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KR20050122544A - 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판을 이용한ｐｎａ 칩 - Google Patents

에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판을 이용한ｐｎａ 칩 Download PDF

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KR20050122544A
KR20050122544A KR1020040047677A KR20040047677A KR20050122544A KR 20050122544 A KR20050122544 A KR 20050122544A KR 1020040047677 A KR1020040047677 A KR 1020040047677A KR 20040047677 A KR20040047677 A KR 20040047677A KR 20050122544 A KR20050122544 A KR 20050122544A
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pna
epoxy group
polymer
acrylate
plastic substrate
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하정민
장재영
김인수
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주식회사 엘지화학
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Abstract

본 발명은 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판위에 원하는 DNA 염기서열을 포함하는 탐침 PNA(Peptide Nucleic Acid)가 고정화된 것을 특징으로 하는 PNA 칩에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 단일가닥 PNA를 투명한 플라스틱 위에 에폭시 필름을 이용하여 효과적이고 저렴하게 고정화할 수 있으며, PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 형광 시그날 검출을 통해 단일 염기 유전자 변이(Single Nucleotide Polymorphism)를 검출할 수 있다.

Description

에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판을 이용한 ＰＮＡ 칩{PNA chip using plastic substrate coated with polymer having epoxy groups}
본 발명은 PNA (Peptide Nucleic Acid) 칩에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판위에 원하는 DNA 염기서열을 포함하는 탐침 PNA가 고정화된 것을 특징으로 하는 PNA 칩에 관한 것이다.
펩타이드뉴클레익에시드(Peptide Nucleic Acid, 이하 PNA)는 Gene-targeting drug로서 처음 개발되었으며 PNA와 상응하는 DNA와의 뛰어난 하이브리드 형성 성질로 인하여 많은 연구가 발표되고 있다. PNA/DNA 하이브리드 형성의 기본은 그에 상응하는 DNA 단일 가닥과 강한 base paring을 통하여 상호작용을 하는 것이다. 다시 말하면 PNA의 가장 큰 특징은 상보적인 DNA와 뛰어난 하이브리드를 형성하여 DNA인지도가 아주 뛰어나다는 것이다. PNA의 구조는 DNA와 아주 흡사하다. PNA의 구조는 negative charge를 띠는 DNA의 sugar-phosphate backbone을 대신하여 neutral한 peptide backbone을 가지고 있으며 amide bond에 의해서 연결된 반복 유닛인 N-(2-aminoethyl)glycine을 가지고 있다. PNA에 존재하는 4개의 necleobase는 DNA의 base와 비슷한 공간을 차지하고 있으며 전체적인 분자간 거리도 거의 흡사하게 배열되어 있음이 알려져 있다. 이러한 PNA의 구조는 DNA와는 달리 Nulease나 protease에 의한 degradation이 되지 않아 높은 생물학적 안정성을 제공하고 있다. 또한, DNA duplex의 thermal stability는 DNA backbone의 차지로 인하여 salt 농도에 의해영향을 받지만 PNA/DNA duplex의 thermal stability는 PNA의 neutral backbone으로 인하여 근본적으로 salt 농도와는 무관하게 된다. 이러한 성질은 DNA와의 electrostatic repulsion을 감소시켜 PNA/DNA duplex의 thermal stability를 증가시킨다. 이런 다양한 PNA의 이점으로 인하여 DNA가 할 수 없는 중요한 생물학적 응용이나 진단용으로 중요해 지고있는 추세이다.
PNA 고정화 기술은 DNA 고정화기술과 유사한 방법으로 연구되고 있다. 지금까지의 DNA고정화 방법은 분석하고자 하는 시료와 하이브리드를 형성하게 하기 위하여 단일가닥 DNA를 고정하는 방법이 대부분이다. 그 방법들은 DNA를 고체표면에 흡착시키는 방법(Nikiforov and Rogers, Anal Biochem. 1995)이 주로 사용되고, 일부 혼성중합 방법(Proudnikov et al., Anal Biochem. 1998; Rehman et al., Nucleic Acids Res. 1999)이나, 복합체 형성 방법(Nilsson et al., Anal Biochem. 1995 )등이 개발되어 있다. 주로 합성을 통하여 만들어지는 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법들로는 광리소그라피(photolithography) (Gerhold et al., Trends Biochem Sci. 1999 )이 널리 알려져 있으며, 올리고뉴클레오티드합성시에 도입한 반응기와 지지대 간의 공유결합을 이용하는 방법으로 실란(silane) ( Rogers et al., Anal Biochem. 1999) 또는 자기조립 단층막( Higashi et al., J Colloid Interface Sci. 1999)을 이용한방법들이 사용되고 있다. 위의 방법에서 흡착등의 물리적인 방법으로 고정화된 생체물질에는 고정화에 따른 공간적, 구조적 제약이 있으며 비특이적 흡착에 의한 배경 신호가 높게 나타나는 등 분석상의 어려움이 있다. 또한, 에폭시 실란을 코팅하는 경우 유리기질에만 코팅이 가능하고 플라스틱 기질에 코팅하기 어려워 기질의 성형에 제한을 가져온다.
생체물질 혹은 고분자 어레이를 형성하는 방법에는 마이크로로봇이 3차원적으로 움직이면서 원하는 위치에 선택적으로 생화학물질을 떨어뜨리는 스폿팅(Spotting)방식, 만년필 촉과 같은 형태의 핀(pin)을 이용하여 어레이하는 마이크로 어레이 방식, 원하는 위치에 선택적으로 빛을 쪼임으로써 표면을 변화시켜 표면과 생체분자와의 결합 반응이 특정 위치만 일어나게 하는 광 리소그라피(photolithography) 방식, 미소전극 어레이(microelectrode array)의 전극 전압을 조절하여 생체분자가 특정 전극에만 고정되도록 하는 전자 어드레싱(electronic addressing)방식이 있다. 본 발명은 비접촉 잉크젯 인쇄 스폿팅(non-contacting inkjet printing spotting)방법을 이용하여 PNA를 어레이 하였다
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 범용 플라스틱 기질에 에폭시기를 갖는 중합체를 도입하거나 코팅하면 PNA를 플라스틱 위에 저렴하고 효과적으로 고정화할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 범용 플라스틱 기질에 PNA를 저렴하고 효과적으로 고정화할 수 있는 새로운 PNA 칩을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 PNA 칩을 효과적으로 제조하는 방법을 제공하는 데 있다
본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 PNA 칩을 이용하여 단일 염기 유전자 변이(Single Nucleotide Polymorphism)를 검출하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판위에 원하는 DNA 염기서열을 포함하는 탐침 PNA (Peptide Nucleic Acid)가 고정화된 것을 특징으로 하는 PNA 칩을 제공한다.
본 발명에 있어서, 플라스틱 기판은 중합체가 코팅될 수 있는 어떤 것도 될 수 이으나, 바람직하게는 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리노보낸(polynorbonene), COC(Cyclic olefin Copolymer), 불소화 폴리이미드, 폴리스틸렌(PS), SBC(styrene-butadiene copolymer), ABS(acrylonitrile butadiene styrene), SAN((styrene acrylonitrile) 및 폴리 술폰으로 구성된 군에서 선택된 재질로 만들어진 투명한 플라스틱 기판인 것을 특징을 한다. 기존의 글라스 기판에 비하여 플라스틱 기판은 좀더 저렴한 방법으로 제공받을 수 있으며 표면 처리를 따로 수행할 필요가 없는 장점이 있다. 또한 깨지기 쉬운 글래스 기판보다 보다 유연한 플라스틱 기판을 사용함으로써 운반 및 저장이 쉽고 사용자가 다루기 쉽다는 장점이 있다. 또한 투명한 플라스틱 기판은 형광을 발하지 않기 때문에 PNA의 신호 검출이 용이하다.
본 발명에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체는 에폭시(epoxy)를 작용기로 갖는 어떤 중합체도 될 수 있으나, 바람직하게는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 에폭시기를 갖지 않는 아크릴레이트 모노머의 공중합체인 것을 특징으로 한다. 이러한 공중합체는 선택되어지는 기판에 따라 자유롭게 선택되어질 수 있으며 특히 에폭시를 가지는 모노머의 중량비를 조절함으로써 원하는 에폭시 함량을 가지는 공중합체를 제조할 수 있다. 그리고 PNA와의 접근성 또한 적절한 모노머를 사용함으로써 향상시킬 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서, 에폭시기를 갖는 중합체는 하기 화학식1을 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 점성이 큰 아크릴레이트 모노머의 공중합체인 것을 특징으로 한다.
－［ＣＲ３Ｒ３－ＣＲ１Ｒ３－Ｘ］ｎ－
（상기식에서,　Ｒ１은　에폭시기를　가지는　에스터이고，R３는　수소　또는　알킬기이고, Ｘ는　점성이 큰 아크릴레이트계　화합물이다）
본 발명에 있어서, 점성이 큰 아크릴레이트 모노머는 아크릴레이트의 자외선 경화법에서 코팅성을 향상시키기 위하여 사용될 수 있는 어떤 것도 가능하나(T. Jaworek, Macromol Symp., 159, 197, 2000; Cliff Roffey, " Photogeneration of Reactive Species for UV Curing", 1997 참조), 바람직하게는 점도가 8~6000cp(25℃) 범위인 아크릴레이트 모노머, 더욱 바람직하게는 dipentaerythrithol hydroxy pentaacrylate(DPHA), 9-ethyleneglycol diacrylate(9-EGDA), Pentaerythritol tri,tetraacrylate(PETA), Polyethyleneglycol 400 diacrylate, Tripropyleneglycol diacrylate, trimethylol propane triacrylate 및 Dipentaerythritol hexacrylate로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예에서, 에폭시기를 갖는 중합체는 하기 화학식2를 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 플라스틱 기질과 접착(adhesion)가능한 아크릴레이트 유도체의 공중합체인 것을 특징으로 한다.
－［ＣＲ３Ｒ３－ＣＲ１Ｒ３－ＣＲ３Ｒ３ －ＣＲ２Ｒ３］ｎ－
（상기식에서,　Ｒ１은　에폭시기를　가지는　에스터이고，Ｒ２는 알킬에스터이고，Ｒ３는　수소　또는　알킬기이다）
본 발명에 있어서, 플라스틱 기질과 접착(adhesion)가능한 아크릴레이트 유도체는 플라스틱 기질과 모노머의 종류가 유사하여 중합체의 물성이 비슷하여 코팅시 기질과의 접착이 용이한 어떤 아크릴레이트 유도체도 가능하나, 바람직하게는 메틸메타아크릴레이트(MMA), 에틸아크릴레이트, 에틸메타아크릴레이트(EMA), n-프로필아크릴레이트, n-프로필메타아크릴레이트,아이소프로필아크릴레이트, 아이소프로필메타아크릴레이트로 구성된 군 또는 상기 물질군에서 선택되어져 합성된 중합체에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 상기 메틸메타아크릴레이트(MMA)는 기질이 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA)일때 그 물성이 거의 동일하여 특히 유리하다.
본 발명에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체에서 에폭시기의 함량, 즉 중합체에서 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 단량체가 차지하는 중량%는 0.1-100%까지 가능하나, 바람직하게는 10% 이상, 더욱 바람직하게는 20 - 30% 인 것을 특징으로 한다. 에폭시기가 10% 이하인 경우에는 낮은 에폭시기 밀도로 인하여 PNA를 좁은 영역에 집적하기 어려워 형광신호가 약하게 나타나며 반면에 40% 이상인 경우에는 PNA의 고정화가 에폭시기의 밀도증가와 더불어 증가하지 않음을 알 수 있었다. 이는 상대적으로 많아진 에폭시기에 의하여 코팅 표면의 에폭시기가 표면에 돌출되지 못하고 파묻히는 결과를 주어 PNA와 효과적으로 반응하지 못하기 때문으로 생각된다.
본 발명에 있어서, 탐침 PNA는 그 아민(amine) 말단이 바로 플라스틱 기판에 코팅된 중합체의 에폭시(epoxy)기와 결합될 수도 있으나, 바람직하게는 탐침 PNA의 아민 말단에 말단에 아민 작용기를 가지며 에테르가 있거나 없는 탄소수 5-8개의 카르복실산이 링커로 추가된 것을 특징으로 한다. 상기 링커는 공정화된 탐침 PNA의 공간 방향성을 증가시켜 DNA와의 하이브리드 형성을 극대화할 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머, 점성이 큰 아크릴레이트 모노머 및 광개시제를 10~90: 80~5 : 1~10의 비율로 혼합하는 단계, 상기 혼합액을 플라스틱 기판위에 코팅하는 단계, 자외선을 이용하여 경화시키는 단계, 및 탐침 PNA 프린팅 용액을 스포팅하는 단계를 포함하는 PNA 칩의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머, 플라스틱 기질과 물성이 비슷한 아크릴레이트 유도체 및 라디칼 개시제를 10~99: 1~89 : 0.1~0.5의 비율로 혼합하는 단계, 상기 혼합액을 라디칼 중합시키는 단계, 상기 중합체를 용해제에 용해시킨 용액을 플라스틱 기판위에 코팅하는 단계, 및 탐침 PNA 프린팅 용액을 스포팅하는 단계를 포함하는 PNA 칩의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 탐침 PNA의 아민기와 중합체의 에폭시기의 친핵성 치환반응을 효과적으로 수행하기 위한 탐침 PNA 프린팅 용액에 적당한 농도, 바람직하게는 0.01~1.0M 특히 바람직하게는0.05~0.5M 농도의 염기 베이스를 첨가하여 고정화를 돕는 것을 특징으로 한다. 상기 염기 베이스는 수산화나트륨, 수산화 칼륨, 탄산 나트륨, 탄산 칼륨, 루이스 산과 같은 일반적인 염기물을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 탐침 PNA를 스포팅하기 전에 중합체가 코팅된 플라스틱 기판을 30%이상의 습도가 유지되는 곳에 4시간 이상 보관하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 습도가 30%미만의 낮은 조건에서 코팅 기질을 보관할 경우 에폭시와 아민간의 반응 효율이 저하되어 시그널 감소로 나타날 수 있다. 습도는 바람직하게는 50% 이상에서 95%까지 가능하다. 보관시간을 4시간 이상으로 한 것은 유기 용매를 날려 보내기 위한 것으로 습도가 유지되는 한 수십 시간까지 보관이 가능하다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명에 따른 PNA 칩에 표적 DNA를 포함한 반응 시료를 적용하는 단계, 탐침 PNA와 표적 DNA를 혼성화(Hybridization) 반응시키는 단계, 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계, 및 PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 생체 물질를 고정하기 위한 에폭시기를 가지는 고분자물질을 제공한다.
[화학식 1]
－［ＣＲ３Ｒ３－ＣＲ１Ｒ３－Ｘ］ｎ－
[화학식 2]
－［ＣＲ３Ｒ３－ＣＲ１Ｒ３－ＣＲ３Ｒ３ －ＣＲ２Ｒ３］ｎ－
（상기식에서,　Ｒ１은　에폭시기를　가지는　C3-12의 에스터이고，Ｒ２는 C2-16의 알킬에스터이고，Ｒ３는　수소　및　C1-16의 알킬기이고, Ｘ는　점성이 큰 아크릴레이트계　화합물이다, n은 모노머 농도와 반응시간에 의존하지만, 바람직하게는 10~2000이다.
상기 고분자 물질은 아크릴레이트계 화합물을 사용하여 i)자외선 경화법(T. Jaworek, Macromol Symp., 159, 197, 2000; Cliff Roffey, 'Photogeneration of Reactive Species for UV Curing', 1997 참조) 또는 ii)라디칼중합(Bevington, J.C., in 'Comprehensive Polymer Science', Vol 3, 65 1989; Tedder, J.M., Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 21, 401, 1982 참조)을 이용하여 제공된다.
상기 고분자 물질은 2가지 이상의 아크릴레이트계 모노머를 사용하였고 다양한 조합의 모노머 사용으로 에폭시기 비율을 다양하게 조절할 수 있으므로 적합한 에폭시기를 가지는 고분자 물질을 제공할 수 있다.
I) 자외선 경화법으로 제공되어지는 코팅층 형성용 고분자 필름은 에폭시기를 가지는 아크릴레이트와 점성이 큰 아크릴레이트 모노머를 한가지 이상 사용한다. 아크릴레이트 모노머는 2개 이상의 비닐기를 가지는 모노머를 사용한다. 본 발명은 자외선 경화시 사용되는 코팅용액 조성과 아크릴레이트 화합물의 조성비를 제공하고 자외선 경화시 효과적인 코팅 방법을 제공한다.
II) 라디칼중합법으로 제공되어지는 코팅층 형성 고분자 필름은 마찬가지로 에폭시기를 가지는 아크릴레이트와 플라스틱 기질과 물성이 비슷한 아크릴레이트 유도체 및 일반적인 라디칼 개시제(azo-화합물, 과산화물, redox 개시제)를 사용하여 라디갈 중합을 하여 제공한다(Graeme moad, 'the chemistry of free radical polymerization', 1995). 마찬가지로 에폭시기를 가지는 아크릴레이트의 중량비에 따라 에폭시기의 비율을 결정할 수 있고 그에 따른 고분자 합성 방법을 제공한다.
열중합법을 이용한 코팅층 형성 고분자 화합물에서는 에폭시기를 가지는 아크릴레이트 외에 알킬에스터를　가지는　아클릴레이트계　모노머를 사용하였다.
자외선을 이용한 코팅층 형성용 고분자 화합물에서 사용되는 에폭시기를 가지는 아크릴레이트계 외에 다른 아크릴레이트계 모노머는 dipentaerythrithol hydroxy pentaacrylate(DPHA), 9-ethyleneglycol diacrylate(9-EGDA), Pentaerythritol tri,tetraacrylate(PETA), Polyethyleneglycol 400 diacrylate, Tripropyleneglycol diacrylate, trimethylol propane triacrylate 및 Dipentaerythritol hexacrylate와 같은 점성이 큰 아크릴레이트 모노머를 주로 사용한다.
따라서 코팅층 형성용 고분자 화합물은 에폭시기를 가지는 아크릴레이트 외 상기 아크릴레이트계 모노머 1가지 이상으로 구성되어진다.
상기 공중합법을 이용한 코팅층 형성 고분자 합성에서는 에폭시기를 가지는 아크릴레이트와 다른 아크릴레이트의 중량 비를 0.1:99.9에서 100:0으로 제조할 수 있고 생체물질을 고정하기위한 에폭시기를 가지는 아크릴레이트의 중량 비는 10%이상이 바람직하다.
공중합시 반응온도는 에폭시기의 고리 열림을 방지하기 위하여 90℃이하에서 공중합을 수행시키는 것이 바람직하다.
공중합시에 반응시간을 조절함으로서 고분자의 평균 분자량 조절이 가능한데, 코팅용액제조와 코팅시 투명도나 갈라짐 방지를 위하여 1에서 6시간 정도 반응시키는 것이 바람직하다.
고분자 합성 종료는 과량의 메틸알콜등의 알코올류를 사용하여 침전함으로써 코팅층 형성용 고분자를 제공한다.
건조된 고팅층 형성용 고분자는 테트라하이드로퓨란, 디클로로메탄 등을 이용해서 0.1% ~ 5% 코팅용액을 제조 할 수 있고 갈라짐이나 투명도를 위하여 1~3%의 코팅용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 코팅층 형성용 고분자 화합물 코팅하는 기판은 일반적인 실리콘 웨이퍼, 유리에도 사용될 수있으나, 바람직하게는 플라스틱 기판, 더욱 바람직하게는 투명한 플라스틱 기판을 사용할 수 있다. 기존의 칩 기판은 주로 잘 가공된 비싼 유리를 사용하여왔으나 본 발명에서는 싸고 다루기 쉬운 일반적인 플라스틱기판을 사용하여 유리 기판이 지니는 단점을 극복할 수 있었다. 일반적으로 투명한 플라스틱이라 함은 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리노보낸(polynorbonene), COC(Cyclic olefin Copolymer), 불소화 폴리이미드, 폴리스틸렌(PS), SBC(styrene-butadiene copolymer), ABS(acrylonitrile butadiene styrene), SAN((styrene acrylonitrile) 또는 폴리 술폰 등을 포함한 기판을 포함한다.
상기코팅층 형성용 고분자 화합물의 코팅은 디핑법, 스프레이법, 및 프린팅법 등 범용 코팅방법 중에서 어느 하나의 방법을 사용해도 무관하다. 상기 코팅시 PMMA는 습도가 50%이상인 조건에서 보관 후 사용하는 것이 좋으며 습도가 낮은 조건에서 보관할 경우 PNA의 고정화 효율이 떨어질 수 있다.
본 발명은 플라스틱 기판위에 유도된 에폭시기와 생체물질인 PNA와의 강한 고정화 방법은 적당한 농도의 염기　베이스 (수산화나트륨，　수산화　칼륨，탄산　나트륨，탄산　칼륨，　루이스　산)를 이용하여 마이크로 어레이를 이용하여 스폿팅 함으로써 쉽고 저렴한 방법으로 제공한다.
본 발명은 아민 수식된 PNA를 상기 기질 위에 유도된 에폭시기에 결합시키기 위하여 염기성 촉매를　사용한 프린팅 버퍼(printing buffer)를 제조하였으며, 잉크젯 어레이어를 이용한 주입에 의해 표면에 고정되도록 함으로써 쉽고 저렴한 방법으로 제공한다. 상기 고정화는 23℃정도의 온도와 50%-60%의 습도가 유지되는 조건에서 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 방법으로 제조된 PNA 배열을 이용하여 PNA와 DNA의 특이적인 하이브리드 형성을 수행하는데 필요한 최적의 하이브리드 형성을 위한 버퍼용액과 반응 조건 및 효과적인 세척방법을 제공한다.
하이브리드 형성을 위한 버퍼용액 조성으로는 5X SSC, 50mM HEPES, 1% SDS, 0.1% BSA를 포함하며 반응 전에 비특이적 하이브리드 형성를 막기위한 별도의 블로킹 과정을 포함하지 않는다.
반응 후 세척을 위한 버퍼용액으로는 1X, 0.1X, 0.01X, 0.001 X SSC를 사용하였으며 각각 5분씩 세척하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
(실시예 1) 자외선 경화법
에폭시기를 도입하기위한 글리시독시메틸메타아그릴레이트(GMA)와 9-에틸렌글리콜디아크릴레이트(9-EGDA), 광개시제(Irgacure 184, Ciba-Geigy Chemical Co.) 를 적당한 비율(10~90: 80~5 : 1~10)로 혼합한다. 광개시제를 완전히 녹인 후 폴리메틸메타아크릴레이트 기판에 스핀코터로 500 rpm에서 6초간 코팅하고 연속적으로1000~4000rpm에서 20초간 코팅한다. 그리고 질소분위기에서 254nm의 자외선을 이용하여 경화한 다음 건조한 곳에 보관한다. 이 방법은 상기 아크릴레이트 모노머와 플라스틱기질에 국한되는 것이 아니고 다양한 모노머와 기질에 적용할 수 있다. 생성된 에폭시기를 갖는 중합체의 화학식은 다음과 같다: -[CH2C(CH3)(C(O)OCH2CHCH2)CH2CH(C(O)O(CH2CH2O)9C(O)CHCH2)]n-. 상기와 같은 자외선 경화법에 따라, 9-EGDA대신 DPHA 또는 PETA를 사용하면 GMA와 DPHA또는 PETA의 중합체를 제조할 수 있다. 도 １은　본　발명에서　범용　플라스틱　위에　에폭시기를　가지는　폴리머를　코팅하고 에폭시기를 가지는 폴리머 위에 PNA를 고정화한 　모식도이다.
(실시예 2) 라디칼중합법
에폭시기를 도입하기위한 글리시독시메틸메타아크릴레이트(GMA)와 메틸메타아크릴레이트(MMA), 라디칼 개시제(2,2,6,6-tetramethyl-4-piperidinol, TMPO), 그리고 분자량 조절제를 적당한 비율로 혼합한다. 그 혼합비는 위에 언급한 순서대로 다음과 같다. 99~10 : 1~89 : 0.1~0.5 : 0.1~0.5 의 비로 혼합하였다. 혼합된 용액은 75℃ 오븐에서 2시간동안 정체한 다음 연속적으로 90℃에서 0.5~3시간동안 정체한다. 메틸메타아크릴레이트의 중량비에 따라 점성에 큰 차이가 남으로 완전히 고체가 되기 전에 반응을 종료한다. 반응혼합물이 적당한 점성으로 되었을 때 메틸알코올을 과량 첨가하여 강하게 교반하여 재결정을 수행한다. 채취한 결정은 하루동안 진공건조 한다. 얻어진 고분자는 NMR 분석을 통하여 에폭시기의 함량을 결정하였고, GPC를 이용하여 평균 분자량을 측정 하였다. 위에서 합성된 고분자를 중량비 0.1~5%로 테트라하이라퓨란에 용해한다. 폴리메틸메타메틸메타아크릴레이트(PMMA )기질을 스핀 코터에 고정하고 코팅용액 2ml를 분취하여 스핀코팅하였다(도면 1). 생성된 에폭시기를 갖는 중합체의 화학식은 다음과 같다: -[CH2C(CH3)(C(O)OCH2CHCH2)CH2C(CH3)(C(O)OCH3)]n-, 평균 분자량 Mw : 75000 ~ 250000. 상기와 같은 라디칼 중화법에 따라, MMA대신 EMA를 사용하면 GMA와 EMA의 중합체를 제조할 수 있다.
상기 코팅된 기질은 50%이상의 습도가 유지되는 곳에 4시간 이상 보관 후 사용한다. 습도가 낮은 조건에서 코팅 기질을 보관할 경우 에폭시와 아민간의 반응 효율이 저하되어 시그널 감소로 나타날 수 있다. 도 ４는 에폭시기를 가지는 폴리머로 코팅된 플라스틱을 다양한 습도(10, 20-30, >50%)하에 노출한 후, PNA array의 PNA/DNA 하이브리드 형성 결과를 본 실시예로 본 발명의 코팅 플라스틱이 PNA 고정화전에 보관되어야 할 조건을 나타낸다. 측정 값 PM/MM ratio는 DNA/ PNA hybridization결과 PM (perfect match)의 평균 형광 시그널을 MM (mismatch)의 평균 형광 시그널로 나눈 비를 나타내며 PM과 MM의 시그널 차이는 한개의 염기 차이에 의해 나타나는 결과이다. 비가 클수록 표적 DNA가 우수한 specificity를 나타내는 것이다. 도 4에서 보여지듯이, 30%이상의 습도, 더욱 바람직하게는 50% 이상의 습도에서 코팅 슬라이드를 보관하였을때 시그널 감도(PM/MM ratio)가 훨씬 좋게 나왔다.
(실시예 3) PNA-Cy3의 고정화
앞에서 제조된 플라스틱 위의 에폭시기 필름에 PNA를 고정시키기 위하여 GMA의 함량에 따른 PNA의 고정화 정도에 관한 실험을 진행하였다. 사용한　ＰＮＡ는　rtl180W(PNAGENE. Inc)이며　Ｃ　말단에　형광체인　Ｃｙ３가　결합되어　있는　것이다. 프린팅　용액　제조와　스폿팅은　아래의 실시예　５와　같은　방법으로　제조하였다．　고분자 필름은 GMA함량에 따라 에폭시기의 함량이 20%, 30%, 40%, 50%를 각각 사용하였다. 사용한 PNA는 rtL-180의 말단에 형광체가 결합되어 있어 직접적으로 고정화되는 정도를 검출할 수 있게 하였다. 사용한 PNA의 농도는 각각 500, 400, 300, 200, 100 nm에 대하여 고정화 정도를 실험 하였다. 도 ２a는　본　발명에서　필름의　에폭시기　함량에　따른　최적의　ＰＮＡ를　고정화율을　구하는　실시예의　형광　이미지와　도 2b는 그 스폿　배치도　이다. 도 ３은　도 ２의　형광　이미지　정량 분석　데이터이다. Y축의 S/B ratio는 PNA-cy3를 첨가하지 않은 스폿 조성물의 형광세기를 바탕 신호로 한 것이다. 도 3으로부터, 필름의 epoxy 함량이 20%와 30%에서 최대의 고정화됨을 보여 주었고 나머지 함량에서도 고정화가 문제 없음을 알 수 있었다. 상기 실험에서 사용한　ＰＮＡ인 rtl180W의 서열은 다음과 같다.
rtL180w: N terminal (5') GTTTCTCC*TGGCT- C terminal (3')－Ｃｙ３ [서열번호2]
(실시예 4) 프린팅 용액 제조 및 어레이 제작
13mer의 PNA oligo nucleotide (PANAGENE, Inc.)는 50uM로 증류수에 녹인다. PNA A는 DNA와의 하이브리드 형성을 정성적으로 확인하기위한 위한 대조군 서열이며 rtL180w는 HBV (hepatitis B virus)의 RNA poymerase의 독특한 서열이다 (GeneIn,Inc.). rtL180m은 라미부딘 내성을 나타내는 HBV의 RNA polymerase의 서열로 rtL180w와 rtL180m간에 서열 차이는 1염기이다 (CA). rtL180w와 rtL180m 서열은 SNP (Single Nucleotide Polymorphism)확인을 위한 실험군 서열로 사용되었다. 고정화를 위하여 베이스로는 0.1N 농도의 NaOH 용액이 사용되었다. 위에서 제조한 두 용액을 1:1~0.5의 비율로 석어서 96 well plate에 준비한다. 준비한 시료를 잉크젯 방식의 어레이어 (Cartesian)를 통하여 스폿팅한 후 습도 50% 이상, 온도 23-4℃에서 16시간정도 보관하여 epoxy와 아민간의 반응이 충분히 이루어지도록 한다(도 5). 스폿팅시에 스폿의 크기를 일정하게 하기 위하여 습도를 높여 줄 필요가 있다.
아래는 상기 실험에 고정된 탐침 PNA 서열 (PNA oligo nucleotide 서열-13mer)을 나타낸다.
A 서열(인공서열): N terminal (5') TTCCACCAGATGG - C terminal (3') [서열번호1]
W 서열(rtL180w): N terminal (5') GTTTCTCC*TGGCT- C terminal (3') [서열번호2]
M 서열(rtL180m): N terminal (5') GTTTCTCA*TGGCT- C terminal (3') [서열번호3]
(실시예 5) On-Chip-Reaction 과 SNP ( Single Nucleotide Polymorphism) 검출
PNA가 고정된 PMMA슬라이드는 5분간 증류수 수세를 통하여 남아있는 NaOH를 제거한 후 별도의 blocking과정 없이 바로 Hybridization을 수행한다. Hybridization buffer는 5X SSC (sodium chloride와 sodium citrate로 구성된 pH7.0 buffer), 50mM HEPES, 1% SDS, 0.1% BSA로 구성되어 있으며 Target은 형광 발색단의 종류인 Cyanine3 가 수식된 DNA (1pM~100nM)를 이용하였다. Target이 포함된 Hybridization 용액은 94℃에서 5분간 열변성 한 후, 42℃에서 60분간 incubation하였다. 보통 PNA는 DNA에 비해 한 개의 염기당 1도 정도 높은 Tm값을가진다. 비특이적 PNA/DNA 반응을 제거 하기위한 세척은 1X SSC, 0.1X SSC, 0.01X SSC, 0.001X SSC buffer를 사용하여 각 5분씩 진행하였다. 세척이 끝난 PNA array는 습기를 완전히 제거한 후 형광 검출용 laser scanner (Axon Instrument, Inc.)를 사용하여focus position 65, PMT 400 조건에서 시그널을 확인한다. 도 ５a는 표적 DNA에 따른 PNA/DNA hybridization 결과를 보여주는 형광 이미지 분석 데이터이고 도 5b는 그 스폿 배치도이다. (A)는 Positive Control로서 Artificial PNA 서열에 대한 상보적인 DNA oligonucleotide를, (B)는 일반 HBV감염을 확인하기위한 PNA 서열에 대한 상보적인 DNA oligonucleotide를, (C)는 라미부딘 내성을 가지는 HBV감염을 확인하기위한 DNA oligonucleotide를 각각 target DNA로 사용하였다. 도 5로부터 각 PNA 프로브와 표적 DNA 올리고뉴클레오티드가 특이적으로 혼성화하는 것을 알 수 있다. 도　６a 및 6b는 에폭시기 함량에 따른 rtL180w와 rtL180m의 PNA/DNA 하이브리드 형성 결과를 보여주는 정량분석 데이터이다. 도 6으로부터 중합체의 epoxy 함량이 20%와 30%에서 하이브리드가 가장 잘 형성되는 것을 알 수 있었다.
아래는 반응에 사용된 Target DNA 서열 (DNA oligo nucleotide 서열- 13mer)을 나타낸다.
A Target 서열: 5' Cy3- CCATCTGGTGGAA-3' [서열번호4]
W Target 서열: 5' Cy3- AGCCAG*GAGAAA-3' [서열번호5]
M Target 서열: 5' Cy3- AGCCAT*GAGAAA-3' [서열번호6]
(실시예　6) ＰＮＡ　링커　실험
ＰＮＡ의　아민　말단에　탄소수가　５~８개인　아민　작용기가　있는　산을　반응시켜　상보적　ＤＮＡ와의　하이브리드 형성을　최대화　하는　실험을　실시　하였다．도　７a 및 7b는　본　발명에서　ＤＮＡ와의　하이브리드 형성을　극대화　하기위한　링커에　대한　모식도 및 대표적인 링커들의 화학구조식이다. O-링커는 2-(2-aminoethoxy)ethoxy acetic acid이며, M-링커는 2-aminoethoxy acetic acid, C-링커는 6-aminohexanoic acid이다. ＰＮＡ의　아민　말단에　반응시킨　아민기를　가지는　산은　ＰＮＡ와　반응하여　팹타이드　본드를　형성하고　말단에　다시　아민　작용기를　주어　앞의　실시예와　마찬가지로　에폭시기를　가지는　필름과　반응하여　고정화　될　수　있다．이는　고정화된　탐침　ＰＮＡ의　공간　방향성을　증가시켜　ＤＮＡ와의　하이브리드 형성을　극대화　시킬　것으로　판단하였다．링커로　쓰인　아민기를　가지는　산은　６－아미노카프론산을　사용하였다．에폭시기　필름은　고정화와　하이브리드 형성에서　최대값을　보이는　２０％，３０％를　사용하였다．기존의　rtL180 W 타입과　비교　실험을　수행하였으며　실험　방법은　실시예 4, 5의　방법과　같다．도　８a는　본　발명에서　링커에　의한　ＤＮＡ와의　하이브리드　형성을 보여주는 실시예로 형광이미지이고, 도 8b는 그 스폿　배치도이다. 스폿 배치도의 아래에는 링커타입과 PNA 타입이 기재되어 있다. H2O+NaOH는 네가티브 콘트롤이고, rtLW는 링커가 없는 기존의 와일드 타입 PNA, rtLW-3은 O 링커, rtLW-4는 M 링커, rtLW-5는 C6 링커가 붙여진 rtLW PNA를 나타낸다. 마지막의 PNA-cy3는 위치 마커이다. 도　９a 및 9b은　도　8의　형광　이미지　정량 분석　데이터이다. rtLW는 링커가 없는 기존의 와일드 타입 PNA, rtLW-3은 O 링커, rtLW-4는 M 링커, rtLW-5는 C6 링커가 붙여진 rtLW PNA를 나타낸다. 도 9로부터 링커가 결합된 PNA 프로브가 표적 DNA에 대해 훨씬 우수한 specificity를 나타내는 것을 알 수 있다.
아래는 상기 실험에 사용된 탐침 PNA-링커 서열을 나타낸다.
W(rtL180w)-링커 서열: 5' Cy3- AGCCAG*GAGAAA-3'- Linker
M(rtL180m)-링커 서열: 5' Cy3- AGCCAT*GAGAAA-3'- Linker
(실시예 7) PNA/DNA 하이브리드 형성의 민감도
실시예 1, 2를 통해 준비된 코팅 슬라이드에 기존에 알려진 PNA 또는 DNA Probe농도 보다 낮은 농도인 10uM, 5uM까지 감소시켜서 고정한 후 실시예 4, 5에서 수행된 방법으로 PNA array의 민감도를 살펴보았다. PNA는 DNA보다 높은 Tm값을 가지고 전하를 띄지 않아 반발력을 나타내지 않으므로 DNA에 비해 높은 binding affinity를 가지므로 5uM이 고정되어도 높은 시그널 ratio를 나타낸다. 도 10은 탐침 PNA 농도에 따른 PNA/DNA 하이브리드 형성의 감도를 보여주는 정량 분석 데이터이다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 범용 플라스틱 위에 효과적이고 저렴하게 탐침 PNA를 고정화 시켜 다양한 유전자의 변이를 탐색할 수 있으며, 우수한 PNA의 물리적 화학적 성질로 인하여 기존의 DNA칩의 단점을 극복할 수 있을 것으로 기대한다.
도　１은　본　발명에서　범용　플라스틱　위에　에폭시기를　가지는　폴리머를　코팅하고, 그 폴리머의 에폭시기에 PNA를 고정화시킨 모식도이다.
도　２는　본　발명에서　필름의　에폭시기　함량에　따른　최적의　ＰＮＡ를　고정화율을　구하는　실시예의　형광　이미지와　스폿　배치도이다.
도　３은　도　２의　형광　이미지　정량 분석　데이터이다.
도　４는 에폭시기를 가지는 폴리머로 코팅된 플라스틱을 다양한 습도하에 노출한 후, PNA array의 PNA/DNA 하이브리드 형성 결과를 나타낸 그래프이다.
도　５는 표적 DNA에 따른 PNA/DNA hybridization 결과를 보여주는 형광 이미지 분석 데이터와 스폿 배치도이다.
도　６는 에폭시기 함량에 따른 PNA/DNA 하이브리드 형성 결과를 보여주는 정량분석 데이터이다.
도　７는　본　발명에서　ＤＮＡ와의　하이브리드 형성을　극대화하기위한　링커에　대한　모식도와 화학구조식이다.
도　８는　본　발명에서　링커에　의한　ＤＮＡ와의　하이브리드　형성을 보여주는 실시예로 형광이미지와　스폿　배치도이다.
도　９은　도　8의　형광　이미지　정량 분석　데이터이다.
도　10은 탐침 PNA 농도에 따른 PNA/DNA 하이브리드 형성의 감도를 보여주는 정량 분석 데이터이다.
<110> LG co., Ltd. <120> PNA chip using plastic substrate coated with polymer having epoxy groups <130> PN054718 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A sequence <400> 1 ttccaccaga tgg 13 <210> 2 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W sequence (rtL180w) <400> 2 gtttctcctg gct 13 <210> 3 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M sequence (rtL180m) <400> 3 gtttctcatg gct 13 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A Target sequence <400> 4 ccatctggtg gaa 13 <210> 5 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> W Target sequence <400> 5 agccaggaga aa 12 <210> 6 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M Target sequence <400> 6 agccatgaga aa 12

Claims (14)

  1. 에폭시기를 갖는 중합체가 코팅된 플라스틱 기판위에 원하는 DNA 염기서열을 포함하는 탐침 PNA (Peptide Nucleic Acid)가 고정화된 것을 특징으로 하는 PNA 칩
  2. 제 1항에 있어서, 플라스틱 기판은 폴리메틸메타아크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리노보낸(polynorbonene), COC(Cyclic olefin Copolymer), 불소화 폴리이미드, 폴리스틸렌(PS), SBC(styrene-butadiene copolymer), ABS(acrylonitrile butadiene styrene), SAN((styrene acrylonitrile) 및 폴리 술폰으로 구성된 군에서 선택된 재질로 만들어진 투명한 플라스틱 기판인 것을 특징을 하는 PNA 칩
  3. 제 1항에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 에폭시기를 갖지 않는 아크릴레이트 모노머의 공중합체인 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
  4. 제 3항에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체는 하기 화학식1을 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 점성이 큰 아크릴레이트 모노머의 공중합체인 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
    [화학식 1]
    －［ＣＲ３Ｒ３－ＣＲ１Ｒ３－Ｘ］ｎ－
    （상기식에서,　Ｒ１은　에폭시기를　가지는　에스터이고, Ｒ３는　수소　또는　알킬기이고, Ｘ는　점성이 큰 아크릴레이트계　화합물이다）
  5. 제 4항에 있어서, 점성이 큰 아크릴레이트 모노머는 dipentaerythrithol hydroxy pentaacrylate(DPHA), 9-ethyleneglycol diacrylate(9-EGDA), Pentaerythritol tri,tetraacrylate(PETA), Polyethyleneglycol 400 diacrylate, Tripropyleneglycol diacrylate, trimethylol propane triacrylate 및 Dipentaerythritol hexacrylate로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
  6. 제 3항에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체는 하기 화학식2를 가지는 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머와 플라스틱 기질과 접착(adhesion)가능한 아크릴레이트 유도체의 공중합체인 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
    [화학식 2]
    －［ＣＲ３Ｒ３－ＣＲ１Ｒ３－ＣＲ３Ｒ３ －ＣＲ２Ｒ３］ｎ－
    （상기식에서,　Ｒ１은　에폭시기를　가지는　에스터이고, Ｒ２는 알킬에스터이고, Ｒ３는　수소　또는　알킬기이다）
  7. 제 6항에 있어서, 플라스틱 기질과 접착가능한 아크릴레이트 유도체는 메틸메타아크릴레이트(MMA), 에틸아크릴레이트, 에틸메타아크릴레이트(EMA), n-프로필아크릴레이트, n-프로필메타아크릴레이트, 아이소프로필아크릴레이트, 아이소프로필메타아크릴레이트로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
  8. 제 1항에 있어서, 에폭시기를 갖는 중합체에서 에폭시기의 함량은 20 - 30% 인 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
  9. 제 1항에 있어서, 탐침 PNA의 아민 말단에 말단에 아민 작용기를 가지며 에테르가 있거나 없는 탄소수 5-8개의 카르복실산이 링커로 추가된 것을 특징으로 하는 PNA 칩.
  10. 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머, 점성이 큰 아크릴레이트 모노머 및 광개시제를 10~90: 80~5 : 1~10의 비율로 혼합하는 단계, 상기 혼합액을 플라스틱 기판위에 코팅하는 단계, 자외선을 이용하여 경화시키는 단계, 및 탐침 PNA 프린팅 용액을 스포팅하는 단계를 포함하는 PNA 칩의 제조방법.
  11. 에폭시기를 갖는 아크릴레이트 모노머, 플라스틱 기질과 물성이 비슷한 아크릴레이트 유도체 및 라디칼 개시제를 10~99: 1~89 : 0.1~0.5의 비율로 혼합하는 단계, 상기 혼합액을 라디칼 중합시키는 단계, 상기 중합체를 용해제에 용해시킨 용액을 플라스틱 기판위에 코팅하는 단계, 및 탐침 PNA 프린팅 용액을 스포팅하는 단계를 포함하는 PNA 칩의 제조방법.
  12. 제 10항 또는 제 11항에 있어서, 탐침 PNA 프린팅 용액에 0.01~1.0M농도의 염기 베이스를 첨가하여 고정화를 돕는 것을 특징으로 하는 PNA 칩의 제조방법.
  13. 제 11항에 있어서, 스포팅하기 전에 중합체가 코팅된 플라스틱 기판을 30%이상의 습도가 유지되는 곳에 4시간 이상 보관하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 PNA 칩의 제조방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 PNA 칩에 표적 DNA를 포함한 반응 시료를 적용하는 단계, 탐침 PNA와 표적 DNA를 혼성화(Hybridization) 반응시키는 단계, 비특이적 반응을 제거하기 위해 세척하는 단계, 및 PNA/DNA 하이브리드 형성에 의한 형광 시그널을 검출하는 단계를 포함하는 SNP(Single Nucleotide Polymorphism) 검출방법.
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