자의 인산화 의존 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
본 발명은 또 (a) 테스트 화합물로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 내의 PDElB 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 PDElB 활성의 대조레벨의 차이는 PDElB 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 일 실시예에서 PDElB 활성의 조절은 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 조절을 조절한다. 또 다른 실시예에서, 활성의 차이는 DARPP-32(도파민 및 cAMP-조절되는 phosphoprotein-32), ARPP-16(DARPP-16), ARPP-19(DARPP-19), ARPP-21(DARPP-21), cAMP 반응 요소 결합 단백질(CREB), AMPA 수용체(예를 들면 GluR1 AMPA 수용체), cAMP, cGMP, CK1, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B 및 PP1,칼슘 채널, Na/K ATPase, NMDA 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 분자의 인산화 의존 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
본 발명은 또한 (a) PDE1B 및 Thr34-탈인산화된 DARPP-32로 유력(potential) 약제를 접촉하는 단계; 및 (b) Thr34-탈인산화된 DARPP-32의 인산화의 양을 검출하는 단계를 포함하는 그런 치료가 필요한 환자에서 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함아나 이에 한정되지 않는 이상을 치료하는 능력이 테스트되어지는 약제를 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 유력(potential)약제 존재 하에서 Thr34-탈인산화된 DARPP-32의 인산화 증가가 검출되면 상기 약제를 동정되었다. 일 실시예에서 PDE1B 및 Thr34-탈인산화된 DARPP-32은 세포 또는 조직 내이다. 다른 실시예에서 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력이 테스트되었다.
본 발명은 또 (a) PDE1B 및 Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체로 유력(potential) 약제를 접촉하는 단계; 및 (b) Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체의 인산화의 양을 검출하는 단계를 포함하는 그런 치료가 필요한 환자에서 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않은 이상을 치료하는 능력이 테스트되어지는 화합물을 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 유력(potential) 약제 존재 하에서 Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체의 인산화 증가가 검출되면 상기 약제를 동정되었다.
일 실시예에서 PDE1B 또는 Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체는 세포 또는 조직 내이다. 다른 실시예에서 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력이 테스트되었다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 (a) 세포 또는 조직 내의 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계; (b) 유력 약제로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (c) 상기 세포 또는 조직 내에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 능력이 테스트될 약제를 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 최조 및 두번째 레벨의 차이는 세포내 신호 전달 경로의 활성을 조절하는 상기 유력 약제의 능력의 지표이다.
일 실시예에서, 상기 방법은 (d) 상기 세포내 신호전달 경로가 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함한다.
특정 실시예에서 세포내 신호전달 경로는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 (a) 유력 약제로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 능력이 테스트될 약제를 동정하는 방법을 제공한다. 여기서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 대조레벨의 차이는 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다. 일 실시예에서 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로는 PDE1B에 의해 조절된다. 일 실시예에서 상기 방법은 (c) 상기 세포내 신호전달 경로가 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함한다. 특정 실시에에서 상기 세포내 신호전달 경로는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로이다.
당업계의 당업자에서 분명히 이해되는 것 처럼, 본 명세서에 기재된 합리적인 의약 디자인을 포함하는 그런 과정을 포함하는 PDElB 활성을 조절할 수 있는 약제, 약 또는 화합물을 동정하는 여기에 기재된 일 실시예 및/또는 모든 실시예는 부가적인 의액 스크리닝 및 분석을 형성하기 위해 결합될 수 있고, 그 모든 것은 본 발명에 의해 예상되어진다.
PDElB는 cAMP의 레벨을 조절하는데 중요한 역할을 하고, cAMP-PKA 경로는 뇌에서 많은 다른 신호전달 경로와 상호작용을 하기 때문에, PDE1B 조절은 파킨슨 병, 헌팅톤 병, 주의력 결핍 장애(ADD), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 신경 변성 질병, 트렛트(Tourette) 증후군, 틱 장애, 렛슈(Lesch)- 니안스(Nyans) 질환, 통증, 긴장이상(dystonias), 물질 또는 의약품 남용, 정신분열증, 스키조에펙티브 질환, 우울증, 감정(affective) 질환, 조울병, 강박 신경장애, 섭식 장해, 구토, 패닉 장애, 염려증, 편두통, 간대성근경련, 월경전 증후군(PMS), 심리적 외상 후 스트레스 장해, 카르시노이드 증후군, 알츠하이머 병, 스트로크, 간질, 휴면 또는 서커디안(circadian) 리듬 무질서(예를 들면 불면증), 성 병, 스트레스 병, 고혈압 및 암을 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는 질병의 치료 및/또는 그 증상을 완화할 것이다.
본 발명의 방법에서, DARPP-32의 인산화 패턴 및/또는 레벨 및/또는 GluR1 AMPA 수용체 인산화 패턴 및/또는 레벨은 테스트 화합물로 세포 또는 조직의 처리 전 후 모두에서 결정될 수 있다.
당업자는 본 발명에서 예를 들어 일단 어느 화합물이 알려진 완화제 화합물과 유사한 DARPP-32의 인산화 패턴 및/또는 레벨 및/또는 GluR1 AMPA 수용체 인산화 패턴 및/또는 레벨의 변화를 만들 수 있는 것으로 판명되면, 그 화합물을 도파민 작용성 시스템이 관련된 다른 이상 뿐 아니라 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내신호전달 경로 이상을 치료하는데 사용될 수 있다. 그러한 이상은 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 내용 중에서, 그 동정된 그 화합물은 본 특허명세서에 기재된 것과 같은 연구로부터 온 데이터에 기초하여 당업자에 의해 결정될 수 있는 유효량 또는 용량으로 투여될 수 있다. 그러한 데이터는 IC50 결정 결과를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 PDE1B의 활성 조절을 통한 도파민 D1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절할 수 있는 약제를 동정하는 in vivo 방법을 제공한다. 그러한 방법은 단독으로 본 명세서에 기재된 것과 같은 in vitro 및 in situ 방법과 결합하여 사용될 수 있다.
그러한 in vivo 방법은 인간을 제외한 포유류에 약제를 투여하는 것을 포함한다. 다음 PDE1B 활성화의 양(및/또는 속도)는 결정될 수 있다. 약제는 약제가 존재하지 않은 경우에 비하여 약제의 존재시에 PDE1B 활성화의 양(및/또는 속도)가 증가 또는 감소된 때, 도파민 D1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절할 수 있는 것으로 동정된다. 바람직한 실시예에서, 인간을 제외한 포유류는 설치류이고, 더욱 바람직한 실시예에서, 그 설치류는 야생형 마우스이다. 다른 실시예에서, 인간을 제외한 포유류는 질병 또는 이상용 동물 모델이다. 그러한 동물 모델은 본 발명의 명세서에 기재되었다.
또 다른 실시예에서, 실험 동물은 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 이상에 대한 유력 약제의 효과를 확인하는데 사용된다. 다음에 그런 이상을 완화하는 유력 조절자 선택될 수 있다.
예를 들어, 일 실시예에서 동물의 운동 또는 학습 행동 반응은 약제의 존재 및 부존재에서 결정될 수 있다. 특정 실시예에서, 동물(예를 들어 마우스)의 운동 활성은 실시예에 기재된 활성 모니터에서 특정될 수 있다. 특정 실시예에서, 예를 들어 수평 운동 활성 동안 탐구 행동에 대한 실험, 에타엠파타민 처리의 투여 후에 운동 활성 테스트 또는 모리스 워터 미로와 같은 행동 테스트를 실시예에 기재한 바와 같이 사용할 수 있다.
동물 또는 동물 모델에서 잠재적인 치료약(예를 들어 후보 의약품, 유력 조절자 등)을 시험하는 방법은 당업계에 주지되었다.
따라서 잠재적인 치료약은 모든 동물을 치료하기 위해 사용할 수가 있다. 잠재적인 조절자는 원하는 용도에 따라 국소적, 구강, 피하 또는 복막내(예를 들어 복강내)를 포함하는 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 최적의 용량은 경험적으로 정의 될 것이다. 동물을 예를 들어 포커스된 마이크로파 광선 조사에 의해 희생될 수가 있다.
PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 이상의 병리학적 증상을 완화하는 이들 화합물의 잠재적인 효능은 질병용 동물 모델에서 평가될 수가 있다.
예를 들면, 헌팅톤 질병 유전자의 인간 질병 유발 형태의 이소성(ectopical) 적으로 발현하는 동물은 HD 환자의 증상과 유사한 신경병리학적인 증상을 보인다. 그러한 하기에서 기술하는 바와 같이, 이런 모델들은 어떠한 잠재적인 치료약의 효능을 평가하기 위해서 이용할 수가 있다. 통상적으로, 잠재적인 조절자없는 투여 전달수단(vehicle)이 투여되는 대조군이 하나의 군인 적어도 두개의 군의 동물들이 분석에 사용된다.
일 실시예에서, 본 발명은 (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계; (b)상기 유력 치료용 약제에 대한 상기 동물의 반응을 측정하는 단계; (c) 상기 동물의 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서 상기 동물은 마우스이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계; (b) 세포내 신호전달 경로와 상호작용하는 뉴로트랜스미터의 투여에 대한 상기 동물의 반응을 측정하는 단계; (c) 상기 동물의 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 동물 및 상기 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서 상기 동물은 마우스이다. 또 다른 실시예에서, 세포내 신호전달 경로는 도파민 D1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로이다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계; (b) 도파민 투여에 대한 상기 동물의 반응을 측정하는 단계; (c) 상기 동물의 도파민 투여에 대한 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서 상기 동물은 마우스이다.
본 발명은 또한 (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계; (b) 상기 동물의 (i) 수평 운동 활성을 위한 테스트 기간 동안 탐구(exploratory) 행위의 표시(exhibition); (ii) 메타앰피타민 치료제의 투여 후에 과잉행동성의 표시; (iii) 모리스(Morris) 워터 미로(maze)의 포착(acquisition)에서 경로 길이; (iv) 상기동물로부터 온 선조체(striatal) 슬라이스내의 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 레벨의 변화; 및 (v) 상기 동물로부터 온 핵 횡(accumbens) 슬라이스내의 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 레벨의 변화로 구성된 군으로부터 선택된 반응을 측정하는 단계; (c) 상기 동물의 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및 (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다. 바람직한 실시예에서 상기 동물은 마우스이다.
본 발명의 또 다른 관점은 추측되는 치료약물을 동물 모델에 투여하는 단계 및 상기 이상에 관련된 것으로 믿어지는 동물 모델의 어느 표현형 특징에 대한 추정되는 치료약의 효능을 측정 및/또는 결정하는 것을 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다.
잠재적 치료 약제는 테스트 반응 및 정상(예를 들어 투약 당하지 않은 또는 야생형) 반응 사이의 통계학적 유의성이 있는지에 기초하여 선택된다. 잠재적 치료 약제는 측정된/결정된 특징의 통계학적으로 유의성이 있는 변화를 보이는 것을 선택한다. 바람직한 실시예에서, 치료 약제의 존재 하에서 야생형 동물의 반응은 약제가 투여되지 않은 야생형 동물의 반응과 특징직으로 다르다.
본 발명의 또 다른 관점은 추측되는 치료약물을 하나의 질병용 동물 모델에 투여하는 단계 및 상기 이상에 관련된 것으로 믿어지는 상기에 기재된 어느 표현형특징에 대한 추정되는 치료약의 효능을 측정 및/또는 결정하는 것을 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법을 제공한다.
다른 실시예에서, 그 약제는 D1 수용체 작용제와 함께 투여된다. 다음 PDE1B 활성의 조절의 양(및/또는 속도)는 결정된다. 약제 부존재시에 예를 들어 D1 수용체 작용제의 투여는 PDE1B, DARPP-32 및 GluR1 AMPA 수용체 활성의 증가를 야기해야 하므로, 약제는 그 약제의 부존재에 비하여 약제의 존재시에 활성화의 양(및/또는 속도)가 상당히 증가 또는 감소된 때, PDE1B의 활성을 조절할 수 있는 것으로 동정된다.
다른 실시예에서, 그 약제는 D1 수용체 길항제와 함께 투여된다. 다음 PDE1B 활성의 조절의 양(및/또는 속도)는 결정된다. 약제 부존재시에 D1 수용체 길항제의 투여는 PDE1B, DARPP-32 및 GluR1 AMPA 수용체 활성의 감소를 야기해야 하므로, 약제는 그 약제의 부존재에 비하여 약제의 존재시에 활성화의 양(및/또는 속도)가 상당히 증가 또는 감소된 때, PDE1B의 활성을 조절할 수 있는 것으로 동정된다.
일 실시예에서, 다른 구조 골격(예를 들어 퓨린) 뿐 아니라 관계가 없는 자연 발생적인 화합물에 기초하 화학적 화합물의 결합 라이브러리는 의약 후보로 테스트될 수 있다. 이 형태의 바람직한 실시예에서 분석은 본 명세서에 기재된 자동 로봇 기술을 갖는 고속 작업처리량(throughput) 기술을 사용하여 수행하였다. 양성 결과("hit")는 대조군 반응(의약 후보군이 분석에 포함되지 않은)에 비교하여 PDE1B의 감소되거나 증가된 활성을 나타낸다.
일단 의약 후보군이 선택되면, 그 의약 후보군의 구조적 변이체들을 테스트할 수 있다. 이들 화합물들은 또한 막 투과성, 효과 특이성, 독성과 같은 파라미터로 세밀히 조사하고 변형할 수 있다. 다음 그 선택된 화합물이 PDE1B 활성을 변화 및/또는 최소의 부작용을 갖는 예측되는 행동 변화를 유도하는지를 결정하기 위해 이 이차 스크리닝의 선택된 화합물(예를 들어 가장 강력한)은 in situ 및 동물 모델에서 평가될 수 있다. 그러한 행동 이상은 본 명세서(또 예를 들어 Kosten 등, J.Pharmacol., Exp. Ther. 269:137-144(1994); 1999년 10월 15일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 번호 09/419,379 "Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling"; 2000년 10월 13일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국특허출원 번호 09/687,959 "Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling" 참조, 각각은 그것의 전체에 레퍼런스에 의해 여기에 삽입됨)에 기재된 바와 같이, 테스팅 운동 활성, 또는 학습 및 기억 및/또는 선택된 약의 자기 투여 또는 펄스전(prepulse) 저해(예를 들어 1998년 7월 7일 특허된 미국 특허 제 5,777,195호 참조, 그것의 전체에 레퍼런스에 의해 여기에 삽입됨)를 포함할 수가 있으나 여기에 한정되는 것은 아니다. 특정 실시예에서 당업계에서 통상적으로 알려진 항 우울제 효능 테스트 방법(예를 들어 설치류 꼬리-현탁 테스트)을 사용하였다.
이들 테스트는 다음 임상 실험에서 인간 실험를 수반할 수 있다. 대안적으로 일부 실시예에서 임상 실험에서 인간 실험은 동물 실험없이 수행될 수 있다. PDE1B이외에 타겟에 영향을 미치는 화합물도 하기에서 예를 든 대안적인 타겟을 사용하여 유사하게 스크리닝할 수 있다.
대안적으로, PDE1B 활성의 조절자(예를 들어 활성제 또는 저해제)는 스크리닝(예를 들어 재조합 박테리오파아지에 의해 생성된 랜덤 펩타이드 라이브러리(예를 들면, 스콧 및 스미스, Science 249：386-390(1990); Cwirla 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87：6378-6382(1990); Devlin 등. Science 249：404-406(1990)) 및 케미컬 라이브러리)에 의해 얻을 수 있다.
"파아지 방법"을 사용하여 매우 큰 라이브러리는 만들어 질 수가 있다(106-108).
제2의 방법은 화학 방법을 사용하는 것 있을 수가 있다. 그것은 Geysen 방법(Geysen 등, Molecular Immunology 23：709-715(1986);Geysen 등, J. Immunologic Method 102：259-274(1987)) 및 Fodor 등의 방법(Science 251：767-773(1991)이 예들이다. Furka 등(14th international Congress of Biochemistry, 제5권, Abstract FR:013(1988); Furka, Int.J. Peptide Protein Res.37:487-493 (1991)), Houghton(미국 특허 제 4,631,211호, 1986년 12월 특허) 및 Rutter 등(미국 특허 제 5,010,175호, 1991년 4월 23일 특허)는 펩타이드 혼합물을 제조하는 방법을 개시한다.
그러한 펩타이드는 PDE1B 활성의 유력 조절자로 테스트될 수 있다.
또 다른 관점에서 합성 라이브러리(Needels 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10700-4(1993);Ohlmeyer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：10922-10926(1993); Lam 등, 국제 특허 공개 번호 WO 92/00252; Kocis 등, 국제 특허 공개 번호 WO 94/28028, 그것의 전체에 레퍼런스에 의해 여기에 삽입됨) 및 그와 같은 것은 본 발명에서 PDElB 활성화의 조절자에 대한 스크리닝에 사용될 수 있다. 일단 잠재적인 조절자가 동정되면, 화학적 유사물은 시판되고 있는 케미컬 라이브러리(예를 들어 Chembridge사, 샌디에고, CA 또는 Evotec OAI, Abingdon, 영국)로부터 선택되거나 대안적으로 새로 합성될 수 있다. 그 장래 약제(약)은 PDE1B 활성화의 활성에 대한 그것을 효과를 테스트하는 표준 방법에 둘 수 있다. 다음 PDE1B 활성화의 활성을 조절하는 약이 선택되었다.
한 특정한 방법에서, 타겟(예를 들어 PDE1B)은 고체상에 부착될 수 있다. 고체상에 그러한 타겟을 둘 수 있는 방법은 당업계에 주지되었고, 타겟에 바이오틴을 결합 및 고체상에 아비딘을 결합하는 것과 같은 것을 포함한다. 고체상은 반응하지 않은 것들을 제거하기 위해 세척할 수 있다. 표지된 잠재적인 조절자(예를 들어, 저해제)의 용액은 고체상과 접촉될 수 있다. 고체상에 남아 있는 표지된 잠재적인 조절자의 양은 및 그것에 의해 타겟에 결합된 양은 결정될 수 있다. 대안적으로 또는 이외에도 예를 들어 표지된 잠재적인 조절자 및 그 타겟은 결정될 수 잇다. 그 타겟 또는 그 잠재적인 조절자에 대한 적당한 표지가 여기에 개시되어 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 잠재적인 조절자는 독자적 또는 이어서 일어나는 PKA에 의한 Thr34 DARPP-32의 인산화 또는 PP2B에 의한 그것의 탈인산화, 또는 PKA에 의한 Ser845-GluRl AMPA 수용체의 인산화 또는 Ser845-GluRl AMPA 수용체의 탈인산화를 조절하는 능력이 분석될 수 있다. 본 명세서에 결합 분석이 기재되어있다. 그러한 하나의 실시예에서, Thr34 DARPP-32 또는 그 Thr34 잔기를 포함하는 그것의 절편의 인산화 또는 탈인산화의 양 및/또는 속도를 결정한다. 또 다른 실시예에서 Ser845-GluRl AMPA 수용체 또는 그 Ser845 잔기를 포함하는 그것의 절편의 인산화 또는 탈인산화의 양 및/또는 속도를 결정한다. 그러한 방법은 당업게에 공지되어 있고, 일 실시예에서, 1999년 10월 15일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 번호 09/419,379 "Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling" 및 2000년 10월 13일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국특허출원 번호 09/687,959 "Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling"(그것의 각각은 그것의 전체에 레퍼런스에 의해 여기에 삽입됨) 또는 Yan 등(1999, Nature Neurosci.3:13-17)에 개시된 방법이 사용되었다. 다른 실시예에서, Yan 등(1999, Nature Neurosci.3:13-17)의 방법은 AMPA 수용체 활성을 분석하는데 사용될 수 있다. 따라서 본 발명의 방법에서 세포내 신호전달 분자의 활성을 조절하는 PDE1B 활성 조절자가 선택된다.
또 다른 실시예에서, 잠재적인 조절자는 선조체(striatal) 조직 슬라이스에 첨가될 수 있다(실시예에 기재). 조직 샘플을 여러 농도의 잠재적인 조절자로 처리할 수 있고, 다음 샘플의 PDE1B 활성을 분석할 수 있다. PDE1B 활성의 잠재적인 조절자는 예를 들어 그 시약을 갖는 크렙스 바이카보네이트 버퍼에서 배양된 단시간에 제조된 네오스트리아탈(neostriatal) 슬라이스의 처리에 의해 in situ 자연 뉴런 에서 테스트될 수 있다. 이들 화합물들의 효과는 배양 시간 및 적정 농도를 경험적으로 정의하여 테스트될 수 있다. 특정 실시예에서 선조체 조직의 균질화물을 면역블럿 분석을 수행하였다.
5.2.1 포스포다이에스터레이즈에 대한 효소 분석
본 발명의 방법에서 PDE1B를 포함하나 이에 한정되지 않는 캘모듈린 의존 포스포다이에스터레이즈(CaM-PDEs)의 저해제 및 활성화제는 당업계에 통상적으로 알려진 방법을 사용하여 검출하고 분리 및/또는 분리된 효소의 직접 분석에 의해 동정될 수 있다. 그러한 분석은 당업자에게 주지되어 있다.
예를 들어 일 실시예에서 톰슨 등(1971, Multiple cyclic nucleotide phosphodiestrase activities from rat brain. Biochemistry 10：311-316)의 방법이 PDE 활성에 대한 분석에 사용될 수 있다. 한 측면에서 cAMP 또는 cGMP는 분석의 기질로 사용될 수 있다. 일 실시예에서 예를 들어 Swinnen 등(1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86：8197-8201)에 기재된 바와 같이 조직은 프로테이즈 저해제 혼합물을 포함하는 버퍼에서 처음 균질화된다.
PDE1B는 예를 들어 시판 항체(예를 들어 AB-1655 래빗 Anti-Calmodulin 의존 Phosphodiesterase 1B1 Affinity-Purified Antibody(Chemicon))을 사용하여 표준 방법을 사용하여 뇌 균질물로부터 면역침전될 수 있다.
또 다른 실시예에서 PDE1B는 이온 교환 크로마토 그래피 및 칼모듈린-세파로스상의 친화 크로마토그래피(Sharma, R. K., T. H. Wang 등 (1980) "Purification and properties of bovine brain calmodulin-dependent cyclic nucleotide phosphodiestrase" J Biol Chem 255(12) 5916-23).
또 다른 실시예에서 CaM-PDE mRNA의 클로닝된 cDNA 카피는 배쿨로바이러스 에서 에피토프-태크 효소를 발현하는데 사용될 수 있고, 이 효소는 곤충 세포 추출물로부터 정제된 친화성일 수 있다. Sonnenburg 등 PDE1A 효소에 대한 이 방법을 기재하였고(Sonnenburg, W. K., D.Seger, 등(1995). "Identification of inhibitory and calmodulin-binding domain of the PDE1Al and PDElA2 calmodulin-stimulated cyclic nucleotide phosphodiesterase." J Biol Chem 270(52)：30989-1000), 그것은 PDE1B에 대해 용이하게 적용할 수 있다.
포유류 포스포다이에스터레이즈는 또한 PDE-결핍 효모에서 발현될 수 있다(Engels, P., M. Sullivan, 등 (1995). "Molecular cloning and functional expression in yeast of a human cAMP-specific phosphodiesterase subtype(PED IV-C). "FEBS Lett 358(3)：305-10; Atienza, J. M. and J. Colicelli (1998)." Yeast model system for study of mammalian phosphodiesterase." Methods 14(1)：35-42). 재조합 효모에서 CaM-PDE 발현은 또 Loughney 등에 의해 기재된 방법(1996, "Isolation and characterization of cDNAs corresponding to two human calcium, calmodulin-regulated 3',5'-cyclic nucleotide phosphodiesterase." J. Biol Chem 271(2)：796-806)에 의해 수행될 수 있다.
CaM-PDE의 과잉 발현은 당업계에서 통상적으로 알려진 방법에 따라 수행될 수 있다. 한 실시예에서 CaM-PDE의 과잉 발현은 pcDNA3와 같은 벡터를 사용하여 트랜스택션된 포유류 세포에서 수행되었다. 이 실시예의 관점에서 CaM-PDE의 과잉 발현은 트랜스팩션된 세포와 비-트랜스팩션된 세포를 비교(Yan. C., A.Z. Zhao, 등(1996). "The calmodulin-dependent phosphodiesterase gene PDE1C encodes several functionally different splice variants in a tissue-specific manner." J Biol Chem 271(41):25699-706)하여 클론된 효소의 저해를 연구하는 수단을 제공한다.
CaM-PDE 활성은 당업계에서 통상적으로 알려진 방법에 따라 분석하였다. 포스포다이에스터레이즈 저해제를 검출하기 위해서 방사성 동위원소 표지된 cAMP 또는 cGMP의 포스포다이에스터레이즈 절단을 사용할 수 있다. 일 실시예에서 포스포다이에스터레이즈 활성의 분석은 두 단계 생화학적 분석을 수반하는 표지된 아데노신의 회수에 의존한다. 첫 단계에서 포스포다이에스터레이즈는 [3H] cAMP를 [3H]5'-AMP로 가수분해한다. 두번째 단계에서 뱀독 5'- 뉴크레오티데이즈를 [3H]5'-AMP를 [3H]아데노신으로 전환시키기 위해 첨가하였다. 표지된 아데노신은 음이온 교환 또는 친화 크로마토그래피를 통해서 [3H]5'-AMP로부터 분리된 후 액체 신틸레이션 카운팅에 의해 검출되었다. 그러한 분석은 cAMP-특이적 포스포다이에스터레이즈 PDE4에 대해서는 Hansen 및 Beavo((1982, "Purification of two calcium/calmodulin-dependent forms of cyclic nucleotide phosphodiesterase by using conformation-specific monoclonal antibody chromatography."Proc Natl Acad Sci USA 79(9)：2788-92)에 기재되어 있었고, Daniels 및 Alvarez(1996, "Semiautomated method for the assay of cyclic adenosine 5'-monophosphate phosphodiesterase."Anal Biochem 236(2)：367-9)에 의한 고속작업처리량을 변형하였다.
이들 분석들은 칼슘/칼모듈린 의존 PDE1B 효소의 저해제를 검출하기 위해 당업계에 공지된 방법들에 따라 변형될 수 있다. 예를 들어 일 실시예에서 CaCl2(0.2 mM) 및 칼모듈린(4 ㎍/㎖)은 그 어세이에 첨가된다. 반정제된 혼합물에서 PDE1B 활성은 칼슘과 칼모듈인이 존재시의 포스포다이에스터레이즈 활성을 1mM EGTA가 있는 경우에 측정한 그 활성과 비교하여 검출될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 고속 작업처리량 방법은 예를 들어 Daniels 및 Alvarez(1996, "Semoautomated method for the assay of cyclic adenosine 5'-monophosphate phosphodiesterase." Anal Biochem 236(2)：367-9)의 방법을 사용한 CaM-PDE 분석을 수행하여 사용될 수 있다. 그러한 분석은 일 실시예에서 원-스텝 방법으로 변형될 수 있다. 원-스텝 방법에서는 뱀 독 포스포다이에스터레이즈를 사용한3H-AMP의 아데노신으로의 변환이 생략된다. 대신에,3H-AMP를 알카리 pH에서 알루미나 또는 보로네이트 수지를 사용하는 친화 크로마트그래피에 의해 [3H]cAMP로부터 분리한다(Smith, B. J., M. R.Wales, 등(1993)."A phosphodiesterase assay using alumina microcolumns." Anal Biochem 214(1)：355-7; Duplantier, A. J., C. J. Andresen, 등(1998). "7-0xo-4,5,6,7-tetrahydro-1H-pyrazolo[3,4-c]pyrimidines as novel inhibitors of human eosinophil phosphodiesterase." J Med Chem 41(13): 2268-77: Burnouf, C., E. Auclair. 등 (2000). "Synthesis, structure-activity relationship, and pharmacological profile of 9-amino-4-oxo-1-phenyl-3,4,6,7-tetrahydro[1,4]diazepino[6,7,1-hi]indole: discovery of potent, selective phosphodiesterase type 4 inhibitors." J Med Chem 43(25): 4850-67).
5.2.2.키네이즈 및 포스파테이즈에 대한 효소 분석
키네이즈 활성은 당업계의 여러가지 주지 방법(예를 들면 파커 2000, 형광 편광법: 핵 수용체-리간드 결합 및 키네이즈/포스파테이즈 분석을 사용한 고속 작업처리량 스크리닝 분석 개발, J. Biomolec.Screening 5(2)：77-88; Bader 등((2001, J. Biomolec.Screening 6(4):255-64; Liu, F., X. H. Ma, 등 (2001).. "사이크린-의존 키네이즈 5 및 대사조절형 글루타메이트 수용체에 의한 카세인 키테이즈의 조절" Proc Natl Acad USA 98 (20)：11062-8; 에반즈, D. B., K. B. 랭크, 등 (2002). " 96 웰 포맷을 사용한 인간의 타우 프로테인키네이즈 II/Cdk5의 저해제를 연구하기 위한 신틸레이션 접근 분석" Journal of Biochemical & Biophysical Methods 50(2-3)：151-61에 개시된 방법)에 의해 모니터될 수 있다.
그러한 방법을 사용하여, 대상의 키네이즈를 갖는 샘플을 인산화 자리를 제공하기 위한 적합한 조성물의 합성 펩타이드 기질 및 방사성 ATP에 대한 적당한 조건하에서 노출시킨 후 그 펩타이드와 새로 상호작용한 그 방사성 포스페이트를 측정하였다. 기질 펩타이드에 공유결합적으로 연결된 바이오틴과 같은 화학적 부위의 첨가는 스테렙트아비딘-코팅된 비드에 의한 기질 펩타이드의 결합이 가능케한다. 비드 결합된 펩타이드는 분리될 수 있고, 결합된 방사성활성은 측정되거나 바람직하게는 기질 펩타이드와 결합된 방사성활성은 신틸레이션 접근 분석에 적합한 비드를 사용하여 직접 측정할 수 있다.
단백질 포스파테이즈 활성은 당업계의 여러가지 주지의 방법(예를 들면 코헨 등(1988, 토끼 골격근으로부터 온 단백질 포스파타제이즈 l 및 단백질 포스파테이즈 -2A, Methods Enzymol 159：390-408) 또는 스튜어트 및 코엔(1988, 토끼 골격근으로부터 온 단백질 포스파테이즈 -2B：칼슘 이온 의존 칼모듈린- 자극되는 효소, Methods Enzymol 159：409-16).
PDE1B의 조절자는 또 DARPP-32 인산화의 조절자(즉 Ser137 DARPP-32 인산화(CK1), Thr75 DARPP-32 인산화(Cdk5) 또는 Thr34 DARPP-32 인산화(PKA,PP2B, PP1)의 조절자에 대한 스크리닝으로 동정될 수 있다. 그러한 방법들은 1999년 10월 15일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 번호 09/419,379("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling") 및 2000년 10월 13일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국특허출원 번호 09/687,959("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling") 및 1998년 7월 7일 Fienberg 등에 의해 특허된 미국 특허번호 제 5,777,195에 개시되고, 이들 각각은 레퍼런스에 의해 여기에 삽입한다.
5.2.3 다른 인산화 분석
펩타이드 기질의 인산화는 또 인(phospho)특이적인 항체의 직접 결합 또는 경쟁자 인(phospho)펩타이드로부터 온 인특이적인 항체의 치환(displacement)을 측정(파커, 로 등 2000, 형광 편광법: 핵 수용체-리간드 결합 및 키네이즈/포스파테이즈 분석을 사용한 고속 작업처리량 스크리닝 분석 개발, J. Biomolec.Screening 5(2)：77-88)하여 검출할 수 있다. 형광 공명 에너지 전이(FRET) 또는 형광 편광화(FP)와 같은 형광 방법은 특정 인펩타이드-항체 복합체를 검출하는데 사용될 수 있다. 이들 방법들은 결합된 족의 분리에 의존하는 것이 아니라 용액에서 특정 결합때문에 일어나는 형과의 변화에 의존하는 "균질" 검출을 채택하고 있다는 장점이 있다.
인특이적 항체를 생산하는 방법은 당업계에 주지되었다. 일 실시예에서 상기 방법은 1999년 10월 15일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 번호 09/419,379("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling") 및 2000년 10월 13일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국특허출원 번호 09/687,959("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling", 레퍼런스에 의해 여기에 삽입)에 개시된 방법들을 특이성을 갖는 인산화 상태-특이적 항체(예를 들어, Thr34-인산화된 DARPP-32)를 제조하는데 사용되었다.
포스포세린, 포스포쓰레오닌 또는 포스포타이로신에 대한 인산화 상태-특이 항체는 시판된다. 이들 항체들은 단백질들이 일반적으로 인산화되는지 및 어느 잔기에 인산화되는지를 결정하는데 유용하다. 그러한 항체들은 상업적으로 구입할 수 있다(예를 들어 산타 클로스 Biotechnology사, Sigma RBI, 스트라타진, Upstate Biotechnology, 그리고, Zymed를 포함한 상업 공여원의 리스트에 대한 스미스, Thescientist 15[4])：24, 2001년 2월 19일).
형광 공명 에너지 전이 또는 FRET는 거대 분자의 특정 결합을 검출할 수 있는 균질화된 분석으로 넓리 사용되고 있다. FRET는 방출광보다는 여기된 "도너" 형광분자(형광단(fluorophore))에서 "어셉터"형광단 근처로 그들의 에너지를 전이하는 능력에 의존한다. 따라서 기질 타겟에 결합에 의해 두 형광단이 공간에서 서로 모아진 때 정상 도너 파장에서 방출된 형광은 감소하고 그 어셉터 형광단에 의해 방출되는 형광은 증가한다. 노너 형광 감소 또는 어셉터 형광 증가는 그 결합을 측정하는데 사용될 수 있다.
일 실시예에서 Bader 등(2001, 시간 분석 형광 공명 에너지 전이에 기초한 고 작업강도 스크리닝에 대한 cGMP 의존 단백질 키네이즈 분석, J. Biomolec.Screening 6(4)：255-64)에 개재된 방법을 예를 들어 포스포다이에스터레이즈, 키네이즈, 또는 단백질 포스파테이즈의 활성을 결정하는데 사용된다. Bader 등은 시간 분석 형광 공명 에너지 전이에 기초한 고 작업강도 스크리닝에 대한 cGMP 의존 단백질 키네이즈 분석을 개재하고, 당업자에서 알 수 있는 바와 같이 그 방법은 포스포다이에스터레이즈 또는 단백질 포스파테이즈의 분석에 적용될 수 있다. 대상의 키네이즈를 갖는 샘플은 ATP 및 키네이즈-특이 인산화 자리를 갖는 합성 펩타이드 기질 및 N-말단 바이오틴 부분에 노출시켰다. 인산화된 펩타이드는 알로파이코시아닌(allophycocyanin)-표지된 스트렙트아비딘, 인펩타이드 특이적 항체 및 유로피움(Europium)-켈레이트-표지된 2차 항체를 사용하여 검출하였다. 인산화된 기질 분자에 스트렙트아비딘 및 그 인특이적 항체의 동시 결합은 2차 항체 상의유로피움 킬레이트 "도너"가 알로파이코시아닌 형광단 "어셉터"에 충분히 근접하여 615nm에서 유로피움 방출 감소 및 665nm 파장에서 알로파이코시아닌 방출의 증가를 측정할 수 있을 만큼 형광 공명 에너지 전이가 일어나게 한다. 유로피움- 및 알로파이코시아닌 도너-어셉터 쌍은 여기된 유로피움의 긴 형광 생존시간을 이용하기 위해 사용되고, 따라서 그 신호는 시간-분석(resolved)"된다.
쿠마린 미 형광 이소싸이오시아네이트(FITC)와 같은 다른 쌍의 형광단들이 사용될 수 있다. 형광 공명 에너지 전이(FRET)에 관여할 수 있는 그러한 분자쌍을 FRET 쌍이라 명명한다. 에너지 전이를 일으키기 위해 도너 및 어셉터 분자를 전형적으로 매우 근접(70에서 100Å까지(Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211:353-388: Selvin, 1995, Methods Enzymol.246:300-334)하게 있어야 한다. 에너지 전이 효율은 도너 및 어셉터 분자사이의 거리에 따라 빠르게 저하된다.
일반적으로 FRET에 사용되는 분자들은 후르오레세인, 5-카르복실후르오레세인(FAM), 2' 7'디메톡시(dimethoxy)-4'5' -디클로로-6-카르복실후르오레세인(JOE), 로다민, 6-카르복실로다민(R6G), N, N, N', N'-테트라메틸 6-카르복실로다민(TAMRA), 6-카르복실-X-로다민(ROX), 4-(4'-디메틸아미노페니라조(dimethylaminophenylazo)안식향산(DABCYL), 및 5-(2'-아미노에틸)아미노나프탈렌(aminonaphthalene)-1-설폰산(EDANS)을 포함한다.
형광단이 도너 인지 어셉터인지는 그것의 여기 및 방출 스펙트럼 및 그것이 쌍을 이루는 형광단에 의해 정의되고 된다. 예를들어 FAM은 488nm의 파장을 갖는 광에 의해 매우 효율적으로 여기되고 500에서 650nm의 스펙트럼을 갖는 빛을 방출하고 525nm의 최대 방출을 갖는다. FAM은 JOE, TAMRA 및 ROX(그 모두는 514nm에서 최대 여기를 갖는다).
형광 편광화 측정은 포스포다이에스터레이즈, 단백질 키네이즈, 또는 포스파테이즈의 활성을 측정하는데 사용될 수 있다(파커, 로 등 2000, 형광 편광법: 핵 수용체-리간드 결합 및 키네이즈/포스파테이즈 분석을 사용한 고속 작업처리량 스크리닝 분석 개발, J. Biomolec.Screening 5(2)：77-88; Turek 등, 2001, Anal. Biochem. 299：45-53). 형광 작은 인펩타이드에 큰 특정 항체의 결합은 반전 빈도(tumbling) 속도를 늦게하고 형광 편광화 신호를 증가시킨다. 따라서 형광 편광화는 결합한 형광성 인펩티드의 양에 비례한다.
이 분석은 고정된 농도의 형광 펩타이드 및 항체를 생체 샘플에 첨가하고 비 형광 인단백질 또는 인펩타이드의 존재하에서 신호의 감소로 기록되는 경쟁적 모델에 사용될 수 있다. 그것은 또한 포스파테이트 첨가(예를 들어 키네이즈에 의해) 또는 제거(예를 들어 포스파테이즈에 의해)가 항체 결합을 조절하여 편광화 신홀르 조절하는 직접 결합 모드에도 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 형광 편광화 분석은 생산물-특이적 항-인산화된 펩타이드-특이적(예를 들어 항-인-세린)항체가 사용되는 Turek 등(2001, Anal. Biochem. 299：45-53)의 방법을 사용하여 수행된다.
또 다른 실시예에서 인산화용 세포 기초 분석이 사용된다. 특정 실시예에서 단백질 인산화에 대한 신호전달은 in vivo(예를 들어 형광 표시제, 그와 같은 방법의 사용은 사또 등(2002, 단일 생 세포내에서 단백질 인산화를 화상화하는 형광 표시제, Nature Biotechnology 20(3)：287-94)에 기재된 것과 같은 방법을 사용한 단일 생 세포) 에서 볼 수 있다. 그러한 센서는 유연한 링커에 의해 분리된 두 형광 단백질 분자로 구성되었다. 그 링커의 인산화는 두 형광 단백질을 서로 근접하게 하는 형태 변화를 일으켜 FRET가 일어나고 시스템의 형광 변화를 일으킨다.
5.3 PDE1B 활성을 조절하는 약제
본 발명은 또 하기에서 기술하는 약제, 약, 화합물 또는 소분자를 포함하나 이에 한정되지 않는 PDE1B 활성을 조절하는 조성물을 제공한다. 또 본 발명은 하기에서 기술하는 약제, 약, 화합물 또는 소분자를 포함하나 이에 한정되지 않는 PDE1B 활성의 조절을 통한 DARPP-32 또는 GluRl AMPA 수용체의 활성을 조절하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 또 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 이상의 치료 방법에 사용되는 조성물을 제공한다. 여기서 그 조성물은 하기에서 기술하는 약제(agent), 약(drug), 화합물 또는 소분자를 포함하나 이에 한정되지 않는 PDE1B 활성을 조절하는 조성물이다.
상기에서 기술한 바와 같이, 어느 특정 이론에 의해 속박되는 것을 원하지 않는 본 발명의 한 측면은 도파민 D1 수용체가 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로를 통하여 DARPP-32의 인산화를 중재한다. 본 발명에서 D1 수용체 활성화는 아데니릴 사이크레이즈 활성화(및 증가된 cAMP)를 이끈다. cAMP는 DARPP-32 및 CREB와 같은 다운스트림 신호전달 경로 성분을 인산화하는 프로틴 카네이즈 A(PKA;cAMP-의존 프로틴 카이네이즈)를 활성화한다. 이들 신호 전달들은 cAMP를 그것의 5'모노포스페이트로 가수분해하는 PDE1B를 포함하나 이에 한정되지 않는 포스포다이에스터레이즈(PDEs)에 의해 다운-레귤레이트되거나 업-레귤레이트된다.
본 발명의 다른 측면에서, 칼슘 조절되는 PDE1B는 도파민 D 1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 도파민 조절되는 세포내 신호전달 경로 및 또 다른 세포내 신호전달 경로 사이의 활성을 조절하는 인터페이스이다.
따라서 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로에서 상기 기재된 상호작용에 영향를 미치는 본 발명의 방법에 따라 동정된 어느 화합물은 또 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료상의 치료(treatment)의 기초로 작용될 수 있고 따라서 그러한 상호작용에 참여하는 모든 단백질은 여기에서 기재된 것과 같은 분석에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 PDE1B 활성을 조절할 수 있는 것으로 일단 밝혀진 기술 중 하나가 이해된다면, 그 화합물은 PDE1B 활성이 관여할 수 있는 이상을 치료하기 위하여 세포(예를 들어 뉴런)의 PDE1B 활성을 조절하기 위해서 치료적으로 사용될 수 있을 것이다. 그러한 이상은 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 PDE1B의 활성을 조절할 수 있어서 그것에 의해 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는이상을 완화하는 약을 개발하기 위한 합리적인 의약 디자인을 수행하는 방법을 더욱 제공한다. 그러한 합리적인 의약 디자인은 출발점으로 PDEl의 저해제(또는 활성화제)로 밝혀진 화합물을 사용하여 수행될 수 있다. 그러한 합리적인 의약 디자인은 당업계에 주지되어 있다. 특정 실시예에서 1999년 10월 15일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 번호 09/419,379("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling") 및 2000년 10월 13일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국특허출원 번호 09/687,959("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling"), 레퍼런스에 의해 여기에 삽입에 개재된 합리적인 의약 디자인을 사용한다.
사실, 잠재적인 조절자는 PDE1B의 잠재적인 조절자를 동정하기 위해, GRAM, DOCK 또는 AUTODOCK(Dunbrack 등, Folding 및 Design 2：27-42(1997))과 같은 도킹 프로그램을 사용한 컴퓨터 모델링의 사용을 통하여 조사될 수가 있다. 다음 이들 조절자들은 PDE1B 활성에 대한 그들의 효과를 테스트할 수 있다. 이 과정은 잠재적인 조절자의 형태 및 화학적 구조가 어느 정도 잘 PDE1B에 결합하는지를 확인하기 위한 PDE1B 복합체에 잠재적인 조절자의 컴퓨터 맞춤(fitting)을 포함할 수 있다(예를 들어 Bugg 등, 1993, Scientific American (12월) 269(6)：92-98; 웨스트 등 TIPS, 16:67-74(1995) 참조). 컴퓨터 프로그램은 조절자/저해제와 단위체의 인력, 척력 및 공간적 저해성을 평가하는데 사용될 수 있다. 일반적으로 맞춤이 더욱 딱 맞을 수록 공간적 저해성이 낮아지고, 이러한 특성들은 더 딱 맞는 결합상수와 일치하기 때문에 인력이 클수록 더욱 강력한 잠재적인 조절자이다. 게다가 잠재적인 의약의 디자인에서 특이성이 크면 클수록 다른 단백질과 더 잘 작용하지 않을 의약일 것이다. 이것은 다른 단백질과 원하지 않는 상호작용으로 인한 잠재적인 부작용을 최소화할 것이다.
처음에는 PDE1B에 결합하는 것으로 알려진 화합물들을 하나 이상의 유력한 잠재적인 유사체가 밝혀질 때까지 컴퓨터 모델링 프로그램에 의해 전체적으로 변형할 수 있다. 그 외에 선택된 유사체의 전체적인 변형은 하나 이상의 유력한 잠재적인 유사체가 밝혀질 때까지 컴퓨터 모델링 프로그램에 의해 전체적으로 변형될 수 있다. 그러한 분석은 당업자에게 주지되어 있고, 예를 들어 HIV 프로테이즈 저해제의 개발에서 효과를 보였다(예를 들어 Lam 등 (Science 263：380-384(1994));Wlodawer 등, Ann. Rev. Biochem. 62：543-585(1993);Appelt, Perspectives in Drug Discovery and Design 1：23-48(1993); 에릭슨, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128(1993)).
하나의 잠재적인 약제에 대한 타겟(예를 들어 PDE1B 또는 DARPP-32) 또는 잠재적인 약제는 표지될 수 있다. 적당한 표지는 요소(예를 들어 알카라인 포스파테이즈 또는 호스래디쉬페옥시데이즈), 형광단(예를 들면 소수 형광단을 명명하면 후르오렛세인이소싸이노시에네이트(FITC), 피코에리트린(PE), 텍사스 레드(TR), 로다민, 자유 또는 킬레이트화된 란타나이드(lanthanide) 시리즈 염 특히 Eu3+), 발색단, 방사성동위원소, 킬레이트화제, 염료, 콜로이드 골드, 라텍스 입자, 리간드(예를 들어 바이오틴), 화학형광제(chemiluminescent agents) 마그네틱 비드 또는 마그네틱 공명 화상화 표지를 포함한다. 대조마커를 사용하였을 때 수용체 및 대조군 마커에 대해 동일 또는 다른 표지를 사용하였다.
실시예에서 방사성 표지는3H,14C,32P,35S,36Cl,51Cr,57Co,58Co,59Fe,90Y,125I,131I 및186Re를 사용했고, 당업계에서 공지된 표준 카운팅 절차를 이용할 수 있다.
실시예에서 그 표지는 효소이고, 검출은 본 발명에서 사용된 당업계에 알려진 색채계, 분광기, 형광분광기, 전류검출 또는 기체부피 기술의 방법에 의하여 수행될 수 있다.
직접 표지는 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 표지의 예이다. 직접 표지는 그것의 자연 상태에서 육안(예를 들어, 화합물을 통한 시각적 관찰 또는 디세팅(dissecting) 광 현미경) 또는 광학 필터 및/또는 응용 촉진(예를 들면 형광을 증가하기 위한 U.V.광)의 도움에 의해 용이하게 볼 수 있는 것이다. 본 발명의 방법에 의해 사용될 수 있는 색채 표지의 예는 예를 들어 Leuvering(미국 특허 4,313,734)에 의해 개재된 것과 같은 금 졸 입자들 같은 금속 졸 입자들; Gribnau 등(미국 특허 4,373,932) 및 Mayer 등 (WO 88/08534)에 의해 개재된 것과 같은 염료 졸 입자들; Mayer 등 (WO 88/08534), Snyder(EPA 0280 559, 및 0 281 327)에 의해 개재된 것과 같은 염료 라텍스; 또는 캠벨 등(미국 특허 4,703,017)에 의해 개재된 것과 같은 캡슐화된 염료를 포함한다.
다른 직접 표지는 예를 들어 변형/융합 녹색 형광 단백질(1997년 4월 29일특허된 미국 특허 제 5,625,048호 및 1997년 7월 24일 공개된 WO 97/26333, 이들 각각은 레퍼런스에 의해 여기에 삽입)을 포함하나 이에 한정되지 않는 방사성뉴크레오타이드, 발광 부분 또는 형광 부분을 포함한다.
이들 직접 표지 도구외에도, 효소를 포함하는 간접 표지가 본 발명에 또한 이용될 수 있다. 예를 들어 알카라인 포스파테이즈 또는 호스래디쉬페옥시데이즈, 라이소자임, 글루코오스­6­포스페이트 탈수소효소, 젖산 탈수소효소, 또는 우레아제를 사용한 효소-연결 면역분석과 같은 여러 타입의 효소-링크된 면역분석은 당업계에 주지되었다. 이들 및 다른 유사한 분석은 당업계에 주지되었고, 예를 들어 Engvall(1980, "효소 면역분석 ELISA 및 EMIT", Methods in Enzymology, 70: 419-439) 및 미국 특허 4,857,453에 기재되었다.
일 실시예에서 단백질은 대사 표지화에 의해 표지될 수 있다. 대사 표지는 [35S]-메티오닌 또는 [32P]-오쏘포스페이트와 같은 대사 표지가 보충된 배양 배지의 존재 하에서 단백질을 발현하는 세포를 in vitro 배양하는 중에 일어난다. [Cl2]-메티오닌으로 대사(또는 생합성) 표지외에 본 발명은 [14C]-아미노산 및 [3H]-아미노산(비반응 위치에서 삼중수소 표지된)로 표지(1999년 10월 15일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국 특허 출원 번호 09/419,379("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling") 및 2000년 10월 13일에 Bibb 등에 의해 출원된 미국특허출원 번호 09/687,959("Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation inDopamine Signaling", 레퍼런스에 의해 여기에 삽입)를 더욱 예상한다.
5.4. 진단 및 치료 방법
본 특허명세서에 기재된 바와 같이 본 발명은 PDE1B의 활성 또는 발현을 조절하는 약제, 약, 화합물 및 조성물을 제공한다. 또 본 발명은 PDE1B 활성을 변경하는 약제를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 그것을 필요로 하는 환자에서 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 이상을 치료하는 방법을 제공한다. 여기서 PDE1B 활성은 DARPP-32 및/또는 GluRl AMPA 수용체의 인산화를 조절한다.
본 발명은 PDE1B 활성을 변경하는 유효량의 본 발명의 화합물을 인간(예를 들어 환자) 또는 동물 대상에 투여하여 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 질병 치료방법을 제공한다. 한 실시예에서 상기 약제는 PDElB 활성을 촉진 또는 증가시킨다. 또 다른 실시예에서는 약제는 PDE1B 활성의 조절을 통하여 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 촉진(또는 증가) 또는 저해(또는 감소)시킨다.
일 실시예에서 본 발명은 PDE1B 활성을 조절하는 여기서는 DARPP-32의 34번째 쓰레오닌 및/또는 GluRl AMPA 수용체의 845번째 세린에서의 인산화가 조절되는 약제를 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병 치료방법을 제공한다. 특정 실시예에서 약제는 PDE1B와 결합하여 PDElB의 활성을 조절한다.
한 실시예에서 그러한 치료가 필요한 대상은 PDElB 활성 및 DARPP-32 활성, GluRl AMPA 수용체 활성 및/또는 도파민 D 1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는데 충분한 양의 본 발명의 화합물이 투여된다.
본 발명은 증상을 나타내는 대상 또는 환자에서 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 질병의 증상을 완화할 수 있는 본 발명의 약제(또는 약 또는 화합물)를 투여하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서 본 발명은 증상을 나타내는 대상 또는 환자에서 상기 질병의 증상을 완화할 수 있는 여기에 기재된 방법에 의하여 동정된 약제를 투여하는 방법을 제공한다.
또 다른 실시예에서, 본 발명은 PDE1B 활성을 조절하는 약제를 그것을 필요로하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 이상의 치료 방법을 제공한다. 여기서 DARPP-32 및/또는 GluRl AMPA 수용체의 인산화는 조절된다. 특정 실시예에서 PDE1B 활성은 저해된다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 PDE1B 활성을 조절하고 Thr34-인산화된 DARPP-32의 인산화를 조절하는 약제를 그것을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을포함하는 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병 치료방법을 제공한다.
또 다른 실시예에서 본 발명은 PDElB의 활성을 조절하는 유효량의 화합물을 투여하는 것을 포함하는 GluRl AMPA 수용체의 인산화-의존 활성화에서 증가 또는 감소를 특징으로 하는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 PDE1B 관련 및/또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 증상 및/또는 질병 상태 특성과 관련된 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병을 치료하는데 사용된다.
특정 실시예에서, 본 발명은 PDE1B 활성을 저해하는 약제를 환자에게 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 환자에서 파킨슨 병을 치료하는 방법을 제공한다. 여기서 Thr34-DARPP-32 및/또는 Ser845-GluRl AMPA 수용체의 인산화는 증가된다.
바람직하게는 치료방법에 투여된 약제, 화합물 또는 조성물은 이상, 및 그것에 의한 병(condition) 및 질병을 치료할 수 있게 충분한 양 및 충분한 속도로 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier)를 통해서 투과할 수 있다. 그러한 일 실시예에서 그 약제는 정맥내 투여된다. 또 다른 실시예에서 그 약제는 구강 투여된다. 더욱 바람직하게는 그 약제는 담체없이 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있다(투여 방법 및 경로에 대해서는 5.6을 참조).
본 발명은 대상으로부터 온 샘플에서 PDE1B 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 그러한 질병을 갖는 것으로 의심되는 대상에서 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병을 진단하는 방법을 제공한다. 여기서 그러한 이상을 갖지 않는 대상에서 온 대조군 샘플의 PDE1B 활성의 대조군 레벨과 비교하여 상기 대상으로부터 온 샘플에서 PDE1B 활성의 레벨이 큰 경우에는 상기 대상은 상기 이상을 가진 것을 나타낸다. 특정 실시예에서 상기 대상은 인간이다.
일 실시예에서, PDE1B 레벨은 DARPP-32의 phospho-Thr34 또는 GluRl AMPA 수용체의 phospho-Ser845의 인산화를 측정하여 결정된다. 다른 실시예에서 PDE1B 활성의 레벨은 PDE1B mRNA의 레벨이고, 상기 PDE1B mRNA의 레벨은 당업계에 주지된 방법(예를 들어 in situ 교잡화)에 의해 결정된다. 다른 실시예에서, PDE1B 활성의 레벨은 PDE1B 단백질의 레벨이고, 상기 단백질 레벨은 당업계에 주지된 방법(예를 들어 면역블럿)에 의해 결정된다.
본 발명은 (a) PDE1B에 특이적으로 결합하는 이미지 방법에 의해 검출될 수 있는 표지가 결합된 약제를 투여하는 단계; (b) 상기 투여 후 상기 대상에서 상기 약제가 PDE1B에 특이적으로 결합하고 결합하지 않은 약제를 배경 레벨에서 제거하기 위한 충분한 시간을 대기하는 단계; 및 (c) 상기 대상에서 PDE1B의 레벨을 검출하기 위해 상기 이미지 방법으로 상기 대상을 이미지하는 것을 포함하는 그러한 이상을 가진 것으로 의심되는 대상에서 in vivo PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 이상을 검출하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서 상기 대상은 인간이다.
5.5 동물 모델
본 발명의 방법에서 동물 모델은 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정된 화합물을 테스트하는데 사용될 수 있다. 여기서 그 화합물은 동물 모델을 사용한 기능적 유용성을 위해 테스트될 수 있다. 본 발명의 방법에서 동물 모델은 야생형 동물(모델로서 예를 들어 정상 또는 야생형 생리적 또는 행동 상태)일 수 있다. 대안으로는 그 동물 모델은 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 질병 또는 이상에 대한 모델일 수 있다. 그러한 동물 모델은 PDE1B의 활성을 조절 또는 질병이나 이상의 증상을 완화하는 화합물을 스크리닝하기 위한 분석에 사용될 수 있다. 그러한 동물들은 마우스, 랫트, 햄스터, 양, 돼지, 소 등일 수 있고 바람직하게는 인간을 제외한 포유류이다.
본 발명의 일 실시예에서 그러한 동물 또는 그것으로 부터 온 조직 신경계의 변화된 생리적인 조절을 갖는 동물 모델은 세포내 레벨 특히 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트(예를 들면 NMDA 수용체, AMPA 수용체), GABA, 아세틸콜린, 아데노신(예를 들면 A2A 수용체), 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드(예를 들면 ANP, BNP, CNP) 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로를 포함하나 이에 한정되지 않는 세포내 신호전달 경로의 레벨에서 작용하는 잠재적인 치료약 및/또는 치료 처방(regimens)의 스크리닝에 이용될 수 있는 것 쓸 수 있다.
그러한 동물 모델에 의해 나타나는 결함을 역전(reverse)할 수 있는 약은 세포내 신호전달 케스케이드의 일 지점에서 작용하고 따라서 치료적으로 잠재적인 용도이다. 이외에도 일부 결함은 행동 레벨에서 일어나므로 그 모습 또는 이들의 변화는 그러한 행동의 변화에서 치료용도에 대하여 높은 예측할 수 있는 가치를 갖는다.
본 발명의 방법에서 따라서 동물 모델은 정상 또는 질병 환자군 모두가 관여하는 여러 단백질 인산화 단계의 작용기작을 밝히는 스크리닝 도구로서 사용될 수 있다. 예를 들어 동물 모델은 여러 신경적 질병 및 장애를 겪는 환자의 치료에 사용될 수 있는 여러 잠재적인 치료 전략 및 치료 약제에 대한 반응을 평가하는데 이용될 수 있다.
동물 모델을 사용하여 증가된 약효 및 최소한의 부작용을 포함하는 잠재적으로 유리한 효과에 대한 여러 소 분자 약을 스크리닝할 수 있다. 그러한 스크리닝에 대한 전형적인 후보군은 여러 시판되는 약 라이브러리로부터 얻을 수 있다.
동물 모델을 이용할 수 있는 특정 신경 또는 행동 질병은 여기에 기재된 바와 같이 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 것을 포함한다. 내생적 또는 외부적 약제에 대한 그 여러 특징 반응을 이용하고 잠재적인 치료 약제로 처리된 동물과 이 반응을 비교하고, 특정 질병 상태에서 잠재적인 치료 약제의 유용성을 평가하는 것을 만들 수 있다. 예를 들어 그 잠재적인 치료 약제는 특정 질병이나 이상에 대한 동물 모델에 투여될 수 있고, 도파민에 대한 그것의 반응을 모니터할 수 있다. 다음 정상, 야생형 마우스에서 도파민에 대한 반응과 비교는 그 잠재적인 치료 약제의 가치의 지표를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 동물 모델에 예측되는 치료 약제를 투여하고, 이상과 관계 있는 것으로 믿어질 수 있는 어느 표현형의 특징에 대한 예측되는 치료약제의 효과를 측정 및/또는 결정하는 것을 포함하는 PDE1B 관련 및 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하는 그러나 이에 한정되지 않는 이상의 치료에서 가능한 용도에 대한 치료 약제를 선택하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 측면의 실시예에서, 예측되는 치료 약제는 동물 모델에 투여되고, 도파민에 대한 테스트 반응을 동물 모델에서 측정한다. 여기서 치료약제의 부존재하에서 동물 모델의 정상 반응은 야생형 동물의 반응과 특징적으로 다르다. 그 잠재적인 치료약제는 테스트 반응 및 정상 반응 사이에 통계학적으로 유의성이 있는지 여부에 기초하여 선택된다. 잠재적 치료 약제는 측정/결정된 특징에서 통계학적으로 유의적인 변화를 보인다. 바람직한 실시예에서 치료 약제의 부존재하에서 동물 모델의 반응은 그 치료 약제가 투여되지 않은 야생형 동물의 반응과 특징적으로 다르다.
본 발명의 또 다른 측면은 동물 모델에 예측되는 치료 약제를 투여하고, 파킨슨 병과 관계 있는 것으로 믿어질 수 있는 어느 표현형의 특징에 대한 예측되는 치료 약제의 효과를 측정 및/또는 결정하는 것을 포함하는 파킨슨 병의 치료에 가능한 용도에 대한 치료 약제를 선택하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 동물 모델은 하기에 기재된 동물 모델을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 동종접합(homozygous) PDE1B 넉아웃 마우스를 여기에 개재된바와 같이 PDE1B 활성을 조절하는 후보 약제를 확인하거나 입증하는 부가적인 시험 또는 분석에 여기에 개재된 바와 같이 사용될 수 있다. 일 실시예에서 본 발명은 그것의 내생적인 PDE1B 유전자에서 동종 접합 파괴를 포함하는 PDE1B 결손(예를 들어 널(null) 또는 "넉아웃" 마우스를 제공한다. 여기서 파괴란 기능적 PDE1B의 발현을 막는것을 의미하고, 더욱이 야생형 PDE1B 유전자를 갖는 마우스와 비교하여 상기 넉아웃 마우스의 표현형은 cAMP 또는 cGMP 가수분해 분석을 할 때 PDE1B 효소 활성이 결여된 것을 포함한다. 일 실시예에서 상기 파괴는 PDE1B 촉매자리의 타겟된 파괴를 포함한다. 다른 실시예에서 그 파괴는 PDE1B 유전자의 코딩 지역으로 삽입을 포함한다.
넉아웃 마우스는 기능적 PDE1B을 자연적을 코딩하고 발현하는 유전자의 비(non)작용적 대립유전자를 포함한다. 기능적 PDE1B을 자연적을 코딩하고 발현하는 유전자의 두 비작용적 대립유전자를 포함하는 넉아웃 마우스는 따라서 기능적 PDE1B을 발현할 수 없다.
비작용적 대립유전자는 당업계에 주지된 몇 가지 방법으로 생성될 수 있다. 그 모든 것은 본 발명에 사용될 수 있다. 바람직한 실시예에서 비작용적 대립유전자는 외부 DNA를 PDE1B 대립유전자의 코딩 지역, 바람직하게는 촉매 도메인에 대한 코딩 지역 속으로 삽입내지는 대체하여 결함있게 만든다. 일 실시예에서 그 삽입은 PDE1B을 코딩하는 대립유전자의 지역의 전사 전에 전사를 종결하는 신호를 포함한다. 그러한 실시예에서 PDE1B의 촉매 도메인의 코딩 지역에서 DNA 부분을 제거하고 상기 삽입체로 대체하는 것이 더욱 더 바람직하다.
본 발명의 PDE1B 넉아웃 마우스는 실시예에서 개재된 바와 같이 도파민 및/또는 과잉행동에 반응하여 증가하는 표현형을 포함한다. 다른 실시예에서 도파민의 상기 증가 반응은 DARPP-32의 34번째 쓰레오닌 및/또는 GluRl AMPA 수용체의 845번째 세린에서의 증가된 인산화에 의해 확인된다.
다른 실시예에서, 야생형 PDE1B 유전자를 갖는 마우스와 비교하여 PDE1B 넉아웃 마우스의 표현형은 처음 30분의 수평 운동 활성에 대한 시험 기간 동안 상당히 더 탐구하는 행동을 나타냄, 메타엠페파민 약제의 투여 후 상당히 더 과잉행동을 나타냄, 모리스 워터 미로의 인식에서 상당히 더 긴 경로 길이를 나타냄, 상기 마우스에서 온 선조체 슬라이스에서 D1 수용체 작용제의 투여에 대해 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 증가된 레벨을 나타냄 및 상기 마우스의 횡 슬라이스에서 D1 수용체 작용제의 투여에 대해 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 증가된 레벨을 나타냄으로 구성된 군으로부터 선택된 표현형을 더욱 더 포함한다. PDE1B이 실험적으로(예를 들어 본 발명의 화합물 투여를 통해) 저해되는 야생형 마우스는 일실시에에서 PDE1B 넉아웃 마우스의 상기 기재한 표현형 특성의 일부 및/또는 전부를 나타낼 수 있다는 것은 당업자는 인식할 것이다 .
본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명의 PDE1B 넉아웃 동물은 마우스가 실험실 연구동물로 뛰어난 장점이 있으므로 마우스인 것이 바람직하다. 그러나 PDE1B 단백질을 갖는 다른 어느 동물도 본 발명의 방법에 적용될 것이다. 그러한 동물은 마우스, 랫트, 햄스터, 양, 돼지, 소 등일 수 있고 바람직하게는 인간을 제외한 동물이다.
넉아웃 마우스를 제조하는 방법은 당업계에 주지된다. 그 방법은 PDE1B를 코딩하는 지노믹 DNA를 얻고, 상기 지노믹 DNA 및 마커 유전자(상기 마커 유전자는 상기 지노믹 DNA의 엑손내에 위치)를 포함하는 벡터를 만드는 것을 포함한다. 그 벡터는 다음 배아 줄기(ES)세포 내로 일렉트로포레이트(electroporate)하였고, 그것의 지놈으로 삽입된 배아줄기세포를 선택하였다. 여기서 선택된 세포는 마우스 지놈에서 PDE1B에 대한 유전자의 내생적(endogenous) 자리로 삽입된 마커 유전자를 갖는다. 다음 상기 세포는 마우스 낭포(blastocyst)속으로 삽입하고 가임신된 암컷 마우스 속으로 재 이식하여 그것의 생식세포(germ line)에서 PDE1B에 대한 결손된 대립유전자를 포함하는 키메릭 마우스를 생산한다. 두 이형교잡 마우스는 그 다음에 동종교잡 넉아웃 마우스 후손을 생산하게 자란다.
동족(homologous) 재결합을 통한 타겟 유전자를 갖는 세포를 생산하는 방법은 당업계에 공지된다(예를 들어 Chappel,미국특허번호 5,272,071; 1991.5.16일 발행된 PCT 공개번호 WO91/06667);Capecchi 등 1995.11.7일 특허된 미국특허 5,464,764; Capecchi 등 1997.5.6일 특허된 미국특허 5,627,059; Capecchi 등 1996.1.30일 특허된 미국특허 5,487,992). 동족 재조합 벡터 및 동족 재조합 동물을 제조하는 방법은 토마스 및 카펫치, 1987, Cell 51; 503; 브레드리, 1991, Curr.Opin.Bio/Technol.2: 823-29; 및 PCT 공개번호 WO90/11354, WO91/01140 및 WO 93/04169에 더욱 더 기재되어 있다.
일 실시예에서 본 발명은 (a)PDE1B의 일부를 코딩하는 지노믹 DNA를 얻고; (b)상기 지노믹 DNA 및 마커 유전자(상기 마커 유전자는 상기 지노믹 DNA의 엑손내에 위치)를 포함하는 벡터를 만들고;(c)그 벡터는 일렉트로포레이션에 의해 배아 줄기(ES)세포 내로 삽입하고;(d)그것의 지놈으로 삽입된 배아줄기세포를 선택하였다. 상기 벡터가 동족 재결합에 의해 그것의 지놈 속으로 그 내생적 PDE1B 유전자 속으로 삽입으로 인하여 파괴된 PDE1B 유전자를 갖는 세포를 선택하고;(e)상기 세포를 마우스 낭포(blastocyst) 속으로 삽입하여 키메릭 낭포를 형성하고;(f)가임신된 암컷 마우스 속으로 상기 키메릭 낭포 결과물을 이식하여 상기 가임신된 마우스가 그것의 생식세포(germ line)에 PDE1B 유전자 돌연변이체를 포함하는 키메릭 마우스를 생산하고;(g) 파괴된 PDE1B 유전자를 포함하는 이형교잡 마우스를 만들어 그것에 의해 상기 파괴된 PDE1B 유전자에 이형교잡인 마우스를 제조하는 상기 키메릭 마우스를 사육하고; 및 (h) 상기 파괴된 PDE1B 유전자에 대해 각각 이종교잡인 암컷과 수컷을 함께 짝을 지어 주고 사기 파괴된 PDE1B 유전자에 대해 동종교잡인 후손을 선택하는 것에 의해 제조되는 PDE1B 넉아웃 마우스를 제공한다.
또 다른 실시예에서, 파킨슨 변에 마우스 모델이 사용된다(Uhl 등, 1985, Lancet 1：956-57;Mokry, 1995, 파킹슨 병의 연구에 사용된 동물 모델 및 행동 시험, Physio. Res. 44:143-150.; Du, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 14669-14674). 이런 종류의 모델 동물계는 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로에 대한 그들의 효과로 인하여 파킨슨병의 치료에 유용한 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 다른 대안적인 실시예에서 파킨슨병의 랫트 모델이 사용된다. 특정 실시예에서 랫트를 표준 방법에 따라 6-0HDA(6-hydoxydopamine; 도파민 작용성 뉴로톡신)으로 일방적으로(즉 한 범위) 주사하였다. 6-0HDA는 도파민 작용성 뉴런에 의해 선택적으로 흡수되고 뉴론을 죽인다. 그러한 6-0HDA 손상 동물은 파킨슨병의 동물모델로 간주된다(실시예 참조).
또 다른 실시예, 정신 분열병의 동물 모델이 사용된다(Sipes 등 1995(랫트에서 프레펄스 저해의 8-0H-DPAT 파괴)：(+) WAY 100,135로 리버설 및 작용 ㅈ리의 위치, Psychopharmacology(Berl) 117(1)：41-8;Cao 등, 2002, Brain Research 937：32-40). 그러한 모델 동물을 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로에 대한 그들의 효과로 인하여 정신분열증의 치료에 유용한 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
다른 실시예에서 주의력 결핍증(ADD) 및 주의력 결핍 과잉행동장애(ADHD)의 에 대한 랫트 모델이 사용된다(예를 들어, Hansen 등, 1999, 주의력 결핍 과잉행동장애의 동물 모델에서 알콜 반응성, 과잉행동 및 운동 침착성이 없는 운동, Psychopharmacology 146：1-9; 러셀, 2002, Behavioral Brain Res.130：191-196). 예를 들어 러셀은 ADHD에 대한 유전자의 모델인 자발적으로 고혈압 랫트 모델을 개재하였다. 그러한 모델 모델 동물계가, 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로에 대한 그들의 효과로 인하여 ADHD 치료에 유용한 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서는 통증의 동물 모델이 사용된다(예를 들어, O'Callaghan 등, 1975, 수정된 열판 과정에 의한 마취제 길항제의 진통제 활성의 정량화, J. Pharmacol Exp Ther 192：497-505;Guarna 등, 2002, J. Neurochem. 80:271-277; Menendez 등, 2002, 일방향 열판시험：마우스에서 중추 및 말초 통각 과민을 검출하는 단순하고 변형된 방법, J Neurosci. Methods 113：91-97).Guarna 등은 급성 열외상수용(themonociception)에 대한 마우스 모델을 개시한다. Menendez 등은 중추 및 말초 과잉마취에 대한 마우스 모델을 개재한다. 그러한 모델 동물계는 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로에 대한 그들의 효과로 인하여 통증 치료에 유용한 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 중독(예, 코카인 중독)의 랫트 모델이 사용된다(Caine, 및 Koob, 1995, 도파민 작용제 7-0H-DPAT로 전처리가 랫트의 여러 다른 스케줄 하에서 코카인 자기 투여 공여량-효과 기능을 왼쪽으로 옮긴다. Behav. Pharmacol 6：333-347; Orsini 등, 2002, Brain Research 925：133-140). 그러한 모델 동물계는 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로에 대한 그들의 효과로 인하여 의약 남용이나 중독 치료에 유용한 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서는 간질의 동물 또는 조직 모델이 사용된다(예를 들어, Paschoa 등, 1997, 실험적인 간질의 흥분의 발작 패턴 및 피질성의 자극 모델, Brain Res.770：221-227; Kokaia, 1995, Exper.Neurol.133:215-224; Merlin, 1999, J. Neurophysiol. 82: 1078-1081; Merlin, 2001, J. Neurophysiol. 87:621-625). Kokaia(1995, Exper. Neurol. 133:215-224)는 간질 마우스 모델을 개재하였다. Merlin(2001, J. Neurophysiol. 87:621-625)은 간질의 귀니아피그 해마 슬라이스 모델을 개재한다. 그러한 모델 동물 또는 조직은 도파민 D 1 세포내 신호전달 경로에 대한 그들의 효과로 인하여 간질 치료에 유용한 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
또 다른 실시예에서는 동물 모델은 동종접합성의 DARPP-32 넉아웃 마우스이다(Fienberg 등에 의해 1998년 7월 7일 등록된 미국특허 5,777,195; Nishi 등에 의해 2000년 1월 11일 등록된 미국특허 6,013,621호; 및 Fienberg 등에 의해 1998년 , Sci 281:838-842; 각각은 레퍼런스에 의해 여기에 삽입됨). 일 실시예에서 그 동종접합성의 DARPP-32 넉아웃 마우스는 PDE1B 활성을 조절하는 후보 약제를 증명 또는 확인하기 위해 부가적인 실험이나 분석에 사용될 수 있다. 특정 실시예에서 그 증명은 Nishi 등(2000년 1월 11일 등록된 미국특허 6,013,621호)에서 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. PDE1B 활성을 조절하는 그러한 약제가 동정된 때, DARPP-32 넉아웃 마우스 내에 그러한 약제의 존재 또는 투여는 상기 약제의 부존재 또는 비투여에 비하여 cAMP 반응 엘레먼트 결합 단백질(CREB), AMPA 수용체(예를 들면 GluRl AMPA 수용체), cAMP, cGMP, PKA, PKG, PP-2B, PP-l, 칼슘 채널, Na/K ATPase 및 NMDA 수용체의 활성화 크기를 감소해야 한다.
5.6 약학 조성물 및 제재
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 본 발명의 약제(또는 약 또는 화합물)의 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 PDE1B 활성을 조절 및 PDE1B 관련 및 도파민 D 1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 포함하나 이에 한정되지 않는 이상을 치료하는 약학 조성물을 포함한다. 일 실시예에서 정상 기능의 감소는 상기 리스트된 질병 또는 이상(예를 들어 파킨슨 병)의 표현형의 발생을 야기하므로 PDE1B 활성의 증가 또는 도파민 D 1 수용체 세포내 신호전달 경로의 다운 스트림 성분의 활성화는 그러한 이상의 증상을 나타내는 인간의 증상을 완화할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 그 증상을 나타내는 환자 또는 대상에서 PDE1B 관련 이상 및 도파민 D 1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 증상을 완화할 수 있는 약제를 투여하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서 어떤 이상(예를 들어 파킨슨 병)의 증상은 PDE1B 활성의 레벨을 감소시켜 완화될 수 있다. 다른 실시예에서 상기 이상의 증상은 PDE1B 활성의 레벨을 증가시켜 완화될 수 있다.
본 발명은 상기에서 본 발명의 약제 또는 약 화합물의 약학 조성물을 제공한다. 상기 약제, 약, 또는 화합물 또는 그들의 생리적으로 수용가능한 염 및 용매화 화합물은 주사, 경구, 국소, 비내(nasal), 흡입, 입 또는 코를 통한 취입(insufflation), 구강(buccal), 비경구, 직장 투여 또는 그 외 종류의 투여를 위해 제재화될 수 있다. 본 발명은 유효량의 본 발명의 약제와 약리학적으로 수용가능한 희석액, 방부제, 가용화제, 유화제, 아쥬반트, 부형제 및/또는 캐리어를 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 여러 버퍼 (예를 들면 Tris-HCI, 초산염, 인산염), pH 및 이온 강도의 희석액; 데타젠트 및 용해제(예를 들면 Tween 80, Polysorbate 80), 항산화제(예를 들면 아스코르빈산, 스디움케타바이설화이드), 방부제(예를 들면 씨메로살(Thimerosal), 벤질알코올) 및 벌킹 물질(예를 들면 락토스, 만니톨)과 같은 첨가물을 포함한다.
본 조성물은 폴리락틱 에시드, 폴리클리코릭 에시드 등 또는 리포좀과 같은 폴리머 화합물의 특정 조제물로 상입될 수 있다. 히알론산도 사용될 수가 있다. 생리적합 흡수성 폴리머들을 락타이드(그것은 D, L, 락틱 에시드 및 D-, L- 메소 락타이드를 포함), 그리코라이드(그리콜릭 산을 포함하는 것),ε-카르포락톤, p-다이오사논(미국 특허 제 4,052,988호에 개시되는 1,4-dioxan-2-one), p-dioxanone의 알킬 대체된 유도체(미국 특허 제 5,703,200호에 개시되는 6,6-디메틸 l , 4-dioxan-2-one), 트리에틸렌 카르보네이트(l, 3-dioxan-2-one), 1,3-dioxanone의 알킬 대체된 유도체(미국 특허 제 5,412,068호에 개시), 델타-바레로락톤(valerolactone), beta-부틸올락톤(butyrolactone), 감마-부틸올락톤,ε-데카라톤(decala tone), 하이드록시부티레이트, 하이드록시바레레이트
(hydroxyvalerate), 1,4-dioxepan-2-one(미국 특허 제 4,052,988호에 개재 및 그 다이머 1,5,8,12-tetraoxacyclotetradecane-7, 14 dione), 1,5-dioxepan-2-one의 호모폴리머 및 코폴리머 및 그것의 폴리머 브렌드를 포함하나 이에 한정되지 않는 아리패틱 폴리에스테르, 코 폴리머 및 브렌드으로 구성된 군으로부터 선택된다.
그러한 조성물은 본 발명의 단백질 및 유도체의 인 비보 정화의 속도 및 인비보 방출 속도, 물리적 상태, 안정도에 영향을 줄 수 있다. 레민톤의 Pharmaceutical Sciences, 제18판(1990, Mack Publishing사, Easton, PA 18042) 페이지 1435-1712)참조. 본 조성물은 액체나 동결건조된 형태와 같은 건조된 파우더로 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 것은 레민톤의 Pharmaceutical Sciences, 제18판(1990, Mack Publishing사, Easton, PA 18042) 제 89장에 일반적으로 기재된 경구용 고체 제형이다. 고형물 제형은 정제, 캡슐, 필, 트로키(troch) 또는 마름모꼴정제(lozenge), 카시제(cachet) 또는 펠렛(pellet)을 포함한다. 또 리포좀 또는 프로테이노이드·캡슐화법은 현재의 조성물을 제재화하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 프로테이노이드 마이크로스페어는 미국 특허 제 4,925,673호에 보고된 것과 같이). 치료적으로 가능한 고형물 형태에 대해서는 마샬, K에 의해 G.S. Banker 및 C.T. Rhodes에 의해 편집된 Modern Pharmaceutics 제10장, 1979에 기재되어 있다. 일반적으로 제재화는 상기 약제와 비활성 성분을 포함할 것이다(위에서는 보호작용을 가지고 장에서는 생리적으로 할성 물질의 분비를 하게 만드는).
완전한 위 저항성을 확보하기 위해 적어도 pH 5.0에서 흡수되지 않는 코팅이 사용된다. 장 코팅으로 사용되는 더 통상적인 비활성 성분은 예는 셀룰로스 아세테이트 트리멜리테이트(CAT), 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트(HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트(PVAP), 유드라짓 L3OD, 아쿠아테릭, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트(CAP), 유드라짓 L,유드라짓 S 및 셀락(Shellac)이다. 이들 코팅들은 혼합된 필름으로 사용될 수 있다.
코팅 또는 코팅의 혼합물은 또 위에서 보호 목적이 아닌 정제에도 사용될 수 있다. 이것은 슈가 코팅 또는 정제를 삼키기 용이하게하는 코팅을 포함할 수 있다. 캡슐은 건조 약제(즉 파우더)의 운반을 위한 젤라틴 같은 단단한 껍질을 구성할 수 있고; 액제 형태에 대해서는 연질 젤라틴 껍질이 사용될 수 있다. 카시제의 껍질 재료는 두꺼운 전분 또는 다른 식용의 페이퍼이 가능할 수 있다. 필, 마름모형 정제, 성형된 정제 또는 정제 분말용으로는 모이스트 매싱(moist massing) 기술이 사용될 수가 있다.
상기 치료제는 그래뉼 또는 펠렛 형태에서 순수한 멀티 미립자로서 제재에 포함될 수가 있다. 캡슐 투여를 위한 물질의 제재는 분말, 가볍게 압축된 플러그 (plug) 또는 심지어 정제로 사용될 수 있다. 사기 치료제는 또 압축에 의해 제조될 수가 있다.
안료 및 향료는 모두 포함될 수가 있다. 예를 들어, 단백질 (또는 유도체)은 제제화될 수가 있고(예를 들어 리포좀 또는 마이크로스피아 캡슐화법에 따라) 그 다음에 안료 및 향료를 포함하고 있는 냉장된 음료와 같은 식용 산물내에 더욱 포함될 수 있다.
하나는 희석될 수 있고, 비활성 물질 또는 충전제에 의해 치료제의 체적을 증가할 수 있다. 이러한 희석액 또는 충전제는 탄수화물, 특히 만니톨, a-락토스, 무수 락토스, 섬유소(예를 들면 미결정성 섬유소), 슈크로스, 칼슘 수소 인산염 변형된 덱스트란 및 전분을 포함할 수가 있다. 또 칼슘 3 인산염, 탄산마그네슘 및 염화 나트륨을 포함하는 일부 무기 염은 충전제로 사용될 수 있다. 일부 시판 희석액은 Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress 및 Avicell이다.
정제분해물질(disintegrant)는 고체상 약제 형태로 치료제를 제형화하는데 포함될 수가 있다. 정제분해물질로 사용되는 물질은 전분(예를 들면, 감자 전분 또는 전분, Explotab)에 기초한 시판 정제분해물질)을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것은 아니다. 나트륨 전분·글리콜산염, Amberlite, 스디움 카복시메틸 셀룰로오스, 울트라밀로펙틴(ultramylopectin), 알긴산나트륨, 젤라틴, 오렌지 껍질, 산 카복시메틸 셀룰로오스, 천연 스펀지 및 벤토나이트가 모두 사용될 수가 있다. 다른 형태의 정제분해물질은 불용성 양이온 교환 수지이다. 분말상의 껌질이 정제분해물질로서 결합제로서 사용될 수가 있고, 이것들은 한천, Karaya 또는 트라가칸타(tragacanth)와 같은 분말상의 껌질을 포함할 수가 있다. 알긴산 및 그 나트륨 염도 정제분해물질로 유용하다.
결합제는 경질 정제를 형성하기 위해 상기 치료 약제를 결합하는데 사용될 수 있고 아카시아, 트라가칸타, 전분(예를 들어 프리젤라틴화된 옥수수 전분) 및 젤라틴과 같이 천연 물질에서 온 물질을 포함한다. 다른 것은 메틸 셀룰로오스(MC), 에틸 셀룰로오스(EC), 그리고 카르복실메틸 셀룰로오스(CMC)를 포함한다. 폴리비닐 피롤리돈(PVP) 및 하이드록프로필메틸(hydroxypropylmethyl) 셀룰로오스(HPMC) 모두가 치료제를 과립화하기 위해 알코올 용액에서 사용될 수가 있다.
제재화 과정에서 붙는 것을 방지하기 위해 항-마찰제(anti-frictional agent)가 상기 치료제의 제재에 포함될 수가 있다. 윤활제가 상기 치료제와 그 다이(die) 벽 사이에 층에 사용될 수가 있고 이것들은 그 마그네슘 및 칼슘 염을 포함하는 스테아릭산, 폴리 테트라 플루오르 에틸렌(PTFE), 유동 파라핀, 식물유 및 왁스, 활석(talc) 및 실리카를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 라우릴(lauryl) 황산나트륨, 마그네슘 라우릴 황산 에스테르, 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜, Carbowax 4000의 및 6000과 같은 가용 윤활제도 사용될 수가 있다.
압축 중에 재배열을 돕고 제재화 동안 상기 약제의 흐름 성질을 개량할 수가 있는 활제(glidants)가 첨가될 수가 있다. 상기 활제는 전분, 활석, 발열성 실리카및 수화된 실리코알루마네이트를 포함할 수가 있다.
수용성 환경으로 상기 치료제의 용해를 돕기 위해, 계면활성제가 습윤제로 첨가될 수가 있다. 계면활성제는 음이온 세제(예를 들면 나트륨 라우릴 설페이트, , 다이옥틸 나트륨·술포숙시네이트 및 디옥틸·나트륨·설폰산 에스테르)를 포함할 수가 있다. 양이온 활성제는 사용될 수 있고, 벤자르코니움(benzalkonium) 염화물 또는 벤제토니움(benzethonium) 염화물을 포함할 수가 있다. 계면활성제로서 제재에 포함될 수가 있는 잠재적인 비이온성의 디터젠트의 리스트는 라우로마크로골(lauromacrogol) 400, 스테아린산포리오키실 40, 폴리오시에틸렌(polyoxyethylene) 하이드로게네이트된 카스톨(castor) 오일 10, 50, 및 60, 글리세롤 모노스테아린산, 포리솔베이트 40,60,65 및 80, 슈크로스 지방산 에스테르, 메틸셀룰로오스 및 카복시메틸 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는 상기 단백질 도는 그것의 유도체 또는 다른 비율의 혼합물의 제제에 존재할 수 있다.
잠재적으로 약제의 섭취를 증가시키는 첨가제는 예를 들어 지방산 올레인산, 리놀산 및 리노렌산이다.
조절되는 방출 구강 제재가 바람직할 수 있다. 상기 약제는 확산이나 거르기(leaching) 기작에 의해 방출을 가능케하는 비활성 매트릭스, 예를 들어 검으로 들어갈 수 있다. 천천히 축퇴하는(degenerating) 매트릭스도 제재에 들어갈 수 있다. 일부 장용 코팅은 또 지체되는 분비 효과를 갖는다.
이 약제의 또 다른 조절 분비의 형태는 Oros 약제 계(Alza사)(즉 그 약을 반투막에 감싸서 삼투 효과에 의해 물이 들어오게하고 그 약제는 단일 작은 개구부를 통해 밀어 낼 수 있는)에 근거한 방법에 의하였다.
다른 코팅이 이 제제에 사용될 수 있다. 이것은 코팅 팬에 적용할 수 있는 다양한 종류의 슈가를 포함한다. 그 치료 약제는 필름 코팅된 정제로 주어질 수 있고 이 예에서 사용된 그 물질은 두 군으로 나눈다. 첫째는 비장용성 물질이고 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 메틸하이드록시-에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필-메틸셀룰로오스, 소디움 카르복시-메틸셀룰로오스, 프로피돈 및 폴리에틸렌 글리콜이다. 둘째는 통상 프타르산(phthalic acid)의 에스테르인 장용성 물질로 구성된 군이다.
적정 필름 코팅을 제공하기 위해 물질의 믹스가 이용될 수가 있다. 필름 코팅은 팬-코터(coater) 또는 유동(fluidized) 베드 또는 압축 코팅에 의해 수행될 수가 있다.
경구투여를 위한 액체 제재물은 예를 들어 용액, 시럽 또는 현탁의 형태를 취할 수가 있거나 사용전 물 또는 다른 적당한 운반수단을 갖는 구성을 위해 건조 산물로 나타낼 수 있다. 그렇나 액체 제재물은 현탁제(예를 들면 솔비톨·시럽, 셀룰로오스 유도체 및 수소 부가된 식용지방); 유화제(예를 들면 레시틴 또는 아카시아); 비수용 운반수단(예를 들면 아몬드유, 유성의 에스테르, 에틸 알코올 또는 분획된 식물유);그리고, 방부제∥(예를 들면 메틸 또는 프로필- p-하이드록시 벤조에티트, 또는 솔빈산)과 같은 약리학적으로 수용가능한 첨가제로 통상의 수단에 의해 제조될 수 있다. 그 조제물은 버퍼 염, 항료, 안료, 감미료를 적당량 포함할 수 있다.
상기 약제의 비내 전달도 가능하다. 비내 전달은 허파에 상기 산물의 축적의 필요없이 상기 치료 산물을 코로 투여한 후에 그 단백질의 혈관으로의 이동을 가능케한다. 비 절달 조성은 덱스트란 또는 사이크로덱스트란을 갖는 것을 포함한다.
흡입에 의한 투여를 위해 본 발명의 용도의 화합물은 한 적절한 추진체(propellant)(예를 들어 다이클로로다이후루로메탄 (dichlorodifluoromethane), 트리클로로후로로메탄, 다이클로로테트라후루로메탄, 이산화탄소, 또는 적당한 가스)를 사용하여 가압된 팩으로부터 온 에어로졸 분무 프레젠테이션 또는 분무기의 형태로 통상적으로 운반될 수 있을 것이다. 압축된 에어로졸의 경우 그 용량 단위는 미터로 측정해진 양을 운반하기 위한 밸브를 제공하여 결정될 수가 있다. 흡입자 또는 취입기(insufflator)에 이용되는 젤라틴과 같은 캡슐 및 카트리지는 상기 화합물과 적절한 분말 베이스(예를 들면 락토스 또는 전분)의 분말 혼합을 포함하여 제재화될 수 있다.
대량 순간 투여 또는 연속 주입과 같은 주사에 의한 비경구투여용으로 상기 화합물을 제재화될 수가 있다. 주사용 제재는 첨가 방부제를 갖는 예를 들면, 앰플 또는 멀티 공여량 용기 내의 단위 형태내에 나타날 수가 있다. 상기 조성물은 현탁, 용액 또는 오일 또는 수용성 담체내의 에멀젼과 같은 형태로 섭취될 수 있고 현탁, 안정 및/또는 분산제와 같은 제재화제를 포함할 수 있다. 대안적으로 그 활성 성분은 사용전에 예를 들어 살균된 병원체 없는 물과 같은 적당한 운반수단으로 구성하기 위한 파우더 일 수 있다.
그 화합물들은 예를 들어 코코아버더 또는 다른 글리세라이드와 같은 통상의 좌약 베이슬르 포함하는 좌약 또는 체류 관장제와 같은 직장투여용 조성물로 제제화될 수 있다.
상기 개재한 상기 제재외에도 상기 화합물들은 디포트(depot) 제재로 제재화될 수 있다. 그러한 장기 작용하는 제재들은 착상(예를 들어 피하, 또는 근육내) 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 이와 같이 예를 들어 화합물은 적절한 폴리머 또는 소수성 물질들(예를 들어 수용가능한 오일내의 에멀젼으로) 또는 이온교환 수지 또는 예를 들어 관대한 가용성 염과 같은 관대한 가용성 유도체로 제제화될 수 있다.
그 조성물들은 필요에 따라 상기 활성성활성 성분을 포함하고 있는 하나 이상의 유니트제형을 포함할 수가 있는 팩 또는 디스팬서 장치에 나타날 수가 있다. 상기 팩은 예를 들면 금속 또는 플라스틱박(예를 들면 블리스터 포장)을 포함할 수 있다. 사기 팩 또는 디스팬서 장치에는 투여를 위한 지시를 수반할 수 있다.
5.6.1 용량 결정(DOSAGE DETERMINATION)
그러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 LD50(50%의 군에 치사량) 및 ED50(50%의 군에 치료적으로 효과적인 양)을 결정하는 것과 같은 세포 배양 또는 실험동물에서의 표준 약제 절차에 의해 결정될 수가 있다. 독성 및 치료적 효과간의 용량비는 치료 계수이고, 그것은 LD50/ED50 비로서 나타내질 수가 있다. 큰 치료 인덱스를 나타내는 화합물들이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물이 사용될 수가 있는 반면에 비감염 세포에 잠재적인 피해를 최소화하고 그것에 의해부작용을 감소하기 위해 환부 조직의 부위에 이런 종류의 화합물을 표적하는 운반 시스템을 디자인하기 위해 신중함을 필요하게 된다.
세포 배양 분석 및 동물 실험으로부터 얻을 수 있는 데이터는 인간 용도를 위해 용량의 범위를 결정하는데 사용될 수가 있다. 그러한 화합물의 용량은 독성이 없거나 거의 없는 ED50값을 포함하는 순환 농도 범위내인 것이 바람직하다. 그 용량은 사용되는 투약 형태에 따라 이 범위내에서 변할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 어떠한 화합물에 대해서 치료적으로 유효량은 세포 배양 분석으로부터 처음으로 추정될 수가 있다. 공여량은 세포배양에서 결정한 것과 같이 IC50값(증상의 최대 저해의 1/2을 달성하기 위한 실험 화합물의 농도)를 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서 제재화될 수 있다. 그러한 정보는 인간에게 유용한 용량을 보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 혈장에서 레벨은 고성능 액체 크로마토크래피(HPLC)에 의해 측정될 수가 있다.
5.6.2 투여의 경로
본 발명의 치료 조성물의 성분 또는 성분들은 비경구, 국소, 예를 들어 경구, 비내, 직장과 같은 점막내(transmucosally) 또는 경피내 투여될 수 있다. 바람직하게는 예를 들면 정맥 주사와 같은 비경구 투여이고, 소동맥, 근육내, 경피내, 피하내, 복강내, 심실내(intraventricular) 및 두개골내를 포함하지만 이에 한정되지 않는 투여이다. 바람직한 실시예에서 본 발명의 치료 조성물의 성분 또는 성분들은 경구 또는 비경구로 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 약제(약 또는 화합물)는 혈액-뇌 관문을 가로지르고 더욱 바람직하게는 용이하게 통과하여 예를 들어 경구, 비경구 또는 정맥내 투여를 가능케 할 수 있다. 대안적으로 상기 약제는 혈액-뇌 관문을 가로지르거나 전달될 수 있게 하기 위해 변형될 수 있거나 변화할 수 있다. 분자의 소수성을 증가시키고; 분자를 트랜스퍼링 또는 도코사헥사엔산(docoshexaenoic acid) 등과 같은 혈액-뇌 관문내의 수용체에 타겟되는 담체에 컨쥬게이트로 넣는 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 혈액­뇌 장벽을 통과할 수 있는 분자에 대한 많은 전략이 당업계에 공지되어 있다.
또 다른 실시예에서는 본 발명의 약제는 약제를 투여하기 위해 두개골에 작은 구멍을 뚫는 표준 과정을 거쳐서 투여된다.
또 다른 실시예에서는 분자는 두엽내 더욱 바람직하게는 뇌실내에 투여된다.
또 다른 실시예에서는 혈액­뇌 관문의 삼투 파괴(disruption)가 뇌로 상기 약제를 운반을 효과적으로 하기 위해서 사용될 수 있다(Nilaver 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92：9829-9833(1995). 다른 실시예에서 약제는 혈액­뇌관문으로 타겟되는 리포좀내에서 투여될 수가 있다. 리포좀의 약제의 투여는 공지되었다(Langer 등(Science 249:1527-1533)：Treat 등, 감염성 질병 및 암의 치료에서 리포좀, 로페스-베레스테인(Berestein) 및 피들러(Fidler), Liss, New York, pp. pp. 317-327 및 353-365(1989)). 이런 종류의 모든 방법은 본 발명에서 생각될 수 있다.
비록 일부 예측이 혈액-뇌 관문을 통과하는 분자의 능력에 관해 만들어졌음에도 불구하고, 이러한 예측은 고작해야 이론적이다. 뇌 속으로 화합물이 들어가는속도 및 양은 분배계수, 이온화 상수 및 분자의 크기에 의해 결정된다고 일반적으로 생각된다. 비록 옥타놀(octanol) 수계가 특별한 주의를 받았지만, 뇌 투과에 대한 일반적으로 적용될 수 있는 모델로서 단일 분배 용매계가 나타난 것이 없고, Hansch 및 공동 연구자는 이 계에서 약 100의 분배 계수가 중추신경계(CNS)로 들어가는데 적합하다고 제안하였다(Glave 및 Hansch, J. Pharm. Sci. 61:589(1972); Hansch 등, J. Pharm. Sci. 76:663(1987)). 실제로 옥타놀-물 분배 시스템만이 혈액-뇌 관문을 통과하는 화합물의 능력을 정성적으로 표시하는것을 제공하였다. 예를 들어 공지된 히스타민 H2 수용체 길항제의 비교는 그들의 뇌 투과 및 옥타놀 물 분배계수사이에는 그러한 단순한 상관관계가 없다는 것을 제안한다.(Young 등, J. Med. Chem. 31:656(1988)). 옥타놀-물 분배계수외에 다른 인자들이 혈액-뇌 관문을 통과하는 경향에 영향을 준다. 혈액-뇌 관문을 통과하는 히스타민 H2 수용체 길항제의 능력의 비교는 뇌 통과는 한 화합물의 전체 수소 결합 능력이 감소함에 따라 증가한다고 제안한다(Young 등, J. Med. Chem. 31:656(1988)). Begley 등(J. Neurochem.55：1221-1230(1990), 여기에 레퍼런스로 삽입)은 혈액-뇌 관문을 통과하는 사이크로스포린 A의 능력을 개재하였다. Begley 등에 의해 사용된 방법은 (1)삼중수호화된 약제 화합물에 대한 방정식으로 뇌 업테이크 지수(BUI)를 측정: BUI=[(뇌3H/뇌14C)/(인젝트된3H/인젝트된14C)X 100, 여기서14C 레퍼런스 화합물은 C 부탄올 또는 유사 용매;(2) 뇌 퍼후젼 실험; (3) 정맥내 대량 주사 실험; 및 (4) 배양된 뇌 모세혈관 내피(endothelium) 실험을 포함한다.
또 다른 실시예에서는 상기 치료제는 베시클 특히 리포좀으로 운반될 수 있다(Langer 등 Science 249:1527-1533(1990)：Treat 등, 감염성 질병 및 암의 치료에서 리포좀, 로페스-베레스테인(Berestein) 및 피들러(Fidler), Liss, New York, pp. pp. 317-327 및 353-365(1989)). 그것의 전신성 부작용을 줄이기 위해 이것은 그 약제를 투여하는 방법에 바람직할 수 있다.
또 다른 실시예에서는 사기 치료제는 조절된 방출 시스템에서 운반될 수가 있다. 예를 들어 상기 약제는 정맥내 주입제, 이식 가능한 삼투 펌프, 경피성의 패치, 리포좀 또는 투여의 다른 모드를 사용해 투여될 수가 있다. 일 실시예에서는 펌프가 사용될수가 있다(상기 Langer ; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14：201(1987);Buchwald 등, Surgery 88：507(1980); Saudek 등, N. Engl.J. Med. 321：574(1989) 참조). 또 다른 실시예에서는 폴리머 물질이 사용될 수 있다(조절된 방출의 제약 적용, Langer 및 Wise(편집), CRC 출판사)：보카 라톤, 플로리다 (1974)); 조절된 약 생리이용성, 약 생산물 디자인 및 수행, Smolen 및 Ball(편집), Wiley：뉴욕(1984); Ranger 및 Peppas, J. Macromol. Sci.Rev.Macromol. Chem. 23: 61(1983); 또, Levy 등, Science 228：190(1985)); During 등 Ann. Neurol. 25: 351(1989; Howard 등, J. Neurosurg. 71: 105(1989)를 참조). 또 다른 실시예에서 조절된 방출 시스템은 치료 타겟(즉 뇌)의 부근에 놓여질 수가 있어서 전신 용량의 일부만이 필요할 수 있다(예를 들어, Goodson, 조절된 방출의 제약 적용 제2권, pp. 115-138(1984) 참조). 다른 조절된 방출계는 Langer((Langer 등 Science 249:1527-1533(1990))에 의한 리뷰에서 언급되었다.
하기 실험적 실시예는 비한정적으로 제공된다.
실시예1: 포스포다이에스터레이즈(PDE) 1B 넉아웃 마우스는 도파민 작용제에 대해 과장된 운동 과잉행동 및 DARPP-32 인산화를 나타내고, 손상된 공간 학습을 나타냈다
이 실시예는 PDE1B에 의해 매개되는 환상 뉴클레오타이드의 불활성화에 의한 환상 뉴클레오타이드 신호의 증가는 DARPP-32 및 관련된 신호전달 경로를 통한 도파민 작용성 기능에서 중요한 역할을 하는 것을 나타낸다.
상동적 재조합을 사용해 활성을 포스포다이에스터레이즈-매개되는 (PDE1B) 환상 뉴클레오타이드 가수분해 활성이 부족한 마우스를 제조하였다. PDE1B -/- ("null") 마우스는 급성 D-메타엠페타민 투여의 후 과장된 과잉행동을 보였다. PDE1B -/- 마우스에서 온 선조체(striatal) 슬라이스는 도파민 D1 수용체 작용제 또는 포르스코린(forskolin) 자그 후 증가된 레벨의 phospho-Thr34 DARPP-32 및 포스포 Ser845 GluR1의 증가된 레벨을 나타냈다. PDEIB-/- 및 PDEIB +/-(이형접합성의) 마우스는 모리스 미로 공간 학습 결핍을 나타냈다.
6.1. 재료 및 방법
6.1.1. PDE1B 넉아웃 마우스
PDE1B 유전자의 엑손2-13에 해당하는 두 오버래핑 클론인 TRC2 및 TRC4, 을기재된(Reed, T.R.등 1998.Mamm. Gen. 9：571-579) 바와 같이 I-129/SvJ Lambda Dash II 마우스 지노믹 라이브러리를 스크리닝하여 얻었다. 엑손 4 및 5 및 pBluescript II KS(-)의 멀티플 클로닝 사이트의 일부(스트라타진사, La Jolla, CA)를 포함하는 0.8 kb의 XbaI 절편을 타켓팅 벡터의 BamHI 부위에 브런트 엔드 라이게이션하였다. 엑손 13에 2.4 kb의 비코딩 서열 3'을 포함하는 엑손 9의 지노믹 DNA 3'을 포함하고 있는 5 kb의 AccI/KpnI 절편은 타켓팅 벡터의 ClaI 부위에 브런트 엔드 라이게이션하였다(도 1A 참조). 타겟 벡터 골격 pGKKOV는 Li 등에 으해 기재되어 있었다(1996.EMBO J 15：714-724). 이 벡터는 각각 멀티플 클로닝 사이트의 KpnI 및 HindIII 부위에 삽입된 HSV-TK 선택 가능한 마커 및 PGK-HPRT 선택 가능한 마커를 갖는 pBluescript II SK(+)에서 유래한다. 삽입체의 방향은 시퀀싱에의해 결정된다.
타겟팅 벡터(50㎍)은 NotI으로 리니어라이즈하고, 9.3×106의 E14TG2a 배아 줄기(ES) 세포로 일렉트로포레이드(electroplate)하였다. ES세포 자격이 주어진 15% ES 세포용 소 태아 혈청(Life Technologies,Carlsbad, CA), 0.3mM L-글루타민,75,000의 유니트의 Pen/Strep, 60유니트의 LIF 및 선택 과정을 위해 2μM의 Cytovene 및 1X HAT(Life Technologies,Carlsbad, CA)가 공급된 0.009% 베타-메캅토에탄올을 포함하는 플레이트 당 10 ml의 DMEM내에 2.2×106마이트마이신 C-처리된 마우스 배아 섬유아세포상의 10개의 100cm 조직배양 플레이트에 ES 세포를 플레이트하였다. 5일의 선택 후에 302 ES세포 클론을 선택하고 24 웰의 플레이트에 대해 폈다. 클론은 서던 블롯 분석에 의해 스크리닝하였다. 2개의 포지티브 클론으로부터 온 세포는 C57Bl/6 낭포(blastocyst)에 삽입하고 가임신된 암컷에 이식하였다. 키메릭 후손은 합계 3 역교배 번식을 구지 위해 두 부가적인 세대를 위한 C57Bl/6 마우스(Charles River, Wilmington, MA)를 자라게 하는 이종 접합체 후손을 생산하는 C57Bl/6 마우스로 자랐다. 혈통간(inter-breeding) 제3대에서 온 후손이 행동 실험에 사용되었다.
행동 테스트에 대해, 아이를 낳지 않는(nulliparous) 제4대(F4) PDE1B가 결손된 마우스 및 그들의 야생형 한 배에서 태어난 메이트가 사용되었다. 생화학에 사용된 동물들은 제3대 및 4대 역교배의 후손이었다. 마우스는 생후 7일(P7)이라고 귀에 표시하였고, P7에서 시작하여 매주 체중을 재어 Pl12에 끝마쳤다. 꼬리 생검은 P21 또는 P42에 얻을 수 있었다. 한 배에서 태어난 것은 P28에 이유(wean)했다. 마우스는 케이지에 대해 2-4 마우스씩 같은 성별은 각각 케이즈에서 키웠다. 개별 마우스는 만약 같은 성별의 같은 배에서 나온 것이 아니든지 시각상 결합이 존재한다면 실험에서 배제하였다. 모든 과정은 실험의 마지막까지 유전형에 대해 모르는 같은 실험자에 의해 수행되었다.
6.1.2 서던 블럿 분석
서던 블롯 분석이 Reed(1998, Mamm. Gen. 9：571-576)에 기재된 바와 같이 ES세포 또는 꼬리 생검으로부터 정제된 StuI 또는 NdeI/KpnI-처리된 DNA에 대해 수행되었다. 간단하게는 프레하이브리다이제이션 및 하이브리다이제이션은 1%의 SDS,1M의 NaCl, 및 10%의 덱스트란 설페이트내에서 65℃에서 수행되었다. 블럿은 마우스 PDE1B 엑손 3 및 164bp의 프랜킹 인트론 서열에 해당하는 347 bp의 PCR- 생성된 프로브로 스크리닝하였다. 사용된 PCR 프라이머는 5'-GACACTAAGTGGGTATAGCTGGGT-3'(SEQ ID NO：5), 및 5'-GTGGGAATAAGTCTCAGGGTAGG-3'(SEQ ID NO：6)이었다. 25 ng의 프로브는 Prime-It II 키트(스트라타진사)로 랜덤 프라이밍하여32P-dCTP로 방사성 동위원소로 표지하였고, 5mg/500㎕ 연어 정액 DNA로 5분 동안 가열하고 30 ml의 하이브리다이제이션 버퍼를 첨가하였다. 블롯은 12-16시간 동안 교잡하고 최종 포스트하이브리다이제이션 세척은 2 X SSC + 1%SDS 내에서 65℃에서 수행하였다. 상기 프로브는 PDE1B 유전자의 타겟된 지역의 바깥쪽에 있다. 상동적 재조합은 3.7에서 2.2 kb(StuI)(도 lA, B 참조) 및 3.7에서 10.6 kb(NdeI/KpnI)로(도 lA 참조) 크기의 이동을 야기한다.
6.1.3 노던 블럿 분석
전체 뇌 RNA를 TriReagent 방법(Molecular Research Center, 신시내티, OR)을 사용해 분리하였다. RNA(10㎍)는 1%의 변성 아가로스 겔에서 분획되었고 20 X SSC를 사용하여 나일론 막상에 24시간 트랜스퍼하였다. 그 블럿은 50%의 포름아마이드, 50 mM의 NaP04, 5 X SSC, 5 X Denhardt's, 0.5%의 SDS, 및 1% 글라이신을 갖는 10 ml의 용액에서 250㎕의 10mg/ml의 연어 정액 DNA로 42℃에서 4시간 프레하이브리다이제이션하였다. 상기 블럿은32P- 표지된 프로브 K-17, Repaske 등(1992. J. Bioi. Chem. 267：18683-18688)에 기재된 바와 같이 중앙 촉매 도메인에 해당하는348bp의 마우스 부분적 PDE1B cDNA로 교잡했다. 그 프로브는 100㎕의 10mg/ml의 연어 정액 DNA로 5분 동안 가열하고, 50%의 포름아마이드, 20 mM의 NaP04, 5 X SSC, 1 X Denhardt's, 0.5%의 SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 갖는 10 ml의 하이브리다이제이션 버퍼를 첨하가고 42℃에서 21시간 동안 배양하였다. 최종 포스트-하이브리다이제이션 세척은 O.1X SSC + 0.1% SDS에서 55℃에서였다.
6.1.4. 운동(LOCOMOTOR)활성의 측정
P50, P5I 또는 P52상에서, 운동활성은 X축을 따라 16 포토 탐지기-LED 쌍 및 Y축을 따라 16쌍을 갖는 30.5cm x 30.5 cm Digiscan 기구(모델 RXY2Z, Accuscan Electronics, 콜롬부스, OH)에서 측정되었다. 프리 챌린지 활성은 1시간 기간에 걸쳐 3분 간격으로 기록되었다. 마우스는 5ml/kg 체중의 주사 부피를 내기 위하여 식염수에 혼합된 1mg/kg d-메타엠페타민 염산(free base)의 피하 주사에 의해 챌린지되었고 활성은 3분 간격으로 추가적으로 2시간 동안 기록되었다. 수평 활성 및 전체, 중심, 가장자리(margin) 거리를 측정하였다.
6.1.5. 운동 활성 및 모리스 미로에서 학습 행동의 결정
P50에서 한 배에서 태어난 모든 동물들을 한 끝에 와이어 래더를 갖는 15×244cm의 스트레이트 물 채널로 4회 실험 투여하였다. 그 채널은 PVC 재료로 만들어졌고, 35cm 깊이의 27-29℃의 물로 채워졌다. 대상을 래더로부터 반대편에서 채널에 위치시키고 래더를 발견하고 빠져나가기 위해 최대 60초를 주었다. 이들 시험은 모리스 위터 미로 실험 전에 물로부터 빠져나오는 동기 및 수영 능력을 측정하는데 사용되었다. 두 한 배에서 태어난 마우스는 부족한 수영 능력 때문에 더 자세한 행동 테스트로부터 배제되었다.
모리스 워터 미로는 마우스를 위해 변형해서 사용된다(Upchurch, M.및 J.M.
Wehner. 1988. Behav. Gen. 18：55-68). 그 미로는 직경 162 cm 외측 탱크에 의해 둘러싸인 122 cm의 직경을 갖는 원형, 스텐레이스였다. 그 안쪽의 주변부는 균일한 흰 도료로 칠했다. 뚜명한 아크릴·플랫폼은 10x lOcm이며, 수면 1cm 아래에 넣었다. 흰 비독성 도료는 플랫폼을 위장하기 위해서 물에 첨가되었다. 물 온도는 27-29℃로 유지되었다. 한 배에서 태어난 것을 프랫폼 위치를 평형화하기 위해 두 군으로 나누었다. 실험은 P51로부터 시작되어 각각 숨겨진 플랫폼 포착 및 되돌아옴(반대 4분원(quadrant)로 이동된 플랫폼을 가지고)에 대해 6일씩 18일간 계속되었고, 신호된(cued) 학습을 나중에 하였다. 숨겨진 플랫폼 포착을 위해 플랫폼을 SE 또는 NW 4분원에 위치시키고, 시작 위치(N, S, E 또는 W)를 매 실험다다 랜덤 순서로 바꾸었다. 4번의 실험이 최대 60초의 시간 제한과 30초의 실험간 간격을 가지고 매일 주어졌다. 60초내에 플랫폼을 발견하지 못한 마우스는 30초 실험간 간격 동안플랫폼위에 놓았다. 프로브 실험(60초)은 포착 실험 전 3일날 주어졌고, 플랫폼이 가지고 마지막 포착 실험 후 6일날 제거되었다. 되돌아 옴(reversal) 양상을 위해, 반대편 4분원에 이동된 플랫폼을 가지고 같은 과정이 수행되었다. 신호된 학습을 위해 디스탈(distal) 큐를 불명료하게 하기 위해 미로 주위에 검은 커튼을 두르고, 플랫폼은 그 플랫폼 위에 14 cm의 놋쇠 막대 위에 올린 검은 고체 실린더(5x7 cm)에 의해 표시되었다. 하루 당 4번의 실험이 그 플랫폼을 가지고 주어졌고, 매 실험마다 시작 위치는 랜덤하게 위치하였다. 플랫폼이 다음 실험을 위해 위치하는 30초 실험간 간격 동안 마우스는 홀딩 케이지에 위치하였다. 데이터는 포착 및 되돌아 옴 양상을 위해 비데오 트래킹 시스템(San Diego Instruments, 샌디에고, CA)을 사용하여 기록되었다. 신호된 포착 잠재성은 휴대 타이머에 기록되어 폐회로 모니터로 관찰되었다.
6.1.6. 후각 오리엔테이션(OLFACTORY ORIENTATION)
각 한배에서 태어난 모든 후손인 P9, P11 및 P13은 전에 기재한 것과 같은 그들의 가정의 케이지 냄새에 후각 오리엔테이션 개별적으로 시험되었다(Acuff-Smith 등, 1992. Psychopharmacology 109：255-263). 각 한배에서 태어난(litter)것의 집 깔짚(bedding)을 P7으로 바뀌었다. 깔집은 P14에 대한 테스트가 완결된 후 다시 바꾸지 않았고 각 테스트 날 사용되었고, 그 다음에 집 케이지로 되돌아 갔다. 각 테스트 전에 새끼를 어미로부터 떼어내어 체온을 유지하기 위해 히팅 패트상의 홀딩 케이지에 놓았다.
선조체 슬라이스(STRIATAL SLICES)의 제조 및 처리
네오스티리아탈 슬라이스를 당업계에서 공지된 방법에 따라 (Nishi, A. 등, 1997, J. Neurosci. 17:8147-8155)에 따라, 수컷의 C57/BL6 마우스(생 후 6-8 주)로부터 제조되었다.
수컷 PDE1B-/-(null) 및 WT 마우스(8-12 주령)을 목을 베었다. 그 뇌는 급속히 아이스-콜드 표면으로 이동하고 블럭하고, 4℃로 유지되는 Vibratome(Ted Pella, Redding, CA)의 커팅 표면에 고정했다. 그 뇌를 다음과 같은 조성을갖는(mM)(125 NaCl, 5 KCl, 26 NaHC03, 1.5 CaCl2, 1.5 MgS04및 10 글루코오스, pH 7.4) 차가운, 산소를 포함하게 한(95%O2/5% 이산화탄소) 크렙스 바이카보네이트 버퍼에 담구었다. 두정(coronal) 마우스 뇌 절편(400㎛ 두께)들을 자르고 콜드 버퍼에 모았다. 스트리아탈 또는 핵 측(accumbens) 슬라이스를 해부 현미경하에서 두정 부분으로 부터 잘랐다. 각 슬라이스들은 30℃에서 15분 동안 신선한 버퍼내에 프리인큐베이션하고 추가적으로 30분 동안 프리인큐베이션을 계속하였다. 이 두번째 프리인큐베이션 말미에 버퍼를 크렙스 버도 또는 테스트 물질을 갖는 버퍼로 5분 동안 대체하였다. 슬라이스들을 액체 질소로 급속히 냉동하여 분석 때까지 -80℃에서 저장하였다.
6.1.8. 면역블럿팅
동결된 슬라이스를 1% SDS를 갖는 균질화 버퍼내에서 소니케이션하였다. 작은 앨러쿼트(aliquot)의 균질물은 스탠다드로 소 혈청 알부민을 사용한 표준 분석에 의한 단백질 결정을 위해 간직했다. 동일 양의 단백질(50㎍)의 10% 아크릴아마이드 겔 상에 로딩하고, SDS/PAGE에 의해 분리된 후 Tobin 등에 의해 기재된 방법(1979.Proc. Natl. Acad. USA 76：4350-4354)에 따라 나이트로셀루로스 막에 트랜스퍼하였다. 막를 다음 항체(GluRl의 Ser845-인산화 된 형태를 검출하는 항혈청(Kameyama, K.등 1998. Neuron 21：1163-1175), 인산화 상태에 무관하게 GluRl의 C말단의 영역을 검출하는 항 혈청(pharmingen사), 포스포 Thr34를 포함하는 DARPP-32 펩타이드를 검출하는 인산화-특이적 항체인 mAb23(Snyder,G.L. 등, J.Neurosci.12：3071-3083), PKA에 의해 인산화 되는 부위) 또는 인산화 상태에 관계없이 DARPP-32를 검출하는 단일 클론 항체인 C24-5a(Hemmings, H.C.및 P. Greengard. 1986. J. Neurosci. 6: 1469-1481).
항체 결합은 염소 항-래빗 호스래디쉬 페옥시데이즈 결합된 TgG 또는 염소 항-마우스 호스래디쉬 페옥시데이즈 결합된 IgG로 배양하고, ECL 면역 블럿팅 검출계(Amersham Biosciences)에 의해 나타날 수 있었다. 화학발광은 오트래디오그라피에 의해 검출되고, 밴드는 NIH Image 1.52의 소프트웨어를 사용한 스캔된 화상 분석에 의해 정량하였다. 덴시토메트리에 의한 ECL 시그널의 정량화에 대한 선형 범위가 제한되기 때문에 그 신호들이 정확한 정량을 허용하는 밀도의 범위내에 있는지를 확인하기 위해서 샘플의 각 세트에 대해 몇개의 필름 노출을 얻었다.
6.1.9.통계학적 방법(STATISTICAL METHODS)
데이터는 ANOVA(일반적 선형 모델)를 거쳐 분석되었다. 반복되어 측정된 성분을 갖는 데이터를 위해 날짜와 분석내에 대상 팩터내로 처리된 실험을 갖는 스플릿 프럿 ANOVA를 사용하였다(Kirk, 1995). 데이터는 하나 이상의 같은 성별을 갖는 각 유전자형에 대해 한 배에서 태어난 것내에서 평균하였다(Holson 및 Pearce(1992). 중요한 상호작용은 단순한 효과 ANOVA를 사용하여 더욱 분석되었다. 자손(posteriori) 군 비교는 던칸(Duncan)의 방법에 의해 수행되었다. 시간-의존적 상호작용 분석이 직교 분해(decompostion)에 의한 트렌드 분석을 사용하여 활성 데이터에 대해 수행되었다. 각 유전자형의 마우스의 비가 예측된 멘델의 비에 맞는지를 분석하는데 χ2을 사용하였다. 네오스트리아탈 슬라이스 데이터는 맨(Mann)-휘트니(Whitney) U test에 의해 분석되었다. p < 0.05로서 정의되는 유의성을 갖는 것는 것으로 나타내었다.
6.2. 결론 및 토론
촉매 도메인의 표적화된 파괴에 의해 PDE1B 효소가 불활성화된 마우스 모델을 개발하였다. 이 "넉아웃" 마우스는 뇌의 인 비보에서 PDElB 활성의 기능적 중요성을 파악하기 위한 연구에 사용되었다. PDEIB 활성이 결손된 마우스를 생성하기 위해 상동적 재조합에 의해 마우스 배아 줄기세포 지노믹 DNA에서 PDE1B 촉매 도메인을 코딩하는 서열을 파괴하기 위해 타겟팅 벡터를 제조하였다(도 1A). HAT 및 Cytovene 선택에서 생종한 302 ES세포 콜로니 중에서 26개를 PDE1B 엑손 3 및 측방의 인트론 배열에 대응하는 프로브를 사용한 서던 블롯에 의해 분석되었다. 그 파괴된 유전자는 클론들 중 9개에 존재하였다.
두 재조합 배아 줄기세포주를 데이 E3.5 C57B1/6 낭포(b1astocysts)로 마이크로인젝션하고 가임신된 암컷에 이식하였다. 28 키메라들이 생겼고(17개의 수컷 및 11개의 암컷), 한 배아 줄기세포주에서 8 또는 29%는 C57B1/6 마우스로 성장할 때 점라인(germline) 트랜스니션을 나타냈다. 제3세대 이종 접합체 마우스는 키워져서 178마리의 야생형 마우스(27%), 309마리의 이종접합성 마우스(47%), 157마리의 널(null) 마우스(24%), 및 제노타이프전에 죽은 마우스(2%)를 야기하였다. 이 비율은 2분석에 의해 1:2:1이 예상되는 멘델비와 크게 다르지 않았다. F4 유전자형을 나타내는 서던 블롯은 도 1B에 나타낸다.
PDE1B 널(null) 및 이종접합성 마우스의 물리적 모습과 일반적인 행동은 야생형 한배에서 태어난 메이트의 것과 같다. 세 유전자형 중에 이유(wean)전 또는 이유후 체중은 큰 차이가 없었다. 야생형 마우스(2%)와 비교해 더 많은 PDE1B 널 마우스(6%) 및 이종 접합체 마우스(6%)가 출산 후 일 주일 내에 죽었다. 타겟된 도메인 내에 K-17, 348bp 마우스 부분적 PDE1B cDNA((Repaske, D.R.등 1992. J. Biol. Chem.267：18683-18688)와 프로브된 전체 뇌 RNA의 노던 블럿 분석은 oftotal인 뇌리보좀리보 핵산이 K-17을 수반하는 철저 조사한 노던블로트 분석은 PDE1B 유전자에 대한 넉아웃 마우스의 성공적인 생산을 확인하는 널 마우스에서 PDE1B mRNA 부존재 및 이종접합성 마우스에서 PDE1B mRNA의 감소를 나타낸다(도 1 C). 게다가 PDE1B mRNA 레벨은 이종접합성 마우스에서 정상 대립유전자의 명백한 업레귤레이션을 갖지 않는 마우스에서 감소했다. 전체 마우스 뇌에서 온 PDE1B 의 면역침전은 cAMP 가수분해에 대해 분석시에 널 마우스에서 PDElB의 효소 활성이 결여되었다는 것을 나타냈다. 이종 접합체 마우스는 야생형에서 보여지는 활성 레벨의 50%를 나타내었다.
PDE1B 유전자의 기능적 중요성 및 뇌조직에서 그것의 발현을 조사하기 위해서, 넉아웃의 운동(locomotor) 활성을 일련의 표준 운동 활성 테스트를 사용하여 연구하였다. 그 실험은 테스트 조건 또는 운동에 대한 치료제의 효과을 통상적으로 정의하는데 사용되는 실험이고 그 결과들을 예측되는 인간에서의 결과로 외삽법에 의해 추정하는데 통상적으로 사용되는 실험이다. 그러한 실험은 의약 개발과정의표준적인 부분이다.
탐구(exploratory) 및 메타엠페타민-자극된 활성 모두를 널(넉아웃), 이종접합체 및 야생형 마우스에서 연구하였다. 유전자형의 현저한 효과는 프리(pre)-챌린지 탐구 및 포스트-챌린지 탐구 활성 모든 관점에서 마우스간에 현저한 차이가 있는 수평 운동 활성에 대해 관찰하였다. 수평 활성 실험에 대한 프리-챌린지 및 포스트-챌린지 관찰된 인터벌 상호작용에 의한 중요한 유전자형이 있다. ANOVA 분석은 프리-챌린지 이종접합성 마우스는 야생형 마우스의 것과 비교하여 활성레벨를 보이는(도2) 반면에 PDE1B 널 마우스(넉아웃 마우스)는 현저하게 더 탐구 행동, 특히 실험기간의 처음 30분 동안을 보인다. 30에서 60분 사이에 PDE1B 널 마우스는 야생형 활성 레벨쪽으로 길들여졌으나 여전히 다소 더 활동성을 유지하였다. ANOVA 분석 및 포스트 챌린지 수평 활성의 군 비교는 활성 레벨면에서 이종 접합성 마우스는 야생형 마우스와 비록 크지는 않지만 약간의 차이가 있다는 것을 나타낸다. 그 자극된 과잉행동 반응은 메타엠페타민 처리 후 90분간 지속되었다. 이것은 WT 마우스에서 일어나는 것 보다 METH 처리후 PDE1B -/- 마우스에서 같은 시간 기간에 대한 활성의 급격한 증가에 의해 도 2에서 볼 수 있다.
PDE1B 널 마우스의 자극된 반응이 대조군인 야생형 마우스의 반응과 정성적으로 뿐 아니라 정량적으로 차이가 있는지를 결정하기 위하여, 직교분해(orthogonal decomposition)을 사용한 트랜드 분석이 수행되었다. 야생형에 대한 널 비교는 인터벌 상호작용에 의해 유전자형에 대한 중요한 선형, 2차(quadratic), 3차(cubic) 트랜드를 보였고; 야생형 상호작용에 대한 널 비교은어떤 중요한 효과를 보이지 않았다. 데이터에 제일 잘 맞는 2차 트랜드인 야생형에 대한 널 비교에서는 널 마우스가 메타엠페타민에 대하여 야생형 마우스보다 변화의 속도가 빠르고 더 활동성이 있다는 것을 보이고, 그 마우스에서 더 빠른 반응속도를 나타낸다.
전체 거리의 종결점을 조사했을 때 얻어진 수평활성과 같은 반응의 패턴을 보였다. 수형활성의 측정에서와 같이, 양 프리-챌린지 및 포스트-챌린지 모두 유전자형의 주요한 주된 효과가 있다. 프리-챌린지 및 포스트-챌린지 기간 모두에서 PDE1B 널 마우스는 야생형 마우스에 비하여 더 먼 전체 거리를 여행하였다. 인터벌 상호작용에 의한 유전자형도 프리-챌린지 및 포스트-챌린지 모두에서 관찰되었고, 그 패턴은 수평활성 측정에서와 같았다. 수평 활성의 결과와 비교하여 전체 활성의 측정에 대하여 확인된 결과 중 하나의 차이가 있었다. 이것은 프리-챌린지 기간 도안에 보여진 성(sex) 상호작용에 의한 유전자형에서 였다. 널 암컷만이 전체 활성의 측면에서 과잉행동성 반응을 보이는 반면에 널 수컷은 전체 활성 프리-챌린지에서 현저한 증가를 보이지 않았다(도 3). 그러나 메타엠페타민 챌린지 후 널 수컷과 암컷 모두는 야생형 마우스와 비교하여 자극된 과잉행동성을 보였다. 비록 그 결과들은 통계적으로 유의하지는 않지만 수컷 널 마우스에서 다소 증가된 전체 반응을 나타내었다. 수컷 이종접합성 마우스는 또 비록 통계학적으로 야생형 마우스 제안된 미묘한 유전자-공여량 효과와는 차이는 없지만 중간 반응을 보였다. 거리 데이너튼 충심 및 주변부 활성의 관점에서 더 분석되었다. 양 분석들 모두에서 전체 거리의 측정에서 관측된 것과 같은 같은 유의적인 효과 및 상호작용을 보였다.
다음 운동활성을 일직선 채널 및 모리스 워터 미로의 신호된(cued) 습득에서 테스트하였다. 수영 능력을 결정하기 위해 사용된 일직선 채널에서 세 유전자형 가에 중요한 차이는 관찰되지 않았다 모든 마우스들이 동등한 수영 능력과 빠져나오려는 동기를 가졌다. 유사하게 근거리 신호가 존재하고 모리스 워터 미로로부터 원거리 신호가 제거되었을 때 신호된 학습에 대한 주요한 효과 및 상호작용이 발견되지 않았다.
공간 학습 및 기억은 숨겨진 모리스 워터 미로에서 실험되었다. 그 결과들은 모리스 워터 미로의 신호된 습득에서 이종접합성 마우스 및 PDE1B 널 마우스는 야생형 마우스보다 유의적으로 더 긴 경로 길이를 가졌다(도 5A). 플랫폼 상호작용에 의한 유전자형에 의한 중요한 날이 발견되었다. 비록 양쪽 모두의 4분원(quadrant)의 플랫폼으로 테스트되는 야생형 마우스는 이종 접합체 또는 PDE1B 널 마우스보다 더 짧은 경로 길이를 가지고 그 상호작용은 그 효과가 3일에서 6일에서(남동쪽 4분원에서) 더 크다는 사실의 산물이다. 경로 길이에 대한 성별 효과에 의한 유전자형에 의한 중요한 실험은 관찰되나 성별에 의한 기여는 경미하게 보였다. 잠재성을 조사할 수 있을 때 같은 패턴은 보였다. 다른 측정과 같이 그 효과는 한 목표 4분원이 다른 것(동남쪽)에 대해 더 크다. 널 및 이종접합성 마우스는 3일과 4일에서 야생형 마우스에 비하여 현저하게 더 긴 잠재성을 가졌다. 성별 상호작용에 의한 유전자형에 의한 실험은 관찰되었으나, 전과 같이 그 성별의 기여는 경미하였다.
그 테스트에 대한 학습 커브가 조사되었을 때, 누적적인 거리 및 잠재성에 대한 패턴이 그룹들 간에 유사하였다(도 5 및 6). 모든 그룹은 1일날에 유사한 수행을 보였고 이것은 유전자형 사이에 전에 존재하는 수행차이가 없다는 것을 나타낸다. 차후의 날 들에서, 야생형 마우스는 테스트의 각 연속적인 날에 목표에 대한 더 짧은경로를 필요로 하는 꾸준한 향상을 나타냈다. 이와 대조적으로 널과 이종 접합체 마우스는 그들의 아생형 대조군에 비하여 각 날에서 적은 개량을 나타내고 테스트 3일에서 6일 사이에 큰 차이를 야기하였다. 비록 6일날 24실험 후 널 및 이질 접합성의 마우스는 야생형 마우스와 동등하게 실행하고 있지 않았다.
경로 길이의 프로브 트라이얼 측정 및 타겟 존에서의 머문 시간은 두 방법으로 분석하였다. 첫째, 이러한 데이터는 고리(annuli)에 의해 분석되었다：타겟 플랫폼 부위를 갖는 한 고리, 플랫폼의 외부 가장자리(edge) 및 그 플랫폼의 내부 가장자리의 안쪽. 둘째로 프로브 트라이얼 데이너튼 네 동등한 4분원으로 미로를 나누어 분석하였다. 전체적으로 널 및 이종 접합성 마우스는 야생형 마우스에 비하여 타겟 고리에서 상당히 덜 수영하였다(도 7 A). 플랫폼 위치 상호작용에 의한 중요한 유전자형은 표적 고리 및 외측 고리 모두에서 발견되었다. 다시 널 마우스 및 이종 접합체 마우스는 야생형 마우스에서 비교한 바와 같이 남동 조건에서 가장 현저한 효과인 표적 고리에서 덜 수영하였다. 반대로 널 마우스 및 이종 접합체 마우스는 야생형 마우스보다 외측 외측 고리에서 상당히 더 수영하였다(도 7B). 안쪽의 고리, 머문 시간 또는 플랫폼 크로싱내에서 경로 길이는 큰 차이가 발견되지 않았다. 플랫폼 위치에 의한 유전자형에 의한 날짜의 중요한 상호작용은 이종 접합체 마우스가 야생형 마우스보다 타겟으로부터 상당히 더 멀리 있는 타겟으로부터 평균거리에서 발견되었다. 이외에도 이종 접합체 마우스는 야생형 마우스에 비하여 상당히 더 짧은 머문 시간을 갖는다. 4분원들에 기이한 시간 또는 거리의 차이가 없었다.
되돌아옴(reversal) 테스트에서 경로 길이 또는 누적적인 거리의 측정에 대해서는 중요한 차이가 발견되지 않았다. 유전자형 상호작용에 의한 실험은 널 마우스는 야생형 마우스보다 테스트의 24실험에서 현저하게 긴 잠재성(latency)을 갖는 잠재성이 관찰되었다. 되돌아옴 프로브 실험에서는 큰 차이가 발견되지 않았다. 이외에 후각 오리엔테이션의 관점에서 세 유전자형 중에 큰 차이가 발견되지 않았다.
PDE1B 유전자가 결핍한 마우스(PDE1B 널 마우스)가 PKA-중재되는 단백질 인산화의 기능적 증가가 나타나는지를 결정하기 위한 실험이 수행되었다. 스트리아탈 뇌 슬라이스를 수컷의 야생형 및 수컷의 PDE1B 널 마우스로부터 조제되었다. 다음 그 슬라이스들은 도파민 D1 형 수용체 작용제인 SKF81297(10μM)에 10분간 노출되었다. DARPP-32 Thr34에서 및 GluRl AMPA 수용체 Ser845에서의 인산화에 대한 처리의 효과는 인산화 상태 특이적인 항체들을 사용하여 측정하였다9도 4C, D); 이들 기질들은 도파민 D1 수용체 및 PKA의 활성화에 의해 조절된다는 것을 보였다(Greengard, P. 등. 1999. Neuron 23:433-447). 도파민 수용체 작용제 처리는 대조군(작용제를 처리하지 않은) 마우스와 비교하여 야생형 마우스의 스트리아탈 슬라이스에서 phospho-Thr34의 레벨이 4-5배 증가한 반면에 작용제 처리는 대조군(작용제를 처리하지 않은) 마우스와 비교하여 phospho-Ser845의 레벨이 4-5배 증가하였다(도 4D). 야생형 마우스 및 PDE1B 널 마우스에서 온 스트리아탈 슬라이스에 D1 수용체 작용체로 처리시 양쪽 모두의 phospho-Thr34 및 phospho-Ser845의 레벨은 대조군과 비교하여 PDE1B 널 마우스에서 크게 증가하였다(phospho-Thr34에서는 15배 증가, phospho-Ser845에서는 13배 증가)(도 4D). 이외에도 야생형 마우스와 비교하여 PDE1B 널 마우스에서 온 핵 측좌(accumbens) 슬라이스에서 관찰된 증가된 D1 중재되는 인산화가 있다. 흥미롭게도 PDE1B 널 마우스에서 온 처리되지 않은 스트리아탈(도 4C) 또는 측좌 슬라이스를 야생형 마우스로부터 온 스트리아탈 또는 측좌 슬라이스와 비교할 때 phospho-Thr34, phospho-Ser845의 기초 레벨 또는 DARPP-32 또는 GlnR1의 전체 레벨에서 큰 차이가 없었다.
아데니릴 사이크레이즈의 직접 활성제인 포르스코린(forskolin)(10μM)을 PDE1B 널 및 야생형 마우스에서 온 스트리아탈 슬라이스의 cAMP 레벨을 증가시키기 위해서 사용했다(도 4A). 프르스코린 처리는 야생형 마우스(21배 증가)와 비교할 때 PDE1B 널 마우스에서 온 스트리아탈 슬라이스내에서 phospho-Thr34 DARPP-32 및 phospho-Ser845 GluRl AMPA 수용체의 레벨의 더 현저하게 큰 증가(65 배 증가)를 유도하였다(도 4B).
이들 데이터는 PDE1B 활성이 결핍된 마우스가 야생형 및 이종 접합체 마우스와 비교와 비교시에 상당히 증가된 자발적 및 메타엠페타민 유도된 운동 활성을 가진다는 것을 나타낸다. 나타나는 생화학 데이터는 PDE1B가 결손된 마우스 행동에서 이들 변화는 뇌에서 인간을 포함한 동물의 운동 활성의 주된 조절자인 스트리아탈 경로의 파괴의 결과인 것 같다. PDE1B-결손된 마우스에서 관찰된 행동 변화는 새로운 환경(탐구) 또는 급성 의약 챌린지(메타엠페타민)에 반응하여 관찰되었다. 이외에도 데이터는 PDE1B-결손된 마우스는 프리 챌린지 기간의 마지막 15분에서 야생형동물과 큰 차이가 없다는 사실에 의해 나타낸 바에 따라 메파엠페타민 챌린지를 주기 전에 환경에 길들여졌다는 것을 보였다. 따라서 PDE1B-결손된 마우스는 사전 프리 챌린지 활성 레벨에 기인하지 않는 메타엠페타민 챌린지에 대하여 활성의 증가된 레벨을 보였다.
운동 활성은 신경독성물질 및 각성제의 효과를 실험하는 표준방법으로 잘 확립되었다. 예를 들면 코카인 및 앰페타민과 같은 많은 약물들은 뇌에서 도파민 작용성 신호전달을 통하여 운동 활성에 영향을 준다(Traficante, L.등, 1976. Life Sci. 19: 1061-1066). 이들 약물은 뇌에서 도파민 전달자에 결합하여 도파민 과잉 및 도파민 수용체에 대한 증가된 리간드 결합을 야기하고 아데니릴 사이크레이즈를 활성화하여 세포내 cAMP의 레벨을 증가시킨다(Giros, B 등, 1996. Nature 379: 606-612). 증가된 세포내 cAMP의 레벨은 PKA를 활성화시켜서 DARPP-32 및 CREB와 같은 단백질을 포함하는 세포 단백질을 인산화시킨다(Cunningham, S 및 A.Kelley. 1993. J Neurosci. 13: 2342-2350; Konrade, C 등, 1994. J. Neurosci. 14: 5623-5634; Misrendino, M.및 E Nestler. 1995. Brain Res. 674: 299-306). Dl 수용체에 도파민의 결합은 또 세포내 cGMP 레벨을 증가하고 PKG의 활성화를 이끌고, DARPP-32 뿐 아니라 다른 단백질들의 인산화를 이끈다(Altar, C. 등. 1990. Eur. J Pharmacol. 181: 17-21; Tsou, K.등 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：3462-3465). 이 경로의 변화는 도파민, 도파민·수용체, 도파민 수송체 또는 DARPP-32가 결손된 마우스와 관련된 여러 연구들에서 보여주는 것과 같이 운동 활성의 레벨의 변화를 일으킨다.
PDE1B가 결손된(널) 마우스는 야생형과 비교하여 증가된 활성 레벨을 가지고 생화학적 데이터뿐 아니라 급성 엠페타민 챌리지에서 활성의 더 큰 증가를 갖는다는 것 보여주는 현재의 데이터를 가지고, PDE1B 환상(cyclic) 뉴클레오타이드 가수분해 활성을 제거하여 환상 뉴클레오타이드에서 도파민 수용체 생성된 증가의 크기 및 지속은 증가한 것을 나타낸다.
이러한 데이터는 PDE1B 활성이 학습 뿐 아니라 뇌의 스트리아탈 경로의 활성을 통해서 운동에도 관련되었다는 것을 나타낸다. PDE1B가 결손된 마우스에서 보여주는 중요한 효과는 PDE1B가 뇌의 학습 뿐 아니라 운동 활성의 중요한 조절 인자인 것을 나타낸다. 기초 인산화는 PDE1B 넉아웃 마우스에서는 영향이 없는 반면에 DARPP-32 및 GluRl의 D1 수용체 중재되는 인산화는 PDE1B 결손된 또는 넉아웃 마우스에서 증가되었다는 것을 나타내는 생화학적 데이터는 PDE1B가 PDE1B 신호전달 경로의 변화를 통하여 학습 및 운동에 관여한다는 소견을 지지한다.
본 발명에서 PDE1B가 뇌 특히 운동 및 학습과 관련되어 알려진 지역들에서 도파민 신호전달에서 역할를 갖는다는 이해에 기초하여 PDE1B는 파킨슨 병, 헌팅톤 병, 주의력 결핍 장애(ADD), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 신경 변성 질병, 트렛트(Tourette) 증후군, 틱 장애, 렛슈(Lesch)- 니안스(Nyans) 질환, 통증, 긴장이상(dystonias), 물질 또는 의약품 남용, 정신분열증, 스키조에펙티브 질환, 우울증, 감정(affective) 질환, 조울병, 강박 신경장애, 섭식 장해, 구토, 패닉 장애, 염려증, 편두통, 간대성근경련, 월경전 증후군(PMS), 심리적 외상 후 스트레스 장해, 카르시노이드 증후군, 알츠하이머 병, 스트로크, 간질, 휴면 또는 서커디안(circadian) 리듬 무질서(예를 들면 불면증), 성 병, 스트레스 병, 고혈압 및 암을 포함하지만, 이것으로 한정되는 것이 아닌 여러 질병의 치료에 사용될 수 있는 새로운 약제들의 개발에 새로운 타겟을 의미한다.
본 발명은 여기에 기재된 특정 실시예에 한정되는 것이 아니다. 사실 여기 기재된 것 외에 본 발명의 여러 변형은 상기 기재로부터 당업자에 있어서는 명확하다. 그러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위내에 해당될 것이다.
여기에서 인용된 모든 레퍼런스는 마치 개별 간행물, 특허, 또는 특허출원서가 모든 의도를 위해 온전히 그대로 레퍼런스에 의해 삽입된 것으로 특정하게 개별적으로 나타내는 것과 같은 정도로 모든 의도를 위해 온전히 그대로 레퍼런스에 의해 여기에 삽입하였다.
어느 간행물의 인용은 출원일 전에 공지되었고 본 발명은 선발명에 의해 그러한 발행이 보다 선행하다는 것을 부여하지 않는다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
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<110> The Rockefeller University Children's Hospital Medical Center <120> PHOSPHODIESTERASE ACTIVITY AND REGULATION OF PHOSPHODIESTERASE1B-MEDIATED SIGNALING IN BRAIN <150> US60/316320 <151> 2001-08-31 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Pro Lys Asp Arg Lys Lys Ile Gln Phe Ser Val Pro Ala Pro 1 5 10 15 Pro Ser Gln Leu Asp Pro Arg Gln Val Glu Met Ile Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Pro Thr Pro Ala Met Leu Phe Arg Leu Ser Glu His Ser Ser Pro Glu 35 40 45 Glu Glu Ala Ser Pro His Gln Arg Ala Ser Gly Glu Gly His His Leu 50 55 60 Lys Ser Lys Arg Pro Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys 65 70 75 80 Ala Val Gln Arg Ile Ala Glu Ser His Leu Gln Ser Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Asn Glu Asn Gln Ala Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg 100 105 110 Glu Leu Gly Tyr Pro Arg Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp 115 120 125 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Val 130 135 140 Ile Arg Gln Ser Ala Gly Gln Lys Thr Thr Arg Gly Leu Gly Leu Glu 145 150 155 160 Gly Pro Trp Glu Arg Pro Pro Pro Leu Asp Glu Ser Glu Arg Asp Gly 165 170 175 Gly Ser Glu Asp Gln Val Glu Asp Pro Ala Leu Ser Glu Pro Gly Glu 180 185 190 Glu Pro Gln Arg Pro Ser Pro Ser Glu Pro Gly Arg 195 200 <210> 2 <211> 201 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asp Pro Lys Asp Arg Lys Lys Ile Gln Phe Ser Val Pro Ala Pro 1 5 10 15 Pro Ser Gln Leu Asp Pro Arg Gln Val Glu Met Ile Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Pro Thr Pro Ala Leu Leu Phe Arg Val Ser Glu His Ser Ser Pro Glu 35 40 45 Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ser Pro His Gln Arg Thr Ser Gly Glu Gly 50 55 60 His His Pro Lys Ser Lys Arg Pro Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ala Val Arg Arg Leu Gln Thr Ile Ser Asn Leu Ser Glu 85 90 95 Asn Gln Ala Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg Glu Leu 100 105 110 Gly Tyr Pro Gln Glu Asp Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Asp 115 120 125 Glu Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Gly Ser Arg Gly Thr 130 135 140 Val Gly Gln Lys Leu Leu Val Ala Gly Val Trp Arg Gly Pro Gly Ser 145 150 155 160 Ala His Leu Leu Trp Met Ser Pro Arg Glu Met Glu Thr Leu Arg Thr 165 170 175 Lys Trp Lys Ala Glu Gln His Glx Val Ser Leu Glu Arg Asn Leu Ser 180 185 190 Ile Pro Ala Pro Pro Glu Pro Gly Thr 195 200 <210> 3 <211> 205 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 3 Met Asp Pro Lys Asp Arg Lys Lys Ile Gln Phe Ser Val Pro Ala Pro 1 5 10 15 Pro Ser Gln Leu Asp Pro Arg Gln Val Glu Met Ile Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Pro Thr Pro Ala Leu Leu Phe Arg Val Ser Glu His Ser Ser Pro Glu 35 40 45 Glu Glu Ser Ser Pro His Gln Arg Thr Ser Gly Glu Gly His His Pro 50 55 60 Lys Ser Lys Arg Pro Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys 65 70 75 80 Ala Val Gln Arg Ile Ala Glu Ser His Leu Gln Thr Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Ser Glu Asn Gln Ala Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg 100 105 110 Glu Leu Gly Tyr Pro Asn Glu Asp Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp 115 120 125 Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Gly 130 135 140 Ser Arg Gly Thr Ala Gly Asn Lys Leu Thr Ser Gly Gln Gly Leu Glu 145 150 155 160 Gly Pro Trp Glu Arg Pro Pro Pro Leu Asp Glu Pro Gln Arg Asp Gly 165 170 175 Asn Ser Glu Asp Gln Gly Glu Gly Arg Ala Thr Gln Ser Glu Pro Gly 180 185 190 Glu Glu Pro Arg His Pro Thr Pro Pro Glu Ser Gly Thr 195 200 205 <210> 4 <211> 203 <212> PRT <213> bovine <400> 4 Met Asp Pro Lys Asp Arg Lys Lys Ile Gln Phe Ser Val Pro Ala Pro 1 5 10 15 Pro Ser Gln Leu Asp Pro Arg Gln Val Glu Met Ile Arg Arg Arg Arg 20 25 30 Pro Thr Pro Ala Met Leu Phe Arg Leu Ser Glu His Ser Ser Pro Glu 35 40 45 Glu Glu Ala Ser Pro His Gln Arg Ala Ser Gly Glu Gly His His Leu 50 55 60 Lys Ser Lys Arg Pro Asn Pro Cys Ala Tyr Thr Pro Pro Ser Leu Lys 65 70 75 80 Ala Val Gln Arg Ile Ala Glu Ser His Leu Gln Ser Ile Ser Asn Leu 85 90 95 Gly Glu Asn Gln Ala Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Gly Glu Leu Arg 100 105 110 Glu Leu Gly Tyr Pro Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp 115 120 125 Glu Glu Glu Glu Glu Asp Ser Gln Ala Glu Val Leu Lys Gly Ser Arg 130 135 140 Gly Ser Ala Gly Gln Lys Thr Thr Tyr Gly Gln Gly Leu Glu Gly Pro 145 150 155 160 Trp Glu Arg Pro Pro Pro Leu Asp Gly Pro Gln Arg Asp Gly Ser Ser 165 170 175 Glu Asp Gln Val Glu Asp Pro Ala Leu Asn Glu Pro Gly Glu Glu Pro 180 185 190 Gln Arg Met Pro Ala His Pro Glu Pro Gly Thr 195 200 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 gacactaagt gggtatagct gggt 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer <400> 6 gtgggaataa gtctcagggt agg 23 <210> 7 <211> 906 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Gln His Ile Phe Ala Phe Phe Cys Thr Gly Phe Leu Gly Ala Val 1 5 10 15 Val Gly Ala Asn Phe Pro Asn Asn Ile Gln Ile Gly Gly Leu Phe Pro 20 25 30 Asn Gln Gln Ser Gln Glu His Ala Ala Phe Arg Phe Ala Leu Ser Gln 35 40 45 Leu Thr Glu Pro Pro Lys Leu Leu Pro Gln Ile Asp Ile Val Asn Ile 50 55 60 Ser Asp Ser Phe Glu Met Thr Tyr Arg Phe Cys Ser Gln Phe Ser Lys 65 70 75 80 Gly Val Tyr Ala Ile Phe Gly Phe Tyr Glu Arg Arg Thr Val Asn Met 85 90 95 Leu Thr Ser Phe Cys Gly Ala Leu His Val Cys Phe Ile Thr Pro Ser 100 105 110 Phe Pro Val Asp Thr Ser Asn Gln Phe Val Leu Gln Leu Arg Pro Glu 115 120 125 Leu Gln Asp Ala Leu Ile Ser Ile Ile Asp His Tyr Lys Trp Gln Lys 130 135 140 Phe Val Tyr Ile Tyr Asp Ala Asp Arg Gly Leu Ser Val Leu Gln Lys 145 150 155 160 Val Leu Asp Thr Ala Ala Glu Lys Asn Trp Gln Val Thr Ala Val Asn 165 170 175 Ile Leu Thr Thr Thr Glu Glu Gly Tyr Arg Met Leu Phe Gln Asp Leu 180 185 190 Glu Lys Lys Lys Glu Arg Leu Val Val Val Asp Cys Glu Ser Glu Arg 195 200 205 Leu Asn Ala Ile Leu Gly Gln Ile Ile Lys Leu Glu Lys Asn Gly Ile 210 215 220 Gly Tyr His Tyr Ile Leu Ala Asn Leu Gly Phe Met Asp Ile Asp Leu 225 230 235 240 Asn Lys Phe Lys Glu Ser Gly Ala Asn Val Thr Gly Phe Gln Leu Val 245 250 255 Asn Tyr Thr Asp Thr Ile Pro Ala Lys Ile Met Gln Gln Trp Lys Asn 260 265 270 Ser Asp Ala Arg Asp His Thr Arg Val Asp Trp Lys Arg Pro Lys Tyr 275 280 285 Thr Ser Ala Leu Thr Tyr Asp Gly Val Lys Val Met Ala Glu Ala Phe 290 295 300 Gln Ser Leu Arg Arg Gln Arg Ile Asp Ile Ser Arg Arg Gly Asn Ala 305 310 315 320 Gly Asp Cys Leu Ala Asn Pro Ala Val Pro Trp Gly Gln Gly Ile Asp 325 330 335 Ile Gln Arg Ala Leu Gln Gln Val Arg Phe Glu Gly Leu Thr Gly Asn 340 345 350 Val Gln Phe Asn Glu Lys Gly Arg Arg Thr Asn Tyr Thr Leu His Val 355 360 365 Ile Glu Met Lys His Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gly Tyr Trp Asn Glu 370 375 380 Asp Asp Lys Phe Val Pro Ala Ala Thr Asp Ala Gln Ala Gly Gly Asp 385 390 395 400 Asn Ser Ser Val Gln Asn Arg Thr Tyr Ile Val Thr Thr Ile Leu Glu 405 410 415 Asp Pro Tyr Val Met Leu Lys Lys Asn Ala Asn Gln Phe Glu Gly Asn 420 425 430 Asp Arg Tyr Glu Gly Tyr Cys Val Glu Leu Ala Ala Glu Ile Ala Lys 435 440 445 His Val Gly Tyr Ser Tyr Arg Leu Glu Ile Val Ser Asp Gly Lys Tyr 450 455 460 Gly Ala Arg Asp Pro Asp Thr Lys Ala Trp Asn Gly Met Val Gly Glu 465 470 475 480 Leu Val Tyr Gly Arg Ala Asp Val Ala Val Ala Pro Leu Thr Ile Thr 485 490 495 Leu Val Arg Glu Glu Val Ile Asp Phe Ser Lys Pro Phe Met Ser Leu 500 505 510 Gly Ile Ser Ile Met Ile Lys Lys Pro Gln Lys Ser Lys Pro Gly Val 515 520 525 Phe Ser Phe Leu Asp Pro Leu Ala Tyr Glu Ile Trp Met Cys Ile Val 530 535 540 Phe Ala Tyr Ile Gly Val Ser Val Val Leu Phe Leu Val Ser Arg Phe 545 550 555 560 Ser Pro Tyr Glu Trp His Ser Glu Glu Phe Glu Glu Gly Arg Asp Gln 565 570 575 Thr Thr Ser Asp Gln Ser Asn Glu Phe Gly Ile Phe Asn Ser Leu Trp 580 585 590 Phe Ser Leu Gly Ala Phe Met Gln Gln Gly Cys Asp Ile Ser Pro Arg 595 600 605 Ser Leu Ser Gly Arg Ile Val Gly Gly Val Trp Trp Phe Phe Thr Leu 610 615 620 Ile Ile Ile Ser Ser Tyr Thr Ala Asn Leu Ala Ala Phe Leu Thr Val 625 630 635 640 Glu Arg Met Val Ser Pro Ile Glu Ser Ala Glu Asp Leu Ala Lys Gln 645 650 655 Thr Glu Ile Ala Tyr Gly Thr Leu Glu Ala Gly Ser Thr Lys Glu Phe 660 665 670 Phe Arg Arg Ser Lys Ile Ala Val Phe Glu Lys Met Trp Thr Tyr Met 675 680 685 Lys Ser Ala Glu Pro Ser Val Phe Val Arg Thr Thr Glu Glu Gly Met 690 695 700 Ile Arg Val Arg Lys Ser Lys Gly Lys Tyr Ala Tyr Leu Leu Glu Ser 705 710 715 720 Thr Met Asn Glu Tyr Ile Glu Gln Arg Lys Pro Cys Asp Thr Met Lys 725 730 735 Val Gly Gly Asn Leu Asp Ser Lys Gly Tyr Gly Ile Ala Thr Pro Lys 740 745 750 Gly Ser Ala Leu Arg Asn Pro Val Asn Leu Ala Val Leu Lys Leu Asn 755 760 765 Glu Gln Gly Leu Leu Asp Lys Leu Lys Asn Lys Trp Trp Tyr Asp Lys 770 775 780 Gly Glu Cys Gly Ser Gly Gly Gly Asp Ser Lys Asp Lys Thr Ser Ala 785 790 795 800 Leu Ser Leu Ser Asn Val Ala Gly Val Phe Tyr Ile Leu Ile Gly Gly 805 810 815 Leu Gly Leu Ala Met Leu Val Ala Leu Ile Glu Phe Cys Tyr Lys Ser 820 825 830 Arg Ser Glu Ser Lys Arg Met Lys Gly Phe Cys Leu Ile Pro Gln Gln 835 840 845 Ser Ile Asn Glu Ala Ile Arg Thr Ser Thr Leu Pro Arg Asn Ser Gly 850 855 860 Ala Gly Ala Ser Ser Gly Gly Ser Gly Glu Asn Gly Arg Val Val Ser 865 870 875 880 His Asp Phe Pro Lys Ser Met Gln Ser Ile Pro Cys Met Ser His Ser 885 890 895 Ser Gly Met Pro Leu Gly Ala Thr Gly Leu 900 905

Claims (56)

  1. 도파민 D1 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는데 충분한 양의 화합물로 세포 또는 조직에 접촉(contact)하는 것을 포함하는 세포 또는 조직에서 PDE1B 활성을 조절하는 방법.
    여기서 상기 화합물로 상기 세포 또는 조직의 접촉은 PDE1B 활성의 조절을 야기한다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 PDE1B와 결합하는 것을 특징으로 하는 조절 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 PDE1B의 발현을 변화하는 것을 특징으로 하는 조절 방법.
  4. 제 1항에 있어서, DARPP-32의 phospho-Thr34("phospho-Thr34") 또는 GluRl AMPA 수용체의 phospho-Ser845("phospho-Ser845")의 인산화는 조절되는 것을 특징으로 하는 조절 방법.
  5. (a) 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계;
    (b) 테스트 화합물로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및
    (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로내에서 PDElB 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법.
    여기서 PDElB 활성의 최초 및 두번째 레벨은 PDElB 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
  6. 제 5항에 있어서, DARPP-32의 phospho-Thr34("phospho-Thr34") 또는 GluRl AMPA 수용체의 phospho-Ser845("phospho-Ser845")의 인산화는 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5항에 있어서, PDElB 활성의 상기 차이는 DARPP-32 또는 GluRl AMPA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 5항에 있어서, PDElB 활성의 상기 차이는 ARPP-16, ARPP-19, ARPP-21, CREB, cAMP, cGMP, CKl, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B, PP-1, 칼슘 채널, Na/K ATPase 또는 NMDA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. (a) 세포 또는 조직의 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계; (b) 테스트 화합물로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및 (c) 상기 세포 또는 조직에서PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법.
    여기서 PDElB 활성의 상기 최초 및 상기 두번째 레벨의 차이는 상기 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
  10. 제 9항에 있어서, DARPP-32의 phospho-Thr34("phospho-Thr34") 또는 GluRl AMPA 수용체의 phospho-Ser845("phospho-Ser845")의 인산화는 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, PDElB 활성의 상기 차이는 DARPP-32 또는 GluRl AMPA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, PDElB 활성의 상기 차이는 ARPP-16, ARPP-19, ARPP-21, CREB, cAMP, cGMP, CKl, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B, PP-1, 칼슘 채널, Na/K ATPase 또는 NMDA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. (a) 세포 또는 조직의 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계;
    (b) 테스트 화합물로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및
    (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법.
    여기서 PDElB 활성의 최초 및 두번째 레벨의 차이는 상기 경로의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
  14. 제 13항에 있어서, DARPP-32의 phospho-Thr34("phospho-Thr34") 또는 GluRl AMPA 수용체의 phospho-Ser845("phospho-Ser845")의 인산화는 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. (a) 테스트 화합물로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법.
    여기서 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 PDElB 활성의 대조레벨의 차이는 상기 경로의 활성을 조절하는 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
  16. 제15항에 있어서, PDElB 활성의 상기 레벨 및 상기 대조군 레벨의 차이는 DARPP-32 또는 GluRl AMPA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서 PDElB 활성의 상기 차이는 ARPP-16, ARPP-19, ARPP-21, CREB, cAMP, cGMP, CKl, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B, PP-1, 칼슘 채널, Na/K ATPase 또는 NMDA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 15항에 있어서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 상기 대조군 레벨의 상기 차이는 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. (a) 테스트 화합물로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 PDElB 활성을 조절하는 화합물을 동정하는 방법.
    여기서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는조직내의 대조레벨의 차이는 PDElB 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
  20. 제 19항에 있어서, PDElB 활성의 상기 레벨 및 상기 대조군 레벨의 차이는 DARPP-32 또는 GluRl AMPA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, PDElB 활성의 차이는 ARPP-16, ARPP-19, ARPP-21, CREB, cAMP, cGMP, CKl, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B, PP-1, 칼슘 채널, Na/K ATPase 또는 NMDA 수용체의 인산화에 의존하는 활성화를 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19항에 있어서, PDElB 활성의 상기 레벨 및 상기 대조군 레벨의 차이는 도파민 D1 수용체, 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. (a) 유력(potential) 약제로 세포 또는 조직 내에서 PDE1B 및 Thr34-탈인산화된 DARPP-32와 접촉하는 단계; 및
    (b) Thr34-탈인산화된 DARPP-32의 인산화의 양을 검출하는 단계를 포함하는 그런 치료가 필요한 환자에서 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력에 대해 테스트되는 화합물을 동정하는 방법.
    여기서 유력(potential) 약제 존재 하에서 Thr34-탈인산화된 DARPP-32의 인산화 증가가 검출되면 상기 약제을 동정한다.
  24. 제 23항에 있어서, PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력이 테스트되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. (a) 유력(potential) 약제로 세포 또는 조직 내에서 PDE1B 및 Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체와 접촉하는 단계; 및
    (b) Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체의 인산화의 양을 검출하는 단계를 포함하는 그런 치료가 필요한 환자에서 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력이 테스트되는 화합물을 동정하는 방법.
    여기서 유력(potential) 약제 존재 하에서 Ser845-탈인산화된 GluR1 AMPA 수용체의 인산화 증가가 검출되면 상기 약제을 동정한다.
  26. 제 25항에 있어서, PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 능력이 테스트되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. (a) 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계;
    (b) 유력 약제로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및
    (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 능력이 테스트되는 약제를 동정하는 방법.
    여기서 PDElB 활성의 최초 및 두번째 레벨의 차이는 상기 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 유력 약제의 능력의 지표이다.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 방법은 (d) 상기 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로가 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. (a) 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 최초 레벨을 결정하는 단계;
    (b) 유력 약제로 상기 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및
    (c) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 두번째 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 능력이 테스트되는 약제를 동정하는 방법.
    여기서 PDElB 활성의 최조 및 두번째 레벨의 차이는 상기 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 유력 약제의 능력의 지표이다.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 방법은 (d) 상기 세포내 신호전달 경로가 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. (a) 유력 약제로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 능력이 테스트되는 약제를 동정하는 방법.
    여기서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 대조레벨의 차이는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 방법은 (c) 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성이 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. (a) 유력 약제로 세포 또는 조직을 접촉하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 또는 조직에서 PDElB 활성의 레벨을 결정하는 단계를 포함하는 세포 또는 조직내 도파민 D2 수용체, 일산화 질소, 노르아드레너직, 뉴로텐신, CCK, VIP, 세라토닌, 글루타메이트, GABA, 아세틸콜린, 아데노신, 칸나비노이드 수용체, 나트륨 배설 증가성(natriuretic) 펩티드 또는 엔돌핀 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 능력이 테스트되는 약제를 동정하는 방법.
    여기서 PDElB 활성의 상기 레벨 및 테스트 화합물로 접촉하지 않은 비교 세포 또는 조직내의 대조레벨의 차이는 상기 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 상기 테스트 화합물의 능력의 지표이다.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 방법은 (d) 상기 세포내 신호전달 경로의 활성이 조절되는지를 결정하는 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계;
    (b)상기 유력 치료용 약제에 대한 상기 동물의 반응을 측정하는 단계;
    (c) 상기 동물의 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법.
  36. 제 35항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 35항에 있어서, 상기 이상은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계;
    (b) 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로와 상호작용하는 뉴로트랜스미터의 투여에 대한 상기 동물의 반응을 측정하는 단계;
    (c) 상기 동물의 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 38항에 있어서, 상기 이상은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계;
    (b) 도파민 투여에 대한 상기 동물의 반응을 측정하는 단계;
    (c) 상기 동물의 도파민 투여에 대한 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법.
  42. 제 41항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 41항에 있어서, 상기 이상은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. (a) 유력 치료용 약제를 동물에게 투여하는 단계;
    (b) 상기 동물의 (i) 수평 운동 활성을 위한 테스트 기간 동안 탐구(exploratory) 행위의 표시(exhibition); (ii) 메타엠페타민 치료제의 투여 후에 과민활성의 표시; (iii) 모리스(Morris) 워터 미로(maze)의 포착(acquisition)에서 경로 길이; (iv) 상기 동물로부터 온 선조체(striatal) 슬라이스내의 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 레벨의 변화; 및 (v) 상기 동물로부터 온 핵 횡(accumbens) 슬라이스내의 phospho-Thr34 또는 phospho-Ser845의 레벨의 변화로 구성된 군으로부터 선택된 반응을 측정하는 단계;
    (c) 상기 동물의 반응을 유력 치료용 약제가 투여되지 않은 대조군 동물의 반응과 비교하는 단계; 및
    (d) 상기 동물 및 대조군 동물 사이에 관찰된 반응의 차이에 기초하여 유력 치료용 약제를 선택하는 단계를 포함하는 PDE1B 관련 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상의 치료용도의 유력 치료용 약제를 선택하는 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 44항에 있어서, 상기 이상은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. PDE1B 활성을 조절하는 약제를 환자에 투여하는 것을 포함하는 그것을 필요로 하는 환자에게 PDE1B 관련 이상 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 방법.
    여기서 PDE1B 활성은 세포내 신호전달 물질의 인산화를 조절한다.
  48. 제 47항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 물질은 DARPP-32 또는 GluRl AMPA 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 47항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 물질은 ARPP-16, ARPP-19, ARPP-21, CREB, cAMP, cGMP, CKl, CK2, Cdk5, PKA, PKG, PP-2C, PP-2B, PP-1, 칼슘 채널, Na/K ATPase 또는 NMDA 수용체인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 47항에 있어서, 상기 약제는 PDE1B 활성을 증가 또는 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 47항에 있어서, 상기 약제는 PDE1B 활성을 저해 또는 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 47항에 있어서, 상기 이상은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  53. PDE1B 활성을 조절하는데 충분한 양의 본 발명의 화합물을 투여하여 환자 내의 PDE1B 관련 이상 또는 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로 이상을 치료하는 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 상기 약제는 PDE1B 활성을 증가 또는 촉진하는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 53항에 있어서, 상기 약제는 PDE1B 활성을 저해 또는 감소하는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 53항에 있어서, 상기 약제는 PDE1B 활성의 조절을 통하여 도파민 D1 수용체 세포내 신호전달 경로의 활성을 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20040066788A (ko) 2001-08-31 2004-07-27 더 락커펠러 유니버시티 프스포다이에스터레이즈 활성 및 뇌에서프스포다이에스터레이즈 1ｂ 매개되는 신호의 조절
WO2004080270A2 (en) * 2003-03-13 2004-09-23 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with phosphodiesterase 1b (pde1b)
EP1756144A4 (en) * 2004-05-19 2008-08-20 Merck & Co Inc ISOLATED NUCLEIC ACID MOLECULES COPYING FOR A NEW PHOSPHOPROTEIN DARPP-32, PROTEINS CODED AND THEIR USE
CN101248050B (zh) 2005-06-06 2013-07-17 武田药品工业株式会社 有机化合物
WO2007025103A2 (en) * 2005-08-23 2007-03-01 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds for treating reduced dopamine receptor signalling activity
MX2008015489A (es) 2006-06-06 2009-01-13 Intra Cellular Therapies Inc Compuestos organicos.
US9198924B2 (en) 2006-11-13 2015-12-01 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
US9006258B2 (en) 2006-12-05 2015-04-14 Intra-Cellular Therapies, Inc. Method of treating female sexual dysfunction with a PDE1 inhibitor
CA2681650C (en) * 2007-03-27 2016-11-22 Omeros Corporation The use of pde7 inhibitors for the treatment of movement disorders
US8637528B2 (en) 2007-03-27 2014-01-28 Omeros Corporation Use of PDE7 inhibitors for the treatment of movement disorders
CA2707218A1 (en) 2007-12-06 2009-06-11 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
CN104370918A (zh) 2007-12-06 2015-02-25 武田药品工业株式会社 有机化合物
CA2740398A1 (en) 2008-12-06 2010-06-10 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
MX2011005934A (es) 2008-12-06 2011-12-16 Intra Cellular Therapies Inc Compuestos organicos.
ES2580759T3 (es) 2008-12-06 2016-08-26 Intra-Cellular Therapies, Inc. Compuestos orgánicos
EP2358723B1 (en) 2008-12-06 2015-05-13 Intra-Cellular Therapies, Inc. 4,5,7,8-tetrahydro-2H-imidazo[1,2-a]pyrrolo[3,4-e]pyrimidine compounds as PDE1 inhibitors
PE20110995A1 (es) 2008-12-06 2012-02-06 Intra Cellular Therapies Inc DERIVADOS DE PIRROLO[3,4-e]PIRIMIDINA COMO INHIBIDORES DE PDE1
PE20110922A1 (es) 2008-12-06 2012-01-22 Intra Cellular Therapies Inc DERIVADOS DE PIRAZOLO[4,3-e]PIRIMIDIN COMO INHIBIDORES DE LA FOSFODIESTERASA 1 (PDE1)
JP2012518685A (ja) 2009-02-25 2012-08-16 イントラ−セルラー・セラピーズ・インコーポレイテッド 眼障害のためのｐｄｅ１阻害剤
WO2010132127A1 (en) * 2009-05-13 2010-11-18 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
WO2011016861A2 (en) 2009-08-05 2011-02-10 Intra-Cellular Therapies, Inc. Novel regulatory proteins and inhibitors
TW201206937A (en) 2010-05-31 2012-02-16 Intra Cellular Therapies Inc Organic compounds
EP2576551A4 (en) 2010-05-31 2014-04-16 Intra Cellular Therapies Inc ORGANIC CONNECTIONS
EP2575817A4 (en) 2010-05-31 2014-01-08 Intra Cellular Therapies Inc ORGANIC CONNECTIONS
US9371327B2 (en) 2010-05-31 2016-06-21 Intra-Cellular Therapies, Inc. PDE1 inhibitor compounds
WO2012171016A1 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
JP6549040B2 (ja) 2013-02-17 2019-07-24 イントラ−セルラー・セラピーズ・インコーポレイテッドＩｎｔｒａ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ， Ｉｎｃ． 新規使用
EP2968338B1 (en) 2013-03-15 2019-01-09 Intra-Cellular Therapies, Inc. Pde1 inhibitors for use in the treatment and/or prevention of cns injuries, and pns diseases, disorders or injuries
CA2906640C (en) 2013-03-15 2021-07-20 Intra-Cellular Therapies, Inc. Substituted imidazo-[1,2-a]pyrazolo[4.3-e]pyrimidin-4[5h]-one compounds and pharmaceutical compositions and use therof as pde1 inhibitors
TW201609713A (zh) * 2013-12-19 2016-03-16 Ｈ 朗德貝克公司 作爲ｐｄｅ１抑制劑之喹唑啉－ｔｈｆ－胺
WO2015106032A1 (en) 2014-01-08 2015-07-16 Intra-Cellular Therapies, Inc. Products and pharmaceutical compositions
WO2015196186A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
ES2745819T3 (es) 2014-08-07 2020-03-03 Intra Cellular Therapies Inc Derivados de imidazo[1,2-a]-pirazolo[4,3-e]-pirimidin-4-ona con actividad inhibidora de la PDE1
US9546175B2 (en) 2014-08-07 2017-01-17 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
US10285992B2 (en) 2014-08-07 2019-05-14 Intra-Cellular Therapies, Inc. Combinations of PDE1 inhibitors and NEP inhibitors and associated methods
IL292225B2 (en) * 2014-09-17 2024-12-01 Intra Cellular Therapies Inc Derivatives of 5,7,7-trimethyl-[2H]-imidazo-[1,2-a]pyrazolo[4,3-e]pyrimidin-4(5H)-one and pharmaceutical compositions comprising them.
CN107205999B (zh) 2014-12-06 2021-08-03 细胞内治疗公司 有机化合物
RU2702732C1 (ru) 2014-12-06 2019-10-10 Интра-Селлулар Терапиз, Инк. Органические соединения
WO2017172795A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 Intra-Cellular Therapies, Inc. Novel compositions and methods
US11291666B2 (en) 2016-09-12 2022-04-05 Intra-Cellular Therapies, Inc. Uses
JP7401442B2 (ja) 2018-01-31 2023-12-19 イントラ－セルラー・セラピーズ・インコーポレイテッド 新規使用
US12410175B2 (en) 2019-09-03 2025-09-09 Intra-Cellular Therapies, Inc. Compounds
US12364695B2 (en) 2020-06-02 2025-07-22 Intra-Cellular Therapies, Inc. Methods of treating inflammatory disease

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US110628A (en) 1871-01-03 Improvement in paint-brushes
US4052988A (en) 1976-01-12 1977-10-11 Ethicon, Inc. Synthetic absorbable surgical devices of poly-dioxanone
JPS6032638B2 (ja) 1976-09-01 1985-07-29 武田薬品工業株式会社 ３−アミノピラゾロ〔３，４−ｄ〕ピリミジン誘導体
NL7807532A (nl) 1978-07-13 1980-01-15 Akzo Nv Metaal-immunotest.
NL8000173A (nl) 1980-01-11 1981-08-03 Akzo Nv Toepassing van in water dispergeerbare, hydrofobe kleurstoffen als label in immunochemische testen.
EP0077372A1 (de) 1981-04-22 1983-04-27 Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik GmbH NEUE PYRAZOLO(3,4-d)PYRIMIDINE, VERFAHREN ZU DEREN HERSTELLUNG UND SIE ENTHALTENDE ARZNEIMITTEL
HU186891B (en) * 1981-06-12 1985-10-28 Richter Gedeon Vegyeszet Process for producing esters of apovincaminic acid
US4703017C1 (en) 1984-02-14 2001-12-04 Becton Dickinson Co Solid phase assay with visual readout
US4631211A (en) 1985-03-25 1986-12-23 Scripps Clinic & Research Foundation Means for sequential solid phase organic synthesis and methods using the same
US4666908A (en) 1985-04-05 1987-05-19 Warner-Lambert Company 5-Substituted pyrazolo[4,3-d]pyrimidine-7-ones and methods of use
NL8720442A (nl) 1986-08-18 1989-04-03 Clinical Technologies Ass Afgeefsystemen voor farmacologische agentia.
EP0281327B1 (en) 1987-02-27 1993-06-30 EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) Immunoreactive reagent, method of preparation and its use to determine an immunoreactive species
EP0280559B1 (en) 1987-02-27 1993-10-20 EASTMAN KODAK COMPANY (a New Jersey corporation) Agglutination immunoassay and kit for determination of a multivalent immune species using a buffered salt wash solution
US4857453A (en) 1987-04-07 1989-08-15 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay device
EP0560411B1 (en) 1987-04-27 2000-07-26 Unilever N.V. Specific binding assays
US5274074A (en) 1987-12-17 1993-12-28 United States Surgical Corporation Medical devices fabricated from homopolymers and copolymers having recurring carbonate units
US5010175A (en) 1988-05-02 1991-04-23 The Regents Of The University Of California General method for producing and selecting peptides with specific properties
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
EP0950707B1 (en) 1989-07-25 2009-02-18 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5464764A (en) 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
ES2127458T3 (es) 1989-11-06 1999-04-16 Cell Genesys Inc Produccion de proteinas utilizando recombinacion homologa.
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
US5250534A (en) 1990-06-20 1993-10-05 Pfizer Inc. Pyrazolopyrimidinone antianginal agents
IL98559A0 (en) 1990-06-21 1992-07-15 Schering Corp Polycyclic guanine derivatives
US5139749A (en) 1990-06-22 1992-08-18 Tas, Inc. Fluidized calcining process
AU2515992A (en) 1991-08-20 1993-03-16 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
US5294612A (en) 1992-03-30 1994-03-15 Sterling Winthrop Inc. 6-heterocyclyl pyrazolo [3,4-d]pyrimidin-4-ones and compositions and method of use thereof
US20020006963A1 (en) 1992-06-23 2002-01-17 Young James W. Method of using and compositions comprising (-) sibutramine optionally in combination with other pharmacologically active compounds
EP0686157A1 (en) * 1993-02-26 1995-12-13 Schering Corporation 2-benzyl-polycyclic guanine derivatives and process for preparing them
GB9304919D0 (en) 1993-03-10 1993-04-28 Celltech Ltd Chemical compounds
ES2289194T3 (es) 1993-05-27 2008-02-01 Aventis Pharmaceuticals Inc. Bibliotecas en fase solida codificadas, segregadas topologicamente.
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
GB9523675D0 (en) 1995-11-20 1996-01-24 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US5824683A (en) 1995-11-28 1998-10-20 Schering Corporation 2'- 4'-halo- 1,1'-biphenyl!-4-yl!methyl!-5'-methyl-spiro cyclopentane-1,7' (8'H)- 3H! imidazo 2,1-b!purin!-4' (5'H)-ones
GB9526245D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US5703200A (en) 1996-03-15 1997-12-30 Ethicon, Inc. Absorbable copolymers and blends of 6,6-dialkyl-1,4-dioxepan-2-one and its cyclic dimer
US5798246A (en) * 1996-03-25 1998-08-25 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cyclic nucleotide phosphodiesterase
US5777195A (en) 1996-05-17 1998-07-07 The Rockefeller University Knockout mutant mouse for DARPP-32 and use thereof
JPH1143499A (ja) * 1996-09-11 1999-02-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規タンパク質およびそのｄｎａ
US5885834A (en) * 1996-09-30 1999-03-23 Epstein; Paul M. Antisense oligodeoxynucleotide against phosphodiesterase
GB9622363D0 (en) 1996-10-28 1997-01-08 Celltech Therapeutics Ltd Chemical compounds
WO1998028281A1 (en) 1996-12-23 1998-07-02 Celltech Therapeutics Limited Fused polycyclic 2-aminopyrimidine derivatives, their preparation and their use as protein tyrosine kinase inhibitors
SE9701398D0 (sv) 1997-04-15 1997-04-15 Astra Pharma Prod Novel compounds
IT1291372B1 (it) 1997-05-21 1999-01-07 Schering Plough S P A Uso di analoghi eterociclici di 1,2,4-triazolo (1,5-c) pirimidine per la preparazione di medicamenti utili per il trattamento delle malattie
WO1999020273A1 (en) * 1997-10-17 1999-04-29 The Rockefeller University Use of an inhibitor of the dephosphorylation of darpp-32 for treating schizophrenia
US6013621A (en) * 1997-10-17 2000-01-11 The Rockfeller University Method of treating psychosis and/or hyperactivity
GB9722520D0 (en) * 1997-10-24 1997-12-24 Pfizer Ltd Compounds
US6423716B1 (en) 1998-03-31 2002-07-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nitrogenous heterocyclic compounds
US6133273A (en) 1998-05-08 2000-10-17 American Home Products Corporation Pyrazolopyrimidine-2,4-dione sulfonamides
PE20000728A1 (es) 1998-06-26 2000-08-21 Cocensys Inc Heterociclos 4-bencil piperidina alquilsulfoxido y su uso como antagonistas receptores subtipo-selectivo nmda
BR9913850A (pt) * 1998-09-17 2001-10-23 Otsuka Pharma Co Ltd Gene ly6h
JP2000224992A (ja) * 1998-11-30 2000-08-15 Tanabe Seiyaku Co Ltd 新規ホスホジエステラーゼ及びその遺伝子
GB9907658D0 (en) 1999-04-06 1999-05-26 Zeneca Ltd Chemical compounds
US6656717B1 (en) * 1999-06-25 2003-12-02 Memory Pharmaceuticals Corp. Cyclic AMP phosphodiesterase isoforms and methods of use
JP2003503354A (ja) 1999-06-30 2003-01-28 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド Ｓｒｃキナーゼ阻害剤化合物
DE60006541D1 (de) 1999-06-30 2003-12-18 Merck & Co Inc Src-kinase hemmende verbindungen
DE19931206A1 (de) 1999-07-07 2001-01-11 Stief Christian Arzneimittel zur Erhöhung des cAMP-Spiegels und deren Verwendung
CA2384101A1 (en) 1999-09-10 2001-03-15 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
CZ20021067A3 (cs) 1999-09-30 2002-11-13 Neurogen Corporation Určité alkylendiaminové substituované pyrazolo[1,5-a]- 1,5-pyrimidiny a pyrazolo[1,5-a]-1,3,5-triaziny
DZ3218A1 (fr) 1999-10-11 2001-04-19 Pfizer Pyrimidine-7-ones 5-(2-substitutees-5-heterocyclylsulphonylpyride-3-yl)-dihydropyrazolo[4,3-d] servant d'inhibiteurs de la phosphodiesterase
IL152925A (en) 1999-10-21 2010-04-15 Pfizer Pharmaceutical preparations for the treatment of neurological disease containing an inhibitor of ring guanizine '3', 5 '- monophosphate phosphodiesterase 5 and one of gabapentin or pregabalin
AU2005201482A1 (en) 1999-11-08 2005-05-05 Pfizer Inc. Compounds for the treatment of female sexual dysfunction
SE9904724D0 (sv) * 1999-12-22 1999-12-22 Carlsson A Research Ab New modulators of dopamine neurotransmission I
WO2001078711A2 (en) 2000-04-19 2001-10-25 Lilly Icos, Llc. Pde-v inhibitors for treatment of parkinson's disease
US6693099B2 (en) 2000-10-17 2004-02-17 The Procter & Gamble Company Substituted piperazine compounds optionally containing a quinolyl moiety for treating multidrug resistance
SE0102315D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 Astrazeneca Ab Compounds
JP2004538323A (ja) * 2001-08-10 2004-12-24 ザ ロックフェラー ユニバーシティー Ｄａｒｐｐ−３２リン酸化のモジュレーションのための組成物及び方法
JP4450365B2 (ja) 2001-08-28 2010-04-14 シェーリング コーポレイション 多環式グアニンホスホジエステラーゼｖ阻害剤
KR20040066788A (ko) 2001-08-31 2004-07-27 더 락커펠러 유니버시티 프스포다이에스터레이즈 활성 및 뇌에서프스포다이에스터레이즈 1ｂ 매개되는 신호의 조절
US6649908B2 (en) 2001-09-20 2003-11-18 Agilent Technologies, Inc. Multiplexing capillary array for atmospheric pressure ionization-mass spectrometry
HN2002000317A (es) 2001-11-02 2003-05-21 Pfizer Inhibidores de pde9 para tratamiento de trastornos cardiovasculares
US20030195205A1 (en) 2001-11-02 2003-10-16 Pfizer Inc. PDE9 inhibitors for treating cardiovascular disorders
MXPA04004170A (es) 2001-11-02 2004-09-06 Pfizer Prod Inc Tratamiento del sindrome de resitencia a la insulina y diabetes de tipo 2 con inhibidores de pde9.
MXPA04004370A (es) 2001-11-09 2004-08-11 Schering Corp Derivados policiclicos de guanina inhibidores de fosfodiesterasa v.
US7579324B2 (en) 2002-02-15 2009-08-25 C-A-I-R Biosciences Gmbh Conjugates of biologically active compounds, methods for their preparation and use, formulation and pharmaceutical applications thereof
EP1476200A4 (en) 2002-02-21 2008-08-13 Univ Rockefeller COMPOSITION AND METHOD FOR REGULATING CALCIUM DEPENDENT SIGNALING IN THE BRAIN
SE0203825D0 (sv) 2002-12-20 2002-12-20 Astrazeneca Ab Novel fused heterocycles and uses thereof
US20050048573A1 (en) 2003-02-03 2005-03-03 Plexxikon, Inc. PDE5A crystal structure and uses
WO2004087906A1 (en) 2003-03-31 2004-10-14 Pfizer Products Inc. Crystal structure of 3',5'-cyclic nucleotide phosphodiesterase 1b (pde1b) and uses thereof
CA2517487A1 (en) 2003-04-01 2004-10-14 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Inhibitors of phosphodiesterases in infertility
CN101248050B (zh) 2005-06-06 2013-07-17 武田药品工业株式会社 有机化合物
WO2007025103A2 (en) 2005-08-23 2007-03-01 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds for treating reduced dopamine receptor signalling activity
MX2008015489A (es) 2006-06-06 2009-01-13 Intra Cellular Therapies Inc Compuestos organicos.
WO2008055959A1 (en) 2006-11-09 2008-05-15 Galapagos N.V. Novel compounds useful for the treatment of degenerative & inflammatory diseases
US9198924B2 (en) 2006-11-13 2015-12-01 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
US9006258B2 (en) 2006-12-05 2015-04-14 Intra-Cellular Therapies, Inc. Method of treating female sexual dysfunction with a PDE1 inhibitor
CN104370918A (zh) 2007-12-06 2015-02-25 武田药品工业株式会社 有机化合物
CA2707218A1 (en) 2007-12-06 2009-06-11 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds
WO2010132127A1 (en) 2009-05-13 2010-11-18 Intra-Cellular Therapies, Inc. Organic compounds

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