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KR20090124020A - 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트 및 상기프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이 - Google Patents

식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트 및 상기프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이 Download PDF

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KR20090124020A
KR20090124020A KR1020080050010A KR20080050010A KR20090124020A KR 20090124020 A KR20090124020 A KR 20090124020A KR 1020080050010 A KR1020080050010 A KR 1020080050010A KR 20080050010 A KR20080050010 A KR 20080050010A KR 20090124020 A KR20090124020 A KR 20090124020A
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Abstract

본 발명은 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 이용하여 식중독균을 검출하는 방법, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는 식중독균 검출 키트에 관한 것이다.
본 발명의 프로브는 식품 산업에서 문제가 되고 있는 식중독균에 대한 빠른 검출 및 동정에 활용될 수 있을 것이다.
올리고뉴클레오티드, 마이크로어레이, 식중독균, 비교 유전체학, 프로브

Description

식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트 및 상기 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이{Oligonucleotide probe set for dectecting food-borne pathogens and microarray containing the probe set}
본 발명은 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트, 상기 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이 및 키트에 관한 것이다.
식중독균은 세계적으로 인간의 건강에 주요한 문제점을 일으키고 있으며 식품산업, 공공 건강 증진, 미생물 테러 등의 분야에서 식중독균의 빠른 검출이 필요한 실정이다. 인간에 질병을 일으키는 균들 중 주요한 식중독균들은 다음과 같다: 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) O157:H7 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피무리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium). 이러한 식중 독균의 검출은 인간의 건강과 식품 산업에서 매우 중요시되고 있으며, 식중독 검출에 있어서 민감도 (sensitivity), 검출 시간 (rapidity) 및 특이적인 검출(specificity)이 가장 중요한 요건이다. 기존에 알려져 있는 생화학적인 식중독균의 진단 방법은 일반적으로 2-3일 정도의 시간이 필요하며 한 번의 실험으로 다중의 병원균의 검출에는 무리가 있었다.
몇몇의 DNA를 이용한 식중독균의 검출방법이 보고되었으나, 이 방법들 중 PCR (polymerase chain reaction, 중합효소연쇄반응)은 가장 일반적으로 사용된 방법이다. 그러나 PCR은 사용하는 프라이머의 숫자에 제한이 있으므로 다중의 식중독균의 검출에 문제점을 가지고 있다. 또한 비슷한 속 균주들 사이에서 DNA 서열의 유사성이나 다양성에 의한 위양성(false-positive)이나 위음성(false-negative)을 나타낼 수 있는 가능성이 있다. DNA 서열에 중심을 둔 마이크로어레이 실험 방법은 유전자 발현, 지노타이핑(genotyping) 및 단일염기다형성(single-nucleotide polymorphism) 등의 실험에 사용되어 왔다(Chizhikov et al. 2002. J. Clin. Microbiol. 40: 2398-2407). 또한 마이크로어레이 실험방법은 한 번의 실험으로 다수의 식중독균을 검출할 수 있는 잠재능력 때문에 새로운 식중독균 검출 방법으로 제안되었다 (Al-khaldi et al. 2002. J. AOAC Int. 85: 906-910).
최근 들어, cDNA 및 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 기술이 병원성 미생물의 분석에 적용되어 왔으며 (Burton et al. 2005. Molecular and Cellular Probes. 19: 349-357), 하나의 칩으로 4종의 식중독균을 검출할 수 있는 연구가 보고되었다 (Sergeev et al. 2004. Biosensors and Bioelectronics. 20: 684-698). 이러한 기존의 연구들에서 제작된 프로브들은 미생물의 flagelline 유전자나 독성 유전자 (병원성 관련 유전자 포함), 16S rRNA 또는 23S rRNA 서열에서 제작되었다. 그러나 이러한 표적 유전자들은 같은 속의 미생물들 간에 그 서열을 공유하고 있으며, 이는 cross-hybridization의 결과를 초래할 가능성이 높다. 또한, 이러한 연구들에서 혼성화 전에 PCR을 수행하는데, 이 방법은 사용 가능한 프로브의 수가 제한적일 수밖에 없으며 이는 다수의 병원균을 검출하는데 무리가 있다 (Chizhikov et al. 2001. Appl. Environ. Microbiol. 67: 3258-3263).
2006년 1월을 기준으로 약 270개 이상의 미생물에 대한 게놈 서열이 National Center for Biotechnology information (NCBI, http://www.ncbi.nih.gov/genomes/lproks.cgi)에 공개되어 있으며, 대부분의 식중독균에 대한 게놈 염기서열 분석 작업이 끝났거나 진행 중에 있다.
한국특허등록 제10-611056호에는 병원성 미생물 검출을 위한 올리고뉴클레오티드마이크로칩 및 이를 이용한 병원성 미생물 검출방법이 개시되어 있으며, 한국특허등록 제10-671501호에는 식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 프로브 서열과는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명에서는 각각의 식중독균의 게놈 서열로부터 각각의 식중독균에 특이적인 70-mer 올리고뉴클레오티드 프로브들을 선별하였으며, 선별된 프로브들을 이용하여 "FBP-1"이라고 명명한 식중독균 검출용 마이크로어레이 칩을 제작하였다. 이 제작한 칩을 이용하여 다양한 식중독균 및 비병원성 균들의 게놈 DNA와 반응시켜 그 특이성을 증명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 신속하고 정확한 검출이 가능한 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 이용하여 식중독균을 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는 식중독균 검출 키트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 프로브는 식품 산업에서 문제가 되고 있는 식중독균에 대한 빠른 검출 및 동정에 활용될 수 있을 것이라 사료되며, 또한 게놈 서열 비교 방법 및 DNA 칩을 이용한 마이크로어레이 실험 방법이 미생물 병원균에 대한 안전성 연구에 적용될 수 있는 가능성을 보여주었다. 또한, 비교 유전체학의 미생물 분류 연구에 대한 새로운 적용방법을 제시하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
서열번호 31 내지 40의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 41 내지 50의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브;
서열번호 51 내지 60의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
서열번호 61 내지 70의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 포함하는 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세 트에서, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 31 내지 40의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 31 내지 40의 올리고뉴클레오티드 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에서, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 41 내지 50의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 41 내지 50의 올리고뉴클레오티드 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에서, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 51 내지 60의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 51 내지 60의 올리고뉴클레오티드 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에서, 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 61 내지 70의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 61 내지 70의 올리고뉴클레오티드 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세 트는 가장 바람직하게는 서열번호 31 내지 70의 올리고뉴클레오티드 모두를 포함할 수 있다.
본 명세서에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 단일가닥 핵산 서열을 말한다.
본 명세서에 있어서, 프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이를 제공한다.
본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 올리고뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 올리고뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함된다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.
용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 올리고뉴클레오티드 프로브가 부착될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH2 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한,
시료의 게놈 DNA를 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및
상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는 식중독균을 검출하는 방법을 제공한다.
상기 식중독균은 식중독을 유발하는 임의의 균일 수 있으나, 바람직하게는 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 및 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)이다.
본 명세서에 있어서, "혼성화"란 핵산의 2개의 상보적 가닥이 조합하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 과정을 말한다.
본 발명의 일 구체예는, 본 발명의 방법에 있어서 상기 혼성화는 높은 엄격도 혼성화 조건하에서 수행될 수 있다. 본 구체예에서, 상기 높은 엄격도 혼성화 조건은 바람직하게는 65℃에서 동일한 몰의 Na2HPO4 및 NaH2PO4, 1mM EDTA 및 0.02% 소듐 도데실 설페이트를 포함하는 0.12 M 포스페이트 버퍼를 포함하는 것이다.
또한, 본 명세서에 있어서, "엄격도 (stringency)"란 혼성화 및 그 후의 처리 단계 동안 존재하는 온도 및 용매 조성을 기술하기 위하여 사용되는 용어이다. 높은 엄격도 조건하에서는 고도로 상동적인 핵산 혼성체가 형성될 것이다. 즉, 충분한 정도의 상보성이 없는 혼성체는 형성되지 않을 것이다. 따라서 분석 조건의 엄격도는 혼성체를 형성하는 2 핵산 가닥 사이에 필요한 상보성의 양을 결정한다. 엄격도는 표적과 비표적 핵산과 형성된 혼성체 사이의 안정성의 차이를 최대화하기 위하여 선택된다.
상기 시료는 식중독균이 의심되는 미생물을 포함하는 임의의 시료일 수 있으며, 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 게놈 DNA를 추출할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 Cy-5 또는 Cy-3이다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 Klenow fragment를 이용하여 핵산을 합성하거나 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지 는 핵산 합성 또는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 핵산 합성 또는 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 프로브 세트는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화될 수 있다. 마이크로어레이 기판 상에 고정화되는 올리고뉴클레오티드 프로브 세트에 대하여는 상기 기재한 바와 같다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 식중독균의 검출은 검출 가능한 신호를 발생시키는 물질로 상기 시료의 게놈 DNA를 표지하고, 이를 상기 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화시키고, 그로부터 발생하는 신호를 검출하여 이루어질 수 있다. 상기 검출 가능한 신호는 예를 들면, 광학적 신호 또는 전기적 신호가 될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 상기 광학적 활성 물질은 형광 또는 인광을 발생시키는 물질일 수 있다. 상기 형광 물질은 예를 들면, 플루오로레신(fluorescein), Cy-5 및 Cy-3 일 수 있다. 또한, 상기 게놈 DNA는 혼성화 전 또는 후에 검출 가능한 신호를 발생시키는 물질로 표지되거나, 표지되어 있지 않을 수 있다. 표지되어 있지 않은 경우의 상기 게놈 DNA와 올리고뉴클레오티드 프로브의 혼성화 결과는 예를 들면, 전기적 신호를 통하여 검출할 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한,
본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는 식중독균 검출 키트를 제공한다. 올리고뉴클레오티드 프로브 세트는 전술한 바와 같다. 상기 키트는 또한 혼성화 반응에 필요한 시약을 필요로 하는데, 이는 당업계에 통상적으로 이용되는 것을 이용할 수 있으며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실험 방법
사용한 미생물 균주
본 발명에서 사용한 미생물은 표 1 과 같이 ATCC (the American Type Culture Collection) 균주들을 수집하여 사용하였다.
표 1. 본 발명에 이용된 균주.
종 균주 종 균주
Salmonella serovar Typhimurium ATCC 19585 Listeria monocytogenes ATCC 19118
Salmonella serovar Typhimurium ATCC 14028 Listeria monocytogenes ATCC 7644
Salmonella serovar Typhimurium ATCC 13311 Listeria monocytogenes ATCC 15313
Salmonella serovar Typhi ATCC 6539 Listeria ivanovii ATCC 19119
Salmonella serovar Typhi ATCC 33459 Listeria welshimeri ATCC 35897
Salmonella serovar Paratyphi B ATCC 13428 Listeria inocua ATCC 33090
Salmonella serovar Paratyphi C ATCC 10719 Listeria grayi ATCC 25401
Salmonella serovar Enteritidis ATCC 4931 Listeria seeligeri ATCC 35967
Salmonella bongori ATCC 43975 Staphylococcus aureus ATCC 25923
Salmonella enterica salamae ATCC 15793 Staphylococcus aureus ATCC 6538P
Salmonella enterica arizonae ATCC 13314 Staphylococcus aureus ATCC 6538
Salmonella enterica diarizonae ATCC 43973 Staphylococcus aureus ATCC 29737
Salmonella enterica houtenae ATCC 43974 Stapylococcus haemolyticus ATCC 29970
Salmonella enterica indica ATCC 43976 Stapylococcus epidermidis ATCC 14990
Salmonella serovar Choleraesuis ATCC 13312 Vibrio parahaemolyticus ATCC 27969
Salmonella serovar Gallinarum ATCC 9184 Vibrio parahaemolyticus ATCC 33844
Salmonella serovar Pullorum ATCC 9120 Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802
Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894 Vibrio cholerae ATCC 14547
Escherichia coli ATCC 27325 Vibrio vulnificus ATCC 33815
Escherichia coli ATCC 23736 Campylobacter jejuni ATCC 43429
Escherichia coli ATCC 25922 Campylobacter jejuni ATCC 33291
Escherichia coli ATCC 11775 Clostridium botulinum ATCC 3502
Yersinia enterocolitica ATCC 23715 Clostridium perfringens ATCC 3624
Bacillus cereus ATCC11778 Citrobacter frenudii ATCC 8090
Bacillus cereus ATCC14579 Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Bacillus cereus ATCC10876 Enterobacter cloacae ATCC 13047
Bacillus subtilis ATCC 6633 Enterobacter sakazakii ATCC 29544
Bacillus subtilis ATCC 6051 Enterococcus faecalis ATCC 19433
Bacillus thuringiensis ATCC 35646 Kelbsiella pneumoniea subsp. pneumoniae ATCC 8724
Bacillus thuringiensis ATCC 10792 Proteus vulgaris ATCC 29905
Bacillus anthracis ATCC 14578 Rahnella aquatilis ATCC 15552
Listeria monocytogenes ATCC 19111 Shigella boydii ATCC 8700
Listeria monocytogenes ATCC 19113 Shigella flexneri ATCC 12022
Listeria monocytogenes ATCC 19114 Shigella sonnei ATCC 25931
Listeria monocytogenes ATCC 19115
총 69개의 균주들이 사용되었으며 식중독균들 및 비 식중독균들로 이루어져 있다. 사용되어진 식중독균들은 다음과 같다: 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes), 스태필로코커스 오레우스(Staphylococcus aureus), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) O157:H7, 살모넬라 엔테리카 세로바 티피(Salmonella enterica serovar Typhi) 및 살모넬라 엔테리카 세로바 티피무리움(Salmonella enterica serovar Typhimurium). 각각의 미생물들은 각각의 배지와 조건에서 배양하였으며, Bacillus anthracis ATCC 14578와 Clostridium botulinum ATCC 3502 의 경우는 한국국립보건원 (the Korea Center for Disease Control and Prevention, KCDC)에서 게놈 DNA를 얻었다.
게놈 DNA 추출
각각의 키운 미생물들을 원심 분리하여 균체를 모은 뒤 DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 추출한 게놈 DNA의 농도는 UV-spectrophotometer (Model UV-1700, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였으며 흡광도의 비 (A260/A280)가 1.8에서 2 사이의 DNA 들만을 본 발명에 사용하였다.
식중독균들의 게놈 DNA 서열
본 발명에서 사용된 게놈 DNA 서열들은 표 2와 같다.
표 2. 본 발명에 이용된 게놈 서열.
박테리아 균주 Ref. seq Genbank Total base(bp) 단백질 코딩 유전자 병원성
Bacillus cereus ATCC 14579 NC_004722 AE016877 5,411,809 5234 병원균
Listeria monocytogenes strain EGD NC_003210 AL591824 2,944,528 2846 병원균
Listeria inocua NC_003212 AL592022 3,011,208 2989 비병원균
Stapylococcus aureus N315 NC_002745 BA000018 2,814,816 2594 병원균
Stapylococcus aureus Mu50 NC_002758 BA000017 2,878,529 2714 병원균
Stapylococcus aureus MW2 NC_003923 BA000033 2,820,462 2632 병원균
Clostridium botulinum Hall strain A (ATCC 3502) CB.dbs 3,886,916 병원균
Clostridium perfringens str. 13 NC_003366 BA000016 3,031,430 2660 병원균
Campylobacter jejuni subsp. jejuni NCTC 11168 NC_002163 AL111168 1,641,481 1634 병원균
Vibrio parahaemolyticcus RIMD 2210633 NC_004603 BA000031 3,288,558 3080 병원균
NC_004605 BA000032 1,877,212 1752
Yersinia enterocolitica YE.dbs 4,615,899 병원균
Escherichia coli O157:H7 EDL933 NC_002655 AE005174 5,528,445 5324 병원균
Escherichia coli O157:H7 NC_002695 BA000007 5,498,450 5361 병원균
Escherichia coli K12 NC_000913 U00096 4,639,221 4279 비병원균
Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 NC_003197 AE006468 4,857,432 4451 병원균
Salmonella enterica serovar Typhi CT18 NC_003198 AL513382 4,809,037 4395 병원균
본 발명에 사용된 대부분의 식중독균 서열 파일 (ffn file (코딩 영역 서열 ), fna file (전체 게놈 서열))들은 NCBI에서 얻었으며, Yersinia enterocolitica과 Clostridium botulinum Hall strain A (ATCC 3502)의 게놈 DNA 서열들은 Sanger Institute (http://www.sanger.ac.uk/Projects/Y_enterocolitica/, http://www.sanger.ac.uk/Projects/C_botulinum/) 에서 얻었다. 식중독균들과 관련이 있는 비병원성의 균들의 게놈 DNA 서열들도 사용되었으며, 총 16개의 게놈 DNA 서열들이 본 발명에서 사용되었다.
비교 유전체학을 이용한 식중독균 특이적인 프로브 선별 작업
각 식중독균에 특이적인 70-mer 올리고뉴클레오티드들의 선별 작업에 대한 모식도는 도 1과 같다. 16개의 박테리아의 게놈 DNA 서열들의 데이터베이스를 만들었으며, 각각의 11개의 식중독균들의 코딩 영역 서열들은 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 이용하여 게놈 DNA 서열들의 데이터베이스에 비교하였다. Clostridium botulinum 과 Yersinia enterocolitica 의 게놈 DNA의 경우에는 유전자 서열 부분이 아직까지 분석이 되어있지 않기 때문에 전체 게놈 서열들을 800bp 크기로 400bp씩 중복되도록 자른 뒤 800bp 크기의 DNA 조각들을 게놈 DNA 서열들의 데이터베이스와 비교하였다.
BLAST 결과물 중, 각각의 유전자 (혹은 각각의 DNA 조각들)에 대하여 유사도가 가장 높은 결과물들을 선택하였으며, 이 결과들에 기초하여 각각의 식중독균에 특이적일 것으로 생각되는 유전자 (혹은 DNA 조각)들을 선별하였으며, 다시 BLAST 프로그램을 이용하여 NCBI의 nr 데이타베이스와 비교하였다. 이 방법을 통하여 각 각의 식중독균에 특이적일 것으로 생각되는 유전자들을 선별하였으며 (표 3), 선별된 유전자들은 시작 서열부터 1 base pair의 간격으로 이동하며 70-mer 크기의 DNA 조각들로 나누었다. 이들 70-mer DNA 조각들 중 Tm (melting temperature) 값이 78±0.5℃인 서열들을 다시 선별하였으며 데이타베이스 들과 다시 비교하여 각각의 식중독균에 특이적인 70-mer DNA 서열들을 최종적으로 선별하였다.
표 3. 11가지 식중독균의 게놈 DNA 서열로부터 선발된 70-mer 프로브 및 구축된 70-mer 올리고뉴클레오티드의 수.
Bacillus cereus ATCC 14579 Listeria monocytogenes EGD Stapylococcus aureus Mu50 Clostridium botulinum Hall strain A Clostridium perfringens str. 13 Campylobacter jejuni NCTC 11168
유전자 수 (단편) 5,234 2,846 2,714 9758a 2,660 1,634
1차 선발된 유전자 수 2,508 136 1,422 3402a 1,414 935
2차 선발된 유전자 수 2,004 113 333 38a 916 722
2차 선발된 유전자에서 70mer DNA 단편 수 1,110,015 81,919 252,300 27,778 637,562 524,884
70mer DNA 단편 수 Tm.=78℃ 10,873 805 1,988 251 1,201 2,410
BLAST 결과를 이용하여 선발된 단편 수 49 152 364 44 228 238
최종 선발된 단편 수 36 106 126 17 103 122
구축된 70-mer 올리고뉴클레 오티드 수 19 30 20 15 30 30
FBP-1 구축에 이용된 70mer 프로브 수 10 10 10 10 10 10
(계속)
Vibrio parahaemolyt icus RIMD Yersinia enterocolitica Escherichia coli O157:H7 EDL933 Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 Salmonella enterica serovar Typhi CT18
유전자 수 (단편) 4,831 11539a 5,323 4,451 4,395
1차 선발된 유 전자 수 2,653 2948a 848 196 290
2차 선발된 유 전자 수 1,669 87a 336 138 210
2차 선발된 유 전자에서 70mer DNA 단편 수 1,069,484 63,771 166,599 97,850 97,875
70mer DNA 단편 수 Tm.=78℃ 8,864 332 1,114 518 598
BLAST 결과를 이용하여 선발 된 단편 수 1,571 67 141 124 166
최종 선발된 단 편 수 26 24 62 91 102
구축된 70-mer 올리고뉴클레 오티드 수 20 20 15 41 35
FBP-1 구축에 이용된 70mer 프로브 수 10 10 10 10 10
양성 대조군 및 음성 대조군의 제작
애기장대(Arabidopsis thaliana)의 putative tubulin beta-4 chain (accession number AY059075)과 actin 3 (accession number AY093784) 유전자의 일부분을 PCR을 이용하여 하기 프라이머로 증폭하였다: Actin3-f 5'-CTCTTGACTACGAGCAGGAA-3'(서열번호 113) 및 Actin3-r 5'-AGTCCTTCCTGATGTCGACA-3'(서열번호 114); Tb4-f 5'-AAGAGGTTGACGAGCAGATG-3'(서열번호 115) 및 Tb4-r 5'-GCCTTTCTCCTGAACATAGC-3'(서열번호 116). 증폭된 DNA 조각은 Perfect-T 클로닝 키트 (TaKaRa, Shiga, Japan)을 이용하여 pMD18-T 벡터에 삽입되었으며 제작된 플라 스미드 DNA는 -20℃에 저장하였다.
양성 대조군 및 음성 대조군으로 사용하기 위한 프로브의 서열은 각각A rabido psis thaliana의 putative tubulin beta-4 chain (accession number AY059075)과 actin 3 gene (accession number AY093784)으로부터 특이적인 서열을 선별하였다: 5'-AAGTCCAGTGTCTGTGATATTGCACCAAAGGGTTTGAAAATGGCGTCTACTTTCATTGGTAACTCAACCT-3'(서열번호 111) 및 5'-AGGTTCTTTACCAGCCATCTATGATTGGTATGGAGAATGCTGGTATCCATGAAACCACCTATAACTCCAT-3'(서열번호 112).
올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 제작
112개의 프로브들(224 올리고뉴클레오티드 DNA 스팟)로 구성된 올리고뉴클레오티드 DNA 칩을 제작하였다. 5'말단을 아민으로 변환시킨 70-mer 올리고뉴클레오티드들은 Illumina 사(Illumina Inc., San Diego, CA)에서 제작하였으며, 50pmol의 농도로 혼성화 용액에 녹인 후, CMT-GAPS II 실란 슬라이드 글라스 위에 pixsys 5500 arrayer (Cartesian Technologies, USA)를 이용하여 DNA 칩을 제작하였다. 제작이 끝난 뒤에는 하나의 칩을 Syto61으로 염색한 후, GenePix 4100A scanner (Axon Instruments, Redwood City, CA)로 스캔하여 칩의 제작을 확인하였다. 칩 위의 각각의 블록은 혼성화 바로 전에 CoverWell perfusion chamber (PC8R-0.5, Grace-Bio Labs, Inc., Bend, OR)로 덮어서 구역을 구분하였다.
시료 DNA 의 Cy3 형광물질 표지 및 혼성화
미생물의 게놈 DNA들은 BioPrime DNA labeling System (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 Cy3 형광물질로 표지하였다. 500ng 의 게놈 DNA 와 1ng 의 양성 대조군을 eppendorf 튜브에 넣고 3차 증류수를 넣어 20 ㎕까지 채운 뒤 20 ㎕의 2.5X Random Primers Solution을 넣고 끓는 물에 5분 동안 넣은 뒤, 곧바로 얼음 속에 넣어 온도를 낮추었다. 6 ㎕의 3차 증류수, 1 ㎕의 dNTP 용액 (10 mM dATP, dGTP 및 dTTP; 3 mM dCTP), 2 ㎕의 Cy3-dCTP (1 mM, GeneChem Inc., Daejeon, Korea), 40 유닛의 Klenow fragment를 넣은 뒤, 37℃에서 2시간 동안 반응을 진행하였다. 반응이 끝난 뒤, Cy3 형광물질로 표지된 DNA는 소듐 아세테이트 (3M, pH 5.2)와 100% 에탄올로 침전시킨 뒤, 45 ㎕ 혼성화 용액으로 녹였다. 이 용액은 2분간 끓는 물에서 끓인 뒤, 상온에서 식히고 마이크로어레이 칩의 각각의 챔버에 넣고 60℃에서 8시간 동안 혼성화하였다. 혼성화가 끝난 뒤, DNA 칩을 1차 세정액 (2X SSC, 0.1% SDS)으로 60℃에서 5분간 세정하고, 2차 세정액 (1X SSC)으로 실온에서 3분간 세정한 후, 3차 세정액 (0.2X SSC)으로 실온에서 3분간 반응하고 원심 분리하여 건조시켰다.
스캔, 이미지 분석 및 분류
혼성화가 끝난 칩은 Axon Instruments GenePix 4100A scanner (Axon Instruments, Redwood City, CA)를 이용하여 5 ㎛의 해상도로 스캔을 하였으며, 스 캔한 이미지는 GenePix Pro 6.0 (Axon Instruments, Redwood City, CA) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 이미지 분석된 파일들은 MS excel 파일로 저장하였다. 각각의 미생물에 대한 분석 MS excel 파일들은 GeneSpring 7.2 (Silicon Genetics, Palo Alto, CA) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 사용된 알고리즘은 Pearson correlation에 기본을 두어 분석하였다.
실시예 1: 비교 유전체학을 통한 11개 식중독균에 대한 특이적인 프로브 선별 및 FBP -1의 제작
비교유전체학을 통하여 11개 식중독균에 특이적인 70-mer 올리고뉴클레오티드들을 선별하였으며, 그 과정이 표 3에 나타나 있다. 11개의 식중독균에서 총 275개의 70mer의 프로브들이 제작되었다. 이 프로브들은 슬라이드 글라스에 고정되었으며, 다양한 미생물의 게놈 DNA로부터 준비된 시료들과 반응하였다. 275개의 프로브들 중 최종적으로 110개의 프로브들(각각의 식중독균에 대하여 10개의 프로브)이 선발되었으며, 도 2와 같이 FBP-1이라고 명명한 마이크로어레이 칩을 제작하였다. 제작된 FBP-1은 총 8개의 블록으로 나누어져 있으며, 각각의 블록은 110개의 식중독균 특이적 프로브들이 2번씩 반복으로 찍혀있으며, 양성 대조군 및 음성 대조군이 찍혀 있다. 그러므로 제작된 FBP-1은 한 번의 실험으로 총 8개의 시료를 반응할 수 있으며, 각각의 블록은 12줄로서 각 줄은 20개의 스팟(10 개의 프로브)으로 이루어져 있다.
표 4. FBP-1의 구축을 위한 70-mer 올리고뉴클레오티드 프로브 서열.
Figure 112008038435230-PAT00001
Figure 112008038435230-PAT00002
Figure 112008038435230-PAT00003
Figure 112008038435230-PAT00004
Figure 112008038435230-PAT00005
식중독균들의 확보된 프로브 (70mer)를 이용하여 DNA 칩을 도 2와 같이 제작하였다. 각각의 식중독균에 대하여 10개씩의 70mer 프로브 (5'-아민 변형)를 제작하였으며, 제작된 프로브의 농도를 50uM로 맞추어서 아민-실란 코팅된 슬라이드 (corining) 위에 프린트하여 일차적으로 DNA 칩을 제작하였다.
제작된 DNA 칩은 식중독균 10 종류에 대한 특이적인 프로브들이 프린트되어 있으며, 인간에게 특이적으로 질병을 일으키는 S. typhi에 특이적인 프로브 10개를 프린트하여 총 110개의 스팟과 2개의 양성 대조군 스팟 및 2개의 음성 대조군 스팟을 포함하고 있다.
선별한 각 식중독균에 특이적인 프로브들과 실험결과를 토대로 하여 최종적으로 110개의 스팟 (각 식중독균에 대하여 10개씩의 특이적인 프로브를 선별하였음)이 찍혀있는 도 2와 같은 마이크로어레이 칩을 제작하였으며, FBP-1 (Food Borne Pathogen)이라고 명명하였다.
최종적으로 제작된 DNA 칩은 총 8개의 블록으로 이루어져 있으며, 각 블록은 110개의 프로브들이 두 번 반복으로 찍혀 있으며, 양성 대조군 및 음성 대조군 용으로 각각 식물에 존재하는 Tubulin beta-4 chain과 Actin 3 유전자의 서열을 사용하였다.
게놈 DNA는 Bioprime DNA labeling kit을 사용하였으며 Cy3로 표지하였다. 양성 대조군 DNA로는 식물체의 Tubulin beta-4 chain 유전자를 플라스미드 DNA에 삽입하여 사용하였다.
실시예 2: 엔테로박테리아(Enterobacteriae)에 속하는 식중독균들의 마이크로어레이 결과
Salmonella, Escherichia coli O157:H7 및 Yersinia enterocolitica 는 Enterobacteriae에 속해 있는 식중독균으로 알려져 있다. 이러한 식중독균들은 Enterobacteriae에 속하는 다른 미생물들과의 게놈 DNA 서열의 유사도가 높기 때문에 특이적인 검출이 힘든 것으로 알려져 있다. 최근에 Escherichia coli, Shigella 및 Salmonella 를 동정하기 위하여 gyrB 유전자로부터 제작된 10개의 프로브들이 평가되었다 (Kakinuma et al. 2003. Biotechnology and Bioengineering. 83: 721-728). 그러나 몇몇의 프로브들은 다른 종류의 미생물들과 반응하는 결과를 나타내었으며, 그러므로 Enterobacteriae 내에 속하는 미생물들과 구분할 수 있는 충분한 결과를 보여주지 못하였다. 본 발명에서는 Salmonella enterica serovar Typhimurium, Salmonella enterica serovar Typhi, Escherichia coli O157:H7 와 Yersinia enterocolitica에 특이적인 프로브들을 제시하였으며, 각각의 10개의 프로브들은 도 3과 같이 각각의 식중독균에 특이적인 것을 확인하였다. Salmonella enterica serovar Typhimurium은 도 3 (A, B, C)과 같이 10 개의 선별된 프로브에 특이적으로 반응하는 것을 확인하였다.
10개의 Salmonella enterica serovar Typhimurium 특이적인 프로브들 중 4개의 프로브는 포유동물이나 조류에 특이적으로 질병을 일으키는 것으로 알려진 Salmonella subspecies I 에 속하는 serovar들에도 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7, Salmonella serovar Choleraesuis, Enteritidis, Pullorum, Gallinarum, Paratyphi C and Paratyphi B). Salmonella subspecies I 에 속하는 않는 Salmonella의 경우에는 어떠한 프로브와도 반응하지 않는 것을 확인할 수 있었다. Salmonella serovar Typhi에 특이적인 프로브의 경우, Salmonella serovar Typhi ATCC 33459와 ATCC 6539가 도 3 과 도 7과 같이 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. Salmonella serovar Paratyphi A 는 인간에 특이적으로 질병을 일으키는 것으로 알려져 있는 균주로서 역시 serovar Typhi에 특이적인 프로브들 가운데 3개의 프로브와 반응하는 것을 확인할 수 있었으며 이는 기존에 보고되어진 것과 같이 serovar Typhi 와 Paratyphi A의 유전적인 형질이 가까운 것을 확인할 수 있는 결과였다(데이타 미제시). Yersinia enterocolitica ATCC 23715와 Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894의 경우에도 도 3 (G 및 E)과 같이 각각의 특이적인 프로브들과 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
특히, 도 3 (F) 및 도 7과 같이 비병원성 균인 Escherichia coli 들이 반응하지 않는 것을 확인함으로써, 본 발명에서 선별한 프로브들은 병원성의 Escherichia coli O157:H7 균주와 비병원성 Escherichia coli를 선별할 수 있는 능력을 갖고 있는 것을 확인할 수 있었다. Enterobacteriae에 속하는 다수의 비병원성 균들과 반응한 결과, 도 7과 같이 식중독균에 특이적인 것을 확인할 수 있었다.
E. coli O157 : H7: E. coli O157:H7 ATCC 43894의 대하여 특이적으로 반응하는 것으로 확인하였으며, 병원성을 갖지 않는 E. coli　 균주들에 대하여는 반응하지 않는 것을 확인하였다.
Salmonella typhimurium , Salmonella typhi : Salmonella typhimurium , Salmonella typhi에 대하여 특이적으로 반응하였으나, 다양한 Salmonella 균주들과 반응한 결과 Salmonella serovar에 따라 다양한 패턴의 마이크로어레이 실험결과가 나왔다.
장내 미생물에 해당하는 식중독균들에 대하여 실험을 수행한 결과, Salmonella typhimurium에 특이적인 프로브들은 Salmonella spp.에서 반응하는 것으로 확인할 수 있었으며, Salmonella typhi 에 특이적인 프로브들은 인간에 특이적으로 질병을 일으키는 것으로 알려져 있는 Salmonella typhi 및 paratyphi A에 특이적인 것을 확인할 수 있었다.
E. coli O157:H7에 특이적인 프로브들도 식중독균인 E. coli O157:H7에만 특이적인 것이 확인되었으며, 제작되어진 Yersinia enterocolitica의 프로브들도 특이적으로 반응하는 것으로 확인되었다.
음성 대조군 시료 DNA로 다양한 장내미생물들과 반응시킨 결과 제작된 DNA 칩은 비병원성 장내미생물 (비식중독균)에는 반응하지 않는 것을 확인하였다.
실시예 3: 바실랄레스(Bacillales)에 속하는 식중독균의 마이크로어레이 결과
Bacillales에 속하는 식중독균들에 대한 결과는 도 4와 같다. Staphylococcus aureus ATCC 25923는 도 4의 A 및 도 7와 같이 특이적인 결과를 나타내었다. Staphylococcus haemolyticus ATCC 29970와 Staphylococcus epidermis ATCC 14990도 FBP-1과 반응한 결과, 도 4 (B, C)와 같이 반응하지 않는 결과를 나타냄으로서 Staphylococcus aureus에서 제작된 10개의 프로브들은 Staphylococcus aureus 와 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. Listeria monocytogenes의 경우, 도 4 (D-G)와 도 7과 같이 총 7개의 Listeria monocytogenes 의 균주가 프로브들과 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었으며, 7개의 균주들의 반응 패턴 이 각각의 균주에 따라서 다른 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 L. monocytogenes 균주들 사이에서도 유전적인 형질이 다르다는 것을 의미한다. 일반적으로 동물에 대하여 병원성 균으로 알려졌으며 게놈 DNA 서열이 L. monocytogenes와 거의 비슷하다고 알려진 Listeria ivanovii도 도 4 와 도 7과 같이 10개의 프로브들과 반응하는 것을 확인할 수 있었다. Bacillus cereus 에 특이적으로 제작된 10개의 프로브들은 도 4 (H-K)와 같이 B. cereus ATCC 10778 및 ATCC 14579 뿐만 아니라 Bacillus anthracis ATCC 14578 와 Bacillus thuringiensis ATCC 10792 와도 반응하는 것을 확인하였다. 이 세 개의 균주들은 병원성 균인 Bacillus cereus 그룹으로 간주되고 있으며, 음성 대조군 균주로 반응했던 비병원성 균인 Bacillus subtilis와는 반응하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
Bacillus cereus : 총 3종의 Bacillus cereus 균주들에 대하여 특이적으로 발색하는 것을 확인하였으며, Bacillus subtilis , Bacillus thuringiensis의 균주들에 대하여는 발색하지 않았으므로 제작된 프로브가 특이적인 것으로 확인하였다.
Staphylococcus aureus : 보유하고 있는 5종의 Staphylococcus aureus에 대하여 반응하였으며, Stapylococcus haemolyticus, Stapylococcus epidermidis에 대하여는 반응하지 않는 것을 확인하였다.
Listeria monocytogenes : 총 7개의 Listeria monocytogenes 균주들과 Listeria ivanovi 등의 균주들과 실험한 결과로 Listeria monocytogenes ATCC 7644 및 ATCC 19113의 경우 10개의 스팟에서 모두 발색을 하였지만, ATCC 19111, ATCC 19114의 경우에는 각각 다른 패턴으로 발색하는 것을 확인하였다. Listeria welshimeri, Listeria inocua , Listeria grayi , Listeria seeligeri 의 대조구 균들은 발색하지 않는 것으로 확인되었다.
Staphylococcus aureus에 특이적으로 제작된 프로브들은 Staphylococcus aureus에만 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
Listeria의 경우는 제작된 10개의 프로브들에 대한 결과 패턴의 차이는 있으나 Listeria monocytogenes에 반응하는 것으로 확인되었으며, 병원성 균으로 알려진 Listeria ivanovi에도 반응하는 것을 확인할 수 있었다.
Bacillus cereus의 경우 대부분의 프로브들이 Bacillus cereus , Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis에만 특이적으로 반응하는 것을　확인하였다. 근래 들어 이 세 종의 미생물은 Bacillus cereus 그룹으로 간주되고 있으며 병원성균으로서 게놈 DNA의 유사도가 상당히 높은 것으로 알려져 있다.
실시예 4: 비브리오나시애(Vibrionaceae)에 속하는 식중독균에 대한 마이크로어레이 결과
Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802와 ATCC 33844는 FBP-1 과의 반응 결과, 도 5 와 도 7에 나타난 것과 같이 선별된 10개의 프로브와 특이적으로 반응하는 것을 확인할 수 있었다. 병원성 균으로 알려져 있는 Vibrio cholerae ATCC 14547 과 Vibrio vulnificus ATCC 33815는 프로브들과 반응하지 않았다.
Vibrio parahemolyticus : 3종의 Vibrio parahemolyticus에 대하여 특이적이었으며 Vibrio cholerae 및 Vibrio vulnificus에 대하여는 반응하지 않는 것을 확 인하였다.
실시예 5: Clostridium perfringens , Clostridium botulinum 및 Campylobacter jejuni 의 마이크로어레이 결과
Campylobacter spp.는 병원성 균으로 알려져 있으며 C. jejuni ATCC 33291 및 ATCC 43429를 반응한 결과, 도 6과 같이 특이적인 결과를 나타내었다. Clostridium botulinum과 Clostridium perfringens에서 특이적으로 제작한 각각 10 개의 프로브들도 C. botulinum ATCC 3502 및 C. perfringens ATCC 3624 와 반응한 결과 도 6과 같이 특이적인 결과를 나타내었다.
* Clostridium botulinum, Clostridium perfringens , Yersinia enterocolitica: 각각의 Clostridium botulinum ATCC 3502, Clostridium perfringens ATCC 3624, Yersinia enterocolitica ATCC 23715 에 대하여 특이적인 것을 확인하였다.
* Campylobacter jejuni: 총 2종의 Campylobacter jejuni ATCC 43429는 10개의 스팟이 발색하였으나 대조구에서는 그 발색 패턴이 다르게 나타났으므로 추가적인 프로브의 실험 및 Campylobacter jejuni 다양한 균주들과의 결과를 확인해야 한다.
* Clostridium perfringens, Clostridium botulinum , Camphylobacter jejuni에 대하여도 역시 특이적으로 반응한 결과를 확인하였다.
실시예 6: 다양한 미생물들의 게놈 DNA 들과의 마이크로어레이 결과
식중독균 및 비병원성 균들을 포함하여 총 69개의 미생물들을 FBP-1 칩과 반응을 하였으며 그 결과는 도 7과 같다. 본 발명에 사용된 균주들은 각각의 식중독균에 선별된 프로브들에 대하여 양성 및 음성 대조군 균주로서 FBP-1 칩과 반응하였다. 그 전체적인 결과는 도 7 에 나타나 있으며 본 발명에서 선별된 각 식중독균에 특이적인 프로브들과 제작된 FBP-1 칩이 식중독균을 구분할 수 있는 능력을 보유하였음을 확인하였다.
현재 일차적으로 제작된 마이크로어레이 칩에 대하여 확보해왔던 10종의 식중독 미생물들과 대조구 미생물들을 이용하여 게놈 DNA를 추출하였고 마이크로어레이 실험을 수행하여 제작된 대다수의 프로브들이 각각의 식중독균들에 특이적인 것을 확인하였다.
실험을 수행한 식중독균들은 각각의 특이적인 프로브와 반응하는 것을 확인할 수 있었으며 비식중독균들의 경우 본 발명에서 제작한 마이크로어레이 칩 (FBP-1)과 반응하지 않는 결과를 나타내었다. 본 dendrogram은 본 발명에서 제작된 마이크로어레이 칩 식중독균 및 병원성 균들에 특이적으로 반응함을 보여주었다.
도 1은 게놈 서열 및 비교 유전체학을 이용하여 11가지 식중독균으로부터 70-mer 올리고뉴클레오티드 프로브 선발의 작업 흐름도를 보여준다.
도 2는 Syto 61 테스트 후의 FBP-1 마이크로어레이의 레이아웃을 보여준다. 각 슬라이드는 8개의 블록으로 이루어져 있으며, 각 블록은 110개 프로브, 양성 대조군 및 음성 대조군으로 이중 스팟팅되어 있다.
도 3은 Enterobacteriae 식중독균의 마이크로어레이 결과이다.
A, Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585; B, serovar Typhimurium ATCC 13311; C, serovar Typhimurium ATCC 14028; D, Salmonella enterica serovar Typhi ATCC 33459; E, Escherichia coli O157:H7 ATCC 43894; F, E. coli ATCC 11775; G, Yersinia enterocolitica ATCC 23715.
도 4는 Bacillales 식중독균의 마이크로어레이 결과이다.
A, Staphylococcus aureus ATCC 25923; B, S. haemolyticus ATCC 29970; C, S. epidermis ATCC 14990; D, Listeria monocytogenes ATCC 19115; E, L. monocytogenes ATCC 19118; F, L. ivanovii ATCC 19119; G, L. inoccua ATCC 33090; H, Bacillus cereus ATCC 10778; I, B. cereus ATCC 14579; J, B. thuringensis ATCC 10792; K, B. antharacis ATCC 14578.
도 5는 Vibrionaceae 식중독균의 마이크로어레이 결과이다.
A, Vibrio parahaemolyticus ATCC 17802; B, V. parahaemolyticus ATCC 33844; C, V. cholerae ATCC 14547; D, V. vulnificus ATCC 33815.
도 6은 Clostridium perfringens, Clostridium botulinum 및 Campylobacter jejuni의 마이크로어레이 결과이다.
A, Clostridium perfringens ATCC 3624; B, Clostridium botulinum ATCC 3501; C, Camphylobacter jejuni ATCC 43429; D, C. jejuni ATCC 33291.
도 7은 Genespring 프로그램을 이용한 다양한 박테리아 게놈 DNA의 마이크로어레이 데이터 세트를 이용하여 분석된 계통수(dendrogram)이다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Oligonucleotide probe set for dectecting food-borne pathogens and microarray containing the probe set <130> PN08106 <160> 116 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC1312 probe <400> 1 tacacttcgc gttgtggcag aggttattaa gaagcgtgat gataaaaaaa tcattacgct 60 gcaaacaaac 70 <210> 2 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC1501 probe <400> 2 ttgcatgggg atcgcatatt acgattatgt tctctatatg tagggatgtt acaagcagag 60 ctgctagtca 70 <210> 3 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC1801 probe <400> 3 tttatcgtag tgaaaaatca cgtagttctc atactggtgg gaaaggaatg gggcttgcaa 60 tttcgaaaag 70 <210> 4 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC2098 probe <400> 4 tgaggagttt ttttcctcaa cgttatatgc acgtacgaaa caagattggg catatgcacc 60 aaacatgtat 70 <210> 5 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BC2140 probe <400> 5 ctccctttac 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<223> YE0013 probe <400> 75 ttttaactct ctttcgattt cttcgatctg ttcacagaga tagccataat gctgatgaag 60 tcgggtgagc 70 <210> 76 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YE0014 probe <400> 76 ttgcagatca aagacattct ttcagagaac ccggcagtct tcagtatttc ggtgccataa 60 tacataatca 70 <210> 77 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YE0015 probe <400> 77 gattgtcttg ccaactaatt gcttcaattg acaagatcgg ttgtagtgag ttttcatttg 60 gcgtgtatcc 70 <210> 78 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YE0016 probe <400> 78 tactcaaaaa aagaagtacc aaaaacctga ttaaaagcac aatgaccacg cacactgtcg 60 gcaactaaac 70 <210> 79 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YE0017 probe <400> 79 tcttcaacct gccttcacct tgcaagatcg agtttttgag gtttgtcagc agtctgatat 60 taatcttact 70 <210> 80 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> YE0020 probe <400> 80 tgatattgga aatgttgttc acccaacata aaagggagat tcagtgaagc ggtcaaatta 60 atcagtcggg 70 <210> 81 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z0146 probe <400> 81 agattgcgtc atggtatata ggtaccaatg accagccgtg gatcaacttt tacattgaca 60 atgactcttt 70 <210> 82 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z0152 probe <400> 82 ctgaagttca ggaactgaca ttagacgcag aaggtaaagg ccagtacgta tttaacgcat 60 cttacgttaa 70 <210> 83 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z0372 probe <400> 83 caataggtgg agtgacattt attcgtcgtc caacttttaa cgatcgcttc atcgtggaag 60 atggaaatac 70 <210> 84 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z0502 probe <400> 84 gatttcttca tccggatacg tatctgccga taaactgcac aaactctata agacaaattt 60 ggaagacgcg 70 <210> 85 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z1019 probe <400> 85 gtactgatac atacaaacag taaaagatct gttaacgcaa ttaactgatg gcatggagct 60 cttcgcgctg 70 <210> 86 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z1139 probe <400> 86 tgcattctgg ttctgtcagc actgataata tccttttggc tggatgttga ctctgttact 60 cgagtattac 70 <210> 87 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z1140 probe <400> 87 tatgttttta gttgtcgggg agacagcaag aagtcaaaac tatgctctga atggatattc 60 tcgtggtacc 70 <210> 88 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z1535 probe <400> 88 taggtcaaac tgaagatggt cggacagcgc ttattgagtt cggaaaaatt aatatgaccg 60 acacctattt 70 <210> 89 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z1543 probe <400> 89 gcgatcgttg gagtattcgc gggtttgaaa atagcgtagg tttgtcaggg aatgatggtt 60 tttatataaa 70 <210> 90 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Z1554 probe <400> 90 tttataaaaa ccagtaaccc ggaattgatt tgggtgacgg tggtattacc tattttgaca 60 gcaacaggtg 70 <210> 91 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STY0201 probe <400> 91 tgaaaagtag ttcgagcgcc cagatggtac tcaaacctaa cgactcaagc tcaatttata 60 aagataccac 70 <210> 92 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STY0322 probe <400> 92 acgatgttga tactatcggt tttcagggga aagggctatt tttttctgac agactgatcg 60 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<400> 104 tgatttaata ggcaaaaaaa gcgaagaata tgcattaaac tgggaaaaaa accgcctaat 60 cggtctcggc 70 <210> 105 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STM2761 probe <400> 105 taagcaagat tgagctgtta gagttagttc gacgtggacg tataaaattc gtcgcattcc 60 aaaatctcca 70 <210> 106 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STM2762 probe <400> 106 cgtagctaat acgaaaaaag aaacagaaaa aatcggagcg acgataaagg tagtgctagg 60 cgttttcgtt 70 <210> 107 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STM0654 probe <400> 107 ttattacatc ggaaaaggta tcaaacaaga ttaccagcag gcaatatact ggtttcgaaa 60 agcggcagac 70 <210> 108 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STM0762 probe <400> 108 tatgcaaaaa aagaacaact tgcatgctgc catgataccg gcacttgtat cgttataatg 60 gaaattggac 70 <210> 109 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STM0763 probe <400> 109 gcatttccga gagatttatc cagagatgga actctctctt gttgaagagg ggacttttgg 60 tttacatgat 70 <210> 110 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> STM0764 probe <400> 110 aaacaaccca gtcttgtttt ttcagcaacg catgctttgt ctttctcttt tgtaccgcat 60 ttgttaaaac 70 <210> 111 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tubulin bete-4 chain probe <400> 111 aagtccagtg tctgtgatat tgcaccaaag ggtttgaaaa tggcgtctac tttcattggt 60 aactcaacct 70 <210> 112 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actin 3 probe <400> 112 aggttcttta ccagccatct atgattggta tggagaatgc tggtatccat gaaaccacct 60 ataactccat 70 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin3-f primer <400> 113 ctcttgacta cgagcaggaa 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin3-r primer <400> 114 agtccttcct gatgtcgaca 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tb4-f primer <400> 115 aagaggttga cgagcagatg 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tb4-r primer <400> 116 gcctttctcc tgaacatagc 20

Claims (7)

  1. 서열번호 31 내지 40의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브;
    서열번호 41 내지 50의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브;
    서열번호 51 내지 60의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브; 및
    서열번호 61 내지 70의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 비브리오 파라해모리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브를 포함하는 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 31 내지 70의 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 식중독균 검출용 올리고뉴클레오티드 프로브 세트.
  3. 제1항 또는 제2항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이.
  4. 시료의 게놈 DNA를 제1항 또는 제2항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트와 접촉시켜 상기 시료 중의 표적 서열과 프로브 서열을 혼성화시키는 단계; 및
    상기 프로브와 시료 중의 표적 서열 사이의 혼성화 정도를 검출하는 단계를 포함하는 식중독균을 검출하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 표적 서열은 검출 가능한 표지 물질로 표지되어 있는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 프로브 세트는 마이크로어레이의 기판 상에 고정화되어 있는 것인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프로브 세트를 포함하는 식중독균 검출 키트.
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102426233A (zh) * 2011-11-15 2012-04-25 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 液相芯片检测空肠弯曲菌的方法
CN102507949A (zh) * 2011-11-15 2012-06-20 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法
KR101222907B1 (ko) * 2010-09-08 2013-01-16 고려대학교 산학협력단 여시니아 엔테로콜리티카 랜덤 지노믹 ｄｎａ 단편을 이용한 유전자 칩

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR100611056B1 (ko) 2002-12-16 2006-08-10 학교법인 포항공과대학교 병원성 미생물 검출을 위한 올리고뉴클레오티드마이크로칩 및 이를 이용한 병원성 미생물 검출방법
JP2006166912A (ja) 2004-11-19 2006-06-29 Hokkaido Univ 培養併用インサイチューハイブリダイゼーション法により生きている食中毒細菌及び衛生指標細菌群を迅速かつ特異的に計数するための遺伝子プローブ及びその方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101222907B1 (ko) * 2010-09-08 2013-01-16 고려대학교 산학협력단 여시니아 엔테로콜리티카 랜덤 지노믹 ｄｎａ 단편을 이용한 유전자 칩
CN102426233A (zh) * 2011-11-15 2012-04-25 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 液相芯片检测空肠弯曲菌的方法
CN102507949A (zh) * 2011-11-15 2012-06-20 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法
CN102426233B (zh) * 2011-11-15 2013-12-04 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 液相芯片检测空肠弯曲菌的方法
CN102507949B (zh) * 2011-11-15 2013-12-25 吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心 液相芯片检测金黄色葡萄球菌的方法

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