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KR20120027276A - 인플루엔자를 예방하기 위한 면역증강된 백신 - Google Patents

인플루엔자를 예방하기 위한 면역증강된 백신 Download PDF

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KR20120027276A
KR20120027276A KR1020117028417A KR20117028417A KR20120027276A KR 20120027276 A KR20120027276 A KR 20120027276A KR 1020117028417 A KR1020117028417 A KR 1020117028417A KR 20117028417 A KR20117028417 A KR 20117028417A KR 20120027276 A KR20120027276 A KR 20120027276A
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KR
South Korea
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vaccine
influenza
ser
seq
hemagglutinin
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Withdrawn
Application number
KR1020117028417A
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Inventor
클라우스 슈토어
필립 도미츠
귀다이스 귀세페 델
미카엘 브뢰커
Original Assignee
노파르티스 아게
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Publication date
Application filed by 노파르티스 아게 filed Critical 노파르티스 아게
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Abstract

H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 함유하는 백신이 수중유 에멀젼 애쥬번트로 애쥬번트 첨가된다. 이 백신은 "돼지 인플루엔자"라고 하는 바이러스에 대해서 사람을 면역화하는데 적합하다. 백신은 1가 백신일 수 있다. 백신은 2개의 상이한 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 포함할 수 있으며, 이때 (i) 제 1의 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌은 SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO: 1과 더욱 가깝게 관련되고, (ii) 제 2의 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌은 SEQ ID NO: 1보다 SEQ ID NO: 3과 더욱 가깝게 관련된다. 1가 백신은 3가 A/H1N1-A/H3N2-B 계절 인플루엔자 백신과 함께 투여될 수 있다.

Description

인플루엔자를 예방하기 위한 면역증강된 백신{ADJUVANTED VACCINES FOR PROTECTING AGAINST INFLUENZA}
본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염에 대해 면역증강된(adjuvanted) 백신 분야에 관한 것으로, 특히 2009년 4월에 창궐한 돼지독감 균주(swine flu strain)와 같은 균주에 대한 것이다.
2009년 4월에, 멕시코와 미국을 포함한 많은 국가에서 돼지독감이 인간에게 발병되었음이 확인되었고, 이후 전세계적으로 빠르게 퍼졌다. 2009년 6월에는 WHO에 의해 전염병으로 선포되었다. 이 질병은 새롭게 확인된 돼지 인플루엔자 바이러스 A/California/04/2009 A(H1N1)에 의한 것이다. 이 돼지독감 균주는 현재의 인간 계절 백신에서의 A(H1N1)를 포함하여, 현재의 인간 인플루엔자 백신 균주와의 면역학적 교차반응성이 없는 것처럼 보인다. 이 바이러스는 '돼지 인플루엔자,' '신규 돼지-유래 H1N1 인플루엔자,' '인간-돼지 인플루엔자,' '신규 인플루엔자 A(H1N1)' 및 '인플루엔자 A(H1N1)'과 같이 다양하게 불린다.
이러한 돼지독감 바이러스와 이들의 변종이, 인간에서 인간으로 전파되는 것을 막을 수 있는 백신에 대한 요구가 있다.
본 발명의 제1의 태양에 따르면, H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스의 적혈구응집소(hemagglutinin)를 함유하는 백신이, 수중유 에멀젼 어쥬번트(oil-in-water emulsion adjuvant)로 면역증강된다. 이 적혈구응집소는 수용체에서 면역반응을 유도하고, 상기 어쥬번트는 면역반응의 이종변종 커버능(heterovariant coverage)을 증가시킨다. 비록, 특정 H1 항원은 자신의 돼지독감 플루에 대하여 보호할 수 없을지라도, 이 어쥬번트는 면역반응을 증가시켜, 백신 적혈구응집소가 돼지독감 플루의 적혈구응집소와의 면역 교차 반응성이 낮아도 보호가 가능하다. 더욱이, 백신이 돼지독감 플루 적혈구응집소와 면역 교차 반응하는 적혈구응집소를 포함한다면, 동종의 균주에 대한 보호뿐만 아니라, 자연발생의 드리프트 종(drift strains)과 같은 이들의 변종에 대한 보호가 가능해진다.
따라서, 본 발명은 (i) H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소 및 (ii) 수중유 에멀젼 어쥬번트를 포함하는 백신을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 돼지독감 환자(일반적으로 인간)의 면역화 방법을 제공한다.
몇몇 구체예에서는, H1 적혈구응집소는 SEQ ID NO: 3 보다는 SEQ ID NO: 1과 더 밀접한 관련이 있고, 다른 구체예에서는, SEQ ID NO: 1 보다는 SEQ ID NO: 3과 더 밀접한 관련이 있다.
본 발명은 (i) SEQ ID NO: 3 보다는 SEQ ID NO: 1과 더 밀접한 관련이 있는 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소 및 (ii) 수중유 에멀젼 어쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 이 조성물은 1가의 백신(즉, 단일의 인플루엔자 바이러스종 유래의 적혈구응집소 항원을 포함)일 수 있으나, 몇몇 구체예에서는, 예를 들면, H3N2 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소 및 인플루엔자 B 바이러스 적혈구응집소를 포함하는 다가의 백신일 수 있다.
본 발명의 제2의 태양에 따르면, 본 발명은 2개의 다른 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함하는 면역원성 조성물을 제공하며, 여기서 (i) 제1의 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소는 SEQ ID NO: 3 보다는 SEQ ID NO: 1과 더 밀접한 관련이 있고, (ii) 제2의 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소는 SEQ ID NO: 1 보다는 SEQ ID NO: 3과 더 밀접한 관련이 있고, 상기 조성물은 면역 어쥬번트로서 수중유 에멀젼 어쥬번트를 함유한다. 면역증강된 H1 적혈구응집소의 이러한 혼합물은 H1 인플루엔자 A 바이러스종에 대하여 현재 이용가능한 것 보다 더 넓은 스펙트럼의 보호를 제공한다. 이 조성물은 또한 (iii) H3N2 및/또는 (iv) 인플루엔자 B 바이러스 항원을 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 이 조성물은 (iii) H3N2, (iv) B/Victoria/2/87 유사 인플루엔자 B 바이러스종, 및 (v) B/Yamagata/16/88 유사 인플루엔자 B 바이러스종을 포함한다.
본 발명의 제 3 태양에 따르면, H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 함유하는 1가 백신은 3가의 A/H1N1-A/H3N2-B 계절 인플루엔자 백신과 함께 투여되며, 여기서 이들 백신 모두는 수중유 에멀젼으로 면역증강된다. 1가 백신은 SEQ ID NO: 3 보다는 SEQ ID NO: 1과 더 밀접한 관련이 있는 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함하고, 3가 백신은 SEQ ID NO: 1 보다는 SEQ ID NO: 3과 더 밀접한 관련이 있는 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함한다. 1가 백신은 3가 백신 투여 이전, 이후 또는 동시에 투여될 수 있다. 두개의 백신이 별도로 투여되는 경우, 투여 간격은 2-26주일 수 있다. 하나의 유용한 구체예에서, 우선 3가 계절 백신(FLUAD™ 산물로 면역증강됨)을 투여받은 환자는 이후에 1가 백신(면역증강됨)을 받는다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 면역증강된 3가 계절 백신의 사전투여는 SEQ ID NO: 3 보다는 SEQ ID NO: 1 와 더 밀접한 관련이 있는 적혈구응집소와 함께 1가 H1N1 백신의 효능을 향상시킬 수 있다.
관련 구체예에서, H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 함유하는 1가 백신은 4가의 A/H1N1-A/H3N2-B-B 계절 인플루엔자 백신과 함께 투여되며, 여기서 2개의 B종 균주는 B/Victoria/2/87 유사 균주 및 B/Yamagata/16/88 유사 균주이며, 이들 백신 모두는 수중유 에멀젼으로 면역증강된다. 1가 백신은 SEQ ID NO: 3 보다는 SEQ ID NO: 1과 더 밀접한 관련이 있는 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함하고, 4가 백신은 SEQ ID NO: 1 보다는 SEQ ID NO: 3과 더 밀접한 관련이 있는 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함한다. 1가 백신은 3가 백신 투여 이전, 이후 또는 동시에 투여될 수 있다. 두개의 백신이 별도로 투여되는 경우, 투여 간격은 2-26주일 수 있다. 하나의 유용한 구체예에서, 우선 1가 백신을 투여받은 환자는 이후에 4가 백신을 받는다.
본 발명의 제 4 태양에 따르면, H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함하는 1가 백신은 2회 투여(two-dose) 처방에 따라 투여되며, 여기서 1가 백신의 모든 투여는 수중유 에멀젼과 함께 투여된다. 1가 백신은 SEQ ID NO: 3 보다는 SEQ ID NO: 1과 더 밀접한 관련이 있는 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함한다. 두번의 투여는 1-6주 간격으로 투여되는 데, 예를 들면 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주 간격으로 투여된다. 몇몇 구체예에서, H1 적혈구응집소는 1가 백신 2개 모두에 있어서 동일하고, 다른 구체예에서는 2개의 1가 백신에 있는 H1 적혈구응집소는 다른 아미노산 서열, 예를 들면 20개 이하의 아미노산이 다를 수 있다(예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산 치환).
항원 성분
본 발명은 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 백신항원으로서 사용한다. 이 항원은 일반적으로 인플루엔자 비리온으로부터 제조될 수 있으며, 또는 적혈구응집소는 재조합 숙주(예를 들면, baculovirus 백터을 사용하여 곤충세포주에서)에서 발현될 수 있고, 정제형(참조문헌 1, 2 및 3 참조) 또는 바이러스 유사 입자형(VLPs; 참조문헌 4 및 5 참조)으로 사용될 수 있다. 그러나, 일반적으로, 항원은 비리온으로부터 유래될 것이다.
현재, 다양한 형태의 인플루엔자 바이러스 백신이 이용된다(참조문헌 17 및 18 참조). 알려진 바이러스는, 일반적으로 살아있는 바이러스 또는 불활성화된 바이러스에 기초한다. 본 발명의 백신내의 항원은 불활성화된 바이러스 형태를 취한다. 불활성화된 백신은 전체(whole) 비리온, 스플리트(split) 비리온, 또는 정제된 표면 항원에 기초한다. 바이러스를 불활성화하기 위한 화학수단은, 유효량의 하나 이상의 세제, 포름알데히드, 포르말린, β-프로피오락톤, 또는 UV 와 같은 것으로 처리하는 것을 포함한다. 다른 화학수단은 메틸렌블루, 솔라렌(psoralen), 카복시풀러렌(carboxyfullerene (C60)) 또는 이들의 조합으로의 처리를 포함한다. 바이러스 불활성화를 위한 다른 방법은 공지이며, 예를 들면 디에틸아민, 아세틸에틸렌이민 또는 감마선 방사를 들 수 있다.
백신은 전체 비리온, 스플리트 비리온, 또는 정제된 표면항원(적혈구응집소와 일반적으로 뉴라미니다제(neuraminidase))을 포함할 수 있다. 스플리트 비리온 및 정제된 표면항원(즉, 서브비리온 백신)은 특히 본 발명에 유용하다.
비리온은 다양한 방법에 의해 바이러스 함유액으로부터 수거될 수 있다. 예로써, 정제공정은 비리온 파괴제를 함유하는 선형 수크로스 구배 용액을 이용하여 존 원심분리(zonal centrifugation)에 의할 수 있다. 이후, 항원은 선택적으로 희석, 정용여과(diafiltration)를 거쳐 정제될 수 있다.
'트윈-에테르(Tween-ether)' 스플리팅 공정을 포함하여, 스플리트 비리온은 ethylether, polysorbate 80, deoxycholate, tri-N-butyl phosphate, Triton X-100, Triton Nl 01, cetyltrimethylammonium bromide, Tergitol NP9 등과 같은 물질로 처리함으로써 서브비리온 제제를 만들 수 있다. 인플루엔자 바이러스를 스플리팅하는 방법은 당업계에서 공지이며, 예로서 참조문헌 7-12 등을 참조. 바이러스를 스플리팅하는 것은, 일반적으로 파괴농도의 스플리팅제로 감염성 또는 비 감염성의 전체 바이러스를 파괴하거나 또는 단편화함으로써 얻을 수 있다. 이러한 파괴에 의해, 바이러스의 통합성을 변경하여, 바이러스 단백질의 전체 또는 부분적인 용해가 가능하다. 바람직한 스플리팅제는 비이온성 및 이온성(예, 양이온성) 계면활성제이며, 구체적인 예로서 다음과 같은 것이 있다: 알킬글리코시드, 알킬티오티오글리코시드, 아실 당, 술포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카미드, 헤카메그, 아킬펜옥시-폴리에톡시에탄올, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTABs (cetyl trimethyl ammonium bromides), 트리-N-부틸 포스페이트, Cetavlon, 미리스틸트리메틸암모늄 염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐펜옥시 폴리옥시에탄올(예, Triton X-100 또는 Triton N101과 같은 트리톤 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(트윈 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 등을 들 수 있다. 하나의 유용한 스플리팅 공정은, 소듐데옥시콜레이트(sodium deoxycholate) 및 포름알데히드의 연속적인 효과를 이용하며, 스플리팅은 수크로스 밀도 구배액과 같이 초기의 비리온 정제단계 동안 일어날 수 있다. 따라서, 스플리팅 공정은 (비-비리온 물질을 제거하기 위해) 비리온-함유 물질의 정제, (예를 들면, CaHPO4 흡착과 같은 흡착법을 이용하여) 수확한 비리온의 농축, 비-비리온 물질로부터 전체 비리온을 분리, 밀도 구배 원심분리 단계(소듐데옥시콜레이트와 같은 스플리팅제를 함유하는 수크로스 구배)에서 스플리팅제를 이용한 비리온 스플리팅, 불필요한 물질을 제거하기 위한 여과(예, 초여과)의 단계들을 포함할 수 있다. 통상, 스플리트 비리온은 소듐포스페이트로 완충된 등장성 염화나트륨 용액에 재현탁할 수 있다. BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 산물들은 스플리트 백신이다.
정제된 표면 항원 백신은 인플루엔자 표면 항원 적혈구응집소 및, 일반적으로는 뉴라미니다제를 또한 포함한다. 정제된 형태의 이들 단백질을 제조하는 공정은 당업계에서 잘 알려져 있다. FLUVIRIN™, AGRIPP AL™ 및 INFLUVAC™ 산물은 서브유닛 백신이다.
또한, 인플루엔자 항원은 INFLEXAL V™ 및 INVAVAC™ 산물과 같은, 비로좀(virosome)(핵산 프리 바이러스 유사 리포좀 입자)의 형태로 제공될 수 있지만, 본 발명과 함께 비로좀을 사용하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 몇몇 구체예에서, 인플루엔자 항원은 비로좀의 형태가 아니다.
백신의 적혈구응집소 항원은 어떠한 적합한 균주에서 유래한 것일 수 있다. 몇몇 구체예에서, 적혈구응집소는, 면역증강되지 않는 형태로 인간개체에 투여되었을 때, A/California/04/2009 적혈구응집소(SEQ ID NO: 1; GI:227809830)와 교차반응하지 않는 항-적혈구응집소 항체를 유도하는 것이며; 이들 구체예에서, 백신의 어쥬번트는 면역반응을 증가시켜, 인간개체가 A/California/04/2009 적혈구응집소와 교차반응하지 않는 항체를 생산하도록 한다. 다른 구체예에서, 적혈구응집소는, 면역증강되지 않는 형태로 인간개체에 투여되었을 때, A/California/04/2009 적혈구응집소(SEQ ID NO: 1)와 교차반응하지 않는 항-적혈구응집소 항체를 유도할 수 있으며; 이들 구체예에서, 백신의 어쥬번트는 면역반응을 증가시켜, 인간개체가 A/California/04/2009의 드리프트종에 대해 보호하도록 도울 수 있는, 더 넓은 스펙트럼의 항체를 생산하도록 한다. 다른 구체예에서, 적혈구응집소는 A/California/04/2009 (SEQ ID NO: 1)에서 유래한다. 다른 구체예에서, 적혈구응집소는 SEQ ID NO: 2와 적어도 i%의 서열동일성을 갖는 HA1 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 i란 85 이상, 예를 들면 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 그 이상(예, 100)을 의미한다. 다음의 알려진 바이러스종 중 어떠한 것으로부터 이용가능하다:
A/swine/Guangxi/17/2005, A/Swine/Ohio/891/01, A/Swine/Indiana/9K035/99, A/Swine/Indiana/P12439/00, A/swine/Minnesota/ 1192/2001, A/SW/MN/23124-T/01, A/swine/Guangxi/ 13/2006, A/swine/Minnesota/00194/2, A/SW/MN/l 6419/01, A/Swine/Illinois/100085 A/01, A/swine/OH/511445/2007, A/Swine/Illinois/ 100084/01, A/Swine/North Carolina/93523/01, A/Turkey/MO/24093/99, A/swine/Korea/PZ4/2006, A/swine/Korea/PZ7/2006, A/swine/Kansas/00246/2004, A/swine/Iowa/24297/ 1991 , A/swine/Korea/CY08/2007, A/swine/Korea/JL02/2005, A/swine/Maryland/23239/1991, A/swine/Korea/S 11/2005, A/turkey/IA/21089-3/1992, A/swine/Wisconsin/1915/1988, A/Swine/Iowa/930/01, A/swine/Korea/Hongsong2/2004, A/Ohio/3559/1988, A/swine/Iowa/17672/1988, A/turkey/NC/19762/1988, A/swine/St-Hyacinthe/106/1991, A/swine/Korea/JL04/2005, A/swine/Korea/JL01/2005, A/WI/4755/1994, A/swine/California/T9001707/1991, A/swine/Korea/Asan04/2006, A/MD/12/1991, A/Swine/Wisconsin/235/97, A/swine/Kansas/3228/1987, A/Swine/Indiana/ 1726/1988, A/swine/Ontario/ 11112/04, A/Swine/Wisconsin/ 163/97, A/SW/MO/1877/01, A/swine/Shanghai/3/2005, A/turkey/NC/17026/1988, A/swine/Iowa/31483/1988, A/swine/Guangdong/2/01, A/swine/Iowa/1/1987, A/swine/Iowa/3/1985, A/swine/Tennessee/31/1977 등을 들 수 있다.
또한, 적합한 HA 항원을 갖는 H1N1종은 A/California/04/2009 자체, A/California/7/2009, A/Texas/5/2009, A/England/195/2009, 및 A/New York/18/2009을 포함한다.
바람직한 구체예는, 면역증강되지 않는 형태로 인간개체에 투여되었을 때, A/California/04/2009 적혈구응집소(SEQ ID NO: 1)와 교차반응하지 않는 항-적혈구응집소, 예를 들면 상기한 바와 같이 SEQ ID NO: 2와 적어도 i% 서열동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 적혈구응집소 항체를 유도할 수 있는 적혈구응집소를 포함한다.
몇몇 구체예에서, 적혈구응집소는 SEQ ID NO: 3 (A/Chile/1/1983) 보다는 SEQ ID NO: 1 (A/California/04/2009)에 좀더 밀접한 관련이 있으며, 다른 구체예에서, 적혈구응집소는 SEQ ID NO: 1 보다는 SEQ ID NO: 3에 좀더 밀접한 관련이 있다. SEQ ID NO: 3 보다는 SEQ ID NO: 1에 좀더 밀접한 관련이 있는(즉, 동일한 알고리즘 및 파라미터를 사용하였을 때, SEQ ID NO: 3보다는 SEQ ID NO: 1과 더 높은 정도의 서열동일성을 갖는) 적혈구응집소를 'Hl*' 적혈구응집소라고 칭한다. SEQ ID NOs: 1 및 3은 80.4%의 동일성을 갖는다.
본 발명에 사용하기 위한 유용한 전장 H1 적혈구응집소 서열은, 상기와 같이 SEQ ID NO: 2에 적어도 i%의 서열 동일성 갖거나 또는 SEQ ID NO: 7에 적어도 i%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 뿐만 아니라, SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 6을 포함한다.
이상적으로는, 적혈구응집소는 HA1/HA2 절단부위 근처에서 하이퍼-베이직(hyper-basic) 영역을 포함하지 않는다. 바람직한 적혈구응집소는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호한다(하기 참조).
SEQ ID NO: 6(SEQ ID NO: 7을 포함)은 유용한 H1* 적혈구응집소이다. 이것은 잔기 214, 226 및 240에서 SEQ ID NO: 1과 상이하다(즉, 99.47%의 서열동일성).
본 발명의 조성물은, H1* 적혈구응집소와 같은 H1 적혈구응집소 및 수중유 에멀젼 어쥬번트를 포함할 뿐만 아니라, 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스와 같은 하나 이상(1, 2, 3, 4 또는 그 이상)의 추가의 인플루엔자 바이러스종에서 유래하는 항원을 포함할 수 있다.
따라서, 조성물은 하나 이상의 종을 특징으로 하는 정상 계절 백신 및 수중유 에멀젼 어쥬번트 이외에도, 적어도 하나의 H1* 적혈구응집소, 예를 들면 2개의 H1종(하나는 H1* 적혈구응집소이고 나머지 하나는 H1* 적혈구응집소가 아님)과 1개의 H3N2종과 1개의 인플루엔자 B 바이러스종을 갖는 4가 백신, 또는 2개의 H1종(하나는 H1* 적혈구응집소이고 나머지 하나는 H1* 적혈구응집소가 아님)과 H3N2종과 2개의 인플루엔자 B 바이러스종(B/Victoria/2/87 유사종 및 B/Yamagata/16/88 유사종)을 갖는 5가 백신을 포함한다. 또한, 본 발명은 H1* 적혈구응집소와 H5 적혈구응집소와 수중유 에멀젼 어쥬번트를 포함하는 2가 백신을 제공한다. 백신이 하나 이상의 인플루엔자종을 포함하는 경우, 서로 다른 종들은 일반적으로 별도로 성장시켜, 바이러스가 수확된 이후에 혼합하여 항원을 제조한다. 따라서, 본 발명의 공정은 하나 이상의 인플루엔자종 유래의 항원을 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 백신이 2개의 인플루엔자 B를 포함할 경우, 하나는 B/Victoria/2/87 유사종, 나머지 하나는 B/Yamagata/16/88 유사종이 포함될 수 있다. 이들은 보통 항원적으로 구별되나, 2개의 계통을 구별하기 위하여 아미노산 서열상의 차이로 설명될 수 있으며, 예로써 B/Yamagata/16/88 유사종은 보통(그러나 항상 그런것은 아님) 'Lee40' HA 서열(참조문헌 14)을 기준으로 넘버링할 경우에 아미노산 잔기 164에서 결실된 HA 단백질을 갖는다. 항원으로서 2개 이상의 인플루엔자 B 바이러스종을 갖는 본 발명의 몇몇 구체예에서, 적어도 2개의 인플루엔자 B 바이러스종은 구별되는 적혈구응집소를 가질 수 있지만, 관련된 뉴라미니다제를 가질수도 있다. 예를 들면, 이들은 모두 B/Victoria/2/87 유사 뉴라미니다제(참고문헌 15)를 가질수도 있고, 또는 이들은 모두 B/Yamagata/16/88 유사 뉴라미니다제를 가질수도 있다. 예를 들면, 2개의 B/Victoria/2/87 유사 뉴라미니다제는 모두 하나 이상의 다음의 서열 특이성을 가질 수 있다: (1) 잔기 27에서 세린이 아니라 바람직하게는 루이신, (2) 잔기 44에서 글루타메이트가 아니라 바람직하게는 리신, (3) 잔기 46에서 트레오닌이 아니라 바람직하게는 이소루리신, (4) 잔기 51에서 프롤린이 아니라 바람직하게는 세린, (5) 잔기 65에서 아르기닌이 아니라 바람직하게는 히스티딘, (6) 잔기 70에서 글리신이 아니라 바람직하게는 글루타메이트, (7) 잔기 73에서 루이신이 아니라 바람직하게는 페닐알라닌, 및/또는 (8) 잔기 88에서 프롤린이 아니라 바람직하게는 글루타민. 유사하게 몇몇 구체예에서, 뉴라미니다제는 잔기 43에서 결실이 일어나거나 트레오닌을 가질 수 있으며; 비록 최근의 바이러스종들은 잔기 43의 트레오닌을 재획득하는 경우도 있으나, 뉴라미니다제(NA) 유전자에서 3개의 뉴클레오티드가 결실되어 일어나는 잔기 43의 아미노산 결실은, B/Victoria/2/87 유사종의 특징으로 보고되었다(참고문헌 15). 물론 역으로, S27, E44, T46, P51, R65, G70, L73 및/또는 P88과 같은 2개의 B/Yamagata/16/88 유사 뉴라미니다제들에 의해 반대의 특징들이 공유될 수 있다. 이들 아미노산은 'Lee40' 뉴라미니다제 서열을 기준으로 넘버링된다(참고문헌 16).
적혈구응집소 단백질이 정제되는 인플루엔자 바이러스는 항바이러스 치료법에 저항성을 보일 수 있다(예를 들면, oseltamivir(참고문헌 17) 및/또는 zanamivir에 저항성).
몇몇 구체예에서, 본 발명에 사용되는 바이러스종은 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합 우선성을 갖는 적혈구응집소를 갖는다. 인간의 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류(갈락토오스에 시알산이 α-2,6 연결)를 갖는 다당류 수용체에 결합하지만, 난(egg) 및 베로 세포(Vero cell)는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 다당류 수용체를 갖는다.
MDCK와 같은 세포에서의 인간 인플루엔자 바이러스의 성장은, 난 패시징(egg passaging)과 달리, 천연의 Sia(α2,6)Gal 결합을 유지하기 위해 적혈구응집소에 선택압력을 제공한다. 바이러스가 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대해 결합 선호를 갖는지를 결정하기 위하여, 다양한 분석법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 참조문헌 18은 친화도 상수(affinity constant)의 민감하고도 정량적인 측정을 제공하는, 인플루엔자 바이러스 수용체-결합 활성을 위한 고체상 효소결합 분석법(solid-phase enzyme-linked assay)을 설명하고 있다. 참조문헌 19는 2개의 다른 시알산화글리코단백질에 바이러스가 결합하였는지를 평가할 수 있는 고체상 분석법을 사용하였으며(Sia(α2,3)Gal determinant를 갖는 ovomucoid; 및 Sia(α2,6)Gal determinant인 돼지 α2-macroglobulin), 또한 2개의 수용체 유사체인 프리 시알산(Neu5Ac) 및 3'-시알화락토오스(Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc)에 대하여 바이러스의 결합을 평가한 분석법을 기술하고 있다. 참조문헌 20은 α2,3 또는 α2,6 연결에 대한 수용체 선호성을 명확히 판별할 수 있는 글리칸 어레이를 사용한 분석법을 보고하고 있다. 참조문헌 21은 Sia(α2,6)Gal 또는 Sia(α2,3)Gal을 함유하도록 효소변형된 인간 적혈구의 응집에 기초한 분석법을 보고하고 있다. 분석법의 타입에 따라, 바이러스 자체와 직접적으로 분석이 수행될 수 있고, 또는 바이러스에서 정제된 적혈구응집소와 간접적으로 분석이 수행될 수 있다.
몇몇 구체예에서, H1 적혈구응집소는 난-유래의 바이러스에서 관찰되는 패턴과 다른 글리코실화 패턴을 갖는다. 따라서, 적혈구응집소 HA (및 다른 글리코단백질)은 닭의 난에서 관찰되지 않는 글리코형을 포함할 수 있다. 유용한 적혈구응집소는 개의 글리코형을 포함한다.
적혈구응집소 항원을 포함하는 이외에, 본 발명의 백신은 일반적으로 뉴라미니다제 단백질, 예를 들면 바이러스성 뉴라미니다제를 포함한다. 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 뉴라미니다제 서브타입 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9에 대하여 보호할 수 있으나, 보통은 N1 (e.g. H1N1 virus) 또는 N2 (e.g. H1N2 virus)에 대하여 보호할 수 있다. 전체 비리온, 스플리트 비리온 및 서브유닛 백신은 모두 적혈구응집소 및 뉴라미니다제를 포함한다. 백신이 뉴라미니다제 항원을 포함할 경우, 이 뉴라미니다제는 SEQ ID NO: 4와 적어도 j%의 서열동일성을 가질 수 있으며, 여기서 j란 예를 들면 75, 80, 85, 88, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 그 이상 (e.g. 100)와 같은 75 이상을 의미한다. 많은 그러한 서열이 이용된다. 몇몇 구체예에서, 뉴라미니다제는 SEQ ID NO: 5 보다는 SEQ ID NO: 4에 좀더 밀접한 관련이 있다. SEQ ID NOs: 4 및 5는 서로 82%의 서열 동일성을 갖는다.
또한, 백신은 M1 및/또는 M2 (또는 이들의 단편), 및/또는 핵단백질과 같은 매트릭스 단백질을 포함할 수 있다. 돼지 모델에 의하면, (수중유 에멀젼으로 면역증강된) 불활성화된 H1N1 돼지 인플루엔자 바이러스 백신에 M2를 첨가할 경우 백신의 효능이 증가할 수 있음을 보여준다(참조문헌 22).
인플루엔자 바이러스는 reassortant 종일 수 있고, 역유전학 기술에 의해 얻어질수도 있다. 역유전학 기술(참조문헌 23-27)은 플라즈미드를 사용하거나 또는 플라즈미드-프리 시스템을 사용하여 원하는 게놈 단편을 갖는 인플루엔자 바이러스를 시험관내에서 제조할 수 있다. 일반적으로, 이 기술은 (a) poll 프로모터로부터 원하는 바이러스 RNA 분자를 인코딩하는 DNA 분자, 및 (b) poll 프로모터로부터 바이러스 단백질을 인코딩하는 DNA 분자를 발현하는 공정과 관련되며, 이때 세포내에서 양 타입의 DNA가 발현되어 완전한 감염성 바이러스의 어셈블리가 이루어진다. 바람직하게는, 이 DNA는 모든 바이러스 RNA 및 단백질을 제공하지만, 또한 일부 RNA 및 단백질을 제공하기 위하여 보조 바이러스(helper virus)를 이용하는 것이 가능하다. 각각의 바이러스 RNA를 제조하기 위해 별개의 플라즈미드를 이용하는 플라즈미드에 기초한 방법이 바람직하며(참조문헌 28-30), 또한 이들 방법은 모든 또는 일부의 바이러스 단백질(예, PBl, PB2, PA 및 NP 단백질)을 발현하기 위하여 플라즈미드를 이용하며, 몇몇 방법에서는 12개 이하의 플라즈미드가 이용된다. 개의 세포가 이용된다면, 개의 poll 프로모터가 이용될 수 있다(참조문헌 31).
소요되는 플라스미드의 수를 줄이기 위하여, 하나의 접근은 [32], 동일한 플라스미드 (e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8 인플루엔자 A vRNA 조각을 코딩하는 서열) 상의 다수의 RNA 중합효소 I 전사 카세트 (바이러스성 RNA 합성을 위한), 및 다른 플라스미드 (e.g. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 9 인플루엔자 A mRNA 전사체를 코딩하는 서열) 상의 RNA 중합효소 II 프로모터를 갖는 다수의 단백질-코딩 영역을 결합하는 것이 있다. 이 방법은: (a) 단일 플라스미드 상의 PB1, PB2 및 PA mRNA-코딩 영역; 및 (b) 단일 플라스미드 상의 모든 8 vRNA-코딩 조각을 포함할 수 있다. 하나의 플라스미드 상의 NA 및 HA 조각과, 다른 플라스미드 상의 6개의 다른 조각을 포함하는 것도 가능한 방법이다.
바이러스성 RNA 조각을 코딩하기 위한 pol I 프로모터의 사용의 대안으로서, 박테리오파지 중합효소 프로모터를 사용하는 것이 가능하다[33]. 예를 들면, SP6, T3 또는 T7 중합효소의 프로모터는 편리하게 사용될 수 있다. 비록 세포가 외인성 중합효소를 코딩하는 플라스미드로 트랜스펙션되어야 하지만, pol I 프로모터의 종-특이성 때문에 박테리오파지 중합효소 프로모터는 많은 세포 유형(e.g. MDCK)에 더욱 편리할 수 있다.
다른 기술로서, 바이러스성 RNAs와 단일 주형으로부터 발현 가능한 mRNAs를 동시에 코딩하는 이중의 pol I 및 pol II 프로모터를 사용하는 방법이 가능하다[34, 35].
본원 발명에서 사용된 인플루엔자 A 바이러스는 A/PR/8/34 바이러스 (전형적으로 A/PR/8/34의 6개의 조각으로서, 6:2 병원체와 같은 백신 균주의 HA 및 N 조각을 포함) -특히 알에서 생장하는 바이러스-의 하나 이상의 RNA 조각을 포함할 수 있다. 또한, A/WSN/33 바이러스 또는 백신 제조를 위해 병원체 바이러스를 생산할 수 있는 어느 다른 바이러스 균주로부터 하나 이상의 RNA 조각을 포함할 수 있다. 전형적으로, 본원 발명은 사람 간에 전염 가능한 바이러스 균주로부터 보호하는데, 이 균주의 게놈은 보통 포유류(e.g. 사람) 인플루엔자 바이러스에서 유래된 적어도 하나의 RNA 조각을 포함할 것이다.
항원의 원천으로 사용된 바이러스는 알 또는 세포 배양 상에서 생장할 수 있다. 인플루엔자 바이러스 생장을 위한 현재 기본 방법은 알 산물(요막액)로부터 정제한 바이러스를 무특이변체(specific pathogen-free; SPF) 발육계란(embryonated hen eggs)에 이용하는 것이다. 하지만 최근에는, 바이러스를 동물세포 배양에서 생장시키고 있는데, 속도와 알레르기상의 이유로 이 생장 방법이 바람직하다. 만일 알-기초 바이러스성 생장이 사용된다면, 하난 이상의 아미노산이 알의 요막액 안으로 바이러스와 함께 도입될 것이다 [12].
세포배양에 있어서, 바이러스성 생장 기질은 전형적으로 포유동물 기원의 셀 라인일 것이다. 적당한 원천 포유동물 세포는 햄스터, 소, 영장류 (사람 및 원숭이를 포함) 및 개의 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 신장 세포, 섬유아세포, 망막세포, 폐 세포 등과 같은 여러 유형의 세포가 사용될 수 있다. 적당한 햄스터 세포의 예는 BHK21 또는 HKCC를 가지는 셀 라인이다. 적당한 원숭이 세포(e.g. 아프리카 녹색 원숭이 세포)는 Vero 셀 라인으로서 신장 세포와 같은 것이다. 적당한 개 세포는 MDCK 셀 라인으로서 신장 세포와 같은 것이다. 따라서 적당한 셀 라인은 MDCK, CHO, 293T, BHK, Vero, MRC-5, PER.C6, WI-38 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 인플루엔자 바이러스의 생장을 위한 바람직한 포유동물 셀 라인은 Madin Darby canine kidney로부터 유래한 MDCK 세포 [36-39], 아프리카 녹색 원숭이 (Cercopithecus aethiops ) 신장으로부터 유래한 Vero 세포 [40-42], 또는 인간배아 망막아세포로부터 유래한 PER.C6 세포[43] 등을 포함한다. 이들 셀 라인은 광범위하게 사용가능한데, 예를 들면 American Type Cell Culture (ATCC ) collection, Coriell Cell Repositories 또는 European Collection of Cell Cultures (ECACC) 등으로부터 가능하다. 예를 들면, ATCC는 카타로그 번호 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587 하에 다양한 다른 Vero 세포를 제공하며, 카타로그 번호 CCL-34 하에 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁번호 96022940 하에 ECACC로부터 이용가능하다. 포유동물 셀 라인에 대안으로 덜 바람직한 것으로서, 바이러스를 오리 (e.g. 오리의 망막 세포) 또는 암탉으로부터 유래된 셀 라인을 포함하는 조류 셀 라인에서 생장시킬 수 있다 [44-46]. 조류 셀 라인의 예로, 조류 배아줄기세포 [44, 47] 및 오리 망막 세포 [45]를 포함한다. 적당한 조류 배아줄기세포는 닭 배아줄기세포인 EB45, EB14, 및 EB14-074로부터 유래한 EBx 셀 라인을 포함한다 [48]. 닭 배아섬유아세포 (CEF) 또한 사용될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 생장을 위한 가장 바람직한 셀 라인은 MDCK 셀 라인이다. 원 MDCK 셀 라인은 ATCC의 CCL-34로부터 이용가능하나, 이 셀 라인의 유도체도 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 참조문헌 36은 MDCK 셀 라인을 개시하고 있는데, 이는 서스펜션 배양 (DSM ACC 2219로 기탁된 'MDCK 33016')에서의 생장을 위해 채택되었다. 유사하게, 참조문헌 49는 MDCK-유래 셀 라인을 개시하고 있는데, 이는 serum-free culture (FERM BP-7449로 기탁된 ‘B-702')에서 서스펜션으로 생장한다. 참조문헌 50은 비-발암성 MDCK 세포를 개시하는데, 이는 ’MDCK-S' (ATCC PTA-6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 ‘MDCK-SF1003' (PTA-6503)을 포함한다. 참조문헌 51은 감염에 대한 높은 민감성을 가지는 MDCK 셀 라인을 개시하고 있는데, ’MDCK.5F1' 세포 (ATCC CRL-12042)를 포함한다. 이들 MDCK 셀 라인 중 어느 것도 사용될 수 있다.
포유동물 셀 라인에서 바이러스를 생장시키면, 유리하게도 조성물에서 알 단백질 (e.g. 난백 알부민 및 오보뮤코이드) 및 닭 DNA가 없어지게 되고, 이에 따라 알레르기 정도를 감소시킬 수 있다.
셀 라인에서 바이러스를 생장시키고, 생장을 위한 배양, 및 또한 바이러스성 접종원을 배양의 시작에 사용하면, 바람직하게는 단순헤르페스바이러스, 호흡기합포체바이러스, 파라인플루엔자바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 버나바이러스, 서코바이러스, 및/또는 파보바이러스의 염려가 없어질 것이다 [52]. 단순페르페스바이러스가 없는 것이 특히 바람직한 것이다.
MDCK와 같은 셀 라인 상에서 생장하는 동안, 바이러스는 서스펜션 [36, 53, 54] 또는 지지 배양 (adherent culture)에서 생장될 수 있다. 서스펜션 배양을 위한 하나의 적당한 MDCK 셀 라인은 MDCK 33016 (DSM ACC 2219로서 기탁된) 이다. 대안으로서, 마이크로캐리어 배양법이 이용될 수 있다.
인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 셀 라인은, 바람직하게는, serum-free culture 배지 및/또는 protein free 배지 상에서 생장된다. 배지는 본원 발명의 명세서 상에 serum-free 배지로서 인용되었는데, 사람 또는 동물 기원의 혈청으로부터 아무런 첨가물도 없다. Protein-free는 배양수단이고, 세포의 증식이 단백질, 성장인자, 다른 단백질 첨가물 및 비-혈청 단백질을 제외한 채 발생하고, 다만 임의적으로 바이러스성 생장에 필요한 트립신 또는 다른 단백질 분해효소와 같은 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 배양으로 생장하는 세포는 자연적으로 그 자체로 단백질을 포함한다.
인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 셀 라인은, 바이러스성 복제를 하는 동안 바람직하게는, 37℃에서 생장하는데, 예를 들면 30-60℃, 31-35℃, 또는 33±1℃이다.
배양된 세포에서 바이러스를 증식하는 방법은, 일반적으로 배양된 세포와 배양될 균주를 접종하는 단계, 바이러스 증식에 필요한 기간 동안 감염된 세포를 기르는 단계, 예를 들면 바이러스 역가 또는 항원 발현에 따른 것 (e.g. 접종 후 24 내지 168 시간), 증식된 바이러스를 수집하는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 바이러스에 접종되는데 (PFU 또는 TCID50에 의해 측정된) 세포 비율은 1:500 내지 1:1 이고, 바람직하게는 1:100 내지 1:5, 보다 바람직하게는 1:50 내지 1:10이다. 바이러스는 세포의 서스펜션에 더해지거나 세포의 단층에 적용되고, 바이러스는 적어도 60분 동안 세포 상에 흡수되고, 다만 일반적으로 300분 미만, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃ 바람직하게는 28℃ 내지 37℃에서 90 내지 240분 사이이다. 획득한 배양 상청액의 바이러스성 산물을 증가시키기 위하여, 동결융해 또는 효소 활동에 의해 감염된 세포 배양 (e.g. 단층)이 제거될 수 있다. 획득한 유동체는 불활성되거나 또는 동결된 채 저장된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 보다 바람직하게는 0.001 내지 2의 감염다중도 ("m.o.i.")에서 감염될 것이다. 더욱더 바람직하게는, 세포는 약 0.01의 m.o.i.에서 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60 시간에 획득할 수 있다. 바람직하게는, 세포는 감염 후 34 내지 48 시간에 획득할 수 있다. 가장 바람직하게는, 세포는 감염 후 34 내지 48 시간에 획득할 수 있다. 바이러스성 방출을 위하여 세포 배양을 하는 동안에 일반적으로 단백질 분해효소 (전형적으로 트립신)가 추가될 수 있고, 단백질분해효소는 배양하는 동안 어떠한 적당한 단계에서도 추가될 수 있다.
적혈구응집소 (HA)는 불활성화된 인플루엔자 백신에 있어서 주된 면역원이고, 백신 투여량은 HA 수준을 참고하여 표준화되는데, 전형적으로, 일원방사면역확산법(SRID assay)에 의해 측정된다.
현재 백신은 일반적으로 균주 당 약 15μg의 HA를 포함하고, 또한 아이에게 투여하는 경우 또는 긴급한 상황인 경우 등과 같을 때에는 더 낮은 투여량으로 이용될 수도 있다. 1/2 (i.e. 균주 당 7,5μg의 HA, FOCETRIA™), 1/4 (i.e. 균주당 3.75μg, PREPANDRIX™) 및 1/8과 같은 분할 투여량으로 사용되고 [56, 57], 높은 투여량으로도 사용된다 (e.g. 3x 또는 9x 투여량[58, 59]). 따라서 백신은 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 150μg의 HA를 포함할 것이고, 바람직하게는 0.1 내지 50μg, 예를 들면 0.1-20μg, 0.1-15μg, 0.1-10μg, 0.1-7.5μg, 0.5-5μg, 3.75-15μg 등이다. 특정 투여량은 균주당 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 3,75, 약 1.9, 약 1.5 μg 등을 포함한다. 균주 당 동일한 HA 질량은 일반적이다. 본원 발명에서와 같이 백신 내에 아쥬번트가 있을 시에는 낮은 투여량 (즉, <15μg/dose)이가장 유용하다. 몇 몇 연구 (e.g. 참조문헌 60)에서 최고 90μg 의 투여량이 사용되었으나, 본원 발명의 조성물은 일반적으로 15μg/dose/균주 이하를 포함할 것이다.
본원 발명에서 사용된 HA는 바이러스에서 발견되는 것과 같은 자연형 HA 일 것이고, 또는 변형될 것이다.
본원 발명의 조성물은, 특히 스플릿 또는 표면항원백신을 위하여, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제('Tweens'로 알려진, 예를 들면 폴리소르베이트80), 옥토시놀 (옥토시놀-0(트리톤 X-100) 또는 10, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 ('CTAB'), 또는 소듐 디옥시콜레이트와 같은 세제를 포함할 수 있다. 세제는 오직 극 소량으로 존재할 수도 있다. 따라서 백신은 옥토시놀-10,α-토코페릴 하이드로겐 숙시네이트 및 폴리소르베이트80 각각 1 mg/ml 미만을 포함할 수 있다. 극소량의 다른 잔류 성분은 항생제, 예를들면 네오마이신, 카나마이신, 폴리마이신 B 등일 수 있다.
숙주 세포 DNA
셀 라인 상에서 생장하는 바이러스에서, DNA의 어떤 종양 활성을 최소화 하기 위하여, 최종 백신 안에서 잔류 셀 라인 DNA의 양을 최소화 하는 것은 일반적인 방법이다. 따라서 조성물은 비록 숙주 세포 DNA의 극소량이 존재하더라도, 바람직하게는 투여량 당 잔류 숙주 세포 DNA 10ng (바람직하게는 1ng 미만, 및 보다 바람직하게는 100pg 미만)을 포함한다. 일반적으로, 숙주세포 DNA는 본원 발명의 조성물로부터 제외되는 것이 바람직하고 DNA는 100bp 보다 긴 것이다. 잔류 숙주세포 DNA의 측정은 현재는 생물학에 있어서 일반적인 조절 요건이고, 당업자에게도 일반적인 능력수준에 있는 것이다.DNA 측정에 사용된 분석은 일반적으로 입증된 분석일 것이다 [61, 62]. 입증된 분석의 성능 특성은 수학적 및 정량적 용어로 기술될 수 있고, 이것의 가능한 오류의 원천을 확인할 수 있다. 이러한 분석은 일반적으로 정확도, 정밀도, 특이성과 같은 특성을 테스트할 수 있다.
분석이 조정되고 (e.g. 알려진 숙주세포 DNA의 표준 정량에 대하여) 및 테스트되고 나서, 정량적 DNA 측정은 일반적으로 동작될 수 있다. DNA 정량화를 위하여 세가지 주요한 기술이 사용될 수 있는데, 서던 블롯 또는 슬롯 브롯과 같은 하이브리드화 방법[63]; Threshold™ 시스템과 같은 면역 측정법[64]; 및 정량적 PCR[65] 등이다. 하이브리드화를 위한 프로브의 선택, 증폭을 위한 프라이머 및/또는 프로브의 선택 등과 같은 숙주세포에 의존하는 각 방법의 특성에 대하여 구체적인 설명이 없더라도, 당업자는 이들 방법을 용이하게 알 수 있다. 분자 장치로 부터 Threshold™ 시스템은 전체 DNA의 피코그램 수준으로 정량적인 분석하기 위한 것이고, 생약학적으로 오염된 DNA의 모니터링 수준으로 사용된다 [64]. 일반적인 분석은 바이오티닐화된 ssDNA 결합 단밸질, 우레아제-결합 안티-ss움 항체, 및 DNA 간의 반응 복합의 비-서열-특이성 형성을 포함한다. 모든 분석 성분은 제조자로부터 이용가능한 완전한 전체 DNA 분석 키트에 포함되어 있다. 다양한 상업적 제조사들은 잔류 숙주세포 DNA를 탐지하기 위하여 정량적 PCR 분석을 제공하는데, AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies 등이 있다. 사람 바이러스성 백신의 숙주세포 DNA 오염을 측정하기 위한 화학발광 하이브리드화 분석 및 전체 DNA Threshold™ 시스템의 비교는 참조문헌 66에서 기술되어 있다.
DNA 오염은 백신을 제조하는 과정에 있어서 크로마토그래피 등과 같은 기본적인 정제과정을 통하여 제거될 수 있다. 잔류 숙주세포 DNAdml 제거는 DNA 분해효소(DNase)를 이용하는 것과 같은 핵산분해효소 치료에 의해 강화될 수 있다. 숙주세포 DNA 오염을 감소하기 위한 편리한 방법은 참조문헌 67 및 68에 개시되어 있는데, 2-단계 치료를 포함하는 것으로, 우선, 바이러스성 생장에 이용될 수 있는 DNase (e.g. 벤조네이즈)를 사용하고, 비리온 붕괴에서 사용될 수 있는 양이온 세제 (e.g. CTAB)이다. β-프로피오락톤과 같은 알킬화제를 사용하는 치료도 숙주세포 DNA 제거에 이용될 수 있고, 유리하게는 포름알데하이드를 사용하지 않고 비리온을 불활성화 시키는데 사용될 수도 있다 [69].
적혈구응집소 15μg 당 숙주세포 DNA <10ng (e.g. <lng, <100pg)를 포함하는 백신이 바람직하고, 0.25ml 볼륨 당 숙주세포 DNA <10ng (e.g. <lng, <100pg)를 포함하는 백신도 마찬가지이다. 적혈구응집소 50μg 당 숙주세포 DNA <10ng (e.g. <lng, <100pg)를 포함하는 백신이 보다 바람직하고, 0.5ml 볼륨 당 숙주세포 DNA <10ng (e.g. <lng, <100pg)를 포함하는 백신도 마찬가지이다.
수중유 에멀전 아쥬번트
본원 발명의 조성물은 수중유 에멀전 아쥬번트를 포함하는데, 이는 본 조성물을 투여하는 환자에 있어서 유도되는 면역 반응 (체액성 및/또는 세포성)을 강화하는 기능을 한다. Novartis Vaccines 사의 FLU AD™ 제품은 수중유 에멀전을 포함한다.
다양한 적당한 에멀전이 알려져있고, 이들은 일반적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하고, 이들 오일 및 계면활성제는 생분해성 (대사성) 및 생적합성이다. 에멀전 내의 오일 액적은 일반적으로 지름이 5μm 미만이고, 유리하게는 에멀전은 초미립자의 오일 액적 포함하고 이들 작은 크기는 안정적인 에멀전 제공을 위하여 마이크로플루다이저를 사용하여 달성될 수 있다. 200nm 미만의 크기를 가진 액적이 바람직하고, 이들은 필터 살균을 받을 수 있다. 본원 발명은 동물 (어류와 같은) 또는 식물 원천으로부터 얻은 오일과 함께 사용될 수 있다. 식물 오일의 원천은 견과, 씨앗 및 곡물을 포함한다. 땅콩 오일, 콩 오일, 코코넛 오일, 및 올리브 오일, 가장 일반적으로 사용가능한 예는 견과 오일. 호호바 콩으로부터 얻은 것과 같은 호호바 오일을 사용할 수도 있다. 씨앗 오일은 잇꽃 오일, 목화씨 오일, 해바라기씨 오일, 참깨씨 오일 등과 같은 것을 포함한다. 곡물 군에 있어서, 옥수수 오일이 가장 손쉽게 이용가능하고, 다만 다른 시리얼 곡물, 예를 들면 밀, 귀리, 호밀, 벼, 테프, 라이밀 등과 같은 것도 사용될 수 있다. 씨앗 오일에서 자연적으로 발생하지는 않는 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10 탄소 지방산 에스터가 견과 및 씨앗 오일로부터 시작되는 적당한 재료의 가수분해, 분리 및 에스터화에 의해 제조될 수 있다. 포유동물 우유의 지방 및 오일은 대사될 수 있어서 본원 발명에 이용될 수 있다. 동물 원천으로부터 순수 오일을 얻기 위한 것으로서 분리, 정제, 비누화 및 다른 방법에 관한 과정은 당업계에 알려져있다. 대부분의 어류 포함 대사 가능한 오일은 쉽게 회복된다. 예를 들면, 대구의 간 오일, 상어 간 오일, 및 경랍과 같은 고래 오일 등 여러 어류 오일이 여기에서 사용될 수 있다. 많은 분지 사슬 오일이 5-탄소 이소프렌 단위로 합성되고 일반적으로 터페노이드로 불린다. 상어 간 오일은 분지된, 불포화된 터페노이드를 포함하는데 스쿠알렌으로 알려진 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔을 포함한다. 다른 바람직한 오일은 토코페롤이다(이하 참고). 스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀전은 특히 바람직하다. 오일의 혼합물도 사용할 수 있다.
계면활성제는 이들의 'HLB'(hydrophile/lipophile balance)에 의해 분류될 수 있다. 본원 발명의 바람직한 계면활성제는 적어도 10의 HLB, 바람직하게는 적어도 15, 및 보다 바람직하게는 적어도 16의 HLB를 가진다. 본원 발명은 이하의 계면활성제를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 폴리오시에틸렌 소르비탄 에스터 계면활성제 (일반적으로 Tweens라고 불림), 특히 폴리소르베이트20 및 폴리소르베이트80; 선형 EO/PO 블록 공중합체와 같은, 상표명 DOWF AX™로 시판되는 에틸렌 옥시드 (EO), 프로필렌 옥시드 (PO), 및/또는 부틸렌 옥시드 (BO)의 공중합체; 옥토시놀, 이는 다양한 수의 반복되는 에톡시 (옥시-1,2-에탄디일) 군 및 특히 흥미있는 옥토시톨-9 (Triton X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올)을 가짐; (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 포스파티딜콜린 (렉시틴)과 같은 포스포리피드; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 오레일 알코올 (Brij 계면활성제로 알려진), 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르 (Brij 30)과 같은 것으로부터 유래된 폴리옥시에틸렌 패티 에테르; 및 소르비타 트리올레이트 (Span 850 및소르비탄 모노라우레이트와 같은 소르비탄 에스터 (일반적으로 SPANs로 알려짐). 에멀전에 포함되기에 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트), Span 80 (소르비탄 트리올레이트), 렉시틴 및 Triton X-100 이다. 상기 언급한 바와 같이, Tween 80과 같은 세제는 이하의 실시예에 나타난바와 같이 열 안정성에 기여한다.
계면활성제는, 예를 들면, Tween 80/Span 85 혼합물과 같이 혼합물로 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트 (Tween 80)과 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 및 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 (Triton X-100)과 같은 옥토시톨의 조합도 적당하다. 다른 유용한 조합은 라우레스 9 플러스 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 및/또는 옥토시놀을 포함한다.
바람직한 계면활성제의 양 (% by weight) 은: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스터 (Tween 80과 같은) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1 %; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (Triton X-100 또는 다른 Triton 시리즈의 세제) 0.001 내지 0.1 %. 특히 0.005 내지 0.02 %; 폴리옥시에틸렌 에테르 (라우레스 9와 같은) 0.1 내지 20 %, 특히 0.1 내지 10 % 및 특히 0.1 내지 1% 또는 약 0.5 % 이다.
본원 발명에 유용한 특이적 수중유 에멀전 아쥬번트는 다음과 같으나 이에 제한되지는 않는다:
● 스쿠알렌, Tween 80 및 Span 85의 초미립 에멀전. 본 에멀전의 조성물은 볼륨으로 스쿠알렌 약 5%, 폴리소르베이트80 약 0.5% 및 Span 85 약 0.5%가 될 수 있다. 무게로는, 이들 비율은 스쿠알렌 4.3%, 폴리소르베이트 80 0.5% 및 Span 85 0.48%가 된다. 이들 아쥬번트는 'MF59'[70-72]로 알려져 있고, 참조문헌 73의 챕터 10 및 참조문헌 74의 챕터 12에 보다 상세하게 기술되어 있다. MF59 에멀전은, 유리하게는, 10mM 소듐 시트레이트 버퍼와 같은 시트레이트 이온을 포함한다.
● 스쿠알렌, α-토코페롤, 및 폴리소르베이트 80을 포함하는 에멀젼. 이 에멀젼은 2-10% 스쿠알렌, 2-10% 토코페롤 및 0.3-3% Tween 80을 포함할 수 있고, 안정된 에멀젼을 제공하기 위하여 스쿠알렌;토코페롤의 중량비가 바람직하게는 <1 (e.g. 0.90)이다. 스쿠알렌과 Tween 80은 약 5:2의 부피비 또는 약 11:5의 중량비로 존재할 수 있다. 하나의 이러한 에멀젼은 Tween 80을 PBS에 녹여 2% 용액을 얻은 후, 90ml의 이 용액을 (5g DL-α-토코페롤 및 5ml 스쿠알렌)의 혼합물과 혼합하고, 이어서 이 혼합물을 마이크로액화함으로써 만들어질 수 있다. 그 결과 얻어지는 에멀젼은 서브마이크론, 예로써 100 내지 250nm의 평균직경, 바람직하게는 180nm의 평균직경의 오일 액적을 가질 수 있다.
● 스쿠알렌, 토코페롤, 및 트리톤 세제(예, Triton X-100)를 포함하는 에멀젼. 또한, 이 에멀젼은 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 이 에멀젼은 인산버퍼를 함유할 수 있다.
● 폴리소르베이트(예, 폴리소르베이트 80), 트리톤 세제(예, Triton X-100) 및 토코페롤(예, α-토코페롤 숙시네이트)을 포함하는 에멀젼. 이 에멀젼은 이들 3개의 성분들을 약 75:11:10의 질량비{e.g. 750μg/ml polysorbate 80, HOμg/ml Triton X-100 및 lOOμg/ml α-tocopherol succinate)로 포함할 수 있으며, 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 어떠한 기여가 있어야 한다. 또한, 이 에멀젼은 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 또한, 이 에멀젼은 3d-MPL(하기 참조)를 포함할 수 있다. 수성상은 인산버퍼를 함유할 수 있다.
● 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401 ("Pluronic™ L121")을 포함하는 에멀젼. 이 에멀젼은 인산으로 완충된 염(pH 7.4)으로 조제될 수 있다. 이 에멀젼은 muramyl 디펩티드에 대한 유용한 전달 비히클이며, "SAF-I" 어쥬번트내의 트레오닐-MDP와 함께 사용되었다(0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% polysorbate 80)(참조문헌 75). 또한, 이 에멀젼은 "AF" 어쥬번트에서와 같이 트레오닐-MDP 없이 사용될 수도 있다(5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% polysorbate 80)(참조문헌 76). 마이크로액화(Microfluidisation)이 바람직하다.
● 스쿠알렌, 수성 용매 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 친수 비온성 계면활성제(e.g. polyoxyethylene (12) cetostearyl ether) 및 소수 비온성 계면활성제(e.g. orbitan monoleate 또는 'Span 80'과 같은 sorbitan ester 또는 mannide ester)을 포함하는 에멀젼. 바람직하게는, 이 에멀젼은 열가역적이며 및/또는 200 nm 미만의 크기를 갖는 오일 액적을 적어도 90부피% 갖는다(참조문헌 77). 또한, 이 에멀젼은 하나 이상의 알디톨(e.g. mannitol); 동결억제제(cryoprotective agent)(e.g. dodecylmaltoside 및/또는 sucrose와 같은 당류); 및/또는 알킬폴리글리코시드를 포함할 수 있다. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다. 이 에멀젼은 스쿠알렌 : 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르 : 소르비탄 올리에이트 : 만니톨을 330 : 63 : 49 : 61의 질량비로 함유할 수 있다.
● 0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비이온성 계면활성제를 포함하는 에멀젼. 참조문헌 78에 기술한 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딕산, 스핑고미에린 및 카디오리핀이다. 서브마이크론 크기의 액적이 바람직하다.
● 경 미네랄 오일과 같은 비대사성 오일, 및 레시틴, Tween 80 또는 Span 80과 같은 적어도 하나의 계면활성제를 포함하는 서브마이크론의 수중유 에멀젼. QuilA saponin, cholesterol, a saponin-lipophile conjugate (예, 참조문헌 79에 기술된 GPI-0100로서, 글루쿠로닉산의 카르복실기를 통하여 desacylsaponin에 지방족 아민이 추가되어 생성), 디메티이디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-bis(2-히드록시에틸)프로판디아민과 같은 첨가제를 포함할 수 있다.
● 미네랄 오일, 비이온의 친유성 에톡시화된 지방알코올, 및 비이온의 친수성 계면활성제(e.g. 에톡실화된 지방알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)를 포함하는 에멀젼(참조문헌 80).
● 미네랄 오일, 비이온의 친수성 에톡시화된 지방알코올, 및 비이온의 친유성 계면활성제(e.g. 에톡실화된 지방알코올 및/또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)를 포함하는 에멀젼(참조문헌 80).
● 사포닌(예를 들어, QuilA 또는 QS21)과 스테롤(예를 들어, 콜레스테롤)이 나선형 미셀로 결합되어 있는 에멀젼[81].
조성물 중의 항원과 어주번트는 전형적으로 환자에게 송달하는 시점에서 혼합될 것이다. 에멀젼은 제조 과정에서 항원과 혼합될 수 있거나, 또는 송달시 즉석에서 혼합될 수 있다. 따라서, 어주번트와 항원은 사용시 최종 배합할 수 있게 준비된 상태로 포장된 백신이나 보급된 백신에서 개별적으로 보존될 수 있다. 항원은 일반적으로 수성 형태일 것이므로 백신은 2개의 액체를 혼합함으로써 최종적으로 제조된다. 혼합되는 2개 액체의 부피비는 다양할 수 있지만(예를 들어, 5:1 내지 1:5), 일반적으로는 약 1:1이다.
항원과 어주번트가 혼합된 후에는 일반적으로 적혈구응집소 항원이 수성 용액 중에 존재할 텐데, 이들은 오일/물 계면 주위에 분포될 수 있다. 일반적으로, 적혈구응집소가 에멀젼의 오일상으로 들어갈 가능성은 거의 없다.
조성물이 토코페롤을 포함하는 경우에는 α, β, γ, δ, ε 또는ξ 토코페롤 중 어느 것이 사용될 수 있으며, α-토코페롤이 바람직하다. 토코페롤은 몇 가지 형태를 취할 수 있는데, 예를 들어 상이한 염 및/또는 이성질체의 형태를 취할 수 있다. 염은 숙시네이트, 아세테이트, 니코티네이트 등과 같은 유기 염을 포함한다. D-α-토코페롤과 DL-α-토코페롤이 모두 사용될 수 있다. 토코페롤은 노인층 환자(예를 들어, 60세 이상)에 사용하기 위한 백신에 포함되는 것이 유익한데, 왜냐하면 비타민 E가 이러한 환자군에서 면역반응에 대해 긍정적인 효과를 가진다고 보고되었기 때문이다[82]. 또한, 이들은 에멀젼의 안정화에 도움이 될 수 있는 항산화 특성을 가진다[83]. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이고, 이 토코페롤의 바람직한 염은 숙시네이트이다. 숙시네이트 염은 생체내에서 TNF-관련 리간드와 협력하여 일하는 것으로 판명되었다. 또한, α-토코페롤 숙시네이트는 인플루엔자 백신과 상용성이고, 수은 화합물을 대신하는 유용한 보존제인 것으로 알려져 있다.
상기 언급된 대로, 스쿠알렌을 포함하는 수중유 에멀젼이 특히 바람직하다. 어떤 구체예에서, 백신 용량 중 스쿠알렌 농도는 5-15mg의 범위일 수 있다(즉, 용량 부피를 0.5mL라고 하면 10-30mg/mL의 농도). 그렇지만 스쿠알렌의 농도를 감소시키는 것도 가능한데[84,85], 예를 들어 용량 당 < 5mg, 또는 심지어 용량 당 < 1.1mg을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 사람의 용량은 용량 당 9.75mg 스쿠알렌을 포함할 수 있거나(FLUAD™ 제품과 마찬가지: 0.5mL 용량 부피 중에 9.75mg 스쿠알렌, 1.175mg 폴리소르베이트 80, 1.175mg 소르비탄 트리올레에이트), 또는 이 양의 분수량, 예를 들어 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 또는 1/10의 양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 7.31mg 스쿠알렌/용량(과 그에 따라 폴리소르베이트 80과 소르비탄 트리올레에이트 각각 0.88mg), 4.875mg 스쿠알렌/용량(과 그에 따라 폴리소르베이트 80과 소르비탄 트리올레에이트 각각 0.588mg), 3.25mg 스쿠알렌/용량, 2.438mg 스쿠알렌/용량, 1.95mg 스쿠알렌/용량, 0.975mg 스쿠알렌/용량 등을 포함할 수 있다. FLUAD™-강도 MF59의 이러한 분수량 희석물 중 어느 것이라도 본 발명에서 사용될 수 있다.
상기 언급된 대로, 항원/에멀젼 혼합은 송달할 때에 즉석에서 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명은 혼합할 수 있게 준비된 항원과 어주번트 성분을 포함하는 키트를 제공한다. 키트에서는 어주번트와 항원이 사용 시점까지 개별적으로 보존될 수 있다. 이 성분들은 키트 내에서 서로 물리적으로 분리되어 있으며, 이 분리는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 두 성분은 바이알과 같은 별도의 2개 용기에 들어 있을 수 있다. 다음에, 2개 바이알의 내용물이, 예를 들어 1개의 바이알의 내용물을 꺼내서 그 내용물을 다른 바이알에 첨가하거나, 또는 두 바이알의 내용물을 모두 꺼내서 세 번째 용기에서 이들을 혼합하는 것에 의해 혼합될 수 있다. 바람직한 구성에서, 키트 성분 중 하나는 주사기에 들어 있고, 다른 성분은 바이알과 같은 용기에 들어 있다. 주사기를 사용해서(예를 들어, 바늘과 함께) 그것의 내용물을 혼합용의 두 번째 용기에 삽입할 수 있고, 그런 다음 혼합물이 주사기에 다시 흡인될 수 있다. 다음에, 주사기의 혼합된 내용물이 전형적으로는 멸균된 새 바늘을 통해서 환자에게 투여될 수 있다. 한 성분을 주사기에 충전하는 것은 환자 투여를 위해 별도의 주사기를 사용할 필요성을 없앤다. 다른 바람직한 구성에서, 2개의 키트 성분이 분리된 상태로 동일한 주사기에 함께 보유되는데, 주사기는 예를 들어 참고문헌 86-93 등에 개시된 것들과 같은 이중-챔버 주사기가 사용된다. 주사기가 작동되면(예를 들어, 환자에게 투여하는 과정에서) 2개 챔버의 내용물이 혼합된다. 이 구성은 사용시 별도의 혼합 단계의 필요성을 없앤다.
제약 조성물
본 발명의 조성물은 제약학적으로 허용될 수 있다. 이들은 일반적으로 항원 및 어주번트 이외의 성분들을 포함하는데, 예를 들어 이들은 전형적으로 하나 이상의 제약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)를 포함한다. 이러한 성분들에 대한 충분한 논의는 참고문헌 94에서 입수할 수 있다.
조성물은 일반적으로 수성 형태일 것이다.
조성물은 티오메르살(예를 들어, 10μg/mL) 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나, 백신은 바람직하게는 수은 물질을 실질적으로 함유하지 않아야 하며(즉, 5μg/mL 미만), 예를 들어 티오메르살을 함유하지 않는 것이 바람직하다[95]. 수은을 함유하지 않는 백신이 더욱 바람직하다. 보존제를 함유하지 않는 백신이 특히 바람직하다.
독성을 제어하기 위해서는 나트륨염과 같은 생리학적 염을 포함하는 것이 바람직하다. 염화나트륨(NaCl)이 바람직하며, 이것은 1-20mg/mL로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염들은 염화칼륨, 인산이수소칼륨, 무수인산이나트륨, 염화마그네슘, 염화칼슘 등을 포함한다.
조성물은 일반적으로 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg의 삼투농도를 가질 것이며, 더 바람직한 삼투농도는 290-310 mOsm/kg의 범위 내이다. 삼투농도는 예방접종으로 인한 통증에 영향이 없다고 이미 보고되었지만[96], 삼투농도를 이 범위 내로 유지하는 것이 그래도 바람직하다.
조성물은 하나 이상의 버퍼를 포함할 수 있다. 전형적인 버퍼는 포스페이트 버퍼; Tris 버퍼; 보레이트 버퍼; 숙시네이트 버퍼; 히스티딘 버퍼; 또는 시트레이트 버퍼를 포함한다. 버퍼는 전형적으로 5-2OmM의 범위로 포함될 것이다. 버퍼는 에멀젼의 수성상에 존재할 수 있다.
조성물의 pH는 일반적으로 5.0-8.1, 더 전형적으로 6.0-8.0, 예를 들어 6.5-7.5, 또는 7.0-7.8일 것이다. 따라서, 본 발명의 과정은 포장하기 전에 벌크 백신의 pH를 조정하는 단계를 포함할 수 있다.
조성물은 멸균되는 것이 바람직하다. 조성물은 글루텐을 함유하지 않는 것이 바람직하다.
바람직한 백신은, 예를 들어 1 IU/mL 미만, 바람직하게는 0.5 IU/mL 미만의 낮은 내독소 함량을 가진다. 내독소 측정의 국제 단위는 잘 알려져 있으며, 예를 들어 NIBSC로부터 입수할 수 있는 2 nd International Standard(Code 94/580 - IS)과 같은 국제기준[97,98]과 비교함으로써 샘플에 대해 계산될 수 있다. 난에서 성장된 바이러스로부터 제조된 기존 백신의 내독소 수준은 0.5-5 IU/mL의 범위이다.
백신은 항생제(예를 들어, 네오마이신, 카나마이신, 폴리믹신 B)를 함유하지 않는 것이 바람직하다.
조성물은 1회 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있거나, 또는 여러 번의 면역화를 위한 물질을 포함할 수 있다(즉, "멀티도즈" 조성물). 멀티도즈 구성은 일반적으로 백신에 보존제를 포함한다. 보존제의 필요성을 피하기 위해서 백신은 물질을 꺼내기 위한 무균 어댑터가 구비된 용기에 넣어질 수 있다.
인플루엔자 백신은 전형적으로 약 0.5mL의 투약 부피로 투여되지만, 소아에게는 절반의 용량(즉, 약 0.25mL)이 투여될 수 있고, 단위 용량은 대응하여 선택될 것인데, 예를 들어 환자 투여에 적합한 0.5mL 용량을 제공할 수 있는 단위 용량이 선택될 것이다.
조성물 또는 키트 성분의 포장
본 발명의 과정은 백신을 용기에, 특히 의사가 사용하는 보급형 용기에 넣는 단계를 포함할 수 있다. 백신의 적합한 용기는 바이알, 코 스프레이 및 일회용 주사기를 포함하며, 이들은 멸균된 것이어야 한다.
조성물/성분을 바이알에 넣는 경우, 바이알은 유리나 플라스틱 재료로 제조되는 것이 바람직하다. 조성물을 바이알에 넣기 전에 바이알이 멸균되는 것이 바람직하다. 라텍스-과민성 환자에서 문제를 피하기 위해서 바이알은 라텍스-무함유 마개로 밀봉되는 것이 바람직하고, 모든 포장 재료에 라텍스가 없는 것이 바람직하다. 바이알은 백신 1회 용량을 포함할 수 있거나, 또는 2회 이상의 용량("멀티도즈" 바이알), 예를 들어 10회 용량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 제조된다.
바이알은 미리 충전된 주사기가 캡에 삽입될 수 있고, 주사기의 내용물이 바이알로 방출될 수 있고, 바이알의 내용물이 다시 주사기로 들어갈 수 있는 적합한 캡(예를 들어, Luer 락)을 구비할 수 있다. 바이알로부터 주사기를 제거한 후에는 바늘이 부착되어 조성물이 환자에게 투여될 수 있다. 캡은 시일 또는 커버 내부에 위치되는 것이 바람직하며, 시일 또는 커버를 제거한 후에야 캡에 접근할 수 있어야 한다. 바이알은 특히 멀티도즈 바이알에서 내용물의 무균 제거가 가능한 캡을 구비할 수 있다.
조성물/성분을 주사기에 포장하는 경우, 주사기에는 바늘이 부착될 수 있다. 부착된 바늘이 없다면 별도의 바늘이 조립 및 사용을 위해서 주사기와 함께 제공될 수 있다. 이러한 바늘에는 덮개가 사용될 수 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 전형적이다. 주사기에는 필오프식 라벨이 제공되며, 여기에 로트 번호, 인플루엔자 시즌 및 내용물의 유효기간이 인쇄될 수 있고, 이것은 기록 보존을 쉽게 할 수 있다. 주사기의 플런저는 흡인 동안 플런저가 의도치 않게 제거되는 것을 방지할 수 있는 스토퍼를 구비하는 것이 바람직하다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 구비할 수 있다.
일회용 주사기는 1회 용량의 백신을 함유한다. 주사기는 일반적으로 바늘을 부착하기 전에 끝 부분을 밀봉하고 있는 팁 캡을 구비할 텐데, 이 팁 캡은 부틸 고무로 제조된 것이 바람직하다. 주사기와 바늘이 개별적으로 포장된 경우에는 바늘에 부틸 고무 덮개가 끼워진 것이 바람직하다. 바람직한 주사기는 "Tip-Lok"™ 상표명으로 시판되는 것들이다.
용기에는, 예를 들어 소아에게 송달하는 것을 쉽게 하기 위해 절반-용량 부피가 표시될 수 있다. 예를 들어, 0.5mL 용량을 함유하는 주사기에는 0.25mL 부피를 나타내는 표시가 있을 수 있다.
유리 용기(예를 들어, 주사기 또는 바이알)를 사용하는 경우에는 소다 석회 유리보다는 붕규산염 유리로 제조된 용기를 사용하는 것이 바람직하다.
조성물은 백신의 세부사항, 예를 들어 투여설명서, 백신 내의 항원의 세부사항 등을 포함하는 리플릿과 함께(예를 들어, 동일한 상자에) 제공될 수 있다. 또한, 설명서에는 경고가 적혀 있을 수 있는데, 예를 들어 예방접종 후 아나필락시스 반응이 일어난 경우에 아드레날린 용액을 쉽게 이용할 수 있도록 보관하고 있으라는 경고 등이 적혀 있을 수 있다.
치료 방법, 및 백신 투여
본 발명의 조성물은 사람 환자에게 투여하기에 적합하며, 본 발명은 환자에게 본 발명의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 면역반응을 일으키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 의약으로 사용하기 위한 본 발명의 키트 또는 조성물을 제공한다.
본 발명의 방법 및 사용에 의해서 일어나는 면역반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 방어 항체 반응을 포함할 것이다. 인플루엔자 바이러스 예방접종 후의 항체 반응, 중화 용량 및 방어작용을 평가하는 방법들은 본 분야에 잘 알려져 있다. 사람 인플루엔자 바이러스의 적혈구응집소에 대한 항체 역가가 방어작용과 상호관련된다는 것이 인체 연구에서 밝혀졌다(약 30-40의 혈청 샘플 적혈구응집-억제 역가는 동종성 바이러스에 의한 감염을 약 50% 방어한다)[99]. 항체 반응은 전형적으로 적혈구응집 억제, 미소중화, 단일 방사상 면역분산(SRID), 및/또는 단일 방사상 용혈반응(SRH)에 의해서 측정된다. 이러한 분석 기술은 본 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명의 조성물은 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 면역화 경로는 근육내 주사에 의한 것이고(예를 들어, 팔이나 다리에), 다른 이용가능한 경로들은 피하 주사, 비내[100-102], 진피내[103,104], 경구[105], 경피, 경진피[106] 경로 등을 포함한다. 진피내 경로와 비내 경로가 좋다. 진피내 투여는, 예를 들어 약 1.5mm 길이의 바늘이 달린 마이크로인젝션 장치를 수반할 수 있다.
본 발명에 따라서 제조된 백신은 소아와 성인의 치료에서 모두 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 현재 생후 6개월부터의 소아와 성인의 면역화에 사용하도록 권장된다. 따라서, 환자는 1세 미만(예를 들어, 6개월 미만), 1-5세, 5-15세, 15-55세, 또는 55세 이상일 수 있다. 백신을 접종 받는 바람직한 환자는 노인층(예를 들어, 50세 이상, 60세 이상, 및 바람직하게는 65세 이상), 연소자(예를 들어, 5세 이하, 또는 6개월에서 24세, 또는 6개월에서 4세 사이의 환자, 또는 5-18세 환자), 중년층(25-64세), 입원 환자, 건강관리 종사자, 군대 및 군인, 임산부, 만성질환자, 면역결핍 환자, 예방접종을 받기 전 7일 이내에 항바이러스 화합물(예를 들어, 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 복용한 환자, 난 알러지가 있는 사람 및 해외여행을 하는 사람이다. 그러나, 이러한 그룹에만 백신이 적합한 것은 아니고, 전국민에게 더 일반적으로 사용될 수 있다.
일부 장년들(60세 이상 노인의 약 1/3)과 소수의 청년들은 A/CA/04/09 유행성 균주에 대한 혈청 항체가 이미 있을 수 있지만, 소아들은 본질적으로 항체를 갖지 않는다. 젊은 사람의 면역화는 이 균주에 대한 항체를 도출하지 못한다[107]. 수중유 어주번트를 포함하는 본 발명의 면역원성 조성물을 받을 수 있는 대상이 되는 유용한 그룹은 A/CA/04/09 유행성 균주에 대한 기존 혈청 항체를 갖고 있지 않은 사람들, 예를 들어 1960년 이후, 1970년 이후, 1980년 이후, 1990년 이후, 또는 2000 이후에 태어난 환자들이다.
본 발명의 바람직한 조성물은 효능에 대한 CPMP 기준에서 1, 2 또는 3을 만족한다. 성인(18-60세)에서 이들 기준은 (1) 70% 이상의 혈청방어; (2) 40% 이상의 혈청전환; 및/또는 (3) 2.5배 이상의 GMT 증가이다. 노인층(60세 초과)에서 이들 기준은 (1) 60% 이상의 혈청방어; (2) 30% 이상의 혈청전환; 및/또는 (3) 2배 이상의 GMT 증가이다. 이들 기준은 적어도 50명의 환자를 대상으로 한 오픈 라벨 연구에 기초한다. 기준은 백신에 들어 있는 균주별로 적용된다.
치료는 1회 용량 일정 또는 다수 용량 일정에 의해 이루어질 수 있다. 다수 용량은 1차 면역화 일정 및/또는 2차 면역화 일정에서 사용될 수 있다. 다수 용량 일정에서는 다양한 용량이 동일한 또는 상이한 경로에 의해 제공될 수 있는데, 예를 들어 비경구로 프라임 투여하고 점막 경로로 부스터 투여하는 방식, 점막 경로로 프라임 투여하고 비경구로 부스터 투여하는 방식 등이다. 2회 이상 용량(전형적으로는 2회 용량)의 투여는 면역학적으로 투약 경험이 없는 환자에서, 예를 들어 이전에 인플루엔자 예방접종을 전혀 받은 적이 없는 사람이나, 또는 새로운 HA 서브타입에 대해 예방접종하려는 경우에 특히 유용하다. 다수 용량은 전형적으로 적어도 1주일 간격으로 투여될 것이다(예를 들어, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 12주, 약 16주 등).
본 발명에 의해서 생산된 백신은 다른 백신들과 실질적으로 동시에(예를 들어, 동일한 의료상담 과정에서, 또는 건강관리 전문가나 예방접종 기관을 방문했을 때) 환자에게 투여될 수 있으며, 예를 들어 홍역 백신, 이하선염 백신, 루벨라 백신, MMR 백신, 바리셀라 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 콘쥬게이트형 H. influenzae 타입 b 백신, 불활화 소아마비 바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막구균 콘쥬게이트 백신(예를 들어, 3가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균 콘쥬게이트 백신 등과 실질적으로 동시에 투여될 수 있다. 폐렴구균 백신 및/또는 수막구균 백신과 실질적으로 동시에 투여하는 것은 노인층 환자에서 특히 유용하다.
유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물, 특히 인플루엔자 바이러스에 대해 활성인 항바이러스 화합물(예를 들어, 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)과 실질적으로 동시에(예를 들어, 동일한 의료상담 과정에서, 또는 건강관리 전문가을 방문했을 때) 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 항바이러스제는 뉴라미니다제 억제제, 예를 들어 에스테르(예를 들어, 에틸에스테르)와 염(예를 들어, 포스페이트 염)을 포함하는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복실산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)아미노]-2,6-안히드로-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-엔오산을 포함한다. 바람직한 항바이러스제는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복실산, 에틸에스테르, 포스페이트(1:1)이며, 이것은 또한 오셀타미비르 포스페이트(TAMIFLU™)라고도 한다. 투여될 수 있는 다른 항바이러스제는 티모신 알파 1이다(예를 들어, 티말파신, 28개 아미노산의 합성 펩티드, ZADAXIN™로서 입수가능함)[108]. 한 특정 구체예에서, 환자는 불활화된 전 비리온 백신(예를 들어, 1가, H1*)을 접종 받는 것과 동시에 오셀타미비르 포스페이트와 같은 뉴라미니다제 억제제를 받는다.
백신 제품 및 키트
상기 언급된 대로, 본 발명은 (i) SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO:1에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소 및 (ii) 수중유 에멀젼 어주번트를 포함하는 백신을 제공한다. 유용한 구체예에서, 이 조성물은 1가 불활화 표면 항원 백신이다. 불활화 바이러스는 난에서 또는 세포 배양물(예를 들어, MDCK 세포에서[36,118])에서 성장된 것일 수 있다. 백신은 0.5mL 단위 용량을 함유하는 주사기(예를 들어, 붕규산염 유리)에 넣어져 출시될 수 있으며, 각 단위 용량은 7.5μg의 H1 적혈구응집소를 포함한다(예를 들어, 재교배(reassortant) 균주 X-179A 또는 X-181 유래의 것과 같은 A/California/7/2009-유사 균주). 주사기는 브로모-부틸 고무 플런저-스토퍼를 구비할 수 있다. 어주번트는 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트리올레에이트를 포함하며, 예를 들어 HA 7.5μg 당 약 9.75mg의 스쿠알렌, 약 1.18mg의 폴리소르베이트 80 및 약 1.18mg 소르비탄 트리올레에이트를 포함한다. 조성물은 시트레이트 버퍼를 포함할 수 있다. 조성물은 수은을 함유하지 않는 것이 이상적이지만, 때로는 소량의 티메로살이 포함될 수 있다. 어떤 구체예에서, 어주번트가 첨가된 백신은 3.75μg의 HA를 가지며, 특히 0.25mL 투약 부피가 사용될 때 그러하다. 어주번트가 첨가된 백신은 근육내 경로로, 예를 들어 삼각근이나 전외측대퇴부에 투여될 수 있다. 어주번트 첨가된 백신은 1회 용량이 접종될 수 있거나, 또는 2회 용량이 접종될 수 있다(예를 들어, 2주 내지 6개월 간격으로, 예를 들어 3주 간격으로). 주사기는 각각 블리스터 팩에 넣어져서 상자에, 예를 들어 10개들이 상자에 포장될 수 있다.
또한, 본 발명은 (i) SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO:1에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소 및 (ii) 수중유 에멀젼 어주번트를 포함하는 백신을 제공한다. 유용한 구체예에서, 이 조성물은 1가 불활화 표면 항원 백신이다. 불활화 바이러스는 난에서 성장된 것일 수 있다. 백신은 다수의 0.5mL 단위 용량을 함유하는 바이알로서, 예를 들어 티메로살을 포함하는 10회 용량 바이알로서 출시될 수 있으며, 각 단위 용량은 약 7.5μg 또는 15μg 또는 30μg의 H1 적혈구응집소를 포함한다(예를 들어, 재교배 균주 X-179A 유래의 것과 같은 A/California/7/2009-유사 균주). 어주번트는 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트리올레에이트를 포함하며, 예를 들어 HA 7.5μg 당 약 9.75mg의 스쿠알렌, 약 1.18mg의 폴리소르베이트 80 및 약 1.18mg 소르비탄 트리올레에이트를 포함한다. 조성물은 시트레이트 버퍼를 포함할 수 있다. 어주번트가 첨가된 백신은 근육내 경로로, 예를 들어 삼각근이나 전외측대퇴부에 투여될 수 있다. 어주번트 첨가된 백신은 1회 용량이 접종될 수 있거나, 또는 2회 용량이 접종될 수 있다(예를 들어, 2주 내지 6개월 간격으로, 예를 들어 3주 간격으로).
또한, 본 발명은 (i) SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO:1에 더욱 가깝게 관련된 비어주번트 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함하는 제 1 키트 성분 및 (ii) 수중유 에멀젼 어주번트를 포함하는 제 2 키트 성분을 포함하는 키트를 제공한다. 2개의 키트 성분은 사용 시점에서 혼합될 수 있으며, 이로써 본 발명의 1가 백신이 제공된다. 유용한 구체예에서, 제 1 키트 성분은 1가 분할 비리온 불활화 백신이다. 불활화 바이러스는 난에서 성장된 것일 수 있다. 키트는 2개-바이알 조성물(예를 들어, 붕규산염 유리, 선택적으로 부틸 고무 스토퍼 구비)로서 출시될 수 있으며, 각 바이알은 1:1 부피비로 혼합하기 위한 등 부피의 액체를 포함하는데, 예를 들어 2.5mL 항원과 2.5mL 어주번트가 혼합될 수 있다. 어주번트가 첨가된 1가 백신의 0.5mL 단위 용량은 약 7.5μg, 3.75μg 또는 1.9μg의 H1 적혈구응집소를 포함할 수 있다(예를 들어, 재교배 균주 X-179A 유래의 것과 같은 A/California/7/2009-유사 균주). 어주번트는, 예를 들어 0.5mL 단위 용량 중에 스쿠알렌, DL-α-토코페롤 및 폴리소르베이트 80을 포함한다: 약 10.7mg 스쿠알렌, 약 11.9mg 토코페롤 및 약 4.9mg 폴리소르베이트 80(또는 이 양의 분수량, 예를 들어 스쿠알렌, 토코페롤 및 폴리소르베이트 80의 양들의 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9 또는 1/10). 따라서, 어주번트 성분은 2.20:2.44:1의 질량비(스쿠알렌:토코페롤:폴리소르베이트 80)로 존재할 수 있다. 어주번트 성분은 H1 적혈구응집소 μg 당 2.85μg 스쿠알렌, 3.16μg 토코페롤 및 1.30μg 폴리소르베이트 80으로 존재할 수 있다. 백신은 티오메르살 보존제를, 예를 들어 약 1Oμg/ml로, 즉 0.5mL 용량 중에 약 5μg로 포함할 수 있다. 어주번트가 첨가된 백신은 1회 용량이 접종될 수 있거나, 또는 2회 용량이 접종될 수 있다(예를 들어, 1주, 2주 또는 3주 간격으로, 또는 3주를 초과하는 간격, 예를 들어 3-26주 간격으로). 18-60세의 성인은 1회 용량을 받는 것이 유용할 수 있고, 60세를 넘은 노인들은 2회 용량을 받을 수 있다. 3-9세의 소아는 절반 용량, 예를 들어 1.875μg의 HA를 함유한 0.25mL 부피를 받을 수 있다. 항원과 어주번트 성분은 모두 포스페이트 버퍼를 포함할 수 있다. 항원 성분은 폴리소르베이트 80, 옥톡시놀 10, 염화칼륨 및/또는 염화마그네슘을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 항원 바이알 50개(각각 2.5mL 현탁액이 들어 있는)와 어주번트 바이알 50개(각각 2.5mL 에멀젼이 들어 있는)를 포함할 수 있다. 항원 바이알은 1개의 팩으로 있을 수 있고, 어주번트 바이알은 2개의 팩으로 있을 수 있다. 어주번트가 첨가된 백신은 근육내 경로로, 예를 들어 삼각근이나 전외측대퇴부에 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 (i) SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO:1에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소 및 (ii) 수중유 에멀젼 어주번트를 포함하는 백신을 제공한다. 유용한 구체예에서, 이 조성물은 1가 불활화 표면 항원 백신이다. 불활화 바이러스는 MDCK 세포에서 성장되었다[36,118]. 백신은 3.75μg의 H1 적혈구응집소를 함유하는 단위 용량으로 출시된다(예를 들어, 재교배 균주 X-179A 유래의 것과 같은 A/California/7/2009-유사 균주). 어주번트는 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 소르비탄 트리올레에이트를 포함하며, 약 4.875mg 스쿠알렌, 약 0.59mg 폴리소르베이트 80 및 약 0.59mg 소르비탄 트리올레에이트를 포함한다. 조성물은 시트레이트 버퍼를 포함할 수 있다. 어주번트가 첨가된 백신은 근육내 경로로, 예를 들어 삼각근이나 전외측대퇴부에 투여될 수 있다. 어주번트 첨가된 백신은 1회 용량이 접종될 수 있거나, 또는 2회 용량이 접종될 수 있다(예를 들어, 2주 내지 6개월 간격, 예를 들어 3주 간격으로). 단위 용량은 0.25mL의 부피를 가질 수 있으며, 환자는 1개 단위 용량(예를 들어, 3-17세 또는 18-40세 환자) 또는 2개 단위 용량(40세를 넘은 환자)을 1회 면역화 시에 받을 수 있다. 백신은 0.25mL 용량 10개들이 팩으로서 보급될 수 있다.
본 발명은 또한 (i) SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO: 1과 더욱 가깝게 관련된 비어주번트 H1 서브형 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함하는 제1 키트 성분 및 (ii) 수중유 에멀젼 어주번트를 포함하는 제2 키트 성분을 포함한다. 제2 키트 성분은 사용 시 혼합되어 본 발명의 1가 백신을 제공할 수 있다. 유용한 구체예에서, 제1 키트 성분은 1가의 불활성화된 스플리트 비리온이다. 불활성화된 바이러스는 난에서 성장될 수 있었다. 키트는 단위 부피의 항원을 함유하는 제1 바이알과 3x 단위 부피의 에멀젼을 함유하는 제2 바이알, 예를 들어 혼합되어 4x 단위 부피의 최종 백신을 제공하기 위한, 2-바이알 조성물(예를 들어, 선택적으로 클로로부틸 마개를 가지는 붕규산 유리)로서 존재할 수 있다. 따라서 1.5ml의 항원은 4.5ml의 에멀젼과 합쳐져서 6ml의 백신을 제공할 수 있다. 0.5ml 단위 용량의 1가의 어주번트 백신은 약 3.8μg의 H1 적혈구응집소를 포함할 수 있다(예를 들어, A/California/7/2009-유사 균주, 예컨대 재교배 균주 X-179A). 어주번트는 예를 들어, 0.5ml 단위 용량: 약 12.4mg 스쿠알렌, 약 1.9mg 소르비탄 올레이트, 약 2.4mg 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르, 및 약 2.3mg 만니톨 (또는 그것의 부분적 양, 예를 들어, 스쿠알렌, 소르비탄 올레이트, 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르 및 만니톨의 이들 양의 3/4, 2/3, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 또는 1/10)로 스쿠알렌, 소르비타 올레이트, 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르 및 만니톨을 포함한다. 따라서, 어주번트 성분은 124:19:24:23의 질량 비율(스쿠알렌: 소르비탄 올레이트 : 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르 : 만니톨)로 존재할 수 있다. 백신은 티메로살 보존제, 예를 들어, 약 11.3μg /0.5ml, 또는 약 3μg의 티메로살/μg의 적혈구응집소를 포함할 수 있다. 항원 및 어주번트 성분은 둘 다 인산완충액을 포함할 수 있다. 피험자는 1회 투여량의 어주번트 백신을 받을 수 있고 또는, 더 일반적으로는 2회 투여량을 받을 수 있다(예를 들어, 3주 이상, 예를 들어 3-26주로써 분리됨). 3-60세의 피험자는 1회 투여량을 유용하게 받을 수 있는 반면, 60 초과의 노인은 2회 투여량을 받을 수도 있다. 6개월령 이상 3세 미만의 아이들은 절반의 투여량, 예를 들어 약 1.9μg HA와 함께 0.25ml 부피를 받을 수 있다. 어주번트 백신은, 예를 들어 삼각근 또는 전외측 대퇴에서 근육내로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 선행 구에서 정의한 바와 같은 제1 키트 성분과 선행 구에서 정의한 바와 같은 제2 키트 성분을 혼합하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 백신을 제조하는 방법을 제공한다.
이 섹션에서 언급한 백신은 SEQ ID NO: 7을 포함하는 적혈구응집소를 유용하게 포함할 수 있다.
혼합된-공급원 백신
상기 언급한 본 발명의 일부 구체예는 다가이며, 즉 그것들은 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 HA 항원을 포함한다. 다가 백신을 제조하기 위해 사용되는 바이러스는 모두 동일한 기질을 사용하여 성장될 수 있고(예를 들어, 난에서 모두 성장, 또는 MDCK 배양물에서 모두 성장 등) 또는 그것들은 다른 기질에서 성장될 수 있다(예를 들어, 난에서 한 균주를 성장, 세포 배양물에서 다른 균주를 성장; 또는 MDCK 배양물에서 한 균주 또는 Vero 배양물에서 다른 균주를 성장). 예를 들어, 성장 기질은 특정 균주의 성장 선호도에 따라서 선택될 수 있으며, 예를 들어, H1N1 균주가 난 보다는 세포 배양물에서 더 양호하게 성장하지만, 인플루엔자 B 바이러스는 반대의 선호도를 나타낸다면, 그것들은 다른 기질에서 성장된 다음 혼합될 수 있다.
한 구체예에서, H1* 균주(예를 들어, H1N1)는 세포 배양물(예를 들어, 현탁 배양물과 같은 MDCK 배양물에서[36,118])에서 성장하고, 다른 균주(예를 들어, H3N2 균주, 인플루엔자 B 균주 등)는 난에서 성장될 수 있다. 균주들로부터 만들어진 항원들은 그 다음에 혼합되어 다가의 인플루엔자 백신을 공급할 수 있다. 이 과정은 2가지의 H1 균주(하나는 H1* 적혈구응집소, 하나는 H1* 적혈구응집소가 아님), H3N2 균주, 및 하나의 인플루엔자 B 균주를 가지는 4-가 백신을 제조하는데 특히 적당하다.
따라서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 적어도 2가지의 다른 균주로부터 얻어지는 적혈구응집소를 포함하는 백신을 제공하며, 제1 적혈구응집소는 난에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 제조되고, 제2 적혈구응집소는 세포 배양물에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 제조된다. 따라서 2가지의 다른 인플루엔자 바이러스의 균주가 한 가지는 세포 배양물에서 하나는 난에서 성장된다. 바이러스는 두 공급원으로부터 정제된 다음, 혼합되어 백신을 제공한다.
제1 및 제2 적혈구응집소는 둘 다 인플루엔자 A 바이러스로부터, 둘 다 인플루엔자 B 바이러스로부터, 또는 하나는 인플루엔자 A 바이러스 나머지는 인플루엔자 B 바이러스로부터 나올 수 있다. 바람직하게는 하나의 제1 및 제2 적혈구응집소 중 적어도 하나는 인플루엔자 A 바이러스로부터 나온다. 제1 및 제2 적혈구응집소가 둘 다 인플루엔자 A 바이러스인 경우, 이는 전형적으로 H1 적혈구응집소 및 H3 적혈구응집소, 예를 들어, H1N1 균주 및 H3N2 균주일 것이다.
제1 및 제2 적혈구응집소가 인플루엔자 A 바이러스 적혈구응집소를 포함한다면, 이것들 중 하나는 H1* 적혈구응집소일 수 있다. 2가지의 인플루엔자 A 헤마글루티틴은 둘 다 H1* 적혈구응집소가 아닌 것이 바람직하고, 2가지의 인플루엔자 A 적혈구응집소는 둘 다 H1 적혈구응집소가 아닌 것이 더 바람직하다. 백신이 H1* 적혈구응집소를 포함한다면, 이는 바람직하게는 제2 적혈구응집소가며, 즉, H1* 균주는 세포 배양물에서 성장되고, H1* 백신 항원은 그 다음에 난으로부터 제조된 H1*가 아닌 백신 항원과 합쳐진다. 다른 구체예에서, H1* 적혈구응집소는 제1 적혈구응집소가며, 즉 H1* 균주는 난에서 성장되고, H1* 백신 항원은 그 다음에 세포 배양물로부터 제조된 H1*가 아닌 백신 항원과 합쳐진다.
적당한 세포 배양물 숙주들은 상기 설명하였고, MDCK 세포, 예를 들어 MDCK 33016을 포함하며, 이는 현탁액에서 성장될 수 있고 H1* 적혈구응집소를 가지는 바이러스를 제조하는데 유용하다.
이 혼합된 공급원 접근은 H1* 균주, H1*가 아닌 H1 균주, H3 균주 및 인플루엔자 B 균주를 포함하는 백신 제조에 특히 유용하다. H1* 균주는 세포 배양물에서 성장될 수 있고, 다른 3가지의 균주(즉, 최근 계절의 백신에 대해 보통 3가의 혼합물)는 통상의 방법으로 난에서 성장될 수 있다.
일반
용어 "포함하는"은 "포함하는" 뿐만 아니라 "이루어지는"을 포함하며, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수도 있고 또는 일부 부가적인 것, 예를 들어 X + Y를 포함할 수도 있다.
단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않으며, 예를 들어 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요하다면, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
수치적 값 x와 관련된 용어 "약"은 선택적이며, 예를 들어 x±10%를 의미한다.
"GI" 넘버링은 상기 사용되었다. GI 넘버, 또는 "Genlnfo Identifier"는 서열이 그것의 데이터베이스에 추가될 때, NCBI에 의해 처리된 각 서열 기록에서 연속하여 할당된 일련의 숫자이다. GI 번호는 서열 기록의 등록 번호와 유사성을 가지지 않는다. 서열이 업데이트 된다면(예를 들어, 정정, 또는 주석 또는 정보의 부가), 그것은 신규 GI 번호를 받는다. 따라서, 주어진 GI 번호와 관련된 서열은 결코 변경되지 않는다.
달리 구체적으로 언급되지 않는다면, 2가지 이상의 성분들을 혼합하는 단계를 포함하는 과정은 어떤 특정 혼합 순서를 필요로 하지 않는다. 따라서 성분들은 임의의 순서로 혼합될 수 있다. 3가지 성분들이 있다면, 2 가지 성분들이 서로 혼합될 수 있고, 이어서 그 조합물이 제3 성분 등과 합쳐질 수 있다.
동물(및 특히 소) 물질이 세포 배양물에서 사용된다면, 그것들은 전염성 해면양뇌증(TSE)이 없는, 특히 광우병(BSE)이 없는 공급원으로부터 얻어져야 한다. 전반적으로, 동물-유래 물질이 전체적으로 없는 배양물 세포가 바람직하다.
화합물이 조성물의 부분으로서 신체에 투여된다면, 화합물은 대안으로 적당한 프로드러그로써 대체될 수 있다.
세포 배양물이 재교배 또는 역 유전학 과정을 위해 사용된다면, 바람직하게는 사람 백신 생성에서 사용을 위해, 예를 들어 Ph Eur general chapter 5.2.3로서 승인된 것이다.
폴리펩티드 서열 사이의 동일성은 갭 오픈 페널티=12 및 갭 확장 페널티=1인 아핀(affine)갭 검색을 사용하여, MPSRCH 프로그램(Oxford Molecular)에서 보충되는 바와 같은 Smith-Waterman 상동성 검색 알고리즘에 의해 바람직하게 결정된다.
도 1은 비어주번트(0.5 또는 1μg HA 투여량) 또는 MF59 (0.5μg)으로 어주번트 H1N1 sw 항원으로 면역화 후 얻어진 HI 역가를 나타낸다. PBS 대조군이 또한 사용되었다. 검정색 바(bar)는 한 번의 면역화 후 역가를 나타내며; 회색 바는 2번의 면역화 후 역가를 나타낸다.
도 2는 다양한 프라임/부스트 섭생으로 면역화된 페럿에 부하된 폐 바이러스를 나타낸다. 동물 그룹 A 내지 H는 하기에서 설명한다. y-축은 Log10TCID50/gr을 나타낸다. 도 3은 동일한 페럿에서 비강 바이러스 부하를 나타내고 y-축은 log10 CDU를 나타낸다. 도 4는 동일 페럿에서 HI 역가를 나타낸다.
도 5는 계절적인 H1N1 (Brisbane)으로 프라이밍한 마우스에서 2번의 H1N1sw 부스팅 투여 후 IgG 혈청 항체 역가를 나타낸다(ELISA). 프라이밍 및 부스팅 균주 및 어주번트 첨가를 나타낸다.
페럿 연구
참고문헌 109는 인플루엔자 백신을 조사하기 위한 페럿 모델을 보고한다. 페럿은 어주번트(스쿠알렌-함유 수중유 에멀젼, MF59™) 또는 비어주번트 계절적 백신, 또는 PBS로 프라이밍되었다. 3주(21일) 후 이들 페럿은 어주번트 또는 비어주번트 3가의 계절적 또는 1가의 전염병 ('H1N1sw') 백신, 또는 PBS의 부스터 투여량을 받았다. 전제 8개의 동물 그룹 A 내지 H가 사용되었다:
Figure pct00001
제49일에 페럿을 H1N1sw 균주 (106 TCID50)로 면역성 검사를 하였고, 폐 병리를 각 그룹에서 평가하였다. 단지 코와 기관을 감염시키는 계절적 H1N1과 달리, H1N1sw 바이러스는 또한 폐를 감염시킨다. H1N1sw 바이러스는 페럿에 대해 치명적이지 않다.
영향을 받은 폐 유조직의 평균 %는:
Figure pct00002
이었다.
따라서, PBS 그룹과 비교하여, 어주번트 또는 비어주번트 계절적 백신으로 사전에 프라이밍되고, 그 다음에 상동 계절적 또는 H1N1sw로 부스팅된 모든 페럿들은 폐 병변에서 중요한 감소를 가진다. 부스팅 투여가 H1N1sw일 때 최고의 효과가 관찰되었고, 프라이밍과 부스팅 백신은 둘 다 어주번트가 첨가되었다(그룹 C). 프라이밍의 부재시 조차, 어주번트 H1N1sw의 1회 투여는 유사한 보호를 제공한다.
폐 바이러스 부하를 평가하였고 결과는 도 2에서 나타낸다. PBS와 비교하여, 어주번트 H1N1sw 백신 중 하나의 투여는 2 내지 3 로그에 의한 폐 바이러스 부하를 감소시켰다(그룹 G & H를 비교). H1N1sw 백신접종이 비어주번트 계절적 인플루엔자 백신의 투여 전에 선행된다면, 폐에서 바이러스 부하는 거의 검출가능하지 않은 수준으로 감소하였고(그룹 F), 계절적 백신이 어주번트가 첨가되기 전이라면(그룹 C) 바이러스 부하는 검출가능하지 않은 수준이었다.
바이러스 부하는 또한 비강 표본으로부터 평가할 수 있다(도 3), PBS와 비교하여, 어주번트 H1N1sw 백신이지만, 비어주번트 백신이 아닌 1회의 투여는 1 log로서 비강 표본에서 바이러스 부하를 감소시켰다. H1N1sw 백신접종이 비어주번트 계절절 백신으로 백신 접종에 의해 선행된다면, 비강 바이러스 부하는 추가로 감소되었다(그룹 F). H1N1sw 백신접종이 어주번트 계절적 백신으로 백신접종에 의해 선행되었다면, 비강 바이러스 부하는 검출가능하지 않다(그룹 C). 유사한 결과를 목 표본에서 발견하였다.
HI 항체 반응을 또한 제 49일에 측정하였다(도 4). 어주번트 H1N1sw 백신 중 1회 투여는 비어주번트 H1N1sw 백신보다 더 면역성이었다. 어주번트 계절적 백신으로 사전에 면역화한 페럿에서 H1N1sw 바이러스에 대한 HI 역가는 적어도 1 log로써 증가되었다.
계절절 H1N1 및 H3N2 계절적 균주에 대한 HI 항체 반응을 또한 평가하였다. 계절적 H1N1 및 H1N1sw 사이의 교차-반응하는 항체들은 HI에 의해 검출되지 않았다.
따라서 어주번트 H1N1sw 백신의 1회 투여는 폐, 코, 및 목에서 바이러스 부하에 의해 측정한 비어주번트 백신보다 더 면역원성이고 더 효율적이었다. 면역원성과 효율성은 둘 다 계절적 인플루엔자 백신으로 사전 면역화에 의해 향상되었고, 이 효과는 계절적 백신이 어주번트가 있다면 더 양호하였다. 면역원성과 효율성의 이런 향상은 계절적 H1N1과 H1N1sw 사이의 항체 교차-반응(HI에 의함)에 기인하여 나타나지 않는다.
이 결과는 노인들이 항체들의 작은 교차-반응성에도 불구하고 H1N1sw 바이러스에 대해 더 양호하게 보호되는 이유를 설명할 수 있다. 이 효과는 계절적 바이러스로 사전의 면역학적 경험에 기인할 수 있기 때문에, 항체들의 교차-반응성이 거의 없거나 없음에도 불구하고, 그것들은 또한 건강한 성인에서 1회 투여 후 양호한 반응을 나타내는 임상적 시도의 예비적 결과를 설명할 수 있다. 결과는 또한 어주번트의 존재하에서 그리고 환자가 사전에 어주번트 계절적 백신으로 면역화되었다면, 더 양호한 보호가 달성된다는 것을 암시한다. 데이터는 1회 용량이 여전히 임상학적으로 유용할 수 있다 해도 최상의 그리고 지속된 보호를 위해, 면역학적으로 나이브한 개체(예를 들어, 어린이) 및 면역학적으로 약한 개체는 1회 이상의 어주번트 H1N1sw 백신의 투여를 필요로 한다는 것을 제안한다. 이 페럿 연구의 더욱 상세한 설명은 참고문헌 110에 있다.
마우스 연구 I
H1N1sw 백신으로 수중유 에멀젼 어주번트를 사용하는 것의 이점은 마우스에서 수행한 면역원성 연구로부터 명백하다. 프라이밍되지 않은 마우스에서, 플루 항원에 어떤 사전 노출 없이, 에멀젼-어주번트 H1N1sw 백신의 1회 투여는 사람에서 보호와 관련된 HI 역가를 제공한다. 그러나, 어주번트 없이 이 역가에 도달하기 위해 2회의 투여가 필요로 되었다. 따라서 사람 보호는 어린이에게서조차 1회 어주번트 투여량으로 달성될 수 있다. 대조적으로, 1976년 돼지 플루 백신은 어린이와 젊은 성인에 대해 2회 투여가 필요로 되었다. 추가로, 어주번트는 프라이밍되지 않은 피험자에서조차 1회 투여 면역화를 가능하게 하기 때문에, 인플루엔자에 이미 노출된 피험자들(예를 들어, 일반 성인 모집단)은 또한 강한 반응을 이루기 위해 백신의 단지 1회의 어주번트 투여를 필요로 한다.
백신을 난에서 성장된 H1N1sw A/California/07/2009 H1N1-유사 바이러스로부터 제조하였다. 백신은 스쿠알렌 (MF59™)을 포함하는 수중유 에멀젼의 어주번트가 첨가되지 않거나 첨가되었다. 백신을 0.5μg 또는 1μg 중 하나의 HA 투여로 SRID에 의해 표준화하였다. 6-7 주령의 Balb/c 마우스를 인산완충식염수, 0.5 또는 1.0 μg(HA 함량)의 항원 단독, 또는 0.5 μg의 항원으로 50 μl의 어주번트와 함께 제1일에 근육내로 면역화하였다. 투여 부피는 100μl이었다. 혈청을 제13일에 얻었다. 마우스를 제2 투여로 부스팅하였고, 제14일에 처음으로 매칭하였다. 혈청을 제21일에 다시 수집하였다. 혈청을 항원에 대해 불활성화된 전 바이러스 및 칠면조 적혈구를 사용하여 헤마글루틴화 억제(HI)에 의해 평가하였다.
0.5 μg 어주번트 항원에 의한 단일 면역화는 면역화의 2주 후 얻은 혈청에서 1:63의 평균 작용 항체(HI) 역가를 유발하였다. 1:40의 HI 역가는 계절의 인플루엔자로부터 사람의 보호와 관련된다[111]. 2주 후 어주번트 백신으로 제2 면역화는 부스트 후 1주에 얻은 혈청에서 1:1280으로 평균 HI 역가를 증가시켰다. 어주번트 없이 항원으로 단일 면역화는 상당한 HI 역가를 유발하지 않았지만, 2주 후 제2 면역화는 후에 1:160의 HI 역가를 유발하였다. 0.5 또는 1.0 μg의 비어주번트 항원으로 면역화에 의해 유발되는 역가에서 유의한 차이는 없었다.
이들 데이터는 다른 잠재적 전염성 인플루엔자 균주에 대해 백신으로 사람 면역화의 결과와 일치한다. 어주번트 없이, H5 조류 인플루엔자 균주에 대한 백신은 낮은 항체 역가를 유발하고; MF59는 유발된 항체의 신속성, 역가 및 폭넓음을 증가시킨다[112,113]. 1976년 돼지 기원 인플루엔자의 훨씬 더 적은 사람 발병 동안, 어주번트 백신은 이용될 수 없었다. 1976년 백신의 1회 투여는 젊은 사람에서 낮은 항체 역가를 유발하였지만, 노인 개체에서 상당히 더 높은 역가를 유발하였고, 아마도 노인 피험자는 더 주요한 인플루엔자 감염 또는 면역화를 경험하였기 때문이다[114]. 마우스 면역화 데이터는 H1N1 sw 전염성 면역화 캠페인에서 MF59와 같은 어주번트를, 특히 인플루엔자 감염 또는 면역화에 대한 사전 노출이 거의 없거나 없는 어린이와 젊은 성인에 대해 포함하는 것을 지지한다. 이들 개체들은 현재 전염병에서 질병률 및 사망률에 특히 취약하다[115]. MF59-어주번트 전염성 항원으로, 면역학적으로 나이브한 마우스에 주어진 1회 투여는 사람에서 계절적 인플루엔자로부터의 보호와 관련된 항체 반응을 생성하며; 어주번트 없이, 2회 투여가 필요로 된다. 이 연구에서, 비어주번트 항원의 0.5 내지 1 μg은 관찰된 투여 반응이 없었다. 마우스에서 이런 발견은 이용가능한 투여의 수를 증가시킬 수 있는 투여-스페어링(sparing) 섭생이 사람 임상 시도에서 효과적이라는 것을 증명할 수 있는 가능성을 증가시킨다.
마우스 연구 II
계절적 H1N1(A/Brisbane/59/2007; 0.2μg HA 투여) 1가의 백신(MF59 어주번트가 있거나 없는)으로 프라이밍한 마우스를 동일한 백신으로 또는 동일한 1가의 백신으로(또한, MF59 어주번트가 있거나 없는) 2회(제36일과 제66일) 부스팅하여 전염성 H1N1 sw 균주로부터 제조하였다(A/California/04/2009 적혈구응집소).
면역 반응의 ELISA 분석(도 5)는 마우스가 H1N1sw 백신에서 더 높은 역가 반응에 대해 효과적으로 프라이밍되고, 이 프라이밍은 H1N1sw 백신이 어주번트가 없다면 특히 중요하다는 것을 제안한다. 프라이밍되지 않은 마우스 또는 비어주번트 계절적 H1N1으로 프라이밍된 마우스에서, H1N1sw 백신은 어주번트가 있어야만 높은 역가 반응을 보였다.
따라서 H1N1sw 백신의 어주번트 첨가는 강한 면역 반응을 위해 중요한 것으로 보인다. 게다가, 어주번트 첨가는 계절적 백신이 전염성 백신에 대한 강한 항체 반응을 위한 프라이밍을 허용하는 것이 중요한 것으로 보인다.
요약해서, 2회 투여의 비어주번트 전염성 백신으로 면역화는 비어주번트 계절적 백신으로 프라이밍되지 않은 마우스 또는 프라이밍된 마우스에서 기능적 항체를 거의 유발하지 않았다. 그러나, 어주번트 계절적 백신으로 프라이밍된 마우스에서, 비어주번트 전염성 백신의 2회 투여는 양호한 반응을 제공하였다. 마우스는 그것들이 프라이밍되었는지 여부와 상관없이 어주번트 전염성 백신의 2회 투여와 강하게 반응하였다. 어주번트 계절적 백신이 전염성 균주에 대한 항체를 효율적으로 유발하지 않을 수 있지만, 따라서, 그것들은 전염성 백신에 대한 더 높은 역가를 위해 프라이밍될 수 있다. 이들 데이터는 전염성 면역화를 위한 수중유 어주번트의 사용과 또한 계절적 캠페인에서 전염성 면역화를 위한 모집단을 준비하는 것을 지지한다.
마우스 연구 III
40개 중 3개의 그룹 6주령 암컷 BALB/c 마우스는 2005/06 시즌 또는 2009/10 시즌 중 하나에(둘 다 북반구), 3가의 계절적 백신의 1회 근육내 주사를 받았다. 인플루엔자-나이브 대조군 마우스는 PBS를 받았다. 백신들을 제0일에 1/1Oth 사람 투여(1.5μg HA/균주)로 투여하였다. 제40일에 마우스를 각각 10마리의 동물들의 4개의 서브그룹으로 나누었고 1가의 불활성화된 H1N1sw 백신으로 재접종하였다. 4개의 그룹을 소르비탄 올레이트, 폴리옥시에틸렌 세토스테아릴 에테르 및 만니톨과 조합하여 스쿠알렌을 포함하는 서브미크론 수중유 에멀젼 어주번트와 함께 또는 없이 높은 또는 낮은 투여량(3μg HA 또는 0.3 μg HA)을 받았다. 모든 동물들은 그 다음에 제61일에 제2 H1N1sw 투여량을 받았다. 제2 및 전염성 H1N1 균주에 대한 HI 항체들의 존재를 제40일, 제61일, 제75일, 및 제102일에 평가하였다. 이 마우스의 완전한 상세한 설명은 참고문헌 116에서 주어진다.
결과는 H1N1 백신의 1회 주사가 어주번트와 함께 또는 어주번트 없이 보호 수준에 대한 HI 항체 반응을 유발하기에 충분하다는 것을 확인하였다. H1N1sw 균주에 대한 HI 항체 역가(GMT)는 비어주번트 백신의 0.3 μg HA로 면역화된 나이브한 마우스의 그룹을 제외한 모든 그룹에서 > 40 이었다.
이전의 계절적 인플루엔자 백신 접종에 의해 유발된 항체들은 H1N1sw 균주와 교차 반응하지 않지만, 계절적 인플루엔자 백신으로 프라이밍은 비어주번트 H1N1sw 백신에 대해 더 높은 항체 반응을 야기하였다. 대조적으로, 이전의 계절적 면역화는 이들 군에서 어주번트 백신에 의해 유발된 강한 1차 반응에 기인하는 것 같이, 마우스에서 어주번트 H1N1sw 백신의 면역원성에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않았다.
결론적으로, 마우스 연구 III은 수중스쿠알렌 에멀젼과 함께 제형화되는 스플리트-비리온 불활성화된 H1N1sw 백신의 사람에서 사용을 지지한다.
Focetria ™ 및 Celtura ™ 제품
Either SPF 난 (Focetria™에 대해) 또는 MDCK 세포의 현탁 배양물(Celtura™에 대해)을 SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO: 1과 더욱 가깝게 관련된 적혈구응집소과 함께 재교배 H1N1 인플루엔자 A 바이러스 균주로 감염시켰다. 바이러스를 알려진 기술을 사용하여 성장시킨 다음 수집하였고 불활성화시키고, 1가의 표면 항원 백신을 정제된 바이러스로부터 제조하였다. 정제된 항원들을 희석시킨 다음 서브미크론 스쿠알렌 방울(MF59™)을 포함하는 수중유 에멀젼과 합하여서 Focetria™ 제품(7.5μg의 적혈구응집소/0.5ml 단위 투여량을 가짐) 및 Celtura™ 제품(3.75μg의 적혈구응집소/0.25ml 단위 투여량을 가짐)에 대한 벌크 백신을 제공하였다. 제품을 주사기에 채운다. 따라서 제품을 주사를 위해 사전에 채운 주사기에서 나눈다. 이들 2가지의 1가 어주번트 제품은 다양한 지역에서 사람 용도를 위한 권한이 부여되었다.
사람 연구 I( 레스터 , 영국)
참고문헌 117에서 보고하는 바와 같이 1가의 표면 항원 백신들을 A/California/7/2009 H1N1sw 균주로부터 제조하였다. 백신 균주는 A/California/7/2001 H1N1sw로부터의 HA, NA 및 PB1 유전자 절편을 가지고 나머지 5개 절편은 A/PR8/8/34로부터 나온다. 바이러스를 MDCK 세포에서 성장시킨다. 바이러스와 항원들을 3가의 OPTAFLU™ 제품을 제조하기 위해 사용한 과정을 사용하여 제조하였다[118]. 두 백신들을 제조하였다: 7.5μg HA과 서브미크론 스쿠알린 방울을 포함하는 MF59 수중유 에멀젼을 가지는 어주번트 백신; 및 완충제 중에서 15μg HA를 가지는 비어주번트 백신. 모든 백신들은 0.5ml 부피를 가졌다. 어주번트 백신의 절반의 용량을 일부 피험자에 대해 사용하였다(즉, 0.25ml 부피로). SRID 시약이 이용가능하지 않기 때문에 최종 백신의 HA 함량은 역상 HPLC에 의해 결정하였다.
175명의 환자를 7개의 그룹으로 나누었다. 환자들은 단일 투여량(제0일) 또는 2회의 동일한 투여량(제0일; 제7일, 제14일 또는 제21일)을 받았다. 7개의 그룹 A 내지 G는 다음과 같았다(투여량; adj = 어주번트):
Figure pct00003
면역원성을 제0일, 제14일 및 제21일에 평가하였다. 중간 평가는 제21일 투여량의 투여 바로 직전에 면역원성을 측정하였다. 따라서 A 내지 C 그룹은 그들의 섭생을 완료한 한편, D 그룹은 단지 1회의 7.5μg 어주번트 투여량을 받았다. E 내지 G 그룹은 이 중간 단계에서 평가하지 않았다. 항체 반응은 혈구응집(haemagglutination)(HI) 어세이에 의해, 기하학적 평균 역가(geometric mean titers: GMT), 기하학적 평균 비율, 혈청 전환(%) 및 혈청 보호(%)로서 평가되었다. 항체 반응은 또한 마이크로중화(MN)에 의해 GMTs로서, 역가 ≥>40 (%)을 갖는 환자의 비율 또는 혈청 전환으로서 평가되었다. 중간 평가에서 HI에 의한 항체 반응은 다음과 같았다:
Figure pct00004
중간 평가에서 MN에 의한 항체 반응은 다음과 같았다:
Figure pct00005
예비면역화 항체는 HI 어세이(역가 >1:8) 및 MN 어세이 (역가 >1:10)에 의해 각각 환자의 14% 및 39%에서 검출되었고, 이 빈도는 연령 또는 이전에 계절 백신을 받은 경험과 무관하였다. 제14일에, HI 및 MN 어세이를 사용하여 측정한 기하학적 평균 역가(GMTs)는 단지 단일 투여량을 받은 환자들과 비교하여 2회의 7.5μg 어주번트 투여량을 받은 환자들(D 그룹에 대해 A 내지 C 그룹을 비교)에서 더 높았고 그룹들 간의 역가에 있어서 유의적인 차이는 없었다. 제21일에, 단일 투여량 또는 2회 투여량을 받은 환자들 가운데 역가에 있어서 유의적인 차이는 없었다. 모든 환자들은 제21일에 1:40을 초과하는 역가에서 MN 항체를 가졌다.
따라서 중간 단계에서 면역 반응은 어주번트 백신의 1회 투여량의 투여 후 2주 내에 2009 H1N1sw 바이러스에 대한 혈청 보호와 일치되었다. 여러가지 스케줄로 투여된 7.5 μg의 HA를 함유하는 어주번트 백신의 단일 또는 2회 투여량은 강건한 항체 역가를 유발하였다. 2배 투여량(15 μg HA)은 단일 투여량보다 더 높은 항체 수준을 제공하였으나, 혈청 보호 역가는 모든 그룹에서 환자의 적어도 80%에서 달성되었다.
사람 연구 II
1가의 불활성화된 항원 백신을 난에서 성장한 A/California/7/2009 H1N1sw 바이러스로부터 제조하였다. 항원을 30μg/ml의 HA 농도로 희석하였고 MF59 수중유 에멀션(시트르산 완충액 중에 미크론이하 스쿠알렌 점적을 포함함)과 혼합하여 15μg/ml의 HA 농도를 갖는 어주번트 벌크를 얻었다. 어주번트 백신을 개별 0.5ml 투여량으로 주사기에 포장하여 0.5ml 투여량 당 7.5μg HA를 갖는 백신을 제공하였다. 어주번트 백신(예를 들면 FOCETRIA™ 제품)은 예를 들어서 삼각근 또는 전외측 대퇴부에 근육내 투여한다.
사람 연구 III
H1N1sw 주로부터의 1가 불활성화된 분리 백신을 사람 성인 자원자들(18-60세)에게 제공하였다. 환자들은 어주번트 백신 또는 비어주번트 백신을 받았다. 어주번트 백신은 스쿠알렌(AS03)을 포함하는 미크론이하 수중유 에멀션을 갖는 5.25μg HA를 가졌고; 비어주번트 백신은 21μg HA를 가졌다. 백신은 제0일 및 제21일에 투여되었다. A/California/7/2009에 대한 HI 역가, 또한 혈청 전환 및 혈청 보호를 이들 날들에 평가하였다. 이 사람 연구의 전체 자세한 내용은 참고문헌 119에 주어져 있다. 백신은 잘 허용되었고 면역원성 결과는 다음과 같았다:
Figure pct00006
따라서 어주번트 백신 및 비어주번트 백신은 둘다 성인에서 면역원성이었고, 5.25μg HA (어주번트) 또는 21μg HA (비어주번트) 중 어느 하나의 1회 투여량은 자격 평가기준을 만족하기에 충분하였다. 4배 더 적은 항원을 갖는 어주번트 백신은 비어주번트 백신에 대한 비교할만한 면역 반응을 유발하였다.
사람 연구 IV
어주번트 1가 H1N1sw 백신(7.5μg HA; FOCETRJA™)을 3가 (3x15 μg HA) 2009/10 계절 백신 (어주번트 또는 비어주번트)과 동시에, 또는 3개월 후에 사람 환자(성인 및 노인)에게 제공하였다. 모든 백신은 불활성화된 표면 항원 백신이었고, 어주번트는 스쿠알렌 함유 수중유 에멀션(MF59™)이었다. 모든 백신의 면역원성은 제1일 및 제22일에 혈구응집 억제에 의해 평가하였고 환자 다이어리를 사용하여 안전성 및 반응생성력을 모니터하였다. 이 사람 연구의 전체 자세한 내항은 참고문헌 120에 주어져 있다.
어주번트 H1N1sw 백신의 단일 투여량은 어느 백신이든 허용성 또는 면역원성에 영향을 주지 않고 성인에서 계절 백신접종 3개월 후 또는 계절 백신과 동시에 성인 및 노인 환자에 대해 자격 평가기준을 충족하였다.
사람 연구 V: 조합 요법
만성 투석을 하고 있는 말기 신장 질환을 갖는 환자에게 1가 불활성화 표면 항원 백신의 형태로 H1N1* 적혈구응집소(hemagglutinin)를 함유하는 FOCETRJA™ 백신을 투여량 당 7.5 μg을 제공하였다. 백신은 스쿠알렌을 포함하는 MF59™ 미크론이하 수중유 에멀션 어주번트를 포함한다. 일부 환자들은 또한 간염 바이러스의 치료용으로 알려진 펩티드인 티말파신(thymalfasin)(티모신 알파 1; ZADAXIN™ 제품으로서 상업적으로 이용됨)을 받았다.
두가지 다른 투여량의 티말파신을 시험하여 무작위 3-암(arm) 오픈 레벨 연구를 제공하였다.
티말파신은 2회 제공되었고, 백신접종 7일 전에 1회째 주사 및 백신접종일에 2회째 주사하였다. 제21일에 적어도 1:40의 항체 역가를 달성하지 않은 모든 환자들은 그날에 2회째 백신접종을 받았다.
FOCETRJA™ 백신만을 받은 환자들과 비교하여, 두번 투여량으로 티몰파신의 추가는 백신접종 21일 후 및 42일 후에 모두 혈청 전환된 환자의 백분률에 있어서 통계학적으로 상당한 증가를 가져왔다. 티말파신(3.2mg)의 낮은 투여량을 받은 환자의 93%와, 높은 투여량(6.4mg)을 받은 환자의 94%는 42일 후에 H1N1* 바이러스에 대한 혈청 전환을 달성하였고 백신만을 받은 환자의 77%와 비교되었다.
사람 연구 VI
두가지 다중심 무작위 투여량 범위 연구는 6개월생 내지 12세의 건강한 어린이에서 어주번트(MF59와 함께) 및 비어주번트 난 유도 및 세포배양물 유도 1가 H1N1sw 백신을 평가하였다. 목적은 건강한 어린이 및 성인에서 바람직한 백신 조제물(어주번트와 함께 또는 없이), 투여량 및 스케줄(단일 또는 2회 투여)를 확인하는 것이었다.
등록시, 환자들은 (i) 네가지 연령 코호트, 즉 9-17세, 3-8세, 12-35개월 및 6-11개월로 계층화하였고; (ii) 무작위로, 3.75μg HA + Vi 투여량 MF59, 7.5μg HA + 전체 투여량 MF59 또는 15μg HA 비어주번트가 제공된 세가지 백신 그룹으로 하였다. 9-17세 연령 어린이 및 6-11개월 유아는 단지 어주번트 백신만을 받았다. 환자들은 21일 간격을 두고 2회 백신접종을 받았다. 백신은 난에서 또는 MDCK 세포 배양물(현탁 배양)에서 제조되었다.
면역원성은 혈구응집 억제(HI)에 의해 각 백신접종후 21일후 측정하였다. 백신접종 후/전 HI 역가의 기하학적 평균 HI 역가 (GMT) 및 기하학적 평균 비율(GMR)을 계산하였다. 혈청 전환, 즉 백신접종 후 HI ≥1:40를 갖는 환자 및 베이스라인에서 음(HI <1:10)인 환자의 %, 또는 베이스라인에서 양(HI≥1:10)인 환자에 대한 최소 4배 증가를 또한 평가하였다. 혈청보호 비율(SP), 즉 HI 역가 ≥1:40을 갖는 환자의 ＾을 또한 평가하였다.
3-8세 및 9-17세 연령 환자(세포 유도 백신을 받은 388명 환자, 및 난 유도 백신을 받은 403명 환자)로부터 중간 제시물을 얻었다. 세포 유도 백신을 받는 환자에서 GMT 및 GMR 값은 다음과 같았다:
Figure pct00007
난 유도 백신을 받는 환자에서 GMT 및 GMR 값은 다음과 같았다:
Figure pct00008
두 연구에서 어주번트 백신은 9-17세 및 3-8세 연령 코호트에서 제 1 및 제 2 백신접종 3주후 SP 비율 ≥70%를 가졌다. 두 연구에서 비어주번트 백신은 2회째 백신 투여량 3주후 3-8세 연령 코호트에서 SP 비율 ≥70%를 달성하였다. 두 연령 코호트에서 모든 백신(3-17세)은 두 연구에서 1회째 및 2회째 백신접종 3주후SC 비율 ≥40%를 가졌다. GMT는 각 투여량 3주후 강하게 증가하였고 두 코호트에서 모든 백신은 GMRs ≥2.5를 가졌다.
어주번트 난 유도(FOCETRIA™) 및 세포 배양물 유도(CELTURA™) 백신은 비어주번트 백신보다 더 낮은 HA 투여량에서 신속하고 강한 면역 반응을 유도하였다. 모든 어주번트 백신의 면역원성은 1회 투여량으로 유럽 정규 유행병 인플루엔자 백신 평가기준(HI 역가 ≥1:40을 갖는 환자 >70%; 혈청 전환 >40% 및 GMR >2.5)을 충족한다.
사람 연구 VII ( 코스타 리카 )
이 연구는 소아 집단에서 어주번트(MF59와 함께) 또는 비어주번트 H1N1sw 백신의 투여 후 안전 및 항체 반응을 결정하는 것을 목적으로 하였다. 백신을 난에서 성장시킨 바이러스로부터 제조하였다. 환자들을 두 연령 그룹으로 나누고(어린이 연령 3-8세 및 성인 연령 9 내지 17세) 무작위로 (a) 어주번트 백신의 단일 7.5μg 투여량, (b) 단일 15μg 비어주번트 투여량, 또는 (c) 30μg 비어주번트 투여량(2×l5μg 투여량)으로 하였다. 3주후, 환자들은 7.5μg의 H5N1 혈소판 응집소를 갖는 MF59-어주번트 백신(표면 항원 백신, 난-유도)을 받았다. 혈청 시험을 위한 혈액 샘플을 제1일(면역화), 제22일, 제29일 및 제43일에 수집하였다. H1N1 백신 항원에 대한 항체 역가를 혈구응집 억제(HI)에 대해 평가하였다. 항혈구응집 억제 항체의 기하학적 평균 역가(GMTs), 혈청 전환(SC) 비율 및 HI 역가 ≥1:40를 갖는 환자의 백분률을 계산하였다. SC 비율 및 HI 역가 ≥1 :40를 이용가능한 생물학 평가 및 연구 센터(Center for Biologies Evaluation and Research: CBER) 정규 평가기준과 비교하였다. SC 비율에 대한 95% CI의 하부 결합은≥40%이어야 한다. HI 역가 ≥1 :40을 갖는 백분률에 대한 95% CI의 하부 결합은 ≥ 70%이어야 한다.
194명의 어린이 및 196명의 성인이 등록하였다. 1회째 투여량(제22일)후, 7.5μg 어주번트 백신을 제공한 어린이의 93%는 HI 역가 ≥1:40을 달성하였고, 비어주번트 백신을 제공한 어린이의 72-74%와 비교되었다. 어린이 연령 3-8세에서 어주번트 백신에 대한 SC 비율(제22일)(91%)은 비어주번트 백신(71-72%)보다 더 높았다. 제29일에, 7.5μg의 어주번트 백신을 제공한 모든 환자들은 HI 역가 ≥1 :40을 달성하였고; 모든 백신은 CBER 평가기준을 충족하였다. 2회째 백신 투여량 후에 SC 비율은 모든 연구 그룹에 걸쳐 83-95% 범위이었다. GMTs는 각 백신접종후 상승하였고, 특히 어린이에서 7.5μg 어주번트 백신을 제공한 환자들에서 더 강하게 상승하였다. 모든 세가지 H1N1 백신은 백신의 2회 투여량 내에서 소아 집단에서 높은 HI 항체 반응을 발생시켰고, 1회 투여량 후 단지 어주번트 백신만 CBER 면역원성 평가기준을 충족하는 HI 항체 반응을 달성하였다. 이들 평가기준은 비어주번트 백신과 비교한 어주번트 백신에서 항원의 더 낮은 전체 투여량(7.5μg)으로도 충족되었다.
사람 연구 VIII (미국)
투여량 범위 연구를 수행하여 소아 집단에서 수중유 어주번트(MF59)와 함께 또는 없이 1가 H1N1sw 백신의 최적 투여량을 평가하였다. 전체 1357명의 건강한 어린이, 3 내지 < 9세 연령을 등록시켰다. 어린이들을 무작위로 균등하게 8개 그룹으로하고 제1일 및 제22일에 근육내 백신 주사를 제공하였다. 백신을 MF59와 함께 또는 전혀 없이 또는 절반 투여량으로 3.75, 7.5, 15 또는 30 μg HA로서 조제하였다. CBER 평가기준에 따르는 면역원성(HI 어세이)[HI 역가 ≥1 :40 (95% CI 하부 결합 ≥ 70%) 및 혈청 전환 비율 (95% CI 하부 결합 > 40%)]을 제22일 및 제43일에 평가하였다. 혈청 전환은 백신접종 전 HI 역가 < 1 : 10 및 백신접종 후 역가 ≥1 :40, 또는 백신접종 전 HI 역가 ≥1 :10 및 백신접종 후 역가의 ≥ 4-배 상승으로서 정의되었다. HI 항체 반응은 백신접종 역가 후 내지 전의 기하학적 평균 역가(GMTs) 및 기하학적 평균 비율(GMRs)로서 표시되었다. 각 그룹 간의 GMT 비율의 쌍으로의 비교를 행하였고 95% CI를 0.5, 및 이어서, 0.67의 비열화성 마진에 대해 평가하였다. 백신 그룹 간의 차이는 GMT 비율 둘레의 2-측면 95% CI가 1을 함유하지 않으면 통계학적으로 유의한 것으로 추정되었고, 통계학적으로 상당한 우수성 아니면 열화성을 나타낸다.
GMT 및 GMR 결과는 다음과 같았다:
Figure pct00009
각 그룹에서 베이스라인 혈청양성 비율(HI 역가 ≥10)은 비교할만하였다(18% - 27%). 모든 어주번트 그룹은 단일 투여량 후 HI 역가 ≥1 :40 평가기준을 만족한 한편 비어주번트 그룹은 2회 투여량 후에만 혈청 보호 평가기준을 충족하였다. 모든 백신 그룹에서의 환자들은(비어주번트7.5μg 그룹 제외) 투여량 1 후에 혈청 전환 평가기준을 만족하였고 모든 그룹은 2회 투여량 후 이 평가기준을 만족하였다. 2-측면 95% CI를 사용하는 제22일에 GMTs의 쌍으로 한 그룹 비교는 모든 어주번트 백신이 비어주번트 백신보다 우수하다는 것을 나타낸다. 어주번트 그룹은 단일 투여량 후 자격 평가기준을 충족하였고 7.5μg 항원 및 MF59 어주번트의 절반 투여량을 갖는 백신 투여량은 분명하게 우수한 반응을 나타내었다.
본 발명을 예로써만 기술하였으며 본 발명의 범위와 개념을 벗어나지 않으면서 수정들이 가해질 수 있다는 것이 이해될 것이다.
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Gly Tyr Ile Cys Ser Gly 305 310 315 320 Ile Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly 325 330 335 Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys 340 345 350 Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg 355 360 365 Asn Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp 370 375 380 Asn Asn Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser 385 390 395 400 Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp 405 410 415 Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys 420 425 430 Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val 435 440 445 Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro 450 455 460 Phe Thr Ile Asp Lys 465 <210> 5 <211> 470 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 5 Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Ile Cys Met Thr 1 5 10 15 Ile Gly Ile Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile 20 25 30 Trp Val Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile 35 40 45 Cys Asn Gln Arg Ile Ile Thr Tyr Glu Asn Ser Thr Trp Val Asn Gln 50 55 60 Thr Tyr Val Asn Ile Asn Asn Thr Asn Val Val Ala Gly Lys Asp Thr 65 70 75 80 Thr Ser Val Thr Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg Gly 85 90 95 Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly 100 105 110 Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu Glu 115 120 125 Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His 130 135 140 Ser Asn Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Ala Leu Met Ser 145 150 155 160 Cys Pro Ile Gly Glu Ala Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser 165 170 175 Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Met Gly Trp Leu Thr 180 185 190 Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Asp Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr 195 200 205 Asn Gly Ile Ile Thr Glu Thr Ile Lys Ser Trp Arg Lys Arg Ile Leu 210 215 220 Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr 225 230 235 240 Ile Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly Pro Ala Ser Tyr Arg Ile Phe 245 250 255 Lys Ile Glu Lys Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ile Glu Leu Asp Ala Pro 260 265 270 Asn Ser His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Thr Gly Thr Val 275 280 285 Met Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val 290 295 300 Ser Phe Asn Gln Asn Leu Asp Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly 305 310 315 320 Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Lys Asp Gly Lys Gly Ser Cys Asp 325 330 335 Pro Val Thr Val Asp Gly Ala Asp Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Arg 340 345 350 Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Asn Ser Ser Arg 355 360 365 Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Asp Thr Asp 370 375 380 Ser Asn Phe Leu Val Lys Gln Asp Val Val Ala Met Thr Asp Trp Ser 385 390 395 400 Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp 405 410 415 Cys Met Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Val Arg Gly Arg Pro Arg 420 425 430 Glu Gly Thr Thr Val Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly 435 440 445 Val Asn Ser Asp Thr Ala Asn Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu 450 455 460 Pro Phe Thr Ile Asp Lys 465 470 <210> 6 <211> 566 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 6 Met Lys Ala Ile Leu Val Val Leu Leu Tyr Thr Phe Ala Thr Ala Asn 1 5 10 15 Ala Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr 20 25 30 Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn 35 40 45 Leu Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val 50 55 60 Ala Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly 65 70 75 80 Asn Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile 85 90 95 Val Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe 100 105 110 Ile Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp 130 135 140 Ser Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser 145 150 155 160 Phe Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro 165 170 175 Lys Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val 180 185 190 Leu Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu 195 200 205 Tyr Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser 210 215 220 Lys Thr Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Arg 225 230 235 240 Glu Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys 245 250 255 Ile Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe 260 265 270 Ala Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro 275 280 285 Val His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn 290 295 300 Thr Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys 305 310 315 320 Pro Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg 325 330 335 Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly 340 345 350 Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr 355 360 365 His His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Leu Lys Ser 370 375 380 Thr Gln Asn Ala Ile Asp Glu Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile 385 390 395 400 Glu Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn His 405 410 415 Leu Glu Lys Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe 420 425 430 Leu Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn 435 440 445 Glu Arg Thr Leu Asp Tyr His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu 450 455 460 Lys Val Arg Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly 465 470 475 480 Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Thr Cys Met Glu Ser Val 485 490 495 Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ala Lys Leu 500 505 510 Asn Arg Glu Glu Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Thr Arg Ile Tyr 515 520 525 Gln Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Val 530 535 540 Val Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu 545 550 555 560 Gln Cys Arg Ile Cys Ile 565 <210> 7 <211> 326 <212> PRT <213> Influenza A virus <400> 7 Asp Thr Leu Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr Val 1 5 10 15 Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn Leu 20 25 30 Leu Glu Asp Lys His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Arg Gly Val Ala 35 40 45 Pro Leu His Leu Gly Lys Cys Asn Ile Ala Gly Trp Ile Leu Gly Asn 50 55 60 Pro Glu Cys Glu Ser Leu Ser Thr Ala Ser Ser Trp Ser Tyr Ile Val 65 70 75 80 Glu Thr Pro Ser Ser Asp Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Ile 85 90 95 Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu 100 105 110 Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Thr Ser Ser Trp Pro Asn His Asp Ser 115 120 125 Asn Lys Gly Val Thr Ala Ala Cys Pro His Ala Gly Ala Lys Ser Phe 130 135 140 Tyr Lys Asn Leu Ile Trp Leu Val Lys Lys Gly Asn Ser Tyr Pro Lys 145 150 155 160 Leu Ser Lys Ser Tyr Ile Asn Asp Lys Gly Lys Glu Val Leu Val Leu 165 170 175 Trp Gly Ile His His Pro Ser Thr Ser Ala Asp Gln Gln Ser Leu Tyr 180 185 190 Gln Asn Ala Asp Ala Tyr Val Phe Val Gly Ser Ser Arg Tyr Ser Lys 195 200 205 Thr Phe Lys Pro Glu Ile Ala Ile Arg Pro Lys Val Arg Asp Arg Glu 210 215 220 Gly Arg Met Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Val Glu Pro Gly Asp Lys Ile 225 230 235 240 Thr Phe Glu Ala Thr Gly Asn Leu Val Val Pro Arg Tyr Ala Phe Ala 245 250 255 Met Glu Arg Asn Ala Gly Ser Gly Ile Ile Ile Ser Asp Thr Pro Val 260 265 270 His Asp Cys Asn Thr Thr Cys Gln Thr Pro Lys Gly Ala Ile Asn Thr 275 280 285 Ser Leu Pro Phe Gln Asn Ile His Pro Ile Thr Ile Gly Lys Cys Pro 290 295 300 Lys Tyr Val Lys Ser Thr Lys Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn 305 310 315 320 Ile Pro Ser Ile Gln Ser 325

Claims (23)

  1. (i) SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO:1에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 및 (ii) 수중유 에멀젼 애쥬번트를 포함하는 백신을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 사람의 면역화 방법.
  2. (i) SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO:1에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 및 (ii) 수중유 에멀젼 애쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 1가 백신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 헤마글루티닌이 SEQ ID NO: 2와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 2 항 내지 제 4 항 중 한 항에 있어서, 수중유 에멀젼 애쥬번트가 스쿠알렌을 포함하며, 직경 250nm 이하의 소적들을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제 2 항 내지 제 5 항 중 한 항에 있어서, 조성물의 헤마글루티닌 농도가 약 7.5μg/ml 또는 약 15μg/ml인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제 2 항에 있어서, H3N2 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌과 인플루엔자 B 바이러스 헤마글루티닌을 또한 포함하는 3가 백신인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. 2개의 상이한 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌과 수중유 에멀젼 애쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물로서, (i) 제 1의 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌은 SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO: 1에 더욱 가깝게 관련되고, (ii) 제 2의 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌은 SEQ ID NO: 1보다 SEQ ID NO: 3에 더욱 가깝게 관련되는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, (iii) H3N2 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌 및 (iv) 인플루엔자 B 바이러스 헤마글루티닌을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 8 항에 있어서, (iii) H3N2 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌; (iv) B/Victoria/2/87 유사 인플루엔자 B 바이러스 헤마글루티닌; 및 (v) B/Yamagata/ 16/88 유사 인플루엔자 B 바이러스 헤마글루티닌을 또한 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. (i) H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 1가 백신을 환자에게 투여하는 단계 및 (ii) 3가 A/H1N1-A/H3N2-B 계절 인플루엔자 백신을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스에 대해 사람을 면역화하는 방법으로서, (a) 1가 백신은 SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO: 1에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 포함하고, (b) 3가 백신은 SEQ ID NO: 1보다 SEQ ID NO: 3에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 포함하며, (c) 1가 백신이 수중유 에멀젼 애쥬번트를 포함하고, (d) 3가 백신이 수중유 에멀젼 애쥬번트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 1가 백신을 3가 백신을 투여하기 적어도 4주 전에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 1가 백신을 3가 백신을 투여하고 적어도 4주 후에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 사람을 면역화하기 위한 1가 백신의 제조에서 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌의 사용으로서, 백신은 수중유 에멀젼 애쥬번트를 포함하고, 1가 백신은 SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO: 1에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  15. 제 14 항에 있어서, 사람이 이전에 3가 A/H1N1-A/H3N2-B 계절 인플루엔자 백신을 받은 적이 있고, 3가 백신은 SEQ ID NO: 1보다 SEQ ID NO: 3에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
  16. 전술한 항 중 한 항에 있어서, 에멀젼이 서브마이크론 직경의 오일 소적들을 포함하며, 에멀젼이 스쿠알렌을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법, 조성물 또는 사용.
  17. 적어도 2개의 상이한 균주의 인플루엔자 바이러스로부터 얻어진 헤마글루티닌을 포함하는 백신으로서, 제 1의 헤마글루티닌은 난에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 제조되고, 제 2의 헤마글루티닌은 세포 배양물에서 성장된 인플루엔자 바이러스로부터 제조되며, 제 2의 헤마글루티닌은 SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO: 1에 더욱 가깝게 관련되는 것을 특징으로 하는 백신.
  18. 제 17 항에 있어서, 세포 배양물은 MDCK 세포 배양물인 것을 특징으로 하는 백신.
  19. (i) 재조합 숙주에서 발현된 정제된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌으로서, SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO: 1에 더욱 가깝게 관련된 H1 헤마글루티닌, 및 (ii) 수중유 에멀젼 애쥬번트를 포함하는 면역원성 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 헤마글루티닌은 배큘로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 셀라인에서 발현된 것을 특징으로 하는 조성물.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서, 조성물은 재조합 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  22. 피험자에게 인플루엔자 백신의 2회의 분리된 용량을 투여하는 단계를 포함하는 피험자를 면역화하는 방법으로서, (a) 2회의 용량은 1-6주 간격으로 투여되고, (b) 각 백신은 SEQ ID NO: 3보다 SEQ ID NO: 1에 더욱 가깝게 관련된 H1 서브타입 인플루엔자 A 바이러스 헤마글루티닌을 함유하며, (c) 피험자는 2회의 백신 용량을 받는 동안 오셀타미비르 포스페이트와 같은 뉴라미니다제 억제제를 적어도 3번 복용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 투여되는 백신 중 하나 또는 둘 모두 수중유 에멀젼 애쥬번트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Legal Events

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Patent event date: 20111128

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
PC1203 Withdrawal of no request for examination
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid