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KR20080106430A - 진정 세균 숙주 세포 내에서의 직교형 번역 성분의 발현을 위한 시스템 - Google Patents

진정 세균 숙주 세포 내에서의 직교형 번역 성분의 발현을 위한 시스템 Download PDF

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KR20080106430A
KR20080106430A KR1020087022447A KR20087022447A KR20080106430A KR 20080106430 A KR20080106430 A KR 20080106430A KR 1020087022447 A KR1020087022447 A KR 1020087022447A KR 20087022447 A KR20087022447 A KR 20087022447A KR 20080106430 A KR20080106430 A KR 20080106430A
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KR
South Korea
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trna
nucleotide sequence
providing
coli
promoter
Prior art date
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Ceased
Application number
KR1020087022447A
Other languages
English (en)
Inventor
영하 류
피터 지 슐츠
Original Assignee
더 스크립스 리서치 인스티튜트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 더 스크립스 리서치 인스티튜트 filed Critical 더 스크립스 리서치 인스티튜트
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 비천연 아미노산(unnatural amino acid)을 포함하는 폴리펩티드의 조성물과 이 폴리펩티드를 생체 내에서 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 유전적으로 프로그래밍된 위치에 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 진정 세균 내에서 효율적으로 발현시키기 위한 플라스미드 시스템을 제공한다.

Description

진정 세균 숙주 세포 내에서의 직교형 번역 성분의 발현을 위한 시스템{SYSTEM FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS}
관련 출원에 대한 상호 참고 문헌
본 출원은 미국 가특허 출원 제60/780,973호(2006년 3월 9일 출원); 미국 가 명세서 특허 출원 제60/783,497호(2006년 3월 17일 출원); 및 미국 가 명세서 특허 출원 제60/855,336호(2006년 10월 29일 출원)의 우선권의 이익을 주장하며, 상기 각각의 참고 문헌의 내용은 모든 목적을 위하여 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다.
미합중국 지원하에서 연구 및 개발된 발명의 권리에 대한 진술
본 발명은 미국 에너지국과의 계약(ER46051)하에서 미국 정부의 지원으로 이루어진 것이다. 미국 정부는 본 발명에 대해 임의의 권리들을 갖는다.
발명의 분야
본 발명은 단백질 화학 분야 예를 들어, 번역 생화학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 하나 이상의 비천연 아미노산(unnatural amino acid)을 포함하는 폴리펩티드의 조성물과 이 폴리펩티드를 생체 내 생산하는 방법에 관한 것이다.
단백질 구조와 기능에 관한 연구는 역사적으로 천연(천연 생성) 아미노산(naturally occurring amino acid)의 R기를 통하여 파악할 수 있는 화학적 특성 연구에 의존하여 왔다. 불행하게도, 세균으로부터 인간에 이르기까지, 알려진 유기체는 모두 동일하게 20개의 아미노산을 암호화한다[단, 셀레노시스테인(예를 들어, Bock외 다수, (1991), Molecular Microbiology 5:515-20) 및 피롤리신(예를 들어, Srinivasan외 다수, (2002), Science 296:1459-62) 포함]. 이와 같이 R기는 한정되어 있으므로, 이것이 단백질 구조와 기능에 관한 연구에 있어서 한계로 작용하였는데, 즉, 이러한 점으로 말미암아 이와 같은 연구는 천연 아미노산의 화학적 특성에 국한될 수밖에 없었다.
신규한 물리 화학적 특성 및 생물학적 특성을 갖는, 화학적으로 다양한 비천연 아미노산을 원핵 생물 유기체 및 진핵 생물 유기체 내에서 단백질에 생체 내 위치 특이적으로 통합하기 위한 일반적인 방법이 개발되었다[Wang외 다수, Science 292, 498-500 (2001); Chin외 다수 Science 301, 964-967 (2003); Wang and Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. 44, 34-66 (2005)]. 이러한 방법은 단백질 번역시 효과적으로 작용하되, 숙주 유기체 내 내인성 tRNA, RS, 아미노산 또는 코돈 중 임의의 것과 교차 반응을 하지는 않는, 각각의 비천연 아미노산에 대한 유일 코돈-tRNA 쌍과 이에 상응하는 아미노아실-tRNA 합성 효소(aaRS 또는 간단히 RS)에 의존적이다[즉, 직교성(orthogonal)임에 틀림없다]. 이와 같은 tRNA-RS 쌍을 이용하면, 구조적으로 다양한 다수의 아미노산 예를 들어, 독특한 화학 반응성을 가지는 아미노산[Wang외 다수, Proc. Natl. Sci. Acad. USA. 100, 56-61 (2003)] 및 광화학 반 응성을 가지는 아미노산[Chin외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 11020-11024 (2002); Wu외 다수, J. Am. Chem. Soc, 126, 14306-14307 (2004)], 글리코실화된 아미노산[Zhang외 다수, Science 303, 371-373 (2004)], 형광성을 가지는 아미노산[Wang and Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. 44:34-66 (2005)], 금속 결합성 아미노산[Wang and Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. 44:34-66 (2005)] 그리고 산화 환원 활성을 가지는 아미노산[Alfonta외 다수, J. Am. Chem. Soc. 125:14662-14663 (2003)]을 유전적으로 암호화할 수 있었다. 하나의 특정 돌연 변이 MjtRNA-Tyr(CUA)-MjTyrRS 쌍은 이. 콜라이(E.coli) 내에서 새로운 아미노산을 암호화하는데 특히 유용하였다[Wang and Schultz, Chem. Biol. 8:883-890 (2001)].
그러나, 비천연 아미노산의 다양한 어레이(array)를 생체 내에서 통합하는 기술을 성공시켰음에도 불구하고, 비천연 아미노산을 함유하는 돌연 변이 단백질을 생산하기 위한 발현 시스템의 효율은 최적화되지 못하였으며, 또한 선택 코돈(selector codon)을 피해갈 수 있는 직교형 시스템의 억제 효율도 떨어질 수 있다. 이에 따라서, 직교형 번역 시스템의 억제 효율을 개선하기 위한 시약을 개발할 필요성이 당 업계에 대두되고 있다. 본원에 개시된 발명은 이하 기술한 바를 살펴보면 알 수 있는 바와 같이, 상기와 같은 한계점과 기타 필요한 사항을 만족시키는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 특정 위치에서 선택 코돈[예를 들어, 앰버 넌센스 코돈(amber nonsense codon)]에 의해 유전적으로 암호화된 비천연 아미노산을 하나 이상 포함하는 돌연 변이 단백질을 세균 내에서 효율적으로 발현하는데 유용한, 개선된 발현 벡터 시스템을 제공한다. 이와 같은 시스템은 진정 세균(예를 들어, 이. 콜라이) 내에서 비천연 아미노산이 단백질에 통합되는 효율을 상당 수준 개선하는 것이다. 본 발명의 특징을 이루는 신규의 발현 벡터는, 다양한 이. 콜라이 발현 벡터 골격 및 이. 콜라이 균주와 광범위하게 혼화될 수 있으며, 또한 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 또는 직교형 억제 tRNA 이외에도, 목적으로 하는 기타 단백질 또는 tRNA를 용이하게 발현시킬 수도 있다.
본 발명에서 이용하고 있는 직교성 번역 기술은 당 업계에 공지되어 있다. 그러나, 본 발명은 사용된 특정 직교형 번역 성분[즉, 특정 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 또는 특정 직교형 억제 tRNA]에 관한 임의의 측면에만 국한되는 것은 아니다. 실제로, 본 발명은 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 또는 억제 tRNA의 발현에만 국한되지 않고, 세균 발현 벡터 시스템 내에서 광범위하게 사용될 수 있는 개선된 조성물과 방법을 제공한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 다양한 핵산 구성체를 제공한다. 이에 관한 구체예로서는 예를 들어, 다음과 같은 것들을 포함한다:
구성체 A: 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 프롤린 tRNA 유전자로부터 유래하는 프로모터(promoter) 및 종결부위(terminator) 뉴클레오티드 서열과 발현 가능한 뉴클레오티드 서열을 가지는 구성체로서, 상기 프로모터 및 종결부위 서열은 둘 다 발현 가능한 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있으며, 상기 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 프로모터와 종결부위 뉴클레오티드 서열에 대해 이종이다.
구성체 B: 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열과 발현 가능한 뉴클레오티드 서열을 가지는 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터인 프로모터 뉴클레오티드 서열을 가지는 구성체로서, 상기 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터 뉴클레오티드 서열은 발현 가능한 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있다.
몇몇 측면에 있어서, 구성체 A와 구성체 B의 특징은 동일한 벡터내에서 이용되며, 이때 발현 가능한 뉴클레오티드 서열들은 상이하다.
구성체 C: 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 구성체로서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다.
구성체 D: 복수개의 tRNA 유전자 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리시스트론 오페론을 가지는 구성체로서, 적어도 하나의 tRNA 유전자는 천연 tRNA 오페론 유래의 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래한 이종성 폴리뉴클레오티드 링커에 의해 적어도 하나의 인접 tRNA 유전자와 분리되어 있다.
몇몇 구체예에서, 구성체 A, B 및 C는 동시에 사용되며, 구성체 A 내에 존재하는 발현 가능 뉴클레오티드 서열은 O-tRNA를 암호화하고, 구성체 B 내에 존재하는 발현 가능 뉴클레오티드 서열은 O-RS를 암호화한다.
이와 같은 구성체의 몇몇 구체예에서, 이. 콜라이 프롤린 tRNA 유전자는 이. 콜라이 proK, proL 및 proM tRNA 유전자로부터 선택된다. 몇몇 구체예에서, 이. 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열은 각각 서열 번호 32(프로모터) 및 서열 번호 33(종결부위)에 제시된 이. 콜라이 proK의 프로모터 및 종결부위로부터 유래한다. 몇몇 구체예에서, 구성체 A 내에 존재하는 발현 가능 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론이다. 몇몇 구체예에서, 구성체 A 내의 발현 가능 뉴클레오티드 서열은 tRNA를 암호화하는데, 예를 들어, tRNA는 하나 이상의 고세균 tRNA로부터 유래하거나, 또는 tRNA는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]에 의해 암호화된다. 몇몇 구체예에서, 발현 가능 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론이다. 몇몇 측면에서, 발현 가능 뉴클레오티드 서열은 다수의 폴리시스트론 오페론이다.
구성체 B가 사용될 때, 발현 가능 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드 예를 들어, 아미노아실-tRNA 합성 효소를 암호화할 수 있다. 몇몇 측면에서, 구성체 B의 발현 가능 뉴클레오티드 서열은 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는데, 여기서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 상응 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 몇몇 측면에서, 상기 O-RS는 메타노코커스 재너쉬(Methanococcus jannaschii) 아미노아실-tRNA 합성 효소 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소로부터 유래한다. 이러한 측면에서, 임의로, 상기 O-RS는, 서열 번호 2에 제시된 야생형 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소(야생형 Mj-tRNA TyrRS)의 아미노산 서열과 비교하여, 286번 아미노산 위치 또는 286번 아미노산 위치와 유사한 아미노산 위치에 아스파르트산에서 아르기닌으로의 치환이 일어난 것이다.
본 발명의 상기와 같은 구성체는 숙주 세포 예를 들어, 진정 세균 숙주 세포 예를 들어, 이. 콜라이 세포 내에서 사용될 수 있다.
구성체 D가 사용될 경우, 폴리시스트론 오페론은 동일한 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 포함할 수 있다. 이와 같은 몇몇 경우에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 2개는 상이하다. 상기 구성체 D의 이와 같은 폴리시스트론 오페론은 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 구성체 D의 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드, 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드, 또는 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드와 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드 둘 다를 포함할 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 valU 및 valX; ileT 및 alaT; serV 및 argV; valV 및 valW; glyT 및 thrT; metT 및 leuW; glnW 및 metU; hisR 및 leuT; glnU 및 glnW; leuP 및 leuV; glnV 및 glnX; alaW 및 alaX; ileU 및 alaU; ileV 및 alaV; metU 및 glnV; glyW 및 cysT; argX 및 hisR; 및 argY 및 argZ로부터 선택되는 내인성 에스케리치아 콜라이 tRNA 유전자 사이에 위치하는 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래할 수 있다. 몇몇 측면에서, 구성체 D의 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열(valU/valX 링커) 또는 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열(ileT/alaT 링커)로부터 유래한다.
다른 측면에서, 본 발명은 특정 위치에, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는, 목적 폴리펩티드의 발현을 위한 번역 시스템을 제공한다. 본 발명의 시스템은 다음과 같은 것들을 함유한다:
(a) 비천연 아미노산;
(b) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체로서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것인 핵산 구성체; 및
(c) 상기 O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하며, 상기 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 폴리뉴클레오티드 내 선택 코돈의 위치는, 상기 폴리뉴클레오티드가 발현되어 폴리펩티드를 생산할 때, 목적 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치를 제어하는 것인 폴리뉴클레오티드.
본 발명의 이와 같은 시스템에 있어서, 핵산 구성체는 다음과 같은 하나 이상의 특징들 중 임의의 것들을 포함할 수 있다:
(1) 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 유전자로부터 유래한 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열로서, 상기 프로모터 및 종결부위 서열은 둘 다 O-tRNA를 포함하거나 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있으며, 여기서, 상기 O-tRNA는 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열에 이종성인 것인 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열;
(2) 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가지는 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터에 상응하는 뉴클레오티드 서열로서, 상기 변형된 이. 콜라이 glnS 뉴클레오티드 서열은 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있는 것인 뉴클레오티드 서열; 또는
(3) O-tRNA 유전자 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론으로서, 적어도 하나의 O-tRNA 유전자는 천연 tRNA 오페론 유래의 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커에 의해 적어도 하나의 인접 O-tRNA 유전자와 분리되어 있는 것인 폴리시스트론 오페론.
이와 같은 시스템에 있어서, 이. 콜라이 프롤린 tRNA 유전자는 이. 콜라이 proK, proL 및 proM tRNA 유전자로부터 선택될 수 있다. 상기 이. 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열은 각각 서열 번호 32(프로모터) 및 서열 번호 33(종결부위)에 제시된 이. 콜라이 proK의 프로모터 및 종결부위 서열로부터 유래할 수 있다. 폴리시스트론 오페론은 동일한 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 포함할 수 있는데, 여기서, 이종성 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 2개는 상이한 것이다. 이와 같은 시스템에 있어서, 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드, 또는 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드, 또는 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드와 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드 둘 다를 포함할 수 있다. 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 valU 및 valX; ileT 및 alaT; serV 및 argV; valV 및 valW; glyT 및 thrT; metT 및 leuW; glnW 및 metU; hisR 및 leuT; glnU 및 glnW; leuP 및 leuV; glnV 및 glnX; alaW 및 alaX; ileU 및 alaU; ileV 및 alaV; metU 및 glnV; glyW 및 cysT; argX 및 hisR; 및 argY 및 argZ로부터 선택되는 내인성 에스케리치아 콜라이 tRNA 유전자 사이에 위치하는 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래할 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열(valU/valX 링커) 또는 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열(ileT/alaT 링커)로부터 유래한다.
이와 같은 시스템에서, O-tRNA는 하나 이상의 고세균 tRNA로부터 유래할 수 있다. 몇몇 측면에 있어서, O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론이다. 몇몇 측면에서, O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 포함한다. 이 시스템에 관한 다른 측면에서, O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론이다.
기타 측면에서, 번역 시스템은 메타노코커스 재너쉬 아미노아실-tRNA 합성 효소 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 O-RS를 이용할 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 O-RS는, 서열 번호 2에 제시된 야생형 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소(야생형 Mj-tRNA TyrRS)의 아미노산 서열과 비교하여, 286번 아미노산 위치 또는 286번 아미노산 위치와 유사한 아미노산 위치에 아스파르트산에서 아르기닌으로의 치환이 일어난 것이다.
이러한 시스템에 관한 몇몇 측면에서, 상기 성분들은 숙주 세포 예를 들어, 진정 세균 숙주 세포 예를 들어, 이. 콜라이 세포 내에 함유되어 있다.
기타 측면에서, 본 발명은 특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는 목적 폴리펩티드를 숙주 세포 내에서 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 다음의 단계들을 포함한다:
(a) (i) 비천연 아미노산; (ii) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체[여기서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화함]; (iii) 상기 O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하며, 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드[여기서, 상기 선택 코돈의 위치는 목적 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치와 서로 관련됨]; 및 (iv) 상기 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(c) 상기 숙주 세포 내에서 폴리펩티드가 번역되는 동안, 폴리펩티드 내 특정 위치에 비천연 아미노산을 통합함으로써, 특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는 목적 폴리펩티드를 생산하는 단계.
이와 같은 방법에 있어서, 상기 O-tRNA는 하나 이상의 고세균 tRNA로부터 유래할 수 있다. 본 방법에 사용된 구성체는 하나 이상의 O-tRNA 종을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론을 이용할 수 있다. 사용된 O-tRNA는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 포함할 수 있거나, 또는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론을 포함할 수 있다. 본 방법의 몇몇 측면에 있어서, 상기 O-RS는 메타노코커스 재너쉬 아미노아실-tRNA 합성 효소 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소로부터 유래할 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 O-RS는, 서열 번호 2에 제시된 야생형 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소(야생형 Mj-tRNA TyrRS)의 아미노산 서열과 비교하여, 286번 아미노산 위치 또는 286번 아미노산 위치와 유사한 아미노산 위치에 아스파르트산에서 아르기닌으로의 치환이 일어난 것이다.
이와 같이 폴리펩티드를 생산하는 방법은 다수의 핵산 구성체를 이용할 수 있는데, 여기서, 상기 구성체는 다음과 같은 성분들 중 임의의 것을 이용할 수 있다.
(I) 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 유전자로부터 유래한 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열로서, 상기 프로모터 및 종결부위 서열은 둘 다 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있으며, 여기서, 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 종결부위 서열에 이종성인 것인 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열;
(II) 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가지는 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터에 상응하는 프로모터 뉴클레오티드 서열로서, 상기 변형된 이. 콜라이 glnS 뉴클레오티드 서열은 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있는 것인 프로모터 뉴클레오티드 서열; 및
(III) O-tRNA 유전자 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론으로서, 적어도 하나의 O-tRNA 유전자는 천연 tRNA 오페론 유래의 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커에 의해 적어도 하나의 인접 O-tRNA 유전자와 분리되어 있는 것인 폴리시스트론 오페론.
(I)이 사용되는 경우, 이. 콜라이 프롤린 tRNA는 이. 콜라이 proK, proL 및 proM tRNA로부터 선택될 수 있다. 이. 콜라이 proK가 사용되는 경우, 서열 번호 32(프로모터) 및 서열 번호 33(종결부위)이 사용될 수 있다.
(III)의 폴리시스트론 오페론이 사용되는 경우, 다수의 동일한 이종성 폴리뉴클레오티드 링커가 사용될 수 있으며, 여기서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 2개는 상이한 것이다. 몇몇 측면에서, (III)의 폴리시스트론 오페론은 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드, 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드, 또는 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드와 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드 둘 다를 사용한다. 뿐만 아니라, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 valU 및 valX; ileT 및 alaT; serV 및 argV; valV 및 valW; glyT 및 thrT; metT 및 leuW; glnW 및 metU; hisR 및 leuT; glnU 및 glnW; leuP 및 leuV; glnV 및 glnX; alaW 및 alaX; ileU 및 alaU; ileV 및 alaV; metU 및 glnV; glyW 및 cysT; argX 및 hisR; 및 argY 및 argZ로부터 선택되는 내인성 에스케리치아 콜라이 tRNA 유전자 사이에 위치하는 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래할 수 있다. 특히, 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열(valU/valX 링커) 또는 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열(ileT/alaT 링커)이 사용될 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 숙주 세포는 진정 세균 숙주 세포, 예를 들어, 에스케리치아 콜라이 숙주 세포이다.
기타 측면에서, 본 발명은 비천연 아미노산을 가지는 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 이와 같은 방법에서는 본 발명의 신규 벡터 시스템을 사용하는데, 이로써, 비천연 아미노산을 함유하는 단백질의 생산성을 개선할 수 있다. 이와 같은 방법에서는 특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는 목적 폴리펩티드를 생산하는 방법은 숙주 세포 내에서 수행될 수 있는데, 이 방법은
(a) (i) 비천연 아미노산;
(ii) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체;
(iii) 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체로서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것인 핵산 구성체;
(iv) O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하며, 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 선택 코돈의 위치는 목적 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치와 서로 관련되어 있는 것인 폴리뉴클레오티드; 및
(v) 상기 (i), (ii), (iii) 및 (iv)를 포함하는 숙주 세포
를 제공하는 단계를 포함한다.
상기 방법은 (ii) 및 (iii)의 핵산 구성체가 다음과 같은 3가지 특징 중 하나 이상을 함께 포함할 것을 요한다:
(I) 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 유전자로부터 유래한 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열로서, 상기 프로모터 및 종결부위 서열은 둘 다 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있으며, 여기서, 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 프로모터 및 종결부위 서열에 이종성인 것인 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열;
(II) 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가지는 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터에 상응하는 프로모터 뉴클레오티드 서열로서, 상기 변형된 이. 콜라이 glnS 뉴클레오티드 서열은 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있는 것인 프로모터 뉴클레오티드 서열; 및
(III) O-tRNA 유전자 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론으로서, 적어도 하나의 O-tRNA 유전자는 천연 tRNA 오페론 유래의 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커에 의해 적어도 하나의 인접 O-tRNA 유전자와 분리되어 있는 것인 폴리시스트론 오페론.
상기 방법은 (b) 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 숙주 세포 내에서 폴리펩티드가 번역되는 동안, 폴리펩티드 내 특정 위치에 비천연 아미노산을 통합함으로써, 특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는 목적 폴리펩티드를 생산하는 단계에 의해 이루어진다.
임의로, O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 고세균 tRNA로부터 유래한다. 상기 O-tRNA는 하나 이상의 O-tRNA 종을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론 내에 제공될 수 있다. 몇몇 측면에서, 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 포함한다. 폴리시스트론 오페론은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)] 복수개를 이용할 수도 있다.
다른 측면에서, O-RS는 메타노코커스 재너쉬 아미노아실-tRNA 합성 효소 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 것이다. 임의로, 상기 O-RS는, 서열 번호 2에 제시된 야생형 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소(야생형 Mj-tRNA TyrRS)의 아미노산 서열과 비교하여, 286번 아미노산 위치 또는 286번 아미노산 위치와 유사한 아미노산 위치에 아스파르트산에서 아르기닌으로의 치환이 일어난 것이다.
상기 방법에 관한 기타 구체예에서, (I)의 핵산 구성체는 이. 콜라이 proK, proL 및 proM tRNA로부터 선택되는 이. 콜라이 프롤린 tRNA를 포함한다. 뿐만 아니라, (I)의 구성체는 서열 번호 32(프로모터) 및 서열 번호 33(종결부위)에 제공된 이. 콜라이 proK의 프로모터 및 종결부위 서열을 이용할 수 있다.
상기 방법에 관한 기타 구체예에서, (III)의 핵산 구성체는 동일한 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 다수 이용한다. 임의로, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 2개는 상이한 것이다.
임의로, 본 방법에 있어서 (III)의 폴리시스트론 오페론은 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드, 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드, 또는 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드와 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드 둘 다를 포함하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 사용한다. 본원에 사용된 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 valU 및 valX; ileT 및 alaT; serV 및 argV; valV 및 valW; glyT 및 thrT; metT 및 leuW; glnW 및 metU; hisR 및 leuT; glnU 및 glnW; leuP 및 leuV; glnV 및 glnX; alaW 및 alaX; ileU 및 alaU; ileV 및 alaV; metU 및 glnV; glyW 및 cysT; argX 및 hisR; 및 argY 및 argZ로부터 선택되는 내인성 에스케리치아 콜라이 tRNA 유전자 사이에 위치하는 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래할 수 있다. 예를 들어, 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열(valU/valX 링커) 또는 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열(ileT/alaT 링커)로부터 유래할 수 있다. 임의로 상기 방법들은 진정 세균 숙주 세포, 예를 들어, 에스케리치아 콜라이에서 행해진다.
다른 측면에서, 본 발명은 또한 특정 위치에 하나 이상의 비천연 아미노산을 가지는 목적 폴리펩티드를 발현시키기 위한 번역 시스템을 제공한다. 본질적으로, 이 시스템은 다음과 같은 것들을 포함한다:
(a) 비천연 아미노산;
(b) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체로서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것인 핵산 구성체; 및
(c) 상기 O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하며, 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 이 폴리뉴클레오티드 내 선택 코돈의 위치는, 폴리뉴클레오티드가 발현되어 폴리펩티드를 생산할 때, 목적 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치를 제어하는 것인 폴리뉴클레오티드.
임의로, 이러한 시스템 성분들은 숙주 세포 내에 통합된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 특정 위치에 비천연 아미노산을 가지는 목적 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 본질적으로, 이와 같은 방법은 다음의 단계들을 이용한다:
(a) (i) 비천연 아미노산;
(ii) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체로서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것인 핵산 구성체;
(iii) O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하며, 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 선택 코돈의 위치는 목적 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치와 서로 관련되어 있는 것인 폴리뉴클레오티드; 그리고
(iv) 상기 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 숙주 세포
를 포함하는 번역 시스템을 제공하는 단계.
이와 같은 방법들은 (b) 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 (c) 상기 숙주 세포 내에서 폴리펩티드가 번역되는 동안, 폴리펩티드 내 특정 위치에 비천연 아미노산을 통합함으로써, 특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는 목적 폴리펩티드를 생산하는 단계를 추가로 포함한다.
정의
본 발명을 상세히 설명하기에 앞서서, 본 발명은 다양할 수 있는 특정 생물 시스템에 국한되는 것은 아님을 이해해야 할 것이다. 뿐만 아니라, 본원에 사용된 용어는 특정 구체예를 설명하기 위한 목적으로만 사용된 것이지, 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아님도 이해해야 할 것이다. 본 발명의 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 단수형 "하나", "하나의" 그리고 "상기"라는 용어는 달리 특정하지 않는 한, 복수를 나타내는 의미도 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "하나의 세포"에는 2개 이상의 세포들의 집합을 포함하는 것이며; "하나의 폴리뉴클레오티드"라는 용어에도 폴리뉴클레오티드 자체와 이 폴리뉴클레오티드의 다수의 복사체가 포함된다.
본원 및 이하 본원의 명세서 중 나머지 부분에 정의되어 있지 않더라도, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 발명이 속한 업계의 당 업자에 의해 일반적으로 이해되는 용어와 동일한 의미를 보유한다. 본 발명을 기술하고 한정함에 있어서, 다음과 같은 용어는 이하에 제시된 정의에 따라서 사용될 것이다.
직교형(직교성): 본원에 사용된 "직교형(직교성)(orthogonal)"이란 용어는, 어떤 분자가, 세포 또는 번역 시스템에 대해 내인성인 분자에 비하여, 효율이 떨어지는 내인성 세포 성분과 함께 작용하거나, 또는 세포의 내인성 성분과 함께 작용하지 못하는 경우[예를 들어, 직교형 tRNA(O-tRNA) 및/또는 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)]를 의미한다. tRNA와 아미노아실-tRNA 합성 효소와 관련하여, 직교형이라 함은, 내인성 tRNA 합성 효소와 함께 작용하는 내인성 tRNA의 효율에 비하여, 내인성 tRNA 합성 효소와 함께 작용하는 직교형 tRNA의 효율이 떨어지거나[예를 들어, 효율이 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만], 또는 작용성이 없는(inability) 경우, 또는 내인성 tRNA와 함께 작용하는 내인성 tRNA 합성 효소의 효율에 비하여, 내인성 tRNA와 함께 작용하는 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소의 효율이 떨어지거나[예를 들어, 효율이 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 또는 1% 미만], 또는 작용성이 없는 경우를 의미한다. 직교형 분자는 세포 내 기능이 정상인 내인성 상보 분자를 보유하지 않는다. 예를 들어, 세포 내 직교형 tRNA는, 내인성 RS에 의해 내인성 tRNA가 아미노아실화되는 경우에 비하여, 효율이 감소하였거나 또는 0인, 세포 내 임의의 내인성 RS에 의해 아미노아실화된다. 다른 예에 있어서, 직교형 RS는, 내인성 RS에 의해 내인성 tRNA가 아미노아실화되는 경우에 비하여, 효율이 감소하였거나 또는 0인, 목적 세포 내 임의의 내인성 tRNA를 아미노아실화한다. 제1의 직교형 분자와 함께 작용하는 제2의 직교형 분자가 세포에 도입될 수 있다. 예를 들어, 직교형 tRNA/RS 쌍은, 대조군 쌍 예를 들어, 상응하는 tRNA/RS 내인성 쌍, 또는 활성 직교형 쌍(예를 들어, 티로실 직교형 tRNA/RS 쌍)에 비하여, 일정한 효율(예를 들어, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 효율)로 세포 내에서 함께 작용하는 상보성 성분들이 도입되어 있다.
직교형 티로실-tRNA: 본원에 사용된 직교형 티로실-tRNA(티로실-O-tRNA)는 목적 번역 시스템에 대해 직교성인 tRNA로서, 상기 tRNA는 (1) 천연 티로실-tRNA와 동일하거나 실질적으로 유사하며; (2) 자연 돌연 변이 또는 인공 돌연 변이 유발법에 의해 천연 티로실-tRNA로부터 유래하고; (3) 상기 (1) 또는 (2)의 야생형 서열 또는 돌연 변이 티로실-tRNA 서열을 사용하는 임의의 방법에 의해 유래하며; (4) 야생형 또는 돌연 변이 티로실-tRNA에 상동성이고; (5) 티로실-tRNA 합성 효소 예를 들어, 서열 번호 2, 4, 6, 8 또는 10의 합성 효소에 대한 기질로서 지정된 임의의 예시적인 tRNA에 상동성이며; (6) 예를 들어, 서열 번호 1의 O-tRNA 내 티로실-tRNA 합성 효소에 대한 기질로서 지정된 임의의 예시적인 tRNA의 보존적 변이체이다. 티로실-tRNA는 아미노산이 하전된 상태 또는 하전되지 않은 상태로서 존재할 수 있다. 또한, "티로실-O-tRNA"는 동족 합성 효소에 의하여 티로신 또는 루신 이외의 아미노산 예를 들어, 비천연 아미노산으로 하전된다(아미노아실화된다). 실제로, 본 발명의 티로실-O-tRNA는 번역 중 선택 코돈에 대응하여, 연장되고 있는 폴리펩티드에 본질적으로 임의의 아미노산(천연 아미노산 또는 인공적인 아미노산)을 삽입하는데 사용되는 것이 유리하다는 것도 이해할 것이다.
직교형 티로실 아미노산 합성 효소: 본원에 사용된 직교형 티로실 아미노산 합성 효소(티로실-O-RS)는 목적 번역 시스템 내 아미노산을 보유하는 티로실-O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 효소이다. 티로실-O-RS가 티로실-O-tRNA 상에 하전시키는 아미노산은 임의의 아미노산(천연 아미노산, 비천연 아미노산 또는 인공적 아미노산)일 수 있으며, 또한 본원에서 한정되는 것은 아니다. 상기 합성 효소는 임의로 천연 티로실 아미노산 합성 효소와 동일하거나 또는 이에 상동성이거나, 또는 예를 들어, 서열 번호 4, 6, 8 또는 10 내에 O-RS로서 지정된 합성 효소와 동일하거나 또는 이에 상동성이다. 예를 들어, 상기 O-RS는 예를 들어, 서열 번호 4, 6, 8 또는 10의 티로실-O-RS의 보존적 변이체일 수 있으며/있거나, 예를 들어, 서열 번호 4, 6, 8 또는 10의 O-RS의 서열과 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상 동일할 수 있다.
동족(Cognate): "동족의"라는 용어는 함께 작용하는 성분들 예를 들어, 직교형 tRNA와 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소를 의미한다. 상기 성분들은 또한 상보성인 것이라 칭하여질 수도 있다.
우선적으로 아미노아실화하다: 본원의 직교형 번역 시스템에 있어서, O-RS가 발현 시스템 내 임의의 내인성 tRNA를 하전시킬 때보다 더 효율적으로, 아미노산으로 O-tRNA를 하전시킬 때, 이 O-RS는 동족 O-tRNA를 "우선적으로 아미노아실화"하는 것이다. 즉, O-tRNA와 임의의 내인성 tRNA가 거의 균등한 몰비로 번역 시스템에 존재할 때, O-RS는 그것이 내인성 tRNA를 하전할 때보다 더욱 빈번하게 O-tRNA를 하전할 것이다. O-RS에 의하여 하전된 O-tRNA : O-RS에 의해 하전된 내인성 tRNA의 상대적 비율은 높은 것이 바람직하며, 그 결과, O-tRNA와 내인성 tRNA가 번역 시스템 내에 균등한 몰 농도로 존재할 때, 상기 O-RS는 O-tRNA를 독점적으로 또는 거의 독점적으로 하전시킨다. O-tRNA와 O-RS가 균등한 몰 농도로 존재할 때, O-RS에 의해 하전된 내인성 tRNA와 O-tRNA 사이의 상대적 비율은 1:1 이상, 바람직하게는 약 2:1 이상, 더욱 바람직하게는 5:1, 더욱 바람직하게는 10:1, 더욱 바람직하게는 20:1, 더욱 바람직하게는 50:1, 더욱 바람직하게는 75:1, 더욱 바람직하게는 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 5,000:1 또는 그 이상이다.
(a) O-RS가 내인성 tRNA 보다는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하고, (b) 이와 같은 아미노아실화가, 임의의 천연 아미노산을 가지는 O-RS에 의한 O-tRNA의 아미노아실화에 비하여, 비천연 아미노산에 특이적인 경우, 상기 O-RS는 "비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는" 것이다. 즉, 비천연 아미노산과 천연 아미노산이 O-RS와 O-tRNA를 포함하는 번역 시스템 내에 균등한 몰량으로 존재할 때, 상기 O-RS는 천연 아미노산을 가지는 O-tRNA보다 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 더욱 빈번하게 하전시킬 것이다. 바람직하게, 천연 아미노산이 하전된 O-tRNA에 대한 비천연 아미노산이 하전된 O-tRNA의 상대적 비율은 높다. 더욱 바람직하게, O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 독점적으로 또는 거의 독점적으로 하전시킨다. 천연 아미노산과 비천연 아미노산 둘 다가 번역 시스템 내에 균등한 몰 농도로 존재할 때, 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA의 하전 량과 천연 아미노산을 가지는 O-tRNA의 하전 량 사이의 상대적 비율은 1:1 이상, 바람직하게는 약 2:1 이상, 더욱 바람직하게는 5:1, 더욱 바람직하게는 10:1, 더욱 바람직하게는 20:1, 더욱 바람직하게는 50:1, 더욱 바람직하게는 75:1, 더욱 바람직하게는 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 5,000:1 또는 그 이상이다.
선택 코돈(selector codon): "선택 코돈"이란 용어는, 번역 과정에서 내인성 tRNA에 의해 인식되지 않고 O-tRNA에 의해 인식되는 코돈을 의미한다. O-tRNA 안티코돈 루프는 mRNA상에 있는 선택 코돈을 인식하며, 그것의 아미노산 예를 들어, 비천연 아미노산을 폴리펩티드 내 선택 코돈 위치에 통합시킨다. 선택 코돈으로서는 예를 들어, 넌센스 코돈(nonsense codon), 예를 들어, 종결 코돈 예를 들어, 앰버(amber), 오커(ochre) 및 오팔(opal) 코돈; 4 염기 이상의 염기로 이루어진 코돈; 희귀 코돈(rare codon); 천연 염기 쌍 또는 인위적 염기 쌍으로부터 유래하는 코돈 등을 포함할 수 있다.
억제 tRNA(suppressor tRNA): 억제 tRNA는 예를 들어, 선택 코돈에 대응하여 아미노산을 폴리펩티드 사슬에 통합하는 기작을 제공함으로써, 소정의 번역 시스템 내에서 메신저 RNA(mRNA)의 해독을 변경시키는 tRNA이다. 예를 들어, 억제 tRNA는 예를 들어, 종결 코돈(예를 들어, 앰버, 오커 또는 오팔 코돈), 4염기 코돈 및 희귀 코돈 등을 통독(read-through)할 수 있다.
억제 활성(suppression activity): 본원에 사용된 "억제 활성"이란 용어는, 일반적으로, tRNA(예를 들어, 억제 tRNA)가 번역 종결 또는 번역 오류(예를 들어, 틀-이동)를 유발하는 코돈(예를 들어, 앰버 코돈 또는 4 염기 이상의 염기로 이루어진 코돈인 선택 코돈)을 번역시 통독할 수 있도록 만드는 능력을 의미하는 것이다. 억제 tRNA의 억제 활성은 제2의 억제 tRNA, 또는 대조군 시스템 예를 들어, O-RS가 결여된 대조군 시스템에 비한, 번역 통독 관측 활성의 %로서 표현될 수 있다.
본 발명은 억제 활성을 정량할 수 있는 다양한 방법을 제공한다. 목적으로 하는 선택 코돈(예를 들어, 앰버 코돈)에 대한 특정 O-tRNA 및 O-RS의 억제율(%)이란, 목적으로 하는 번역 시스템이 양성 대조군 구성체와는 달리, O-RS 및 O-tRNA를 포함하고, 양성 대조군에 O-tRNA, O-RS 및 선택 코돈이 결여되어 있는 경우, 목적으로 하는 번역 시스템 내 발현된 테스트 마커를 암호화하는 핵산 내 선택 코돈을 포함하는 소정의 발현된 테스트 마커(예를 들어, LacZ)의 활성의 %를 의미하는 것이다. 그러므로, 예를 들어, 선택 코돈이 결여된 활성 양성 대조군 마커 구성체가 소정의 번역 시스템 내에서 X의 관측 활성을, 상기 마커 검정 결과에 상대적인 단위로서 나타내면, 선택 코돈을 포함하는 테스트 구성체의 억제율(%)은, O-tRNA와 O-RS를 포함하는 번역 시스템 내에서 테스트 마커 구성체가 발현되는 경우를 제외하고, 양성 대조군 마커가 발현되는 조건과 동일한 환경 조건 하에서 테스트 마커 구성체가 나타내는 X%이다. 통상적으로, 테스트 마커를 발현하는 번역 시스템은 또한 O-RS 및 O-tRNA에 의해 인식되는 아미노산을 포함한다. 임의로, 억제율(%)의 측정 결과는, 테스트 마커와 동일한 선택 코돈을 포함하되, O-tRNA, O-RS 및/또는 이 O-tRNA 및/또는 O-RS에 의해 인식되는 관련 아미노산은 포함하지 않는, "백그라운드" 또는 "음성" 대조군 마커 구성체와 테스트 마커를 비교함으로써 재정립될 수 있다. 상기 음성 대조군은 목적 번역 시스템 내 마커로부터 발생하는 백그라운드 신호 효과를 설명해주는 억제율(%) 측정 결과를 정규화하는데 유용하다.
억제 효율은 당 업계에 공지된 임의의 수의 검정법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, β-갈락토시다제 리포터 검정법이 사용될 수 있는데, 예를 들어, 유도체화된 lacZ 플라스미드(lacZ 핵산 서열 내 선택 코돈을 가지는 구성체)는 본 발명의 O-tRNA를 포함하는 플라스미드와 함께, 적당한 유기체(예를 들어, 직교형 성분이 사용될 수 있는 유기체)의 세포에 도입된다. 동족 합성 효소도 또한 도입될 수 있다[발현 시 동족 합성 효소를 암호화하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로서 도입될 수 있다]. 세포는 배지 중에서 원하는 밀도 예를 들어, OD600 약 0.5가 될 때까지 배양하며, β-갈락토시다제 검정법은 예를 들어, 베타플루어(BetaFluor)™ β-갈락토시다제 검정 키트(Novagen)를 이용하여 수행한다. 억제율(%)은, 구성체가 원하는 위치에 선택 코돈보다는 상응하는 센스 코돈을 가지는 경우, 비교 가능한 대조군에 상대적인 시료의 활성(%), 예를 들어, 유도체화된 lacZ 구성체로부터 측정되는 값으로서 계산될 수 있다.
번역 시스템: "번역 시스템"이란 용어는, 연장되고 있는 폴리펩티드 사슬(단백질)에 아미노산을 통합하는 성분을 의미한다. 번역 시스템 성분으로서는 예를 들어, 리보좀, tRNA, 합성 효소 및 mRNA 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 O-tRNA 및/또는 O-RS는 시험관 내 또는 생체 내 번역 시스템 예를 들어, 비-진핵 생물 세포 예를 들어, 진정 세균(예를 들어, 이. 콜라이) 또는 진핵 생물 세포 예를 들어, 효모 세포, 포유동물 세포, 식물 세포, 조류 세포, 진균 세포, 곤충 세포 등에 부가될 수 있거나 또는 이의 일부가 될 수 있다.
비천연 아미노산: 본원에 사용된 바와 같이 "비천연 아미노산"이란 용어는, 20개의 일반적인 천연 아미노산 또는 셀레노 시스테인 또는 피롤리신 중 하나가 아닌, 임의의 아미노산, 변형된 아미노산 및/또는 아미노산 유사체를 의미한다. 예를 들어, 비천연 아미노산 p-벤조일-L-페닐알라닌(Bpa), 파라-아세틸-L-페닐알라닌(pAcPhe), 파라-아지도-L-페닐알라닌(pAzPhe) 및 파라-요오도-L-페닐알라닌(pIPhe)이 본 발명에 사용된다.
∼에 대응하여(in response to): 본원에 사용된 "∼에 대응하여"란 용어는, 본 발명의 O-tRNA가 선택 코돈을 인식하고, 연장되고 있는 폴리펩티드 사슬에 tRNA와 결합된 비천연 아미노산이 통합되는 것을 매개하는 과정을 의미한다.
폴리펩티드: 폴리펩티드는 임의의 길이를 가지며, 통상적으로(절대적인 것은 아님) 공유 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산(천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 또는 이의 조합체)으로 이루어진 임의의 올리고머이다. 폴리펩티드는 임의의 공급원으로부터 유래한 것일 수 있는데, 예를 들어, 천연 폴리펩티드, 재조합 분자 유전학적 기술에 의해 생산된 폴리펩티드, 세포 또는 번역 시스템으로부터 유래하는 폴리펩티드, 또는 무세포(cell-free) 합성 수단에 의해 생산된 폴리펩티드일 수 있다. 폴리펩티드는 그것을 이루고 있는 아미노산 서열 예를 들어, 그것을 구성하는 아미노산의 1차 구조에 의해 특징 지워진다. 본원에 사용된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 전장 서열에 국한되지 않고, 일부 서열 또는 완전 서열일 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드는 임의의 특정 생물 활성을 가지거나 가지지 않는 것에 의해 한정되지 않는다. 본원에 사용된 "단백질"이란 용어는, 폴리펩티드와 동의어이다. "펩티드"라는 용어는 소형 폴리펩티드 예를 들어, 길이가 2∼25 아미노산인 폴리펩티드를 의미한다.
보존적 변이체: 본원에 사용된 번역 성분과 관련된 내용에 있어서 "보존적 변이체"란 용어는, 참고 O-tRNA 또는 O-RS와 비교하여, 서열 내 변이가 일어난 성분 예를 들어, O-tRNA 또는 O-RS와 유사한 보존적 변이체인 염기 성분과 기능상 유사하게 작용하는, 번역 성분 예를 들어, 보존적 변이체 O-tRNA 또는 보존적 변이체 O-RS를 의미한다. 예를 들어, O-RS 또는 이 O-RS의 보존적 변이체는 비천연 아미노산 예를 들어, N-아세틸갈락토사민 부를 포함하는 아미노산을 가지는 동족 O-tRNA를 아미노아실화할 것이다. 이와 같은 예에서, O-RS와 보존적 변이체 O-RS는 동일한 아미노산 서열을 가지지 않는다. 보존적 변이체는, 이 보존적 변이체가 상응하는 O-tRNA 또는 O-RS에 상보성인 한, 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 5개 이상의 서열 변이를 가질 수 있다.
몇몇 구체예에서, 보존적 변이체 O-RS는 그것의 원래 O-RS과 비교하여, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 보존적 변이체 O-RS는, 그것의 원래 O-RS와 비교하여, 하나 이상의 보존적 아미노산 치환을 포함하며, 또한, O-RS 생물 활성을 보유하는 것으로서; 예를 들어, 이 O-RS가 유래한 모 O-RS 분자 생물 활성의 10% 이상, 또는 20% 이상, 30% 이상 또는 40% 이상을 보유하는 보존적 변이체 O-RS이다. 몇몇 바람직한 구체예에서, 보존적 변이체 O-RS의 활성은 그것이 유래한 모 O-RS 분자 생물 활성의 50% 이상이다. 보존적 변이체 O-RS의 보존적 아미노산 치환은 O-RS의 임의의 도메인 예를 들어, 아미노산 결합 포켓(amino acid binding pocket) 내에서 일어날 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 핵산: "핵산", "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열", "올리고뉴클레오티드", "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자" 또는 본원에 사용된 이것과 유사한 용어들은, 통상적으로 당-인산염 골격에 의해 결합된 염기의 올리고머 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 그리고 이의 단편 또는 일부, 그리고 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미하며, 또한 센스 또는 안티센스 사슬을 나타내기도 한다. 상기 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드라는 용어는 또한 구체적으로, 생물학적으로 생성되는 5개의 염기(즉, 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의 염기로 이루어진 핵산을 포함하며, 또한 비-천연 골격의 구조를 가지는 핵산 예를 들어, PNA 분자를 포함하기도 한다.
핵산 분자(예를 들어, DNA 또는 RNA)는 "5' 말단"과 "3' 말단"을 가지는 것으로 알려져 있는데, 그 이유는, 모노뉴클레오티드가 반응하여, 포스포디에스테르 결합을 통해 하나의 모노뉴클레오티드의 5탄당 고리의 5' 인산염이 이 모노뉴클레오티드에 인접하는 3' 산소와 결합하는 방식으로, 한 방향으로 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 생산하기 때문이다. 그러므로, 폴리뉴클레오티드는 통상적으로 5' 인산염을 포함하는 하나의 "5' 말단부"와, 3' 산소를 포함하는 하나의 "3' 말단부"를 가질 것이다. 폴리뉴클레오티드 서열은, 설사 그것이 대형 핵산의 내부에 존재할지라도, 5' 및 3' 배향을 가진다고 할 수 있다. 선형 또는 환형 DNA 분자에 있어서, 구체적인 요소들을 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5' 요소라고 칭한다. 이와 같은 용어는, 전사가 DNA 사슬을 따라서 5'→3' 방식으로 진행된다는 사실을 말해준다.
유전자: 본원에 사용된 "유전자"란 용어는 가장 일반적으로, 원래의 또는 재조합된 방식으로 작동 가능하도록 연결할 때, 몇몇 생산물 또는 기능을 제공하는 폴리뉴클레오티드 요소의 조합을 의미한다. "유전자"란 용어는, 본원에서는 광의로 해석되므로, 유전자의 mRNA, cDNA, cRNA 및 게놈 DNA 형태들을 포함한다. 몇몇 경우에 있어서, 유전자는 유전될 수 있는 것이다. 몇몇 측면에서, 유전자는 폴리펩티드를 생산하는데 필요한 암호화 서열(예를 들어, "개방 해독 틀" 또는 "암호화 영역")을 포함하며, 다른 측면에서, 유전자는 폴리펩티드를 암호화하지 않는다. 폴리펩티드를 암호화하지 않는 유전자의 예로서는 리보좀 RNA 유전자(rRNA)와 운반 RNA(tRNA) 유전자를 포함한다.
"유전자"란 용어는, 임의로 유전자 위치에 존재하는 비-암호화 조절 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 핵산의 암호화 영역 이외에도, "유전자"라는 용어는, 암호화 영역의 5 말단 및 3' 말단에 인접한 전장 mRNA의 전사된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이와 같은 비 암호화 영역은 크기가 다양하며, 통상적으로는 암호화 영역의 5' 말단 및 3' 말단 둘 다에 일정 부위에 걸쳐 존재하고 있다. 암호화 영역의 5' 말단 및 3' 말단에 위치하고, mRNA 상에 함유되어 있는 서열을 5' 및 3' 비-번역 서열(5'UT 및 3' UT)이라고 부른다. 상기 5' UT 및 3' UT 둘 다는 조절 기능을 수행할 수 있는데, 예를 들어, 번역을 개시한다든지, 전사 후 절단을 수행한다든지, 또는 폴리아데닐화를 수행한다든지 할 수 있다. "유전자"라는 용어로서는 mRNA, cDNA 및 유전자의 게놈 형을 포함한다.
몇몇 측면에서, 유전자의 게놈 형 또는 게놈 클론은 전사된 mRNA의 서열과, 전사체의 외부에 존재하는 기타 비-전사 서열을 포함한다. mRNA 전사 단위 외부에 존재하는 조절 영역을 때로는 "5' 또는 3' 측접 서열"이라고 부른다. 유전자의 기능성 게놈 형은 통상적으로 전사를 조절하는데 필요한 조절 요소를 함유한다. 예를 들어, "프로모터"라는 용어는, 일반적으로 DNA 영역, 통상적으로는(절대적인 것은 아님) 전사를 정확하게 개시하는데 충분한 전사 개시 위치의 5' 말단부를 나타내는데 사용된다. 몇몇 구체예에서, 프로모터는 구성적으로 활성인 반면에, 대안 구체예에서, 상기 프로모터는 조건부로 활성을 나타내기도 한다(예를 들어, 임의의 생리 조건 하에 있을 때에만 전사가 개시됨). 원핵 생물에 있어서, 프로모터의 활성은 인접한 "작동 인자" 서열에 의해서 조정될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 3' 측접 영역은 전사 종결을 조절하는 부가의 서열(때때로 "종결부위" 서열이라고 부름)을 함유한다. 일반적으로, "조절 요소"라는 용어는, 핵산 서열의 발현에 관한 몇몇 측면을 조절하는 임의의 유전적 요소를 의미한다.
발현 가능 뉴클레오티드 서열: 본원에 사용된 "발현 가능 뉴클레오티드 서열"이란 용어는, 전사되어(예를 들어, DNA-의존성 RNA 중합 효소에 의해 전사되어) 전사체를 생산할 수 있는 임의의 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것이다. 상기 전사체 서열은 제한되어 있지 않은데, 단백질-암호화 서열(예를 들어, 아미노아실-tRNA 합성 효소를 암호화할 수 있는 서열) 또는 비-단백질 암호화 서열(예를 들어, tRNA 분자를 암호화할 수 있는 서열)일 수 있다.
작동 가능하도록 연결된: 본원에 사용된 "작동 가능하도록 조합하여", "작동 가능한 순서로", "작동 가능하도록 연결된", "작동 가능하도록 결합된" 및 이와 유사한 어구는, 핵산과 관련하여 사용될 때, 각각 가능상 관련성이 있도록 배치된 핵산 서열의 결합을 의미하는 것이다. 예를 들어, 작동 가능하도록 연결된 프로모터 서열, 개방 해독 틀 및 종결부위 서열은 RNA 분자를 정확하게 생산할 수 있다. 몇몇 측면에서, 작동 가능하도록 연결된 핵산 요소는 개방 해독 틀을 전사시켜, 궁극적으로는 폴리펩티드를 생산하게 된다(즉, 개방 해독 틀이 발현됨).
오페론: 본원에 사용된 "오페론"이라는 용어는, 원핵 생물에서 유전자 발현을 조절하는 유전 단위(예를 들어, 염색체 영역)를 의미한다. 오페론은 통상적으로 하나 이상의 폴리펩티드(들) 또는 RNA(들)를 암호화하는 하나 이상의 유전자와, 유전자의 전사를 조절하는 인접 조절 영역(또는 영역들)을 포함한다. 조절 영역은 통상적으로 프로모터와 작동 인자를 포함한다. 원핵 생물 유전자의 암호화 영역을 예전부터 "시스트론"이라 칭하여 왔다. 다수의 시스트론들을 함유하는 오페론을 "폴리시스트론"이라 부른다. 폴리시스트론 오페론 내 유전자들은 통상적으로 기능상 서로 연관되어 있으며, 통상적으로 하나의 단위로서 함께 전사될 뿐만 아니라, 연합 방식으로 발현된다.
구성체: 본원에 사용된 "구성체"란 용어는, 핵산 절편(들)을 세포에 운반할 수 있는 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 기타 분자를 의미한다. "벡터" 또는 "비이클(vehicle)"이란 용어는 때때로 "벡터"와 호환되어 사용된다. 벡터는 임의로 벡터의 증식과 조작을 매개하는 부분(예를 들어, 복제에 필요한 서열, 약물 또는 항생제 내성을 부여하는 유전자, 다중 클로닝 위치(multiple cloning site), 클로닝된 유전자를 발현시킬 수 있도록 작동 가능한 형태로 결합된 프로모터/인핸서 요소 등)을 포함한다. 벡터는 종종 플라스미드, 박테리오파지 또는 식물이나 동물 바이러스로부터 유래한다. "클로닝 벡터" 또는 "셔틀 벡터" 또는 "서브 클로닝 벡터"는 서브 클로닝 단계를 촉진하는 부분(예를 들어, 다수의 제한 엔도뉴클레아제 위치를 함유하는 다중 클로닝 위치)이 작동 가능하도록 연결되어 있다.
발현 벡터: 본원에 사용된 "발현 벡터"라는 용어는, 특정 숙주 유기체 내에서 암호화 서열의 발현을 촉진하는 폴리뉴클레오티드 서열이 작동 가능하도록 연결되어 있는 재조합 벡터(예를 들어, 세균 발현 벡터)를 의미한다. 원핵 생물 내 발현을 촉진하는 폴리뉴클레오티드 서열은 통상적으로 프로모터, 전사 종결 서열 즉, 종결부위 서열, 작동 인자(임의적), 그리고 리보좀 결합 위치를, 종종 다른 서열들과 함께 포함한다.
암호화하다: 본원에 사용된 "암호화하다"라는 용어는, 중합체 거대 분자 또는 일련의 서열 내 정보가, 제1 분자 또는 일련의 서열과 상이한 제2 분자 또는 일련의 서열을 생산하는데 사용되는 임의의 과정을 의미한다. 본원에 있어서, 상기 용어는 광의로 사용되고 있으며, 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 몇몇 측면에서, "암호화하다"라는 용어는, 반 보존적 DNA 복제 과정 즉, 이중 가닥 DNA 분자 중 하나의 사슬이 DNA-의존적 DNA 중합 효소에 의해 새로이 합성되는 상보성 자매 사슬을 암호화하는 주형으로서 사용되는 과정을 나타내는 것이기도 하다.
다른 측면에서, 상기 "암호화하다"라는 용어는, 하나의 분자 내 정보가, 제1 분자와 화학적 성질이 상이한 제2 분자를 생산하는데 사용되는 임의의 과정을 의미한다. 예를 들어, DNA 분자는 (예를 들어, DNA-의존적 RNA 중합 효소를 통합하는 전사 과정에 의해서) RNA 분자를 암호화할 수 있다. 뿐만 아니라, RNA 분자는 번역 과정을 통하여 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 번역 과정을 기술하는데 사용될 경우, 상기 "암호화하다"라는 용어는 또한 아미노산을 암호화하는 3중 코돈으로까지 그 대상이 확대된다. 몇몇 측면에서, RNA 분자는 예를 들어, RNA-의존적 DNA 중합 효소를 통합하는 역전사 과정에 의해 DNA 분자를 암호화할 수 있다. 다른 측면에서, DNA 분자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있으므로, 이 경우에 사용된 "암호화하다"라는 용어는 전사 및 번역 과정 둘 다를 포함하는 의미임을 이해해야 할 것이다.
이종성: 본원에서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 사용된 "이종(heterologous)" 또는 "외인성(exogenous)"이라는 용어는, 분자가, 재배열되었거나 인공적으로 생물 시스템에 공급되며, 원래의 형태로는 존재하지 않거나(예를 들어, 서열의 경우, 게놈상의 위치 또는 부분이 재배열되었거나) 또는 특정 생물 시스템에 원래 존재하지 않았던 경우를 의미한다. 상기 용어는, 천연 공급원 이외의 공급원으로부터 기원한 관련 물질을 나타내거나, 또는 부분들의 비-천연 형태, 유전자상 위치 또는 부분들이 재배열된 상태를 가지는 분자를 의미하기도 한다. "외인성" 및 "이종"이라는 용어는 때때로 "재조합"과 호환되어 사용되기도 한다.
재조합체: 핵산 또는 폴리펩티드와 관련하여 사용된 "재조합체"란 용어는, 인간의 개입에 의해 변형된 물질(예를 들어, 재조합 핵산, 유전자, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 등)을 의미하는 것이다. 일반적으로, 재조합 분자의 일부의 배열은 원래의 형태를 가지지 않으며, 또한 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 1차 서열은 임의의 방식으로 조작된다. 재조합 물질을 생산하기 위한 변형법은 천연 환경 또는 천연 상태로 존재하는 물질 상에서 이루어질 수 있거나, 또는 이러한 천연 환경 또는 천연 상태와는 독립적으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 천연 핵산은, 이 핵산이 유래한 세포 내에서 이루어진 인간의 개입에 의해, 변형되거나, 또는 이와 같이 변형된 DNA로부터 전사되면, 재조합 핵산이 되는 것이다. 유전자 서열 개방 해독 틀은, 만일 이 뉴클레오티드 서열이 그것의 천연 서열로부터 분리되어 임의의 유형의 인공 핵산 벡터로 클로닝되면 재조합체가 되는 것이다. 재조합체란 용어는 또한 재조합 물질을 보유하는 유기체를 의미하는 것일 수도 있다. 재조합 분자를 생산하는 방법 및 시약, 특히, 재조합 핵산은 당 업계에 일반적이고 통상적으로 알려져 있다[예를 들어, Maniatis외 다수 (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, [1982]; Sambrook외 다수 (eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Volumes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, [1989]; 및 Ausubel외 다수 (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1-4, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994) 참조].
원래의 또는 내인성: 이종 또는 외인성 분자와는 대조적으로, "원래의(native)" 또는 "내인성(endogenous)" 분자는 연구중인 생물 시스템, 종 또는 염색체에 원래부터 존재하던 분자이다. "원래의" 또는 "내인성" 유전자는, 통상적으로 천연 상태에서 발견되는 염색체 이외의 공급원에 의해 암호화된 핵산 요소를 함유하지 않는 유전자이다. 내인성 유전자, 전사체 또는 폴리펩티드는 그것의 천연 염색체 위치에 의해 암호화되는 것이지, 세포에 인공적으로 공급되는 것이 아니다.
숙주 세포: "숙주 세포"라는 용어는 통상적으로, 이종 핵산 예를 들어, 벡터를 함유하고, 핵산의 복제 및/또는 발현을 지지하는 세포를 의미하는 것이다. 숙주 세포는 원핵 세포 예를 들어, 이. 콜라이, 또는 진핵 세포 예를 들어, 효모, 곤충, 양서류 또는 포유동물 세포일 수 있다. 바람직하게, 숙주 세포는 식물 세포이다. 본 발명에 있어서, 하나의 특히 바람직한 숙주 세포로서는 대두 숙주 세포가 있다.
진핵 생물: 본원에 사용된 "진핵 생물"이란 용어는, 유카리아(Eucarya) 계에 속하는 유기체를 의미한다. 진핵 생물은 일반적으로, 다수의 세포로 이루어진 조직이라는 점(반드시 다수의 세포로 이루어진 것은 아님[예를 들어, 효모)], 막 결합 핵과 기타 막 결합 기관, 선형 유전 물질(즉, 선형 염색체)가 존재한다는 점, 오페론이 존재하지 않는다는 점, 인트론(intron), 캡핑 메시지와 폴리-A mRNA, 그리고 기타 생화학적 특성이 존재한다는 점 예를 들어, 리보좀의 구조가 명확하다는 점에서, 원핵 생물과 구별된다. 진핵 생물 유기체로서는 예를 들어, 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충, 파충류 및 조류 등), 섬모충, 식물(예를 들어, 단자엽 식물, 쌍자엽 식물 및 조류 등), 진균, 효모, 편모충, 미포자충, 원생 생물 등을 포함한다.
원핵 생물: 본원에 사용된 "원핵 생물"이란 용어는, 모네라(Monera) 계(프로카리아(Procarya)라고도 부름)에 속하는 유기체를 의미한다. 원핵 생물 유기체는 일반적으로, 단일 세포 조직으로 되어 있다는 점, 출아나 분체 형성에 의해 무성 생식을 한다는 점, 막 결합 핵 또는 기타 막 결합 기관이 결여되어 있다는 점, 환형 염색체를 가진다는 점, 오페론이 존재한다는 점, 인트론이 존재하지 않는다는 점, 캡핑 메시지 및 폴리 A mRNA, 그리고 기타 생화학적 특성이 존재하지 않는다는 점 예를 들어, 리보좀의 구조가 명확하지 않다는 점에서, 진핵 생물과 구별된다. 프로카리아는 진정 세균 및 고세균(때때로 "원시세균"이라고도 부름)과 같은 아계를 포함한다. 남조류(청록 조류) 및 마이코플라스마는 때때로 모네라 계에서 별도로 분류되기도 한다.
세균: 본원에 사용된 "세균" 및 "진정 세균"이라는 용어는, 고세균과는 구별되는 원핵 생물 유기체를 의미한다. 이와 유사하게, 고세균이란, 진정 세균과는 구별되는 원핵 생물을 의미한다. 진정 세균과 고세균은 다수의 형태학적 및 생화학적 기준에 따라서 구분될 수 있다. 예를 들어, 리보좀 RNA 서열과, RNA 중합 효소 구조상의 차이점, 인트론 및 항생제 감수성 존부, 세포 벽 펩티도글리칸 및 기타 세포 벽 성분의 존부, 막성 지질이 분지형 구조인지 비 분지형 구조인지 여부, 그리고 히스톤 및 히스톤-유사 단백질의 존부는 유기체를 진정 세균 또는 고세균으로 나누는데 사용된다.
진정 세균의 예로서는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 서머스 서모필러스(Thermus thermophilus) 및 바실러스 스테아로서모필러스(Bacillus stearothermophilus)를 포함한다. 고세균의 예로서는 메타노코커스 재너쉬(Methanococcus jannaschii)(Mj), 메타노사르시나 마제이(Methanosarcina mazei)(Mm), 메타노박테리움 서모오토트로피큠(Methanobacterium thermoautotrophicum)(Mt), 메타노코커스 마리팔루디스(Methanococcus maripaludis), 메타노파이러스 칸들러리(Methanopyrus kandleri), 할로박테리움(Halobacterium) 예를 들어, 할로페랙스 볼카니(Haloferax volcanii) 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아카에오글로버스 펄기두스(Archaeoglobus fulgidus)(Af), 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus)(Pf), 파이로코커스 호리코시(Pyrococcus horikoshii)(Ph), 파이로바큘럼 아에로필럼(Pyrobaculum aerophilum), 파이로코커스 어비시(Pyrococcus abyssi), 설포로버스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)(Ss), 설포로버스 토코다이(Sulfolobus tokodaii), 아에유로피륨 페르닉스(Aeuropyrum pernix)(Ap), 서모플라스마 액시도필럼(Thermoplasma acidophilum) 및 서모플라스마 볼카니움(Thermoplasma volcanium)을 포함한다.
∼로부터 유래한: 본원에 사용된 "∼로부터 유래한"이란 용어는, 어느 성분이 특정 분자 또는 유기체로부터 분리되거나 또는 이 특정 분자 또는 유기체에 의해 생산된 경우, 또는 정보가 특정 분자 또는 유기체로부터 얻어진 경우를 의미한다. 예를 들어, 제2의 폴리펩티드로부터 유래하는 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 경우, 유래한 폴리펩티드 종은 예를 들어, 천연 발생 돌연 변이, 인공 유도 돌연 변이 또는 인공 랜덤 돌연 변이에 의해 생성될 수 있다. 폴리펩티드를 유도하는데 사용된 돌연 변이 유발법은 의도적으로 유도하거나 또는 고의로 랜덤하게 진행시킬 수 있거나, 아니면 이들 각각의 방식을 혼합하여 적용시킬 수 있다. 제1 폴리펩티드로부터 유래한 상이한 폴리펩티드를 생산하기 위한 폴리펩티드의 돌연 변이 유발법은 (예를 들어, 중합 효소의 불 신뢰성에 의해) 무작위적으로 진행될 수 있으며, 유래한 폴리펩티드는 적당한 스크리닝 방법 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 의해 동정될 수 있다. 폴리펩티드의 돌연 변이 유발법은 통상적으로 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 조작 단계를 포함한다.
이와 유사하게, "∼로부터 유래한"이라는 용어는, 폴리뉴클레오티드에도 적용할 수 있다. 공급원 폴리뉴클레오티드로부터 유래한 폴리펩티드는 공급원 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 경우, 유래된 종은 예를 들어, 천연 발생 돌연 변이, 인공 유도 돌연 변이 또는 인공 랜덤 돌연 변이에 의해 생산될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 유도하는데 사용된 돌연 변이 유발법은 의도적으로 유도하거나 또는 고의로 랜덤하게 진행시킬 수 있거나, 아니면 이들 각각의 방식을 혼합하여 적용시킬 수 있다. 몇몇 측면에서, 유래한 폴리뉴클레오티드는 공급원 폴리뉴클레오티드를 이종성 폴리뉴클레오티드 즉, 원래의 또는 내인성 폴리뉴클레오티드와는 상이한 폴리뉴클레오티드에 배치함으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, 유전자 프로모터는, 내인성 프로모터 도메인을 구분하여, 이를 그것이 평소에는 결합하지 않던 상이한 뉴클레오티드 서열과 작동 가능하도록 배치함으로써, 내인성 유전자 프로모터로부터 유래할 수 있다.
양성 선별 또는 스크리닝 마커: 본원에 사용된 "양성 선별 또는 스크리닝 마커"란 용어는, 존재할 경우 예를 들어, 발현 및 활성화될 경우, 특질을 포함하지 않는 세포로부터 특질을 포함하는 세포 예를 들어, 양성 선별 마커를 가지는 세포를 동정하는 마커를 의미한다.
음성 선별 또는 스크리닝 마커: 본원에 사용된 "음성 선별 또는 스크리닝 마커"란 용어는, 존재할 경우 예를 들어, 발현 및 활성화될 경우, (예를 들어, 특성이나 특질을 보유하는 세포에 비하여) 선택된 특성 또는 특질을 포함하지 않는 세포를 동정할 수 있도록 만드는 마커를 의미한다.
선별 또는 스크리닝 제제: 본원에 사용된 "선별 또는 스크리닝 제제"라는 용어는, 존재할 경우 군집으로부터 임의의 성분들을 선별/스크리닝할 수 있는 제제를 의미한다. 예를 들어, 선별 또는 스크리닝 제제는 예를 들어, 영양분, 항생제, 빛의 파장, 항체, 발현된 폴리뉴클레오티드 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 선별 제제는 예를 들어, 농도 및 강도 등에 따라서 달라질 수 있다.
리포터: 본원에 사용된 "리포터" 또는 이와 균등한 용어는 일반적으로, 연구 중인 시스템 내에서 용이하게 검출될 수 있는 임의의 성분을 의미하는 것으로서, 여기서, 리포터 검출 여부는 몇몇 기타 분자 또는 특성의 존부와 상관되어 있거나, 또는 상기 리포터는 목적 시스템 내 표적을 동정, 선별 및/또는 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 특정 용도로 사용하기에 가장 적당한 리포터는 의도로 하는 용도와 기타 당 업자에게 공지된 변수에 따라서 선택된다. 몇몇 측면에서, 리포터는 리포터 유전자이다.
다양한 리포터 분자 및 유전자는 당 업계에 공지되어 있다. 각각의 리포터는 이 리포터를 검출하기 위한 특별한 검정 수단을 갖는다. 일부 리포터 검출 검정 수단으로서는 효소에 의한 검정 수단이 있을 수 있는 반면에, 기타 검정 수단으로서는 면역학적 특성을 이용하는 수단(예를 들어, ELISA 또는 면역 조직 화학적 분석 수단), 또는 비색 수단이 있을 수 있다. 또한, 리포터는 항생제 내성 또는 감수성을 부여하는 단백질 예를 들어, 효소(예를 들어, β-락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 등), 형광 마커(예를 들어, 녹색 형광 단백질 예를 들어, GFP, YFP, EGFP 및 RFP 등), 발광 마커(예를 들어, 반딧불이의 루시퍼라제 단백질), 친화성계 스크리닝 마커, 효소 활성 예를 들어, lacZ(β-갈락토시다제), 또는 기타 양성 또는 음성 선별 마커 유전자 예를 들어, ADH(알콜 탈수소 효소), his3, ura3, leu2, lys2 등을 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 4개의 비천연 아미노산의 구조와 상응하는 명칭 즉, p-벤조일-L-페닐알라닌(Bpa), 파라-아세틸-L-페닐알라닌(pAcPhe), 파라-아지도-L-페닐알라닌(pAzPhe) 및 파라-요오도-L-페닐알라닌(pIPhe)을 나타내는 것이다.
도 2는 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자에 대한 proK 프로모터 및 종결부위, BpaRS 유전자 내 D286R 돌연 변이, BpaRS 유전자에 대한 glnS 프로모터의 돌연 변이형, 및/또는 tRNA 유전자의 복수개의 복사체를 포함하는 플라스미드의 억제 효율(야생형 β-갈락토시다제에 비한 효율)을 나타내는 그래프이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내며, 이때의 n은 3이다.
도 3은 나열된 억제 플라스미드로부터 발현된 앰버 억제 MjtRNA-Tyr(CUA)를 노던 블럿 분석한 결과에 대한 화학 발광 이미지를 나타내는 것이다.
도 4는 야생형 glnS 프로모터와 돌연 변이된 glnS 프로모터의 제어 하에 발현된 BpaRS를 웨스턴 블럿 분석한 결과에 대한 화학 발광 이미지를 나타내는 것이다. 블럿은 항-His(C-말단) 항체-HRP 접합체(Invitrogen)를 사용하였다.
도 5는 pSup-BpaRS-6TRN의 플라스미드 맵을 나타내는 것이다. 기타 합성 효소 유전자는 상응하는 pBK 플라스미드로부터 이 플라스미드의 NdeI/PstI 위치에 서브 클로닝되었다.
도 6은 Bpa, pAcPhe, pAzPhe 및 pIPhe이 통합된 새로운 시스템의 억제 효율을 나타내는 것이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타내며, 이때의 n은 3이다.
도 7은 Bpa의 존부 하에 발현되는 Ser-4 대신에 Bpa를 함유하는 돌연 변이 미오글로빈을 웨스턴 블럿한 결과에 대한 화학 발광 이미지를 나타내는 것이다. 블럿은 항-His(C-말단) 항체-HRP 접합체(Invitrogen)를 사용하였다.
도 8은 본 발명에 사용되는 다양한 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 나타낸 것이다.
상세한 설명
본 발명은 선택 코돈(예를 들어, 앰버 넌센스 코돈)에 의해 특정 위치에서 유전적으로 암호화된 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 돌연 변이 단백질을 세균 내에서 효과적으로 발현시키는데 유용한, 개선된 발현 벡터 시스템을 제공한다. 이와 같은 시스템은 당 업계에 비천연 아미노산을 생체 내 통합하는 것으로 알려진 직교성 번역 기술을 이용한다. 본 발명은 사용된 특정 직교형 번역 성분(즉, 특정 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 또는 특정 직교형 억제 tRNA)과 관련된 임의의 측면에 제한되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 몇몇 구체예에서, 본 발명은 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 또는 억제 tRNA의 발현에 국한되지 않는 세균 발현 벡터 시스템에서 광범위하게 사용되는, 개선된 조성물과 방법을 제공한다.
본 발명은 진정 세균(예를 들어, 이. 콜라이) 내에서 비천연 아미노산을 단백질에 통합하는 효율을 상당 수준 개선시키고, 선택 코돈에 의해 유전학적으로 지정된 특정 위치에 비천연 아미노산을 함유하는 돌연 변이 단백질을 고 수율로 발현시키는 특징을 갖는 신규의 발현 벡터를 제공한다. 본 발명을 수행하거나 이용하는데 있어서 그 효율을 개선하는 기작에 관하여 이해하고 있다고 하여도, 비천연 아미노산을 복적 단백질에 통합시키는 효율은 아마도(최소한 부분적으로나마) 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 및 억제 tRNA의 발현을 개선함으로 인하여 개선될 것이다.
직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 또는 직교형 억제 tRNA를 발현시키는 것 이외에도, 본 발명의 신규한 발현 벡터는 다양한 이. 콜라이 발현 벡터 골격과 이. 콜라이 균주와 광범위하게 혼화 가능할 뿐만 아니라, 목적으로 하는 기타 단백질 또는 tRNA의 발현에도 쉽게 사용될 수 있다.
몇몇 측면에서, 본 발명에 의해 제공된 신규한 발현 벡터는 별도의 플라스미드와는 독립적으로 사용된다. 기타 측면에서, 하나의 신규한 특징 또는 이 특징의 조합이 다수의 플라스미드에 사용된다. 또 다른 구체예에서, 이러한 특징들 다수는 동일한 플라스미드 상에서 함께 사용된다. 본 발명은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 돌연 변이 단백질의 발현을 개선하는데 사용될 수 있으며, 몇몇 경우, 목적으로 하는 특정 폴리펩티드 또는 tRNA의 발현을 광범위하게 개선하는데 사용될 수 있는, 세균 발현 벡터 시스템에 다수의 개선점을 제공한다.
본 발명은 예를 들어, 다음과 같은 개선점을 세균 발현 벡터 시스템에 제공한다:
(A) 본 발명은 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 유전자와 직교형 억제 tRNA 유전자가 동일한 플라스미드 상에 존재하는 발현 벡터를 제공한다. 이는 상기 2가지 성분이 이미 각각 별도의 플라스미드 상에 존재할 경우, 이와 같은 직교형 성분의 발현을 간단하게 만들어 준다;
(B) 본 발명은 이종성 tRNA 서열 예를 들어, 직교형 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자 또는 기타 임의의 직교형 tRNA 유전자를 발현하기 위한, 이. 콜라이 프롤린 tRNA 오페론 유래의 개선된 프로모터 및 종결부위 서열을 제공한다. 프로모터 및 종결부위 서열을 유도하는데 사용된 이. 콜라이 프롤린 tRNA 유전자는 이. 콜라이 proK, proL 및 proM tRNA 유전자일 수 있다.
(C) 본 발명은 tRNA 유전자의 발현을 위한 개선된 재조합 폴리시스트론 오페론을 제공하는데, 여기서, 상기 오페론 내 임의의 tRNA 유전자 2개는 천연 tRNA 폴리시스트론 오페론 링커로부터 유래하는 이종 링커 서열 예를 들어, 이. 콜라이 valU 및 valX 유전자, 또는 예를 들어, ileT 및 alaT 유전자 사이에 천연 생성되는 링커에 의해 분리되어 있다.
(D) 본 발명은 개방 해독 틀 예를 들어, 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소를 암호화하는 개방 해독 틀의 발현을 개선하기 위한, 이. 콜라이 glnS 프로모터로부터 유래하는 신규한 프로모터 서열을 제공한다.
O-tRNA 및 O-RS 유전자의 공동 발현을 위한 벡터 시스템
몇몇 측면에서, 본 발명은 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 유전자와 직교형 억제 tRNA 유전자가 동일한 플라스미드 상에 존재하는 발현 벡터를 제공한다. 이와 같은 특징은 선행 기술에 비하여 개선된 것인데, 즉, 예전에는 O-tRNA와 O-RS 유전자를 독립적으로 운반하는 2개의 별도 발현 벡터들로 숙주 세포를 공동으로 형질 전환시켜야만 했다.
실시예에 기술된 바와 같이, 본 발명에서는 O-tRNA와 O-RS 종을 공동으로 발현하는데 적당한 일련의 관련 발현 벡터들을 구성한다. 이와 같은 플라스미드들로서는 다음의 것들을 포함한다:
pYR-BpaRS1
pYR-BpaRS5
pYR-BpaRS5(D286R)
pYR-BpaRS-TRN
pYR-BpaRS-TRN(D286R)
pYR-BpaRS-3TRN(D286R)
pYR-BpaRS-6TRN(D286R)
pSup-BpaRS-6TRN(D286R)
pSup-pAcPheRS-6TRN
pSup-pAzPheRS-6TRN
pSup-pIPheRS-6TRN
상기 플라스미드들은 각각 본 발명의 특징을 이룬다. 그러나, 본 발명은 상기 플라스미드에 국한되지 않으며, 당 업자들은 이들 플라스미드의 변이체를 구성하는 것도 본 발명의 범위 내에 포함된다는 사실을 알게 될 것이다.
예를 들어, 본 발명의 임의의 플라스미드는 임의의 특정 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하기 위해 임의의 특정 O-tRNA 또는 O-RS 종을 발현시키는 것에 제한되는 것은 아니다. 본원에 제공된 실시예에는, p-벤조일-L-페닐알라닌(Bpa), 파라-아세틸-L-페닐알라닌(pAcPhe), 파라-아지도-L-페닐알라닌(pAzPhe) 및 파라-요오도-L-페닐알라닌(pIPhe)을 특이적으로 하전하는 tRNA를 가지는 4개의 상이한 O-RS 종과 MjtRNA-Tyr(CUA)(서열 번호 1)을 성공적으로 사용하는 것에 관하여 기술되어 있다[도 1 및 도 8, 서열 번호 4, 6, 8 및 10 참조].
이와 같은 실시예는 본 발명이 기타 O-tRNA 및 O-RS 종과 함께 광범위하게 사용되는 적용 예를 예시하는데 사용된다. 실제로, 본 발명은 목적으로 하는 임의의 O-tRNA 또는 임의의 O-RS, 구체적으로 진정 세균 세포 내에서 최적으로 작용하는 직교형 번역 성분을 발현시키는데 사용된다. 몇몇 측면에서, 본 발명은 특히 천연 고세균(예를 들어, 메타노코커스 재너쉬) 아미노아실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 O-RS 종, 또는 고세균 tRNA로부터 유래하는 O-tRNA 종과 함께 사용된다. 본 발명에 사용되는 다양한 O-tRNA 및 O-RS 종에 관하여는 당 업계에 공지되어 있으며, 다수의 문헌에 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[국제 특허 출원 공보 WO 2002/086075(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITION FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"; WO 2002/085923(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"; WO 2004/094593(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"; WO 2005/019415(2004년7월 7일); WO 2005/007870(2004년 7월 7일); WO 2005/007624(2004년 7월 7일) 및 WO 2006/110182(2005년 10월 27일)(발명의 명칭: "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS."]을 참조하시오. 이와 같은 출원들은 각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다. 비천연 아미노산을 통합하는 직교형 번역 시스템 및 이의 생산 방법과 용도에 관하여는 문헌[Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed, 44(1):34-66 (2005), Xie and Schultz, "An Expanding Genetic Code," Methods 36(3):227-238 (2005); Xie and Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire," Curr. Opinion in Chemical Biology 9(6):548-554; 및 Wang외 다수, "Expanding the Genetic Code," Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., epub Jan 13, 2006; 상기 문헌의 내용은 각각 그 자체로서 참고용으로 인용됨]에 더욱 상세히 개시되어 있다.
선행 기술(예를 들어, 본원에 인용된 기술)은 또한 공지된 O-RS 및 O-tRNA 종의 다양한 변이체(예를 들어, 보존적 변이체)와 단편의 구성 및 용도에 대한 지침을 제공하기도 한다. 이와 같은 변이체 및 단편들은 또한 본 발명의 발현 벡터와 함께 사용되기도 한다. 당 업계는 또한 본 발명과 함께 사용되는 새로운 O-RS 및 O-tRNA 종을 동정 및 구성하는 지침을 제공하기도 한다.
플라스미드 구성 및 진정 세균 숙주 세포
실시예 6에 기술 및 사용되는, 본 발명에 의하여 제공된 플라스미드는 pACYC184 벡터 골격을 바탕으로 한다. 그러나, 본 발명의 플라스미드는 특정 골격의 벡터를 사용하는 것에 한정되지 않는다. 당 업자는 다양한 플라스미드(예를 들어, 기타 공중이 이용 가능하거나 시판중인 플라스미드) 중 어느 하나가 본 발명의 플라스미드를 구성하는데 사용될 수 있음을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 플라스미드 pACYC177 및 pRARE2 벡터(Novagen: 수탁 번호 갱신, 2001년 6월 12일)는 본 발명과 관련하여 사용될 수도 있다. 몇몇 측면에서, 혼화 가능한 복제 기점(예를 들어, p15A 복제 기점) 및 하나 이상의 선별 마커를 포함하는 임의의 플라스미드는 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 플라스미드 pSC101의 유도체도 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
실시예 6에도 기술되어 있는 바와 같이, 본 발명에 의해 제공되는 플라스미드는 원샷(One Shot)® TOP-10 전기 수용성 이. 콜라이(Invitrogen™)를 형질 전환하는데 사용되었다. 그러나, 이와 같은 특정의 숙주 세포로서는, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하기 위해 숙주 세포로서 사용되는 진정 세균 균주에 한정되지 않는다. 당 업자는 다양한 숙주 세포 중 임의의 하나(예를 들어, 기타 시판중인 플라스미드와 사용자에 의해 생산된 균주)는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하는데 용이하게 사용될 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 기타 숙주 세포로서는 예를 들어, 이. 콜라이 균주 DH10B™(Invitrogen™), 일렉트로콤프(Electrocomp)™, 진 혹스(GeneHogs)®(Invitrogen™), BL21 원샷®(Invitrogen™), 그리고 BL21(DE3) 원샷® (Invitrogen™)이 있다. 실제로, 임의의 내인성 tRNA 억제 유전자를 가지지 않는 임의의 이. 콜라이 균주가 숙주 세포로서 적당하다. 이. 콜라이 이외의 기타 진정 세균 종도 본 발명에 사용된다. 예를 들어, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)도 본 발명의 벡터에 대한 숙주 세포로서 사용될 수 있다고 생각된다.
O-tRNA 발현용인, 개선된 프로모터 및 종결부위 서열
직교형 번역 시스템의 억제 효율을 개선하기 위하여, 천연 이. 콜라이 tRNA 프로모터 및 종결부위를 가지는 신규의 앰버 억제 tRNA 오페론을 구성하였다. 이. 콜라이 tRNA 유전자에 대한 연구를 통하여, 이. 콜라이 프롤린 tRNA는 고세균 tRNA와 동일한 C1-G72 쌍을 가진다는 사실을 알 수 있었는데; 이와 같은 염기쌍은 이. 콜라이 내에서 MjTyrRS에 의해 MjtRNA-Tyr(CUA)를 선택적으로 인식하기 위한 주요 동일성 결정 인자이다[Wang and Schultz, Chem. Biol, 8:883-890 (2001)].
이와 같은 관찰 결과를 보았을 때, 합성 앰버 억제 tRNA 유전자는 이종 O-tRNA 유전자가 모노시스트론 proK 오페론 내 동일한 길이(77 뉴클레오티드)의 이. 콜라이 proK 유전자를 대체하도록 구성되었다. 개선된 발현 벡터(pYR-BpaRS5)는, proK 프로모터(서열 번호 32) 및 proK 종결부위(서열 번호 33)의 제어 하에서, pYR-BpaRS1내 기원 억제 tRNA 오페론을 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자로 치환함으로써 생산되었다. 이러한 발현 구성체는, pYR-BpaRS1 벡터의 활성에 비하여, O-tRNA의 발현량을 2배 증가시키는 것을 알 수 있었으며(도 3 참조), 그 결과, 억제 효율도 상당 수준 개선되었음을 알 수 있었다(도 2 참조).
그러므로, 본 발명은 목적으로 하는 tRNA를 발현시키기 위한, 개선된 발현 벡터를 제공하는데, 여기서, 상기 폴리시스트론 tRNA의 발현은 이. 콜라이 프롤린 tRNA 유전자 proK로부터 유래하는 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열에 의해 유도된다.
실시예 1에 기술한 바와 같이, 이와 같이 개선된 발현 벡터를 입증하는데 사용된 특정 tRNA는 직교형 tRNA(O-tRNA), 더욱 구체적으로, MjtRNA-Tyr(CUA)이었다. 그러나, tRNA 발현 효율을 개선시키는 것은 비단 MjtRNA-Tyr(CUA)나, O-tRNA에만 국한되는 것만은 아니다. 실제로, 본 발명의 이와 같은 특징은 목적으로 하는 임의의 tRNA의 발현을 개선하는데 사용될 수 있다.
이. 콜라이에 있어서, 3가지 종류의 tRNA에는 번역 시 프롤린으로 하전된다. proK tRNA 유전자 이외에, 이. 콜라이는 2개의 부가 프롤릴-tRNA 유전자를 사용하기도 한다. 이 유전자로서는 proL 및 proM이 있다. proK 위치의 구조와 유사한 구조를 참고로 하였을 때, proL의 프로모터 서열(서열 번호 34) 및 proL 및 proM의 종결부위 서열(서열 번호 35 및 36)은 본 발명의 개선된 발현 벡터를 구성하는데에도 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 상이한 이. 콜라이 프롤릴-tRNA 유전자로부터 유래하는 프로모터와 종결부위를 조합하여, 발현을 개선하는 것도 본 발명의 특징을 이룬다. 예를 들어, proK의 프로모터 서열(서열 번호 32)은 proL의 종결부위 서열(서열 번호 35)와 함께 사용될 수 있다.
개선된 폴리시스트론 오페론 구조
본 발명은 tRNA 유전자를 발현시키기 위한, 개선된 재조합 폴리시스트론 오페론을 제공한다. 이와 같은 폴리시스트론 오페론은 목적으로 하는 tRNA 유전자를 다수의 복사체(예를 들어, 3개의 복사체)만큼 포함하는데, 여기서, tRNA 서열은 천연 tRNA 폴리시스트론 오페론의 링커 예를 들어, 이. 콜라이 valU 및 valX 유전자(서열 번호 14), 또는 이. 콜라이 ileT 및 alaT tRNA 유전자(서열 번호 15) 사이에 천연 생성되는 링커로부터 유래하는 이종 링커 서열에 의해 분리된다.
그러므로, 본 발명은 폴리시스트론 tRNA 오페론을 발현시키기 위한, 개선된 발현 벡터를 제공하는데, 여기서, 상기 오페론은 하나 이상의 이종성 tRNA 링커(즉, 2개 이상의 발현된 tRNA 서열을 분리하는 링커)를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 실시예 3에 기술되어 있는 바와 같이, 복수개의 tRNA 링커는 오페론 내 3개 이상의 발현된 tRNA 서열을 분리하는 데 사용된다. 이 경우, 각각의 발현된 tRNA 쌍 사이에 사용된 tRNA 링커는 상이할 수 있거나(실시예 3 참조), 또는 각각의 tRNA 유전자 사이의 동일한 링커일 수 있다.
본 발명은 이. 콜라이 valU 및 valX 유전자 링커(서열 번호 14), 또는 이. 콜라이 ileT 및 alaT tRNA 유전자 링커(서열 번호 15)를 사용하는 것에 한정되지 않는다. 실제로, 부가의 천연 tRNA 링커가 본 발명에 사용되기도 한다. 예를 들어, 이하에 나열된 원래의 이. 콜라이 tRNA 유전자 사이에 위치하는 다음과 같은 각각의 링커들이 본 발명에 사용될 수 있으며, 이때, 재조합 시스템에 사용된 링커는 재조합 오페론 내에서 발현된 tRNA 서열과는 이종이다. 이와 같이 유용한 tRNA 링커로서는 다음과 같은 것들을 포함한다:
Figure 112008064869645-PCT00001
몇몇 구체예에서, 본 발명에 사용되는 바람직한 tRNA 링커는 T(-1) 및 A(77) 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다. 이와 같은 tRNA 링커 내 2개의 뉴클레오티드 위치는 원래(즉, 내인성) 뉴클레오티드 내 존재하던 tRNA 전구체의 5' 및 3'-가공 과정(processing)을 효율적으로 진행시키는데 적당한 것으로 파악된다. 예를 들어, 문헌[Li and Deutscher, "Maturation pathways for E. coli tRNA precursors: A random multienzyme process in vivo " Cell 86:503-512 (1996); 및 Zahler외 다수, "Recognition of the 5' leader of pre-tRNA substrates by the active site of ribonuclease P," RNA 9:734-745 (2003)]을 참조하시오. 다른 구체예에서, 본 발명에 사용되는 tRNA 링커는 (원래부터 존재하거나 조작된) 제한 위치들을 포함한다.
몇몇 구체예에서, 본 발명은 (임의로는 직렬로 배열된) 다수의 동일한 폴리시스트론 오페론을 포함하는 구성체를 제공한다. 그러므로, 만일 하나의 폴리시스트론 오페론이 발현 가능 뉴클레오티드 서열(예를 들어, tRNA 유전자)을 3개의 복사체만큼 포함하면, 상기 오페론 중 2개는 총 6개의 tRNA 유전자 서열을 발현시킬 것이다. 이와 같은 형태의 유전자 클러스터 배열을 실시예 3과 도 5에 나타내었다.
실시예 3에 기술된 바와 같이, 개선된 재조합 폴리시스트론 오페론은 직교형 tRNA MjtRNA-Tyr(CUA)을 발현한다. 그러나, 본 발명은 MjtRNA-Tyr(CUA)의 발현에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, 본 발명은 직교형 tRNA 종의 발현에 한정되는 것도 아니다. 실제로, 본 발명의 개선된 폴리시스트론 오페론은 임의의 원하는 tRNA 종을 발현하는데 사용될 수 있다.
폴리펩티드 발현용인 개선된 이. 콜라이 glnS 프로모터
본 발명은 개방 해독 틀의 발현을 개선하기 위한, 이. 콜라이 glnS 프로모터 유래 신규 프로모터 서열을 제공한다. 실시예 2에 기술된 바와 같이, 돌연 변이 glnS 프로모터(서열 번호 12)[Plumbridge and Soll (Biochimie 69:539-541 (1987)]를 본 발명의 발현 벡터에 서브 클로닝하였다. 서브 클로닝된 glnS 프로모터 영역을 서열 결정한 결과, 프로모터 서열에 (문헌(Plumbridge and Soll)에 개시된 바와 같은 치환 이외에도) 결실이 의도하지 않게 발생하였음을 알 수 있었다. 이와 같이 추가로 변형된 신규한 glnS 프로모터 변이체를 glnS-TNR(서열 번호 13)이라고 부른다. 놀랍게도, 이와 같이 돌연 변이가 일어난 결과, 야생형 glnS 프로모터 활성에 비하여, 변형된 시스템의 번역 효율이 개선되었음을 알 수 있었다(웨스턴 블럿팅에 의해 확인)(도 4 참조).
실시예 2 및 5에 기술된 바와 같이, glnS-TNR 프로모터는 직교형 합성 효소 BpaRS, pAcPheRS, pAzPheRS 및 pIPheRS를 발현하는데 사용되었다. 그러나, 본 발명은 특정 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소의 발현 또는 일반적으로 임의의 아미노아실-tRNA 합성 효소에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이 개선된 프로모터는 임의의 원하는 폴리펩티드 개방 해독 틀의 세균 내 발현에 광범위하게 사용된다.
직교형 tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소 기술
직교형 tRNA와 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소 쌍과 관련된 활성을 이해함으로써, 본 발명의 신규한 조성물과 방법에 관하여 더욱 잘 이해할 수 있다. 유전 암호에 비천연 아미노산을 부가적으로 가하기 위해서는, 숙주 번역 기구에서 효과적으로 작용할 수 있되, 대상 번역 시스템에 대해서는 "직교성"인, 아미노아실-tRNA 합성 효소 및 적당한 tRNA를 포함하는 신규의 직교형 쌍이 필요한데, 이는 곧, 상기 직교형 쌍은 번역 시스템에 내인성인 합성 효소 및 tRNA와 독립적으로 작용한다는 것을 말해준다. 원하는 특성을 갖는 직교형 쌍은 임의의 내인성 tRNA에 의해서 해독되지 않는 특정 코돈 예를 들어, 선택 코돈만을 해독 또는 인식하는 tRNA와, 오직 하나의 특정 비천연 아미노산을 가지는 동족 tRNA를 우선적으로 아미노아실화(또는 "하전")하는 아미노아실-tRNA 합성 효소를 포함한다. 상기 O-tRNA는 통상적으로 내인성 합성 효소에 의해 아미노아실화되는 것은 아니다. 예를 들어, 이. 콜라이에 있어서, 직교형 쌍은 예를 들어, 이. 콜라이 내에 40개 존재하는 내인성 tRNA 중 임의의 것과 교차 반응하지 않고, 이. 콜라이 내에 21개 존재하는 내인성 합성 효소 중 임의의 것에 의해 아미노아실화되지 않는 직교형 tRNA를 포함할 것이다. 현재, 당 업계에 알려진 바와 같이 직교형 번역 기술을 이용하여, 구조적으로 다양한 다수의 비천연 아미노산이 단백질에 통합되었다.
비천연 아미노산이 위치 특이적으로 폴리펩티드에 통합되는 능력으로 말미암아, 상기 단백질의 매우 선택적인 번역 후 변형과, 신규 특성을 갖는 단백질을 조작할 수 있음으로써 단백질 연구에 박차를 가할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 함유하는 단백질을 발현시키면, 특이적으로 표지화하거나, 효소의 촉매 기능을 변성시키거나, 생물 활성을 개선하거나, 또는 기질에 대한 교차 반응성을 감소시키거나, 기타 단백질, 소형 분자 또는 생체 분자와 단백질을 가교시키거나, 단백질 분해를 감소 또는 억제하거나, 단백질의 생체 내 반감기를 개선함으로써(예를 들어, 도입된 반응 위치들을 페그화하거나 또는 기타의 방법으로 변형시킴으로써) 단백질 연구를 가속화할 수 있다.
하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하는데 적당한 직교형 번역 시스템에 관하여는, 직교형 번역 시스템을 생산하기 위한 일반적인 방법으로서 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[국제 특허 출원 공보 WO 2002/086075(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA-AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); WO 2002/085923(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); WO 2004/094593(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); WO 2005/019415(2004년 7월 7일); WO 2005/007870(2004년 7월 7일); WO 2005/007624(2004년 7월 7일) 및 WO 2006/110182(2005년 10월 27일)(발명의 명칭: "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS.")]을 참조하시오. 상기 출원들 각각은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있다. 비천연 아미노산을 통합하는 직교형 번역 시스템과, 이의 생산 방법 및 용도에 관한 자세한 설명은 문헌[Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005), Xie and Schultz, "An Expanding Genetic Code," Methods 36(3):227-238 (2005); Xie and Schultz, "Adding Amino Acids to the Genetic Repertoire," Curr. Opinion in Chemical Biology 9(6):548-554; Wang외 다수, "Expanding the Genetic Code," Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 35:225-249 (2006); 및 Xie and Schultz, "A chemical toolkit for proteins - an expanded genetic code," Nat. Rev. Mol. Cell Biol, 7(10):775-782 (2006; epub Aug 23, 2006); 상기 문헌들은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]에 기술되어 있다.
이와 같은 번역 시스템은 일반적으로 직교형 tRNA(O-tRNA), 작교형 아미노아실 tRNA 합성 효소(O-RS) 및 비천연 아미노산을 포함하는 세포(원핵 생물 세포 예를 들어, 이. 콜라이, 또는 진핵 생물 세포 예를 들어, 효모일 수 있음)를 포함하는데, 여기서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 아미노아실화한다. 본 발명의 직교형 쌍은 O-tRNA 예를 들어, 억제 tRNA, 틀 이동 tRNA 등과, 동족 O-RS를 포함할 수 있다.
일반적으로, 직교형 쌍이 선택 코돈을 인식하고, 선택 코돈에 대응하여 아미노산을 운반할 때, 이 직교형 쌍은 선택 코돈을 "억제한다"고 말할 수 있다. 즉, 번역 시스템(예를 들어, 세포)의 내인성 기구에 의해 인식되지 않는 선택 코돈은 일반적으로 하전되지 않는데, 그 결과, 핵산으로부터 번역될 폴리펩티드의 생산이 차단된다. 직교형 쌍 시스템에 있어서, O-RS는 특이적인 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 아미노아실화한다. 하전된 O-tRNA는 선택 코돈을 인식하고, 선택 코돈에 의해 번역이 차단되는 것을 막아준다. 상기 세포는 예를 들어, 목적으로 하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 통하여, 비천연 아미노산을 연장 중인 폴리펩티드 사슬에 통합함에 있어서, O-tRNA/O-RS 쌍을 이용하는데, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 선택 코돈을 포함한다. 임의의 바람직한 측면에서, 세포는 부가의 O-tRNA/O-RS 쌍을 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 부가의 O-tRNA에는 상이한 비천연 아미노산을 가지는 부가적 O-RS가 결합한다. 예를 들어, O-tRNA 중 하나는 4 염기 코돈을 인식할 수 있고, 다른 것은 종결 코돈을 인식할 수 있다. 대안적으로, 다수의 상이한 종결 코돈 또는 다수의 상이한 4 염기 코돈은 상이한 선택 코돈을 특이적으로 인식할 수 있다.
임의의 구체예에서, 시스템은 직교형 tRNA(O-tRNA), 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS), 비천연 아미노산 및 목적으로 하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 포함하는 세포 예를 들어, 이. 콜라이 세포 또는 효모 세포를 포함하는데, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 선택 코돈을 포함한다. 번역 시스템은 또한 무세포 시스템 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 O-tRNA/O-RS 쌍과 비천연 아미노산을 함께 가지는, 시판중인 다수의 "시험관 내" 전사/번역 시스템 중 임의의 것일 수도 있다.
전술한 바와 같이, 몇몇 구체예에서, 세포 또는 기타 번역 시스템 내에는 다수의 O-tRNA/O-RS 쌍이 존재하는데, 이로써, 하나 이상의 비천연 아미노산을 폴리펩티드에 통합할 수 있다. 예를 들어, 세포는 부가의 상이한 O-tRNA/O-RS 쌍과 제2의 비천연 아미노산을 추가로 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 부가의 O-tRNA는 제2의 선택 코돈을 인식하고, 이와 같은 부가의 O-RS는 제2의 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 예를 들어, (O-tRNA가 예를 들어, 앰버 선택 코돈을 인식하는 경우) O-tRNA/O-RS 쌍을 포함하는 세포는 제2의 직교형 쌍을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서, 상기 제2의 O-tRNA는 상이한 선택 코돈 예를 들어, 오팔 코돈, 4 염기 코돈 등을 인식한다. 바람직하게, 상이한 직교형 쌍은 상이한 선택 코돈의 인식을 촉진할 수 있는, 상이한 공급원으로부터 유래한다.
O-tRNA 및/또는 O-RS는, 천연 생성될 수 있거나 또는 예를 들어, 다양한 유기체 중 임의의 것으로부터 tRNA의 라이브러리 및/또는 RS 라이브러리를 생산함으로써 천연 tRNA 및/또는 RS를 돌연 변이시키고/돌연 변이시키거나, 다수의 유용한 돌연 변이 기술을 이용함으로써 유래될 수 있다. 예를 들어, 직교형 tRNA/아미노아실-tRNA 합성 효소 쌍을 생산하는 한 가지 방법은, 예를 들어, 숙주 세포 이외의 공급원이나 다수의 공급원으로부터 유래한, (숙주 세포에) 이종성인 tRNA/합성 효소 쌍을 숙주 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 이종 후보 합성 효소의 특성으로서는, 예를 들어, 임의의 숙주 세포 tRNA를 하전시키지 않는다는 점이 있으며, 이종 후보 tRNA의 특성으로서는, 예를 들어, 임의의 숙주 세포 합성 효소에 의해 아미노아실화되지 않는다는 점이 있다. 뿐만 아니라, 이종성 tRNA는 모든 숙주 세포 합성 효소에 직교성이다.
직교형 쌍을 생산하는 제2의 방법은, O-tRNA 또는 O-RS를 스크리닝 및/또는 선별하기 위해 돌연 변이 라이브러리를 생산하는 단계를 포함한다. 이와 같은 기술은 연계하여 실시될 수 있다.
직교형 tRNA(O-tRNA)
직교형 tRNA(O-tRNA)는 예를 들어, 생체 내 또는 시험관 내에서, 높은 억제 효율로 O-tRNA에 의해 인식되는 선택 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 단백질에 비천연 아미노산을 통합하는 과정을 바람직하게 매개한다. 억제 효율은 당 업계에 공지된 다수의 검정법 중 임의의 검정법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, β-갈락토시다제 리포터 검정법은 예를 들어, 유도체화된 lacZ 플라스미드(lacZ 핵산 서열 내 선택 코돈을 가지는 구성체)가 본 발명의 O-tRNA를 포함하는 플라스미드와 함께, 적당한 유기체(예를 들어, 직교형 성분이 사용될 수 있는 유기체)로부터 유래하는 세포에 도입되었는지를 관찰하는데 사용될 수 있다. 동족 합성 효소도 (발현시 동족 합성 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드로서) 도입될 수 있다. 세포는 배지 중에서 원하는 밀도(예를 들어, OD600 약 0.5)로 배양하며, β-갈락토시다제 검정법은 예를 들어, 베타플루어(BetaFluor)™ β-갈락토시다제 검정 키트(Novagen)를 이용하여 수행한다. 억제율(%)은 비교 가능한 대조군 활성에 대한 시료 활성의 % 예를 들어, 유도체화된 lacZ 구성체로부터 측정되는 수치로서 계산될 수 있는데, 여기서, 상기 구성체는 선택 코돈보다는 원하는 위치에 상응하는 센스 코돈을 가진다.
O-tRNA는 또한 공지의 O-tRNA를 보존적으로 변이시켜 유도될 수 있다. 예를 들어, O-tRNA의 보존적 변이체로서는 본원의 서열 목록에 있는 특정 O-tRNA와 같이 작용을 하며, 적당한 자기-상보성으로 인해 tRNA가 L자 형태 구조로 유지되도록 만들되, 본원의 서열 목록, 도면 또는 실시예에 개시된 서열과 동일한 서열을 가지지 않는(그리고, 바람직하게는 야생형 tRNA 분자 이외의 것인) 분자를 포함한다.
O-tRNA를 포함하는 조성물은 또한 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 포함할 수 있는데, 여기서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. 임의의 구체예에서, O-tRNA를 포함하는 조성물은 또한 (예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내) 번역 시스템을 포함할 수 있다. 핵산은 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는데, 여기서, 상기 폴리뉴클레오티드는 O-tRNA에 의해 인식되는 선택 코돈, 또는 세포 내에 존재할 수 있는 하나 이상의 선택 코돈들을 함께 포함한다.
직교형 tRNA(O-tRNA)를 생산하는 방법에 관하여는 공지되어 있다. 본 발명의 임의의 구체예에서, O-tRNA는 돌연 변이 라이브러리를 생산함으로써 생산될 수 있다. 돌연 변이 tRNA의 라이브러리는 당 업계에 공지된 다수의 돌연 변이 유발법을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 돌연 변이 tRNA는 위치 특이적 돌연 변이법, 랜덤 점 돌연 변이법, 상동성 재조합법, DNA 셔플링(DNA shuffling) 또는 기타 반복적 돌연 변이 유발법, 키메라 구성법 또는 이들 방법의 임의의 병행법에 의해 생산될 수 있다.
부가의 돌연 변이가 특정 위치(들) 예를 들어, 비보존적 위치, 또는 보존적 위치, 랜덤한 위치(들) 또는 tRNA의 원하는 루프 또는 영역을 한꺼번에 조합한 위치 예를 들어, 안티코돈 루프, 수용체 줄기, D 팔 또는 루프, 가변 루프, TPC 팔(arm) 또는 루프, tRNA 분자의 기타 영역 또는 이들 위치 또는 영역을 조합한 위치 또는 영역에 도입될 수 있다. 통상적으로, tRNA에 발생하는 돌연 변이로서는, 선택 코돈을 인식할 수 있도록 만드는 돌연 변이 tRNA 라이브러리의 각각의 일원의 안티코돈 루프를 돌연 변이시키는 것을 포함한다. 이 방법은 또한 O-tRNA에 부가 서열을 부가시키는 것을 포함할 수 있다. 통상적으로, O-tRNA는 출발 물질 예를 들어, 복수개의 tRNA 서열에 비하여 대상 유기체의 직교성(orthogonality)이 개선되는 반면에, 원하는 RS에 대한 이것의 친화성은 보존된다.
본 발명의 방법은 tRNA 및/또는 아미노아실-tRNA 합성 효소의 서열의 유사성(및/또는 추론 상동성)을 분석하여, O-tRNA, O-RS 및/또는 이들의 쌍에 대한 잠재적인 후보 성분 즉, 특정 유기체에 대해 직교성일 것으로 추정되는 성분을 결정하는 단계를 포함한다. 당 업계에 공지되어 있으며, 본원에 개시된 컴퓨터 프로그램이 분석용으로 사용될 수 있는데, 예를 들어, BLAST 및 파일 업 프로그램이 사용될 수 있다. 하나의 예에서, 이. 콜라이 내에서 사용되는 유효한 직교형 번역 성분을 선택하기 위하여, 진정 세균 유기체에 대해 서열 유사성이 낮은 합성 효소 및/또는 tRNA를 선택한다.
통상적으로, O-tRNA는 예를 들어, 제1 종의 세포 군집을 예를 들어, 음성 선별하여 얻을 수 있는데, 이 경우, 세포는 다수의 잠재적 O-tRNA의 일원을 포함한다. 음성 선별로 말미암아, 세포에 내인성인 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)에 의해 아미노아실화된 잠재적인 O-tRNA 라이브러리 일원을 포함하는 세포를 제거하게 된다. 이로써, 제1 종의 세포에 직교성인 tRNA 풀이 제공된다.
임의의 구체예에서, 음성 선별에 있어서, 선택 코돈은 음성 선별 마커 예를 들어, 항생제 내성을 부여하는 효소 예를 들어, β-락타마제, 검출 가능한 생산물을 부여하는 효소 예를 들어, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 예를 들어, 독성 생산물 예를 들어, 바나제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를, 불 필수 위치(예를 들어, 여전히 기능성 바나제를 생산하는 위치)에 도입된다. 스크리닝/선별 과정은 선별 제제(예를 들어, 항생제 예를 들어, 암피실린)의 존재 하에서, 세포 군집을 배양함으로써 수행한다. 하나의 구체예에서, 선별 제제의 농도는 다양하다.
예를 들어, 억제 tRNA의 활성을 측정하기 위하여, 선택 코돈의 생체 내 억제를 바탕으로 하는 선별 시스템 예를 들어, 음성 선별 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 예를 들어, β-락타마제에 대한 유전자(bla)에 넌센스(예를 들어, 종결) 또는 틀 이동 돌연 변이가 도입된 시스템을 사용한다. 예를 들어, 임의의 위치(예를 들어, A184)에 선택 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드 변이체 예를 들어, bla 변이체가 구성된다. 세포 예를 들어, 세균은 이와 같은 폴리뉴클레오티드로 형질 전환된다. 내인성 이. 콜라이 합성 효소에 의해 효과적으로 하전되지 못하는 직교형 tRNA의 경우, 항생제 내성 예를 들어, 암피실린 내성은 플라스미드로 형질 전환되지 않은 세균에 있어서의 내성과 비슷하거나 그 이하일 것이다. 만일 이 tRNA가 직교형이 아니거나, 또는 tRNA를 하전할 수 있는 이종 합성 효소가 시스템 내에서 함께 발현되면, 높은 수준의 항생제 내성 예를 들어, 암피실린 내성이 관찰된다. 항생제 농도가 플라스미드로 형질 전환되지 않은 세포에서의 항생제 농도와 거의 동일한 LB 아가 평판 상에서 배양될 수 없는 세포 예를 들어, 세균이 선택된다.
독성 생성물(예를 들어, 리보뉴클레아제 또는 바나제)의 경우, 다수의 잠재적 tRNA 일원이 내인성 숙주 예를 들어, 에스케리치아 콜라이 합성 효소에 의해 아미노아실화될 때(즉, 숙주 예를 들어, 에스케리치아 콜라이 합성 효소에 직교형이 아닐 때), 선택 코돈은 억제되며, 생산된 독성 폴리뉴클레오티드 생산물은 세포를 사멸시키게 된다. 직교형 tRNA 또는 비-기능성 tRNA를 보유하는 세포는 생존하게 된다.
하나의 구체예에서, 선택 코돈이 예를 들어, 약물 내성 유전자 예를 들어, β-락타마제 유전자에 의해 암호화되는 양성 선별 마커 내에 존재하는, 대상 유기체에 직교성인 tRNA 풀은 이후, 양성 선별된다. 양성 선별은 세포에 직교성인 tRNA 풀의 일원을 암호화하거나 포함하는 폴리뉴클레오티드, 양성 선별 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 그리고 동족 RS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포 상에서 수행된다. 임의의 구체예에서, 세포의 제2 군집은 음성 선별에 의해 제거되지 않은 세포를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 세포 내에서 발현되며, 이 세포는 선별 제제 예를 들어, 암피실린의 존재 하에서 배양한다. 이후, tRNA는 함께 발현된 동족 합성 효소에 의해 아미노아실화되는 능력과 상기 선택 코돈에 대응하여 아미노산을 삽입하는 능력에 대해 선별된다. 통상적으로, 이와 같은 세포는 비-기능성 tRNA 또는 목적 합성 효소에 의해 효과적으로 인식될 수 없는 tRNA를 보유하는 세포에 비하여, 억제 효율이 증가함을 알 수 있다. 상기 비-기능성 tRNA 또는 목적 합성 효소에 의해 효과적으로 인식되지 않는 tRNA를 보유하는 세포는 항생제에 대해 감수성이다. 그러므로, (i) 숙주의 내인성 합성 효소 예를 들어, 에스케리치아 콜라이의 합성 효소에 대한 기질이 아니고; (ii) 목적 합성 효소에 의해 아미노아실화될 수 있으며; (iii) 번역시 기능을 가지는 tRNA는 상기 양 선별 과정에서 생존한다.
그러므로, 동일한 마커는 그것이 스크리닝되는 방법에 따라서, 양성 마커 또는 음성 마커일 수 있다. 즉, 상기 마커가 스크리닝되면 양성 마커인 것이고, 상기 마커가 스크리닝되지 않으면 음성 마커인 것이다.
전술한 방법에 있어서, 선별 예를 들어, 양성 선별, 음성 선별 또는 양성 및 음성 선별 둘 다의 엄중도로서는, 임의로 다양화된 선별 엄중도를 포함한다. 예를 들어, 바나제는 독성이 강한 단백질이므로, 음성 선별의 엄중도는 상이한 수의 선택 코돈을 바나제 유전자에 도입하고/도입하거나, 유도성 프로모터를 사용함으로써 조절될 수 있다. 다른 구체예에서, 선별 제제 또는 스크리닝 제제의 농도(예를 들어, 암피실린 농도)는 다양하다. 본 발명의 몇몇 측면에서, 원하는 활성은 초기 단계에서 낮을 수 있으므로 상기 엄중도는 다양하다. 그러므로, 낮은 엄중도 선별 기준은 초기 선별 단계에서 적용되며, 높은 엄중도 선별 기준은 후기 선별 단계에서 적용된다. 임의의 구체예에서, 음성 선별, 양성 선별, 또는 음성 및 양성 선별 둘 다는 다수 회 반복될 수 있다. 다수의 상이한 음성 선별 마커, 양성 선별 마커, 또는 음성 및 양성 선별 마커 둘 다가 사용될 수 있다. 임의의 구체예에서, 양성 및 음성 선별 마커는 동일할 수 있다.
또 다른 유형의 선별/스크리닝 방법이, 선택 코돈에 대응하여 비천연 아미노산을 운반하는 직교형 번역 성분 예를 들어, O-tRNA, O-RS 및 O-tRNA/O-RS 쌍을 생산하기 위하여 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 음성 선별 마커, 양성 선별 마커, 또는 음성 및 양성 선별 마커 둘 다는 적당한 반응물의 존재 하에서 발광 반응을 촉진하거나 형광을 내는 마커를 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 마커의 생산물은 형광 활성화 세포 분류법(FACS) 또는 발광법에 의해 검출된다. 임의로, 상기 마커는 친화성계 스크리닝 마커를 포함한다. 문헌[Francisco, J. A.외 다수, (1993) Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 90: 10444-8]을 참조하시오.
재조합 직교형 tRNA를 생산하는 부가의 방법에 관하여는 문헌[국제 특허 출원 공보 WO 2002/086075(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); WO 2004/094593(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); 및 WO 2005/019415(2004년 7월 7일)]에서 살펴볼 수 있다. 또한, 문헌[Forster외 다수, (2003) Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo PNAS 100(11):6353-6357; 및 Feng외 다수, (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100(10): 5676-5681]을 참조하시오.
직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)
본 발명에 사용되는 O-RS는 시험관 내 또는 생체 내에서, 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. O-RS는, O-RS를 포함하는 폴리펩티드 및/또는 O-RS 또는 이의 일부를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 의해, 번역 시스템 예를 들어, 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, O-RS는 당 업계에 공지된 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함한다. 다른 예에서, O-RS 또는 이의 일부는 서열 목록 또는 본원의 실시예에 개시된 서열을 포함하는 아미노산을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 상보성 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된다. 예를 들어, 유용한 O-RS 분자의 서열에 관한 도 8을 참조하시오.
직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS) 예를 들어, O-tRNA와 함께 사용되는 O-RS를 동정하는 방법이 공지되어 있다. 예를 들어, 이와 같은 방법은 제1 종의 세포 군집을 선별(예를 들어, 양성 선별)하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 세포는 개별적으로 다음의 것들을 포함한다: 1) 다수의 아미노아실-tRNA 합성 효소(RS)의 일원(예를 들어, 다수의 RS는 돌연 변이 RS, 제1 종 이외의 종으로부터 유래하는 RS, 또는 돌연 변이 RS와 제1 종 이외의 종으로부터 유래하는 RS 둘 다를 포함할 수 있음); 2) 직교형 tRNA(O-tRNA)(예를 들어, 하나 이상의 종으로부터 유래하는 것); 및 3) (예를 들어, 양성) 선별 마커를 암호화하고 하나 이상의 선택 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드. 세포는 다수의 RS 일원이 결여되었거나, 또는 그 수가 감소한 세포에 비하여, 억제 효율이 증가한 세포로서 선별 또는 스크리닝된다. 억제 효율은 당 업계에 공지되어 있으며, 본원에 개시된 기술에 의해 측정될 수 있다. 억제 효율이 증가한 세포는 O-tRNA를 아미노아실화하는 활성 RS를 포함한다. 제1 종으로부터 유래하는 tRNA의 제1 세트의 활성 RS에 의한 (시험관 내 또는 생체 내) 아미노아실화 수준은, 제2 종으로부터 유래하는 제2 세트 tRNA의 활성 RS에 의한 (시험관 내 또는 생체 내) 아미노아실화 수준에 비교된다. 아미노아실화 수준은 검출 가능한 물질(예를 들어, 표지화된 비천연 아미노산)에 의해 측정될 수 있다. tRNA의 제1 세트에 비하여, tRNA의 제2 세트를 더욱 효과적으로 아미노아실화하는 활성 RS가 통상적으로 선택되며, 이로써, O-tRNA와 함께 사용되는, 효과적인(최적화된) 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소가 제공된다. 이 방법에 의해 동정된 O-RS는 또한 본 발명의 특징을 이룬다.
다수의 검정법 중 임의의 방법이 아미노아실화를 측정하는데 사용될 수 있다. 이와 같은 검정법은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 아미노아실화 검정법에 관하여는 예를 들어, 문헌[Hoben and Soll (1985) Methods Enzymol. 113:55-59]에 개시되어 있다. 아미노아실화는 또한 직교형 번역 성분과 리포터를 함께 사용하여, 단백질을 암호화하는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 발현하는 세포에서 이 리포터를 검출함으로써 측정될 수 있다. 문헌[WO 2002/085923(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS") 및 WO 2004/094593(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE.")]을 참조하시오.
동정된 O-RS는 또한 합성 효소의 기질 특이성을 변경시키도록 조작될 수도 있는데, 그 결과, 일반적 20개 아미노산 중 임의의 것이 아닌, 원하는 비천연 아미노산만이 O-tRNA에 하전된다. 비천연 아미노산에 대하여 기질 특이성을 가지는 직교형 아미노아실 tRNA 합성 효소를 생산하는 방법으로서는, 합성 효소를 돌연 변이시키는 것 예를 들어, 합성 효소 내 활성 위치, 합성 효소 내 편집 기구 위치(editing mechanism site), 합성 효소의 상이한 도메인들을 조합함으로 인해 생성된 상이한 위치들을 돌연 변이시키는 것과, 선별 과정을 실시하는 것을 포함한다. 양성 선별 이후 음성 선별을 수행하는 것을 바탕으로 하는 기술이 사용된다. 양성 선별에 있어서, 양성 마커의 불 필수 위치(들)에 도입된 선택 코돈을 억제함으로써, 양성 선별 압 하에서 세포가 생존할 수 있다. 천연 아미노산 및 비천연 아미노산 둘 다 존재할 경우, 생존 세포는 천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 중 어느 하나를 가지는 직교형 억제 tRNA를 하전시키는 활성 합성 효소를 암호화한다. 음성 선별에 있어서, 음성 마커의 불 필수 위치(들)에 도입된 선택 코돈을 억제하면, 천연 아미노산 특이성을 가지는 합성 효소가 제거된다. 음성 및 양성 선별에서 살아남은 세포는 비천연 아미노산만을 가지는 직교형 억제 tRNA를 아미노아실화(하전)하는 합성 효소를 암호화한다. 이와 같은 합성 효소들을 대상으로 하여, 이후 추가의 돌연 변이 유발법 예를 들어, DNA 셔플링 또는 기타 반복적 돌연 변이 유발법이 수행될 수 있다.
돌연 변이 O-RS 라이브러리는 당 업계에 공지된 다양한 돌연 변이 유발 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 돌연 변이 RS는 위치 특이적 돌연 변이, 랜덤 점 돌연 변이, 상동성 재조합법, DNA 셔플링 또는 기타 반복적 돌연 변이 유발법, 키메라 구성법 또는 이들 방법의 임의의 병행법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 돌연 변이 RS의 라이브러리는 2개 이상의 기타 라이브러리 예를 들어, 소형이며, 다양성이 작은 "서브-라이브러리(sub-library)"로부터 생산될 수 있다. RS의 키메라 라이브러리도 본 발명에 포함된다. 다양한 유기체(예를 들어, 미생물 예를 들어, 진정 세균 또는 고 세균)으로부터 유래하는 tRNA 합성 효소 라이브러리 예를 들어, 천연의 다양성을 포함하는 라이브러리[예를 들어, 미국 특허 제6,238,884호(Short외 다수); 미국 특허 제5,756,316호(Schallenberger외 다수); 미국 특허 제5,783,431호(Petersen외 다수); 미국 특허 제5,824,485호(Thompson외 다수); 미국 특허 제5,958,672호(Short외 다수) 참조]는 임의로 구성되어 직교형 쌍에 대해 스크리닝됨에 주목해야 할 것이다.
일단 합성 효소에 양성/음성 선별/스크리닝 기술을 적용시킨 다음, 이러한 합성 효소들을 대상으로 추가의 돌연 변이 유발법을 수행할 수 있다. 예를 들어, O-RS를 암호화하는 핵산이 분리될 수 있으며; (예를 들어, 랜덤 돌연 변이 유발법, 위치 특이적 돌연 변이 유발법, 재조합법 또는 이들 방법의 임의의 병행법에 의해) 돌연 변이된 O-RS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 세트가 핵산으로부터 생산될 수 있으며; 이와 같은 각각의 단계들 또는 이러한 단계의 조합은 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 돌연 변이 O-RS가 얻어질 때까지 반복 수행될 수 있다. 본 발명의 몇몇 측면에 있어서, 이와 같은 단계들은 다수 회 예를 들어, 2회 이상 수행된다.
O-tRNA, O-RS 또는 이들의 쌍을 생산하기 위한 본 발명의 방법에 있어서, 선별/스크리닝 엄중도 수준을 추가로 이용할 수 있다. 선별 또는 스크리닝 엄중도는 O-RS를 생산하는 방법의 한 단계 또는 두 단계에서 다양할 수 있다. 이와 같이 엄중도를 다양하게 하는 방법으로서는, 사용되는 선별 제제/스크리닝 제제의 양을 바꾸어주는 것을 포함할 수 있었다. 양성 및/또는 음성 선별 과정 중 추가의 단계가 수행될 수도 있다. 선별 또는 스크리닝 과정은 또한 아미노산 투과도, 번역 효율, 번역 신뢰도 등에서 하나 이상을 바꾸는 것을 포함할 수도 있다. 통상적으로, 하나 이상의 변화는 직교형 tRNA-tRNA 합성 효소 쌍이 단백질을 생산하는데 사용되는 유기체 내에 존재하는 하나 이상의 유전자를 돌연 변이시키는 것을 바탕으로 한다.
O-RS를 생산하고, 합성 효소의 기질 특이성을 바꾸어주는 것에 관한 부연 설명은 문헌[국제 특허 출원 공보 WO 2002/086075(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); 및 WO 2004/094593(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE."]에서 살펴볼 수 있다. 뿐만 아니라, 문헌[Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); 본 문헌의 내용은 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용됨]도 참조하시오.
공급원 및 숙주 유기체
본 발명에 사용되는 직교형 번역 성분(O-tRNA 및 O-RS)은 본 발명의 O-tRNA/O-RS 성분과 숙주 시스템이 직교형 방식으로 작용하는, 임의의 기타 종으로부터 유래하는 숙주 번역 시스템을 사용함에 있어서, 임의의 유기체(또는 유기체의 조합체)로부터 유래될 수 있다. 동일한 유기체로부터 유래하는 직교형 쌍의 O-tRNA와 O-RS가 필요하지는 않다. 몇몇 측면에서, 직교형 성분은 진정 세균 숙주 시스템에서 사용되는 고세균의 유전자(즉, 원시세균 유전자)로부터 유래한다.
예를 들어, 직교형 O-tRNA는 고세균 유기체 예를 들어, 고 세균 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬, 메타노박테리움 서모오토트로피큠, 할로박테리움 예를 들어, 할로페랙스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아카에오글로버스 펄기두스, 파이로코커스 퓨리오서스, 파이로코커스 호리코시, 아에유로피륨 페르닉스, 메타노코커스 마리팔루디스, 메타노파이러스 칸들러리, 메타노사르시나 마제이(Mm), 파이로바큘럼아에로필럼, 파이로코커스 어비시, 설포로버스 솔파타리쿠스(Ss), 설포로버스 토코다이, 서모플라스마 액시도필럼 및 서모플라스마 볼카니움 등, 또는 진정 세균 예를 들어, 에스케리치아 콜라이, 서머스 서모필러스 및 바실러스 스테아로서모필러스 등으로부터 유래할 수 있는 반면에, 직교형 O-RS는 유기체 또는 유기체의 조합 예를 들어, 고세균 예를 들어, 메타노코커스 재너쉬, 메타노박테리움 서모오토트로피큠, 할로박테리움 예를 들어, 할로페랙스 볼카니 및 할로박테리움 종 NRC-1, 아카에오글로버스 펄기두스, 파이로코커스 퓨리오서스, 파이로코커스 호리코시, 아에유로피륨 페르닉스, 메타노코커스 마리팔루디스, 메타노파이러스 칸들러리, 메타노사르시나 마제이, 파이로바큘럼 아에로필럼, 파이로코커스 어비시, 설포로버스 솔파타리쿠스, 설포로버스 토코다이, 서모플라스마 액시도필럼 및 서모플라스마 볼카니움 등, 또는 진정 세균 예를 들어, 에스케리치아 콜라이, 서머스 서모필러스 및 바실러스 스테아로서모필러스 등으로부터 유래할 수 있다. 하나의 구체예에서, 진핵 생물 공급원 예를 들어, 식물, 조류, 원생 생물, 진균, 효모, 동물(예를 들어, 포유동물, 곤충 및 절지 동물 등) 등은 O-tRNA 및 O-RS의 공급원으로서 사용될 수도 있다.
O-tRNA/O-RS 쌍의 각각의 성분은 동일한 유기체 또는 상이한 유기체로부터 유래할 수 있다. 하나의 구체예에서, O-tRNA/O-RS 쌍은 동일한 유기체로부터 유래한다. 대안적으로, O-tRNA/O-RS 쌍의 O-tRNA 및 O-RS는 상이한 유기체로부터 유래한다.
O-tRNA, O-RS 또는 O-tRNA/O-RS 쌍은 생체 내 또는 시험관 내에서 선별 또는 스크리닝될 수 있으며/있거나, 세포 예를 들어, 진정 세균 세포 내에서 사용될 수 있으며, 그 결과, 비천연 아미노산을 가지는 폴리펩티드가 생산될 수 있다. 사용된 진정 세균 세포의 예로서는, 에스케리치아 콜라이, 서머스 서모필러스, 바실러스 스테아로서모필러스 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 번역 성분을 포함하는 진정 세균 세포 조성물도 본 발명의 특징을 이룬다.
다른 종에 사용하기 위하여, 하나의 종에 존재하는 O-tRNA 및/또는 O-RS를 스크리닝하는 것에 관한 문헌[국제 특허 출원 공보 WO 2004/094593(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE")(2004년 4월 16일)]을 참조하시오.
몇몇 측면에서, O-tRNA, O-RS 또는 O-tRNA/O-RS 쌍은 생체 내 또는 시험관 내에서 선별 또는 스크리닝될 수 있으며/있거나, 비천연 아미노산을 가지는 폴리펩티드를 생산하기 위하여 세포 예를 들어, 진핵 생물 세포 내에서 사용될 수 있다. 이와 같은 진핵 생물 세포 예를 들어, 임의의 적당한 효모 세포 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae; S. cerevisiae)가 사용될 수 있다. 본 발명의 번역 성분들을 포함하는 진핵 생물 세포의 조성물도 본 발명의 특징을 이룬다.
비록 (예를 들어, O-RS, O-tRNA 및 비천연 아미노산을 포함하는) 직교형 번역 시스템이, 비천연 아미노산을 가지는 단백질을 생산하기 위해 배양된 숙주 세포를 이용할 수 있지만, 본 발명의 직교형 번역 시스템은 원 상태의 생존 숙주 세포를 필요로 하는 것은 아니다. 예를 들어, 직교형 번역 시스템은 세포 추출물의 존재 하에서 무세포 시스템을 이용할 수 있다. 실제로, 단백질 생산용인 무세포 시험관 내 전사/번역 시스템을 사용하는 기술이 널리 확립되어 있다. 이와 같은 시험관 내 시스템을 개량하여, 본원에 개시된 직교형 번역 시스템 성분을 사용하여 비천연 아미노산을 가지는 단백질을 생산하는 것은 본 발명의 범위 내에 있는 것이다.
선택 코돈
직교형 번역 시스템 내 선택 코돈은 단백질 생합성 기구의 유전적 암호 틀을 확장한다. 예를 들어, 선택 코돈은 유일 3 염기 코돈, 넌센스 코돈 예를 들어, 종결 코돈 예를 들어, 앰버 코돈(UAG) 또는 오팔 코돈(UGA), 인위적 코돈, 4 염기 이상으로 이루어진 코돈, 희귀 코돈 등을 포함한다. 다수의 선택 코돈이 원하는 유전자 예를 들어, 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상의 유전자에 도입될 수 있다. 상이한 선택 코돈을 사용함으로써, 3개의 상이한 선택 코돈을 사용하여 다수의 비천연 아미노산 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 위치 특이적으로 동시에 통합할 수 있는 다수의 직교형 tRNA/합성 효소 쌍이 사용될 수 있다.
하나의 구체예에서, 본 발명의 방법은 세포 내에서 비천연 아미노산을 폴리펩티드로 생체 내 통합하는데 사용되는 종결 코돈인 선택 코돈을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 종결 코돈을 인식하고 비천연 아미노산을 가지는 O-RS에 의하여 아미노아실화된 O-tRNA가 생산된다. 이와 같은 O-tRNA는 숙주의 천연 아미노아실-tRNA 합성 효소에 의해 인식되지 않는다. 종래의 위치 지정 돌연 변이 유발법은 목적으로 하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 내 목적 위치에 종결 코돈을 도입하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sayers외 다수 (1988), 5',3' Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 791-802]을 참조하시오. O-RS, O-tRNA 및 목적으로 하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 예를 들어, 생체 내 조합되면, 비천연 아미노산은 종결 코돈에 대응하여 통합되고, 그 결과, 특정 위치에 비천연 아미노산이 포함된 폴리펩티드가 생성된다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 선택 코돈으로서 사용된 종결 코돈으로서는 앰버 코돈, UAG 및/또는 오팔 코돈, UGA가 있다. 하나의 예에서, UAG 및 UGA 둘 다 선택 코돈으로서 사용된 유전 암호는 가장 풍부한 종결 신호인 오커 넌센스 코돈 UAA를 보존하면서 22개의 아미노산을 암호화할 수 있다.
비천연 아미노산을 생체 내 통합하는 과정은 숙주 세포를 거의 파괴하지 않고서도 행하여질 수 있다. 예를 들어, 비-진핵 생물 세포 예를 들어, 에스케리치아 콜라이에 있어서는, UAG 코돈에 대한 억제 효율이 O-tRNA 예를 들어, 앰버 억제 tRNA와 방출 인자 1(RF1)(UAG 코돈에 결합하여, 리보좀으로부터 연장되고 있는 펩티드의 방출을 개시하는 인자) 사이에서 일어나는 경쟁 결과에 따라서 달라지므로, 억제 효율은 예를 들어, O-tRNA 예를 들어, 억제 tRNA의 발현 수준을 증가시키거나, 또는 RF1 결핍 균주를 사용함으로써 조정될 수 있다. 진핵 생물 세포에 있어서는, UAG 코돈에 대한 억제 효율이 O-tRNA 예를 들어, 앰버 억제 tRNA와 진핵 생물 방출 인자(예를 들어, eRF)(종결 코돈에 결합하여, 리보좀으로부터 연장되고 있는 펩티드의 방출을 개시하는 인자) 사이의 경쟁 결과에 따라서 달라지므로, 억제 효율은 예를 들어, O-tRNA 예를 들어, 억제 tRNA의 발현 수준을 증가시킴으로써 조정될 수 있다. 뿐만 아니라, 부가의 화합물 예를 들어, 환원제 예를 들어, 디티오트레이톨(DTT)도 존재할 수 있다.
비천연 아미노산도 희귀 코돈과 함께 암호화될 수 있다. 예를 들어, 시험관 내 단백질 합성 반응에 있어서 아르기닌의 농도가 감소할 때, 희귀 아르기닌 코돈인 AGG는 알라닌으로 아실화된 합성 tRNA에 의해 Ala를 효율적으로 삽입하는 것으로 판단된다. 예를 들어, 문헌[Ma외 다수, Biochemistry. 32:7939 (1993)]을 참조하시오. 이 경우, 합성 tRNA는 에스케리치아 콜라이 내에 소수 존재하는 천연 tRNAArg과 경쟁하게 된다. 뿐만 아니라, 몇몇 유기체는 모든 3중 코돈을 이용하지 않는다. 메타노코커스 루테우스 내에 할당되지 않은 코돈인 AGA는 시험관 내 전사/번역 추출물 중에서 아미노산을 삽입하는데 이용되었다. 예를 들어, 문헌[Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997)]을 참조하시오. 본 발명의 성분은 이와 같은 희귀 코돈을 생체 내에서 사용하도록 생산될 수 있다.
선택 코돈은 또한 연장된 코돈 예를 들어, 4 염기 이상의 코돈 예를 들어, 4 염기, 5 염기, 6 염기 또는 그 이상의 염기로 이루어진 코돈을 포함할 수도 있다. 4 염기 코돈의 예로서는 AGGA, CUAG, UAGA 및 CCCU 등을 포함한다. 5 염기 코돈의 예로서는 AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU 및 UAGGC 등을 포함한다. 본 발명의 방법은 틀 이동 억제를 바탕으로 하여 연장된 코돈을 사용하는 단계를 포함한다. 4 염기 이상의 염기로 이루어진 코돈은 예를 들어, 1개 또는 복수개의 비천연 아미노산을 동일한 단백질에 삽입할 수 있다. 다른 구체예에서, 안티코돈 루프는 예를 들어, 4 염기 이상의 염기로 이루어진 코돈, 5 염기 이상의 염기로 이루어진 코돈 또는 6 염기 이상의 염기로 이루어진 코돈 또는 그 이상의 염기로 이루어진 코돈을 해독할 수 있다. 4 염기 코돈으로서는 256개가 있을 수 있으므로, 다수의 비천연 아미노산은 4개 이상의 염기로 이루어진 코돈을 이용하여 동일한 세포 내에서 암호화될 수 있다. 문헌[Anderson외 다수, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; 및, Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769]을 참조하시오.
예를 들어, 시험관 내 생합성 방법을 이용하여, 비천연 아미노산을 단백질에 통합하는데 4 염기 코돈이 사용되었다. 예를 들어, 문헌[Ma외 다수, (1993) Biochemistry, 32:7939; 및 Hohsaka외 다수, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:34]을 참조하시오. CGGG 및 AGGU는 2-나프틸알라닌과 리신의 NBD 유도체를 시험관 내에서, 2개의 화학적으로 아실화된 틀 이동 억제 tRNA와 함께, 스트렙타비딘에 동시에 통합하는데 사용되었다. 문헌[Hohsaka외 다수, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121:12194]을 참조하시오. 생체 내 연구에 있어서, 무어(Moore)외 다수는 UAGN 코돈(여기서, N은 U, A, G 또는 C일 수 있음)을 억제하는 NCUA 안티 코돈을 가지는 tRNALeu 유도체의능력을 관찰한 결과, 4중체 UAGA는 안티코돈 UCUA를 가지는 tRNALeu에 의해 13∼26%의 효율로 0 또는 -1 틀에서 다소 해독될 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 문헌[Moore외 다수, (2000) J. Mol. Biol., 298:195]을 참조하시오. 하나의 구체예에서, 희귀 코돈이나 넌센스 코돈을 바탕으로 하는 연장 코돈이 본 발명에서 사용될 수 있으며, 그 결과, 기타 원치 않던 위치에서 미스 센스 통독 및 틀 이동 억제를 감소시킬 수 있다. 4 염기 코돈을 다양한 직교형 시스템 내에서 선택 코돈으로서 사용하였다. 예를 들어, 문헌[WO 2005/019415; WO 2005/007870 및 WO 2005/07624]을 참조하시오. 또한, 문헌[Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); 그 내용은 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용됨]을 참조하시오. 이하 실시예에서는 앰버 선택 코돈을 사용하였지만, 다양한 비천연 아미노산 O-RS에 관하여 전술한 바와 같은 것과 유사하게 돌연 변이를 포함하도록 변형된, 4 염기 O-tRNA와 합성 효소를 포함하도록, 본원의 실시예들을 변형시킴으로써, 4 염기 이상의 염기로 이루어진 코돈을 사용할 수도 있다.
소정의 시스템에 있어서, 선택 코돈은 또한 천연의 3 염기 코돈 중 하나를 포함할 수도 있는데, 이 경우 내인성 시스템은 천연 염기 코돈을 이용하지 않는다(또는 거의 드물게 사용한다). 예를 들어, 이 시스템으로서는 천연 3 염기 코돈을 인식하는 tRNA 결여 시스템, 및/또는 3 염기 코돈이 희귀 코돈인 시스템을 포함한다.
선택 코돈은 임의로는 인위적 염기 쌍을 포함한다. 이와 같은 인위적 염기 쌍은 현존하는 유전자 알파벳을 더욱 증가시킨다. 하나의 잉여 염기 쌍은 3중 코돈의 수를 64개에서 125개로 증가시킨다. 세 번째 염기 쌍의 특성으로서는, 안정하고 선택적인 염기 쌍을 형성하는 특성, 효소 즉, 중합 효소에 의해 높은 신뢰도로 DNA에 효율적으로 통합되는 특성, 그리고 초기의 인위적 염기 쌍을 합성한 후 계속적으로 프라이머를 효율적으로 연장하는 특성을 포함한다. 본 발명의 방법과 조성물에 적당할 수 있는 인위적 염기 쌍에 관한 설명은 예를 들어, 문헌[Hirao외 다수, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182]에 개시되어 있다. 또한, 문헌[Wu, Y.외 다수, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630]을 참조하시오. 기타 관련 문헌들은 이하에 나열되어 있다.
생체 내 사용에 있어서, 인위적 뉴클레오시드는 막 투과성으로서, 인산화되어 상응하는 삼인산염을 형성한다. 뿐만 아니라, 유전 정보가 안정적으로 증가하여, 세포 효소에 의해서도 파괴되지 않는다. 베너(Benner)외 다수에 의해 행해진 이전의 연구에서는, 통상적인 왓슨-크릭 쌍에 있던 수소 결합 패턴과는 상이한 수소 결합 패턴을 이용하였는데, 이에 관하여 가장 주목할만한 예로서는 이소-C:이소-G 쌍이 있다. 예를 들어, 문헌[Switzer외 다수, (1989) J. Am. Chem. Soc. 111:8322; 및 Piccirilli외 다수, (1990) Nature, 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602]을 참조하시오. 이와 같은 염기들은 일반적으로 천연 염기들과 어느 정도 오류 쌍을 형성하게 되며, 효소에 의해서 복제될 수도 없다, 쿨(Kool)외 다수는, 염기들 간 소수성 팩킹 상호 작용(hydrophobic packing interaction)은 수소 결합을 대신하여 염기 쌍을 형성시킬 수 있다고 하였다[Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; 및 Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.. 36, 2825]. 전술한 조건들을 모두 만족시키는 인위적 염기 쌍을 개발하려는 노력에 있어서, 슐츠(Schultz) 및 로메스버그(Romesburg)와 그의 동료들은 일련의 인위적 소수성 염기들을 체계적으로 합성하여 연구하였다. PICS:PICS 자기-쌍은 천연 염기 쌍보다 더 안정적인 것으로 파악되며, 에스케리치아 콜라이 DNA 중합 효소 I의 클레노우 단편(Klenow fragment)(KF)에 의해 DNA에 효율적으로 통합될 수 있다. 예를 들어, 문헌[McMinn외 다수, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121:11586; 및 Ogawa외 다수, (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:3274]을 참조하시오. 3MN:3MN 자기-쌍은 KF에 의해, 생물 기능에 대해 충분히 효율적이고 선택적으로 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ogawa외 다수, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:8803]을 참조하시오. 그러나, 양 염기들은 추가의 복제에 대한 사슬 종결부위로서 작용을 한다. 최근 들어, PICS 자기-쌍을 복제하는데 사용될 수 있는 돌연 변이 DNA 중합 효소가 개발되었다. 뿐만 아니라, 7AI 자기-쌍은 복제될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Tae외 다수, (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439]을 참조하시오. Cu(II)와 결합할 때 안정한 쌍을 형성하는 신규의 메탈로염기 쌍인 Dipic:Py도 개발되었다. 문헌[Meggers외 다수, (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:10714]을 참조하시오. 연장된 코돈 및 인위적 코돈은 천연 코돈에 대해 원래부터 직교성이므로, 본 발명의 방법은 이 코돈에 대한 직교형 tRNA를 생성하는 특성을 이용할 수 있다.
번역 우회 시스템(translation bypassing system)은 또한 원하는 폴리펩티드 내에 비천연 아미노산을 통합시키는데 사용될 수도 있다. 번역 우회 시스템에 있어서, 대형 서열은 유전자 내에 삽입되지만, 단백질로 번역되지는 않는다. 상기 서열은, 리보좀이 서열을 뛰어 넘어 삽입부 하류의 번역을 재개하도록 유도하는 역할을 담당하는 구조를 포함한다.
비천연 아미노산
본원에 사용된 비천연 아미노산이란, 셀레노시스테인 및/또는 피롤리신과 20개의 유전적으로 암호화된 알파-아미노산[알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소루신, 루신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린] 이외의 임의의 아미노산, 변형된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 의미하는 것이다. 알파-아미노산의 일반 구조는 하기 화학식 I로서 나타낼 수 있다:
Figure 112008064869645-PCT00002
비천연 아미노산은 통상적으로 화학식 I의 구조를 가지는데, 여기서, 상기 R기는 20개의 천연 아미노산에 사용된 하나의 R기 이외의 임의의 치환기이다. 20개의 천연 아미노산의 구조에 관하여 기술한 문헌[Biochemistry, L. Stryer, 3rd ed. 1988, Freeman and Company, New York]을 참조하시오. 또한, 본 발명의 비천연 아미노산은 상기 20개의 알파-아미노산 이외의 천연 화합물일 수 있음에 주목하여야 할 것이다.
본 발명의 비천연 아미노산은 통상적으로 천연 아미노산과 측쇄가 상이하므로, 비천연 아미노산은 이들 아미노산이 천연 단백질을 형성하는 것과 동일한 방식으로, 기타 아미노산 예를 들어, 천연 또는 비천연 아미노산과 아미드 결합을 형성한다. 그러나, 비천연 아미노산은 천연 아미노산과 구별되는 측쇄 기를 가진다.
도 1은 본 발명의 실시예에 사용된 비천연 아미노산의 구조를 나타내는 것이다. 이와 같은 비천연 아미노산은 적당한 O-RS 및 O-tRNA 쌍을 이용하여 단백질에 통합될 수 있다. 예를 들어, p-벤조일-L-페닐알라닌(Bpa)은 서열 번호 1의 O-tRNA와 서열 번호 4의 동족 O-RS를 포함하는 직교형 번역 쌍을 이용하여 통합될 수 있다. 파라-아세틸-L-페닐알라닌(pAcPhe)은 서열 번호 1의 O-tRNA와 서열 번호 6의 동족 O-RS를 포함하는 직교형 번역 쌍을 이용하여 통합될 수 있다. 파라-아지도-L- 페닐알라닌(pAzPhe)은 서열 번호 1의 O-tRNA와 서열 번호 8의 동족 O-RS를 포함하는 직교형 번역 쌍을 이용하여 통합될 수 있다. 파라-요오도-L-페닐알라닌(pIPhe)은 서열 번호 1의 O-tRNA와 서열 번호 10의 동족 O-RS를 포함하는 직교형 번역 쌍을 이용하여 통합될 수 있다.
그러나, 본원에 사용된 비천연 아미노산은 본 발명이 보다 광범위하게 사용될 수 있음을 예시하기 위한 것이며, 본 발명은 도 1에 나타낸 아미노산을 사용하는 것에 국한되는 것은 아니다.
다수의 상이한 비천연 아미노산은 예를 들어, 적당한 제2의 O-RS/O-tRNA 쌍과 제1의 직교형 쌍을 함께 사용하여, 목적으로 하는 폴리펩티드에 동시에 통합될 수 있는데, 여기서, 상기 제1 직교형 쌍과 상기 제2 직교형 쌍은 상이한 선택 코돈을 사용한다.
예를 들어, 다른 비천연 아미노산에 있어서, 화학식 I의 R은 임의로 알킬-, 아릴-, 아실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 에테르, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 에논, 이민, 에스테르, 하이드록실아민, 아민 등, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 기타 목적으로 하는 비천연 아미노산으로서는, 광활성화 가교 링커를 포함하는 아미노산, 스핀-표지화 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속 함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규의 작용기를 가지는 아미노산, 기타 분자들과 공유적으로 또는 비 공유적으로 상호 작용하는 아미노산, 광 케이지화된 아미노산 및/또는 광 이성체화 가능한 아미노산, 바이오틴 또는 바이오틴-유사체 함유 아미노산, 케토 함유 아미노산, 글리코실화 아미노산, 아미노산 측쇄에 당 부분이 부착된 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 중원자 치환된 아미노산, 화학적으로 절단 가능하거나 광 절단 가능한 아미노산, 천연 아미노산에 비하여 측쇄가 연장된 아미노산(예를 들어, 탄소 수 약 5개 이상 및 약 10개 이상인 폴리에테르 또는 장쇄 탄화수소), 탄소-결합 당 함유 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산 및 하나 이상의 독성 부분을 함유하는 아미노산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 측면에서, 본 발명은 이하 화학식 IV에 의해 예시된 일반 구조를 가지는 비천연 아미노산을 제공한다:
Figure 112008064869645-PCT00003
이와 같은 구조를 가지는 비천연 아미노산은 통상적으로 R1이 20개의 천연 아미노산(예를 들어, 티로신 또는 페닐알라닌) 중 하나에 사용된 치환기이고, R2는 임의의 치환기인 임의의 구조를 가진다. 그러므로, 이와 같은 유형의 비천연 아미노산은 천연 아미노산 유도체로서 간주할 수 있다.
비천연 아미노산은 또한 예를 들어, 화학식 II 및 III의 구조에 의해 나타내어지는 변형된 골격 구조를 포함할 수도 있다:
Figure 112008064869645-PCT00004
Figure 112008064869645-PCT00005
[식 중,
Z는 통상적으로 OH, NH2, SH, NH-R' 또는 S-R'를 포함하고; 동일하거나 상이할 수 있는 X 및 Y는 통상적으로 S 또는 O를 포함하며, 임의로 동일하거나 상이한 R 및 R'는 통상적으로 화학식 I의 비천연 아미노산에 대해 전술한 R기와 수소에 관한 구성 성분과 수소로 이루어진 동일한 목록으로부터 선택됨]
예를 들어, 본 발명의 비천연 아미노산은 임의로는 화학식 II 및 III에 의해 나타낸 아미노기 또는 카복실기 내 치환기들을 포함한다. 이와 같은 유형의 비천연 아미노산으로서는 α-하이드록시산, α-티오산, α-아미노티오카복실레이트 예를 들어, 일반적인 20개의 천연 아미노산에 상응하는 측쇄 또는 인위적 측쇄를 가지는 것을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, α-탄소에 존재하는 치환기들로서는 임의로, L, D, 또는 α-α-이중 치환된 아미노산 예를 들어, D-글루 타메이트, D-알라닌, D-메틸-O-티로신 및 아미노부티르산 등을 포함한다. 기타 구조적 대안 성분으로서는 환형 아미노산 예를 들어, 프롤린 유사체와, 3, 4, 6, 7, 8 및 9원 고리 프롤린 유사체, β 및 γ 아미노산 예를 들어, 치환된 β-알라닌 및 γ-아미노 부티르산을 포함한다.
몇몇 측면에서, 본 발명은 L-형태의 비천연 아미노산을 이용한다. 그러나, 본 발명이 L-형태를 가지는 비천연 아미노산을 사용하는 것에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 비천연 아미노산들의 D-거울 이성체도 본 발명에 사용되는 것으로 생각된다.
티로신 유사체로서는 파라-치환된 티로신, 오르토-치환된 티로신 및 메타 치환된 티로신을 포함하며, 여기서, 상기 치환된 티로신은 알키닐기, 아세틸기, 벤조일기, 아미노기, 히드라진, 하이드록시아민, 티올기, 카복시기, 이소프로필기, 메틸기, C6∼C20 직쇄 또는 분지쇄 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, O-메틸기, 폴리에테르기 및 니트로기 등을 포함한다. 뿐만 아니라, 다중 치환된 아릴 고리도 고려 대상일 수 있다. 본 발명의 글루타민 유사체로서는 α-하이드록시 유도체, γ-치환 유도체, 환형 유도체 및 아미드 치환 글루타민 유도체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 페닐알라닌 유사체의 예로서는 파라-치환된 페닐알라닌, 오르토-치환된 페닐알라닌 및 메타-치환된 페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 여기서, 상기 치환기로서는 알키닐기, 하이드록시기, 메톡시기, 메틸기, 알릴기, 알데히드, 니트로, 티올기 또는 케토기 등을 포함한다. 비천연 아미노산의 구체예로서는 p-에틸티오카보닐-L-페닐알라닌, p-(3-옥소부타노일)-L-페닐알라닌, 1,5-댄실-알라닌, 7-아미노-쿠마린 아미노산, 7-하이드록시-쿠마린 아미노산, 니트로벤질-세린, O-(2-니트로벤질)-L-티로신, p-카복시메틸-L-페닐알라닌, p-시아노-L-페닐알라닌, m-시아노-L-페닐알라닌, 비페닐알라닌, 3-아미노-L-티로신, 비피리딜 알라닌, p-(2-아미노-1-하이드록시에틸)-L-페닐알라닌, p-이소프로필티오카보닐-L-페닐알라닌, 3-니트로-L-티로신 및 p-니트로-L-페닐알라닌을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 뿐만 아니라, p-프로파길옥시페닐알라닌, 3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌(DHP), 3,4,6-트리하이드록시-L-페닐알라닌, 3,4,5-트리하이드록시-L-페닐알라닌, 4-니트로-페닐알라닌, p-아세틸-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 3-니트로-티로신, 3-티오-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcβ-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌 및 이소프로필-L-페닐알라닌 등을 포함한다. 직교형 번역 시스템을 이용하여 통합될 수 있는 다양한 비천연 아미노산의 구조에 관하여는 공지되어 있다. 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있는 참고 문헌들을 참조하시오.
비천연 아미노산의 화학 합성
상기 비천연 아미노산의 다수가 시판중에 있다[예를 들어, Sigma(USA) 또는 Aldrich(Milwaukee, WI, USA)]. 시판되고 있지 않은 아미노산은 임의로는, 다양한 문헌에 제공된 바와 같이 합성되거나 또는 당 업자에게 공지된 표준적인 방법을 이용하여 합성된다. 유기 합성 기술에 관하여는 예를 들어, 문헌[Organic Chemistry, Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry, March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York); 및 Advanced Organic Chemistry, Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)]을 참조하시오. 비천연 아미노산을 합성하는 것에 관하여 기술하고 있는 부가의 문헌으로서는 예를 들어, 문헌[WO 2002/085923(발명의 명칭: "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids"); Matsoukas외 다수, (1995) J. Med. Chem.. 38, 4660-4669; King and Kidd (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc, 3315-3319; Friedman and Chatterrji (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig외 다수 (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1 -methylbutyl]amino]quinoline(Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay외 다수, (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials,. Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen and Rapoport (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866; Christie and Rapoport (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of(+)- Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989:1859-1866; Barton외 다수 (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-a-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43:4297-4308; 그리고, Subasinghe외 다수, (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate- sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7]을 포함한다. 또한, 국제 특허 출원 공보 WO 2004/058946(발명의 명칭: "PROTEIN ARRAYS"(2003년 12월 22일)을 참조하시오.
비천연 아미노산의 세포 내 흡수
세포에 의한 비천연 아미노산 흡수(uptake)는, 예를 들어, 단백질에 통합될 비천연 아미노산을 고안 및 선택하는데에 있어서 통상적으로 하나의 문제점으로 인식되고 있다. 예를 들어, α-아미노산의 전하 밀도가 높으면, 그러한 화합물은 세포를 투과하지 못할 것이라고 간주한다. 천연 아미노산은 종종 다양한 정도의 아미노산 특이성을 나타내는 단백질계 운반 시스템의 집합체(collection)를 통하여 세포로 흡수된다. 비천연 아미노산 중 어느 것이 세포에 의해 취하여지는지를 평가하는 스크리닝법이 신속하게 수행될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 WO 2004/058946(발명의 명칭 "Protein Arrays")(2003년12월 22일)의 독성 검정법과; 문헌[Liu and Schultz(1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS 96:4780-4785]을 참조하시오. 비록 흡수는 다양한 검정법에 의해 용이하게 분석되지만, 세포 내 흡수 경로에 순응하는 비천연 아미노산을 고안하는 것에 관한 대안은 생체 내에서 아미노산을 합성하는 생합성 경로를 제공하는 것이다.
비천연 아미노산의 생합성
아미노산과 기타 화합물을 생산하는 다수의 생합성 경로는 이미 세포 내에 존재한다. 특정 비천연 아미노산의 생합성 방법은 천연에서(예를 들어, 세포 내에서) 수행될 수 없지만, 본 발명은 그러한 방법을 제공한다. 예를 들어, 비 천연 아미노산의 생합성 경로는 신규 효소를 첨가하거나 또는 현존하는 숙주 세포 경로를 변형함으로써 숙주 세포 내에서 진행될 수 있다. 임의로, 추가의 신규 효소로서는 천연 효소 또는 인공 진화 효소가 있다. 예를 들어, p-아미노페닐알라닌의 생합성[WO 2002/085923(상동)]은 기타 유기체로부터 유래하는 공지의 효소를 조합하여 첨가함으로써 진행된다. 이러한 효소 유전자는, 상기 세포를 이 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 전환 시킴으로써, 이 세포에 도입될 수 있다. 상기 유전자가 세포 내에서 발현될 때, 이 유전자는 원하는 화합물을 합성하는 효소 경로를 제공한다. 임의로 첨가되는 효소의 종류에 관하여는 이하, 본원에 예시되어 있다. 부가의 효소 서열은 예를 들어, Genebank에서 살펴볼 수 있다. 인공적으로 진화된 효소는 동일한 방식으로 세포에 부가될 수도 있다. 이러한 방식으로, 세포의 세포 내 기구와 공급원은 조작되어 비천연 아미노산을 생산하게 되는 것이다.
실제로, 다양한 방법 중 임의의 방법이, 시험관 내 또는 생체 내에서, 생합 성 경로에 사용되는 신규의 효소를 생산하거나, 또는 현존하는 경로를 진화시키거나, 비천연 아미노산을 생산하는데 사용될 수 있다. 비천연 아미노산을 생산기 위하여(또는 실제로 새로운 기질 특이성 또는 기타 목적으로 하는 활성을 가지는 합성 효소를 진화시키기 위하여), 효소 및 기타 생합성 경로에 관여하는 성분들을 진화시키는 다수의 방법들이 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 셔플링은 임의로 비천연 아미노산을 시험관 내 또는 생체 내 생산하기 위한(또는 새로운 합성 효소를 생산하기 위한) 신규의 효소 및/또는 이러한 효소의 경로를 개발하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; 및 Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751]을 참조하시오. 관련 방법에 있어서는 관련된(예를 들어, 상동성인) 유전자군을 셔플링하여, 원하는 특성을 가지는 효소로 신속하게 진화시킨다. 이와 같은 "유전자 군 셔플링" 방법에 관한 예는 문헌[Crameri외 다수 (1998) "DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution" Nature, 391(6664): 288-291]에서 살펴볼 수 있다. 신규의 효소(생합성 경로에 관여하는 성분 또는 합성 효소)는 또한 예를 들어, 문헌[Ostermeier외 다수 (1999) "A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology" Nature Biotech 17:1205]에 개시된 바와 같은, "하이브리드 효소를 생산하기 위한 증분 절단[incremental truncation for the creation of hybrid enzymes("ITCHY")]"으로 알려진 DNA 재조합 방법을 이용하여 생산될 수도 있다. 이 방법은 또한 하나 이상의 시험관 내 또는 생체 내 재조합 방법에 대한 기질로서 사용될 수 있는 효소 라이브러리 또는 기타 경로에 관여하는 변이체를 생산하는데 사용될 수도 있다. 또한 문헌[Ostermeier외 다수 (1999) "Combinatorial Protein Engineering by Incremental Truncation," Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 3562-67, 및 Ostermeier외 다수(1999), "Incremental Truncation as a Strategy in the Engineering of Novel Biocatalysts," Biological and Medicinal Chemistry, 7: 2139-44]도 참조하시오. 기타 방법에서는 예를 들어, 비천연 아미노산을 생산하는 것과 관련된 생합성 반응을 촉매하는 능력에 대해 선택된 효소 라이브러리 또는 기타 경로에 관여하는 변이체(또는 신규의 합성 효소)를 생산하는 지수적 앙상블 돌연 변이 유발법(exponential ensemble mutagenesis)을 이용한다. 이 방법에 있어서ㄴ는목적 서열의 작은 잔기 군을 같은 종류로 랜덤화하여, 각각의 변형된 위치에서 기능성 단백질을 유도해 내는 아미노산을 동정한다. 본 발명에서 비천연 아미노산의 생산을 위한 신규 효소(또는 신규 합성 효소)를 생산하는데 적당할 수 있는 이와 같은 방법의 예에 관하여는 문헌[Delegrave and Youvan (1993) Biotechnology Research 11:1548-1552]에서 살펴볼 수 있다. 또 다른 방법에서, 효소 및/또는 경로에 관여하는 성분을 조작하기 위하여, 예를 들어, 문헌[Arkin and Youvan (1992) "Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets of amino acids for semi-random mutagenesis" Biotechnology 10:297-300; 또는 Reidhaar-Olson외 다수 (1991) "Random mutagenesis of protein sequences using oligonucleotide cassettes" Methods Enzymol. 208:564-86]에 개시된 일반적인 돌연 변이 유발법을 이용하는 돌연 변이 유발법 즉, 도핑되었거나 축퇴성인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 효소 및/또는 경로에 관여하는 성분을 조작하는 랜덤 또는 준-랜덤 돌연 변이 유발법이 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 재조립과 위치-포화 돌연 변이 유발법을 사용하는 또 다른 방법(종종 "비-확률적" 돌연 변이 유발법이라고도 칭함)도 효소 및/또는 경로에 관여하는 성분을 생산하는데 사용될 수 있는데, 이후, 상기(예를 들어, 비천연 아미노산을 생체 내 생산하기 위한) 효소 및/또는 경로에 관여하는 성분들은 그것들이 하나 이상의 합성 효소 또는 생합성 경로의 기능을 수행하는 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 문헌[WO 2000/046344(발명의 명칭: "NON-STOCHASTIC GENERATION OF GENETIC VACCINES AND ENZYMES")(Short)]을 참조하시오.
이와 같은 돌연 변이법에 대한 대안적 방법은, 유기체의 전체 게놈을 재조합하는 단계와, 결과로 생성된 자손을, 이 자손이 특정 경로를 진행시키는지 여부에 대해 선별하는 단계를 포함한다(이를 종종 "전 게놈 셔플링(whole genome shuffling)"이라 칭함). 이 방법은 예를 들어, 게놈 재조합법과, 유기체(예를 들어, 이. 콜라이 또는 기타 세포)가 비천연 아미노산(또는 이의 중간체)을 생산하는 능력을 가지는지 여부를 선별함으로써, 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 문헌들에 교시된 방법은 세포 내 현존하고/현존하거나 새로운 경로를 진화시켜, 비천연 아미노산을 생체 내에서 생산하는, 경로 디자인에 응용될 수 있다: Patnaik외 다수 (2002) "Genome shuffling of lactobacillus for improved acid tolerance" Nature Biotechnology, 20(7): 707-712; 및 Zhang외 다수 (2002) "Genome shuffling leads to rapid phenotypic improvement in bacteria" Nature, February 7, 415(6872): 644-646.
유기체 및 대사 경로 조작에 관한 기타 기술 예를 들어, 원하는 화합물의 생산 기술도 수행 가능하며, 또한 이러한 기술을 비천연 아미노산의 생산에 적용될 수도 있다. 유용한 경로 조작 방법에 관하여 교시하는 문헌의 예로서는 다음과 같은 것들을 포함한다: Nakamura and White (2003) "Metabolic engineering for the microbial production of 1,3 propanediol" Curr. Opin. Biotechnol. 14(5):454-9; Berry외 다수 (2002) "Application of Metabolic Engineering to improve both the production and use of Biotech Indigo" J. Industrial Microbiology and Biotechnology 28:127-133; Banta외 다수 (2002) "Optimizing an artificial metabolic pathway: Engineering the cofactor specificity of Corynebacterium 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase for use in vitamin C biosynthesis" Biochemistry, 41(20), 6226-36; Selivonova외 다수 (2001) "Rapid Evolution of Novel Traits in Microorganisms" Applied and Environmental Microbiology, 67:3645 등.
사용된 방법과는 상관없이, 통상적으로 본 발명의 조작된 생합성 경로에 의해 생산된 비천연 아미노산은, 단백질 생합성을 효율적으로 진행시키기에 충분한 농도 예를 들어, 천연 세포 내 양 만큼이되, 기타 세포 내 아미노산의 농도에는 거의 영향을 미치지 않는 정도, 또는 세포 내 공급원을 소모하는 정도로 생산된다. 이러한 방식으로 생체 내 생산되는 통상적인 농도는 약 10∼약 0.05mM이다. 일단 세포가 특정 경로에 바람직한 효소를 생산하도록 조작되고, 또한 비천연 아미노산이 생산될 때, 생체 내 선별법은 임의로 리보좀 단백질 합성 및 세포 성장 둘 다에 대한 비천연 아미노산의 생산을 추가로 최적화하는데 사용되기도 한다.
본 발명에 사용되는 직교형 성분
비천연 아미노산을 단백질에 통합시키는 과정은 이. 콜라이 내 선택 코돈 유전 신호에 대응하여, 비천연 아미노산을 통합하는 직교형 쌍에 의해 수행되는데, 여기서, 상기 직교형 성분들은 숙주 세포의 번역 기구의 내인성 이. 콜라이 성분과는 교차 반응을 하지 않지만, 목적으로 하는비천연 아미노산을 인식하고, 또한 선택 코돈(예를 들어, 앰버 넌센스 코돈, TAG)에 대응하여 이 비천연 아미노산을 단백질에 통합시킨다. 본 발명에 사용되는 직교형 성분은, 진정 세균 숙주 세포 예를 들어, 이. 콜라이 내에서 직교형 쌍으로서 작용하는, 메타노코커스 재너쉬 티로실 tRNA-합성 효소 유래 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소와, 돌연 변이 티로실 tRNACUA 앰버 억제 인자를 포함한다. 이 시스템에서, 돌연 변이 아미노아실-tRNA 합성 효소는 각각의 비천연 아미노산을 가지되, 일반적인 20개의 아미노산 중 임의의 것은 가지지 않는 억제 tRNA를 아미노아실화한다.
직교형 성분을 생산하는 방법이 본 발명에 사용되는데, 여기서, 이와 같은 방법을 통하여, 선택 코돈 예를 들어, 앰버 종결 코돈, 넌센스 코돈, 4 염기 이상의 염기로 이루어진 코돈 등에 대응하여 예를 들어, 생체 내에서 비천연 아미노산 예를 들어, 도 1에 제시된 비천연 아미노산이, 연장중인 폴리펩티드 사슬에 통합하는 것이다. 예를 들어, 직교형-tRNA(O-tRNA), 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS) 그리고 이의 쌍이 본 발명에 사용된다.
몇몇 구체예에서, 이와 같은 쌍은 비천연 아미노산을 연장 중인 폴리펩티드 사슬에 통합시킨 후, 이 폴리펩티드가 번역 후 변형되도록 만드는데 사용될 수 있다. 번역 후 변형된 비천연 아미노산의 직교형 시스템일 수 있는 비천연 아미노산에 관한 부가 정보에 관하여는 예를 들어, 문헌[Chin외 다수, Science (2003) 301:964-967; Zhang외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:8882-8887; Anderson외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:7566-7571; Wang외 다수, (2001) Science 292:498-500; Chin외 다수, (2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; Chin and Schultz, (2002) ChemBioChem 11:1135-1137; Chin외 다수, (2002) PNAS United States of America 99: 11020-11024: Wang and Schultz, (2002) Chem. Comm.. 1-10; Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); Xie and Schultz, "An Expanding Genetic Code," Methods 36:227-238 (2005); 및 Deiters외 다수, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524 (2005); 상기 문헌 모두 각각 본원에 그 자체로서 참고용으로 인용되어 있음]에 개시되어 있다.
또한, 비천연 아미노산 직교형 시스템에 관한 문헌[국제 특허 출원 공보 WO 2002/086075(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"); WO 2002/085923(발명의 명 칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); WO 2004/094593(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); WO 2005/019415(2004년 7월 7일); WO 2005/007870(2004년 7월 7일); WO 2005/007624(2004년 7월 7일); WO 2006/034332(2005년 9월 20일); 및 WO 2006/110182(발명의 명칭: "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS")(2005년 10월 27일)(Schultz외 다수)]도 참조하시오.
임의의 구체예에서, 본 발명에 사용되는 O-RS는 특정 비천연 아미노산을 가지는 임의의 내인성 tRNA에 비하여, O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는데, 여기서, 상기 O-RS는 O-tRNA에 편향되고, 비천연 아미노산이 하전된 O-tRNA : 동일한 비천연 아미노산이 하전된 내인성 tRNA의 비율은 1:1 이상이며, 더욱 바람직하게, 상기 O-RS는 O-tRNA를 독점적으로 또는 거의 독점적으로 하전시킨다.
본 발명은 또한 직교형 tRNA(O-tRNA)를 이용하기도 하는데, 여기서, 상기 O-tRNA는 선택 코돈을 인식한다. 통상적으로, O-tRNA는, 선택 코돈에 대응하여, 동족 합성 효소의 존재 하에서, 서열 목록에 제시된 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 서열 번호 1)을 포함하거나 또는 이 서열에 의해 암호화되는 O-tRNA의 억제 효율에 비하여, 예를 들어, 약 45%, 50%, 60%, 75%, 80%, 또는 90% 이상의 억제 효율을 나타낸다. 하나의 구체예에서, O-RS 및 O-tRNA 모두의 억제 효율은, O-RS가 존재하지 않을 때 O-tRNA의 억제 효율보다 예를 들어, 5배, 10배, 15배, 20배 및 25배 이상이다. 몇몇 측면에서, O-RS 및 O-tRNA 모두의 억제 효율은 메타노코커스 재너쉬로부터 유래하는 직교형 티로실-tRNA 합성 효소 쌍의 억제 효율의 45% 이상이다.
본 발명은 단백질 생산을 프로그래밍하는 번역 시스템 및 뉴클레오티드 서열을 포함하는 세포(예를 들어, 이. 콜라이)를 이용하는데, 여기서, 상기 번역 시스템은 직교형-tRNA(O-tRNA), 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)와, 비천연 아미노산을 포함한다. 통상적으로, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 임의의 내인성 tRNA에 비하여, O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는데, 여기서, 상기 O-RS는 O-tRNA에 편향되고, 비천연 아미노산이 하전된 O-tRNA : 비천연 아미노산이 하전된 내인성 tRNA의 비율은 1:1 이상이며, 더욱 바람직하게, 상기 O-RS는 O-tRNA를 독점적으로 또는 거의 독점적으로 하전시킨다. 상기 O-tRNA는 제1 선택 코돈을 인식하고, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다.
다양한 폴리뉴클레오티드도 또한 본 발명에 사용된다. 이와 같은 폴리뉴클레오티드로서는 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 인공적(예를 들어, 천연 생성되지 않고 사람이 제작한 예를 들어, 재조합된) 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 또한 고도로 엄중한 조건 하에서, 실질적으로 전장의 핵산에 비하여, 전술한 바와 같은 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 핵산을 포함할 수도 있다. 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터들도 본 발명에 사용된다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스, 발현 벡터 등을 포함할 수 있다. O-tRNA/O-RS 쌍을 이루는 성분들을 생산하는 방법에 관하여는 공지되어 있으며, 본 발명에 사용되기도 한다. 본원의 내용과 본원에 인용된 참고 문헌들을 참조하시오.
핵산 및 폴리펩티드 서열 및 변이체
본원에 기술된 바와 같이, 예를 들어, O-tRNA 및 O-RS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 각각의 아미노산 서열이 사용되는 것과 마찬가지로, 본 발명에 사용된다. 본원은 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 예를 제공하며, 또한 이를 참조하기 쉽게 인용하였다. 그러나, 본 발명은 본원에 개시된 서열들을 한정적으로 이용하는 것은 아님을 알게 될 것이다. 당 업자는 또한, 본 발명이 본원에 개시된 기능을 가지는 다수의 관련 서열들 예를 들어, 본원에 개시된 O-RS의 보존적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 제공함을 알게 될 것이다.
본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 천연 tRNA의 폴리뉴클레오티드와 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 동일한(그러나, 천연 tRNA는 아닌 것인) 인공 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 또한 천연 tRNA의 폴리뉴클레오티드와 예를 들어, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 동일한(그러나, 100% 동일하지는 않은) 인공 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
임의의 구체예에서, 본 발명에 사용되는 벡터(예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 파지 및 바이러스 등)는 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 기타 구체예에서, 발현 벡터는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상에 작동 가능하도록 연결된 프로모터를 포함한다. 다른 구체예에서, 세포는 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다.
당 업자는 개시된 서열의 다수의 변이체들도 본 발명에 사용됨을 알게 될 것이다. 예를 들어, 기능상 동일한 서열을 생산하는, 본원에 개시된 서열의 보존적 변이체가 본 발명에 사용될 수 있다. 핵산 폴리뉴클레오티드 서열의 변이체 즉, 본원에 개시된 하나 이상의 서열에 혼성화되는 변이체도 본 발명에 사용된다.
보존적 변이
유전자 암호의 축퇴성으로 인하여, "침묵 치환(silent substitution)"(즉, 암호화된 폴리펩티드에 변이가 발생하지 않는, 핵산 서열 내 치환)은 아미노산 서열을 암호화하는 모든 핵산 서열의 함축된 특징이다. 이와 유사하게, 아미노산 서열 내 하나 또는 제한된 수의 아미노산이, 매우 유사한 특성을 갖는 상이한 아미노산으로 치환되는 "보존적 아미노산 치환"은 또한, 개시된 구성체와 매우 유사한 것으로 쉽게 확인된다. 이와 같이 개시된 각각의 서열에 관한 보존적 변이는 본 발명의 특징을 이룬다.
특정 핵산 서열의 "보존적 변이"란, 핵산이, 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 경우, 또는 상기 핵산이 아미노산 서열을 암호화하지 않는 경우, 또는 서열이 본질적으로 동일한 경우를 의미한다. 당 업자는 암호화된 서열에 있어서 각각의 치환, 결실 또는 부가 즉, 하나의 아미노산 또는 낮은 비율(통상적으로, 5% 미만, 더욱 통상적으로 4%, 2% 또는 1% 미만)의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 것이 "보존적으로 변형된 변이"라는 것을 알게 될 것이며, 이때, 이와 같은 변이의 결과로, 아미노산이 결실, 부가되거나 또는 임의의 아미노 산이 화학적으로 유사한 아미노산으로 치환된다. 그러므로, 본 발명에 나열된 폴리펩티드 서열의 "보존적 변이"는, 낮은 비율, 통상적으로 5% 미만, 더욱 통상적으로 2% 미만 또는 1% 미만의 폴리펩티드 서열의 아미노산을, 동일한 보존적 치환기의 아미노산으로 치환시키는 것을 포함한다. 마지막으로, 핵산 분자의 암호화된 활성을 변경시키지 않는 서열의 부가 예를 들어, 비-기능성 서열의 부가는 기본 핵산의 보존적인 변이에 해당한다.
기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 여기서, 하나의 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예를 들어, 방향족 측쇄 또는 양으로 하전된 측쇄)을 갖는 다른 아미노산 잔기에 대하여 치환되므로, 폴리펩티드 분자의 기능상의 특성을 실질적으로 변질시키지 않는다. 이하, 유사한 화학적 특성을 갖는 천연 아미노산을 포함하는 군의 예를 제시하였는데, 여기서, 어느 군 내에서의 치환은 "보존적 치환"인 것이다.
보존적 아미노산 치환
비극성 및/또는 지방족 측쇄 극성, 비하전 측쇄 방향족 측쇄 양으로 하전된 측쇄 음으로 하전된 측쇄
글리신 알라닌 발린 루신 이소루신 프롤린 세린 트레오닌 시스테인 메티오닌 아스파라긴 글루타민 페닐알라닌 티로신 트립토판 리신 아르기닌 히스티딘 아스파테이트 글루타메이트
핵산의 혼성화
비교에 의한 혼성화가 본 발명에 사용되는 핵산 즉, 본원에 제공된 핵산의 보존적 변이를 포함하는 핵산을 동정하는데 사용될 수 있으며, 이와 같은 비교 혼성화 방법은 본 발명에 사용되는 핵산을 구별하는데 바람직한 방법이다. 고도, 초고도 및 최고도의 엄중 조건 하에서, 본원에 제공되었거나 또는 참조하기 쉽도록 나열된 핵산에 혼성화하는 표적 핵산도 본 발명에 사용된다. 이와 같은 핵산의 예로서는, 소정의 핵산 서열에 비하여, 하나 또는 소수의 침묵 핵산 치환 또는 보존적 핵산 치환을 가지는 핵산을 포함한다.
테스트 핵산은, 50% 이상이 프로브에 완전히 매치되는 상보성 표적으로서 혼성화될 때 프로브 핵산에 특이적으로 혼성화된다고 말할 수 있는데, 다시 말해서, 노이즈에 대한 신호 비율이, 매치되지 않은 표적 핵산 중 임의의 것에 대한 혼성화시 관찰되는 노이즈 대한 신호 비율의 약 5∼10배로 완전히 매치된 프로브가 완전히 매치된 상보성 표적에 결합하는 조건 하에서, 표적에 프로브가 혼성화될 때의 비율의 절반 이상에 해당한다.
핵산은 통상적으로 용액 중에서 회합할 때 "혼성화"된다. 널리 특성 규명된 물리-화학적 힘 예를 들어, 수소 결합력, 용매 배제력(solvent excluding) 및 염기 축적력(base stacking) 등으로 말미암아, 핵산이 혼성화되는 것이다. 핵산의 혼성화에 관한 광범위한 가이드는, DNA 및 RNA 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 합성, 표지화, 검출 및 정량에 관하여 상세히 기술되어 있는 문헌[Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes part I chapter 2, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," (Elsevier, New York), 및 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel외 다수, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons Inc. 공동 출판, (2004년 증보판)("Ausubel"); Hames and Higgins (1995) Gene Probes 1 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, (Hames and Higgins 1) 및 Hames and Higgins (1995) Gene Probes 2 IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England (Hames and Higgins 2)]에서 살펴볼 수 있다.
서던 블럿 또는 노던 블럿에 있어서 필터 상에 100개 이상의 상보성 잔기를 가지는 상보성 핵산의 혼성화를 위한 엄중 혼성화 조건에 관한 예로서는, 50%의 포르말린 및 1㎎의 헤파린과 함께 42℃에서 밤새도록 혼성화시키는 것이 있다. 엄중 세척 조건에 관한 예로서는, 65℃에서 0.2× SSC로 15분 동안 세척하는 것이 있다[SSC 완충액에 관한 설명이 개시되어 있는 Sambrook(상동)의 저서 참조]. 고도의 엄중도 세척은 종종 낮은 엄중도 세척으로써 백그라운드 프로브 신호를 제거한 다음에 행하여 진다. 낮은 엄중도 세척의 예로서는, 40℃의 2× SSC에서 15분 동안 세척하는 것이 있다. 일반적으로, 신호 : 노이즈의 비율이 특정 혼성화 검정법의 비 관련 프로브에 대해 관찰되는 비율에 비하여 5배(또는 그 이상)라 함은 곧, 특이적인 혼성화가 일어남을 나타내는 것이다.
핵산 혼성화 실험 예를 들어, 서던 및 노던 혼성화에 있어서 "엄중한 혼성화 세척 조건"은 서열 의존적인 것으로서, 상이한 환경 매개 변수 하에서의 조건과는 상이하다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 가이드는 문헌[Tijssen (1993)(상동), 및 Hames and Higgins, 1 and 2]에서 살펴볼 수 있다. 엄중한 혼성화 조건 및 세척 조건은 임의의 테스트 핵산에 대한 실험을 통하여 용이하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 엄중한 혼성화 조건 및 세척 조건을 결정함에 있어서, 선별된 기준 세트가 부합할 때까지 (예를 들어, 혼성화 또는 세척 과정에서, 온도를 높이거나, 염 농도를 감소시키거나, 세제의 농도를 증가시키고/증가시키거나, 유기 용매 예를 들어, 포르말린의 농도를 증가시킴으로써) 혼성화 조건 및 세척 조건을 점진적으로 증가시킨다. 예를 들어, 고도로 엄중한 혼성화 조건 및 세척 조건에 있어서, 혼성화 조건 및 세척 조건은 완전히 매치된 상보성 표적에 프로브가 결합할 때까지, 신호 : 노이즈 비율이 프로브 : 매치되지 않은 표적의 혼성화시 관찰되는 비율의 5배 이상만큼 점진적으로 증가한다.
"매우 엄중한" 조건은 특정 프로브에 대한 용융점(Tm)과 동일한 온도가 되도록 선택된다. 상기 Tm은, (제한된 이온 세기와 pH 하에서) 테스트 서열의 50%가 완전히 매치된 프로브와 혼성화되는 온도이다. 본 발명의 목적에 있어서, 일반적으로 "고도로 엄중한" 혼성화 조건 및 세척 조건은 제한된 이온 세기 및 pH에서 특정 서열에 대한 Tm보다 약 5℃ 더 낮은 온도로서 선택된다.
"초고도 엄중도(ultra high-stringency)" 혼성화 조건 및 세척 조건은, 혼성화 조건 및 세척 조건의 엄중도를, 프로브가 완전히 매치된 상보성 표적 핵산에 결합함에 있어서 신호 : 노이즈의 비율이, 매치되지 않은 표적 핵산 중 임의의 핵산에 혼성화되는 경우에 관찰되는 비율보다 10배 이상 증가할 때까지 증가시키는 조건을 말한다. 이와 같은 조건 하에서, 신호 : 노이즈 비율이, 완전히 매치된 상보성 표적 핵산의 비율의 1/2 이상이 될 때 프로브에 혼성화하는 표적 핵산은, 초고도 엄중도 조건 하에서 프로브에 결합하는 것으로 간주된다.
이와 유사하게, 더욱 높은 수준의 엄중도는 관련성 있는 혼성화 검정법의 혼성화 및/또는 세척 조건을 점차적으로 증가시킴으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 조건 및 세척 조건의 엄중도를, 완전히 매치된 상보성 표적 핵산과 프로브의 결합에 대한 신호 : 노이즈 비율이, 매치되지 않은 표적 핵산 중 임의의 것에 대한 혼성화시 관찰되는 비율의 10배, 20배, 50배, 100배 또는 500배 이상이 될 때까지, 증가시킬 수 있다. 이와 같은 조건 하에서, 신호 : 노이즈 비율이, 완전히 매치된 상보성 표적 핵산의 비율의 1/2 이상이 될 때 프로브에 혼성화하는 표적 핵산은, 최고도 엄중도 조건(ultra-ultra stringency condition) 하에서 프로브에 결합하는 것으로 간주된다.
엄중도 조건 하에서 상호 혼성화되지 않는 핵산은, 이 핵산이 암호화하는 폴리펩티드가 상당 수준 동일하면, 실질적으로 동일한 것이다. 이러한 결과는 예를 들어, 핵산의 복사체가 유전자 암호에 의해 허용되는 최대 코돈 축퇴성을 이용하여 생성될 때에 얻어진다.
유일 부분 서열(unique subsequence)
몇몇 측면에서, 본 발명은 본원에 개시되었거나 또는 참조하기 쉽게 제공된 O-tRNA 및 O-RS 서열로부터 선택된 핵산 내 유일 부분 서열을 포함하는 핵산을 이용한다. 유일 부분 서열은 임의의 공지 O-tRNA 또는 O-RS 핵산 서열에 상응하는 핵산에 비하여 유일하다. 예를 들어, 디폴트 매개 변수에 맞춘 BLAST를 이용하여 정렬을 수행할 수 있다. 임의의 유일 부분 서열은 예를 들어, 본 발명의 핵산을 동정하는 프로브로서 유용하다.
이와 유사하게, 본 발명은 본원에 개시되었거나 또는 참조하기 쉽게 제공된 O-RS의 서열로부터 선택된 폴리펩티드 내 유일 부분 서열을 포함하는 폴리펩티드를 이용한다. 그러므로, 유일 부분 서열은 공지된 폴리펩티드 서열 중 임의의 것에 상응하는 폴리펩티드에 비하여 유일하다.
본 발명은 또한 엄중한 조건 하에서, O-RS의 서열로부터 선택되는 폴리펩티드 내 유일 부분 서열을 암호화하는 유일 암호화 올리고뉴클레오티드에 혼성화하는 표적 핵산을 제공하는데, 여기서, 상기 유일 부분 서열은 대조군 폴리펩티드 중 임의의 것(예를 들어, 본 발명의 합성 효소가 예를 들어, 돌연 변이에 의하여 유도되는 모 서열)에 상응하는 폴리펩티드에 비하여 유일하다. 유일 서열은 전술한 바와 같이 결정된다.
서열 비교, 다양성 및 동일성
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 있어서, "동일한" 또는 "동일성(%)"란 용어는, 2개 이상의 서열 또는 부분 서열이 이하에 기술된 서열 비교 알고리즘 중 어느 하나(또는 당 업자가 이용 가능한 기타 알고리즘) 또는 가시적 관찰에 의해 측정되는 최대 상응성에 대해 정렬 및 비교될 때, 동일하거나 특정 %의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 가지는 경우를 의미하는 것이다.
2개의 핵산 또는 폴리펩티드(예를 들어, O-tRNA 또는 O-RS를 암호화하는 DNA, 또는 O-RS의 아미노산 서열)에 있어서 "실질적으로 동일한"이란 어구는, 2개 이상의 서열 또는 부분 서열이 서열 비교 알고리즘 중 어느 하나 또는 가시적 관찰에 의해 측정되는 최대 상응성에 대해 정렬 및 비교될 때, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 동일성이 약 60% 이상, 약 80% 이상, 약 90∼95%, 약 98% 이상, 약 99% 이상인 경우를 의미하는 것이다. 실제 모 서열을 참고로 하지 않았을 때, "실질적으로 동일한" 서열은 통상적으로 "상동성"인 것으로 간주한다. 바람직하게, "실질적 동일성"은 약 50개 이상의 잔기로 이루어진 서열 영역, 더욱 바람직하게는 약 100개 이상의 잔기로 이루어진 서열 영역에 걸쳐서 존재하며, 가장 바람직하게, 이 서열들은 약 150개의 잔기로 이루어진 영역이 실질적으로 동일하거나, 또는 비교될 2개의 서열의 전체 길이가 실질적으로 동일하다.
단백질 및/또는 단백질 서열은 일반적인 모 단백질 또는 단백질 서열로부터 천연적으로 또는 인공적으로 유래할 때, "상동성"인 것이다. 이와 유사하게, 핵산 및/또는 핵산 서열은 그것들이 일반적인 모 핵산 또는 핵산 서열로부터 천연적으로 또는 인공적으로 유래할 때, 상동성인 것이다. 예를 들어, 임의의 천연 핵산은 하나 이상의 선택 코돈을 포함하는 임의의 실현 가능한 돌연 변이 유발법에 의해 변형될 수 있다. 발현 시, 이와 같이 돌연 변이된 핵산은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 암호화한다. 물론, 돌연 변이 과정은 부가적으로 하나 이상의 표준적인 코돈을 변경시키기도 하며, 이로써, 결과로 생성된 돌연 변이 단백질 내 하나 이상의 표준 아미노산이 변이된다. 상동성은 일반적으로, 2개 이상의 핵산 또는 단백질(또는 이의 서열) 사이의 서열 유사성으로부터 추정된다. 상동성을 확립하는데 유용한 서열들 간 유사성의 정확한 %는 대상 핵산 및 단백질에 따라서 달라지지만, 상동성을 확립하는데에는 통상적으로 25% 정도의 서열 유사성이 필요하다. 더욱 높은 수준 예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상의 서열 유사성도 상동성을 확립하는데 필요할 수 있다. 서열 유사성(%)을 측정하는 방법(예를 들어, 디폴트 매개 변수를 이용하는 BLASTP 및 BLASTN)에 관하여는 본원에 개시되어 있으며, 일반적으로 사용되고 있다.
서열 비교 및 상동성 측정에 있어서, 통상적으로 하나의 서열은 테스트 서열이 비교될 참고 서열로서의 역할을 담당한다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 경우, 테스트 서열 및 참고 서열을 컴퓨터에 입력시키며, 필요에 따라서 부분 서열의 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 매개 변수를 지정한다. 이후, 서열 비교 알고리즘을 통하여, 지정된 프로그램 매개 변수를 바탕으로 해서, 참고 서열에 상대적인, 테스트 서열(들)에 대한 서열 동일성(%)을 계산한다.
예를 들어, 비교를 위한 서열의 최적 정렬법은 예를 들어, 스미스와 워터맨(Smith and Waterman)에 의한 문헌[Adv. Appl. Math. 2:482(1981)]에 개시된 국소 상동성 알고리즘, 니들맨 및 운치(Needleman and Wunsch)에 의한 문헌[J. Mol. Biol. 48:443(1970)]에 개시된 상동성 정렬 알고리즘, 피어슨 및 립맨(Pearson and Lipman)에 의한 문헌[Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)]에 개시된 유사성 검색 방법, 알고리즘 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA[Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI]의 컴퓨터에 의한 수행, 또는 가시적 관찰에 의한 방법[예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel외 다수, Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc 공동 출판(2004 증보판)]에 의해 수행될 수 있다.
서열 동일성(%)과 서열 유사성(%)을 측정하는데 적당한 알고리즘의 일례로서는 BLAST 알고리즘이 있다[Altschul외 다수, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]. BLAST 분석을 수행하는 소프트웨어는 국립 생명 공학 정보 센터의 웹 사이트로부터 공개적으로 입수 가능하다. 이 알고리즘은 우선, 의문 서열 내 문자 길이 W인 짧은 문자를 동정함으로써, 고 스코어링 서열 쌍(HSP)을 동정하는데, 여기서, 상기 짧은 문자들은 데이터베이스 서열 내 동일한 길이를 가지는 문자와 정렬하였을 때 몇몇 양성 범위의 최소 치 스코어 T와 매치되거나 또는 이를 만족시킨다. 상기 T는 이웃하는 문자 스코어 최소 치를 의미한다[Altschul외 다수, 상동]. 이와 같이 이웃하는 첫 번째 문자 히트(world hit)는 상기 짧은 HSP를 함유하는 긴 HSP를 찾기 위한 검색 작업을 개시하는 시드(seed)로서의 역할을 한다. 이후, 상기 문자 히트는 누적 정렬 스코어(cumulative alignment score)가 증가할 수 있는 한, 각각의 서열을 따라서 양쪽 방향으로 연장된다. 누적 스코어는, 뉴클레오티드 서열에 있어서는 매개 변수 M(한 쌍의 매치 잔기에 대한 보상 스코어(reward score); 항상 >0임)과 N(매치 잔기에 대한 패널티 스코어(penalty score); 항상 <0임)를 이용하여 계산된다. 아미노산 서열에 있어서, 스코어링 매트릭스는 누적 스코어를 계산하는데 사용된다. 누적 정렬 스코어가 그것의 최대 수치로부터 X 만큼 떨어질 때; 하나 이상의 네거티브 스코어링 잔기 정렬이 누적됨으로 인하여 누적 스코어가 0 이하로 될 때; 또는 양 서열 중 어느 하나의 말단이 도달할 때까지, 각 방향으로 문자 히트를 연장시킨다. BLAST 알고리즘 매개 변수 W, T 및 X는 정렬의 감도와 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열용)에서는 디폴트값으로서 문자 길이(W) = 11, 기대치(E) = 10, 컷오프(cut-off) = 100, M=5, N=-4를 사용하고, 두 사슬을 비교한다. 아미노산 서열용인 BLASTP 프로그램 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스[Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915]에서는 디폴트값으로서 문자 길이(W) = 3이고, 기대치(E) = 10을 사용한다.
서열 동일성(%)을 계산하는 이외에, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 간 유사성을 통계학적으로 분석하기도 한다[예를 들어, Karlin and Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)]. BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성에 관한 한 가지 척도로서는 확률의 최소 합[P(N)]이 있는데, 이는, 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 우연히 매치될 확률을 나타내는 것이다. 예를 들어, 참고 핵산에 대한 테스트 핵산의 비교시 확률의 최소 합이 약 0.1 미만, 더욱 바람직하게는 약 0.01 미만, 그리고 가장 바람직하게는 약 0.001 미만이면, 그 핵산은 참고 서열과 유사한 것으로 간주한다.
돌연 변이 유발법 및 기타 분자 생물학적 기술
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드와 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 분자 생물학적 기술을 이용하여 조작될 수 있다. 분자 생물학적 기술에 관하여 기술되어 있는 일반적인 문헌으로서는 문헌[Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques. Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook외 다수, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2001 ("Sambrook") 및 Current Protocols in Molecular Biology. F.M. Ausubel외 다수, eds., Current Protocols, Greene Publishing Associates, Inc. 및 John Wiley & Sons, Inc. 공동 출판, (2004년 증보판) ("Ausubel")]을 포함한다. 상기 문헌에는, 돌연 변이 유발법, 벡터 및 프로모터를 사용하는 방법과, 예를 들어, 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 생산용 선택 코돈을 포함하는 유전자를 생산하는 것과 관련된 기타 다수의 관련 주제들, 직교형 tRNA, 직교형 합성 효소 및 이들의 쌍을 사용하는 방법에 관하여 기술되어 있다.
예를 들어, tRNA 분자를 돌연 변이시키고, tRNA 라이브러리를 생산하며, 합성 효소의 라이브러리를 생산하고, 목적으로 하는 단백질 또는 폴리펩티드 내 비천연 아미노산을 암호화하는 선택 코돈을 삽입하기 위해, 다양한 유형의 돌연 변이 유발법이 본 발명에 함께 사용될 수 있다. 이와 같은 돌연 변이 유발법으로서는, 위치 지정, 랜덤 점 돌연 변이 유발법, 상동성 재조합법, DNA 셔플링 또는 기타 반복적 돌연 변이 유발법, 키메라 구성법, 우라실 함유 주형을 이용하는 돌연 변이 유발법, 올리고뉴클레오티드 유도 돌연 변이 유발법, 포스포로티오에이트 변형 DNA 돌연 변이 유발법, 갭이 형성된 이중 DNA를 이용하는 돌연 변이 유발법 또는 이들의 임의의 병행법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 부가의 적당한 방법으로서는 점 미스 매치 수복법, 수복능 결여 숙주 균주를 이용하는 돌연 변이 유발법, 제한 선별 및 제한 정제, 결실 돌연 변이 유발법, 전체 유전자 합성에 의한 돌연 변이 유발법, 이중 가닥 파열부 수복법(double-strand break repair) 등을 포함한다. 예를 들어, 키메라 구성법을 포함하는 돌연 변이 유발법도 또한 본 발명에 포함된다. 하나의 구체예에서, 돌연 변이 유발법은 천연 분자 또는 변형 또는 돌연 변이된 천연 분자에 관한 공지의 정보 예를 들어, 서열, 서열 비교 결과, 물리적 특성, 결정 구조 등을 바탕으로 하여 수행된다.
숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 구성체 예를 들어, 벡터(예를 들어, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있음)를 포함하는 구성체로 유전자 조작(예를 들어, 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염)된다. 예를 들어, 직교형 tRNA, 직교형 tRNA 합성 효소와, 유도체화될 단백질에 대한 암호화 영역은, 원하는 숙주 세포 내에서 기능성인 유전자 발현 조절 요소에 작동 가능하도록 연결되어 있다. 통상의 벡터는 전사 및 번역 종결부위, 전사 및 번역 개시 서열, 그리고 특정 표적 핵산의 발현을 조절하는데 유용한 프로모터를 함유한다. 임의로, 상기 벡터는 하나 이상의 독립 종결부위 서열, 진핵 생물 또는 원핵 생물 내 카세트의 복제를 허용하는 서열, 또는 진핵 생물 및 원핵 생물 둘 다에서 카세트 복제를 허용하는 서열(예를 들어, 셔틀 벡터)과, 상기 진핵 생물 시스템 및 원핵 생물 시스템 둘 다에 대한 선별 마커를 함유하는 일반적인 발현 카세트를 포함한다, 벡터는 원핵 생물 또는 진핵 생물, 또는 바람직하게는 진핵 생물 및 원핵 생물 둘 다에서의 복제 및/또는 통합에 적당하다. 문헌[Giliman and Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts외 다수, Nature. 328:731 (1987); Schneider, B.외 다수, Protein Expr. Purif. 6435:10 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (모두 상동)]을 참조하시오. 상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 세균, 바이러스, 나출 폴리뉴클레오티드, 또는 접합 폴리뉴클레오티드의 형태를 가질 수 있다. 상기 벡터는, 표준적인 방법 예를 들어, 전기 천공법[From외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)], 바이러스 벡터에 의한 감염, 소형 비드 또는 입자의 매트릭스 내에, 또는 그 표면에 핵산을 가지는 소형 입자에 의한 고속 충격 침투법[Klein외 다수, Nature 327, 70-73 (1987)] 등에 의하여, 세포 및/또는 미생물 내에 도입된다.
이. 콜라이 내에서 앰버 종결 코돈(UAG)에 대응하여, 비천연 아미노산을 단백질에 위치 특이적으로 통합시키기 위한 고 효율 및 다용도 단일 플라스미드 시스템이 개발되었다. 상기 새로운 시스템에 있어서, 엠.재너쉬 억제 tRNAtyr(CUA) 및 티로실-tRNA 합성 효소 쌍은 하나의 플라스미드 내에서 암호화되는데, 상기 플라스미드는 대부분의 이. 콜라이 발현 벡터와 혼화 가능한 것이다. proK 프로모터 및 종결부위의 제어 하에 있는 모노시스트론 tRNA 오페론은 최적의 2차 구조 및 tRNA 가공을 위해 구성되었다. 합성 효소에 대한 glnS 프로모터의 돌연 변이된 형태의 것을 도입시키면, 억제 효율 및 신뢰도 둘 다 상당 수준 증가하였다. 복수개의 tRNA 유전자 복사체와 합성 효소에 대한 특이적 돌연 변이(D286R)에 의해 억제 효율이 증가할 수도 있었다[Kobayashi외 다수, "Structural basis for orthogonal tRNA specificities of tyrosyl-tRNA synthetases for genetic code expansion," Nat. Struct. Biol., 10(6):425-432 (2003)]. 최적화된 시스템의 보편성은 또한, 몇몇 상이한 비천연 아미노산을 고효율로, 그리고 정확하게 통합함으로써 입증되었는데, 단백질 기능과 구조에 대한 연구에 있어서 이 시스템의 독특한 유용성은 이미 입증된 바 있다.
클로닝에 유용한 세균 및 박테리오파지의 카탈로그가 제공되어 있다[ATCC, 예를 들어, The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1996) Gherna 외 다수(eds), ATCC 발행]. 서열 결정, 클로닝 및 분자 생물학에 관한 기타 측면에 대한 부가의 기본적인 방법과, 이에 내재되어 있는 이론적인 사항은 문헌[Sambrook(상동), Ausubel(상동), 및 Watson외 다수(1992) Recombinant DNA Second Edition, Scientific American Books, NY]에서 살펴볼 수 있다. 뿐만 아니라, 본질적으로, 임의의 핵산[및 실질적으로 표지화된 임의의 핵산(표준적인 것 또는 비 표준적인 것)]은 주문 제작하거나 다양한 상업적 공급처 중 임의의 공급처 예를 들어, 미들랜그 서티파이드 리에이전트 컴퍼니(Midland Certified Reagent Company)(Midland, TX), 더 그레이트 아메리칸 진 컴퍼니(The Great American Gene Company)(Ramona, CA), 익스프레스진 인코포레이션(ExpressGen Inc.)(Chicago, IL), 오페론 테크놀로지스 인코포레이션(Operon Technologies Inc.)(Alameda, CA) 등으로부터 통상적으로 주문하여 구입할 수 있다.
조작된 숙주 세포는 예를 들어, 스크리닝 단계, 프로모터 활성화 또는 형질 전환체의 선별과 같은 작업용으로 적당하게 개질된 통상의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 상기 세포는 임의로 트랜스게닉 유기체 내에서 배양될 수도 있다. 예를 들어, 세포 분리 및 배양(예를 들어, 후속 핵산 분리를 위한 배양)용으로 유용한 기타 참고 문헌으로서는 문헌[Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York 및 이에 인용된 참고 문헌들; Payne외 다수 (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) 및 Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL]을 포함한다.
목적으로 하는 단백질 및 폴리펩티드
특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하는 방법도 본 발명의 특징을 이룬다. 예를 들어, 세포가 하나 이상의 선택 코돈을 포함하고 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 경우, 상기 방법은 적당한 배지 내에서 세포(예를 들어, 이. 콜라이 세포)를 배양하는 단계; 그리고, 세포가, 세포 내에서 기능을 하고 선택 코돈을 인식하는 직교형 tRNA와, 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 추가로 포함하는 경우, 비천연 아미노산을 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 이와 같이, 이. 콜라이 내에서 생산된 단백질은 선택 코돈에 상응하는 위치에 비천연 아미노산을 포함한다. 이후, 상기 단백질은 비천연 아미노산이 공유 변형을 수행하는 조건 하에서 임의로 반응할 수 있으며, 이로써 번역 후 단백질을 생산할 수 있다.
임의의 구체예에서, 상기 O-RS는 발현 시스템 내 임의의 내인성 tRNA보다는 동족 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화한다. O-tRNA 및 O-RS가 동등한 몰 농도로 존재할 때, O-tRNA 및 O-RS에 의해 하전된 내인성 tRNA 사이의 상대적 비율은 1:1 이상, 바람직하게는 약 2:1 이상, 더욱 바람직하게는 5:1, 더욱 바람직하게는 10:1, 더욱 바람직하게는 20:1, 더욱 바람직하게는 50:1, 더욱 바람직하게는 75:1, 더욱 바람직하게는 95:1, 98:1, 99:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 5,000:1 이상이다.
특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는, 번역 후 변형된 단백질도 본 발명의 특징을 이룬다. 단백질은 세포 예를 들어, 이. 콜라이 세포 내에서 생산된다. 상기 O-tRNA/O-RS 쌍도 세포 내에 존재하며, 상기 쌍은 숙주 세포의 번역 기구를 이용하여, 선택 코돈에 대응해 비천연 아미노산을 융합 단백질에 생체 내 통합시킨다. 번역 후 변형될 수 있는 다양한 비천연 아미노산을 통합하기 위해 숙주 세포 내에서 O-tRNA/O-RS 시스템이 작용을 하는 능력은 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Chin외 다수, Science (2003) 301:964-967; Zhang외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:8882-8887; Anderson외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:7566-7511; Wang외 다수, (2001) Science 292:498-500; Chin외 다수, (2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; Chin and Schultz, (2002) ChemBioChem 11:1135-1137; Chin외 다수,(2002) PNAS United States of America 99:11020-11024; Wang and Schultz, (2002) Chem. Comm., 1-10; Wang and Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed., 44(1):34-66 (2005); Xie and Schultz, "An Expanding Genetic Code," Methods 36:227-238 (2005); 및 Deiters외 다수, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 15:1521-1524 (2005); 상기 문헌들은 각각 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용됨]을 참조하시오.
또한, 문헌[국제 특허 출원 공보 WO 2002/086075(발명의 명칭: "METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE PRODUCTION OF ORTHOGONAL tRNA AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE PAIRS"; WO 2002/085923(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"; WO 2004/094593(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"; WO 2005/019415(2004년 7월 7일); WO 2005/007870(2004년 7월 7일); WO 2005/007624(2004년 7월 7일); WO 2006/034332(2005년 9월 20일); 및 WO 2006/110182(발명의 명칭: "ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS FOR THE IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS",(2005년 10월 27일)(Schultz외 다수)]에 개시된 비천연 아미노산 직교형 시스템도 참조하시오. 상기 문헌은 각각 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용되어 있다.
비천연 아미노산은 예를 들어, 단백질 구조 및/또는 기능에 변이를 가하여주기 위해[예를 들어, 크기, 산성, 친핵성, 수소 결합, 소수성, 단백질 분해 효소 표적 위치의 접근성을 변경하거나, (예를 들어, 단백질 어레이용) 부분을 표적화하거나, 표지 또는 반응기를 통합하기 위해] 통합될 수 있다. 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 전반적으로 새로운 촉매 특성 또는 물리적 특성이 강화될 수 있다. 예를 들어, 다음과 같은 특성은 단백질에 비천연 아미노산을 포함시킴으로써 변형되기도 한다: 독성, 생체 분포성, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 특성 및/또는 광 화학적 특성, 촉매 능, 반감기(예를 들어, 혈청 반감기), 예를 들어, 공유적으로 또는 비 공유적으로 기타 분자와 반응하는 능력. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 포함하는 조성물은 예를 들어, 신규의 치료제, 진단제, 촉매 효소, 산업용 효소, 결합 단백질(예를 들어, 항체로서, 그리고 예를 들어, 단백질의 구조 및 기능 연구에 유용하다. 예를 들어, 문헌[Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652]을 참조하시오. (예를 들어, [3+2] 고리 첨가 반응 또는 스타우딩거 변형법에 의해) 번역 후 선택적으로 변형될 수 있는 비천연 아미노산을 포함하는 단백질은 반응 파트너와 커플링될 수 있는 임의의 원하는 작용기를 함유하도록 조작될 수 있다. 반응 파트너의 특성은, 폴리펩티드 내 비천연 아미노산 잔기에 공유 부착되는 적당한 반응 부를 포함한다는 점을 제외하고는 어떠한 제한도 없다.
몇몇 측면에서, 조성물은 하나 이상 예를 들어, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 비천연 아미노산을 가지는 단백질을 포함한다. 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있는데, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 단백질 내에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 상이한 위치가 존재할 수 있다. 다른 측면에서, 조성물은 하나 이상의(그러나, 전부는 아닌) 특정 아미노산을 가지는 단백질을 포함하는데, 이 단백질에 존재하는 특정 아미노산은 비천연 아미노산이다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 가지는 소정의 단백질에 있어서, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이할 수 있다[예를 들어, 단백질은 2가지 이상의 상이한 유형의 비천연 아미노산, 또는 동일한 비천연 아미노산 중 2개를 포함할 수 있다]. 2개 이상의 비천연 아미노산을 가지는 소정의 단백질에 있어서, 비천연 아미노산은 동일하거나 상이한 것일 수 있거나, 아니면 하나 이상의 상이한 비천연 아미노산을 가지는 동일한 종류의 비천연 아미노산이 복수개 조합된 것일 수 있다.
본질적으로, 비천연 아미노산(그리고 예를 들어, 하나 이상의 선택 코돈을 포함하는 상응하는 임의의 암호화 핵산)을 포함하는 임의의 단백질(또는 이의 일부)은 본원의 조성물과 방법을 이용하여 생산될 수 있다. 공지의 단백질 중 수십만 개를 동정하려는 시도는 행해지고 있지 않으나, 이들 단백질 중 임의의 것은 예를 들어, 관련 번역 시스템 내 하나 이상의 적당한 선택 코돈을 포함하도록 만드는 임의의 수행 가능한 돌연 변이 방법을 조작함으로써, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있다. 공지된 단백질에 대한 일반적인 서열 저장소로서는 GenBank EMBL, DDBJ 및 NCBI를 포함한다. 기타 저장소는 인터넷을 검색하여 쉽게 찾을 수 있다.
통상적으로, 단백질은 임의의 사용 가능한 단백질(예를 들어, 치료용 단백질, 진단용 단백질, 산업용 효소, 또는 이의 일부 등)에 대하여 예를 들어, 60% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상 동일하며, 이 단백질은 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있는 치료용 단백질, 진단용 단백질 및 기타 단백질의 예는 예를 들어, 문헌[국제 특허 출원 공보 WO 2004/094593(2004년 4월 16일)(발명의 명칭: "Expanding the Eukaryotic Genetic Code"); 및 WO 2002/085923(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS.")]에서 살펴볼 수 있다. 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있는 치료용 단백질, 진단용 단백질 및 기타 단백질의 예로서는, 알파-1 항 트립신, 안지오스타틴, 항 용혈 인자, 항체(항체에 관한 상세한 설명은 이하에 기술하였음), 아포 지방 단백질, 아포 단백질, 심방 나트륨 이뇨 인자, 심방 나트륨 이뇨 폴리펩티드, 심방 펩티드, C-X-C 케모카인(예를 들어, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-1O, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG), 칼시토닌, CC 케모카인(예를 들어, 단핵구 주화성 단백질-1, 단핵구 주화성 단백질-2, 단핵구 주화성 단백질-3, 단핵구 염증 단백질-1 알파, 단핵구 염증 단백질-1 베타, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262), CD40 리간드, C-kit 리간드, 콜라겐, 집락 형성 인자(CSF), 보체 인자 5a, 보체 억제 인자, 보체 수용체 1, 시토킨(예를 들어, 상피 호중구 활성화 펩티드-78, Groα/MGSA, GROβ, GROγ, MIP-1α, MIP-1δ, MCP-1), 상피 성장 인자(EGF), 에리스로포이에틴(EPO), 박리 독소(exfoliating toxin) A 및 B, 인자 IX, 인자 VII, 인자 VIII, 인자 X, 섬유 아세포 성장 인자(FGF), 피브리노겐, 피브로넥틴, G-CSF, GM-CSF, 글루코세레브로시다제, 고나도트로핀, 성장 인자, 헤지호그 단백질(hedgehog protein)[예를 들어, 소닉(Sonic), 인디언(Indian), 데저트(Desert)], 헤모글로빈, 인간 세포 성장 인자(HGF), 히루딘, 인간 혈청 알부민, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 인터페론(예를 들어, IFN-α, IFN-β, IFN-γ), 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 등), 각질 세포 성장 인자(KGF), 락토페린, 백혈병 억제 인자, 루시퍼라제, 뉴튜린, 호중구 억제 인자(NIF), 온코스타틴 M, 골원성 단백질, 부갑상선 호르몬, PD-ECSF, PDGF, 펩티드 호르몬(예를 들어, 인간 성장 호르몬), 플레이오트로핀, 단백질 A, 단백질 G, 발열성 외독소 A, 발열성 외독소 B, 발열성 외독소 C, 릴랙신, 레닌, SCF, 가용성 보체 수용체 I, 가용성 I-CAM 1, 가용성 인터루킨 수용체(IL-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15), 가용성 TNF 수용체, 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 스트렙토키나제, 초항원 즉, 스타필로코커스 장독소(SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), 과산화물 디스뮤타제(SOD), 독소 충격 증후군 독소(TSST-1), 티모신 알파 1, 조직 플라스미노겐 활성 인자, 종양 괴사 인자 베타(TNF 베타), 종양 괴사 인자 수용체(TNFR), 종양 괴사 인자-알파(TNF 알파), 혈관 내피 성장 인자(VEGEF) 및 유로키나제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 개시된 단백질 내 비천연 아미노산을 생체 내 통합하기 위한 조성물 및 방법을 이용하여 생산할 수 있는 단백질의 하나의 군으로서는 전사 조정 인자 또는 이의 일부를 포함한다. 전사 조정 인자의 예로서는 세포 성장, 분화 또는 조절 등을 조정하는 유전자 및 전사 조절 인자 단백질을 포함한다. 다양한 치료 표적을 제공하는 전사 조정 인자는 원핵 생물, 바이러스 및 진핵 생물 예를 들어, 진균, 식물, 효모, 곤충 및 동물 예를 들어, 포유 동물에서 찾아볼 수 있다. 발현 및 전사 활성 인자는 다양한 기작 예를 들어, 수용체에 결합하는 기작, 신호 전달 케스케이드를 촉진하는 기작, 전사 인자의 발현을 조절하는 기작, 프로모터 및 인핸서에 결합하는 기작, 프로모터와 인핸서에 결합하는 단백질과 결합하는 기작, DNA를 풀어주는 기작, 전-mRNA를 스플라이싱하는 기작, RNA를 폴리아데닐화하는 기작, 그리고 RNA를 분해하는 기작에 의해 전사를 조절한다는 사실을 알 수 있을 것이다.
본 발명의 단백질(예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 가지는 단백질)의 일군으로서는 생물학적으로 활성인 단백질 예를 들어, 시토킨, 염증 분자, 성장 인자, 이들의 수용체 및 발암 유전자 생산물 예를 들어, 인터루킨(예를 들어, IL-1, IL-2 및 IL-8 등), 인터페론, FGF, IGF-I, IGF-II, FGF, PDGF, TNF, TGF-α, TGF-β, EGF, KGF, SCF/c-Kit, CD40L/CD40, VLA-4/VCAM-1, ICAM-1/LFA-1, 및 히알루린/CD44; 신호 전달 분자 및 상응하는 발암 유전자 생산물 예를 들어, Mos, Ras, Raf 및 Met; 그리고 전사 활성 인자 및 억제 인자 예를 들어, p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rel, 그리고 스테로이드 호르몬 예를 들어, 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토스테론, 알도스테론의 수용체, LDL 수용체 리간드 및 코르티코스테론을 포함한다.
하나 이상의 비천연 아미노산을 가지는 효소(예를 들어, 산업용 효소) 또는 이의 일부도 본 발명에 의해 제공된다. 효소의 예로서는 예를 들어, 아미다제, 아미노산 라세마제, 아실라제, 탈수소 효소, 이산소화 효소, 디아릴프로판 퍼옥시다제, 에피머라제, 에폭시드 가수 분해 효소, 에스터라제, 이소머라제, 키나제, 글루코스 이소머라제, 글리코시다제, 글리코실 전이 효소, 할로퍼옥시다제, 모노옥시게나제(예를 들어, p450s), 리파제, 리그닌 퍼옥시다제, 니트릴 수화 효소, 니트릴라제, 단백질 분해 효소, 인산화 효소, 서브틸리신, 아미노기 전이 효소 및 뉴클레아제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이와 같은 다수의 단백질은 시판중에 있으며[예를 들어, 시그마 바이오사이언시스(Sigma BioSciences) 카탈로그], 상응하는 단백질 서열 및 유전자, 그리고 통상적으로 이의 다수의 변이체는 널리 공지되어 있다[예를 들어, Genbank 참조]. 이것들 중 임의의 것은 본 발명에 따라서 하나 이상의 비천연 아미노산을 삽입하여, 예를 들어, 단백질의 목적으로 하는 하나 이상의 치료 특성, 진단 특성 또는 효소 특성을 변경시킬 수 있다. 치료학적으로 관련 있는 특성의 예로서는, 혈청 반감기, 유통 반감기, 안정성, 면역원성, 치료 활성, 검출 가능성(예를 들어, 비천연 아미노산 내 리포터 기(예를 들어, 표지 또는 표지 결합 위치)를 포함시킴으로 인함), LD50 또는 기타 부작용의 감소, 위장관을 통한 체내 도입 능[예를 들어, 경구 흡수성(oral availability)] 등을 포함한다. 진단 특성의 예로서는 유통 반감기, 안정성, 진단 활성, 검출 가능성 등을 포함한다. 관련 효소 특성의 예로서는 유통 반감기, 안정성, 효소 활성, 생산 능 등을 포함한다.
기타 다수의 단백질도 본 발명의 조성물과 방법을 이용하여 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 하나 이상의 백신 단백질 내 하나 이상의 천연 아미노산을 감염성 진균 예를 들어, 아스퍼질러스(Aspergillus), 칸디다(Candida) 종; 예를 들어, 병원성 세균에 대한 모델로서 사용되는 세균 특히, 이. 콜라이와, 의학적으로 중요한 세균 예를 들어, 스타필로코사이(Staphylococci)[예를 들어, 아우레우스(aureus)], 또는 스트렙토코사이(Streptococci)[예를 들어, 뉴모니아에(pneumoniae)]; 원생 동물 예를 들어, 포자충류[예를 들어, 플라스모디아(Plasmodia)], 근족충류[예를 들어, 엔타모에바(Entamoeba)] 및 편모충류(트리파노소마(Trypanosoma), 레이슈매니아(Leishmania), 트리코모나스(Trichomonas), 지알디아(Giardia) 등); 바이러스 예를 들어, (+) RNA 바이러스(예를 들어, 폭스바이러스(Poxvirus) 예를 들어, 백시니아(vaccinia); 피코나바이러스(Picornavirus) 예를 들어, 폴리오(polio); 토가바이러스(Togavirus) 예를 들어, 루벨라(rubella); 플라비바이러스(Flavivirus) 예를 들어, HCV; 및 코로나바이러스(Coronaviruses), (-) RNA 바이러스(예를 들어, 래비도바이러스(Rhabdovirus) 예를 들어, VSV; 파라믹소바이러스(Paramyxovirus) 예를 들어, RSV; 오르토믹소바이러스(Orthomyxovirus) 예를 들어, 인플루엔자(influenza); 부니아바이러스(Bunyavirus); 및 아레나바이러스(Arenavirus), dsDNA 바이러스[예를 들어, 레오바이러스(Reovirus)], RNA→DNA 바이러스, 즉, 레트로바이러스(Retrovirus) 예를 들어, HIV 및 HTLV, 및 임의의 DNA→RNA 바이러스예를 들어, B형 간염 바이러스로부터 유래하는 단백질 내 비천연 아미노산으로 치환하는 단계를 포함할 수 있다.
농업과 관련하여 이용되는 단백질 예를 들어, 곤충 내성 단백질(예를 들어, Cry 단백질), 전분 및 지질 생산 효소, 식물 및 곤충 독소, 독소-내성 단백질, 미코톡신 해독 단백질, 식물 성장 효소(예를 들어, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카복실라제/옥시게나제, "RUBISCO"), 리폭시게나제(LOX) 및 포스포에놀피루베이트(PEP) 카복실라제도 비천연 아미노산 변형에 적당한 표적이다.
임의의 구체예에서, 목적으로 하는 단백질(또는 이의 일부)은 핵산에 의해 암호화된다. 통상적으로, 핵산은 하나 이상의 선택 코돈, 2개 이상의 선택 코돈, 3개 이상의 선택 코돈, 4개 이상의 선택 코돈, 5개 이상의 선택 코돈, 6개 이상의 선택 코돈, 7개 이상의 선택 코돈, 8개 이상의 선택 코돈, 9개 이상의 선택 코돈, 10개 이상의 선택 코돈을 포함한다.
목적으로 하는 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 당 업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 돌연 변이될 수 있으며, 이것은 본원의 내용 중 "돌연 변이 유발법 및 기타 분자 생물학적 기술"에 예를 들어, 비천연 아미노산을 통합하기 위한 하나 이상의 선택 코돈을 포함한다고 기술되어 있다. 예를 들어, 목적으로 하는 단백질에 대한 핵산은 하나 이상의 선택 코돈을 포함하도록 돌연 변이 유발되는데, 그 결과, 하나 이상의 비천연 아미노산이 삽입된다. 본 발명은 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 임의의 변이체 예를 들어, 임의의 단백질의 돌연 변이체를 포함한다. 이와 유사하게, 본 발명은 또한 상응하는 핵산, 즉, 하나 이상의 비천연 아미노산을 암호화하며 하나 이상의 선택 코돈을 가지는 임의의 핵산을 포함한다.
번역 후 변형된 비천연 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하기 위하여, 직교형 tRNA/RS 쌍을 통해 비천연 아미노산을 생체 내 통합하는데 적당한 숙주 세포 및 유기체를 이용할 수 있다. 숙주 세포는 직교형 tRNA, 직교형 tRNA 합성 효소를 발현하는 하나 이상의 벡터와, 유도체화될 단백질을 암호화하는 벡터를 포함하도록 유전자 조작된다(예를 들어, 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염된다). 이러한 성분들은 각각 동일한 벡터 상에 있을 수 있거나, 또는 별도의 벡터에 존재할 수 있거나, 아니면, 2개의 성분은 하나의 벡터상에 존재하고, 세 번째 성분은 제2의 벡터에 존재할 수 있다. 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 세균, 바이러스, 나출 폴리뉴클레오티드, 또는 접합된 폴리뉴클레오티드의 형태를 가질 수 있다.
면역 반응성에 의한 폴리펩티드의 정의
본 발명의 폴리펩티드는 다양한 신규 폴리펩티드 서열(예를 들어, 본원의 번역 시스템에서 합성된 단백질의 경우에는 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드, 또는 예를 들어, 신규 합성 효소의 경우에는 표준적인 아미노산의 신규 서열)을 제공하므로, 이 폴리펩티드는 또한 예를 들어, 면역 검정법에서 인식될 수 있는 새로운 구조적 특징을 제공하기도 한다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항혈청과, 이와 같은 항혈청이 결합된 폴리펩티드를 생산하는 것도 본 발명의 특징을 이룬다. 본원에 있어서, 상기 "항체"란 용어는, 분석물(항원)에 특이적으로 결합하고 이를 인식하는, 면역 글로불린 유전자 또는 면역 글로불린 유전자들에 의해 실질적으로 암호화된 폴리펩티드, 또는 이의 단편을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 예로서는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 단일 가닥 항체 등을 포함한다. 발현 라이브러리를 사용하는 방법 예를 들어, 파지 디스플레이법에 의하여 생산된 면역 글로불린 단편 예를 들어, Fab 단편 및 단편들을 본원에서는 "항체"라는 용어에 포함시킨다. 예를 들어, 항체의 구조와 관련 용어에 관한 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 4th Ed., 1999, Raven Press, New York]을 참조하시오.
면역 검정법에서 사용될 항혈청을 생산하기 위하여, 면역원성 폴리펩티드 중 하나 이상은 본원에 기술된 바와 같이 생산 및 정제된다. 예를 들어, 재조합 단백질은 재조합 세포 내에서 생산될 수 있다. 마우스의 타고난 변종(이 마우스 변종을 사용하여 나온 결과는 마우스의 실제 유전적 동일성으로 인하여 더욱 쉽게 재현 가능하므로 본 면역 검정법에 사용됨)을, 표준적인 마우스 면역화 방법에 따라서, 표준적인 애쥬반트 예를 들어, 프룬트 애쥬반트와 함께 면역원성 단백질(들)로 면역화한다[예를 들어, Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York; 특이적 면역 반응성을 측정하는데 사용될 수 있는 항체 생산법, 면역 검정법 및 조건에 관하여 기술되어 있음]. 단백질, 항체, 항혈청 등에 관한 부가의 설명은 문헌[국제 특허 출원 공보 WO 2004/094593(발명의 명칭: "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE"); WO 2002/085923(발명의 명칭: "IN VIVO INCORPORATION OF UNNATURAL AMINO ACIDS"); WO 2004/035605(발명의 명칭: "GLYCOPROTEIN SYNTHESIS"); 및 WO 2004/058946(발명의 명칭: "PROTEIN ARRAYS."]에서 살펴볼 수 있다.
키트
키트도 본 발명의 특징을 이룬다. 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드를 생산하기 위한 키트는 본 발명의 특징을 이루는데, 여기서, 상기 키트는 본 발명의 하나 이상의 구성체를 포함한다. 예를 들어, 이러한 키트는 다음과 같은 부품 및 성분들로부터 선택되는 다양한 부품 및 성분들을 포함할 수 있다: 키트 성분을 담는 용기, 폴리펩티드를 생산하기 위한 지시가 담긴 자료, O-tRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산, O-RS를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산, 비천연 아미노산, 비천연 아미노산을 번역 후 변형시키기 위한 시약, 그리고 O-tRNA/O-RS의 발현을 위한 이. 콜라이 숙주 세포의 적당한 균주.
이하 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이지 한정하고자 하는 것은 아니다. 당 업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 변형될 수 있는 비-표준적인 매개 변수들이 다수 존재함을 알게될 것이다. 본원에 개시된 실시예 및 구체예는 오로지 예시를 위한 것이며, 또한 당 업자에게 다양한 변형 또는 변경이 제안될 것이고, 이와 같은 다양한 변형 또는 변경은 본 출원의 사상과 관점 그리고 첨부된 청구항의 범위 내에 포함된다는 사실을 이해할 수 있다.
실시예 1
비천연 아미노산을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 위한, 단일 플라스미드 시스템의 구성
본 실시예에는, p-벤조일-L-페닐알라닌을 통합하기 위한 직교형 아미노아실-tRNA 및 아미노아실-tRNA 합성 효소 쌍의 양 성분을 암호화하는 플라스미드를 구성하는 것에 관하여 기술되어 있다.
이. 콜라이 숙주 세포 내에서 기능을 가지는 직교형 번역 쌍의 양 성분들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 플라스미드(pYR-BpaRS1)를 구성하였다. 다시 말해서, 상기 두 개의 성분들은 직교형 tRNA MjtRNA-Tyr(CUA)와, 광 가교 아미노산인 p-벤조일-L-페닐알라닌(Bpa, 도 1 참조)을 가지는 직교형 tRNA를 특이적으로 아미노아실화하는 돌연 변이 MjTyrRS 합성 효소(BpaRS)이다. 문헌[Chin외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11020-11024 (2002)]을 참조하시오.
이 pYR-BpaRS1 플라스미드 시스템의 억제 효율을 측정하기 위하여, pYR-BpaRS1과 lacZ 리포터 플라스미드(즉, lacZ 유전자의 리더 서열 내 허용 가능한 위치에 앰버 돌연 변이가 발생한, β-갈락토시다제를 암호화하는 lacZ 리포터 플라스미드) 둘 다에 의해 동시 형질 전환된 TOP10 이. 콜라이 세포(Invitrogen™)에 대한 β-갈락토시다제 활성을 측정하였다. 불행하게도, 세포를 1mM Bpa 존재 하에 배양하였을 때, β-갈락토시다제 활성은 매우 낮았다(도 2). tRNA 유전자의 측접 서열을 변형시킴으로써 억제 효율을 증가시키기 위한 시도도 성공적이지 못하였다.
이와 같은 억제 효율을 개선하기 위하여, 천연 이. 콜라이 tRNA 프로모터와 종결부위를 포함하는 새로운 앰버 억제 tRNA 오페론을 구성하였다. 이. 콜라이 tRNA 유전자를 조사해본 결과, 이. 콜라이 프롤릴 tRNA는 고세균 tRNA와 동일한 C1-G72 쌍을 가지며; 이 염기 쌍은 이. 콜라이 내 MjTyrRS에 의해 MjtRNA-Tyr(CUA)을 선택적으로 인식하는 주요 동일성 결정기(major identity determinant)임을 알 수 있었다[Wang and Schultz, Chem. Biol. 8:883-890 (2001)]. 이와 같은 관찰 결과를 살펴보았을 때, 합성 앰버 억제 tRNA 유전자는 이 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자가 동일한 길이의(77 뉴클레오티드) 모노시스트론 proK 오페론 내 이. 콜라이 proK 유전자를 대신하여 포함되도록 구성되었다. 상기 proK 유전자는 이. 콜라이 내에서 가장 자주 사용되는 프롤린 코돈(CCG)을 인식하는 tRNA를 암호화하므로[Nakamura외 다수, Nucleic Acids Res. 28:292 (2000)], 상기 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자는 상기 proK 프로모터의 제어 하에서 효과적으로 전사됨을 예상할 수 있었다. 천연적으로 proK 프로모터의 상류에 위치하는 FIS 결합 위치도 tRNA 전사를 증강시키는 합성 유전자 구성체 내에 포함되었다[Muskhelishvili외 다수, EMBO J. 16:3655-3665 (1997)]. pYR-BpaRS1 내 원래의 억제 tRNA 오페론을, proK 프로모터 및 종결부위의 제어하에 있는 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자로 치환함으로써, 최종 발현 벡터 pYR-BpaRS5를 생산하였다. 이. 콜라이에 형질 전환되었을 때, 이 플라스미드는 MjtRNA-Tyr(CUA)의 발현량을 (1pp 프로모터 및 rrnC 종결부위의 제어하에 있는 원래 tRNA 유전자에 비하여) 2배 증가시켰다[노던 분석법에 의해 확인됨(도 3)]. 이와 같이 (야생형 β-갈락토시다제 발현량에 비하여) 발현량이 증가하였음은 곧, 억제 효율이 8%에 해당함을 의미한다[β-갈락토시다제 활성 검정법에 의해 측정됨(도 2)].
실시예 2
개선된 합성 효소 유전자 및 프로모터의 생산
본 실시예에는, 직교형 번역 시스템 성분의 발현을 위한 개선된 시스템의 구성에 관하여 기술되어 있는데, 여기에서는, 합성 효소 유전자 및 합성 효소 프로모터에 돌연 변이를 일으켰을 때의 효과를 측정한다.
코바야시(Kobayashi)외 다수는 이미, MjTyrRS 내 Asp286을 Arg로 단일 아미노산 치환하면(D286R), MjtRNA-Tyr(CUA)의 전체적인 시험관 내 아미노아실화 비율이 상당 수준 증가하는데(kcat/Km가 67배 더 커짐), 이는 주로 동족 합성 효소에 의해 앰버 억제 tRNA 내 안티 코돈(CUA)의 인식률이 증가하였기 때문(Km보다 57배 낮아짐)이라는 사실을 보고한 바 있다[Kobayashi외 다수, Nat. Struct. Biol. 10:425-432 (2003)]. 이와 같은 정보를 이용하여, 동일한 D286R 돌연 변이를 위치 지정 돌연 변이 유발법에 의해 pYR-BpaRS5 내 BpaRS 유전자에 도입하였다. 실제로, 상기 BpaRS의 D286R 돌연 변이체는 β-갈락토시다제 활성을 4.5배 증가시켰다(도 2 참조).
-10 영역에 GATC 대신 TATC 서열이 존재하는 돌연 변이 glnS 프로모터(서열 번호 12)는 이미 유전자 발현량이 증가하였음을 알 수 있었다[Plumbridge and Soll, Biochimie 69:539-541 (1987)]. 이러한 사실을 바탕으로 하여, pYR-BpaRS5 내 야생형 glnS 프로모터를 상기 문헌[Plumbridge and Soll]에 개시된 glnS 프로모터의 돌연 변이형으로 치환하여, 본 시스템의 효율을 개선하고자 하였다. 그러나, 이 프로모터 서열을 pYR-BpaRS5에 삽입한 다음, 서열 결정한 결과, 의도로 한 돌연 변이 이외에, 의도로 하지 않은 부가적인 결실 돌연 변이도 일어났음이 확인되었다. 의도로 한 glnS 프로모터 내 하나의 뉴클레오티드 치환(-11번 위치에서 G→T) 이외에도, β-갈락토시다제 활성에 대해 검정된 결실 돌연 변이체중 하나의 특정 돌연 변이체인 pYR-BpaRS-TRN 즉, 하나의 뉴클레오티드가 결실된(-15번 위치의 A 잔기가 결실된) 돌연 변이체는, pYR-BpaRS5에 비하여 β-갈락토시다제 활성이 5배 증가하였다(도 2 참조). 이와 같이 서열 결정에 의해 확인된 새로운 돌연 변이 glnS 프로모터 도메인(glnS-TRN이라 칭함)의 완전한 뉴클레오티드 서열을 도 13에 제시하였다.
Figure 112008064869645-PCT00006
glnS 프로모터의 돌연 변이형의 제어하에 있는 BpaRS 발현량은 2배 개선되었다(웨스턴 블럿팅 분석법에 의해 측정됨[도 4 참조)]. BpaRS의 D286R 치환체와 새로운 돌연 변이 glnS 프로모터를 조합한 결과, β-갈락토시다제 활성이 1.5배 더 증가하였으며, 이에 따라서, 전체적인 억제 효율은 pYR-BpaRS-TRN(D286R)에 대해서 57%였다.
실시예 3
개선된 tRNA 발현 시스템의 생산
본 실시예에는, 직교형 번역 시스템 성분을 발현시키기 위한, 개선된 시스템의 구성에 관하여 기술되어 있는데, 이때, 폴리시스트론 오페론 내에 MjtRNA-Tyr(CUA) 복수개를 배치하였을 때의 효과를 측정하였다.
억제 효율에 대한 앰버 억제 tRNA 복수개의 효과를 관찰하였다. 하나의 proK 프로모터 및 종결부위의 제어하에 있는 3개의 앰버 억제 tRNA 유전자를 함유하는 폴리시스트론 MjtRNA-Tyr(CUA) 오페론을 구성하였다.
폴리시스트론 오페론 내 3개의 직렬 O-tRNA 서열들은 천연 이. 콜라이 tRNA 링커 서열로부터 유래하는 tRNA 링커 서열에 의해 서로 분리되어 있었다. 이와 같이 특정 링커 서열은 T(-1) 및 A(77) 뉴클레오티드를 함유하므로, 이 링커 서열로 선택하였다. 이와 같이 tRNA 링커 내 2개의 뉴클레오티드 위치는, 원래의 상태(즉, 내인성)로 있을 때 tRNA 전구체의 5' 및 3'-가공 과정을 효율적으로 수행하는데 최적인 것으로 파악된다.
재조합 폴리시스트론 오페론 내 제1 및 제2 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자는 이. 콜라이 valU 및 valX tRNA 유전자 사이에 원래부터 존재하던 링커(서열 번호 14)로부터 유래한 tRNA 링커에 의해 분리되어 있다. 재조합 폴리시스트론 오페론 내 제2 및 제3 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자는 이. 콜라이 IleT 및 alaT tRNA 유전자(서열 번호 15) 사이에 원래부터 존재하던 링커(서열 번호 15)로부터 유래하는 tRNA 링커에 의해 분리되어 있다. 이와 같은 폴리뉴클레오티드는 편리한 제한 위치를 포함한다는 점에서, 상기 링커를 사용하면 추가의 실용적인 이점을 얻을 수 있다.
3개의 억제 tRNA 유전자를 함유하는 합성 폴리시스트론 tRNA 오페론의 2개의 동일한 복사체를 결찰하여, 6개의 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자를 포함하는 유전자 클러스터를 생산하였다. 3개의 tRNA와 6개의 tRNA를 포함하는, 조립된 유전자 클러스터를 pYR-BpaRS-TRN(D286R)에 클로닝하여, 각각 pYR-BpaRS-3TRN(D286R) 및 pYR-BpaRS-6TRN(D286R)을 생산하였다. 이. 콜라이 내에서 발현시켰을 때, 이 플라스미드는 MjtRNA-Tyr(CUA)의 발현량을 각각 30% 및 50% 증가시켰다[노던 분석법에 의해 측정됨(도 3 참조)]. 이와 같이 메시지 발현량이 증가하면, β-갈락토시다제 활성이 30∼40% 증가할 수 있다(도 2 참조).
이들 플라스미드 내에서 암호화된 이. 콜라이 휘귀 코돈 tRNA는 대부분의 단백질 발현에 불 필수적인 것일 수 있으므로, 이와 같은 이. 콜라이 tRNA 유전자를 플라스미드 pYR-BpaRS-6TRN(D286R)로부터 제거하여, pSup-BpaRS-6TRN(D26SR)를 생산하였다(도 5 참조). 예상한 바와 같이, 생체 내 β-갈락토시다제 활성 검정법에 의해 측정된 이 플라스미드의 억제 효율은 모 플라스미드의 억제 효율과 동일하였다(도 6 참조).
실시예 4
개선된 발현 시스템을 이용하는, 비천연 아미노산 포함 모델 단백질의 발현
본 실시예에는, 본 발명의 개선된 발현 시스템을 사용하여, 비천연 아미노산을 포함하는 모델 단백질 향유 고래 미오글로빈을 발현하는 것에 관하여 기술되어 있다.
본 발명의 시스템을 이용하여 비천연 아미노산의 단백질로의 통합 수율 및 신뢰도가 한층 개선되는지 여부를 관찰하기 위해서, 향유 고래 미오글로빈의 Bpa 돌연 변이체에 대한 Ser-4를 이. 콜라이 내에서 발현시켰다[Chin외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11020-11024 (2002)]. pBAD/Myc-His/MB(S4TAG) 및 pSup-BpaRS-6TRN(D286R)으로 동시 형질 전환된 TOP1O 이. 콜라이 세포(Invitrogen™)를 37℃에서 1mM Bpa의 존재 하에 루리아-버타니(Luria-Bertani) 배지 중에서 배양하였다. 상기 생체 내 β-갈락토시다제 검정 데이터와 마찬가지로, 전장 돌연 변이 미오글로빈은 전체 정제 수율 40㎎/ℓ로 생산되었던 반면에, 상기 시스템은 2㎎/ℓ의 돌연 변이 단백질을 생산하였다[Chin외 다수, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:11020-11024 (2002)]. 아미노산의 부재 하에서 SDS-PAGE 겔을 사용하여 관찰한 결과, 돌연 변이 단백질은 관찰되지 않았다(도 6). Ser-4 대신 Bpa를 함유하는 돌연 변이 미오글로빈의 MALDI-TOF 질량 분광 분석법을 수행한 결과, 평균 질량은 18521이었는데, 이는 계산을 통해 예측하였던 질량인 18520과 거의 일치하는 값이다. 질량 스펙트럼에 있어서, 4번 위치에 아미노산이 통합되어 있다는 증거는 찾아볼 수 없었다.
실시예 5
본 발명의 개선된 발현 시스템의 광범위한 이용 가능성
본 실시예에는, 4개의 상이한 비천연 아미노산을 포함하는 β-갈락토시다제의 발현에 관하여 기술되어 있는데, 여기서, 발현 시스템은 상이한 비천연 아미노산에 대하여 하전 특이성을 가지는 상이한 돌연 변이 합성 효소를 사용한다.
본 발명의 발현 시스템의 보편성을 테스트해보기 위하여, 3개의 부가 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소를 상기 시스템 내에서 테스트하였다. 이와 같은 O-RS는 대안적으로, p-아세틸-L-페닐알라닌(pAcPhe), p-아지도-L-페닐알라닌(pAzPhe) 및 p-요오도-L-페닐알라닌(pIPhe)을 가지는 O-tRNA MjtRNA-Tyr(CUA)를 특이적으로 아미노아실화한다(즉, 하전시킨다)(도 1). 이와 같은 비천연 아미노산은 화학-표지화[Wang외 다수, Proc. Natl. Sci. Acad. USA 100:56-61 (2003)], 광-가교[Chin외 다수, J. Am. Chem. Soc, 124:9026-9027 (2002)], 및 X선 결정학 위상 분석[Xie외 다수, Nat. Biotechnol., 22: 1297-1301 (2004)] 실험에 유용하다. 각각의 O-RS를 pSup-BpaRS-6TRN(D286R)의 NdeI/PstI 위치에 서브 클로닝하여, 이와 같은 돌연 변이 MjTyrRS 유전자를 암호화하는 본 발명의 발현 벡터를 구성하여, 벡터 pSup-pAcPheRS-6TRN, pSup-pAzPheRS-6TRN 및 pSup-pIPheRS-6TRN 벡터를 제조하였다. Bpa를 사용하였을 때와 마찬가지로, 상기 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 세포를 상기 아미노산(1mM)의 존재 하에 배양하였을 때, β-갈락토시다제 활성 수준은 야생형 β-갈락토시다제의 활성 수준과 유사한데(도 7), 이는 곧, 각각의 비천연 아미노산을 포함하는 β-갈락토시다제가 생산됨을 말해주는 것이다.
실시예 6
플라스미드 구성
pYR-BpaRS1
BpaRS 및 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자를 pRARE2 플라스미드(Novagen)의 SacI 및 SpeI 위치에 삽입함으로써, pYR-BpaRS1, 클로람페니콜 내성 마커를 함유하는 p15A 레플리콘, lpp 프로모터 및 rrnC 종결부위의 제어하에 있는 MjtRNA-Tyr(CUA), 그리고 glnS 프로모터의 제어하에 있는 BpaRS를 생산하였다.
proK 프로모터 및 종결부위를 가지는 Mj tRNA-Tyr(CUA) 유전자
하나의 PCR 반응에서 전체 tRNA 오페론을 구성하기 위해, 중첩 PCR 기법에서 4개의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR을 통하여, proK 프로모터 및 종결부위를 함유하는 모노시스트론 MjtRNA-Tyr(CUA) 오페론을 구성하였다:
Figure 112008064869645-PCT00007
이후, 2개의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 PCR 앰플리콘을 증폭시켰다:
Figure 112008064869645-PCT00008
결과로 생성된 앰플리콘을 pYR-BpaRS1의 BclI 및 XhoI 위치(밑줄친 부분) 사이에 삽입하여, 플라스미드 pYR-BpaRS5을 생산하였다.
돌연 변이 glnS 프로모터
돌연 변이 glnS 프로모터를 4개의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하는 PCR에 의해 구성하였다:
Figure 112008064869645-PCT00009
생성물을 pYR-BpaRS5의 XmaI 및 NdeI 위치 사이에 삽입하였다. 다수의 클론들을 생체 내 LacZ 활성 검정법으로 스크리닝하고, 활성이 개선된 하나의 특정 단일 염기 결실 돌연 변이체를 동정하여 서열 결정하였다(이를 pYR-BpaRS-TRN이라 칭함).
직렬 tRNA 유전자 카세트
이. 콜라이 게놈 내, valU 및 valX 유전자 사이에 원래부터 존재하는 링커 서열(서열 번호 14)과 ileT 및 alaT 유전자 사이에 원래부터 존재하는 링커 서열(서열 번호 15)을 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자 사이의 스페이서로서 사용하였다. 상기 링커 서열들은 MjtRNA-Tyr(CUA) 유전자가 결찰된 BsmAI 및 EarI 제한 위치를 함유한다. 이와 같이 측접하는 서열들은 또한 T(-1) 및 A(77) 잔기들을 함유하는데, 이 잔기들은 tRNA 전구체의 효율적인 5'-가공 과정 및 3'-가공 과정에 적합하다. 3개의 프라이머 세트를 사용하는 PCR을 통하여 상기 tRNA 유전자 카세트를 증폭시켰다:
Figure 112008064869645-PCT00010
Figure 112008064869645-PCT00011
Figure 112008064869645-PCT00012
각각의 세트로부터 유래하는 생성물을 BsmAI(1 세트), EarI(2 세트) 또는 상기 제한 효소 둘 다(3 세트)로 절단하였다. 이들 3개의 제한 단편들을 결찰한 결과, 2개의 상이한 천연 링커 서열에 의해 연결된 tRNA 유전자 3개를 함유하는 폴리 시스트론 tRNA 오페론이 생산되었다. 결과로 생성된 유전자 클러스터를 2개의 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의해 증폭시켰다:
Figure 112008064869645-PCT00013
Figure 112008064869645-PCT00014
상기 4 세트 및 5 세트로부터 유래하는 PCR 생산물을 SphI로 분해하고, 이를 서로 결찰시켜 비 배향성 직렬 tRNA 유전자 조립체를 생산하였는데, 이 조립체는 2개의 동일한 폴리시스트론 tRNA 오페론으로 이루어져 있으며, 또한 이 오페론은 각각 하나의 proK 프로모터 및 종결부위의 제어 하에 있는 3개의 tRNA 유전자를 암호화한다. 하나 또는 2개의 동일한 폴리시스트론 tRNA 오페론을 함유하는 각각의 tRNA 유전자 클러스터를 pYR-BpaRS-TRN의 ApaLI 및 XhoI 위치에 클로닝한 결과, 각각 pYR-BpaRS-3TRN 및 pYR-BpaRS-6TRN이 생성되었다.
pSup 플라스미드
SpeI 및 DrdI으로 절단한 다음, 녹두의 뉴클레아제로 처리하여, 원래 pRARE2 플라스미드 내에서 암호화된 12개의 이. 콜라이 tRNA 유전자 각각을 pYR-BpaRS-6TRN(D286R)으로부터 분리하였다. 선형화된 벡터들을 다시 결찰하여 pSup-BpaRS-6TRN(D286R)을 만들었다. p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌 및 p-요 오도-L-페닐알라닌에 대한 돌연 변이 MjTyrRS 유전자를 이 유전자들에 상응하는 pBK 플라스미드로부터 pSup-BpaRS-6TRN(D286R)의 NdeI 및 PstI 위치에 서브 클로닝하여, 각각 pSup-pAcPheRS-6TRN, pSup-pAzPheRS-6TRN 및 pSup-pIodoPheRS-6TRN을 만들었다.
lacZ 단백질 플라스미드 및 생체 내 β-갈락토시다제 활성 검정법
위치 배향 돌연 변이 유발법을 통하여 LacZ 리포터 플라스미드인 pBAD/Myc-His/LacZ(TAG)를 생산함으로써, pBAD/Myc-His/LacZ(Invitrogen™)의 lacZ 유전자의 상류에 위치하는 리더 서열(MDPLVTAASVLEFGLFET; 서열 번호 57)의 13번 잔기에 있는 페닐알라닌 코돈(밑줄친 부분)을 앰버 코돈(TAG)으로 돌연 변이시켰다. 각각의 억제 플라스미드와 이 플라스미드를 함께 사용하여 이. 콜라이 TOP1O 세포(Invitrogen™)를 동시 형질 전환시켰다. 세포를 0.02% 아라비노스 및 1mM 비천연 아미노산을 함유하는 루리아-버타니(LB) 배지 중에서 밤새도록 항온 처리하였다(37℃). 문헌[Miller, J.H. Experiments in Molecular Genetics. (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972)]에 개시된 방법에 따라서, LacZ(β-갈락토시다제) 활성을 측정하였다.
실시예 7
일반적인 방법
플라스미드를 클로닝하여 유지시키는데에 XL1-블루 이. 콜라이 세포(Stratagene)를 사용하였다. PfuUltra™ 고 신뢰도 DNA 중합 효소(Stratagene®)를 중합 효소 연쇄 반응(PCR)용으로 사용하였다. 퀵 체인지(QuikChange)® II 위치 지정 돌연 변이 유발 키트(Stratagene®)를 사용하여 위치 지정 돌연 변이 유발법을 수행하였다. 서열 결정에 의하여, 구성된 모든 플라스미드 서열을 확인하였다.
단백질 발현
4번 위치(Ser-4)에 앰버 코돈이 위치하는, C-말단 6 히스티딘 태깅된 돌연 변이 향유 고래 미오글로빈 유전자(pBAD-JYAMB-4TAG 유래)를 pBAD/Myc-His(Invitrogen™)의 NcoI 및 KpnI 위치 사이에 삽입하여, pBAD/Myc-His/MB(S4TAG)를 생산하였다. pSup-BpaRS-6TRN(D286R)과 이 플라스미드를 함께 사용하여 이. 콜라이 TOP1O(Invitrogen™)을 동시 형질 전환시켰다. 세포를 100㎎/㎖의 카베니실린, 50㎎/㎖의 클로람페니콜 및 1mM Bpa를 함유하는 LB 중에서 항온 처리하였다(37℃). OD600=0.6에서, 0.2% 아라비노스를 첨가하여 세포를 유도시킨 다음, 이 세포를 12시간 동안 항온 처리하였다. 원심 분리하여 세포를 수집한 다음, 이를 버그버스터(BugBuster)® 시약(Novagen®)으로 분해하였다. 봉입체로부터 얻은 단백질을 제조자의 프로토콜에 따른 변성 조건 하에서 탈론(TALON)® 금속 친화성 수지(Clontech®)로 정제하였다. 정제된 단백질을 한외 여과로 농축시키고, 이를 MALDI-TOF 질량 분광 분석법으로 분석하였다. 브래드포드 방법(Bradford method)으로 단백질 농도를 측정하였다.
노던 분석법
각각의 억제 플라스미드로 형질 전환된 이. 콜라이 TOP1O 세포(Invitrogen™)를 LB 중에서 항온 처리하였다(37℃). OD600=0.8에서, 세포를 수집하였다. 전술 한 바와 같이, 페놀 추출법과 이소프로파놀 분류법으로 총 tRNA를 분리하였다[Deutscher and Hilderman, "Isolation and partial characterization of Escherichia coli mutants with low levels of transfer ribonucleic acid nucleotidyltransferase," J.Bacteriol., 118:621-627 (1974)]. 15% 변성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 RNA 시료를 분리한 다음, 이를 진 스크린 플러스(GeneScreen Plus)® 막(PerkinElmer®)으로 옮겼다. 55℃에서, 밤새도록 상기 막을 다음과 같은 서열로 혼성화하였다:
5'-바이오틴-CCCTGCTGAACTACCGCC-3'(서열 번호 58)
제조자의 프로토콜에 따라서, 노스2사우스(North2South) 화학 발광 혼성화법 및 검출 키트(Pierce)를 사용하여, 혼성화된 바이오틴화 프로브를 검출하였다.
Bpa 발현의 웨스턴 분석
PCR에 의해 C-말단 6 히스티딘 태깅 BpaRS 유전자를 구성하여, 이를 pYR-BpaRS5 및 pYR-BpaRS-TRN의 NdeI 및 PstI 위치 사이에 삽입하여, 각각 pYR-BpaRS5(C-His) 및 pYR-BpaRS-TRN(C-His)을 만들었다. 각각의 플라스미드로 형질 전환시킨 이. 콜라이 Top10 세포를 LB 중에서 항온 처리하였다(37℃). 세포를 OD600=1에서 수집하고, 이를 버그버스터 시약으로 분해하였다. 총 단백질을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리한 다음, PVDF 막(Invitrogen)에 옮겼다. 상기 막을 항-His(C-말단) 항체-HRP 접합체(Invitrogen)로 혼성화하고, 이를 화학 발광법으로 검출하였다.
본원에 개시된 실시예 및 구체예는 오로지 예시적 목적으로 기술된 것이며, 또한 당 업자는 여기에 변형 또는 변경을 가할 수 있을 것이며, 이와 같은 변형 및 변경 예들은 본원의 사상과 관점, 그리고 본원에 첨부된 청구의 범위 내에 포함되는 것임을 알 수 있을 것이다.
전술한 본 발명은 명확성과 이해를 위한 목적으로 어느 정도 상세히 기술되어 있지만, 이와 같이 기술된 사실을 통하여, 당 업자는 본 발명의 실제 범위를 벗어나지 않고 발명의 형태와 세부 사항에 다양한 변화를 가할 수 있음도 알 것이다. 예를 들어, 전술한 모든 기술과 장치는 다양한 방식으로 함께 사용될 수 있다. 본 출원에 인용된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 서류들은, 각각의 공보, 특허, 특허 출원 및/또는 기타 서류가 모든 목적을 위하여 참고용으로 인용되어 있음을 나타낼 때와 동일한 정도로, 모든 목적을 위하여 그 자체로서 본원에 참고용으로 인용되어 있는 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> The Scripps Research Institute Ryu, Youngha Schultz, Peter G. <120> SYSTEMS FOR THE EXPRESSION OF ORTHOGONAL TRANSLATION COMPONENTS IN EUBACTERIAL HOST CELLS <130> 54-001730PC <140> PCT/US 07/005914 <141> 2007-03-07 <160> 58 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 77 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> suppressor tyrosyl-tRNA CUA derived from Methanococcus jannaschii <400> 1 ccggcgguag uucagcaggg cagaacggcg gacucuaaau ccgcauggcg cugguucaaa 60 uccggcccgc cggacca 77 <210> 2 <211> 306 <212> PRT <213> Methanococcus jannaschii <400> 2 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Tyr 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 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tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagatta 918 <210> 4 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> p-benzoyl-L-phenylalanine aminoacyl-tRNA synthetase <400> 4 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Gly 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Leu Tyr Gly Ser Pro Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val 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ggcattatct ccaaataaaa aagatgattg atttacaaaa tgctggattt 180 gatataatta tattgttggc tgatttacac gcctatttaa accagaaagg agagttggat 240 gagattagaa aaataggaga ttataacaaa aaagtttttg aagcaatggg gttaaaggca 300 aaatatcttt atggaagtcc tttccagctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tacgagtcat 480 tatttaggcg ttgatgttgc agttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagatta 918 <210> 6 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> p-acetyl-L-phenylalanine aminoacyl-tRNA synthetase <400> 6 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu Ala Met 85 90 95 Gly Leu Lys Ala Lys Tyr Val Tyr Gly Ser Glu Phe Gln Leu Asp Lys 100 105 110 Asp Tyr Thr Leu Asn Val Tyr Arg Leu Ala Leu Lys Thr Thr Leu Lys 115 120 125 Arg Ala Arg Arg Ser Met Glu Leu Ile Ala Arg Glu Asp Glu Asn Pro 130 135 140 Lys Val Ala Glu Val Ile Tyr Pro Ile Met Gln Val Asn Gly Cys His 145 150 155 160 Tyr Arg Gly Val Asp Val Ala Val Gly Gly Met Glu Gln Arg Lys Ile 165 170 175 His Met Leu Ala Arg Glu Leu Leu Pro Lys Lys Val Val Cys Ile His 180 185 190 Asn Pro Val Leu Thr Gly Leu Asp Gly Glu 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attccagctt gataaggatt atacactgaa tgtctataga 360 ttggctttaa aaactacctt aaaaagagca agaaggagta tggaacttat agcaagagag 420 gatgaaaatc caaaggttgc tgaagttatc tatccaataa tgcaggttaa tggttgtcat 480 tataggggcg ttgatgttgc tgttggaggg atggagcaga gaaaaataca catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagatta 918 <210> 8 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> p-azido-L-phenylalanine aminoacyl-tRNA synthetase <400> 8 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile 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catgttagca 540 agggagcttt taccaaaaaa ggttgtttgt attcacaacc ctgtcttaac gggtttggat 600 ggagaaggaa agatgagttc ttcaaaaggg aattttatag ctgttgatga ctctccagaa 660 gagattaggg ctaagataaa gaaagcatac tgcccagctg gagttgttga aggaaatcca 720 ataatggaga tagctaaata cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagatta 918 <210> 10 <211> 306 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> p-iodo-L-phenylalanine aminoacyl-tRNA synthetase <400> 10 Met Asp Glu Phe Glu Met Ile Lys Arg Asn Thr Ser Glu Ile Ile Ser 1 5 10 15 Glu Glu Glu Leu Arg Glu Val Leu Lys Lys Asp Glu Lys Ser Ala Leu 20 25 30 Ile Gly Phe Glu Pro Ser Gly Lys Ile His Leu Gly His Tyr Leu Gln 35 40 45 Ile Lys Lys Met Ile Asp Leu Gln Asn Ala Gly Phe Asp Ile Ile Ile 50 55 60 Leu Leu Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu Asn Gln Lys Gly Glu Leu Asp 65 70 75 80 Glu Ile Arg Lys Ile Gly Asp Tyr Asn Lys Lys Val Phe Glu 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cttccttgaa tatcctttaa ccataaaaag gccagaaaaa 780 tttggtggag atttgacagt taatagctat gaggagttag agagtttatt taaaaataag 840 gaattgcatc caatggattt aaaaaatgct gtagctgaag aacttataaa gattttagag 900 ccaattagaa agagatta 918 <210> 12 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> mutant E. coli glnS promoter <400> 12 cgattatcaa ttttaaaaaa ctaacagttg tcagcctgtc ccgcttataa tatcatacgc 60 c 61 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> modified mutant E. coli glnS promoter TRN <400> 13 cgattatcaa ttttaaaaaa ctaacagttg tcagcctgtc ccgctttaat atcatacgcc 60 <210> 14 <211> 44 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 14 actactttat gtagtctccg ccgtgtagca agaaattgag aagt 44 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 15 aatttgcacg gcaaatttga agaggtttta actacatgtt at 42 <210> 16 <211> 3 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 16 ttt 3 <210> 17 <211> 4 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 17 tcct 4 <210> 18 <211> 6 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 18 agatgt 6 <210> 19 <211> 9 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Escherichia coli <400> 29 gtttaaaaga catcggcgtc aagcggatgt ctggctgaaa ggcctgaaga attt 54 <210> 30 <211> 57 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 30 tttagtcccg gcgcttgagc tgcggtggta gtaataccgc gtaacaagat ttgtagt 57 <210> 31 <211> 62 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 31 tctcttactt gatatggctt tagtagcggt atcaatatca gcagtaaaat aaatttcccg 60 at 62 <210> 32 <211> 62 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 32 aggcattttg ctattaaggg attgacgagg gcgtatctgc gcagtaagat gcgccccgca 60 tt 62 <210> 33 <211> 35 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 33 aattcgaaaa gcctgctcaa cgagcaggct ttttt 35 <210> 34 <211> 64 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 34 atcagttagc gaaatatctt acttgcaatc ggtgtggaaa acggtagtat tagcagccac 60 gagt 64 <210> 35 <211> 41 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 35 aaaatcccaa gaaaaaacca acccttacgg ttggtttttt t 41 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 36 attttgaacc ccgcttcggc ggggtttttt 30 <210> 37 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 37 gtgcacggct aactaagcgg cctgctgact ttctcgccga tcaaaaggc 49 <210> 38 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 38 ctttctcgcc gatcaaaagg cattttgcta ttaagggatt gacgagggcg tatctgcgca 60 gtaagatgcg ccccgcattc cggcggtagt tcagcagggc 100 <210> 39 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 39 ctttctcgcc gatcaaaagg cattttgcta ttaagggatt gacgagggcg tatctgcgca 60 gtaagatgcg ccccgcattc cggcggtagt tcagcagggc 100 <210> 40 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 40 gcataagctt atgcaaaaaa gcctgctcgt tgagcaggct tttcg 45 <210> 41 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 41 agtctgatca gtgcacggct aactaagcgg 30 <210> 42 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 42 gcatctcgag atgcaaaaaa gcctgctcgt tg 32 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 43 ccgagctccc gggtcatc 18 <210> 44 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 44 ccgagctccc gggtcatcaa tcatccccat aatccttgtt agattatcaa ttttaaaaaa 60 ctaacagttg tcagcctgtc 80 <210> 45 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 45 gtccatatgg gattcctcaa agcgtaaaca acgtataacg gcgtatgata ttataagcgg 60 gacaggctga caactgttag 80 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 46 gtccatatgg gattcctc 18 <210> 47 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 47 gtgcacggct aactaagcgg cctgctgact ttctcgccga tcaaaaggc 49 <210> 48 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 48 tacacggcgg agactacata aagtagttgg tccggcgggc cggatttg 48 <210> 49 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 49 gtagtctccg ccgtgtagca agaaattgag aagtccggcg gtagttcagc ag 52 <210> 50 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 50 aaacctcttc aaatttgccg tgcaaatttg gtccggcggg ccggatttg 49 <210> 51 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 51 gcaaatttga agaggtttta actacatgtt atccggcggt agttcagcag 50 <210> 52 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 52 gcatctcgag atgcaaaaaa gcctgctcgt tg 32 <210> 53 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 53 atcagtgcac ggctaactaa gcgg 24 <210> 54 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 54 gctggcatgc atgcaaaaaa gcctgctcgt tgagc 35 <210> 55 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 55 atcagcatgc ggctaactaa gcggcctgct g 31 <210> 56 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide primer <400> 56 gctgctcgag atgcaaaaaa gcctgc 26 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> leader sequence <400> 57 Met Asp Pro Leu Val Thr Ala Ala Ser Val Leu Glu Phe Gly Leu Phe 1 5 10 15 Glu Thr <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> synthetic oligonucleotide probe <400> 58 ccctgctgaa ctaccgcc 18

Claims (82)

  1. (a) 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 프롤린 tRNA 유전자로부터 유래하는 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열과, 발현 가능한 뉴클레오티드 서열[여기서, 상기 프로모터 및 종결부위 서열은 둘 다 상기 발현 가능한 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있으며, 상기 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 상기 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열에 이종성임];
    (b) 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가지는 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터에 상응하는 프로모터 뉴클레오티드 서열과, 발현 가능한 뉴클레오티드 서열[여기서, 상기 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터 뉴클레오티드 서열은 상기 발현 가능한 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있음];
    (c) 직교형(orthogonal) tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열과, 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열[여기서, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화함]; 또는
    (d) 복수개의 tRNA 유전자 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리시스트론 오페론[여기서, 적어도 하나의 tRNA 유전자는, 천연 tRNA 오페론 유래의 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커에 의해 적어도 하나의 인접 tRNA 유전자와 분리되어 있음]
    을 포함하는 핵산 구성체를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 구성체는 상기 (a)와 (b) 둘 다를 포함하며, 상기 (a)의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열과 상기 (b)의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 상이한 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 구성체는 상기 (a), (b) 및 (c)를 포함하며, 상기 (a)의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 상기 O-tRNA를 암호화하고, 상기 (b)의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 상기 O-RS를 암호화하는 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 이. 콜라이 프롤린 tRNA 유전자는 이. 콜라이 proK, proL 및 proM tRNA 유전자로부터 선택되는 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 이. 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열은 각각 서열 번호 32(프로모터) 및 서열 번호 33(종결부위)에 제시된 이. 콜라이 proK의 프로모터 및 종결부위 서열로부터 유래하는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (a)의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 (a)의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 tRNA를 암호 화하는 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 tRNA는 하나 이상의 고세균 tRNA로부터 유래하는 것인 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 tRNA는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]에 의해 암호화되는 것인 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론인 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 복수개의 상기 폴리시스트론 오페론인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 (b)의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 폴리펩티드를 암호화하는 것인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (b)의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 아미노아실-tRNA 합성 효소를 암호화하는 것인 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (b)의 발현 가능한 뉴클레오티드 서열은 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하고, 상기 O-RS는 비천연 아미노산을 가지는, 상응하는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 O-RS는 메타노코커스 재너쉬(Methanococcus jannaschii) 아미노아실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 것인 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 상기 O-RS는 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 것인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 O-RS는, 서열 번호 2에 제시된 야생형 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소(야생형 Mj-tRNA TyrRS)의 아미노산 서열과 비교하여, 286번 아미노산 위치 또는 286번 아미노산 위치와 유사한 위치에 아스파르트산에서 아르기닌으로의 치환이 일어난 것인 조성물.
  18. 제1항의 조성물을 포함하는 숙주 세포.
  19. 제18항에 있어서, 진정 세균 숙주 세포인 숙주 세포.
  20. 제18항에 있어서, 상기 숙주 세포는 이. 콜라이 세포인 숙주 세포.
  21. 제1항에 있어서, 상기 (d)의 폴리시스트론 오페론은 동일한 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 포함하는 것인 조성물.
  22. 제1항에 있어서, 상기 (d)의 폴리시스트론 오페론은 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 포함하고, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 2개는 상이한 것인 조성물.
  23. 제1항에 있어서, 상기 (d)의 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드, 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드, 또는 상기 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드와 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드 둘 다를 포함하는 것인 조성물.
  24. 제1항에 있어서, 상기 (d)의 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 valU 및 valX; ileT 및 alaT; serV 및 argV; valV 및 valW; glyT 및 thrT; metT 및 leuW; glnW 및 metU; hisR 및 leuT; glnU 및 glnW; leuP 및 leuV; glnV 및 glnX; alaW 및 alaX; ileU 및 alaU; ileV 및 alaV; metU 및 glnV; glyW 및 cysT; argX 및 hisR; 및 argY 및 argZ로부터 선택되는 내인성 에스케리치아 콜라이 tRNA 유전자 사이에 위치하는 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 것인 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 (d)의 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열(valU/valX 링커) 또는 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열(ileT/alaT 링커)로부터 유래하는 것인 조성물.
  26. 하나 이상의 비천연 아미노산을 특정 위치에 포함하는, 목적 폴리펩티드의 발현을 위한 번역 시스템으로서,
    (a) 비천연 아미노산;
    (b) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체로서, 상기 O-RS는 상기 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것인 핵산 구성체; 및
    (c) 상기 O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈(selector codon)을 포함하며, 상기 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 이 폴리뉴클레오티드 내 선택 코돈의 위치는, 상기 폴리뉴클레오티드가 발현되어 폴리펩티드를 생산할 때, 상기 목적 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치를 제어하는 것인 폴리뉴클레오티드
    를 포함하는 번역 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 상기 핵산 구성체는
    (i) 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 유전자로부터 유래한 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열[여기서, 상기 프로모터 및 종결부위 서열은 둘 다 상기 O-tRNA를 포함하거나 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있으며, 상기 O-tRNA는 상기 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열에 이종성임];
    (ii) 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가지는 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터에 상응하는 뉴클레오티드 서열[여기서, 상기 변형된 이. 콜라이 glnS 뉴클레오티드 서열은 상기 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있음]; 및
    (iii) 상기 O-tRNA 유전자 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론[여기서, 적어도 하나의 O-tRNA 유전자는 천연 tRNA 오페론 유래의 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커에 의해 적어도 하나의 인접 O-tRNA 유전자와 분리되어 있음]
    중 하나 이상을 포함하는 것인 번역 시스템.
  28. 제27항에 있어서, 상기 이. 콜라이 프롤린 tRNA 유전자는 이. 콜라이 proK, proL 및 proM tRNA 유전자로부터 선택되는 것인 번역 시스템.
  29. 제27항에 있어서, 상기 이. 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열은 각각 서열 번호 32(프로모터) 및 서열 번호 33(종결부위)에 제시된 이. 콜라이 proK의 프로모터 및 종결부위 서열로부터 유래하는 것인 번역 시스템.
  30. 제27항에 있어서, 상기 폴리시스트론 오페론은 동일한 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 포함하는 것인 번역 시스템.
  31. 제27항에 있어서, 상기 폴리시스트론 오페론은 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 포함하고, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 2개는 상이한 것인 번역 시스템.
  32. 제27항에 있어서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드, 또는 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드, 또는 상기 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드와 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드 둘 다를 포함하는 것인 번역 시스템.
  33. 제27항에 있어서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 valU 및 valX; ileT 및 alaT; serV 및 argV; valV 및 valW; glyT 및 thrT; metT 및 leuW; glnW 및 metU; hisR 및 leuT; glnU 및 glnW; leuP 및 leuV; glnV 및 glnX; alaW 및 alaX; ileU 및 alaU; ileV 및 alaV; metU 및 glnV; glyW 및 cysT; argX 및 hisR; 및 argY 및 argZ로부터 선택되는 내인성 에스케리치아 콜라이 tRNA 유전자 사이에 위치하는 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 것인 번역 시스템.
  34. 제27항에 있어서, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커는 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열(valU/valX 링커) 또는 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열(ileT/alaT 링커)로부터 유래하는 것인 번역 시스템.
  35. 제26항에 있어서, 상기 O-tRNA는 하나 이상의 고세균 tRNA로부터 유래하는 것인 번역 시스템.
  36. 제26항에 있어서, 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론인 번역 시스템.
  37. 제26항에 있어서, 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 포함하는 것인 번역 시스템.
  38. 제26항에 있어서, 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론인 번역 시스템.
  39. 제26항에 있어서, 상기 O-RS는 메타노코커스 재너쉬 아미노아실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 것인 번역 시스템.
  40. 제26항에 있어서, 상기 O-RS는 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 것인 번역 시스템.
  41. 제26항에 있어서, 상기 O-RS는, 서열 번호 2에 제시된 야생형 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소(야생형 Mj-tRNA TyrRS)의 아미노산 서열과 비교하여, 286번 아미노산 위치 또는 286번 아미노산 위치와 유사한 위치에 아스파르트산에서 아르기닌으로의 치환이 일어난 것인 번역 시스템.
  42. 제26항에 있어서, (a), (b) 및 (c)를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 번역 시스템.
  43. 제42항에 있어서, 상기 숙주 세포는 진정 세균 숙주 세포인 번역 시스템.
  44. 제42항에 있어서, 상기 숙주 세포는 이. 콜라이 세포인 번역 시스템.
  45. 특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는 목적 폴리펩티드를 숙주 세포 내에서 생산하는 방법으로서,
    (a) (i) 비천연 아미노산;
    (ii) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체[여기서, 상기 O-RS는 상기 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화함];
    (iii) 상기 O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하며, 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드[여기서, 상기 선택 코돈의 위치는 목적 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치와 서로 관련됨]; 및
    (iv) 상기 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 숙주 세포
    를 제공하는 단계;
    (b) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 숙주 세포 내에서 상기 폴리펩티드가 번역되는 동안, 상기 폴리펩티드 내 상기 특정 위치에 상기 비천연 아미노산을 통합함으로써, 상기 특정 위치에 상기 비천연 아미노산을 포함하는 상기 목적 폴리펩티드를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 하나 이상의 고세균 tRNA로부터 유래하는 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 하나 이상의 O-tRNA 종을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  48. 제45항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 포함하는 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  49. 제45항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  50. 제45항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 메타노코커스 재너쉬 아미노아실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  51. 제45항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  52. 제45항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 서열 번호 2에 제시 된 야생형 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소(야생형 Mj-tRNA TyrRS)의 아미노산 서열과 비교하여, 286번 아미노산 위치 또는 286번 아미노산 위치와 유사한 위치에 아스파르트산에서 아르기닌으로의 치환이 일어난, O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  53. 제45항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는
    (I) 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 유전자로부터 유래한 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열[여기서, 상기 프로모터 및 종결부위 서열은 둘 다 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있으며, 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 프로모터 및 종결부위 서열에 이종성임];
    (II) 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가지는 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터에 상응하는 프로모터 뉴클레오티드 서열[여기서, 상기 변형된 이. 콜라이 glnS 뉴클레오티드 서열은 상기 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있음]; 및
    (III) O-tRNA 유전자 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론[여기서, 적어도 하나의 O-tRNA 유전자는 천연 tRNA 오페론 유래의 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커에 의해 적어도 하나의 인접 O-tRNA 유전자와 분리되어 있음]
    중 하나 이상을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 (I)의 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하며, 상기 이. 콜라이 프롤린 tRNA는 이. 콜라이 proK, proL 및 proM tRNA로부터 선택되는 것인 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 (I)의 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하며, 상기 이. 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열은 각각 서열 번호 32(프로모터) 및 서열 번호 33(종결부위)에 제시된 이. 콜라이 proK의 프로모터 및 종결부위 서열을 포함하는 것인 방법.
  56. 제53항에 있어서, 상기 (III)의 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계는, 동일한 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  57. 제53항에 있어서, 상기 (III)의 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계는, 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 제공하는 단계를 포함하고, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 2개는 상이한 것인 방법.
  58. 제53항에 있어서, 상기 (III)의 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계는, 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드, 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드, 또는 상기 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드와 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드 둘 다를 포함하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  59. 제53항에 있어서, 상기 (III)의 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계는, valU 및 valX; ileT 및 alaT; serV 및 argV; valV 및 valW; glyT 및 thrT; metT 및 leuW; glnW 및 metU; hisR 및 leuT; glnU 및 glnW; leuP 및 leuV; glnV 및 glnX; alaW 및 alaX; ileU 및 alaU; ileV 및 alaV; metU 및 glnV; glyW 및 cysT; argX 및 hisR; 및 argY 및 argZ로부터 선택되는 내인성 에스케리치아 콜라이 tRNA 유전자 사이에 위치하는 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  60. 제53항에 있어서, 상기 (III)의 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계는, 서열 번호 14의 뉴클레오티드 서열(valU/valX 링커) 또는 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열(ileT/alaT 링커)로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  61. 제45항에 있어서, 상기 숙주 세포를 제공하는 단계는, 진정 세균 숙주 세포 를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  62. 제45항에 있어서, 상기 숙주 세포를 제공하는 단계는, 에스케리치아 콜라이 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  63. 특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는 목적 폴리펩티드를 숙주 세포 내에서 생산하는 방법으로서, 하기 단계 (a)∼(c)를 포함하는 방법:
    (a) (i) 비천연 아미노산;
    (ii) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체;
    (iii) 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체[여기서, 상기 O-RS는 상기 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화함];
    (iv) 상기 O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하며, 상기 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드[여기서, 상기 선택 코돈의 위치는 목적 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치와 서로 관련됨]; 및
    (v) 상기 (i), (ii), (iii) 및 (iv)를 포함하는 숙주 세포
    를 제공하는 단계로서, 상기 (ii) 및 (iii)의 핵산 구성체는 함께
    (I) 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 유전자로부터 유래한 프로모터 및 종결부위 뉴클레오티드 서열[여기서, 상기 프로모터 및 종결부위 서열은 둘 다 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있으며, 상기 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 상기 프로모터 및 종결부위 서열에 이종성임];
    (II) 서열 번호 13의 뉴클레오티드 서열을 가지는 변형된 이. 콜라이 glnS 프로모터에 상응하는 프로모터 뉴클레오티드 서열[여기서, 상기 변형된 이. 콜라이 glnS 뉴클레오티드 서열은 상기 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하도록 연결되어 있음]; 및
    (III) O-tRNA 유전자 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론[여기서, 적어도 하나의 O-tRNA 유전자는 천연 tRNA 오페론 유래의 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커에 의해 적어도 하나의 인접 O-tRNA 유전자와 분리되어 있음]
    중 하나 이상을 포함하는 것인 단계;
    (b) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 숙주 세포 내에서 상기 폴리펩티드가 번역되는 동안, 상기 폴리펩티드 내 특정 위치에 상기 비천연 아미노산을 통합함으로써, 상기 특정 위치에 상기 비천연 아미노산을 포함하는 상기 목적 폴리펩티드를 생산하는 단계.
  64. 제63항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 하나 이상의 고세균 tRNA로부터 유래하는 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 하나 이상의 O-tRNA 종을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  66. 제63항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 포함하는 O-tRNA를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  67. 제63항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 서열[MjtRNA-Tyr(CUA)]을 복수개 포함하는 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  68. 제63항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 메타노코커스 재너쉬 아미노아실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  69. 제63항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소로부터 유래하는 O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  70. 제63항에 있어서, 상기 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 서열 번호 2에 제시된 야생형 메타노코커스 재너쉬 티로실-tRNA 합성 효소(야생형 Mj-tRNA TyrRS)의 아미노산 서열과 비교하여, 286번 아미노산 위치 또는 286번 아미노산 위치와 유사한 위치에 아스파르트산에서 아르기닌으로의 치환이 일어난, O-RS를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  71. 제63항에 있어서, 상기 (I)의 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하며, 상기 이. 콜라이 프롤린 tRNA는 이. 콜라이 proK, proL 및 proM tRNA로부터 선택되는 것인 방법.
  72. 제63항에 있어서, 상기 (I)의 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 에스케리치아 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계를 포함하며, 상기 이. 콜라이 프롤린 tRNA 프로모터 및 종결부위 서열은 각각 서열 번호 32(프로모터) 및 서열 번호 33(종결부위)에 제시된 이. 콜라이 proK의 프로모터 및 종결부위 서열을 포함하는 것인 방법.
  73. 제63항에 있어서, 상기 (III)의 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 동일한 이 종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  74. 제63항에 있어서, 상기 (III)의 핵산 구성체를 제공하는 단계는, 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 복수개를 제공하는 단계를 포함하며, 상기 이종성 폴리뉴클레오티드 링커 중 적어도 2개는 상이한 것인 방법.
  75. 제63항에 있어서, 상기 (III)의 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계는, 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드, 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드, 또는 상기 5' 말단 티미딘 뉴클레오티드와 3' 말단 아데노신 뉴클레오티드 둘 다를 포함하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  76. 제63항에 있어서, 상기 (III)의 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계는, valU 및 valX; ileT 및 alaT; serV 및 argV; valV 및 valW; glyT 및 thrT; metT 및 leuW; glnW 및 metU; hisR 및 leuT; glnU 및 glnW; leuP 및 leuV; glnV 및 glnX; alaW 및 alaX; ileU 및 alaU; ileV 및 alaV; metU 및 glnV; glyW 및 cysT; argX 및 hisR; 및 argY 및 argZ로부터 선택되는 내인성 에스케리치아 콜라이 tRNA 유전자 사이에 위치하는 천연 폴리뉴클레오티드 링커로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  77. 제63항에 있어서, 상기 (III)의 폴리시스트론 오페론을 제공하는 단계는, 서 열 번호 14의 뉴클레오티드 서열(valU/valX 링커) 또는 서열 번호 15의 뉴클레오티드 서열(ileT/alaT 링커)로부터 유래하는 이종성 폴리뉴클레오티드 링커를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  78. 제63항에 있어서, 상기 숙주 세포를 제공하는 단계는 진정 세균 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  79. 제63항에 있어서, 상기 숙주 세포를 제공하는 단계는, 에스케리치아 콜라이 숙주 세포를 제공하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  80. 하나 이상의 비천연 아미노산을 특정 위치에 포함하는 목적 폴리펩티드를 발현시키기 위한 번역 시스템을 생산하는 방법으로서,
    (a) 비천연 아미노산;
    (b) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체로서, 상기 O-RS는 상기 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화하는 것인 핵산 구성체; 및
    (c) O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하며, 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로서, 이 폴리뉴클레오티드 내 선택 코돈의 위치는, 상기 폴리뉴클레오티드가 발현되어 폴리펩티드를 생산할 때, 상기 목적 폴 리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치를 제어하는 것인 폴리뉴클레오티드
    를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 (a), (b) 및 (c)를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 것인 방법.
  82. 특정 위치에 비천연 아미노산을 포함하는 목적 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서,
    (a) (i) 비천연 아미노산;
    (ii) 직교형 tRNA(O-tRNA)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 직교형 아미노아실-tRNA 합성 효소(O-RS)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구성체[여기서, 상기 O-RS는 상기 비천연 아미노산을 가지는 O-tRNA를 우선적으로 아미노아실화함];
    (iii) 상기 O-tRNA에 의해 인식되는 하나 이상의 선택 코돈을 포함하며, 상기 목적 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드[여기서, 상기 선택 코돈의 위치는 상기 목적 폴리펩티드 내 비천연 아미노산의 특정 위치와 서로 관렴됨];
    (iv) 상기 (i), (ii) 및 (iii)을 포함하는 숙주 세포
    를 포함하는 번역 시스템을 제공하는 단계;
    (b) 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 숙주 세포 내에서 상기 폴리펩티드가 번역되는 동안, 상기 폴리펩 티드 내 상기 특정 위치에 상기 비천연 아미노산을 통합함으로써, 상기 특정 위치에 상기 비천연 아미노산을 포함하는 상기 목적 폴리펩티드를 생산하는 단계
    를 포함하는 방법.
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