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KR20110120275A - 큐프레독신으로 암을 예방하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

큐프레독신으로 암을 예방하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20110120275A
KR20110120275A KR1020117016815A KR20117016815A KR20110120275A KR 20110120275 A KR20110120275 A KR 20110120275A KR 1020117016815 A KR1020117016815 A KR 1020117016815A KR 20117016815 A KR20117016815 A KR 20117016815A KR 20110120275 A KR20110120275 A KR 20110120275A
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cancer
cupredoxin
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Application number
KR1020117016815A
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English (en)
Inventor
브래드 태일러
라제쉬와리 메타
토루 야마다
크레익 비티
타파스 다스 굽타
Original Assignee
씨디쥐 테라퓨틱스, 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 세포독성 화합물의 선택적 진입을 통한 암세포를 죽이고/죽이거나 암세포의 성장을 억제하는 방법 및 물질을 개시한다. 세포독성 화합물의 선택적 진입은 아주린의 p18 및 p28 절단부를 포함하는 큐프레독신으로부터 유도된 단백질 전달 도메인을 사용함으로써 성취된다.

Description

큐프레독신으로 암을 예방하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS TO PREVENT CANCER WITH CUPREDOXINS}
본 출원은 2008년 12월 18일 출원된 미국특허 출원 번호 12/338,480에 대하여 35 U.S.C §§ 119 및 120에 의거한 우선권을 주장하며, 상기 미국특허 출원 번호 12/338,480 출원은 2007년 12월 14일 출원된 미국 가출원 번호 61/013,709에 대해 우선권을 주장하는 2008년 12월 15일에 출원된 미국특허 출원 번호 12/314,703의 계속 출원이며; 그리고 2007년 2월 8일에 출원된 미국특허 출원 번호 60/800,098에 대해 우선권을 주장하는 2008년 2 월 8일에 출원된 12/028,683의 계속 출원이며; 그리고 2005년 7월 19일에 출원된 미국특허 출원 번호 60/700,297에 대해 우선권을 주장하는 2006년 7월 19일에 출원된 출원번호 11/488,693의 계속 출원이며; 그리고 2004년 10월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 60/616,782 및 2005년 5월 13일에 출원된 미국 가출원 번호 60/680,500에 대해 우선권을 주장하는 2005년 10월 6일에 출원된 미국특허 출원번호 11/244,105의 계속 출원이다.
본 발명은 암과 연관된 치료를 위해, 그리고 구체적으로는 포유류의 세포, 조직 그리고 동물들에서 전암성 병소들이 발달하는 것을 억제하기 위해 사용되는 z큐프레독신 및 큐프레독신의 변이체, 유도체, 구조적 등가물, 그리고 적어도 하나 이상의 다른 화학적 항암치료를 위해 사용되는 화학적 방어제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전암성 병소가 발달하는 것, 그리고 궁극적으로는 암을 억제하기 위하여 포유류의 화학적 방어제로서 큐프레독신의 사용, 및 큐프레독신의 변이체, 유도체, 구조적 등가물에 관한 것이다.
암의 화학적 예방은 침윤성 암으로의 암화 과정을 역행, 억제 또는 예방하기 위해 천연, 합성, 또는 생물학적 화학제들의 사용을 의미한다. 고위험군에서 암을 예방하기 위한 최근의 임상적 시도들은 화학적 암예방 치료는 고위험 환자들에게 현실적인 치료법이라는 것을 시사한다. 화학적 암예방 치료는 다발성 영역 발암과 다단계 발암의 개념을 바탕으로 한다. 영역 발암에서, 조직 영역에 전반적으로 일어난 발암 물질의 보편적 노출은 조직에서의 미만성 상피성 손상과 변이된 세포의 복제성 증식으로 이어진다. 영역에서 전반적으로 일어나는 이러한 유전적 변이들은 하나 이상의, 전암성 또는 악성이 된 병소들이 그 영역에서 발달할 수 있는 가능성을 증가시킨다. 다단계 발암은 이러한 유전적 그리고 형질성 변형들의 축적으로 일어난다. 다단계 발암에서 하나 또는 그 이상의 단계를 막는 것은 암의 발달을 지연 또는 예방할 수 있다. 개괄적으로 문헌[Tsao 등, CA Cancer J Clin 54:150-180 (2004)]를 참조하라.
마우스 유선 기관 배양 (MMOC)은 호르몬에 의해 유래된 유선의 구조적 분화와 DMBA에 의해 유래된 분비선에서의 종양발현전/종양발현후 폐포 결절성 병소들의 발달 모두에 대한, 화학적 방어제로서의 가능성이 있는 물질들의 억제성 효과들을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 어리고 임신하지 않은 동물들로부터 채집된 유선들은 인슐린 (I) + 프로락틴 (P) + 알도스테론 (A) 조건 하에서 6일 동안 배양되었을 때, 완전히 자란 분비선들로 분화될 수 있다. 이러한 분비선들은 임신한 마우스들로부터 채집된 분비선들과 형태학적으로 유사성을 띤다. 알도스테론은 에스트로겐 (E) + 프로게스테론 (Pg)로 대체될 수 있다. 하이드로코르티손 (H)을 배지에 포함하면 유선의 기능적 분화가 촉진된다. Mehta 및 Banerjee, Acta Endocrinol. 80:501 (1975); Mehta 및 Moon, Breast Cancer: Treatment and Prognosis 300, 300 (Basil A Stoll ed., Blackwell Press 1986). 그러므로, 이 배양 시스템에서 관찰되었던, 호르몬에 의해 유래된 구조적 그리고 기능적 분화는 동물의 다양한 생리학적 단계들 동안 관찰된 호르몬들에 대한 반응들을 모방한다.
마우스들은 MMOC에서 암의 형성 이전에 특징적인 종양발현전 단계를 보인다. 그러한 종양발현전 병소들은 C3H 마우스들에서 마우스 유방 종양 바이러스에 의해 유래되거나, 또는 DMBA에 의해 BALB/c 마우스들에서 유래된다. 성장 단계 3일 그리고 4일 사이에서 분비선들이 2 μg/ml DMBA에 노출된 뒤, 인슐린만을 포함하는 배지에서 2~3주 동안 분비선들을 퇴화시킨 것은 유선 세포 병소 (MAL)의 형성으로 이어졌다. Hawthorne 등, Pharmaceutical Biology 40:70-74 (2002); Mehta 등, Methods in Cell Science 19:19-24 (1997). 더 나아가서, DMBA에 의해 유래된 유방 병소를 포함하는 분비선들로부터 채집된 상피세포를 동질유전자적 호스트에 이식한 것은 유선암의 발달로 이어졌다. Telang 등, PNAS 76:5886-5890 (1979). 병리학적으로, 이러한 종양들은 동일 계통의 마우스들에 DMBA를 처리했을 때 생체 내에서 관찰된 경우들과 유사했다. Id.
MMOC에서 DMBA에 의해 유래된 유방 병소의 형성은 레티노이드와 같은 다양한 종류의 화학적 방어제들에 의해 억제될 수 있다. 이러한 약물들은 브라시닌과 레스페레트롤, 티올, 항산화제, OFMO와 데구엘린과 같은 오르니틴 탈탄산효소의 억제제, 프로스타글란딘 합성 억제제, 칼슘 조절제, 등으로부터 유래된 화학적 방어제를 포함한다 Jang 등, Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eur. J. Cancer 36:1275-1282 (2000); Mehta 등, J. Natl. cancer Inst. 89:212-219 (1997). 이러한 연구들은 이 기관 배양 시스템이 유방 발암에 대한 조성물들의 효과를 결정하는 것에 있어서 고유한 모델을 제공한다는 것을 분명히 입증한다. 결과들은 그러한 조성물들의 생체 내 투여에 의해 획득된 억제 반응과 가깝게 연관되어 있을 것으로 추측할 수 있다.
MMOC는 또한 유선관 병소 (MAL)을 형성하기 위해 유래될 수 있다. MDL은 알도스테론과 하이드로코르티손 대신 에스트로겐과 프로게스테론이 배지에 포함될 경우에 유래될 수 있다. 난소 스테로이드의 존재 하에서, 폐포 구조들은 매우 작지만 선관 내 병소들은 조직병리학적 위치에서 관찰될 수 있다. Mehta 등, J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001). 난소 호르몬 의존성 ER+ 유방암에 특이적으로 작용하는, 타목시펜과 같은 항에스트로겐은 MDL의 형성은 억제하였지만 MAL은 억제하지 않았다. 그러므로 통상적 MAL 유도 프로토콜에 더하여, 이러한 수정된 배양 모델은 이제 MAL과 MOL 모두에서 화학적 방어제의 효과들을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
포유류의 세포 안으로 단백질의 진입은 단백질의 작은 조각에 좌우되며, 일반적으로 "단백질 전달 도메인" 또는 PTD로 일컬어진다. 이러한 조각은 어떤 단백질이 포유류의 세포 안으로 전달될 수 있도록 외래 단백질과 결합된 신호로써 사용될 수 있다. 예를 들어, 양친매성 펩타이드는 인간 섬유아세포 HS68 또는 쥣과의 림프성 백혈병 L1210 세포(Chaloin, L. 등, Bioconjugate Chem. 12:691-700,(2001))으로써 DNA-절단된 메탈로포피린의 흡수가 가능하도록 사용된다.
세포-침투성 펩타이드(CPPs) 또는 페네트라틴(penetratin), 트란스포탄(transportan), Tat(아미노산 45-57 또는 48-60) 및 양친매성 펩타이드 MAP와 같은 세포-전달 매개체(CDVs)로 불리는 펩타이드는 짧고, 양친매성이고 양이온성 펩타이드 및 펩타이드 유도체이며, 대개 다수의 리신 및 아르기닌 잔기를 함유한다(Fisher, P. M., Med Res Rev, 27:755-795(2007)). 그들은 유전자 치료에서 세포독성의 약물, 안티-센스 올리고 뉴클레오티드, 단백질 및 펩타이드를 포함하는 다양한 카르고에 대한 잠재적 전달제 또는 전달 비히클 그리고 유인 펩타이드(decoy peptide)로서 특별히 주목을 받는 저분자 분류를 형성한다(Hallbrink, M. 등. Biochim. Biophys. Acta 1515: 101-109 (2001); Lindgren, M., 등. Trends Pharmacol. Sci. 21 : 99-103 (2000); Gusarova, 등, J Clin Invest, 117: 99-111 (2007); Melnick, A., Biochem Soc Trans, 35: 802-806 (2007); Astriab-Fisher 등, Pharm Res, 19: 744-754 (2002); El-Andaloussi 등, J Gene Med, 8: 1262-1273 (2006); Cashman 등, MoI Ther, 6: 813-823 (2002)).
본 발명의 목적은 큐프레독신으로 암을 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공함에 있다.
본 발명은 우선적으로 세포에 진입하고, 또한 포유류 세포, 조직 및 동물의 전암성 병소의 발달을 억제하는 큐프레독신, 또는 큐프레독신의 변이체, 유도체 및 구고적 등가물일 수 있는 펩타이드를 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
추가적으로, 본 발명은 암 세포에 세포독성의 큐프레독신을 접촉시킴으로써 암 세포를 죽이는 방법에 관한 것이며, 상기 세포독성 큐프레독신은 하나 이상의 세포사멸 경로를 거쳐서 암세포에 우선적으로 진입하며, 그리고 상기 세포독성의 큐프레독신은 아주린의 절단부이며, 그리고 상기 아주린의 절단부는 서열번호: 2의 C-말단으로부터의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 아주린의 절단부는 녹농균으로부터 유래된 것이다. 다른 실시예에서, 상기 아주린의 절단부는 서열번호: 2를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 아주린의 절단부는 서열번호: 2로 구성된다.
또 다른 실시예에서, 상기 세포독성 큐프레독신은 카베올라-매개된 엔도사이토시스를 통해 암 세포에 진입할 수 있다. 또 다른 실시예에서, 상기 암세포 안으로 세포독성 큐프레독신의 진입은 골지체에 의해 매개된다.
추가적인 실시예에서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 암세포의 상태에 상관없이 암세포의 세포막에 접촉할 수 있는 아미노산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 세포독성 큐프레독신은 암세포의 세포막 상의 아미노산, 세포 표면 펩타이드, 및/또는 세포막 상의 수용체와 접촉한다. 일부 실시예에서, 상기 세포독성 큐프레독신은 서열번호: 1의 69, 70, 75, 76 및 85 위치에 있는 아미노산 각각을 포함한다. 이러한 실시예 중 어느것에서, 이러한 아미노산은 상기 서열번호: 1과 유사하거나 상응하는 상기 세포독성의 큐프레독신 내의 위치에 있을 수 있다.
또 다른 실시예에서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 서열번호: 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 서열번호: 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다.
본 발명은 암세포의 세포막에 접촉할 수 있는 단리된 펩타이드, 카베올라-매개된 엔도시토시스를 통해 암세포에 들어가고, 암세포를 죽이는 것과 관련이 있으며, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 2의 C-말단 아미노산을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 세포막 상의 아미노산들, 세포 표면 펩타이드들, 및/또는 수용체들에 접촉한다. 일부 실시예에서, 암 세포 안으로 단리된 펩타이드의 주입은 골지체에 의해 매개된다. 다른 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 녹농균으로부터 유래된다. 추가 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 2를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 2로 구성된다. 또 다른 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 2의 C-말단 아미노산으로 구성된다. 예를 들어, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 35, 36 및 37로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 35, 36 및 37로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성된다.
또한, 본 발명은 암세포의 세포막에 접촉할 수 있는 단리된 펩타이드, 카베올라-매개된 엔도시토시스를 통해 암세포에 들어가고, 암세포를 죽이는 것과 관련이 있으며, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 1의 69, 70, 75, 76 및 85 위치에서 발견되는 하나 이상의 아미노산들을 포함한다. 추가 실시예에서, 단리된 펩타이드는 서열번호: 1의 69, 70, 75, 76 및 85 위치에 있는 아미노산들을 각각 포함한다. 이러한 실시예에서, 상기 아미노산들은 상기 서열번호: 1과 유사하거나 상응하는 단리된 펩타이드 내의 위치에 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 세포막 상의 아미노산들, 세포 표면 펩타이드들, 및/또는 수용체들에 접촉한다.
추가적으로, 본 발명은 상술한 하나 이상의 단리된 펩타이드를 포함하는 약학조성물에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다. 다른 실시예에서, 약학적으로 허용되는 담체는 정맥 내 투여에 적합하다.
본 발명은 본 발명의 약학 조성물중 하나 이상을 치료적 유효량으로 환자에게 투여함으로써 포유류 환자를 치료하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 상기 환자는 인간이다. 다른 실시예에서, 상기 환자는 일반 사람보다 암 발전에 있어서 더 큰 위험에 있다. 추가적인 실시예에서, 상기 암은 흑색종, 유방암, 췌장암, 아교모세포종, 성상세포종, 폐암, 결장암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 피부암, 그리고 자궁경부암으로부터 선택된다. 다른 시릿예에서, 상기 환자는 적어도 하나의 고 위험군 특징을 가진다. 다른 실시예에서, 상기 환자는 전암성 병소를 가진다. 또 다른 실시예에서, 상기 환자는 암 또는 전암성 병소로부터 치료되었다. 일부 실시예에서, 상기 약학 조성물은 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 피하 주사, 흡입, 국부적 투여, 경피성 패치, 좌약, 유리체 주사, 및 경구 투여로 구성되는 군으로부터 선택된 경로에 의해 투여된다. 특정 실시예에서, 투여의 방식은 정매 내 주사에 의한다.
본 발명은 바이알에 본 발명의 하나 이상의 약학 조성물을 포함하는 키트와 관련이 있다. 일부 실시예에서, 상기 키트는 환자에게 활성 조성물을 투여하기 위한 장치를 더 포함한다.
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 단리된 펩타이드 및 카르고 화합물을 포함하는 약학 조성물과 더 관련이 있다. 일부 실시예에서, 상기 단리된 펩타이드는 상기 카르고 화합물에 연결된다. 일 구체적인 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 타목시펜이다. 다른 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 단백질, 리포단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 다당류, 핵산, 염료, 극미립자(microparticle), 나노입자, 독소 및 약물로 구성된 군으로부터 선택된다. 또 다른 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 검출가능한 물질이다. 예를 들어, 상기 카르고 화합물은 X-선 CT에 의해 검출가능한 X-선 조영제(contrast agent), MRI에 의해 검출가능한 자기 공명 영상 조영제, 또는 초음파 조영제일 수 있으며, 초음파에 의해 검출가능하다. 일부 실시예에서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 적당한 담체를 더 포함한다.
또한, 본 발명은 상술한 하나 이상의 단리된 펩타이드 및 카르고 화합물을 상술한 것처럼 포함하는 약학 조성물과 세포를 접촉시킴으로써 세포 안으로 카르고 화합물을 전달하는 단계를 포함하는 방법과 관련이 있다.
이러한 및 다른 양태, 효과, 및 본 발명의 특징은 다음의 도면 및 특정 실시예의 구체적인 설명으로부터 명확해질 것이다.
염기 서열의 기술
서열번호: 1. 녹농류(pseudomonas aeruginosa)로부터의 아주린의 아미노산 서열(Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys).
서열번호: 2. p28의 아미노산 서열, 녹농균으로부터의 아주린 잔기 50번 내지 77번 (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 3. 포르미디움 라미노숨(Phormidium laminosum)으로부터 유래한 플라스토시아닌의 아미노산 서열(Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Ile Thr Phe Ser Ser Asp Phe Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly).
서열번호: 4. 티오바실러스 페로옥시단스(Thiobacillus ferrooxidans)로부터 유래한 루스티시아닌의 아미노산 서열(Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Ile Pro Gly His Ala Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys).
서열번호: 5. 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터 유래한 슈도아주린의 아미노산 서열(Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr Phe Ile Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gm Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn).
서열번호: 6. 알칼리게네스 파이칼리스(Alcaligenes faecalis)로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열(Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser).
서열번호: 7. 아크로모박터 실로속시단 아종 데니트리피칸스 I(Achromobacter xylosoxidans ssp . denitriflcans I)로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열(Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Tip Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser Asn).
서열번호: 8. 보르데텔라 브론키셉티카(Bordetella bronchiseptica)로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열(Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val Leu Ala His Thr Lys Val Leu Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ala Lys Leu Ala Ala Gly Asp Asp Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Val Asp).
서열번호: 9. 메틸로모나스 종(Methylomonas sp . J)으로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열(Ala Ser Cys Glu Thr Thr Val Thr Ser Gly Asp Thr Met Thr Tyr Ser Thr Arg Ser Ile Ser Val Pro Ala Ser Cys Ala Glu Phe Thr Val Asn Phe Glu His Lys Gly His Met Pro Lys Thr Gly Met Gly His Asn Trp Val Leu Ala Lys Ser Ala Asp Val Gly Asp Val Ala Lys Glu Gly Ala His Ala Gly Ala Asp Asn Asn Phe Val Thr Pro Gly Asp Lys Arg Val Ile Ala Phe Thr Pro Ile He Gly Gly Gly Glu Lys Thr Ser Val Lys Phe Lys Val Ser Ala Leu Ser Lys Asp Glu Ala Tyr Thr Tyr Phe Cys Ser Tyr Pro Gly His Phe Ser Met Met Arg Gly Thr Leu Lys Leu Glu Glu).
서열번호: 10. 수막염균(Neisseria meningitidis) Z2491으로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Thr Ser Met Gly His Asn Ile Val Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Glu Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp).
서열번호: 11. 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescen)로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열(Ala Glu Cys Lys Thr Thr Ile Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Ala Ile Glu Ile Asp Lys Ala Cys Lys Thr Phe Thr Val Glu Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Leu Val Ile Ser Lys Gln Ala Asp Met Gln Pro Ile Ala Thr Asp Gly Leu Ser Ala Gly Ile Asp Lys Asn Tyr Leu Lys Glu Gly Asp Thr Arg Val Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Lys Asp Ser Leu Thr Ile Asp Val Ser Lys Leu Asn Ala Ala Glu Lys Tyr Gly Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Ile Ser Met Met Lys Gly Thr Val Thr Leu Lys).
서열번호: 12. 슈도모나스 클로로라피스(Pseudomonas chlororaphis)로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열(Ala Glu Cys Lys Val Asp Val Asp Ser Thr Asp Gln Met Ser Phe Asn Thr Lys Glu Ile Thr Ile Asp Lys Ser Cys Lys Thr Phe Thr Val Asn Leu Thr His Ser Gly Ser Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Tip Val Leu Ser Lys Ser Ala Asp Met Ala Gly Ile Ala Thr Asp Gly Met Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Gly Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Ile He Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Ala Gly Glu Ser Tyr Glu Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Asn Ser Met Met Lys Gly Ala Val Val Leu Lys).
서열번호: 13. 포도피어슨병균 9a5c(Xylella fastidiosa 9a5c)으로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열(Lys Thr Cys Ala Val Thr Ile Ser Ala Asn Asp Gln Met Lys Phe Asp Gln Asn Thr Ile Lys Ile Ala Ala Glu Cys Thr His Val Asn Leu Thr Leu Thr His Thr Gly Lys Lys Ser Ala Arg Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Thr Lys Thr Thr Asp Met Gln Ala Val Ala Leu Ala Gly Leu His Ala Thr Leu Ala Asp Asn Tyr Val Pro Lys Ala Asp Pro Arg Val Ile Ala His Thr Ala Ile He Gly Gly Gly Glu Arg Thr Ser Ile Thr Phe Pro Thr Asn Thr Leu Ser Lys Asn Val Ser Tyr Thr Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Asn Phe Gly Gly).
서열번호: 14. 오이(Cucumis sativus)로부터 유래한 스텔라시아닌의 아미노산 서열(Met Gln Ser Thr Val His Ile Val Gly Asp Asn Thr Gly Trp Ser Val Pro Ser Ser Pro Asn Phe Tyr Ser Gln Trp Ala Ala Gly Lys Thr Phe Arg Val Gly Asp Ser Leu Gln Phe Asn Phe Pro Ala Asn Ala His Asn Val His Glu Met Glu Thr Lys Gln Ser Phe Asp Ala Cys Asn Phe Val Asn Ser Asp Asn Asp Val Glu Arg Thr Ser Pro Val Ile Glu Arg Leu Asp Glu Leu Gly Met His Tyr Phe Val Cys Thr Val Gly Thr His Cys Ser Asn Gly Gln Lys Leu Ser Ile Asn Val Val Ala Ala Asn Ala Thr Val Ser Met Pro Pro Pro Ser Ser Ser Pro Pro Ser Ser Val Met Pro Pro Pro Val Met Pro Pro Pro Ser Pro Ser).
서열번호: 15. 클로로플렉서스 아우란시아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 유래한 아우라시아닌 A의 아미노산 서열 (Met Lys Ile Thr Leu Arg Met Met Val Leu Ala Val Leu Thr Ala Met Ala Met Val Leu Ala Ala Cys Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Val Thr Ile Glu Ile Gly Ser Lys Gly Glu Glu Leu Ala Phe Asp Lys Thr Glu Leu Thr Val Ser Ala Gly Gln Thr Val Thr Ile Arg Phe Lys Asn Asn Ser Ala Val Gln GIn His Asn Trp Ile Leu Val Lys Gly Gly Glu Ala Glu Ala Ala Asn Ile Ala Asn Ala Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Ala Asn Tyr Leu Pro Ala Asp Lys Ser Asn Ile Ile Ala Glu Ser Pro Leu Ala Asn Gly Asn Glu Thr Val Glu Val Thr Phe Thr Ala Pro Ala Ala Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Val Pro Gly His Tyr Pro Leu Met Gln Gly Lys Leu Val Val Asn).
서열번호: 16. 클로로플렉서스 아우란시아쿠스로부터 유래한 아우라시아닌 B의 아미노산 서열(Ala Ala Asn Ala Pro Gly Gly Ser Asn Val Val Asn Glu Thr Pro Ala Gln Thr Val Glu Val Arg Ala Ala Pro Asp Ala Leu Ala Phe Ala Gln Thr Ser Leu Ser Leu Pro Ala Asn Thr Val Val Arg Leu Asp Phe Val Asn Gln Asn Asn Leu Gly Val Gln His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp Thr Pro Asn Ala Leu Ala Trp Thr Ala Met Leu Asn Ala Gly Glu Ser Gly Ser Val Thr Phe Arg Thr Pro Ala Pro Gly Thr Tyr Leu Tyr Ile Cys Thr Phe Pro Gly His Tyr Leu Ala Gly Met Lys Gly Thr Leu Thr Val Thr Pro).
서열번호: 17. 오이로부터 유래한 오이 기초 단백질의 아미노산 서열(Ala Val Tyr Val Val Gly Gly Ser Gly Gly Trp Thr Phe Asn Thr Glu Ser Trp Pro Lys Gly Lys Arg Phe Arg Ala Gly Asp Ile Leu Leu Phe Asn Tyr Asn Pro Ser Met His Asn Val Val Val Val Asn Gln Gly Gly Phe Ser Thr Cys Asn Thr Pro Ala Gly Ala Lys Val Tyr Thr Ser Gly Arg Asp Gln Ile Lys Leu Pro Lys Gly Gln Ser Tyr Phe Ile Cys Asn Phe Pro Gly His Cys Gln Ser Gly Met Lys Ile Ala Val Asn Ala Leu).
서열번호: 18. 임균(Neisseria gonorrhoeae)으로부터 유래한 Laz의 아미노산 서열(Cys Ser Gln Glu Pro Ala Ala Pro Ala Ala Glu Ala Thr Pro Ala Gly Glu Ala Pro Ala Ser Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala Ala Pro Ala Asp Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Gly Asn Cys Ala Ala Thr Val Glu Ser Asn Asp Asn Met Gln Phe Asn Thr Lys Asp Ile Gln Val Ser Lys Ala Cys Lys Glu Phe Thr Ile Thr Leu Lys His Thr Gly Thr Gln Pro Lys Ala Ser Met Gly His Asn Leu Val Ile Ala Lys Ala Glu Asp Met Asp Gly Val Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp Ala Arg Val Val Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Gly Gly Glu Glu Ser Ser Leu Thr Leu Asp Pro Ala Lys Leu Ala Asp Gly Asp Tyr Lys Phe Ala Cys Thr Phe Pro Gly His Gly Ala Leu Met Asn Gly Lys Val Thr Leu Val Asp)
서열번호: 19. 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus)로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열(Met Ser Leu Arg Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ser Phe Gly Ala Gln Ala Ser Ala Glu Cys Glu Val Ser Ile Asp Ala Asn Asp Met Met Gln Phe Ser Thr Lys Thr Leu Ser Val Pro Ala Thr Cys Lys Glu Val Thr Leu Thr Leu Asn His Thr Gly Lys Met Pro Ala Gln Ser Met Gly His Asn Val Val Ile Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp Glu Arg Val Tyr Ala His Thr Lys Val Val Gly Gly Gly Glu Ser Thr Ser Ile Thr Phe Ser Thr Glu Lys Met Thr Ala Gly Gly Asp Tyr Ser Phe Phe Cys Ser Phe Pro Gly His Tip Ala Ile Met Gln Gly Lys Phe Glu Phe Lys),
서열번호: 20. 클로로플렉서스 아우란시아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터 유래한 아우라시아닌 B의 아미노산 서열 중 57번 내지 89번(His Asn Trp Val Leu Val Asn Gly Gly Asp Asp Val Ala Ala Ala Val Asn Thr Ala Ala Gln Asn Asn Ala Asp Ala Leu Phe Val Pro Pro Pro Asp).
서열번호: 21. 참다래 꽃썩음병균(Pseudomonas syringae)으로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열 중 51번 내지 77번(Ser Lys Lys Ala Asp Ala Ser Ala Ile Thr Thr Asp Gly Met Ser Val Gly Ile Asp Lys Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 22. 수막염균으로부터 유래한 Laz의 아미노산 서열 중 89번 내지 115번(Ile Gly Lys Thr Glu Asp Met Asp Gly Ile Phe Lys Asp Gly Val Gly Ala Ala Asp Thr Asp Tyr Val Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 23. 장염 비브리오균으로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열 중 52번 내지 78번(Ala Asp Thr Ala Asn Ile Gln Ala Val Gly Thr Asp Gly Met Ser Ala Gly Ala Asp Asn Ser Tyr Val Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 24. 보르데텔라 브론키셉티카로부터 유래한 아주린의 아미노산 서열 중 51번 내지 77번(Thr Lys Thr Ala Asp Met Gln Ala Val Glu Lys Asp Gly Ile Ala Ala Gly Leu Asp Asn Gln Tyr Leu Lys Ala Gly Asp).
서열번호: 25. p18의 아미노산 서열, 녹농균으로부터의 아주린 잔기 50번 내지 67번(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly).
서열번호: 26. 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 36번 내지 88번의 아미노산 서열(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly)
서열번호: 27. 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 36번 내지 77번의 아미노산 서열(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 28. 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 36번 내지 89번의 아미노산 서열(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser).
서열번호: 29. 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 36번 내지 128번의 아미노산 서열(Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Tip Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys).
서열번호: 30. 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 53번 내지 70번의 아미노산 서열(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys).
서열번호: 31. 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 53번 내지 64번의 아미노산 서열(Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met)
서열번호: 32. 아미노산 서열 DGXXXXXDXXYXKXXD.
서열번호: 33. 아미노산 서열 DGXXXXDXXYXKXXD.
서열번호: 34. p18b의 아미노산 서열, 녹농균으로부터의 아주린 잔기 60번 내지 77번 (Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 35. p28의 C-말단으로부터 12번째까지의 아미노산의 서열, 녹농균으로부터의 아주린 잔기 66-77(p12)(Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 36. p28의 C-말단으로부터 10번째까지의 아미노산의 서열, 녹농균으로부터의 아주린 잔기 68번 내지 77번 (Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 37. p28의 C-말단으로부터 11번째까지의 아미노산의 서열, 녹농균으로부터의 아주린 잔기 67번 내지 77번(Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 38은 아주린 잔기 p28의 변이체의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Val Val Thr Asp Thr Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 39은 아주린 잔기 p28의 변이체의 아미노산 서열이다 (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Leu Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Leu Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 40은 아주린 잔기 p28의 변이체의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Val Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Val Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 41은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Asp Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala Met Gly Asp Thr Val Val Gly Gln Met Asp Ala Ala Thr Ser Leu).
서열번호: 42은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(아세틸화-Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp-아미드화).
서열번호: 43은 헥사펩타이드의 아미노산 서열이다 (Val Ser Pro Pro Ala Arg).
서열번호: 44은 헥사펩타이드의 아미노산 서열이다(Tyr Thr Pro Pro Ala Leu).
서열번호: 45은 헥사펩타이드의 아미노산 서열이다(Phe Ser Phe Phe Ala Phe).
서열번호: 46은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Thr Pro Gly Cys).
서열번호: 47은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Cys Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 48은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Cys Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 49은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다 (Leu Ser Thr Ala Cys Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 50은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Cys Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 51은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 52은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 53은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 54은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Cys Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 55은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 56은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다 (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Cys Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 57은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 58은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Cys Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 59은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 60은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Cys Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 61은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 62은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asn Gly Cys Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 63은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Ala Thr Met Gly Ser Gly Leu Cys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 64은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다 (Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Leu Thr Ala Ser Gly Leu Cys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 65은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 66은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 67은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 68은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 69은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다 (Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 70은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 71은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Tip Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 72은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 73은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 74은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp).
서열번호: 75은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다(Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Ly s Pro Asp Asp).
서열번호: 76은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다 (X1 Ser X2 Ala Ala Asp X3 X4 X5 Val Val X6 Asp X7X8 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp X9).
서열번호: 77은 큐프레독신에서 파생되어 변형된 펩타이드의 아미노산 서열이다 (X1 Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala X2 X3 Asp X4 Val Val X5 X6 X7 Asp Ala Ala X8 Ser X9).
서열번호: 78은 pUC19-azu에 대한 프라이머이다(5'-CGGGATCCCC GGCAACCTGC CGAAGAACGT CATGGGC -3').
서열번호: 79는 pUC19-azu에 대한 프라이머이다(5'-CGGAATTCGC ATCACTTCAGG GTCAGGG-3').
서열번호: 80은 pGST-azu 36번 내지 50번에 대한 프라이머이다(5'-GGCCACAACT GGGTACTGTG AACCGCCGCC GACATGCAG-3').
서열번호: 81은 pGST-azu 36번 내지 50번에 대한 프라이머이다(5'-CTGC ATGTCG GCGGCGGTTC ACAGTACCCA GTTGTGGCC-3').
서열번호: 82는 pGST-azu 36번 내지 77번에 대한 프라이머이다(5'-CCTGAAGCCC GACGACTGAC GTGTCATCGC CCACACC-3').
서열번호: 83은 pGST-azu 36번 내지 77번에 대한 프라이머이다(5'-GGTGTGGGCG ATGACACGTC AGTCGTCGGG CTTCAGG-3').
서열번호: 84는 pGST-azu 36번 내지 89번에 대한 프라이머이다(5'-CCAAGCTGAT CGGCTCGTGA GAGAAGGACT CGGTGACC-3').
서열번호: 85는 pGST-azu 36번 내지 89번에 대한 프라이머이다(5'-GGTCACCGAG TCCTTCTCTC ACGAGCCGAT CAGCTTGG-3').
서열번호: 86은 azu 50번 내지 77번에 대한 프라이머이다(5'-CGGGATCCTG AGCACCGCCG CCGACATGCA GGG-3').
서열번호: 87은 azu 67번 내지 77번에 대한 프라이머이다(5'-CGGGATCCCC GGCCTGGACA AGGATTACCT GAAGCCCG-3').
서열번호: 88은 역방향 프라이머이다(5'-CGGAATTCGC ATCACTTCAG GGTCAGGG-3').
서열번호: 89는 pGST-azu의 50번 내지 66번에 대한 프라이머이다(5'-GACGGCATGG CTTCCTGACT GGACAAGGAT TACC -3').
서열번호: 90은 pGST-azu의 50번 내지 66번에 대한 프라이머이다(5'-GGTAATCCTT GTCCAGTCAG GAAGCCATGC CGTC- 3').
서열번호: 91은 정방향 프라이머이다(5'-CGGGATCCCC ATGGTGAGCA AGGGCG-3')
서열번호: 92는 역방향 프라이머이다(5'-CGGAATTCCT TGTACAGCTC GTCCATGCCG-3').
서열번호: 93은 pGST-azu의 50번 내지 77번에 대한 프라이머이다(5'-CCGCTCGAGC CTGAGCACCG CCGCCATGCA GGG-3').
서열번호: 94는 pGST-azu의 50번 내지 77번에 대한 프라이머이다(5'-TTTTCCTTTT GCGGCCGCTC AGTCGTCGGG CTTCAGGTAA TC C-3').
서열번호: 95는 폴리아르기닌의 아미노산 서열이다, 또는 Arg8(Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg).
서열번호: 95는 p18의 일부분의 아미노산 서열이다(Ser Gly Leu Asp Lys Asp).
도 1은 p28과 아주린의 효험을 알아보기 위해 평가된 분비선들을 사진으로 묘사하고 있다. 도 1a는 DMBA로 처리한 분비선에서 나타나는 폐포 병소와, 그들을 화학적 방어제와 함께 DMBA를 처리한 분비선과 비교함에 있어 폐포 병소의 대표적인 사진을 보이고 있다. 도 1b 내지 1f는 폐포 병소들의 발달에 대해 p28이 보이는 효과를 대표적인 사진들을 통해 보여준다.
도 2는 DMBA에 의해 유래된 유선세포 병소에 대한 p28의 효험을 그래프를 통해 묘사한다.
도 3은 분비선 병소들의 대표적인 부위들과 p28의 효과를 사진을 통해 묘사한다.
도 4는 DMBA에 의해 유래된 분비선 병소에 대한 p28의 효험을 그래프를 통해 묘사한다.
도 5는 야생성 아주린의 α-나선의 국소부위를 보여줄 뿐만 아니라 야생성 아주린 50-77 단백질 전달 도메인의 국소부위를 보여준다. 아주린 50-77 도메인에서 3개의 아미노산이 프롤린으로 교체된 것을 표시한다.
도 6 (a), (b) 및 (c). (a) 도표는 GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질의 구조를 나타낸다. 상기 gfp 유전자는 gfp 유전자의 3'-말단에서 (GST-GFP을 위해) 주입되었고, 그 후에 상기 azu 50-77 조각은 GST-GFT-azu 50-77 융합 단백질을 만들도록 뼈대가 완성된 상기 gfp 유전자의 3'-말단에서 연결된다. GST-GFP-azu 50-77은 세포 용해물로부터의 단일 융합 단백질로 정제되었다. 정제된 단백질은 SDS-PAGE에 제공되고, Coomassi Blue staining으로 검출되었다(6(b) 및 또한 항-아주린 항체를 사용하여 Western blotting에 의해 검출됨(6(c)).
도 7 (a), (b) 및 (c). 도표는 GST-녹색 형광 단백질(GFP) 및 GST-GFP-아주린 융합 단백질의 내재화에 대한 동역학적 연구를 보여준다. 녹색 형광은 37 ℃에서 1 시간 동안 GST-GFP(10(a)) 또는 GST-GFP-azu 50-77(10(b))의 다양한 농도로 처리된 J774 세포에서 분석되었다. (c) GST-GFP-azu 50-77의 내재화의 시간-의존성. J774 세포는 37 ℃에서 표시된 시간 동안 200 μg/ml의 GST-GFP-azu 50-77로 배양되었고, 유동세포 분석기로 분석되었다.
[127]도 8 (a),(b) 및 (c). (a) 외독소 도메인 III(아미노산 405-613) 뿐만 아니라 도메인 1b의 일부(아미노산 381-404)를 보여주는 도표는 이전에 GST-GFP 융합으로 설명되었던 GST(GST-PEDIII)에 융합했다. 그 다음에, 상기 azu 50-77 조각은 PCR을 사용하여 GST-PEDIII(GST-PEDIII-azu 50-77)의 카복실기 말단에 연결됐다. (b) 융합 단백질은 글루타티온 세파로오스 4B 컬럼 겔 필트레이션 컬럼 크로마토그래피(glutathion Sepharose 4B column gel filtration column chromatography)에 의해 정제되고, 크기 결정을 위해 SDS-PAGE를 작동시켰다. (c) PEDIII-매개된 세포독성에 의해 결정된 UISO-Mel-2 암세포 및 정상적인 섬유아세포(FBT)에서 GST-PEDIII-azu 50-77 융합 단백질의 작용을 보여주는 도표이다.
[128]도 9. UISO-Mel-2 암세포 및 FBT 세포에 대하여 GST-PEDIII-루스티시아닌 융합 단백질의 PEDIII-매개된 세포독성을 보여주는 도표이다. 표시된 다양한 농도의 GST-PEDIII 및 GST-PEDIII-azu 50-77은 UISO-Mel-2 및 FBT 세포와 함께 24시간 동안 배양되었고, 그 이후에 상기 세포 생존력은 MTT 실험에 의해 결정됐다.
도 10, (a), (b) 및 (c). 다양한 조직생성을 통해 형성된 암세포주들과 정상 세포주들에 대한 아주린에서 파생된 펩타이드, p28 또는 p18의 침투를 사진을 통해 나타내고 있다. (a) 37 ℃ 조건 하에 2 시간 동안 놓아둔 뒤에 일어난 알렉사플루오르(alexafluor) 568로 표지된 p28 또는 p18의 침투를 보이는 사진들이다. 양이온성 Arg8 (서열번호: 95)가 대조군으로 사용되었다. (b) 같은 세포주들에 알렉사플루오르 568로 표지된 p28 또는 p18을 37 ℃ 조건에서 2시간 동안 놓아둔 뒤에 일어난 침투의 유세포 분석기를 통한 분석을 그래프를 통해 나타내고 있다. (c) 그래프들은 정상 세포주에서 배수 증가한 형광을 나타내고 있다. 4개의 흑색종 세포주로 p28 또는 p18의 침투의 유사한 관찰은 정상 세포주들에서 형광이 몇 배수 이상 증가한 것을 보인다.
도 11, (a) 및 (b). Azu 60-77 (p18b)와 azu 66-77 (pl2)가 암세포 및 정상 세포주 안으로의 유입하는 것을 사진을 통해 나타내고 있다. 세포는 알렉사플루오르 568로 표지된 p18b (a) 또는 p12 (b)와 함께 37 ℃ 조건에서 2시간 동안 배양된 뒤 이미지은 공초점 현미경을 통해 기록되었다.
도 12, (a) 및 (b). 아주린과 그 펩타이드들의 세포막 독성을 나타낸 그래프들이다. (a) UISO-Mel-2 세포이 37 ℃ 조건에서 p28, p18 그리고 아주린의 각기 다른 농도 조건 하에 10분 동안 노출되었을 때의 LDH 유출 분석이다. 표준 용해 버퍼 (cytotox-one 시약)이 양성 대조군으로 첨가되었다. 노출에 따른 형광도외 변화는 λex 560nm와 λem 590nm에서 측정되었다. 용해 버퍼는 100% LDH 방출로 정의되었다. 데이터는 통제군의 양성 형광도 % 를 나타낸다. 데이터는 평균 ±SEM으로 보여졌다. (b) p28, p18 그리고 아주린 조건 하에 배양된 인간 적혈구 세포로부터의 헤모글로빈 유출이다. 인간 적혈구 세포은 37 ℃에서 펩타이드 처리 조건으로 배양되었으며 540nm 에서의 흡광도가 측정되었다. 0.1% Triton X-100 처리에 따른 헤모글로빈 방출이 100% 헤모글로빈 방출로 정의되었다. 데이터는 평균 삼중 측정에서의 ±SEM을 나타낸다.
도 13, (a), (b), (c) 및 (d). UISO-Mel-2 세포을 향한 p28과 p18의 온도 의존성 그리고 경쟁적 내재화를 나타낸 사진들이다. 2011M 조건에서 알렉사플루오르 568으로 표지된 p28 (a) 또는 p18 (b)의 침투가 각기 다른 온도 조건에서 공초점 현미경을 이용하여 평가되었다. (c)와 (d) 5 uM 조건에서 알렉사플루오르 568으로 표지된 p28 또는 p18이 비표지된 펩타이드들의 존재/부재 하(200배 초과량)에 37 ℃에서 30분 동안 놓아둔 이후 UISO-Mel-2 세포을 향해 침투한 정도의 공초점 분석이다.
도 14, (a), (b), (c) 및 (d). (a) p28, p18 (20 uM) 그리고 Arg8 (서열번호: 95) (10 uM)이 헤파린 황산의 존재/부재 하 (100 ug/ml)에 37 ℃에서 1시간 동안 놓아둔 이후 UISO-Mel-2 세포을 향해 침투한 정도의 공초점 분석이다. (b) 억제제의 존재 하에 p28 또는 p18의 침투를 유세포 분석기로 분석한 결과를 나타낸 그래프들이다. 억제제의 부재 (대조군) 하에 측정된 세포 형광 강도가 100%로 간주되었다. (c) 억제제의 존재 하에 섬유아세포를 향한 p28과 p18의 침투를 FRCS 분석한 결과를 나타낸 그래프들이다. (d) 카베올린 I과의 p18과 p28의 공동 국지화를 보이는 사진들이다 (판 1). UISO-Mel-2 세포은 알렉사플루오르 568으로 표지된 p18 또는 p28 (20 uM) 또는 배지들에서 37 ℃ 조건에서 2시간 동안 배양되었다. 세포은 항-카베올린 1 면역염색을 위해 고착된 뒤에 가공되었다. 항-골진 97 항체들에 뒤따른, 알렉사플루오르 568으로 표지된 p18 또는 p28 (20 uM)의 37 ℃ 조건에서 2시간 후에 UISO-Mel-2 세포을 향한 침투를 공초점 분석했다 (판 2). 알렉사플루오르 568로 표지된 아주린, p28, 그리고 p18 (빨간색)과 미토트랙커 (녹색) (판 3)과 리소트랙커 (녹색) (판 4) 염료들의 UISO-Mel-2 세포 내에서의 공동 국지화. 세포은 37 ℃에서 20uM 아주린, p28, p18과 함께, 또는 오로지 배지 조건 하에서 배양되었다. 90분 동안 배양한 뒤, 미토트랙커 / 리소트랙커 탐침들이 더해졌으며 세포은 30분 동안 배양되었다. 세포은 DAPI (파란색)로 대비염색 되었다. 아주린, p28 또는 p18의 공동 국지화는 노란색 형광으로 나타난다.
도 15, (a) 및 (b). 37 ℃에서 72시간 동안 아주린, p28 또는 p18의 농도를 증가하는 조건 하에 배양된 UISO-Mel-2 세포을 나타낸 그래프들이다. MTT (a); 직접 세포 계수 (b). 대조군 웰에서의 세포 생육 (MTT) 또는 세포 개수가 100%로 간주되었다. 데이터는 평균 ±SEM을 나타낸다.
도 16, (a) 내지 (h). 단백질 및/또는 완충액으로 세포를 치료한 후에공초점 현미경을 사용하여 얻은 세포에 의해 흡수한 화합물을 보여주는 묘사 사진이다. (a) 인간 뇌 종양 LN-229 세포는 라벨링 되지 않은 단백질 또는 PBS 완충액 20 μM로 2 시간 동안 선처리 되었다. 모든 완충액이 제거된 이후에 Alex568-paz 20 μM이 30 분 동안 37 ℃에서 첨가되었다. (b) 상기 LN-229 세포는 이후에 라벨링 되지 않은 단백질 또는 PBS 완충액 20 μM 및 Alex568-paz 20 μM로 30 분 동안 37 ℃에서 처리되었다. (c) 인간 뇌 종양 LN-229 세포의 다른 군은 라벨링 되지 않은 단백질 또는 PBS 완충액 10 μM로 선처리 된 후에, PBS 완충액을 사용하여 세번 세척되었다. 모든 완충액이 제거된 이후에 Alex568-paz 10 μM이 30 분 동안 37 ℃에서 첨가되었다. (d) 상기 LN-229 세포는 이후에 라벨링 되지 않은 단백질 또는 PBS 완충액 10 μM 및 Alex568-paz 10 μM로 30 분 동안 37 ℃에서 처리되었다. (e) 인간 뇌 종양 LN-229 세포는 라벨링 되지 않은 단백질 또는 PBS 완충액 20 μM로 처리되었고, Alex568-paz 20 μM로 30 분 동안 37 ℃에서 처리되었다. (f) 인간 뇌 종양 LN-229 세포는 Alex568-H.8 20 μM로 30 분 동안 37 ℃에서 처리되었다. (g) 인간 뇌 종양 LN-229 세포는 Alex568-단백질 20 μM로 30 분 동안 37 ℃에서 처리되었다. (h) 인간 유방선암 MCF-7 세포는 Alex568-단백질 20 μM로 30 분 동안 37 ℃에서 처리되었다.
도 17, (a) 내지 (c). 세포 안으로 결합 및 들어가는 펩타이드를 묘사하는 그래프 및 차트이다. (a) UISO-Mel-2 또는 섬유아세포(3 x 105 세포)는 패놀레드가 없는 MEME 배지에 부유 되었다. 반응은 30, 60, 90, 120 초 동안 얼음 상에서 Alexaflour 568-포화된 p28을 10, 50, 100, 150, 250, 300 및 400 μM 첨가함으로써 시작되었다. 세포는 유세포 분석기로 분석되었다. (b) Km 및 Vmax는 펩타이드 농도(μM)를 속도(MFI/sec)에 도시함으로써 계산되었다. (c) 펩타이드 결합 및 주입은 모든 Mel2 세포(50,000 cells/ml)를 사용하여 결정되며, 1000 fold excess의 라벨링되지 않은 p28의 존재/부존재 하에서 방사선 동위원소로 라벨링된 아주린의 농도를 높여가며(0-175 mM) 또는 아주린의 농도를 높여가며 30 분 동안 37 ℃에서 배양되었고, 세포 펠렛내에 남아있는 방사능은 감마카운터를 사용하여 세어졌다. 125I 아주린만으로 배양된 세포내의 방사능은 총 결합에 고려되거나; 라벨링되지 않은 아주린 또는 p28의 존재하에서의 방사능은 비특이적 결합에 고려되었다. 특이적 결합은 총 결합과 만들어진 스캐차드플롯(Scatchard plot)으로부터 비특이적 결합을 뺌으로써 결정되었다.
도 18, (a) 내지 (c). 멜라노마 MEL-23 종양을 가지는 마우스에 p28 염료 복합물을 250 μL 중 60 μ몰랄 농도로 주입한 이후에, 그리고 (a) 대조군 PBS를 주입한지 24 시간 이후에 찍은 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이고, (b) 대조군 PBS를 주입한 지 48 시간 이후에 찍은 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다. (c) 멜라노마 MEL-23 종양을 가지는 마우스에 p28을 200 μM로 주입한 지 24 시간 및 48 시간 후에 찍은 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 19, (a) 내지 (c), 멜라노마 MEL-23 종양을 가지는 마우스에 p18을 60 μ몰랄농도로 주입 지 (a) 17 시간, (b) 24 시간, 및 (c) 46 시간 후에 찍은 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다. 또한, (c)는 p18을 주입한 지 46 시간 후에 심장, 폐, 간, 시장, 췌장, 및 뇌를 포함하는 마우스의 장기를 찍은 사진을 묘사한 것이다.
도 20, (a) 및 (b). (a) p18, p28 및 arg-8 (서열번호 95)를 60 μ몰농도로 주입한 지 12 시간 후에 찍은 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다. (b) p18, p28 및 arg-8 (서열번호 95)를 주입한 지 12 시간 후에 찍은 마우스의 뇌를 포함하는 마우스의 장기의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 21, (a) 및 (b). (a) 멜라노마 MEL-6 종양을 가지는 마우스에 600 μM의 p18 및 arg-8(서열번호 95)을 미정맥(tail vein)에 주입한 지 40 시간 후에 찍은 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다. p18로 처리된 동물들은 50 만개의 세포를 수용했고, arg-8(서열번호 95)로 처리된 동물들에서는 100 만개의 세포를 수용했다. (b) 600 μM의 p18 및 arg-8(서열번호 95)을 주입한 지 40 시간 후에 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다.
도 22, (a) 및 (b). (a) 멜라노마 MEL-23 종양을 가지는 마우스에 60 μM의 p28 및 arg-8(서열번호 95)을 주입한 지 16 시간 후에 찍은 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다. (b) 멜라노마 MEL-23 종양을 가지는 마우스에 60 μM의 p28 및 arg-8(서열번호 95)을 주입한 지 24 시간 후에 찍은 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 23. 멜라노마 MEL-23을 가지는 마우스 안으로 60 μM의 p28 및 p18 염료를 주입한 지 48 시간 후에 찍은 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다.
도 24. MEL-23 종양 및 장기를 가지는 마우스 안으로 60 μM의 p28을 주입한 지 24 시간 후에 찍은 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다.
도 25. 60 μM의 p28 및 arg-8(서열번호 95)을 주입한 지 16 시간 후에 찍은 멜라노마 MEL-23을 가지는 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 26. 60 μM의 p18을 주입한 지 16 시간 후에 찍은 멜라노마 MEL-23을 가지는 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 27. 240 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 고 투여량 처리한지 10 시간 및 24 시간 후에 찍은 종양을 가지는 마우스의 측면 사진을 묘사한 것이다.
도 28. 240 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 고 투여량 처리한지 28 시간 후에 찍은 MCF-7 종양을 가지는 마우스 및 장기들의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다. 또한, 240 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 고 투여량 처리한지 28 시간 후에 찍은 MCF-7을 가지는 마우스의 사진을 묘사한 것이다.
도 29. 240 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 고 투여량 처리한지 50 시간 후에 찍은 종양을 가지는 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 30. 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)을 HCT-116 종양 및 장기를 가지는 마우스의 미정맥 안으로 주입한지 24 시간 후에 찍은 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다.
도 31, (a) 및 (b). (a) 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)을 HCT-116 종양 및 장기를 가지는 마우스의 미정맥 안으로 주입한지 24 시간 후에 찍은 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다. (b) 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)을 미정맥 안으로 주입한지 21 시간 후에 HCT-116 종양을 가지는 마우스로부터 찍은 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다.
도 32, (a) 및 (b). (a) 120 μM의 p28을 주입한지 24 시간 후에 HCT-116을 갖는 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사하며, 100 만개의 세포를 미정맥에 주입한지 47 일에 HCT-116을 갖는 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 33. 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 처리한지 24 시간 후에 찍은 MEL-6 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다.
도 34, (a) 및 (b). (a) 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95) 및 60 μM의 arg-8(서열번호 95)을 주입한지 22 시간 후에 찍은 MEL-6 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다. (b) 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95) 및 60 μM의 arg-8(서열번호 95)로 처리한 후 MEL-6 마우스의 사진을 묘사한 것이다.
도 35, (a) 및 (b). (a) 60 및 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 처리한지 22 시간 후에 찍은 HT-1080 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다. (b) 60 및 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 처리한지 22 시간 후에 찍은 HT-1080 마우스의 뇌 사진을 나란히 묘사한 것이다.
도 36. 60 및 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 처리한지 16 시간 후에 가진 독소루비신(Doxorubicin) vs p28 연구 과정의 HT-1080 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사할 것이다.
도 37, (a) 및 (b). (a) 60 및 120 μM의 p28 및 arg-8(서열번호 95)로 처리한 지 22 시간 후에 찍은 HT-1080 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다. (b) 60 및 120 μM의 p28 및 arg-8(서열번호 95)로 처리한 지 22 시간 후에 찍은 HT-1080 마우스의 뇌 사진을 나란히 묘사한 것이다.
도 38, (a) 및 (b). (a) 60 및 120 μM의 p18 및 arg-8(서열번호 95)로 처리한 지 22 시간 후에 찍은 HT-1080 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다. (b) 60 및 120 μM의 p18 및 arg-8(서열번호 95)로 처리한 지 22 시간 후에 찍은 HT-1080 마우스의 뇌 사진을 나란히 묘사한 것이다.
도 39, (a) 내지 (e). 미정맥을 거쳐서 처리된 폐 전이를 가지는 HT-1080의 사진을 묘사하는 것으로, (a) 복강 내에 3 mg/kg 독소루비신 3 회 처리; (b) 복강 내에 5 mg/kg p28 매일 주입; (c) PBS 대조군, 복강내에 매일 PBS 주입; (d) 복강 내에 10 mg/kg p28 매일 주입; (e) 복강 내에 매일 20 mg/kg 주입했다.
도 40, (a) 및 (b). (a) 1 x 106 세포가 미정맥 안으로 주입되고(43 일 동안), 모든 처리된 마우스는 폐 전이를 가지는 동물 연구에서, 60 μM의 p28을 미정맥 안으로 주입한 지 24 및 26 시간 후에 찍은 HT-1080 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다. (b) 1 x 106 세포가 미정맥 안으로 주입되는(43 일 동안) 동물 연구에서, 60 μM의 p28을 미정맥 안으로 주입한 지 22 시간 후에 찍은 HT-1080 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다. 동물 6982는 사진을 찍을 때 죽었었다.
도 41. 1 x 106 세포가 미정맥 안으로 주입되는(43 일 동안) 동물 연구에서, 60 μM의 p28을 미정맥 안으로 주입한 지 26 시간 후에 찍은 HT-1080 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 42, (a) 및 (b). 60 및 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 처리된 지 12 시간 후에 찍은 (a) 마우스의 장기의 사진, (b) Balb-C 펩타이드 연구에서 마우스의 배의 사진을 묘사한 것이다.
도 43, (a) 및 (b). 60 및 120 μM의 p18, p28 및 arg-8(서열번호 95)로 처리된 지 24 시간 후에 찍은 (a) 마우스의 장기의 사진, (b) Balb-C 펩타이드 연구에서 마우스의 배의 사진을 묘사한 것이다.
도 44. 60 μM의 p18 및 arg-18(서열번호 95)을 미정맥 안으로 주입한 지 16 시간 후에 MEL-6 마우스(미정맥을 거쳐 50 만개의 세포가 주입됨)의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 45, (a) 내지 (d). p18 및 p28로 처리한 이후에 마우스의 장기, 특히 마우스의 뇌의 사진을 묘사한 것이다.
도 46. p28, p18 및 arg-8(서열번호 95)로 처리한 지 24 시간 후에 찍은 MEL-6 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다.
도 47, (a) 내지 (c). (a) 60 μM의 p28, p18 및 arg-8(서열번호 95)을 주입한 지 3 시간 후에 MEL-6 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 거이다. (b) 60 μM의 p28, p18 및 arg-8(서열번호 95)을 주입한 지 22 시간 후에 MEL-6 마우스 및MEL-6 마우스의 장기의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다. (c) 60 μM의 p28, p18 및 arg-8(서열번호 95)을 주입한 지 24 시간 후에 MEL-6 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다.
도 48, (a) 및 (b). p18 및 p28을 (a) 마우스의 뇌 및 (b) 마우스의 장기에 흡수한 것을 묘사한 것이다.
도 49. 50 만개의 세포가 정맥 내 주입으로 미정맥에 주입하는 연구에서, 24 μM의 p18 및 arg-8(서열번호 95)을 미정맥 안으로 주입한 지 120 시간 후에 찍은 MEL-6 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 50. p18로 처리한 지 168 시간 후에 찍은 MEL-6 마우스의 장기의 사진을 묘사한 것이다,
도 51. arg-8(서열번호 95) 및 p18을 주입한 지 72 시간 이후에 찍은 MEL-6 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사하고, 세포를 주입한 지 41 일 후에 찍은 MEL-6 마우스의 측면 및 등면 사진을 묘사한 것이다.
도 52. arg-8(서열번호 95) 및 p18을 주입한 이후에 찍은 마우스의 등 사진을 묘사한 것이다.
도 53. arg-8 및 p18을 주입한 지 3, 24 및 48 시간 후에 찍은 마우스의 측면 및 정면 사진을 묘사한 것이다.
도 54. p28에 의한 인간 유방암 세포의 성장 억제를 나타내는 그래프들이다. MCF-7 세포은 p28 (0-200 uM)과 37 ℃ 조건에서 24, 48 그리고 72시간 동안 배양되었다. 세포 계수 (a) 와 MTT 분석 (b). 독소루비신 (10 uM)이 양성 대조군으로 사용되었다. 데이터는 대조군 +- SEM의 평균 %를 나타낸다. *, p < 0.05. (c) p28에 의한 MCF-7 이종 이식 성장의 억제. 한 군당 최소한 10 마리의 마우스들이 10일, 14일, 21일 그리고 25일에 파클리탁셀 15 umol/kg로 복강 내에 처리되거나 30일 동안 매일 10 mg/kg p28로 복강 내에 처리되었다. 막대들은 평균 +- SEM을 나타낸다. *, p < 0.05.
도 55. (a)와 (b)는 p28에 의한 유방암 세포로의 침투와 그 세포 주기들을 FACS 분석한 그래프들이다. MCF-7 (a)와 MDD2 세포 (b)은 p28 (50 uM) 으로 48시간과 72시간 동안 처리되었다. 세포은 프로피디움 요오드화물로 염색되었으며 Yamada, 등, Proc Natl Acad Sci USA, 101:4770-4775 (2004) 에서 기술된 방법과 같이 유세포 분석기로 분석되었다. G1, S, G2/M 그리고 준-G1 (세포 사멸) 기들에서의 세포 비율들이 나타나있다. (c)는 37 ℃에서 2시간 동안 20 uM p28 또는 10 uM 양이온성 (양성 대조군) 펩타이드인 옥타아르기닌 (Arg8, 서열번호: 95)로 처리된, 무-페놀레드 MEM 조건에서 하룻밤 동안 커버글라스 위에서 배양된 MCF-7과 MDD2 세포을 나타내는 사진들을 포함한다. 적색-알렉사플루오르 568로 표지된 p28, Blue-DAPI (핵).
도 56. p28이 p53과의 상호작용. (a) 내지 (d) 는 세포 내에서의 p53과 p28 농도를 나타내는 사진들이다. (a) p28과 배양한 지 일정 시간이 지난 후 MCF-7 세포에서의 p53 농도. 처리 직전에 측정한 p53 농도에 상대적인 (%) 상승 (0 시간 경과 에서 100%). (b) GST-p28과 p53 사이의 복합체 형성을 설명하는 GST pull-down assay. 왼쪽에서 오른쪽 순서로, GST-p28 (10과 20 ug/반응), GST-MDM2와 GST 단독. p53은 항-p53 항체를 사용한 면역블러팅 (IB)을 통해 검출되었다. (c) p53은 p28의 과다 조건 하에 GST-MDM2에 의해 침전되었다 (위). 세 개의 다른 항-p53 항체들, Pab 1801 (아미노산 32-79), ab 2433 (아미노산 277-296), 그리고 Pab1802 (아미노산 306-393)이 p28의 존재 하에 GST-p53이 고착된 비드들과 반응했다. 항-p28 항체를 사용한 IB로 검출된 p28 (아래쪽). (d) p28 조각들인 p12, p18 그리고 p18b들의 과다 조건 하에 일어나는 GST-p53으로의 p28 결합을 위한 경쟁반응. 결합의 상대적인 양 (p28 단독은 100%로 표현된다). M: p28 표지. (e)는 p28 또는 아주린에 대한 노출 이후 MCF-7 핵 추출물에서 일어난 p53 DNA 결합을 나타낸 그래프이다. 과산화수소로 처리된 MCF-7 세포의 핵 추출물이 내부 대조군으로 작용했다. p53-올리고뉴클레오티드 복합체가 p53에 대한 단일 클론 항체로 수량화 되었다. 데이터는 평균 +- 삼중 측정에서의 SEM을 나타낸다.
도 57. p28에 의한 사이클린 (CDK와 CDKI) 의 연속을 유도하는 것을 나타낸 사진들이다. MCF-7 (a)와 MDD2 세포 (b)는 p28 (50 uM)에 각각 24, 48 그리고 72시간 동안 노출되었으며 면역블러팅에 의해 단백질 농도가 결정되었다. 세포 내 국지화와 p21 (c)과 사이클린 B1 (d)의 상대적인 농도. MCF-7 세포은 p28과 함께 커버글라스 위에서 72시간 동안 배양되었다. P21과 사이클린 B는 각각 특이적 항체들로 염색되었다. (e) 인산화된 cdc2는 항 p-cdc2 항체로 추산되었다 (Santa Cruz Biotechnology, CA). 모든 결과들은 액틴에 의해 내부 대조군으로 정상화되었다.
도 58. 단백질 구조를 묘사하는 사진이다. a) α-나선형 구조로 절단한 아주린; b) 70 ns 시뮬레이션의 결과; c) 시뮬레이션 구조에서 Cα 원자들 사이의 거리에 기초한 티오에테르 가교 위치의 측정.
본 명세서에서, “세포” 라는 용어는 “하나의 세포” 라고 구체적으로 기술되지 않은 한 단수 및 복수 단위 모두를 포함한다.
본 명세서에서, “폴리펩타이드”, “펩타이드”, 그리고 “단백질”이라는 용어는 아미노산 잔기의 중합체를 표기하기 위해 상호 교환적으로 사용되었다. 용어는 하나 이상의 아미노산 잔기가 자연적으로 존재하는 아미노산에 대응하는 인공적인 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 적용된다. 또한, 상기 용어는 자연적으로 존재하는 아미노산 중합체에도 적용된다. 또한, “폴리펩타이드”, “펩타이드”, 그리고 “단백질”이라는 용어는 글리코실화 반응, 지질 부착, 황산화, 글루탐산 잔기의 감마 카복실화, 수산화, 그리고 ADP-리보스화를 포함하는, 그러나 여기에 국한되지는 않는 변화를 의미한다. 폴리펩타이드가 항상 완전히 선형 구조로 존재하는 것은 아니라는 것이 인식될 것이다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 유비퀴틴 표지의 결과로 분지 될 수 있으며, 자연적으로 발생하지 않는 인간에 의한 조작이 불러온 사건들과 자연적으로 발생하는 사건을 포함하는 단백질 번역 후 사건들의 결과로서 구형(가지를 포함하거나 포함하지 않는)을 띨 수 있다. 구형의, 가지를 띤, 그리고 가지를 띤 구형의 폴리펩타이드는 비-번역 자연적 과정에 의해 합성될 수 있으며, 완전히 인공적인 방법으로도 합성될 수 있다.
본 명세서에서, “약학적 활성”이라는 용어는 생물학적 시스템에 대한 약물 또는 다른 화학물질의 효과를 의미한다. 화학물질의 효과는 이로울 수(치료성)도 있으며, 해로울 수(유독성)도 있다. 순수한 화학물질 또는 혼합물은 자연성분(식물, 동물 또는 광물)이거나 합성물일 수 있다.
본 명세서에서, “전암성” 라는 용어는 전암성, 또는 통제 없이 비정상적으로 세포가 분열하기 이전을 의미한다.
본 명세서에서, “병소”라는 용어는 비정상적 조직의 영역을 의미한다.
본 명세서에서, “병리학적 상태”라는 용어는 신체적 기능의 수행능력을 방해 또는 변형시키는, 살아있는 동물 또는 그의 한 부분의 정상상태로부터의 해부학적 그리고 생리학적 편차를 의미하며, 다양한 요소들(영양실조, 산업적 위험요소, 또는 기후), 구체적인 감염 매개체(벌레, 기생성 원생생물, 박테리아, 또는 바이러스), 생물체의 내재성 감염(유전적 이례), 또는 이러한 요소들의 조합들에 대한 반응이다.
본 명세서에서, “상태”라는 용어는 신체적 기능의 수행능력을 방해 또는 변형시키는, 살아있는 동물 또는 그의 한 부분의 정상상태의 손상을 야기하는 정상으로부터의 해부학적 그리고 생리학적 편차를 포함한다.
본 명세서에서, “으로부터의 고통”이라는 용어는 병리학적 상태의 증상을 현재 나타내는 것과, 관찰 가능한 증상 없이 병리학적 상태를 가지는 것과, 병리학적 상태로부터 회복하는 것, 또는 병리학적 상태로부터 회복한 것들을 포함한다.
본 명세서에서, “화학적 예방”이라는 용어는 악화가 되기 전의 병소 및/또는 암의발달, 또는 재발의 위험을 낮추거나, 막거나, 억제하거나, 반전시키거나 또는 늦추기 위한 생물학적 또는 화학적일 수 있는 약물, 비타민, 또는 다른 자연적 또는 인공적 약품의 사용을 의미한다.
본 명세서에서, “세포독성”이라는 용어는 세포에 독성을 전달할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, “세포독성 큐프레독신”은 암세포를 포함하는 세포에 독성인 큐프레독신 또는 이의 변이체, 유도체, 절단부 또는 구조적 등가물을 말한다.
본 명세서에서, “치료”라는 용어는 치료되고 있는 상태와 연관된 상태 또는 증상의 진행 또는 심각성을 막는 것, 낮추는 것, 멈추는 것, 또는 반전시키는 것을 포함한다. 그러한 맥락에서, “치료”라는 용어는 필요한 의료적, 치료적 및/또는 예방적 투여를 포함한다. 또한, 투여는 암과 같은 상태의 발달을 막거나 경감시키는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, “세포 성장 억제”라는 용어는 세포 분열 및/또는 세포 확장을 늦추거나 멈추는 것을 의미한다. 이 용어는 또한 세포 발달의 억제 또는 세포 사멸의 증가를 포함한다.
“치료적 유효량”은 치료받고 있는 대상의 특정 상태에 존재하는 증상을 부분적으로 또는 완전히 완화하거나, 그 발달을 막기에, 낮추기에, 멈추기에 또는 반전시키기에 효과적인 양이다. 치료적 유효양의 결정은 당해 분야의 통상의 기술자의 충분한 능력 범위 안에 존재한다.
“실질적으로 순수한”이라는 용어는 본 명세서에 사용된 바와 같이, 예를 들어 성장 배지 또는 세포의 내용물로부터 단리된 단백질과 같이, 본 발명의 단백질 또는 다른 세포성 결과물을 변형시키기 위해 사용될 때에는, 다른 단백질 및/또는 다른 조성물을 거의 포함하지 않거나, 그들이 거의 섞이지 않은 형태로 존재하는 것을 의미한다. “실질적으로 순수한”이라는 용어는 단리된 건조 중량 중 최소 약 75% 분량, 또는 최소한“75%만큼 실질적으로 순수하다”라는 것을 의미한다. 더욱 구체적으로,“실질적으로 순수한”이라는 용어는 단리된 건조 중량 중 최소 약 85% 분량, 또는 최소한“85%만큼 실질적으로 순수하다”라는 것을 의미한다. 가장 구체적으로,“실질적으로 순수한”이라는 용어는 단리된 건조 중량 중 최소 약 95% 분량, 또는 최소한“95%만큼 실질적으로 순수하다”라는 것을 의미한다. 또한, “실질적으로 순수한”이라는 용어는 본 발명의 인공적으로 만들어진 단백질 또는 조성물을 변형하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들면, 합성 단백질이 시약 및 합성 반응의 부산물로부터 분리되는 것에 사용될 수 있다.
“약학적 등급”이라는 용어는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 펩타이드 또는 조성물에 대해 사용되는 경우, 자연적 상태에서 발견되는 물질에 동반되는 구성 성분, 즉 합성 시약과 부산물을 포함하는 구성요소로부터 실질적으로 또는 근본적으로 분리되었고, 약학적으로의 사용을 손상시킬 수 있는 구성 요소로부터 실질적으로 또는 근본적으로 단리된 펩타이드 또는 조성물이다. 예를 들어, “약학적 등급”은 어떠한 발암 물질로부터 분리될 수 있다. 몇몇 경우에서, “약학적 등급”은 예를 들어 “정맥 내 약학적 등급”과 같은 의도된 투여 용도에 의해, 환자에게 정맥 내 투여하는 것이 알맞지 않도록 조성물을 만들 수 있는 어떠한 물질로부터 실질적으로 또는 근본적으로 단리된 펩타이드 또는 조성물을 명시하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, “정맥 내 약학적 등급”인 펩타이드는 SDS와 같은 계면활성제, 그리고 아자이드와 같은 항균 물질로부터 분리될 수 있다.
“단리된”, 정제된” 또는 “생물학적으로 순수한” 이라는 용어들은 자연적 상태에서 발견되는 물질에 동반되는 구성 성분으로부터 실질적으로 또는 근본적으로 단리된 물질들을 의미한다. 그러므로, 본 발명에 따라 단리된 펩타이드는 바람직한 경우 생체의 원상태에 존재하는 펩타이드와 일반적으로 연관된 물질을 포함하지 않는다. 폴리펩타이드의 “단리된” 영역은 그 부분이 파생된 폴리펩타이드의 전체 서열을 포함하지 않는 영역을 의미한다. “단리된” 핵산, 단백질, 또는 그들의 조각은 당해 기술자에 의해 뉴클레오티드 서열 분석, 제한 절단, 위치선택적 돌연변이, 그리고 핵산 조각을 위한 발현 벡터로의 서브복사를 포함하지만 여기에 국한되지는 않는 조작과, 실질적으로 순수한 양의 단백질 또는 단백질 조각을 얻기 위해 그들의 원상태로부터 실질적으로 분리되었다.
펩타이드에 관련하여 본 명세서에서 사용된 “변이체”이라는 용어는 야생형 폴리펩타이드와 비교하여 대체되거나, 삭제되거나 삽입된 아미노산을 보유하고 있을 수 있는 아미노산 서열 변이체을 의미한다. 변이체은 야생형 펩타이드의 절단부일 수 있다. “삭제”는 폴리펩타이드로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것이며, “절단”은 폴리펩타이드의 하나 또는 양쪽 끝으로부터 하나 이상의 아미노산을 제거하는 것이다. 그러므로, 변이체 펩타이드는 폴리펩타이드를 부호화하는 유전자의 조작을 통해 만들어질 수 있다. 변이체은 최소한 폴리펩타이드의 약학적 활성은 변형시키지 않는 범위 내에서, 그 기본적 구성 또는 성질을 변형함으로서 만들어질 수 있다. 예를 들어, 아주린의 “변이체”은 전암성 포유류 세포의 발달을 억제하는 능력을 유지하고 있는 변이된 아주린일 수 있다. 일부 실시예에서, 변이체 펩타이드는 ε-(3,5-dinitrobenzoyl)-Lys 잔기와 같은 비자연적 아미노산들로 합성될 수 있다. Ghadiri & Fernholz, J. Am. Chem. Soc., 112:9633-9635 (1990). 일부 실시예에서, 변이체은 야생형 펩타이드 또는 그 부분과 비교했을 때 20개 이하의 아미노산이 대체되었거나, 삭제되었거나 삽입되었다. 일부 실시예에서, 변이체은 야생형 펩타이드 또는 그 부분과 비교했을 때 15개 이하의 아미노산이 대체되었거나, 삭제되었거나 삽입되었다. 일부 실시예에서, 변이체은 야생형 펩타이드 또는 그 부분과 비교했을 때 10개 이하의 아미노산이 대체되었거나, 삭제되었거나 삽입되었다. 일부 실시예에서, 변이체은 야생형 펩타이드 또는 그 부분과 비교했을 때 6개 이하의 아미노산이 대체되었거나, 삭제되었거나 삽입되었다. 일부 실시예에서, 변이체은 야생형 펩타이드 또는 그 부분과 비교했을 때 5개 이하의 아미노산이 대체되었거나, 삭제되었거나 삽입되었다. 일부 실시예에서, 변이체은 야생형 펩타이드 또는 그 부분과 비교했을 때 3개 이하의 아미노산이 대체되었거나, 삭제되었거나 삽입되었다. 다른 실시예에서, 상기 변이체은 본 명세서에 개시된 방법 및 기술을 사용하여 생성된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “아미노산” 이라는 용어는 일반적으로 하나의 (a) 탄소 원자이며, 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 탄소 원자에 의해 직접적으로 최소 하나 이상의 아미노 잔기와 최소 하나 이상의 카복실 잔기가 연결된 구조를 포함하는 어떠한 성분들인, 모든 자연적으로 발생하는, 또는 비자연적으로 발생하는, 또는 인공적인 아미노산 잔기들을 구성하는 아미노산 성분을 의미한다.
펩타이드에 관련하여 본 명세서에서 사용된 “유도체”이라는 용어는 목표 펩타이드로부터 파생되어 나온 펩타이드를 의미한다. 유도체는 펩타이드가 그 필수적 활성 중 일부를 유지하는 정도로 일어나는 펩타이드의 화학적 변형을 포함한다. 예를 들어, 아주린의 “유도체”는, 예를 들어 포유류 세포에서 신생 혈관 형성을 억제할 수 있는 능력을 유지하는 화학적으로 변형된 아주린일 수 있다. 화학적 변형의 관심사는 펩타이드의 아미드화, 아세틸화, 황산화, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 변형, 인산화 또는 글리코실화 반응 또는 본 명세서에 개시된 다른 방법 및 기술을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는다. 추가로, 유도체 펩타이드는 폴리펩타이드 또는 그 조각과, 다른 펩타이드, 약물 분자 또는 다른 치료적 또는 약학적 약품 또는 검출 가능한 탐침을 포함하지만, 이에 국한되지는 않는 화학적 조성물 간의 융합일 수 있다.
“퍼센트 (%) 아미노산 서열 유사성”이라는 용어는 두 서열이 나열되었을 때 후보 서열에서 아미노산 서열이 폴리펩타이드의 아미노산 서열과 유사한 퍼센티지로 정의된다. 퍼센트 아미노산 유사성을 결정하기 위해, 서열이 나열되며, 만약 필요하다면 최대 퍼센트 서열 유사성을 얻기 위해 공백이 도입된다; 보존적 대체는 서열 유사성의 일부로 고려되지 않는다. 퍼센트 유사성을 결정하기 위한 아미노산 서열 배열 과정들 또한 당해 기술자에게 잘 알려져 있다. 종종 BLAST, BLAST2, ALIGN2 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개된 컴퓨터 소프트웨어가 펩타이드 서열들을 나열하기 위해 특정 실시 예에서, Blastp (National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD로부터 구할 수 있다)가 긴-복잡성 필터, 예상 10, 글자 크기 3, 존재 11과 확장 1이라는 기본값을 사용하여 이용된다.
아미노산 서열들이 나열되었을 때, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열A의 퍼센트 아미노산 서열 유사성(다른 말로 하면 주어진 아미노산 서열 A가 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정한 퍼센트 아미노산 서열 유사성을 가지고 있다)은 다음과 같이 계산될 수 있다: % 아미노산 서열 유사성 = X/Y*100, X는 A와 B를 서열 배열 프로그램 또는 알고리즘이 배열했을 때 나타나는, 일치하는 서열들로 등록된 아미노산 잔기의 개수이며, Y는 B에 있는 아미노산 잔기의 총 개수이다.
만약 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않다면, B에 대한 A의 퍼센트 아미노산 서열 유사성은 A에 대한 B의 퍼센트 아미노산 서열 유사성과 같지 않을 것이다. 보다 긴 서열을 보다 짧은 서열에 비교할 때는, 보다 짧은 서열이 “B” 서열이 될 것이다. 예를 들어, 절단된 펩타이드들을 대응하는 야생형 폴리펩타이드에 대조할 때, 절단된 폴리펩타이드가 “B” 서열일 것이다.
일반
일부 실시예에서, 본 발명은 큐프레독신 및 큐프레독신의 변이체, 유도체, 절단부 및 구조적 등가물을 포함하는 조성물을 제공하고, 포유류의 암의 발달을 예방하는 방법을 제공한다. 다른 실시예에서, 본 발명은 큐프레독신 및 암세포를 포함하는 포유류의 세포에 우선적으로 진입하는 큐프레독신의 변이체, 유도체, 절단부 및 구조적 등가물을 포함하는 조성물을 제공한다. 다른 실시예는 포유류에서 암의 발달 또는 암의 재발을 예방하는 능력을 함유하는 큐프레독신의 변이체, 유도체 및 구조적 등가물을 제공한다. 특정 실시예는 녹농류 아주린, 아주린의 변이체, 유도체 및 구조적 등가물을 포함하는 조성물을 제공하고, 특히 일반인보다 높은 암 발병 위험에 있는 환자를 치료하기 위한 사용을 제공한다.
본 발명의 다른 실시예는 암 세포를 직접적으로 및/또는 우선적으로 침투하는 방법을 포함한다. 본 발명의 추가적인 실시예는 암 및 정상적인 세포를 직접적으로 및/또는 우선적으로 침투하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 화학방어제 효과를 가진다. 다른 실시예는 암 세포에 우선적으로 치료 화합물을 전달하는 방법을 제공한다. 마지막으로, 본 발명은, 전암성(premalignant) 병소를 유도, 및 전암성 및/또는 악성 세포의 발달을 관찰하기 전 또는 후에, 포유류의 세포, 조직 및 큐프레독신 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조상 등가물를 갖는 세포와 접촉하는 동물의 암의 발달을 연구하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시예는 본 명세서에 공개로부터 분명해 질 것이다.
이전에, 녹농균에 의해 정교하게 만들어진 산화환원 단백질, 큐프레독신 아주린,은 정상 세포이 아닌 J774 폐암 세포에만 우선적으로 진입한 다음 세포 사멸을 유도한다고 알려졌었다. Zaborina 등, Microbiology 146:2521-2530 (2000). 아주린은 또한 인간 흑색종 UISO-Mel-2 또는 인간 유방암 MCF-7 세포에 우선적으로 진입한 다음 죽일 수 있다. Yamada 등, PNAS 99:14098-14103 (2002); Punj 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004). 녹농균으로부터 추출된 아주린은 J774 마우스 망상 세포 육종 세포에 우선적으로 진입한 다음, p53 종양 억제 단백질과 복합체를 형성하여 안정화 시키며, 세포 내 p53 농도를 증가시키고, 세포 사멸을 유도한다. Yamada 등, Infection and Immunity 70:7054-7062 (2002). 아주린 분자의 다양한 도메인들에 대한 구체적인 연구는 아미노산 50-77 (p28) (서열번호:2)의 내재화와 순차적인 세포 사멸 활성에 대단히 중요한 단백질 전달체 (PTD)를 대표한다는 것을 보였다. Yamada 등, Cell. Microbial. 7:1418-1431 (2005).
현재 아주린으로 알려지고, 아주린으로부터 유래된 펩타이드로 알려진, 예를 들어 p28 및 p18은 화학방어제 성질을 가진다. 아주린 및 이의 유도체로 현재 알려진 p28은 마우스의 유선 장기 배양에서 전암성 종양전의 병소의 형성을 예방한다. 마우스의 유선 장기 배양 모델에서, 50 μg/ml의 아주린은 폐포 병소의 형성을 67 % 억제한다고 발견했다. 이와 유사하게, 25 μg/ml의 p28은 폐포 병소의 형성을 67 % 억제한다고 발견했다(실시예 1 참조). 나아가, 50 μg/ml의 아주린이 유방 병소의 형성을 79 % 억제하고, 25 μg/ml의 p28은 유방 병소의 형성을 71 % 억제다고 발견했다(실시예 1 참조). 공초점의 형미경 및 FAC는, 아주린 및 p28이 정상적인 쥣과의 유방 상피 세포(MM3MG) 및 유방 암 세포(4T1)에 들어갔다는 것을 보여주었다. 또한, p28은 온도, 시간 및 농도에 의존하는 방식으로 인간 탯줄 정맥 상피 세포(HUVEC)에 들어가고, Matrigel® 위에 놓인 HUVEC의 모세관 형성을 투여량에 의존하는 방식으로 억제했다. 또한, 공초점 현미경 및 FAC는 p18이 인간의 흑색종 세포주(Mel-2,7,29), 유방 세포주(MCF-7), 난소 세포주(SK-OV3), 췌장 세포주(CAPAN-2), 교아종 세포주(LN-299), 성상세포종 세포주(CCF-STTG1), 전립선 세포주(LN-CAP) 및 신장 세포주(ACHN-CRN1611)에 우선적으로 진입했다는 것을 보여주었다. 게다가, 이종 이식된 흑색종 종양을 함유하는 흉선이 제거된 마우스에 적외선의 염료(λem 800 nm)로 라벨링된 p18의 촬상은 피하의 초기 암, 및 정상 장기 및 조직에 축적되지 않고 먼 장기 전이로의 우선적 흡수를 명백히 보여주었다. 그러므로, 현재 알려진 아주린 및 아주린의 변이체이 전암성 종양전의 병소의 형성을 억제하는데 사용될 수 있고, 따라서 포유류 환자에서 암의 발달 특히 유방암의 형성을 억제하는데 사용될 수 있다.
방사선치료 및 화학치료를 포함하는, 표준 암 치료 방법은 암 세포의 DNA 손상을 수반한다. 정상 DNA 손상에 대한 세포의 반응은 DNA 수선의 활성, 세포 순환 저지 및 치사를 포함한다(Hall, Radiobiology for the Radiologist, Harper and Row, 1988). 예를 들어, DNA 이중 가닥 단절의 유도는 결손, 이동원체, 고리 및 후기가교(anaphase bridge)를 포함하는 치명적인 염색체의 변형을 가져온다(Hall, Radiobiology for the Radiologist, Harper and Row, 1994). 종양 및 다양한 암 세포에 의한 본 발명의 펩타이드의 우선적 흡수 때문에, 일 실시예에서는 p18을 포함하는 이러한 펩타이드는 물질을 종양 및 암세포 안으로 주입하기 위한 비바이러스성 벡터로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 펩타이드는, 종양 또는 암세포에 치료상의 DNA 또는 RNA 조각 치료를 제공하도록 DNA 또는 RNA 조각을 암세포에 주입하기 위하여 사용될 수 있다.
단백질 전달 도메인(PTDs) 이들의 구조적 특성에 기초하여 양쪽 분류에 일부가 모두 속함에도 불구하고, 양이온 잔기 또는 양친매성 α-나선으로 2 개의 군으로 클러스터를 이룬다. 일반적으로, 양이온 펩타이드는 음으로 하전된 표면 당단백질에 결합함으로써 원핵생물 및 진핵생물 종의 세포막과 최초 상호작용하며, 정상 및 악성세포주의 넓은 범위 안으로 효과적인 진입을 가능하게 한다(Kondejewski, L.H., 등, J Biol Chem 277: 67-74 (2002); Fuchs, S.M. 및 Raines, R.T., Biochemistry, 43: 2438-2444 (2004)). HS에 대한 양이온 펩타이의 결합은 HS에 대한 이들의 높은 친화성(Kd - 109nM)에 부합하며, 이 값은 하기 예의 아주린, p18 및 p28에서 보고된 것보다 훨씬 크다(Tran, D. et al, Proc Natl Acad Sci USA 84: 7957- 7961 (1987)).
이것(예, p28 및 p18)으로부터 유래된 아주린 및 펩타이드는 암세포에 우선적으로 진입하고, 세포분열억제 및 세포독성 메커니즘을 통해 이들의 확산을 억제하는 특유의 성질을 지닌다. 레독스(Redox) 단백질은 세포 침투성 펩타이드(CPPs), 즉 항증식제로 보통 분류되지 않는다. 아주린, p28 및 p18의 진입은 양이온 CPPs와 별개라고 여겨진다. 상기 양친매성, 아주린 조각 p18 및 p28은 아주린의 54번 내지 67번 아미노산 α-나선 구조를 함유할 뿐만 아니라 β-병풍구조도 함유한다. 인테그린 및 카데린을 포함하는 몇몇의 세포 표면 수용체 상에서 잘못된 N-글리코실화는 진행의 변화 및 암의 다양한 조직 형성의 전이와 관련되며, 아주린, p18 및 p28의 침투 최초 단계에서 아직 알려지지 않은 N-글리코실화된 세포 표면 단백질의 역할을 시사한다(Partridge, E.A., 등, Science 306: 120- 124 (2004); Seales, E.C., 등, Cancer Res 65:4645-4652 (2005)).
세포 내 침입을 위한 엔도시토시스 성분을 보조하는 CPPs의 온도 의존적 양이온성 진입은 아주린과 아주린의 아미노산 조각 50-77 (p28)의 진입에 나타난다. Yamada, T., 등, Cell Microbiol 7: 1418-1431 (2005). 아주린의 50-67 부위 (p18, 서열번호: 25)가 정상과 악성 세포로의 진입은 p28에 비례하여 가속되는 것으로 보인다. p18의 보다 낮은 Km값과 보다 높은 Vmax 값은 아주린의 아미노산 50-67 서열이 인지질막과 연관되었을 때 아주린의 실제 PTD를 보다 가깝게 나타내는 양친매성 구조를 결정한다는 것을 제의한다. 그러나 에너지 의존성 세포 내 진입 또는 소낭이 관련된 과정은 이러한 펩타이드에게 허용된 유일한 진입 메커니즘은 아닌 것으로 보인다. 예를 들어, 양이온성 펩타이드의 진입을 억제하는, 대사성 그리고 막전위 억제제인 소디움 아자이드와 와베인 (Na+ K+ ATPase 억제제)은 UISO-Mel-2 세포 또는 섬유아세포로의 p18 또는 p28의 진입을 저해하지 않았으며 (도 14 b, c), 이로서 그 펩타이드들이 직접 세포막을 관통할 수 있다는 것을 입증한다.
아주린 유래 펩타이드는 시사된 다른 양이온 CPPs의 세포 침투 경로 즉, 대음세포작용(macropinocytosis), 애틴 필라먼트 또는 미세소관을 따라 후기 엔도솜 또는 리소좀에 분배, 및 특정 세포 순환 단계에서 침투하는 것과 비교할 때, 이러한 각각의 경로의 억제제는 매우 효과적이지 못했기 때문에(도 14 b,c), 다른 침투 경로를 보통 사용한다. p18, p28 및 아주린은 혈장막에 침투하고, 디나민-독립 클라트리닌 의존성 담체로 매개된 방식으로 설명되는 카베올레와 관련된 후기 엔도솜, 리소솜 및 골지에 도달한다(Kirkham, M. and Parton, R.G., Biochem Biophys Acta 1746: 349-363 (2005)). 액틴 필라먼트를 파괴하는, 노코다졸(nocodazole)에 의한 침투의 현저한 억제 및 시토칼라신-D(cytochalasin-D)에 의한 억제의 상대적인 부족은 카베올레 매개된 진입을 보여준다. Id. 이러한 진입 경로는 일체형 세포 표면 구성성분 및 외관상 이질적인 분자, 즉, 덱스트란, 그리고 전형적인 식균작용 경로를 건너뛰기 위해 카베올레를 또한 활용하는 병원균 또는 이들의 산물의 넓은 영역을 설명해왔다. 지방 라프트(lipid raft)를 파괴하기 위해 β-메틸시클로덱스트란, 필리핀(filipin) 또는 니스타틴(nystatin)을 갖는 혈장막 도메인으로부터의 콜레스테롤이 감소하며, 막 구성성분들을 분리하고 막을 구분하기 위해 유체 플랫폼을 제공하는 혈장막 도메인은 UISO-MEL-2 세포 및 섬유아세포(각각, 35 % 및 42 %) 안으로 p18(50 %) 및 p28(~60 %)의 침투를 상당히 억제했으며, 이는 p18 및 p28의 상당한 비율(~60 %)가 카베올레를 거쳐서 혈장막에 침투한다는 것을 입증한다. 카베올레는 신호 전달의 조절자로서 기능 하는 카베올린 특이 단백질(카베올린-1, -2, 또는 -3)의 존재에 의해 정의된 혈장막의 지방 라프트 함입의 50 내지 100 nm 오메가 모양의 부분집합이다.
브레펠딘 A는 골지체를 파괴하며 p18 누적을 억제함으로, 이 경로 및 상기 골지체가 p18 및 p28의 진입 그리고 세포 내 수송에서도 사용된다. 포낭을 통한 p18과 p28의 세포 관통은 N-글리코실화의 억제제들이 세포진입을 UISO-Mel-2 세포에서 ~60%, 그리고 섬유아세포에서 각각 25%와 35% 저해시킨다는 증거에 따라 행동한다. P18과 p28 진입 사이에 존재하는 퍼센트 차이는 암과 정상 세포 간의 N-글리코실화 막구조의 숫자에 연관되어 있으며, 이 메커니즘을 통한 p28과 p18의 상대적인 진입 경로에도 연관되어 있다. 도 14 b, c.
아주린, p28, 그리고 p18 모두는 다른 많은 항암 펩타이드들과 비교했을 때 보다 높은 친화성과 높은 수용력으로 결합한다. 결합한 뒤, 이 단백질/수용체 복합체는 포낭에 국지화된 뒤, 내재화가 이루어지고, 곧이어 (포낭을 통해) 골지체, 소포체, 그리고 핵으로 이동하는 것으로 알려져 있다. 포낭-매개 진입에 추가로, 역학적 분석 또한 p28과 p18이 비-클라트린 소낭 매개 과정을 통해 세포막을 관통한다는 것을 보인다. 클라트린- 그리고 카베올린-비의존성 경로는 인터루킨 2 수용체와 특정 글리코실-포스파티딜이노시톨 (GPI)-닻형 단백질 등을 위한, 필수 구성요소적 내재화 메커니즘으로서 존재할 수 있다. Lamaze, C., 등, Mol Cell 7: 661-671 (2001); Sabharanjak, S., 등, Dev Cell, 2:411-423 (2002). 또한, 클라트린- 및 카베올린- 독립적 엔도사이토시스는 쥣과의 폴리오마 바이러스에 대하여 독점적으로 또는 인플루엔자 바이러스의 경우에 종래의 경로와 함께 조합을 이루어서 세포에 침투하도록 병원체에 의해 사용될 수 있다. Ewers, H., 등, Proc Natl Acad Sci USA 102: 15110-15115 (2005); Sieczkarski, S.B. 및 Whittaker, G.R., J Virol, 76: 10455-10464(2002). 정상 세포보다 암세포에서 두드러지게 나타나는 카베올린-1 발현 향상은 암세포로의 아주린, p28 그리고 p18의 우선적 진입에 있어서 유일한 근거가 되지는 않는 것으로 보인다. 섬유아세포와 다른 몇몇 정상 세포 또한 그들의 표면에 많은 양의 포낭을 가지고 있다.
실시예 18 내지 24는, p18(아주린의 아미노산 50-67) 및 p28 (아주린의 아미노산 50-77)이 엔도시토시스, 카베오좀 유래 및 카베오좀 독립 경로를 거쳐 암세포에 우선적으로 침투한다. 상기 p18 및 p28의 세포 침투는 암세포를 선호하는 것 중에서 모든 현재의 CPPs와 관련하여 유일하다. 놀랍게도, 상기 p28의 C-말단 으로부터의 10-12 아미노산(서열번호: 35, 36 및 37)은 세포 순환 억제 및 세포사멸 활성/세포독성에 주로 책임이 있는 도메인을 포함한다. 게다가, 이런 동일한 도메인은 세포의 상태와 상관없이 세포막 상의 특정 잔기에 아마도 접촉하여서, 진입을 가능하게 한다. 특히 아주린의 아미노산 69, 70, 75, 76 및 85는 세포막에 접촉을 제공한다. 동일한 아미노산을 갖는 펩타이드 또는 펩타이드 쇄의 동일한 자리에 위치하는 유사한 구조를 갖는 아미노산은 특정 세포막 잔기에 접촉하고 세포에 진입하는 동일하거나 유사한 능력을 갖거나, 아주린의 아미노산 69, 70, 75, 76 및 85와 유사하거나 동등한 펩타이드 쇄의 자리는 특정 세포막 잔기에 접촉하고 세포에 진입하는 동일하거나 유사한 능력을 가질 것이다. 일단 내재화되면, p28은 세포분열 억제 메커니즘을 통해 최로 암세포 확산을 억제한다. 따라서, p18 및 p28은 인간 암세포 안으로 아주린의 우선적인 집입 및 인간 암세포 상의 항증식성 물질의 상당량 및 아주린의 세포독성 활성을 각각 설명한다.
암세포에 진입하는 것에 부가하여, 실시예 31에서 개시된 방법을 사용하여 얻어진 p18 및 p28은 종양 및 포유류 장기에 진입할 수 있다(도 16 내지 53에 보여짐). 또한, 놀랍게도, p18 및 p28은 혈액 뇌 관문에 침투할 수 있고, 포유류 뇌에 진입하며, 이는 예를 들어, 도 20a, 20b, 21b, 23, 24, 28, 30, 31a, 32b, 33, 34b, 35a-b, 37a-c, 38a-c, 40a, 42a, 43a, 45a-d, 46, 47b, 48a-b 및 50에 의해 입증된다.
본 발명의 상기 펩타이드는 DNA 또는 RNA 조각과 같은 다른 분자 또는 화합물을 포유류의 암세포 안으로 주입하기 위해 사용될 수 있다. 하기는 본 발명의 펩타이드, 그리고 일 실시예에서는 포유류의 암세포 안으로 연쇄된 분자의 진입을 가능하게 하는 p18과 함께 주입될 수 있는, 이에 국한되지 않는 예시적인 기술 및/또는 특정 DNA 또는 RNA 조각을 설명한다. 예를 들어, 세포에 우선적으로 진입할 수 있는 본 발명의 화합물은 유전자 치료, RNAi 접근법, 조혈 유전자의 전이, 상동 재조합, 리보자임 기술, 안티센스 기술, 종양 면역치료 및 종양 진통제, 중개연구, 항-유전자 치료(안티센스, siRNA & 리보자임), 세포사멸, 면역학 및 면역치료, DNA 합성 및 DNA 수선과 함께 사용될 수 있다.
유전자 치료는 유전자의 발현에 적합한 환경 하에서 암세포 안으로 외래 유전자의 전이, 예를 들어 종양 진통제 또는 세포사멸의 유도제를 포함한다. 일단 발현되면, 상기 유전자 산물은 종양의 성장을 늦추거나, 종양의 전이 가능성을 억제함으로써 종양 세포상에 이로운 효과를 부여하거나, 종양을 완전히 죽인다. 역사적으로, 암 유전자 치료의 임상적 효과는 1) 종양 내에서 치료 유전자 발현의 부족한 조절, 및 2) 종양에 대한 벡터의 선별적인 표적화에 의해 제한되어 왔다. 본 발명의 화합물은 종양 세포의 선별적인 표적화를 다룬다. 나아가, 몇몇의 계획은 유전자 발현의 조절을 위해 제안되어왔다. 하나의 계획은, 치료 유전자를 조절하는 프로모터는 종양-선택적 전사 인자에 의해 활성화되는 곳에서 복사의 표적화이다. 실시예는 MUC-1 프로모터를 유방암에 그리고 CEA 프로모터를 대장암에 사용하는 것을 포함한다(Kurihara 등, "Selectivity of a replication-component adenovirus for human breast carcinoma cells expressing the MUCl antigen," J Clin. Invest. 106(6): 763-771, 2000; Konishi 등, "Transcriptionally targeted in vivo gene therapy for carcinoembrionic antigen-producing adenocarcinoma," J Med. ScL, 48(3): 79-89, 1999).
안티센스 기술은 선택된 유전자에 의해 발현되는 mRNA에 일반적으로 상호 보완적인 세포 안으로 핵산 분자의 주입을 필요로 한다. 상기 안티센스 분자는 mRNA 분자의 번역을 억제하고, 유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 막는다. 상기 안티센스 기술의 변형은 삼중 나선을 형성하도록 유전자의 DNA에 결합하는 안티센스 분자에 의해 선택된 유전자의 전사를 막을 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 하나의 특정 안티센스 약물은 G3139이다(오블리머슨(oblimersen)으로도 알려졌으며; Genta, Inc., Lexington, MA에 의해 제조됨). 사용될 수 있는 또 다른 안티센스 분자는 G4460이다(c-myb로eh 알려졌으며; Genta, Berkely Height, NJ에 의해 제조됨).
또한, RNA 간섭(RNAi)계 분자는 본 발명의 펩타이드에 결합될 수 있다. RNAi는 이중 가닥 RNA("dsRNA"), 짧은 헤어핀 RNA("shRNA") 또는 유사한 특징을 가지는 다른 핵산 분자에 의해 보통 매개된다. 이러낳 핵산 분자는 Dicer 및 Drosha를 포함하는 세포의 효소에 의해 작은 조각으로 처리되거나 절단된다. 이후에, 상기 핵산 분자의 작은 조각은 mRNAs의 저하를 매개하는 단백질 착물(RISC 착물)에 의해 흡수될 수 있다. 상기 RISC 착물은 흡수된 핵산 분자와 함께 상호보완적인 염기쌍인 mRNA를 저하시킬 것이다. 이런 방식으로, 상기 mRNA는 특이적으로 파괴되어서, 암호화된 단백질을 만드는 것으로부터 막는다.
리보자임 기술은 목표 RNA 분자에 결합하는 RNA 분자를 발현하는 세포 안으로 핵산 분자의 주입을 필요로 하고, 목표 RNA 분자의 우선적 분열을 촉진한다. 상기 목표 RNA 분자는 일반적으로 mRNA이지만, 예를 들어 레트로바이러스 RNA 분자(retroviral RNA molecule)일 수 있다.
또한, 2 번의 유전자 비활성화 화(대립유전자 각각에 대해 한번씩)가 요구되는 상동 재조합에 의한 목표 유전자 결손은 본 발명과 함께 사용될 수 있는 전략이다.
또한, 본 발명의 화합물과 함께 전달되는 특정한 치료는 암 성장을 위해 중요한 단백질의 발현을 조절할 수 있는 암-특이적 전사 착물(CSTCs)에 대항 될 수 있다. 예를 들어, CSTCs에 대항하는 암 치료에 관해 설명하기 위해 본 명세서에 참조로 포함된 미국특허출원 2008/0027002를 참조하라.
큐프레독신들 간의 높은 수준의 구조적 유사성 때문에, 아주린 및 아주린의 절단부보다 큐프레 독신은 비엔도사이토시스 및 엔도사이토시스 경로를 통하여 암 세포에 우선적으로 진입할 수 있을 것이고, 포유류의 전암성 병소의 형성을 더 억제할 수 있을 것으로 여겨진다. 그러한 큐프레독신은 예를 들면, 세균 또는 식물에서 발견될 수 있다. 일부 큐프레독신은 녹농균에서 추출한 아주린과 유사한 약물동력학적 활성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 티오바실러스 페로옥시단스(서열번호:4 )에서 유래된 루스티시아닌 또한 대식세포에 진입하여 세포 사멸을 유도할 수 있다. Yamada 등, Cell Cycle 3:1182-1187 (2004); Yamada 등, Cell. Micro. 7:1418-1431 (2005). 푸르미디움 라미노숨(서열번호: 3)에서 유래된 플라스토시아닌 및 아크로모박터 시클로클라스테스(서열번호 5:)에서 유래된 슈도아주린 또한 대식세포에 대한 세포독성을 가지고 있다. 미국특허 공개번호 제20060040269호, 2월 23일, 2006년에 발간. 그러므로 본 발명의 조성물과 방법에서 다른 큐프레독신이 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 추가로, 포유류에서 암의 형성을 억제할 수 있는 능력을 보존하고 있는 큐프레독신의 변이체, 유도체, 절단부, 그리고 구조적 등가물 또한 본 발명의 조성물과 방법에서 사용될 수 있다. 이 변이체과 유도체는 큐프레독신의 절단부과, PEG화(PEGylation)과 알파 나선의 전-탄화수소 안정화를 포함하지만 이에 국한되지 않는, 본 발명에 개시된 아미노산과 단백질 변형의 보존적 대체를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
p53 을 통한 화학적 방어
아주린의 아미노산 50-77 부위 (p28, 서열번호: 2)와 p53의 상호작용이 연구되었으며 아래의 실시예 26 내지 실시예 30에서 기술되었다. 본 명세서에서 밝혀진 바와 같이, p28은 스트레스에 대한 반응으로 기능적인 활성을 띠어 세포 주기 고정 또는 세포 사멸을 유발하는 종양 억제 단백질인 p53에 의해 매개되는 인간 유방암 세포에 대한 항-증식 효과를 보인다. 연속적으로 진행되는 GST-침전 검사, 글리세롤 구배 원심 분리, 미세열량계 실험, 단분자 힘 분광학, 그리고 컴퓨터 모델링을 사용한 실험은 아주린이 N-말단 또는 p53의 DNA 결합 도메인과 결합하여 그 세포 내 농도를 증가시킨다는 것을 보인다. 본 명세서의 실시예 26 내지 실시예 30 및 도 54 내지 도 57에서 나타난 결과는 p28에 대한 결합 부위를 p53의 N-말단과 DNA 결합 도메인들인 아미노산 1-17, 24-31, 80-276 또는 297-305로 그 범위를 좁힌다.
p53이 지닌 아주린 결합 도메인이 아주린 Met44 및 Met64에 의해 기술된 소수성 영역을 포함한다는 제안은 소수성 영역이 파괴된 변이(변이 아주린 M44KM64E)가 아주린 조건 하 보다 인간 흑색종(Mel-2) 세포에 대해 더 낮은 세포독성을 띤다는 증거에 의해 뒷받침된다. 이것은 아주린 분자의 p53 결합 도메인이 소수성 영역을 둘러싼다는 것을 보여준다. 최근의 도킹 시뮬레이션 연구는 야생형 아주린과 비교했을 때 상호 작용 자유 에너지에서 변이 복합체가 보이는 유의미한 손실인 ~75 kJ/mol을 입증하면서, 다시 한 번 Met44 및 Met64 잔기를 둘러싸는 아주린의 소수성 영역이 p53과의 상호작용에 중요하다는 것을 보인다. Met64가 p28의 p53 결합부위(p28의 아미노산 15번) 내부에 존재하게 되면서, 경쟁적 검사, 변이 연구 및 도킹 연구는 이것이 p53에 결합하는 아주린 도메인이라는 것을 확실히 보인다.
종양 억제 단백질인 p53은 세포 주기 진행의 억제제인 21 kDa 단백질 p21/Waf1/Cip1을 포함하는, 많은 유전자들에 대해 전사 조절자로서 작용하는 지배적인 핵 단백질이다. p28로 MCF-7 세포를 처리했을 때 p53 농도가 증가했으며, 이것은 사이클린 의존성 인산화효소(CDK), 그 중 특별히 G1과 G2/M 세포 주기 진행을 각각 조절하는 cdc2 및 CDK2의 활성에 강한 억제제로 작용하는 p21의 보다 높은 세포 내 농도로 이어졌다. G2/M 주기가 진행되는 동안, cdc2 및 CDK2 인산화효소는 각각 사이클린 B 및 사이클린 A에 주로 연관되어 활성화된다. CDK 억제제 p21은 G2/M 주기가 고정된 세포에서 사이클린 A와 효율적으로 작용하지만, 같은 조건에서 사이클린 B1은 p21과 작용하지 않으며 따라서 사이클린 B1의 농도는 지속적으로 증가한다. 이것은 MCF-7 세포에서 p28에 의해 유래된 G2/M 고정은 CDK2 및 사이클린 A의 억제에 연관되어 있다는 것을 보인다(도 51 a).
또한, MCF-7 세포에서 p28에 의해 유래된 p21의 증가는 Cip/Kip CDKI 족의 또 다른 구성원인 p27의 시간 의존성 증가에 의해 보조되었다. Hsu 등, 2008은 최근 p53의 유래가 루시퍼레이즈 분석에 의해 결정된 것처럼, p21과 p27 모두의 프로모터 활성을 증가시켰다는 것을 입증했다. Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS), 2008. 추가로, p21 및 p27 프로모터에 대한 p53 DNA 결합 활성은 p53 유도체인 프로게스테론에 의해 활성화되었으며, 이것은 p21뿐만 아니라 p27 또한 p53에 의해 전사적으로 조절된다는 것을 의미한다. 총괄적으로, 데이터는 p28에 의한 p53 농도의 증가는 뒤이어 p21과 p27을 상향 조절하며, 이로서 MCF-7 세포에서 CDK2와 사이클린 A의 세포 내 농도를 크게 감소시킴으로 G2/M 세포 주기를 억제한다(도 57a). 보고된 바는 사이클린 B1과 p21 사이의 부족한 또는 불충분한 연관은 p28에 대한 노출 이후 일어나는 사이클린 B/cdc2 활성의 증가는 p28에 의해 유래된 p21의 증가라는 유사한 패턴을 반영할 수도 있다는 것을 제의한다. p28에 대한 노출에 따라 인산화된 cdc2(비활성화 형태)는 사이클린 B1의 세포 내 농도 향상을 도우며, 이로써 cdc2 인산화의 증가가 cdc2-사이클린 B 복합체의 증가에 반영된다는 것을 제의한다. 이와 유사한 경우인 고농도의 세포질 내 사이클린 B1이 보조하는 MCF-7과 MDA-MB-468 인간 유방암 세포에서의 G2 고정은 미세소관의 알려진 파괴 물질인 노코다졸과 p21의 전사 단계 그리고 번역 단계의 활성체에 의해 유래된다. 전-트랜스 레티놀산(ATRA) 및 소디움 뷰티레이트(SB)와 같은 분화 물질은 CDK6, p21 및 p27을 포함하는 G1 세포 주기 조절 단백질의 유도와 G2 세포 주기 조절 단백질인 CDK2의 억제와 상호연관되는, 구강 편평세포 암종에서 G1 주기 고정과 성장 억제라는 유사한 현상을 생성한다. p28이 MDD2 세포에서 p21을 증가시키지 않았고, p27이 이 세포에서 존재하지 않는 것으로 보이므로, CDK2와 사이클린 A의 농도는 크게 변하지 않았으며(도 57e) 세포 주기의 억제는 일어나지 않았다. G1과 G2/M 주기 고정을 일으키며 인간 세포에서 cdc2 활성을 조절하는 중요한 조절자인 CDK2와 사이클린 A 복합체의 p28에 의해 유래된 양적 감소에 대한 추가적인 증거는 G2/M 에서 세포 주기 고정을 일으키는 CDK2-사이클린 A 복합체를 비활성화 시키는, HeLa 세포로의 사이클린 A RNAi 진입 뒤에 일어나는 G2 주기 연기에서 발견된다.
p21이나 p27과 같은 Cip/Kip 족 단백질이 사이클린 A 의존성 CDK2의 강한 억제제이지만, 그들은 사이클린 D-의존성 인산화효소의 양성 조절자로 작용한다. Cip/Kip 족 단백질은 CDK4와 CDK6을 안정화시킬 수 있다. CDK4는 유방암, 신경교종, 육종 그리고 자궁경부 암종을 포함하는 넓은 범위의 종양들에서 증폭되어 과발현되는 반면, CDK6 유전자는 편평세포암종, 신경교종, 그리고 림프종을 포함하는 특정 악성종류에서 증폭된다. 초기 CDK6의 대조군 농도가 CDK4보다 낮음에도 불구하고, CDK4가 아닌 CDK6의 농도가 p28에 노출된 MCF-7 세포에서 지속적으로 증가한다. 다시 말하지만, p28에 대한 반응으로 p53 및 p21이 증가하지 않은 MDD2 세포에서 CDK4 및 CDK6의 변화는 일어나지 않았다(도 57e). p16Ink4a, p15Ink4b, p18Ink4c와 p19Ink4d인 CDKI의 Ink4 군은 G!에서 세포주기의 진행을 조절하는 CDK4 및 CDK6과 특이적으로 관련되어 억제한다. P16Ink4a 유전자가 MCF-7 세포에서 동형 접합적으로 삭제되므로, Ink4 CDKI 단백질은 CDK4보다 CDK6에서 보다 낮은 억제성 효과를 보여야 할 것이며, 이를 통해 CDK6에서 관찰되는 CDK6의 증상이 본질적으로 안정적인 CDK4 농도의 존재 하에 합리성을 제공할 것이기 때문이다.
총괄하여, 이러한 결과는 p28이 p53에 결합하여, p53의 농도를 증가시킴으로 CDK2-사이클린 A 복합체의 p21과 p27비활성을 통해 항-증식성 활성을 증폭하게 되며, 이를 통해 시험관내 MCF-7 유방암 세포에서 G2/M 세포주기 고정을 일으키며 비흉선 마우스에서의 MCF-7 이종 이식 성장의 억제를 야기하는 것을 입증한다.
본 발명의 조성물
특정 실시예에서, 본 발명은 포유류의 세포, 조직 및 동물의 전암성 병소의 발달을 억제하는 큐프레독신 또는 큐프레독신의 변이체, 절단부, 유도체 또는 구조적 등가물인 펩타이드를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 포유류의 세포, 조직 및 동물의 암의 발달을 억제하는 큐프레독신 또는 큐프레독신의 변이체, 절단부, 유도체 또는 구조적 등가물인 펩타이드를 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 35, 36 또는 37과 같은 p28(서열번호 2)의 C-말단을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 아주린과 동일하거나 유사한 위치에서 서열번호: 1의 69, 70, 75, 76 및 85 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 일부 실시예는 암세포에 우선적으로 진입하는 큐프레독신 또는 큐프레독신의 변이체, 절단부, 유도체 또는 구조적 등가물인 펩타이드를 더 제공한다. 추가적인 양태에서, 본 발명은 카베올레-매개된 및 골지 매개된 경로를 포함하는 엔도시토시스 경로에 의해 세포에 우선적으로 진입하고, 그 안에서 화학적 방어 효과를 가지는 큐프레독신 또는 큐프레독신의 변이체, 절단부, 유도체 또는 구조적 등가물인 펩타이드를 제공한다. 추가적인 실시예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 35, 36 및 37과 같은 p28의 C-말단을 포함하거나, 서열번호 35, 36 및 37과 같은 p28의 C-말단으로 구성된다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 아주린과 동일하거나 유사한 위치에서 서열번호: 1의 69, 70, 75, 76 및 85 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 아주린과 동일하거나 유사한 위치에서 서열번호: 1의 69, 70, 75, 76 및 85 위치에 있는 아미노산을 포함한다.
일부 실시예에서, 상기 펩타이드는 단리된다. 일부 실시예에서, 상기 펩타이드는 실질적으로 순수하거나 약학적 등급이다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 펩타이드를 포함하거나 이를 필수적 구성요소로 하는 조성물에 존재한다. 또 다른 구체적인 실시 예에서, 펩타이드는 비-항원성이며 포유류, 그리고 더욱 구체적으로는 인간에게서 면역 반응을 불러 일으키지 않는다. 일부 실시예에서, 펩타이드는 완전한 길이의 큐프레독신보다 짧으며, 큐프레독신의 약학적 활성 중 일부를 유지하고 있다. 구체적으로, 일부 실시예에서, 펩타이드는 마우스 유선 기관 배영에서 전암성 병소의 발달을 억제하는 능력을 유지하고 있을 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 예를 들어, 카베올레-매개된 엔도사이토시스를 통해서 세포안으로 직접적으로 그리고 우선적으로 진입하는 능력을 유지한다. 다른 실시예에서, 상기 펩타이드는 세포내의 직접적 및 우선적 진입 능력을 유지하고 그 안에서 화학적 방어 효과를 가진다.
다른 양태에서, 본 발명은 큐프레독신 또는 암세포에 우선적으로 진입하는 큐프레독신의 변이체, 유도체, 절단부 또는 구조적 등가물인 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 조성물, 특히 약학 조성물을 제공한다. 구체적인 실시예에서, 약학적 구성 요소는 예를 들면, 구강, 복강 내, 또는 정맥 내를 포함하지만 여기에 국한되지는 않는 특정한 투여 경로를 위해 설계되었다. 그러한 구성 요소는 물에 수화될 수 있거나, 이후의 수화를 위해 건조될 수 있다(동결 건조 등을 통해). 그러한 구성 요소는 예를 들면, 알코올을 포함하지만 여기에 국한되지는 않는, 물 이외의 다른 용매들에 담길 수 있다.
또한, 본 발명의 특정 실시예는 포유류의 세포, 조직 및 동물의 암세포 및/또는 종양에 우선적으로 진입하는 큐프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물인 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 35 또는 36과 같은 p28의 C-말단이다. 일부 실시예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 25를 가지는 p18이다. 일부 실시예에서, 상기 펩타이드는 p18의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물이다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 DNA 또는 RNA에 결합된 p18이다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 유전자 또는 유전자의 일부분이다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 한번 전달되면 치료적 효과를 가진다. 일부 실시예에서, 상기 펩타이드는 서열번호 2를 가지는 p28이다. 일부 실시예에서, 상기 펩타이드는 p28의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물이다. 일부 실시예에서, 상기 조성물은 DNA 또는 RNA에 결합된 p28이다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 유전자 또는 유전자의 일부분이다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 한번 전달되면 치료적 효과를 가진다.
큐프레독신 사이에 존재하는 높은 구조적 상동성 때문에, 큐프레독신이 아주린과 p28과 같은 화학적 예방 물성을 지닐 것이라고 고려된다. 일부 실시예에서, 큐프레독신은 아주린, 슈도아주린, 플라스토시아닌, 루스티시아닌, 아우라시아닌, 스텔라시아닌, 오이 기초 단백질 또는 Laz를 포함하지만 여기에 국한되지는 않는다. 특히 구체적인 실시예에서, 아주린은 녹농균, 알칼리게네스 파이칼리스, 아크로모박터 실로속시단 아종 데니트리피칸스 I, 보르데텔라 브론키셉티카, 메틸로모나스 종, 수막염균, 임균, 슈도모나스 플로오레센스, 슈도모나스 클로로라피스, 포도피어슨병균, 울바 퍼투시스 그리고 장염 비브리오로부터 파생된다. 일 실시예에서, 아주린은 녹농균으로부터 유래된다. 다른 특정 실시예에서, 큐프레독신은 서열번호: 1, 3-19 아미노산 서열을 포함한다
본 발명의 양태는 야생형 큐프레독신과 비교했을 때 대체된, 삭제된 또는 삽입된 아미노산을 가지는 아미노산 변이체인 펩타이드를 포함한다. 본 발명의 변이체은 야생형 큐프레독신의 절단부일 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 화학적 방어제는 야생형 폴리펩타이드의 전체 길이보다 짧은 큐프레독신의 영역을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 펩타이드는 절단된 큐프레독신의 10개 이상 정도의 잔기, 15개 이상 정도의 잔기, 또는 20개 이상 정도의 잔기를 포함한다. 일부 실시예에서, 펩타이드는 절단된 큐프레독신의 100개 이하 정도의 잔기, 50개 이하 정도의 잔기, 40개 이하 정도의 잔기, 30개 이하 정도의 잔기 또는 20개 이하 정도의 잔기를 가진다. 일부 실시예에서, 큐프레독신은 본 발명의 펩타이드에 대해, 그리고 더욱 구체적으로는 본 발명의 펩타이드로서 서열번호: 1, 3-19에 대해, 최소 70%의 아미노산 서열 유사성, 최소 80%의 아미노산 서열 유사성, 최소 90%의 아미노산 서열 유사성, 최소 95%의 아미노산 서열 유사성, 또는 최소 99%의 아미노산 유사성을 지닌다.
구체적인 실시예에서, 큐프레독신의 변이체은 녹농균으로부터의 아주린 잔기 50번 내지 77번 (p28, 서열번호: 2), 아주린 잔기 50번 내지 67번 (p18, 서열번호: 25) 또는 아주린 잔기 36번 내지 88번 (서열번호: 26)를 포함한다. 다른 실시예에서, 큐프레독신의 변이체은 녹농균으로부터의 아주린 잔기 50번 내지 77번 (서열번호: 2), 아주린 잔기 50번 내지 67번 (서열번호: 25) 또는 아주린 잔기 36번 내지 88번 (서열번호: 26)를 포함한다. 다른 구체적인 실시예에서, 변이체은 아주린을 제외한 큐프레독신의 동등한 잔기들을 포함한다. 아주린 잔기 50번 내지 77번 (서열번호: 2) 또는 아주린 잔기 36번 내지 88번 (서열번호: 35)와 유사한 약학적 활성을 지니는 다른 큐프레독신 변이체이 설계될 수 있다는 것이 고려되었다. 이것을 하기 위해, 대상 큐프레독신 아미노산 서열이 녹농균으로부터의 아주린 서열에 BLAST, BLAST2, ALGlN2 또는 Megalign (DNASTAR)를 사용하여 배열되며, 대상 큐프레독신 서열에서 녹농균 아미노산 서열에 위치한 관련된 잔기와 동등한 잔기가 발견되며, 따라서 동등한 펩타이드가 설계된다.
본 발명의 일 실시예에서, 큐프레독신 변이체은 최소한 클로로플렉서스 아우란티아쿠스의 아우라시아닌 B의 아미노산 57번 내지 89번(서열번호: 20)를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 변이체은 적어도 녹농류으로부터의 아주린(서열번호: 25)의 아미노산 50번 내지 67번을 함유한다. 본 발명의 다른 실시 예에서, 상기 큐프레독신 변이체은 최소한 참다래 꽃썩음병균으로부터의 아주린의 아미노산 51번 내지 77번 (서열번호: 21)을 포함한다. 본 발명의 다른 실시 예에서, 상기 큐프레독신 변이체은 최소한 수막염균 Laz로부터의 아미노산 89번 내지 115번 (서열번호: 22)를 포함한다. 본 발명의 다른 실시 예에서, 상기 큐프레독신 변이체은 최소한 장염 비브리오로부터의 아주린의 아미노산 52번 내지 78번 (서열번호: 23)을 포함한다. 본 발명의 다른 실시 예에서, 상기 큐프레독신 변이체은 최소한 보르데텔라 브론키셉티카로부터의 아주린의 아미노산 51번 내지 77번 (서열번호: 24)을 포함한다.
또한, 상기 변이체은 자연적으로 존재하지 않는, 합성된 아미노산으로 만들어진 펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 비자연적으로 존재하는 아미노산 또한 혈관 내에서 구성 요소의 반감기를 최적화시키거나 연장하기 위해 상기 변이체에 포함될 수 있다. 그러한 상기 변이체은 D,L-펩타이드(부분입체이성질체), (예를 들면, Futaki 등, J. Biol. Chem. 276(8):5836-40 (2001); Papo 등, Cancer Res. 64(16):5779-86 (2004); Miller 등, Biochem. Pharmacol. 36(l):169-76, (1987).; 특이한 아미노산을 포함하는 펩타이드 (예를 들어 Lee 등, J. Pept. Res. 63(2):69-84 (2004)), 탄화수소 고정에 뒤따른 올레핀을 포함하는 비자연적 아미노산(예를 들면, Schafmeister 등, J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski 등, Science 305:1466-1470 (2004)), 그리고 ε-(3,5- dinitrobenzoyl)-Lys 잔기들을 포함하는 펩타이드를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
다른 실시예에서, 본 발명의 펩타이드는 큐프레독신의 유도체이다. 큐프레독신의 유도체는 펩타이드가 큐프레독신의 중요한 활성 중 일부를 유지하고 있는 범위 내의 화학적 변형물이다. 예를 들면, 아주린의“유도체”는 엔도사이토시스 또는 비엔도사이토시스 경로를 통해 세포 내로 우선적으로 진입할 수 있는 능력 뿐만 아니라, 포유류 세포, 조직 또는 동물에서 전암성 병소의 발달을 억제할 수 있는 능력을 유지하고 있는, 화학적으로 변형된 아주린일 수 있다. 화학적 변형 중 관심사는 펩타이드의 탄화수소 안정화, 아미드화, 아세틸화, 황산화, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 변형, 인산화 그리고 글리코실화와, 본 명세서에서 밝혀진 방법과 기법을 포함하지만 여기에 국한되지는 않는다. 추가로, 파생된 펩타이드는 펩타이드, 약물 분자 또는 다른 치료성 또는 약학적 시약 또는 검출 가능한 탐침을 포함하지만 여기에 국한되지는 않는 화학적 조성물에 큐프레독신 또는 큐프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 융합시키는 것일 수 있다. 유도체의 관심사는 구형화된 펩타이드들 (예를 들면, Monk 등, BioDrugs 19(4):261-78, (2005); DeFreest 등, J. Pept. Res. 63(5):409-19 (2004)), N- 그리고 C- 말단 변형 (예를 들어 Labrie 등, Clin. Invest. Med. 13(5):275-8, (1990)), 그리고 탄화수소 고정에 뒤따른 올레핀을 포함하는 비자연적 아미노산 (예를 들어 Schafmeister 등, J. Am. Chem. Soc. 122:5891-5892 (2000); Walenski 등, Science 305:1466-1470 (2004)) 를 포함하지만 여기에 국한되지는 않는, 당해 분야의 기술자에게 잘 알려진 일부 방법과 같이, 혈관 내에서 본 발명의 구성 요소와 펩타이드의 반감기가 연장되거나 최적화되게 할 수 있는 화학적 변형을 포함한다.
일부 실시예에서, 큐프레독신은 펩타이드의 수화 반응을 감소시키거나, 펩타이드의 탈아미노 반응을 감소시키거나, 산화 반응을 감소시키거나, 면역원성을 감소시키고/감소시키거나 펩타이드의 구조적 안정성을 향상시키는 것을 포함하지만 여기에 국한되지 않는 방법을 사용하여 달라질 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 큐프레독신은 암세포 내로 우선적으로 진입하는 능력을 향상시키고/시키거나 그 안에서 세포독성 효과를 가지는 방법을 이용하여 변형될 수 있다. 본 명세서에 포함된 두 개 이상의 변형은 큐프레독신으로부터 파생된 하나의 변형된 펩타이드에서 조합될 수 있으며, 또한 본 영역의 구성원에게 잘 알려진 약물동력학적 물성을 향상시키기 위해 다른 변형 방법과 본 명세서에 포함된 하나 또는 그 이상의 변형과 조합될 수 있다. 그러한 변이체과 유도체를 설계하기 위한 많은 방법이 당해 기술자에게 잘 알려져 있다.
생체내 변환
특별히 아주린의 절단부과 같은 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드와 같은 화학적 방어제의 약물동력학적 물성을 향상시키기 위한 한 접근 방법은, 생체 내 변환에 보다 덜 민감한 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드의 변이체과 유도체를 생성하는 것이다. 생체 내 변환은 펩타이드의 약물동력학적 활성을 감소시킬 뿐만 아니라 환자의 체내에서 제거되는 비율 또한 증가시킨다. 이를 달성하는 한 방법은 생체 내 변환이 일어날 가능성이 가장 높은 아미노산 및/또는 아미노산 서열을 결정하여 이 아미노산을 특정한 변환적 과정에 민감하지 않은 아미노산으로 대체하는 것이다.
일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드는 비자연적 아미노산 또는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 특정한 비자연적 아미노산의 도입은 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드의 약물동력학적 물성을 향상시킨다. 그러한 도입은 부위 특이적일 수 있으며 생체 내에서 특정 생화학적 변형을 피하기 위해 일어날 수 있다. 이러한 경우에 잘 부합되는 비자연적 아미노산은 β-아미노산(예를 들면, b3와 b2), 호모-아미노산, 고리형 아미노산, 방향족성 아미노산, Pro 및 Pyr 유도체, 3-치환된 알라닌 유도체, 글리신 유도체, 고리-치환된 Phe 및 Tyr 유도체, 선형 핵 아미노산 및 디아미노산을 포함한다. 그러한 비자연적 아미노산은 위치선택적 변형, 리보솜 번역, 또는 펩타이드의 화학적 합성에 의해 펩타이드에 포함될 수 있다. 이러한 각각의 방법들이 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드를 합성하는 데에 적용될 수 있다.
예를 들어, 큐프레독신으로부터 파생된 변형된 펩타이드는 야생형 아미노아실-tRNA 합성효소(AARSs)를 비자연적 아미노산과 함께 사용하여 비자연적 큐프레독신 변이체을 생산하기 위해 합성될 수 있다. Hartman, 등, PLoS One, 2(10): e972 (2007); Miranda, 등, J. Am. Chem. Soc. 129: 13153-13159 (2007)을 참조. 리보좀 번역 기구의 특이성은 리보좀 번역을 사용하여 펩타이드에 포함될 수 있는 비자연적 아미노산의 다양성을 제한한다. 90개 이상의 AARS 기질인 비자연적 구성 요소의 측쇄과 중추 구조 유사체를 포함한 구조가 알려져 있다. Hartman, 등, PLoS One, 2(10): e972 (2007). 50개 이상의 비자연적 아미노산이 전-효소성 번역 시스템을 사용하여 높은 효율로 펩타이드에 포함될 수 있으며, 펩타이드는 최대 13개의 다른 비자연적 아미노산을 포함할 수 있다. Hartman, 등, PLoS One, 2(10): e972 (2007). 일부 실시예에서, 그러한 아미노산은 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드에 포함될 수 있다.
One method of chemically modifying a 큐프레독신 또는 시토그롬 c551 또는 이들의 변이체, 유도체, 절단부 또는 구조적 등가물을 화학적으로 변형하는 하나의 방법은 하기 주어지는 단계를 따를 수 있으며, 상기 단계는 항-HIV 작은 단백질을 설계하는 단계, 예를 들어, 소수성 N-말단 변형, 총 단백질-중합체 복합 화학적 합성(total protein-polymer conjugate chemicals synthesis), 암호화 및 비암호화된 아미노산 돌연변이, 펩타이드 골격 공학(peptide backbone engineering), 및 부위-특이적 중합체 부착(site-specific polymer attachment)에 의해 개선된 약학적 성질을 갖는 CCL-5(RANTES)를 설계하는 단계이다. 항-HIV 단백질은, 변화하는 부착 위치에서 중합체 치환기를 함유하는 CCL-5 유사체 안으로 자연의 및 비자연의 아미노산 잔기를 포함하는 것에 의해 설계될 수 있다. 연구들은, 중합체에 의해 변형된 CCL-5 유도체(polymer-modified CCL-5 derivatives)의 시험관 내에서 항-HIV의 활성이 CCR-5 신호와 연관이 있어서, 펩타이드로의 변화가 CCR-5 활성을 파괴하지 않아야 한다는 것을 나타냈다. Miranda, 등, J. Am. Chem. Soc. 129: 13153-13159 (2007), 상기 문헌은 본 명세서에 전체로 포함된다.
다른 변형들은 광학적으로 활성을 띠는 α-아미노산의 사용을 포함할 수 있다. 광학적으로 활성을 띠는 α-아미노산들과 그들의 유도체를 사용하는 것은 약학적, 농약, 및 카이랄 리간드로 그 영역이 확장되고 있다. 특별히, 카이랄 글리신과 알라닌 등가물은 중요한 역할을 맡는다. α-아미노산을 만드는 최소 하나의 광학선택적 전략이 제안되었으며, 이를 통해 광학이성질적으로 순수한 α-아미노산을 기결정된 입체화학에서 허용한다. Lu, 등 본 명세서에 참고로 그 개요가 포함된, 2008년 9월 11일에 인터넷에 출간된 (J. Org. Chem. 에 출판하기 위해) “α-아미노산의 비대칭적 합성: α-메틸 트랜스신나말데하이드로부터 파생된 모노사이클릭 이미노락톤의 알킬화와 제조”. 큐프레독신으로부터 파생된 변형된 펩타이드는 거울상 이성질체를 생성하기 위해 광학적으로 활성을 띠는 α-아미노산을 사용하여 합성될 수 있다.
수화 반응은 아스파탐산을 포함하는 펩타이드에서 일반적으로 문제가 된다. 아스파탐산은 고리형 이미드 중간체를 형성하기 위한 탈수 반응에 민감하며, 이를 통해 비활성인 이소-아스파탐산 유사체로 전환되며, 궁극적으로 펩타이드 사슬을 절단하게 된다. 예를 들어, 아스파탐산-프롤린이 펩타이드 서열에 존재하는 경우, 산 촉매 반응으로 유래되는 고리형 이미드 중간체의 형성은 펩타이드 체인의 절단으로 이어질 수 있다. 비슷하게, 아스파탐산-글리신이 펩타이드 서열에 존재하는 경우, 고리형 중간체는 원형의 아스파탐산 형태로 변하거나(무해함) 이소-아스파탐산 유사체로 변할 수 있다. 종래에는 모든 아스파탐산 형태가 이소-아스파탐산 유사체로 바뀐다. 비슷하게, 세린이 포함된 서열 또한 탈수 반응을 통해 펩타이드 사슬을 절단할 수 있는 고리형 이미드 중간체를 형성할 수 있다. 펩타이드의 절단은 세포질 내 반감기의 감소와 펩타이드의 특이적 약학적 활성의 감소로 이어질 수 있다.
큐프레독신으로부터 유래된 펩타이드 서열에 존재하는 아스파라긴 및/또는 세린을 다른 아미노산으로 대체하는 것은 더욱 길어진 세포질 내 반감기와 펩타이드의 특이적 약학적 활성의 증가와 같은, 향상된 약물동력학적 물성으로 이어질 수 있다는 것이 고려된다. 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드의 한 변이체에서는 하나 이상의 아스파라긴 잔기를 다른 아미노산 잔기, 구체적으로는 글루탐산 잔기로 대체할 수 있다. 다른 고려되는 변이체에서, 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드의 하나 이상의 세린 잔기를 다른 아미노산 잔기, 그리고 구체적으로는 트레오닌 잔기로 대체할 수 있다. 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드 중 일부 변이체에서는, 하나 이상의 아스파라긴 잔기와 하나 이상의 세린 잔기가 대체된다. 일부 실시예에서, 보존적 대체가 이루어졌다. 다른 실시예에서는, 비보존적 대체가 이루어졌다.
아미노산 잔기의 탈아미노화 반응은 생체내 변환에서 특별한 문제다. 이 염기 촉매 하의 반응은 아스파라긴-글리신 또는 글루타민-글리신을 포함하는 서열에서 자주 일어나며, 아스파탐산-글리신 서열에서와 같은 메커니즘을 따라간다. 아스파라긴-글리신 서열의 탈아미노화 반응은 이후 수화 반응을 거쳐 아스파탐산 또는 아스파라긴의 이소아스파탐산 유사체를 형성하게 되는 고리형 이미드 중간체를 형성한다. 추가로, 고리형 이미드 중간체는 D-아스파탐산 또는 아스파라긴의 D-이소아스파탐산 유사체를 향한 라세미화로 이어질 수 있는데, 이들 모두는 펩타이드의 비활성 형태로 다시 이어질 수 있는 가능성이 존재한다.
큐프레독신 펩타이드의 탈아미노화가 큐프레독신에 존재하는 아스파라긴-글리신 또는 글루타민-글리신 서열의 글리신, 아스파라긴, 및/또는 글루타민을 다른 아미노산으로 대체함으로서 예방될 수 있고, 더욱 길어진 세포질 내 반감기와 펩타이드의 특이적 약학적 활성의 증가와 같은, 향상된 양물동력학적 물성으로 이어질 수 있다는 것이 고려된다. 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래된 펩타이드의 하나 이상의 글리신 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되었다. 구체적인 실시예에서, 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드의 하나 이상의 글리신 잔기가 트레오닌 또는 알라닌 잔기로 대체되었다. 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드의 하나 이상의 아스파라긴 또는 글루타민 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체되었다. 구체적인 실시예에서, 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드의 하나 이상의 아스파라긴 또는 글루타민 잔기가 알라닌 잔기로 대체되었다. 다른 구체적인 실시예에서, 녹농균으로부터의 아주린의 잔기 58번 및/또는 68번 (서열번호: 1)에 존재하는 글리신, 또는 다른 큐프레독신의 동등한 글리신이 알라닌 또는 트레오닌으로 대체되었다. 다른 구체적인 실시예에서, 녹농균으로부터의 아주린의 잔기 59번(서열번호: 1)에 존재하는 메티오닌, 또는 다른 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드에 존재하는 동등한 메티오닌 잔기가 알라닌으로 대체되었다. 다른 구체적인 실시예에서, 녹농균으로부터의 아주린 잔기 63번(서열번호: 1)에 존재하는 글리신, 또는 다른 큐프레독신으로부터 파생된 펩타이드에 존재하는 동등한 글리신 잔기가 트레오닌으로 대체되었다. 일부 실시예에서, 보존적 대체가 이루어졌다. 다른 실시예에서, 비보존적 대체가 이루어졌다. 구체적인 실시예에서, 본 발명의 큐프레독신으로부터 파생된 변형된 펩타이드는 다음의 서열을 포함하며, 이 서열에서 밑줄이 쳐진 아미노산들은 야생형 녹농균 p28 서열로 대체된다.
LSTAADMQAVVTDTMASGLDKDYLKPDD (서열번호: 38).
아미노산의 가역적과 비가역적 산화 반응은 큐프레독신으로부터 유래된 펩타이드의 약학적 활성 및/또는 세포질 내에서의 반감기를 감소시킬 수 있는 문제를 제기할 다른 생체 내 변형 과정이다. 시스테인과 메티오닌 잔기는 가역적 산화 과정을 거치는 주요 잔기이다. 시스테인의 산화 과정은 보다 높은 pH에서, 즉 티올이 보다 쉽게 양성자를 잃고 쉽게 사슬-내 또는 사슬-외 이화황 결합을 형성할 수 있는 조건에서 가속화된다. 이러한 이황화 결합은 시험관 내 환경에서 디티올드레이톨(DTT) 또는 트리스(2-카르복시에틸포스핀) 하이드로클로라이드(TCEP)를 처리함으로서 쉽게 반전될 수 있다. 메티오닌은 메티오닌 술폭시화물, 그리고 이후 메티오닌 술폰을 형성하기 위해 화학적 그리고 광화학적 경로 모두에 의해 산화되는데, 이들 모두는 그 반응을 반전시키는 것이 거의 불가능하다.
큐프레독신으로부터 유래된 펩타이드에서 일어나는 산화 반응이 메티오닌 및/또는 시스테인 잔기를 다른 잔기로 치환함을 통해 예방될 수 있다는 것이 고려되었다. 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래된 펩타이드에 존재하는 하나 이상의 메티오닌 및/또는 시스테인 잔기는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되었다. 구체적인 실시예에서, 메티오닌 잔기는 류신 또는 발린 잔기에 의해 치환되었다. 다른 구체적인 실시예에서, 녹농균으로부터의 아주린 잔기 56번 및 64번 (서열번호: 1)에 존재하는 하나 이상의 메티오닌 잔기, 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래된 펩타이드에 존재하는 동등한 메티오닌 잔기가 류신 또는 발린에 의해 치환되었다. 일부 실시예에서, 보존적 치환이 이루어졌다. 다른 실시예에서, 비보존적 치환이 이루어졌다. 구체적인 실시예에서, 본 발명의 큐프레독신 펩타이드는 다음 서열들 중 하나를 포함하며, 밑줄 친 아미노산은 야생형 녹농균 p28 서열로 치환되었다: LSTAADLQGVVTDGLASGLDKDYLKPDD (서열번호: 39) 또는 LSTAADVQGVVTDGVASGLDKDYLKPDD (서열번호: 40).
다이케토피페라진과 파이로글루탐산 형성은 큐프레독신으로부터 유래된 펩타이드들의 약학적 활성, 세포질 내에서의 반감기 및/또는 면역원성에 영향을 끼칠 수 있는 또 다른 생체 내 변형 과정(예, 세포에 우선적으로 진입하는 능력)이다. 다이케토피페라진의 형성은 글리신이 N-말단에서 세 번째 위치에 놓여있을 때, 그리고 더욱 구체적으로는 프롤린 또는 글리신이 1번 또는 2번 위치에 존재할 때 보통 일어난다. 반응은 두 번째와 세 번째 아미노산 사이에 존재하는 아미드 카보닐기를 향한 N-말단 질소의 친핵성 공격을 동반하며, 이것은 첫 두 아미노산이 디케토피페라진의 형태를 띠고 절단되는 것으로 이어진다. 반대로, 파이로글루탐산의 형성은 만약 글루타민이 N-말단에 존재한다면 거의 필연적으로 일어난다. 이것은 N-말단 질소가 글루타민의 측쇄 카보닐 탄소를 공격해서 탈아미노화된 파이로글루타마일 펩타이드 유사체를 형성하는, 유사 반응이다. 이러한 전환은 또한 N-말단에서 아스파라긴을 포함하는 펩타이드에서도 마찬가지로 일어나지만, 보다 적은 정도로 일어난다.
N-말단으로부터 1, 2 또는 3번 위치에 존재하는 글리신, N-말단으로부터 3번 위치에 존재하는 프롤린, 또는 N-말단에 존재하는 아스파라긴을 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들에서 다이케토피페라진과 파이로글루탐산의 형성이 낮춰질 수 있다는 것이 고려되었다. 일부 실시예에서, N-말단으로부터 1, 2, 또는 3번 위치에 존재하는 글리신이 다른 아미노산 잔기로 치환되었다. 구체적인 실시예에서, 글리신 잔기가 트레오닌 또는 알라닌 잔기로 치환되었다. 다른 실시 예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 N-말단의 3번 위치에 존재하는 프롤린이 다른 아미노산 잔기로 치환되었다. 구체적인 실시 예에서, 프롤린은 알라닌 잔기로 치환되었다. 다른 실시 예에서, N-말단에 존재하는 아스파라긴이 다른 아미노산 잔기로 치환되었다. 구체적인 실시예에서, 아스파라긴 잔기는 글루타민 잔기로 치환되었다. 일부 실시예에서, 보존적 치환이 이루어졌다. 다른 실시예에서, 비보존적 치환이 이루어졌다.
큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 약학적 활성, 세포질 내 반감기 및/또는 면역원성에 영향을 끼칠 수 있는 다른 생체 내 변형 과정은 라세미화이다. 이 용어는 아미노산 또는 펩타이드의 카이랄 완전성의 전반적인 손실을 광범위하게 일컫는 데 사용된다. 라세미화는 아미노산의 한 거울상 이성질체 형태(주로 L-형태)를 염기 촉매 하에 L-거울상 이성질체 및 D-거울상 이성질체의 1:1 혼합물로 바꾸는 과정을 수반한다. 펩타이드의 안정성을 향상시키기 위한 한 가지 일반적인 방법은 레트로-인버소(D-이성질체) 펩타이드를 만드는 것이다. 펩타이드 구조의 이중 변환은 종종 측쇄의 표면 위상을 온전히 남겨놓으며, 따라서 생물학적으로 활성을 띤 펩타이드를 안정화시키기 위해 광범위하게 사용되었다. Snyer 등, PLoS Biol. 2:0186-0193 (2004). D-아미노산으로 치환된 Tat은 L-아미노산 펩타이드와 마찬가지로 세포 안으로 내재화된다. Futaki 등, J. Biol. Chem. 276:5836-5840 (2001); Huq 등, Biochemistry 38:5172-5177 (1999). 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들의 하나 이상의 아미노산 잔기는 그 아미노산 잔기의 D-이성질체로 치환되었다. 다른 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 모든 아미노산 잔기들은 그 잔기들의 D-이성질체로 치환되었다. 일 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 변형된 펩타이드는 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 레트로-인버소(retro-inverso)(D-이성질체) 버전이다. 한 구체적인 실시 예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 변형된 펩타이드는 DDPKLYDKDLGSAMGDTVVGQMDAATSL (서열번호: 41)이다.
큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드를 생체 내 변형적 분해로부터 보호하는 다른 방법은 N-아세틸화와 C-아미드화이다. 이 유도체는 펩타이드를 분해로부터 보호할 수 있으며 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드를 자연적 단백질에 존재하는 알파 아미노와 카복실기의 전하 상태를 보다 가깝게 흉내낼 수 있도록 만들 수 있다. N-아세틸화 및/또는 C-아미드화가 일어난 펩타이드는 상업적 제공자들에 의해 제공될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 N-말단이 아세틸화될 수 있다. 본 발명의 다른 실시 예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 C-말단이 아미드화될 수 있다. 구체적인 일 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 변형된 펩타이드는 아세틸화-LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD-아미드화 (서열번호: 42)이다.
고리화는 본 명세서에 기술된 큐프레독신을 포함하는 치료적 펩타이드에 이익이 될 수 있는, 추가적인 생체 내 변형의 방법이다. 고리화는 치료적 펩타이드들을 안정화 시킴으로써, 보다 오래 보존되고, 보다 낮은 투여량으로 투여될 수 있으며 보다 적은 빈도수로 투여될 수 있도록 한다. 고리화는 펩타이드 분해효소 및 단백질 분해효소에 대항하여 펩타이드를 분해로부터 보호하는 것으로 나타났다. 고리화는 화학적 또는 효소적으로 이루어질 수 있다. 효소적 고리화는 일반적으로 화학적 고리화보다 문제가 적은데, 그 이유는 화학적 고리화는 부위 특이성 그리고 입체 특이성이 떨어질 수 있으며, 이로 인해 고리화 대신 다합체화가 일어나 복잡한 다단계 과정을 요구할 수 있기 때문이다.
효소적 고리화는 란티바이오틱, 즉 (메틸)란티오닌을 포함하는 세균성 펩타이드에서 보여졌다. 예를 들면, R. Rink, 등, “Lantibiotic Structures as Guidelines for the Design of Peptides that Can Be Modified by Lantibiotic Enzymes” 44 Biochem., 8873-82 (2005); R. Rink, 등, "Production of Dehydroamino Acid-Containing Peptides by Lactococcus lactis" 73:6 Applied and Environmental Microbiology, 1792-96 (2007); R. Rink, 등, "NisC, the Cylcase of the Lantibiotic Nisin, Can Catalyze Cyclization of Designed Nonlantibiotic Peptides" 46 Biochem., 13179-89 (2007)(각각은 모두 본 명세서에 참고로 포함되었다). 란티바이오틱은 그람-양성 세균의 성장에 의해 생성되며, 그 성장을 억제한다. 란티바이오틱에서, 디하이드로알라닌과 디하이드로뷰티린은 세린과 트레오닌 잔기의 효소 매개 탈수소 반응에 의해 생성된다. 시스테인은 이후 효소적으로 탈수된 세린과 트레오닌 잔기에 결합되어 티오에테르 고리화를 형성한다. 자연적으로 발생하는 란티바이오틱은, 최대 19개 잔기가 떨어져 있는 잔기들 사이에서 티오에테르 결합을 통해 어떻게 그러한 결합이 일어날 수 있는 지를 보인다. 티오에테르 고리 형성은 선도 펩타이드에 따라 결정된다. 고리화의 위치는 고리화효소를 매개로 일어나는 부위 특이성 그리고 입체특이성 고리 닫힘과, 탈수반응이 일어날 수 있는 세린과 트레오닌 잔기들의 위치에 따라 결정된다.
란티바이오틱의 특성이 가장 잘 규명된 것은 니신, 즉 락토코커스 락티스에 의해 생성된 오환성 펩타이드 항생물질이다. 니신은 네 개의 메틸란티오닌, 한 개의 란티오닌, 두 개의 디하이드로알라닌, 한 개의 디하이드로뷰티린, 그리고 26개의 변형되지 않은 아미노산으로 구성되어 있다. 니신의 티오에테르 가교 다섯 개는 세린과 트레오닌으로부터 생성되는 디하이드로알라닌과 디하이드로뷰티린에 시스테인 잔기를 첨가함으로 생성된다. 니신은 막관련 효소 복합체에 의해 전사 후 과정으로 진입하는, 티오에테르를 포함하는 아미노산을 포함한다. 이 효소 복합체는 다음을 포함한다: 운반체 NisT, 세린과 트레오닌 탈수효소 NisB, 그리고 고리화효소 NisC. NisB는 세린과 트레오닌 잔기를 탈수화시키며, 그들을 각각 디하이드로알라닌과 디하이드로뷰티린으로 바꾼다. 이 과정에 뒤따른 반응은 NisC 촉매 하에, 시스테인이 생성된 디하이드로잔기에 거울상 이성질체에 우선적으로 결합시키는 것이다. NisT는 변형된 프리니신을 내보내는 과정을 촉진시킨다. 또 다른 효소인 NisP는 프리니신에서 니신 선도 펩타이드를 절단한다.
고리화효소 NisC는 그 특성이 잘 규명되었다. Li 등, "Structure and Mechanism of the Lantibiotic Cylclase Involved in Nisin Biosynthesis" 311 Science, 1464-67 (2006) (모두 본 명세서에 참고로 포함되었다).
란티바이오틱에서 고리화의 분석은 고리화를 선호하는 펩타이드의 아미노산 서열 및 특성의 식별을 가져온다. 세린 및 트레오닌 잔기 옆에 특정한 아미노산이 존재하는 경우 NisB 효소가 탈수화 반응을 더 자주 이끈다는 것이 알려졌다. 란티바이오틱 프로펩타이드에서 세린과 트레오닌 잔기들에 소수성, 비방향성 잔기들이 가깝게 존재할 경우 고리화가 더욱 자주 일어난다는 것이 알려졌다. 번형된 시스테인 옆에 위치한 잔기들은 변형된 트레오닌들과 세린들 옆에 위치한 잔기들보다 전형적으로 소수성을 덜 띤다. 헥사펩타이드 VSPPAR(서열번호: 43), YTPPAL(서열번호: 44) 및 FSFFAF(서열번호: 45)를 포함하는 예외가 발견되었다. 이 헥사펩타이드는 3번 또는 4번 위치에 존재하는 프롤린, 또는 양쪽 측면에 페닐알라닌이 존재할 경우 탈수화 반응을 막을 수 있다는 것을 시사한다. 고리는 전형적으로 탈수화된 잔기를 C-말단에 위치한 시스테인에 연결함으로써 형성된다. 하지만, 고리들은 N-말단에 위치한 시스테인에 탈수화된 잔기를 연결함으로써 형성될 수도 있다.
니신 탈수화 및 수송 효소는 니신에만 특이적이지 않으며, 사실상 비-니신 펩타이드(그리고 비-란티바이오틱 펩타이드)를 변형하기 위해 사용될 수도 있다는 것 또한 알려졌다. NisB는 인간 펩타이드 호르몬과 같은 펩타이드에서, 그 펩타이드가 N-말단적으로 란티바이오틱 선도 펩타이드에 융합되어 있을 경우 세린과 트레오닌 잔기를 탈수화시키는 것으로 알려졌다. 비-란티바이오틱 펩타이드에서, 유사한 고리 형성 특성이 적용된다; 다시 말해, 탈수화 반응의 범위는 탈수화가 가능한 세린과 트레오닌 잔기들 옆에 위치하는 부위의 아미노산 특성에 따라 조절된다. 세린과 트레오닌 주위에 소수성 잔기들 (예를 들어 알라닌과 발린)이 존재하는 것은 완전한 탈수화 반응을 허용하며, 그러므로 티오에테르 고리 형성의 향상을 가져온다. N-말단 아스파탐산과 C-말단 주위에 위치한 아르기닌은 탈수화 반응을 막는다. 또한 프롤린 잔기들 및 페닐알라닌 잔기의 존재는 탈수화 반응에 있어서 선호되지 않는 것으로 알려졌다. 일반적으로, 친수성 잔기가 주위에 존재하는 것은 세린과 트레오닌 잔기의 탈수화 반응을 막는다. 소수성 주위는 탈수화를 선호하며; 친수성 주위는 탈수화를 선호하지 않는다. 연구에 의해 탈수화 반응이 일어날 경우, 세린과 트레오닌 주위 잔기들이 가지는 평균 소수성은 N-말단 쪽에서 ~~.40 이며, C-말단 쪽에서 0.13 정도인 것으로 밝혀졌다. 또한, 탈수화되지 않은 세린 및 트레오닌 주위 잔기가 가지는 평균 소수성은 N-말단 쪽에서 ~~ 0.36이었으며 C-말단 쪽에서 -1.03이었다. 탈수화 반응은 트레오닌 주위 잔기의 존재에 의해 제한되지는 않으며, 니신 선도 펩타이드와 탈수화되고자 하는 잔기 사이의 거리에 의해서 제한되지도 않았다.
NisC는 자연적으로 발생하는 란티바이오틱에 관련이 없는 펩타이드들에서 티오에테르 고리의 부위 특이적 형성을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 그러한 펩타이드들은 니신 선도 펩타이드에 반드시 융합되어야 한다. 몇몇 사례들에서, 티오에테르 고리들은 예를 들면 디하이드로알라닌이 시스테인으로부터 두 아미노산만큼 떨어진 것과 같은 경우에서, 자발적으로 형성될 수도 있다. 자발적 고리화와 다르게, NisC 촉매 하에 일어난 고리화는 탈수화된 프리니신에 대해 입체특이성을 보인다. 그 결과로, 니신에 포함되어 있는 메틸란티오닌들과 란티오닌들은 DL 배향으로 존재한다. 비-란티바이오틱 펩타이드들에서 일어나는 고리화 또한 입체특이적일 것으로 생각된다.
이러한 원리들은 본 명세서에 기술되어 있는, 큐프레독신과 그 유도체과 절단부을 포함하는 조성물에 적용될 수 있다.
티오에테르 가교
자연 상태에서, 란티바이오틱-효소 유래된 티오에테르 가교들은 최대 19개의 아미노산만큼의 거리로 생성된다. 2개 내지 4개의 아미노산만큼의 거리인 티오에테르 가교들은 매우 흔하다.
일부 실시예에서, 상기 큐프레독신은 상기 구조에 티오에테르 가교를 도입함으로써 변형될 수 있다. 예를 들어 아주린 절단체인 p28(서열번호: 2)는 이 방법을 통해 변형될 수 있다. GROMACS (www.gromacs.org) 소프트웨어를 사용한 확장된 분자 동역학적 시뮬레이션 (70 ns)은 37 ℃ 조건에서 p28 알파 나선 구조의 6번 내지 16번 위치가 불안정하며, 그 펩타이드가 베타 병풍 구조를 택하려는 경향을 보인다는 것을 제의한다. 도 58, a 및 b. 이 사실을 p53과의 상호작용에 필요한 것으로 예측되는 분자의 일부분이 용매에 노출되어 있다는 사실과 종합하면, p28 펩타이드의 이 부위에 티오에테르 가교를 도입하는 것은 그 기능에 아무런 영향을 끼치지 않을 수도 있다는 것을 제의한다.
p28 아미노산 서열은 서열번호: 2(LSTAADMQGVVIDGMASGLDKDYLKPDD)이다. P18로 알려진 아미노산 서열은 서열번호: 25(LSTAADMQGVVTDGMASG)이다. 서열 SGLDKD(서열번호: 96)는 p53과 상호작용할 수 있다. 티오에테르 가교는 N-말단에 있는 Ser/Thr과 C-말단에 있는 Cys 사이에 형성될 수 있다. 세린/트레오닌은 탈수화되었으며 시스테인에 결과적으로 연결되었다. 트레오닌들이 선호되는데, 그 이유는 그들이 세린들보다 더욱 쉽게 탈수되기 때문이다. 일반적으로, 트레오닌 주위의 소수성 잔기(최소 하나)가 선호되는데, 그 이유는 그들이 탈수화 반응의 범위를 확장시키기 때문이다. 음전하를 띠는 아미노산들인 글루탐산과 아스파탐산들은 주위 잔기로 존재할 경우 탈수화 반응에 대해 강한 부정적인 효과를 가진다. 일반적으로 친수성인 주위 잔기들, 그 중 특별히 글리신의 경우, 탈수화 반응을 선호하지 않는다. Cys보다 더욱 우선적으로, 전하를 띠는 친수성 잔기들, 특별히 글루탐산과 아스파탐산과 같은 잔기들에 대해 약간의 선호도가 존재한다. 티오에테르 고리의 크기에 따라, 고리 구조에 동참하는 아미노산들의 크기가 영향을 끼치는 정도가 달라진다.
일 실시예에서, 절단된 아주린 서열은 LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLTPGC(서열번호: 46)이다. 티오에테르 가교는 p28의 25번 및 28번 위치 사이에 형성되며, 카복시에티다아제(carboxyetidase)에 대해 완전히 보호된다. 2번, 3번 및 25번 위치들은 탈수화되지만, 티오에테르 고리 형성에 의해 p53과의 상호작용에 연관되어 있다고 생각되는 서열이나 도입되는 서열들은 변이되지 않는다. 그러므로, 펩타이드 활성은 변해서는 안 된다. 트레오닌은 두 소수성 아미노산 사이에 존재하며, 그러므로 구체적인 지침들에 따라 탈수화 효소인 NisB에 의해 완전히 탈수화될 것으로 예측된다. Rink 등, Biochemistry 2005를 보라. 또한, 같은 지침들은 25번 및 28번 위치들을 동반하는, 고리화 효소 NisC에 의한 고리화를 예측하며, 그 특별한 이유는 시스테인 이전에 위치한 아스파탐산 때문이다.
다른 실시 예에서, 절단된 아주린 서열은 LSTAADCQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 47)이며, 티오에테르 가교는 3번 및 7번 위치 사이에 형성된다. 3번 및 7번 위치 사이에 형성되는 고리는 니신의 고리 A와 유사하며 2번 위치에 존재하는 트레오닌을 사용한다. 6번 위치에 존재하는 아스파탐산은 고리화를 선호할 것이다.
다른 실시 예에서, 절단된 아주린 서열은 LSTAACMQGWTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 48)이며, 2번 위치에 있는 트레오닌은 티오에테르 가교를 형성하기 위해 사용된다.
다른 실시 예에서, 위의 문단들에서 기술된, 절단된 아주린들에 존재하는 두 개 이상의 티오에테르 고리는 하나의 펩타이드로 합쳐진다.
다른 실시 예에서, 많은 절단된 아주린 서열들은 생성된 뒤에, 황 가교에 존재하는 하나의 란티오닌과 두 개에서 세 개의 추가적인 아미노산으로 형성된 고리를 지니는 펩타이드들을 분석함으로써 트레오닌 고리들을 찾기 위해 분석될 수 있다. 이것은 아래의 서열들 중 하나 또는 그 조합들을 동반할 수 있다:
LSTACDMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 49)
LSTAATMQCVVTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 50)
LSTAATMQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 51)
LSTAANTQGCVTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 52)
LSTAANTQGVCTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 53)
LSTAADMTAVCTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 54)
LSTAADMTAVVCDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 55)
LSTAADMQTVVCDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 56)
LSTAADMQTVVTCGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 57)
LSTAADMQATVTCGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 58)
LSTAADMQATVTDCMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 59)
LSTAADMQGVTADCMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 60)
LSTAADMQGVTADGCASGLDKDYLKPDD(서열번호: 61)
LSTAADMQGVVTNGCASGLDKDYLKPDD(서열번호: 62)
많은 개수의 서열들을 유전학적으로 형성하여, 변형의 범위와 생성 정도를 바탕으로 한 정제 과정을 위해 한 군을 선택하는 것이 실용적인 접근일 것이다.
다른 실시 예에서, 티오에테르 가교는 p28 (서열번호: 2)의 12번 위치에 존재하는 트레오닌과 펩타이드의 C-말단 사이에 형성된다. 13번 위치의 Cα와 28번 위치의 아스파탐산 사이의 거리는 17.52 옹스트롬일 수 있으며, 이것은 1.5 나노미터보다 더 큰데, 곧 펩타이드 구조의 유의미한 변형을 의미한다. 도 58c.
다른 실시 예에서, 펩타이드 서열은 LSTAADMQGVVTATMGSGLCKDYLKPDD(서열번호: 63)이며, 14번 위치에서 2번 위치에 형성된 4.38 옹스트롬 거리에 티오에테르 가교를 지니고 있다. 13번 위치에서 아스파탐산이 알라닌으로 변이된 것으로 인해 14번 위치에 존재하는 트레오닌의 탈수화가 선호된다. 16번 위치에서 알라닌이 글리신으로 변이된 것은 17번 위치의 세린의 탈수화를 완전히 막으며, 이로써 고리화를 향상시킨다.
다른 실시 예에서, 펩타이드 서열은 LSTAADMQGVVTDLTASGLCKDYLKPDD(서열번호: 64)이며, 15번 위치에서 20번 위치에 형성된 5.83 옹스트롬 거리에 티오에테르 가교를 지니고 있다. 이 상황에서, 14번 위치에서 글리신이 류신으로 변이된 것으로 인해 15번 위치에 존재하는 트레오닌의 탈수화가 선호된다.
3차 구조 안정화
큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 3차 구조 안정성은 약학적 활성, 세포질내반감기및/또는 면역원성을 포함하는 약물역동성의 대부분 요소들에 영향을 끼친다. Kanovsky 등, Cancer Chemother. Pharmacol. 52:202-208 (2003); Kanovsky etal, PNAS 23:12438-12443 (2001)을 참조. 펩타이드 나선들은 종종 무작위한 코일 형태로 분리되어, 단백질 분해 효소의 공격에 보다 민감해지고 세포막을 잘 관통하지 못할 수 있다. Schafmeister et ah, J. Am. Chem. Soc. 122:5891- 5892 (2000). 그러므로, 펩타이드의 전반적인 구조를 안정화할 수 있는 한 방법은 펩타이드의 알파-나선 구조를 안정화 시키는 것이다. 나선 형성과 연관된 분자 내 수소 결합은 극성 아미드 뼈대의 노출을 감소시키며, 이를 통해 수송 펩타이드의 막 관통에 방해가 되는 요소를 감소시킴으로서, 관련된 약학적 활성을 증가시키고 단백질 분해 효소에 의한 절단으로부터 펩타이드의 저항성을 증가시킨다. Id. 녹농균으로부터의 아주린(서열번호: 1)은 잔기 53번 내지 56번, 58번 내지 64번 및 68번 내지 70번에 알파-나선들을 가지고 있다.
알파-나선을 안정화시킬 수 있는 한 방법은 글리신, 프롤린, 세린 그리고 아스파탐산과 같은, 나선 구조를 망가트리는 아미노산 잔기들, 또는 나선 구조에서 중성 성질을 가지는 알라닌, 트레오닌, 발린, 글로타민, 아스파라긴, 시스테인, 히스티딘, 리신 또는 아르기닌과 같은 아미노산 잔기들을, 나선을 형성하는 잔기들인 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 글루탐산, 티로신, 트립토판 그리고 메티오닌과 같은 아미노산들이나, 예를 들어 알파-아미노-이소뷰틸산 (Aib)와 같은 나선을 선호하는 아미노산 잔기 치환물로 치환하는 것이다. 본 명세서에 그 개요가 참고로 포함된, Miranda et ah, J. Med. Chem., 51, 2758-2765 (2008)을 참조하라. 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들의 알파-나선이 하나 또는 그 이상의 글리신, 프롤린, 세린 및/또는 아스파탐산 잔기들을 다른 아미노산들로 치환함을 통해 안정화될 수 있다고 고려된다. 구체적인 실시예에서, 글리신, 프롤린, 세린, 아스파탐산, 알라닌, 트레오닌, 발린, 글로타민, 아스파라긴, 시스테인, 히스티딘, 리신 및/또는 아르기닌 잔기들이 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 글루탐산, 티로신, 트립토판, Aib 및/또는 메티오닌 잔기들로 치환된다. Lee 등, Cancer Cell Intl. 11 :21 (2005) 을 보라. 다른 구체적인 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 알파-나선에 존재하는 하나 또는 그 이상의 세린 또는 글루타민 잔기들이 치환될 수 있다. 더욱 구체적인 실시예에서, 녹농균으로부터의 아주린의 53번 내지 56번, 58번 내지 64번 및 68번 내지 70번째 잔기들(서열번호: 1)에 존재하는 세린 및/또는 글루타민 잔기들, 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들의 동등한 잔기들이 치환될 수 있다. 다른 구체적인 실시 예에서, 녹농균으로부터의 아주린 57번 아미노산 잔기(서열번호: 1)에 존재하는 글루타민 잔기, 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래한 동등한 잔기가 치환될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 트립토판으로 치환될 수 있다. 다른 구체적인 실시 예에서, 녹농균으로부터의 아주린 52번 아미노산 잔기(서열번호: 1)에 존재하는 트레오닌 잔기, 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 동등한 잔기가 치환될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 트립토판으로 치환될 수 있다. 다른 구체적인 실시 예에서, 녹농균으로부터의 아주린 61번 아미노산 잔기 (서열번호: 1) 에 존재하는 트레오닌 잔기, 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 동등한 잔기가 치환될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 트립토판으로 치환될 수 있다. 다른 구체적인 실시 예에서, 녹농균으로부터의 아주린 63번 아미노산 잔기(서열번호: 1)에 존재하는 글리신 잔기, 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 동등한 잔기가 치환될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 트립토판으로 치환될 수 있다. 다른 구체적인 실시 예에서, 녹농균으로부터의 아주린 52번, 57번, 61번 또는 63번 아미노산 잔기들(서열번호: 1)에 존재하는 하나 또는 그 이상의 트레오닌, 글루타민 또는 글리신 잔기들, 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 동등한 잔기가 치환될 수 있으며, 더욱 구체적으로는 트립토판으로 치환될 수 있다. 구체적인 실시 예에서, 큐프레독신 펩타이드는 다음의 서열들 중 하나를 포함하며, 이 서열들에서 밑줄 쳐진 아미노산은 야생형 녹농균 p28 서열에 치환된다:
LSWAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 65);
LSTAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 66);
LSTAADMQGVVWDGMASGLDKD YLKPDD(서열번호: 67);
LSTAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 68);
LSWAADMWGVVTDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 69);
LSWAADMQGVVWDGMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 70);
LSWAADMQGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 71);
LSTAADMWGVVWDGMASGLDKD YLKPDD(서열번호: 72);
LSTAADMWGVVTDWMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 73);
LSTAADMQGVVWDWMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 74); 또는
LSWAADMWGVVWDWMASGLDKDYLKPDD(서열번호: 75)
다른 실시예에서, 다른 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들에 존재하는 동등한 아미노산들은 트립토판으로 치환된다.
알파-나선 3차 구조를 안정화시키는 다른 방법은 파이-쌓임이 가능한 비자연적 아미노산 잔기들을 사용하는 방법을 수반한다. 예를 들어, Andrews and Tabor (Tetrahedron 55:11711-11743 (1999)) 에서, ε-(3,5-dinitrobenzoyl)-Lys 한 쌍이 펩타이드의 알파-나선 부위에 각각 다른 간격을 두고 치환되었다. 결과들은 i,(i+4) 간격이 가장 효과적인 안정화 배열임을 밝혔다. 최대 90%까지 물의 비율을 상승시키자 펩타이드의 나선형 함량이 높아졌다. ε- acyl-Lys 잔기 쌍들이 동일한 i,(i+4) 간격으로 배열되었을 때에는 안정화 효과가 없었으며, 이로서 파이-파이 상호작용으로부터 대부분의 안정화가 발생한다는 것을 알 수 있었다. 일 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드는 리신 잔기들이 ε-(3,5-dinitrobenzoyl)-Lys 잔기들로 치환될 수 있도록 변형되었다. 한 특정일 실시예에서, 리신 잔기들은 ε-(3,5-dinitrobenzoyl)-Lys 잔기들로 i,(i+4) 배열을 통해 치환될 수 있다.
알파-나선 3차 구조를 안정화시키는 다른 방법은 알파-나선 내부에 존재하는 측쇄들 사이에 존재하는 정전기적 상호작용을 사용한다. His-Cys 또는 His-His 잔기 쌍들이 i,(i+4) 배열로 펩타이드들에 치환되었을 때, 펩타이드들은 Cu, Zn 또는 Cd 이온들을 더했을 때 50% 정도의 나선형에서 90% 정도의 나선형으로 바뀌었다. 루테니움 (Ru) 염이 His-His 펩타이드에 첨가되었을 때, 교환-비활성 복합체가 형성되었으며, 이 대환식 cis-[Ru-(NH3)4L2]3+ 복합체에서 L2들은 두 개의 히스티딘의 측쇄이며 나선 안정성을 향상시켰다. Ghadiri and Fernholz, J. Am. Chem. Soc. 112, 9633-9635 (1990). 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들은 가 두 히스티딘들의 측쇄인 대환식 cis-[Ru-(NH3)4L2]3+ 를 포함할 수 있다. Aucauc 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 히스티딘-시스테인 또는 히스티딘-히스티딘 잔기 쌍들이 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 알파-나선 구조 내부에 i,(i+4) 배열로 치환되었다. 다른 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 히스티딘-시스테인 또는 히스티딘-히스티딘 잔기 쌍들이 녹농균으로부터의 아주린의 53-56, 58-64 그리고 68-70 번째 잔기들(서열번호: 1), 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 동등한 잔기들에 i,(i+4) 배열로 치환되었다. 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들은 추가로 Cu, Zn, Cd 및/또는 Ru 이온들을 포함할 수 있다.
알파-나선 3차 구조를 안정화시키는 다른 방법은 알파-나선의 측쇄들 사이에 이황화 결합 형성을 수반한다. 또한 펩타이드 서열에서 분리되어 있는 잔기들 사이에 공유 결합을 형성하는 방법을 통해 나선형 구조를 안정화시키는 것도 가능하다. 흔하게 채택되는 자연적인 방법은 바로 이황화 결합을 사용하는 것이다. Pierret 등, Intl. J. Pept. Prot. Res., 46:471-479 (1995). 일부 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기 쌍들은 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들의 알파-나선에 치환되었다. 다른 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기 쌍들이 녹농균으로부터의 아주린의 53-56, 58-64 그리고 68-70 번째 잔기들(서열번호: 1), 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 동등한 잔기들에 치환되었다.
알파-나선 3차 구조를 안정화시키는 다른 방법은 측쇄 락탐 가교들을 사용하는 것을 수반한다. 락탐은 아미노산들의 고리화를 통해 형성될 수 있는 고리형 이미드이다. 측쇄과 측쇄의 가교들은 다양한 펩타이드들, 그리고 양친매성 또는 모델 알파-나선형 펩타이드들, 옥시토신 길항제, 멜라노트로핀 유사체, 글루카곤, 그리고 SDF-1 펩타이드 유사체들과 같은 펩타이드 유사체들에 대한 성공적인 제약 조건으로 사용되었다. 예를 들어, 글루카곤-유사 펩타이드-1 (GLP-1)은 점차적으로 특정한 나선-선호 조건 하에서 나선형 모양을 띠며, 락탐 가교 형성을 통해 안정화될 수 있다. Miranda 등, J. Med. Chem., 51, 2758-2765 (2008). 이 락탐 가교들은 각기 다른 정도의 크기, 효과를 끼치는 안정성 그리고 결합력을 보일 수 있다. Id. 그러한 변형들은 세포질 내에서 조성물의 안정성을 향상시켰다. Id. 고리화 부위들과 선택된 잔기들 사이에 존재하는 공간의 정도에 따라, 락탐 가교들은 꺾임 또는 나선형 구조들을 유도하며 안정화시키는 데에 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 큐프레독신 또는 변이체 유사체들이 인접한 아미노산들 (예를 들면, i 내지 i+4 글루탐산-리신 제한) 사이에 락탐 가교 형성을 생성하는 것을 통해 만들어졌다. 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드는 알파-나선 함량을 향상시키기 위해 그러한 변형들을 포함할 수 있다.
알파-나선 3차 구조를 안정화시키는 다른 방법은 전-탄소 교차결합 방법이다. 전-탄화수소 교차결합 방법은 나선형 구조의 안정화, 단백질 분해효소 저항성 그리고 세포 투과성을 증가시키는 것으로 증명되었다. Walensky et ah, Science, 305, 1466-1470 (2004). α,α- 이치환되었고 올레핀을 포함하는 비자연적 아미노산들이 펩타이드들에 포함되었다. 루테니움 촉매 하의 올레핀 음위 전환은 나선을 교차결합 하기 위한 전-탄화수소 “스테이플”을 형성한다. Schafmeister 등, J. Am. Chem. Soc, 122, 5891-5892 (2000); Walensky 등, id. 올레핀을 포함하는 비자연적 아미노산들은 Schafmeister 등 (id.) and Williams and Im (J. Am. Chem. Soc, 113:9276-9286 (1991))에서 제공된 방법들에 따라 합성될 수 있다. 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들은 전-탄화수소 스테이플들에 의해 안정화된다. 구체적인 실시예에서, 자연적 아미노산에 대응하는 하나 또는 그 이상의 α,α- 이치환되었고 올레핀을 포함하는 비자연적 아미노산들이 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 알파-나선에 치환되었다. 다른 실시예에서, 자연적 아미노산에 대응하는 하나 또는 그 이상의 α,α- 이치환되었고 올레핀을 포함하는 비자연적 아미노산들이 녹농균으로부터의 아주린의 53-56, 58-64 그리고 68-70 번째 잔기들(서열번호: 1), 또는 다른 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드의 동등한 잔기들에 치환되었다.
일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 변형된 펩타이드는 X1SX2AADX3X4X5VVX6DX7X8ASGLDKDYLKPDX9 (서열번호: 76)를 포함할 수 있으며, 이 때 X1 은 L 또는 아세틸화된-L, X2 는 T 또는 W, X3 는 M, L 또는 V, X4 는 Q 또는 W, X5 는 G 또는 A, X6 는 T 또는 W, X7 은 G, T 또는 W, X8 은 M, L 또는 V, 및 X9 는 D 또는 아미드화된-D. 다른 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 변형된 펩타이드는 X1SX2AADX3X4X5VVX6DX7X8ASGLDKDYLKPDX9(서열번호: 76)를 포함할 수 있으며, 이 때 X1 은 L 또는 아세틸화된-L, X2 는 T 또는 W, X3 는 M, L 또는 V, X4 는 Q 또는 W, X5 는 G 또는 A, X6 는 T 또는 W, X7 은 G, T 또는 W, X8 은 M, L 또는 V, 및 X9 는 D 또는 아미드화된-D이다. 다른 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 변형된 펩타이드는 X1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX8SX9(서열번호: 77)를 포함할 수 있으며, 이 때 X1 은 X1 은 D 또는 아세틸화된-D, X2 는 M, L 또는 V, X3 는 G, T 또는 W, X4 는 T 또는 W, X5 는 G 또는 A, X6 는 Q 또는 W, X7 은 M, L 또는 V, X8 은 T 또는 W, 및 X9 는 L 또는 아미드화된-L이다. 다른 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 변형된 펩타이드는 X1DPKLYDKDLGSAX2X3DX4VVX5X6X7DAAX8SX9(서열번호: 77)를 포함할 수 있으며, 이 때 X1 은 D 또는 아세틸화된-D, X2 는 M, L 또는 V, X3 는 G, T 또는 W, X4 는 T 또는 W, X5 는 G 또는 A, X6 는 Q 또는 W, X7 은 M, L 또는 V, X8 은 T 또는 W, 및 X9 는 L 또는 아미드화된-L이다. 관심사인 구체적 펩타이드들은 도표 3에 기록되어 있다.
PEG 화( PEGylation )
치료적 그리고 진단적 중요도를 가진 약물들에 PEG를 공유 결합적으로 부착하는 것은 생체 내 환경에서 약물의 세포질 내 반감기를 증가시키고, 및/또는 그들의 면역원성과 항원성을 감소시킨다. Harris and Chess, Nature Reviews Drug Discovery 2:214-221 (2003). 예를 들어, PEG 결합은 인터루킨 (Kaufman 등, J. Biol. Chem. 263:15064 (1988); Tsutsumi 등, J. Controlled Release 33:447 (1995)), 인터페론 (Kita 등, Drug Des. Delivery 6:157 (1990)), 카탈라아제 (Abuchowski 등, J. Biol. Chem. 252:3582 (1977)), 과산화물 제거효소 (Beauchamp 등, Anal. Biochem. 131:25 (1983)), 그리고 아데노신 탈아미노 효소 (Chen 등, Biochem. Biophys. Acta 660:293 (1981))들을 포함하는 많은 치료성 단백질들의 약물역동적 물성을 향상시킨다. FDA는 PEG를 식품, 화장품 그리고 주사 가능하거나, 국부적이거나, 직장의, 그리고 코의 조제에서 운반체 또는 기초로 사용 가능한 승인을 내렸다. PEG는 약한 유독성을 보이며, 콩팥들 (30 kDa 미만의 PEG들) 또는 분변 (20 kDa 초과의 PEG) 에 의해 신체 내에서 제거된다. PEG는 물에서 높은 용해도를 보인다.
치료적 펩타이드의 PEG화는 신장 초미세여과를 감소시킴으로 인해, 그리고 따라서 체내에서 약물의 제거량을 낮춤으로 환자의 혈관 내에서 펩타이드의 잔존 시간을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 전하 억제는 신장 투과에 영향을 끼칠 수 있다. 전하 억제는 단백질에서 전하를 띨 수 있는 작용기, 다시 말해 아민이나 카복실기의 보조 화학적 변형의 결과일 수 있다. 구체적으로, 단백질-PEG 유도체를 생산하는 데에 있어 가장 흔한 과정은 단밸질 아미노기들을 아미드로 전환시키는 것을 수반하는데, 이 결과로 양의 전하를 잃게 되고, 이것은 다시 단밸질 미세여과를 변화시킬 수 있다. 음전하성 고분자들이 신장의 미세여과에 의해 중성 또는 양성 분자들보다 느리게 제거되는 것으로 밝혀졌기 때문에, 아미누기에 대한 PEG 접합은 혈관 내에서 PEG화된 펩타이드의 영구성을 연장시킬 수 있는 것으로 예측된다.
분자 크기와 구형 미세여과 또한 치료성 펩타이드의 신장 미세여과에 영향을 끼칠 수 있다. 자연적인 구형 단백질의 신장 제거를 위한 분자 질량 제한 범위는 약 70 kDa로 고려되며, 이것은 혈청 알부민의 분자 질량과 유사하다. 그러므로 70 kDa를 초과하는 분자 질량을 지닌 단백질들은 주로 간에서의 흡수, 단백질 분해, 그리고 면역계에 의한 제거 등을 포함하는, 신장의 미세여과를 제외한 다른 경로로 체내에서 제거된다. 그러므로 PEG화로 치료성 펩타이드의 크기를 늘리는 것은 환자의 혈관으로부터 그 펩타이드를 신장 미세여과로 걸러내는 것을 낮출 수 있다.
추가적으로, 치료적 펩타이드의 PEG화는 그 펩타이드의 면역원성을 낮추며, 또한 치료성 펩타이드와의 직접적인 접촉을 요구하는 요소들, 즉 단백질 분해성 효소들과 섭식 세포 등으로부터 펩타이드를 보호한다. 특별히 가지 구조를 띠는 PEG의 우산과 같은 구조는 단밸질 분해성 효소들, 항체들, 섭식 세포 등에 접근하는 것에 있어서 선형 PEG보다 더욱 나은 보호를 제공하는 것으로 밝혀졌다. Caliceti and Veronese, Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:1261-12778 (2003).
일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 본 발명의 펩타이드들은 시스테인 분자에 공유 결합으로 연결된 하나 또는 그 이상의 PEG 분자들을 가지는 것으로 변형되었다. 공유 결합은 PEG 분자에서 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드에 직접적으로 연결된 공유 결합일 필요는 없지만, 서로 및/또는 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드에 공유 결합으로 연결된 하나 또는 그 이상의 연결 분자들에 공유 결합으로 연결될 수 있다. 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들은 부위 특이적 PEG화를 가진다. 구체적인 실시예에서, PEG 분자(들)는 녹농균으로부터의 아주린의 3, 26 및/또는 112번 잔기(서열번호: 1)에 존재하는 시스테인에 공유 결합적으로 연결될 수 있다. 다른 실시예에서, 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기들이 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드에 치환된 뒤 PEG화될 수 있다. 일부 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드를 PEG화 하는 방법은 무엇보다도 NHS, 환원성 아미노화, 말리미드(malimid) 또는 에폭시드(epoxid)일 수 있다. 다른 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들은 하나 또는 그 이상의 리신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파탐산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 티로신, 또는 N-말단 아미노기와 C-말단 카복실산에 PEG화가 일어날 수 있다. 더욱 구체적인 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들은 하나 또는 그 이상의 리신들 또는 N-말단 아미노기들에 PEG화가 일어날 수 있다. 다른 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들에 하나 또는 그 이상의 리신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파탐산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 또는 타이로신 잔기들이 치환된 뒤에 PEG화 된다. 다른 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들은 하나 또는 그 이상의 아미노 기에 PEG화를 받았다. 다른 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들은 평균적으로 PEG-기반으로 한 중합체의 평균 분자 무게인 약 200 내지 100,000 Da, 약 2,000 내지 20,000 돌턴, 또는 약 2,000 내지 5,000 돌턴일 수 있는 중합체를 가진다. 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 유래 펩타이드는 분지된 특히, 약 50 KDa인 PEG 분자가 분지된 하나 이상의 PEG 분자로 구성될 수 있다. 다른 실시예에서, 큐프레독신으로부터 유래한 펩타이드들은 하나 또는 그 이상의 선형 PEG 분자들을 포함하며, 특별히 이들의 질량은 하나에 5 kDa 정도이다.
다른 실시 예에서, 펩타이드는 포도당-조절된 단백질 78(GRP78)에 특이적으로 결합하는 고리형 13단위 중합체로 구성된 올리고펩타이드인 Pep42의 켤레인, 큐프레독신 또는 그 변이체, 구조적 등가물 또는 유도체인 펩타이드일 수 있으며, 이는 암세포 내부로 내재화된다. 큐프레독신 또는 큐프레독신의 변이체, 구조적 등가물 또는 유도체는 본 명세서에서 그 개요의 전부가 참고로 기술된, Yoneda 등, "A cell-penetrating peptidic GRP78 ligand for tumor cell-specific prodrug therapy," Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 18: 1632- 1636 (2008) 에서 밝혀진 합성 방법에 따라 Pep42와 연결될 수 있다.
다른 실시 예에서, 펩타이드는 큐프레독신의 구조적 등가물인 펩타이드다. 큐프레독신과 다른 단백질들 사이에 존재하는 유의미한 구조적 동종성을 결정하는 연구들의 실시예는 Toth 등 (Developmental Cell 1:82-92 (2001)) 를 포함한다. 구체적으로, 큐프레독신과 그 구조적 등가물 사이에 존재하는 유의미한 구조적 동종성은 VAST 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. Gibrat 등, Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej 등, Proteins 23:356-3690 (1995). 구체적인 실시예에서, 큐프레독신과 그 구조적 등가물 간의 구조적 대조로부터 나온 VAST p 값은 약 10-3 미만, 약 10-5 미만, 또는 약 10-7 미만일 수 있다. 다른 실시예에서, 큐프레독신과 그 구조적 등가물 사이의 유의미한 구조적 동종성은 DALI 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. Holm & Sander, J. MoI. Biol. 233:123-138 (1993). 구체적인 실시예에서, 켤레적 구조 대조에 대한 DALI Z 점수는 최소 약 3.5, 최소 약 7.0, 또는 최소 약 10.0 이다.
본 발명의 구성 요소 중 펩타이드가 큐프레독신의 변이체, 유도체, 절단부 및/또는 구조적 등가물 중 하나 이상일 수 있다는 것이 고려되었다. 예를 들면, 펩타이드들은 PEG화 된 아주린의 절단부일 수 있으며, 그로 인해 절단부와 유도체이 동시에 될 수 있게 된다. 일 실시예에서, 본 발명의 펩타이드들은 루테니움 촉매 하의 올레핀 음위 전환에 의한 전-탄화수소 “스테이플”에 뒤이은 α,α- 이치환되었고 올레핀을 포함하는 비자연적 아미노산들로 합성되었다. Scharmeister 등, J. Am. Chem. Soc. 122:5891- 5892 (2000); Walensky 등, Science 305:1466-1470 (2004). 추가적으로, 아주린의 구조적 등가물인 펩타이드들은 다른 펩타이드들에 융합될 수 있으며, 그로 인해 구조적 등가물과 유도체의 성격을 동시에 띠는 하나의 펩타이드를 만든다. 이 실시예은 단지 설명하기 위함이며, 본 발명을 제한하기 위함이 아니다. 큐프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 구리와 결합할 수도 있으며, 하지 않을 수도 있다.
일부 실시예에서, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 녹농균으로부터의 아주린, 그리고 구체적으로는 p28의 약학적 활성 중 일부를 가지고 있다. 특정일 실시예에서, 큐프레독신과 큐프레독신의 변이체, 유도체 그리고 구조적 등가물은 포유류 세포, 그리고 구체적으로는 유선 세포에서 (여기에 국한되지는 않는다) 전암성 병소들의 발달을 억제 또는 예방할 수 있다. 본 발명은 또한 구체적으로는 흑색종, 유방암, 췌장암, 아교모세포종, 성상세포종, 폐암, 결장암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 피부암, 그리고 자궁경부암을 포함하지만 여기에 국한되지는 않는, 포유류의 전암성 병소들의 발달을 억제할 수 있는 기능을 가지고 있는 큐프레독신과 큐프레독신의 변이체, 유도체 그리고 구조적 등가물을 제공한다. 암세포 발달의 억제는 대조군 처리와 비교했을 때 통계적으로 유의미한, 전암성 병소들의 발달의 모든 감소, 또는 그 상승률의 감소다.
큐프레독신이 엔도사이토시스를 통해 암세포에 우선적으로 진입할 수 있다고 알려져 있고, 구체적으로는 또한 유방 세포, 그리고 더욱 구체적으로는 마우스 유선 세포이라고 할 수 있는, 포유류 세포, 조직 또는 동물에서 전암성 병소들 그리고 궁극적으로는 암의 발달을 억제할 수 있다는 것이 알려져 있기 때문에, 이제 이러한 활성을 유지하는 큐프레독신의 변이체과 유도체를 설계하는 것이 가능하다. 그러한 변이체, 유도체 그리고 구조적 등가물은 예를 들면 큐프레독신의 다양한 변이체, 유도체 그리고 구조적 등가물의 “도서관”을 만든 다음 실시예 1에서 사용된 시범적 방법과 같은, 본 영역에서 알려진 많은 방법들 중 하나를 사용해 마우스 유선 기관 배양에서 각각의 우선적 진입 및/또는 화학적 예방 활성을 실험하는 과정을 통해 만들어질 수 있다. 결과물로 생성되는 화학적 예방 활성 및/또는 암세포에 우선적인 진입 능력을 가지고 있는 큐프레독신의 변이체, 유도체 그리고 구조적 등가물은 본 발명의 방법들에서 아주린 또는 p28 대신, 또는 그들과 같이 사용될 수 있다.
일부 구체적인 실시예에서, 큐프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 7,12-디메틸벤즈(a)안트라센(7,12-dimethylbenz(a)anthracene)(DMBA)에 의해 마우스 유선 기관 배양 (MMOC)에서 유래된 전암성 병소들의 발달을, 비처리된 대조군과 통계적으로 차이를 보이는 정도까지 억제할 수 있다. 펩타이드는 실시예 1에서, 또는 Mehta 등, J Natl Cancer Inst, 93:1103-1106 (2001)) 및 Mehta 등, Meth Cell Sci 19:19-24 (1997)에서 기술된 MMOC 모델 시스템을 사용하여 이 활성에 대해 검정될 수 있다. 암의 발달이 억제된 것인지의 여부를 결정하기 위한 다른 방법들은 본 영역에서 잘 알려져 있으며, 그들 또한 사용될 수 있다.
몇몇 구체적인 실시예에서, 큐프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 MMOC 모델에서 일어난 유선포 병소(MAL)의 발달을 비처리된 대조군과 통계적으로 차이를 보이는 정도까지 억제할 수 있다. 몇몇 구체적인 실시예에서, 큐프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 유선 병소(MDL)의 발달을 비처리된 대조군과 통계적으로 차이를 보이는 정도까지 억제할 수 있다. 펩타이드는 실시예 1에서 기술된, DMBA에 의해 전암성 병소들을 형성하기 위한 MMOC 모델을 사용하여 이 활성에 대해 검정될 수 있다. MMOC 모델 시스템에서 전암성 병소들의 발달을 평가하는 것은 실시예 1에서 제공된 것처럼, 형태측정학적 분석에 의해, 또는 조직병리학적 분석에 의해 결정될 수 있다.
일부 특정 실시예에서, 상기 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물는 포유류의 세포, 조직 및 동물의 암세포 및/또는 종양에 우선적으로 진입할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 변이체은 p18의 유도체 또는 구조적 등가물이다. 일부 실시예에서, 상기 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물는 포유류의 세포, 조직 및 동물의 암세포 및/또는 종양에 우선적으로 진입할 수 있고, DNA 또는 RNA를 전달한다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 유전자 또는 유전자의 일부분이다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 한번 전달되면 치료적 효과를 가진다. 일부 실시예에서, 상기 변이체은 p28의 유도체 또는 구조적 등가물이다. 일부 실시예에서, 상기 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물는 포유류의 세포, 조직 및 동물의 암세포 및/또는 종양에 우선적으로 진입할 수 있고, DNA 또는 RNA를 전달한다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 유전자 또는 유전자의 일부분이다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 한번 전달되면 치료적 효과를 가진다.
큐프레독신
이 작고 푸른 구리 단백질들 (큐프레독신들)은 세균성 전자 전달계에 참여하는 전자 전달 단백질들 (10~20 kDa)이거나, 알려지지 않은 기능을 가진다. 구리는 기질 단백질에 의해서만 고정되어 있다. 구리 주위의 두 개의 히스티딘과 한 개의 시스테인 리간드들이 만드는, 특별하게 왜곡된 삼각평면 배열은 그 금속 부위에 대단히 특유한 전기적 물성과 짙은 푸른 색을 제공한다. 큐프레독신들 중 몇몇은 고해상도에서 결정학적으로 그 특성이 결정되었다.
일반적인 큐프레독신들은 낮은 서열 동종성을 지니지만, 높은 구조적 동종성을 지닌다. Gough & Clothia, Structure 12:917-925 (2004); De Rienzo 등, Protein Science 9:1439-1454 (2000). 예를 들어, 아주린의 아미노산 서열은 아우라시아닌 B와 31% 일치하고, 루스티시아닌과 16.3%, 플라스토시아닌과 20.3%, 그리고 슈도아주린과 17.3% 유사하다. 표 1을 보라. 하지만, 이 단백질들의 구조적 유사성은 더욱 표명되었다. 구조 비교를 통한 VAST p 값의 경우, 아우라시아닌 B에 대한 아주린의 값은 10-7.4, 루스티시아닌에 대한 아주린의 값은 10-5, 플라스토시아닌에 대한 아주린의 값은 10-5.6, 그리고 슈도아주린에 대한 아주린의 값은 10-4.1이다.
모든 큐프레독신들은 8가닥의 베타-원통 또는 베타-샌드위치 접힘 구조를 가지며, 대단히 높은 정도의 보존적 위치 구조를 지닌다. De Rienzo 등, Protein Science 9:1439-1454 (2000). 메티오닌과 류신과 같은, 많은 긴 사슬 양친매성 잔기들의 존재로 인한 현저한 소수성 영역이 아주린, 아미시아닌, 남세균성 플라스토시아닌, 오이 기초 단백질의 구리 부위 주변에 존재하며, 슈도아주린과 진핵생물성 플라스토시아닌에서는 상대적으로 적은 범위에서 존재한다. Id. 소수성 영역들은 또한 스텔라시아닌과 루스티시아닌 구리 부위들에서 작은 크기로 발견 되지만, 그들은 다른 특성들을 지닌다. Id.
하기 표 1은 VAST 알고리즘을 사용한, 녹농균으로부터 유래한 아주린 (1JZG)의 다른 단백질로의 서열과 구조적 배열에 대한 것이다.

PDB		 배열 길이1
% 아미노산
유사성		 P-값2 점수3 RMSD4
설명
1AOZ A 2 82 18.3 10e-7 12.2 1.9 Ascorbate oxidase
1QHQ A 113 31 10e-7.4 12.1 1.9 AuracyaninB
1V54 B 1 79 20.3 10e-6.0 11.2 2.1 Cytocrome c oxidase
1GY2 A 92 16.3 10e-5.0 11.1 1.8 Rusti-cyanin
3MSP A 74 8.1 10e-6.7 10.9 2.5 Motile Major Sperm Protein5
1IUZ 74 20.3 10e-5.6 10.3 2.3 Plasto-cyanin
1KGY E 90 5.6 10e-4.6 10.1 3.4 Ephrinb2
1PMY 75 17.3 10e-4.1 9.8 2.3 Pseudo-azurin
1) 배열 길이: 두 구조 사이에 겹쳐진, 동등한 C-알파 원자쌍의 개수, 즉 3D 중첩을 계산하기 위해 사용된 잔기의 개수
2) P-값: VAST p 값은 확률로 표현된 비교의 의미를 측정하는 척도다. 예를 들어, 만약 p 값이 0.001이라면 이러한 양상을 띠는 일치를 완전히 무작위적인 상황에서 볼 확률은 1000분의 1이라는 것을 의미한다. VAST 로부터의 p 값은 MMDB 데이트베이스에 500 종류의 독립적 그리고 비연관적 도메인들이 존재한다는 가정을 사용하여, 다중 대조의 효과를 위해 조정된다. 그러므로 보여진 p 값은 각 도메인 쌍의 쌍별 비교에서 나온 p 값을 500으로 나눈 것에 대응한다.
3) 점수: VAST 구조-유사성 점수이다. 이 숫자는 겹쳐진 이차 구조 요소들의 개수와 연관되어 있으며, 그 겹침의 질에 연관되어 있다. 보다 높은 VAST 점수는 보다 높은 유사성이라는 연관성을 띤다.
4) RMSD: 옹스트롬으로 표현한 잔기 겹침의 평균 값에 루트를 취한 값이다. 이 숫자는 두 구조의 최적화된 겹침이 이루어 진 후, 동등한 C-알파 원자들 사이의 평균 제곱 값의 루트 값으로 취해진다. RMSD 값이 구조적 배열의 범위와 비례하며, RMSD를 총체적인 구조적 유사성을 기술하는 용도로 사용할 때에 이 크기는 반드시 고려되어야 한다는 것을 알라.
5) 난모세포 성숙에서 에프린 길항제로 작용하는 것으로 밝혀진 꼬마선충의 주요 정자 단백질이다. Kuwabara, Genes and Development 17:155-161 (2003).
아주린
아주린들은 특정한 세균에서 전자 전달에 관여하는 큐프레독신 족에 속하는 128개의 아미노산 잔기들을 가지는, 구리를 지닌 단백질이다. 아주린들은 녹농균 (PA) (서열번호: 1), 아크로모박터 실로속시단, 그리고 아크로모박터 데니트리피칸스에서 유래한 종류들을 포함한다. Murphy 등., J. MoI. Biol. 315:859-871 (2002). 아주린들 사이에 존재하는 아미노산 서열 유사성은 60 내지 90% 정도를 보이며, 따라서 이 단백질들은 강한 구조적 동종성을 보인다. 모든 아주린들은 특징적인 베타-겹침구조와 격자 무늬의 모티프를 가지며, 단백질에서는 항상 같은 부분에 하나의 구리 원자가 놓인다. 추가로, 아주린들은 본질적으로 구리 부위 주변을 둘러싸는 중성 소수성 영역을 가진다. Id.
플라스토시아닌
플라스토시아닌들은 남세균들, 조류 그리고 식물들에 존재하는 용해 가능한 단백질들이며, 그들의 산화 상태에서 파란색이고 한 분자 당 한 개의 구리를 지닌다. 그들은 엽록체 내에 존재하며, 전자 운반체로 기능한다. 포플러의 플라스토시아닌 구조가 1978년에 결정된 이후, 조류 (때목말, 잎파래, 클라미도모나스)와 식물 (껍질 콩) 플라스토시아닌들은 결정학적 또는 NMR 방법을 통해 결정되었으며, 포플러 구조는 1.33 옹스트롬 해상도로 개선되었다. 서열번호: 3은 호열성 남세균인 포르미디움 라미노숨으로부터 유래한 플라스토시아닌의 아미노산 서열을 보인다. 다른 관심사인 플라스토시아닌은 울바 퍼투시스로부터 유래되었다.
조류와 관다발 식물들의 플라스토시아닌들에 존재하는 서열적 다양성 (예를 들어 클라미도모나스와 포플러 단백질 사이에 존재하는 62% 서열 유사성)에도 불구하고, 3차원적 구조들은 보존되었다 (예를 들어 클라미도모나스와 포플러 단백질들 사이에 존재하는, C 알파 위치들 사이의 0.76 옹스트롬 제곱 평균 편차). 구조적 특성들은 8가닥의 역팽형 베타-원통구조의 한 끝에 존재하는, 비틀어진 사면체 구조의 구리 결합 부위와, 하나의 음전하 영역, 그리고 평평한 소수성 표면을 포함한다. 구리 부위는 그 전자 전달 기능에 최적화되어 있으며, 음전하 그리고 소수성 영역들은 생리학적 반응 동반자를 인식할 수 있도록 제시되어 있다. 화학적 변형, 교차 결합, 그리고 부위 특이적 돌연변이 유도 실험들은 사이토크롬 f와의 결합 상호작용에 있어서 음전하와 소수성 영역들의 중요성을 확정지었으며, 플라스토시아닌을 포함하는 두 개의 기능적으로 유의미한 전자 전달 경로들의 모델들을 입증하였다. 하나의 추정상의 전자 전달 경로는 상대적으로 짧으며 (약 4 옴스트롱) 소수성 영역에 용매에 노출된 구리 리간드 His-87을 포함하며, 다른 한 경로는 보다 길며 (약 12~15 옴스트롱) 움전하 영역에 거의 보존된 잔기인 Tyr-83을 포함한다. Redinbo 등, J. Bioenerg. Biomembr. 26:49-66 (1994).
루스티시아닌
루스티시아닌들은 티오바실러스 (현재는 아시디티오바실러스로 불린다)로부터 얻은, 푸른 구리를 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드이다. 티오바실러스 페로옥시단스로부터 얻은, 대단히 안정되었고 높은 산화성을 보이는 큐프레독신 루스티시아닌 (서열번호: 4)의 산화 형태의 X 선 결정 구조는 다중 파장 비정상 회절에 의해 결정되었으며 1.9 옴스트롱 해상도로 개선되었다. 루스티시아닌들은 중심에 6개, 그리고 7개의 가닥을 가지는 베타-병풍 구조로 만들어진 베타-겹침 구조를 지니는 형태로 구성되어 있다. 다른 큐프레독신들과 마찬가지로, 구리 이온은 뒤틀린 사면체 내에 배열된 네 개의 보존된 잔기들 (His 85, Cys 138, His 143, Met 148)의 복합체에 의해 조정되었다. Walter, RX. 등, J. MoI. Biol. 263:730-51 (1996).
슈도아주린
슈도아주린들은 푸른 구리를 포함하는 단일 사슬 폴리펩타이드 족이다 아크로모박터 시클로크라스테스로부터 얻은 슈도아주린의 아미노산 서열들이 서열번호: 5에 밝혀져 있다. 슈도아주린의 X-선 구조 분석은 그것이 아주린들과 낮은 서열 동종성을 가짐에도 불구하고 유사한 구조를 가진다는 것을 보인다.슈도아주린들과 아주린들의 전체적인 구조에는 두 개의 주요한 차이점들이 존재한다. 슈도아주린들에는 아주린들과 비교했을 때 상대적으로 더 긴, 두 개의 알파-나선들을 포함하는 카르복시 말단의 연장이 존재한다. 중간 펩타이드 부위에서 아주린들은 슈도아주린에서는 짧은 길이로 존재하는, 연장된 고리를 가지며, 이것은 짧은 알파-나선을 포함하는 덮개를 형성한다. 구리 원자 부위에 존재하는 주요 차이점은 MET 측쇄의 형태와 Met-S 구리 결합 길이뿐이며, 이것은 슈도아주린의 것이 아주린의 것보다 훨씬 짧다.
파이토시아닌
파이토시아닌으로 식별 가능한 단백질들은 오이 기초 단백질, 스텔라시아닌, 마비시아닌, 우메시아닌, 오이 껍질 벗김 큐프레독신, 완두꼬투리에 존재하는 추정상의 푸른 구리 단백질, 그리고 애기장대로부터 유래한 푸른 구리 단백질을 포함하지만, 여기에 국한되지는 않는다. 오이 기초 단백질과 완두꼬투리 단백질을 제외한 다른 모든 경우에서는, 푸른 구리 부위에서 일반적으로 발견되는 축성 메티오닌 리간드는 글루타민으로 치환되었다.
아우라시아닌
호열성 녹색 활공 광합성 세균인 클로로플렉서스 아우란티아쿠스로부터 세 개의 작은 푸른 구리 단백질들이 분리되었으며, 이들은 각각 아우라시아닌 A, 아우라시아닌 B-1, 그리고 아우라시아닌 B-2로 지정되었다. 두 개의 B 형태들은 당단백들이며 서로와 거의 동일한 물성들을 지니지만, A 형태와는 동떨어져 있다. 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아미드 전기영동은 나타나는 단량체 분자 질량을 14(A), 18(B-2), 그리고 22(B-1)kDa로 나타낸다.
아우라시아닌 A의 아미노산 서열이 결정되었으며, 139 개의 잔기로 구성되어 있는 폴리펩타이드 구조라는 것이 밝혀졌다. Van Dreissche 등, Protein Science 8:947-957 (1999). His58, Cysl23, Hisl28, 그리고 Met132들은 알려진 작은 구리 단백질들인 플라스토시아닌과 아주린의 경우들처럼, 그들이 진화적으로 보존된 금속 리간드들일 것으로 추측될 수 있는 방식으로 배열되었다. 이차 구조 예측 또한 아우라시아닌이 녹농균으로부터 유래한 아주린과 포플러 잎으로부터 유래한 플라스토시아닌의 것과 유사한 일반적인 베타-원통 구조를 가지고 있을 것을 나타낸다. 아주린의 공통 서열과의 전체적인 유사성은 플라스토시아닌의 공통 서열과의 전체적인 유사성과 대략적으로 비슷하며, 약 30.5%이다. 아우라시아닌의 N-말단 서열 1-18번 부위들은 글리신과 수산화 아미노산들의 함량이 매우 높다. Id. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스로부터 유래한 아우라시아닌의 사슬 A 를 알기 위해서는 모범적인 아미노산 서열 서열번호: 15을 참조하라 (NCBI Protein Data Bank Accession No. AAM12874).
아우라시아닌 B 분자는 일반적인 큐프레독신 접힘을 가진다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스로부터 유래한 아우라시아닌 B의 결정 구조가 연구되었다. Bond 등., J. MoI. Biol. 306:47-67 (2001). 추가적인 N-말단 가닥을 제외하고, 분자는 세균성 큐프레독신인 아주린의 구조와 매우 비슷하다. 다른 큐프레독신들에서처럼, 구리 리간드들 중 하나는 폴리펩타이드의 4번 가닥에 놓여있으며, 다른 세 개는 7번과 8번 가닥 사이의 커다란 고리 위에 놓여있다. 구리 부위 기하는 옆의 세 리간드들 사이에 일어나는 아미노산 공간 배열을 참고로 논의되었다. 결정학적으로 그 특성이 결정된, 아우라시아닌 B의 구리 결합 도메인은 아마 다른 몇몇 막과 관련된 전자 전달 단백질들에 존재하는 구조들과 유의미한 서열 유사성을 보이는 N-말단 꼬리에 의해 세포막 주변 세포질쪽에 아마 결합되어 있을 것이다. B 형태의 아미노산 서열들은 McManus 등. J. Biol. Chem. 267:6531-6540 (1992)에 나타나있다. 클로로플렉서스 아우란티아쿠스로부터 유래한 아우라시아닌의 사슬 B 를 알기 위해서는 모범적인 아미노산 서열 서열번호: 16을 보라 (NCBI Protein Data Bank Accession No.1QHQA).
스텔라시아닌
스텔라시아닌들은 식물 큐프레독신의 흔한 과인, 파이토시아닌들의 하위 분류이다. 스텔라시아닌의 모범적인 서열은 본 명세서에 서열번호: 14로 포함되었다. 고추냉이 뿌리로부터 얻은 스텔라시아닌인 우메시아닌의 결정 구조 (Koch 등, J. Am. Chem. Soc. 127:158-166 (2005)) 와 오이 스텔라시아닌의 결정 구조 (Hart el al., Protein Science 5:2175-2183 (1996)) 또한 밝혀졌다. 단백질은 다른 파이토시아닌과 전반적으로 유사한 접힘 구조를 가지고 있다. 에프린 B2 단백질 엑토도메인 3차 구조는 스텔라시아닌과 유의미한 유사성을 포함한다. Toth 등, Developmental Cell 1:83-92 (2001). 스텔라시아닌의 모범적인 아미노산 서열은 National Center for Biotechnology Information Protein Data Bank 에서 Accession No. IJER, 서열번호: 14로 발견된다.
오이 기초 단백질
오이 기초 단백질의 모범적 아미노산 서열은 본 명세서에 서열번호: 17로 포함되었다. 1종푸른 구리 단백질인 오이 기초 단백질 (CBP)의 결정 구조는 1.8 옹스트롬 해상도로 개선되었다. 이 분자는 격자 베타-원통 구조를 가진다는 점에서 다른 푸른 구리 단백질들과 닮았지만, 이 원통 구조의 경우 한 쪽이 열려 있어 “베타-샌드위치” 또는 “베타-타코” 구조로 보다 잘 기술된다. Guss 등, J. MoL Biol. 262:686-705 (1996). 에프린 B2 단백질 엑토도메인 3차 구조는 오이 기초 단백질과 높은 유사성 (50 알파 탄소들에 대해 제곱 평균 편차 1.5 옴스트롱) 을 보인다. Toth 등, Developmental Cell 1:83-92 (2001).
구리 원자는 일반적인 푸른 구리 NNSS’ 배위를 지니며, Cu-N(His39) = 1.93 옴스트롱, Cu-S(Cys79) = 2.16 옴스트롱, Cu-N(His84) = 1.95 옴스트롱, Cu-S(Met89) = 2.61 옴스트롱인 결합 길이를 가진다. 이황화 가교인 (Cys52)-S-S-(Cys85)는 분자 구조를 안정화시키는 데에 있어 중요한 역할을 하는 것으로 보인다. 폴리펩타이드 접힘은 푸른 구리 단백질들 (파이토시아닌)의 아과(sub-family) 중 흔히 발견되는 유형이며, CBP가 높은 정도의 서열 유사성을 지니는, 비-금속단백질인 돼지풀 알레르기원 Ra3 또한 마찬가지다. 현재 파이토시아닌으로 식별 가능한 단백질들은 CBP, 스텔라시아닌, 마비시아닌, 우메시아닌, 오이 껍질 벗김 큐프레독신(cucumber peeling cupredoxin), 완두꼬투리에 존재하는 추정상의 푸른 구리 단백질, 그리고 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 유래한 푸른 구리 단백질이다. 오이 기초 단백질과 완두꼬투리 단백질을 제외한 다른 모든 경우에서는, 푸른 구리 부위에서 일반적으로 발견되는 축성 메티오닌 리간드는 글루타민으로 치환되었다. 오이 기초 단백질의 모범적인 아미노산 서열은 NCBI Protein Data Bank Accession No. 2CBP, 서열번호: 17로 발견된다.
사용방법
본 발명은 만일 건강한 환자가 아니면, 상술한 큐프레독신 또는 큐프레독신의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물인 적어도 하나의 펩타이드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 악성 종양을 예방하는 방법을 제공한다. 화학적 방어 치료는 발명과 관련된 경로의 방해 요인이 암의 성장을 막을 것이라는 가설에 기초한다. 상기 큐프레독신 녹농균 및 절단된 아주린 펩타이드 p28은 전암성 병소의 최초 형성을 억제하든지 존재하는 전암성 병소의 성장을 죽이거나 억제함으로써 전암성 병소의 발달을 억제한다고 현재 알려져 있다.
그러므로, 만일 건강한 환자가 아니면, 전암성 병소의 발달을 억제하는 능력을 갖는 상술한 큐프레독신, 또는 큐프레독신의 변이체, 절단부, 유도체 또는 구조적 등가물는 화학적 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 만일 건강한 환자가 아니면, 일반인보다 더 높은 암 발달 위험에 있다. 본 발명의 조성물로 치료 함으로써 예방할 수 있는 암은 흑색종 암, 유방암, 췌장암, 교모세포종 암, 성상세포종 암, 폐암, 대장암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 피부암 및 자궁경부암을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 다른 실시예에서, 상기 환자는 인간이 아니다.
본 발명은 암 세포 내로 우선적으로 진입하기 위한 조성물 및 방법을 더 포함한다. 큐프레독신, 특히 아주린 유도체 p18 및 p28은 본 발명에서 개시된 메커니즘을 통하여 암 세포에 진입하는 것으로 알려져 있으며, 상기 메커니즘은 골지체에 의해 매개될 수 있는 카베올레 매개된 엔도사이토시스를 포함한다. 그러므로, 큐프레독신 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 암 세포에 진입하고 죽이는데 사용될 수 있고, 세포막을 가로질러서 카르고를 수송하기 위해 사용될 수도 있다.
또한 본 발명은 발암물질로 유도하기 이전 또는 이후, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체, 절단부 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물로 포유류 세포에 접촉시키고 그 세포의 진행을 관찰함으로써 암의 발병을 조사하는 방법을 포함한다. 일부 실시예에서는, 세포가 마우스 유선 세포이며, 또 다른 실시에에서는, 세포가 포유동물에서 악성이 될 수 있는 다른 세포이다.
일반 사람들보다 암 발병의 위험성이 높은 환자는 고위험 특성을 가진 환자, 전암성 병소를 가진 환자 및 초기 암을 치료받았거나 전암성 병소를 불완전하게 치료받은 환자일 수 있다. 전체적으로 Tsao 등., CA Cancer J Clin 54:150-180(2004) 참조. 고위험 특성은 환자의 행동적, 유전적, 환경적, 또는 생리학적 요인일 수 있다. 환자에게 다양한 형태의 암이 발생하게 되는 행동적 요인에는 흡연, 다이어트, 알콜 소비, 호르몬 치환 요법, 높은 체질량 지수, 비분만, 빈랑 사용, 빈번한 구강청정제 사용, 인간 유듀종 바이러스에의 노출, 소아 만성 태양 노출, 이른 나이의 첫 성교, 다수의 성적 파트너, 및 경구 피임제 사용 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 환자에게 다양한 형태의 암이 발생하게 되는 유전적 요인에는 암의 가족력, BRCA1 및 BRCA2의 유전자 담체 상태, 유방 종양의 이전 기전 기록, 가족성 선종성 용종증(FAP), 유전성 비폴립증 결장직장암(HNPCC), 적모 또는 금발과 흰피부의 표현형, 색소성 건피증 및 민족성 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 환자에게 다양한 형태의 암이 발생하게 되는 환경적 특징에는 라돈에의 노출, 다환식 방향족 탄화수소, 니켈, 크로메이트, 비소, 석면, 클로로메틸 에테르, 벤조[에이]피렌, 방사선, 및 고무 또는 페인트 직업적 노출로부터의 방향족 아민 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 환자에게 다양한 형태의 암이 발생하게 되는 여러가지 특징에는 기류 폐색을 갖는 만성 폐쇄성 폐질환, 만성 방광염, 주혈흡충증, 고령, 및 면역손상 상태 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 암 발병의 위험성이 높은 환자는 특정 종류의 암에 대해 발병되는 다양한 위험 모델을 이용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 유방암에 걸리는 경향이 높은 환자는 여러가지 중에 가일 리스크 모델(Gail risk model) 또는 클라우스 모델(Claus model)을 이용하여 결정될 수 있다. Gail 등., J Natl Cancer Inst 81:1879-1886(1989); Cuzick, Breast 12:405-411(2003); Huang 등., Am J Epidemiol 151:703-714(2000) 참조.
전암성 병소를 가진 환자는 일반 사람들보다 암 발병의 위험성이 높다. 환자의 전암성 병소 존재는 당해 분야에 잘 알려져 있는 많은 방법에 의해 결정될 수 있다. 환자가 전암성 병소를 보유하고 있는지를 결정하기 위해서 환자내에서 전암성 병소으로부터 유래되는 중간체 마커 또는 바이오마커(biomaker)를 측정할 수 있다. 대부분 암 환자의 경우, 종양 세포 및 주변의 조직학적 정상 조직에서 염색체 이상이 발생한다. 염색체 이상의 발전은 전암성 병소으로부터 침입 암으로의 표현형 발전과 변행된다. Thiberville 등., Cancer Res. 55:5133-5139 (1995). 따라서, 암과 관련한 염색체 이상은 환자의 전암성 병소를 검출하기 위한 중간체 마커로서 이용될 수 있다. 암과 관련한 통상적인 염색체 이상에는 3p(FHIT 및 기타), 9p(p16INK4, p16INK4B, 및 p16ARK에 대한 9p21), 17p(p53 유전자에 대한 17p13 및 기타), 및 13q(망막아종 유전자 Rb에 대한 13q14 및 기타)와 같은 종양 억제 유전자의 대립유전자 삭제 또는 이형성(heterozygosity) 손실(LOH) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 3p 및 9p의 삭제는 흡연 및 폐암 초기 단계와 관련이 있다. Mao 등., J Natl Cancer Inst. 89:857-862(1997). 3p, 5p, 8p, 17p 및 18q 삭제는 통상적인 상피성 암의 변화이다. Tsao 등, CA Clin. Cancer J. Clin 54:153 (2004) 참조. 암과 관련한 다른 염색체 변이는 종양 유전자를 활성화시키는 변이를 포함한다. 그 존재가 중간체 마커로서 이용될 수 있는 종양 유전자에는 Rac, c-myc, 상피 성장 인자, erb-B2 및 시클린스 E, D1, 및 B1 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 전체적으로 id. (154) 참조.
다른 중간체 마커는 전암성 세포 및 암 세포에서 조절 상승된 유전자의 산물일 수 있다. 전암성 세포에서 조절 상승될 수 있는 유전자에는 시클로옥시게나제 COX-1 및 COX-2 텔로메라제 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 다른 암세포 바이오마커 및 일부 전암성 세포에는 p53, 상피 성장 인자 수용체(GFR), 증식세포 핵 항원(PCNA), PAS, COX-2, Ki-67, DNA 이수체(aneuploidy), DNA 폴리머라제-α, ER, Her2neu, E-카드헤린, RARβ, hTERT, p16INK4a, FHIT(3p14), Bcl-2, VEGF-R, HPV 감염, LOH 9p21, LOH 17p,p-AKT, hnRNP A2/B1, RAF, Myc, c-KIT, 사이클린 D1, E 및 B1, IGF1, bcl-2, p16, LOH 3p21.3, LOH 3p25, LOH 9p21, LOH 17p13, LOH 13q, LOH 8p, hMSH2, APC, DCC, DPC4, JV18, BAX, PSA, GSTP1, NF-kB, AP1, D3S2, HPV 감염, LOH 3p14, LOH 4q, LOH 5p, 방광 종양 항원(BTA), BTK TRAK (Alidex, Icn., Redmond WA), 요로 기질 단백질 22, 섬유소 분해산물, 자가분비 이동인자(autocrine motility factor) 수용체, BCLA-4, 시토케라틴 20, 히알루론산, CYFRA 21-1, BCA, 베타-인간 코리오닉 고나도트로핀, 및 조직 폴리펩타이드 항원(TPA) 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 전체적으로 id.(155-157) 참조.
초기 암이 치료되었거나 전암성 병소이 불완전하게 치료받은 환자도 또한 일반 사람들보다 암 발병의 위험성이 높다. 제 2 원발 종양이라는 것은 암 병력을 가진 사람의 새로운 원발 암을 의미한다. 제 2 원발 종양은 머리 및 목의 암의 주요 사망 원인이다. id. (150) 참조. 제 2 원발 종양은 전이와는 구별된다. 전자는 새로 발생하는 것인 반면, 후자는 존재하고 있는 종양으로부터 발생한다. 유방, 머리 및 목, 폐 및 피부의 암 또는 전암성 병소를 치료받은 경험이 있는 환자는 제 2 원발 종양이 발병할 위험성이 특히 높다.
큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체, 절단부 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 경로에 의해 다양한 방식으로 환자에게 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체, 또는 구조적 등가물은 정맥내, 근육내, 피하, 국소, 경구로 또는 흡입에 의해 투여된다. 상기 조성물은 암 발병 위험이 있는 환자의 부위로 펩타이드가 전달되는 어떠한 수단에 의해서도 환자에 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체, 절단부 또는 구조적 등가물은 정맥 내로 투여된다.
한 실시예에서, 본 방법은 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체, 절단부 또는 큐프레독신의 구조적 등가물을 함유하는 조성물 1회 단위 투여량과 다른 화학적 방어제를 함유하는 조성물 1회 단위 투여량을 거의 동시에 투여하거나, 또는 정해진 시간 후에 나머지 조성물을 투여하는, 예를 들어 약 1분 내지 약 60분 후에 나머지 조성물을 투여하거나, 약 1시간 내지 약 12시간 후에 나머지 조성물을 투여하는 방식으로, 환자에게 병행 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 관심 대상인 화학적 방어제에는 타목시펜, 아로마타아제 억제제, 예를 들어 레트로졸 및 아나스트로졸(Arimidex®), 레티노이드, 예를 들어 N-[4-하이드록시페닐]레틴아미드(4-HPR, 펜레티니드), 비스테로이드계 항염증제 (NSAIDs), 예를 들어 아스피린 및 설린닥, 셀레콕시브(COX-2 억제제), 데플루오로메틸로르니팅(DFMO), 우르소데옥시콜린산, 3-하이드록시-3-메틸글루타릴 코엔자임 A 리덕타제 억제제, EKI-785(EGFR 억제제), 베바시주마브(VEGF-수용체에 대한 항체), 세툭시마브(EGFR에 대한 항체), 레티놀, 예를 들어 비타민 A, 베타-카로틴, 13-시스 레티노인산, 이소트레티노인 및 레티닐 팔미테이트, α-토코페롤, 인터페론, 암용해 아데노바이러스 dl1520(ONYX-015), 게피티닙(gefitinib), 에드레티네이트, 피나스테라이드, 인돌-3-카르비놀, 레스베라트롤, 클로로겐산, 라록시펜, 및 올티프라즈 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
암 세포 및 종양 안으로 조성물의 진입을 가능하게 하는 조성물
본 발명은 세포 안으로 카르고 화합물을 전달하는 방법 및 물질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 카르고 화합물의 전달은 적합한 수송 폴리펩타이드의 사용을 통해 이루어진다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 수송 폴리펩타이드에 연결된다. 적합한 수송 펩타이드는 큐프레독신, 또는 "큐프레독신 진입도메인"을 함유하는 큐프레독신의 조각을 포함한다. 상기 용어 "큐프레독신 진입 도메인"은 포유류의 암세포 안으로 큐프레독신의 진입을 위해 요구되는 아미노 서열을 포함하는 큐프레독신 조각을 의미한다. 본 발명에 의해 전달되는 카르고 화합물은 단백질, 지질단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 다당류, 핵산을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 상기 핵산은 RNA, DNA, 항-감지 핵산, 염료, 형광 및 방사성 태그, 극미립자 또는 나노 입자, 독성, 무기 및 유기 분자, 작은 분자, 및 약물(예, 화학적 방어 약물)을 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 약물 및 독성은 종양 세포를 죽인다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 큐프레독신은 녹농균으로부터의 아주린(서열번호: 1)과 같은 아주린이다. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 큐프린은 특히 플라스토시아닌(plastocyanin), 루스티시아닌(rusticyanin), 또는 슈도아주린(pseudoazurin) 이다. 특정 실시예에서, 상기 아주린은 특히 녹농균, 슈도모나스 시린게(pseudomonas syringa), 수막염균(Neisseria meningitides ), 임균(Neisseria gonorrhoeae ), 장염비브리오균(Vibrio par ahaemolyticus) 또는 보데텔라브론키셉티카균(Bordetella bronchiseptica)이다.
일 실시예에서, 카르고(cargo) 화합물은 암세포와 같은 세포의 세포 순환 진행을 없애거나 지연하도록 전달된다. 이러한 암세포는 특히 예를 들어, 골육종 세포, 폐암 세포, 대장암 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 연조직 육종 세포(soft tissue sarcoma cell) 또는 유방암, 간암, 방광암 또는 전립선암 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 카르고 화합물은 특히 p53과 같은 세포 순환 통제 단백질; p16, p21 또는 p27과 같은 사이클린의존성 키나아제억제인자(cyclin-dependent kinase inhibitor); 티미딘키나아제(thymidine kinase) 또는 니트로리덕타아제(nitroreductase)와 같은 자살 단백질(suicide protein); 인터루킨1, 인터루킨2 또는 과립대식세포집락자극인자(granulocyte macorphage colony stimulating factor)(GM-CSF)와 같은 시토카인 또는 다른 면역조절 단백질; 또는 녹농균 외독소 A와 같은 독소일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 화합물 분류 중 하나의 생물학적 활성 조각이 전달된다. 또 다른 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 상기 목표 조직의 영상을 생성하기 위해 전달된다. 예를 들어, 상기 목표 조직은 암일 수 있고, 상기 카르고 화합물은 X-선 단층 화상(CT), 자기 공명 영상(MRI) 및 초음파에 의한 검출을 위한 영상을 생성하기 위하여 흔히 사용되는 것 중 하나일 수 있다. 이러한 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 γ선 또는 양전자 발산 방사성 동위원소(positron emitting radioisotope), 자기공명영상용 조영제(magnetic resonance imaging contrast agent), X-선 조영제, 또는 초음파 조영제이다.
본 발명은 DNA 또는 RNA를 포유류 암세포 안으로 우선적으로 주입하는 방법을 포함한다. 어떤 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 카르고 화합물이다. 일부 실시예에서, 상기 방법은 DNA 또는 RNA에 결합된 p18 또는 p38을 제공하는 단계 및 상기 화합물은 포유류의 신체 안으로 주입하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 유전자 또는 유전자 조각이다. 일부 실시예에서, 상기 DNA 또는 RNA는 일단 포유류의 세포 안으로 주입되면 치료적 효과를 가진다.
본 발명은 암세포 안으로 펩타이드의 우선적인 진입을 가능하게 할 뿐만 아니라, 포유류의 암세포 안으로 연쇄된 카르고의 수송을 가능하게 하지만 암세포가 아닌 세포에는 연쇄된 카르고의 전달을 하지 않게 하는 단백질 전달 도메인을 제공한다. 큐프레독신 단백질은 포유류의 암세포 안으로 연쇄된 카르고의 진입을 가능하게 하는 단백질 전달 도메인, 큐프레독신 진입 도메인을 포함한다고 밝혀졌다. 일부 실시예에서, 모든 큐프레독신 단백질은 암세포 안으로 연쇄된 카르고의 선택적 수송을 가능하게 하도록 사용될 수 있다. 다른 실시예에서, 큐프레독신의 일부분은 암세포 안으로 연쇄된 카르고를 수송하도록 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 전장 야생형 단백질(full length wild-type protein)보다 적은 큐프레독신 영역으로 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 큐프레독신의 약 10 개의 잔기, 약 15 개의 잔기 또는 약 20 개의 잔기보다 많은 수의 잔기로 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 큐프레독신의 약 50 개의 잔기, 약 40 개의 잔기 또는 약 30 개의 잔기 이하의 수의 잔기로 구성된다. 일부 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 큐프레독신에 대하여 적어도 약 90 %의 아미노산 서열 동일성, 적어도 약 95 %의 아미노산 서열 동일성 또는 적어도 약 99 %의 아미노산 서열 동일성을 가진다.
일부 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 아주린 진입 도메인이다. 본 발명의 일 실시예에서, 아주린 진입 도메인은 적어도 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 50번 내지 77번인, p28 (서열번호: 2)을 함유한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 36번 내지 77번 (서열번호: 27)을 함유한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 36번 내지 89번 (서열번호: 28)를 함유한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 36번 내지 128번 (서열번호: 29)을 함유한다. 또 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 녹농균으로부터의 아주린의 아미노산 50번 내지 67번인, p18 (서열번호: 25)을 함유한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 녹농균으로부터의 아주린의 53번 내지 70번 (서열번호: 30)을 함유한다. 또 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 녹농균으로부터의 아주린의 53번 내지 64번 (서열번호: 31)를 함유한다.
본 명세서에서 개시되는 실시예, 특히 실시예 19는 p18(아미노산 50-67) 상에는 존재하지 않는 p28의 C-말단 영역이 세포막 상의 특정 잔기에 아마도 접촉하여 세포로의 접근을 제공한다는 것을 입증한다. 따라서, 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 p28의 아미노산 66번 내지 77번 (서열번호: 35)을 함유하는 아주린 진입 도메인이다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 p28의 아미노산 68번 내지 77번 (서열번호: 36)을 함유하는 아주린 진입 도메인이다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 p28의 아미노산 67번 내지 77번 (서열번호: 37)을 함유하는 아주린 진입 도메인이다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 서열번호: 2의 69번, 70번, 75번, 76번 및 85번 위치에 있는 하나 이상의 아미노산을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 녹농균으로부터의 아주린외에 큐프레독신으로부터의 진입도메인이다. 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 시아노박테리아 포르미디움 라미노섬(cyanobacterium Phormidium laminosum)으로부터의 플라스토시아닌 조각(서열번호: 3), 철산화세균(Thiobacillus ferrooxidans)으로부터의 루스티시아닌 조각(서열번호: 4); 아크로모박터 시클로크라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터의 슈도아주린 조각(서열번호: 5), 슈도모나스 시린게으로부터의 아주린 조각(서열번호: 21), 수막염균으로부터의 아주린 조각(서열번호: 10), 장염미브리오균으로부터의 아주린 조각(서열번호: 8), 또는 클로로플렉서스 아우란티아쿠스(Chloroflexus aurantiacus)로부터의 아우라시아닌 조각(서열번호: 15 및 16)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 클로로플렉서스 아우란티아쿠스의 아우라시아닌 B의 아미노산 57번 내지 89번 (서열번호: 20)를 함유한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 슈도모나스 시린게 아주린의 아미노산 51번 내지 77번 (서열번호: 21)을 함유한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 수막염균 LaZ의 아미노산 89번 내지 115번 (서열번호: 22)를 함유한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 장염미브리오균 아주린의 아미노산 52번 내지 78번 (서열번호: 23)을 함유한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 적어도 보데텔라 브론키셉티가(bordetella bronchiseptica) 아주린의 아미노산 51번 내지 77번 (서열번호: 24)을 함유한다.
큐프레독신 진입 도메인의 변형
본 발명의 또 다른 실시예에서, 큐프레독신 진입 도메인은 세포 안으로 카르고 화합물을 선택적으로 진입 및/또는 수송하는 능력을 보유하는 변이체을 생산하도록 화학적으로 변형되거나 유전적으로 변경된다. 예를 들어, 실시예 14는, 54번, 61번 및 70번 위치에 주입된 프롤린 잔기를 가지는 녹농균으로부터의 아주린이 UISO-Mel-2-세포에 진입하는 능력을 보유한다는 것을 보여준다.
또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 보존 아미노산 서열 DGXXXXXDXXYXKXXD(서열번호: 32) 또는 DGXXXXDXXYXKXXD(서열번호: 33)을 포함하며, 이 때 D는 아스파르트산, G는 글라이신, Y는 티로신, K는 리신 및 X는 임의의 아미노산이다(실시예 17 참조).
큐프레독신 진입 도메인의 변이체은 표준 기술에 의해 합성될 수 있다. 유도체는 직접이던지 또는 변형이나 부분적 치환에 의해서던지 간에 천연 화합물로부터 형성된 아미노산 서열이다. 유사체들은 천연 화합물에 대해 유사하지만 동일하지 않은 구조를 갖지만, 특정 구성성분 또는 측쇄에 대하여 상이한 아미노산 서열이다. 유사체는 합성될 수 있거나, 상이한 진화의 기원에 기인할 수 있다.
만일 상기 유도체 또는 유사체가 변형된 아미노산을 함유한다면, 변이체은 전장에 걸치거나 전장에 걸치지 않을 수 있다. 큐프레독신 진입 도메인의 변이체은, 동등한 크기의 아미노산 서열 또는 상동 알고리즘에 의해 수행되어 정렬되는 정렬된 서열과 비교할 때, 큐프레독신 진입 도메인에 대해 적어도 약 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % 또는 99% 동등성의 실질적으로 상응하는 영역을 함유하는 분자를 포함하지만 이제 국한되지 않는다.
또 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인의 변이체은 녹농균으로부터의 아주린 잔기 50번 내지 77번인 p28 (서열번호: 2)에 대해 상당한 구조적 유사성을 가진다. 또 다른 실시예에서, 상기 퓨프레독신 진입 도메인의 변이체은 녹농균으로부터의 아주린 잔기 50번 내지 67번인 p18 (서열번호: 25)에 대해 상당한 구조적 유사성을 가진다. 큐프레독신과 다른 단백질 간의 상당한 구조적 상동 관계를 확인하는 연구의 실시예는 Toth 등(Developmental Cell 1:82-92 (2001))을 포함한다. 특히, 상기 큐프레독신 진입 도메인의 변이체과 녹농균으로부터의 아주린 잔기 50번 내지 77번 (서열번호: 2) 간의 상당한 구조적 상동 관계는 VAST 알고리즘을 사용하여 확인된다(Gibrat 등, Curr Opin Struct Biol 6:377-385 (1996); Madej 등, Proteins 23:356-3690 (1995)). 특정 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인의 변이체과 녹농균으로부터의 아주린 잔기 55번 내지 77번(서열번호: 2)의 구조적 비교로부터의 VASP p 값은 약 10-3보다 작거나, 10-5보다 작거나, 10-7보다 작다. 다른 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인의 변이체과 녹농균으로부터의 아주린 잔기 50번 내지 77번 (서열번호: 2) 간의 상당한 구조적 상동 관계는 DALI 알고리즘(Holm & Sander, J MoI. Biol. 233:123-138 (1993))을 사용하여 확인될 수 있다. 특정 실시예에서, 쌍별 구조적 비교에 대한 상기 DALI Z점수는 적어도 약 3.5, 적어도 약 7.0 또는 적어도 약 10.0이다.
상기 큐프레독신 진입 도메인에 대한 변형은 올리고핵산-매개된(부위 특이적) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝, PCR 돌연변이 유발 및 본 명세서에 개시된 방법 및 기술과 같은 당해 분야에 알려진 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발(Carter, Biochem J. 237:1-7 (1986); Zoller 및 Smith, Methods Enzymol. 154:329-50 (1987)), 카세트 돌연변이 유발(cassette mutagenesis), 제한 선택 돌연변이 유발(restriction selection mutagenesis)(Wells 등, Gene 34:315-23 (1985)) 또는 다른 알려진 기술은 큐프레독신 진입 도메인 변이체 핵산을 생산하도록 복제 DNA 상에서 수행될 수 있다. 게다가, 큐프레독신 진입 도메인과의 구조적 유사성을 갖는 뉴클레오티드 암호화 진입 도메인은 당해 분야에 잘 알려진 방법으로 합성될 수 있다. 나아가, 야생형 또는 변이체 큐프레독신 진입 도메인인 단백질 분자는 당해 분야에 잘 알려진 방법으로 합성될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 카르고 화합물에 결합된 큐프레독신 진입 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 이 때 상기 카르고 화합물은 단백질 또는 펩타이드이다. 본 발명에 따른 상기 핵산 분자는 당해 분야에 알려진 기술의 조합을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 큐프레독신 진입 도메인 및 상기 카르고 화합물에 대한 핵산 서열은 화학적 합성 또는 복제에 의해 개별적으로 제조될 수 있다. 이후에, 상기 핵산 서열들은 관심 핵산 분자를 제공하도록 리가아제를 사용하여 붙인다.
큐프레독신 진입 도메인을 사용하여 카르고 화합물을 전달하는 방법
많은 아르기닌이 풍부한 펩타이드는 포유류의 세포막을 통과하여 전위시키고, 단백질 카르고 화합물을 이러한 세포 안에 지니고 있다고 알려져 있다(Suzuki, T., 등. J. Biol. Chem. 277:2437-43 (2002)). 예를 들어, 짧은 아르기닌이 풍부한 HIV Tat 단백질의 11개의 아미노산 분절(아미노산 47번 내지 57번)은 카르고 단백질을 포유류의 세포 안으로 수송을 가능하게 한다(Schwarze, SR., 등. Trends Cell Biol. 10:290-95 (2000)). α-나선 함량을 높이고 아르기닌 잔기의 배치를 최적화하는 합성한 진입 도메인은 단백질 전달 도메인으로서의 가능성을 높이는 것으로 보여져 왔다(Ho, A., 등. Cancer Res. 61 :474-77 (2001)). 이와 대조적으로, 녹농균으로부터의 아주린은 하나의 아르기닌 잔기를 가진다.
일부 실시예에서, 본 발명은 카르고 화합물이 p18(서열번호: 25) 및 p28(서열번호: 2)와 같은 세포 안으로 진입할 수 있게 하는 큐프래독신 조각들의 사용을 아우른다. 이러한 조각들은 세포 안으로 진입할 필요가 있는 이러한 조각을을 식별하는 임의의 방법에 의해 확인될 수 있다. 이러한 방법 중 하나에서, 큐프레독신 조각은 표지 물질에 결합되고, 상기 큐프레독신 조각이 세포에 진입하였는지 여부를 확인하도록 시험을 수행했다. 이러한 방법은 상술한 상기 큐프레독신의 적합한 조각을 식별하는데에 사용될 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 녹농균(서열번호: 1)로부터의 아주린; 시아노박테리아 포르미디움 라미노섬으로부터의 플라스토시아닌(서열번호: 3), 철산화세균으로부터의 루스티시아닌(서열번호: 4); 또는 아크로모박터 시클로크라스테스로부터의 슈도아주린(서열번호: 5), 슈도모나스 시린게로부터의 아주린 조각(서열번호: 21), 수막염균으로부터의 아주린(서열번호: 10), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibro parahaemolyticus )로부터의 아주린(서열번호: 19), 장염미브리오균으로부터의 아주린(서열번호: 8), 클로로플렉서스 아우란티아쿠스로부터의 아우라시아닌 A 및 B(서열번호: 15 및 16), 이 외의 아주린 및 아주린 유사 단백질과 같은 큐프레독신 또는 상기의 조각에 부착된다. 다른 실시예에서, 상기 카르고는 p28(서열번호: 2), p18(서열번호: 25) 또는 서열번호: 35 내지 37 중 어느 하나와 같은 큐프레독신 진입 도메인에 연결된다.
본 발명의 다양한 실시예에서, 큐프레독신 진입 도메인은 시험관 안, 탈체 또는 생체조건 안에서 카르고 화합물을 세포 안으로 전달한다. 예를 들어, 전달은 스미어테스트와 같이 큐프레독신 진입 도메인 착물 및 카르고 화합물을 세포 배양에 첨가함으로써 시험관 안에서 달성될 수 있다. 대안적으로, 전달은 착물이 환자로부터 제거된 샘플, 예를 들어 혈액, 조직 또는 골수에 첨가하고, 환자에게 처리된 샘플을 돌려보냄으로써 탈체로 달성될 수 있다. 또한, 전달은 착물을 환자에게 직접적으로 투여함으로써 달성될 수 있다. 본 발명의 방법은 치료, 예방, 진단 또는 조사 목적을 위해 사용될 수 있다. 카르고 화합물은 본 발명에 의해 전달되었고, 이 때 상기 본 발명은 단백질, 지방단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 다당류, 핵산, 안티센스 핵산을 포함하는 핵산, 염료, 극미립자(microparticles) 또는 나노입자, 독소, 유기분자 및 무기분자, 소분자 및 약물을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
일 실시예에서, 검출가능한 물질, 예를 들어 녹색형광단백질(green fluorescent protein)과 같은 형광 물질; 발광 물질; β-갈락토시다아제와 같은 효소; 또는 방사성 동위원소로 라벨링 되거나 비오틴 잔기와 혼합된 단백질(biotinylate protein)은 검출가능한 표현형을 세포에 부여하도록 전달된다. 유사하게, 검출가능한 물질, 예를 들어 형광 물질로 라벨링 된 극미립자 또는 나노입자가 전달될 수 있다. 적합한 나노입자의 일 예는 2002년 5월 7일에 등록된 미국특허 제6,383,500호에서 발견되며, 참조로써 명확히 포함된다. 많은 이러한 검출가능한 물질은 당해 기술자에게 알려져 있다.
일부 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 X-선 단층 화상, 자기 공명 영상, 초음파 촬상 또는 방사성 핵종 신티그램 촬영(radionuclide scintigraphy)에 적합한 검출가능한 물질이다. 이러한 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 진단 목적으로 환자에게 투여된다. 조영제는 X-선 CT, MRI 및 초음하에 의해 얻어지는 영상을 향상시키도록 카르고 화합물로서 투여된다. 상기 큐프레독신 진입 도메인을 거쳐서 종양 조직을 겨냥하는 방사성 핵종 카르고 화합물의 투여는 방사성 핵종 신티그램 촬영을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인은 카르고 화합물을 포함하거나 포함하지 않는 방사성뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 γ-선 또는 양전자 발산 방사선 동위원소, 자기공명영상용 조영제, X-선 조영제, 또는 초음파 조영제이다.
카르고 화합물로서 사용하기에 적합한 초음파 조영제는 생체 적합성 가스의 미소기포, 액체 담체, 및 계면활성제 미소구체를 포함하지만 이에 국한되지 않으며, 표적화 부분 및 미소기포 사이에 시각적 연결 부분(optical linking moiety), Ln을 더 포함한다. 이와 관련해서, 상기 용어 액체 담체는 수용액을 의미하고, 상기 용어 계면활성제는 용액에서 계면 장력의 감소를 초래하는 임의의 양친매성 물질을 의미한다. 계면활성제 미소구체를 형성하기 위해 적합한 계면활성제의 목록은 EP0727225A2에 개시되며, 본 명세서에 참조로 명확히 포함된다. 상기 용어 계면활성제 미소구체는 나노구체, 리포좀, 비히클 등을 포함한다. 상기 생체적합성 가스는 공기 또는 C3-C5 과플루오로알칸(perfluoroalkane)과 같은 플루오르화 탄소이며, 이는 음파반사성(echogenicity)의 차이로 인하여 초음파 촬상에 명암을 제공한다. 상기 가스는 큐프레독신 진입 도메인에 부착되며, 선택적으로 연결군을 거쳐 부착되는 미소구체 내에 캡슐화되거나 함유된다. 상기 부착은 공유 결합 힘, 이온 결합 힘 또는 반데르발스 힘에 의할 수 있다. 이러한 조영제의 특정 예는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 펩티도미메틱이 결합하는 복수의 종양 신생혈관 수용체를 갖는 지방 캡슐화된 과플루오로화 탄소를 포함한다.
카르고 화합물로서 사용하기에 적합한 X-선 조영제는 하나 이상의 X-선 흡수 또는 원자번호 20 이상의 "중"원자를 포함하지만 이에 국한되지 않으며, 상기 큐프레독신 진입 도메인 및 X-선 흡수 원자 사이에 시각적 연결 부분(optical linking moiety), Ln을 더 포함한다. X-선 조영제로 빈번하게 사용되는 중원자는 요오드이다. 최근에, 금속 킬레이트로 구성되는 X-선 조영제(예, 미국특허 제5,417,959호) 및 복수의 금속 이온으로 구성되는 폴리킬레이트(예, 미국특허 제5,679,810호)가 개시되었다. 더 최근에, 다핵 클러스터 착물은 X-선 조영제로서 개시되었다(예, 미국특허 제5,804,161호, PCT WO91/14460 및 PCT WO92/17215).
카르고 화합물로서 사용하기에 적합한 MRI 조영제는 하나 이상의 상자기성 금속 이온을 포함하지만 이에 국한되지 않으며, 상기 큐프레독신 진입 도메인 및 상자기성 금속 이온 사이에 시각적 연결 부분(optical linking moiety), Ln을 더 포함한다. 상기 상자기성 금속 이온들은 금속 착물 또는 금속 산화물 입자의 형태로 존재한다. 미국특허 제5,412,148호 및 5,760,191은 MRI 조영제에 사용하기 위한 상자기성 금속 이온에 대한 킬레이터의 예를 개시한다. 미국특허 제5,801,228호, 제5,567,411호 및 제5,281,704는 MRI 조영제에 사용하기 위한 하나 이상의 상자기성 금속 이온을 착화하는데 유용한 폴리킬런트(polychelants)의 예를 개시한다. 미국특허 제5,520,904호는 MRI 조영제로서 사용하기 위한 상자기성 금속 이온으로 구성된 미립자 조성물을 개시한다.
또 다른 실시예에서, 카르고 화합물은 암세포와 같은 세포 순환 진행을 없애거나 지연하도록 전달된다. 이러한 암세포는 예를 들어, 골육종 세포, 폐암 세포, 대장암 세포, 림프종 세포, 백혈병 세포, 연조직 육종 세포 또는 유방암, 간암, 방광암 또는 전립선암 세포일 수 있다. 예를 들어, 상기 카르고 화합물은 p53과 같은 세포 순환 통제 단백질; p16, p21 또는 p27과 같은 사이클린의존성 키나아제억제인자; 티미딘키나아제 또는 니트로리덕타아제와 같은 자살 단백질; 인터루킨1, 인터루킨 2 또는 과립대식세포집락자극인자(GM-CSF)와 같은 시토카인 또는 다른 면역조절 단백질; 또는 녹농균 외독소 A와 같은 독소일 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 화합물 분류 중 하나의 생물학적 활성 조각이 전달된다.
또 다른 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 핵산이다. 일부 실시예에서, 상기 핵산은 상기 화합물 분류 중 하나에 대해 암호화한다. 또 다른 실시예에서, 상기 카르고 화합물은 암을 치료하기 위해 사용되는 약물이다. 이러한 약물은 예를 들어, 5-플루오로우라실; 인터페론 α; 메토트렉사트(methotrexate); 타목시펜(tamoxifen); 및 빈크린스틴(vincrinstine)을 포함한다. 상기 예들은 오직 실례를 위해서 제공되며, 많은 다른 이러한 화합물들은 당해 기술자에게 알려져 있다. 다른 실시예에서, 상기 핵산은 유전자 치료에 유용하다.
암을 치료하기에 적합한 카르고 화합물은 니트로젠머스터드(nitrogen mustad), 알킬설폰산염, 니트로소우레아(nitrosoureas), 에틸렌이민 및 트리아젠(triazenes)과 같은 알킬화제; 엽산길항제, 퓨린유사체 및 피리미딘유사체와 같은 항대사물질; 안트라시클린(anthracyclines), 블레오마이신, 미토마이신, 닥티노마이신 및 플리카마이신과 같은 항생제; L-아스파라기나아제; 파르네실 트랜스퍼레이스 억제제(farnesyl-protein transferase inhibitors)와 같은 효소; 5.알파.-환원효소 억제제; 17.베타.-히드록시스테로이드 디히드로게나아제형 3의 억제제; 글루코코르티코이드, 에스트로겐/항에스트로겐, 안드로겐/항안드로겐, 프로게스틴 및 황체호르몬-방출호르몬 길항제와 같은 호르몬제, 옥트레오티드 아세트산염(octreotide acetate); 엑테이나시딘(ecteinascidins) 또는 이의 유사체 및 유도체와 같은 미소관 교란제(microtubule-disruptor agents); 탁산(taxanes), 예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel)(Taxol™), 도데탁셀(Taxotere™) 및 이의 유사체와 같은 미소관 안정제 및 에포틸론(epothilones)A-F 및 이의 유사체와 같은 에포틸론; 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids), 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins), 탁산(taxanes)과 같은 식물 유래 산물; 및 토포이소머라아제 억제제(topiosomerase inhibitors); 프레닐-단백질 트랜스퍼라아제 억제제(prenyl-protein transferase inhibitors); 및 히드록시우레아, 프로카바진(procarbazine), 미토탄(mitotane), 헥사메틸멜라민(hexamethylmelamine)과 같은 마이셀레니우스제(miscellaneous agents), 시스플라틴(cisplatin) 및 카보플라틴(carboplatin)과 같은 백금 배위 착물(platinum coordination complexes); 및 생물학적 반응조절물질, 성장 인자와 같은 항암 및 세포독성 물질로서 사용되는 다른 물질; 면역기능 조절제 및 모노클론항체를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
항암 및 세포독성 물질 분류의 대표 예는 메클로로레타민 히드로클로라이드(mechlorethamine hydrochloride), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 클로로람부실(chlorambucil), 멜팔란(melphalan), 이포스파미드(ifosfamide), 부설판(busulfan), 카뮤스틴(carmustin), 로뮤스틴(lomustine), 세뮤스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin), 티오테파(thiotepa), 다카바진(dacarbazine), 메토트렉산염(methotrexate), 티오구아닌(thioguanine), 메르캅토퓨린(mercaptopurine), 플루다라빈(fludarabine), 펜타스타틴(pentastatin), 클라드리빈(cladribin), 시타라빈(cytarabine), 플루오로우라실(fluorouracil), 독소루비신 히드로클로라이드(doxorubicin hydrochloride), 다우노루비신(daunorubicin), 이다루비신(idarubicin), 블레오마이신 황산염(bleomycin sulfate), 미토마이신 C(mitomycin C), 악티노마이신 D(actinomycin D), 사프라신(safracins), 사프라마이신(saframycins), 퀴오카르신(quinocarcins), 디스코더몰리드(discodermolides), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 빈오렐빈 타르트르산염(vinorelbine tartrate), 에토포시드(etoposide), 에토포시드 인산염(etoposide phosphate), 테니포시드(teniposide), 파클리탁셀(paclitaxel), 타목시펜(tamoxifen), 에스트라뮤스틴(estramustine), 에스트라뮤스틴 인산염 나트륨(estramustine phosphate sodium), 플루타미드(flutamide), 부세세린(buserelin), 류프롤리드(leuprolide), 프테리딘(pteridines), 디인(diyneses), 레바미솔(levamisole), 아플라콘(aflacon), 인터페론(interferon), 인터루킨(interleukins), 알데스루킨(aldesleukin), 필그라스팀(filgrastim), 사크라모스팀(sargramostim), 리툭시맵(rituximab), BCG, 트레티노인(tretinoin), 이리노테칸 염산(irinotecan hydrochloride), 베타메토손(betamethosone), 젬시타빈 염산(gemcitabine hydrochloride), 알트레트아민(altretamine), 및 토포테가(topoteca) 및 상기의 임의의 유사체 또는 유도체를 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
이러한 분류의 바람직한 구성원은 파클리탁셀, 시스플라틴, 카보플라틴, 독소루비신, 카미노마이신(carminomycin), 다우노루비신, 아미노프테린(aminopterin), 메토트렉산염, 메토프테린(methopterin), 미토마이신 C, 엑테이나시딘 743, 또는 프로피로마이신(pofiromycin), 5-플루오로우라신, 6-메르캅토퓨린, 젬시타빈, 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 포도필로톡신 또는 에토포시드와 같은 포도필로톡신 유도체, 에토포시드 인산염 또는 테니포시드, 멜팔란, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 류로시딘(leurosidine), 빈데신(vindesine) 및 류로신을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
카르고 화합물로서 유용한 항암제 및 다른 세포독성제의 예는: 독일특허 제4138042.8호에서 발견되는 에포틸론 유도체; WO 97/19086, WO 98/22461, WO 98/25929, WO 98/38192, WO 99/01124, WO 99/02224, WO 99/02514, WO 99/03848, WO 99/07692, WO 99/27890, WO 99/28324, WO 99/43653, WO 99/54330, WO 99/54318, WO 99/54319, WO 99/65913, WO 99/67252, WO 99/67253 및 WO 00/00485; WO 99/24416에서 발견되는 사이클린의존성 키나아제 억제인자(또한, 미국특허 제6,040,321호 참조); 및 WO 97/30992 및 WO 98/54966에서 발견되는 프레닐-단백질 트랜스퍼라아제 억제제; 및 미국특허 제6,011,029호에서 일반적으로 및 구체적으로 개시되는 물질(상기 미국특허의 화합물은 임의의 NHR 조절제(예를 들어, AR 조절제, ER 조절제를 포함하지만 이에 국한되지 않음)와 함께, LHRH 조절제와 함께 또는 외과적거세 특히 암의 치료에 있어서 함께 이용될 수 있다)를 포함한다.
본 발명의 화합물과 함께 카르고 화합물로서 이용되는 상기 다른 치료제는 예를 들어, 의사용 탁상 편람(PDR)에 표시된 양이 사용되거나, 표시가 되어있지 않으면 당해 기술자에 의해 결정된다.
큐프레독신 진입 도메인을 함유, 포함 또는 이로 구성되는 약학 조성물 뿐만 아니라 카르고 화합물에 연결된 큐프레독신 진입 도메인 착물을 함유하는 약학 조성물은, 임의의 종래의 방식으로 제조될 수 있으며, 상기 종래 방식의 예는 평범한 혼합, 용해, 입화, 드라제-생산(dragee-making), 유체화, 캡슐화, 포집화 또는 동결건조 과정이 있다. 상기 착물은 당해 분야에서 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 손쉽게 혼합될 수 있다. 이러한 담체는 조제용 물질이 정제, 환약, 드라제, 캡슐, 액체, 젤, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 정제되는 것을 가능하게 한다. 또한, 적합한 부형제는 예를 들어, 필러 및 셀룰로오스 조제용 물질을 포함한다. 다른 부형제는 예를 들어, 방향제, 착색제, 점착 감소제(detackifier), 증점제 및 다른 허용가능한 첨가제, 보조제 또는 결착제를 포함할 수 있다.
이러한 조성물은 예를 들어, 세포형의 검출 또는 촬상에 사용되거나, 세포사와 관련된 상태를 치료 또는 이의 예방에 사용될 수 있다. 상기 조성물은 세포사에 대한 저항과 관련된 상태를 예방하거나 치료하는데에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 상기 용어 "세포사에 대한 저항과 관련된 상태"은 합당한 전문의 또는 임상의에 의해 결정되는 유형과 유사한 건강한 세포와 비교할 때, 적어도 장기적인 세포 수명으로 특징지어지는 질병, 상태, 또는 질환을 나타낸다. 일반적으로, 숙주 생물체는 인간 또는 동물과 같은 포유류이다.
큐프레독신 진입 도메인을 함유하는 조성물은 임의의 적합한 경로, 예를 들어, 경구, 구강, 흡입, 설하, 직장, 질(vaginal), 경요도, 비강, 국소, 피부를 통한, 즉 경피성 또는 비경구(정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 관상동맥 내 투여)에 의해 투여될 수 있다. 상기 조성물 및 이의 약학 제제는 의도되는 목적을 달성하도록 임의의 유효량으로 투여될 수 있다. 세포사에 대한 저항과 관련된 상태를 치료하기 위해 투여되는 경우, 상기 조성물은 치료적 유효량으로 투여된다. "치료적 유효량"은 치료되는 대상의 발달을 막기 위한 유효량, 또는 치료되는 대상에 존재하는 증상을 완화하기 위한 유효량이다. 치료적 유효량의 결정은 당해 분야의 기술자의 능력으로 충분하다.
물론, 적절한 투여량은 예를 들어, 이용되는 큐프레독신 진입 도메인을 함유하는 화합물, 숙주, 투여의 방법 및 치료되는 상태의 성격 및 가혹함에 따라 달라질 것이다. 반면에, 본 발명의 방법의 일 실시예에서, 인간에서 만족스러운 치료 결과는 몸무게에 대해 상기 큐프레독신 진입 도메인을 함유하는 화합물을 약 0.001 내지 약 20 mg/kg의 일일 투여량에서 얻어진다고 표시된다. 일 실시예에서, 인간의 치료를 위해 표시된 일일 투여량은, 투여되는 상기 큐프레독신 진입 도메인을 함유하는 화합물의 약 0.7 mg 내지 약 1400 mg일 수 있으며, 이는 예를 들어, 일일 투여량, 1주 투여량, 1월 투여량, 및/또는 지속적인 투여량으로 편리하게 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루에 1 내지 12 번으로 나뉘어 별개의 투여량으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 투여량은 격일, 3일 마다, 4일 마다, 5일 마다, 6일 마다, 매주 및 31일이 되는 날 까지 이와 유사하게 투여될 수 있다. 투여량은 정제, 패치, 정맥 내 투여 등을 포함하는 임의의 해당되는 투여 형태를 사용하는 지속적, 간헐적 또는 단일 투여량일 수 있다. 더 구체적으로, 상기 조성물은 치료적 유효량으로 투여된다. 특정 실시예에서, 상기 치료적 유효량은 몸무게의 약 0.01 내지 20 mg/kg이다. 특정 실시예에서, 상기 투여량 수준은 약 10 mg/kg/day, 약 15 mg/kg/day, 약 20 mg/kg/day, 약 25 mg/kg/day, 약 30 mg/kg/day, 약 35 mg/kg/day, 약 40 mg/kg/day, 약 45 mg/kg/day 또는 약 50 mg/kg/day이다.
일 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인을 함유하는 화합물을 환자에게 주입하는 방법은 암을 치료하는 것으로 알려진 다른 약물과 함께 공동 투여하는 것이다. 이러한 방법은 당해 분야에서 잘 알려진 것이다. 특정 실시예에서, 상기 큐프레독신 진입 도메인을 함유하는 화합물은 혼합제의 일부이거나, 공동 투여량에 함유되거나, 암을 치료하기 위한 다른 약물과 함께 공동 투여된다. 예를 들어, 이러한 약물은 본 명세서에 열거되는 것들을 포함하고, 특히 5-플루오로우라실; 인터페론 α; 메토트렉산염; 타목시펜; 및 빈그린스틴을 포함한다. 상기 예는 오직 실례 목적으로 제공되는 것이며, 많은 다른 이러한 화합물은 당해 분야의 기술자에게 알려져 있다.
큐프레독신 진입 도메인을 암호화하는 핵산 분자 또는 진입 도메인 및 카르고 화합물 중 어느 하나를 혼합하는 융합 단백질은, 벡터 안으로 삽입되어 유전자 치료 백터로서 사용될 수 있다. 유전자 치료 백터는 예를 들어, 정맥 내 주사, 국소 투여에 의해 대상에 전달될 수 있거나(Nabel 등., 미국특허 제5,328,470호 1994. USA), 입체공간적 주사(stereotactic injection)에 의해 대상에 전달될 수 있다(Chen 등, Proc Natl Acad Sci USA, vol. 91, pp 3054-57 (1994)). 상기 유전자 치료 백터의 약학적 제조는 허용가능한 희석제를 포함할 수 있거나, 상기 유전자 치료 비히클이 고착되는 지효성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전한 유전자 전달 백터가 재조합 세포로부터 온전하게 예를 들어, 레트로바이러스의 백터가 생산되는 경우, 상기 약학적 제조는 유전자 전달 시스템을 만들어 내는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
일 앙태에서, 상기 착물이 체내에서 생성되도록, 상기 조성물은 DNA로서 전달된다. 일부 실시예에서, 상기 DNA는, 예를 들어, Ulmer 등., Science 259:1745-49 (1993) 및 Cohen, Scinece 259:1691-92 (1993)에서 개시되듯이, "네이키드(naked)" 이다. 네이키드 DNA의 활용은, 세포 안으로 효과적으로 수송되는 담체 예를 들어, 생분해성 비드(bead) 상에 DNA를 코팅함으로써 증가 될 수 있다. 이러한 방법에서, 상기 DNA는 핵산 발현 시스템, 박테리아 및 바이러스 발현 시스템을 포함하여 당해 통상의 기술자에게 알려진 임의의 다양한 전달 시스템 내에 존재할 수 있다. 이러한 발현 시스템 안으로 DNA를 포함하는 기술은 당해 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다(참조예, WO90/11092, WO93/24640, WO 93/17706, 및 미국특허 제5,736,524호).
생물체에서 생물체로 유전자 물질을 실어 나르기 위해 사용되는 백터는 두개의 일반적인 분류로 나누어질 수 있다. 클론벡터는 적절한 숙주 세포의 증식에 필수적이지 않은 영역을 갖고, 그곳에 외래 DNA를 삽입할 수 있는 복제 플라스미드 또는 파지(phage)이다. 발현백터(예, 플라스미드, 효모, 또는 동물 바이러스 게놈)는 조성물의 DNA와 같은 위부 DNA를 전사하고 번역하기 위하여 숙주 세포 또는 조직 안으로 외래 유전자 물질을 도입하기 위하여 사용된다. 발현백터에서, 상기 도입된 DNA는 상기 삽입된 DNA를 전사하도록 상기 숙주세포에 신호를 보내는 프로모터와 같은 요소에 실시 가능하게 연결된다. 일부 프로모터는 예를 들어, 특정 인자에 반응하여 유전자 전사를 통제하는 유래성 프로모터에 특히 유용하다. 조성물 폴리뉴클레오티드를 유도성 프로모터에 실시 가능하게 연결함으로써 야생성 아주린 진입 도메인 조성물 폴리펩타이드 또는 야생성 아주린 진입 도메인 조각의 발현을 통제할 수 있다. 전형적인 유래성 프로모터의 예는 α-인터페론, 열충격, 중금속 이온, 및 글루코코르티코이드(Kaufman, Methods Enzymol. 185 :487-511 (1990)) 및 테트라시클린과 같은 스테로이드에 반응하는 것들을 포함한다. 다른 바람직한 유래성 프로모터는, 세포에 구조체가 도입되었지만 유래 물질이 외래로부터 공급되는 경우에 이러한 세포 내에서 반응하는 세포에 내생 하지 않는 것들을 포함한다. 일반적으로, 유용한 발현백터는 종종 플라스미드이다. 반면에, 바이러스성 백터와 같은 발현백터의 다른 형태(예, 복제 결함 리트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)가 고려된다.
백터 선택은 사용되는 생물체 또는 세포에 의해 좌우된다. 일반적으로, 백터는 신호서열, 복제 원점, 표지 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종료 서열을 포함한다.
큐프레독신 진입 도메인-카르고 화합물 복합체를 포함하는 키트
또 다른 양태에서, 본 발명은 상자 또는 용기에 하기를 하나 이상으로 함유하는 키트를 제공한다. (1) p18 또는 p28과 같은 큐프레독신 진입 도메인을 독자적으로 포함하거나, 카르고 화합물에 연결된 시약; (2) 약학적으로 허용가능한 보강제 또는 부형제를 함유하는 시약; (3) 주사기와 같은 투여를 위한 비히클; (4) 투여를 위한 설명. 구성요소 (1) 내지 (4) 중 두 개 이상이 동일한 용기에서 발견되는 것이, 실시예에서 또한 고려된다.
큐프레독신 , 큐프레독신 진입 도메인, 큐프레독신 진입 도메인-카르고 화합물 복합체, 또는 이의 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 포함하는 약학 조성물
큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 약학 조성물은 통상적인 방식, 예를 들어 통상적인, 혼합, 용해, 과립화, 드라제-제조, 유화, 캡슐화, 포획 또는 냉동건조 공정에 의해 제조될 수 있다. 실질적인 순수 또는 약제 급의 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 당해 분야에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 쉽게 혼합될 수 있다. 이러한 담체는 제제를 정제, 알약, 드라제, 캡슐, 액상, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제조할 수 있게 한다. 또한 적합한 담체 또는 부형제는 예를 들어 충진제 및 셀룰로오즈 제제를 포함할 수 있다. 다른 부형제로는 예를 들어 향미제, 착색제, 비점착제(detackifier), 증점제 및 다른 허용가능한 첨가제, 보조제 또는 결합제 등이 있다. 일부 실시예에서, 약학적 제제는 적어도 1종의 방부제를 함유할 수 있다. 약학적 투여 형태에 관한 일반적 방법론은 Ansel 등., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(Lippencott Williams & Wilkins, Baltimore MD (1999))에서 찾을 수 있다.
본 발명에 사용되는 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물은 주사(예를 들어, 진피내, 피하, 근육, 복강주사 등), 흡입, 국소 투여, 좌약, 경피 패치 사용, 또는 입을 포함하여 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 약물 전달 시스템에 관한 일반적인 정보는 Ansel 등., id에서 찾을 수 있다. 일부 실시예에서, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물은 여러가지 중에 피하 및 정맥 주사용 주사가능 물질로서 직접 사용될 수 있다. 특히, 주사가능 조성물은 화학적 예방 요법에 적합한 환자를 치료하는데 유리하게 사용될 수 있다. 또한 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 조성물은 폴리프로필렌 글리콜과 같은 보호제 또는 유사 코팅제와 혼합된 후에 경구로 투여될 수 있다.
주사에 의해 투여되는 경우, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 특히 생리학적으로 호환성 완충액, 예를 들어 행크액(Hanks solution), 링거액 또는 생리 식염수 완충액의 수용액으로 조성될 수 있다. 이 용액은 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 조성제를 함유할 수 있다. 이와 다르게, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 분말 형태로 제조되어, 사용전에 적합한 운반체, 예를 들어 살균한 피로겐-비함유 물과 함께 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 약학 조성물은 펩타이드에 의해 모방되는 면역 반응을 향상시키기 위해 첨가되는 보조제 또는 기타 다른 물질을 함유하지 않는다. 일부 실시예에서, 약학 조성물은 펩타이드에 대한 면역 반응을 억제하는 물질을 함유한다.
정맥 내 수액에 의해 투여되는 경우, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 투여에 사용되는 정맥 수액 은 결정질(crystalloid) 또는 콜로이드로 구성될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 결정질은 무기질 염 또는 다른 수용성 분자의 수용액이다. 본 명세서에서 사용되는 콜로이드는 젤라틴과 같은 큰 불용성 분자를 포함한다. 정맥 수액은 무균성일 수 있다.
정맥 내 투여에 사용될 수 있는 결정질 수액에는 노말 식염수(0.9% 농도의 염화나트륨 용액), 링거 락테이트 또는 링거액, 및 D5W로도 불리는 5% 덱스트로즈 수용액 등이 있으며, 표 2에 기재되어 있다. 표 2는 통상적인 결정질 용액의 조성을 보여준다.
용액 별칭 [Na+] [Cl-] [글루코즈]
D5W 5% 덱스트로즈 0 0 252
2/3 & 1/3 3.3% 덱스트로스
/0.3% 식염수		 51 51 168
반-노말 식염수 0.45% NaCl 77 77 0
노말 식염수 0.9% NaCl 154 154 0
링거 락테이트 링거액 130 109 0
* 링거 락테이트는 또한 28mmol/L 락테이트, 4mmol/L K+ 및 3mmol/L Ca2 +를 함유한다.
흡입에 의해 투여되는 경우, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 적합한 분사제, 예를 들어 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 이산화탄소 또는 기타 다른 적합한 가스의 사용과 함께 가압형 팩 또는 분무기로부터 나오는 에어로졸 형태로 전달될 수 있다. 가압형 에어로졸의 경우, 투여 단위는 계량된 양을 전달하기 위해 밸브를 제공함으로써 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위해서, 단백질 분말 혼합물과 적합한 분말(예를 들어, 락토오즈 또는 전분)을 함유하는 캡슐 및 카트리지, 예를 들어 젤라틴을 제조할 수 있다.
국소 투여에 의해 투여되는 경우, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 당해 분야에 잘 알려진 바와 같이, 용액, 겔, 연고, 크림, 젤리 타입, 현탁액 등으로 제조될 수 있다. 일부 실시예에서, 투여는 경피 패치에 의해 가능하다. 좌약(예를 들어, 직장 또는 질)에 의해 투여되는 경우, 큐프레독신 또는 그 변이체 및 유도체 조성물은 통상적인 좌약 베이스를 함유하는 조성물로 제조될 수도 있다.
경구 투여되는 경우, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 당해 분야에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 혼합시킴으로써 용이하게 제조될 수 있다. 만니콜, 락토오즈, 스테아르산 마그네슘 들과 같은 고상 담체가 사용될 수 있으며, 이러한 담체는 치료받는 대상에 의해 경구 섭취되도록, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체, 절단부 또는 구조적 등가물을 정제, 알약, 드라제, 캡슐, 액상, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로 제조할 수 있게 한다. 예를 들어 분말, 캡슐 및 정제와 같은 경구용 고상 제제의 경우, 적합한 부형제는 충진제, 예를 들어 당류, 셀룰로오즈 제제, 과립화제 및 결합제를 포함한다.
당해 분야에 잘 알려진 바와 같이, 기타 다른 통상적 담체는 또한 다가 담체는 박테리아 협막 다당체(capsular polysaccharide), 덱스트란 또는 유전자 조작 벡터와 같은 다가 담체를 또한 포함할 수 있다. 또한, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 서방형 제제(sustained-release formulation)는 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물이 연장된 시간에 걸쳐 방출될 수 있도록 한다. 이 서방형 제제가 없다면, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 치료 효과를 유발하거나 향상시키기 전에 섭취자의 시스템으로부터 처리되거나 및/또는 예를 들어 프로테아제 및 단순 가수분해에 의해 분해될 것이다.
본 발명의 펩타이드의 혈류 속 반감기는 당해 분야에 잘 알려진 다수의 방법에 의해 연장 또는 최적화될 수 있다. 본 발명의 펩타이드 변이체은 안정성, 특이적 활성, 혈류내에서의 수명을 증가시키고 및/또는 큐프레독신의 면역원성(immunogenicity)을 감소시키면서, 펩타이드가 포유류 세포, 조직 및 동물의 전암성 병소의 발생을 억제하는 능력을 보유할 수 있는 다양한 변이체를 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 변이체은 상기 펩타이드의 가수분해를 감소시키거나, 펩타이드의 탈아미드화를 감소시키거나, 산화를 감소시키거나, 면역원성을 감소시키거나, 펩타이드의 구조적 안정성을 증가시키거나, 펩타이드의 크기를 증가시키는 물질이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 펩타이드는 또한 환형화 펩타이드(Monk 등., BioDrugs 19(4): 261-78 (2005); DeFreest 등., J.Pept. Res. 63(5): 409-19 (2004) 참조), D,L-펩타이드(부분 입체이성질체)(Futaki 등., J.Bio.Chem. Feb 23; 276(8): 5836-40 (2001); Papo 등., Cancer Res. 64(16): 5779-86 (2004); Miller 등., Biochem. Pharmacol. 36(1): 169-76 (1987)); 비통상적 아미노산을 함유하는 펩타이드(Lee 등., J.Pept. Res. 63(2): 69-84 (2004) 참조), N- 및 C-말단 변형체(labrie 등., Clin. Invest. Med. 13(5): 275-8 (1990) 참조), 탄화수소 스테이플링(Schafmeiser 등., J.Am. Chem. Soc. 122: 5891-5892 (2000), Walenski 등., Science 305:1466-1470 (2004) 참조); 및 PEG화(PEGylation)을 포함할 수 있다.
다양한 실시예에서, 약학 조성물은 담체 및 부형제(완충액, 탄수화물, 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 글리신과 같은 아미노산, 산화예방제, 세균발육 저지제, 킬레이트화제, 현탁제, 증점제 및/또는 방부제), 물, 오일, 식염수, 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액, 생리학적 조건에 근접하기 위해 필요한 기타 다른 약학적으로 허용가능한 보조 물질, 예를 들어 완충제, 강장 조절제, 습윤제 등을 함유한다. 본 발명의 조성물을 투여하기 위해서 당해 분야의 일반 숙련자에게 알려져 있는 어떠한 적합한 담체를 사용할 수 있으나, 담체의 유형은 투여 방식에 따라 달라질 것이라는 점을 인식해야 할 것이다. 또한 화합물은 잘 알려진 기법에 의해 리포좀 내에 캡슐화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 위한 담체로서 생분해가능한 마이크로스피어(microsphere)를 사용할 수 있다. 적합한 생분해가능한 마이크로스피어는 예를 들어 미국특허 제4,897,263호; 제5,075,109호; 제5,928,647호; 제5,811,128호; 제5,820,883호; 제5,853,763호; 제5,814,334호; 및 제5,942,252호에 개시되어 있다.
약학 조성물은 잘 알려진 통상적인 살균 기법에 의해 살균처리되거나 살균 여과될 수 있다. 이렇게 하여 생성된 용액은 사용을 위해 그대로 포장하거나 또는 동결건조시킨다. 동결건조된 제제는 투여 전에 무균 용액과 혼합한다.
큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 투여
큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물, 예를 들어 p18 또는 p28은 약학 조성물로서 조성되어 투여될 수 있으며,어떠한 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 경구, 흡입, 직장, 질, 경피, 비강, 국소, 즉, 경피 또는 비경구(정맥내, 근육내, 피하 및 관상내) 또는 유리성 투여에 의해 투여될 수 있다. 약학 조성물은 의도하는 목적을 달성하기에 유효한 양으로 투여될 수 잇다. 특히 본 조성물은 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 특정 실시예에서, 치료적 유효량은 일반적으로 체중 1kg 당 약 0.01 ~ 20mg/day이다.
큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 암을 예방하기 위해 단독으로 또는 다른 활성 물질 및/또는 카르고 화합물과 함께 사용될 수 있다. 물론 적합한 투여량은 예를 들어, 사용되는 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 화합물, 숙주, 투여 방식, 및 잠재성 암의 성질 및 심한 증세에 따라 달라질 것이다. 그러나, 일반적으로 인간에 있어서 1일 투여량이 체중 1kg 당 1일에 약 0.01 ~ 20mg일 때 만족할 만한 결과를 얻을 수 있는 것으로 제시된다. 제시된 인간에 있어서 1일 투여량은 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 화합물 약 0.7mg 내지 140mg의 양으로, 예를 들어 1일 투여량, 1주 투여량, 1개월 투여량 및/또는 지속적 투여량으로 편리하게 투여될 수 있다. 1일 투여량은 하루 당 1회 내지 12회 나누어서 투여될 수 있다. 이와는 달리, 2일마다, 3일마다, 4일마다, 5일마다, 6일마다, 1주마다, 및 같은 방식으로 하루씩 증가시키면서 31일 또는 그 이상마다 투여할 수 있다. 이와는 달리, 패치, 정맥 투여 등에 의해 연속적으로 투여할 수도 있다.
정밀한 조성, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 주치의에 의해 결정된다. 투여량 및 투여 간격은 치료 효과를 유지하기에 충분한 카르고 화합물을 갖거나 갖지 않는 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물의 혈장 함량을 제공하기 위해서 개별적으로 조정될 수 있다. 일반적으로, 바람직한 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물과 하나 이상의 다른 화학적 방어제는 의도하는 투여 경로 및 표준 약학적 기준을 고려하여 선택된 약학적 담체와 혼합하여 투여된다.
한 양태에서, 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 폴리펩타이드가 그 자리에서 생성되도록 DNA로서 전달된다. 한 실시예에서, DNA는 예를 들어, Ulmer 등.,(Science 259: 1745-1749 (1993))에 기재되어 있으며, Cohen(Science 259: 1691-1692 (1993))에 의해 재검토된 "네이키드(naked)" DNA이다. 네이키드 DNA의 흡수는 DNA를 후에 세포 내로 효율적으로 수송될 수 있는 담체(생분해가능한 비드) 상에 코팅시킴으로써 증가될 수 있다. 이러한 방법에서는, 핵산 발현 시스템, 박테리아 및 바이러스 발현 시스템을 포함하여 당해 분야의 일반 숙련자에 알려져 있는 어떠한 다양한 전달 시스템 내에서도 DNA가 존재할 수 있다. 이러한 발현 시스템 내로 DNA를 혼입시키는 기술은 당해 분야의 일반 숙련자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, WO90/11092, WO93/24640, WO93/17706 및 미국특허 제 5,736,524 호 참조.
유전물질을 생물체에서 생물체로 이동시키는데 사용되는 벡터는 두가지 종류로 분류될 수 있다. 클로닝 벡터는 적합한 숙주 세포 내에서의 증식에 필수적인 부위를 가진 복제 플라스미드 또는 파지이며 숙주 세포내에 외래 DNA를 삽입시킬 수 있다. 이 외래 DNA는 벡터의 한 성분인 것처럼 복제 및 증식된다. 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드, 효모 또는 동물 바이러스 게놈)는 큐프레독신의 DNA와 같은 외래 DNA를 전사 및 번역하기 위해서 숙주 세포 또는 조직내에 외래 유전물질을 도입하는데 사용된다. 발현 벡터에서, 이 도입된 DNA는 삽입된 DNA를 고도로 전사하기 위해서 숙주 세포에 신호를 보내는 프로모터와 같은 구성요소에 작동가능하게 연결된다(operably-linked). 특이적 인자에 대한 유전자 전사를 조절하는 유래성 프로모터와 같은 일부 프로모터는 특히 유용하다. 큐프레독신 또는 그 변이체 및 유도체 폴리뉴클레오티드를 유래성 프로모터에 작동가능하게 연결함으로써 특이적 인자에 대한 큐프레독신 또는 그 변이체 및 유도체의 발현을 조절할 수 있다. 전형적인 유래성 프로모터의 예는 α- 인터페론, 열 충격, 중금속 이온, 글루코코르티코이드(Kaufman, Methods Enzymol. 185:487-511 (1990)) 및 테트라시클린과 같은 스테로이드에 반응성이 있는 물질이다. 또 다른 바람직한 유래성 프로모터는 콘스트럭트(construct)가 도입되고 있는 세포내에서 내생적이지 않지만, 유도물질이 외생적으로 공급되면 상기 세포내에서 반응성이 있는 물질을 포함한다. 일반적으로, 유용한 발현 벡터는 플라스미드이다. 그러나, 바이러스 벡터(예를 들어, 복제-결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 종류의 발현 벡터도 고려될 수 있다. 부가적으로, 일 실시예에서 포함되는 본 발명의 상기 펩타이드, p18은 암 세포 또는 종양 안으로 치료적 화합물을 선택적으로 전달하기위한 백터로서 사용될 수 있다.
벡터 선택은 사용되는 생물체 또는 세포 및 원하는 벡터 운명에 의해 결정된다. 일반적으로, 벡터는 신호 서열, 복제 원류(oriGln), 마커 유전자, 폴리링커 부위, 향상제 구성요소, 프로모터 및 전사 종료 서열을 함유한다.
큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 포함하는 키트
한 특징으로서, 본 발명은 패키지 또는 용기 속에 하나 이상의 다음과 같은 요소를 포함하는 키트 또는 치료 방식을 제공한다. (1) 하나 이상의 큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물을 함유하는 약리학적 활성 조성물, (2) 부가적인 화학적 방어 약물, 및 (3) 예를 들어 주사기, 네블라이저 등과 같이, 생물학적 활성 조성물을 환자에 투여하기 위한 장치
키트가 공급되는 경우, 조성물의 다른 성분은 필요에 따라 별도의 용기에 패키징되고 사용 전에 혼합될 수 있다. 이러한 별도의 성분 패키징은 활성 성분의 기능을 손실하지 않고 장기간 저장할 수 있게 한다.
키트에 포함되는 시약은 다른 성분의 수명을 보존하고 용기 원료에 의해 흡착되거나 변경되지 않는 어떠한 종류의 용기 내에 내포될 수 있다. 예를 들어 밀봉된 유리 앰플(ampoule)은 동결건조된 큐프레독신 및 그 변이체, 유도체 및 구조적 등가물, 또는 질소와 같은 중성 비반응성 기체하에 패키징된 완충액을 내포한다. 앰플은 유리, 유기 중합체, 예를 들어 폴리카보네이트, 폴리스티렌 등, 세라믹, 금속 또는 유사 시약을 보유하는데 전형적으로 사용되는 기타 다른 물질과 같은 어떠한 적합한 물질로도 구성될 수 있다. 적합한 용기의 다른 예를 들면, 앰플과 유사한 재료로부터 제조될 수 있는 간이 병, 및 알루미늄이나 합금과 같이 호일-계열 내부를 가질 수 있는 봉투 등이 있다. 또 다른 용기로는 시험관, 물약병, 플라스크, 병, 주사기 등이 있다. 용기는 피하 주사바늘에 의해 뚫어질 수 있는 스토퍼를 구비한 병과 같은 무균 억세스 포트(access port) 형태를 가질 수 있다. 또 다른 용기는 용이하게 제거될 수 있는 막에 의해 두 부분으로 분리되어 있는 형태로서 막을 제거하면 성분이 혼합될 수 있다. 제거가능한 막은 유리, 플라스틱, 고무 등이 될 수 있다.
키트에는 또한 사용설명서가 제공된다. 사용설명서는 종이 또는 다른 재료상에 인쇄될 수 있으며, 플로피 디스크, CD-ROM, DVD-ROM, Zip 디스크, 비디오테이프, 오디오테이프, 플래쉬 메모리 장치 등과 같은 전자-판독가능한 매체로서 공급될 수 있다. 상세한 정보는 키트와 물리적으로 연관되지 않을 수도 있지만, 그 대신, 사용자는 키트 제조자 또는 보급자에 의해 명시되어 있는 인터넷 웹 사이트에서 접할 수 있으며, 전자 우편으로 제공받을 수 있다.
큐프레독신 , 큐프레독신 진입 도메인 및 그 변이체, 유도체 및 구조적 등가물의 수정
큐프레독신 또는 그 변이체, 유도체 또는 구조적 등가물은 상술한 바와 같은 변이체 및 유도체를 제조하기 위해 화학적으로 수정되거나 유전학적으로 변이될 수 있다. 이러한 변이체 및 유도체는 표준 기법에 의해 합성될 수 있다. 큐프레독신 진입 도메인은 유사하게 변형될 수 있다.
큐프레독신의 자연발생적 대립형질 변이체 외에도, 전암성 병소의 발생을 억제하는 큐프레독신의 능력을 사실상 변경시키지 않고 암호화된 큐프레독신의 아미노산 서열의 변경을 유발하는 큐프레독신 암호화 서열로의 돌연변이에 의해 변화가 이루어질 수 있다. "불필수" 아미노산 잔기는 약리학적 활성을 변화시키지 않으면서 큐프레독신의 야생형 서열로부터 변경될 수 있는 잔기이고, "필수 아미노산 잔기는 이러한 약리학적 활성에 필요한 잔기이다. 예를 들어, 큐프레독신 중에 보존되는 아미노산 잔기는 특히 변경될 수 없는 것으로 추측되며, 따라서 "필수"이다.
폴리펩타이드의 약리학적 활성을 변경시키지 않는 보존성 치환체로서 가능한 아미노산은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 유용한 보존성 치환체는 표 3에 "바람직한 치환체"로서 기재되어 있다. 한 종류의 아미노산이 같은 종류의 다른 아미노산으로 대체되는 보존성 치환은 치환이 화합물의 약리학적 활성을 기본적으로 변경시키지 않는 한도 내에서 본 발명의 범위에 속한다. 표 3은 바람직한 치환체를 보여준다.
원 잔기 치환체 예 바람직한 치환체
Ala(A) Val, Leu, Ile Val
Arg(R) Lys,Gln, Asn Lys
Asn(N) Gln, His, Lys, Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro, Ala Ala
His(H) Asn, Gln, Lys, Arg Arg
Ile(I) Leu, Val, Met, Ala, Phe, 노르류신 Leu
Leu(L) 노르류신, Ile , Val, Met, Ala, Phe Ile
Lys(K) Arg, Gln, Asn Arg
Met(M) Leu, Phe, Ile Leu
Phe(F) Leu, Val, Ile , Ala, Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr, Phe Tyr
Tyr(Y) Trp, Phe, Thr, Ser Phe
Val(V) Ile, Leu, Met, Phe, Ala, 노르류신 Leu
(1)β-시트 또는 α-나선 구조와 같은 폴리펩타이드 백본의 구조, (2) 전하, (3) 소수성, 또는 (4) 표적 부위의 측쇄의 크기에 영향을 미치는 비보존성 치환체는 약리학적 활성을 변화시킨다. 일반적인 측쇄 특성을 기초로 하여 잔기를 분류하였으며, 이는 표 4에 기재되어 있다. 비보존성 치환은 분류된 종류 중 하나가 다른 종류로 교체되는 것을 의미한다. 치환체는 보존성 치환 부위에 도입될 수도 있고, 특히 비보존성 부위에 도입될 수도 있다. 하기 표 4는 아미노산 종류를 보여준다.
분류 아미노산
소수성 노르루이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile
중성 친수성 Cys, Ser, Thr
산성 Asp, Glu
염기성 Asn, Gln, His, Lys, Arg
쇄 구조를 방해함 Gly, Pro
방향족성 Trp, Tyr, Phe
변이체 폴리펩타이드는 올리고뉴클레오티드-매개(부위-지정) 돌연변이 유발, 알라닌 스캐닝 및 PCR 돌연변이 유발과 같은 당해 분야에 알려진 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 큐프레독신 변이체 DNA를 제조하기 위해서, 부위-지정 돌연변이 유발(Carter , Biochem J. 237: 1-7 (1986); Zoller and Smith, Methods Enzymol. 154: 329-350 (1987)), 카세트 돌연변이 유발, 제한효소 선택 돌연변이유발(Wells 등., Gene 34: 315-323 (1985)), 또는 다른 공지된 기법이 복제 DNA를 이용하여 수행될 수 있다.
또한 공지된 큐프레독신의 돌연변이를 이용하여 본 발명의 방법에 사용되는 변이체 큐프레독신을 제조할 수 있다. 예를 들어, 아주린의 C112D 및 M44KM64E 돌연변이체변이체변이체과는 다른 세포독성 및 증식 억제 활성(growth arresting activity)을 가지는 것으로 알려져 있으며, 이러한 변화된 활성은 본 발명의 치료 방법에 효과적일 수 있다.
본 발명의 보다 완전한 이해는 후술하는 특정 실시예를 참조함으로써 이루어질 수 있다. 본 실시예는 단지 설명을 하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 상황에 따라 편의를 위해 형태 변화 및 등가물의 대체가 고려될 수 있다. 본 명세서에서 특정 용어들이 사용되나, 이러한 용어들은 설명을 위한 것으로서 제한을 두기 위한 것은 아니다. 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않는 한도 내에서, 앞서 기술한 바와 같이 본 발명에 수정 및 변경을 가할 수 있다.
실시예 1. MMOC 모델에서 DMBA 에 의해 유도된 유방 병소들에 대한 펩타이드 p28의 효과
마우스 유선 기관 모델은 DMBA에 대한 반응으로 일어나는 유선 세포 병소(MAL) 또는 분비선 병소(MDL)의 발달에 대한 사용 가능성을 지닌 화학적 방어제의 효험을 실험하는 것을 허용한다. 적절한 배양 조건 내의 DMBA 처리는 배지 내에서 호르몬적 조건을 바탕으로 하여 MAL 또는 MDL을 형성한다. Hawthorne 등, Pharmaceutical Biology 40: 70-74(2002); Mehta 등, J. Natl. Cancer Inst. 93: 1103-1106(2001). 배지 내에서 에스트로겐과 프로게스테론으로 처리된 분비선들에서는 분비선 병소들이 발달하며, 알도스테론과 하이드로코르티손으로 처리된 분비선들은 에스트로겐과 프로게스테론 비의존성 폐포 병소들을 형성한다. 발암 물질 또는 화학적 방어제에 노출되지 않은 유선들은 성장 촉진 호르몬들의 부재 조건 하에 구조적 퇴화가 일어나며, 3일째 내지 4일째 사이에 24시간 동안 DMBA로 처리된 경우에는 호르몬 감퇴에 의한 구조적 퇴화가 예방된다. 그 이유는 추측컨대 분비선들이 정상적 호르몬 반응성을 손실하였고, 그들의 발달 과정에 변형이 일어났기 때문이다. 동질유전자적 마우스에 변형된 세포을 이식함으로 유선암종을 형성하는 것은 이러한 억제되지 않은 영역들의 전암성의 종양전 특성을 증명하였다.
유선의 흉부 부분이 각각의 Balb/c 마우스들로부터 무균적으로 제거되었으며, 절제된 분비선들은 몇몇 군으로 나뉘어졌다. p28의 효과들은 배지 내에서 4 종류의 다른 희석도에서 분석되었다. 실험된 시약 없이 발암물질로 처리된 분비선들은 화학적 방어제의 부재 시에 일어나는 발생률 퍼센트를 결정하기 위한 척도로 사용되었다. 추가적인 대조군이 화학적 예방을 위한 양성 대조군으로 사용되기 위해 포함되었다. 아주린은 50μl/ml의 농도로 배지에 포함되었다. 유선 세포 병소 (MAL)로 오염된 분비선들은 병소의 발생률(주어진 처리 군에서 총 분비선의 개수 대비 병소를 포함하는 모든 분비선)을 측정하기 위해 검사되었다. 분비선 병소들 (MDL)에서도 비슷한 실험 과정이 도입되었지만, 아래에서 언급된 것처럼 그 방법들은 폐포와 분비선 병소들에서는 호르몬적 조합이 다르게 사용되었다. 분비선들은 포르말린에 고정되었고, 이후 조직병리학적 검사를 위해 가공되었다. 각 조각들은 에오신과 헤마토셀린으로 염색되었으며, 현미경으로 검사되었다. 대조군과 처리군 사이에 존재하는 분비선 병소들의 다중성이 비교되었다.
기관 배양 과정. 연구를 위해 사용된 실험적 동물들은 3~4주의 연령인, 어리고 임신하지 않은 BALB/c 암컷 마우스였으며, Charles River, Wilmington, MA에서 획득하였다. 마우스들은 9일 동안 1㎍ 에스트라디올-17β + 1mg 프로게스테론을 매일 피하 내 주사로 처리되었다. 이 처리는 스테로이드로 전처리 되지 않은 동물들은 시험관 내 조건에서 호르몬들에 반응하지 않기 때문에, 필수적인 과정이다. 모든 배양 과정은 자세하게 기술되어 있다. Jang 등, Science 275:218-220 (1997); Mehta, Eu. J. Cancer 36:1275-1282 (2000); Mehta 등, J. Natl. Cancer Inst. 89:212-219(1997); Mehta 등, J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001).
요약하면, 동물들은 경추 탈골로 죽였으며, 유선의 흉부 부위를 절제한 뒤 견사 위에 올려, 무혈청 Waymouth MB752/1 배지(5 분비선(glands)/5ml/접시)에서 10일 동안 배양되었다. 유선 세포 병소를 유도하기 위한 실험 과정으로서, 1 ml의 배지 당 글루타민, 항생제(페니실린 및 스트렙토마이신 100 유닛/ml 배지)와 성장 촉진 호르몬들, 5㎍ 인슐린(I), 5㎍ 프로락틴(P), 1㎍ 알도스테론(A) 및 1㎍ 하이드로코르티손(H)이 첨가되었다. 분비선 병소들의 유도를 위해서, 배지는 5㎍/ml, 5㎍/ml P, 0.001㎍/ml 에스트라다이올 17β 및 1㎍/ml 프로게스트론(Pg)를 포함했다. Mehta 등, J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001). 발암물질인 DMBA (2㎍/ml)가 3일과 4일 사이에 배지로 첨가되었다. 본 연구를 위해, DMBA는 DMSO에 최종 농도 4 mg/ml로 용해되었고, 50 μg I가 100 ml 배지에 최종 농도 2 μg/ml로서 첨가되었다. 대조군 접시들은 DMSO를 수송체로 지녔다.
4일째, 분비선들을 신선한 배지로 씻은 뒤 DMBA를 포함하고 있지 않은 신선한 배지로만 차 있는 새로운 접시로 옮기는 과정을 통해 DMBA가 배지로부터 제거되었다. 10일 동안 배양한 뒤, 분비선들은 I 만을 포함하는(5㎍/ml) 배지에서 14일 동안 추가로 유지되었다. 전체 배양기간 동안, 분비선들은 95% O2 및 5% CO2 상태에서 37℃ 조건으로 유지되었다. 화학적 방어제는 성장 촉진 시기 중 첫 열흘 동안 배지에 포함되었다. 실험 펩타이드인 p28은 12.5㎍/ml 내지 100㎍/ml의 범위의 4 종류의 농도에서 실험되었다. 아주린은 배지 내에서 50㎍/ml의 조건으로 실험되었다. 펩타이드는 멸균수에 용해되었으며 사용 이전에 여과되었다. 배지는 일주일에 세 번 교환되었다(월요일, 수요일 및 금요일). 노출의 마지막 시기에, 분비선들은 포르말린에 고정되었다.
유선 세포 병소의 형태학적 분석. 유선 병소 세포의 검사를 위해, 분비선들은 명반 카르민에 염색되었으며, 병소의 존재를 검사했다. 유방 병소의 존재 또는 부재, 분비선 당 존재하는 병소들의 심각성, 그리고 약제의 유독성이 각각의 분비선들에 대해 기록되었다. 자일렌에 보관된 분비선들은 해부 현미경을 사용하여 각 분비선들에 대한 유방 병소의 존재 또는 부재, 발병률, 그리고 심각성이 검사되었다. 유선들은 유방 병소에 대하여 양성 또는 음성으로 기록되었으며, 발병률은 그 군에 존재하는 분비선들의 총 개수 대비 병소를 나타내는 분비선들의 비율로 결정되었다. 분비선들의 확장 또는 화학적 방어제의 처리로 인한 유방 구조의 붕괴는 유독성 효과로 고려되었다. 사용 가능성을 지니는 화학적 방어제의 효과성을 결정하기 위한 발생률을 위해 자료에 대한 통계적 분석이 이루어졌다.
도 1a는 DMBA로 처리된 분비선들에 존재하는 폐포 병소들과, 화학적 방어제와 DMBA가 함께 처리된 분비선들과의 비교와 관련한 대표적인 사진을 보인다. 폐포 병소의 발달에 대한 p28의 효과들은 도 1b 내지 1f에 보여져 있으며 도 2에 요약되어 있다. 25 ㎍/ml 농도에서 펩타이드 p28은 MAL 형성을 67% 억제했다. 100㎍/ml까지 농도를 증가시킨 것은 펩타이드의 효과를 향상시키지 않았다. 아주린과 펩타이드를 비교했을 때, p28이 아주린 만큼이나 MAL 발달에 효과가 있다는 결론이 나타났다. 50㎍/ml 농도의 아주린은 67% 억제를 보였다. 통계학적 분석에 의하면 DMBA 대조군과 비교했을 때 p28의 효과는 12.5㎍/ml보다 큰 농도에서 통계학적으로 유의미하다는 것을 나타냈다. (p< 0.01, 피셔의 정확 검정; 카이 자승 검정).
MDL 의 조직병리학적 검사. MDL을 검사하기 위해, 분비선들은 조직병리학적 검사들을 위해 가공되었다. 분비선들은 5-미크론 길이의 조각들로, 세로로 절개되었으며 에오신 헤마토젤린으로 염색되었다. 각 분비선의 세로로 잘린 조각들은 몇 개의 영역으로 나뉘어졌으며, 각 영역은 분비선 병소의 여부를 판단하기 위해 검사되었다. Mehta et ah, J. Natl. Cancer Inst. 93:1103-1106 (2001). 간략하게, 모든 분비선이 현미경으로 검사되었다; 보다 작은 분비선들은 보다 큰 분비선들과 비교했을 때 더 적은 개수의 전체 영역들을 가질 것이다. 그러므로 각 분비선들은 변동하는 영역 개수를 가질 것이다. 종종 분비선들에 발견되는 조각들의 개수 또한 각 분비선들마다 크게 다를 것이다. 이것은 각 군들마다 다양한 변동으로 이어진다. 분비선의 과다 형성 또는 이형성을 포함하는 영역들이 결정되었으며, 각 분비선들의 총 영역 개수들과 비교되었다. 심각하게 폐색되거나, 과다 형성 또는 이형성을 띤 분비선들 사이에는 별다른 차이를 두지 않았다. 이러한 조직학적 패턴들 중 하나라도 포함하는 모든 영역들은 병소에 대한 양성으로 간주되었다. 처리군들의 심각성을 대조군들과 비교했으며, 억제율이 계산되었다.
도 3은 대표적인 분비선 병소를 보인다. DMBA는 과다 형성, 이형성에서 분비선들의 완전한 폐색까지 아우르는 다양한 분비선 병소들을 유도한다. 분비선 병소 대 분비선 조각들의 총 개수의 비율이 결정되었다. 다시 한 번, 12.5㎍/ml 농도의 p28은 MDL 형성의 15%만을 억제했다. 하지만, 25㎍/ml에서는 50 μg/ml 아주린에서 관찰된 것과 비교가 가능할 만큼의 유의미한 병소 억제가 나타났다. 12.5㎍/ml보다 높은 농도에서 p28의 효과는 통계적으로 유의미했다(p<0.01, 피셔의 정확 검정). 이러한 결과들은 도 4에 요약되어 있다. 종종 화학적 방어제들의 효과들은 MAL과 MDL에서 각각 다르게 나타난다. 예를 들어 타목시펜은 MDL의 발달을 억제했지만 MAL은 억제하지 않았다. 흥미로운 사실은 바로 아주린과 p28이 에스트로겐과 프로게스테론 의존성 분비선 병소들 모두를 억제하였고, 에스트로겐과 프로게스테론 비의존성 폐포 병소들 또한 억제했다는 것이다.
이 실시예는 바로 p28과 아주린 모두가 유방 조직들에서 전암 상태의 병소들의 발달을 억제할 수 있다는 것이다. 그러므로 p28과 아주린은 포유류 환자들에서 화학적 방어제로 사용될 수 있을 것이다.
실시예 2. 유전자 전달
녹농류로부터 단리된 단백질 중 큐프린 계통의 구성원인 아주린은 암세포에 진입하고, 시험관 내에서 및 신체 내에서 p53-매개된 세포사멸을 유도한다. 양이온성 및 음이온성 큐프레독신 및 유전자 전달을 위한 잠재적인 백터로 유래된 펩타이드의 침투 선택성을 평가했다. 하기의 큐프레독신을 검사했다: 아주린(14 kDa, PI 5.7), 루스티시아닌(17 kDa, pI 8.0), 및 플라스토시아닌(11 kDa, pI 5.4). 상기 결과는 아주린이 가장 큰 선택적 침투를 가진다고 나타냈다.
아주린(azu)의 25 개의 아미노산(a.a.) 조각을 합성했고, 다양한 암 및 조직학적으로 일치하는 정상 세포 안으로의 침투에 대하여 평가했다. 공초점 현미경 및 유세포 분석기(FACS)는, Alexafluor 568(800da)로 라벨링된 18개의 아미노산(1.7 kDa, azu 50-67) 조각(p18)이 인간 흑색종 세포주(Mel-2, 7, 29), 유방 세포주(MCF-7), 난소 세포주(SK-OV3), 췌장 세포주(CAPAN-2), 교아 세포종 세포주(LN-229), 성상 세포종 세포주(CCF-STTG1), 전립선 세포주(LN-CAP) 및 신장 세포주(ACHN-CRL1611)를 선택적으로 침투했지만, 각각의 대조군에는 침투하지 않았다. LDH 방출 및 용혈 분석은 p18이 침투 도중에 암세포 막 구조를 파괴하지 않거나, 인간 적혈구의 용혈을 생산하지 않는다는 것을 보여주었으며, p18이 막 구조를 방해하지 않고 인간 암세포에 침투한다는 것을 시사한다. 세포 내재화의 특정 억제제(시토칼라신 D; 액틴중합의 억제, 택솔; 미소관 해중합(depolymerization)의 억제, 클로르프로마진(chlorpromazine); 클라트린-매개된 엔도시토시스의 억제, 아지드화 나트륨; 대사억제 또는 스타우로스포린(staurosporine); 세포 순환 억제)로 Mel-2 세포의 선처리는 p18의 침투에 무시해도 될 정도의 효과를 미친다. 반면에, 니스타틴(카베올레 형성 억제제) 및 브레펠딘 A(골지체 방해물질)와 함께 Mel-2 세포의 배양은 p18의 침투를 상당히 억제했으며, p18의 침투에 식균작용경로의 일부가 수반된다는 것을 시사한다. 이종 이식된 흑색종 암을 지니는 비흉선 마우스에서 적외선 염료(λem 800nm)로 라벨링된 p18의 촬상은 정상 장기 및 조직에 축적됨이 없이 초기 피하 종양 및 다른 장기 전이에서 선택적인 흡수를 명백히 증명한다. 따라서, 일 실시예에서 포함하는 본 발명의 펩타이드 p18은 유전자(또는 임의의 DNA/RNA 조각)치료를 위한 비-바이러스성 백터로서 상당한 활용을 가질 것으로 보인다.
실시예 3 - 플라스미드 구조
융합 글루타티온 S-트랜스퍼라아제(GSST)-절단된 야생성 아주린(azu) 유도체를 발현하는 플라스미드는 교정 DNA 폴리머라아제를 사용하는 폴리머라아제 연쇄반응에 의해 제조된다. 도 5는 다양한 절단된 야생성 아주린 구조의 개략적인 묘사를 보여준다. pGST-azu 36-128에 대하여, 증폭된 PCR 조각은 상업의 GST 발현 백터 pGEXSX(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855)의 BamH1 및 EcoR1 영역 안으로 주입되었다. 상기 조각은 주형 및 프라이머로서 pUC19-azu를 이용하여 증폭되었으며, 5'-CGGGATCC CCG GCA ACC TGC CGA AGA ACG TCA TGG GC-3' (서열번호: 78) 및 5'-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3' (서열번호: 79), 상기 서열에서 추추가적으로 주입된 BamHl 및 EcoRI 영역은 각각 밑줄그었다. azu 유전자의 카복실-말단 절단부는 QuickChange site-direct mutagenesis 키트(Stratagene, La Jolla, CA 92307)를 사용하여 종결코돈에 주입함으로써 점증적으로 수행되었다.
pGST-azu 36-50, pGST-azu 36-77 및 pGST-azu 36-89에 대하여, 종결 코돈은 Ser51, Ser78 및 Gly90 안으로 각각 주입되었다. pGST-azu 36-128을 지닌 플라스미드는 주형 DNA로서 사용되었다. 특정 부위 돌연변이 유도를 위한 올리고뉴클레오티드의 세개의 세트는 다음과 같다. pGST-azu 36-50에 대하여: 5'-GGC CAC AAC TGG GTA CTG TGA ACC GCC GCC GAC ATG CAG-3' (서열번호: 80), 및 5'-CTG CAT GTC GGC GGC GGT TCA CAG TAC CCA GTT GTG GCC-3' (서열번호: 81). pGST-azu 36-77에 대하여 5'-CCT GAA GCC CGA CGA CTG ACG TGT CAT CGC CCA CAC C-3' (서열번호: 82) 및 5'-GGT GTG GGC GAT GAC ACG TCA GTC GTC GGG CTT CAG G-3' (서열번호: 83). pGST-azu 36-89에 대하여: 5'-CCA AGC TGA TCG GCT CGT GAG AGAAGG ACT CGG TGA CC-3' (서열번호: 84), 및 5'-GGT CAC CGA GTC CTT CTC TCA CGA GCC GAT CAG CTT GG-3' (서열번호: 85). 상기 플라스미드 pGST-azu 50-77 및 pGST-azu 67- 77는 주형 DNA로서 pGST-azu 36-77를 사용하는 PCR에 의해 생성되었다.
증폭된 PCR 조각들, azu 50-77 및 azu 67-77는 정방향 프라이머 5'-CGGGATCC TGA GCA CCG CCG CCG ACA TGC AGG G-3' (서열번호: 86) 및 5'-CGGGATCC CCG GCC TGG ACA AGG ATT ACC TGA AGC CCG-3' (서열번호: 87)를 사용하여 얻어졌고, 상기 추가적으로 주입된 BamHI 영역은 믿줄로써 표시된다. 역방향 프라이머, 5'-CGGAATTC GCA TCA CTT CAG GGT CAG GG-3', 는 두 경우 모두에서 활용되었다(서열번호 88).
gst-azu 50-77을 지니는 플라스미드는 하기의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 Gly67에 종결 코돈을 주입함으로써 pGST-azu 50-66를 생성하기 위해 사용되었다: 5'-GAC GGC ATG GCT TCC TGA CTG GAC AAG GAT TAC C-3' (서열번호: 89), 및 5'-GGT AAT CCT TGT CCA GTC AGG AAG CCA TGC CGTC-3' (서열번호: 90). 또한, 녹색형광단백질을 암호화하는 녹색형광단백질 유전자(gfp)는 PCR에 의해 증폭되었다. 사용된 정방향 및 역방향 프라이머는 각각의 oligonuclotides의 5' 말단에 BamHl 및 EcoRI 영역을 함유하는 5'-CGGGATCC CCA TGG TGA GCA AGGGCG-3' (서열번호: 91) 및 5'-CGGAATTC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC G-3' (서열번호: 92)이다. PCR 증폭에 따른 PCR 조각은 pGST-GFP를 만들기 위하여 pGEXSX 백터 안으로 라이게이션 시켰다. gst-gfp-azu 50-77를 지니는 플라스미드 DNA의 제조를 위하여, 상기 azu 50-77 유전자는 주형 및 프라이머 5' - CCGCTCGAG CCT GAG CAC CGC CGC CATGCA GGG-3' (서열번호: 93) and 5' - TTTTCCTTTTGCGGCCGC TCA GTC GTC GGG CTT CAG GTA ATC C-3' (서열번호: 94)로서 pGST-azu 50-77로 PCR에 의해 증폭되었으며, 상기 주입된 Xho I 및 Not I 영역은 각각 밑줄그었다. 정제된 azu 50-77 조각은 Xho 1 및 Not 1 고유의 제한 효소 영역에서 pGST-GFP 안으로 주입되었다.
실시예 4 - 단백질의 정제
Wt-아주린 및 M44KM64E 돌연변이 아주린이 제조되었고, 문헌[Yamada, T. 등. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 101, pp. 4770-75 (2004)]에서의 설명처럼 정제되었고, 미국특허 출원번호 10/720,603로 출원계속중이며, 내용은 참조로써 포함된다. 간략하게, 상기 야생성 아주린 유전자는 문헌[Kukimoto 등, FEBS Lett, vol. 394, pp 87-90 (1996)]에 의해 개시되는 방법에 따른 PCR로 증폭되었다. PCR은 주형 DNA로써 녹농균 계통 PAOl로 부터의 게놈의 DNA를 사용하여 수행되었다.
Hindlll 및 Pstl로 절단된 상기 545 bp의 증폭된 DNA 조각은 pUC19의 상응하는 영역 안으로 삽입되었고, 그 결과 상기 아주린 유전자는 발현 플라스미드 pUC19-azuA를 수득하도록 lac 프로모터의 하류에 위치되었다. 대장균 JMl 09는 상기 아주린 유전자의 발현을 위한 숙주 계통으로서 사용되었다. 상기 재조합 대장균 계통은 50 μg/ml, 0.1 mM IPTG를 함유하는 2YT 배지에서 배양되었고; 아주린을 생산하도록 16 시간 동안 370 ℃에서 0.5 mM CuSO4로 배양되었다.
상기 M44KM64E 돌연변이 아주린의 제조를 위해서, 아주린 유전자의 위치선택적 돌연변이가 QuickChange site-directed mutagenesis 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하여 수행되었다. 돌연변이는 DNA 염기서열 결정에 의해 확인되었다.
플라스미드 DNA, 애시디티오바딜러스 페로옥시던스(Acidithiobadilus ferrooxidans)로부터의 큐프레독신 루스티시아닌을 암호화하는 rus 유전자를 지니는 pET9a는 Dr. Kazuhiko Sasaki, Central Research Institute of Electric Power Industry, Chiba, Japan로부터 얻었다.
루스티시아닌은 문헌[Sasaki, K., 등. Biosci. Biotechnol. Biochem., vol. 67, pp. 1039-47 (2003)]의 방법을 약간 변형한 방법을 사용하여 rus 유전자를 함유하는 대장균 BL21(DE3)으로부터 분리되었다. 간략히 말하면, 아세트산 완충액(pH 4.0) 및 CM-세파로오스(Sigma Chemicals, St. Louis, MO 63178)는 β-알라닌 완충액(pH 4.0) 및 TSK-겔 CM-650 컬럼(Tosoh Bioscience, LLC, Montgomeryville, PA 18936) 대신에 사용되었다. 두 개의 다른 정제된 큐프레독신, 포르미디움 라미노숨(Phormidium laminosum)으로부터의 플라스토시아닌 및 아크로모박터 시클로클라스테스(Achromobacter cycloclastes)로부터의 슈도아주린은 각각 Dr. Beatrix G. Schlarb-Ridley, University of Cambridge, UK 및 Dr. Christopher Dennison, University of Newcastle Upon Tyne, UK로부터 얻었다.
모든 재조함 GST-융합 유도체는 하기로 정제된다: 대장균 BL21 세포가 숙주 세포주로서 사용되었다. L 브로스(L broth)의 성장의 초기 로그 기(log phase)에서 0.4 mM IPTG로 유도한 후에, GST-융합 단백질은 클루타티온 세파로오스 4B 친화성 크로마토그래피 및 PBS를 갖는 세파덱스 75 겔-여과 컬럼(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ 08855)을 사용하여서 세포 추출물로부터 정제되었다. ALEXA FLOUR®로 라벨링 된(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR 97402) 정제된 단백질, 야생성 아주린 및 GST-유도체 또는 다른 큐프레독신은 제조사의 설명에 따라 분리되었다. 결합되지 않은 자유 형광성 화학물질은 겔-여과 컬럼에 의해 제거되었다.
실시예 5 - 세포 배양
J774 및 UISO-Mel-2 세포(Frederick Cancer Research and Development Center, Frederick, Maryland U.S.A.에서 판매됨)는 Yamada, T. 등, Infect. Immun. vol. 70, pp. 7054-62 (2002); Goto, M., 등, Mol. Microbiol, vol. 47, pp. 549-59 (2003); 및 Yamada, T., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 99, pp. 14098-103 (2002)에서 설명되는 것과 같이 배양되었고, 참조로써 이의 내용이 포함된다. 인간의 정상적인 섬유아세포(stock culture collection of the Department of Surgical Oncology, University of Illinois at Chicago (UIC), Chicago)는 2 mM L-글루타민, 0.1 mM MEM 필수 아미노산을 함유하는 Eagle's 염을 갖는 MEM에서 배양되었고, 10 %의 가열 비활성화한 소태아혈청, 100 Units/ml의 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신이 보충되었다. MCF-7 및 MOF-1OF 세포는 Punj 등, Oncogene 23:2367-78 (2004)에서 설명되는 것과 같이 배양되었다.
실시예 6 - J774 , UISO - Mel -2 및 섬유아세포의 공동 배양, 및 공초점 현미경
J774, UISO-Mel-2, 및 섬유아세포는 개개의 커버글라스 상에서 배양되었다. 하룻밤 동안 배양한 후에, 상기 세포는 깨끗한 배지를 사용하여 세척되었고, 모든 세 개의 세포주는 ALEXA FLUOR® 568로 포화된 야생성 아주린 200 μg/ml를 함유하는 배양 접시 상에 놓였다. 이후에, 상기 세포는 0.5 또는 3.5 시간 동안 37 ℃에서 5 % CO2하에서 배양되었다.
현미경 시료의 제조를 위하여, 세포는 커버글라스 상에서 37 ℃에서 배양되었다. 배양된 세포는 단백질 처리 이전에 37 ℃ 또는 4 ℃에서 2시간 동안 놓여졌다. 미리-데워진 37 ℃의 깨끗한 배지 또는 어름같이 찬 4 ℃의 깨끗한 배지는 붉은색 형광(ALEXA FLUOR®568로 라벨링됨)큐프레독신 또는 GST-융합 유도체와 혼합되었고, 및 세포와 함께 배양되었다. 상기 세포는 PBS로 세척되었고, -20 ℃에서 5 분 동안 메탄올로 고착되었다. PBS로 2회 세척한 후, 핵 염색을 위해서(VECTASHILD, Vector, Burlingame, CA) 1.5 μg/ml 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 함유하는 봉입제를 첨가하고, 공초점 현미경으로 사진을 찍었다.
실시예 7 - J774 세포로 큐프레독신의 진입
야생성 아주린, 이의 돌연변이 변이체 M44KM64E, 플라스토시아닌, 슈도아주린 및 루스티시아닌을 실시예 6에서와 같이 J774 세포와 함께 배양했고, 상기 세포를 공초점 현미경으로 검사했다. 이러한 실험에서, 상기 큐프레독신은 붉은색 형광을 나타내도록 ALEXA FLUOR®568로 포화되었고, 1 시간 동안 37 ℃에서 200 μg/ml 농도로 J774 세포와 함께 배양했고, 독립적인 실험으로 야생성 아주린 및 루스티시아닌을 1 시간 동안 37 ℃에서 6 내지 7 μM농도로 J774 세포와 함께 배양했다. 상기 핵을 DAPI를 사용하여 청색으로 염색했다. 단백질을 갖지 않는 대조군은 그대로 유지됐다. 모든 경우에서, 상기 큐프레독신은 J774 세포의 시토솔 안으로 진입하는 것으로 보여졌다. 유사한 실험에서, 아우라시아닌 A 및 B는 MCF7 암세포에 선택적으로 진입하고, 비-암성 대조군 세포에는 진입하지 않는다.
실시예 8 - 야생형 아주린 및 루스티시아닌의 다양한 세포 유형으로의 진입
야생형 아주린은, MCF-7 세포와 대조적으로, MCF-10F 세포에 대해 감소된 세포독성의 활성을 나타낸다. 문헌[Punj et al. Oncogene 23:2367-2378 (2004)] 참조. J774, 복막 대식세포, 비만 세포(mast cells), 인간 유방암 MCF-7 및 인간 정상 상피 MCF-10F 세포(시카고의 위치한 일리노이 주립대학 시카고의 외과 종양학과에서 수집)는 실시예 5에서와 같이 처치되고 조사되었고, 야생형 아주린이 그러한 세포들로 진입할 수 있는지 확인하기 위해 검사되었다.
야생형 아주린은 45분 배양 동안 J774 세포내에서 내재화되었다. 그러나, 복막 대식 세포 또는 비만 세포에서는 매우 비효율적으로 내재화되었다. 6시간 배양후에 조차, 그러한 세포들은 매우 제한적인 진입을 나타내었다. 유사하게, 야생형 아주린은 유방암 MCF-7 세포에 효율적으로 진입하면서, 정상 유방 MCF-10F 세포에 진입하는 속도는 매우 감소됨을 나타내었다.
ALEXA FLUOR®-컨쥬게이트된 아주린은 UISOMel-2 및 MCF-7 암 세포에는 효율적으로 진입했으나, 정상 유방 MCF 10A1 세포에는 그렇지 않았다. 그러나, Alexa fLuor®-컨쥬게이트된 루스티시아닌은 UISOMel-2 및 MCF-7 암 세포의 시토졸(cytosol)에 진입할 뿐만 아니라 정상 MCF 10A1 세포에도 진입했다. 루스티시아닌이 시토졸에 균일하게 분포되어 있는 암세포에서와 달리, MCF 10A1 세포에서는 대부분의 루스티시아닌은 핵을 둘러싸고 있는 핵 주변의 공간에 격리되어 있다.
실시예 9 - 야생형 아주린 - 매개된 세포독성 및 성장 저해
야생형 아주린이 다양한 세포로 진입하는 특이성을 추가로 측정하기 위하여, Alexa fluor-컨쥬게이트된 야생형 아주린이 J774, UISO-Mel-2 및 정상 섬유아세포로 진입을 37℃에서 30분 및 3.5시간 배양하는 동안 측정되었다. 야생형 아주린은 J774 및 UISO-Mel-2 세포에는 30분 이내에 빠르게 진입하는 것으로 보여졌고; 매우 적은 야생형 아주린이 이 기간 동안 섬유아세포의 시토졸에서 보여졌다. 3.5시간의 배양 후에, 야생형 아주린의 소량만이 섬유아세포에서 발견되었다.
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일-2,5 테트라졸륨 브로마이드)(MTT) 분석을, 문헌[ Yamada, T., et al . Infect . Immun. 70:7054-62 (2002)], [Goto, M., et al . MoI . Microbiol 47:549-59 (2003)], 미국 특허 출원 번호 10/720,603(2003. 11. 24.자 출원)에 기재된 바와 같이(상기 문헌들의 내용은 본원에 참조로 포함됨), 야생형 아주린의 세포독성을 측정하기 위해 수행하였다. 도 1b는, 24시간 배양 동안 J774 및 UISO-Mel-2 세포에서만 야생형 아주린-매개된 세포독성이 상당한 정도로 발견되었다는 것을 보여준다.
M44KM64E 돌연변이 아주린은 J774 세포에서 매우 적은 세포사멸-유도 활성을 나타내었으나, 1㎎/㎖ 농도에서는 G1에서 S기로의 세포 주기 진행을 상당히(약 95%) 저해하였다. 세포 주기 진행은 유세포 분석기로 분석하였으며, 이러한 분석법은 문헌[Hiraoka, Y. et al , Proc . Natl . Acad . Sci . USA, vol. 101:6427-32 (2004)] 및 [Yamada, T. et al . Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101 :4770-75 (2004)](상기 문헌들의 내용은 본원에 참조로 포함됨). 도 1a는 섬유아세포가 500㎍/㎖ 또는 1㎎/㎖의 M44KM64E 돌연변이 아주린으로 처리되었을 때, 세포 주기 진행의 저해 정도는 약 20%였다.
실시예 10 - 야생형 아주린을 섬유아세포 및 MCF -10F 세포로 미세주사( microinjection )
문헌[Punj, V., et al ., Oncogene 23:2367-78 (2004)]에 기재된 방법을 사용하여, 야생형 아주린을 섬유아세포 및 MCF-10F 세포로 미세주사하였다. 세포사멸 유도, 핵 DNA의 응축 및 단편화를 유도하는지에 대해, 세포들을 검사하였다. 야생형 아주린이 미세주사된 단일 세포들에서, 5시간 배양 후에 상당한 핵 DNA(DAPI로 파란색으로 표지)의 응축 및 단편화가 관찰되었으나, 30분 배양 후에는 그렇지 않았다.
실시예 11 - 37℃에서의 야생형 아주린 융합 유도체의 내재화
실시예 1에서와 같이, N-말단 및 C-말단에서 절단된(truncated) 야생형 아주린의 일련의 GST 융합체를 제조하고 정제하였다(도 2a 및 도 2b 참조). ALEXA FLUOR® 568 컨쥬게이트된 야생형 아주린, GST 및 GST-azu 융합 유도체를 사용하여, 1시간 배양 동안 37℃에서 J774 세포로의 내재화를 실시예 5에 기재된 방법으로 조사하였다. 핵은 DAPI로 파란색으로 염색하였다.
야생형 아주린이 내재화되었고, GST는 세포 주변에 그래도 남아 있고 내재화되지 않았다. GST-azu 36-128 및 GST-azu 36-89는 내재화되었고 GST-azu 36-77도 내재화되었다. 그러나, 추가적인 절단(truncations)은, GST-azu 50-77은 내재화되었으나 GST-azu 36-50은 매우 비효율적이었고 표면에 덩어리를 형성하는 것으로 보여주었다.
실시예 12 - 4℃에서의 야생형 아주린 융합 유도체의 내재화
4℃에서 배양된 J774 세포에서의 야생형 아주린 및 GST-azu 융합 유도체의 내재화를 조사하였다. 4℃에서, 1시간 배양 동안 J774 세포내에서의 야생형 아주린 내재화는 심각하게 악화되었다. 비슷한 악화는 또한 GST-azu 36-128 및 GST 36-89에서도 또한 보여졌다. 더 짧은 GST-azu 36-77, GST-azu 50-77, GST-azu 50-66 및 GST-azu 66-77은 4℃에서 내재화가 심각하게 악화되었음을 보여주었다.
실시예 13 - J774 및 흑색종 UISO - MeI -2 세포에서의 GST - GFP - azu 50-77 융합 단백질의 에너지 의존적인 내재화
GST는 GFP와 융합되어 GST-GFP 융합 유도체를 만들었다. 추가적으로, azu 50-77는 GST-GFP(Mr 53 kDa) 융합 단백질에 융합시켰다(도 6a 참조). 정제된 GST, GST-GFP 및 GST-GFP-azu 50-77 융합 유도체의 유동성은 SDS-PAGE에서 조사되었다(도 6b 참조). 검출은 쿠마시에 블루 염색 및 항-아주린 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅에 의해 수행되었다(도 6c).
GST-GFP의 다양한 농도로 처리한 J774 세포의 유세포 분석의 결과는 이 단백질은 J774 세포에 결합한다는 것을 보여주었다. GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질의 농도를 증가시키면서 처리한 J774의 유세포 분석기에서의 분리는 FST-GFP 단독인 경우에 비하여 상당히 감소된 형광성을 나타내었다(도 7). GFP의 포유류 세포에서의 내재화는 형광성의 감소를 나타내는 것으로 알려져 있다는 것을 알아야 한다. 이러한 형광성의 감소는 J774 세포가 200㎍/㎖의 GSP-GFP-azu 50-77 융합 단백질로 처리하고 37℃에서 시간을 증가시키면서 배양시키는 경우 또한 명백하다.
GST-GFP 및 GST-GFP-azu 50-77의 결합 및 내재화 프로필의 차이가 있는지 알아보기 위하여, 37℃ 및 4℃에서 J774 및 UISO-Mel-2 세포들을 GST-GFP 및 GST-GFP-azu 50-77와 함께 배양시켰다. 공초점 현미경을 사용하여 녹색 형광물질의 위치를 찾아내었다. J774 세포에서, GST-GFP 융합 단백질은 표면에 결합하였고, 37℃ 및 4℃ 모두에서 내재화되지 않았다. 이와 달리, GST-GFP-azu 50-77은 37℃에서 내재화되고 4℃에서는 내재화되지 않는 것으로 나타났다. UISO-Mel-2 세포에서, GST-GFP 융합 단백질은 37℃ 및 4℃ 모두에서 표면상에서 유지되었다. 이와 달리, J774 세포와 유사하게, GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질은 37℃에서 내재화되고 4℃에서는 내재화되지 않는 것으로 나타났다.
실시예 14 - 야생형 아주린이 세포막 침투 및 엔도시토시스 메카니즘에 의해세포막 유방 세포로 진입
야생형 아주린이 진입하는 것이 단지 수용체-매개된 엔도시토시스에만 의존한다면, 그것은 프로토노포어 카보닐 시아나이드 m-클로로프페닐하이드라존(CCCP), 에너지 생산의 미토콘드리아 언커플러(mitochondrial uncoupler), 또는 표지화되지 않은 아주린 또는 수용체를 차단하는 다른 큐프레독신으로 미리 배양시키는 것에 의해 차단될 수 있다. J774 및 UISO-Mel-2 세포들을 10배 잉여의 농도의 큐브레독신으로 2시간 동안 4℃에서 배양하였는데, 이 세포들을 완전히 세척하여 큐프레독신을 제거하였고, 그리고 ALEXA FLUOR® 568-컨쥬게이트된 아주린으로 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 큐프레독신으로 처리하지 않은 세포에서만큼 내재화된 아주린이 있었다. 사이토칼라신 D(St. Louis, Mo 63195에 위치한 시그마 알드리치에서 구입가능함)의 효과, 세포의 미세섬유망(microfilament network) 붕괴시키는 수용체-매개된 엔도시토시스의 공지된 억제제, 골지체를 붕괴하고 전통적인(classical) 소포-매개된 분비를 억제하는 것으로 공지된 브레펠딘 A(St. Louis, Mo 63195에 위치한 시그마 알드리치에서 구입가능함)의 효과를 또한 시험하였다. 20 pM 농도에서의 CCCP는 UIPO-Mel-2 세포에 아주린의 흡수를 상당히 감소시켰고, 0.25 내지 0.5pM의 사이토칼라신 D도 마찬가지였다. 한편, 브레펠딘 A는 의미있는 효과를 나타내지 않았다.
실시예 15 - GST - PEDIII - azu 50-77 융합 유도체의 UISO - Mel -2 세포로 진입
녹농균의 GST-융합체는 문헌[Hwang, J. et al , Cell 48:129-36 (1987)] 및 [Reiter, Y. 및 Pastan, L, Trends Biotechnol . 16:513-20 (1998)]에 기재된 바에 따라 만들어졌다. GST-PEDIII 융합 유도체는 외독소 A의 아미노산 381-613을 함유하였다. PEDIII는 ADP-리보실 트랜스퍼라아제 활성을 갖는 것으로 알려져 ㅇ이있고, 진핵 세포에서 진핵 연장 인자 2(eukaryotic elongation factor 2)를 억제함으로써 진핵 세포에서의 세포의 단백질 합성을 저해한다.
GST-GFP-azu 50-77에 대해 기재된 바와 같은 PCT을 사용하여, azu 50-77 서열을 GST-PEDIII 융합 단백질의 카복실 말단에 도입하였다(도 8a 참조). 이러한 두 개의 융합 단백질(GSTPEDIII 및 GST-PEDIII-azu 50-77)을 글루타티온-세파로즈 4B 컬럼 크로마토그래피로 52 kDa 및 54 kDa 단백질로 정제하였다(도 8b 참조). 그리고 나서, UISO-Mel-2 및 정상 섬유아세포(FBT) 세포들을 이 단백질들의 다양한 농도로 37℃에서 24시간 동안 배양시켰고, 실시예 9에 기재된 바와 같은 MTT 분석에 의해 세포 죽음의 정도를 측정하였다.
GST-PEDIII 는 낮은 세포독성만을 나타내었지만, GST-PEDIII-azu 50-77 융합 단백질은 UISO-Mel-2 세포로의 효율적인 진입으로 인하여 높은 세포독성을 가졌다(도 8c 참조). 이와 달리, 융합 단백질은 섬유아세포에 대한 세포독성은 낮은 수준을 나타내었다.
실시예 16 - 야생형 아주린의 α-나선구조의 불안정화는 UISO - Mel -2 세포에서의 내재화에 실질적인 효과를 가지지 못한다
α-나선구조가 아주린의 진입에 역할을 하는지 알아보기 위하여, 나선 구조를 불안정하게 하는 세 개의 프로린 잔기를 야생형 아주린의 위치 54, 61 및 70의 위치에 도입하였고(도 6 참조), 전체 길이 A54PT61PK70P 돌연변이 아주린의 진입을 시험하였다. 이 위치에서 단일(single) 및 이중(double) 돌연변이들을 또한 제작하여 진입을 테스트하였다. A54PT61PK70P 돌연변이 아주린은 아주린 유전자의 위치 지정 돌연변이(site-directed mutagenesis)에 의해 만들어지는데, 이러한 돌연변이는 QuickChange site-directed mutagenesis 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 사용하였다.
돌연변이들은 200㎍/㎖로 UISO-Mel-2 세포와 함께 1시간 동안 37℃에서 배양되었고, 배양한 후에 형광 물질의 위치를 공초점 현미경으로 알아냈다. 모든 경우에 있어서, ALEXA FLUOR® 568-컨쥬게이트된 돌연변이 아주린은 UISO-Mel-2 세포로 진입했다. 유사하게, GST-GFP-azu 50-77 융합 단백질, 그의 삼중(triple) A54PT61PK70P 돌연변이 변이체도 UISO-Mel-2 세포로 진입하는지를 조사했을 때, 의미있는 차이가 관찰되지 않았다.
실시예 17 - GST - PEDIII - 루스티시아닌 융합 유도체의 UISO - Mel -2 세포로 진입
녹농균 외독소 A 도메인 III(PEDIII)의 GST-융합체는 실시예 15에서처럼 제작되었다.
GST-GFP-azu 50-77에 대해 기재된 바와 같은 PCT을 사용하여, 전체 길이의 루스티시아닌 서열을 GST-PEDIII 융합 단백질의 카복실 말단에 도입하였다. 이 융합 단백질을 글루타티온-세파로즈 4B 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다. 그리고 나서, UISO-Mel-2 및 FBT 세포들을 이 융합 단백질의 다양한 농도로 37℃에서 24시간 동안 배양시켰고, 실시예 7에 기재된 바와 같은 MTT 분석에 의해 세포 죽음의 정도를 측정하였다.
GST-PEDIII-루스티시아닌 융합 단백질은 UISO-Mel-2 세포에 대해 높은 세포독성을 나타내었다(도 9 참조). 이와 달리, 그 융합 단백질은 FBT 세포에 대해 낮은 수준의 세포독성만을 나타내었다.
실시예 18 - 인간 세포주로의 p18 및 p28 의 진입
세포 배양 및 세포주: 인간의 암성 및 비암성 (불멸 및 비불멸) 세포주들은 ATCC [폐암(lung cancer) (A549 및 NCI-H23 선암종(adenocarcinoma)), 정상 폐(normal lung) (CCD-13Lu), 전립선암(prostate cancers) (DU145 및 LN-CAP), 정상 전립선(normal prostate) (CRLl 1611), 유방암(breast cancer) (MCF-7), 정상 유방(normal breast) (MCF-IOA), 대장암(colon cancer) (HCTl 16), 정상 대장(normal colon) (CCD33Co), 섬유육종(fibrosarcoma) (HTl 080), 및 난소암(ovarian cancer) (SK-OV3 선암종)]로부터 얻어졌다. 피부로부터 단리된 정상 섬유아세포를 설정했다. 정상 난소의 세포(HOSE6-3)은 Dr. S. W. Tsao(홍콩대학교)에 의해 기증되었다. 흑색종 주(UISO-Mel-2, 23, 29)를 설정했고 특정했다. 5 % CO2 또는 공기 내에서 10 %의 가열 비활성된 소태아혈청(Atlanta Biological Inc., Lawrenceville, GA), 100 units/ml의 페니실린 및 100 μg/ml의 스트렙토마이신이 37 ℃에서 보충되는 MEM-E(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 UISO-Mel-2를 제외한 모든 세포를 배양했다.
증식 분석( Proliferation assays )/세포 성장( Cell growth ): 흑색종 세포는 평저 24 웰 플레이트(flat bottom 24 well plates)(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 12x103 cells/well의 밀도로 시드(seed)되었다(4개의 동형). 24시간 후, 배지가 변경되었고, 새로운 p17, p28, 아주린 또는 펩타이드가 없는 유사량의 배지(8개의 동형)가 72시간 동안 매일 추가되었다. 이후, 세포은 Beckman 코울터(Coulter)(Z 1 코울터 입자 계수기(coulter particle counter))에서 카운트되었다. 값들은 4개의 동형들의 평균 ±SD를 나타낸다.
MITT 분석( MITT Assay ): 흑색종 세포는 평저 96 웰 플레이트(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 2000 cells/well의 밀도로 시드되었고, 24시간 동안 고정되었다. 이어서, 새로이 준비된 펩타이드(10㎕) 또는 배양 배지가 각각의 웰(well)에 추가되었다. 24시간 후, 배지가 변경되었고, p18, p28 또는 아주린이 매일 추가되었다. 72 시간 배양 후, 10㎕의 MTT 작용제(Trevigen, Gaithersburg, MD)가 각각의 웰에 추가되었고, 샘플이 3시간 동안 배양되었으며, RT/sig 100 ㎕의 세정제(detergent)가 각각의 웰에 추가되었고, 샘플이 37℃에서 추가로 3시간 동안 배양되었다. 흡광도(absorbance)가 SpectraMax 340 플레이트 리더(SpectraMax 340 plate reader) (Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)로 측정되었고, 치료된 대조군에 대해 상대적으로 치료된 세포에서 570㎚에서 흡광도의 퍼센트 변화가 결정되었다. 값들은 평균 ±SD를 나타낸다. 대조군과 치료군 사이의 중요성은 학생들의 t-검사에 의해 결정되었다.
펩타이드 합성: p18, Leu50-Gly67 LSTAADMQGVVTDGMASG (서열번호: 25), p28 Leu50-Asp77 LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD (서열번호: 2), p18b Val60-Asp77 VTDGMASGLDKDYLKPDD (서열번호: 38), MAP, 마스토파란(Mastoparan)-7, 및 폴리 알기닌(poly arGlnine) (Arg8, 서열번호: 82)을 포함하는 모든 아주린 유래 펩타이드는 C S Bio, Inc. (MeIo Park, CA)에 의해 합성되었다. 펩타이드는 동결 건조 분말 부분 표본(lyophilized powder aliquoted)으로 수용되었고, 밀폐 데시케이터(air-tight desiccators)에 -20℃로 저장되었다. 모든 펩타이드는 후속하여 질량 분석법(mass spectrometry) 및 역상 HPLC에 의해 >95% 순도 및 물질 밸런스(mass balance)로 분석되었다.
아주린 펩타이드에 대한 예측 모델링: GENETYX 소프트웨어(6.1 버전)는 아주린 유래 펩타이드에 대한 Robson 구조 모델을 생성하는 데 이용되었다. Gamier, J., Osguthorpe, D. J., Robson, B.의 J MoI Biol, 120: 97-120 (1978). MAPAS 소프트웨어는, 강한 막 접촉을 위해 주어진 단백질 구조를 예측하고 그러한 접촉을 형성할 가능성이 가장 큰 단백질 표면의 영역을 정의하는 데 이용되었다. Sharikov, Y. 등의 Nat Methods, 5: 119 (2008). 단백질, 즉 아주린이 MRS(membranephilic residue score) > 3, MAS(membranephilic area score) > 60%, 및 Kmphas(coefficient of membranephilic asymmetry) 2.5를 초과하여 갖는다면, 단백질이 참 막-접촉 영역(true membrane-contacting region)을 가질 확률이 높다.
펩타이드 /단백질 라벨링: 펩타이드는 Alexafluor 568 염료(Molecular Probes, Eugene, OR)와 1:2 단백질: 염료 비율로 혼합된 1 ㎖의 PBS에서 용해되었고, 100 ㎕의 중탄산나트륨(sodium bicarbonate)이 추가되었으며, 그 혼합물은 4℃에서 연속적으로 교반되면 하룻밤 동안 배양되었다. 라벨링된 펩타이드는 p12에 대해서 슬라이드-A-Lyzerg 투석 카세트 1000 MVCO (Slide-A-Lyzerg Dialysis Cassettes 1000 MWCO)를 사용하고 그 밖의 것들에 대해서 2000 MWCO(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 사용하여 냉각-PBS에 대해 투석함으로써 무염료(free dye)로부터 분리되었다.
세포 침투/ 공초점 분석( Cell penetrationfconfocal analysis ): 세포는 유리 커버글라스(glass coverslips) 상에 시드되었고, 5%의 CO2 하에 37℃에서 하룻밤동안 고착되었다. 세포는 새로운 배지로 세정되었고, Alexafluor 568 라벨링된 아주린 펩타이드(20 μM) 또는 Arg8(서열번호: 95) (5 μM))을 포함하는 예열된 배지 또는 단독 배지에서 2시간 동안 37℃에서 하룻밤동안 고착되었다. 배양에 이어서, 커버글라스는 PBS로 3회 세정되었고, 세포는 5분 동안 2.5% 포르말린으로 고정되었으며, PBS에서 2회, 탈이온수에서 1회 세척되었고, 핵 카운터 염색(nuclear counter staining)을 위해 커버글라스가 1.5㎍/㎖ DAPI를 포함하는 배지에 배접되었다(VECTASHIELD(R) Vector Laboratories, Burlingame CA). 세포 흡수(cellular uptake) 및 분포는 전화된 공초점 레이저 스캐닝 현미경('Model LC510, Carl Zeiss Inc., Gottingen, Germany) 하에서 촬영되었다.
리소좀(lysosomes) 또는 미토콘드리아와의 펩타이드 공동국지화(co-localization)는 Alexafluor 568 라벨링된 아주린 또는 펩타이드로 37 ℃에서 2시간 동안 유리 커버글라스 상에서 성장하는 세포를 배양함으로써 판정되었다. 미트로트래커(Mitrotracker) (MitroTracker(R) Green FM Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) 또는 리소트래커(lysotracker) (LysoTracker(R) Green DND-26 Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)가 마지막 30분의 배양 시간 동안 추가되었다(최종 농도 1 μM). 세포는 PBS로 3회 세정되었고, 5분 동안 2.5% 프로말린으로 고정되었으며, PBS로 2회 세척되었고, 15분 동안 PBS 중 0.1% Triton-X100에서 배양되었다. 이후, 세포는 1% BSA를 갖는 PBS에서 1 ㎍/㎖의 래빗 항-인간 골진 97(rabbit anti-human golGln 97) 또는 항-인간 카베올린 I(anti-human caveolin I) (Abeam, Cambridge, MA)로 배양되었다. 4 ℃에서 1시간 배양 후에, 커버글라스는 PBS로 1회 세척되었고, 산양 항-토끼 항체(goat anti-rabbit antibody)로 공액된 Alexafluor 468 을 함유하는 PBS에서 10 분 배양되고, PBS로 2회 세척되고, 탈이온수로 1회 세척되었다. 이후에, 커버글라스는 핵 카운터 염색을 위해 1.5 μg/ml의 DAPIfmf 함유하는 배지에 배적되었다. Alexaflour 568(적색) 및 Alexaflour 468(녹색)의 공동국지화가 분석되었고 촬영되었다.
커버글라스 상의 UISO-Mel-2 세포가 100 ㎍/㎖ 헤파린 황산(Sigma- Aldrich, St. Louis, MO)을 포함하는 MEM-E에서 30분 동안 사전배양되었고, p18, p28 또는 Arg8(서열번호: 95)는 최종 농도가 20μM이 되도록 추가되었다. 1시간 후, 커버글라스가 세척되었고, 고정되었으며, 전술한 바와 같이 분석되었다.
FFACS 에 의한 세포 투과( Cell penetration by FFACS ): 세포(1.0 x 106/500 μl PBS)가 Alexafluor 568 라벨링된 p18 또는 p28(20μM), Arg8(5μM)로 또는 배지 단독에서 37 ℃에서 2시간 동안 배양되었고, PBS에서 3회 세척되었으며, 5분 동안 2.5% 포르말린으로 고정되었고, PBS에서 2회 세척되었으며, 200μl PBS에서 재부유되었고, 단일 세포 현탁액(suspension)을 얻도록 스크린을 통과했다. 샘플은 MoFIo 세포 분별 장치(Cell Sorter) (Dako, Glostrup, Denmark) λex 568 ㎚ 및 λem 603㎚로 분석되었고, 바탕 수준(background levels) 이상의 평균 형광 강도의 배수 증가(fold increase)가 계산되었다. 결과는 3개의 개별 실험의 평균 형광성을 나타낸다.
유입 억제자( Entry inhibitors ): 37℃에서 페놀레드(phenol red)-, 무혈청(serum-free) MEM-E에서 보존되는 CUISO-Mel-2 세포 (300 ㎕ 당 3x105)는, 클로로프로마진(Chloropromazine)(클라트린-중재 엔도사이토시스(clathrin-mediatied endocytosis)의 억제자, 10 ㎍/㎖, 60 min); 아밀로라이드(Amiloride)(대음세포작용(macropinocytosis) 억제자, 50 μM, 30 min); 니스타틴(Nystatin)(50 ㎍/㎖, 30 min); 메틸-β-시클로덱스트린(MβCD, 5mM, 60 min); 필리핀(Filipin)(카베올라-중재 엔도사이토시스(caveolae-mediated endocytosis)의 억제자, 3 ㎍/㎖, 60 min); 택솔(미세소관 안정화제(microtubule stabilizer), 20 μM, 30 min); 스타우로스포린(Staurosporine)(세포 주기 억제자, 250 nM, 10 min); 아지드화 나트륨(물질대사 억제자, 1 mM, 60 min); 와베인(Oauabain)(ATPase-의존성 Na+/K+ 펌프 억제자, 50 mM, 60 min); 브레펠딘 A((Brefeldin A)(BFA; 골지체 분열물질(Golgi apparatus disruptor), 100μM, 60 min); 보르트만닌(Wortmannin)(초기 엔도솜(early endosome) 억제자, 100nM, 30 min); 모넨신(Monensin) (후기 엔도솜/리소좀을 억제함, 10 μM, 60 min); 노코다졸(Nocodazole)(카베오솜(caveosome) 형성을 억제함, 10 μM, 60 min); 사이토칼라신 D(액틴 필라멘트 및 미세소관 분열물질, 5 μM, 30 min); 벤질 2-아세타미도-2-데옥시-α-D-갈락토피라노시드(BnGalNac; O-링크된 글리코실화 억제자, 3 mM, 48 hrs); 튜니카마이신(Tunicamycin)(N-링크된 글리코실화 억제자, 20 ㎍/㎖, 48 hrs); 및 뉴라미니다아제(Neuraminidase)(단백질로부터 시알산(cleave sialic acid) 잔기를 쪼갬, IU/ml, 30 min)를 포함하는 억제자로 선처리되었다. 최종 농도는 개개의 억제자의 투여량 응답 곡선으로부터 유래되었다. 그 후, Alexafluor 568 라벨링된 p18 또는 p28(20μM)이 추가되었고, 1 시간 동안 배양되었으며, 세포는 전술한 바와 같이 세척되었고, 고정되었으며, 유세포 분석(flow cytometric analysis)을 위해 제조되었다.
세포막 독성 분석/ LDH 누출 분석( Cell Membrane Toxicity Assays / LDH Leakage Assay ): LDH 누출 분석은 100μl의 UISO-Mel-2 세포(5x103)로 제조자의 명령(CytoTox-One, Promega, WI)에 따라 수행되었다. 펩타이드/단백질을 포함하지 않는 세포가 음성 대조군으로서 사용되었다. 실험은 3회 실행되었다(데이터는 평균 ±SEM을 나타낸다).
용혈 분석( Hemolysis assay ): 인간의 전체 혈액 샘플(2-3 ㎖)은 1000xg에서 10분 동안 원심분리되었고, 펠릿은 PBS로 1회 및 HKR 버퍼 pH7.4(18)로 1회 세척되었다. 이어서 세포 펠릿은 HKR 버퍼에서 4% 적혈구(erythrocytes)로 재부유되었고, HRK 버퍼에서 950μl의 펩타이드, 아주린 (5, 50, 100μM) 또는 0.1% 트리톤(Triton) X-100을 갖는 1.5 ㎖ 관(tube)으로 50 ㎕가 이동되어, RBC 막을 완전히 파열시켰다. MAP 및 마스토파란 7(Mastoparan 7)(Bachem California, Inc., Torrance, CA)이 양성 대조군으로서 사용되었다. 37℃에서 30분 동안 회전시키며 배양한 후, 관은 1000xg에서 2분 동안 원심 분리되었고, 300 ㎕의 상청액이 96-웰 플레이트로 이동되었으며, 흡광도가 540 nm에서 측정되어 기록되었다.
유입의 동역학( Kinetics of Entry ): 1.5㎖ 관의 UISO-Mel-2 세포(5x105 세포)가 페놀레드 없이 MEME 배지에서 부유되었다. 반응은 얼음 상에서 5, 10, 15 및 20 sec 동안 0, 10, 20, 50, 100, 150 및 200 μM로 Alexa fluor 568로 공액된 p18을 추가하거나 30, 60, 90 및 120 sec 동안 1, 10, 25, 50, 100, 150 및 200 μM로 Alexafluor 568-공액된 p28을 추가함으로써 시작되었다. 배양 후, 1㎖의 냉각-PBS가 혼합물에서 250 ㎕ 반응물에 첨가되었다. 세포는 4℃에서 2분 동안 600xg에서 2회 원심 분리되었다. 적어도 10,000개의 고정 세포가 각각의 반응물 내의 유세포 분석에 의해 분석되고, 그들의 바탕 및 상대적인 형광성이 계산되었다.
아주린의 I 125 라벨링 및 경합 분석( I 125 Labeling of Azurin and Competition Assays): 펩타이드 결합 및 유입은 전체 세포 분석을 이용하여 HEPES 용액(50,000 cells/㎖)에서 UISO-Mel-2 세포로 판정되었고, 1000 배를 초과하는 라벨링되지 않은 p18, p28 또는 아주린의 존재/부재 시에 증가하는 농도(0-175nM)의 방사성 동위원소의 아주린으로 37℃에서 30분 동안 배양되었으며, 이어서 얼음처럼 냉각된 PBS로 3회 세척되었으며, 감마 카운터를 이용하여 카운트된 세포 펠릿에 방사성으로 남게 된다. I125 아주린 단독으로 배양된 세포 내의 방사능은 총 결합으로 간주되었고, 라벨링되지 않은 아주린, p18 또는 p28의 존재 시의 방사능은 비특정 결합으로 간주되었다. 특정 결합은 총 결합 및 생성된 스캐차드 플롯(Scatchard plots)으로부터 비특정 결합을 감하여 판정되었다.
실시예 19 - 암세포 내로의 선택적 유입에 책임을 지는 p28 의 도메인
펩타이드-GST 구조체로부터의 초기 데이터는 아미노산 50-77의 아주린을 세포 투과에 대한 PTD로서 정의하였는데, 이는 아주린 분자를 안정화시키는 아주린의 잔기 54-67을 포괄하는 α-나선 영역에 대한 구조적 증거와 잘 맞는다. 공초점 분석은, p28/아주린의 p28 및 p18(도 10a)이 상대적으로 유사한 효율을 갖는 인간 흑색종, 전립선, 폐, 유방, 및 방광 암세포를 투과했지만, 조직병리학적으로 일치하는 정상 세포주을 동일한 수준(도 10b)으로 투과하지 않았다는 것을 초기에 제안하였다. 특이한 예상은 CCD-13Lu, 폐 섬유아세포(fibroblasts)로부터 유래된 세포주이었다. 양이온(cationic) Arg8(서열번호: 82)은 신속하고 효율적으로 섬유아세포 내로 흡수되었고(도 11a), 그 밖의 모든 정상 세포주은 검사되었다(데이터는 도시되지 않음).
이러한 관찰은, 본질적으로, 폐암을 제외하면, p28 형광이 약 0.5-6이었고, p18이 대응하는 정상 세포주보다 더 높은 약 0.5-3 배였다는 더욱 민감한 FACs 분석(도 10b)에 의해 확인되었다. 세포 내 형광 강도에서의 유사한 패턴은, p18의 상대적 강도가 p28로 관찰된 것의 약 50%였던 조직병리학적 아류형(histopathologic subtype), 흑색종 내에서 관찰되었다(도 11c). 바탕을 넘어서는 형광 강도는, 더 적은 p18이 개별 세포에 진입했음을 제안하는 데 대비하여, p28보다는 p18에 노출된 정상적인 암세포 쌍에서 꾸준히 더 낮았다(데이터는 도시되지 않음). 모든 경우에 있어서, p18 및 p 28의 암 또는 정상 세포 내로의 진입 정도는, 유입에 대한 어떠한 우선순위도 관찰되지 않은 Arg8(서열번호: 95)로 관찰된 것보다 현저히 더 낮다(도 10a). p18의 예측된 Robson 구조(데이터는 도시되지 않음)는, C-말단 아미노산이 부분 β-시트를 형성하는 것을 시사한다. 이것과, p28의 친수성 C-말단으로부터 10개의 아미노산(아미노산 68-77)(서열번호: 40)이 부족한 p18의 더 짧은 길이는, 아주린에 대한 PTD로서 p18이 엔도사이토시스 이상의 비-엔도사이토시스 또는 막 수용체가 매개하는 과정을 통해 암세포 및 정상 세포 내로의 더욱 신속한 진입을 가진다는 것을 보여준다. MAPAS 데이터(MRS 3.74, MAS 87.1, Kmpha 2.37)는 아주린의 아미노산 69, 70, 75, 76, 85가 막 접촉에 최상의 기회를 제공하는 것을 보여주는데, 이는 p18 (아미노산 50-67)에 존재하지 않는 p28의 C-말단 영역이 세포 상태와 무관하게 세포막 상의 특정 잔기와 접촉할 가능성이 가장 높다는 것을 입증한다.
p18 및 p28에서 관찰된 선택적 투과는 동일한 세포주을 아주린 60-77(p18b) 또는 아미노산 66-77(p12), p28의 C-말단으로부터 12개의 아미노산(도 11a, b)에 노출시킴으로써 확인되었다. 여기서, p18 및 p28로 관찰된 선택적 투과는 완전히 파괴되었다. p18(이론적 pI 4.13)은 짧은 α-나선 및 부분 β-시트를 가지며, 극도로 친수성이어서 선택적 유입를 함께 인도할 수 있다. p12(이론적 pI 4.33)는 2차적 α-나선 구조가 부족하지만, 역시 친수성이어서, 전체 친수성이 세포 투과 선택도의 감소에 대한 주요 기여체가 될 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 20 - 세포 투과는 막 분열 결과가 아니다
아주린, p28 및 p18에 의한 세포 투과는 막 분열에 기인하지 않는다. 5-100 μM p28, p18 또는 아주린의 하에서 UISO-Mel-2 세포(도 12a)를 사용하는 LDH 유출 분석은, 혈장막 무결성(18)을 변경함으로써 펩타이드나 아주린 어느 것도 세포에 진입하지 않았다는 것을 시사하였다. 막 교란의 부족은, 수용체 의태 MAP(receptor mimetic MAP) 및 비만 세포 탈과립화 펩타이드 마스토파란 7(mastoparan 7)에 대항하는 인간 적혈구에서 아주린, p28 및 p18의 용혈 활성을 판정함으로써 확인되었는데, 이는 세포막을 양친매성 알파-나선으로 전이시키고, 이행 G 단백질(heterotrimeric G proteins)을 활성화시킨다. 마스토파란 7은 25μM에서 완전한 세포 용해를 야기하였고, 그 반면에 아주린, p28 및 p18은 대조군(페티드 없음)에 비해 어떠한 용혈 효과도 없었다(도 12b).
실시예 21 - p18 / p28 투과는 에너지 의존적이고 포화시킬 수 있다
UISO-Mel-2 세포 내로의 p28(도 13a) 및 p28(도 13b)의 투과는 온도 의존적이다. 세포 투과 및 세포내 수송은 4℃에서 3시간을 넘게 비교적 천천히 일어나는 반면에, 다양한 구획을 통과하는 진입 및 세포 내 수송은 p18 및 p28이 노출된 후 2시간 내에 UISO-Mel-2 세포의 세포핵에 존재하기 때문에 22℃ 및 37℃에서 신속하게 일어난다. 200배 초과의 라벨링되지 않은 펩타이드의 존재 하에서 30분 이후에 UISO-Mel-2 세포 내로 5μM의 p28(도 13c) 또는 p18(도 13d)의 투과는 심하게 단축되었으며, 이는 유입이 포화가능한 과정이었고, 특정 수용체 또는 세포면 단백질 또는 특정 잔기가 적어도 부분적으로 초기 유입에 책임이 있다는 것을 시사한다.
실시예 22 - p28 및 p18 의 동역학
인간 섬유아세포에 상대적인 UISO-Mel-2 세포 내로의 p28 및 p18 유입의 동역학은, 세포가 고정되고 평균 형광 강도(MFI)가 판정되었을 때 배양 후 계산되었다. 각 펩타이드의 Km 및 Vmax는 펩타이드 농도(μM) 대 속도(MFI/sec)를 구상하거나 스캐차드 분석에 의해 계산되었다. 암세포 및 정상 세포(각각, Vmax 2.88, Km 102.1 및 Vmax 1.89, Km 166.0) 내로의 아주린 조각 50-67 (pl8: Vmax 2.46, Km 101.6) 및 50-77 (p28: Vmax 1.87, Km 159.1)의 투과가 서로 현저히 다르더라도, p18이 -42% 더 빠르게 진입하고, 각 펩타이드의 정상 및 암세포 내로의 진입 속도는 가상적으로 동일하다. p18에 대해 상대적인 p28로의 암세포 노출에 이은 형광량의 증가는 악성 세포에 진입하는 p28의 양의 증가로 인한 것일 가능성이 있다. 125I 아주린 및 p18은 유사한 친화력으로 UISO-Mel-2 세포과 결합했다. 대조적으로, 현저하게 더 많은 p28(Kd 2.5μM, Bmax 3.0 pm)은, p18 (Kd 18 min, Bmax 0.51 pm) 또는 아주린 (Kd 10 nm 및 0.48 pm)보다 더 높은 온도(37℃ 대 4℃)에서 더 긴 시간 주기(20 min 대 2 min) 동안 노출될 때 더 높은 친화도로 UISO-Mel-2 세포에 결합했다. 이러한 결과는, 아주린, p28 및 p18 모두가 진입 이전에 비교적 높은 친화도 및 용량으로 암 및 정상 세포면 상의 부위에 결합하지만 2개 이상의 메커니즘을 통해 진입할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 23 - p18 / p28 투과는 카바올레 및 골지 합성물을 수반한다
분류로서, pTat 및 Arg8(서열번호: 95)과 같은 양이온 CPPs는, 엔도사이토시스 이전에 음이온 황화 프로테오글리칸(proteoglycans)과 초기에 결합함으로써 세포에 진입한다. 100 ㎍/㎖ 헤파린 황산(heparin sulfite: HS)의 존재/부재에서 무혈청 조건 하에서 UISO-Mel-2 와 함께 p28 및 p18과 Arg8(서열번호: 95)의 배양은 세포내 Arg8(서열번호: 95)의 양을 상당히 감소시키지만, p28 또는 p18 중 어느 것의 유입도 변경하지 않는다(도 14a). 시알산 잔기를 고착시키는 O-링크된 글리코실화(glycosylation), BnGalNac, 및 네루아미니다제(neruaminidase)의 특정 억제자의 존재 또는 부재 시에 UISO-Mel-2 세포 내로의 p18 및 p28의 투과는 더욱 특성화되었고(도 14b), 어떠한 투과 억제도 관찰되지 않았다. 그러나, N-링크된 글리코실화의 억제자인 튜니카마이신(tunicamycin)은 세포막 전체에서 p18 및 p28의 투과를 현저하게 감소시켰다.
UISO-MeI-2 세포 내로의 p18 및 p28의 진입도 에너지 의존적 수송 메커니즘, 즉 ATP 억제자를 이용하여 분석되었다. 아지드화 나트륨(도 14b) 및 와베인(ouabain)(Na+K+ ATPase 펌프)는 펩타이드의 투과를 현저하게 억제하지 않았는데, 이는 어떠한 엔도사이토시스 경로도 이러한 펩타이드의 투과에 수반되지 않을 수 있다는 것을 시사한다. 클라트린으로 매개된 엔도사이토시스의 특정 억제자인 클로르프로마진(Chlorpromazine: CPZ)은 투과에 대해 어떠한 효과도 없고, 대음세포작용 억제자 아밀로라이드(amiloride)도 그러하다(도 14b). 택솔을 갖는 미세소관의 안정화는 투과에 대해 어떠한 효과도 없지만, 사이토칼라신(Cytochalasin) D를 이용한 액틴 필라멘트 및 대음세포작용의 분열은 p18 및 p28의 투과의 작은(-20%) 재생가능한 억제를 생성하였다. 아밀로라이드의 효과의 부족은, 사이토칼라신 D의 억제 활동이 액틴 필라멘트에 대한 그것의 효과를 통한 것일 수 있다는 것을 시사한다.
스타우로스포린(staurosporine)을 이용한 세포 주기의 억제는 투과를 차단하지 않았고, 이는 투과가 세포주기 특정성이 아니었다는 것을 시사한다. 암세포 혈장 막의 p18 및 p28 투과에 대한 스타우로스포린의 효과의 부족은, Src 키나아제/티로신 키나아제 의존성 경로가 투과에 수반되지 않았고, 디나민(dynamin)에 독립적이었으며, 그에 따라 카베올라 출아(budding)에 독립적이었다는 것을 시사한다. p18 또는 p28 중 어느 것도, 플로틸린-1(데이터는 도시되지 않음), 혈장 막 내부 및 식균작용 매개자의 특정 개체군에 잔류하는 단백질과 함게 공동국지화하지 않아, 내면화에서 플로틸린 및 디나민에 대한 역할을 논의하였다. 대조적으로, 카베올라 수송 및 콜레스테롤 가동화(mobilization)의 억제자를 분열시키고, 그에 따라 카베올라-중재 엔도사이토시스를 분열시키는 노코다졸은 투과율 50-65%를 억제하였다.
이후, p18 및 p28의 세포내 배치는, 보르트만닌, 초기 엔도솜 형성의 억제자, 후기 엔도솜/리소좀을 억제하는 모넨신, 및 브레펠딘 A(BFA), 골지체 분열물질을 이용하여 분석되었다. 보르트만닌은 p18 또는 p28의 세포내 누적을 차단하지 않아, 콜레라 독성과는 달리, 초기 엔도솜 경로로의 카베올라가 p18 및 p28의 세포내 수송(trafficking)에 수반되지 않는다. p18 및 p28의 세포내 수송에서 조기 엔도솜 수반의 부족은 또한 클라트린 매개 엔도사이토시스가 이러한 펩타이드의 내면화에 수반되지 않는다는 것을 시사한다.
그러나, 모넨신(도 14b) 및 BFA는 p18(-10%)보다 p28(-30%)에 대한 더 큰 억제자 효과(도 14b)와 함께 양측의 펩타이드의 세포내 누적을 감소시켰다. 또한, 섬유아세포 내로의 p28 및 p18의 투과는 MβCD, 노코다졸, 모넨신 및 튜니카마이신에 의해 억제되었지만, 아밀로라이드, 아지드화 나트륨, 및 CPZ에 의해 억제되지는 않았다(도 14c). 이것은, 암 및 정상 세포 내로의 진입에 대한 적어도 하나의 메커니즘이 유사하지만, 암세포 내로의 추가적인 선택적 누적이 보통의 막 수용체 또는 구조, 즉 카베올라의 개수의 함수일 수 있다는 것을 보여준다(도 14d, 패널 1, 2). Alexafluor 568 라벨링된 p18 및 p28은 카베올린-1 및 golgin 97 항체와 공동국지화되었다(도 14d, 패널 1, 2). 이것은, 이러한 세포기관들이 p18 및 p28의 세포내 수송에 수반된다는 것을 확인한다. 흥미롭게도, p18이나 p28을 제외한 아주린은 미토콘드리아 특정 형광과 공동국지화되었다(도 14d, 패널 3). 대조적으로, p18을 제외한 p28 및 아주린은 리소좀과 공동국지화되었다(도 14d, 패널 4).
실시예 24 - p28 및 p18 의 기능적 분석
아주린은 시험관내 및 생체내의 여러 인간 암세포주의 성장을 억제한다. 도 15a 및 15b는 MTT 및 세포 카운트에 의해 판정된 바와 같이 UISO-Mel-2 세포에 대하여 아주린 및 디카바진(dacarbazine)(DTIC)에 상대적인 p18 및 p28의 효과를 도시한다. 72 시간 노출 후, 아주린은 100 및 200μM -15%에서 세포 생존율을 감소시켰다(p<0.05)(도 15a). p28은 세포 생존율 14 및 22% (p < 0.05)를 각각 100 및 200μM에서 억제하였다. 대조적으로, p18은 어떠한 효과도 없는 반면, 디카바진(DTIC)은 UISO-Mel-2 생존율에 대하여 상당한 투여량 관련 감소를 생성했다. 또한, 아주린 및 p28(200μM)은 UISO-Mel-23 및 29 세포의 생존율을 현저하게 감소시켰고, p18은 UISO-Mel-2 세포 증식에 대해 어떠한 효과도 없다.
직접적인 세포 카운트에 의해 측정되는 흑색종 세포 증식의 28 및 아주린 억제에서의 명백한 증가(-30-35%; UISO-Mel-2)는, 억제자 효과가 임의의 지연에 이어서 세포사멸)를 갖는 세포 주기의 수준에 주로 존재할 수 있다는 것을 시사한다. p18이 암세포를 선택적으로 투과하였다 하더라도, p28과 달리, 그것은 세포 증식에 대해 가상적으로 어떠한 억제자 활동도 갖지 않았다. 이 결과는, p28의 세포증식 억제 및 세포독성 활동이 서열의 C-말단 10-12 아미노산에 있을 것이라는 것을 나타낸다.
실시예 25 - 아주린 및 p28 결합 및 세포로의 진입
UISO-Mel-2 또는 섬유아세포(3x105 세포수)는 MEME 배지에 페놀 레드(phenol red) 없이 현탁시켰다. 반응은 Alexafluor 568-컨쥬게이트된 p28을 얼음 상에서 10, 50, 100, 150, 250, 300 및 400μM의 농도로 30, 60, 90 및 120 초 동안 넣어주는 것에 의해 시작되었다. 세포들은 유세포 분석기로 분석되었다. 펩타이드들의 세포로의 흡수는 도 17a의 그래프에서 보여진다. Km 및 Vmax는 펩타이드 농도(μM)에 대한 속도(MFI/초)를 플로팅하는 것에 의해 계산되었다. 이러한 계산은 도 17b에 도시되었다. 펩타이드 결합 및 진입은 전체 Mel2 세포((50,000 세포수/㎖)를 사용하여 결정되었고, 방사성 표지된 아주린의 농도를 증가시키면서(0-175nM) 1000배 잉여의 표지되지 않은 p28, 또는 아주린의 존재/부존재하에서 37℃에서 30분 동안 배양되었고, 세포 펠렛에 남아있는 방사성 활성은 감마 카운터를 사용하여 카운트하였다. 그 결과는 도 17c에 도시하였다. 125I 아주린만으로 배양된 세포에서의 방사성 활성은 전체 결합으로 생각되고; 표지되지 않은 아주린 또는 p28의 존재하에서의 방사성 활성은 비특이적인 결합으로 생각되었다. 특이적 결합은, 전체 결합으로부터 비특이적 결합을 빼고, 생성된 스캐차드 플롯(Scatchard plots)에 의해 결정되었다.
실시예 26 - 아주린 -유도 펩타이드를 이용하는 p53 을 통한 암 성장의 억제: 물질 및 방법
세포 배양. ATCC (Manassas, VA)로부터 얻어진 인간 유방암 세포주 MCF-7 (야생형 p53), 및 Dr. Andrei V. Gudkov (Lerner Research Institute, Cleveland, Ohio)로부터 얻어진 MDD2 (p53 dominant negative)는, 2 mM L-글루타민, 10% 열적 비활성화된 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 Units/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신(streptomycin)으로 보충된 0.1 mM 에센셜 아미노산을 포함하는 MEM-E (Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 배양되었다.
박테리아 배양 및 아주린의 분리. 대장균 JM 109는 야생형 아주린의 생성을 위한 호스트 품종으로서 사용되었다. 배양 조건 및 단백질 정제 단계는 Yamada, 등, Infect Immun, 70:7054-7062 (2002) 및 Goto, 등, Mol Microbiol, 47:549-449 (2003)에서 설명된 바와 같다.
펩타이드 합성. p18, Leu50-Gly67 LSTAADMQGVVTDGMASG(서열번호: 25), p28 Leu50-Asp77 (서열번호: 2) LSTAADMQGVVTDGMASGLDKDYLKPDD, p18b Val60-Asp77 (서열번호: 34) VTDGMASGLDKDYLKPDD, pl2 Gly56-Asp77 (서열번호: 35) SGLDKD YLKPDD, 및 폴리알기닌(Arg8)(서열번호: 95)을 포함하는 모든 아주린 유래 펩타이드는 CS Bio, Inc. (Menlo Park, CA)에 의해 95% 를 초과하는 순도 및 물질 밸런스로서 합성되었다.
증식 분석: 세포는 MEM-E에서 24-웰 플레이트(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) 내로 12x103 cells /well의 밀도로 4회 시드되었고, 24, 48 및 72 시간 동안 5, 50, 100 및 200μM의 p28의 존재에서 배양되었다. 배지는 매일 변경되었다. 대조표준 웰은 p28없이 MEM-E를 수용했다(8회). 독소루비신(10 μM)은 양성 대조군(Zl coulter; Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA)으로서 이용되었다. 값은 대조군의 (%)를 나타낸다. 대조군과 치료군 사이의 중요성은 학생의 t-검사에 의해 판정되었다.
MTT 분석: MCF-7 세포는 24시간 동안 고착되고 각각의 웰에 추가되는 MEM-E 또는 새로이 마련된 펩타이드(10 ㎕)로 2000 cells/well의 밀도로 (4회) 시드되었다. 24시간 후, 배지 및 p18, p28, 아주린 및 독소루비신이 매일 추가되었다. 배양 후, 10 ㎕의 MTT 시약(Trevigen, Gaithersburg, MD)이 각각의 웰에 추가되었고, 샘플이 3시간 동안 실온에서 배양되었으며, 100 ㎕의 세정제가 각각의 웰에 추가되었고, 37℃에서 추가로 3시간 동안 배양되었다. 흡광도(570 nm)가 측정되었고(SpectraMax 340 plate reader, Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA), 치료된 세포 내의 퍼센트 변화가 판정되었다. 대조군과 치료군 사이의 중요성(p<0.05)은 학생들의 t-검사에 의해 판정되었다.
이종이식( Xenograft ) 모델. 에스트라디올 선처리된(0.72mg/pellet, 60일 방출; Innovative Research, Sarasota, FL) 암컷 비흉선 마우스(female athymic mice) (Harlan; 연령 4-5 주)는 우측 흉부(flank)에 3x10 MCF-7 세포를 수용하였고, 처리 전에 대조군과 실험군으로 랜덤화되었다. 대조군 동물은 PBS/피마자유(castor oil) 복강 내 파클리탁셀(Paclitaxel)을 수용하였고, PBS/피마자유 내에 15μmol/kg이 종양 세포 접종 후(post-tumor cell inoculation) 10, 14, 21 및 25일에 복강 내 주입되거나, 또는 멸균 PBS에서 p28, 5 또는 10 mg/kg가 30일 동안 매일 주입되었다. 종양 부피는 주당 3회 판정되었다. 체중은 매주 2회 측정되었다. 마우스는 31일째에 검시되었고, 모든 종양은 조직병리학 및 면역 세포 화학(immunocytochemistry)을 위해 수집되었다. 대조군과 치료군 사이의 중요성(p<0.05)은 학생들의 t-검사에 의해 판정되었다.
면역 세포 화학. BrdU, 검사 2시간 전에 복강 내에 몸무게에 대해 50 mg/kg으로 주입되었다. BrdU로 라벨링된 종양 세포의 세포핵은 항-BrdU 단일클론 항체(Beckon Dickinson, Franklin Lakes, NJ)와 구별되었다. p53 발현은 포르말린 고정 시에 정량되었고, 5 μ 파라핀 절편은 6분 동안 압력솥에서 10mM 시트로 버퍼로 치료되었다. 냉각된 슬라이드는 10분 동안 3% H2O2로 처리되어 내생 페록시다제(endogenous peroxidase)를 차단하였고, 10분 동안 차단 혈청으로 덮였으며, 실온에서 2시간 동안 p53 항체(DO-I, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)에 노출되었다. 래트 항-마우스 IgG2a는 제 2 항체로서 이용되었다. p53을 발현하는 세포는 Vectastain Elite ABC 키트(Vector Laboratories, Burlingame, CA) 및 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(diaminobenzidine tetrahydrochloride)(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)를 이용하여 식별되었다. 슬라이드는 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대비염색되었다. 각각의 종양 주변부로부터의 10개의 비중첩 필드(250 cells /field)는 p53 라벨링된 세포에 대해 (40x) 스크리닝되었다.
공초점 현미경: 세포는 5% CO2에서 37℃로 유리 커버글라스 상에서 하룻밤 동안 시드되었고, 새로운 배지로 세정되었으며, Alexa Fluor 568 라벨링된 펩타이드(20μM), Arg8 (서열번호: 82) (5μM),를 포함하는 예열된 배지 또는 배지 단독에서 2시간 동안 37℃에서 배양되었다. 배양 후, 커브글라스는 PBS로 2회 세정되었고, 5분 동안 2.5% 포르말린으로 고정되었으며, PBS에서 2회 세척되었고, d.i. H2O에서 1회 세척되었으며, 염색 세포핵을 카운트하기 위한 1.5㎍/㎖ DAPI(VECTASHIELD<(R)>, Vector Laboratories)를 포함하는 배지에 배접되었다. 사이클린 B1 및 p21 염색은 고정 세포에서 판정되었고, 메탄올 및 아세톤에 의해 퍼미에이블라이즈(permiabilized)되었으며, PBS로 세척되었고, 항-p21 또는 사이클린 B로 1:200 희석액(Santa Cruz Biotechnology)에서 배양되었다. 2차적 항체 공액 Alexa Fluor 568은 1:100 희석으로 사용되었다. 세포 흡수 및 세포내 분포는 전화된 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Model LC510, Carl Zeiss Inc., Gottingen, Germany)을 사용하여 판정되었다.
동역학: MCF-7 및 MDD2 세포(3x105 세포)는 페놀레드 없이 MEM-E에서 부유되었다. 반응은 얼음 상에서 30, 60, 90 및 120 sec 동안 1, 10, 25, 50, 100, 150 및 200μM으로 Alexa Fluor 568-공액된 p28을 추가함으로써 시작되었다. 배양 후, 1 ml의 냉각-PBS는 반응 혼합물에 추가되었고, 세포는 4℃에서 2분 동안 600xg에서 2회 원심분리되었다. 적어도 10,000개의 고정 세포가 매 시점 및 농도마다 유세포 분석에 의해 분석되었고, 그들의 바탕 및 상대적인 형광이 계산되었다.
세포 주기 분석. MCF-7 및 MDD2는 37℃에서 48 및 72 시간 동안 50μM의 p28로 배양되었고, 인산 완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 2회 세척되었고, -20℃에서 70% 에탄올로 고정되었다. 고정된 세포는 PBS로 2회 세척되었고, 20 ㎍/㎖의 RNase A를 포함하는 PBS에서 50㎍/㎖ 프로피디움 이오디드(PI)에 의해 염색되었다. 유세포 분석(EPICS Elite ESP, Beckman Coulter, Fullerton, CA)은 DNA 콘텐츠를 판정하는 데 사용되었다. 최소 천개의 세포가 각 실험에서 수집되었다.
면역블러팅 . MCF-7 및 MDD2 세포가 0, 24, 48 및 72 시간 동안 50μM의 p28로 배양되었고, 전체 세포 용해(lysates)는 전술된 방법(3)에 따라 마련되었다. 인산화된 cdc2(p-cdc2)에 대한 세포 용해는 10 mM NaF, 137 mM NaCl, 1 mM NaVO4, 10 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM DTT 및 프로테이나제 억제자(proteinase inhibitor)(Sigma Aldrich)에서 마련되었다. p53, p27, CDKs, 시클린(cyclins) (Santa Cruz Biotechnology), p21(Invitrogen)에 대항하는 항체는 공급자의 명령에 따라 사용되었다. 액틴 발현은 단일 클론 액틴 항체((Santa Cruz Biotechnology) 및 ECL 시약(Santa Cruz Biotechnology)을 이용하여 시각화된 단백질 밴드로 판정되었다.
항- p28 항체( anti - p28 antibody ). 시스테인은 p28의 N-말단(CS Bio Inc., Menlo Park, CA)에 도입되었고, 이어서 펩타이드는 시스테인 잔기의 티올 계열을 통해 키홀 림펫 헤모사이아닌(Keyhole limpet hemocyanin)으로 공액되었으며, 화합물은 피부내 및 피하에 접종되었고, 래빗(New Zealand White, Covance, MI)에서 p28 (아주린의 아미노산 60-77 )의 아미노산 11-28 에 대해 특정적인 다중클론 항체가 생성되었다. 항체 적정 농도(titer)는 p28 (0-3㎍/well)을 사용하여 직접적인 ELISA에 의해 판정되었다. 1;140,000의 항체 희석물은, 96 웰-플레이트(Nunc, Rochester, NY)가 1 ㎍/well p28로 코팅되었을 때, 25℃에서 기질(1-Step PNPP, Pierce, Rockford, IL)로 15분 배양 후 150 nm에서 0.5의 흡광도의 재생가능한 변화를 주는 데 충분한 것이었다.
GST 풀-다운 분석( GST pull - down assay ). p53과 결합하는 p28은 Punj, 등, Oncogene 23:2367-2378 (2004)에서 설명된 바와 같이 본질적으로 GST 풀-다운 분석을 이용하여 분석되었다. 정제된 GST-p28(10 및 20㎍/reaction), GST-MDM2 (20 ㎍/reaction) 및 GST 단독(20 ㎍/reaction)은, 글루타티온 세파로오제(Glutathione Sepharose) 4B 비드(GE Healthcare, NJ)에 결합되고, PBS로 2회 세척함으로써 제거된 펩타이드에는 결합되지 않는다. MCF-7 세포의 전체 세포 용해는 프로테이나제 억제자 칵테일(Sigma- Aldrich)을 포함하는 PBS/0.1% 트리톤(Triton) X-100으로 15분 동안 얼음 상에서 생성되었고, 4℃에서 30분 동안 14000 r.p.m.으로 원심 분리되었다. 결과적인 상청액은 비드와 혼합되었고, 4℃에서 2시간 동안 배양되었으며, PBS로 2회 세척되어, 비결합 세포 용해물을 제거하고 이어서 10% SDS-PAGE 상에서 로딩하기 전에 SDS-샘플 버퍼에서 가열되었다. 막은 TBST (Tris/0.05%Tween20)에서 탈지 우유(5%) 및 4℃에서 5% 탈지 우유 내의 다중 클론 p53 항체(FL-393, Santa Cruz Biotechnology)로 배양되었고, TBST로 3회 세척되었으며, 2차적 래빗 IgG-HRP 항체(Sigma-Aldrich)가 추가되었고, 실온(r/t)에서 1시간 동안 배양되었으며, TBST로 3회 세척되었다.
p53 상의 잠재적 결합 부위는 다음과 같이 식별되었다. p53의 MDM2 결합 부위(18-23aa)에서의 상호 작용은 p28(10-50 몰 초과)의 존재 시에 GST-풀 다운 분석을 이용하여 분석되었고, p53 밴드가 면역블러팅(IB)에 의해 검출되었다. 입수가능한 p53 단백질의 최대 커버리지를 포함하는 3개의 상이한 항-p53 항체, 즉 1801 (아미노산 32-79; Santa Cruz Biotechnology), ab 2433 (277- 296aa; Abeam Inc., Cambridge, MA) 및 Pab1802 (306-393aa; Santa Cruz Biotechnology)는 각각 p28의 존재 시에 GST-p53 불멸 비드에 반응하였다. 배양 후, 샘플은 비결합 p28을 제거하도록 PBS로 2회 세척되었고, 원시 PAGE 샘플 버퍼(Tri/글리세롤(glycerol)/BPB)에서 비등되었으며, 5% 원시-PAGE 상으로 로딩되었다. 샘플은 전기블로팅(electroblotting)(1시간 동안 0.2 Amp)에 의해 PVDF 막으로 전사되었고, 막은 TBST에서 탈지 우유(5%)로 차단되었으며, 4℃에서 5% 탈지 우유에서 다중 클론 항체 대 p28(1:5000 희석)로 배양되었다. TBST로 세척한 후, HRP-공액된 래빗 항-IgG 항체(1 :7000 희석n, Santa Cruz Biotechnology)가 적용되었다. p28 밴드는 ECL 시약을 이용하여 시각화되었다. p28 상의 결합 도메인은 p28과 글루타티온 세파로오제 4B 비드 상에서 움직이지 않는 p28 프라그먼트인 GST-p53(20 ㎍/reaction)에 대한 p12, p18 및 p18b 사이의 경합 분석을 이용하여 식별되었다. 반응은 4℃에서 2시간 동안 배양되었고, 비결합 p28을 제거하도록 PBS로 2회 세척되었으며, 이어서 원시 PAGE 샘플 버퍼(Tri/글리세롤/BPB)에서 비등되었고, 5% 원시-PAGE 상에서 로딩되었다. 단백질은 전기블리팅(1시간 동안 0.2 Amp)에 의해 PVDF 막으로 전사되었고, 차단되었으며, 16시간 동안 4℃에서 다중 클론 항체 대 p28로 배양되었다. p28 밴드는 ECL 시약으로 시각화되었다. 밴드 강도는 Gel & Graph Digitizing Software, UN-SCAN-IT(TM) (Silk Scientific Inc., Orem, Utah)를 사용하여 판정되었고, 특정 단백질/액틴의 비율이 계산되었다. 각각의 단백질 밴드 아래에 표시된 번호는 처리 직전(100%로서 0시간 발현됨)의 단백질 babd 강도의 상대적인 비율이다.
p53 DNA -결합 활동도. 핵 파편(Nuclear fractions)(Nuclear Extraction kit, Active Motif, Carlsbad, CA)은 제조자의 명령에 따라 24시간 동안 50 μM의 p28 또는 아주린과의 배양 후 MCF-7 세포로부터 분리되었다. 핵 추출 상청물질은 4℃에서 10분 동안 14,000 rpm의 원심 분리에 의해 수집되었다. 단백질 농도는 브라드포드(Bradford) 방법을 이용하여 판정되었다. p53의 DNA-결합 활동은 TransAM p53 키트(Active Motif)를 이용하여 측정되었다. 간단히 말해서, DTT 및 폴리[d(I-C)]를 포함하는 40 ㎕의 결합 버퍼가 각각의 웰에 도입되어 p53 교감 올리고뉴클레오티드와의 비특정 결합을 예방하였다. 핵 추출이 H2O2-처치되거나 버퍼만을 갖는 각각의 웰에 각각 양성 및 음성 대조군으로서 적용되었고, 1시간 r/t에서 배양되었다. 웰은 2회 세척되었고, 100㎕의 p53 항체(1;1000 희석)가 적용되었으며, 1시간 동안 실온에서 배양되었다. 세척 후, HRP와 공액된 2차적 항체가 추가되었고, 샘플이 1시간 동안 배양되었으며, 암흑 속에서 3분 동안 발현되었다. DNA와 결합하는 p53은 450 및 655 nm의 흡광률에 의해 판정되었다.
실시예 27 - 시험관내 및 생체내의 인간 암세포의 성장에 대한 p28 처치 효과
아주린은 p53-매개된 세포사멸(apoptosis)의 도입을 통해 그것의 항암 활동에 영향력을 행사한다. 도 54a 및 도 54b는 직접적인 세포 카운트 및 MTT 분석에 의해 판정된 야생형 p53(양성) MCF-7 세포에 대해 p28 및 독소루비신(doxorubicin)의 효과를 도시하고 있다. p28은 초기에 24 시간 노출 후 5μM에서 -23% 및 50-200 μM에서 -36%인 세포 수의 현저한 감소(p < 0.05)를 생성하는 투여량 및 시간 관련 적으로 시험관 내에서 MCF-7 세포의 증식을 억제하였다 (도 54A). 독소루비신 (DNA 인터칼레이팅 약물)도 시간에 따라 세포 성장을 현저히 억제하였다. MTT 분석에 의해 결정되는 세포 생존은 p28에 의해 현저히 변하지 않았지만, 독소부비신은 MCF-7 세포 생존(도 54b)에서 시간에 따라 상당히 감소하였다. 매일 30일 복강내 노출(도 54c)에 대한 비흉선 마우스의 이종 이식된 MCF-7 세포에서, p28도 투여량에 따라 상당히 감소하여, 체중의 감소나 행동의 변화를 야기하지 않으면서 파크릴탁셀®으로 관찰한 수준까지 종양의 크기(p<0.05)를 감소시켰다. 15 μmol/kg 파크릴탁셀®의 10일, 14일, 21일, 및 25일 투여에 비하여, 30일간 매일 10 mg/kg p28 복강내 투여로 MCF-7의 성장을 상당히 억제하였다(~20%). 제안된 세포 사이클에서의 종양 크기의 p28 유도 감소와 관련된 BrdU 라벨링의 감소는 억제되었다(표 5). 반대로, BrdU 라벨링과 종양 크기의 감소는 대조군과 비교해서 p28에서 핵 p53-염색의 약간의 증가와 paclitaxel® 처리 군에서의 상당한 증가를 수분하였다 (표 X).
하기 표 5는 MCF-7 이종 이식된 종양에서의 BrdU 및 p53에 대한 것이다.
N BrdU(%) p53(%)
대조군 7 21.0 ± 2.7 15.6 ± 0.82
p28(5mg/kg) 4 17.6 ± 0.75* 15.8 ± 0.51
p28(10mg/kg) 3 16.1 ± 1.4* 17.7 ± 0.92
파클리탁셀 6 9.0 ± 1.8** 25.4 ± 0.65**
모든 종양은 처치 후 31일 되는 날에 수집되었다. 값들은 평균±SEM.*, p<0.025;**, 각각의 대조군에서 p<0.01; 학생의 T-test.
실시예 28 - p28 에 의한 세포 주기 진행의 억제
2개의 동질 유전자형의 유방암 세포주
세로 MCF-7(야생형 p53) 및 MDD2(우성인 음성 p53)의 세포 주기는 48-72 시간 동안 p28로의 노출 및 MCF-7 세포에서 72 시간에 세포사멸의 후속 유도 후에 G2/M 시기에 증가된 세포 개체군을 보였다(도 55a). 본질적으로 p28-처치된 MDD2 세포에서 세포 주기 진행 또는 세포사멸의 억제가 전혀 없다(도 55b). p28p-처치된 MDD2 세포에서 세포 주기 억제 및 세포사멸의 부족(도 55b)은 MDD2 세포 내로의 p28 진입에서의 차이(도 55c), 또는 Vmax (MCF-7: 1.83 MFI/초, MDD2: 2.21 MFI/초)나 Km(MCF-7: 144.3μM, MDD2: 147.9μM)에서의 차이로 인한 것이 아니었다.
실시예 29 - p53 레벨은 p28 에 의해 향상되었다
아주린은 p53과의 혼합물을 형성하고, MCF-7 세포에서 세포내 p53 레벨을 상승시킨다. MCF-7에서 p53의 세포내 레벨은 p28로의 시후 노출(time post exposure)에 비해 현저하게 증가하였다(도 56a). GST 풀-다운 분석은, p28이 p53과 결합한다는 것을 시사하였다(도 56b). 여기서, GST-p28 및 GST-MDM2는 MCF-7 세포 용해로부터 p53을 성공적으로 풀-다운(pull down)했지만, GST 단독으로는 그러하지 않았다. p28의 몰 증가는 GST-MDM2와 결합과 경합하지 않았는데, 이는 p53의 아미노산 18-23이 p28에 대한 바람직한 결합 부위가 아니었다는 것을 시사한다. p53 단백질(아미노산 32-79, 277-296, 306-393)의 상이한 동기(motifs)를 인식하는 p53 항체의 존재 및 부재 시의 추가적 GST-풀 다운 분석은, p53과 결합하는 p28을 차단하지 않았는데, 이는 p28이 그러한 인식 부위 외래에서 p53의 영역과 결합한다는 것을 시사한다(도 56c).
GST-p53 단백질로 고정된 세파로제 4B-글루타티온 비즈(beads)가 p28과 아주린의 아미노산 66번 내지 77번, 아미노산 50번 내지 67번, 또는 아미노산 60번 내지 77번(p28 프라그먼트 p12, p18, p18b)으로 각각 배양되었을 때, 상당한 양의 p28이 p18 및 p18b에 의해 치환되었지만, p12가 경합자로서 사용되었을 때만 약하다. 이러한 결과는 p53과의 최대 결합이 p28의 아미노산 11번 내지 28번(아주린의 아미노산 60번 내지 77번) 내에서 일어난다는 것을 시사한다.
p28이 p53의 세포내 레벨을 증가시키므로, p28 또는 아주린으로 처치된 MCF-7 세포핵 추출물로부터 얻어진 p53의 DNA-결합 활동도 검사되었다. p28 및 아주린에 의해 처치된 MCF-7 세포의 핵 파판에서 p53 DNA-결합 활동성은 대조군(p>0.1, p28 대 아주린)보다 1.8 및 2.3배 더 높았다. 돌연변이된 올리고뉴클레오티드 서열을 제외한 야생형의 p53 교감은 p53에서의 p28 유도 증가를 완전히 차단하여, MCF-7 세포의 핵 추출물에서 p53이 야생형 p53에 대한 교감 올리고유클레오티드 서열과 특히 결합하는 것을 확인하였다(도 56e).
실시예 30 - p28 에 의한 세포 주기 관련 단백질의 변형
CDK 억제자(CDKIs), p21 및 p27, 블록 세포 주기 진행의 상향조절. p28은 시후 노출에 따라 MCF-7 세포에서 대조군 이상으로 p21, p27, CDK6 및 시클린(cyclin) B1의 세포내 레벨을 증가시켰다(도 57a). 유사 분열 경로(mitotic process)에서 필수적인 단백질인 CDK2 및 시클린 A의 레벨은 후속하여 p28 처치된 MCF-7 세포에서 시후 노출에 따라 감소한다(도 57a). 대조적으로, p53, cdc2, CDK2, CDK4 및 CDK6은 MDD2 세포에서 필수적으로 일정하게 유지되었고(도 57b), 그 반면에 시클린 A 및 시클린 B1(48시간)은 약간 증가하였다. p21이 MDD2 세포에서 p53-독립적 경로에 의해 발현될 수 있으므로, p21은 검출 가능한 상태로 남아 있었다. 그러나, p28은 p21의 레벨을 변경하지 않았다(도 57b). 대조적으로, p27은 비처치되거나 p28 노출된 MDD2 세포에서 검출 가능하지 않았다. p28에 응답하여 면역블로팅함으로써 검출된 MCF-7 세포에서 p21 및 시클린 B1의 증가된 레벨은 각각 그들의 핵 및 시토졸 부분에서의 증가에 의해 반영되었다(도 57c, 57d). p28로의 MCF-7 세포의 노출은 또한, cdc2의 불활성 형태인 인산화(phosphorylated) cdc2(p-cdc2)의 누적을 유도하였다. p-cdc2의 레벨은 p28로의 MDD2 세포의 다음 노출을 증가시키지 않았다(도 57e).
실시예 31 - 마우스 기관으로 p18 및 p28 의 진입의 이미지화
인간 암 연구를 포함하는 생물학적 연구에 있어서, 작은 동물의 생체내의 이미지화는 중요한 의미를 가진다. 태깅된 생물학적 프로브를 트래킹하고 시각화하는 능력은 연구자가 생물학적 과정 및 작용 및 효능의 메카니즘을 추론할 수 있게 한다. 이미지화는, 이종이식을 갖는 누드 마이스에서, 단백질(예를 들어 아주린과 아주린 단편 p28 및 p18)의 큐프레독신 류의 단백질의 근적외선 표지된 펩타이들이 최초의(primary) 그리고 전이성의 종양 부위들로 이동되는 것을 직접적으로 시각화하는 데 사용될 수 있다. 문헌[J Biomed Optics 10:054010-1-11, 2005], [J Amer Soc Exp Neuother 2:215-225, 2005] 및 [Topics Curr Chem 222:1-29, 2002] 참조.
절차. Mel2 이종이식 종양을 갖는 무흉선 누드 마우스를 종양 크기가 0.5㎤가 될 때까지 모니터하였다. 마우스를 케타민:자일라진(2:1)의 혼합물을 사용하여 마취시켰는데, 추천되는 투여량은 10㎕/gm 마우스 b.w. s.c.였다. 마취된 마우스를 표지된 펩타이드를 주입하기 이전과 이후에 직접 iCor Odyssey Imager로 직접 스캔하였다. 마취된 마우스는 정맥 내로 (꼬리 정맥으로) IRDye™ 800cw로 표지된 p18/p28을 마우스 당 1.25㎍/㎕ - 125㎍의 농도로 주사되었다. 마우스는, 잉여의 염색이 그들의 시스템을 깨끗하게 할 때까지(일반적으로 ~5일) 매 24시간에 적어도 한번 스캔되었다. 5일째에, 마우스를 희생시키고 각각의 동물들을 마지막에 스캔하였다. 신장, 위, 장, 비장, 뇌, 심장 및 폐를 포함하는 기관, 그리고 종양을 절제하고 반으로 나누고 반은 조직학적 검사를 위해 고정시켰다. 기관 및 조양의 나머지 반은 소량의 PBS로 덮은 후에, 스캔되었다.
SEQUENCE LISTING <110> TAYLOR, BRAD N. MEHTA, RAJESHWARI YAMADA, TOHRU BEATTIE, CRAIG DAS GUPTA, TAPAS <120> COMPOSITIONS AND METHODS TO PREVENT CANCER WITH CUPREDOXINS <130> 14PR-141880 <140> 12/338,480 <141> 2008-12-18 <150> 12/314,703 <151> 2008-12-15 <150> 12/028,683 <151> 2008-02-08 <150> 61/013,709 <151> 2007-12-14 <150> 60/900,098 <151> 2007-02-08 <150> 11/488,693 <151> 2006-07-19 <150> 11/244,105 <151> 2005-10-06 <150> 60/700,297 <151> 2005-07-19 <150> 60/680,500 <151> 2005-05-13 <150> 60/616,782 <151> 2004-10-07 <160> 96 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 128 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 1 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Gln Gly Asn Asp Gln Met Gln Phe Asn 1 5 10 15 Thr Asn Ala Ile Thr Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Ser His Pro Gly Asn Leu Pro Lys Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met 50 55 60 Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp Ser Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Leu Ile Gly Ser Gly Glu Lys Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Gln Tyr Met Phe Phe Cys 100 105 110 Thr Phe Pro Gly His Ser Ala Leu Met Lys Gly Thr Leu Thr Leu Lys 115 120 125 <210> 2 <211> 28 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 2 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 3 <211> 105 <212> PRT <213> Phormidium laminosum <400> 3 Glu Thr Phe Thr Val Lys Met Gly Ala Asp Ser Gly Leu Leu Gln Phe 1 5 10 15 Glu Pro Ala Asn Val Thr Val His Pro Gly Asp Thr Val Lys Trp Val 20 25 30 Asn Asn Lys Leu Pro Pro His Asn Ile Leu Phe Asp Asp Lys Gln Val 35 40 45 Pro Gly Ala Ser Lys Glu Leu Ala Asp Lys Leu Ser His Ser Gln Leu 50 55 60 Met Phe Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Glu Ile Thr Phe Ser Ser Asp Phe 65 70 75 80 Pro Ala Gly Thr Tyr Thr Tyr Tyr Cys Ala Pro His Arg Gly Ala Gly 85 90 95 Met Val Gly Lys Ile Thr Val Glu Gly 100 105 <210> 4 <211> 155 <212> PRT <213> Thiobacillus ferrooxidans <400> 4 Gly Thr Leu Asp Thr Thr Trp Lys Glu Ala Thr Leu Pro Gln Val Lys 1 5 10 15 Ala Met Leu Glu Lys Asp Thr Gly Lys Val Ser Gly Asp Thr Val Thr 20 25 30 Tyr Ser Gly Lys Thr Val His Val Val Ala Ala Ala Val Leu Pro Gly 35 40 45 Phe Pro Phe Pro Ser Phe Glu Val His Asp Lys Lys Asn Pro Thr Leu 50 55 60 Glu Ile Pro Ala Gly Ala Thr Val Asp Val Thr Phe Ile Asn Thr Asn 65 70 75 80 Lys Gly Phe Gly His Ser Phe Asp Ile Thr Lys Lys Gly Pro Pro Tyr 85 90 95 Ala Val Met Pro Val Ile Asp Pro Ile Val Ala Gly Thr Gly Phe Ser 100 105 110 Pro Val Pro Lys Asp Gly Lys Phe Gly Tyr Thr Asp Phe Thr Trp His 115 120 125 Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Tyr Val Cys Gln Ile Pro Gly His Ala 130 135 140 Ala Thr Gly Met Phe Gly Lys Ile Val Val Lys 145 150 155 <210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Achromobacter cycloclastes <400> 5 Ala Asp Phe Glu Val His Met Leu Asn Lys Gly Lys Asp Gly Ala Met 1 5 10 15 Val Phe Glu Pro Ala Ser Leu Lys Val Ala Pro Gly Asp Thr Val Thr 20 25 30 Phe Ile Pro Thr Asp Lys Gly His Asn Val Glu Thr Ile Lys Gly Met 35 40 45 Ile Pro Asp Gly Ala Glu Ala Phe Lys Ser Lys Ile Asn Glu Asn Tyr 50 55 60 Lys Val Thr Phe Thr Ala Pro Gly Val Tyr Gly Val Lys Cys Thr Pro 65 70 75 80 His Tyr Gly Met Gly Met Val Gly Val Val Gln Val Gly Asp Ala Pro 85 90 95 Ala Asn Leu Glu Ala Val Lys Gly Ala Lys Asn Pro Lys Lys Ala Gln 100 105 110 Glu Arg Leu Asp Ala Ala Leu Ala Ala Leu Gly Asn 115 120 <210> 6 <211> 128 <212> PRT <213> Alcaligenes faecalis <400> 6 Ala Cys Asp Val Ser Ile Glu Gly Asn Asp Ser Met Gln Phe Asn Thr 1 5 10 15 Lys Ser Ile Val Val Asp Lys Thr Cys Lys Glu Phe Thr Ile Asn Leu 20 25 30 Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Lys Ala Ala Met Gly His Asn Val Val 35 40 45 Val Ser Lys Lys Ser Asp Glu Ser Ala Val Ala Thr Asp Gly Met Lys 50 55 60 Ala Gly Leu Asn Asn Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Glu Arg Val Ile 65 70 75 80 Ala His Thr Ser Val Ile Gly Gly Gly Glu Thr Asp Ser Val Thr Phe 85 90 95 Asp Val Ser Lys Leu Lys Glu Gly Glu Asp Tyr Ala Phe Phe Cys Ser 100 105 110 Phe Pro Gly His Trp Ser Ile Met Lys Gly Thr Ile Glu Leu Gly Ser 115 120 125 <210> 7 <211> 129 <212> PRT <213> Achromobacter xylosoxidans <400> 7 Ala Gln Cys Glu Ala Thr Ile Glu Ser Asn Asp Ala Met Gln Tyr Asn 1 5 10 15 Leu Lys Glu Met Val Val Asp Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val His 20 25 30 Leu Lys His Val Gly Lys Met Ala Lys Val Ala Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Glu Ala Asp Lys Gln Gly Val Ala Thr Asp Gly Met 50 55 60 Asn Ala Gly Leu Ala Gln Asp Tyr Val Lys Ala Gly Asp Thr Arg Val 65 70 75 80 Ile Ala His Thr Lys Val Ile Gly Gly Gly Glu Ser Asp Ser Val Thr 85 90 95 Phe Asp Val Ser Lys Leu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ala Tyr Phe Cys 100 105 110 Ser Phe Pro Gly His Trp Ala Met Met Lys Gly Thr Leu Lys Leu Ser 115 120 125 Asn <210> 8 <211> 129 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 8 Ala Glu Cys Ser Val Asp Ile Ala Gly Thr Asp Gln Met Gln Phe Asp 1 5 10 15 Lys Lys Ala Ile Glu Val Ser Lys Ser Cys Lys Gln Phe Thr Val Asn 20 25 30 Leu Lys His Thr Gly Lys Leu Pro Arg Asn Val Met Gly His Asn Trp 35 40 45 Val Leu Thr Lys Thr 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<211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(7) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(10) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(15) <223> Any amino acid <400> 32 Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Xaa Asp 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(6) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(9) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Any amino acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(14) <223> Any amino acid <400> 33 Asp Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Xaa Tyr Xaa Lys Xaa Xaa Asp 1 5 10 15 <210> 34 <211> 18 <212> PRT <213> Pseudomonas aeruginosa <400> 34 Val Thr Asp Gly Met Ala Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro 1 5 10 15 Asp Asp 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Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 49 Leu Ser Thr Ala Cys Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 50 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 50 Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Cys Val Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 51 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 51 Leu Ser Thr Ala Ala Thr Met Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 52 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 52 Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Cys Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 53 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 53 Leu Ser Thr Ala Ala Asn Thr Gln Gly Val Cys Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 54 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 54 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Cys Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 55 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 55 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Thr Ala Val Val Cys Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 56 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 56 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Cys Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 57 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 57 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Thr Val Val Thr Cys Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 58 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 58 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Cys Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 59 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 59 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Ala Thr Val Thr Asp Cys Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 60 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 60 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Cys Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 61 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 61 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Thr Ala Asp Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 62 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 62 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asn Gly Cys Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 63 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 63 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Ala Thr Met Gly 1 5 10 15 Ser Gly Leu Cys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 64 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 64 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Leu Thr Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Cys Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 65 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 65 Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 66 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 66 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 67 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 67 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 68 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 68 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 69 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 69 Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 70 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 70 Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 71 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 71 Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 72 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 72 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Trp Asp Gly Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 73 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 73 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Thr Asp Trp Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 74 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 74 Leu Ser Thr Ala Ala Asp Met Gln Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 75 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 75 Leu Ser Trp Ala Ala Asp Met Trp Gly Val Val Trp Asp Trp Met Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 76 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> May or may not be N-term acetylated <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Thr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Met, Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Gln or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Gly or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Thr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Gly, Thr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Met, Leu or Val <220> <223> May or may not be C-term amidated <400> 76 Leu Ser Xaa Ala Ala Asp Xaa Xaa Xaa Val Val Xaa Asp Xaa Xaa Ala 1 5 10 15 Ser Gly Leu Asp Lys Asp Tyr Leu Lys Pro Asp Asp 20 25 <210> 77 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <223> May or may not be N-term acetylated <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Met, Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (15)..(15) <223> Gly, Thr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (17)..(17) <223> Thr or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Gly or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Gln or Trp <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Met, Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (26)..(26) <223> Thr or Trp <220> <223> May or may not be C-term amidated <400> 77 Asp Asp Pro Lys Leu Tyr Asp Lys Asp Leu Gly Ser Ala Xaa Xaa Asp 1 5 10 15 Xaa Val Val Xaa Xaa Xaa Asp Ala Ala Xaa Ser Leu 20 25 <210> 78 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 cgggatcccc ggcaacctgc cgaagaacgt catgggc 37 <210> 79 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 cggaattcgc atcacttcag ggtcaggg 28 <210> 80 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 ggccacaact gggtactgtg aaccgccgcc gacatgcag 39 <210> 81 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 ctgcatgtcg gcggcggttc acagtaccca gttgtggcc 39 <210> 82 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 cctgaagccc gacgactgac gtgtcatcgc ccacacc 37 <210> 83 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 ggtgtgggcg atgacacgtc agtcgtcggg cttcagg 37 <210> 84 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 ccaagctgat cggctcgtga gagaaggact cggtgacc 38 <210> 85 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 ggtcaccgag tccttctctc acgagccgat cagcttgg 38 <210> 86 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 cgggatcctg agcaccgccg ccgacatgca ggg 33 <210> 87 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial 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Sequence: Synthetic primer <400> 93 ccgctcgagc ctgagcaccg ccgccatgca ggg 33 <210> 94 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 94 ttttcctttt gcggccgctc agtcgtcggg cttcaggtaa tcc 43 <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 95 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 96 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 96 Ser Gly Leu Asp Lys Asp 1 5

Claims (76)

  1. 암세포를 세포독성의 큐프레독신과 접촉시킴으로써 암 세포를 죽이는 단계를 포함하는 방법에 있어서,
    상기 세포독성의 큐프레독신은 하나 이상의 엔도사이토시스 경로를 통해 우선적으로 상기 암 세포에 들어가고,
    상기 세포독성의 큐프레독신은 아주린(azurin)의 절단부(truncation)이고,
    상기 아주린의 절단부는 서열번호: 2의 C-말단으로부터의 아미노산들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 아주린의 절단부는 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 아주린의 절단부는 서열번호: 2를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 아주린의 절단부는 서열번호: 2로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 카베올레-매개된 엔도사이토시스(caveolae-mediated endocytosis)를 통해 우선적으로 암세포로 들어가는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 세포독성의 큐프레독신이 암세포로 들어가는 것은 골지체에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 암세포의 상태에 상관없이 암세포의 세포막에 접촉할 수 있는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 암세포의 세포막 상의 아미노산들과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 암세포의 세포막 상의 세포 표면 펩타이드들과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 암세포의 세포막 상의 수용체들과 접촉하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 서열번호: 1의 69, 70, 75, 76 및 85 위치에 있는 아미노산 각각을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 서열번호: 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 7 항에 있어서, 상기 세포독성의 큐프레독신은 서열번호: 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 카베올레-매개된 엔도사이토시스를 통해 암세포로 들어가고, 암세포를 죽이며, 단리된 펩타이드는 서열번호: 2의 C-말단으로부터의 아미노산을 포함하는 암세포의 세포막에 접촉할 수 있는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 암세포의 세포막 상의 아미노산들과 접촉하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 암세포의 세포막 상의 세포 표면 펩타이드들과 접촉하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  17. 제 14 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 암세포의 세포막 상의 수용체들과 접촉하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  18. 제 14 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드가 암세포로 들어가는 것은 골지체에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  19. 제 14 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 녹농균으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  20. 제 14 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 2를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  21. 제 14 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 2로 구성되는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  22. 제 14 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 14 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 35, 36 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 단리된 펩타이드로서, 상기 단리된 펩타이드는 암 세포의 세포막에 접촉할 수 있고, 카베올라-매개된 엔도사이토시스를 통해 암 세포에 들어갈 수 있고, 암 세포를 죽일 수 있으며,
    상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 1의 69, 70, 75, 76 및 85 위치에 있는 아미노산을 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 서열번호: 1의 69, 70, 75, 76 및 85 위치에 있는 아미노산 각각을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  26. 제 24 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 상기 암세포의 세포막 상의 아미노산들과 접촉하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  27. 제 24 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 상기 암세포의 세포막 상의 세포 표면 펩타이드들과 접촉하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  28. 제 24 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 상기 암세포의 세포막 상의 수용체들과 접촉하는 것을 특징으로 하는 단리된 펩타이드.
  29. 제 14 항에 따른 단리된 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  30. 제 29 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 정맥 내 투여에 적합한 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  32. 제 29 항에 따른 약학 조성물의 치료학적 유효량을 포유류 환자에게 투여함으로써 상기 포유류 환자를 치료하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 환자는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 환자는 암의 발달에 대한 위험이 일반인보다 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 암은 흑색종 암, 유방암, 췌장암, 교모세포종 암, 성상세포종 암, 폐암, 대장암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 피부암 및 자궁경부암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 환자는 적어도 하나의 고위험 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 33 항에 있어서, 상기 환자는 전암 병소들을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 33 항에 있어서, 상기 환자의 암 또는 전암 병소들을 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 32 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 피하 주사, 흡입, 경피투여 패치(transdermal patch), 좌약, 유리체강 내 주사 또는 경구 투여로부터 선택되는 투여 방법에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 39 항에 있어서, 상기 투여 방법은 정맥 내 주사인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 바이얼에 제 29 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  42. 제 24 항에 따른 단리된 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 정맥 내 투여에 적합한 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 42 항에 따른 약학 조성물의 치료학적 유효량을 포유류 환자에게 투여함으로써 상기 포유류 환자를 치료하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 환자는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 환자는 암의 발달에 대한 위험이 일반인보다 더 높은 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, 상기 암은 흑색종 암, 유방암, 췌장암, 교모세포종 암, 성상세포종 암, 폐암, 대장암, 두경부암, 방광암, 전립선암, 피부암 및 자궁경부암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제 46 항에 있어서, 상기 환자는 적어도 하나의 고위험 특징을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 46 항에 있어서, 상기 환자는 전암 병소들을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 46 항에 있어서, 상기 환자의 암 또는 전암 병소들을 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 45 항에 있어서, 상기 약학 조성물은 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 피하 주사, 흡입, 경피투여 패치, 좌약, 유리체강 내 주사 또는 경구 투여로부터 선택되는 투여 방법에 의해 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 투여 방법은 정맥 내 주사인 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 바이얼에 제 42 항에 따른 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  55. 제 14 항에 따른 단리된 펩타이드 및 카르고 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 상기 카르고 화합물에 연결된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  57. 제 56 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 타목시펜인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  58. 제 55 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 단백질, 리포단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 다당류, 핵산, 염료, 극미립자(microparticle), 나노입자, 독소 및 약물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  59. 제 55 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 검출가능한 물질(detectable substance)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 X-선 CT에 의해 검출가능한 X-선 조영제(contrast agent)인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  61. 제 59 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 MRI에 의해 검출가능한 자기 공명 영상 조영제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  62. 제 59 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 초음파에 의해 검출가능한 초음파 조영제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  63. 제 55 항에 있어서, 약학적으로 적당한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  64. 제 55 항에 따른 약학 조성물을 세포에 접촉시킴으로써 카르고 화합물을 세포로 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 59 항에 따른 약학 조성물을 환자에게 투여함으로써 암을 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 24 항에 따른 단리된 펩타이드 및 카르고 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  67. 제 66 항에 있어서, 상기 단리된 펩타이드는 상기 카르고 화합물에 연결된 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  68. 제 67 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 타목시펜인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  69. 제 66 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 단백질, 리포단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 다당류, 핵산, 염료, 극미립자, 나노입자, 독소 및 약물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  70. 제 66 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 검출가능한 물질인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  71. 제 70 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 X-선 CT에 의해 검출가능한 X-선 조영제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  72. 제 70 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 MRI에 의해 검출가능한 자기 공명 영상 조영제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  73. 제 70 항에 있어서, 상기 카르고 화합물은 초음파에 의해 검출가능한 초음파 조영제인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  74. 제 66 항에 있어서, 약학적으로 적당한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.ㅍ
  75. 제 66 항에 따른 약학 조성물을 세포에 접촉시킴으로써 카르고 화합물을 세포로 전달하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제 70 항에 따른 약학 조성물을 환자에게 투여함으로써 암을 진단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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