KR20050044726A

KR20050044726A - 플라비바이러스 ｎｓ1 서브유닛 백신

Info

Publication number: KR20050044726A
Application number: KR1020047008702A
Authority: KR
Inventors: 하울리폴; 레이러소냐; 카르도사메리제인; 헨리섬마그델린시아
Original assignee: 버베리안 노딕 에이/에스; 벤처 테크놀로지스 에스디엔 비에이치디
Priority date: 2001-12-04
Filing date: 2002-11-20
Publication date: 2005-05-12
Anticipated expiration: 2022-11-20
Also published as: JP2005511042A; CA2466413C; EP1456230A2; CA2466413A1; CN101397574A; KR101042458B1; CN1602316A; AU2002356690A1; US20060159699A1; AU2002356690B2; US20100047280A1; US20100136054A1; US7759116B2; CN102409063A; JP4500049B2; EP2345665A2; WO2003048184A2; EP2345665A3; WO2003048184A3; US8815501B2

Abstract

본 발명은 플라비바이러스(Flavivirus)의 NS1 단백질 또는 그의 일부분에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 플라비바이러스 및 하나 또는 그 이상의 다른 플라비바이러스에 대한 백신으로 유용한 뎅기(Dengue) 바이러스의 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 모든 혈청형(serotype)의 뎅기 바이러스에 대한 백신으로 유용한 뎅기 바이러스 혈청형, 특히 혈청형 2의 NS1 단백질 또는 그의 일부분에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 플라비바이러스 NS1 또는 그의 일부분을 코딩하는 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터 및 플라비바이러스 NS1을 포함하거나 또는 발현하는 백신에 관한 것이다.

Description

플라비바이러스 ＮＳ1 서브유닛 백신 {Flavivirus NS1 Subunit Vaccine}

본 발명은 플라비바이러스(Flavivirus)의 NS1 단백질 또는 그의 일부분에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 상기 플라비바이러스 및 하나 또는 그 이상의 다른 플라비바이러스에 대한 백신으로 유용한 뎅기(Dengue) 바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 모든 혈청형(serotype)의 뎅기 바이러스에 대한 백신으로 유용한 뎅기 바이러스 혈청형, 특히 혈청형 2의 NS1 단백질 또는 그의 일부분에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 플라비바이러스 NS1 또는 그의 일부분을 코딩하는 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터 및 플라비바이러스 NS1을 포함하거나 또는 발현하는 백신에 관한 것이다.

뎅기열(dengue fever)에 대한 병인체는 플라비비리대 과(family flaviviridae)의 플라비바이러스 속(Flavivirus genus)에 속하는 뎅기 바이러스이다(Burke and Monath, 2001). 특별히 중요한 플라비바이러스 서브그룹은 흔히 모기-매개성(mosquito-borne) 플라비바이러스라고 불리는, 즉 모기에 의해 전달되는 플라비바이러스이다. 상기 그룹은 앞서 언급한 뎅기 바이러스뿐만 아니라 서나일(West nile) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스 및 황열(Yellow fever) 바이러스와 같은 다른 중요한 바이러스를 포함한다(Fields Virology, ed. by Fields B.N., Lippincott-Raven Publishers, 3rd edition 1996, ISBN: 0-7817-0253-4, 931-1034). 상기 바이러스들에 의해 전염되는 전형적인 질병으로는 서나일 바이러스에 의해 유도되는 서나일 열, 서나일 뇌염, 일본 뇌염 바이러스에 의해 유도되는 뇌염, 황열 바이러스에 의해 유도되는 황열, 뎅기 바이러스에 의해 유도되는 뎅기열, 뎅기 출혈열(DHF, dengue hemorrhagic fever) 및 뎅기 쇼크 신드롬(DSS, Dengue shock syndrome)이 있다.

플라비바이러스는 바이러스의 게놈과 결합하는 뉴클레오캡시드를 형성하는 캡시드(capsid) 단백질(C)과 이를 둘러싸는 지질 이중층에 박혀있는 M(membrane) 및 E(envelope) 단백질로 구성되는 세 개의 구조 단백질에 의해 형성되며, 막이 있고, 단일-가닥인 양성-센스(positive-sense) RNA 바이러스이다. 상기 게놈은 약 11 kb 길이이며 약 3,400개의 아미노산 잔기를 가지는 전구체 폴리단백질을 코딩하는 단일한 열린 해독 틀(open reading frame)을 포함하고 있다. 각각의 바이러스 단백질은 세포 및 바이러스 프로테아제(protease)의 작용에 의해서 상기 전구체로부터 생성된다. 상기 세 개의 구조 단백질(C, M 및 E)은 폴리단백질의 N-말단 부위로부터 유래되며, 이후 7개의 비구조 단백질인 NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5가 뒤따른다(Lindenbach 및 Rice, 2001).

당단백질인 NS1은 모든 플라비바이러스에 존재하며 바이러스의 생존에 필수적인 것으로 보인다. 뎅기 바이러스 NS1은 가용성 육량체(hexamer) 형태로 감염된 포유동물 세포로부터 분비된다(Flamand 등, 1999). 상기 비공유적으로 결합된 육량체 복합체(complex)는 세 개의 이량체 서브유닛에 의해 형성되며, 310 kDa의 분자량을 가진다. 이량화(dimerization)는 NS1 단백질이 세포막으로 이동하기 위한 선행조건이며, 여기에서 상기 단백질은 감염된 세포 표면에 있는 독특한 바이러스 거주(resident) 단백질로 존재한다.

뎅기 감염을 매개하는 곤충 세포주에서는 그렇지 않지만, 포유동물 세포에서는 이동된 NS1의 일부가 세포외 환경으로 방출된다. 세포외 NS1은 높은 육량체 올리고머 형태로 존재하는 가용성 단백질 또는 바이러스가 아닌 미세입자와 결합한 형태로 분비된다. 아울러, NS1은 뎅기 바이러스에 감염된 환자의 혈청에서 순환하는 것으로 발견되었는데, 이것은 NS1의 분비가 인간 숙주에서의 플라비바이러스 감염의 중요한 역할을 한다는 것을 제시한다. 플라비바이러스의 감염 과정 동안 NS1 단백질은 강한 항체 반응을 일으키며, 이것은 아마도 보체-매개성(complement-mediated) 경로(Schlesinger, JJ 등, 1987) 및 항체-의존성 세포독성(ADCC, antibody-dependent cell cytotoxicity, Schlesinger, JJ 등, 1993)을 통하여 숙주에서 감염된 바이러스를 제거하는 것을 돕는 것으로 보인다.

네가지 혈청형의 뎅기 바이러스 혈청형 1(Den-1) 내지 뎅기 바이러스 혈청형 4(Den-4)를 포함하는 뎅기 바이러스는 인간의 감염과 관련되는 플라비바이러스 속의 가장 중요한 일원이며, 독감과 유사한 증상으로부터 심각하거나 또는 치명적인 질환, 쇼크 증상을 가지는 뎅기 출혈열 등과 같은 범위의 질병을 일으킨다. 뎅기의 출현은 모기 벡터가 풍부한 열대 및 아열대 지역의 인구 밀집 지역에서 계속적으로 중요한 공중 보건 문제로 남아있다.

세계의 많은 지역에서 모기-매개성 플라비바이러스에 의해 유도되는 뎅기 감염 및 다른 질병이 확산되는 것은 뎅기열(DF) 및 뎅기 출혈열을 예방할 수 있는 뎅기 백신 및 일부 또는 모든 모기-매개성 플라비바이러스에 의해 유도되는 감염에 대하여 면역화된 인간을 방어하기 유용한 백신을 개발하기 위한 많은 노력을 낳게 했다.

대부분의 DF는 상기 네 가지 혈청형 중 어느 한가지에 의해 처음으로 감염된 후 나타나는 것이 분명하며, DHF는 처음 감염된 혈청형의 뎅기 바이러스와는 다른 혈청형에 의해 두 번째로 감염된 인간에게 일어나는 비율이 크다. 상기와 같은 발견으로부터 뎅기 혈청형에 대한 항체를 가지고 있는 인간이 적당한 기간에 다른 바이러스 혈청형에 의해 순차적으로 감염되면 어떤 경우에 DHF가 일어날 수 있다는 가설이 제기되었다. 항체-의존성 상승(enhancement) 반응이 뎅기 바이러스뿐만 아니라 막을 가진 다른 바이러스에 대해서도 시험관내에서 알려져 왔으며, DHF의 병인론에 있어서 중요한 메카니즘으로 간주되고 있다.

DHF는 일반적으로 복수의(셋 혹은 넷) 바이러스 혈청형이 동시에 존재하는 지역에서 발생하는 것으로 관찰되었다. 동남아시아 국가와 같이 풍토병 DHF를 가지는 국가에서는 연령-특이적 발병 비율이 어린이에게서 높으며, 높은 연령 그룹에서는 DHF의 발병 건수가 감소한다. 이것은 뎅기에 대한 혈청유병(seroprevalence)의 증가와 대략적으로 일치하며, 자연 감염이 방어성 면역을 유발시킬 수 있음을 가리킨다. 상기와 같은 현상은 A형 간염 바이러스와 같은 다른 바이러스 감염에서 관찰되는 것과는 유사하지 않다. 임상에서 관찰해보면 환자들은 DHF를 두차례 경험할 수도 있지만(Nimmannitya 등, 1990) 이것은 매우 드문 경우이며, 두 번째 및 이후의 감염을 일으키는 혈청형을 정확하게 동정하는 것이 어렵다. 동일한 구역에서 모든 네가지 뎅기 바이러스 혈청형이 존재함에도 불구하고 지금까지 동일한 인간에게 네차례 감염된 경우는 보고된 바 없다. 이것은, 자연에서는 동일한 인간이 두가지 또는 세가지 뎅기 바이러스 혈청형에 감염되면 교차-반응성 항체 또는 심지어 교차-반응성 세포독성 임파구 반응을 일으킨다는 것을 제시한다. 이로부터 자연에 존재하는 다른 뎅기 바이러스 혈청형에 의해 감염되는 것으로부터 조절 또는 방어될 수 있다.

현재 승인된 뎅기 백신은 없다. 오늘날, 뎅기 바이러스의 감염 방지는 주된 모기 벡터인 애데스 애집티(Aedes aegypti)의 통제에 의존한다. 살충제 내성, 지방 보건국이 효과적인 모기 통제 프로그램을 유지하게 할 수 있게 해주는 기술 및 재정적 지원의 부족 및 벡터 모기 및 뎅기 바이러스의 계속되는 지역적인 전파가 현재의 모기 통제 프로그램에 의해 뎅기 감염을 방지하는 것을 실질적으로 불가능하게 만든다. 따라서, 뎅기 바이러스 감염을 방지하기 위해서는 모든 네가지 혈청형의 뎅기 바이러스에 대한 안전하고 효과적인 백신을 개발하는 것이 대부분의 비용-효과적인 방법들보다 우선하는 것으로 WHO에 의해 지정되었다. WHO는 뎅기 및 DHF에 대한 이상적인 백신은 순차적인 감염이 일어나지 않도록 모든 혈청형에 의해 유발되는 감염을 방지할 수 있는 종류여야 함을 권고하였다.

상기 목적을 위하여, WO98/13500에서는 모든 뎅기 바이러스 혈청형을 발현하는 재조합 변형 백시니아 바이러스 앙카라(MVA, modified vaccinia virus ankara)를 사용하거나 또는 각각의 재조합 MVA가 한가지 뎅기 바이러스 혈청형에 대하여 적어도 한가지의 항원을 발현하는 네가지 재조합 MVA를 사용할 것을 제시하였다. 두가지 전략 모두 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 백신화를 위한 매우 유망한 전략을 제공한다. 그러나, 투여되었을 때 한가지 이상의 플라비바이러스 또는 한가지 이상 혈청형의 뎅기 바이러스, 바람직하게는 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응을 일으키는 단일 서브유닛 백신을 제공하는 것이 요구된다. 아울러, WO98/13500은 뎅기 바이러스 NS1을 코딩하는 재조합 MVA를 개시하고 있다. WO98/13500에서는 한가지 뎅기 바이러스 혈청형으로부터 유래되는 항원이 상기 항원이 기원하는 뎅기 바이러스 혈청형에 대해서 뿐만 아니라 다른 뎅기 바이러스 혈청형 유래의 항원에 대해서도 면역 반응을 일으킨다는 내용은 개시되어 있지 않다.

WO99/15692는 하나 또는 그 이상의 DNA 서열을 포함하고 발현할 수 있으며, 면역 상승 또는 항체 의존성 상승에 영향을 줄 수 없는 뎅기 바이러스 항원을 코딩하는 재조합 MVA를 개시하고 있다. WO99/15692에서는 한가지 뎅기 바이러스 혈청형 유래의 항원이 상기 항원이 기원하는 뎅기 바이러스 혈청형에 대해서 뿐만 아니라 다른 뎅기 바이러스 혈청형 유래의 항원에 대해서도 면역 반응을 일으킨다는 내용은 개시되어 있지 않다.

도 1a는 본 발명의 실시예에서 사용된 콘스트럭트(construct)의 뎅기 NGC 균주 "신호 서열+NS1" cDNA 단백질 코딩 서열을 보여준다. 자연 상태에서의 NS1 유전자의 개시 부위는 화살표로 나타내었다. 중요한 특징은 ATG 개시 코돈 및 중지 코돈(본 실시예에서는 "TAG")이 삽입되어 있다는 점이다. 뉴클레오타이드 서열의 번호는 NGC 균주 게놈(진뱅크 기탁번호 AF038403)에서의 위치를 나타낸다. 도 1a의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 서열번호 5와 대응된다. 아미노산은 독립적으로 서열번호 6에 나타나 있다.

도 1b는 뎅기 NGC 균주 "신호 서열+NS1" 단백질 코딩 서열을 포함하는 플라스미드 pAF7NS1의 개략도이다.

도 1c는 상기 카세트의 PCR 증폭을 위한 pBN345 및 oBN338 프라이머 결합 부위를 보여주는 플라스미드 pAF7내의 NS1 카세트의 뉴클레오타이드 서열이다. 도 1c의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 서열번호 7과 대응된다. 아미노산은 독립적으로 서열번호 8에 나타나 있다.

도 1d의 윗부분은 뎅기 NGC 균주 NS1 아미노산 서열(뎅기 NCG 폴리단백질의 아미노산 776 내지 1127, 진뱅크 기탁번호 AF038403)의 카이트-둘리틀(Kyte-Doolittle) 소수성 좌표(hydrophobicity plot)를 나타낸다. 0 보다 윗쪽의 수치는 소수성을 나타낸다. 아랫부분은 E 단백질 C-말단의 마지막 28 아미노산(아미노산 748 내지 775)으로부터 유래되는 신호 서열을 포함하는 뎅기 NGC 균주 NS1 아미노산 서열의 카이트-둘리틀 소수성 좌표를 나타낸다. 총 아미노산 서열은 뎅기 NCG 폴리단백질(진뱅크 기탁번호 AF038403)의 748 내지 1127 아미노산을 나타내며, 상기 균주의 경우 "ATG" 개시 코돈은 있으나 중지 코돈은 없다. Sig=신호 서열. 0 보다 윗쪽의 수치는 소수성을 나타낸다.

도 2는 "폭스바이러스 프로모터+신호 서열+NS1" 발현 카세트의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 도 2의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 서열번호 9와 대응된다. 아미노산은 독립적으로 도 10에 나타나 있다. 간략히 설명하면, 최소 폭스바이러스 초기/후기 프로모터 인자는 뎅기 바이러스 혈청형 2의 NS1 단백질의 발현을 조절하며, 상기 NS1 단백질의 N-말단은 E 단백질의 C-말단 28 아미노산과 융합된다. 번역은 핵산 서열에 삽입된 TAG 중지 코돈에서 종결된다.

도 3a는 클론 pBN41을 생산하기 위하여 NS1 발현 카세트를 pBNX07의 블런트(blunt) 말단 Xho I 부위(블런트 말단 클로닝)로 클로닝하는 것을 보여준다. PPr = 폭스바이러스 프로모터, D2F1 = 결실 부위 2의 인접부위(flank) 1, NPT II = 네오마이신 저항 유전자, IRES = 내부 리보좀 도입 부위, EGFP = 증가된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescence protein), (pBN41에서의) NS1 = 신호 서열 +NS1, D2F2 = 결실 부위 2의 인접부위 2, Sig = 신호 서열, AmpR = 암피실린 저항 유전자.

도 3b는 MVA의 여섯군데 결실 부위의 위치(-J- = 결실 부위의 접합점)를 보여주는 MVA(진뱅크 U94848)의 HindIII 지도이다. "PPr+NPT II+IRES+EGFP+PPr+NS1" 카세트는 MVA의 결실 부위 2 위치에 삽입되었다. PPr = 폭스바이러스 프로모터, NPT II = 네오마이신 저항 유전자(단백질 코딩 서열), IRES = 내부 리보좀 도입 부위, NS1 = 신호 서열 + 뎅기 2 NGC 균주의 NS1 단백질 코딩 서열.

도 4는 세 마리 토끼 모두에 대하여 면역후 혈청 적정(titration)을 읽은 ELISA 흡광도 그래프이다.

도 5는 ELISA 교차 반응성 연구를 보여주는 그래프이다. DENV-1, DENV-3, DENV-4, JEV 및 WNV로 감염된 세포 용해물(lysate)을 이용한 38일(A) 및 66일(B)에서의 토끼 혈청의 교차 반응성이 ELISA 분석에 의해 검사되었다.

발명의 목적

따라서, 본 발명의 목적은 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 혈청형 유래로서 안정하고 쉽게 생산될 수 있으며, 백신화된 인간을 백신이 유래되는 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 혈청형뿐만 아니라 다른 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 혈청형에 대해서도 방어하는 면역 반응을 일으키는 백신을 제공하는 것이다. 본 발명의 특별한 목적은 백신화된 인간을 모기-매개성 플라비바이러스 또는 백신이 유래되는 플라비바이러스 혈청형뿐만 아니라 다른 모기-매개성 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 혈청형에 대해서도 방어하는 모기-매개성 플라비바이러스 유래의 백신을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 한가지 뎅기 바이러스 혈청형으로부터 유래되고 적어도 두가지 바람직하게는 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 의한 감염으로부터 인간을 방어하는 백신을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적들은 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분 및 각각 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 DNA 서열을 사용함으로써 해결되었다. 특히, 한가지 모기-매개성 플라비바이러스로부터 유래되고, 또한 상기 백신이 유래되는 모기-매개성 플라비바이러스로부터 감염되는 것뿐만 아니라 적어도 다른 한가지 모기-매개성 플라비바이러스에 대한 감염에 대해서도 인간을 방어하는 백신을 제공하기 위한 목적은 모기-매개성 플라비바이러스, 특히 뎅기 바이러스, 바람직하게는 뎅기 바이러스 혈청형 2 및 이에 대응하는 DNA 서열을 사용함으로써 해결되었다. 더욱 구체적으로는, 한가지 뎅기 바이러스 혈청형에서 유래되고, 또한 적어도 두가지, 바람직하게는 적어도 세가지, 더욱 바람직하게는 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 감염 및 바람직하게는 다른 플라비바이러스, 특히 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스 및 서나일 바이러스와 같은 모기-매개성 플라비바이러스에 대한 감염으로부터 인간을 방어하는 백신을 제공하기 위한 목적은 뎅기 바이러스, 특히 뎅기 바이러스 혈청형 2의 NS1 단백질 또는 그의 일부분 및 이에 대응하는 DNA 서열을 사용함으로써 해결되었다.

실험 부분에서 더욱 구체적으로 볼 수 있는 바와 같이, 백신화 후 다시(de novo) 발현되는 한가지 혈청형의 뎅기 바이러스 유래 NS1 단백질은 뎅기 바이러스 혈청형 1, 2, 3 및 4와 함께 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스 및 서나일 바이러스와 같은 플라비바이러스 속의 다른 일원의 NS1 단백질과 교차 반응하는 항체 반응을 일으킬 수 있다. 따라서, 한가지 뎅기 바이러스 혈청형 기원 유래의 NS1 단백질은 적어도 두가지, 더욱 바람직하게는 세가지, 더욱 더 바람직하게는 네가지 모든 혈청형의 뎅기 바이러스 및 추가로 하나 또는 그 이상의 다른 플라비바이러스 속 바이러스에 대한 동시 방어를 위한 공통적인 DHF 서브유닛 백신이다. 상기 서브유닛 백신 전략에서 E 단백질은 관여하고 있지 않기 때문에, 뎅기 바이러스 혈청형의 순차적인 노출에 따른 항체 의존성 상승(ADE)에 대한 위험은 없으며, 따라서 뎅기 감염이 자연적으로 일어나는 동안 백신과 관련되는 DHF가 유발되지는 않는다.

NS1 단백질은 핵산, 바람직하게는 적어도 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 DNA로부터 발현될 수 있다. 상기 문장에 있어서, "적어도"라는 용어는 발현 카세트가, 하기에 더욱 구체적으로 정의된 바와 같이, 독립된 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분과 융합된 단백질/펩타이드와 같은 추가적인 단백질/펩타이드를 코딩할 수 있는 것으로 해석된다. 본 명세서에 있어서, "DNA"는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 선형 또는 원형 DNA 또는 플라스미드 또는 바이러스 게놈 형태의 DNA와 같은 모든 유형의 DNA를 의미한다. 플라비바이러스는 RNA 바이러스이기 때문에 플라비바이러스 NS1 단백질을 코딩하는 DNA는 cDNA 또는 합성 DNA와 같은 비-자연 발생적 DNA이다.

"플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 발현 카세트"라는 용어는 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분의 코딩 서열이 전사, 특히 전사의 개시를 조절하는 인자에 의해 선행되는 것으로 해석된다. 상기 전사 조절 인자의 예에는 원핵생물 프로모터(promoter) 및 진핵생물 프로모터/인핸서(enhancer)가 있다. 바람직한 진핵생물 프로모터/인핸서는 인간 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus) 즉시 초기(immediate early) 프로모터/인핸서 및 7.5 프로모터와 같은 폭스바이러스(poxvirus) 프로모터 및 실시예 부분에서 개시된 것과 같은 폭스바이러스 최소(minimal) 프로모터가 있다. 폭스바이러스 최소 프로모터의 서열은 도 2 뿐만 아니라 서열번호 9에 개시되어 있다. 상기 발현 카세트는 필요하다면 원핵생물 종결 인자 또는 진핵생물 폴리 A 신호 서열과 같은 전사의 종결을 조절하는 인자를 추가로 포함할 수 있다.

상기 발현 카세트는 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분만을 발현하거나, 또는 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분과 함께 하나 또는 그 이상의 플라비바이러스 단백질/펩타이드를 추가로 발현할 수 있으며, 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분 및 추가적인 단백질/펩타이드는 독립적인 단백질/펩타이드 또는 융합된 단백질/펩타이드로 생산될 수 있다. 만일 본 명세서에서 달리 정의되지 않는다면, 본 발명에 있어서 "펩타이드"라는 용어는 적어도 10개 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 20개 아미노산, 가장 바람직하게는 적어도 25개 아미노산의 연속적인 아미노산 서열의 나열(stretch)을 의미한다.

추가적인 플라비바이러스 단백질은 전체 길이의 E 단백질은 아닌데, 그 이유는 상기 단백질이 DHF의 발생에 관여하는 것으로 보이기 때문이다. 따라서, 만일 추가적인 플라비바이러스 펩타이드가 E 단백질 유래라면, 40 아미노산 이하, 바람직하게는 35 아미노산 이하를 포함하여야 한다. 만일 E 단백질 유래 아미노산 서열의 나열이 NS1 단백질 또는 그의 일부분과 함께 발현된다면, 상기 아미노산 나열은 ADE 또는 DHF의 발생에 관여하는 에피토프(epitope)를 포함하지 않아야 한다.

만일 상기 발현 카세트가 NS1 단백질 또는 그의 일부분뿐만 아니라 추가로 플라비바이러스 단백질/펩타이드를 독립적인 단백질/펩타이드 형태로 발현한다면, 발현 카세트는 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열 및 추가적인 플라비바이러스 단백질을 코딩하는 서열 사이에 내부 리보좀 도입 부위(IRES, internal ribosome entry site)를 포함할 수 있다. IRES 인자는 당업자에게 있어서 잘 알려져 있다. IRES 인자의 예로는 피코나바이러스(picornavirus) IRES 인자 또는 C형 간염 바이러스의 5' 비코딩 영역이 있다.

다른 한편으로, 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 핵산 서열은 NS1 단백질 또는 그의 일부분과 추가적인 플라비바이러스 단백질/펩타이드 사이의 융합 단백질이 생산되는 방식으로 추가적인 플라비바이러스 단백질/펩타이드를 코딩하는 DNA 서열과 융합될 수 있다. 만일 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분 및 추가적인 플라비바이러스 단백질/펩타이드가 융합 단백질/펩타이드의 형태로 생산된다면, 각각의 코딩 서열이 틀(frame) 내에서 융합된다.

바람직한 실시예에서, NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 DNA 서열은 E 단백질의 글리코실화 신호 서열을 코딩하는 서열에 의해 선행된다. 상기 실시예에 따르면, NS1 단백질 또는 그의 일부분과 융합된 E 단백질 글리코실화 신호 서열을 포함하는 융합 단백질이 생산된다. 상기에서 언급한 바와 같이, E 단백질 유래 아미노산 서열 나열은 가능한 짧아야 하며, 상기 아미노산 나열이 ADE 및 DHF의 생산에 관여하는 에피토프를 포함하는 경우는 제외되어야 한다. E 단백질의 글리코실화 신호 서열은 상기 요구조건을 충족시킨다.

다른 바람직한 실시예에서, 본 발명에 따라 사용되는 상기 발현 카세트는 유일한 플라비바이러스 서열로 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함한다. 따라서, 상기 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 발현 카세트는 플라비바이러스 게놈의 다른 부분, 특히 NS2A 또는 E 단백질 유래의 다른 펩타이드/단백질을 발현하지 않는다.

다른 실시예에서, 본 발명에 따른 DNA는 플라비바이러스 유래가 아닌 단백질/펩타이드와의 융합 단백질 형태로 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 발현한다. 상기 단백질/펩타이드는 비-플라비바이러스 신호 서열 또는 발현된 융합 단백질의 검출 또는 정제에 유용한 태그(tag)와 같은 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따라 사용된 발현 카세트에 존재하는 플라비바이러스 서열의 일반적인 구조를 이해하기 위해서는 플라비바이러스 게놈의 구조를 간략하게 요약하는 것이 도움을 줄 것이다: 자연적인 플라비바이러스 감염동안에, 상기 바이러스는 단일 폴리단백질을 생산하며, 이후 이것은 일차로 숙주 세포의 프로테아제에 의해서 절단되고 이후 바이러스에 의해 코딩되는 프로테아제에 의해 하기 단백질들로 절단된다: C, PrM 및 M, E, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5(폴리단백질 전구체에 따른 단백질 순서). 따라서, DNA 서열, 특히 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 cDNA 서열은 "ATG" 개시 코돈(start codon)의 첨가를 필요로 한다. 바람직한 실시예에서, 상기 개시 ATG 뒤에 글리코실화 신호를 코딩하는 서열이 뒤따라서 새롭게 합성된 NS1 단백질이 소포체 내에서 글리코실화된다. 상기 신호 서열은 당업자에게 잘 알려져 있다. 마지막으로, 상기 단백질-코딩 카세트는 중지 코돈(stop codon)을 필요로 하며, 이것은 cDNA 서열을 코딩하는 단백질의 3' 말단에 첨가된 TAG일 수 있다. 본 발명에서 사용된 실시예에서, "ATG+신호 서열" 인자는 뎅기 바이러스 새로운 기니아 균주("NGC 균주", 진뱅크 기탁번호 AF038403)에 있어서 아미노산 M(ATG)으로 시작되는 E 단백질의 소수성 C-말단(마지막 28 아미노산)을 코딩하는 서열로부터 유래되었다. 본 발명에 따른 전형적인 발현 카세트는 도 2 및 서열번호 9 및 서열번호 10에 개시되어 있다.

따라서, 요약하면 상기 실시예는 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 DNA의 용도에 관한 것으로서, 상기 코딩 서열은 개시 코돈("ATG") 및 바람직하게는 상기에서 정의된 바와 같이 E 단백질 유래의 글리코실화 신호 서열을 코딩하는 서열에 의해 선행되고, 상기 코딩 서열은 번역 중지 코돈에 의해 종결된다(도 1a, 1c 및 2, 서열번호 5 내지 10).

본 발명에 따라 사용될 수 있는 DNA 서열은 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩한다. "플라비바이러스"라는 용어는 모든 플라비바이러스를 의미한다. 더욱 바람직하게는 상기 "플라비바이러스"는 서나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스 및 뎅기 바이러스와 같은 모기-매개성 플라비바이러스를 의미한다. 본 발명에 따른 DNA에 의해 코딩되는 한가지 모기-매개성 바이러스 유래의 NS1 단백질 또는 그의 일부분은 백신화된 인간을, 상기 백신이 유래되는 바이러스 또는 바이러스 혈청형의 감염에 대해서 뿐만 아니라 다른 모기-매개성 바이러스 또는 백신이 유래되는 바이러스와는 다른 혈청형의 감염에 대해서도 보호할 수 있어야 한다. NS1 단백질은 바람직하게는 모든 뎅기 바이러스 혈청형이 될 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 NS1 단백질을 코딩하는 서열은 뎅기 바이러스 새로운 기니아 균주("NGC 균주", 진뱅크 기탁번호 AF038403)와 같은 뎅기 바이러스 혈청형 2 유래이다. "서브타입" 및 "혈청형"이라는 용어는 본 명세서를 통하여 상호 교환가능하다.

"NS1 단백질 또는 그의 일부분"이라는 문맥에 있어서의 "그의 일부분"이라는 용어는 "그의 일부분"이 유래하는 NS1 단백질에 대한 특이적 면역 반응을 유도할 수 있을 정도로 충분히 긴 NS1 단백질의 아미노산 나열을 의미한다. 만일, 상기 플라비바이러스가 뎅기 바이러스라면, 아미노산 나열은 모든 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질에 대하여 인간을 포함하는 백신화된 동물에서 면역 반응을 일으키는 아미노산 나열이어야 한다. 실시예 부분에서, 당업자가 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 특이적인 면역 반응을 유도하는지 여부를 어떻게 결정할 수 있는가를 보여주었다. 바람직한 실시예에 따르면, 상기 플라비바이러스 DNA 서열은 전체 NS1 단백질을 코딩한다. 따라서, "NS1 단백질 또는 그의 일부분"이라는 용어는 자연적으로 발생하는 NS1 단백질의 전체 서열 및 여전히 면역 반응을 유발할 수 있는 더 짧은 에피토프 나열을 의미한다.

아울러, "NS1 단백질"이라는 용어는 자연적으로 발생하는 NS1 단백질의 유도체(derivative)에 관한 것이다. 상기 유도체는 자연적으로 발생하는 NS1 단백질에 대하여 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입을 가지는 단백질일 수 있다. 한 예로서, 이러한 유도체는 아미노산 서열에 있어서 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 유사성(homology)을 갖는 단백질이다. 결과적으로, "그의 일부분"이라는 용어는 또한 상기 NS1 단백질 유도체의 일부분에 관한 것이다.

요약하면, 본 발명의 가장 바람직한 실시예 중 하나는 모기-매개성 플라비바이러스 NS1 또는 그의 일부분을 코딩하는 발현 카세트를 포함하는 DNA를 사용하는 것이며, 상기에서 플라비바이러스는 바람직하게는 뎅기 바이러스, 특히 뎅기 바이러스 혈청형 2이고, NS1 단백질 또는 그의 일부분은 전사 조절 인자에 의해 조절된다. 더욱 바람직하게는 본 발명에 따른 DNA는 글리코실화 신호 서열을 가지는 융합 단백질 형태로 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩한다.

추가로, 본 발명은 상기에서 기술한 DNA를 포함하는 벡터 및 본 발명에 따른 면역 반응을 유도하기 위한 상기 벡터의 용도에 관한 것이다. "벡터"라는 용어는 당업자에게 있어서 알려진 모든 벡터를 의미한다. 벡터는 pBR322 또는 pUC 시리즈의 벡터와 같은 플라스미드 벡터일 수 있다. 더욱 바람직하게는 상기 벡터는 바이러스 벡터이다. 본 발명의 명세서에서 "바이랄(viral) 벡터" 또는 "바이러스 벡터"라는 용어는 바이러스 게놈을 포함하는 감염성 바이러스를 의미한다. 이 경우, 본 발명의 DNA는 개개 바이러스 벡터의 바이러스 게놈속으로 클론된다. 이후, 재조합 바이러스 게놈은 패키지(package)되고, 이렇게 해서 얻어진 재조합 벡터는 세포 및 세포주의 감염, 특히 인간을 포함하는 살아있는 동물의 감염을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 전형적인 바이러스 벡터는 아데노바이러스(adenovirus) 벡터, 레트로바이러스(retrovirus) 벡터 또는 아데노 연관 바이러스 2(AAV2)에 기초한 벡터이다. 가장 바람직한 것은 폭스바이러스 벡터이다. 상기 폭스바이러스는 바람직하게는 카나리폭스(canarypox) 바이러스, 파울폭스바이러스(fowlpoxvirus) 또는 백시니아 바이러스일 수 있다. 더욱 바람직하게는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA, Sutter, G. 등, 1994, Vaccine 12; 1032-40)이다. 전형적인 MVA 균주는 ECACC (European Collection of Animal Cell Culture)에 기탁번호 ECACC V00120707로 기탁되어 있는 MVA 575이다. 가장 바람직한 것은 PCT 출원 WO02/42480 (PCT/EP01/13628)에 기술되어 있는 MVA-BN 또는 그의 유도체이다. 상기 출원의 내용들은 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다. MVA-BN은 ECACC에 기탁번호 ECACC V00083008로 기탁되어 있다. MVA-BN 바이러스 벡터는 매우 약독화된 바이러스인 것으로 밝혀졌기 때문에 MVA-BN 또는 그의 유도체를 사용함으로써 플라비바이러스에 대하여 특히 안전한 바이러스 백신을 제공하기 위한 추가적인 기술적 문제가 해결되었다. 특히, MVA-BN은 종래에 알려진 MVA 균주들보다 더욱 약독화된 것으로 판명되었다. MVA-BN은 변형된 백시니아 앙카라 바이러스로부터 유래되었으며, 인간 세포주에서 재생산적으로 복제할 수 있는 능력을 상실한 것으로 특성화된다. MVA-BN은 인간에서의 복제능이 없기 때문에 알려진 모든 백시니아 바이러스 균주들보다 더 안전하다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 상기에서 정의된 MVA-BN 및 MVA-BN의 유도체 DNA를 포함하는 바이러스 벡터를 개시하고 있다. MVA-BN의 형태(feature), MVA 균주가 MVA-BN 또는 그의 유도체인지 여부를 평가하기 위한 생물학적 분석에 대한 기술 및 MVA-BN 또는 그의 유도체를 획득하기 위한 방법은 WO02/42480에 개시되어 있다.

ECACC V00083008에 기탁된 바이러스 "유도체", 즉 MVA-BN의 유도체라는 용어는 WO02/42480에서 정의된 바대로 본 발명에서 사용된다. 하기에서, MVA-BN 유도체의 형태를 간략하게 요약하였다. MVA-BN의 유도체의 정의에 관한 보다 상세한 정보, 특히 MVA 바이러스가 MVA-BN의 유도체인지 여부를 결정하기 위해 사용된 생물학적 분석에 관한 보다 상세한 정보는 WO02/42480에 기술되어 있다. 따라서, 상기 용어는 기탁된 MVA-BM 균주의 하기 특성 중 적어도 한가지를 가지며, 그의 게놈과 하나 또는 그 이상의 차이를 보이는 백시니아 바이러스에 관한 것이다. 바람직하게는 유도체는 적어도 둘, 더욱 바람직하게는 적어도 셋, 가장 바람직하게는 하기 네 가지 MVA-BN의 특성 모두를 가진다.

- 병아리 배아 섬유아세포(CEF, chicken embryo fibroblast) 및 어린 햄스터 신장 세포주 BHK (ECACC 85011433)에서 재생산적인 복제를 할 수 있으나, 인간 세포주 HaCat (Boukamp 등, 1988, J. Cell Biol., 106(3), 761-71)에서는 재생산적인 복제를 할 수 없음

- 생체내에서 복제할 수 없음

- 치사 시도 모델(lethal challenge model)에서 공지된 균주인 MVA 575 (ECACC V00120707)와 비교할 때 높은 면역원성(immunogenicity)을 유도 및/또는

- DNA-프라임(prime)/백시니아 바이러스 부스트(boost) 처방(regime)과 비교할 때, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 적어도 실질적으로 동일한 수준의 면역성을 유도

특히, MVA-BN의 유도체는 필수적으로 MVA-BN과 동일한 복제 특성을 가진다. 기탁된 바이러스와 동일한 "복제 특성"을 가지는 바이러스는 CEF 세포 및 BHK, HeLa, HaCat 및 143B 세포주에서 유사한 증폭 비율로 복제되고, AGR129 형질전한 마우스 모델에서 결정된 것과 유사한 생체내 복제를 보여주는 바이러스이다.

"재생산적인 복제를 할 수 없는"이라는 용어는 WO02/42480에서 정의된 바대로 본 명세서에서 사용된다. 따라서, "재생산적인 복제를 할 수 없는" 바이러스는 인간 세포주 HaCat에서 1 보다 작은 증폭비를 보이는 바이러스이다(Boukamp 등, 1988, J. Cell Biol., 106(3); 761-71). 바람직하게는, 본 발명에 따라 벡터로 사용된 바이러스의 복제율은 인간 세포주 HaCat에서 0.8 또는 그 이하이다. 바이러스의 "증폭 비율"은 처음 세포를 감염시키기 위해 사용된 양(Input)에 대한 감염된 세포로부터 생산된 바이러스(Output)의 비율(증폭 비율)이다. 아웃풋 및 인풋 사이에서 "1"이라는 비율은 감염된 세포로부터 생산된 바이러스의 양이 처음 세포를 감염시키기 위해 사용된 양과 동일한 증폭 상태인 것으로 정의된다.

MVA-BN 및 그의 유도체를 정의하는 문맥에 있어서, "생체내에서 복제할 수 없음"이라는 용어는 WO02/42480에서 정의된 바대로 본 명세서에서 사용된다. 따라서, 상기 용어는 WO02/42480에서 설명된 바대로 인간 및 마우스 모델에서 복제되지 않는 바이러스를 의미한다. WO02/42480호에서 사용된 마우스(AGR129 마우스)는 성숙한 B- 및 T-세포를 생산할 수 없다. 특히, MVA-BN 및 그의 유도체는 10⁷ pfu의 바이러스가 복강내로 투여되어 마우스를 감염시킨 후 적어도 45일, 더욱 바람직하게는 적어도 60일, 가장 바람직하게는 90일 이내의 기간 동안에는 AGR129 마우스를 죽이지 않는다. 바람직하게는, "생체내에서 복제할 수 없음"을 보이는 바이러스는 10⁷ pfu의 바이러스가 복강내로 투여되어 마우스를 감염시킨 후 45일, 바람직하게는 60일 및 가장 바람직하게는 90일 후에 AGR129 마우스의 기관 또는 조직으로부터 어떠한 바이러스도 회복되지 않는 것으로 추가로 특정된다.

MVA-BN 및 그의 유도체는 WO02/42480에서 설명된 것처럼 바람직하게는 치사 시도 마우스 모델에서 결정된 것과 같이 공지된 균주인 MVA 575와 비교할 때 높은 면역원성을 가지는 것에 의해 특정된다. 상기와 같은 모델에서, 백신화되지 않은 마우스는 웨스턴 리저브(Western Reserve) 균주 L929 TK+ 또는 IHD-J와 같은 복제 수용성(competent) 백시니아 균주에 감염된 후 죽어버린다. 복제 수용성 백시니아 바이러스에 감염되는 것은 치사 시도 모델이 기술된 문맥에서 "시도"를 의미한다. 시도후 4일째에 마우스는 일반적으로 죽어 버리며, 난소에서의 바이러스 타이터(titer)는 VERO 세포를 이용한 표준 플라크 분석(standard plaque assay)에 의해 결정된다. 상기 바이러스 타이터는 백신화되지 않은 마우스 및 MVA-BN 및 그의 유도체로 백신화된 마우스에 대해 결정된다. 더욱 구체적으로, MVA-BM 및 그의 유도체는 백신화되지 않은 마우스와 비교할 때 10² TCID₅₀/㎖ 바이러스로 백신화된 후 상기 테스트에서 난소 바이러스 타이터가 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 감소되는 것으로 특정된다.

MVA-BN 또는 그의 유도체는 바람직하게는 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교할 때 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 적어도 실질적으로 동일한 수준의 면역성을 유도하는 것에 의해 특정된다. WO02/42480에서 개시된 "분석 1" 및 "분석 2"중 하나, 바람직하게는 양쪽 모두에서 측정된 CTL 반응이 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교할 때 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서 적어도 실질적으로 동일하다면, 백시니아 바이러스는 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교할 때 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방에서 적어도 실질적으로 동일한 수준의 면역원성을 유도하는 것으로 간주된다. 더욱 바람직하게는, 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 투여 후의 상기 CTL 반응은 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 처방과 비교할 때 적어도 한가지 분석에서 더 높다. 가장 바람직하게는 상기 CTL 반응은 양쪽 분석 모두에서 더 높다.

WO02/42480은 상기에서 정의된 특성을 가지는 MVA-BN 및 그의 유도체가 어떻게 얻어질 수 있는지를 개시한다.

상기에서 정의된 DNA를 폭스바이러스 DNA로 삽입시키는 방법 및 재조합 폭스바이러스를 얻는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 재조합 백시니아 바이러스에 있어서, 본 발명에 따른 DNA의 발현은 바람직하게는, 그러나 배타적이지는 않게, 폭스바이러스 프로모터, 바람직하게는 백시니아 바이러스 프로모터의 전사조절 하에 놓여 있다. 본 발명에 따른 DNA의 삽입은 바이러스 게놈의 비필수(non-essential) 부위에 이루어지는 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, 이형(heterologous) 핵산 서열이 MVA 게놈의 자연 발생 결실 부위로 삽입된다(PCT/EP96/02926에서 개시됨).

요약하면, 본 발명의 가장 바람직한 실시예 중 하나에서는 상기에서 정의된 DNA를 포함하는 벡터를 제공하며, 여기에서 상기 벡터는 MVA-BN 또는 그의 유도체이고 상기 DNA는 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 발현 카세트를 포함하며, 상기 플라비바이러스는 바람직하게는 뎅기 바이러스, 더욱 바람직하게는 뎅기 바이러스 혈청형 2이다.

바람직한 실시예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 또는 몇 가지 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 혈청형에 대한 백신화에 사용되기 위한 본 발명에 따른 벡터에 의해 코딩되는 NS1 단백질 또는 그의 일부분의 유용성에 관한 것이다. 본 발명에 따른 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 정의하기 위하여, NS1을 코딩하는 DNA가 상기 DNA로부터 발현된 산물(product)에 의해 정의되어 있는 상기 상세한 설명 부분을 참고한다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질에 관한 하기 요약은 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 요약하면, 상기 NS1 단백질은 모든 플라비바이러스에 의해 코딩되는 분리된 NS1 단백질 또는 그의 일부분일 수 있다. 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분은 바람직하게는 뎅기 바이러스, 더욱 바람직하게는 뎅기 바이러스 혈청형 2로부터 유래된다. 상기 단백질은 바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분의 아미노산 서열만을 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 NS1 단백질은 효율적인 단백질의 발현을 위해 요구되는 추가적인 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 아미노산/아미노산 서열의 예는 상기에 개시되어 있으며, ATG 코돈의 첨가에 의해 코딩되는 단백질의 N-말단 메티오닌 및 NS1 단백질 또는 그의 일부분의 글리코실화를 위한 신호 서열로 작용하는 E 단백질의 C-말단 유래 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 다른 신호 서열들도 본 발명의 범위내에 포함되어 있다. 다른 실시예에서, 상기 NS1 아미노산 서열 또는 그의 일부분은 다른 단백질/펩타이드와 융합될 수 있다. 융합 파트너의 예로는 태그와 같이 단백질의 동정에 사용되는 서열 또는 다른 플라비바이러스 단백질 또는 그의 일부분의 서열이 있다.

바람직한 실시예에서, 본 발명은 백신, 특히 몇 가지 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 혈청형에 대한 백신으로서의 DNA, 벡터 또는 본 발명에 따른 NS1 단백질 및 그의 일부분에 관한 것이다. "백신"은 화합물, 즉 특이적인 면역 반응을 일으키는 DNA, 단백질, 벡터 또는 바이러스이다.

상기 실시예의 다른 한편에 따르면, 본 발명에 따른 상기 "백신"은 모든 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 뎅기 바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분에 기초하고 있다. 특히, 한가지 뎅기 바이러스 혈청형, 특히 혈청형 2의 NS1 단백질이 적어도 두가지, 바람직하게는 적어도 세가지, 가장 바람직하게는 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 면역 반응 및 바람직하게는 적어도 한가지의 다른 모기-매개성 플라비바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 본 발명에 따른 한가지 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 다른 플라비바이러스의 NS1 단백질에 대한 면역 반응을 유도한다는 것을 발견하였다. 상기에서 지적한 바와 같이, "플라비바이러스"는 바람직하게는 모기-매개성 플라비바이러스이다. 달리 말하면, 본 발명의 발명자들은 다른 실시예에서 본 발명에 따른 한가지 모기-매개성 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분이, 상기 백신을 유도하는 모기-매개성 바이러스뿐만 아니라 다른 모기-매개성 플라비바이러스에 대한 면역 반응도 유도한다는 것을 발견하였다. 따라서, 모기-매개성 플라비바이러스 유래의 백신은 하나 또는 그 이상의 모기-매개성 플라비바이러스에 대한 백신으로 유용하다. 본 명세서에 있어서, "플라비바이러스 유래 벡터" 또는 이와 유사한 용어는 상기에서 정의된 벡터(예를 들면, 폭스바이러스 벡터 또는 플라스미드)가 상기에서 정의된 DNA를 포함하고 있음을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 삽입체 벡터를 의미하며, 벡터 뼈대(backbone)를 의미하지는 않는다. "플라비바이러스 유래 벡터"의 예로는 폭스바이러스 프로모터 및 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 MVA와 같은 폭스바이러스 벡터가 있으며, 상기에서 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열은 ATG 코돈 및 글리코실화 신호 서열을 코딩하는 서열에 의해 선행되며, 상기 코딩 서열은 번역 중지 코돈에 의해 종결된다.

따라서, 상기 DNA, 벡터 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 이용한 백신화는 다양한 범위의 플라비바이러스 또는 적어도 플라비바이러스 혈청형에 대한 단일 서브유닛 백신으로서 유용하다. 따라서, 한가지 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 혈청형 유래의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 DNA 또는 벡터 또는 상기 플라비바이러스 또는 혈청형 유래의 NS1 단백질 또는 그의 일부분은 각각 다른 플라비바이러스 또는 플라비바이러스 혈청형에 대한 백신화를 위한 백신으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 뎅기 바이러스 혈청형 2 유래의 백신은 혈청형 2에 대해서 뿐만 아니라 혈청형 1, 3 및 4 중의 한가지, 두가지 또는 모든 혈청형에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 아울러, 서나일 바이러스, 일본 뇌염 바이러스 및 황열 바이러스와 같은 다른 플라비바이러스에 대하여 인간을 방어하기 위해 유용하게 사용될 수 있다.

바람직한 실시예에서, 본 발명에 따른 DNA는 백신으로 사용된다. 당업자에게 있어서, 본 발명에서와 같이 진핵세포 발현 카세트를 운반하는 네이키드(naked) DNA를 투여하면, 특히 근육내 주사하면, 발현 카세트에 의해 코딩되는 단백질의 발현이 일어난다는 것이 공지되어 있다. 상기 단백질은 면역 시스템에 노출되어서 특이적인 면역 반응이 일어난다.

다른 실시예에서, 백신화는 본 발명에 따른 벡터, 특히 바이러스 벡터, 더욱 바람직하게는 폭스바이러스 벡터, 가장 바람직하게는 MVA 벡터와 같은 백시니아 바이러스 벡터의 투여에 의해 이루어진다.

백시니아 바이러스에 기초한 백신을 제조하기 위하여, 본 발명에 따른 바이러스 특히 MVA-BN 및 그의 유도체는 물리적으로 허용가능한 형태로 변형된다. 이것은 천연두(smallpox)에 대한 백신화를 위해 사용된 폭스바이러스 백신을 제조하기 위한 실험에 기초하여 행해질 수 있다(Stickl, H. 등, 1974, Dtsch. Med. Wschr., 99, 2386-2392). 예를 들면, 정제된 바이러스는 5×10⁸ TCID₅₀/㎖의 타이터로 약 10 mM Tris, 140 mM NaCl pH 7.4에서 제형화된 상태로 -80℃에서 저장된다. 백신 샷(shot)을 제조하기 위하여, 예를 들면 10² 내지 10⁹의 바이러스 입자가 2% 펩톤 및 1% 인간 알부민을 포함하는 100 ㎖의 PBS (phosphate-buffered saline) 내에서 앰플(ampoule) 바람직하게는 유리 앰플로 동결건조된다.

백신화를 위하여 사용된 백시니아 바이러스에 기초한 백신, 특히 MVA-BN에 기초한 백신은 동결건조된 상태로 저장되는 것이 특히 바람직하다. 실시예 부분을 보면, 백신화에 사용된 바이러스가 동결건조된 바이러스 상태로 저장된다면 다른 플라비바이러스 및 플라비바이러스 혈청형에 대한 한가지 플라비바이러스의 NS1 단백질에 의해 유도된 면역반응의 교차 반응 비율뿐만 아니라 면역 반응이 특히 높은 것을 알 수 있다. 따라서, 백신 샷은 바람직하게는 제형 내에서 바이러스를 단계적으로 동결건조시킴으로써 생산될 수 있다. 상기 제형은 만니톨, 덱스트란, 설탕, 글리신, 락토스 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 다른 첨가제 예를 들면, 항산화제 또는 불활성 가스, 안정제 또는 재조합 단백질(예를 들면, 인간 혈청 알부민)과 같은 생체내 투여에 적합한 추가적인 부형제를 포함할 수 있다. 동결건조에 적합한 제형을 포함하는 전형적인 바이러스는 10 mM Tris 버퍼, 140 mM NaCl, 18.9 g/ℓ 덱스트란(분자량 36,000∼40,000), 45 g/ℓ 수크로스, 0.108 g/ℓ L-글루탐산 모노 칼륨염 일수화물(monohydrate) pH 7.4를 포함한다. 동결건조 후, 유리 앰플은 봉합되어서 4℃ 내지 실온에서 수개월간 보관될 수 있다. 그러나, 필요로 하지 않는 동안은, 상기 앰플은 -20℃ 이하의 온도에서 저장되는 것이 바람직하다. 백신화를 위하여, 상기 동결건조물은 0.1 내지 0.5 ㎖의 수용액, 예를 들면 물, 생리식염수 또는 Tris 버퍼에 용해되어 전신 또는 국소, 예를 들면 비경구, 근육내 또는 능숙한 당업자에게 알려진 다른 모든 투여 경로로 투여될 수 있다. 투여 방법, 투여량(dose) 및 투여 횟수는 알려진 방법에 따라 당업자에 의해 최적화될 수 있다. 폭스바이러스 벡터의 경우, 가장 바람직한 것은 피하 또는 근육내 투여이다. 가장 바람직하게는, 백신화는 예를 들면, 3 내지 5주의 간격으로 두 번의 백신 샷에 의해 수행된다.

상기 백신이 본 발명에 따른 DNA를 포함하는 MVA-BN 벡터 또는 그의 유도체라면, 본 발명의 특정한 실시예는 첫 번째 바이알/용기에서 첫 번째 백신화("프라이밍") 및 두 번째 바이알/용기에서 두 번째 백신화("부스팅")를 시키기 위한 본 발명에 따른 MVA-BN 바이러스 벡터를 포함하는 백신화 키트에 관한 것이다.

상기 백신이 상기에서 정의된 DNA를 포함하는 MVA-BN 벡터 또는 그의 유도체라면, 본 발명의 특정한 실시예는 치료학적으로 유효한 양으로 첫 번째 접종(inoculation)("프라임 접종") 및 두 번째 접종("부스팅 접종")시키는 백신의 투여에 관한 것이다. 프라임 접종 및 부스팅 접종 사이의 간격은 예를 들면 2 내지 12주이며, 바람직하게는 예를 들면 3 내지 6주이고, 더욱 바람직하게는 예를 들면 약 3주이다. 백신화를 위해 사용되는 바이러스의 양은 적어도 1×10² TCID₅₀, 바람직하게는 예를 들면 1×10⁷ TCID₅₀ 내지 1×10⁹ TCID₅₀이어야 한다. 아울러, 본 발명의 특정한 실시예는 첫 번째 바이알/용기에서 첫 번째 백신화("프라이밍") 및 두 번째 바이알/용기에서 두 번째 백신화("부스팅") 시키기 위한 상기에서 정의된 MVA-BN 바이러스 벡터를 포함하는 백신화 키트에 관한 것이다.

따라서, 백신 실시예에 따르면 본 발명은 상기에서 정의된 DNA, 벡터 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 포함하는 백신 및 백신을 제조하기 위한 상기 DNA, 벡터 또는 단백질의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명은 백신의 제조를 위한 상기 DNA, 벡터 또는 단백질에 관한 것으로서, 상기에서 NS1 단백질 또는 그의 일부분, 상기 DNA 또는 벡터에 의해 코딩되는 NS1 단백질 또는 그의 일부분은 한가지 뎅기 바이러스 혈청형으로부터 유래되며, 상기 DNA, 벡터 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분은 두가지, 세가지 또는 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 백신으로 사용된다. 가장 바람직하게는, 뎅기 바이러스 혈청형은 혈청형 2이다.

아울러, 본 발명은 상기 DNA를 필요로 하는 인간을 포함하는 동물에 상기 벡터 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 접종하는 단계를 포함하는 플라비바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 상기 방법에 관한 것으로서, 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분 또는 상기 DNA 또는 벡터에 의해 코딩되는 NS1 단백질 또는 그의 일부분은 한가지 뎅기 바이러스 혈청형으로부터 유래되며, 상기 DNA, 벡터 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분은 두가지, 세가지 또는 모든 뎅기 바이러스 혈청형에 대한 백신으로 사용된다.

발명의 요약

본 발명은 특히 하기 내용들을 단독 또는 조합한 것에 관한 것이다:

- 전사 조절 인자 및 적어도 모기-매개성 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산,

- 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는

- 상기 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분의 용도로서, 상기 핵산 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 모기-매개성 플라비바이러스 및 적어도 다른 한가지 모기-매개성 플라비바이러스에 대한 백신을 제조하기 위한 용도.

상기에서, 상기 핵산 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 모기-매개성 플라비바이러스는 뎅기 바이러스 유래인 것을 특징으로 하는 용도.

- 전사 조절 인자 및 적어도 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산,

- 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는

- 상기 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분의 용도로서, 모든 뎅기 바이러스 혈청형 및 선택적으로는(optionally) 적어도 다른 한가지 모기-매개성 플라비바이러스에 대한 백신을 제조하기 위한 용도.

상기에서, 상기 핵산 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 뎅기 바이러스는 뎅기 바이러스 혈청형 2 유래인 것을 특징으로 하는 용도.

상기에서, 모기-매개성 플라비바이러스 또는 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열은 ATG 코돈 및 글리코실화 신호 서열을 코딩하는 서열에 의해 선행되고, 상기 코딩 서열은 번역 중지 코돈에 의해 종결되는 것을 특징으로 하는 용도.

상기에서, 다른 모기-매개성 플라비바이러스는 서나일 바이러스, 황열 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.

상기에서, 상기 벡터는 폭스바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 용도.

상기에서, 상기 폭스바이러스 벡터는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 균주, 특히 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁되어 있는 MVA-BN 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 용도.

상기에서, 상기 폭스바이러스 벡터는 동결건조되고, 투여 전에 약학적으로 허용가능한 희석제내에서 재구성되는 것을 특징으로 하는 용도.

상기에서, 상기 전사 조절 인자는 폭스바이러스 프로모터인 것을 특징으로 하는 용도.

상기에서, 상기 백신은 치료학적으로 유효한 양으로 첫 번째 접종("프라임 접종") 및 두 번째 접종("부스팅 접종")시키는 것을 특징으로 하는 용도.

- 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는

- 상기 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 필요로 하는 인간을 포함하는 동물에 접종하는 단계를 포함하는 플라비바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 플라비바이러스의 감염은 상기 핵산, 또는 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 모기-매개성 플라비바이러스에 의한 감염 및/또는 다른 모기-매개성 플라비바이러스에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 방법.

상기에서, 상기 핵산 또는 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 모기-매개성 플라비바이러스는 뎅기 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.

- 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는

- 상기 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 필요로 하는 인간을 포함하는 동물에 접종하는 단계를 포함하는 플라비바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 플라비바이러스 감염은 상기 핵산, 또는 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 뎅기 바이러스 혈청형에 의한 감염 및/또는 다른 뎅기 바이러스 혈청형에 의한 감염 및/또는 다른 모기-매개성 플라비바이러스에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 방법.

상기에서, 상기 DNA 또는 상기 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 뎅기 바이러스는 뎅기 바이러스 혈청형 2인 것을 특징으로 하는 방법.

상기에서, 모기-매개성 플라비바이러스 또는 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열은 ATG 코돈 및 글리코실화 신호 서열을 코딩하는 서열에 의해 선행되고, 상기 코딩 서열은 번역 중지 코돈에 의해 종결되는 것을 특징으로 하는 방법.

상기에서, 상기 벡터는 폭스바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.

상기에서, 상기 폭스바이러스 벡터는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 균주인 것을 특징으로 하는 방법.

상기에서, 상기 MVA 균주는 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁되어 있는 MVA-BN 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.

상기에서, 상기 폭스바이러스 벡터는 동결건조되고, 투여 전에 약학적으로 허용가능한 희석제내에서 재구성되는 것을 특징으로 하는 방법.

상기에서, 상기 전사 조절 인자는 폭스바이러스 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.

상기에서, 상기 폭스바이러스 벡터 또는 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 첫 번째 접종("프라임 접종") 및 두 번째 접종("부스팅 접종")시 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.

전사 조절 인자 및 적어도 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 DNA를 운반하는 폭스바이러스 벡터로서, 상기 폭스바이러스는 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁되어 있는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 균주 BN 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.

상기에서, 상기 플라비바이러스는 모기-매개성 플라비바이러스, 특히 뎅기 바이러스인 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.

상기에서, 상기 뎅기 바이러스는 뎅기 바이러스 혈청형 2인 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.

상기에서, 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열은 ATG 코돈 및 글리코실화 신호 서열을 코딩하는 서열에 의해 선행되고, 상기 코딩 서열은 번역 중지 코돈에 의해 종결되는 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.

상기에서, 상기 전사 조절 인자는 폭스바이러스 프로모터인 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.

상기에서, 상기 폭스바이러스 벡터는 동결건조되는 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.

백신으로서의 상기 폭스바이러스 벡터.

상기 폭스바이러스 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.

플라비바이러스 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 상기 폭스바이러스 벡터 또는 약학적 조성물로서, 상기 폭스바이러스 벡터 또는 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 첫 번째 접종("프라임 접종") 및 두 번째 접종("부스팅 접종")시 투여되는 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터 또는 약학적 조성물.

인간을 포함하는 동물에게 상기 벡터 또는 상기 약학적 조성물을 접종하는 단계를 포함하는 플라비바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법.

상기 폭스바이러스 벡터를 포함하는 세포, 바람직하게는 인간 세포.

플라비바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위해 백신을 제조하기 위한 상기 폭스바이러스 벡터의 용도.

첫 번째 바이알/용기에서 첫 번째 접종("프라이밍 접종") 및 두 번째 바이알/용기에서 두 번째 접종("부스팅 접종")을 하기 위한 상기 폭스바이러스 벡터 또는 상기 약학적 조성물을 포함하는 프라임/부스트 면역을 위한 키트.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. mBN07의 제조

1. NS1 항원의 상세한 기술

본 실시예는 새로운 기니아 C 균주 - NGC 균주(예: 진뱅크 서열 AF038403) 유래 혈청형 2의 NS1에 관한 것이다. 플라비바이러스의 NS1 단백질은 폴리단백질 전구체의 일부로서 생산되기 때문에, 대응하는 DNA에서의 NS1 유전자는 "ATG" 개시 코돈에 의해 선행되지 않는다.

따라서, NS1 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 "ATG" 개시 코돈의 첨가를 필요로 한다. 이후, 새로 합성된 NS1 단백질이 소포체 내에서 글리코실화되도록 신호 서열의 첨가가 뒤따른다. 마지막으로, 단백질을 코딩하는 카세트는 중지 코돈을 필요로 하며, 본 실시예에서는 단백질의 3' 말단을 코딩하는 cDNA 서열에 TAG가 첨가되었다. 본 발명에서 사용된 실시예에서, "ATG+신호 서열" 인자는 E 단백질의 소수성 C-말단(마지막 28 아미노산, NGC 균주에 대하여 아미노산 M(ATG)으로 시작됨)으로부터 유래하였다.

도 1a는 본 발명에서 예로서 사용된 정확한 신호 서열 + NS1 서열을 보여준다(서열번호 5 및 6 참조). "신호 서열+NS1" 뉴클레오타이드 코딩 서열은 하기와 같은 프라이머 쌍을 이용하여 뎅기 NGC 게놈 RNA로부터 RT-PCR 증폭에 의해 획득되었다:

D2NS1-1up : 5'-ACAAGATCTGGAATGAATTCACGTAGCACCTCA-3'(서열번호 4)

이탤릭체 : Bgl II 제한 효소 인식 부위.

밑줄 : 개시 코돈.

D2NS1-2down : 5'-AATAGATCTCTACTAGGCTGTGACCAAGGAGTT-3'(서열번호 3)

이탤릭체 : Bgl II 제한 효소 인식 부위.

밑줄 : 중지 코돈.

RT-PCR 증폭은 로슈 분자 생화학사로부터 구입한 타이탄 원 튜브 RT-PCR 키트(카탈로그 번호 1-939-823)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 그러나, 다른 상업적 또는 비-상업적 RT-PCR 키트도 대신 사용될 수 있음은 당연하다.

이후, RT-PCR 산물은 상업적으로 이용가능한 많은 박테리아 클로닝 플라스미드에 존재하는 임의의 다중 클로닝 부위 중의 BamHI 부위로 클로닝될 수 있으며, 본 실시예에서는 pAF7으로 클로닝되어 pAF7D2NS1에 대한 클론을 제조하였다(pAF7D2NS1의 자세한 서열 정보는 도 1b 및 1c 참조). 도 1d는 NS1 아미노산 서열 및 E 단백질의 C-말단 아미노산 코딩 서열 유래의 첨가된 신호 서열을 포함하는 NS1의 소수성 좌표를 보여준다. 짧은 N-말단 소수성 도메인(domain)은 신호 서열을 가리킨다.

2. NS1 발현 카세트의 상세한 기술(도 2)

카나리폭스, 파울폭스, 백시니아 또는 MVA와 같은 폭스바이러스 벡터로부터 상기 "신호 서열+NS1"을 발현시키기 위하여, 상기 cDNA의 5' 말단에 폭스바이러스 프로모터가 첨가되는 것이 필요하다. 폭스바이러스가 합성하는 모든 RNA는 바이러스에 의해 코딩되는 효소에 의해 폴리아데닐화 되기 때문에 이러한 기능을 수행하기 위한 폴리아데닐화(adenylation) 신호 서열의 첨가는 요구되지 않는다. 모든 폭스바이러스 프로모터가 상기 카세트의 발현을 위하여 사용될 수 있다. 도 2 및 서열번호 9 및 10은 본 발명의 실시예에서 사용된 "폭스바이러스 프로모터+신호 서열+NS1" 카세트의 뉴클레오타이드 서열을 보여준다.

본 발명에서 사용된 실시예에서, "신호 서열+NS1"은 oBN338 및 oBN345 프라이머쌍을 이용하여 NS1 플라스미드 클론으로부터 추가로 PCR 증폭되었다. oBN345 프라이머는 클로닝 플라스미드 내에서 표적(target) 서열의 5'에 폭스바이러스 최소 프로모터 인자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 있다. oBN345 프라이머 결합을 위한 플라스미드 표적 서열은 신호 서열 개시 코돈의 약 40 뉴클레오타이드 상부(upstream)에 위치하고 있다. 이것은 RNA 전사체가 신호 서열 ATG 개시 코돈 이전에 비-단백질 코딩 서열의 나열을 포함하게 하기 위해서이다.

Ps 프로모터를 포함하는 PCR 프라이머:

oBN338 : 5'-TTGTTAGCAGCCGGATCGTAGACTTAATTA-3' (30mer)(서열번호 1)

oBN345 : (서열번호 2)

5'-CAAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAAAAACACGATAATACCATGG-3'

(밑줄 친 뉴클레오타이드는 폭스바이러스 최소 프로모터 서열을 제공한다)

처음 다섯 사이클(cycle)의 PCR 증폭 반응을 위한 어닐링(annealing) 온도는 oBN345 클로닝 벡터에 존재하는 상동(homologous) 서열과 결합하는 뉴클레오타이드 서열로부터 계산되었다.

3. MVA로 NS1 발현 카세트를 삽입(integration)(도 3)

PCR 증폭 산물은 블런트 말단이며, 플라스미드 pBNX07의 절단된 블런트 말단 XhoI 부위로 클로닝되어(도 3a 참조) 플라스미드 pBN41을 형성하였다(도 3a 참조). pBN41은 "폭스 프로모터+신호 서열+NS1" 카세트를 상동 재조합에 의해 MVA의 결실 부위 2에 삽입시키기 위한 벡터이다.

pBN41(도 3a 참조)의 기본 특징은 하기와 같다:

- 플라스미드 뼈대는 스트라타진사(Stratagene) pBluscript SK-plus(진뱅크 기탁번호 VB0078)이다.

- D2F1 : 결실부위 2 인접부위 1 상동 재조합 암(arm). 이것은 진뱅크 서열 U94848인 MVA의 20,117 내지 20,717의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

- PPr : 폭스바이러스 프로모터.

- NPT II : 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 단백질 코딩 서열(진뱅크 V00618의 단백질 코딩 서열)

- IRES : 앤세팔로마이오카디티스(encephalomyocarditis) 바이러스 유래 내부 리보좀 도입 부위.

- EGFP : 증가된 녹색 형광 단백질 코딩 서열(단백질 코딩 서열 - 진뱅크 서열 U57609의 675 내지 1394 뉴클레오타이드).

- NS1 : 뎅기 NGC 균주 유래의 "신호 서열+NS1" 단백질 코딩 서열.

- D2F2 : 결실부위 2 인접부위 2 상동 재조합 암(arm). 이것은 진뱅크 서열 U94848인 MVA의 20,719 내지 21,343의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.

- AmpR : pBluescript의 암피실린 저항 유전자.

3.1. 상동 재조합에 의하여 뎅기 "폭스 프로모터+신호 서열+NS1"을 MVA 결실 부위로 삽입

3.1.1. 상동 재조합에 의한 MVA 게놈으로의 삽입

상기 삽입 벡터 pBN41은 pBN41의 인접부위 1 및 인접부위 2 암(arm)과 MVA 게놈 내에 존재하는 상동 표적 서열 사이의 상동 재조합에 의해 뎅기 NS1 발현 카세트+리포터 카세트(폭스 프로모터+NPTII-IRES-EGFP)를 MVA 게놈내로 삽입시키기 위해 사용된다. 이것은 낮은 감염도(MOI, multiplicity of infection, 예를 들면, 세포당 0.01 감염 유닛)로 미리 MVA에 감염된 병아리 배아 섬유아세포(CEF) 세포로 선형화된 삽입 벡터를 형질전환시킴으로써 수행된다. 감염 후 48시간 또는 감염이 포화상태(confluency)에 도달되었을 때, 바이러스 추출물을 준비한 후 -20℃에서 저장시켜 원하는 재조합 MVA (rMVA)의 선별 및 클론 정제에 사용하였다.

3.1.2. rMVA의 선별 및 클론 정제

비-재조합 MVA(빈(empty) 벡터 바이러스)의 제거 및 rMVA의 증폭은 포화된 병아리 배아 섬유아세포(CEF) 세포를 G418의 존재하에서 낮은 MOI로 감염시킴으로써 수행된다(G418의 양은 CEF 세포를 죽이지 않는 가장 높은 투여량을 결정하기 위하여 최적화되어야 한다). 삽입된 NPT II 유전자를 포함하고 있지 않는 모든 바이러스는 세포 유지 배지에 첨가된 G418의 존재하에서 복제될 수 없다. G418은 DNA 복제를 억제하지만, CEF 세포가 정지된(stationary) 비-복제 상태에 있기 때문에 이들은 G418의 작용에 의해 영향을 받지는 않을 것이다. rMVA로 감염된 CEF 세포는 증가된 녹색 형광 단백질의 존재 때문에 형광 현미경 하에서 가시화될 수 있다.

상동 재조합 단계를 거친 바이러스 추출물은 순차적으로 희석되어 G418의 존재하에서 CEF 세포를 감염시키는데 이용되고 낮은-융점의 아가로즈(agarose) 위에 깔려야 한다. 감염 2일 후, 아가로즈-감염된 플레이트는 녹색 감염 세포의 단일 초점을 확인하기 위하여 형광 현미경하에서 관찰된다. 이러한 세포를 표시하고, 감염된 초점을 포함하는 아가로즈 플러그(plug)를 취하여, 멸균된 세포 유지 배지를 포함하는 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브로 옮긴다. 바이러스는 -20℃에서 세차례 상기 튜브를 동결-해동시킴으로써 아가로즈 플러그로부터 방출된다.

최적의 클론 또는 클론들은 PCR 분석에 의해 빈 벡터로 오염된 표시(sign)가 없을 때까지 아가로즈에서 추가로 클론 정제된다(3 내지 30 회(round)의 클론 정제). 이후, 상기 클론들은 올바른 삽입 형태, 프로모터-외래 유전자 카세트 서열의 확인 및 발현 분석에 대한 엄격한 테스트를 위하여 RT-PCR에 의해 증폭되었다. 상기 분석 후, 추가적인 특성 분석 및 면역원성 연구를 위한 마스터 스톡(master stock)을 제조하기 위하여 단지 하나의 클론만이 G418 선별하에 추가로 증폭되었다.

본 명세서에서 기술된 삽입된 뎅기 NS1 발현 카세트를 포함하는 재조합 MVA는 mBN07이라 명명하였다. 도 3b는 mBN07에 존재하는 삽입된 외래 유전자의 모습을 보여준다.

4. MVA에 의한 진정(authentic) NS1의 발현

재조합 MVA인 mBN07로부터의 NS1 단백질의 발현은 비-변성 조건에서 표준 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다. 보다 상세하게는, 세포당 1.0 감염 유닛의 MOI에서 포유동물 조직 배양 세포 예를 들면, BHK-21 세포를 감염시키기 위해 정제된 mBN07을 사용한 후 NS1의 발현을 분석하였다. 감염 후 24 내지 30시간에 상기 감염된 세포로부터 조(crude) 단백질 추출물을 준비하였으며, 상기 추출물의 일부를 2-머캅토에탄올(ME)을 포함하거나 또는 포함하지 않는 SDS-PAGE 젤 로딩(loading) 버퍼와 혼합하였다. 상기 샘플 + 양성 대조군으로서, 뎅기 NGC 균주로 감염된 세포(모기 세포주)의 단백질 추출물이 SDS-PAGE 젤에서 전기영동으로 분리되었으며, 이후 니트로셀룰로스 막으로 전달되었다. 상기 막은 항-뎅기 NS1 단일클론 항체로 탐지되었다.

mBN07에 의해 발현된 NS1은 항-뎅기 NS1 단일클론 항체에 의해 인식되었으며, 뎅기 감염된 세포의 NS1과 유사한 올바른 이량체 형태를 형성하는 것으로 나타났다(2-ME가 없는 끓이지 않은 mBN07 레인(lane)과 2-ME가 없는 끓이지 않은 DEN2 레인을 비교). 아울러, 이량체 형태는 변성 조건에서 단량체 형태로 용해되는 것으로 확인되었다(2-ME를 포함한 끓인 mBN07 레인 참조).

또한, mBN07로 감염된 세포에서 발현된 NS1은 회복기 환자의 혈청 및 모든 네 가지 뎅기 혈청형의 NS1과 교차 반응하는 단일 클론 항체에 의해 웨스턴 블롯 분석에서 인식되었다. 이것은 mBN07에 의해 발현된 NS1이 면역원인 것을 보여준다.

상기 실시예에서, mBN07(때때로 BN07이라 기재됨)은 액체 상태(선택적으로는 동결 상태) 또는 동결-건조 상태로 저장된다. 동결-건조된 바이러스를 얻기 위하여, 10 mM Tris-버퍼, 140 mM NaCl, 18.9 g/ℓ 덱스트란(분자량 36,000 내지 40,000), 45 g/ℓ 수크로스, 0.108 g/ℓ L-글루탐산 모노 칼륨염 일수화물 pH 7.4를 함유하는 바이러스 포함 용액이 준비된다. 이후, 상기 제형은 동결-건조된다. 재구성하기 위하여, 동결-건조물에 물이 첨가된다.

실시예 2. 혈청형 2 이외의 뎅기 바이러스 NS1 및 일본 뇌염 바이러스(JEV)와 서나일 바이러스(WNV)의 NS1에 대한 mBN07에 의해 발현된 NS1의 교차 면역원성

1. mBN07로부터 발현된 NS1 : 회복기 환자 혈청에 대한 반응성

mBN07에 의해 발현된 NS1이 이미 뎅기 바이러스에 의해 감염된 증거가 있는 회복기 환자의 혈청에 의해 인식될 가능성 여부를 검사하였다. 뎅기 바이러스 막(envelope) 단백질에 대한 항체(뎅기 혈청형 1 내지 4로부터 준비된 진정 항원에 대한 면역블롯)를 가지는 68명의 인간으로부터 얻은 혈청이 mBN07로 감염된 세포 추출물 및, 대조군으로 사용된, MVA-GFP로 감염된 세포 추출물로부터 준비된 면역블롯 스트립(strip)에 대한 테스트를 위하여 선별되었다. 항원을 포함하는 세포 용해물은 2-머캅토에탄올을 포함하지 않는 샘플 버퍼로 처리되었고 가열되지 않았다. 검사된 68명의 혈청 중, 62 혈청(91.2%)은 mBN07에 의해 발현된 BN07 NS1과 면역블롯에서 반응하였다. 상기 혈청들은 모든 4가지 뎅기 바이러스 혈청형 및 일본 뇌염 바이러스의 NS1에 대한 반응성을 위하여 추가로 분석되었다. 결과는 표 1에 나타나 있다. 상기 혈청들 중 54 혈청은 모든 뎅기 바이러스 혈청형 및 일본 뇌염 바이러스의 NS1과 반응하였고, 또한 상기 54 혈청 중 53 혈청(98.2%)은 mBN07로부터 발현된 NS1과 반응하였다. 7 혈청은 적어도 한가지 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1에 대해 특이적이었고 JEV의 NS1과는 반응하지 않았다. 또한, 상기 7 혈청은 모두 mBN07에 의해 발현된 NS1과 반응하였다. 다른 7 혈청은 단지 JEV의 NS1과만 반응하였으며, 모든 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1과는 반응하지 않았다. 그러나, 이들 JEV-특이적 혈청 중 2 혈청(28.6%)은 mBN07에 의해 발현된 NS1과 반응하였다.

	BN07 NS1 음성	BN07 NS1 양성
진정 DEN NS1 양성	0%(0/7)	100%(7/7)
진정 DEN & JEV NS1 양성	1.85%(1/54)	98.18%(53/54)
진정 JEV NS1 양성	71.43%(5/7)	28.57%(2/7)

진정 NS1 및 mBN07에 의해 발현된 NS1에 대한 항혈청 반응의 비교. 괄호 : 양성으로 검사된 샘플의 수/검사된 모든 샘플의 수. DEN = 뎅기, JEV = 일본 뇌염 바이러스.

또한, 동일한 68 혈청이 전막(premembrane) 단백질들에 대한 반응성에 의해 분석되었다. 본 발명자들에 의한 실험에서, 전막에 대한 항체는 NS1 또는 E에 대한 항체보다 훨씬 더 특이적이다. 따라서, 뎅기에 의해 감염되었던 환자는 뎅기 바이러스 전막은 인식하고 JEV 전막은 인식하지 않거나 그 반대 경우인 항체를 생산할 것이다. 이들을 이용한 분석은 환자의 감염 과정에 대한 더 나은 예측을 제공할 것이다. 표 2는 22명의 환자로부터 얻은 혈청이 진정 뎅기 전막 단백질과만 반응하였으며, 따라서 상기 22명의 환자들은 뎅기 바이러스에만 노출되었고 JEV에는 노출되지 않았음을 제시한다. 모든 상기 22 혈청은 mBN07에 의해 발현된 NS1과 반응하였다. 다른 22 환자는 이전에 뎅기 및 JEV 모두에 감염된 증거를 가지고 있었으며, 따라서 다시 모든 22 혈청이 mBN07에 의해 발현된 NS1과 반응하였다. 상기 실험들에서, JEV에 의해서만 이전에 감염된 증거가 있는 21명의 환자들이 있었다(비록, 상기 혈청들이 뎅기 E에 대한 교차-반응성 항체를 가지고 있었지만). 흥미롭게도, 21 중 17명(82%)의 JEV 반응자들은 mBN07에 의해 발현된 NS1과 반응하였다. 전체적으로 단지 3 혈청만이 뎅기 또는 JEV의 전막 단백질과 모두 반응하지 않았으며, 이들중 1 혈청 만이 mBN07에 의해 발현된 NS1과 반응하였다. 이런 현상에 대한 가장 그럴 듯한 이유는 항체 타이터가 너무 낮아서 면역블롯에 의해 검출되지 않았다는 것이다.

	BN07 NS1 음성	BN07 NS1 양성
진정 DEN prM 양성	0%(0/22)	100%(22/22)
진정 DEN & JEV prM 양성	0%(0/22)	100%(22/22)
진정 JEV NS1 양성	19.0%(4/21)	81.0%(17/21)
prM 음성	66.7%(2/3)	33.3%(1/3)

진정 전막 및 BN07 NS1에 대한 항혈청 반응의 비교. 괄호 : 양성으로 검사된 샘플의 수/검사된 모든 샘플의 수. DEN = 뎅기, JEV = 일본 뇌염 바이러스.

또한, 표 2의 데이터는 mBN07에 의해 발현된 NS1과 반응하지 않은 6 혈청 중에서 4 혈청은 이전에 JEV에 의해서만 감염되고 뎅기에 의해서는 감염되지 않은 환자의 것이라는 것을 명확하게 보여준다. 나머지 2 혈청은 뎅기 또는 JEV의 전막 단백질을 검출할 수 있는 항체를 모두 가지고 있지 않았으며, 낮은 타이터를 가지고 있었던 것으로 보인다.

2. 토끼의 mBN07 백신화 및 면역블롯 및 ELISA 분석에 의한 뎅기 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스의 면역후 혈청 검사

세 마리의 특정 병원체 부재(specific pathogen-free) 토끼를 하기에 기재된 백신화 스케쥴에 따라 피하 경로를 통하여 면역화시켰다. 각각의 토끼는 0일째에 1 ㎖의 멸균수에 재구성된 한 바이알의 동결-건조된 백신(1×10⁸ TCID₅₀ BN07 동결-건조 백신)에 의해 백신화되었고, 이후 28일째 다시 백신화되었다. 첫 번째 백신화 이전에 혈액 샘플을 취하였고, 두 번째 백신화 10일 후 다시 취하였다.

0일 = 채혈한 후 첫 번째 백신화

28일 = 두 번째 백신화

38일 = 혈액 샘플링

56일 = 세 번째 백신화

66일 = 혈액 샘플링

112일 = 각각의 토끼로부터 50 ㎖ 채혈

2.1. 면역전 혈액(prebleed) 및 뎅기 혈청형 2에 대한 면역후 혈청의 면역블롯 검사

뎅기 2 바이러스 항원 및 비감염된 C6/36의 항원이 비-변성 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분리되었다. 면역블롯 분석을 위하여 38일째 혈청(1:200 희석)을 사용하였다.

그 결과, mBN07로 백신화된 모든 세 마리 토끼가 높은 타이터의 항-NS1 항체를 생산하였고 이들이 뎅기 혈청형 2에 감염된 조직 배양 모기 세포로부터 생산된 진정 NS1과 교차 반응한다는 것을 명확하게 보여주었다. 백신화 이전에 취한 혈청은 면역블롯에서 어떠한 뎅기 단백질과도 반응하지 않았다.

38일째의 면역후 혈청은 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:10⁴, 1:10⁵, 1:10⁶으로 적정되었고, 뎅기 2 바이러스 항원의 면역블롯 스트립 및 비-변성 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분리된 감염되지 않은 C6/36 세포의 대조군 스트립 상에서 검사되었다. 38일째 세 마리 토끼 혈청에 대한 종말점(endpoint) 적정은 1:10000으로 계산되었다. 66일째 혈청에 대한 종말점 적정은 면역블롯 분석 및 ELISA 모두에서 각각 1×10⁵으로 계산되었다(데이터는 제시하지 않음).

면역전 및 면역후 혈청 모두 1:10², 1:10³, 1:10⁴, 1:10⁵, 1:10 ⁶, 1:10⁷에서 적정되었고, 간접 IgG ELISA에서 검사되었다. 각각의 웰(well)들은 뎅기 2 및 감염되지 않은 C6/36 용해물로 1:250 희석으로 코팅되었다.

		1:10²	1:10³	1:10⁴	1:10⁵	1:10⁶	1:10⁷
토끼 #1	전	-0.012	0.006	0.007	0.003	-0.002	0.001
토끼 #1	후	0.623	0.127	0.02	0.004	0.001	-0.003
토끼 #2	전	-0.012	0	-0.001	-0.003	0	-0.001
토끼 #2	후	0.402	0.06	-0.007	0.008	-0.003	0.002
토끼 #3	전	-0.008	0.03	-0.002	0.005	-0.002	-0.002
토끼 #3	후	0.907	0.224	0.038	0.011	-0.001	-0.003

각각의 토끼로부터 얻은 면역전 및 면역후 혈청에 대한 다른 희석 농도에서의 ELISA 흡광도 판독(전 = 면역전 혈청, 후 = 면역후 혈청)

각 토끼의 면역후 혈청에 대한 적정 결과를 도 4에 나타내었다. 각 토끼의 면역후 혈청에 대한 추정되는 종말점 적정은 1:1000이다.

2.2. 뎅기 혈청형 1, 3 및 4, 일본 뇌염 바이러스 및 서나일 바이러스에 대한 면역전 및 면역후 혈청의 면역블롯 검사

각각의 38일째 토끼 혈청은 1:1000 희석 비율로 뎅기 1, 2, 3, 4 및 JEV 바이러스 항원의 면역 블롯 스트립 및 비-변성 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분리된 감염되지 않은 C6/36 세포의 대조군 스트립 상에서 검사되었다. 각각의 토끼 면역후 혈청은 일본 뇌염 바이러스 면역블롯의 NS1 뿐만 아니라 뎅기 혈청형 1, 3 및 4 유래 NS1과도 반응하는 것을 확인하였다.

각각의 66일째 토끼 혈청은 1:1000 희석 비율로 뎅기 1, 3, 4, WNV 및 JEV 바이러스 항원의 면역 블롯 스트립 및 비-변성 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 분리된 감염되지 않은 C6/36 세포의 대조군 스트립 상에서 검사되었다. 각각의 토끼 면역후 혈청은 일본 뇌염 바이러스 및 서나일 바이러스 면역블롯의 NS1 뿐만 아니라 뎅기 혈청형 1, 3 및 4 유래 NS1과도 반응하는 것을 확인하였다.

면역블롯 분석을 확인하기 위하여, ELISA 교차 반응성 분석이 수행되었다. 마이크로타이터플레이트의 각 웰들은 DENV-1, DENV-3, DENV-4, JEV, WNV 및 감염되지 않은 세포 C6/36 용해물로 1:250 희석 비율로 코팅되었다. 혈청은 38일(도 5의 A) 및 66일(도 5의 B)째 혈청을 사용하였다.

면역블롯 분석 및 ELISA 실험으로부터, 뎅기 바이러스 NS1에 의해 유도된 항체는 모든 다른 뎅기 혈청형, JEV 및 WNV와 교차 반응한다는 것으로 결론지을 수 있다.

2.3. 결론

- mBN07 백신으로 면역화된 토끼는 진정 뎅기 바이러스 혈청형 2 NS1을 인식하는 항체를 유도했다.

- 종말점이 1:10⁴ 및 1:10³인 경우 면역블롯 분석 및 ELISA에서 모두 매우 높은 면역 반응이 관찰되었다.

- 토끼에서 유도된 항체는 다른 모든 뎅기 혈청형(1, 3 & 4)과 교차 반응하였다.

- 또한, 항체는 JEV 및 WNV와 같은 이형 바이러스 유래 NS1과도 교차 반응하였다.

3. 마우스에서의 면역원성 연구

뎅기 바이러스 NS1을 발현하는 mBN07을 이용하여 하기 스케쥴에 따라 복강내 경로를 통해 다른 양으로 암컷 이계교배(out-bred) 마우스를 면역화시켰다. mBN07과 대응되지만 NS1을 발현하지 않는 MVA인 mBN08 및 대조군으로서 PBS를 사용하였다. 마우스에서 생산된 항체가 웨스턴 블롯에서 다른 플라비바이러스 혈청형 및 일본 뇌염 바이러스에서 유래한 NS1 단백질과 각각 반응할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 마우스의 혈청을 사용하였다. 대조군 마우스 유래 혈청은 모든 실험에서 음성으로 나왔다.

하기 그룹이 분석되었다:

그룹	마우스 수	1차 투여량	기간	2차 투여량	채혈전 기간
1	9	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 (PBS에서 1:5로 희석된 0.1 ㎖의 백신/마우스)	4주	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 (PBS에서 1:5로 희석된 0.1 ㎖의 백신/마우스)	3주
2	9	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 동결건조 백신(마우스 당 1.2 ㎖의 물로 재구성)	4주	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 동결건조 백신(마우스 당 1.2 ㎖의 물로 재구성)	3주
3	10	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 동결건조 백신(마우스 당 1.2 ㎖의 물로 재구성)	3주	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 동결건조 백신(마우스 당 1.2 ㎖의 물로 재구성)	4주
4	10	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 (PBS에서 1:5로 희석된 0.1 ㎖의 백신/마우스)	4주	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 (PBS에서 1:5로 희석된 0.1 ㎖의 백신/마우스)	4주
5	10	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 동결건조 백신(마우스 당 1.2 ㎖의 물로 재구성)	4주	각 1×10⁷ TCID₅₀ BN07 동결건조 백신(마우스 당 1.2 ㎖의 물로 재구성)	4주

면역블롯 실험에서, 하기 결과가 얻어졌다:

그룹	마우스 수	DENV-1 양성 (% POS)	DENV-2 양성 (% POS)	DENV-3 양성 (% POS)	DENV-4 양성 (% POS)	JEV 양성 (% POS)
1	9	5 (55.5%)	9 (100%)	3 (33.3%)	7 (77.7%)	5 (55.5%)
2	9	8 (88.8%)	9 (100%)	8 (88.8%)	9 (100%)	5 (55.5%)
3	10	9 (90%)	10 (100%)	9 (90%)	10 (100%)	8 (80%)
4	10	8 (80%)	10 (100%)	9 (90%)	9 (90%)	4 (40%)
5	10	10 (100%)	10 (100%)	10 (100%)	10 (100%)	8 (80%)

Balb/c 마우스를 이용하여 매우 유사한 실험을 수행하였다: 두 개의 1×10⁸ TCID₅₀ BN07의 샷(동결건조 및 물로 재구성)을 이용하여 0일 및 21일에 마우스를 백신화시켰다. 42일째에 혈청을 얻었다. 100%의 혈청이 뎅기 바이러스 2 NS1과 반응하였고, 100%의 혈청이 네가지 모든 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질과 반응하였으며, 75%의 혈청이 JEV의 NS1 단백질과 반응하였다. 1×10⁸ TCID₅₀ 비-동결건조 BN07로부터 얻어진 결과는 하기와 같다: 100%의 혈청이 모든 네가지 뎅기 바이러스 혈청형 유래 NS1과 반응하였다. 상기 혈청은 JEV 유래 NS1을 인식하였으나, 동결-건조 BN07로 백신화된 마우스에서 얻어진 혈청만큼은 반응하지 않았다.

결론:

- BN07로 면역화된 100%의 마우스가 DENV-2 NS1과 매우 강력한 반응을 보이는 항체를 가지고 있었다.

- 1×10⁷ TCID₅₀ BN07로 면역화된 마우스의 면역 반응은 1×10⁸ TCID₅₀ BN07로 면역화된 마우스의 면역 반응만큼 강력하였다(데이터는 나타내지 않음).

- 최고의 교차 반응 퍼센트는 4주의 간격으로 채혈전 4주에 면역화된 마우스에서 관찰되었다.

- 동결건조된 BN07 백신으로 면역화된 마우스는 비-동결건조된 백신으로 면역화된 것과 비교할 때 NS1에 대하여 훨씬 강한 반응을 보이는 것이 관찰되었다.

참고문헌

Nimmannitya S, Kalayanaroo S, Nisalak A 및 Innes B. 1990. 뎅기 출혈열의 두 번째 공격. Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and Public Health, 21, 699.

Burke DS 및 Monath TP., 2001, 플라비바이러스. Fields Virology, 제4판, David M Knipe 및 Peter M Howley 편집. Lippincott Williams 및 Wilkins 발행, 필라델피아. 1043-1125.

Flamand M, Megret F, Mathieu M, Lepault, Rey FA 및 Deubel V., 1999. 뎅기 바이러스 타입 1 비구조 글리코단백질 NS1이 글리코실화-의존적 양상으로 가용성 육량체로 포유동물 세포로부터 분비된다. J. Virol., 73, 6104-6110.

Jang SK, Davies MV, Kaufman RJ 및 Wimmer E., 1989. 엔세팔로마이카디티스 바이러스 RNA의 5' 비번역 부위로 리보좀이 내부 도입됨에 의한 생체내 단백질 합성의 개시. J. Virol., 63, 1651-60.

Lindenbach BD 및 Rice CM., 2001, 플라비바이러스 및 그들의 복제. Fields Virology, 제4판, David M Knipe 및 Peter M Howley 편집. Lippincott Williams 및 Wilkins 발행, 필라델피아. 991-1041.

Schlesinger JJ, Brandriss MW 및 Walsh EE., 1987. 뎅기 2 바이러스 비구조 단백질 NS1의 면역에 의한 뎅기 2 바이러스 뇌염에 대한 마우스의 방어. J. Gen. Virol., 68, 853-7.

Schesinger JJ. Foltzer M 및 Chapman S., 1993. 황열 바이러스 NS1에 대한 항체의 Fc 부위가 마우스의 황열 뇌염에 대한 방어의 결정부위이다. Virology. 192, 132-41.

본 명세서에서 기재된 기술 및 절차들은 분자생물학 및 바이러스학 특히 플라비바이러스 바이러스학 분야 및 폭스바이러스 유전자 분야의 능숙한 당업자에게 있어서 잘 알려져 있다. 개시된 기술 및 절차들은 하기 문헌에서 상세히 발견될 수 있다.

Molecualr Cloning, 실험실 매뉴얼. 제2판. J. Sambrook, E.F. Fritsch 및 T. Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory 출판사. 1989.

Virology Methods Manual. Brian WJ Mahy 및 Hillar O Kangro 편집. 아카데미 출판사. 1996.

Molecular Virology. 실무 접근. AJ Davison 및 RM Elliott 편집. 실무 접근 시리즈. 옥스퍼드 대학의 IRL 출판사. Oxford 1993. 제9장. 백시니아 바이러스 벡터에 의한 유전자의 발현.

Current Protocols in Molecular Biology. 편집인: John Wiley 및 Son Inc. 1998. 제16장 제4과: 백시니아 바이러스 벡터를 이용한 포유동물 세포에서의 단백질의 발현.

Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow 및 David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory 출판사. 1988.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 NS1 단백질은 플라비바이러스 및 하나 또는 그 이상의 다른 플라비바이러스에 대한 백신화에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Bavarian Nordic A/S Venture Technologies Sdn Bhd <120> Flavivirus NS1 Subunit Vaccine <130> 2004-FPA-0960 <150> DK PA 2001 01804 <151> 2001-12-04 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 1 ttgttagcag ccggatcgta gacttaatta 30 <210> 2 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 caaaaaattg aaattttatt tttttttttt ggaatataaa taaaaacacg ataataccat 60 gg 62 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 3 aatagatctc tactaggctg tgaccaagga gtt 33 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 4 acaagatctg gaatgaattc acgtagcacc tca 33 <210> 5 <211> 1143 <212> DNA <213> Dengue virus type 2 <220> <221> CDS <222> (1)..(1140) <223> Signal sequence of Eprotein + NS1 coding sequence <400> 5 atg aat tca cgc agc acc tca ctg tct gtg tca cta gta ttg gtg gga 48 Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly 1 5 10 15 gtc gtg acg ctg tat ttg gga gtt atg gtg cag gcc gat agt ggt tgc 96 Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys 20 25 30 gtt gtg agc tgg aaa aac aaa gaa ctg aag tgt ggc agt ggg att ttc 144 Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe 35 40 45 atc aca gac aac gtg cac aca tgg aca gaa caa tac aag ttc caa cca 192 Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro 50 55 60 gaa tcc cct tca aag cta gct tca gct atc cag aaa gct cat gaa gag 240 Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu 65 70 75 80 ggc att tgt gga atc cgc tca gta aca aga ctg gaa aat ctg atg tgg 288 Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp 85 90 95 aaa caa ata aca cca gaa ttg aat cac att cta tca gaa aat gag gtg 336 Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val 100 105 110 aag ttg act att atg aca gga gac atc aaa gga atc atg cag gca gga 384 Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly 115 120 125 aaa cga tct ctg cag ccc cag ccc act gag ctg aag tat tca tgg aaa 432 Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys 130 135 140 aca tgg ggc aaa gcg aaa atg ctc tct aca gag tct cat aac cag acc 480 Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr 145 150 155 160 ttt ctc att gat ggc ccc gaa aca gca gaa tgc ccc aac aca aac aga 528 Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg 165 170 175 gct tgg aat tcg ctg gaa gtt gaa gac tat ggc ttt gga gta ttc acc 576 Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr 180 185 190 acc aat ata tgg cta aag ttg aga gaa aag cag gat gta ttc tgc gac 624 Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp 195 200 205 tca aaa ctc atg tca gcg gcc ata aaa gac aac aga gcc gtc cat gcc 672 Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala 210 215 220 gat atg ggt tat tgg ata gaa agt gca ctc aat gac aca tgg aag ata 720 Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile 225 230 235 240 gag aaa gcc tct ttc atc gaa gtt aaa agc tgc cac tgg cca aag tca 768 Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser 245 250 255 cac acc ctc tgg agt aat gga gtg tta gaa agt gag atg ata att cca 816 His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro 260 265 270 aag aat ttc gct gga cca gtg tca caa cac aac tac aga cca ggc tac 864 Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr 275 280 285 cat aca caa aca gca gga cca tgg cat cta ggt aag ctt gag atg gac 912 His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp 290 295 300 ttt gat ttc tgc gaa gga acc aca gtg gtg gtg act gag gac tgt gga 960 Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly 305 310 315 320 aat aga gga ccc tct tta aga aca act act gcc tct gga aaa ctc ata 1008 Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile 325 330 335 aca gaa tgg tgc tgc cga tct tgc aca tta cca ccg cta aga tac aga 1056 Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg 340 345 350 ggt gag gac gga tgc tgg tac ggg atg gaa atc aga cca ttg aaa gag 1104 Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu 355 360 365 aaa gaa gag aat ttg gtc aac tcc ttg gtc aca gcc tag 1143 Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala 370 375 380 <210> 6 <211> 380 <212> PRT <213> Dengue virus type 2 <400> 6 Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly 1 5 10 15 Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys 20 25 30 Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe 35 40 45 Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro 50 55 60 Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu 65 70 75 80 Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp 85 90 95 Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val 100 105 110 Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly 115 120 125 Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys 130 135 140 Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr 145 150 155 160 Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg 165 170 175 Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr 180 185 190 Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp 195 200 205 Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala 210 215 220 Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile 225 230 235 240 Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser 245 250 255 His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro 260 265 270 Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr 275 280 285 His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp 290 295 300 Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly 305 310 315 320 Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile 325 330 335 Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg 340 345 350 Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu 355 360 365 Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala 370 375 380 <210> 7 <211> 1296 <212> DNA <213> Dengue virus type 2 <220> <221> CDS <222> (50)..(1189) <220> <221> primer_bind <222> (12)..(32) <220> <221> primer_bind <222> (1243)..(1273) <400> 7 ttttcctttg aaaaacacga taataccatg ggaattcccc cgatctgga atg aat tca 58 Met Asn Ser 1 cgc agc acc tca ctg tct gtg tca cta gta ttg gtg gga gtc gtg acg 106 Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly Val Val Thr 5 10 15 ctg tat ttg gga gtt atg gtg cag gcc gat agt ggt tgc gtt gtg agc 154 Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys Val Val Ser 20 25 30 35 tgg aaa aac aaa gaa ctg aag tgt ggc agt ggg att ttc atc aca gac 202 Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp 40 45 50 aac gtg cac aca tgg aca gaa caa tac aag ttc caa cca gaa tcc cct 250 Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro 55 60 65 tca aag cta gct tca gct atc cag aaa gct cat gaa gag ggc att tgt 298 Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu Gly Ile Cys 70 75 80 gga atc cgc tca gta aca aga ctg gaa aat ctg atg tgg aaa caa ata 346 Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile 85 90 95 aca cca gaa ttg aat cac att cta tca gaa aat gag gtg aag ttg act 394 Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr 100 105 110 115 att atg aca gga gac atc aaa gga atc atg cag gca gga aaa cga tct 442 Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser 120 125 130 ctg cag ccc cag ccc act gag ctg aag tat tca tgg aaa aca tgg ggc 490 Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly 135 140 145 aaa gcg aaa atg ctc tct aca gag tct cat aac cag acc ttt ctc att 538 Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr Phe Leu Ile 150 155 160 gat ggc ccc gaa aca gca gaa tgc ccc aac aca aac aga gct tgg aat 586 Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn 165 170 175 tcg ctg gaa gtt gaa gac tat ggc ttt gga gta ttc acc acc aat ata 634 Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile 180 185 190 195 tgg cta aag ttg aga gaa aag cag gat gta ttc tgc gac tca aaa ctc 682 Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp Ser Lys Leu 200 205 210 atg tca gcg gcc ata aaa gac aac aga gcc gtc cat gcc gat atg ggt 730 Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala Asp Met Gly 215 220 225 tat tgg ata gaa agt gca ctc aat gac aca tgg aag ata gag aaa gcc 778 Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile Glu Lys Ala 230 235 240 tct ttc atc gaa gtt aaa agc tgc cac tgg cca aag tca cac acc ctc 826 Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser His Thr Leu 245 250 255 tgg agt aat gga gtg tta gaa agt gag atg ata att cca aag aat ttc 874 Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro Lys Asn Phe 260 265 270 275 gct gga cca gtg tca caa cac aac tac aga cca ggc tac cat aca caa 922 Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln 280 285 290 aca gca gga cca tgg cat cta ggt aag ctt gag atg gac ttt gat ttc 970 Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe 295 300 305 tgc gaa gga acc aca gtg gtg gtg act gag gac tgt gga aat aga gga 1018 Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly 310 315 320 ccc tct tta aga aca act act gcc tct gga aaa ctc ata aca gaa tgg 1066 Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp 325 330 335 tgc tgc cga tct tgc aca tta cca ccg cta aga tac aga ggt gag gac 1114 Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp 340 345 350 355 gga tgc tgg tac ggg atg gaa atc aga cca ttg aaa gag aaa gaa gag 1162 Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu 360 365 370 aat ttg gtc aac tcc ttg gtc aca gcc t agtagggatc gggggagctc 1210 Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala 375 380 actagtggat ccctccagct cgagaggnct aattaattaa gtctacgatc cggctgctaa 1270 caaagcccga aaggaagctg agttgg 1296 <210> 8 <211> 380 <212> PRT <213> Dengue virus type 2 <400> 8 Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly 1 5 10 15 Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys 20 25 30 Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe 35 40 45 Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro 50 55 60 Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu 65 70 75 80 Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp 85 90 95 Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val 100 105 110 Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly 115 120 125 Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys 130 135 140 Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr 145 150 155 160 Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg 165 170 175 Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr 180 185 190 Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp 195 200 205 Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala 210 215 220 Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile 225 230 235 240 Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser 245 250 255 His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro 260 265 270 Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr 275 280 285 His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp 290 295 300 Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly 305 310 315 320 Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile 325 330 335 Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg 340 345 350 Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu 355 360 365 Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala 370 375 380 <210> 9 <211> 1227 <212> DNA <213> Dengue virus type 2 <220> <221> promoter <222> (5)..(48) <223> minimal poxvirus promoter element <220> <221> CDS <222> (85)..(1224) <223> NS1 <400> 9 ctcgacaaaa aattgaaatt ttattttttt tttttggaat ataaataaaa acacgataat 60 accatgggaa ttccccgatc tgga atg aat tca cgc agc acc tca ctg 108 Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu 1 5 tct gtg tca cta gta ttg gtg gga gtc gtg acg ctg tat ttg gga gtt 156 Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val 10 15 20 atg gtg cag gcc gat agt ggt tgc gtt gtg agc tgg aaa aac aaa gaa 204 Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu 25 30 35 40 ctg aag tgt ggc agt ggg att ttc atc aca gac aac gtg cac aca tgg 252 Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp 45 50 55 aca gaa caa tac aag ttc caa cca gaa tcc cct tca aag cta gct tca 300 Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser 60 65 70 gct atc cag aaa gct cat gaa gag ggc att tgt gga atc cgc tca gta 348 Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val 75 80 85 aca aga ctg gaa aat ctg atg tgg aaa caa ata aca cca gaa ttg aat 396 Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn 90 95 100 cac att cta tca gaa aat gag gtg aag ttg act att atg aca gga gac 444 His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp 105 110 115 120 atc aaa gga atc atg cag gca gga aaa cga tct ctg cag ccc cag ccc 492 Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro 125 130 135 act gag ctg aag tat tca tgg aaa aca tgg ggc aaa gcg aaa atg ctc 540 Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu 140 145 150 tct aca gag tct cat aac cag acc ttt ctc att gat ggc ccc gaa aca 588 Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr 155 160 165 gca gaa tgc ccc aac aca aac aga gct tgg aat tcg ctg gaa gtt gaa 636 Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu 170 175 180 gac tat ggc ttt gga gta ttc acc acc aat ata tgg cta aag ttg aga 684 Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg 185 190 195 200 gaa aag cag gat gta ttc tgc gac tca aaa ctc atg tca gcg gcc ata 732 Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile 205 210 215 aaa gac aac aga gcc gtc cat gcc gat atg ggt tat tgg ata gaa agt 780 Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser 220 225 230 gca ctc aat gac aca tgg aag ata gag aaa gcc tct ttc atc gaa gtt 828 Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val 235 240 245 aaa agc tgc cac tgg cca aag tca cac acc ctc tgg agt aat gga gtg 876 Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val 250 255 260 tta gaa agt gag atg ata att cca aag aat ttc gct gga cca gtg tca 924 Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser 265 270 275 280 caa cac aac tac aga cca ggc tac cat aca caa aca gca gga cca tgg 972 Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp 285 290 295 cat cta ggt aag ctt gag atg gac ttt gat ttc tgc gaa gga acc aca 1020 His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr 300 305 310 gtg gtg gtg act gag gac tgt gga aat aga gga ccc tct tta aga aca 1068 Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr 315 320 325 act act gcc tct gga aaa ctc ata aca gaa tgg tgc tgc cga tct tgc 1116 Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys 330 335 340 aca tta cca ccg cta aga tac aga ggt gag gac gga tgc tgg tac ggg 1164 Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly 345 350 355 360 atg gaa atc aga cca ttg aaa gag aaa gaa gag aat ttg gtc aac tcc 1212 Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser 365 370 375 ttg gtc aca gcc tag 1227 Leu Val Thr Ala 380 <210> 10 <211> 380 <212> PRT <213> Dengue virus type 2 <400> 10 Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val Leu Val Gly 1 5 10 15 Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp Ser Gly Cys 20 25 30 Val Val Ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe 35 40 45 Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro 50 55 60 Glu Ser Pro Ser Lys Leu Ala Ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu 65 70 75 80 Gly Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp 85 90 95 Lys Gln Ile Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu Ser Glu Asn Glu Val 100 105 110 Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly 115 120 125 Lys Arg Ser Leu Gln Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys 130 135 140 Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu Ser His Asn Gln Thr 145 150 155 160 Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg 165 170 175 Ala Trp Asn Ser Leu Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr 180 185 190 Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Arg Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp 195 200 205 Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala 210 215 220 Asp Met Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile 225 230 235 240 Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Ser Cys His Trp Pro Lys Ser 245 250 255 His Thr Leu Trp Ser Asn Gly Val Leu Glu Ser Glu Met Ile Ile Pro 260 265 270 Lys Asn Phe Ala Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr 275 280 285 His Thr Gln Thr Ala Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp 290 295 300 Phe Asp Phe Cys Glu Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly 305 310 315 320 Asn Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile 325 330 335 Thr Glu Trp Cys Cys Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg 340 345 350 Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu 355 360 365 Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn Ser Leu Val Thr Ala 370 375 380

Claims

(1) 전사 조절 인자(transcriptional regulatory element) 및 적어도 모기-매개성 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산,

(2) 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는

(3) 상기 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분의 용도로서, 상기 핵산 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 모기-매개성 플라비바이러스 및 적어도 다른 한가지 모기-매개성 플라비바이러스에 대한 백신을 제조하기 위한 용도.
제 1항에 있어서,

상기 핵산 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 모기-매개성 플라비바이러스는 뎅기 바이러스인 것을 특징으로 하는 용도.
(1) 전사 조절 인자 및 적어도 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산,

(2) 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는

(3) 상기 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분의 용도로서, 모든 뎅기 바이러스 혈청형 및 선택적으로 적어도 다른 한가지 모기-매개성 플라비바이러스에 대한 백신을 제조하기 위한 용도.
제 2항 또는 제 3항에 있어서,

상기 핵산 또는 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 뎅기 바이러스는 뎅기 바이러스 혈청형 2인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 모기-매개성 플라비바이러스 또는 상기 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열은 ATG 코돈 및 글리코실화 신호 서열을 코딩하는 서열에 의해 선행되고, 상기 코딩 서열은 번역 중지 코돈에 의해 종결되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 다른 모기-매개성 플라비바이러스는 서나일 바이러스, 황열 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 벡터는 폭스바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 용도.
제 7항에 있어서,

상기 폭스바이러스 벡터는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 균주, 특히 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁되어 있는 MVA-BN 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 용도.
제 7항 또는 제 8항에 있어서,

상기 폭스바이러스 벡터는 동결건조되고, 또한 투여 전에 약학적으로 허용가능한 희석제 내에서 재구성되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 전사 조절 인자는 폭스바이러스 프로모터인 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 백신은 치료학적으로 유효한 양으로 첫 번째 접종("프라임 접종") 및 두 번째 접종("부스팅 접종")에 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
(1) 전사 조절 인자 및 적어도 모기-매개성 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산,

(2) 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는

(3) 상기 플라비바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을, 필요로 하는 인간을 포함하는 동물에 접종하는 단계를 포함하는 플라비바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 플라비바이러스의 감염은 상기 핵산, 또는 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 모기-매개성 플라비바이러스에 의한 감염 및/또는 다른 모기-매개성 플라비바이러스에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서,

상기 핵산 또는 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 모기-매개성 플라비바이러스는 뎅기 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
(1) 전사 조절 인자 및 적어도 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 핵산,

(2) 상기 핵산을 포함하는 벡터 및/또는

(3) 상기 뎅기 바이러스의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을, 필요로 하는 인간을 포함하는 동물에 접종하는 단계를 포함하는 플라비바이러스의 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 상기 플라비바이러스 감염은 상기 핵산, 또는 상기 NS1 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 뎅기 바이러스 혈청형에 의한 감염 및/또는 다른 뎅기 바이러스 혈청형에 의한 감염 및/또는 다른 모기-매개성 플라비바이러스에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 DNA 또는 상기 단백질 또는 그의 일부분이 유래되는 상기 뎅기 바이러스는 뎅기 바이러스 혈청형 2인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 모기-매개성 플라비바이러스 또는 뎅기 바이러스 혈청형의 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열은 ATG 코돈 및 글리코실화 신호 서열을 코딩하는 서열에 의해 선행되고, 상기 코딩 서열은 번역 중지 코돈에 의해 종결되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 벡터는 폭스바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17항에 있어서,

상기 폭스바이러스 벡터는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
제 18항에 있어서,

상기 MVA 균주는 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁되어 있는 MVA-BN 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 폭스바이러스 벡터는 동결건조되고, 또한 투여 전에 약학적으로 허용가능한 희석제 내에서 재구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 전사 조절 인자는 폭스바이러스 프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 17항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 폭스바이러스 벡터 또는 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 첫 번째 접종("프라임 접종") 및 두 번째 접종("부스팅 접종")에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
전사 조절 인자 및 적어도 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 DNA를 운반하는 폭스바이러스 벡터로서, 상기 폭스바이러스는 ECACC에 기탁번호 V00083008로 기탁되어 있는 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(MVA) 균주 BN 또는 그의 유도체인 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.
제 23항에 있어서,

상기 플라비바이러스는 모기-매개성 플라비바이러스, 특히 뎅기 바이러스인 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.
제 24항에 있어서,

상기 뎅기 바이러스는 뎅기 바이러스 혈청형 2인 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.
제 23항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 플라비바이러스 NS1 단백질 또는 그의 일부분을 코딩하는 서열은 ATG 코돈 및 글리코실화 신호 서열을 코딩하는 서열에 의해 선행되고, 상기 코딩 서열은 번역 중지 코돈에 의해 종결되는 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.
제 23항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 전사 조절 인자는 폭스바이러스 프로모터인 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.
제 23항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 폭스바이러스 벡터는 동결건조되는 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터.
제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서,

백신으로서의 상기 폭스바이러스 벡터.
제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 따른 폭스바이러스 벡터 및 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
플라비바이러스 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 폭스바이러스 벡터 또는 제 30항에 따른 약학적 조성물에 있어서,

상기 폭스바이러스 벡터 또는 약학적 조성물은 치료학적으로 유효한 양으로 첫 번째 접종("프라임 접종") 및 두 번째 접종("부스팅 접종")에 투여되는 것을 특징으로 하는 폭스바이러스 벡터 또는 약학적 조성물.
제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 벡터 또는 제 30항에 따른 약학적 조성물을, 필요로 하는 인간을 포함하는 동물에 접종하는 단계를 포함하는 플라비바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법.
제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 따른 폭스바이러스 벡터를 포함하는 세포, 바람직하게는 인간 세포.
플라비바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위해 백신을 제조하기 위한 제 23항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 따른 폭스바이러스 벡터의 용도.
첫 번째 바이알(vial)/용기 내의 첫 번째 접종("프라이밍 접종") 및 두 번째 바이알/용기 내의 두 번째 접종("부스팅 접종")을 위한 제 23항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 따른 폭스바이러스 벡터 또는 제 30항에 따른 약학적 조성물을 포함하는 프라임/부스트 면역을 위한 키트.