KR20110042026A

KR20110042026A - 저혈당증의 치료 및 검출을 위한 분석 및 방법

Info

Publication number: KR20110042026A
Application number: KR1020107022650A
Authority: KR
Inventors: 퍼-올로프 베르그렌; 알렉산드로 카이세도; 오버 카브레라
Original assignee: 유니버시티 오브 마이애미
Priority date: 2008-03-12
Filing date: 2009-03-12
Publication date: 2011-04-22
Also published as: EP2254568A2; EP2254568A4; CN101990431B; JP5597555B2; US20150105436A1; WO2009114718A3; JP2014073133A; US20110021584A1; US20130217738A1; US8466185B2; EP2254568B1; JP2011513500A; WO2009114718A2; CN101990431A

Abstract

글루카콘 분비의 조절을 위한 방법 및 저혈당증의 치료 방법 및 저혈당증의 치료를 위한 약물 후보 스크리닝 방법. 본 방법들은 진성 당뇨병의 치료 및 잠재적 효능을 위한 약물 후보의 스크리닝에 유용하다.

Description

저혈당증의 치료 및 검출을 위한 분석 및 방법{METHODS AND ASSAYS FOR DETECTING AND TREATING HYPOGLYCEMIA}

정부 권리에 관한 진술

본 발명은 승인 번호 MO1RR16587, 1R01-DK55347-IU42RR016603의 정부의 지원으로 이루어졌으며, NIH에 의해 수여되었다. 미합중국의 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.

혈당 항상성은 췌장의 내분비부, 랑게르한스섬(islets of Langerhans) 내의 각종 세포 타입으로부터 췌장 호르몬의 조화로운 분비에 의해 제어된다. 췌장 β 및 α-세포로부터 인슐린 및 글루카콘의 분비는 각각, 영양소와 자가분비(autocrine), 파라크린(paracrine) 및 신경 신호에 의해 조절된다. 인슐린 분비에 관련된 분자성 메카니즘이 상대적으로 잘 이해되고 있는 반면, 이들 글루카곤 분비의 조절은 그만큼 명백하지 않다. 예컨대, 연구자들은 현재 정상 조건 하에서 우세한 혈당 농도의 비교적 적은 변화에 후속적으로 글루카곤이 어떻게 그토록 효과적으로 분비될 수 있는지를 연구하고 있다.

α-세포로부터의 글루카곤의 분비는 혈당 농도가 감소하는 경우 증가하나(엉걸(Unger), 1985; 죠우(Zhou) 등, 2004), α-세포에 작용하여 글루카곤 분비를 유도하는 기저의 분자성 메카니즘은 공지되지 않았다. 높은 글루코스 수준이 α-세포 상에 직접적으로 작용하여 글루카곤 분비를 억제한다는 것이 제안되었다(고펠(Gopel) 등, 2000; 엉걸, 1985). 이것은 연장된 세포막 탈분극화에 의해 불활성화되는 뉴런-유사 작용 포텐셜의 발생에 기여하는 α-세포 내의 전압-감응성 Na⁺ 채널의 선택적 발현에 의해서 기계적으로 설명된 바 있다(고펠 등, 2000). 본 모델에 따르면, 이들 Na⁺ 채널의 불활성화은 글루코스 수준이 높은 때 α-세포 활성을 억제한다.

그러나 다른 연구에서 글루코스가 β-세포 내의 자극-분비 커플링을 반영하는 메카니즘에 의해 α-세포를 활성화시킨다는 것, 즉, 글루코스가 α-세포와 β-세포를 유사하게 자극한다는 것을 보였다(올슨(Olsen) 등, 2005; 웬트(Wendt) 등, 2004). 따라서, 글루코스 농도 그 자체의 변화보다는 억제 파라크린(paracrine) 신호, 예컨대, 인슐린, GABA 및 Zn² ⁺가 β-세포로부터 분비되는 것이 글루카곤 분비의 직접적인 조절에 관계된다고 제안되었다(프랭클린(Franklin) 등, 2005; 그로마다(Gromada) 등, 2007; 이시하라(Ishihara) 등, 2003; 키사누키(Kisanuki) 등, 1995; 라비에르 및 루터(Ravier and Rutter), 2005; 롤스만(Rorsman) 등, 1989).

그러나, 억제 파라크린 신호의 경감은 글루코스 농도의 상대적으로 적은 감소가 글루카곤 분비를 어떻게 그렇게 효과적으로 촉진시키는지 완전히 설명하지 못한다. 글루타메이트, 중추 신경계 내의 주된 흥분성 신경전달물질이 관심받는데, 이는 대부분의 다른 신호와 달리, 이는 췌도 내의 글루카곤 분비를 억제하는 것이 아니고, 자극할 수 있기 때문이다(버트란드 등(Bertrand et al.), 1993; 하야시 등(Hayashi et al.), 2003c) 소포 내로의 글루타메이트 흡수를 용이하게 하는 소포성 글루타메이트 수송체들은 α-세포에 의해 발현되고(하야시 등(Hayashi et al.), 2001) 글루타메이트는 글루카곤과 함께 분비된다(하야시 등, 2003c).

설치류 모델에서의 연구는 췌도 내의 글루타메이트 신호에서 거대 복잡성을 나타내었다(모리야마와 하야시, 2003). 문헌 내의 결과는 상반되었고, 글루타메이트의 역할이 일정 범위까지 불가사의하게 남았다. 예를 들어, 글루타메이트가 친이온성 글루타메이트 수용체(iGluR)를 통해서 자극(버트란드 등, 1993)하며, 이것이 대사성 글루타메이트 수용체(mGluR)를 통해 글루카곤 분비를 억제(우에하라 등(Uehara et al.), 2004)하고, 이것이 β-세포 내의 mGluR 및 iGluR을 활성화하여 인슐린 분비를 증가시킨다고 보고되었다(버트란드 등, 1992; 버트란드 등, 1995; 스토르토 등(Storto et al.), 2006).

본 발명자들은 글루타메이트의 역할을 명확히 하고 이 발견에 기초하여 분석법 및 방법을 개발하였다. 또한, 본 발명자들은 α-세포가 완전한 글루카곤 반응을 생산해내기 위해서 양성 피드백 루프를 필요로 한다는 것을 발견하였다.

본 출원은 본원에 참고문헌으로 도입된 2008.3.12에 출원된 미국 가특허출원 제61/064,564호에 기초하여 우선권을 주장한다.

본원에서 설명된 발명은 글루카곤 분비의 제어와 검출 및 저혈당증의 치료를 위한 분석 및 방법에 관한다. 일부 실시태양에서, 이러한 방법들은 당뇨병을 치료하고 검출하는데 사용된다.

따라서, 친이온성 글루타메이트 수용체를 활성화시켜 글루카곤 분비를 자극하는 화합물의 유효량을 치료가 필요한 대상에 투여하는 것을 포함하는 저혈당증의 치료 방법을 제공하는 것이 하나의 목적이다.

일 실시태양에서, 본 화합물은 이 효과를 글루타메이트 수용체 서브유닛 GluR6을 활성화시킴에 의해서 달성한다.

친이온성 글루타메이트 수용체는, 예컨대, AMPA/카이네이트 타입 수용체일 수 있다.

치료 방법에서 효과적일 것으로 예상되는 화합물의 예는 카이네이트, AMPA, 및 (2S,4R)-4-메틸글루탐산, (RS)-2-아미노-3-(4-클로로-3-히드록시-5-이속사졸릴)프로피온산, 4,6-비스(벤조일아미노)-1,3-벤젠디카르복실산, (±)-4-(4-아미노페닐)-1,2-디히드로-1-메틸-2-프로필칼바모일-6,7-메틸렌디옥시프탈라진, 1-(4'-아미노페닐)-3,5-디히드로-7,8-디메톡시-4H-2,3-벤조디아제핀-4-온, 1,4-디히드로-6-(1H-이미다졸-1-일)-7-니트로-2,3-퀴녹살린디온 히드로클로라이드, GABA, 비쿠쿨린, 인슐린이다.

바람직한 일 실시태양에서, 화합물은 글루타메이트 유사체이다.

용어 "글루타메이트 유사체"는 예컨대, 글루타메이트와 구조적으로 충분히 유사하여 글루타메이트 수용체에 결합하여 글루타메이트와 유사한 효과를 낼 수 있는 임의의 화합물을 포함하도록 의도된다.

일반적으로, 투여되는 유효 용량은 약 5 mg/kg/일 내지 약 200 mg/kg/일 것으로 예상된다. 그러나, 유효 용량은 과다한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다.

바람직한 실시태양에서, 저혈당증은 진성 당뇨병과 연관된다. 따라서, 1 형 또는 2 형 당뇨병의 치료 방법이 제공된다.

친이온성 글루타메이트 수용체를 활성화시켜서 저혈당증의 치료를 위한 제약의 제조의 제조에서 글루카곤 분비를 자극하는 화합물의 사용 또한 제공된다.

친이온성 글루타메이트 수용체의 글루타메이트 수용체 서브유닛 GluR6를 활성화하여 글루카곤 분비를 자극하는 화합물을 투여하는 것을 포함하는 글루카곤 분비의 자극 방법을 제공하는 것 또한 하나의 목적이다. 예컨대, 친이온성 글루타메이트 수용체는 AMPA/카이네이트 타입 수용체일 수 있다. 유용할 것으로 기대되는 화합물의 예시는 카이네이트, AMPA, GABA 및 인슐린을 포함한다. 바람직한 실시태양에서, 화합물은 글루타메이트 유사체이다. 약 5 mg/kg/일 내지 약 200 mg/kg/일의 용량이 효과적일 것으로 기대된다. 그러나, 유효 용량은 과도한 실험없이 당업자에 의해 결정될 수 있다.

췌도 세포를 2 군으로 제공하여, 여기에서 제1 군은 대조군이고 제2 군에는 존재하는 β 세포를 파괴하기에 충분한 용량의 스트렙토조토신을 투여하는 것; 시험 화합물을 제1 및 제2 군 모두에 투여하는 것; 및 제1 및 제2 군에서 글루카곤 분비의 강화를 측정하여 시험 화합물의 효과를 결정하며, 여기에서 감소된 세포질 칼슘 동원 및/또는 글루카곤 분비는 조절자로서 유용한 화합물을 지시하는 것을 포함하는 당뇨병의 치료에 유용한 조절자의 시험관 내 스크리닝을 위한 분석법을 제공하는 것 또한 하나의 목적이다. 본 방법이 생체 내 사용을 위한 안전성 및 효능을 위해 추가적으로 시험될 화합물을 식별하는데 유용하다는 것이 당업자에게 이해될 것이다.

도 1 a-f는 인간 췌도 내의 친이온성 글루타메이트 수용체의 활성화가 글루카곤 분비를 유도하는 것의 예를 보인다. 도 1(a)는 CNQX (10 μM)에 의해 차단될 수 있는 글루타메이트 유도된 글루카콘 반응을 보인다. 카이네이트 및 AMPA(모두 100 μM) 또한 강한 글루카곤 분비를 끌어낸다. 도 1(b)는 도 1(a) (n = 5 췌도 제제)에 나타난 결과의 정량화를 보인다. 도 1(c)는 대사성 글루타메이트 수용체 길항제 CPPG(100 μM)가 글루타메이트-유도된 글루카곤 반응에 영향을 미치지 않음을 보인다. 대사성 글루타메이트 수용체 작용제 tACPD (100 μM) 및 ACPT-1 (100 μM)는 글루카곤 분비에서의 변화를 끌어내지 않는다. 도 1(d)는 c(n = 3 췌도 제제)에 나타난 결과의 정량화를 보인다. 도 1(e)는 인슐린 분비가 높은 글루코스(11 mM, 11 G)에 의해서 유도되었으나, 카이네이트(6 개의 췌도 제제의 대표)에 의해서는 그렇지 않았음을 보인다. 도 1(f)는 글루타메이트가 인간 췌도 (n = 4 췌도 제제)에서 농도-의존성 [Ca² ⁺]_i 반응을 이끌어냄을 보인다. 자료는 곡선-적합화되었다(힐 방정식(Hill equation)). 모든 도면 내의 결과는 평균± s.e.m.으로 나타낸다.
도 2 a-b는 인간 췌장의 췌도 내의 α-세포가 AMPA/카이네이트 타입의 기능적인 친이온성 글루타메이트 수용체(iGluR)를 발현하는 예를 보인다. 도 2(a)는 인간 췌도 세포 내에 분산된 3G, 11G 및 글루타메이트에 반응하는 [Ca² ⁺]_i를 나타내는 세개의 순차적인 영상(맨 위)를 보인다(슈도칼라(pseudocolor) 규격). 최하단 좌측 영상은 글루카곤(녹색) 및 인슐린(적색) 항체염색을 보인다. 글루카곤 면역반응성 세포 2 및 3은 글루타메이트에 반응했지만, 11G에 반응하지 않았다. 인슐린 면역반응성 세포 1 및 4는 11G에 반응했지만 글루타메이트에 반응하지 않았다. 이들 세포들의 [Ca² ⁺]_i 반응의 흔적이 최하단 오른쪽에 보인다. 화살표는 영상을 찍은 시점을 나타낸다. 흔적 아래의 바는 자극 적용을 나타낸다. 규격 바 = 50 ㎛. 1 mM 글루코스(1G), 3 mM 글루코스(3G) 및 11 mM 글루코스(11G). 결과는 4 인간 췌도 제제를 나타낸다. 도 2(b)는 인간(적색 상징) 및 원숭이 췌도(흑색 상징)으로부터의 각각의 α-세포(좌측) 및 β-세포(우측)의 유전자 발현 프로파일을 보인다. 각각의 줄은 단일 세포를 나타내고, 각각의 열은 상이한 글루타메이트 수용체 유전자를 나타낸다. 상징(흑색 또는 적색 색칠한 원)은 RT-PCR 생성물이 검출되었다는 것을 표시한다.
도 3 a-c는 카이네이트에 대한 α-세포 반응이 전압-의존성 Ca² ⁺ 채널을 통한 Ca² ⁺ 유입을 요구한다는 것을 보인다. 도 3(a)는 iGluR의 활성화가 인간 췌도 세포 내의 내부 전류를 끌어내는 것을 보인다. 카이네이트(100 μM)에 의해 유발된 전체-세포 전류를 나타낸다(최상단 좌측 패널). 이들 전류의 진폭을 네 개의 세포에 대해 평균을 냈다(우측 패널). 카이네이트-유발 전류는 AMPA/카이네이트 수용체 길항제 NBQX (10 μM)에 의해 차단될 수 있다. 고정 전류 = -70 mV. 전류 흔적 위의 바는 카이네이트 적용을 나타낸다. 도 3(b)는 카이네이트(100 μM)가 세포 외 Ca² ⁺의 부재(0 Ca² ⁺+ 1 mM EGTA) 하에 폐기되고 Ca² ⁺채널 차단제 La³ ⁺ (100 μM) 또는 특이적 Ca² ⁺채널 억제제 니모디핀(10 μM), 코노톡신 GVIA (1 μM), 아가톡신 IVA (0.1 μM) 및 미베프라딜(mibefradil)의 조합물의 존재 하에 강하게 감손된 글루카곤 분비에서 큰 증가를 자극(좌측 상의 반응)했다는 것을 입증하는 주변융합(perifusion) 분석법을 보인다. 평균 흔적을 나타내었다(± s.e.m., n = 3 인간 췌도 제제). 화살표는 새로운 용액으로의 전환을 나타낸다. 도 3(c)는 카이네이트에 대한 [Ca² ⁺]_i 반응이 공칭 0 Ca² ⁺에서 폐기되는 것을 보이는 평균 흔적(± s.e.m., n = 9 세포; 3 개의 원숭이 췌도 제제)를 보인다. (d) 카이네이트에 대한 [Ca²⁺]_i 반응이 CNQX(10 μM, n= 7 세포) 및 Ca² ⁺ 채널 차단제 La³ ⁺(30 μM, n = 14 세포) 및 니페디핀(10 μM, n = 18 세포; 스튜던트의 t-시험, P < 0.05)에 의해 억제되었다. 카이네이트에 대한 [Ca² ⁺]_i 반응(340/380 형광 방출비에서의 변화)의 피크 진폭의 평균± s.e.m. 을 나타내었다. 세 마리의 별개의 원숭이 췌도 제제로부터의 자료이다.
도 4 a-d는 자극된 영장류 α-세포 내의 글루타메이트 분비의 예시를 보인다. 도 4(a)는 췌도를 포함하는 원숭이 췌장 절편의 공초점 영상을 보인다. 도면은 글루카곤과 동시-국소화(colocalize) 되지만 인슐린 항체염색성은 아닌 소포성 글루타메이트 수송체 1(vGluT1)의 면역 반응성을 또한 보인다. 결과는 3 개의 인간 췌장을 나타낸다. 도 4(b)는 형광 효소 분석법을 사용하여 글루타메이트 분비를 검출한 실험에서의 췌도의 대표 영상을 보인다. 본 분석법에서, 분비된 글루타메이트는 형광 생성물 레조루핀(resorufin)을 발생시키는 효소성 쇄 반응에서의 기질이다. 레조루핀 형광물질은 컬러-코딩되었다; 낮은(청색; 레스트(rest)) 것에서 높은(황색; 카이네이트) 것으로의 증가는 카이네이트에 대한 반응으로 증가된 글루타메이트 분비를 나타낸다. 효소 글루타메이트 옥시다제(-GO; 최하단 패널)의 부재에서 형광 증가는 거의 없거나 없었다. 도 4(c) 및 (d)는 효소 글루타메이트 옥시다제(-GO)의 부재 하에, 카이네이트 및 KCl의 적용이 레조루핀 형광을 증가시키지 않는 것을 보인다. 낮은 글루코스(1 mM, 1G; P = 0.005), 카이네이트 (100 μM, 카인(kain); P < 0.001), 및 KCl (30 mM; P < 0.001) 탈분극은 GO 없는 카이네이트에 비교하여 췌도로부터 현저한 글루타메이트 분비를 유도하였지만 높은 글루코스(11 mM, 11G; P = 0.289)는 그렇지 않았다(-GO; n = 3 원숭이 췌도 제제; 일 방향(one way) ANOVA 후에 다중 비교 과정, 스튜던트-뉴만-케울스(Student-Newman-Keuls) 방법). 규격 바 = A에서 20 ㎛ 및 B에서 50 ㎛. 임의 단위(a.u.).
도 5는 효과적인 글루카곤 분비에 필요한 자극성 자가분비 글루타메이트 피드백 루프의 예를 보인다. 도 5(a)는 글루카곤-감응성 바이오센서(biosensor) 세포를 사용한 실시간 췌도 글루카곤 분비를 측정하기 위한 실험적인 접근법의 도시를 보인다. 도 5(b)는 개개의 글루카곤 바이오센서 세포 내에서의 [Ca² ⁺]_i 반응에 의해 측정된, 외인성 글루타메이트가 인간 췌도로부터 글루카곤 분비를 이끌어내는 것을 보인다(좌측 패널의 흔적). 인간 췌도의 부재 하에서 글루카곤 바이오센서 세포 내에서 아무 반응도 보이지 않았다(우측 패널의 흔적). 도 5(c) 및 (d)는 바이오센서 세포 내에서의 [Ca² ⁺]_i 반응에 의해 측정된 글루코스 농도의 6 mM에서 1 mM로의 저하에 의해 글루카곤 분비가 유도되었음을 보인다(n- 당해 6 영역). 헹굼은 바이오센서 세포 내의 [Ca² ⁺]_i의 갑작스러운 감소를 유발했다. AMPA/카이네이트 iGluR 길항제 CNQX (10 μM)는 글루카곤 분비를 54 %로 감소(글루코스 농도의 감소 후 8 분 후 측정; n = 3 췌도 제제, 스튜던트의 t-시험, P = 0.042)시키는 글루코스의 효과를 현저히 억제했다.
도 6 a-d는 영장류 췌도의 그것에 유사한 생쥐 췌도 내의 글루타메이트 신호의 예를 보인다. 도 6(a)는 DNQX (10 μM)(좌측; n = 6 주변융합)에 의해 차단되었던 글루카곤 분비를, 글루타메이트(100 μM)가 자극하는 것을 보인 생쥐 췌도의 주변융합 분석법을 보인다. 카이네이트 및 AMPA(모두 100 μM)도 글루카곤 분비를 또한 자극한다(우측; n = 3 주변융합). 도 6(b)는 대사성 글루타메이트 수용체 작용제 tACPD (100 μM) 및 ACPT-1 (100 μM)이 글루카곤 분비의 변화를 이끌어내지 않았음을 보인다(좌측). 대사성 글루타메이트 수용체 길항제 CPPG (100 μM)는 글루타메이트-유도된 글루카곤 반응에 영향을 주지 않았다(우측; n = 3 주변융합). 도 6(c)는 대사성 글루타메이트 수용체 mGluR4가 결핍된 생쥐들로부터의 췌도 내의 글루타메이트 (100 μM)에 대한 글루카곤 반응이 대조군 생쥐들로부터의 췌도의 그것과 상이하지 않았음을 보인다(n =1군 당 4 췌도 제제). 도 6(d)는 인슐린 분비가 높은 글루코스(11 mM, 11G)에 의해 유도되나 카이네이트(좌측), AMPA, 또는 글루타메이트(우측)에 의해서는 그렇지 않음을 보인다. 나타난 실험들은 대표적인 3 개의 췌도 제제들이다.
도 7 a-d는 글루카곤 분비를 자극하기 위한 iGluR의 생체 내 활성화의 예를 보인다. 도 7(a)는 글루타메이트(30 mg/kg; i.p.; n = 7 생쥐) 또는 AMPA (15 mg/kg, n = 8 생쥐)로 전신적으로 처리된 생쥐가 증가된 혈장 글루카곤 농도(좌측; ANOVA, P < 0.05)를 나타냄을 보인다. 혈장 인슐린 농도는 변하지 않았다(중간). AMPA 주입 30 분 후, 생쥐는 증가된 혈장 글루코스 농도를 보였다(우측; 색칠한 기호, n = 8 생쥐, 스튜던트의 t-시험, P < 0.05). 안이 비어있는 기호 = PBS-주입된 생쥐(n = 4). 도 7(b)는 ~3 mM 혈당 농도로 일정한 저혈당성 자극을 제공하기 위한 과인슐린성-저혈당성 클램프(좌측)가 인슐린 주입(중간)으로 유도된 것을 보인다. 저혈당증에 대한 반응인 글루카곤 분비는 식염수-주입된 생쥐(흑색 기호; n = 3; 반복된 측정 ANOVA, P < 0.05)에 비교하여 NBQX 주입 (10 mg/kg; 적색 기호, n = 7) 후에 생쥐 안에서 현저히 약화되었다. 바는 약물 주입을 지시한다. 도 7(c)는 약물 주입 후에 저혈당증을 유지하기에 필요한 글루코스 주입 속도가 식염수-처리된 생쥐(흑색 바; n = 3; 스튜던트의 t-시험, P < 0.05)보다 NBQX-처리된 생쥐(적색 바; n = 7)에서 현저히 컸음을 보인다. 도 7(d)는 글루카곤 분비의 조절을 위해 제안된 모델을 보인다. α-세포의 활성화는 최초 자극과 양성 피드백에 의존한다. 글루코스 수준이 떨어지면, β-세포-유래된 GABA, Zn² ⁺ 또는 인슐린(=최초 자극)으로부터의 더 적은 억제가 있다. 글루타메이트에 의한 양성 피드백은 글루카곤 분비를 강하게 증폭시킨다. 글루코스 수준이 일단 증가하면, 글루카곤 분비는 인슐린, Zn² ⁺, GABA 또는 이 셋의 조합에 의해 억제된다. 글루타메이트 피드백 없이는, α-세포는 완전히 활성화되지 않고 글루카곤 분비는 부족해진다.
도 8은 AMPA/카이네이트 수용체 (GluR6)의 서브유닛 6이 결핍된 생쥐 상의 글루코스 상대(counter)-조절을 평가하기 위해 수행한 인슐린 내용성 검사(ITT)의 예를 보인다. 두 군 모두의 생쥐들에 t=0:00에서 인슐린을 주입하여 저혈당증을 유도하였다. GluR6가 결핍된 생쥐는 야생형 생쥐보다 저혈당으로 더 빠르고 더 깊게 진행되었으며, 이는 이 서브유닛의 존재는 글루코스 상대-조절 동안 중요하다는 것을 나타낸다. GluR6가 결핍된 생쥐가 억제된 시간(-2:00)부터 그들에 인슐린이 주입된 시간(0:00)까지, 혈당의 증가가 있었다는 것을 주목하라. 이 효과는 이 수준의 글루코스에서, 글루코스 상대-조절의 메카니즘이 가동적이지 않기 때문에, 글루코스 상대-조절에 독립적일 가능성이 높다. 특히, 글루코스 편위 곡선의 기울기에 의해 나타내어지는 바와 같이, GluR6가 결핍된 생쥐는 저혈당증으로 더 빨리 진행했다. 인슐린 투여 45 분 후, 생쥐는 노골적인 저혈당 상태로 들어섰고, 바로 이 시점이 글루코스 상대-조절의 메카니즘이 시작되어 정상 혈당 수준을 재설정하기 위해 작용하는 시점이다. GluR6가 결핍된 생쥐 및 야생형 생쥐 내에서, 혈당 수준은 45 분 후에 감소가 계속되었으나, 야생형 생쥐 내의 혈당은 1:45 후에 빠르게 회복되었고, 이는 인슐린 투여 후 3 시간에서 GluR6가 결핍된 생쥐보다 현저하게 더 높은 수준으로 그러했다. 에러 바는 n = 8 (야생형 생쥐) 및 n = 10 (GluR6가 결핍된 생쥐)의 평균의 표준오차를 나타낸다.
도 9는 글루타메이트에 의한 글루카곤 분비 강화가 β 세포의 부재 하에, 모델들이 당뇨병인 상황에서 감소되는 예를 보인다. 이 실험은 생쥐 췌도로 수행되었다. 두 개의 샘플을 병렬("a" 및 "b")로 주변융합하였다. "a" (청색 곡선 및 청색 바) 안에서는 스트렙토조토신으로 β 세포를 선택적으로 파괴하였으나, "b" (적색 곡선 및 적색 바) 안에서는 그렇지 않았다. 이러한 β 세포의 부재는 시험관 내에서 1형 당뇨병-유사 상태를 발생한다. 패널 "A" 내의 글루카곤 분비 프로파일은 이 모델을 사용하여 획득하였다. β 세포의 부재 하에서, 카이네이트는 글루카곤 분비를 강화시킴에 있어서, β 세포의 존재에서만큼 효과적이지 않다(패널 "B"에서 정량화). 비특이적 자극 알지닌이 β 세포의 부재 하에서 기능적으로 손상된 α-세포를 분별해내지 못함을 주목하라. 이들 자료는 카이네이트에 의한 감소된 글루카곤 분비의 강화가 1형 당뇨병에서의 저혈당증 동안의 글루카곤 분비의 결핍에 연관될 수 있다는 것을 보인다.
t=5 분에서, 두 샘플 모두는 5 분간 1OOμM 카이네이트로 자극되었다. 글루코스는 10 분간 11 mM로 증가되었고, 주변융합의 기간 동안 3 mM로 다시 감소되었다. t=45 분에서, 두 샘플(ν) 모두는 5 mM 알지닌으로 자극되었다. 카이네이트-유도된 글루카곤 분비 반응의 진폭은 55 % 감소하였다. 알지닌-유도된 글루카곤 분비 반응의 진폭은 통계학적으로 상이하지 않았다. 카이네이트는 대사성이 아니고, 따라서 바람직한 AMPA/카이네이트 수용체의 작용제인 글루타메이트 유사체이다. 에러 바는 n = 3 주변융합에 대한 표준 편차를 나타낸다. 비교는 독립적인 t-시험에 의해 수행되었다.

췌장의 알파 세포로부터의 글루카곤 분비는 글루코스 항상성 및 생명을 위협하는 저혈당증을 피하는데 있어서 중요하다. 본 발명자들은 글루타메이트가 글루카곤 분비에서 양성 자가분비 신호임을 입증하였다. 본원에 보인 바와 같이, 본 발명자들은 인간 및 생쥐 알파 세포가 이온에 투과성인 막 채널을 형성하는 글루타메이트를 위한 수용체(친이온성 글루타메이트 수용체)를 발현함을 또한 입증하였다. 글루타메이트에 의한 이들 수용체의 활성화는 글루카곤 분비를 야기한다. 이 결과는 또한 알파 세포에서의 글루타메이트 신호의 중요한 성분의 하나가 글루타메이트 수용체 서브유닛 GluR6라는 것도 보인다. 이들 조사는 글루타메이트 수용체 서브유닛 GluR6가 글루코스 상대조절에 기여하며, 이것을 저혈당증의 치료 및 예방을 위한 적절한 약리학적 표적으로 만든다는 것을 보였다.

게다가, 본 방법은 당뇨병을 가진 사람의 치료에도 적용가능하다. 당뇨병을 가진 개인에서, 글루코스 상대조절은 손상되어있다. 이는 혈당의 변화에 대한 알파 세포 응답성의 결핍에 기인된다고 여겨지나, 메카니즘은 공지되지 않았다. 그러나, 본원에 개시된 바와 같이, 기능적인 베타 세포의 부재에서(1형 당뇨병의 경우에서와 같이), 글루타메이트 신호는 손상되어, 덜 효율적인 글루카곤 분비를 야기한다.

글루코스 항상성의 중요한 특징은 췌장의 α-세포로부터의 효과적인 글루카곤 분비이다. 글루카곤 분비를 조절하는 분자성 메카니즘은 여전히 잘 이해되고 있지 않다. 우리는 이제 인간 α-세포가 글루카곤 분비에 필수적인 친이온성 글루타메이트 수용체(iGluR)을 발현한다는 것을 입증한다. 글루코스 농도를 저하시킨 결과로서, 글루타메이트가 α-세포로부터 분비된다. 그 후, 글루타메이트는 AMPA/카이네이트 타입의 iGluR 상에 작용하고, 막 탈분극화, 전압-개폐 Ca² ⁺ 채널의 개방, 세포질 자유 Ca² ⁺ 농도의 증가 및 증강된 글루카곤 분비를 야기한다. 생체 내 iGluR의 봉쇄는 생쥐 안에서 글루카곤 분비를 감소시키고 인슐린-유도된 저혈당증을 악화시킨다. 따라서, 글루타메이트 자가분비 피드백 루프는 α-세포에 그것이 원래 가지는 분비 활성을 효과적으로 강화시키는 능력을 부여한다. 이것은 생리학적 조건 하에서 혈당 농도의 비교적 적은 변화에도 불구하고 적절한 글루카곤 분비를 보증하기 위한 전제조건이다.

개시된 결과는 인간 췌도에서 글루카곤 분비에 대한 양성 피드백을 제공하는 α-세포 내의 진실된 자가분비 신호 분자로서의 글루타메이트를 규명한다. 예컨대, 글루타메이트가 α-세포에 의해 분비되고, β-세포가 아닌 α-세포가 AMPA/카이네이트 타입의 iGluR을 발현한다는 것이 보여진다. α-세포 유래된 글루타메이트에 의한 이들 수용체의 활성화는 α-세포 기능의 양성 피드백을 발생시키고, 글루카곤 분비를 증폭시킨다. 이러한 신규한 자가분비 신호 통로는 혈당 농도의 적은 감소가 어떻게 췌장의 α-세포로부터 글루카곤 분비를 효과적으로 유도할 수 있는지 설명할 수 있다.

글루타메이트가 글루카곤 분비에 양성 피드백을 제공하는 것을 입증하는 하기의 본원의 결과는 글루타메이트가 글루카곤 분비를 자극하는 것을 보이는 연구(버트란드 등, 1993)와 일치하지만, 글루타메이트의 효과는 억제성이고, mGluR4 수용체에 의해 중재된다는 것을 시사하는 일부 보고(모리야마 및 하야시, 2003)와는 대조적이다. 글루타메이트는 우리의 모든 생리학적 실험(예컨대, [Ca² ⁺]_i 영상화, 동적 호르몬 분비 분석법 및 생체 내 혈장 글루카곤 검출)에서 흥분성이었고, 반응은 AMPA/카이네이트 수용체 길항제에 의해 차단될 수 있었으며, 이는 iGluR을 거친 글루카곤 분비의 자극이 글루타메이트 자가분비 피드백 루프의 우세한 효과임을 나타낸다. 대사성 글루타메이트 수용체를 위한 작용제 및 길항제가 글루카곤 분비에 영향을 미치지 않는다는 우리의 발견은 이들 수용체들이 인간 α-세포에서 글루타메이트 신호에 연관되지 않음을 입증한다. 글루타메이트에 대한 글루카곤의 반응이 mGluR4 수용체가 결핍된 생쥐에서 바뀌지 않았기 때문에, 우리는 나아가서 이 수용체가 전에 시사된 바와 같이(우에하라 등, 2004) 글루타메이트에 대한 α-세포 반응에 기여하지 않을 가능성이 높다고 결론지었다.

AMPA 수용체 서브유닛 GluR2 및 GluR3을 인식하는 항체를 이용한 췌도 세포 항체염색은 특이적이지 않으며, 즉, 항체의 펩티드 사전흡착(preadsorption)에 의해 차단될 수 없었다. 인슐린 분비 상의 글루타메이트 수용체 리간드의 약한 효과 및 이전 연구에서의 글루타메이트-반응성 β-세포의 낮은 발생 정도 때문에, 작가들은 인슐린 분비의 조절에서 주된 기능적인 역할을 글루타메이트 수용체에 돌리는 것에 주의를 기울였다(몰나르 등, 1995). 이것은 β-세포가 iGluR을 발현하지 않음을 보여주는 우리의 단일 세포 RT-PCR 결과와 긴밀히 연결된다. β-세포 활성 및 인슐린 분비가 글루타메이트 수용체 작용제로 자극될 수 없다는 것을 보여주는 우리의 발견은 또한 글루타메이트 신호 및 특히, iGluR이 인슐린 분비의 조절에 직접적으로 연관되지 않음을 나타낸다.

파라크린 또는 자가분비 신호에 유의미하기 위해서, 글루타메이트는 생리학적 자극에 대한 반응으로 췌도 세포로부터 분비되어야 한다. 설치류 췌도를 사용한 연구는 α-세포가 분비성 소포 내로 글루타메이트 흡수를 용이하게 하는 소포성 글루타메이트 수송체를 발현한다는 것(하야시 등, 2001c)과 글루타메이트가 글루카곤 분비성 입제 내에 존재하고 글루카곤과 함께-분비된다는 것(하야시 등, 2003)을 보였다. 본 연구에서, 우리는 인간 및 원숭이 α-세포가 소포성 글루타메이트 수송체 vGluT1을 발현함을 발견했다. 본 발명자들은 α-세포의 특이적 자극에 대한 반응인 글루타메이트 분비를 검출하여, α-세포가 영장류 췌도 내의 글루타메이트의 주된 공급원임을 확인하였다. 비록 뉴런 또는 신경 터미널도 또한 글루타메이트를 분비할 수 있지만, 발명자들의 결과는 신경성 요소를 함유하지 않는 배양된 분리된 췌도를 사용하여 얻어졌다(칼쏜(Karlsson) 등, 1997도 참고하라).

본 발명자들이 α-세포가 글루타메이트를 분비한다는 것을 발견했기 때문에, 그리고 iGluR이 α-세포에서 배타적으로 발현되기 때문에, 글루타메이트는 자가분비 신호 분자로 여겨진다. iGluR의 차단이 글루코스 농도의 저하에 대한 글루카곤 반응을 약화시킨다는 것(도 5 참조)을 보여주는 우리의 결과는 글루타메이트가 내생적으로 분비되는 것을 나타내고, 글루타메이트 신호가 양성 자가분비 피드백 루프를 제공한다는 것을 확증시켜준다.

양성 피드백을 갖는 자가분비 루프의 개념은 또한 α-세포가 어떻게 혈장 글루코스 농도의 저하에 적절하게 반응하는지 설명하는데 도움을 준다. 생쥐 안에서 저혈당성 클램프를 사용함으로써, 우리는 생체 내 글루카곤 분비를 자극하고 글루카곤 반응이 iGluR의 약리학전 차단에 의해 현저히 약화된다는 것을 밝혀냈다. 이들 생쥐 안에서, 저혈당증은 악화되었고, 이는 글루코스 상대조절의 내용 상 완전한 글루카곤 반응을 위해서 iGluR이 활성화될 필요가 있다는 것을 나타냈다. 우리는 간접적으로 α-세포에 영향을 줄 수도 있는 중추신경 및 말초신경 상에 글루타메이트가 가질 수 있는 어떠한 추가적인 효과도 배제하지 못한 반면, 우리의 시험관 내 자료는 α-세포가 글루타메이트에 대한 주된 직접 표적이라는 것과 췌도 내(intraislet) 글루타메이트 신호가 신경 입력에 독립적으로 작용할 수 있다는 것을 입증했다. 따라서, 이들 결과는 글루타메이트 자가분비 피드백 루프가 α-세포에서 활성화되어 글루카곤 분비를 강화한다는 것을 입증한다.

우리는 이제 적어도 부분적으로 글루카곤 분비가 어떻게 인간 췌장의 췌도 내에서 효과적으로 조절될 수 있는지를 설명하는 모델을 제기한다(도 7d). 혈당 농도의 저하가 있는 경우, α-세포 상의 β-세포의 음성 파라크린 영향은 감소한다('스위치-오프(Switch-off) 가설; (크라이어 등, 2003; 호프 등, 2004; 조우 등, 2004). 이 단계에서 글루코스 농도는 억제하기에 너무 낮지만(맥도날드 등, 2007; 맥도날드 및 롤스맨, 2007), 여전히 부분적인 글루카곤 분비 및 동시 글루카곤 분비를 작동시키기에 충분히 높고(올슨 등, 2005), α-세포 분비성 활성을 강화시키는 iGluR을 통한 양성 피드백 루프를 발생시킨다. 이는 iGluR의 약리학적 차단이 생체 내에서 인슐린-유도된 저혈당증을 악화시키고 글루카곤 분비를 감소시킴을 보여주는 우리의 결과와 일치한다.

따라서, 저혈당증의 치료 방법 및 글루카곤 분비 조절 및 검출을 위한 분석법 및 방법을 제공하려는 것이 하나의 목적이다. 일 실시태양에서, 이들 방법은 당뇨병의 치료 및 검출에 사용될 수 있다. 그러나, 본 방법은 임의의 인슐린 유도된 저혈당증을 위해 또한 유용할 것이다.

용어 "저혈당증"은 정상보다 낮은 수준의 혈당을 지칭한다. 정상보다 낮은 수준에 대한 정확한 범위는 나이, 건강 및 대상체의 평균 기준치 글루코스 수준과 같은 요소 때문에 대상체에 따라 달라진다. 일부 실시태양에서, 저혈당성 혈당 수준은 70 mg/dl 또는 3.9 mmol/L 미만인 것들을 포함한다.

본원에 설명된 방법은 1 형 및 2 형 당뇨병을 모두 포함하는 인간의 진성 당뇨병의 치료에 특히 유용할 것으로 기대된다.

용어 "대상체"는 진성 당뇨병으로 인한 고통을 받을 수 있는 포유류, 특히, 인간을 포함하도록 의도되며 또한, 저혈당증을 치료하는 것이 적절할 수 있는 임의의 포유류를 포함한다.

본 발명의 일부 실시태양은 친이온성 글루타메이트 수용체(iGluR)를 직접적 또는 간접적으로 활성화시켜 글루카곤 분비를 자극하는 화합물을 투여함으로써 저혈당증을 치료하는 방법에 관한다. 일부 실시태양에서, 화합물은 글루타메이트 수용체 서브유닛 GluR6를 활성화한다.

투여되는 화합물은, 예컨대, (2S,4R)-4-메틸글루탐산일 수 있다. 화합물은 임상의에 의해 결정된 유효 용량으로 투여될 수 있다. 용량은, 일부 실시태양에서 환자의 저혈당증의 정도 및 기타 환자 특이적 요소, 예컨대, 나이, 일반적 건강 및 기타 질병의 존재에 따라 약 5 mg/kg/일 내지 약 200 mg/kg/일 범위일 수 있다.

본 방법의 일부로서 투여되는 화합물은 iGluR의 작용제 또는 부분 작용제일 수 있다. 일부 실시태양에서, 본 화합물은 글루타메이트 수용체 서브유닛 GluR6에 대한 작용제 또는 부분 작용제이다. iGluR에 대한 작용제의 일례는 카이네이트이다.

본 발명의 일부 실시태양은 글루카곤 분비의 조절 시험을 위한 분석법에 관한다. 예컨대, 일부 실시태양에서 본 발명은 우리가 예컨대, 스트렙토조토신으로 선택적으로 베타 세포를 파괴하여, 1 형 당뇨병을 모방한 상황을 생성시킨 시험관 내 모델에 관한다. 치료된 췌도는 알파 세포를 주로 포함한다. 이들 알파 세포들이 글루카곤 분비를 위한 비특이적 자극제인 알지닌으로 자극되는 경우, 그들의 글루카곤 반응은 대조군, 손상되지 않은 췌도 내의 알파 세포의 그것에 유사했다. 베타 세포가 격감된 췌도 내의 알파 세포가 글루타메이트 신호를 손상시키는지 시험하기 위해서, 우리는 그들을 카이네이트, 친이온성 글루타메이트 수용체의 작용제로 자극하였다. 베타 세포가 전혀 없는 췌도 내의 알파 세포는 카이네이트에 대한 글루카곤 반응을 강하게 감소시켰다. 이들 결과는 알파 세포 내의 글루타메이트 신호가 당뇨병의 감소된 베타 세포 덩어리를 가진 췌도 내에서 특이적으로 하향조절되거나 손상되었음을 나타낸다.

하기의 실시예들은 본 발명을 추가적으로 설명하지만 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 추정되지 않는다.

실시예

물질 및 방법들

췌도 분리 및 배양

인간(n = 12, 나이 = 48 ± 7 세), 원숭이(마카까 파시쿨라리스(Macacca fascicularis); n= 15; > 4 년의 나이), 및 생쥐(C57Bl/6; n = 15) 췌도를 다른 곳(카브레라 등, 2006)에 설명된 바와 같이 분리하고 배양하였다. 대사성 글루타메이트 수용체 mGluR4을 결핍한 돌연변이 생쥐 (C57Bl/6 바탕)를 잭슨 실험실(Jackson Laboratories) (미국, 메인주, 바 하버(Bar Harbor))에서 구입하였다. 원숭이 및 생쥐를 사용한 모든 실험적인 프로토콜은 마이애미 대학교 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었다.

세포질 자유 Ca ² ⁺ 의 결정

[Ca² ⁺]_i의 영상화를 다른 곳(카브레라 등, 2006)에 설명된 바와 같이 수행하였다. 췌도 또는 분산된 췌도 세포들을 HEPES-완충 용액(mM: 125 NaCl, 5.9 KCl, 2.56 CaCl₂, 1 MgCl₂, 25 HEPES; 0.1 % BSA; pH 7.4)에 침지하였다. 글루코스를 첨가하여 3 mM의 최종 농도를 만들었다. 췌도 또는 분산된 췌도 세포는 푸라-2(Fura-2) AM (2 μM; 1 시간)에서 배양하고, 폐쇄된 소용적 영상화 챔버(워너 인스트루먼츠(Warner Instruments), 미국, 커네티컷주 함덴)내에 위치시켰다. 입욕액(bathing solution)으로 자극을 적용하였다. 푸라-2가 충진된 췌도는 단색화장치 광원(영국, 페버샴, 카이른 리서치 엘티디, 카이른. 리서치 옵토스캔 단색화장치)로 340 및 380 nm에서 교대로 여기되었다. 영상을 짜이스 엑시오벌트 200 현미경(독일, 제나, 칼 짜이스(Carl Zeiss))에 부착된 하마마츠 카메라(하마마츠 코포레이션, 일본)로 습득하였다. 340/380 형광 방출비에서의 시간에 따른 변화를 개개의 췌도 및 분산된 세포에서 키네틱 영상화 AQM 어드밴스(Kinetic Imaging AQM Advance) 소프트웨어 (키네틱 영상화, 노스캐롤라이나주, 미국)를 사용하여 분석하였다. 형광비 내의 피크 변화는 반응 진폭을 구성했다.

글루카곤 및 인슐린 분비의 역학적 측정

대용량, 자동화된 주변융합 시스템을 췌장의 췌도로부터 호르몬 분비를 역학적으로 측정하기 위해 전개하였다. 낮게 맥동하는 연동성 펌프로 HEPES-완충된 용액(mM: 125 NaCl, 5.9 KCl, 2.56 CaCl₂, 1 MgCl₂, 25 HEPES 및 0.1 % BSA; pH 7.4; 및 100 μL/분의 주변융합 속도)을 바이오-겔(Bio-Gel) P-4 겔(바이오라드(BioRad), 미국, 캘리포니아주, 헐큘레스) 내에 고정된 100 개의 췌장의 췌도를 함유하는 칼럼을 통해 밀었다. 다르게 기술된 것을 제외하고는, 글루코스 농도는 모든 실험에 대해 3 mM로 조정되었다. 주변융합 완충액으로 자극을 가했다. 주변융합제(perifusate)를 96 웰 플레이트 포멧으로 설계된 자동화 분별 수집기에서 수집하였다. 췌도 및 주변융합 용액을 함유하는 칼럼을 37 ℃로 유지시키고, 수집 플레이트 내의 주변융합제를 4 ℃ 미만으로 유지시켰다. 주변융합제를 매 분마다 수집했다. 주변융합제 내의 호르몬 분비를 인간 또는 생쥐 엔도크린(Endocrine) 린코플렉스(LINCOplex) 키트로 제조업자의 설명(린코 리서치, 미국, 미조리주, 세인트 찰스)에 따라 결정하였다.

바이오센서 세포를 이용한 글루카곤 분비의 실시간 결정

BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)(캘리포니아주, 산 호세)로부터 인간 글루카곤 수용체를 안정적으로 발현하는 HEK293H-CNG 세포를 사용하여 실시간으로 글루카곤 분비를 측정하였다. 글루카곤 바이오센서 세포를 태아 우혈청(fetal bovine serum)(10 %) (인비트로젠(Invitrogen)), 푸로마이신(Puromycin) (10 mg/ml) (BD 바이오사이언시즈) 및 G418 술페이트 (500 mg/ml) (미디아테크, 미국, 버지니아주)이 추가된 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM)에서 성장시켰다. 글루카곤 바이오센서 세포에 푸라-2 AM(2 μM; 37 ℃에서 30 분)을 공급하였다. 과량의 푸라-2 AM을 세척한 후에, 췌장의 췌도를 글루카곤 바이오센서 세포의 최상단 위에 위치시키고, 차폐된 소용적 영상화 챔버(워너 인스트루먼츠(Warner Instruments))내에 탑재하여 상술한 바와 같이 [Ca² ⁺]_i를 측정하였다. 췌도의 주변융합은 자극제를 첨가한 후에 중단되어서 췌도 분비성 생산물이 축적되도록 하였고 그 후 10 분 후에 재개되었다. 이 기술로 획득한 글루카곤 분비 프로파일은 주변융합 연구에서 획득된 것과 유사하지만 바이오센서 세포 분석법은 더욱 감응성이었고 가변성을 덜 나타냈다.

내생적 글루타메이트 분비의 미세형광분석 결정법

췌장의 췌도의 내생적 글루타메이트 분비를 미시적 미세형광분석 검출(아카기 등, 2003)을 위해 채용된 앰플렉스 레드 글루탐산 분석 키트(Amplex Red Glutamic Acid Assay Kit)(몰큘러 프로브스(Molecular Probes))로 측정하였다. 본 분석법에서, 분비된 글루타메이트는 높은 형광 생성물 레조루핀(몰큘러 프로브스, 미국, 오래곤주, 유진)을 발생시키는 효소적 쇄 반응에서 기질이다. L-글루타메이트는 글루타메이트 산화제에 의해 산화되어 α-케토글루타레이트, NH₄ 및 H₂O₂를 생산한다. 과산화수소는 호스래디쉬 퍼록시다제(horseradish peroxidase)에 의해 촉진되는 반응에서 앰플렉스 레드 반응제와 반응하여 레조루핀을 발생시킨다. 췌장의 췌도를 폴리-D-리신으로 사전에 코팅된 유리 커버슬립에 부착시켰다. 커버슬립을 차폐된 소용적 영상화 챔버(워너 인스트루먼츠) 내에 탑재하고 자극제를 함유하는 HEPES-완충 용액과 주변융합시켰다. 레조루핀 형광물질은 [Ca² ⁺]_i를 측정하는데 사용된 동일한 영상화 시스템을 사용하여(상기 참조) 510 nm에서 여기되었고, 방출은 590 nm에서 기록되었다.

패치 클램프 전기생리학

막 전류를 분산된 인간 췌도 세포의 전체-세포 패치 클램프 기록을 사용하여 측정하였다. 모든 기록들을 EPC10 패치-클램프 증폭기를 사용하여 증폭시키고 디지털화하고 패치마스터(Patchmaster) 소프트웨어(독일, 람브레히트, 헤카 일렉트로닉(Heka Elektronik))을 사용하여 분석하였다. 피펫들을 수평 프로그램작동성 풀러(puller)(독일, 아우크스부르그, 제이쯔-인스트루먼트(Zeitz-Instrumente), 디엠지 유니버설 풀러(DMZ Universal Puller)) 위에서 붕규산염 유리 모세관으로부터 뽑았다. 5-7 MΩ의 저항을 가진 피펫들을 150 NMG (N-메틸-D-글루카민), 10 EGTA, 1 MgCl₂, 2 CaCl₂, 5 HEPES 및 3 Mg-ATP (pH 7.15)(mM 단위)을 함유하는 피펫 용액으로 충전하였다. 배쓰(bath) 용액은 (mM 단위로) 138 NaCl, 5.6 KCl, 1.2 MgCl₂, 2.6 CaCl₂, 5 HEPES 및 10 TEA (pH 7.4)을 함유하였다. 세포들을 -70 mV에서 전압-클램프하였다. 리간드(예컨대, 카이네이트)를 패치 전극에 부착된 막 패치 또는 단일 세포를 입욕시키는 용액의 신속한 변화를 가능케하는 SF-77B 퍼퓨전 패스트-스텝(Perfusion Fast-Step) 시스템(워너 인스트루먼츠, 미국, 커네티컷주, 함덴)을 사용하여 적용하였다. 우리는 전기생리학적 특성에 기반하여 세포 타입을 식별하려고 시도하지 않았고, 이는 우리의 [Ca² ⁺]_i 영상화 실험 안의 75 %를 초과하는 카이네이트 반응성 세포들이 글루카곤 면역반응성 세포였기 때문이다. 따라서, 우리의 전기생리학적 실험에서 카이네이트에 반응한 세포들은 α-세포일 가능성이 매우 크다.

RT - PCR

90 %를 초과하는 순수 인간 및 원숭이 췌도로부터의 전체 RNA를 키아겐(Qiagen)(캘리포니아주, 발렌시아)으로부터의 RNA 이지(RNA Easy) 키트를 사용하여 분리하였다. cDNA를 슈퍼스크립트^TM 퍼스트-스트랜드 합성 시스템(First-Strand Synthesis System)(인비트로겐)을 사용하여 500 ng의 전체 RNA로부터 합성하였다. cDNA(2 ㎕)를 추가적인 정제없이 PCR 반응(35 회)에서 라이트사이클러(LightCycler) 및 로쉐(Roche) 증폭 키트와 함께 사용하였다. 인간 AMPA/카이네이트(GluR1-7, Ka1 및 KA2)를 위한 프라이머 및 소포성 글루타메이트 수송체(vGluT1-3)을 키아겐으로부터 구입하고, 판매사에 의해 제안된 농도로 사용하였다.

단일 세포 RT - PCR

인간 또는 원숭이 췌도는 각각의 세포 내로 분산되었다. 단일 세포를 유리 마이크로피펫(~20 ㎛)를 사용하여 포집하고 원심분리 튜브에 위치시켰다. mRNA를 슈퍼스크립트 퍼스트 스트랜드 합성 시스템(인비트로겐)을 사용하여 역전사하였다. 실시간 PCR을 태크맨 패스트 유니버설 PCR 마스터 믹스(TaqMan Fast Universal PCR Master Mix) 및 7500 또는 7900HT 패스트 실시간 PCR 시스템(Fast Real-Time PCR Systems)(어플라이드 바이오시스템즈)을 사용하여 수행했다. 태크맨 분석법을 선택하여 엑손 결합을 연결하고 따라서 게놈의 DNA를 검출하지 않았다. 우리는 먼저 각각의 cDNA를 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장의 폴리펩티드에 특이적인 태크맨 탐침으로 증폭시켰다. 췌장성 호르몬 중의 하나를 배타적으로 발현하는 세포를 사용하여 추가적인 PCR을 하여 글루타메이트 수용체 유닛 GRIA 1-4 (AMPA 수용체 서브유닛) 및 GRIK1-5 (카이네이트 수용체 서브유닛) 및 대사성 글루타메이트 수용체 4 및 5 (GRM4 및 GRM5)을 검출하였다.

면역형광

면역형광을 다른 곳(카브레라 등, 2006)에 설명된 바와 같이 진행하였다. 인간, 원숭이 또는 생쥐 췌장의 블록(0.5 cm³) 또는 분리된 췌도를 4 % 파라포름알데히드(4-6 시간)에 고정시키고 냉동했다. 절편(14 ㎛)들을 저온유지장치 위에서 잘랐다. 옵티맥스 세척 완충액(OptiMax Wash Buffer)(바이오지넥스(Biogenex), 미국, 캘리포니아주, 샌 라몬)으로 헹군 후에, 절편들을 유니버설 차단제 시약(5-10 분; 바이오지넥스)에서 배양하고, 옵티맥스 세척 완충액에서 다시 헹구고, 단백질 블록(Protein Block)(20 분, 바이오지넥스)에서 배양하였다. 그 후에, 절편들을 항-인슐린(1:500, 아큐레이트 케미칼 & 사이언티픽 코포레이션(Accurate Chemical & Scientific Corp.), 미국, 뉴욕주), 항-글루카곤 (1:2000; 시그마(Sigma), 미국, 미조리주, 세인트 루이스), 항-소마토스타틴 (1:500; 세로텍(Serotec), 미국, 노스 케롤라이나주), 및 항-췌장성 폴리펩티드(1:100, 세로텍) 항체로 밤새 배양시켰다. 소포성 글루타메이트 수송체(vGluT)을 시각화하기 위해서, 절편들을 항-vGluTl (1:20,000; 케미콘(Chemicon)), 항-vGluT2 (1:10,000; 케미콘) 또는 항-vGluT3 (1:20,000; 케미콘)에서 인슐린 및 글루카곤에 대항하는 항혈청과 함께 배양하였다. 신경성 요소들을 시각화하기 위해서, 분리된 인간 췌도들을 토끼 항-시냅신(synapsin) 1/2 (1:500; 시냅틱 시스템즈(Synaptic Systems), 독일,괴팅엔), 생쥐 항-뉴런 특이적 에놀라제(1 :500, 케미콘), 토끼 항-신경사상체 200 (1:100, 시그마) 또는 닭 항-신경사상체 H (1:200, 뉴로믹스)에서 항체염색시켰다. 항체염색을 알렉사(Alexa) 공액된 2차 항체(1:400; 몰큘러 프로브스, 미국, 오리건주, 유진)를 사용하여 시각화하였다. 세포 핵들을 DAPI(몰큘러 프로브스)로 염색하였다. 슬라이드에 프로롱 안티 페이드(ProLong Anti Fade)(몰큘러 프로브스)를 탑재하고 커버슬립하였다. 음성 대조군으로서 우리는 1차 항체를 이 항체를 기르기 위해 사용된 동물의 혈청으로 치환하였다. 이들 조건 하에서 염색은 관찰되지 않았다. 췌도를 함유하는 췌장의 절편을 상이한 내분비계 마카 및 짜이스 LSM 510 스캐닝 공초점 현미경(독일, 제나, 짜이스)을 사용한 vGluT의 발현에 대해 시험하였다. 우리는 모든 영상 습득을 위해 1 ㎛의 광학적 절편을 선택했다. 모든 영상들을 디지털 방식으로 습득하였고, 더 이상 가공하지 않았다. 절편들을 20 및 40 X 확대해서 보았다. 디지털 영상들을 아도브 포토샵 7.0(아도브 시스템 인크, 미국, 캘리포니아주, 산 호세)를 사용하여 편집하였다. 휘도 및 명암만을 조정하였다.

생체 내 연구

우리는 PBS (n = 4), 글루탐산 모노소다 (30 mg/kg; n = 7) 또는 AMPA (15 mg/kg; n = 8)와 함께 C57BL/6 생쥐를 i.p. 주입함에 의해 iGluR 작용제에 대한 생체 내 반응을 시험하였다. iGluR의 차단이 인슐린-유도된 저혈당증을 악화시키는지 여부를 결정하기 위해서, 생쥐들을 인슐린으로 처리하여 저혈당증을 유도하기 30 분 전에, 우리는 AMPA/카이네이트 iGluR 길항제 NBQX (토크리스(Tocris), 미국, 미조리주, 엘리스빌) i.p.을 20 mg/kg으로 주입하였다.

의식있는 생쥐 내의 과인슐린성 ( Hyperinsulinemic )-저혈당성 클램프

표준화된 저혈당성 자극을 제공하기 위해서, 우리는 과인슐린성-저혈당성 클램프를 사용하여 추가적으로 연구를 수행하였다. 실험의 최소 4일 전에, 생쥐들을 이소플루레인으로 마취시키고, 내재용 카테터를 좌측 경정맥 혈관 내에 주입하고 머리 뒤의 피부판 내의 절개를 통해 표면화시켰다. 생쥐들을 4 시간 동안 단식시키고, 꼬리 절단 샘플링을 위해 개별적인 플라스틱 용기에 넣었다. 기저 혈장 글루카곤 및 인슐린 분비의 결정을 위해 실험의 시작 전에 꼬리 혈액 샘플들(20 ㎕)을 취했다. 인슐린을 초회량 (100 mU/kg)에 이어 20 mU/kg/분의 일정한 주입 속도(액트라피드(Actrapid), 노보 노르디스크(Novo Nordisk))로 투여하였다. 혈장 글루코스 농도를 원 터치 울트라(One Touch Ultra) 글루코스 미터계를 사용하여 10 분 간격으로 결정했다. 글루코스(30 %)를 다양한 속도로 주입하여 저혈당성 수준(~3 mM)로 혈장 글루코스 농도를 유지하였다. 50 분 된 시점에, 과인슐린성-저혈당성 클램프가 달성되었다. 혈당 수준은 정상 상태(3 mM)로 유지되었고 NBQX를 60 분 된 시점에 1 회분(10 mg/kg)으로 투여하고 이어서 실험이 끝날 때까지 주입(10 mg/kg)하였다. 대조군 실험을 NBQX에 사용된 동일한 프로토콜을 따라 식염수(0.9 % NaCl)을 사용하여 수행하였다. 꼬리 혈액 샘플(20 ㎕)을 혈장 글루카곤 및 인슐린 분비의 결정을 위해 수개의 시점에서 취했다: 0, 50, 75 및 90 분. 동물들을 과량의 펜토바르비탈로 안락사시켰다.

통계적 분석법

본원에 설명된 통계적 비교를 위해, 스튜던트의 t-시험, 일-방향 아노바(ANOVA) 또는 반복된 측정 아노바 후의 스튜던트-뉴먼-케울스 방법으로의 다중 비교 절차를 사용하였다.

인간 췌도 내의 친이온성 글루타메이트 수용체의 활성화가 글루카곤 분비를 유도함.

분리된 인간 및 원숭이 췌도 상에 RT-PCR을 수행하여 우리는 AMPA 수용체 타입의 iGluR 서브유닛 GluR1, GluR2, GluR3 및 GluR4 및 카이네이트 수용체 타입의 GluR5, GluR6, GluR7 및 KA2 (도시되지 않음)에 대한 전사를 검출할 수 있었다. 이들 결과들은 베타 셀 콘솔티움 데이타베이스(http://www.betacell.org/resources/data/epcondb/)에서 공개된 것과 일치한다. 췌도 내의 iGluR 서브유닛의 발현은 GluR2/3에 대항하는 항체를 이용한 면역블롯(immunoblot) 분석법(도시되지 않음)에 의해 확인되었다. GluR1 및 GluR4 서브유닛은 검출될 수 없었다. GluR2/3 항체가 사전-흡착된 경우 정확한 크기의 띠가 면역블롯에서 사라졌으나, 췌장 절편 내의 항체염색은 그렇지 않았고, GluR2/3 항체를 사용하여 얻어진 면역형광 신호는 특이적이지 않다는 것을 나타냈다. iGluR의 세포-특이적 발현을 연구하기 위해, 우리는 대체 기술을 사용하기로 결정했다(이하 참조).

설치류 췌도 내의 상기 결과(모리야마 및 하야시, 2003)에 대조적으로, 우리는 기능적인 AMPA/카이네이트 iGluR이 인간 및 원숭이 췌도의 α-세포 내에 배타적으로 존재한다는 것을 발견했다(도 1, 2). 시험관 내 주변융합 기술을 사용하여 호르몬 분비를 검출함으로써, 우리는 글루타메이트(1 μM- 1 mM)가 글루카곤 분비에서 거대한 농도-의존적 증가를 자극한다고 결정했다(도 1a, b). 글루카곤 분비에서의 증가는 또한 iGluR 작용제 카이네이트(100 μM) 및 AMPA(100 μM; 도 1a,b)에 의해서 끌어낼 수도 있었다. AMPA/카이네이트 타입의 iGluR에 대한 두 개의 길항제인 CNQX (10 μM) 및 DNQX (10 μM; 도시되지 않음)는 글루타메이트-유도된 글루카곤 분비를 90 %가 넘게 억제하였다(도 1a, b). 대사성 수용체들은 쥐 췌도 내에서 글루카곤 분비 상에 음성 자가분비 효과를 중재하는 것으로 보고되었다(우에하라 등, 2004). 그러나, 인간 췌도를 사용하여, 우리는 대사성 수용체 작용제 트랜스-ACPD(100 μM) 및 ACPT-1(100 μM) 및 대사성 길항제 CPPG(100 μM)가 기저의 글루카곤 분비 또는 글루타메이트에 대한 글루카곤 반응에 영향을 미치지 않는다는 것을 밝혀냈다(도 1c, d).

AMPA (100 μM) 및 카이네이트(100 μM), 글루타메이트(100 μM) 중 어느 것도 인간(도 1e) 및 원숭이 췌도(도시되지 않음) 내에서 인슐린 분비의 증가를 자극하지 않았다. iGluR 작용제의 이들 효과는 모든 시험된 글루코스 농도(1 mM, 3 mM, 및 11 mM)에서 유사했다.

알파 세포가 AMPA / 카이네이트 타입의 기능적 iGluR 을 발현한다.

인간 및 원숭이 췌도 및 Ca² ⁺ 지시자 푸라-2가 공급된 분산된 단일 췌도 세포는 글루타메이트 (100 μM)에 대한 반응으로 세포질 자유 Ca² ⁺ 농도([Ca² ⁺]_i)의 증가를 보였다. 글루타메이트에 대한 [Ca² ⁺]_i 반응은 농도 의존성(도 1f)이었고, CNQX(10 μM)에 의해 차단될 수 있었다(이하 참조). [Ca² ⁺]_i반응을 끌어낸 글루타메이트 농도의 범위는 중추 신경계 내의 뉴런에 대해 보고된 것(홀만 및 하인만, 1994; 시벌그, 1993)과 유사했다. 글루타메이트에 대해 반응한 세포는 또한 카이네이트(100 μM)에 대해 [Ca²⁺]_i의 거대한 증가(12 세포 중에서 12)로 반응했다. [Ca²⁺]_i의 증가의 관점에서 글루타메이트에 반응한 세포들은 높은 글루코스 농도에 반응하지 않았고(11 mM; n = 43 세포 중에서 43; 도 2a) 높은 글루코스에 반응한 세포들은 글루타메이트에 반응하지 않았다(n = 64 세포 중에서 64; 도 2a). [Ca² ⁺]_i영상화 후에 면역형광을 사용함으로써, 우리는 대부분의 글루타메이트-반응성 세포들이 글루카곤-면역반응성이라는 것(n = 37 세포 중에서 34; n = 4 인간 제제; 도 2a)을 발견했다. 인슐린 면역반응성 세포(n = 8) 중 어느 것도 카이네이트에 반응하지 않았지만, 대부분의 글루카곤 면역반응성 세포들은 반응했다(9 중 7). 원숭이 췌도에서도 유사한 결과가 얻어졌다(도시되지 않음).

AMPA/카이네이트 유전자 GRIA2, GRIA3, 및 GRIK2 (도 2b)에 대한 전사를 나타내는 단일 세포 RT-PCR 실험은 α-세포 (글루카곤에 대해 양성이나 인슐린, 소마토스타틴 또는 췌장의 폴리펩티드에 대해 아님; n = 7 인간 세포, n = 5 원숭이 세포)로서 식별되는 세포 내에서 일관되게 검출될 수 있다. 대조적으로, 식별된 β-세포(오직 인슐린에 대해 양성)에서, 우리는 AMPA/카이네이트 유전자에 대한 전사를 검출할 수 없었다(도 2b). 대사성 글루타메이트 수용체 4 유전자 (GRM4)에 대한 전사는 7 개의 인간 α-세포 중에서 2 개에서 발견되었으나, 원숭이 α-세포 또는 두 종 모두의 β-세포에서는 그렇지 않았다(도 2b). 시험된 세포 중 어느 것도 대사성 글루타메이트 수용체 5 유전자(GRM5)에 대한 전사물을 함유하지 않았다. 이들 자료는 인간 및 원숭이 α-세포는 AMPA/카이네이트 타입의 기능적 iGluR을 발현하며, β-세포는 그렇지 않다는 것을 나타냈다.

AMPA / 카이네이트 수용체의 활성화는 전압 개폐 Ca ² ⁺ 채널을 통한 Ca ² ⁺ 유입을 거쳐 글루카곤 분비를 이끌어낸다.

본 발명자들은 AMPA/카이네이트 iGluR의 활성화가 어떻게 글루카곤 분비를 야기할 수 있는지 시험하였다. 분리된 인간 췌도 세포 상의 전체-세포 패치 클램프 기록은 카이네이트(100 μM)의 적용이 NBQX (10 μM), AMPA/카이네이트 수용체 길항제에 의해 차단될 수 있는 내부 전류를 끌어낼 수 있다는 것을 보인다(도 3a). 카이네이트에 대한 [Ca² ⁺]_i반응은 CNQX (10 μM)에 의해 차단되었고, 세포외 Ca² ⁺ 및 La³⁺ (30 μM), 전압-개폐 Ca² ⁺ 채널의 잠재적 차단제의 부재 하에 폐기된다(도 3c, d). L-타입 Ca² ⁺ 채널 차단제 니페디핀(10 μM)은 카이네이트-유도된 [Ca² ⁺]_i 반응을 약 60 % 정도 감소시켰다(도 3d). 우리는 이들 메카니즘이 카이네이트-유도된 글루카곤 분비에 연관되는지 여부를 추가적으로 조사하였다. 호르몬 분비를 검출하기 위해 주변융합 분석법을 사용하여, 우리는 카이네이트-자극된 글루카곤 분비가 세포외 Ca² ⁺의 부재 하에 폐기됨을 발견하였다(도 3b). La³ ⁺ (30 μM) 및 선택적 Ca²⁺ 채널 억제제의 조합은 카이네이트에 대한 글루카곤 반응을 크게 감소시켰다(90 % 초과). 이들 결과는 카이네이트가 전압-개폐 Ca² ⁺ 채널을 통한 Ca² ⁺ 유입 및 결과적으로 [Ca² ⁺]_i의 증가를 야기하는, α-세포 혈장 막을 탈분극화시키는, AMPA/카이네이트 iGluR을 통한 내부 전류의 활성화에 의해서 글루카곤 분비를 이끌어 낸다는 것을 나타낸다(홀만 및 하인만, 1994; 메이어 및 암스트롱, 2004).

영장류 α-세포는 글루타메이트를 분비한다.

췌도 내의 글루타메이트의 수개의 추정원, 예컨대, 신경 터미널 및 내분비 세포가 있다. 따라서 우리는 글루타메이트가 글루카곤-함유 α-세포로부터 분비되는지 여부를 조사하였다. 글루타메이트의 소포성 분비를 할 수 있는 세포가 소포성 글루타메이트 수송체[vGluT; (프리뮤(Fremeau) 등, 2004)]를 발현했다. 우리의 RT-PCR 결과는 영장류 췌도가 vGluT1 및 vGluT2(도시되지 않음)를 발현한다는 것을 나타낸다. 영장류 췌도 내의 vGluT의 국소화를 조사하기 위해서, 우리는 다중 항체염색을 인간 및 원숭이 췌장의 절편 위에 행했다(도 4a). 쥐에 대한 이전의 연구(하야시 등, 2003a; 하야시 등, 2003b)와 비슷하게, 우리는 α-세포는 vGluT1에 면역반응성이었으나 인슐린-함유 β-세포는 그렇지 않다는 것을 발견했다(도 4a). 이들 결과는 α-세포가 영장류 췌도 내에서 글루타메이트의 주된 공급원이라는 것을 나타낸다.

글루타메이트 분비를 직접적으로 시각화하기 위해서, 우리는 세포외 글루타메이트의 미세형광분석적 검출을 위해 효소 분석법(아카기 등, 2003)을 채용하고, 분리된, 배양된 췌도를 사용하여 본 분석법을 수행하였다(도 4b). 글루코스 농도가 6 mM에서 1 mM로 저하되었을 때, 형광 강도는 현저히 증가하였으며, 글루타메이트가 분비되었다는 것을 나타내었다(도 4c, d). 대조적으로, 높은 글루코스 농도(11 mM)를 이용한 자극은 글루타메이트 분비를 유도하지 않았다(도 4 c, d) 카이네이트(100 μM), α-세포에 특이적인 자극제(상기 참조)로 자극된 경우, 췌도는 글루타메이트를 강하게 분비하였다(도 4b-d). KCl (30 mM) 탈분극화 또한 글루타메이트 분비에서 큰 증가를 이끌어냈다(도 4d). 형광물질 신호는 글루타메이트-감응성 효소 글루타메이트 옥시다제의 부재 하에 작았으며(도 4b-d), 본 분석법에서의 형광 강도의 큰 증가는 글루타메이트의 분비에 의존함을 나타내었다.

신경성 요소가 글루타메이트 신호에 기여할 수 있는지 여부를 결정하기 위해서, 우리는 분리된 췌도를 신경성 마커 시냅신, 뉴런 특이적 에놀라제(enolase), 신경사상체 200 또는 신경사상체 H의 존재에 대해 시험하였다. 우리는 매우 적은 신경 터미널이 밤새의 췌도 배양에서 생존한다는 것을 나타내는 이전의 연구(칼 쏜 등, 1997)와 일치하는 존재한다면, 매우 적은 표지된 섬유, 부톤(bouton) 또는 세포(도시되지 않음)를 발견했다. 우리가 우리의 실험을 배양된 췌도를 사용하여 수행했기 때문에, 우리는 췌도내 글루타메이트가 자극된 영장류 α-세포로부터 주로 유래되었다고 결론지었다.

글루타메이트 신호는 글루카곤 분비에 대한 양성 피드백을 제공한다.

본원에 개시된 본 결과는 α-세포가 iGluR를 발현하고 글루타메이트를 분비한다는 것을 보이며, 글루타메이트가 자가분비 신호라는 것을 시사한다. 우리는 글루코스 농도의 감소가 글루카곤 분비를 강화하는 글루타메이트 피드백 루프를 활성화한다는 가설을 세웠다. 만약 그렇다면, iGluR 길항제의 적용은 글루카곤 반응을 감소시켜야 한다. 이 가설을 낮은 농도의 글루코스에 대한 반응을 검출할만큼 감응성이지 않을 수 있는 주변융합 분석법(호프(Hope) 등, 2004)으로 시험하는 대신에, 우리는 더욱 감응성인 분석법, 즉, 바이오센서 세포에 의한 글루카곤 분비의 검출을 사용하기로 결정했다. 우리는 글루카곤 수용체를 발현하는 바이오센서 세포 층 위에 인간 췌도를 놓았다(로렌테(Llorente) 등, 2006)(글루카곤에 대한 EC₅₀ = 30 pM) (도 5a). 바이오센서 세포는 글루카곤 수용체의 자극에 이어서 cAMP의 증가된 세포내 수준에 의해 활성화되어, 막 탈분극화 및 Ca² ⁺ 유입을 초래하는 환형 뉴클레오티드-개폐 채널을 발현했다. 췌도로부터의 글루카곤 분비는 [Ca² ⁺]_i 지시자 푸라-2가 충진된 바이오센서 세포로부터의 [Ca² ⁺]_i 반응을 기록함에 의해 실시간으로 모니터링되었다. 췌도의 부재 하에서, 바이오센서 세포는 글루타메이트(100 μM)(도 5b) 또는 글루코스 농도(도시되지 않음)의 변화에 반응하지 않았다. 인간 췌도를 바이오센서 세포 위에 놓은 경우, 바이오센서 세포는 글루타메이트 적용에 대해 큰 [Ca² ⁺]_i 반응을 보였으며(도 5b), 이는 글루카곤 분비가 유도되었음을 나타낸다. 바이오센서 세포에서의 [Ca² ⁺]_i 반응에 의해 측정된 것에 의하면, 글루코스 농도의 6 mM에서 1 mM으로의 저하 또한 글루카곤 분비를 유도하였다(도 5c). 글루코스 농도의 감소에 대한 글루카곤 반응은 CNQX (10 μM)에 의해 억제되었다(54 % 감소; 도 5d). 따라서, 우리는 글루코스 농도가 감소하는 경우, α-세포 상의 iGluR의 활성화는 즉각적인 글루카곤 분비에 필요하다고 결론지었다.

α-세포 위의 iGluR 은 생체 내 글루코스 항상성에 기여한다.

예를 들어, 우리는 AMPA/카이네이트 수용체의 활성화는 시험관 내 글루카곤 분비를 위한 가장 강한 자극제 중의 하나라는 것을 밝혔다. α-세포 상의 iGluR의 활성화가 생체 내 글루코스 항상성에 기여하는지 여부를 결정하기 위해, 우리는 생쥐에서 실험을 수행하였다. 시험관 내에서 생쥐 췌도는 AMPA/카이네이트 iGluR 활성화에 대한 반응으로 글루카곤을 분비하였으나, 인슐린을 분비하지 않았다(도 6 a, d). 대사성 수용체 작용제 트랜스-ACPD (100 μM) 및 ACPT-1 (100 μM) 및 대사성 수용체 길항제 CPPG (100 μM)는 기저의 또는 글루타메이트-유도된 글루카곤 분비에 영향을 미치지 않았다(도 6b). 게다가, 글루타메이트에 대한 글루카곤 반응은 야생형 및 mGluR4 KO 생쥐 내에서 구별할 수 없었다(도 6c). 따라서, 생쥐 α-세포는 주로 iGluR의 활성화를 통해 글루타메이트에 반응했지만, β-세포는 그렇지 않았다. 이들 결과는 생쥐 췌도 내의 글루타메이트 신호가 인간 췌도 내의 그것과 유사하다는 것을 나타낸다.

생체 내 AMPA/카이네이트 수용체의 활성화가 글루카곤 분비에 영향을 미치는지 결정하기 위해서, 우리는 생쥐에 글루타메이트 및 AMPA 수용체 특이적 작용제 AMPA를 주입하였다. 글루타메이트(30 mg/kg; i.p.) 및 AMPA (15 mg/kg; i.p.)가 주입된 생쥐들은 처리 30 분 후에 증가된 혈장 글루카곤 농도를 보였다(도 7a). 혈장 인슐린 농도는 영향을 받지 않았다. 이에 수반하여, 이들 생쥐들은 증가된 글루카곤 분비의 결과일 것인, 증가된 글루코스 수준을 가졌다(도 7a). 글루타메이트가 혈뇌장벽을 침투하지 않기 때문에, 글루타메이트 및 AMPA는 아마 중심 효과를 가지지 않았을 가능성이 높고(베이르테르 등, 2007), 사용된 농도에서 AMPA는 중추 신경 침투의 지시자인 경련을 유도하지 않았다(안트 등, 1995). 비록 우리가 말초 뉴런 상에의 효과를 배제할 수는 없지만, 우리 결과의 수집적인 해석은 우리가 실제로 α-세포 상의 AMPA/카이네이트 수용체를 직접적으로 활성화시켰고 그럼으로써 생쥐 생체 내 글루카곤 분비를 자극하였음을 강하게 시사한다.

내분비성 췌장 내의 α-세포로부터의 증가된 글루카곤 분비는 글루코스 상대조절에서 1차적인 역할을 한다(바나르얼(Banarer) 등, 2002; 리짜(Rizza) 등, 1979). 우리는 글루코스 농도의 저하에 대한 완전한 글루카곤 반응을 생성하기 위해 α-세포가 글루타메이트 양성 피드백 루프를 필요로 하는지 여부를 질문하였다. 최초의 실험에서, 생쥐들에 인슐린(1.5 U/kg; i.p.)을 주입하여 저혈당증을 유도하였다. 이들 생쥐들에서, AMPA/카이네이트 iGluR 길항제 NBQX (20 mg/kg, i.p.)을 사용한 전신성 처리는 글루코스 혈장 수준의 인슐린-유도된 강하를 증가시켰다(도시되지 않음). 이 농도에서, NBQX는 진정을 유발하지 않았으며, 처리가 자율적 기능 상의 중추적 영향없이 글루코스 상대조절을 손상시켰다는 것을 시사하였다(리즈(Lees), 2000).

AMPA/카이네이트 수용체의 차단이 전신성 저혈당증에 대한 상대조절성 반응을 감소시키는지 여부를 시험하기 위해서, 우리는 과인슐린성-저혈당성 클램프 기술을 사용하였다(도 7b). 이 기술은 혈장 글루코스 농도가 원하는 수준의 글리세미아(우리 연구에서 약 3 mM)로 유지될 수 있는 표준화된 저혈당성 자극을 제공한다. AMPA/카이네이트 iGluR 길항제 NBQX (10 mg/kg; iv; n = 7)로 전신적으로 처리된 생쥐는 원하는 수준의 글리세미아를 유지하기 위해서 글루코스의 더 큰 주입 속도를 필요로 했으며, PBS 주입된 생쥐(n = 4)인 대조군에 비교해서, 상대조절성 반응이 감소되었음을 시사하였다(도 7c). 실제로, 우리는 글루카곤 혈장 수준이 NBQX-처리된 생쥐에서 더 낮음을 발견했으며, 이는 iGluR의 활성화는 저혈당증에 대한 반응인 효율적인 글루카곤 분비에 필요하다는 것을 나타낸다(도 7b).

이들 실시예들은 본 발명의 가능한 실시태양을 설명한다. 본 발명이 그의 일부 실시태양을 참고로 구체적으로 나타내어지고 설명되었으나, 당업자에게 이들이 예시의 방법으로만 제시되었으며, 제한이 아니라는 것과 그 형식 및 세부사항들에서의 각종 변화가 본 발명의 취지 및 범위를 벗어남이 없이 그 안에서 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 폭 및 범위는 어떠한 상술한 예시적인 실시태양에 의해 제한되어서는 안되며, 오직 하기의 청구항 및 그들의 동등물에 따라서만 규정된다. 본원에서 사용된 임의의 표제들은 단지 정리의 목적으로만 제공되었으며, 특별히 적시되지 않는 한, 본 문서에 어떠한 분할 또는 의미도 부여하도록 의도되지 않는다.

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[참고문헌]

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Claims

친이온성 글루타메이트 수용체를 활성화시켜 글루카콘 분비를 자극하는 화합물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 저혈당증의 치료 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 글루타메이트 수용체 서브유닛 GluR6를 활성화하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 친이온성 글루타메이트 수용체가 AMPA/카이네이트 타입 수용체인 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 카이네이트, AMPA, 및 (2S,4R)-4-메틸글루탐산, (RS)-2-아미노-3-(4-클로로-3-히드록시-5-이속사졸릴)프로피온산, 4,6-비스(벤조일아미노)-1,3-벤젠디카르복실산, (±)-4-(4-아미노페닐)-1,2-디히드로-1-메틸-2-프로필칼바모일-6,7-메틸렌디옥시프탈라진, 1-(4'-아미노페닐)-3,5-디히드로-7,8-디메톡시-4H-2,3-벤조디아제핀-4-온, 1,4-디히드로-6-(1H-이미다졸-1-일)-7-니트로-2,3-퀴녹살린디온 히드로클로라이드, GABA 및 비쿠쿨린으로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 글루타메이드 유사체인 방법.
제1항에 있어서, 상기 화합물이 약 5 mg/kg/일 내지 약 200 mg/kg/일의 용량으로 투여되는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 저혈당증이 진성 당뇨병과 관련된 방법.
저혈당증의 치료를 위한 제약의 제조에 있어서의 친이온성 글루타메이트 수용체를 활성화시켜 글루카콘 분비를 자극하는 화합물의 용도.
친이온성 글루타메이트 수용체의 글루타메이트 수용체 서브유닛 GluR6을 활성화시켜 글루카콘 분비를 자극하는 화합물을 투여하는 것을 포함하는 글루카콘 분비의 자극 방법.
제9항에 있어서, 상기 친이온성 글루타메이트 수용체가 AMPA/카이네이트 타입 수용체인 방법.
제9항에 있어서, 상기 화합물이 카이네이트, AMPA 및 GABA으로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
제9항에 있어서, 상기 화합물이 글루타메이트 유사체인 방법.
제9항에 있어서, 상기 화합물이 약 5 mg/kg/일 내지 약 200 mg/kg/일의 용량으로 투여되는 방법.
췌도 세포를 2 군으로 제공하여, 제1 군은 대조군이고 제2 군에는 존재하는 β 세포를 파괴하기에 충분한 용량의 스트렙토조토신을 투여하는 것; 시험 화합물을 제1 및 제2 군 모두에 투여하는 것; 및 제1 및 제2 군에서 글루카곤 분비의 강화를 측정하여 시험 화합물의 효과를 결정하며, 여기에서 감소된 세포질 칼슘 동원 및/또는 글루카콘 분비는 조절자로서 유용한 화합물을 지시하는 것
을 포함하는 당뇨병의 치료에 유용한 조절자의 시험관내 스크리닝을 위한 분석법.