KR20090074155A - 현미경 시스템의 이미지 처리 방법 - Google Patents
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Abstract
특정 염색체 특성들을 결정하기 위해 형광 동소 보합결합(FISH) 현미경 자동화 샘플 분석의 결과치들을 분석하도록 이미지 처리를 수행하는 일 실시예가 개시된다.
Description
본 출원은 2006년 8월 4일에 출원된 미국 가출원(Provisional Application) 일련번호 제 60/821,536호로부터 우선권을 주장한다. 이 명세서에 인용된 모든 참조들 및 그 참조부호들은, 적절하다면, 추가적인 또는 대안적인 세부사항들, 특징들 및/또는 기술적인 배경의 설명을 위해 본 명세서에서 인용 참조 된다.
본 발명은 유전적 특성(genetic characteristics)의 형광 동소 보합결합(FISH: fluorescence in situ hybridization) 검출을 위한 자동화된 현미경 분석을 수행하도록 채택된 이미지 처리 방법들에 관한 것이다.
종래의 광학 현미경 검사(microscopy)는 일반적으로 염색체들의 정상적인 인간 보체(human complement)가 (X 및 Y로 칭해지는) 성염색체들 및 (1 번 내지 22 번으로 번호를 매긴) 22 개의 상염색체들로 구성된 현미경 슬라이드를 채택한다. 10 개의 인간 수정(human conception)들 중 최소 1 개가 염색체 이상을 갖는다고 추정되었다. 일반적인 법칙으로, 성염색체들의 비정상적인 개수가 치명적이지는 않지만, 불임을 초래할 수 있다. 이와 대조적으로, 상염색체들의 비정상적인 개수는 통상적으로 조기 사망을 초래한다. 출생아(live-born baby)들에게서 발견되는 세가지 상염색체 삼염색체성(autosomal trisomy: 21번, 18번 및 13번 삼염색체성)들 중에서, 21번 삼염색체성(다운 증후군으로 더 널리 알려짐)을 갖는 개체만이 유년기 이후까지 생존한다.
다운 증후군은 출생 후에 용이하게 진단되지만, 출생 전 진단은 문제가 된다. 이제까지, 태아 세포들의 핵형분석(karyotyping)은 다운 증후군, 및 염색체 개수 및/또는 배열의 이상(aberration)과 연관된 다른 유전적 기형(abnormality)의 진단을 위해 기존의 방법을 고수하였다. 이러한 유전적 기형들은, 예를 들어 염색체 추가, 결실, 증폭, 전좌(translocation), 재배열을 포함한다. 이러한 기형의 평가(assessment)는 건강한 개체, 즉 상기에 설명된 정상적인 인간 염색체들의 보체 및 배열을 갖는 사람의 염색체들에 대해 행해진다.
유전적 기형은 상술된 삼염색체성들, 예컨대 다운 증후군뿐만 아니라, 단염색체(monosomy) 및 이염색체(disomy)를 포함한다. 또한, 유전적 기형은 전체 염색체들 및/또는 염색체 분할(chromosome segment)들의 추가 및/또는 결실을 포함한다. 이들과 같은 변형(alteration)들은 다수의 악성 종양들에 존재하는 것으로 보고되었다. 따라서, 염색체 개수 및/또는 분포(예를 들어, 재배열, 전좌)의 이상은 정신 지체와 기형 증후군(malformation syndrome)(du Manoir 외, Human Genetics 90(6): 590-610(1993)), 그리고 가능하게는 종양형성(oncogenesis)의 주요 원인을 나타낸다. 또한, 예를 들어 특정 염색체들에 대해 맵핑된 인간의 유전 질병들의 부분 목록과, 특히 X 염색체 관련 결함들의 목록에 대해서는, 다음을 참조한다: (Harrison's Principles of Internal Medicine, 12th edition, ed. Wilson 외, McGraw Hill, N.Y., pp. 24-46(1991)). 염색체 이상과 관련한 유전적 결함의 수가 증가함에 따라, 유전적 기형 평가를 위해 단순하고 정확한 자동화된 에세이(assay)를 개발하는 것과 연계하여 다양한 시도들이 보고되었다.
일반적으로, 개체의 핵산의 추가, 결실, 증폭, 전좌 및 재배열에 기초하는 유전적 기형들을 진단하는데 핵형분석이 사용된다. "핵형"은 개체의 염색체들의 개수 및 구조를 일컫는다. 통상적으로, 개체의 핵형은, 예를 들어 활성 세포 증식(active cell proliferation)이 발생할 때까지 개체의 주변혈 림프구(peripheral blood lymphocyte)를 배양하고, 염색체 가시화(chromosome visualization)를 위해 단일 증식(예를 들어, 중기, 및 가능하게는 간기) 세포들을 준비하며, 상기 세포들을 고체 지지체에 고정시키고, 상기 고정된 세포들을 동소 보합결합(ISH: in situ hybridization)하여, 개체의 염색체의 이산 부분들을 구체적으로 가시화함으로써 얻어진다.
샘플은 적어도 1 이상의 타겟 핵산을 포함하고, 그 분포는 유전적 기형을 나타낸다. "분포"라 함은, 타겟 핵산을 포함하는 것으로 알려진 1 이상의 핵산들(예를 들어, 염색체들)의 존재, 부재, 상대 양 및/또는 상대 위치를 의미한다. 특히 바람직한 실시예에서, 타겟 핵산은 21번 삼염색체성을 나타내며, 따라서 상기 방법은 다운 증후군을 진단하는데 유용하다. 특히 바람직한 실시예에서, 다운 증후군 분석을 위한 샘플은 모성 주변혈로부터 도출된다. 더 상세하게는, 림프구들은 표준 절차에 따라 주변혈로부터 격리되고, (예를 들어, 유리 슬라이드 상에서 원심분리(centrifuge)함으로써) 세포들이 고체 지지체에 부착되며, 타겟 핵산의 검출을 허용하도록 표준 절차에 따라 상기 고체 지지체에 고정된다(예를 들어, 본 예시들을 참조).
핵산 보합결합 기술들은, 염기쌍에 대한 단일 가닥의(single stranded) 올리고뉴클레오티드 탐침(oligonucleotide probe)의 능력에 기초하며, 부연하면 상보적 핵산 가닥으로 보합결합한다(hybridize). 핵산 탐침들이 형광원(fluorophore: 즉, 특정 파장의 광으로 여기된 때에 형광을 발하는 형광 태그 또는 라벨)으로 라벨링된 FISH("fluorescence in situ hybridization")는 수치 분석뿐만 아니라, 구조적 이상 염색체 이상에 대해 강력한 툴을 나타낸다. 상기 방법은, 조직화학 착색(histochemical staining)을 통해 세포를 표현형화(phenotyping)하도록 제 1 형광원으로 라벨링된 항체와 고정된 세포를 접촉시킨 후, 상기 세포를 유전형화하도록(genotyping) 제 2 형광원으로 라벨링된 DNA 탐침과 상기 고정된 세포를 접촉시키는 단계를 수반한다. 상기 제 1 및 제 2 형광원들은 서로 상이한 파장들에서 형광을 발함에 따라, 고정된 동일한 샘플 상에서 표현형 및 유전형 분석을 가능하게 한다.
형광 동소 보합결합은, 구체적으로 보합결합하여, 타겟 핵산의 가시화를 용이하게 하도록 형광원-라벨링된 탐침을 채택하는 핵산 보합결합 기술을 일컫는다. 이러한 방법들은 해당 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 제 5,225,326호; 미국 특허 출원 일련번호 제 07/668,751호; PCT WO 94/02646호에 개시되어 있으며, 그 전체 내용이 본 명세서에 인용 참조 되고 있다. 일반적으로, 동소 보합결합은, 예를 들어 단일 세포 레벨의 조직들 내에 함유된 바와 같 은 핵산-함유 샘플 내의 핵산의 분포를 결정하는데 유용하다. 이러한 기술들은 핵형분석 적용뿐만 아니라, 세포 내에 함유된 특정 유전자들의 존재, 부재 및/또는 배열을 검출하는데에 사용되었다. 하지만, 핵형분석의 경우, 샘플 내의 세포들은 통상적으로 동소 보합결합 반응의 수행을 위해, 상기 세포들을 고체 지지체에 부착하기 이전에 "중기-확산(metaphase-spread)"을 달성하도록 중기(또는 간기)까지 증식하게 된다.
간명하게, 형광 동소 보합결합은, 샘플을 고체 지지체에 고정시키는 단계, 및 상기 샘플을, 적어도 침전제 및/또는 가교제(cross link agent)를 포함하는 매질과 접촉시킴으로써 그 안에 함유된 성분들의 구조적 무결성(structure integrity)을 보존하는 단계를 수반한다. 샘플을 "고정"하는데 유용한 예시적인 화학제들은 해당 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 상기에 인용된 특허 및/또는 특허 공보에 개시되어 있다.
형광 현미경 검사에 사용되는 하나의 형광 염료로는 DAPI 또는 4',6-디아미디노(diamidino)-2-페닐인돌(phenylindole)[CAS 번호: [28718-90-3]], DNA에 강하게 결합하는 형광 착색제(fluorescent stain)가 있다. DAPI는 손상되지 않은 세포막을 통과할 것이기 때문에, 생존중인 고정된 세포들을 착색하는데 사용될 수 있다. DAPI는 자외선 광으로 여기된다. 이중-가닥(double-stranded) DNA에 결합된 때, 그 흡수 최대치는 약 358 nm일 수 있고, 그 방출 최대치는 약 461 nm일 수 있다. 또한, DAPI가 RNA에도 결합될 것이지만, 강하게 형광성이지는 않다. 그 방출은 RNA에 결합된 때 약 400 nm로 변이된다. DAPI의 청색 방출(blue emission)은 단일 샘플에서 다수의 형광 착색을 사용하기 원하는 현미경 사용자들에게 편리하다. 예를 들어, DAPI와, 플루오레세인(fluorescein) 및 녹색 형광 단백질(GFP)과 같은 녹색-형광 분자들, 또는 텍사스 레드(Texas Red)와 같은 적색-형광 착색들 사이에는 형광 오버랩이 거의 존재하지 않는다. 다른 생물학적 구조들을 검출하기 위해 다른 형광 염료들이 사용된다.
다른 타입의 형광 물질들은 형광 동소 보합결합(FISH)에 사용된다. FISH 방법은 형광 태그들을 이용하여 염색체 구조를 검출한다. 이러한 태그들은 특정 염색체들과 특정 염색체 영역들을 지칭할 수 있다. 이러한 기술은 염색체 기형 및 유전자 맵핑을 식별하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 21번 염색체에 대한 FISH 탐침은 21번 삼염색체성을 갖는 세포들, 즉 다운 증후군의 원인이 되는 21번 염색체가 추가된 세포들을 식별한다. 다색(multicolor) DNA 탐침들을 포함하는 FISH 키트(kit)들은 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, Abbott Laboratories의 Vysis 지사(division)에 의해 판매된 AneuVysion® 멀티칼라 DNA 프로브 키트(Multicolar DNA Probe Kit)는 형광 동소 보합결합(FISH)을 통해 양수 샘플 내의 중기 세포들 및 간기 핵들에서 13번, 18번, 21번, X 및 Y 염색체들의 기형에 대한 생체외(in vitro) 진단 시험용으로 설계되었다. AneuVysion® Assay(CEP 18, X, Y-알파 부수체, LSI 13 및21) 멀티-칼라 프로브 패널(Multi-color Probe Panel)은 CEP 18/X/Y 탐침을 이용하여 18번, X 및 Y 염색체들의 동원체 영역들의 알파 부수체 시퀀스들을 검출하고, LSI 13/21 탐침을 이용하여 13q14 영역 및 21q22.13 내지 21q22.2 영역을 검출한다. AneuVysion 키트는 추정된 고위험 임신을 대상으로 형광 동소 보합결합을 통해 양수로부터 얻어진 중기 세포들 및 간기 핵들에서 13번, 18번, 21번, X 및 Y 염색체들을 식별하고 나열하는데 유용하다. 태그들에 의해 방출된 색들의 조합은 정상적인 염색체 개수들 또는 삼염색체성이 존재하는지 여부를 결정하는데 사용된다.
이와 유사한 맥락으로, Abbott Laboratories의 Vysis 지사에 의한 UroVysion® 키트는, 형광 동소 보합결합을 통해, 방광암에 걸렸다고 의심된 혈뇨(hematuria) 증상이 있는 사람들로부터의 소변 시편들에서 3번, 7번, 17번 염색체에 대한 이수성(aneuploidy)과, 9p21 유전좌위(locus)의 손실을 검출함으로써, 방광암의 발전 및 진행과 연관된 염색체 기형들을 검출하도록 설계된다. UroVysion 키트는 3번, 7번, 9번 및 17번 염색체들 상의 특정 영역들과 상동인(homologous) DNA 탐침 시퀀스들의 4-색, 4-탐침 혼합물로 구성된다. UroVysion 탐침 혼합물은 CEP(Chromosome Enumeration Probe) CEP 3 스펙트럼레드(SpectrumRed), CEP 7 스펙트럼그린(SpectrumGreen), CEP 17 스펙트럼아쿠아(SpectrumAqua) 및 LSI(Locus Specific Identifier) 9p21 스펙트럼골드(SpectrumGold)로 구성된다.
유전적 기형 진단용 형광 동소 보합결합 방법을 발전시킨 상술된 개선사항에도 불구하고, 형광-라벨링된 샘플들의 분석은 여전히 노동-집약적이고, 상당한 정도의 주관성을 수반한다. 이는, 태아 세포들이 모성 세포들로부터 격리되거나, 유전적 기형에 대한 평가에 앞서 그로부터 가시적으로 구별되어야만 하는 유전적 기 형의 태아기 진단과 연계하여 특히 그러하다. 따라서, 예를 들어, 실험 전문가는 샘플을 수동으로 준비하고, 이후 상기 샘플을 착색하며(먼저, 조직화학 착색으로 세포들을 표현형화하고, 그 후 보합결합 탐침으로 세포를 유전형화함); (예를 들어, 상기 언급된 조직화학 착색 절차를 이용하여) 광학 필드 내의 다른 세포들로부터 태아 세포들을 가시적으로 선택하고; 형광원-태그 탐침의 보합결합에 기여할 수 있는 형광색의 상대 분포를 평가하며; 정상적인 인간 염색체 보체를 함유한 제어 샘플들에서 관찰된 분포와, 가시적으로 인식된 분포를 비교하여야 한다. 쉽게 이해할 수 있는 바와 같이, 앞서 언급된 절차는 매우 시간 소모적이다. 더욱이, 결과치들이 가시적으로 인식되기 때문에, 잘못된 결과들의 빈도는 실험마다, 또한 관찰자마다 다를 수 있다.
공동 소유된 미국 특허 제 6,221,607호, "Automated fluorescence in situ hybridization detection of genetic abnormalities"에 개시된 본 발명은, 선택적으로 착색된 염색체들의 주관적인 분석을 배제한, 21번 삼염색체성과 같은 유전적 기형을 결정하는 컴퓨터-구현된 방법들을 개시한다. 더 상세하게는, 본 특허는 적어도 1 이상의 타겟 핵산을 함유한 고전된 샘플에 유전적 기형이 존재하는지 여부를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 예를 들어 염색체 추가, 결실, 증폭, 전좌 및 재배열과 같은, 염색체 개수 및/또는 배열의 이상과 관련된 유전적 기형들을 진단하는데 유용하다.
자동화된 형광 동소 보합결합 방법을 구현하는데 채택될 수 있는 다양한 이미지 처리 기능들을 수행하는 실시예들이 개시된다. 상기 실시예들은, 디지털 전자기기의 동적 범위를 초과하는 세기 범위에 걸쳐 샘플의 모든 영역들을 허용가능하게 이미징하는 자동-노광(auto-exposure) 방법; 상기 샘플 내에 타겟들을 위치시키는, 형광 동소 보합결합(FISH) 관심 대상물을 나열하는 방법; 나열된 관심 대상물들을 분류하고 특성화하는 방법인 핵 식별 방법; 식별된 관심 대상물의 형상을 정의하는 방법인 핵 분할 방법을 포함한다. 본 방법의 실시예들은 세포 핵을 특성화하고, 염색체를 나열하는데 유용하다. 본 발명의 일 실시예는 AneuVysionTMassay(Vysis, Inc., Downers Grove, IL)를 수행하기에 적합하게 되어 있다.
일 실시예에서는, 형광 여기 광원(fluorescence exciting light source) 및 전자 이미징 디바이스를 갖는 현미경 시스템을 이용하여 형광으로 보합결합된 시편(fluorescently-hybridized specimen)의 형광 동소 보합결합 이미지를 분석하는 이미지 처리 방법이 개시되며, 상기 방법은:
형광 여기 조명으로 상기 시편을 조명하는 단계;
조명된 필드 내의 초점심도(depth of focus)에서 상기 시편의 이미지를 캡처하도록 상기 전자 이미징 디바이스의 노광 파라미터들을 조정하는 단계;
상기 시편의 캡처된 이미지 내에 관심 대상물들을 나열하는 단계;
상기 이미지 내의 핵을 식별하는 단계;
상기 이미지 내의 핵을 분할하는 단계;
상기 핵 내에서 발생하는 형광 신호를 카운트(count)하고 특성화하는 단계; 및
결과치들을 해석하고 보고하는 단계를 포함한다.
도 1은 본 발명의 자동화된 분석을 수행하는 컴퓨터 프로그램의 일 실시예의 개략적인 흐름도;
도 2는 노광 파라미터들을 조정하는 프로그램 모듈의 일 실시예를 나타내는 흐름도;
도 3은 관심 대상물들을 나열하는 프로그램 모듈의 일 실시예를 나타내는 흐름도;
도 4는 핵을 식별하는 프로그램 모듈의 일 실시예를 나타내는 흐름도;
도 5는 핵을 분할하는 프로그램 모듈의 일 실시예를 나타내는 흐름도; 및
도 6은 신호들을 특성화하고 결과치들을 보고하는 프로그램 모듈의 일 실시예를 나타내는 흐름도이다.
자동-노광: 디지털 이미지의 획득은, 통상적으로 실험되는 시편의 모든 영역들의 적절한 노광을 필요로 한다. 전자 이미징 디바이스는 전하 결합 소자(charge coupled device: CCD), 또는 상보적 금속 산화물 반도체(complementary metal oxide semiconductor: CMOS) 소자 내의 광-감응성 검출기들의 다-픽셀 평면 어레이이거나, 또는 광학 이미지를 전기 신호들로 변환하기에 적절한 여타의 과학기술일 수 있다. 예시적인 CCD 카메라는, 게이팅 기술(gating technique)을 이용하여, (예를 들어, 16-비트 고 등급(scientific grade) CCD의 전체 범위를 지원하는 Princeton Instrument(Trenton, NJ) PIMAXMG와 같이) 개선된 양자 효율로 약 9 나노초 미만의 게이트 속도를 달성함에 따라, 출력 형광체(output phosphor)의 시간 상수(time constant)에 의해 제한되는 매우 빠른 응답을 허용하는 집약적(intensified) CCD 카메라, 및 광음극(photocathode)에 의해 광자들이 검출되고 해제된 전자들이 갭에 걸쳐 가속되어, CCD의 뒷면 상으로 충돌하는 EBCCD(electron bombarded CCD)(추가 이득 및 동반 속도를 허용)를 포함한다. CMOS 카메라는 특히 형광 현미경 검사에 이용될 수 있다. CMOS 카메라는 증폭기, 및 집적화된 온-칩 포멧(integrated on-chip format)으로 각각의 포토다이오드와 연계된 디지타이저(digitizer)를 갖는다. 최근의 CMOS 센서들은 크게 저하된 잔여 잡음을 가지며, 확장된(extraordinary) 동적 범위를 제공한다.
낮은 세기 검출은 이미지 증폭기(image intensifier) 및 이와 유사한 기술의 채택을 통해 향상될 수 있다. 정확한 노광 시간은, (i) 소정 영역(핵) 내의 평균 이미지 세기 값의 범위, (ⅱ) 가장 높은 이미지 세기의 범위, (ⅲ) 허용된 최대 노광 시간, 및 (ⅳ) 독립적으로 제공되는 노광 조건들과 같은 여러 가지 조건들을 고려한 알고리즘을 이용하여 계산될 수 있다.
각각의 센서 픽처 요소 또는 픽셀은 통상적으로 상기 요소 상에 낙하된(falling) 광자들의 수(광의 양)에 비례하는 전기 전하를 축적한다. 통상적으 로, 요구되는 노광 시간과 상기 픽셀 상에 입사하는 광의 세기 간에 역 선형 관계(inverse linear relationship)가 존재함에 따라, 더 어두운 영역(dimmer area)들은 노광 시간을 증가시킴으로써 별도의 노광들에서 이미징될 수 있다. 노광 후, 이미징 어레이들의 픽셀들은 연속 스캐닝 패턴에서 개별적으로 측정될 수 있다. 그 후, 각각의 요소 측정들은 아날로그 대 디지털 컨버터(A/D) 또는 데이터를 디지털화하는 다른 수단을 이용하여 디지털화될 수 있다. 디지털화된 측정들의 결과적인 스트림은 이미지 분석 절차들이 수행될 수 있는 메모리에 저장될 수 있다.
하지만, 대부분의 경우, 이미지 센서 및 연계된 전자기기의 동적 범위는 통상적으로 단일 시편의 다양한 위치들로부터 발생한 세기들의 범위보다 좁기 때문에, 단일 노광 시간은 시편의 모든 부분들을 적절히 이미징하지 않는다. 예를 들어, 8 비트 D/A 컨버터의 동적 범위는 256:1이며, 이는 이 적용에 부적절할 수 있다. 그 상황에서, 단일 노광 시간으로, 가장 어두운 대상물들이 적절히 노광되면, 밝은 대상물들 또는 핵들이 손실될 것이며, 또는 대안적으로 가장 밝은 대상물들이 적절히 노광되면, 어두운 대상물들이 손실될 것이다.
단일 노광 기간 동안에 이미징 필드의 세기 동적 범위가 너무 큰 경우, 다중 노광 전략이 채택될 수 있다. 가장 높은 세기를 갖는 시편 또는 핵의 부분들은, 먼저 상대적으로 더 짧은 노광 시간을 이용하여 노광되고 분석된다. 그 후, 그 노광에 대해, 상기 이미지의 더 어두운 영역들은 상기 영역들을 적절히 노광하는데 더 긴 노광 시간이 필요한지 여부를 결정하기 위해, 에지 검출 또는 엔트로피 측정(entropy measurement)을 이용하여 분석될 수 있다. 만약 그렇다면, 적절히 더 긴 노광 시간 동안에 추가 노광이 행해질 수 있으며, 픽셀 측정들은 상기 이미지로부터 배제되거나 차단된 높은 세기 핵에 대응한다. 그러한 구조들이 더 이상 발견되지 않을 때까지, 상기 공정은 더 긴 노광 시간들 동안 반복될 수 있다. 더 긴 노광 시간에 대한 대안으로서, 더 긴 단일 노광을 합성하기 위해 더 짧은 다중 노광들이 연산적으로(computationally) 조합될 수 있다. 대안적으로, 상기 노광은 효과적인 현미경 어퍼처를 변화시키거나, 세기를 조사(irradiate)함으로써 변동될 수 있다.
"도트(Dot)" 나열: 시편은 관심 대상물들이 샘플의 깊이 전반에 걸쳐 확산된 유한 두께(finite thickness)를 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "관심 대상물"이라는 용어는 FISH 탐침으로 라벨링된 결과로서 식별된 현미경 필드 내의 여하한의 형태(feature)에 관한 것이다. 관심 대상물의 비-제한적인 예시들은 원형질막(plasma membrane) 또는 그 일부분, 세포소기관(cytoplasmic organelle) 또는 구조, 리보솜, 미토콘드리아(mitochondrion) 또는 그 일부분, 미토콘드리아 핵산, 골지 막(Golgi membrane), 소포체(endoplasmic reticulum) 또는 그 일부, 엔도좀(endosome), 핵, 인(nucleolus), 핵막 또는 그 일부분, 염색체 또는 그 일부분, 및 DNA 분자의 일부분을 포함한다. 그러므로, 이미징은, 각각의 대상물들의 잘 분해된(well resolved) 이미지들을 형성하기 위해 광학 시스템이 개별적으로 포커스될 것을 요구한다. 대안적으로, 모든 관심 대상물들이 허용가능하게 포커스되도록 충분히 작은 간격들에서 선택된 이격 초점 평면들에서 일련의 노광들이 행해 질 수 있다. 초점 평면들의 요구되는 개수 및 분리(separation)는 시편의 두께 및 광학 시스템의 피사계심도(depth-of-field: DOF)로부터 쉽게 결정될 수 있다.
일단, 적절히 포커스된 노광들이 얻어졌으면, 이미지들은 관심 대상물들 또는 형광 동소 보합결합 "도트들"을 식별하고 분리하도록 처리될 수 있다. 이들 "도트들"은 그들이 방출하는 형광 광에 의해 발현되고, 발출된 광의 특성들은 대상물의 특성에 따라 달라진다. 특히, 관심 대상물로부터 발생한 형광 특성들의 비-제한적인 예시들은 형광 라벨의 광학 특성, 및 대상물에 대한 FISH 탐침의 보합결합의 세기를 포함한다.
이미지들을 얻었으면, 관심 형광 동소 보합결합 대상물들("도트들")을 나열하도록 나열 알고리즘이 채택된다. 상기 알고리즘의 제 1 단계는, 세기에 따라, 각각의 이미지 초점 평면들에 걸쳐 밝기의 세기 등고선(intensity contour)들을 효과적으로 정의하는 4'6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI, 이중-가닥 DNA 착색 형광 탐침) 착색 이미지의 분할(segmentation)일 수 있다. 원(raw) 형광 동소 보합결합 채널 이미지들은 콘트라스트 이미지들로 연산적으로 변환될 수 있다. 콘트라스트 이미지들은 원래 이미지의 수학적 변형이며, 각각 변형된 픽셀의 세기는 원래 이미지 내의 인접한 픽셀들에 대한 세기의 변화를 나타낸다. 핵 내의 대상물들은 콘트라스트 임계치를 가장 높은 가능한 값으로부터 사전설정된 낮은 값으로 순차적으로 낮춤으로써 분해(resolve)될 수 있다. 각각의 대상물에 대해, 가장 높은 콘트라스트는 이전 대상물들의 이동 평균(moving average) 및 표준 편차와 비교될 수 있다. 콘트라스트의 상당한 고조(jump)가 검출되면, 더 높은 콘트라스트를 갖는 모든 대 상물들이 잠재 형광 동소 보합결합 "도트들"로서 표시될 수 있다. 또한, 2 개의 잠재 형광 동소 보합결합 "도트들"이 사전설정된 임계값보다 더 가깝게 위치되는 경우, 상기 도트들은 단일 "도트"를 형성하도록 합쳐질 수 있다. 식별된 잠재 형광 동소 보합결합 "도트들"의 상대 콘트라스트 및 크기가 비교될 수 있으며, 최종 형광 동소 보합결합 "도트"들이 특성화되고, 데이터 베이스에 로깅(logging)된다.
핵 식별: 일단, 관심 잠재 대상물들 또는 형광 동소 보합결합 "도트들"이 식별되면, 각각의 대상물들을 분류하고 식별하기 위해 자동 패턴 인식 기술들이 채택될 수 있다. 병진, 회전 및 스케일링(scaling)에 대해 불변하는 대상물의 타원 푸리에 형상 디스크립터(elliptic Fourier shape descriptor)를 개발하기 위해, 형광 동소 보합결합 "도트" 나열 분석에 의해 결정된 각각의 형광 동소 보합결합 "도트" 위치들이 분석될 수 있다. 또한, 핵 내의 방출 세기 분포 및 대상물 크기를 포함하나, 이것으로 제한되지 않는 다른 특성들이 대상물을 기술(describe)하기 위해 채택될 수 있다. 이들 특성들에 기초하여 관심 대상물을 식별하고 카테고리화하기 위해, 패턴 인식 알고리즘이 채택될 수 있다. 초기에, 패턴 인식 알고리즘은 전문 관찰자를 채용하여 대상물을 분류하고, 관찰자의 결과물을 패턴 인식 데이터 베이스에 입력함으로써 트레이닝될 수 있다. 초기 학습 주기 후, 상기 알고리즘은 자동으로 수행될 수 있으며, 패턴 인식 데이터 베이스는 계속 업데이트될 수 있다.
핵 분할: 패턴 인식 알고리즘에 의해 식별된 각각의 핵에 대해, 최대 밝기에 서 시작하는 일정한 세기의 등고선(contour)들이 결정될 수 있다. 또한, 각각의 등고선 상의 각각의 지점에서는, 구배(gradient)가 연산될 수 있다. 상기 등고선이 가장 큰 평균 구배에 대응함에 따라, 비-제한적인 예시의 방식으로 핵의 크기가 결정될 수 있다.
AneuVysionTM 스캐닝 방법: AneuVysionTM 에세이(assay)는 형광 동소 보합결합을 이용하여 가장 보편적인 염색체 수 기형들의 신속한 검출을 허용하는 태아기 진단용 FDA 확인 테스트이다. 이는, 형광 DNA 탐침이 특정 염색체의 일 특정 부분에 선택적으로 부착될 때, 밝은 현미경 신호를 생성하는 형광 DNA 탐침을 생성하기 위해 분자 유전 기술들을 이용한다. DNA 탐침들은 비-분할 세포들의 적절한 염색체들에 부착될 수 있다. 상기 신호들은 상이한 염색체들에 대해 상이한 색들을 갖는다. 세포 내의 신호들의 수를 셈함으로써, 세포 유전학 기술자들은 정상 개수 또는 삼염색체, 단염색체 또는 검출가능한 염색체들의 다른 이상체(aneusomy)가 태아 내에 존재하는지 여부를 알 수 있다.
개시된 실시예들은 다음의 방법을 이용하는 AneuVysionTM 에세이를 효과적으로 자동화하도록 채택될 수 있다. 연산적 히스토그램(computational histogram)이 체계화될 수 있으며, 상기 히스토그램 내의 각각의 빈(bin)은 염색체 구성(chromosomal constituency)의 각각 가능한 조합을 나타낸다. AneuVysionTM CEP(Chromosome Enumeration Probe) 분석 결과들은 X 염색체, Y 염색체 및 18번 염 색체를 나타내는 3 개의 계수들을 포함하는 히스토그램 구조를 이용한다. LSI 탐침에 대응하는 제 2 히스토그램 구조는 12번 염색체 및 13번 염색체를 나타내는 2 개의 계수들을 포함한다. 자동화된 형광 현미경 시스템은 저 배율을 이용하여 핵의 특정화된 수(N)를 찾는다. 비-제한적인 예시들에서, N의 값은 10 또는 20 또는 30, 또는 40, 또는 50, 또는 60, 또는 80 또는 100, 또는 125, 또는 150, 또는 200 또는 그 이상과 같은 정수이도록 특정화된다. 더욱이, N은 여기에 식별된 값들 사이의 여하한의 정수이도록 특정화될 수 있다. 그 후, 상기 시스템은 고 배율을 이용하여 각각의 핵을 개별적으로 이미징한다. 형광 동소 보합결합 광 지점들은 모든 채널들에 대해 셈해지고, 그 결과치들은 상기 설명된 히스토그램 공식으로 체계화된다. 상기 측정 프로세스는, 하나의 빈 카운트(bin count)가 사전설정된 수(M)에 도달할 때까지 계속된다. 예를 들어, 상기 수(M)는 현재의 관리 지침(government guideline)에 대응하는 50일 수 있다. 더 일반적으로, 비-제한적인 예시들에서, M의 값은 10 또는 20 또는 30, 또는 40, 또는 50, 또는 60, 또는 80 또는 100, 또는 125, 또는 150, 또는 200 또는 그 이상과 같은 정수이도록 사전설정된다. 더욱이, M은 여기에 식별된 값들 사이의 여하한의 정수이도록 사전설정될 수 있다. N 핵이 측정된 때, 빈이 요구되는 M 양(quantity)을 포함하지 않으면, 상기 시스템은 저 배율에서 추가 핵에 대해 검색할 수 있으며, 하나의 빈이 양(quantity) N에 도달할 때까지 높은 배율에서 측정을 계속한다. N이 도달되면, 측정을 멈추고, 가장 높은 빈 셈은 그 다음 가장 높은 빈 카운트와 비교될 수 있다. 가장 높은 빈 카운트가 그 다음 가장 큰 빈 카운트보다 더 큰 어느 사정설정 된 퍼센트인 경우, 그 빈에 대응하는 결과들은 임상 결과로서 보고될 수 있다. 이것이 상기 조건을 만족하지 않으면, 비결정적인 결과가 보고될 수 있다. 다양한 비-제한적인 예시들에서, 가장 높은 빈 카운트를 그 다음 가장 높은 빈 카운트와 비교하기 위한 사전설정된 퍼센트는 5 %, 또는 10 %, 또는 15 %, 또는 20 %, 또는, 25 %, 또는 30 %, 또는 35 %, 또는 40 %, 또는 45 %, 또는 50 %, 또는 60 %, 또는 70 %, 또는 80 %, 또는 90 %, 또는 100 %, 또는 125 %, 또는 150 %, 또는 175 %, 또는 200 %, 또는 더 높은 퍼센트 값일 수 있다. 나아가, 사전설정된 퍼센트는 여기에 식별된 것들 사이의 여하한의 정수 또는 비정수 값에서 설정될 수 있다.
본 발명의 형광 동소 보합결합 이미지들을 분석하는 이미지 처리 방법의 일 실시예는 개략적으로 도 1에 도시되어 있다. 형광 탐침에 대해 시편을 동소 보합결합하도록 적절히 처리된 시편을 함유한 현미경 슬라이드가 현미경의 시야 내에 배치된다(400). 비-제한적인 실시예에서, 본 발명에 사용될 수 있는 현미경의 기본 요소들은 X-Y 스테이지, 수은 또는 라벨들의 형광을 여기시키기에 적합한 등가의 광원, 형광 현미경, 색 검출 CCD 이미지 검출 디바이스, 컴퓨터, 및 1 이상의 모니터들을 포함한다. 상기 시스템의 개별 요소들은 주문-제작(custom-build)될 수 있거나, 표준 구성요소들로서 기성품(off-the-shelf)으로 구매될 수 있다. 시편들의 비-제한적인 예시들은 세포, 혈구, 상피세포, 조직, 분열 조직(disrupted tissue), 조직 박편, 생체검사 샘플(biopsy sample), 절개된 외과적 샘플(excised surgical sample) 등을 포함한다.
시편의 깊이 내에서 엄선한(of choice) 초점 평면에서 시편을 포커스하도록 현미경이 조정된다(410). 결합된 라벨링 탐침을 갖는 샘플의 다양한 유전자위들이 형광을 발산하게 하는 형광 여기 조명으로 시편이 조사된다(420). 이들 영역들을 적절히 노광하기 위해 전자 이미징 디바이스의 노광 파라미터들이 조정된다(430). 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 노광 시간, 및/또는 어퍼처, 및/또는 조명 레벨을 변화시킴으로써 노광 파라미터들이 변동될 수 있다. 이미지가 캡처된다(440).
다수의 경우들에서, 캡처된 이미지 내에 제공되고(도 1, 440), 검사 중의 필드 내의 세기 범위는 전자 이미징 디바이스 및/또는 그 지원 전자기기(supporting electronics)의 동적 범위 능력들을 초과할 것이다. 이러한 상황들에 대해, 도 2를 참조하면, 이미지들의 시퀀스를 이용하여 노광이 조정된다. 먼저, 가장 밝은 스폿들이 식별되고(500), 전자 이미징 디바이스의 동적 범위의 끝(top end)에 대응하여, 가장 밝은 스폿들이 적절히 노광되도록 노광 파라미터들이 설정된다(510). 이러한 조건들 하에서 이미지가 캡처된다(520). 노광부족(underexposure)으로 인해 상세부분이 손실되었다는 것을 결정하기 위해, 캡처된 이미지의 덜 밝은 부분들이 분석된다(530). 이 영역들의 노광부족은 더 어두운 형광 스폿들을 검출할 수 없다. 이 어두운 영역들에서 상세부분의 결여가 존재한다면(540), 전자 이미징 디바이스의 동적 범위를 초기 동적 범위 아래의 영역으로 연장하기 위해, 노광 파라미터들이 증가된다(550). 이미징될 더 낮은 세기 레벨에 대응하기 위해, 전자 이미징 디바이스의 지원 전자기기의 범위가 조정되고; 초기 가장 밝은 영역들에 대응하는 이미지 센서의 픽셀들의 출력은 상기 지원 전자기기를 과부화(overload)시키지 않도록 차단되거나 우회(bypass)된다(560). 새로운 이미지가 캡처(520)되고, 이와 유사하게 분석된다(530). 이 프로세스는 전체 이미지가 허용가능하게 이미징되었을 때까지 반복된다(570). 그 후, 관심 대상물들은 캡처된 이미지들의 세트로부터 나열된다(도 1, 450).
나열 알고리즘의 개략도인 도 3을 참조하면, 검사 필드(field of scrutiny)의 깊이 내의 주어진 레벨에 대해, 캡처된 이미지들이 저역 필터링된다(low pass filtered: 600). 상기 이미지들은, 각각의 원래 이미지들을 대응하는 저역 필터링된 버전으로 나눔으로써 콘트라스트 이미지들로서 수학적으로 재-표현될 수 있다(610). 관심 대상물들 및 속성들은 일정한 콘트라스트의 등고선들을 생성함으로써 식별될 수 있다. 콘트라스트 임계치를 측정된 가장 높은 값으로부터 선택된 낮은 값으로 순차적으로 낮춤으로써, 연속적으로 더 낮아지는 일정한 콘트라스트의 등고선들이 분해될 수 있다(620). 각각의 대상물에 대해, 가장 높은 콘트라스트는 이전 대상물들의 이동 평균 및 표준 편차와 비교될 수 있다(630). 콘트라스트에서 상당한 도약이 검출되면, 더 높은 콘트라스트를 갖는 모든 대상물들은 잠재 관심 대상물들("도트들")로서 표시될 수 있다(640). "도트"가 상당히 낮은 콘트라스트를 갖거나, 더 작은 크기를 갖는 경우에 이상값(outlier)으로 고려되며, 또 다른 고려로부터 제외된다(650). 또한, 2 개의 잠재 형광 동소 보합결합 "도트들"이 사전설정된 임계값보다 더 가깝게 위치된 경우, 상기 도트들은 단일 "도트"를 형성하기 위해 합쳐질 수 있다(660). 식별된 잠재 형광 동소 보합결합 "도트들"의 상대 콘트라스트 및 크기가 비교될 수 있고(670), 최종 형광 동소 보합결합 "도트들"이 특성화되고 데이터 베이스에 로깅될 수 있다(680). 상기 프로세스는 샘플의 깊이 전반에 걸쳐 분석을 수행하도록 요구된 초점의 추가 평면들에 대해 반복된다(도 1, 455).
관심 대상물들을 나열했으면, 핵이 식별된다(도 1, 460). 도 4에 개략적으로 도시된 바와 같이, 적절히 포커스되고 노출된 DAPI 이미지가 저 배율에서 얻어진다(700). 콘트라스트 세기의 등고선들은 이미지를 분할하기 위해 수학적으로 생성됨에 따라, 대상물들을 식별한다(710). 열거된 각각의 대상물들에 대해(450), 병진, 회전 및 스케일링에 대해 불변하는 타원 푸리에 형상 디스크립터와 같은 형상 특성화가 연산된다(720). 각각의 대상물의 구성 형태(constituent feature)들의 입도(granulometry), 또는 크기 분포가 연산된다(730). 핵을 완전히 기술하기 위해, 대상물을 분류하는데 사용된 모든 변수들 및 특성들의 조합이 채택된다. 경험 기반 패턴 데이터 베이스와 연계한 패턴 인식 알고리즘은 관심 대상물을 식별하고 카테고리화하는데 사용된다(740).
그 후, 이에 따라 식별된 핵은 도 5에 도시된 바와 같이 분할된다(도 1, 470). 먼저, 가장 높은 세기에 대응하는 일정한 세기의 등고선이 연산된다(800). 이에 따라 식별된 대상물들의 특성들이 기록된다(810). 임계 세기 레벨은 연속적으로 감소되고, 새로운 등고선들이 연산된다(820). 세기 임계치가 낮아짐에 따라, 각각의 대상물들과 연계된 등고선이 확대될 것이고(830), 새로운 대상물들이 가시(visible)될 수 있다(840). 몇몇 경우들에서, 더 높은 세기 레벨들에서 분리된 대상물들은 임계치가 감소됨에 따라 합쳐질 수 있다(850). 세기 임계 레벨이 충분히 낮은 레벨에 도달했으면, 추가 등고선들의 연산이 종료된다(860). 일반적으로, 임계 레벨 결정은 사용되는 현미경 시스템에 대해 특정화된 기계적(instrumental) 또는 시스템 파라미터들을 이용한다. 따라서, 임계치를 생성하는 것은 설치에 대해 특정화된 절차이다. 비-제한적인 예시의 방식으로, 현미경 시스템은 광자 카운트(photon count), 또는 전류, 또는 전하 축적으로서 세기 측정들을 제공할 수 있다. 본 발명의 해당 기술 분야의 당업자라면 이해할 수 있을 것이며, 전체 배경과 구별되는 임계 레벨들의 평가들을 구현할 수 있는 한편, 다른 한편에서는 상당한 등고선 세기 레벨들의 평가들을 구현할 수 있다. 그 점에서, 유효한 크기 범위에 맞지 않는 대상물들은 또 다른 고려로부터 제외될 수 있다(870). 이미 연산된 일정한 밝기의 등고선들은 각각의 대상물들의 에지들을 결정하는데 사용된다(880). 각각의 등고선을 따른 각각의 지점에서, 세기 구배가 연산되고 평균화된다. 각각의 핵의 경계는 가장 큰 평균 구배를 갖는 등고선으로서 정의된다. 그로부터, 대상물들은 그들의 에지들 내에서만 정의된다(890).
이에 따라, 핵을 정의하고 분할하였으면(도 1, 470), 각각의 핵 내의 형광 광 신호들이 카운트되고 특성화되며(도 1, 480), 그 후 해석되고, 결과치들이 보고된다(도 1, 490). 이 최종 단계의 실시예는 도 6에 도시되며, 예를 들어 AneuVysionTM 에세이와 함께 사용하기에 적합하다. 이전에 설명된 바와 같이, AneuVysionTM 에세이는 태아기 진단용 테스트이다. 본 출원서에 설명된 개시된 실시예는 다른 형광 동소 보합결합 에세이들에 대해 동일하게 유효하다. 각각의 빈이 핵 내에 포함된 형광 광 스폿 양들과 색들의 가능한 조합에 대응하도록, 수학적 히스토그램 구조가 생성된다(900). N 형광 광 스폿들의 제 1 그룹의 각각이 카운트되고(910), 그 색이 특성화되며, 결과치들이 히스토그램의 적절한 빈에 추가된다. 제 1 N 스폿들이 카운트된 후, 히스토그램 빈들의 어느 하나의 최대 카운트가 결정된다(920). 그 최대치가 N보다 적으면(930), 추가 핵이 위치된다(940). N의 값들에 대한 비-제한적인 예시들이 상기에 개시되었다. 새로운 핵이 위치될 수 없다면(945), 비결정적 결과들이 보고된다. 수(number) M은 사전설정되고, 조절 요건(regulatory requirement)들에 대응할 수 있다. M에 대한 예시적인 값은 50이다. M의 값들에 대한 비-제한적인 예시들은 앞서 설명되었다. 이와 연계된 추가 광 스폿들이 카운트되고 특성화되며(950), 그 결과치들은 기존의 빈 컨텐츠에 추가된다. 이 프로세스는, 최대 빈 카운트가 N과 같거나 그보다 더 클 때까지 계속된다(930). 어느 빈 내의 최대 수가 M에 도달했으면, 그 다음 가장 큰 히스토그램 빈 내의 수가 결정된다(970). M이 그 다음 가장 큰 수를 사전설정된 Z 퍼센트만큼 초과하는 경우, 유효 테스트 결과로서 염색체 구성(chromosomal constituency)이 보고된다. 사전설정된 퍼센트 값들에 대한 비-제한적인 예시들은 상기에 개시되었다. 한편, M이 그 다음 가장 큰 수를 Z 퍼센트만큼 초과하지 않는다면, 상기 테스트는 비결정적이라고 보고된다(960).
바람직한
실시예들에
대한 설명
본 발명은 바람직한 실시예들에 대해 설명되었지만, 당업자라면, 첨부된 청구항들에 의해 정의된 바와 같이, 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않 고, 본 발명의 다양한 변형들 및/또는 수정들이 행해질 수 있다는 것을 쉽게 알 수 있을 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 문서들은 추가적인 또는 대안적인 세부사항들, 특징들 및/또는 기술적 배경을 설명하기 위해 본 명세서의 적절한 곳에서 인용 참조 되고 있다.
Claims (9)
- 형광 여기 광원(fluorescence exciting light source) 및 전자 이미징 디바이스를 갖는 현미경 시스템을 이용하여, 형광으로 보합결합된(fluorescently-hybridized) 시편의 형광 동소 보합결합(fluorescence in situ hybridization) 이미지를 분석하는 이미지 처리 방법에 있어서,(a) 형광 여기 조명으로 상기 시편을 조명하는 단계;(b) 조명된 필드 내의 초점심도(depth of focus)에서 상기 시편의 이미지를 캡처하도록 상기 전자 이미징 디바이스의 노광 파라미터들을 조정하는 단계;(c) 상기 시편의 캡처된 이미지 내에 관심(of interest) 대상물들을 나열(enumerate)하는 단계;(d) 상기 이미지 내의 핵들을 식별하는 단계;(e) 상기 이미지 내의 핵들을 분할(segment)하는 단계;(f) 상기 핵 내에서 발생하는 형광 신호를 카운트(count)하고 특성화하는 단계; 및(g) 결과치들을 해석하고 보고하는 단계를 포함하는 이미지 처리 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 (b) 및 (c) 단계들은 상이한 초점심도에서 반복되는 이미지 처리 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 노광 파라미터들을 조정하는 단계는:(3a) 상기 시편의 1 이상의 가장 밝은 스폿(spot)들을 결정하는 단계;(3b) 상기 가장 밝은 스폿들이 실질적으로 상기 전자 이미징 디바이스의 동적 범위의 최대치에서 노광되도록 노광 파라미터들을 조정하는 단계;(3c) 상기 이미지를 캡처하도록 노광을 수행하는 단계;(3d) 상기 캡처된 이미지의 더 어두운 부분들의 상세부분(detail)이 노출부족(underexpose)이었는지 여부를 결정하기 위해, 상기 더 어두운 부분들을 분석하는 단계; 및상기 이미지의 상기 더 어두운 부분들이 노출부족이었다면,(3e) 상기 노광 파라미터들을 증가시키는 단계;(3f) 밝은 영역들을 차단하는 단계; 및(3g) 샘플의 상기 더 어두운 영역들이 모두 적절히 이미징될 때까지 상기 (3c) 및 (3d) 단계들을 반복하는 단계를 더 포함하는 이미지 처리 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 관심 대상물들을 나열하는 단계는:상기 보합결합된 시편의 깊이에 걸쳐 이격된 초점 평면들에서 다수의 이미지들을 캡처하는 단계;상기 캡처된 이미지들을, 일정한 콘트라스트의 등고선(contour)들에 의해 특 성화된 콘트라스트 이미지들로 연산적으로(computationally) 변형시키는 단계; 및상기 보합결합된 시편의 상기 깊이 전반에 걸쳐 상기 관심 대상물들을 나열하도록 나열 알고리즘을 수행하는 단계를 더 포함하는 이미지 처리 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 핵들을 식별하는 단계는:5a) 각각의 관심 대상물의 병진, 회전 및 스케일링 불변 형상 디스크립터(shape descriptor)를 연산하는 단계;5b) 각각의 관심 대상물의 크기 분포를 연산하는 단계; 및5c) 경험 기반(experience based) 패턴 데이터 베이스와 연계한 패턴 인식 알고리즘을 채택하여, 상기 관심 대상물을 식별하고 카테고리화(categorize)하는 단계를 더 포함하는 이미지 처리 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 핵들을 분할하는 단계는:6a) 국부적 최대치에서 시작하고 낮은 세기 임계 레벨 쪽으로 진행하는 연속한 세기 간격들에서 일정한 밝기의 등고선들을 연산하는 단계;6b) 상기 각각의 등고선에 대해 평균 구배(average gradient)를 연산하는 단계; 및6c) 상기 각각의 핵들의 경계를, 상기 핵에 대해 가장 큰 상기 평균 구배를 갖는 등고선으로 정의하는 단계를 더 포함하는 이미지 처리 방법.
- 제 1 항에 있어서,상기 결과치들을 해석하고 보고하는 단계는:7a) 각각의 빈(bin)이 핵 내에 포함된 상기 스폿 양(spot quantity)들과 색들의 가능한 조합에 대응하도록, 수학적 히스토그램 구조를 생성하는 단계;7b) 각각의 형광 광 스폿들을 카운트(count)하고, 상기 형광 광 스폿들 각각의 색들을 특성화하는 단계;7c) 상기 히스토그램의 적절한 빈들 내에, 상기 카운트한 결과치들을 기록하는 단계;7d) 상기 빈 내에서의 상기 카운트가 사전설정된 수에 대응할 때까지 상기 카운트를 계속하는 단계;7e) 상기 카운트를 중지하고, 상기 빈에서의 상기 카운트를, 어느 다른 빈에서의 제 2 최대 카운트와 비교하는 단계;7f) 상기 제 2 최대 수가 상기 사전설정된 수의 사전설정된 퍼센트보다 낮은 경우, 최대 수 빈 식별자(maximum number bin identifier)를 보고하는 단계; 또는 대안적으로,7g) 상기 제 2 최대 수가 상기 사전설정된 수의 사전설정된 퍼센트와 같거나 그보다 더 큰 경우 비결정적 결과치(inconclusive result)들을 보고하는 단계를 포함하는 이미지 처리 방법.
- 제 1 항에 있어서,세포 핵이 특성화되는 이미지 처리 방법.
- 제 1 항에 있어서,염색체가 나열되는 이미지 처리 방법.
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| PA0105 | International application |
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| WITN | Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid |