KR20100083593A - 병원성균의 동시 검출 방법 - Google Patents
병원성균의 동시 검출 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20100083593A KR20100083593A KR1020090003053A KR20090003053A KR20100083593A KR 20100083593 A KR20100083593 A KR 20100083593A KR 1020090003053 A KR1020090003053 A KR 1020090003053A KR 20090003053 A KR20090003053 A KR 20090003053A KR 20100083593 A KR20100083593 A KR 20100083593A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- primer
- seq
- staphylococcus aureus
- salmonella enterica
- sta
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title abstract description 6
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 claims abstract description 55
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims abstract description 54
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 claims abstract description 30
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 claims abstract description 18
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 claims description 24
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 19
- 208000019331 Foodborne disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 206010016952 Food poisoning Diseases 0.000 abstract description 9
- 101150114988 invA gene Proteins 0.000 abstract description 6
- 101150021331 toxR gene Proteins 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 102100032240 Thyrotropin-releasing hormone receptor Human genes 0.000 description 3
- 101710202151 Thyrotropin-releasing hormone receptor Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 101150058663 TRH gene Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 108700022487 rRNA Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 101150058720 tdh gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 241000193755 Bacillus cereus Species 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/42—Salmonella
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/44—Staphylococcus
- C12R2001/445—Staphylococcus aureus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/63—Vibrio
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 다중 검출할 수 있는 다중 PCR 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 다중 PCR 방법은 스타필로코커스 아우레우스 23S rRNA 부분 유전자 482bp, 비브리오 파라해몰리티쿠스 toxR 유전자 368bp, 살모넬라 엔테리카 invA 유전자 284 bp의 PCR 산물을 특이적으로 증폭시켜 한 번에 3종류의 식중독 균을 검출할 수 있는 효과가 있다.
스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 엔테리카, 다중 PCR
Description
본 발명은 병원성균의 동시 검출 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 다중 검출할 수 있는 다중 PCR 방법에 관한 것이다.
사람이 오염된 화학적 독소 혹은 자연적 독소를 섭취함으로써 발생하는 질병을 식중독이라 하는데 국내 식중독 사고는 1990년 대비 2006년에 환자수 618명에서 10,833명으로 16년 사이 17배가 증가하였으며, 식중독 사고 1건 당 환자의 발생 비율도 41명으로 약 2.16배가 증가 하였다. 또한 단체 급식의 증가와 외식산업의 발달로 식중독 발생건당 그 규모가 커지고 발생건수에서도 증감을 반복하며 지속적으로 발생하고 있다. 이에 따라 먹거리에 대한 국민의 불안감이 고조되고 건강한 삶의 영위를 위해 식품으로부터 오는 위해를 사전에 예방 하거나 최소화하여 식품의 안전에 대한 확보의 중요성이 높아졌다.
식중독은 화학적 독소 또는 자연적 독소에 의해 발병되는 질병으로 식품에 오염된 병원성 세균들에 의한 것이 대부분이다. 이에 따라 식품으로부터 병원성 세균을 검출하고자하는 노력들이 시도 되었으며, 식품의 병원성 세균 검출법은 생화학적 특성을 이용한 전통적 분석방법에서부터 최근에는 분자생물학적 방법까지 다양하게 개발되어졌다. 전통적 분석방법은 노동집약적이며 검사를 위한 소요 시간이 많이 들어 최근의 식품으로부터 병원성 세균의 검출은 분자생물학적 방법이 각광받고 있다. 분자생물학 중심으로 연구된 병원성 세균 검출법을 살펴보면, 우선 항체를 이용하여 균주의 특이적 항원을 측정하는 면역학적 방법으로는 면역크로마토그래피, 면역리포좀 등이 개발 되었다. 또한 유전학적 방법으로는 일반적으로 PCR을 이용하여 균주의 특정 DNA 서열을 증폭시켜 진단하는 것으로 대상 유전자들은 주로 병원균주의 독소유전자나 병원균에서 발현하는 고유 단백질 유전자, 원시핵 세포의 게놈 상에 간헐적으로 분산되어 있는 반복적인 DNA 서열, 16S rRNA 유전자 등을 사용한 연구도 있다. 그 외에도 김 등은 변패원인균인 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 검출할 수 있는 비표지 면역센서 개발하여 병원균 검출에 있어 바이오센서의 적용도 시도하였다.
그러나 상기와 같이 개발된 검출법은 시장에 상용화가 활성화 되지 않은 상태이며, 시장에서는 검출결과의 정확성 및 검출 비용의 절감과 같은 요구가 지속적으로 이루어지고 있다.
따라서 본 발명에서는 식중독의 발생의 주요 원인균으로 보고되어지고 있는 살모넬라균과 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 국내 수산물에 의한 위장염의 30%를 차지하고 있는 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)를 동시에 검출하여 검사 시간을 단축하고 비용을 절감할 수 있는 다중 PCR 시스템을 구성하여 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 PCR 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적은 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카로부터 템플릿 DNA를 제작하고, 상기 DNA 검출을 위한 최적 구성의 프라이머 세트를 선정한 후, 이들을 섞어 다중 PCR을 수행하여 상기 세 균주를 한번에 검출할 수 있음을 확인함으로써 달성되었다.
본 발명은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 동시에 검출할 수 있는 다중 PCR 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다중 PCR 방법은,
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로부터 각각 템플릿 DNA를 제작하는 단계;
하기 1) 내지 3)의 프라이머 세트를 선정하는 단계;
1) 서열번호 1의 STA-5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 세트,
2) 서열번호 3의 TOX-F 프라이머와 서열번호 4의 TOX-R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머 세트,
3) 서열번호 5의 139 프라이머와 서열번호 6의 141 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출용 프라미어 세트
상기 템플릿 DNA와 프라이머세트를 이용하여 다중 PCR을 수행하는 단계; 및
상기 PCR 산물로부터 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 단계로 이루어진다.
또한 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 1의 STA-5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 3의 TOX-F 프라이머와 서열번호 4의 TOX-R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠 스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 5의 139 프라이머와 서열번호 6의 141 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카 검출용 프라미어 세트를 제공한다.
또한 본 발명은
1) 서열번호 1의 STA-5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 세트,
2) 서열번호 3의 TOX-F 프라이머와 서열번호 4의 TOX-R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스 검출용 프라이머 세트 및
3) 서열번호 5의 139 프라이머와 서열번호 6의 141 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카 검출용 프라미어 세트
를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 및 다중 PCR 방법은 스타필로코커스 아우레우스 23S rRNA 부분 유전자 482bp, 비브리오 파라해몰리티쿠스 toxR 유전자 368bp, 살모넬라 엔테리카 invA 유전자 284 bp의 PCR 산물을 특이적으로 증폭시켜 한 번에 3종류의 식중독 균을 검출할 수 있는 효과가 있다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
본 실시예에 이용된 균주인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)외 9종의 균주는 모두 한국생명공학연구원에서 구입하여 사용하였으며, 배양 배지 및 배양조건은 하기 표 1과 같다.
<표 1>
병원성 세균 및 배지
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)를 다중검출 할 수 있는 다중 PCR 시스템 확립을 위한 PCR 분석시 사용하는 템플릿 DNA를 준비하기 위해 각 병원균의 진탕배양액을 1 mL씩 취하여 10,000 rpm으로 원심분리한 후 상층액을 제거하고 회수한 펠릿을 1 mL로 멸균 증류수로 현탁시키고, 이를 자동핵산추출기(Biorad)를 사용하여 전체 DNA를 정제하였다.
PCR반응 혼합액은 상기에서 정제한 전체 DNA(25 ng)을 주형, 2×PCR 프리믹 스(솔젠트사), 25 pmol 각 프라이머 1 의 혼합액에 증류를 최종 25 가 되도록 첨가하여 iQ5 (Biorad사)를 이용하여 증폭시켰다. PCR 산물은 브롬화 에티디움(5 /mL)을 첨가한 1% 아가로스겔에서 TAE 완충액을 이용하여 전기영동한 후 트랜스일루미네이터(transilluminator)로 확인하였다.
식중독의 원인균인 살모넬라 엔테리카, 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스를 검출 할 수 있는 프라이머는 하기 표 2와 같다. 살모넬라 엔테리카는 284 bp의 PCR 산물인 invA를 증폭시킬 수 있는 139/141 프라이머 세트를 사용하였다. 비브리오 파라해몰리티쿠스는 독소 유전자인 gyr B(285 bp), tdh(199 bp), trh(250 bp), toxR(368 bp)을 증폭시킬 수 있는 GYRB-F/GYRB-R, TDH-F/TDH-R, TRH-F/TRH-R, TOX-F/TOX-R 프라이머 세트를 사용하였다. 스타필로코커스 아우레우스의 STA-5F/STA-5R 프라이머 세트는 23S rRNA 유전자의 특이적 부분을 증폭시킬 수 있는 유전자로 본 발명에서 신규로 디자인 하였으며. 이러한 프라이머는 바이오니아사에 합성을 의뢰하여 본 연구에 이용하였다.
<표 2>
올리고뉴클레오타이드 프라이머 서열
실시예 1 : 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카 검출 특이적 프라이머 선정
식중독의 원인균인 살모넬라 엔테리카, 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스를 검출 할 수 있는 프라이머 세트 선정을 위해 표 2와 같은 프라이머 세트를 선정하여 변성 95℃ 1분, 결합 60℃ 30초, 증폭 72℃ 30초의 순서로 30 사이클을 반복하여 PCR 증폭을 수행 하였다.
그 결과, 비브리오 파라해몰리티쿠스는 GYRB-F와 GYRB-R, TDH-F와 TDH-R, TRH-F와 TRH-R, TOX-F와 TOX-R 각 프라이머 쌍, 살모넬라 엔테리카는 139와 141 프라이머를 이용하여 PCR 증폭한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 살모넬라 엔테리카는 139/141 프라이머 세트에 의해 invA 유전자로부터 284 bp의 PCR 산물을 증폭시켰다. 비브리오 파라해몰리티쿠스는 GYRB-F/GYRB-R 프라이머 세트 경우 285 bp, TOX-F/TOX-R에서 368 bp, TDH-F/TDH-R 199bp의 PCR산물을 증폭시켰으나, TRH-F/TRH-R 프라이머 세트에 의한 trh 유전자 증폭은 검출되지 않았다.
실시예 2 : 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카의 결합 온도범위 조사
차후 다중 실시간 PCR시 살모넬라 엔테리카, 비브리오 파라해몰리티쿠스도 동시 같은 결합 온도에서 특이적 유전자를 증폭시켜야 한다. 따라서 상기 실시예 1을 통해 유전자들을 증폭시킨 프라이머 세트의 결합 온도범위를 조사하였다. 이때 상기 프라이머 세트 중 비브리오 파라해몰리티쿠스의 프라이머 세트인 TDH-F/TDH-R의 경우 타겟 유전자인 tdh 유전자의 증폭이 미약하여 이를 제외하였으며, 결합 온도범위는 52.6-63℃까지로 설정하여 구배 PCR을 수행하였다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 비브리오 파라해몰리티쿠스는 GYRB-F/GYRB-R 프라이머 세트, TOX-F/TOX-R 세트에 의해 모든 온도의 범위에서 gyr B 및 toxR를 증폭 시켰으며, 살모넬라 엔테리카도 139/141 프라이머 세트에 의해 284 bp의 invA 유전자를 증폭시켰다.
실시예 3 : 스타필로코커스 아우레우스 검출 특이적 프라이머 선정
스타필로코커스 아우레우스의 검출을 위한 프라이머 세트는 타깃 유전자를 23S rRNA로 하여 상동성이 없는 부분을 중심으로 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 엔테리카의 프라이머 세트에 의한 PCR 산물의 크기가 280-370bp인 것을 감안하여 500 bp미만 400bp이상의 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머인 STA-5F(5‘TGGATTGCACGTCTAAGCAG)과 STA-5R (5‘TTACCC GACAAGGAATTTCG)를 프라이머로 합성하였다. 이때 PCR 결합 온도는 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 엔테리카의 검출 프라이머 세트들이 결합 온도가 52.6-63℃까지 광범위 한 것을 감안하여 잘못된 결합으로 PCR 증폭이 되어 오판정 결과를 나오는 것을 미연에 방지하고자 다소 높은 온도인 62℃로 하여 PCR 증폭을 수행하였다.
그 결과, 변성 95℃ 1분, 결합 62℃ 30초, 증폭 72℃ 30초의 순서로 30 사이클을 반복하여 PCR 증폭시켜 도 3에 나타낸 바와 같이 498 bp의 23 S rRNA의 특이적 부위를 증폭을 확인 할 수 있었다.
실시예 4 : 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 엔테리카 및 스타필로코커스 아우레우스의 동시검출을 위한 프라이머 세트 구성
상기 결과를 토대로 스타필로코커스 아우레우스의 23S rRNA 유전자로부터 489 bp의 DNA 산물을 증폭시킬 수 있는 STA-5F/STA-5R 프라이머, 살모넬라 엔테리카의 invA 유전자를 증폭시킬 수 있는 139/141 프라이머를 각 병원균 검출을 위한 검출 프라이머 세트로 선정하였다. 또한 비브리오 파라해몰리티쿠스의 경우는 차후 다중 PCR 검출 시에서 전기영동을 통해 스타필로코커스 아우레우스와 살모넬라 엔테리카와 구별이 되어야 함으로 스타필로코커스 아우레우스와 살모넬라 엔테리카의 PCR산물의 중간 크기의 DNA 산물인 368 bp의 toxR 유전자를 타겟 유전자로 선정하고 이를 증폭을 위해 TOX-F/TOX-R을 프라이머를 이용하기로 결정하였으며(표 3 참조), 동시 검출을 위한 다중 PCR 수행조건은 표 4로 구성하였다.
또한 선별을 통해 특이적으로 PCR 되어진 유전자 산물은 T-벡터에 클로닝하여 그 유전자들을 확보하였으며, 해당 유전자 산물은 염기서열 분석을 통하여 선별하고자 하였던 균주의 유전자임을 확인하였다.
<표 3>
실시간 다중 PCR에 대한 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카의 프라이머 및 타겟 유전자
<표 4>
PCR 조건
실시예 5 : 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 엔테리카 및 스타필로코커스 아우레우스 검출 프라이머 세트의 특이성
스타필로코커스 아우레우스의 STA-5F/STA-5R 프라이머, 살모넬라 엔테리카의 139/141 프라이머, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 TOX-F/TOX-R의 각 프라이머 세트들은 각 균주 간 뿐만 아니라 타 병원성균주의 DNA에서 PCR 증폭이 일어나지 않아야 한다. 따라서 우선 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 엔테리카, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 각 프라이머 세트를 이용하여 교차하여 상기의 multiplex PCR 조건으로 PCR 증폭을 수행한 결과, STA-5F/STA-5R 프라이머, TOX-F/TOX-R 프라이머, 139/141 프라이머는 각 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 엔테리카, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 DNA에 대해서 교차반응이 일어나지 않음을 확인하였으여 다중 PCR을 통해 동시 검출시 각 균주에 대한 검출이 가능함을 알 수 있었으며, 선별된 프라이머의 특이성을 나타내었다(도 4 참조).
또한 선정된 프라이머 세트들을 가지고 타 병원성 균주인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus KCTC 1012), 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes KCTC 3569), 에스케치리아 콜리(Escherichia coli KCTC 2593), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris KCTC 2433), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis KCTC 1917), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes KCTC 3096) 칸디다 알비칸스(Candida albicans KCTC7965)을 대상으로 다중 PCR 조건으로 PCR 증폭을 수행하였다(도 5 참조).
표 5에 나타낸 바와 같이, STA-5F/STA-5R 프라이머를 이용한 스타필로코커스 에피더미디스(S. epidermidis KCTC 1917)의 DNA에서 PCR시 증폭에 의한 DNA 단편이 나타났으며, 이를 제외하고는 프라이머에 의한 PCR 증폭은 나타나지 않았다. 스타 필로코커스 에피더미디스에서의 PCR 증폭은 STA-5F/STA-5R 프라이머가 스타필로코커스 아우레우스의 23 S rRNA를 기초로 하여 디자인 된 것이므로 스타필로코커스 에피더미디스와 스타필로코커스 아우레우스가 같은 종이므로 유사성이 높아 증폭이 된 것으로 이는 STA-5F/STA-5R 프라이머가 단지 스타필로코커스 아우레우스의 검출 뿐만 아니라 스타필로코커스 속의 검출도 가능할 수 있을 것으로 사료된다.
따라서 STA-5F/STA-5R 프라이머 외에 TOX-F/TOX-R 프라이머, 139/141 프라이머도 같은 종에 대한 교차반응을 확인을 위한 추가 연구되어져야 할 것이다.
스타필로코커스 아우레우스의 STA-5F/STA-5R 프라이머, 살모넬라 엔테리카의 139/141 프라이머, 비브리오 파라해몰리티쿠스의 TOX-F/TOX-R 프라이머의 각 균주간 타 병원성 균주간의 교차반응을 조사한 결과, 같은 종을 제외하고는 모두들 비특이적인 PCR 증폭은 나타나지 않았으므로 STA-5F/STA-5R 프라이머, 139/141 프라이머, TOX-F/TOX-R 프라이머 세트들은 각 균주의 검출을 위한 특이적 프라이머임을 확인 할 수 있어 다중 PCR로 동시 검출 시 정확성이 높을 것으로 사료되어진다.
<표 5>
다양한 세균 균주에서 특이 유전자의 단일 PCR 검출
1STA-5F(정방향)/STA-5R(역방향) 프라이머, 2TOX-F/TOX-R, 3139/141
실시예 6 : 비브리오 파라해몰리티쿠스, 살모넬라 엔테리카, 스타필로코커스 아우레우스의 PCR 검출법
TOX-F/TOX-R 프라이머, STA-5F/STA-5R 프라이머 및 139/141 프라이머는 각각의 균주에 대해서 교차반응이 일어나지 않음을 상기 실험에서 확인하였으며, 스타 필로코커스 아우레우스, 살모넬라 엔테리카, 비브리오 파라해몰리티쿠스 DNA가 혼합된 상태에서도 특이적으로 해당되는 템플릿 DNA에 결합되어 정상적 PCR반응을 수행하여 검출을 할 수 있는지, 여러 종류의 프라이머들이 PCR 수행 중 서로 반응을 일으키지 않는지와 특이성을 유지하는 지에 대해 알아보고자 다중 PCR을 수행하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 함께 첨가되어진 다중 PCR 검출법을 위해 선정된 TOX-F/TOX-R, STA-5F/STA-5R, 139/141의 3종류 프라이머들은 각 해당하는 템플릿 DNA와 동시에 PCR을 하여도 상호 프라이머 간의 비특이적 반응하지 않았으며, 해당 유전자에 정확히 결합하여 특이적으로 해당 PCR 산물을 증폭시킴을 볼 수 있었다. 또한 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 엔테리카, 비브리오 파라해몰리티쿠스 DNA에 해당 프라이머를 반응 시켰을 시 각 균주간의 DNA간 비특이적 작용 없이 프라이머는 정상적인 PCR 반응을 수행하여 각각의 PCR 산물을 증폭시킴을 볼 수 있었다. 최종적으로 한 처리구에서 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 엔테리카, 비브리오 파라해몰리티쿠스 DNA와 TOX-F/TOX-R, STA-5F/STA-5R, 139/141의 프라이머를 섞어 다중 PCR을 수행하였을 시, 스타필로코커스 아우레우스 23S rRNA 부분 유전자 482bp, 비브리오 파라해몰리티쿠스 toxR 유전자 368bp, 살모넬라 엔테리카 invA 유전자 284 bp의 PCR 산물을 특이적으로 증폭 시켜 한 번에 3종류의 식중독 균을 검출을 확인 할 수 있었다.
도 1은 다양한 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 생성된 PCR 분획의 아가로스겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 다양한 프라이머를 이용한 구배 PCR 증폭에 의해 생성된 PCR 분획의 아가로스겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 STA-5F/STA-5R 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭에 의해 생성된 PCR 분획의 아가로스겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 STA-5F/STA-5R, 139/141 및 TOX-F/TOX-R 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 생성된 PCR 분획의 아가로스겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 STA-5F/STA-5R, 139/141 및 TOX-F/TOX-R 프라이머를 이용한 PCR 증폭에 의해 생성된 PCR 분획의 아가로스겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 STA-5F/STA-5R, 139/141 및 TOX-F/TOX-R 프라이머를 이용한 다중 PCR 증폭에 의해 생성된 특이 PCR 분획의 아가로스겔 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
<110> DAEGU TECHNO PARK
<120> A method for simultaneous detecting bacteria
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer STA-5F for amplifying Staphylococcus aureus
<400> 1
tggattgcac gtctaagcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer STA-5R for amplifying Staphylococcus aureus
<400> 2
ttacccgaca aggaatttcg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer TOX-F for amplifying Vibrio parahaemolyticus
<400> 3
gtcttctgac gcaatcgttg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer TOX-F for amplifying Vibrio parahaemolyticus
<400> 4
atacgagtgg ttgctgtcat g 21
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Forward primer 139 for amplifying Salmonella enterica
<400> 5
gtgaaattat cgccacgttc gggcaa 26
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Reverse primer 141 for amplifying Salmonella enterica
<400> 6
tcatcgcacc gtcaaaggaa cc 22
Claims (5)
- 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)로부터 각각 템플릿 DNA를 제작하는 단계;하기 1) 내지 3)의 프라이머 세트를 선정하는 단계;1) 서열번호 1의 STA-5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 세트,2) 서열번호 3의 TOX-F 프라이머와 서열번호 4의 TOX-R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머 세트,3) 서열번호 5의 139 프라이머와 서열번호 6의 141 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 검출용 프라미어 세트상기 템플릿 DNA와 프라이머세트를 이용하여 다중 PCR을 수행하는 단계; 및상기 PCR 산물로부터 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 단계로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법.
- 제1항에 따른 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 1의 STA- 5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 따른 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 3의 TOX-F 프라이머와 서열번호 4의 TOX-R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스 검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 따른 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시에 검출하는 다중 PCR 방법에 사용되는 서열번호 5의 139 프라이머와 서열번호 6의 141 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카 검출용 프라미어 세트.
- 1) 서열번호 1의 STA-5F 프라이머와 서열번호 2의 STA-5R 프라이머로 구성된 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 세트,2) 서열번호 3의 TOX-F 프라이머와 서열번호 4의 TOX-R 프라이머로 구성된 비브리오 파라해몰리티쿠스 검출용 프라이머 세트 및3) 서열번호 5의 139 프라이머와 서열번호 6의 141 프라이머로 구성된 살모넬라 엔테리카 검출용 프라미어 세트를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스, 비브리오 파라해몰리티쿠스 및 살모넬라 엔테리카를 동시 검출용 키트.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090003053A KR20100083593A (ko) | 2009-01-14 | 2009-01-14 | 병원성균의 동시 검출 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020090003053A KR20100083593A (ko) | 2009-01-14 | 2009-01-14 | 병원성균의 동시 검출 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20100083593A true KR20100083593A (ko) | 2010-07-22 |
Family
ID=42643313
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020090003053A Ceased KR20100083593A (ko) | 2009-01-14 | 2009-01-14 | 병원성균의 동시 검출 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20100083593A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200065546A (ko) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 건국대학교 산학협력단 | 와이셀라 시바리아 jw15 균주를 포함하는 세균성 장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 |
-
2009
- 2009-01-14 KR KR1020090003053A patent/KR20100083593A/ko not_active Ceased
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20200065546A (ko) * | 2018-11-30 | 2020-06-09 | 건국대학교 산학협력단 | 와이셀라 시바리아 jw15 균주를 포함하는 세균성 장질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Salasia et al. | Genotypic characterization of Staphylococcus aureus isolated from bovines, humans, and food in Indonesia | |
| JP2010537650A (ja) | 細菌及び真菌の検出方法 | |
| Schmid et al. | Nucleic acid-based, cultivation-independent detection of Listeria spp. and genotypes of L. monocytogenes | |
| Stäuble et al. | Molecular genetic analysis of Dichelobacter nodosus proteases AprV2/B2, AprV5/B5 and BprV/B in clinical material from European sheep flocks | |
| CA2087006C (fr) | Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires | |
| Wainø et al. | Identification of campylobacteria isolated from Danish broilers by phenotypic tests and species‐specific PCR assays | |
| JP2007117022A (ja) | リステリア・モノサイトゲネス検出のためのプライマーセットおよび方法 | |
| Sharma et al. | Advances and applications of molecular cloning in clinical microbiology | |
| KR20130097974A (ko) | 황색포도상구균의 분자적 동정을 위한 프라이머 및 이를 이용한 황색포도상구균 동정 방법 | |
| CN111020039B (zh) | 空肠弯曲杆菌种特异性分子靶标及其快速检测方法 | |
| CA2718214A1 (en) | Detection of bacteria belonging to the genus campylobacter by targeting cytolethal distending toxin | |
| KR20100083593A (ko) | 병원성균의 동시 검출 방법 | |
| CA2203933C (fr) | Sequences nucleotidiques hybridant specifiquement avec une sequence nucleique genomique de campylobacter | |
| JP2015213439A (ja) | エンテロトキシンｂ、ｃ、ｄ又はｅ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌又は該遺伝子の検出のためのｌａｍｐ用プライマー及びこれを用いたエンテロトキシンｂ、ｃ、ｄ又はｅ遺伝子を有する黄色ブドウ球菌又は該遺伝子の検出法 | |
| JP4336814B2 (ja) | ジンクフィンガー蛋白質を用いる標的核酸の検出方法 | |
| KR20160011511A (ko) | 대장균 o157:h7에 특이적으로 결합하는 단일가닥 dna 압타머 및 그 제조방법 | |
| Hsieh et al. | Identification Leptospira santarosai serovar shermani specific sequences by suppression subtractive hybridization | |
| CN110923349B (zh) | 小肠结肠炎耶尔森氏菌的种特异性检测分子标签3283、3316及其快速检测方法 | |
| Bakhteyari et al. | Cloning and expression of Com1 and OmpH genes of Coxiella burnetii in Periplasmic Compartment of Escherichia coli with the Aim of recombinant subunit vaccine production | |
| JP2007159533A (ja) | ウエルシュ菌検出用プライマーおよび方法 | |
| JP2008005779A (ja) | ラクトバチルス・ブレビス検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 | |
| JP2007189980A (ja) | 黄色ブドウ球菌検出のためのプライマーおよびそれを用いた検出法 | |
| KR101932531B1 (ko) | Lamp를 이용한 장구균 검출용 프라이머 및 그 용도 | |
| KR101919190B1 (ko) | 미생물의 ２ 단계 분석 방법 | |
| KR100966015B1 (ko) | 식중독 병원균의 동시 검출용 프라이머 및 이의 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20090114 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20110218 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20110826 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20110218 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |