KR20070104575A - 표적 유전자의 발현을 억제하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 등을 제공하는 것을 목적으로 하며, 리드 입자와 표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함한 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되고, 그 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해될 수 있고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는, RNA-캡슐화 리포솜을 함유하는 조성물 등을 제공한다.

Description

표적 유전자의 발현을 억제하는 조성물 {COMPOSITION FOR INHIBITING EXPRESSION OF TARGET GENE}

본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 등에 관한 것이다.

표적 유전자의 발현을 억제하는 방법으로서 예를 들어 RNA 간섭 (이하, RNAi라고 부른다) 을 이용한 방법 등이 알려져 있고, 구체적으로는, 표적 유전자의 서열과 동일한 서열을 갖는 2중 사슬 RNA 를 선충 내에 도입하는 경우, 그 표적 유전자의 발현이 특이적으로 억제되는 현상이 보고되고 있다 ["Nature", 1998년, 제391권, 제6669호, p.806-811 참조]. 또, 긴 2중 사슬 RNA 대신에, 21 내지 23 개의 뉴클레오티드 길이의 2중 사슬 RNA 를 초파리 내에 도입함으로써도, 표적 유전자의 발현이 억제되는 것이 발견되었다. 이것은 짧은 간섭 (short interfering) RNA (siRNA) 로 명명된다 (국제공개공보 제 01/75164 호 참조).

포유류 세포에서는, 긴 2중 사슬 RNA 를 도입했을 경우, 바이러스 방어 메카니즘의 작용의 결과로 세포자멸사가 일어나므로, 특정의 유전자의 발현을 억제할 수가 없었다. 하지만, 20 내지 29 개의 뉴클레오티드 길이의 siRNA 가 사용되는 경우, 이러한 반응이 일어나지 않고, 특정의 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것이 발견되었다. 그 중에서도 21 내지 25 개의 뉴클레오티드의 siRNA 가 발현 억제 효과가 높다 ["Nature", 2001년, 제411권, 제6836호, p.494-498; "Nature Reviews Genetics", 2002년, 제3권, 제10호, p.737-747; "Molecular Cell", (USA), 2002년, 제10권, 제3호, p.549-561; "Nature Biotechnology", (USA), 2002년, 제20권, 제5호, p.497-500]. 또, 2중 사슬 RNA 뿐 아니라, 분자내 혼성화에 의해, 헤어핀 구조를 갖는 단일 사슬 RNA 도, siRNA 와 마찬가지로 RNAi 를 나타내는 것이 보고되고 있다 ["Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America", 2002년, 제99권, 제9호, p.6047-6052 참조].

RNAi 에 대해서는, 생체내 시험에 있어서도 많이 검증되어 있다. 50 bp 이하의 길이의 siRNA 를 이용한 태아의 동물에서의 RNAi 의 효과 (특허 문헌 1 참조) 및 성체 마우스에서의 그의 효과 (특허 문헌 2 참조) 가 보고되고 있다. 또, siRNA 를 마우스 태아에게 정맥내 투여한 경우에, 신장, 비장, 폐, 췌장 및 간의 각 장기에서 특정의 유전자의 발현 억제 효과가 확인되고 있다 (비특허 문헌 1 참조). 게다가 뇌세포에 siRNA 를 직접 투여함으로써 또한 특정의 유전자가 발현이 억제되는 것이 보고되고 있다 (비특허 문헌 2 참조).

특허 문헌 1, 비특허 문헌 1 및 2 에서는, 국소 투여나, 하이드로다이나믹 (hydrodynamic) 법으로 불리는, 대량의 siRNA 용액을 일시에 주입하는 방법을 사용하는 전신 투여에 의해 siRNA 의 생체내 투여를 수행하고 있다. siRNA 는 혈액내에서는 불안정하고, 혈액내에서의 분해를 피하기 위해 이러한 투여 방법이 선택된다. 그러나, 국소 투여에서는, 오직 투여한 근방 밖에 siRNA 를 전달할 수 없으므로, 일반적으로 발현의 억제 효율은 매우 낮다. 반면, 하이드로다이나믹 법에서는, 일반적으로 표적 조직은 간으로 한정된다.

즉, 표적 유전자의 발현을 억제하는 목적에 있어서, 전신 투여에 의해 그 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNA 를 표적 조직에 효율적으로 전달하는 방법의 개발이 요구되고 있다.

반면, 핵산의 세포내에의 전달 수단으로서 양이온성 리포솜이나 양이온성 중합체를 이용하는 방법이 알려져 있다. 그러나, 상기 방법에서는, 핵산을 함유하는 양이온성 리포솜이나 양이온성 중합체를 정맥내에 투여 후, 핵산이 혈액으로부터 신속하게 제거되어 버려, 표적 조직이 간이나 폐 이외의 경우, 예를 들어 종양 부위 등인 경우에는 핵산을 표적 조직에 전달하지 못하므로, 충분한 작용의 발현을 가능하게 하기에 이르지 않았다. 따라서, 핵산이 혈액으로부터 신속하게 제거되는 문제점을 해결한 핵산-캡슐화 리포솜 (리포솜내에 핵산을 캡슐화한 리포솜) 이 보고되고 있다 (특허 문헌 3 내지 5 및 비특허 문헌 3 참조). 특허 문헌 3 에서는, 핵산 등을 포함하는 리포솜의 제조 방법으로서 예를 들어, 양이온성 지질을 클로로포름에 미리 용해하고, 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN) 의 수용액과 메탄올을 첨가하고 혼합 후, 혼합물을 원심분리함으로써 클로로포름 층에 양이온성 지질 및 ODN 의 복합체를 이동시킨 다음, 클로로포름 층을 꺼내, 이것에 폴리에틸렌 글리콜화 인지질과 중성 지질과 물을 첨가하여 유중수형 (W/O) 에멀젼을 형성하고, 역상 증발법으로 에멀젼을 처리하여 ODN-캡슐화 리포솜을 제조하는 방법이 보고되어 있다. 특허 문헌 4 및 비특허 문헌 3 에서는, ODN 를 pH 3.8 의 시트르산 수용액에 용해하고, 용액에 지질 (에탄올 중) 을 첨가하여 에탄올 농도를 20 v/v% 까지 감소시켜 ODN-캡슐화 리포솜을 제조하고, 크기순 정립을 위해 여과를 수행하고, 투석에 의해 과잉의 에탄올을 제거한 후, 시료를 pH 7.5 에서 추가 투석해 리포솜 표면에 부착한 ODN 를 제거하여 ODN-캡슐화 리포솜을 제조하는 방법이 보고되어 있다. 각 방법에서, 핵산과 같은 활성 성분을 캡슐화한 리포솜이 제조된다.

한편, 특허 문헌 5 에서는, 액체 중에서 미립자를 지질 막으로 피복하는 방법으로 핵산과 같은 활성 성분을 캡슐화한 리포솜을 제조하는 것이 보고되고 있다. 상기 방법에서는, 미립자가 분산되고, 지질이 용해된 극성 유기용매 함유 수용액 중의 극성 유기용매의 비율을 감소시켜 미립자를 지질 막으로 피복한다. 피복은 액체 중에서 수행되고, 예를 들어 정맥주사용 미립자등에 적합한 크기의 지질 막으로 피복된 미립자 (피복 미립자) 가 뛰어난 효율로 제조된다. 또한, 특허 문헌 5 에서는 미립자의 예로서, 예를 들어 수용성 약물과 양이온 지질로 구성되고, 정전기적 상호작용에 의해 형성되는 복합체가 예시되고 있다. 복합체 입자를 피복하여 수득된 피복 미립자의 입자 직경은 피복되는 복합체 입자에 따라 상이하지만, ODN-지질 복합체를 피복하여 수득된 피복 미립자는 입자 직경이 작고, 주사제로서만 사용할 수 있고, 상기 피복 미립자는 정맥 내에 투여했을 경우, 높은 혈중 체류성을 나타내고, 종양 조직에 많이 집적된다는 것이 보고되고 있다.

[특허 문헌 1] 국제공개공보 제 02/132788 호

[특허 문헌 2] 국제공개공보 제 03/10180 호

[특허 문헌 3] 일본 특허공표공보 2002-508765 호

[특허 문헌 4] 일본 특허공표공보 2002-501511 호

[특허 문헌 5] 국제공개공보 제 02/28367 호

[비특허 문헌 1] "Nature Genetics", 2002년, 제32권, 제1호, p.107-108

[비특허 문헌 2] "Nature Biotechnology", 2002년, 제20권, 제10호, p.1006-1010

[비특허 문헌 3] "Biochimica et Biophysica Acta", 2001년, 제1510권, p.152-166

발명의 개시

발명이 해결하고자 하는 과제

본 발명의 목적은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 조성물 등을 제공하는 것이다.

(1) RNA 가 표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 리포솜이 표적 유전자의 발현 부위를 포함한 조직 또는 장기에 도달할 수 있는, RNA-캡슐화 리포솜을 함유하는 조성물.

(2) 상기 (1) 에 있어서, 리포솜이 정맥내 투여 가능한 크기의 리포솜인 조성물.

(3) 상기 (1) 또는 (2) 에 있어서, RNA 가 RNA 간섭 (RNAi) 을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA 인 조성물.

(4) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자가 종양이나 염 증에 관련된 유전자인 조성물.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자가 혈관신생에 관련된 유전자인 조성물.

(6) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, mRNA 가 KLF5 mRNA 인 조성물.

(7) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, mRNA 가 인간 또는 마우스 KLF5 mRNA 인 조성물.

(8) 상기 (6) 또는 (7) 에 있어서, RNA 가 KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 동일 또는 상이한 1 내지 6 개의 뉴클레오티드가 동일 또는 상이한 방식으로 부가된 2중 사슬 RNA 인 조성물.

(9) 상기 (6) 또는 (7) 에 있어서, RNA 가 KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 갖는 RNA 가 그 서열과 상보적인 서열을 갖는 RNA 에 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결되어, 그의 3' 말단에 동일 또는 상이한 1 내지 6 개의 뉴클레오티드가 부가된, 헤어핀 구조를 갖는 RNA 인 조성물.

(10) 상기 (6) 또는 (7) 에 있어서, RNA 가 하기 (a) 내지 (c) 로 이루어진 군에서 선택되는 RNA 인 조성물:

(a) 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 우리딜산 및 데옥시티미딜산과 관련된 동일 또는 상이한 2 내지 4 원이 동일 또는 상이한 방식으로 부가된 2중 사슬 RNA;

(b) 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나에서 제시되는 서열을 갖는 RNA 가 그 서열과 상보적인 서열을 갖는 RNA 에 2 개의 우리딜산 또는 데옥시티미딜산을 그의 5' 말단에 갖는 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결되어, 그의 3' 말단에 우리딜산 및 데옥시티미딜산과 관련된 동일 또는 상이한 2 내지 4 원이 부가된, 헤어핀 구조를 갖는 RNA; 및

(c) 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 2 개의 우리딜산이 부가된 2중 사슬 RNA.

(11) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, mRNA 가 bcl2 mRNA 인 조성물.

(12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, RNA-캡슐화 리포솜이 리드 입자와 그 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되고, 그 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해될 수 있고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는 조성물.

(13) 상기 (12) 에 있어서, 극성 유기용매가 알콜인 조성물.

(14) 상기 (12) 에 있어서, 극성 유기용매가 에탄올인 조성물.

(15) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 리드 입자가 양이온성 지질을 포함한 리드 입자이며, 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 포함하는 조성물.

(16) 상기(1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, RNA-캡슐화 리포솜이 양이온성 지질을 포함한 리드 입자와 상기 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되는 리포좀이고, 그 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 포함하는 리포솜인 조성물.

(17) 상기 (15) 또는 (16) 에 있어서, 양이온성 지질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 브롬화 암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 조성물.

(18) 상기 (15) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌 글리콜 포스파티딜에탄올아민인 조성물.

(19) 상기 (15) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인 조성물.

(20) 리드 입자와 표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함한 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막을 포함하고, 그 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해될 수 있고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는, RNA-캡슐화 리포솜.

(21) 상기 (20) 에 있어서, 극성 유기용매가 알콜인 리포솜.

(22) 상기 (20) 에 있어서, 극성 유기용매가 에탄올인 리포솜.

(23) 상기 (20) 내지 (22) 중 어느 하나에 있어서, 리드 입자가 양이온성 지질을 포함한 리드 입자이며, 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 함유하는 리포솜.

(24) 양이온성 지질을 포함한 리드 입자와 표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함한 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막을 포함하고, 그 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 함유하는, RNA-캡슐화 리포솜.

(25) 상기 (23) 또는(24) 에 있어서, 양이온성 지질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 브롬화 암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 리포솜.

(26) 상기 (20) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 수용성 물질의 지질 유도 체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌 글리콜 포스파티딜에탄올아민인 리포솜.

(27) 상기 (20) 내지 (26) 중 어느 하나에 있어서, 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인 리포솜.

(28) 상기 (20) 내지 (27) 중 어느 하나에 있어서, RNA 가 RNA 간섭 (RNAi) 을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA 인 리포솜.

(29) 상기 (20) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자가 종양이나 염증에 관련된 유전자인 리포솜.

(30) 상기 (20) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, 표적 유전자가 혈관신생에 관련된 유전자인 리포솜.

(31) 상기 (20) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, mRNA 가 KLF5 mRNA 인 리포솜.

(32) 상기 (20) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, mRNA 가 인간 또는 마우스 KLF5 mRNA 인 리포솜.

(33) 상기 (31) 또는 (32) 에 있어서, RNA 가 KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 동일 또는 상이한 1 내지 6 개의 뉴클레오티드가 동일 또는 상이한 방식으로 부가된 2중 사슬 RNA 인 리포솜.

(34) 상기 (31) 또는 (32) 에 있어서, RNA 가 KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 갖는 RNA 가 그 서열과 상보적인 서열을 갖 는 RNA 에 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결되어, 그의 3' 말단에 동일 또는 상이한 1 내지 6 개의 뉴클레오티드가 부가된, 헤어핀 구조를 갖는 RNA 인 리포솜.

(35) 상기 (31) 또는 (32) 에 있어서, RNA 가 하기 (a) 내지 (c) 로 이루어진 군에서 선택되는 RNA 인 리포솜:

(a) 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 우리딜산 및 데옥시티미딜산과 관련된 동일 또는 상이한 2 내지 4 원이 동일 또는 상이한 방식으로 부가된 2중 사슬 RNA;

(b) 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나에서 제시되는 서열을 갖는 RNA 가 그 서열과 상보적인 서열을 갖는 RNA 에 2 개의 우리딜산 또는 데옥시티미딜산을 그의 5' 말단에 갖는 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결되어, 그의 3' 말단에 우리딜산 및 데옥시티미딜산과 관련된 동일 또는 상이한 2 내지 4 원이 부가된, 헤어핀 구조를 갖는 RNA; 및

(c) 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 2 개의 우리딜산이 부가된 2중 사슬 RNA.

(36) 상기 (20) 내지 (28) 중 어느 하나에 있어서, mRNA 가 bcl2 mRNA 인 리포솜.

(37) 상기 (20) 내지 (36) 중 어느 하나에 따른 리포솜을 포함하는 조성물.

발명의 효과

표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함한 RNA 를 캡슐화하는 리포솜을 포함하는 본 발명의 조성물을 포유류 등에 투여함으로써, 그 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

도 1 은 마우스에 이식된 종양의 시간 경과에 따른 증식을 나타낸다. 횡축은 시간 (시간), 세로축은 종양의 크기 (mm³) 를 나타낸다. ● 는 무처리군, ○ 은 실시예 1 에서 수득된 제제의 투여군을 나타낸다.

도 2 는 암을 갖고 있는 마우스의 꼬리 정맥으로부터, 50 μg 의 siRNA 를 포함한 제제 (실시예 1；도 중 ○, 비교예 1；도 중 ●), 50 μg 의 siRNA 를 포함한 siRNA 용액 (비교예 2；도 중 □, 비교예 3；도 중 ■) 또는 생리 식염수 (도 중 △) 를 투여했을 때의 종양 증식 곡선을 나타낸다.

도 3 은 종양 조직 절편에서 관찰된 CD31 양성 구조의 수를 세어 수득된 결과를 나타낸다. Saline 는 생리적 식염수를, Sc-saline 는 비교예 3 을, sc-WL 는 비교예 1 을, KLF5-saline 는 비교예 2 를, KLF5-WL 는 실시예 1 을 각각 투여한 마우스의 종양에서의 CD31 양성 구조의 수를 나타낸다.

도 4 는 종양으로부터 추출한 mRNA 의 정량적 PCR 의 분석 결과를 나타낸다. Saline 는 생리적 식염수를, Sc-saline 는 비교예 3 을, sc-WL 는 비교예 1 을, KLF5-saline 는 비교예 2 를, KLF5-WL 는 실시예 1 을 각각 나타낸다.

도 5 는 종양으로부터 추출한 KLF5 의 정량 측정 결과를 나타낸다. Saline 는 생리적 식염수를, Sc-saline 는 비교예 3 을, sc-WL 는 비교예 1 을, KLF5-saline 는 비교예 2 를, KLF5-WL 는 실시예 1 을 각각 나타낸다.

도 6 은 종양 근방에 직접 siRNA 를 투여했을 때의 종양 증식 곡선을 나타낸다. △ 는 생리적 식염수 투여를, □ 은 뒤섞인-siRNA 투여를, ○ 은 KLF5-siRNA 투여를 각각 나타낸다.

도 7 은 마우스에 이식된 DU145 종양의 증식의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다. 횡축은 시간 (일), 세로축은 종양의 크기 (mm³) 를 나타낸다. ● 는 무처리군, ○ 은 실시예 3 에서 수득된 제제의 투여군을 나타낸다.

도 8 은 마우스에 이식된 PC-3 종양의 증식의 시간 경과에 따른 변화를 나타낸다. 횡축은 시간 (일), 세로축은 종양의 크기 (mm³) 를 나타낸다. ● 는 무처리군, ○ 은 실시예 3, □ 은 비교예 4, ■ 는 비교예 5 (naked) 에서 수득된 제제의 투여군을 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 있어서의 표적 유전자는, 포유류에서 mRNA 를 생성 및 발현하는 유전자면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 크루펠-유사 인자 (Kruppel-like factor, 이하 KLF 로 약기한다) 유전자가 포함되고, 바람직하게는 KLF5 유전자가 포함된다. KLF 패밀리는, C 말단의 징크 핑거 (zinc finger) 모티프를 갖는 것 을 특징으로 하는 전사 인자의 패밀리이며, 이의 예로는 KLF1, KLF2, KLF3, KLF4, KLF5, KLF6, KLF7, KLF8, KLF9, KLF10, KLF11, KLF12, KLF13, KLF14, KLF15, KLF16 등이 포함되는 것으로 알려져 있다. 포유류에 있어서, KLF 패밀리는 여러가지 조직이나 세포, 예를 들어 적혈구, 혈관 내피 세포, 평활근, 피부 및 임파구 등의 분화, 또한 암, 심혈관질환, 간경변, 신장 질환 및 면역 질환 등의 각종 질환의 병태 형성에 중요한 역할을 하는 것이 보고되고 있다 [The Journal of Biological Chemistry, 2001년, 제276권, 제37호, p.34355-34358; Genome Biology, 2003년, 제4권, 제2호, p.206].

KLF 패밀리 원 중에서 KLF5 는, BTEB2 (basic transcriptional element binding protein 2) 또는 IKLF (intestinal-enriched Kruppel-like factor) 라고도 불린다. 혈관 평활근에 있어서의 KLF5 의 발현은 발생 단계에서 제어를 받는다. KLF5 는 태아의 혈관 평활근에서는 높게 발현되는 반면, 정상적인 성인의 혈관 평활근에서는 발현을 볼 수 없다. 또, 발룬 카테터 (balloon catheter) 에 의한 삭박 후에 재생된 혈관내막의 평활근에서는 KLF5 가 높게 발현된다. 또한 동맥 경화나 재협착으로 인한 병변부의 평활근에서도 KLF5 가 발현된다 [Circulation, 2000년, 제102권, 제20호, p.2528-2534]. 또, 표적 유전자로서 예를 들어, B-CELL CLL/LYMPHOMA (이하 bcl 로 약기한다) 유전자가 포함되고, 바람직하게는 bcl2 유전자가 포함된다.

본 발명에 있어서의 RNA 로서는, 상기 표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의, 바람직하게는 17 내지 25 개의, 더욱 바람직하게는 19 내지 23 개의 연속 뉴클 레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함하는 RNA 가 포함되고, 핵산의 구조중의 인산 부분, 에스테르 부분 등에 포함되는 산소 원자 등이, 예를 들어 황 원자 등의 다른 원자로 치환된 유도체를 포함한다. 또, 본 발명에 있어서의 RNA 의 바람직한 예에는 RNA 간섭 (RNAi) 을 이용한 그 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA 가 포함된다. 여기에서는 KLF5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNA 를 예를 들어, RNA 간섭 (RNAi) 을 이용한 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNA 에 대해 설명할 것이다. 다른 유전자도 또한 유사한 구조를 갖고, 유사한 절차에 의해 수득될 수 있다.

KLF5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNA 는, KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의, 바람직하게는 17 내지 25 개의, 더욱 바람직하게는 19 내지 23 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 (이하 서열 X 로 부른다) 및 그 서열과 상보적인 서열 (이하, 상보 서열 X＇로 부른다) 을 포함한다. 이러한 RNA 의 예에는: (A) 서열 X 의 사슬 (센스 사슬) 및 상보 서열 X＇의 사슬 (안티센스 사슬) 을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 1 내지 6 개, 바람직하게는 2 내지 4 개의 뉴클레오티드가 동일 또는 상이한 방식으로 부가된 2중 사슬 RNA (이하, 이러한 구조의 RNA 를 siRNA 라고 부른다) 로서, KLF5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 2중 사슬 RNA; 및 (B) 서열 X 를 갖는 RNA 가 상보 서열 X＇를 갖는 RNA 에, 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결되어, 그의 3' 말단에 1 내지 6 개, 바람직하게는 2 내지 4 개의 뉴클레오티드가 부가된, 헤어핀 구조를 갖는 RNA (이하, 이러한 RNA 를 shRNA 라고 부른다) 등이 포함된다. 이러한 RNA 에 부가된 뉴클레오티 드의 염기는 동일 또는 상이할 수 있고, 구아닌, 아데닌, 시토신, 티민 및 우라실로부터 독립적으로 선택되고, RNA 또는 DNA 를 뉴클레오티드로서 사용할 수 있지만, 우리딜산 (U) 및 데옥시티미딜산 (dT) 으로부터 선택되는 1 종 또는 2 종이 바람직하다. 스페이서 올리고뉴클레오티드로서는 6 내지 12 개의 뉴클레오티드로 이루어진 RNA 가 바람직하다. 그의 5' 말단에서의 서열로서는 2 개의 뉴클레오티드, UU 인 것이 바람직하다. 스페이서 올리고뉴클레오티드의 예로서 UUCAAGAGA 의 서열로 이루어지는 RNA 가 포함된다. 스페이서 올리고뉴클레오티드에 의해 서로 연결되는 2 개의 RNA 부분 중 어느 쪽이나 5' 말단 측면 상의 RNA 로서 적합할 수 있다. 서열 X 는 KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의, 바람직하게는 17 내지 25 개의, 더욱 바람직하게는 19 내지 23 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열이면 임의의 서열일 수 있으나, 하기 (I) 에 기재의 방법으로 설계한 19 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열이 가장 바람직하다.

상기의 구조의 RNA 는, 서열 X 에 따라 KLF5 유전자의 발현의 억제의 강도가 다르며, 억제가 종종 약하다. 그러므로, 서열 X 로서 복수의 서열을 설계하고 (I), 각각의 서열 X 를 기초로 한 RNA 를 제작하고 (II), RNA 를 KLF5 유전자가 발현되는 세포에 도입해 KLF5 유전자의 발현을 측정하고 (III), KLF5 유전자의 발현을 보다 강하게 억제하는 RNA 를 선택하여, 본 발명의 RNA 를 수득할 수 있다.

(I) 서열 X 의 설계

유전자의 발현을 억제하고 싶은 동물의 KLF5 cDNA 의 뉴클레오티드 서열로부터, AA 로 시작되는 21 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열 부분을 발췌한다. 발췌된 서열의 GC 함량을 계산해, GC 함량이 20 내지 80%, 바람직하게는 30% 내지 70%, 더욱 바람직하게는 40 내지 60% 인 서열을 복수 개 선택한다.

이러한 서열은, 바람직하게는, 개시 코돈으로부터 75 개의 뉴클레오티드 이상 하류에 위치한 코드 영역 내의 서열이다. KLF5 cDNA 의 뉴클레오티드 서열과 관련된 정보는, GenBank 등의 뉴클레오티드 서열 데이타베이스로부터 얻을 수 있다. 서열 정보와 관련해 예를 들어, 마우스 KLF5 cDNA 의 서열은 GenBank 등록 번호 NM_009769 (서열번호 41), 및 인간 KLF5 cDNA 의 서열은 GenBank 등록 번호 AF287272 (서열번호 42) 로 부터 얻을 수 있다.

선택된 서열로부터 5' 말단의 AA 를 제외한 다음, 서열 중의 T 를 U 로 치환한다. 그렇게 수득된 19 개의 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 서열 X 로 정의한다.

(II) RNA 의 제작

상기 (I) 에서 선택된 서열 X 를 바탕으로, 이하와 같이 RNA (siRNA, shRNA 등) 를 제작할 수 있다. 이하에는 부가된 올리고뉴클레오티드로서 U 또는 dT 의 1 또는 2 종의 총 2 개의 경우가 기재될 것이다. 그러나, 다른 뉴클레오티드가 사용된 경우에서도 또한 RNA 를 제작할 수 있다.

(i) siRNA 의 경우

서열 X 의 3' 말단에 U 또는 dT 의 1 또는 2 종의 총 2 개가 부가되어 수득된 서열을 갖는 RNA, 및 상보 서열 X＇의 3' 말단에 U 또는 dT 의 1 또는 2 종의 총 2 개가 부가되어 수득된 서열을 갖는 RNA 를 제작한다. 이러한 2 개의 RNA 부분은, 화학 합성 또는 시험관내 전사에 의해 제작할 수 있다. 화학 합성은, DNA 합성기를 이용해 실시할 수 있다. 그렇지 않으면 Ambion, Japan Bio Services Co., Ltd., 또는 QIAGEN 등의 일부 제작업체에 화학 합성을 의뢰할 수도 있다. 그렇게 화학적으로 합성된 서로 상보적인 서열을 포함한 2 개의 RNA 부분을 어닐링 (annealing) 함으로써, 서열 X 의 사슬 및 상보 서열 X＇의 사슬로 이루어지는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 U 및 dT 로부터 선택되는 동일 또는 상이한 1 종 또는 2 종이 부가된 2중 사슬 RNA 를 제작할 수 있다. 어닐링은 2 개의 RNA 부분을 적당한 완충제에서 90 내지 95℃ 에 1 내지 5 분간 가열 후, 45 내지 60 분간 걸쳐 실온으로 냉각함으로써 실시할 수 있다.

RNA 는 시험관내 전사에 의해 이하와 같이 제작할 수 있다. 우선, T7 RNA 폴리머라아제의 프로모터 서열을 갖는 DNA (T7 프라이머); 상보 서열 X＇의 U 가 T 로 치환되고, 그 5' 말단에는 AA 를 부가하고, 3' 말단에는 T7 프라이머의 3' 말단 8 개의 뉴클레오티드와 상보적인 서열이 추가로 부가된 서열을 갖는 DNA (DNA1); 및 서열 X 의 U 가 T 로 치환되고, 그 5' 말단에는 AA 를 부가하고, 3' 말단에는 T7 프라이머의 3' 말단 8 개의 뉴클레오티드와 상보적인 서열이 추가로 부가된 서열을 갖는 DNA (DNA2) 부분을 각각 제작한다.

T7 프라이머와 DNA1 를 어닐링시킨 후, DNA 폴리머라아제 반응에 의해 2중 사슬 DNA 로 전환시킨다. 수득된 2중 사슬 DNA 를 주형으로서 사용하여 T7 RNA 폴리머라아제를 이용한 시험관내 전사 반응을 실시하여, 서열 X 의 3' 말단에 UU 를 부가하고, 5' 말단에는 리더 서열을 부가하여 수득된 서열을 갖는 RNA 를 합성 할 수 있다. 마찬가지로 T7 프라이머와 DNA2 를 이용해 상기 언급된 동일한 반응을 실시하여, 상보 서열 X＇의 3' 말단에 UU 를 부가하고, 5' 말단에는 리더 서열을 부가하여 수득된 서열을 갖는 RNA 를 합성할 수 있다.

2 개 반응 용액을 혼합해, 그러한 시험관내 전사 반응을 추가로 계속하는 것으로 서로 상보적인 서열을 갖는 2 개의 RNA 부분을 어닐링시킨다. 그 후, 데옥시리보뉴클레아제 및 단일 사슬 RNA 특이적인 리보뉴클레아제에 의해, 주형으로서 사용된 2중 사슬 DNA 및 각 RNA 사슬의 5' 말단의 리더 서열을 소화시킨 다음 제거한다. 각 RNA 사슬의 3' 말단의 UU 는 소화되지 않고 남는다.

상기 언급된 반응은 Silencer·siRNA 제작 키트 (Ambion) 등의 키트를 이용해 실시할 수 있다. T7 프라이머로 어닐링시키는 DNA 는, DNA 합성기를 사용하여 화학 합성할 수 있다. 또 Ambion, Japan Bio Services Co., Ltd., Hokkaido System Science Co., Ltd., 또는 QIAGEN 등의 일부 제조업체에 화학 합성을 의뢰할 수도 있다.

(ii) shRNA 의 경우

서열 X 를 갖는 RNA 를 상보 서열 X＇를 갖는 RNA 에 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결하여, 그의 3' 말단에 1 내지 6 개, 바람직하게는 2 내지 4 개의 뉴클레오티드가 부가된, 헤어핀 구조를 형성하는 RNA 를 DNA 합성기를 이용한 화학 합성에 의해 제작할 수 있다.

(III) KLF5 유전자의 발현 억제

KLF5 유전자를 발현하는 세포주에 상기 (II) 에서 제작된 siRNA 또는 shRNA 를 트랜스펙션한다. 세포주로서는, 상기 (I) 에 기재된 서열 X 의 설계의 기초로서 사용된 KLF5 cDNA 와 동일한 동물종의 세포를 사용한다. KLF5 유전자를 발현하는 세포주의 예에는, 평활근, 섬유아세포 또는 혈관 내피 세포로부터 유래하는 세포주, 예를 들어 마우스 태아 섬유아세포주 C3H/10 T1/2 (ATCC 번호: CCL-226), 또는 인간 탯줄 혈관 내피 세포 등이 포함될 수 있다. RNA 의 트랜스펙션은 동물세포에의 트랜스펙션용 시약, 예를 들어 Polyfect Transfection Reagent (QIAGEN), TransMessenger Transfection Reagent, Oligofectamine Reagent (Invitrogen), 또는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 등을 이용해 실시할 수 있다. 이들 시약을 RNA 와 혼합해 복합체를 형성시킨 후, 복합체를 세포에 첨가한다.

RNA 로 트랜스펙션된 세포에 있어서의 KLF5 유전자의 발현은 RT-PCR 에 의해 분석할 수 있다. RNA 로 트랜스펙션된 세포 및 트랜스펙션되지 않았던 세포로부터 총 RNA 를 제작한다. 그 후, 이 RNA 로부터 cDNA 를 합성한다. 합성된 cDNA 를 주형으로 사용해, KLF5 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR 를 실시한다. KLF5 cDNA 로부터 유래되는 증폭 산물의 양을 아가로오스 겔 전기영동에 의해 정량함으로써, KLF5 유전자의 발현량을 측정한다. RNA 로 트랜스펙션되지 않았던 세포의 KLF5 유전자의 발현량과 비교해, KLF5 유전자의 발현량이 감소한 세포에 트랜스펙션된 RNA 를 KLF5 유전자의 발현량을 억제할 수 있는 RNA 로서 선택한다.

그렇게 선택된 KLF5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNA 로서는, 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬로 이루어지는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 2 개의 우리딜산이 부가된 2중 사슬 RNA 이다. 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬로 이루어지는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 2 개의 우리딜산이 부가된 2중 사슬 RNA 는, 마우스 cDNA 의 서열에 기초하여 설계된 것이고, 마우스 KLF5 유전자의 발현을 억제한다. 상기 서열 중, 서열번호 4, 8 및 10 에서 제시되는 서열은 각각 마우스 KLF5 mRNA 와 인간 KLF5 mRNA 에서 공유된다. 그러므로, 서열번호 4, 8 및 10 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬로 이루어지는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 2 개의 우리딜산이 부가된 2중 사슬 RNA 는, 마우스 KLF5 유전자 뿐만 아니라 인간 KLF5 유전자의 발현도 억제할 수 있다.

상기 (I) 에서 기재된 서열 X 의 설계의 기초로서 사용된 특정 동물종 "A" 의 KLF5 cDNA 는 상동성에 기초하여, 상이한 동물종 "B" 의 KLF5 cDNA 와 정렬시켜, 동물종 "A" 로 선택된 서열 X 와 대응하는 동물종 "B" 의 서열 Y 를 수득할 수 있다. 상기의 방법으로, 동물종 "A" 의 KLF5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNA 가 수득되는 경우, RNA 의 서열 X 및 그 상보 서열 X＇의 영역을 각각 서열 Y 와 그 상보 서열 Y＇에 치환하여 수득된 RNA 는, 동물종 "B" 의 KLF5 유전자를 억제할 수 있는 것으로 생각된다.

예를 들어, 마우스 KLF5 cDNA의 서열에 기초하는 서열번호 2, 3, 7, 9 및 11 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬로 이루어지는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 2 개의 우리딜산이 부가된 2중 사슬 RNA 는, 마우스 KLF5 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 따라서, 인간 KLF5 cDNA 에 있어서 대응하는 서열인 서열번호 12 내지 16 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬로 이루어지는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 2 개의 우리딜산이 부가된 2중 사슬 RNA 는, 인간 KLF5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 것으로 생각된다.

본 발명의 조성물에 있어서의 리포솜 (이하 리포솜 A 라고 부른다) 으로서는, 표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함한 RNA 를 캡슐화하고, 그 리포솜이 표적 유전자의 발현 부위를 포함한 조직 또는 장기에 도달할 수 있는 리포솜이면 특별히 한정되지 않는다. 이의 예에는, 예를 들어 리드 입자와 상기 RNA 를 구성성분으로서 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 캡슐화하는 지질 막으로 구성된 리포솜 등이 포함되고, 바람직하게는 리드 입자와 그 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되는 리포좀으로, 그 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해될 수 있고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는, 리포솜이 포함된다. 또, 리포솜 A 로서는, 바람직하게는 양이온성 지질을 포함한 리드 입자와 상기 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되고, 그 지질 막이 중성 지 질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 포함하는 리포솜이 포함되고, 바람직하게는 리드 입자와 그 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되고, 그 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 함유하는 리포솜이 포함되고, 또한 그 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해될 수 있고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는, 리포솜이 포함된다.

본 발명에 있어서의 리드 입자란 예를 들어, 지질 집합체, 리포솜, 에멀젼 입자, 중합체, 금속 콜로이드, 미립자 제제 등을 구성 성분으로 포함하는 미립자이다. 바람직하게는 리포솜을 구성 성분으로 포함하는 미립자가 포함된다. 본 발명에 있어서의 리드 입자는 지질 집합체, 리포솜, 에멀젼 입자, 중합체, 금속 콜로이드, 미립자 제제 등으로부터 선택되는 2개 이상을 조합하여 수득된 복합체를 구성 성분으로 함유할 수 있고, 지질 집합체, 리포솜, 에멀젼 입자, 중합체, 금속 콜로이드, 미립자 제제 등과 다른 화합물 (예를 들어 당, 지질, 무기 화합물 등) 을 조합하여 수득된 복합체를 구성 성분으로 함유할 수 있다.

리드 입자의 구성 성분으로서의 지질 집합체 또는 리포솜 (이하 리포솜 B 라고 부른다) 은 예를 들어 지질 및/또는 계면활성제 등으로 구성된다. 지질로서는, 단순 지질, 복합 지질 및 유도 지질 중 임의의 것일 수 있고, 예를 들어 인지질, 글리세롤 당지질, 스핑고 당지질, 스핑고이드, 스테롤 등이 포함되고, 바람직 하게는 인지질이 포함된다. 또, 지질로서는, 예를 들어 계면활성제 (하기 기재되는 계면활성제와 동의), 중합체 (하기 기재되는 중합체와 동의, 구체적으로는 덱스트란 등), 및 폴리옥시에틸렌 유도체 (구체적으로는 폴리에틸렌 글리콜 등) 등의 지질 유도체가 포함되고, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜화 인지질이 포함된다. 계면활성제로서는, 예를 들어 비이온성 계면활성제, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 쯔피터성 계면활성제등이 포함된다.

인지질로서는, 예를 들어 포스파티딜콜린 (구체적으로는 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린 (EPC), 디스테아로일 포스파티딜콜린, 디팔미토일 포스파티딜콜린, 디미리스토일 포스파티딜콜린, 디올레오일 포스파티딜콜린 등), 포스파티딜에탄올아민 (구체적으로는 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민, 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 등), 글리세롤인지질 (구체적으로는 포스파티딜세린, 포스파티드산, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 리소포스파티딜콜린 등), 스핑고인지질 (구체적으로는 스핑고미엘린, 세라마이드 포스포에탄올아민, 세라마이드 포스포글리세롤, 세라마이드 포스포글리세로포스페이트 등), 글리세로포스포노 지질, 스핑고포스포노 지질, 천연 레시틴 (구체적으로는 난황 레시틴, 대두 레시틴 등), 및 수소첨가 인지질 (구체적으로는 수소첨가 포스파티딜콜린 등) 등의 천연 및 합성 인지질이 포함된다.

글리세롤 당지질로서는, 예를 들어 술폭시리보실 글리세라이드, 디글리코실 디글리세라이드, 디갈락토실 디글리세라이드, 갈락토실 디글리세라이드, 글리코실 디글리세라이드 등이 포함된다.

스핑고 당지질로서는, 예를 들어 갈락토실 세레브로사이드, 락토실 세레브로사이드, 강글리오사이드 등이 포함된다.

스핑고이드로서는, 예를 들어 스핑간, 이코사스핑간, 스핑고신, 그들의 유도체 등이 포함된다. 유도체로서는, 예를 들어 스핑간, 이코사스핑간, 스핑고신 등의 ―NH₂ 를 ―NHCO(CH₂)_xCH₃ (식 중, x 는 0 내지 18 의 정수를 나타내고, 특히 6, 12 또는 18 이 바람직하다) 로 대체한 것 등이 포함된다.

스테롤로서는, 예를 들어 콜레스테롤, 디히드로콜레스테롤, 라노스테롤, β-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 브라시카스테롤, 에르고카스테롤, 푸코스테롤, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol) 등이 포함된다.

상기와 상이한, 지질로서는, 예를 들어, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄 (DOTAP), N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민 (DODAP), N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄 (DOTMA), 2,3-디올레일 옥시-N-[2-(스페르민카르복시아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄트리플루오로 아세테이트 (DOSPA), N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 브롬화 암모늄 (DMRIE), N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 브롬화 암모늄 (DORIE) 등이 포함된다.

비이온성 계면활성제로서는, 예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 (구체적으로는 Polysorbate 80 등), 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌글리콜 (구체적으로는 Pluronic F68 등), 소르비탄 지방산 (구체적으로는 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노올레에이트 등), 폴리옥시에틸렌 유도체 (구체적으로는 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 폴리옥시에틸렌 라우릴 알콜 등), 글리세롤 지방산 에스테르 등이 포함된다.

음이온성 계면활성제로서는, 예를 들어 아실사르코신, 나트륨 알킬술페이트, 알킬벤젠 술포네이트, 탄소수 7 내지 22 의 나트륨 지방산 등이 포함된다. 구체적으로는 나트륨 도데실 술페이트, 나트륨 라우릴 술페이트, 나트륨 콜레이트, 나트륨 데옥시콜레이트, 나트륨 타우로데옥시콜레이트 등이 포함된다.

양이온성 계면활성제로서는, 예를 들어 알킬아민 염, 아실아민 염, 제4급 암모늄 염, 아민 유도체 등이 포함된다. 구체적으로는 염화 벤잘코늄, 아실아미노에틸디에틸아민 염, N-알킬폴리알킬폴리아민 염, 폴리에틸렌 폴리아미드 지방산, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 도데실트리메틸암모늄 브로마이드, 알킬폴리옥시에틸렌아민, N-알킬아미노프로필아민, 트리에탄올아민 지방산 에스테르 등이 포함된다.

쯔피터성 계면활성제로서는, 예를 들어 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판 술포네이트, N-테트라데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판 술포네이트 등이 포함된다.

리포솜 B 에 있어서는, 이들 지질 및 계면활성제는, 단독으로 또는 조합하여 사용되고, 바람직하게는 조합하여 사용되다. 조합하여 사용하는 경우의 조합으로서는, 예를 들어 수소첨가 대두 포스파티딜콜린, 폴리에틸렌 글리콜화 인지질 및 콜레스테롤로부터 선택되는 2 성분 이상의 조합, 디스테아로일 포스파티딜콜린, 폴리에틸렌 글리콜화 인지질 및 콜레스테롤로부터 선택되는 2 성분 이상의 조합, EPC 와 DOTAP 의 조합, EPC, DOTAP 및 폴리에틸렌 글리콜화 인지질의 조합, EPC, DOTAP, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌 글리콜화 인지질의 조합 등이 예시될 수 있다.

또, 리포솜 B 는 필요에 따라, 콜레스테롤을 포함하는 스테롤과 같은 막 안정화제, 토코페롤과 같은 항산화제 등을 함유할 수 있다.

지질 집합체로서는, 예를 들어 구형 마이셀, 구형 역마이셀, 소세지형 마이셀, 소세지형 역마이셀, 판형 마이셀, 판형 역마이셀, 헥사고날 I, 헥사고날 II 및 2 이상의 지질 분자를 포함하는 회합체가 포함된다.

에멀젼 입자로서는, 예를 들어 지방 에멀젼, 비이온성 계면활성제와 콩기름 으로 구성된 에멀젼, 리피드 에멀젼, 리피드 나노스피어 등의 수중유형 (O/W) 에멀젼, 수중유중수형 (W/O/W) 에멀젼 입자 등이 포함된다.

중합체로서는, 알부민, 덱스트란, 키토산, 덱스트란 술페이트 및 DNA 등과 같은 천연 중합체, 폴리-L-리신, 폴리에틸렌이민, 폴리아스파르트산, 스티렌과 말레산의 공중합체, 이소프로필아크릴아미드와 아크릴피롤리돈의 공중합체, PEG-개질된 덴드리머, 폴리락트산, 폴리락트산 폴리글리콜산 및 폴리에틸렌 글리콜화 폴리락트산 등의 합성 중합체, 및 그들의 염 등이 포함된다.

여기서, 중합체의 염에는, 예를 들어 금속염, 암모늄 염, 산 부가 염, 유기 아민 부가 염, 아미노산 부가 염 등이 포함된다. 금속염으로서는, 예를 들어 리튬 염, 나트륨 염 및 칼륨 염 등의 알칼리 금속 염, 마그네슘 염, 칼슘 염 등의 알칼리 토금속 염, 알루미늄 염, 아연 염 등이 포함된다. 암모늄 염으로서는, 예를 들어 암모늄, 테트라메틸암모늄 등의 염이 포함된다. 산 부가 염으로서는, 예를 들어 염산 염, 황산 염, 질산 염 및 인산 염 등의 무기산 염, 및 아세트산 염, 말레산 염, 푸마르산 염 및 시트르산 염 등의 유기산 염이 포함된다. 유기 아민 부가 염으로서는, 예를 들어 모르폴린, 피페리딘 등의 부가 염이 포함된다. 아미노산 부가 염으로서는, 예를 들어 글리신, 페닐알라닌, 아스파르트산, 글루탐산, 리신 등의 부가 염이 포함된다.

금속 콜로이드로서는, 예를 들어 금, 은, 백금, 구리, 로듐, 실리카, 칼슘, 알루미늄, 철, 인듐, 카드뮴, 바륨, 납 등을 포함한 금속 콜로이드가 포함된다.

미립자 제제로서는, 예를 들어 마이크로스피어, 마이크로캡슐, 나노크리스탈, 리피드 나노입자, 중합체성 마이셀 등이 포함된다.

본 발명에 있어서의 리드 입자는, 바람직하게는 예를 들어 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 중합체로부터 선택되는 1 개 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제 등을 함유한다. 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 중합체로부터 선택되는 1 개 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제는 리드 입자의 구성 성분으로서 사용할 수 있고, 리드 입자의 구성 성분에 첨가하여 사용할 수 있다.

당, 펩티드, 핵산 및 수용성 중합체로부터 선택되는 1 개 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제로서는, 바람직하게는, 당지질, 또는 수용성 중합체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체가 포함되고, 바람직하게는, 수용성 중합체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체가 포함된다. 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 중합체로부터 선택되는 1 개 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제는, 바람직하게는 분자의 일부가 리드 입자의 다른 구성 성분과 예를 들어 소수성 친화력, 정전기적 상호작용 등으로 인해 결합하는 성질을 갖고, 다른 부분이 리드 입자의 제조시 사용되는 용매와 예를 들어 친수성 친화력, 정전기적 상호작용 등으로 인해 결합하는 성질을 갖는, 2 면성을 갖는 물질인 것이 바람직하다.

당, 펩티드 또는 핵산의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예를 들어 수크로오스, 소르비톨, 또는 락토오스 등의 당, 예를 들어 카세인 유래 펩티드, 흰자 유래 펩티드, 대두 유래 펩티드 또는 글루타티온 등의 펩티드, DNA, RNA, 플라스미드, siRNA 또는 ODN 등의 핵산과 예를 들어 상기 리드 입자의 정의에 예증된 임의의 것 또는 예를 들어 서로에 대해 결합된 스테아르산, 팔미트산, 미리스트산, 또는 라우르산 등의 지방산이 포함된다. 바람직하게는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜화 지질, 폴리글리세롤화 지질, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에테르, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 글리세롤 지방산 에스테르 등이 포함된다.

당의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예를 들어 상기 리드 입자의 정의에 예증된 글리세로당지질 및 스핑고당지질 등이 포함된다.

수용성 중합체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예를 들어 폴리에 틸렌 글리콜, 폴리글리세롤, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 올리고당, 덱스트린, 수용성 셀룰로오스, 덱스트란, 콘드로이틴 술페이트, 폴리글리세롤, 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아스파르테이트 아미드, 폴리-L-리신, 맨난, 풀루란, 올리고글리세롤 등 또는 그들의 유도체와 예를 들어 상기 언급된 리드 입자의 정의에서 예증된 임의의 지질, 또는 예를 들어 스테아르산, 팔미트산, 미리스트산 또는 라우르산 등의 지방산이 서로 결합된 것 등이 포함된다. 더욱 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 또는 폴리글리세롤 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체가 예시될 수 있고, 더욱 더 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체가 예시될 수 있다.

폴리에틸렌 글리콜 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜화 지질 [구체적으로는 폴리에틸렌 글리콜 포스파티딜 에탄올아민 (보다 구체적으로는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (PEG-DSPE) 등), 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, Cremophor EL 등], 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 지방산 에스테르 (구체적으로는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트 등), 폴리에틸렌 글리콜 지방산 에스테르 등이 포함되고, 더욱 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜화 지질이 포함된다.

폴리글리세롤 유도체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체로서는, 예를 들어 폴리글리세롤화 지질 (구체적으로는 폴리글리세롤 포스파티딜 에탄올아민 등), 폴리글리세롤 지방산 에스테르 등을 들 수 있고, 더욱 바람직하게는, 폴리글리세롤화 지질이 포함된다.

계면활성제로서는, 예를 들어 상기 언급된 리드 입자의 정의에서 예증된 계면활성제, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에테르 등이 포함되고, 바람직하게는, 폴리옥시에틸렌 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 글리콜, 글리세롤 지방산 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 에테르 등이 포함된다.

또, 바람직하게는, 리드 입자는 정전하를 가진다. 여기서 말하는 "정전하" 란 상기 RNA내의 전하, 분자 분극 등에 대해서 정전기적 인력을 일으키는 전하, 표면 분극 등을 포함한다. 리드 입자가 정전하를 가지려면 바람직하게는, 리드 입자는 양이온성 물질을 함유하고, 더욱 바람직하게는, 리드 입자는 양이온성 지질을 함유하다. 리드 입자에 함유되는 양이온성 물질은 양이온성을 나타내는 물질이지만, 양이온성의 기와 음이온성의 기의 양쪽 모두를 가지는 양쪽이온성의 물질일지라도 pH, 다른 물질과의 결합 등에 의해 상대적인 음성도가 변화하므로, 양쪽이온성 물질은 경우에 따라 양이온성 물질로 분류될 수 있다. 이들 양이온성 물질은 리드 입자의 구성 성분으로서 사용할 수 있고, 또한 리드 입자의 구성 성분에 첨가하여 사용할 수 있다.

양이온성 물질로서는, 예를 들어 상기 언급된 리드 입자의 정의에서 예증된 것들 중의 양이온성 물질 [구체적으로는, 양이온성 지질, 양이온성 계면활성제 (상기와 동의), 양이온성 중합체 등], 등전점 이하의 값의 pH 에서 복합체를 형성할 수 있는 단백질 또는 펩티드 등이 포함된다.

양이온성 지질로서는, 예를 들어 DOTAP, DOTMA, DOSPA, DMRIE, DORIE, DC-Chol등이 포함된다.

양이온성 중합체로서는, 예를 들어 폴리-L-리신, 폴리에틸렌이민, 폴리펙트, 키토산등이 포함된다.

등전점 이하의 값의 pH 에서 복합체를 형성할 수 있는 단백질 또는 펩티드는, 그 물질의 등전점 이하의 값의 pH 에서 복합체를 형성할 수 있는 단백질 또는 펩티드이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 알부민, 오로소뮤코이드, 글로불린, 피브리노겐, 펩신, 리보뉴클레아제 T1 등이 포함된다.

본 발명에 있어서의 리드 입자는 공지의 제조 방법 또는 거기에 준해 제조할 수가 있고, 임의의 제조 방법에 의해 제조된 리드 입자를 사용할 수 있다. 예를 들어, 리드 입자의 한 종류인 리포솜 B 를 구성 성분으로 포함하는 리드 입자의 제조에는 공지의 리포솜의 제조 방법을 적용할 수 있다. 공지의 리포솜의 제조 방법으로서는, 예를 들어 Bangham 등의 리포솜 제조법 ["Journal of Molecular Biology" (J. Mol. Biol.), 1965년, 제13권, p.238-252 참조], 에탄올 주입법 ["Journal of Cell Biology" (J. Cell. Biol.), 1975년, 제66권, p.621-634 참조], 프렌치 프레스 법 ["FEBS Letters" (FEBS Lett.), 1979년, 제99권, p.210-214 참조], 동결 융해법 ["Archives of Biochemistry and Biophysics" (Arch. Biochem. Biophys.), 1981년, 제212권, p.186-194 참조], 역상 증발법 ["Proceedings of the National Academy of Science United States of America" (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 1978년, 제75권, p.4194-4198 참조], pH 구배법 (예를 들어 일본 특허 제 2,572,554 호, 일본 특허 제 2,659,136 호 등 참조) 등이 포함된다. 리포솜 B 의 제조 시에 리포솜 B 를 분산시키는 용액으로서는, 예를 들어 물, 산, 알칼리, 여러 가지의 완충액, 생리 식염수, 아미노산 수액 등을 이용할 수가 있다. 또, 리포솜 B 의 제조 시에는, 예를 들어 시트르산, 아스코르브산, 시스테인 또는 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA) 등의 항산화제, 예를 들어 글리세롤, 글루코오스, 염화 나트륨 등의 등장화제 등의 첨가도 가능하다. 또, 지질 등을 예를 들어 에탄올 등의 유기용매에 용해하고 용매 증류제거한 후, 생리 식염수 등을 첨가하고 혼합물을 진탕 교반 해, 리포솜 B 를 형성시켜 리포솜을 제조할 수 있다.

또, 예를 들어 비이온성 계면활성제 (상기와 동의), 양이온성 계면활성제 (상기와 동의), 음이온성 계면활성제 (상기와 동의), 중합체, 폴리옥시에틸렌 유도체 등에 의한 리포솜 표면 개선도 임의로 실시할 수가 있고, 또한 이들의 표면 개선 리포솜도 본 발명에 있어서의 리드 입자의 구성 성분으로서 사용되다 [D.D.Lasic, F.Martin 편, "Stealth Liposome" (USA), CRC Press Inc, 1995년, p.93-102참조]. 중합체로서는, 예를 들어 덱스트란, 풀로란, 맨난, 아밀로펙틴, 히드록시에틸전분 등이 포함된다. 폴리옥시에틸렌 유도체로서는, 예를 들어 Polysorbate 80, Pluronic F68, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 폴리옥시에틸렌 라우릴 알콜, PEG-DSPE 등이 포함된다. 리포솜 표면 개선은, 리드 입자에 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 중합체로부터 선택되는 1 개 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제를 함유시키는 방법 중 하나로서 이용할 수가 있다.

리포솜 B 의 평균 입자 직경은 요구에 따라 자유롭게 선택할 수 있다. 평균 입자 직경을 조절하는 방법으로서는, 예를 들어 압출법 및 큰 다중막 리포솜 베지클 (MLV) 을 기계적으로 분쇄 (구체적으로는 만톤-카울린, 마이크로 풀루이다이저 등을 사용) 하는 방법 [R.H.Muller, S.Benita, B.Bohm 편저, "Emulsion and Nanosuspensions for the Formulation of Poorly Soluble Drugs", Germany, Scientific Publishers, Stuttgart, 1998년, p.267-294참조] 등이 포함된다.

또, 리드 입자를 구성하는 예를 들어 지질 집합체, 리포솜 B, 에멀젼 입자, 중합체, 금속 콜로이드, 미립자 제제 등으로부터 선택되는 2 개 이상의 성분을 조합하여 수득된 복합체의 제조 방법은, 예를 들어 수중에서 예를 들어 지질, 중합체 등을 단지 혼합하는 제조 방법일 수 있다. 이 때, 필요하면 과립 공정이나 무균 화공정 등을 추가로 더할 수도 있다. 또, 복합체 형성을 예를 들어 아세톤 및 에테르 등 임의의 여러 가지의 용매중에서 실시하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서의 리드 입자의 크기는 평균 입자 직경이 수 nm 내지 수십 μm 인 것이 바람직하고, 10 nm 내지 1000 nm 인 것이 더욱 바람직하고, 50 nm 내지 300 nm 인 것이 더욱 더 바람직하다.

본 발명에 있어서의 지질 막의 구성 성분으로서는, 예를 들어 상기 언급된 리드 입자의 정의에서 예증된 지질 및 계면활성제 등이 포함되고, 바람직하게는, 지질 및 계면활성제 중 중성 지질이 포함되고, 더욱 바람직하게는 인지질이 포함되고, 더욱 바람직하게는 EPC 가 포함된다. 또, 지질 막의 구성 성분은 극성 유기용매에 가용인 것이 바람직하고, 그 지질막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해될 수 있고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는 것이 바람직하다. 여기 서, 중성 지질이란, 지질 및 계면활성제 중, 리드 입자가 상기 기재된 정전하를 가지고 양이온성 물질에서 예증된 양이온 지질과 양이온성 계면활성제 및 하기 기재되는 부착 경합제에서 예증되는 준 음이온성 지질과 음이온성 계면활성제를 제외한 지질을 의미하고, 중성 지질로서 더욱 바람직하게는, 인지질, 글리세롤 당지질, 스핑고 당지질 등이 포함된다.

본 발명에 있어서의 극성 유기용매로서는, 예를 들어 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 2-프로판올, n-부탄올, 2-부탄올 및 tert-부탄올 등의 알콜, 글리세롤, 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜 등의 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등의 폴리알킬렌 글리콜 등이 포함되고, 바람직하게는 에탄올이 포함된다.

또, 지질 막에 사용되는 지질로서 예를 들어 합성 지질 등이 포함된다. 합성 지질로서는, 예를 들어 불소 첨가 포스파티딜콜린, 불소 첨가 계면활성제, 브롬화 디알킬암모늄 등이 포함된다. 이들은 단독으로 또는 다른 지질 등과 조합하여 사용할 수 있다. 또, 지질 막은, 바람직하게는 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 또는 지방족 탄화수소 유도체, 또는 상기의 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 중합체로부터 선택되는 1 개 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제를 포함하고, 상기 수용성 중합체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체를 함유하는 것이 더욱 바람직하고, 상기 폴리에틸렌 글리콜화 인지질을 함유하는 것이 더욱 더 바람직하고, 폴리에틸렌 글리콜 포스파티딜 에탄올아민을 함유하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 있어서의 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체로서는, 예를 들어 상기의 당, 단백질, 펩티드, 핵산 및 수용성 중합체로부터 선택되는 1 개 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체, 또는 당, 단백질, 펩티드, 핵산 및 수용성 중합체로부터 선택되는 1개 이상의 물질의 지방족 탄화수소 유도체가 포함되고, 바람직하게는, 당지질, 및 수용성 중합체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체가 포함되고, 더욱 바람직하게는, 수용성 중합체의 지질 유도체 또는 지방산 유도체가 포함된다.

수용성 물질의 지방족 탄화수소 유도체로서는, 수용성 물질과 예를 들어 장쇄 지방족 알콜, 폴리 옥시프로필렌 알킬, 글리세린 지방산 에스테르의 알콜성 잔기 등이 서로 결합되어 이루어지는 것이 포함된다.

당, 펩티드 또는 핵산의 지방족 탄화수소 유도체로서는, 예를 들어 수크로오스, 소르비톨 또는 락토오스 등의 당, 예를 들어 카세인 유래 펩티드, 흰자 유래 펩티드, 대두 유래 펩티드 또는 글루타티온 등의 펩티드, 예를 들어 DNA, RNA, 플라스미드, siRNA 또는 ODN 등의 핵산의 지방족 탄화수소 유도체가 포함된다.

수용성 중합체의 지방족 탄화수소 유도체로서는, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리글리세롤, 폴리에틸렌이민, 폴리비닐 알콜, 폴리아크릴산, 폴리아크릴아미드, 올리고당, 덱스트린, 수용성 셀룰로오스, 덱스트란, 콘드로이틴 술페이트, 폴리글리세롤, 키토산, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아스파르테이트 아미드, 폴리-L-리신, 맨난, 풀루란, 올리고글리세롤 등 또는 그들의 유도체의 지방족 탄화수소 유도체가 포함되고, 더욱 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜 유도체 또는 폴리글리세롤 유도체 등의 지방족 탄화수소 유도체가 포함되고, 더욱 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리 콜 유도체의 지방족 탄화수소 유도체가 포함된다.

리드 입자가 리포솜 B 를 구성 성분으로 포함하는 미립자인 경우, 리포솜 B와 상기 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되는 성분이 리포솜 A 가 되고, 그 구조로부터 협의의 리포솜으로 분류된다. 리드 입자가 리포솜 B 를 구성 성분으로 포함하는 미립자 이외 인 경우에서도, 리드 입자가 지질 막으로 피복되고 있으므로 수득 물질은 광의의 리포솜으로 분류된다. 본 발명에 있어서, 리드 입자의 구성 성분도 리포솜인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서의 리드 입자와 상기 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자는, 그 리드 입자를 제조 후 또는 그 리드 입자의 제조와 동시에, 그 RNA 를 리드 입자에 부착 또는 캡슐화해 제조할 수 있다. 또한, 그 복합체 입자의 제조 후 또는 복합체 입자의 제조와 동시에, 지질 막으로 그 복합체 입자를 피복하여 리포솜 A 를 제조할 수 있다. 리포솜 A 는, 예를 들어, 일본 특허공표공보 2002-508765 호, 일본 특허공표공보 2002-501511 호, "Biochimica et Biophysica Acta", 2001년, 제1510권, p.152-166 및 국제공개공보 제 02/28367 호 등의 공지의 제조 방법 또는 거기에 준해 제조할 수 있고, 또는 예를 들어 리드 입자에 상기 RNA 를 부착 또는 캡슐화해 복합체 입자를 제조 후, 그 복합체 입자 및 피복층 성분을 그 피복층 성분이 가용인 극성 유기용매를 포함하고, 그 복합체 입자가 용해되지 않고, 그 피복층 성분이 분산 상태로 존재하는 것이 가능한 농도의 액체 중에 분산시키는 공정 및 그 복합체 입자를 그 피복층 성분으로 피복하는 공정을 포함한 제조 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물에 있어서의 리포솜의 바람직한 제조 방법으로서는, 이하의 리드 입자와 상기 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자를 제조하는 공정 (공정 1) 및 그 복합체 입자를 지질 막으로 피복하는 공정 (공정 2 또는 공정 3) 을 포함한 제조 방법이 예시될 수 있다.

공정 1) 리드 입자와 상기 RNA 를 포함하는 복합체 입자를 제조하는 공정

리드 입자를, 예를 들어 물 등의 용매중에 분산시켜 리드 입자가 분산된 액체 중에, 상기 RNA 를 분산 또는 용해해 함유되도록 혼합해, 리드 입자에 그 RNA 를 부착시킨다. 공정 1 에 있어서, 리드 입자의 응집을 억제하기 위해서, 리드 입자는 응집 억제 물질을 함유하는 리드 입자인 것이 바람직하고, 응집 억제 물질로서 상기 당, 펩티드, 핵산 및 수용성 중합체로부터 선택되는 1 개 이상의 물질의 지질 유도체 또는 지방산 유도체 또는 계면활성제를 함유하는 리드 입자인 것이 더욱 바람직하다. 또, 리드 입자가, 정전하를 갖는 경우, 리드 입자가 분산된 액체 중에서, 그 RNA 와 부착 경합제를 공존시켜, 부착 경합제를 그 RNA 와 함께 리드 입자에 부착시킬 수 있다. 또한, 리드 입자가 응집 억제 물질을 함유하는 리드 입자인 경우에도, 리드 입자의 응집을 보다 억제시키기 위해서 부착 경합제를 사용할 수 있다. 리드 입자와 상기 RNA 의 조합으로서는, 복합체 입자가 극성 유기용매를 함유하는 액체에 분산 가능해지는 조합을 선택하는 것이 바람직하고, 극성 유기용매 중의 복합체 입자의 용해도가 공정 2 또는 3 에서 사용되는 지질 막의 구성 성분보다 낮은 것이 더욱 바람직하다. 또한, 그 극성 유기용매를 포함 한 액체 중에, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는 조합을 선택하는 것이 더욱 바람직하다.

부착 경합제로서는, 예를 들어 음이온성 물질 등이 포함되고, 그 음이온성 물질은 분자내의 전하, 분자 분극 등에 의한 정전기적 인력으로 인해, 리드 입자의 구성 성분에 정전기적으로 부착하는 물질을 포함한다. 부착 경합제로서의 음이온성 물질은, 음이온성을 나타내는 물질이지만, 음이온성의 기와 양이온성의 기의 양쪽 모두를 가지는 양쪽이온성의 물질일지라도 pH, 다른 물질과의 결합 등에 의해 상대적인 음성도가 변화하므로, 양쪽이온성 물질은 경우에 따라 음이온성 물질로 분류될 수 있다.

음이온성 물질로서는, 예를 들어 상기 언급된 리드 입자의 정의에서 예증된 것들 중의 음이온성 물질 [구체적으로는, 음이온성 지질, 음이온성 계면활성제 (상기와 동의), 음이온성 중합체 등], 등전점 이상의 값의 pH 에서 복합체를 형성할 수 있는 단백질 또는 펩티드, 핵산 등을 들 수 있다. 바람직하게는 덱스트란 술페이트, 나트륨 덱스트란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 나트륨 콘드로이틴 술페이트, 히알루론산, 콘드로이틴, 데르타만 술페이트, 헤파란 술페이트, 헤파린, 케타란 술페이트, 덱스트란 플루오레세인 음이온성 등으로부터 선택되는 1 개 이상의 물질이 포함된다.

음이온성 지질로서는, 예를 들어 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산 등이 포함된다.

음이온성 중합체로서는, 예를 들어 폴리아스파르트산, 스티렌과 말레산의 공중합체, 이소프로필아크릴아미드와 아크릴 피롤리돈의 공중합체, PEG-개질된 덴드리마, 폴리락트산, 폴리락트산 폴리글리콜산, 폴리에틸렌 글리콜화 폴리락트산, 덱스트란 술페이트, 나트륨 덱스트란 술페이트, 콘드로이틴 술페이트, 나트륨 콘드로이틴 술페이트, 히알루론산, 콘드로이틴, 데르타만 술페이트, 헤파란 술페이트, 헤파린, 케타란 술페이트, 덱스트란 플루오레세인 음이온성 등이 포함된다.

등전점 이상의 값의 pH 에서 복합체를 형성할 수 있는 단백질 또는 펩티드로서는, 그 물질의 등전점 이상의 값의 pH 에서 복합체를 형성할 수 있는 단백질 또는 펩티드이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 알부민, 오로소뮤코이드, 글로불린, 피브리노겐, 히스톤, 프로타민, 리보뉴클레아제, 리소자임 등이 포함된다.

음이온성 물질로서의 핵산으로서는, 예를 들어 DNA, RNA, 플라스미드, siRNA 또는 ODN 등을 들 수 있어 생리 활성을 나타내지 않는다면, 임의의 길이, 임의의 서열을 가질 수 있다.

부착 경합제는, 리드 입자의 구성 성분에 정전기적으로 부착하는 것이 바람직하고, 물질이 리드 입자의 구성 성분에 부착되는 경우에도 리드 입자의 구성 성분을 응집시키는 가교를 형성하지 않는 크기의 물질 또는, 분자 내에 부착하는 부분과 부착에 반발해 리드 입자의 응집을 억제하는 부분을 가지는 물질이 바람직하다.

공정 1 은, 보다 구체적으로는, 예를 들어 응집 억제 물질을 함유하는 리드 입자가 분산된 액체를 제조하는 공정 및 그 리드 입자가 분산된 액체 중에, 상기 RNA 를 분산 또는 용해해 함유시키는 공정 (예를 들어 그 리드 입자가 분산된 액체 중에, 그 RNA 를 더해 분산 또는 용해하는 공정, 그 리드 입자가 분산된 액체 중에, 그 RNA 가 분산 또는 용해된 액체를 더하는 공정 등) 을 포함한 제조 방법으로 실시할 수 있다. 여기서, 리드 입자가 분산된 액체 중에, 상기 RNA 를 분산 또는 용해해 함유시키는 공정에 의해 수득되는 복합체 입자로서는, 구체적으로는, 그 양이온성 지질을 함유하는 리포솜 B 를 구성 성분으로 포함하는 미립자에 그 RNA 가 부착해 형성되는 복합체 입자, 양이온성 지질을 함유하는 지질 집합체를 구성 성분으로 포함하는 미립자에 상기 RNA 가 부착해 형성되는 복합체 입자, 폴리-L-리신 등의 양이온성 중합체를 함유하는 중합체를 구성 성분으로 포함하는 미립자에 상기 RNA 가 부착해 형성되는 복합체 입자가 포함된다. 또, 리드 입자가 분산된 액체 중에, 상기 RNA 를 분산 또는 용해해 함유시키는 공정이, 그 RNA 가 분산 또는 용해한 액에, 부착 경합제를 추가로 혼입시켜, 이것을 그 리드 입자가 분산된 액체 중에 첨가하는 공정인 것이 바람직하다. 이 경우, 그 리드 입자에, 그 RNA 와 그 부착 경합제가 모두 부착해 복합체 입자가 제조되고, 그 복합체 입자의 제조중에 있어서의 리드 입자의 응집 및 제조 후에 있어서의 복합체 입자의 응집을 추가로 억제하여 제조할 수 있다.

리드 입자의 리드 입자가 분산된 액체에 대한 비율은, 리드 입자에 상기 RNA 를 부착할 수 있으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 1 μg/mL 내지 1 g/mL 인 것이 바람직하고, 0.1 내지 500 mg/mL 인 것이 더욱 바람직하다.

공정 2) 복합체 입자를 지질 막으로 피복하는 공정 (1)

공정 1 에서 수득된 복합체 입자가 분산되고 지질 막의 구성 성분이 용해된 극성 유기용매를 포함한 액체 (액체 A) 를 제조하는 공정, 그 다음에, 액체 A 중의 극성 유기용매의 비율을 감소시켜, 복합체 입자를 지질 막으로 피복하는 공정을 포함한 제조 방법에 따라 리포솜 A 를 제조할 수 있다. 이 경우, 리포솜 A 는 분산액 (액체 B) 의 형태로 수득된다. 액체 A 에 있어서의 용매는, 그 지질 막의 구성 성분이 가용이고, 그 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 그 극성 유기용매를 포함한 용매이다. 액체 A 중의 극성 유기용매의 비율을 감소시킨 액체 B 에서는, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 그 복합체 입자도 분산 가능하다. 액체 A 중의 용매가, 극성 유기용매와 극성 유기용매 이외의 용매와의 혼합액인 경우, 예를 들어 그 극성 유기용매와 혼합 가능한 극성 유기용매 이외의 용매를 포함한 용매 (액체 C) 를 첨가하고/하거나 증발 증류제거, 반투막 분리, 분류 등에 의해, 선택적으로 극성 유기용매를 없애는 것으로, 극성 유기용매의 비율을 감소시킬 수가 있다. 여기서, 액체 C 는, 극성 유기용매 이외의 용매를 포함한 용매이며, 극성 유기용매가 액체 A 에 함유된 극성 유기용매의 비율보다 낮으면 포함할 수 있다.

공정 2 에 있어서의 극성 유기용매 이외의 용매로서는, 예를 들어, 물, 액체 이산화탄소, 액체 탄화수소, 할로겐화 탄소, 할로겐화 탄화수소 등을 들 수 있고, 바람직하게는 물이 포함된다. 또, 액체 A 및 액체 C 는, 이온, 완충 성분 등을 포함할 수 있다.

극성 유기용매와 극성 유기용매 이외의 용매의 조합은, 서로 혼합 가능한 조합이 바람직하고, 액체 A 및 액체 B 중의 용매 그리고 액체 C 중의, 용매에 대한 복합체 입자 및 지질 막의 구성 성분의 용해도 등을 고려해 선택할 수 있다. 한편, 복합체 입자는, 액체 A 및 액체 B 중의 용매 그리고 액체 C 중의 임의의 용매에 대한 용해도가 낮은 것이 바람직하고, 또 임의의 극성 유기용매 및 극성 유기용매 이외의 용매에 대한 용해도가 낮은 것이 바람직하다. 지질 막의 구성 성분은, 액체 B 중의 용매 및 액체 C 중의 용매에 대한 용해도가 낮은 것이 바람직하고, 액체 A 중의 용매에 대한 용해도가 높은 것이 바람직하고, 또 극성 유기용매에 대한 용해도가 높은 것이 바람직하고, 극성 유기용매 이외의 용매에 대한 용해도가 낮은 것이 바람직하다. 여기서, 복합체 입자의 용해도가 낮다는 것은, 복합체 입자에 함유되는 리드 입자, RNA 및 부착 경합제 등의 각 성분의, 용매 중에 있어서의 용출성이 낮다는 것을 의미하고, 각 성분의 개개의 용해도가 높아도 각 성분간의 결합 등에 의해 각 성분의 용출성이 낮아지고 있으면 충분하다. 예를 들어, 리드 입자에 포함되는 임의의 성분의 액체 A 중의 용매에 대한 용해도가 높은 경우에도, 리드 입자가 정전하를 가지는 경우, RNA 내의 전하, 분자 분극 등으로 인해 정전기적으로 결합이 형성되고, 액체 A 중의 용매에 대한 성분의 용해도가 낮아지면, 복합체 입자중의 성분의 용출이 억제되어 복합체 입자의 액체 A 중의 용매에 대한 용해도가 낮아질 수 있다. 즉, 리드 입자가 정전하를 가지는 것은, 리포솜 A 의 제조에 있어서, 복합체 입자의 성분의 용출을 억제하고, 생산성과 수율을 향상시키는 효과도 갖추고 있다.

액체 A 에 있어서의 극성 유기용매의 비율은, 지질 막의 구성 성분이 가용이고, 복합체 입자가 분산 가능하다면 특별히 한정되는 것이 아니고, 사용되는 용매나 복합체 입자, 지질 막의 구성 성분의 종류 등에 의해 상이하다. 그러나, 바람직하게는 30 v/v% 이상, 더욱 바람직하게는 60 내지 90 v/v% 이다. 또, 액체 B 에 있어서의 극성 유기용매의 비율은, 액체 A 보다 낮은 농도로 그 극성 유기용매를 포함하고, 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자도 분산 가능한 비율이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 50 v/v% 이하이다.

액체 A 를 제조하는 공정은, 복합체 입자가 용해되지 않으면, 극성 유기용매, 복합체 입자 및 지질 막의 구성 성분, 또는 극성 유기용매, 복합체 입자, 지질 막의 구성 성분 및 극성 유기용매 이외의 용매를 임의의 순서로 첨가하여 액체 A 를 제조하는 공정일 수 있다. 바람직하게는, 그 복합체 입자가 분산된 극성 유기용매를 포함한 액체 (액체 D) 를 제조하고, 액체 D1 중의 극성 유기용매와 동일 또는 상이한 극성 유기용매를 포함한 용매에 그 지질 막의 구성 성분을 용해시킨 액체 (액체 E) 를 제조해, 액체 D 와 액체 E 를 혼합해 액체 A 를 제조하는 공정을 예시할 수 있다. 액체 D 와 액체 E 를 혼합해 액체 A 를 제조하는 경우, 서서히 혼합하는 것이 바람직하다.

공정 3) 복합체 입자를 지질 막으로 피복하는 공정 (2)

공정 1 에서 수득된 복합체 입자 및 지질 막의 구성 성분을, 그 복합체 입자가 용해되지 않고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 상태로 존재하는 농도에서 그 지질 막의 구성 성분이 가용인 극성 유기용매를 포함한 액체 (액체 F) 중에 분산시 키는 공정을 포함한 제조 방법으로 리포솜 A 를 제조할 수 있다. 이 경우, 리포솜 A 는 분산액 상태로 수득될 수 있다. 액체 F 에 있어서의 용매는, 그 지질 막의 구성 성분이 가용인 극성 유기용매를 포함하고, 그 극성 유기용매를 포함한 용매에, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는 용매이다.

액체 F 의 제조 방법은 어떠한 형태도 취할 수가 있다. 예를 들어 복합체 입자의 분산액과 지질 막의 구성 성분의 용액 또는 분산액을 제조한 후, 양액체를 혼합해 액체 F 를 제조할 수 있고, 또한, 복합체 입자 및 지질 막의 구성 성분의 어느 한 쪽의 분산액을 제조해, 수득된 분산액 중, 고체상태의 다른 나머지 복합체 입자 또는 지질 막의 구성 성분을 첨가 및 분산시켜 액체 F 를 제조해도 된다. 복합체 입자의 분산액과 지질 막의 구성 성분의 용액 또는 분산액을 혼합하는 경우에는, 복합체 입자의 분산매는, 미리 극성 유기용매를 포함할 수 있고, 또 피복 지질 막의 구성 성분이 용해 또는 분산될 수 있고, 지질 막의 구성 성분의 용매 또는 분산매는 극성 유기용매를 포함한 액 또는 극성 유기용매만으로 구성되는 액체일 수 있다. 한편, 복합체 입자 및 지질 막의 구성 성분의 어느 한 쪽의 분산액을 제조해, 수득된 분산액에, 고체상태의 다른 나머지 복합체 입자 또는 지질 막의 구성 성분을 더하는 경우에는, 수득된 분산액은 극성 유기용매를 포함한 액체이다. 또한, 액체 F 를 제조한 후에 복합체 입자가 용해되지 않고, 지질 막의 구성 성분이 분산된 경우에는, 복합체 입자가 용해되지 않고, 지질 막의 구성 성분이 분산하는 극성 유기용매 농도의 범위에서 극성 유기용매를 첨가할 수 있고, 또는 유기용매를 제거할 수 있거나 농도를 감소시킬 수 있다. 한편, 액체 F 를 제조한 후에 복합체 입자는 용해하고 있지 않지만, 지질 막의 구성 성분이 용해된 경우에는, 복합체 입자가 용해되지 않고, 지질 막의 구성 성분이 분산된 극성 유기용매 농도의 범위에서 극성 유기용매를 제거할 수 있고, 또는 농도를 감소시킬 수 있다. 대안적으로는, 복합체 입자와 지질 막의 구성 성분을 미리 극성 유기용매 이외의 용매중에서 혼합해, 거기에 복합체 입자가 용해되지 않고, 지질 막의 구성 성분이 분산되는 극성 유기용매 농도의 범위에서 극성 유기용매를 첨가할 수 있다. 이 경우에는, 복합체 입자 및 지질 막의 구성 성분의 각각을 극성 유기용매 이외의 용매 중에 분산시켜, 양분산액을 혼합한 다음에, 극성 유기용매를 첨가하거나, 복합체 입자 및 지질 막의 구성 성분의 어느 한 쪽을 극성 유기용매 이외의 용매 중에 분산시켜, 고체상태의 다른 나머지 복합체 입자 또는 지질 막의 구성 성분을 수득된 분산액에 첨가한 다음에, 극성 유기용매를 첨가할 수 있다. 또, 복합체 입자 및 지질 막의 구성 성분이 분산되고, 극성 유기용매를 함유하는 액체를, 복합체 입자가 지질 막으로 피복되는에 충분한 시간 동안, 액체를 정치 또는 혼합하는 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 복합체 입자와 지질 막의 구성 성분을, 극성 유기용매를 함유하는 액체 중에 분산시킨 후, 액체를 정치 또는 혼합하는 시간은, 복합체 입자 및 지질 막의 구성 성분을, 극성 유기용매를 함유하는 액체 중에 분산시킨 후에 즉시 종료시키지 않는 한 제한은 없지만, 지질 막의 구성 성분이나 극성 유기용매를 함유하는 액의 종류에 따라 임의로 설정할 수가 있고, 수득된 리포솜 A 의 수율이 일정하게 유지되는 시간을 설정하는 것이 바람직하고, 예를 들어 3 초 내지 30 분이다.

액체 F 에 있어서의 극성 유기용매 이외의 용매로서는, 예를 들어 공정 2 에 있어서의 극성 유기용매 이외의 용매로 예시한 것이 포함되고, 바람직하게는 물이 포함된다.

액체 F 에 있어서의 극성 유기용매의 비율은, 복합체 입자와 지질 막의 구성 성분이 함께 분산되고 있는 조건만 충족하는 한 특별히 한정되는 것이 아니고, 사용되는 용매나 복합체 입자, 지질 막의 구성 성분의 종류 등에 따라 상이하다. 그러나, 바람직하게는 1 내지 80 vol%, 더욱 바람직하게는 10 내지 60 vol%, 더욱 바람직하게는 20 내지 50 vol%, 가장 바람직하게는 30 내지 40 vol% 이다.

본 발명에 있어서, 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 대해서 가용이란, 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해하는 성질을 가지는 경우, 가용화제 등의 도움으로 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해하는 성질을 가지는 경우, 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매 중에서 응집체, 마이셀 등을 형성해 유화 또는 에멀젼을 형성할 수 있는 성질을 가지는 경우 등을 포함한다. 또, 지질 막의 구성 성분이 분산한다는 것은, 지질 막의 구성 성분의 전부가 응집체, 마이셀 등을 형성하고, 유화 또는 에멀젼을 형성하는 상태, 지질 막의 구성 성분의 일부가 응집체, 마이셀 등을 형성하고, 유화 또는 에멀젼을 형성해, 나머지 성분이 용해된 상태, 지질 막의 구성 성분의 일부가 응집체, 마이셀 등을 형성하고, 유화 또는 에멀젼을 형성해, 나머지 성분이 침전된 상태 등을 포함한다. 또한, 지질 막의 구성 성분이 용해된다는 것은, 지질 막의 구성 성분의 전부가 응집체, 마이셀 등을 형성하고, 유화 또는 에멀젼을 형성한 상태를 포함하지 않는다.

본 발명에 있어서, 복합체 입자가 분산된다는 것은, 복합체 입자가 현탁 또는 유화 또는 에멀젼을 형성하고 있는 상태를 의미하고, 복합체 입자의 일부가 현탁 또는 유화 또는 에멀젼을 형성해, 나머지 입자가 용해된 상태, 복합체 입자의 일부가 유화 또는 에멀젼을 형성해, 나머지 입자가 침전된 상태 등을 포함한다. 복합체 입자가 용해되지 않다는 것은, 상기의 복합체 입자가 분산된 정의와 동의이다.

본 발명에 따른 리포솜 A의 제조 방법에 있어서 사용되는 극성 유기용매 함유액 중의 복합체 입자의 농도는, 복합체 입자를 지질 막으로 피복할 수 있으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 1 μg/mL 내지 1 g/mL 인 것이 바람직하고, 0.1 내지 500 mg/mL 인 것이 더욱 바람직하다. 또, 사용되는 지질 막의 구성 성분의 농도는, 복합체 입자를 피복할 수 있으면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 1 μg/mL 내지 1 g/mL 인 것이 바람직하고, 0.1 내지 400 mg/mL 인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 리포솜 A에 대한 지질 막의 비율은, 중량비로 1:0.1 내지 1:1000 가 바람직하고, 1:1 내지 1:10 가 더욱 바람직하다.

또, 본 발명의 리포솜 A 의 크기는, 평균 입자 직경이 300 nm 이하인 것이 바람직하고, 200 nm 이하인 것이 더욱 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들어 주사 가능한 크기인 것이 바람직하다.

게다가 상기로 수득된 리포솜 A 에 항체 등의 단백질, 당류, 당지질, 아미노 산, 핵산 또는 여러 가지의 저분자 화합물 및 고분자 화합물 등의 물질에 의해 개질시킬 수 있고, 개질에 의해 수득된 이러한 피복 복합체 입자도 리포솜 A 에 포함 된다. 예를 들어, 타겟팅에 응용하기 위해, 상기로 수득된 리포솜 A 에 대해서, 항체 등의 단백질, 펩티드, 지방산 등에 의한 지질 막의 표면 개질을 추가로 실시할 수도 있다 [D.D.Lasic, F.Martin 편, "Stealth Liposomes" (USA), CRC Press Inc, 1995년, p.93-102참조]. 또, 리포솜 A에 예를 들어 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체에 의한 표면 개질도 임의로 실시할 수가 있다. 이들 표면 개질에 사용되는 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체는, 상기 지질 막의 구성 성분으로서의 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체와 동의이다.

본 발명의 조성물은, 포유류에 투여함으로써, 상기 RNA 를 표적 유전자의 발현 부위를 포함한 조직 또는 장기에 전달할 수가 있고, 생체내로 포유류의 세포에, 예를 들어 KLF5 유전자 및 KLF5 에 의해 전사가 활성화되는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNA 를 도입할 수가 있어 KLF5 유전자 및 KLF5 에 의해 전사가 활성화되는 유전자등의 발현을 억제할 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해, 예를 들어 KLF5 유전자 및 KLF5 에 의해 전사가 활성화되는 유전자의 발현이 억제되어, 평활근의 증식이나 혈관신생을 억제할 수 있으므로, 본 발명의 조성물을 동맥 경화, 관동맥 인터벤션 후 발생하는 재협착, 심장비대 등의 심혈관계 질환, 암등의 치료제 또는 예방제의 유효 성분으로서 사용할 수 있다. 또, 상기 RNA 의 표적 유전자 가 종양이나 염증에 관련된 유전자나 혈관신생에 관련된 유전자인 경우, 예를 들어, 종양의 치료제로서 그 조성물을 투여함으로써, 종양의 치료를 실시하는 것이나, 염증의 치료제로서 그 조성물을 투여함으로써, 염증의 치료를 실시할 수가 있다. 또, 본 발명의 조성물은, 생체내의 스크리닝 시스템에 있어서 POC (Proof of concept) 취득의 툴로서 사용할 수도 있다.

본 발명의 조성물은, 예를 들어 혈액 성분 등의 생체 성분 (예를 들어 혈액, 소화관 관즙 등) 중에서의 상기 RNA 의 안정화, 부작용의 저감, 종양등의 표적 장기에의 약제 집적성의 증대, 경구나 점막에서의 약제의 흡수의 개선등을 목적으로 하는 제제로서 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물을, 의약품의 제제로서 사용하는 경우, 치료에 가장 효과적인 투여 경로를 사용하는 것이 바람직하다. 투여 경로의 예에는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 및 정맥내 등의 비경구투여 경로 및 경구투여 경로가 포함된다. 바람직하게는 정맥내 투여 및 근육내 투여가 포함되고, 더욱 바람직하게는 정맥내 투여가 포함된다.

정맥내 투여 또는 근육내 투여에 적당한 제제로서는, 예를 들어 주사제를 예시할 수 있고, 상기 기술한 방법에 의해 제조한 리포솜 A의 분산액을 그대로 예를 들어 주사제 등의 형태로서 사용하는 것도 가능하다. 그러나, 그 분산액으로부터 예를 들어 여과, 원심분리 등에 의해 용매를 제거한 후 사용하는 것, 또는 그 분산액, 또는 예를 들어 만니톨, 락토오스, 트레할로오스, 말토오스, 글리신 등의 부형제를 보충한 분산액을 동결건조한 후 사용할 수도 있다.

주사제의 경우, 상기의 리포솜 A의 분산액 또는 상기의 용매를 제거 또는 동결건조한 리포솜 A 에, 예를 들어 물, 산, 알칼리, 임의의 여러 가지의 완충액, 생리 식염수, 아미노산 수액등을 혼합해 주사제를 제조하는 것이 바람직하다. 또, 예를 들어 시트르산, 아스코르브산, 시스테인 또는 EDTA 등의 항산화제, 글리세롤, 글루코오스 또는 염화 나트륨 등의 등장화제등을 첨가해 주사제를 제조하는 것도 가능하다. 또, 예를 들어 글리세롤 등의 동결 보존제를 첨가하여 동결보존할 수도 있다.

또, 리포솜 A 는, 적당한 부형제 등과 함께 과립화, 건조하는 등 예를 들어 캡슐, 정제 또는 과립 등의 경구용 제제로 제형화 할 수 있다.

본 발명의 리포솜의 예에는 리드 입자와 상기 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되고, 그 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해될 수 있고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는, 리포솜; 및 양이온성 지질을 포함한 리드 입자와 상기 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되고, 그 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 포함하는 리포솜이 포함된다.

다음에, 실시예 및 참고예에 의해, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예 및 참고예로 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: siRNA 의 제작 1

KLF5 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA 의 서열로서 마우스 KLF5 cDNA의 서열 (GenBank 등록 번호:NM_009769; 서열번호 41) 으로부터, (a) AA 로 시작하는 21 개의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열, (b) GC 함량이 20 내지 80% 의 2 개의 조건을 만족하는, 11 개의 부분 서열을 선택했다. 바람직하게는, 개시 코돈 (서열번호 41 의 뉴클레오티드 167 내지 169 번째의 서열) 보다 75 개 이상의 뉴클레오티드 하류의, 코드 영역 (서열번호 41 의 뉴클레오티드 167 내지 1507 번째의 서열) 내에 위치하는 서열로, GC 함량이 40 내지 60% 인 서열을 선택하였다. 선택한 서열의 서열번호 41 에 있어서의 서열의 위치, 및 GC 함량을 표 1 에 나타냈다. 선택한 서열의 5' 말단의 AA 를 제외한 19 개의 뉴클레오티드의 서열의 T 를 U 로 치환하여 수득된 서열을 각각 서열번호 1 내지 11 에 나타냈다.

서열번호 1 내지 11 중 어느 하나에서 제시되는 서열 및 그 서열과 상보적인 서열의 3' 말단에 각각 UU 또는 dTdT 가 부가된 서열을 갖는 11 종류의 2중 사슬 RNA (이하, 각각 siRNA No.1 내지 No.11 로 부른다) 를 이하와 같이 제작했다. siRNA No.1 내지 No.11 각각의 센스 사슬 및 안티센스 사슬의 서열을 표 1 에 나타냈다 (서열번호 17 내지 38). siRNA No.1 은 하기와 같이 제작했다. 즉, 서열번호 17 및 18 에서 제시된 2 개의 RNA 를 Japan Bio Services Co., Ltd. 에 의뢰해 화학 합성해, 서로 어닐링시켰다. siRNA No.2 내지 No.11 은 Silencer™ siRNA 제작 키트 (Ambion) 를 이용한 시험관내 전사에 의해 제작했다. 시험관내 전사의 주형 제작에 이용하는 DNA 는, Hokkaido System Science Co., Ltd. 에 의해 제작되었다.

참고예 2: siRNA 의 제작 2

참고예 1 에서 수득된 siRNA No. 2 내지 4 및 7 내지 11 에 대해, 마우스 KLF5 cDNA 와 인간 KLF5 cDNA 를 서열의 상동성에 기초하여 정렬함으로써, 마우스에서 선택된 서열과 대응하는 인간의 서열을 수득했다. 표 2 에, 설계의 기초로서 사용된 마우스 KLF5 cDNA 상의 21 개의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 및 서열번호 41 에 있어서의 그 위치와 그 마우스 서열에 대응하는 인간 cDNA상의 21 개의 뉴클레오티드로 이루어지는 서열 및 서열번호 42 에 있어서의 그 위치, 그 인간 서열로부터 5' 말단의 AA 를 제외하여 수득된 RNA 의 서열을 나타내는 서열번호를 나타냈다. 또한, siRNA No. 5 및 6 은 비코드 영역의 서열을 기초로 하고 있기 때문에, 대응하는 인간 서열은 가리키지 않았다.

실시예 1

DOTAP (Avanti Polar Lipids Inc.), PEG-DSPE (NOF Corporation, 이하 동일 적용됨) 및 증류수를 DOTAP/PEG-DSPE/증류수의 비가 30 mg/12 mg/mL 가 되도록 혼합하고, 혼합물을 보르텍스 믹서로 진탕 교반했다. 수득된 분산액을 실온에서 공극 크기 0.4 μm 의 폴리카르보네이트 막 필터 (Whatman) 에 4 회, 공극 크기 0.1 μm 의 폴리카르보네이트 막 필터 (Whatman) 에 10 회, 그 다음 공극 크기 0.05 μm 의 폴리카르보네이트 막 필터 (Whatman) 에 24 회 통과시켜 리드 입자를 제조했다. 수득된 리드 입자의 분산액 0.5 mL 에, 참고예 1 또는 2 의 siRNA No.4 의 8 mg/mL 수용액 0.25 mL 를 첨가하고, 에탄올 1 mL 를 추가 첨가해 복합체 입자를 제조했다. 수득된 복합체 입자의 분산액에, 지질 막의 구성 성분인 EPC (NOF Corporation) 및 PEG-DSPE 를 EPC/PEG-DSPE/에탄올의 비가 120 mg/25 mg/mL 가 되도록 에탄올에 용해한 용액 0.25 mL 를 첨가한 다음, 증류수 23 mL 를 서서히 첨가해 에탄올의 농도가 5 vol% 이하가 되도록 조정해 리포솜을 제조했다. 수득된 리포솜의 분산액을 초원심분리 (1 시간, 110,000×g, 25℃) 해, 상청을 제거하였다. 생리 식염수를 첨가해 잔류물을 다시 재분산시켜 리포솜 분산액을 수득했다 (PEG-DSPE 에탄올 용액). EPC 120 중량부에 대해서 50 중량부의 PEG-DSPE 를 소량 (리포솜 분산액의 약 1/25 부피) 의 에탄올에 용해했다. 리포솜 분산액과 PEG-DSPE 에탄올 용액을 각각 70℃ 에서 2 분간 가열했다. 그 다음, PEG-DSPE 에탄올 용액에 리포솜 분산액을 첨가하고, 혼합했다. 그 다음, 수득된 혼합물을 70℃ 에서 2 분간 가열하고, 수냉해 제제를 수득했다.

제제는 3 로트 제조했다.

동적광산란법 (model ELS-800, Otsuka Electronics Co., Ltd.) 으로 리포솜의 평균 입자 직경을 측정한 결과, 각각 102, 103, 95 nm 였다.

실시예 2

실시예 1 와 마찬가지로 수득된 리드 입자의 분산액 0.5 mL 에, 참고예 1 또는 2 의 siRNA No.1 내지 3 및 5 내지 16 의 각각의 8 mg/mL 수용액 0.25 mL 를 첨가하고, 에탄올 1 mL 를 추가 첨가하여, siRNA No.1 내지 3 및 5 내지 16 의 각각의 복합체 입자를 수득했다. 수득된 복합체 입자의 분산액에, 실시예 1 과 동일한 조작을 해 그 siRNA No.1 내지 3 및 5 내지 16 의 각각을 캡슐화한 리포솜을 수득했다. 수득된 리포솜에 대해 실시예 1 과 동일한 조작을 해 그 siRNANo.1 내지 3 및 5 내지 16 의 각각의 제제를 수득했다.

비교예 1

실시예 1 에 있어서의 siRNA 를, 뒤섞인 KLF5-siRNA (센스 사슬, 5'- GGU ACA CAU GUG CAC ACA C -dTdT-3'; 안티센스 사슬, 5'- GUG UGU GCA CAU GUG UAC C-dTdT-3', Hokkaido System Science Co., Ltd.) 로 바꾸고, 마찬가지로 제제를 수득했다. 제제는 3 로트 이상 제조했다. 또한, 뒤섞인 KLF5-siRNA 는, KLF5-mRNA 의 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함하지 않는 RNA 이다.

동적광산란법 (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments) 으로 리포솜의 평균 입자 직경을 측정하였다. 일례에서 88 nm 였다.

비교예 2

참고예 1 또는 2 의 siRNA No.4 (KLF5 siRNA) 를 생리 식염수에 용해해, 0.5 mg/mL 수용액을 제조했다.

비교예 3

비교예 1 과 동일한 뒤섞인 KLF5 siRNA 를 생리 식염수에 용해해, 0.5 mg/mL 수용액을 제조했다.

시험예 1

1×10⁶ 개의 쥐과 LL/2 루이스 폐 암종 세포 ("The Journal of Biological Chemistry", 2003년, 278권, p.34598-34604) 를 마우스 (BL6J 마우스, 수컷, 5주령)의 피하에 투여했다. LL/2 는 그 증식이 혈관신생의 영향을 크게 받으므로 혈관신생 저해제의 스크리닝에 사용된다. 세포가 고정된 시점 (피하 투여 후 1 내지 2 일) 으로부터, 실시예 1 에서 수득된 제제를 연일, 꼬리 정맥내 투여했다. 투여한 제제는, 미리 인산 완충 식염수로 총 지질의 최종 농도가 5 mg/mL 가 되도록 희석하고, 마우스에 대한 투여량은 siRNA 150 μg/샷/마우스/일로 설정했다.

시간 경과에 따른 마우스에 이식된 종양의 크기를 측정해, 종양의 증식을 측정했다. 결과를 도 1 에 나타낸다.

또, 투여 10 일 후에 마우스로부터 종양을 적출해, 암 세포 주변의 혈관신생을 관찰하고 또한, 암 주변 조직 절편을 다음의 방법으로 CD31 면역염색 및 헤마톡실린-에오신 염색을 실시해 현미경으로 관찰했다.

CD31 면역염색

메탄올 고정한 종양을 파라핀으로 매포한 후, 두께 5 μm 의 절편을 준비했다. 절편을 탈파라핀화 후, 실온으로 10 분간, 0.5% 염소 혈청을 첨가해 블로킹했다. 블로킹액을 흡인 후, 항마우스 CD31 항체 (100 배 희석) (Pharmingen Co.) 를 첨가하고, 절편을 실온에서 2 시간 정치했다. 절편을 PBS 로 세정 후, 비오틴-컨쥬게이트 항-래트 Ig 항체 (200 배 희석) (DAKO Inc.) 를 첨가하고, 절편을 실온에서 1 시간 정치했다. 절편을 PBS 로 세정 후, ABC-AP 키트 AK-5000 (Vector Laboratories Inc.) 를 첨가하고, 절편을 실온에서 30 분간 정치했다. 절편을 PBS 로 세정 후, Vector Red SK-5100 (Vector Laboratories Inc.) 를 첨가하고, 절편을 실온에서 30 분간 정치해 발색시켰다. 절편을 물로 세정 후, 헤마톡신 염색액으로 후염색 한 후, 탈수시킨 다음, 현미경으로 관찰했다.

헤마톡실린-에오신 염색

메탄올 고정한 종양을 파라핀으로 매포한 후, 두께 5 μm 의 절편을 준비했다. 절편을 탈파라핀화 후, 유수로 세정한 다음, 증류수를 통과시켰다. 헤마톡실린 염색액을 첨가하고, 절편을 5 분간 정치했다. 그 다음 절편을 물로 세정 해, 0.5% 염산 용액을 첨가해 분별했다. 절편을 유수로 5 분간 세정 후, 발색시키고 증류수를 통과시켰다. 에오신 염색액을 첨가하고, 절편을 3 분간 정치했다. 95% 에탄올을 첨가하여 분별한 후, 탈수시킨 다음, 현미경으로 관찰했다.

도 1에 의하면, 실시예 1 에서 수득된 제제를 투여한 군에서는, 무처리군과 비교해 암 세포의 증식이 억제되었다. 또, 투여 10 일 후의 암 세포 주변의 관찰에 있어서, 실시예 1 에서 수득된 제제를 투여한 군에서는, 무처리군과 비교해 종양 자체적인 크기도 작고, 게다가 종양 중심부의 광범위한 괴사가 관찰되었다. 게다가 실시예 1 에서 수득된 제제를 투여한 군의 헤마톡실린-에오신 염색 및 CD31 면역염색한 종양 조직 절편의 현미경 관찰에 있어서, 무처리군과 비교해, 종양 주변 및 종양내에서 관찰된 혈관 내피 세포가 감소하고 있는 것이 관찰되었다. 이것은 실시예 1 에서 수득된 제제를 투여한 군에서는, 혈관신생이 억제되고 있는 것이 분명했다.

즉, 항혈관신생 효과 및 암 세포의 증식이 억제됨으로써, 본 발명의 조성물은, 예를 들어 KLF5-siRNA 를 포유류에 정맥내 투여했을 경우에, 효율적으로 종양 근방에 도달할 수가 있어 KLF5 유전자의 발현을 억제할 수 있다는 것이 분명해졌다.

시험예 2

1×10⁶ 개의 쥐과 LL/2 루이스 폐 암종을 마우스 (C57BL/6jjcl 마우스, 수컷, 6주령, CLEA Japan, Inc.) 의 액부 피하에 투여했다. 종양 세포 주사 2 일 후부터 8 일까지, 50 μg 의 siRNA 를 포함한 제제 (실시예 1 또는 비교예 1), 50 μg의 siRNA 를 포함한 siRNA 용액 (비교예 2 또는 3) 또는 생리 식염수를, 각각 연일, 꼬리 정맥내 투여했다.

시간 경과에 따른 마우스에 이식된 종양의 크기를 측정했다. 종양 체적을, (종양의 장경)×(단경)²×1/2 로 계산해, 유의차를 Tukey-kramer 법으로 검정했다. 결과를 도 2 에 나타낸다.

또, 투여 10일 후에 마우스로부터 종양을 적출해, 암 세포 주변의 혈관신생을 관찰하고 또한, 암 주변 조직 절편을 다음의 방법으로 CD31 면역염색해, 조직 절편에서 관찰되는 CD31 구조의 수를 셌다. 하나의 종양 근처 2 시야를 연구하고, 각 5 종양에 대한 구조의 수를 세어, 그 평균을 나타냈다. 유의차를 Tukey-kramer 법으로 검정했다. 결과를 도 3 에 나타낸다.

CD31 면역염색

종양을 적출해, 95% 메탄올 용액으로 고정한 후, 파라핀에 포매했다. 5 μm 두께로 슬라이스 한 종양을 탈파라핀 후, 100 배 희석한 항-CD31 폴리클론 항체 (Pharmingen Co., USA) 실온에서 120 분간 작용시켰다. CD31 항체를 세정 후, 200 배 희석한 비오틴화 항-래트 IgG (DAKO Inc. USA) 를 실온에서 60 분간 작용시켰다. 세정 후, 아비딘-HRP 컨쥬게이트 (Vector Laboratories Inc., USA) 를 실온에서 30 분간 작용시켰다. 세정 후, 디아미노벤진 (Sigma Co., USA) 으로 발색시켰다.

도 2 에 의하면, 실시예 1 에서 수득된 제제를 투여한 군에서만, 의미있는 종양 증식의 억제 효과가 관찰되었다. 또, 도 3 에 의하면, 실시예 1 에서 수득된 제제를 투여한 군에서는, 혈관신생을 나타내는 CD31 의 갈색의 구조의 수가 적고, 종양의 혈관신생이 저해되었다.

시험예 3

1×10⁶ 개의 쥐과 LL/2 루이스 폐 암종을 마우스 (C57BL/6jjcl 마우스, 수컷, 6주령, CLEA Japan, Inc.) 의 액부 피하에 투여했다. 50 μg 의 siRNA 를 포함한 제제 (실시예 1 또는 비교예 1), 50 μg 의 siRNA 를 포함한 siRNA 용액 (비교예 2 또는 3) 또는 생리 식염수를 투여하고, 투여 36 시간 후에 종양을 적출해, 다음의 방법으로 mRNA 발현량 및 KLF5 의 양을 측정했다.

mRNA 발현량의 측정

적출한 종양 세포를, RNeasy Fibrous 조직 키트 (Qiagen Inc.) 를 이용해 지르코니아 볼과 믹서 밀 (MM300, Qiagen) 을 이용해 용해한 후, 정제해 RNA 를 수득했다. cDNA 는 SuperScript First-Strand Synthesis Kit (Invitrogen Inc., USA) 를 이용해 1 μg 의 수득된 RNA 로부터 랜덤 프라이머로 역전사하여 수득했다. 수득된 cDNA 를 Hot Star Taq™ (Qiagen Inc.) 와 특이적 프라이머를 이용해 증폭했다. 이 때, 리보솜 18S RNA 프라이머를 내부 표준으로서 이용했다. 증폭 사이클은, 95℃15분→(94℃30초→53℃30초→72℃30초)×45회로 수행했다. 프라이머 서열은 다음과 같다: 5'-GGTTGCACAAAAGTTTATAC-3' 및 5'-GGCTTGGCGCCTGTGTGCTTCC-3'. mRNA 발현량을 ABI PRISM™ 7900HT (Applied Biosystems Inc., USA) 와 QuantiTect SYBR Green PCR 키트 (Qiagen Inc.) 를 사용해 정량했다. QuantumRNA™ Classic 18S 리보솜 RNA 프라이머 (Ambion Inc., USA) 를 내부 표준으로서 사용하여 표준화를 실시했다. 유의차를 Tukey-kramer 법으로 검정했다. 결과를 도 4 에 나타낸다.

KLF5 량의 측정

적출한 종양 세포를 적당량의 용해용 용액 (150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris, pH 7.5, 0.1% Nonidet P-40, 0.1% 나트륨 라우릴 술페이트, 0.5% 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1 mmol/L DTT, 단백분해효소 저해제)에 담그고, 지르코니아 볼과 믹서 밀 (MM300, Qiagen) 을 이용해 용해해, 원심상청을 수득했다. 단백질 농도는 Dc 단백질 검정 시약 (Bio-Rad, USA) 을 이용해 측정했다. 10 μg 의 단백질을 95℃ 로 15 분간 가열 처리한 다음, 10% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켰다. 전기영동한 단백질은 니트로셀룰로오스 막 (Amersham Inc, USA) 에 이동시키고, 블로킹 처리 (5% 스킴 밀크 중에서 진탕) 를 실시했다. 그 다음, 1000 배 희석된 항-KLF5 모노클론 항체 (Kyowa Hakko Kogyo K.K) 중에서 1 시간 진탕하며여 처리했다. 막을 세정 후, 2000 배 희석된 HRP-라벨화 항-래트 IgG (Amersham Inc.) 로 처리했다. 세정 후, 형광 발색 시약 (ECLplus, Amersham Inc.) 을 사용하여 발색시키고, 웨스턴 블롯팅의 밴드를, 화상 분석 소프트웨어 (Image Quant, Amersham Inc.) 를 이용해 정량했다. 3 마리로 이루어진 한 군 및 5 마리로 이루어진 KLF5 siRNA 투여군에서만 정량을 실시했다. 유의차를 Tukey-kramer 법으로 검정했다. 결과를 도 5 에 나타낸다.

도 4 에 의하면, 실시예 1 에서 수득된 제제의 투여군에서만, KLF5 mRNA 의 생성 억제가 관찰되었다. 도 5 에 의하면, 실시예 1 에서 수득된 제제의 투여군에서만, KLF5 의 생성 억제가 관찰되었다.

참고 시험예 1

1×10⁶ 개의 쥐과 LL/2 루이스 폐 암종을 마우스 (C57BL/6jjcl 마우스, 수컷, 5 내지 6주령) 의 액부 피하에 투여했다. 종양 세포 주사 2 일 후부터 8 일까지, 1 μg 의 siRNA 를 포함한 siRNA 용액 (비교예 2, 비교예 3) 또는 생리 식염수를 연일, 종양에 직접 투여했다.

시간 경과에 따른 마우스에 이식된 종양의 크기를 측정했다. 종양 체적을, (종양의 장경)×(단경)²×1/2로 계산해, 유의차를 Tukey-kramer 법으로 검정했다. 결과를 도 6 에 나타낸다.

도 6 에 의하면, 비교예 1 에서 수득된 KLF5 siRNA 용액 투여군으로 종양의 성장이 억제되는 경향을 관찰할 수 있었지만, 유의차는 관찰할 수 없었다. 또, 투여 10 일 후에 마우스로부터 종양을 적출해, 시험예 2 와 마찬가지로 암 주변 절편을 CD31 면역염색하여 관찰했다. 혈관신생을 나타내는 CD31 에, 양군으로 분명한 차이는 관찰할 수 없었다.

실시예 3

실시예 1 에 있어서의 siRNA 를, bcl2-siRNA (센스 사슬, 5'-GUGAAGUCAACAUGCCUGC -dTdT-3'; 안티센스 사슬, 5'-GCAGGCAUGUUGACUUCAC-dTdT-3', Dharmacon Inc. 또는 Hokkaido System Science Co., Ltd.) 로 바꾸고, 마찬가지로 제제를 수득했다. 제제는 3 로트 이상 제조했다.

동적광산란법 (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments) 으로 리포솜의 평균 입자 직경을 측정하였다. 일례에서 110 nm 였다.

비교예 4

실시예 1 에 있어서의 siRNA 를, GL3-siRNA(센스 사슬, 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGA -dTdT-3'; 안티센스 사슬, 5'-UCGAAGUACUCAGCGUAAG-dTdT-3', Dharmacon Inc. 또는 Hokkaido System Science Co., Ltd.) 로 바꾸고, 마찬가지로 제제를 수득했다. 제제는 3 로트 이상 제조했다. 또한, GL3-siRNA 는, bcl2-mRNA 의 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함하지 않는 RNA 이다.

동적광산란법 (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments) 으로 리포솜의 평균 입자 직경을 측정하였다. 일례에서 99 nm 였다.

비교예 5

실시예 3 과 같은 bcl2-siRNA 를 생리 식염수에 용해해, 0.5 mg/mL 수용액을 제조했다.

시험예 4

1×10⁷ 개의 인간 전립선 암종 세포 DU145 (ATCC No.HTB-81) 를 누드 마우스 (BALB/cAJcl-nu, 수컷, 5주령, CLEA Japan, Inc.) 의 피하에 투여했다. 피하 투여 17 일 후에 종양의 크기를 측정해, 종양의 크기가 150 내지 350 mm³ 에 이른 누드 마우스를 선택했다. 그 다음, 실시예 3 에서 수득된 제제를 꼬리 정맥내 투여했다. 투여는 5 일간 연속해 실시한 후, 2 일간의 회복기를 둔 다음, 추가 5 일간 연속 투여했다.

투여한 제제는, 미리 생리 식염수로 siRNA 최종 농도가 0.75 mg/mL 가 되도록 희석해, 마우스에 대한 투여량을 siRNA 150 μg/샷/마우스/일로 설정했다.

시간 경과에 따른 마우스에 이식된 종양의 크기를 측정해, 종양의 증식을 측정했다. 결과를 도 7 에 나타낸다.

도 7 에 의하면, 실시예 3 에서 수득된 제제를 투여한 군에서는, 무처리군과 비교해 암 세포의 증식이 억제되었다.

시험예 5

1×10⁶ 개의 인간 전립선 암종 세포 PC-3 (ATCC No.CRL-1435) 을 누드 마우스 (BALB/cAJcl-nu, 수컷, 6주령, CLEA Japan, Inc.) 의 피하에 투여했다. 피하 투여 6 일 후에 종양의 크기를 측정해, 종양의 크기가 80 내지 120 mm³ 에 이른 누드 마우스를 선택했다. 그 다음 실시예 3, 비교예 4 또는 5 로 수득된 제제를 선택된 마우스의 꼬리 정맥내 투여했다. 투여는 5 일간 연속해 실시한 후, 2 일간의 회복기를 둔 다음, 추가 5 일간 연속 투여했다.

투여한 제제는, 미리 생리 식염수로 siRNA 최종 농도가 0.75 mg/mL가 되도록 희석해, 마우스에 대한 투여량을 siRNA 150 μg/샷/마우스/일로 설정했다.

시간 경과에 따른 마우스에 이식된 종양의 크기를 측정해, 종양의 증식을 측정했다. 결과를 도 8 에 나타낸다.

도 8 에 의하면, 실시예 3 에서 수득된 제제를 투여한 군에서는, 무처리군, 비교예 4 로 수득된 제제 및 비교예 5 로 수득된 용액을 투여한 군과 비교해 암 세포의 증식이 억제되었다.

표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함한 RNA-캡슐화 리포솜을 함유하는 본 발명의 조성물을, 포유류 등에 투여함으로써, 그 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

「서열목록 프리 텍스트」

서열번호1, 발명자: YAMAUCHI MASAHIRO; TOTTORI TSUNEAKI; ISHIHARA ATSUSHI; YAGI NOBUHIRO; KATO YASUKI

서열번호 17 siRNA No. 1 센스 사슬

서열번호 18 siRNA No. 1 안티센스 사슬

서열번호 19 siRNA No. 2 센스 사슬

서열번호 20 siRNA No. 2 안티센스 사슬

서열번호 21 siRNA No. 3 센스 사슬

서열번호 22 siRNA No. 3 안티센스 사슬

서열번호 23 siRNA No. 4 센스 사슬

서열번호 24 siRNA No. 4 안티센스 사슬

서열번호 25 siRNA No. 5 센스 사슬

서열번호 26 siRNA No. 5 안티센스 사슬

서열번호 27 siRNA No. 6 센스 사슬

서열번호 28 siRNA No. 6 안티센스 사슬

서열번호 29 siRNA No. 7 센스 사슬

서열번호 30 siRNA No. 7 안티센스 사슬

서열번호 31 siRNA No. 8 센스 사슬

서열번호 32 siRNA No. 8 안티센스 사슬

서열번호 33 siRNA No. 9 센스 사슬

서열번호 34 siRNA No. 9 안티센스 사슬

서열번호 35 siRNA No. 10 센스 사슬

서열번호 36 siRNA No. 10 안티센스 사슬

서열번호 37 siRNA No. 11 센스 사슬

서열번호 38 siRNA No. 11 안티센스 사슬

서열번호 39 SEAP siRNA 센스 사슬

서열번호 40 SEAP siRNA 안티센스 사슬

[서열목록]

SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. <120> Preparation which inhibit gene expression <130> 1743 <160> 42 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 1 caugaacguc uuccucccu 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 2 auuuaccugc cacucugcc 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 3 ggaguaaccc ggaucugga 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 4 aagcucaccu gaggacuca 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 5 uccccagacc guccaugcc 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 6 cgcugcgccc acccgccug 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 7 auggagaagu aucugaccc 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 8 aguauagacg agacagugc 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 9 accagacggc aguaaugga 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 10 gcucagagcc uggaagucc 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Mus musculus <400> 11 gccguuccag ugcauggug 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 12 auuuacccac cacccugcc 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 13 ggaguaaccc cgauuugga 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 14 auggagaagu aucugacac 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 15 aucagacagc agcaaugga 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 16 gcccuuccag ugcggggug 19 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 1 sense strand <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 17 caugaacguc uuccucccut t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 1 antisense strand <220> <221> misc_feature <222> (20)..(21) <223> DNA <400> 18 agggaggaag acguucaugt t 21 <210> 19 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 2 sense strand <400> 19 auuuaccugc cacucugccu u 21 <210> 20 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 2 antisense strand <400> 20 ggcagagugg cagguaaauu u 21 <210> 21 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 3 sense strand <400> 21 ggaguaaccc ggaucuggau u 21 <210> 22 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 3 antisense strand <400> 22 uccagauccg gguuacuccu u 21 <210> 23 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 4 sense strand <400> 23 aagcucaccu gaggacucau u 21 <210> 24 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 4 antisense strand <400> 24 ugaguccuca ggugagcuuu u 21 <210> 25 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 5 sense strand <400> 25 uccccagacc guccaugccu u 21 <210> 26 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 5 antisense strand <400> 26 ggcauggacg gucugggggu u 21 <210> 27 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 6 sense strand <400> 27 cgcugcgccc acccgccugu u 21 <210> 28 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 6 antisense strand <400> 28 caggcgggug ggcgcagcgu u 21 <210> 29 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 7 sense strand <400> 29 auggagaagu aucugacccu u 21 <210> 30 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 7 antisense strand <400> 30 gggucagaua cuucuccauu u 21 <210> 31 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 8 sense strand <400> 31 aguauagacg agacagugcu u 21 <210> 32 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 8 antisense strand <400> 32 gcacugucuc gucuauacuu u 21 <210> 33 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 9 sense strand <400> 33 accagacggc aguaauggau u 21 <210> 34 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 9 antisense strand <400> 34 uccauuacug ccgucuggcu u 21 <210> 35 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 10 sense strand <400> 35 gcucagagcc uggaaguccu u 21 <210> 36 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 10 antisense strand <400> 36 ggacuuccag gcucugagcu u 21 <210> 37 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 11 sense strand <400> 37 gccguuccag ugcauggugu u 21 <210> 38 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA No. 11 antisense strand <400> 38 caccaugcac uggaacggcu u 21 <210> 39 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEAP-siRNA sense strand <400> 39 agggcaacuu ccagaccauu u 21 <210> 40 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SEAP-siRNA antisense strand <400> 40 auggucugga aguugcccuu u 21 <210> 41 <211> 1591 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (167)..(1504) <400> 41 ccgagcccag gagccccgat ctccgtgccc gccttcgtga gcgtctggct gccggcccag 60 gggtcccccg ccgcggcccc ccgccgagtc cgccgtcccg tgccagcccg agcgaggtgg 120 gatcgcgatc gctccgtgtc ccgctcccgt aatccccaga ccgtcc atg ccc acg 175 Met Pro Thr 1 cgg gtg ctg acc atg agc gcc cgc ctg gga cca ctg ccc cag ccg ccg 223 Arg Val Leu Thr Met Ser Ala Arg Leu Gly Pro Leu Pro Gln Pro Pro 5 10 15 gcc gcg cag gcc gag ccc gtg ttc gcg cag ctc aag ccg gtg ctg ggc 271 Ala Ala Gln Ala Glu Pro Val Phe Ala Gln Leu Lys Pro Val Leu Gly 20 25 30 35 gct gcg aac ccg gcc cgc gac gcg gcg ctc ttc tcc gga gac gat ctg 319 Ala Ala Asn Pro Ala Arg Asp Ala Ala Leu Phe Ser Gly Asp Asp Leu 40 45 50 aaa cac gcg cac cac cac ccg cct gcg ccg ccg cca gcc gct ggc ccg 367 Lys His Ala His His His Pro Pro Ala Pro Pro Pro Ala Ala Gly Pro 55 60 65 cga ctg ccc tcg gag gag ctg gtc cag aca aga tgt gaa atg gag aag 415 Arg Leu Pro Ser Glu Glu Leu Val Gln Thr Arg Cys Glu Met Glu Lys 70 75 80 tat ctg acc cct cag ctc cct cca gtt ccg ata att tca gag cat aaa 463 Tyr Leu Thr Pro Gln Leu Pro Pro Val Pro Ile Ile Ser Glu His Lys 85 90 95 aag tat aga cga gac agt gcc tca gtg gta gac cag ttc ttc act gac 511 Lys Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Ser Val Val Asp Gln Phe Phe Thr Asp 100 105 110 115 act gaa ggc ata cct tac agc atc aac atg aac gtc ttc ctc cct gac 559 Thr Glu Gly Ile Pro Tyr Ser Ile Asn Met Asn Val Phe Leu Pro Asp 120 125 130 atc act cac ctg aga act ggc ctc tac aaa tcc cag aga cca tgc gta 607 Ile Thr His Leu Arg Thr Gly Leu Tyr Lys Ser Gln Arg Pro Cys Val 135 140 145 aca cag atc aag aca gaa cct gtt acc att ttc agc cac cag agc gag 655 Thr Gln Ile Lys Thr Glu Pro Val Thr Ile Phe Ser His Gln Ser Glu 150 155 160 tcg acg gcc cct cct cct cct ccg gcc ccc acc cag gct ctc ccc gag 703 Ser Thr Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Pro Thr Gln Ala Leu Pro Glu 165 170 175 ttc act agt atc ttc agc tcc cac cag acc aca gcg cca cca cag gag 751 Phe Thr Ser Ile Phe Ser Ser His Gln Thr Thr Ala Pro Pro Gln Glu 180 185 190 195 gtg aac aat atc ttc atc aaa caa gaa ctt cct ata cca gat ctt cat 799 Val Asn Asn Ile Phe Ile Lys Gln Glu Leu Pro Ile Pro Asp Leu His 200 205 210 ctc tct gtc cct tcc cag cag ggc cac ctg tac cag ctg ttg aat aca 847 Leu Ser Val Pro Ser Gln Gln Gly His Leu Tyr Gln Leu Leu Asn Thr 215 220 225 ccg gat cta gac atg ccc agt tcg aca aac cag acg gca gta atg gac 895 Pro Asp Leu Asp Met Pro Ser Ser Thr Asn Gln Thr Ala Val Met Asp 230 235 240 acc ctt aat gtt tct atg gca ggc ctt aac cca cac ccc tct gct gtt 943 Thr Leu Asn Val Ser Met Ala Gly Leu Asn Pro His Pro Ser Ala Val 245 250 255 cca cag acg tca atg aaa cag ttc cag ggc atg ccc cct tgc acg tac 991 Pro Gln Thr Ser Met Lys Gln Phe Gln Gly Met Pro Pro Cys Thr Tyr 260 265 270 275 acc atg cca agt cag ttt ctt cca cag cag gcc act tat ttt ccc ccg 1039 Thr Met Pro Ser Gln Phe Leu Pro Gln Gln Ala Thr Tyr Phe Pro Pro 280 285 290 tca cca cca agc tca gag cct gga agt ccc gat aga caa gct gag atg 1087 Ser Pro Pro Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Asp Arg Gln Ala Glu Met 295 300 305 ctg cag aat ctc acc cca cct ccg tcc tat gcc gct aca att gct tcc 1135 Leu Gln Asn Leu Thr Pro Pro Pro Ser Tyr Ala Ala Thr Ile Ala Ser 310 315 320 aaa ctg gcg att cac aac cca aat tta cct gcc act ctg cca gtt aat 1183 Lys Leu Ala Ile His Asn Pro Asn Leu Pro Ala Thr Leu Pro Val Asn 325 330 335 tcg cca act ctc cca cct gtc aga tac aac aga agg agt aac ccg gat 1231 Ser Pro Thr Leu Pro Pro Val Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Asn Pro Asp 340 345 350 355 ctg gag aag cga cgt atc cac ttc tgc gat tat aat ggt tgc aca aaa 1279 Leu Glu Lys Arg Arg Ile His Phe Cys Asp Tyr Asn Gly Cys Thr Lys 360 365 370 gtt tat aca aag tcg tct cac tta aaa gct cac ctg agg act cat acg 1327 Val Tyr Thr Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His Thr 375 380 385 ggc gag aag ccc tac aag tgc acc tgg gag ggc tgc gac tgg agg ttt 1375 Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Thr Trp Glu Gly Cys Asp Trp Arg Phe 390 395 400 gcc cgg tcg gat gag ctg acc cgc cac tac agg aag cac acg ggc gcc 1423 Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly Ala 405 410 415 aag ccg ttc cag tgc atg gtg tgc caa cgc agc ttc tcc cgc tcc gac 1471 Lys Pro Phe Gln Cys Met Val Cys Gln Arg Ser Phe Ser Arg Ser Asp 420 425 430 435 cac ctc gcg ctg cac atg aag cgc cac cag aac tga gcgagcgaac 1517 His Leu Ala Leu His Met Lys Arg His Gln Asn 440 445 gctgcgccca cccgcctgac gccttgcagt ccgctttgcc atcctttaaa ccgcagacct 1577 aacttcataa aaag 1591 <210> 42 <211> 3359 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (312)..(1682) <400> 42 ggtacgtgcg ctcgcggttc tctcgcggag gtcggcggtg gcgggagcgg gctccggaga 60 gcctgagagc acggtggggc ggggcgggag aaagtggccg cccggaggac gttggcgttt 120 acgtgtggaa gagcggaaga gttttgcttt tcgtgcgcgc cttcgaaaac tgcctgccgc 180 tgtctgagga gtccacccga aacctcccct cctccgccgg cagccccgcg ctgagctcgc 240 cgacccaagc cagcgtgggc gaggtgggaa gtgcgcccga cccgcgcctg gagctgcgcc 300 cccgagtgcc c atg gct aca agg gtg ctg agc atg agc gcc cgc ctg gga 350 Met Ala Thr Arg Val Leu Ser Met Ser Ala Arg Leu Gly 1 5 10 ccc gtg ccc cag ccg ccg gcg ccg cag gac gag ccg gtg ttc gcg cag 398 Pro Val Pro Gln Pro Pro Ala Pro Gln Asp Glu Pro Val Phe Ala Gln 15 20 25 ctc aag ccg gtg ctg ggc gcc gcg aat ccg gcc cgc gac gcg gcg ctc 446 Leu Lys Pro Val Leu Gly Ala Ala Asn Pro Ala Arg Asp Ala Ala Leu 30 35 40 45 ttc ccc ggc gag gag ctg aag cac gcg cac cac cgc ccg cag gcg cag 494 Phe Pro Gly Glu Glu Leu Lys His Ala His His Arg Pro Gln Ala Gln 50 55 60 ccc gcg ccc gcg cag gcc ccg cag ccg gcc cag ccg ccc gcc acc ggc 542 Pro Ala Pro Ala Gln Ala Pro Gln Pro Ala Gln Pro Pro Ala Thr Gly 65 70 75 ccg cgg ctg cct cca gag gac ctg gtc cag aca aga tgt gaa atg gag 590 Pro Arg Leu Pro Pro Glu Asp Leu Val Gln Thr Arg Cys Glu Met Glu 80 85 90 aag tat ctg aca cct cag ctt cct cca gtt cct ata att cca gag cat 638 Lys Tyr Leu Thr Pro Gln Leu Pro Pro Val Pro Ile Ile Pro Glu His 95 100 105 aaa aag tat aga cga gac agt gcc tca gtc gta gac cag ttc ttc act 686 Lys Lys Tyr Arg Arg Asp Ser Ala Ser Val Val Asp Gln Phe Phe Thr 110 115 120 125 gac act gaa ggg tta cct tac agt atc aac atg aac gtc ttc ctc cct 734 Asp Thr Glu Gly Leu Pro Tyr Ser Ile Asn Met Asn Val Phe Leu Pro 130 135 140 gac atc act cac ctg aga act ggc ctc tac aaa tcc cag aga ccg tgc 782 Asp Ile Thr His Leu Arg Thr Gly Leu Tyr Lys Ser Gln Arg Pro Cys 145 150 155 gta aca cac atc aag aca gaa cct gtt gcc att ttc agc cac cag agt 830 Val Thr His Ile Lys Thr Glu Pro Val Ala Ile Phe Ser His Gln Ser 160 165 170 gaa acg act gcc cct cct ccg gcc ccg acc cag gcc ctc cct gag ttc 878 Glu Thr Thr Ala Pro Pro Pro Ala Pro Thr Gln Ala Leu Pro Glu Phe 175 180 185 acc agt ata ttc agc tca cac cag acc gca gct cca gag gtg aac aat 926 Thr Ser Ile Phe Ser Ser His Gln Thr Ala Ala Pro Glu Val Asn Asn 190 195 200 205 att ttc atc aaa caa gaa ctt cct aca cca gat ctt cat ctt tct gtc 974 Ile Phe Ile Lys Gln Glu Leu Pro Thr Pro Asp Leu His Leu Ser Val 210 215 220 cct acc cag cag ggc cac ctg tac cag cta ctg aat aca ccg gat cta 1022 Pro Thr Gln Gln Gly His Leu Tyr Gln Leu Leu Asn Thr Pro Asp Leu 225 230 235 gat atg ccc agt tct aca aat cag aca gca gca atg gac act ctt aat 1070 Asp Met Pro Ser Ser Thr Asn Gln Thr Ala Ala Met Asp Thr Leu Asn 240 245 250 gtt tct atg tca gct gcc atg gca ggc ctt aac aca cac acc tct gct 1118 Val Ser Met Ser Ala Ala Met Ala Gly Leu Asn Thr His Thr Ser Ala 255 260 265 gtt ccg cag act gca gtg aaa caa ttc cag ggc atg ccc cct tgc aca 1166 Val Pro Gln Thr Ala Val Lys Gln Phe Gln Gly Met Pro Pro Cys Thr 270 275 280 285 tac aca atg cca agt cag ttt ctt cca caa cag gcc act tac ttt ccc 1214 Tyr Thr Met Pro Ser Gln Phe Leu Pro Gln Gln Ala Thr Tyr Phe Pro 290 295 300 ccg tca cca cca agc tca gag cct gga agt cca gat aga caa gca gag 1262 Pro Ser Pro Pro Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Asp Arg Gln Ala Glu 305 310 315 atg ctc cag aat tta acc cca cct cca tcc tat gct gct aca att gct 1310 Met Leu Gln Asn Leu Thr Pro Pro Pro Ser Tyr Ala Ala Thr Ile Ala 320 325 330 tct aaa ctg gca att cac aat cca aat tta ccc acc acc ctg cca gtt 1358 Ser Lys Leu Ala Ile His Asn Pro Asn Leu Pro Thr Thr Leu Pro Val 335 340 345 aac tca caa aac atc caa cct gtc aga tac aat aga agg agt aac ccc 1406 Asn Ser Gln Asn Ile Gln Pro Val Arg Tyr Asn Arg Arg Ser Asn Pro 350 355 360 365 gat ttg gag aaa cga cgc atc cac tac tgc gat tac cct ggt tgc aca 1454 Asp Leu Glu Lys Arg Arg Ile His Tyr Cys Asp Tyr Pro Gly Cys Thr 370 375 380 aaa gtt tat acc aag tct tct cat tta aaa gct cac ctg agg act cac 1502 Lys Val Tyr Thr Lys Ser Ser His Leu Lys Ala His Leu Arg Thr His 385 390 395 act ggt gaa aag cca tac aag tgt acc tgg gaa ggc tgc gac tgg agg 1550 Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Thr Trp Glu Gly Cys Asp Trp Arg 400 405 410 ttc gcg cga tcg gat gag ctg acc cgc cac tac cgg aag cac aca ggc 1598 Phe Ala Arg Ser Asp Glu Leu Thr Arg His Tyr Arg Lys His Thr Gly 415 420 425 gcc aag ccc ttc cag tgc ggg gtg tgc aac cgc agc ttc tcg cgc tct 1646 Ala Lys Pro Phe Gln Cys Gly Val Cys Asn Arg Ser Phe Ser Arg Ser 430 435 440 445 gac cac ctg gcc ctg cat atg aag agg cac cag aac tga gcactgcccg 1695 Asp His Leu Ala Leu His Met Lys Arg His Gln Asn 450 455 tgtgacccgt tccaggtccc ctgggctccc tcaaatgaca gacctaacta ttcctgtgta 1755 aaaacaacaa aaacaaaaaa aaaacaagaa aaccacaact aaaactggaa atgtatattt 1815 tgtatatttg agaaaacagg gaatacattg tattaatacc aaagtgtttg gtcattttaa 1875 gaatctggaa tgcttgctgt aatgtatatg gctttactca agcagatctc atctcatctc 1935 atgacaggca gccagtctca acatgggtaa ggggtggggg tgaaggggag tgtgtgcagc 1995 gtttttacct aggcaccatc atttaatgtg acagtgttca gtaaacaaat cagttggcag 2055 gcaccagaag aagaatggat tgtatgtcaa gattttactt ggcattgagt agtttttttc 2115 aatagtaggt aattccttag agatacagta tacctggcaa ttcacaaata gccattgaac 2175 aaatgtgtgg gtttttaaaa attatataca tatatgagtt gcctatattt gctattcaaa 2235 attttgtaaa tatgcaaatc agctttatag gtttattaca agttttttag gattcttttg 2295 gggaagagtc ataattcttt tgaaaataac catgaataca cttacagtta ggatttgtgg 2355 taaggtacct ctcaacatta ccaaaatcat ttctttagag ggaaggaata atcattcaaa 2415 tgaactttaa aaaagcaaat ttcatgcact gattaaaata ggattatttt aaatacaaaa 2475 ggcattttat atgaattata aactgaagag cttaaagata gttacaaaat acaaaagttc 2535 aacctcttac aataagctaa acgcaatgtc atttttaaaa agaaggactt aggggtcgtt 2595 ttcacatatg acaatgttgc atttatgatg cagttttcaa gtaccaaaac gttgaattga 2655 tgatgcagtt ttcatatatc gagatgttcg ctcgtgcagt actgttggtt aaatgacaat 2715 ttatgtggat tttgcatgta atacacagtg agacacagta attttatcta aattacagtg 2775 cagtttagtt aatctattaa tactgactca gtgtctgcct ttaaatataa atgatatgtt 2835 gaaaacttaa ggaagcaaat gctacatata tgcaatataa aatagtaatg tgatgctgat 2895 gctgttaacc aaagggcaga ataaataagc aaaatgccaa aaggggtctt aattgaaatg 2955 aaaatttaat tttgttttta aaatattgtt tatctttatt tattttgtgg taatatagta 3015 agttttttta gaagacaatt ttcataactt gataaattat agttttgttt gttagaaaag 3075 ttgctcttaa aagatgtaaa tagatgacaa acgatgtaaa taattttgta agaggcttca 3135 aaatgtttat acgtggaaac acacctacat gaaaagcaga aatcggttgc tgttttgctt 3195 ctttttccct cttatttttg tattgtggtc atttcctatg caaataatgg agcaaacagc 3255 tgtatagttg tagaattttt tgagagaatg agatgtttat atattaacga caattttttt 3315 tttggaaaat aaaaagtgcc taaaagaaaa aaaaaaaaaa aaaa 3359

Claims (37)

1. RNA 가 표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함하고, 리포솜이 표적 유전자의 발현 부위를 포함한 조직 또는 장기에 도달할 수 있는, RNA-캡슐화 리포솜을 함유하는 조성물.
2. 제 1 항이 있어서, 리포솜이 정맥내 투여 가능한 크기의 리포솜인 조성물.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, RNA 가 RNA 간섭 (RNAi) 을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA 인 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자가 종양이나 염증에 관련된 유전자인 조성물.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자가 혈관신생에 관련된 유전자인 조성물.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 가 KLF5 mRNA 인 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 가 인간 또는 마우스 KLF5 mRNA 인 조성물.
8. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, RNA 가 KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 동일 또는 상이한 1 내지 6 개의 뉴클레오티드가 동일 또는 상이한 방식으로 부가된 2중 사슬 RNA 인 조성물.
9. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, RNA 가 KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 갖는 RNA 가 그 서열과 상보적인 서열을 갖는 RNA 에 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결되어, 그의 3' 말단에 동일 또는 상이한 1 내지 6 개의 뉴클레오티드가 부가된, 헤어핀 구조를 갖는 RNA 인 조성물.
10. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서, RNA 가 하기 (a) 내지 (c) 로 이루어진 군에서 선택되는 RNA 인 조성물:

    (a) 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 우리딜산 및 데옥시티미딜산과 관련된 동일 또는 상이한 2 내지 4 원이 동일 또는 상이한 방식으로 부가된 2중 사슬 RNA;

    (b) 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나에서 제시되는 서열을 갖는 RNA 가 그 서열과 상보적인 서열을 갖는 RNA 에 2 개의 우리딜산 또는 데옥시티미딜산을 그의 5' 말단에 갖는 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결되어, 그의 3' 말단에 우리딜산 및 데옥시티미딜산과 관련된 동일 또는 상이한 2 내지 4 원이 부가된, 헤어핀 구조를 갖는 RNA; 및

    (c) 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 2 개의 우리딜산이 부가된 2중 사슬 RNA.
11. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 가 bcl2 mRNA 인 조성물.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-캡슐화 리포솜이 리드 입자와 그 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되고, 그 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해될 수 있고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는 조성물.
13. 제 12 항에 있어서, 극성 유기용매가 알콜인 조성물.
14. 제 12 항에 있어서, 극성 유기용매가 에탄올인 조성물.
15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 리드 입자가 양이온성 지질을 포함한 리드 입자이며, 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 포함하는 조성물.
16. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, RNA-캡슐화 리포솜이 양이온성 지질을 포함한 리드 입자와 상기 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막으로 구성되는 리포좀이고, 그 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 포함하는 리포솜인 조성물.
17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 양이온성 지질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 브롬화 암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 조성물.
18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 물질의 지질 유도 체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌 글리콜 포스파티딜에탄올아민인 조성물.
19. 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인 조성물.
20. 리드 입자와 표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함한 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막을 포함하고, 그 지질 막의 구성 성분이 극성 유기용매에 용해될 수 있고, 그 지질 막의 구성 성분이 분산 가능하고, 복합체 입자가 분산 가능한 농도로 액체 중에 그 극성 유기용매가 포함될 수 있는, RNA-캡슐화 리포솜.
21. 제 20 항에 있어서, 극성 유기용매가 알콜인 리포솜.
22. 제 20 항에 있어서, 극성 유기용매가 에탄올인 리포솜.
23. 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 리드 입자가 양이온성 지질을 포함한 리드 입자이며, 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 함유하는 리포솜.
24. 양이온성 지질을 포함한 리드 입자와 표적 유전자의 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열 및 그 서열과 상보적인 서열을 포함한 RNA 를 구성 성분으로 포함하는 복합체 입자 및 그 복합체 입자를 피복하는 지질 막을 포함하고, 그 지질 막이 중성 지질 및 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체를 구성 성분으로 함유하는, RNA-캡슐화 리포솜.
25. 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 양이온성 지질이 N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄, N-[1-(2,3-디올레오일프로필)]-N,N-디메틸아민, N-[1-(2,3-디올레일옥시프로필)]-N,N,N-트리메틸 염화 암모늄, N-[1-(2,3-디테트라데실옥시프로필)]-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 브롬화 암모늄 및 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에틸)카르바모일]콜레스테롤로부터 선택되는 하나 이상의 화합물인 리포솜.
26. 제 20 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 수용성 물질의 지질 유도체, 지방산 유도체 또는 지방족 탄화수소 유도체가 폴리에틸렌 글리콜 포스파티딜에탄올아민인 리포솜.
27. 제 20 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 중성 지질이 난황 포스파티딜콜린인 리포솜.
28. 제 20 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 가 RNA 간섭 (RNAi) 을 이용한 표적 유전자의 발현 억제 작용을 갖는 RNA 인 리포솜.
29. 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자가 종양이나 염증에 관련된 유전자인 리포솜.
30. 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 유전자가 혈관신생에 관련된 유전자인 리포솜.
31. 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 가 KLF5 mRNA 인 리포솜.
32. 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 가 인간 또는 마우스 KLF5 mRNA 인 리포솜.
33. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, RNA 가 KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 동일 또는 상이한 1 내지 6 개의 뉴클레오티드가 동일 또는 상이한 방식으로 부가된 2중 사슬 RNA 인 리포솜.
34. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, RNA 가 KLF5 mRNA 의 15 내지 30 개의 연속 뉴클레오티드로 이루어진 서열을 갖는 RNA 가 그 서열과 상보적인 서열을 갖는 RNA 에 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결되어, 그의 3' 말단에 동일 또는 상이한 1 내지 6 개의 뉴클레오티드가 부가된, 헤어핀 구조를 갖는 RNA 인 리포솜.
35. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, RNA 가 하기 (a) 내지 (c) 로 이루어진 군에서 선택되는 RNA 인 리포솜:

    (a) 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 우리딜산 및 데옥시티미딜산과 관련된 동일 또는 상이한 2 내지 4 원이 동일 또는 상이한 방식으로 부가된 2중 사슬 RNA;

    (b) 서열번호 2 내지 16 중 어느 하나에서 제시되는 서열을 갖는 RNA 가 그 서열과 상보적인 서열을 갖는 RNA 에 2 개의 우리딜산 또는 데옥시티미딜산을 그의 5' 말단에 갖는 스페이서 올리고뉴클레오티드를 통해 연결되어, 그의 3' 말단에 우리딜산 및 데옥시티미딜산과 관련된 동일 또는 상이한 2 내지 4 원이 부가된, 헤어핀 구조를 갖는 RNA; 및

    (c) 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나에서 제시되는 서열의 사슬 및 그 서열과 상보적인 서열의 사슬을 갖는 2중 사슬 RNA 이고, 각각의 사슬의 3' 말단에 2 개의 우리딜산이 부가된 2중 사슬 RNA.
36. 제 20 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 가 bcl2 mRNA 인 리포솜.
37. 제 20 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 리포솜을 포함하는 조성물.

Images