KR20120125990A

KR20120125990A - Ｌｉｆ 및 ｂｍｐ에 의한 종양 줄기 세포의 종양발생 가능성의 억제

Info

Publication number: KR20120125990A
Application number: KR1020127028173A
Authority: KR
Inventors: 안젤로 뤼기 베스코비; 브렌트 알랜 레이놀즈
Original assignee: 스템젠 에스.피.에이.
Priority date: 2005-07-19
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2012-11-19
Anticipated expiration: 2026-07-19
Also published as: AU2006271308B2; CA2790675C; CA2615491C; KR101311061B1; US20100167999A1; PL3117833T3; JP2009502771A; JP2015057452A; CA2615491A1; KR101338533B1; HUE040063T2; WO2007010394A2; DK3117833T3; US9737589B2; JP5891068B2; AU2006271308A1; JP2012107063A; CA2790675A1; NZ565172A; US20160228511A1

Abstract

본 발명은 종양의 치료 방법을 비롯한, 과도한 세포 증식 또는 이상 제어된 세포 증식을 특징으로 하는 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 그 방법은 LIF 제제, BMP 제제, BMPR 신호전달 활성자 및 LIFR 신호전달 활성자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 포함하는 약학 조성물을 사용하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 LIF 제제, BMP 제제, BMPR 신호전달 활성자 및 LIFR 신호전달 활성자, 및 LIF 제제, BMP 제제, BMPR 신호전달 활성자 및 LIFR 신호전달 활성자의 확인 방법을 포함한다. 본 발명은 또한 LIF 제제, BMP 제제, BMPR 신호전달 활성자 및 LIFR 신호전달 활성자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 색인어: 과도한 세포 증식 또는 이상 제어된 세포 증식, LIF 제제, BMP 제제, BMPR 신호전달 활성자, LIFR 신호전달 활성자

Description

ＬＩＦ 및 ＢＭＰ에 의한 종양 줄기 세포의 종양발생 가능성의 억제{INHIBITION OF THE TUMORIGENIC POTENTIAL OF TUMOR STEM CELLS BY LIF AND BMPS}

본 명세서 내 임의의 종래 기술에 대한 참조는 본 종래 기술이 임의의 국가의 통상적 일반 지식의 일부를 구성함을 인정한다거나 어떠한 형태로도 제시하고자 함으로 간주되지 않고, 그와 같이 간주되어서도 안 된다. 본원에 인용된 모든 참조 문헌은 전반적으로 참조로 본원에 구체적으로 인용된다.

신경 줄기 세포

종래, 줄기 세포는 분화된 세포가 가장 손실되기 쉽고 크게 교체될 필요가 있는 조직, 예컨대 피부(Huelsken 등, Cell 105: 533-45, 2001), 장 상피(Potten 등, Development 110: 1001-20, 1990) 및 혈액(Morrison 등, Annu Rev Cell Dev Biol 11: 35-71, 1995)에서만 위치하는 것으로 생각되었다. 실제로, 성체 줄기 세포의 가장 잘 알려진 예는, 골수에서 발견되고 궁극적으로는 동물의 수명 전반에 걸쳐 모든 혈액 세포 유형을 발생시키는 원인이 되는 조혈모세포(HSC)이다(Morrison 등, 이하 동일; Weissman, Cell 100: 157-68, 2000; Weissman, Science 287: 1442-6, 2000). 성체 중추신경계(CNS)가 상당량의 신경세포사를 나타내면서 재생 능력이 없는 것으로 생각되어지지 않기 때문에, 신경 줄기 세포의 존재는 개연성도 없어 보이고 불필요해 보였다. 그러나, 1992년에, 2개 독립적 단체는 새로운 뉴런을 발생시키는 능력을 갖는 성체 포유동물 CNS 내에 있는 전구 세포의 존재를 성공적으로 입증하였다(Reynolds and Weiss, Science 255: 1707-10, 1992; Richards 등, Proc Natl Acad Sci USA 89: 8591-5, 1992).

새로운 뉴런의 공급원은 성체 포유동물 CNS의 전체 심실 신경축을 정렬하는 줄기 세포인 것으로 확인되었다(Reynolds and Weiss, 1992). 다른 조직에서 발견되는 줄기 세포와 같이, CNS 줄기 세포 (또는 신경 줄기 세포(NSC))는, 증식, 광범위한 자가 재생, 다수의 후대의 발생, 다혈통 분화 가능성 및 수술후 조직 재생의 생체내 특성의 시험관내 줄기 세포 특성을 입증하는 것으로 나타났다(Hall 등, Development 106: 619-33, 1989; Potten 등, 이하 동일).

줄기 세포의 역할들 중 하나는 분열하고, 증식하여 다수의 미분화된 세포를 형성하는 능력을 갖는 더 수임된(committed) 전구 세포를 발생시키는 것이다. 궁극적으로, 분화된 후대를 발생시키는 것은, 상기의 더 수임된 전구 세포 유형의 후대이다. 따라서, 줄기 세포는 동물의 수명 전반에 걸쳐 분열하는 능력, 및 이에 따른 광범위한 증식 가능성을 갖는 비수임 세포의 비교적 비활동성인(quiescent) 저장고로서 간주될 수 있고, 한편 선조 세포는 더 수임되고, 더 빈번하게 분열하나, 시간 경과에 따라 더 제한된 증식 가능성을 가진다. 발달 중에, 또한 이와 더불어 성체에서, 줄기 세포 및 선조 세포의 증식은 세포 발생을 지지한다.

줄기 세포는 임의의 특정 형태적, 분자적 또는 항원적 기호(signature)의 결여로 인해 기능적 기준에 따라 확인된다. 따라서, 시험관내 줄기 세포의 제어를 연구하기 위해, 줄기 세포 분열을 유도하는 조직 배양 방법이 발달되어야 한다. 그러한 검정이 거의 존재하지 않으나, 신경계에서는 신경구 검정(신경구 검정(NA))(Reynolds and Weiss, 이하 동일)라고 칭해지는 배양 방법이, 시험관내 NSC를 확인하고 전파하며 규명하기 위해 통상 사용된다. 간략히, NA는 배아에서 성체 CNS 조직으로의 마이크로분할, 및 그에 이은 세포 대 세포 접촉의 교란 및 단일 세포 부유액의 발생과 관련된다. 세포를 하나 이상의 증식-유도 성장 인자(즉, 표피 성장 인자[EGF], 염기성 섬유아세포 성장 인자[bFGF] 등)의 존재 하에 한정된 무혈청 배지 내의 조직 배양 장치에서(전형적으로 낮은 밀도로) 플레이팅한다. 2 내지 5일 내에 이러한 조건 하에서, 중복성 NSC는 분열하기 시작하여, 신경구로 칭해지는 미분화 세포의 클론으로 유래된 클러스터를 발생시킨다. 계속되는 증식 유도 인자의 존재 하에, 신경구 내의 세포는 계속해서 분열하고, 이는 신경구를 포함하는 세포의 수를 증가시키고, 궁극적으로는 신경구의 크기를 증가시킨다. 신경구는 수집되어, 단일 세포 부유액에서 교란되며, 세포를 배양액에 다시 플레이팅하여 새 신경구를 발생시킨다. 이러한 방식으로 NSC를 계대 배양하면, 생육가능한 CNS 전구 세포가 산술적으로 증가되게 된다. NA 검정은 NSC가 단리되도록 하고, 한정 조건 하에서 확대하도록 하며, 이에 따라 상이한 실험 조건들 하에서 추정적 줄기 세포의 거동을 연구할 수 있다. NA는 포유동물 NSC의 단리를 위한 표준 검정법이 되었고, 신경계 내 줄기 세포의 세포 생물학 및 분자 생물학을 이해하는데 사용되는 많은 검정법의 핵심을 이룬다.

종양의 성장 및 전파에 기여하는 줄기 세포 특성을 갖는 세포의 소집단으로부터 비롯되는 종양의 개념은 암 생물학 분야에 생소하지 않다. 그 사상은 1970년대 초반에 제안되어, 저-빈도 종양 개시 세포가 정상 조혈모세포(HSC)와 흡사한 것으로 입증되는 급성 골수성 백혈병(AML)에 대한 연구에서 실험적으로 확인되었다. 이 연구는, 백혈병 줄기 세포가 HSC의 직접적 자손이며, HSC 특성을 습득한 더욱 분화된 세포의 생산자임을 제시하였다. 혈액계 외에서의 줄기 세포의 발견은, 고형 조직의 암이 줄기상 세포를 또한 함유할 수 있다는 가능성을 제기하였다. 고형 종양 내의 종양 개시 줄기상 세포의 존재 및 단리는 먼저 인간의 유방암 조직에서 입증되었고, 이 접근법은 CNS의 종양에도 적용되었다.

수개 단체들이, 인간 신경교종 조직으로부터 유래된 세포의 배양액 내 신경구 유사 세포를 발생시키는 능력에 대해 보고하였고, 이에 CNS 종양 내의 NSC의 존재를 제시하였다. 흥미롭게도, 형광 활성화 세포 선별(FACS) 단리에 기초하여, "형광색소음성군(side-population)" 세포의 단리는 잘 확립된 C6 신경교종 세포주가 생체내 악성을 보유하는 신경구 형성 세포의 소집단을 가지는 것을 입증하였다. Galli 및 그의 동료(Galli 등, Cancer Research (2004) 64: 7011-7021)는, 배아 및 성체 CNS로부터 유래된 NSC와 근접한 동일 기능적 성질을 나타내는 인간 다형성 교모세포종(GBM)으로부터의 종양 신경 줄기 세포(tNSC)의 단리, 전파 및 일련의 이식을 보고하였다. 이 GBM tNSC는 프로미닌 양성 전구체로서, 이는 시험관내 중요 신경 줄기 세포를 나타내고, 안정한 방식으로 확대될 수 있으며, 일련 이식-배양 사이클 전반에 걸쳐 원래의 종양-개시 특성을 재발한다. 이와 더불어, 이 연구들은 CNS 종양이 종양 개시 및 악성에 대한 원인이 될 수 있는 줄기 세포의 집단을 함유한다는 가설을 강하게 지지한다. tNSC는 CD133의 tNSC에서의 발현으로 인해 FACS를 이용하여 다른 GBM 세포로부터 분류될 수 있다(Singh 등, Nature (2004) 432:396-401).

GBM는 가장 통상적인 성인의 악성 뇌 종양으로서, 평균 생존 기간이 9 내지 12개월이다. 매우 대부분의 환자가 진단받은 지 2년 내에 사망한다. 본질적으로 치료법이 없고, 관리 요법은 통상 수술, 방사선요법 및 화학요법의 병용법에 기초한다. 생존율은 30년 동안 거의 변하지 않았고, 이에 유전자요법, 혈관신생억제, 면역요법 및 소분자 형질도입(transduction) 억제제와 같은 새로운 치료법의 활발한 연구를 촉진하였다.

LIF

백혈병 억제 인자(LIF)는 많은 조직들, 아마도 모든 조직들에서 유도성 생산이 일어날 수 있는 다작용성 당단백질 사이토카인이다. LIF는 또한 경우에 따라 콜린성 분화 인자(CDF)로 칭해진다. LIF는 인터류킨-6, 온코스타틴 M, 카디오트로핀-1 및 신경 영양성 인자를 위한 수용체로도 사용되는 gp130 수용체 사슬 및 저친화성 LIF-특이적 수용체(LIFR)으로 구성되는 이량체성 막 수용체에 결합함으로써 반응 세포에 대해 작용한다. LIF는 해마 및 후각 수용체 뉴런의 정상 발달 및 포배 이식을 위해 필수적이다. LIF는 배아 줄기 세포를 유도하여 다기능성을 보유하도록 하는 핵심적 능력으로 인해 실험 생물학에 있어 광범위하게 사용된다. LIF는 혈소판 형성, 일부 조혈 세포의 증식, 골 형성, 지방세포 지질 수송, 부신피질자극 호르몬 생성, 뉴런 생존 및 형성, 근육 위성 세포 증식, 및 간세포에 의한 급성 상 생성을 위한 자극자로서 작용하는 것을 비롯하여, 매우 다양한 작용들을 가진다(검토를 위해, 문헌 [Metacalf, Stem Cells 2003; 21:5-14] 참조).

BMP

골 형성 단백질(BMP)은 TGF-h 슈퍼패밀리의 한 구성원이다(Hoodless 등, Cell 85:489-500, 1996). 서열에 있어 동종성에 따라 하위분류될 수 있는 20개 초과의 공지 구성원들이 있다(Hoodless 등, 이하 동일, Wozney 등, J Cell Sci, Suppl 13:149-156, 1990). BMP는 배아 발달 동안 결정적인 역할을 한다. 예를 들어, 그것은 낭배형성, 신경형, 세포 괴사 및 조혈에 영향을 준다(검토를 위해, 문헌 [Nohe 등, Cellular Signalling 16, 291-299 (2004)] 참조). BMP 수용체는 이하 BMPR로 칭해진다. 인간으로부터의 BMPR에는 BMPR1a, BMPR1b 및 BMPR2가 포함된다.

본 발명에 따라, LIF 및 BMP가 선조 세포 및 줄기 세포 생존, 자가 재생, 증식 및/또는 분화를 제어하고, 특히 암성 조직 내 증식 세포의 수를 감소시킬 수 있음이 이제 결정되었다.

발명의 개요

한 측면에서, 본 발명은 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 그 방법은 치료 유효량의 백혈병 억제 인자(LIF) 제제 및/또는 하나 이상의 골 형성 단백질(BMP) 제제를, 그러한 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 겪고 있는 것으로 사료되는 대상 또는 조직에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 종양의 성장을 감소시키는 방법으로서, 치료 유효량의 백혈병 억제 인자(LIF) 제제 및/또는 골 형성 단백질(BMP) 제제를 상기 종양에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. BMP-4 제제를 인간 환자에게 투여함으로써, 뇌 종양(예를 들어, 다형성 교모세포종)을 비롯한, 인간 환자 내의 종양의 성장을 감소시키는 방법도 포함된다.

한 추가의 측면에서, 본 발명은 종양 내의 종양 줄기 세포 및/또는 종양 선조 세포의 수를 감소시키는 방법으로서, 종양을 LIF 제제 및/또는 BMP 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포에서 LIF 수용체(LIFR) 매개 신호전달 또는 BMP 수용체(BMPR) 매개 신호전달을 각기 증가시킬 수 있는 LIF 제제 및 BMP 제제를 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포에서 LIF 수용체(LIFR)-매개 신호전달을 증가시킬 수 있는, 이하 "LIFR 신호전달 활성자" 및 "LIF 수용체 신호전달 활성자"로 칭해지는 작용제를 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 종양 내 LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달을 증가시킴으로써 상기 종양의 성장을 감소시키는 방법을 제공한다. LIFR 매개 신호전달은 예를 들어 LIF 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자를 이용하여 활성화될 수 있고; BMPR 매개 신호전달은 예를 들어 BMP 제제 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 이용하여 활성화될 수 있다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 LIFR 신호전달 활성자 및 BMPR 신호전달 활성자를 확인하는 방법을 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 그 방법은 치료 유효량의 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 그러한 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 겪는 것으로 사료되는 대상 또는 조직에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 종양 내 종양 줄기 세포 및/또는 종양 선조 세포의 수를 감소시키는 방법으로서, 종양을 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 종양의 성장을 감소시키는 방법으로서, 치료 유효량의 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 상기 종양에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포가 대칭 분열을 겪는 가능성을 감소시키는 방법으로서, 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포를 LIF 제제, BMP 제제, BMPR 신호전달 활성자 및 LIFR 신호전달 활성자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 일련 계대 배양된 신경 줄기 세포 내 신경 줄기 세포 빈도 및 신경 선조 세포 빈도를 감소시키는 방법으로서, 신경 줄기 세포를 LIF 제제 및/또는 BMP 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 LIF 제제, BMP 제제, BMPR 신호전달 활성자 및 LIFR 신호전달 활성자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

한 추가의 측면에서, 뇌 종양(예를 들어, 다형성 교모세포종)의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 의약의 제조에 있어서의 BMP-4 제제의 용도를 비롯한, 종양의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 BMP 또는 LIF 제제의 용도가 개시된다.

한 추가의 측면에서, 본 발명은 종양 줄기 세포를 포함하는 종양을 치료하는 방법으로서, 종양 줄기 세포를 종양 줄기 세포의 분화를 유도하는 작용제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 적당한 분화 작용제에는 LIF 제제, BMP 제제, BMPR 신호전달 활성자 및 LIFR 신호전달 활성자가 포함된다. 예를 들어, 다형성 교모세포종은 종양 내(또는 종양의 용적축소 수술 후 절제 공동(resection cavity) 내 남아있는) 종양 신경 줄기 세포를, 종양 신경 줄기 세포의 분화를 유도하기에 충분한 양의 BMP-4 제제와 접촉시킴으로써, 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다.

바람직한 실시양태의 상세한 설명

본 발명을 상세히 기술하기 전에, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명은 특정 제형 성분, 제조 방법, 투약법 등에 제한되지 않고 가변할 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특별한 실시양태를 기술하기 위한 목적으로 사용된 것으로, 제한하고자 함이 아님도 이해해야 한다.

본 명세서에 사용되는, 단일 형태의 표현(영문 관사 "a", "an" 및 "the"에 해당)에는 문맥상 달리 명시적으로 지시되지 않는 한, 복수 측면들도 포함됨을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어 "작용제"라는 표현은 단일 작용제와 더불어 2개 이상의 작용제들을 포함하고; "줄기 세포"라는 표현은 단일 줄기 세포와 더불어, 2개 이상의 줄기 세포들을 포함하며, 기타 표현도 그러하다.

본원에 사용되는 "치료 유효량"은 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료 또는 관리하기에 충분한 치료제의 양, 바람직하게는 일차적, 부위적 또는 전이적 암 조직을 파괴, 변형, 조절 또는 제거하기에 충분한 양을 지칭한다. 치료 유효량은 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 개시를 지연 또는 최소화하기에, 예를 들어 암의 전파 또는 종양의 성장을 지연하거나 최소화하기에 충분한 치료제의 양을 지칭할 수 있다. 치료 유효량은 종양 또는 암의 치료 또는 관리에 있어 치료 이익을 제공하는 치료제의 양을 지칭할 수 있다. 또한, 본 발명의 치료제와 관련한 치료 유효량은 과증식 세포 질환 또는 암의 치료 또는 관리에 있어 치료 이익을 제공하는, 단독 또는 다른 치료법과 병용되는 치료제의 양을 의미한다. 그 용어는 전반적 치료를 향상시키거나, 원치 않는 효과를 감소하거나 피하거나, 또 다른 치료제의 치료 효능 또는 그 치료제와의 상승작용을 증진시키는 양을 포괄할 수 있다.

용어 "작용제", "화합물", "활성 작용제", "활성 화합물", "치료제", "약리학적으로 활성인 작용제", "의약", "활성제" 및 "약물"은 원하는 약리학적 및/또는 생리적 효과를 유도하는 물질을 지칭하기 위해 본원에서 혼용된다. 그 용어는 또한 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그, 활성 대사물, 유사체 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 본원에 구체적으로 언급된 활성 작용제들의 약학적으로 허용가능하고 약리학적으로 활성인 성분을 포괄한다. 용어 "작용제", "화합물", "활성 작용제", "약리학적으로 활성인 작용제", "의약", "활성" 및 "약물"이 사용되는 경우, 활성 작용제 자체, 및 그것의 약학적으로 허용가능하거나, 약리학적으로 활성인 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그, 대사물, 유사체 등을 포괄함을 이해해야 한다. 본 발명의 작용제는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질과 같은 임의의 단백질성 분자, 또는 핵산 분자 및 소 내지 대-천연 또는 합성 유래 유기 및 무기 분자와 같은 비단백질성 분자를 포함할 수 있다. 작용제는 일반적으로 혈-뇌 장벽을 횡단할 수 있거나, CNS에 직접 투여하기에 적당할 수 있다.

본원에서 "치료(처치)"라는 표현은 현존 질환 또는 증상의 중도를 감소시킴을 의미할 수 있다. 용어 "치료"는 또한 질환 또는 증상의 개시를 방지하기 위한 "예방적 처치"를 포괄하도록 사용된다. 용어 "처치"는 완전 회복 시까지 대상을 치료함을 반드시 의미하지는 않는다. 마찬가지로, "예방적 처치"는 대상이 궁극적으로 질환 또는 증상에 걸리지 않게 됨을 반드시 의미하지는 않는다.

본원에 사용되는 "줄기 세포"는 (a) 증식, (b) 연장 기간에 걸친 자가 재생, (c) 다수의 후대를 발생시키는 능력, 및 (d) 당해 세포가 수득되도록 하는 출처인 모든 세포 유형의 조직을 발생시키는 능력이 가능한 미분화 세포를 지칭한다.

본원에 사용되는 "종양 줄기 세포"는 종양으로부터 수득되는 줄기 세포이다. 종양 줄기 세포는 (a) 증식, (b) 연장 기간에 걸친 자가 재생, (c) 다수의 후대를 발생시키는 능력, 및 (d) 당해 세포가 수득되도록 하는 출처인 조직의 모든 종양 유형을 발생시키는 능력이 가능하다. 본원에서 "tNSC"로도 칭해지는 "종양 신경 줄기 세포"는 CNS의 종양으로부터 수득된 종양 줄기 세포를 지칭한다.

본원에 사용되는 "선조 세포"는 (a) 증식, (b) 연장 기간에 걸친 자가 재생, (c) 다수의 후대를 발생시키는 능력, 및 (d) 후대의 하나 이상의 유형을 발생시키는 능력이 가능한 미분화 세포를 지칭한다.

본원에 사용되는 "종양 선조 세포"는 종양으로부터 수득된 선조 세포이다. 종양 선조 세포는 (a) 증식, (b) 제한된 자가 재생, (c) 제한된 수의 후대의 발생, 및 (d) 당해 세포가 수득되도록 하는 출처인 종양에서 발견되는 하나 이상의 세포 유형을 발생시키는 능력이 가능하다.

LIF 제제 및 BMP 제제

한 측면에서, 본 발명은 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 그 방법은 치료 유효량의 백혈병 억제 인자(LIF) 제제 및/또는 하나 이상의 골 형성 단백질(BMP) 제제를, 그러한 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 겪는 것으로 사료되는 대상 또는 조직에 투여하는 단계를 포함한다.

바람직하게, 과도한 증식을 특징으로 하는 장애는 양성 종양 또는 악성 종양(암)이다. 예를 들어, 종양은 청 신경종, 선종, 성상세포종, 연소성 모양세포상 성상세포종, 뇌간교종, 척삭종, 맥락막총, 두개인두종, 상의세포종, 신경절교종, 신경절교신경세포종(ganglioglioneurocytoma), 다형성 교모세포종(GBM), 교종, 림프종, 수모세포종, 수막종, 핍지교종, 시신경 교종, 뇌하수체 종양, 송과체 또는 송과체모세포종을 포함하나 이에 제한되지 않는 뇌 종양일 수 있다. 바람직한 실시양태들에서, 뇌 종양은 GBM이다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 종양의 성장을 감소시키는 방법으로서, 치료 유효량의 백혈병 억제 인자(LIF) 제제 및/또는 하나 이상의 골 형성 단백질(BMP) 제제를 상기 종양에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태들에서, GBM의 성장을 감소시키기 위해 치료 유효량의 BMP-4 제제를 인간 환자 내 GBM에 투여한다.

한 추가의 측면에서, 본 발명은 종양 내 종양 줄기 세포 및/또는 종양 선조 세포의 수를 감소시키는 방법으로서, 종양을 LIF 제제 및/또는 BMP 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이론 또는 가설에 의해 제한되고자 함은 아니나, LIF 제제 및 BMP 제제는 종양에 투여될 때, LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달의 증가를 초래하고, 이는 다시 세포 생존, 자가 재생, 대칭 분열, 증식 및/또는 분화 성질을 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 성질 중 임의의 하나 이상의 조절을 초래하는 것으로 판단된다. 특히, 이론 또는 가설에 의해 제한되고자 함은 아니나, LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달의 증가는 줄기 세포 및 선조 세포의 증식 성질의 감소, 특히 증식하는 줄기 세포 또는 선조 세포에 의해 나타나는 대칭 분열의 확률의 감소, 및 이에 따른 그 세포 수의 감소를 초래하는 것으로 판단된다. 따라서, 다른 한 측면에서, 본 발명은 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포가 대칭 분열을 겪는 가능성을 감소시키는 방법으로서, 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포를 LIF 제제 및/또는 BMP 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 종양 내 LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달을 증가시킴으로써 상기 종양을 감소시키는 방법을 제공한다. LIFR 매개 신호전달은 예를 들어 LIF 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자를 이용하여 활성화될 수 있고(하기 참조); BMPR 매개 신호전달은 예를 들어 BMP 제제 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 이용하여 활성화될 수 있다(하기 참조).

통상적 치료를 이용한 종양발생 세포의 근절을 목적으로 하는 현 치료는, 급속히 사이클링하는 세포를 제거하도록 설계된다. 예를 들어, 종래 화학요법 작용제는 분열 세포에 대해 가장 효과적이다. tNSC는 그것의 변형되지 않은 상대(counterpart)와 마찬가지로 빈번하지 않게 사이클링하며, 이로써 치료의 독성 효과에서 벗어나고 치료 후에 용이하게 종양 확대를 재개할 수 있다. 성체 줄기 세포의 고유한 긴 수명, 및 약물 내성 및 항-세포 괴사 유전자를 발현하는 그것의 고유 능력은 그것의 악성 상대에서 발견될 수 있고, 이는 종양 줄기 세포를 근절하기 위한 효과적 치료 전략을 개발하는데 곤란성을 야기한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 tNSC 세포를 표적화함으로써 이 곤란성을 극복한다. 이론 또는 가설에 의해 제한되고자 함은 아니나, 본원에 기재된 방법 및 조성물은, (실시예에 나와 있는 바와 같이, 신경 분화 마커, 특히 성상교세포 항원의 상향 제어에 의해 입증되는 바와 같이) tNSC에 대해 분화전 영향을 미치고, 이에 따라 세포 생육성에 영향을 미치거나 세포 괴사를 유도하지 않으면서 줄기 세포 풀을 영구적으로 감소시키는 것으로 판단된다. 결과적으로(하기 실시예에 나와 있는 바와 같이), 본 발명의 조성물(특히 GBM 처리를 위한 BMP-4 조성물)에 일시적으로 노출한다해도, tNSC의 종양발생 가능성을 비가역적으로 억제한다.

종양 세포를 사멸시키는 것이 아니라, 그 분화를 유도하는 것이 암 치료를 위한 전적으로 새로운 접근법이다. 따라서, 다른 한 측면에서, 본 발명은 종양 줄기 세포를 포함하는 종양을 치료하는 방법으로서, 종양 줄기 세포를 그 분화를 유도하는 작용제(예컨대, BMP 제제)와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 그러한 한 실시양태에서, 다형성 교모세포종과 같은 뇌 종양 내의 종양 신경 줄기 세포는 BMP-4와 접촉하여, 그 분화가 유도된다.

용어 "LIF 제제" 및 "BMP 제제"는, 번역후 변형을 가하거나 가하지 않은, 천연적으로, 바람직하게는 인간에게 있어, 생산되는 LIF 폴리펩티드 또는 BMP 폴리펩티드를 포함한다. 이는, 인간 LIF의 경우, 진뱅크(GenBank) 승인 번호 NM_002309를 갖는 mRNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 포함한다. 인간 BMP의 경우, 이는 BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, GDF10(BMP-3b), GDF11(BMP11), GDF2(BMP9), BMP1O, BMP15와 같은 인간 유전자에 의해 코딩되는 BMP 폴리펩티드, 및 진뱅크 승인 번호: NM_001719(BMP7); NM_001201(BMP3); NM_001200(BMP2); NM_005448(BMP15); NM_001720(BMP8B); NM_014482(BMP1O); NM_006132(BMP1-4); NM_006131(BMP1-5); NM_006130(BMP1-6); NM_006129(BMP1-3): NM_006128(BMP1-2): NM_001718(BMP6); NM_001199(BMP1-I); NM_130851(BMP4-3); NM_130850(BMP4-2); NM_001202(BMP4-1); NM_181809(BMP8A); NM_021073(BMP5)를 갖는 mRNA에 의해 코딩되는 BMP 폴리펩티드를 포함한다. BMP-4 폴리펩티드는 또한 경우에 따라 BMP-2B로도 칭해짐을 주목한다.

본 발명의 방법 및 조성물에 사용하기 위한 바람직한 BMP에는 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 및 BMP-8b가 포함된다. 특히, BMP-4에 대한 노출은 이하 실시예에서, 전반적 생육성 및 세포 괴사에 영향을 미치지 않으면서, 인간 GBM로부터 단리된 세포를 성숙시키는 것으로 나타난다. 이는 뉴런 및 신경교 마커의 상향 제어를 초래하고, 또한 증식 능력의 주된 감소를 초래한다. BMP-4 노출은 심지어 일시적이더라도 하기 실시예에서, GBM 배양액 내 GBM tNSC 집단(CD133+ GBM 세포)의 크기를 상당히 감소시키고, 이에 GBM 세포의 콜로니 형성 지수를 상당히 감소시키고, GBM tNSC의 확대의 역학성질을 급격히 감소시키는 것으로 나타난다. 이 효과는 비가역적이고, 인간 GBM 세포의 생체내 종양-개시 능력을 소멸시킨다.

본원에 사용되는, 용어 "LIF 제제" 또는 "BMP 제제"는 또한 본 발명의 검정 및 처리 방법에 있어 과도한 세포 증식을 경감시키는 능력을 적어도 부분적으로 보유하는 LIF 또는 BMP 폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드의 단편을 포함하며, 이에 대해 본 발명의 검정 또는 처리 방법에 있어 전장(full-length) LIF 또는 전장 BMP의 활성의 1 내지 100%를 보유한다. 그러한 단편은 본 발명의 검정 또는 처리 방법에 있어 전장 LIF 또는 전장 BMP에 대해 증가된 활성을 가질 수 있다. 그러한 단편은, 전장 단백질 대비, 아미노 또는 카르복시 말단, 또는 양자 모두로부터의 연속적인 일련의 결실된 잔기들을 가질 수 있다. 단편은 구조적 또는 기능적 도메인을 그 특징으로 할 수 있고, 이에는 예컨대 알파-나선 및 알파-나선 형성 부위, 베타-시이트 및 베타-시이트 형성 부위, 턴 및 턴 형성 부위, 코일 및 코일 형성 부위, 친수성 부위, 소수성 부위, 알파 양친성 부위, 베타 양친성 부위, 가용성 부위, 표면 형성 부위 및 기질 결합 부위를 포함하는 단편이 있다. 단편은 펩티드 합성 기법에 의해, 또는 전장 LIF 또는 BMP 폴리펩티드의 절단에 의해 생성될 수 있다. 단편은 그것의 N 말단, C 말단, 또는 N 말단과 C 말단 모두에서 다른 폴리펩티드 서열에 연결되어, 융합 단백질을 형성할 수 있다.

본원에 사용되는 용어 "LIF 제제" 또는 "BMP 제제"는 상기 개시된 바와 같은, LIF 또는 BMP 폴리펩티드, 또는 이의 단편의 아미노산 서열과 부분적으로 상동적이고, 본 발명의 검정 및 처리 방법에 있어 과도한 세포 증식을 경감시키는 능력을 적어도 부분적으로 보유하는 폴리펩티드 또는 글리코폴리펩티드를 포함한다. 상동체는 LIF 또는 BMP, 또는 이의 단편과 50%, 70%, 80%, 80.6%, 83%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9% 동일할 수 있다.

용어 "LIF 제제" 또는 "BMP 제제"는 또한 LIF 또는 BMP 전장 폴리펩티드의 변이체, 및 LIF 또는 BMP 단편의 변이체를 포함한다. 그러한 변이체는 본 발명의 검정 및 처리 방법에 있어 과도한 세포 증식을 경감시키는 능력을 적어도 부분적으로 보유한다. 변이체는 활성에 영향을 거의 미치지 않도록 당업계에 공지된 일반 규칙에 따라 선택되는, 결실, 삽입, 역위, 반복 및 치환을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표현형에 있어 침묵인 아미노산 치환을 수행하는 방법에 관한 지침이, 문헌 [Bowie 등, Science 247: 1306-1310 (1990)](전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 제공되어 있다. 예를 들어, 변이체는 부위 지정 돌연변이 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이(분자 내 모든 잔기에 단일 알라닌 변이를 도입함)에 의해 수득될 수 있다(Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989)). 변이체는 또한 예를 들어, 단백질 또는 펩티드 서열에서 (펩티드 결합을 치환하는) 하나 이상의 비-펩티드 결합을 가지는 아미노산 치환을 가질 수도 있다. 변이체는 또한 천연 발생 L-아미노산, 예를 들어 D-아미노산 또는 비-천연 발생 또는 합성 아미노산, 예를 들어 B 또는 y 아미노산 이외의 아미노산 잔기를 포함하는 치환기를 가질 수 있다. 변이체는 또한 폴리펩티드에 대해 입체배좌 제약을 부가하는 가교성 기를 포함할 수 있다. 변이체는 또한 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 포함할 수 있다. 변이체는 또한 (i) 비-보존 아미노산 잔기들 중 하나 이상으로의 치환(여기에서, 치환된 아미노산 잔기는 유전적 코드에 의해 코딩된 것일 수도 있고 아닐 수 있음), 또는 (ii) 치환기를 갖는 아미노산 잔기들 중 하나 이상으로의 치환, 또는 (iii) 성숙 폴리펩티드의 또 다른 화합물, 예컨대 LIF 또는 BMP 제제의 안정성 및/또는 가용성을 증가시키는 화합물(예를 들어, 프로필렌 글리콜), 또는 LIF 또는 BMP 제제를 특성 세포 유형(예컨대, 종양 신경 줄기 세포)에 표적화하는 화합물, 또는 LIF 또는 BMP 제제가 혈-뇌 장벽(BBB) 및/또는 혈-종양 장벽(BTB)을 횡단하도록 하는 화합물과의 융합, 또는 (iv) 폴리펩티드의 부가적 아미노산 또는 부가적 펩티드 또는 부가적 폴리펩티드와의 융합, 또는 (v) 세포 독성제, 예를 들어 독소 또는 방사성활성 화합물로의 융합, 또는 (vi) 영상화 목적을 위해 사용될 수 있는 마커, 예를 들어 방사성표지로의 융합.

본 발명의 LIF 제제 및 BMP 제제는 천연 발생 폴리펩티드의 단리, 재조합 기법, 폴리펩티드 합성 기법, 또는 이들의 조합법을 비롯한, 임의의 적당한 방식으로 제조될 수 있다. 그러한 폴리펩티드의 제조 방법은 당업계에 잘 이해된다. LIF 또는 BMP 제제는 보다 큰 단백질, 예컨대 융합 단백질의 형태일 수 있다. 분비 또는 리더 서열, 전구(pro)-서열, 정제를 보조하는 서열, 예컨대 다중 히스티딘 잔기, 또는 재조합 생산 중 안정성을 위한 부가적 서열을 가지는 부가적 아미노산 서열을 포함하는 것이 종종 유리하다.

본 발명의 LIF 제제 및 BMP 제제는 바람직하게 단리된 형태로 제공되고, 바람직하게는 실질적으로 정제된다. 재조합에 의해 생성된 형태의 LIF 또는 BMP 제제는 본원에 기재되거나 당업계에 달리 공지된 기법을 이용하여, 예를 들어 문헌 [Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (1988)]에 기재된 1-단계 방법에 의해 실질적으로 정제될 수 있다. 본 발명의 LIF 또는 BMP 제제는 또한 예를 들어, 전장 LIF 또는 BMP에 대해 제기된 본 발명의 항체와 같은, 당업계에 공지된 프로토콜을 이용하여, 천연, 합성 또는 재조합 출처로부터 정제될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태들에서, LIF 제제 및/또는 BMP 제제를 직접 대상에 투여하여, 내인성 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포가 생체내 제어되도록 할 수 있다. 예를 들어, BMP-4 제제는 인간 환자에서 뇌 종양, 예컨대 GBM에 투여될 수 있다. 본 발명의 대안적 실시양태들에서, 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포는 본 발명의 작용제와 시험관내 접촉될 수 있다. 예를 들어, 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포를 포함하는 단리된 종양은 본 발명의 작용제와 시험관내 접촉될 수 있다.

LIF 및/또는 BMP 제제를, LIF 및/또는 BMP 제제를 포함하는 약학적 조성물과 함께, 대상 내의 종양을 비롯한, 대상에게 투여하는 방법이 이하 제목 "투여 및 약학적 조성물"의 단락에 제공된다.

LIF 수용체 신호전달 활성자 및 BMP 수용체 신호전달 활성자

다른 한 측면의 실시양태에서, 본 발명은 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 LIF 수용체(LIFR)-매개 신호전달을 증가시킬 수 있는 이하 "LIFR 신호전달 활성자" 및 "LIF 수용체 신호전달 활성자"로 칭해지는 작용제를 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 LIFR 신호전달 활성자를 확인하는 방법, 및 그러한 LIFR 신호전달 활성자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 LIFR 신호전달 활성자는, 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 LIFR를 직접적으로 활성화하거나(예를 들어, 작용자), 간접적으로, 예컨대 (예를 들어, LIF 자체 발현을 증가시키거나, LIFR-매개 신호전달의 다운스트림 성분, 예컨대 JAK 또는 STAT의 활성 또는 발현을 증가시킴으로써) 2차 분자 또는 화합물의 발현 또는 활성을 증가시키고, 이에 따라 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 LIFR-매개 신호전달을 증가시킴으로써, 줄기 세포 또는 선조 세포 내 LIFR-매개 신호전달을 증가시킬 수 있다.

한 부가적 측면에서, 본 발명은 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 BMP 수용체(BMPR)-매개 신호전달을 증가시킬 수 있는 "BMPR 신호전달 활성자" 및 "BMP 수용체 신호전달 활성자"로 이하 칭해지는 작용제를 제공한다. 본 발명은 또한 그러한 BMPR 신호전달 활성자를 확인하는 방법, 및 그러한 BMPR 신호전달 활성자를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 BMPR 신호전달 활성자는, 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 BMPR를 직접적으로 활성화하거나(예를 들어, 작용자), 간접적으로, 예컨대 (예를 들어, BMPR 자체 발현을 증가시키거나, BMPR-매개 신호전달의 다운스트림 성분의 활성 또는 발현을 증가시킴으로써) 2차 분자 또는 화합물의 발현 또는 활성을 증가시키고, 이에 따라 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 BMPR-매개 신호전달이 증가되도록 함으로써, 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 BMPR-매개 신호전달을 증가시킬 수 있다.

"LIFR"이라는 표현에는 LIFR 상동체, 파라로그(paralog), 오르토로그(ortholog), 유도체, 단편 및 기능적 균등체와 같은 모든 형태들의 LIFR이라는 표현들이 포함된다. 본원에서 "BMPR"라는 표현에는 BMPR 상동체, 파라로그, 오르토로그, 유도체, 단편 및 기능적 균등체와 같은 모든 형태의 BMPR이라는 표현들이 포함된다.

본 발명의 영역에서, LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달의 증가는 LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달의 정상 수준의 1 내지 약 1000%의 증가를 지칭한다. 대안적으로, LIFR 또는 BMPR 신호전달 활성자는, 신호전달이 정상 미만인 경우들에서, LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달의 수준을 정상으로 되돌릴 수 있다.

바람직하게, LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달의 증가는, 생존, 자가 재생, 증식, 대칭 분열 및/또는 분화 성질을 포함하나 이에 한정되지 않는 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 성질들 중 임의의 하나 이상의 조절을 초래한다. 가장 바람직하게는, LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달의 증가는 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포의 분열 성질을 변경하고, 특히 대칭 분열 확률, 또는 증식하는 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포에 의해 나타나는 세포 사이클 빈도를 감소시키며, 이로써 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포의 수가 감소하게 된다.

본 발명의 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질과 같은 임의의 단백질성 분자일 수 있거나, 비-단백질성 분자일 수 있다. LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자를 단리하는 방법이 본원에 제공된다.

본 발명과 관련하여, 모방체는 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자의 특히 유용한 군이다. 그 용어는 예를 들어 LIF와 같은 모방하는 분자와 일부 화학적 유사성을 가지나, 예를 들어 LIFR과 같은 표적과의 상호작용을 작용화하는(모방하는) 물질을 지칭하기 위한 것이다. 펩티드 모방체는 모방체의 한 부류이고, 단백질 2차 구조의 요소를 모방하는 펩티드-함유 분자일 수 있다(Johnson 등, Peptide Turn Mimmics in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto 등, Eds., Chapman and Hall, New York, 1993). 펩티드 모방체의 사용 배후의 기저 원리는, 단백질의 펩티드 골격이 주로 항체 및 항원, 효소 및 기질 또는 구조 단백질의 것과 같은 분자 상호작용을 용이하게 하기 위한 방식으로 아미노산 측쇄를 배향하기 위해 존재한다는 것이다. 그러므로, 펩티드 모방체는 천연 분자와 유사한 분자 상호작용을 허용하도록 설계된다.

약학적으로 활성 화합물로의 모방체의 설계는 "리드(lead)" 화합물에 기초한 약제의 개발을 위한 한 공지된 접근법이다. 이는, 활성 화합물이 합성하기 곤란하거나 고가인 경우, 또는 특별한 투여 방법에 적당하지 않은 경우, 예를 들어 펩티드가 소화관 내 프로테아제에 의해 급속히 분해되는 경향이 있어 경구 조성물용으로는 부적당한 활성 작용제인 경우에 바람직할 수 있다. 모방체 설계, 합성 및 시험은 일반적으로 표적 성질을 위한 다수의 분자를 무작위 스크리닝하는 것을 막기 위해 사용된다. 예를 들어, 펩티드 모방체를 포함한 BMP-4의 모방체가 구체적으로 본원에서 구상된다.

합리적 약물 설계의 목적은, 생물학적으로 활성인 관심 폴리펩티드의 구조적 유사체, 또는 예를 들어 더욱 활성이거나 안정한 형태의 폴리펩티드이거나, 예를 들어 생체내 폴리펩티드의 기능을 증진시키거나 간섭하는 약물을 맞추기 위해 상호작용하는 소분자의 구조적 유사체를 생산하는 것이다(예를 들어, 문헌 [Hodgson, Bio/Technology 9:19-21, 1991] 참조). 한 접근법에서, 먼저 x-선 결정학에 의해, 컴퓨터 모델링에 의해, 또는 가장 전형적으로는 접근법들의 조합에 의해, 관심 단백질의 3차원 구조를 결정한다. 폴리펩티드의 구조에 관한 유용한 정보가 또한 상동적인 단백질의 구조에 기초한 모델링에 의해 얻어질 수 있다. 합리적 약물 설계의 한 예는 HIV 프로테아제 억제제의 개발이다(Erickson 등, Science 249:527-533, 1990).

LIFR 또는 BMPR와 상호작용하고/하거나, 줄기 세포 또는 선조 세포 내 LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달을 (직접적으로 또는 간접적으로) 증가시키는 본 발명의 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자의 능력은, 그것이 단백질성 또는 비-단백질성인지를 불문하고, 당업계의 숙련가에게 공지된 수많은 스크리닝 방법들을 통해 평가될 수 있다. 이는 천연적으로 생성된 라이브러리, 화학적으로 생성된 라이브러리, 또한 조합 라이브러리, 파지 발현 라이브러리 및 시험관내 번역 기재 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함할 수 있다.

LIFR 및 BMPR에 대해 제기된 항체는 LIF 및 BMP의 활성 배치를 각기 모방하는 작용자로서 특히 유용할 수 있다. 적당한 항체에는 다클론성, 단클론성, 단가, 이중특이적, 이형접합, 다중특이적, 인간화 또는 키메라 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 항체, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 및 상기 것들 중 임의의 것의 에피토프-결합 단편이 포함된다. 본원에 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자, 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉 항원에 면역특이적으로 결합하는 결합 부위를 가지는 분자를 지칭한다. 면역글로불린 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(class)(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류(subclass)의 것일 수 있다. 또한, 용어 "항체"(Ab) 또는 "단클론성 항체"(Mab)는 비변형(intact) 분자, 및 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 단편(예컨대, 예를 들어 Fab 및 F(ab')2 단편)을 포함하는 의미이다. Fab 및 F(ab')2 단편은 비변형 항체의 Fc 단편이 결여되어 있고, 동물 또는 식물의 순환을부터 더욱 급속히 소거되며, 비변형 항체보다 덜 비특이적인 조직 결합을 가질 수 있다(Wahl 등, J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). 항체 작용자의 생산 방법이 예를 들어, PCT 공보 WO 96/40281; 미국 특허 제5,811,097호; Deng 등, Blood 92 (6): 1981-1988 (1998); Chen 등, Cancer Res. 58 (16): 3668-3678 (1998); Harrop 등, J. Immunol. 161 (4): 1786-1794 (1998); Zhu 등, Cancer Res. 58 (15): 3209-3214 (1998); Yoon 등, J. Immunol. 160 (7): 3170-3179 (1998); Prat 등, J. Cell. Sci. 111(Pt2): 237-247 (1998); Pitard 등, J. Immunol. Methods 205 (2): 177-190 (1997); Liautard 등, Cytokine 9 (4): 233-241 (1997); Carlson 등, J. Biol. Chem. 272 (17): 11295-11301 (1997); Taryman 등, Neuron 14 (4): 755-762 (1995); Muller 등, Structure 6 (9): 1153-1167 (1998); Bartunek 등, Cytokine 8 (1): 14-20 (1996); Harlow 등, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 제2판, 1988); Hammerling, 등, in: Monoclonoal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681(Elsevier, N. Y., 1981) (이는 모두 전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 기재되어 있다.

("압타머(aptamer)"라고도 알려져 있는) 핵산 리간드도 또한 LIF 및 BMP의 활성 배치를 각기 모방하는 작용자로서 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 압타머는 SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) 방법(Tuerk and Gold, 1990, Science 249: 505-510)(이는 전체적으로 본원에 참조 인용됨)을 이용하여 선택될 수 있다. SELEX 방법에서, 핵산 분자의 큰 라이브러리(예를 들어, 10¹⁵ 개 상이한 분자들)가 표적 분자, 이 경우에는 BMPR, LIFR 또는 이의 부분으로 생성되고/되거나 스크리닝된다. 표적 분자는 소정의 시간 동안 뉴클레오티드 서열의 라이브러리와 함께 인큐베이션되게 된다. 이어서, 혼합물 내 비결합 분자로부터 압타머 표적 분자를 물리적으로 단리하기 위해 수가지 방법이 사용될 수 있고, 비결합 분자는 제거될 수 있다. 이어서, 표적 분자에 대한 최대 친화성을 갖는 압타머를 표적 분자로부터 정제 분리하여, 효소적으로 증폭시켜, 표적 분자에 결합할 수 있는 압타머에 대해 실질적으로 풍부한 분자들의 새 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 이어서, 풍부한 라이브러리를 사용하여, 선택, 분획화 및 증폭의 새 사이클을 개시할 수 있다. 이 선택, 분획화 및 증폭 공정의 5 내지 15 사이클 후에, 라이브러리를 표적 분자에 단단히 결합하는 적은 수의 압타머로 감축시킨다. 이어서, 혼합물 내의 개별 분자를 단리하여, 그것의 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 결합 친화성 및 특이성에 대한 그것의 성질을 측정하고 비교할 수 있다. 이어서, 단리된 압타머를 추가 정련하여, 표적 결합 및/또는 압타머 구조(즉, 코어 결합 도메인으로 절단된 압타머)에 기여하지 않는 임의의 뉴클레오티드를 제거할 수 있다. 예를 들어, 압타머 기술에 대한 검토를 위해, 문헌 [Jayasena, 1999, CHn. Chem. 45: 1628-1650(이의 전반적 교시내용은 참조로 본원에 인용됨)]를 참조한다.

본질적으로 임의의 화학적 화합물이 후보 LIFR 또는 BMPR 신호전달 활성자로서 이용될 수 있다. 그러한 후보 활성자의 검출을 위해 특히 고 산출량 스크리닝 방법이 구상된다. 그러한 고 산출량 스크리닝 방법은 전형적으로 수많은 가능한 치료 화합물(예를 들어, 리간드 또는 조절자(modulator) 화합물)을 함유하는 조합 화학 또는 펩티드 라이브러리를 제공하는 단계를 포함한다. 이어서, 그러한 조합 화학 라이브러리 또는 리간드 라이브러리를 하나 이상의 검정에서 스크리닝하여, 원하는 특징적 활성을 나타내는 라이브러리 구성원(예를 들어, 특별한 화학종 또는 하위부류)를 확인한다. 이에 따라 확인된 화합물은 통상적 리드 화합물로 작용하거나, 그 자체가 잠재적 또는 실제적 치료제로서 사용될 수 있다.

조합 화학 라이브러리는, 수많은 화학적 구성단위(building block)(즉, 아미노산과 같은 시약)를 조합함으로써 화학적 합성 또는 생물학적 합성에 의해 발생되는 다양한 화학적 화합물의 집합체이다. 한 예로서, 선형의 조합 라이브러리, 예를 들어 폴리펩티드 또는 펩티드 라이브러리가, 소정의 화합물 길이(즉, 폴리펩티드 또는 펩티드 화합물 내 아미노산의 수)를 위해, 한 세트의 화학적 구성단위들을 모든 가능한 방식으로 조합함으로써 형성된다. 화학적 구성단위의 그와 같은 조합적 혼합을 통해 수백만개의 화학적 화합물을 합성할 수 있다.

조합 화학 라이브러리의 제조 및 스크리닝이 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 조합 라이브러리에는 펩티드 라이브러리(예를 들어, 미국 특허 제5,010,175호; Furka, 1991, Int. J. Pept. Prot. Res., 37: 487-493; 및 Houghton 등, 1991, Nature, 354: 84-88)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 화학적 다양성 라이브러리를 발생시키기 위한 다른 화학기작들도 사용할 수 있다. 화학적 다양성 라이브러리 화학기작의 비제한적 예에는 펩티드(PCT 공보 제WO 91/019735호), 코딩된 펩티드(PCT 공보 제WO 93/20242호), 무작위 바이오-올리고머(PCT 공보 제WO 92/00091호), 벤조디아제핀(미국 특허 제5,288,514호), 다이버소머, 예컨대 히단토인, 벤조디아제핀 및 디펩티드(Hobbs 등, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6909-6913), 비닐성 폴리펩티드(Hagihara 등, 1992, J. Amer. Chem. Soc, 114: 6568), 글루코스 스카폴딩(glucose scaffolding)을 갖는 비펩티드성 펩티도모방체(Hirschmann 등, 1992, J. Amer. Chem. Soc, 114: 9217- 9218), 소 화합물 라이브러리의 유사 유기 합성(Chen 등, 1994, J. Amer. Chem. Soc, 116: 2661), 올리고카르바메이트(Cho 등, 1993, Science, 261: 1303), 및/또는 펩티딜 포스포네이트(Campbell 등, 1994, J. Org. Chem., 59: 658), 핵산 라이브러리(문헌 [Ausubel, Berger and Sambrook(이하 모두 동일) 참조), 펩티드 핵산 라이브러리(미국 특허 제5,539,083호), 항체 라이브러리(예를 들어, Vaughn 등, 1996, Nature Biotechnology, 14 (3): 309-314) 및 PCT/US96/10287), 탄수화물 라이브러리(예를 들어, Liang 등, 1996, Science, 274-1520-1522) 및 미국 특허 제5,593,853호), 작은 유기 분자 라이브러리(예를 들어, 벤조디아제핀, Baum C&EN, Jan. 18, 1993, p. 33; 및 미국 특허 제5,288,514호; 이소프레노이드, 미국 특허 제5,569,588호; 티아졸리디논 및 메타티아자논, 미국 특허 제5,549,974호; 피롤리딘, 미국 특허 제5,525,735호 및 제5,519,134호; 모르폴리노 화합물, 미국 특허 제5,506,337호; 등)가 포함된다.

조합 라이브러리를 제조하기 위한 장치가 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, 357 MPS, 390 MPS, 어드밴스트 켐 테크(Advanced Chem Tech)(미국 켄터키주 루이스빌 소재); 심포니(Symphony), 레이닌(Rainin)(미국 매사츄세츠주 우브라 소재); 433A, 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재); 9050 플러스(9050 Plus), 밀리포어(Millipore)(미국 매사츄세츠주 벤드포드 소재). 또한, 수많은 조합 라이브러리가 상업적으로 입수가능하다(예를 들어, 컴제넥스(ComGenex)(미국 뉴저지주 프린스턴 소재); 아시넥스(Asinex)(러시아 모스코바 소재); 트리포스 인코포레이티드(Tripos, Inc.)(미국 미주리주 세인트 루이스 소재); 켐스타 리미티드(ChemStar, Ltd.)(러시아 모스코바 소재); 3D 파마슈디칼즈(3D Pharmaceuticals)(미국 펜실베니아주 엑스톤 소재); 마르텍 바이오사이언시스(Martek Biosciences)(미국 매릴랜드주 콜롬비아 소재) 등).

후보 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자를 먼저 결합 검정을 이용하여 LIFR 또는 BMPR에 대한 결합능, 또는 LIFR 또는 BMPR 신호전달 경로의 다운스트림 성분에 대한 결합능에 대해 스크리닝할 수 있고, 이에 결합하는 그 후보물질을 기능적 검정에서 스크리닝할 수 있다. 적당한 결합 검정에는 미국 특허 제6,020,141호 및 제6,036,920호(Pantoliano 등)에 기재된 바와 같은 형광 기재 열 이동 검정(3-디멘셔널 파마슈티칼즈 인코포레이티드(3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc.), 3DP(미국 펜실베니아주 엑스톤 소재))이 포함되고; 이에 대해 또한 문헌 [J. Zimmerman, 2000, Gen. Eng. News, 20 (8))]을 참조한다.

후보 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자를 기능적으로 스크리닝하는 방법의 한 예는 하기 단계들을 포함한다:

(i) 종양 줄기 세포 및/또는 종양 선조 세포의 샘플을 단리하는 단계;

(ii) 분취량의 종양 줄기 세포 및/또는 종양 선조 세포를 적당한 용기에 두는 단계;

(iii) 분취량의 종양 줄기 세포 및/또는 종양 선조 세포를 특별한 시간 동안 특별한 조건 하에서 후보 작용제에 노출하는 단계; 및

(iv) 종양 줄기 세포 및/또는 종양 선조 세포에 대한 형태적, 생리적 및 유전적 변화를 스크리닝하는 단계.

형태적, 생리적 및 유전적 변화는 생존, 자가 재생, 증식 및/또는 분화의 상태를 스크리닝하는 것을 포함한다. 이용될 수 있는 검정의 한 예는 미국 특허 출원 공보 제2005/0112546호(전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 기재된 신경 콜로니 형성 세포 검정(NCFCA)이다. NCFCA는 증식 가능성을 가지고, 부유 배양액 내 구(sphere)를 형성할 수 있거나(신경구 검정) NCFCA 내 콜로니를 형성할 수 있는 줄기 세포 및 선조 세포를 상호 간에 구분할 수 있다. 간략히, 종양으로부터 수득된 일차적 세포 또는 배양된 세포를 미토겐(mitogen) FGF2 및 EGF를 함유하는 무혈청 3-D 콜라겐 매트릭스에 플레이팅한다. 이 배양 조건 하에서, 증식 가능성을 갖는 줄기 세포 및 선조 세포만을 구분하여 1 내지 4주 후에 측정될 수 있는 크기를 갖는 잘 정의된 콜로니를 형성한다. 콜로니 크기의 차이는 기저(founding) 세포의 증식 가능성과 양의 상관 관계를 가지고, 줄기 및 선조 세포 빈도의 판독(readout)을 제공한다. 이 조건 하에서, 직경이 2 mm 초과인 콜로니만이 줄기 세포에서 유래되고, 반면 직경이 2 mm 미만인 콜로니만이 선조 세포에서 유래된다. 줄기 세포 및 선조 세포의 의미있고 정확한 판독을 통해, 이 두 세포 유형의 빈도를 변경하는 유전적 및 후생유전적 요소를 스크리닝할 수 있다.

LIFR 및 BMPR 수용체를 스크리닝하는데 사용될 수 있는 생존, 자가 재생, 증식 및/또는 분화에 대한 검정의 또 다른 예를 하기와 같이 수행한다. 먼저, 해리된 다형성 교모세포종 종양으로부터의 세포를, 문헌 [Gritti 등, J. Neurosci. (1996) 16(3):109-1100](본원에 참조로 인용됨)에 기재된 바와 같이, 미토겐 FGF2(섬유아세포 성장 인자 2) 및 EGF(표피 성장 인자) 함유의 무혈청 배지에 플레이팅한다. 이 배양 시스템은 일차적 종양 배양액으로부터 분화/피분화 세포를 선별 분류하여, 종양 줄기 세포만을, 자유롭게 지수적으로 증식 및 확대하도록 함으로써, 일차적 신경구를 형성한다. 일차적 신경구를 해리하여, 마이크로티터 플레이트 내 EGF 및 FGF2의 존재 하에 클론 밀도로 무혈청 배지에 다시 플레이팅할 수 있다. 후보 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자를 마이크로티터 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 비처리 세포가 증식하도록 하기에 충분한 일정 시간 동안 인큐베이션한다. 인큐베이션 종료 시, 신경구를 다시 해리하고, 공정을 후보 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자의 존재 하에 소정의 부가적 계대 수만큼 반복할 수 있다. 소정의 계대수의 종료 시에, 마이크로티터 플레이트의 웰을 신경구의 존재에 대해 현미경을 이용하여 조사할 수 있고, 신경구의 수 및 크기를 결정하여, 줄기 세포 및 선조 세포에 대한 후보 LIFR 또는 BMPR 신호전달 활성자의 영향의 척도를 제공한다. 실시예 1의 수학적 알고리즘을 이용하여, 각 계대 배양의 종료 시의 줄기 세포 및 선조 세포의 수를 결정할 수 있다. 또한 일련 계대 배양된 비처리 세포와의 비교를 통해, 후보 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자 예를 들어 줄기 세포 및 선조 세포의 증식 성질을 경감시키는 작용제를 확인할 수 있다. 이어서, 후보 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자를 피분화 또는 분화 세포에 대해 검정하여, 후보 작용제가 일반적으로 세포독성인 것이 아니라, 종양 줄기 세포에 대해 특이적인지의 여부를 결정할 수 있다

LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자는 또한 RNA 간섭(RNAi) 분자, 리보자임 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러한 분자는 LIFR 및 BMPR 신호전달의 억제제의 발현을 감소시켜, LIFR 및 BMPR 신호전달의 활성화 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 LIFR 및 BMPR 신호전달 활성자는 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달을 증가시키는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달을 증가시키는 방법으로서, 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 내 LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달을 증가시키기에 충분한 시간 및 조건 하에, 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포를 LIFR 및/또는 BMPR 신호전달 활성자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. LIFR 및/또는 BMPR 신호전달 활성자는 또한 본원에 개시된 바와 같은 LIF 제제 및/또는 BMP 제제와 병용될 수 있다.

본 발명은 또한 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 그 방법은 치료 유효량의 LIFR 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 그러한 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 겪는 것으로 사료되는 대상 또는 조직에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 과도한 세포 증식을 특징으로 하는 장애는 뇌 장애, 더욱 바람직하게는 청 신경종, 선종, 성상세포종, 연소성 모양세포상 성상세포종, 뇌간교종, 척삭종, 맥락막총, 두개인두종, 상의세포종, 신경절교종, 신경절교신경세포종, 다형성 교모세포종(GBM), 교종, 림프종, 수모세포종, 수막종, 핍지교종, 시신경 교종, 뇌하수체 종양, 송과체 또는 송과체모세포종을 포함하나 이에 제한되지 않는 뇌 종양이다. LIFR 및/또는 BMPR 신호전달 활성자는 또한 본원에 개시된 바와 같은 LIF 제제 및/또는 BMP 제제와 (동시에 또는 상이한 시간에) 병용 투여될 수 있다.

한 추가의 측면에서, 본 발명은 종양 내 종양 줄기 세포 및/또는 종양 선조 세포의 수를 감소시키는 방법으로서, 종양을 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 이론 또는 가설에 의해 제한되고자 함은 아니나, LIFR 신호전달 활성자 및 BMPR 신호전달 활성자는 종양에 투여될 때, LIF 또는 BMP-매개 신호전달을 초래하고, 이는 세포 생존, 자가 재생, 대칭 분열, 증식 및/또는 분화 성질을 포함하나 이에 제한되지 않는 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포 성질들 중 임의의 하나 이상의 조절을 초래하는 것으로 판단된다. 특히, LIFR 또는 BMPR-매개 신호전달의 증가는 줄기 세포 및 선조 세포의 증식 성질의 감소, 특히 증식하는 줄기 세포 또는 선조 세포에 의해 나타나는 대칭 분열의 확률의 감소를 초래하고, 이로써 그 수가 감소되는 것으로 판단된다. 따라서, 다른 한 측면에서, 본 발명은 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포가 대칭 분열을 겪는 가능성을 감소시키는 방법으로서, 종양 줄기 세포 또는 종양 선조 세포를 BMPR 신호전달 활성자 및/또는 LIFR 신호전달 활성자와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일부 실시양태들에서, LIFR 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를, 내인성 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포가 생체내 제어되도록 대상에게 직접 투여할 수 있다. 본 발명의 대안적 실시양태들에서, 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포는 본 발명의 작용제와 시험관내 접촉될 수 있다.

LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 포함하는 약학적 조성물과 함께, 종양을 포함한 대상에게 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 투여하는 방법은 이하 제목 "투여 및 약학적 조성물"의 단락에 나와 있다.

투여 및 약학적 조성물

상기 개시된 바와 같이, 치료 유효량의 LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 특히 대상 또는 조직에 투여하여, 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료 또는 예방할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 치료 유효량의 BMP-4 제제 또는 BMP-4 모방체를 GBM을 앓는 인간 환자에게 투여한다. 상기 기재된 종양 및 암에 부가하여, 본원에 개시된 방법에 따라 치료 또는 예방될 수 있는 기타 암에는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 그러한 암의 더욱 특별한 예에는 편평세포암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선양암종, 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막암, 간세포암, 장암 또는 위암(위장관암 포함), 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음암, 흑색종, 갑상선암, 폐암종 및 각종 유형의 머리 및 목 암, 및 B-세포 림프종(저등급/여포 비호지킨 림프종(NHL); 소 림프구성(SL) NHL; 중간등급/여포 NHL; 중간등급 확산 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프구성 NHL; 고등급 소 비-절단 세포 NHL; 벌크성 질환 NHL; 맨틀 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 왈덴스트롬 거대 글로브린혈증); 만성 림프구성 백혈병(CLL); 급성 림프구성 백혈병(ALL); 유모 세포 백혈병; 만성 골수모세포 백혈병; 및 이식후 림프계증식 장애 (PTLD)가 포함된다.

한 실시양태에서, LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자는 약학적 조성물의 형태로 대상에게 투여된다. 따라서, 다른 한 측면에서, 본 발명은 또한 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에 유용한 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 LIF 제제, BMP 제제, LIFR 신호전달 활성자 및 BMPR 신호전달 활성자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 포함한다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 치료 유효량의 BMP-4 제제를 포함하는 약학적 조성물이 GBM의 치료를 위해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 BMP-2 제제를 포함하는 약학적 조성물이 GBM의 치료를 위해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 BMP-5 제제를 포함하는 약학적 조성물이 GBM의 치료를 위해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 BMP-6 제제를 포함하는 약학적 조성물이 GBM의 치료를 위해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 BMP-7 제제를 포함하는 약학적 조성물이 GBM의 치료를 위해 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 유효량의 BMP-8b 제제를 포함하는 약학적 조성물이 GBM의 치료를 위해 제공된다.

다른 한 측면에서, 본 발명은 과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 의약을 제조함에 있어 LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자의 용도를 개시한다. 예를 들어, 다형성 교모세포종의 치료를 위한 의약을 제조함에 있어 BMP-4 제제 또는 BMP-4 모방체의 용도가 구체적으로 구상된다.

본 발명의 약학적 조성물은 단일 작용제를 포함하거나, 상기 작용제들의 임의의 조합물, 예를 들어 LIF 및 BMP-4의 조합물을 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물은 특별한 부류의 1개 초과의 작용제, 2개의 상이한 LIF 제제, 또는 2개의 상이한 BMPR 신호전달 활성자, 예를 들어 BMP-2 및 BMP-4를 포함할 수 있다.

약학적 조성물은 바람직하게 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 그러한 약학적 조성물에서, LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자는 "활성 화합물"을 형성한다. 본원에 사용되는 표현 "약학적으로 허용가능한 담체"에는 약제 투여와 상용적인, 용매, 분산 매질, 코팅물, 항세균제 및 항진균제, 등장 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 보충 활성 화합물이 또한 조성물에 혼입될 수 있다. 약학적 조성물은 그것의 의도된 투여 경로와 상용적이도록 제형된다. 투여 경로의 예에는 비경구, 예를 들어 정맥내, 피내, 피하, 경구(예를 들어, 흡입), 경피(국소), 경점막 및 직장 투여가 포함된다. 비경구, 피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 부유액에는 하기 성분들이 포함될 수 있다: 무균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 불휘발성 오일(fixed oil), 프로필렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 합성 용매; 항세균 작용제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트, 및 장성 조정제, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨으로 조정될 수 있다. 비경구 제제는 앰퓰, 일회용 주사기, 또는 유리 또는 플라스틱으로 된 다중 투약 바이얼 내에 봉해질 수 있다.

과도하거나 이상 제어되는 세포 증식을 겪고 있는 것으로 사료되는 조직 또는 세포를 LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자로 시험관내 처리하는 실시양태들에서, LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자는 약학적 조성물의 형태이거나 그렇지 않을 수 있음을 주목한다.

본원에 사용되는 대상은 인간 및 인간외 영장류(예를 들어, 게릴라, 짧은 꼬리 원숭이(macaque), 명주 원숭이(marmoset)), 가축 동물(예를 들어, 양, 소, 말, 당나귀, 돼지), 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이), 실험실 내 실험 동물(예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 기니어피크, 햄스터), 잡힌 야생 동물(예를 들어, 여우, 사슴) 및 본 발명의 작용제로부터 이익을 볼 수 있는 임의의 기타 유기체를 지칭한다. 본원에 기재된 작용제로부터 이익을 볼 수 있는 동물의 유형에는 제한이 없다. 본 발명의 가장 바람직한 대상은 인간이다. 대상은, 그것이 인간 또는 인간외 유기체인지의 여부를 불문하고, 환자, 개체, 동물, 숙주 또는 수령자로 칭해질 수 있다.

주사용으로 적당한 약학적 조성물에는 무균성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 무균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균 분말이 포함된다. 정맥내 투여의 경우, 적당한 담체에는 생리 식염수, 정균처리수, 크레모포르(Cremophor) EL.TM.(바스프(BASF), 미국 뉴저지주 파시파니 소재), 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우들에서, 조성물은 무균성이어야 하고, 용이한 주사 가능성이 존재하는 정도가 되도록 하는 유체이어야 한다. 그것은 제조 및 조건 하에서 안정해야 하고, 세균 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 적당한 이들의 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성이 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅물의 사용, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 예방이 각종 항세균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티머로살 등에 의해 달성될 수 있다. 많은 경우들에서, 조성물에 등장제, 예를 들어 슈거, 다가알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는, 조성물에 흡수지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시킴으로써 유발될 수 있다.

무균 주사용 용액은 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 조합과 함께 적절한 용매에 요구량의 활성 화합물을 혼입하고, 필요한 경우에는 그 후에 여과 무균처리함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중 요구되는 기타 성분을 함유하는 무균 비히클에 혼입함으로써 제조된다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우에는, 바람직한 제조 방법은 이전에 무균 여과된 용액으로부터의 임의의 원하는 성분에 부가하여 활성 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결 건조이다.

경구 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용성 담체를 포함한다. 경구 치료 투여를 목적으로 하는 경우, 활성 화합물에 부형제를 혼입하여, 정제, 트로키 또는 캡슐, 예를 들어 젤라틴 캡슐의 형태로 사용할 수 있다. 경구 조성물은 또한 구강청결제(mouthwash)로서 사용하기 위해 유체 담체를 이용하여 제조될 수 있다. 약학적으로 상용적인 결합 작용제, 및/또는 보조 물질이 조성물의 부분으로서 포함될 수 있다. 정제, 환약, 캡슐, 트로키 등은, 결합제, 예컨대 미세결정성 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 전분 또는 락토스, 붕해제, 예컨대 알긴산, 프리모겔(Primogel) 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘 또는 스테로테스(Sterotes); 글리던트(glidant), 예컨대 콜로이드성 이산화규소; 감미제, 예컨대 수크로스 또는 삭카린; 또는 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 살리실산메틸, 또는 오렌지 향료 중 임의의 것인 성분들 또는 유사한 성질의 화합물을 함유할 수 있다.

흡입 투여의 경우, 화합물은 적당한 추진제(propellant), 예를 들어 이산화탄소와 같은 기체 또는 네뷸라이저를 함유하는 가압된 용기 또는 디스펜서로부터 에어로졸 분무의 형태로 전달된다.

전신 투여는 또한 경점막 또는 경피 수단에 의해 행해질 수 있다. 경점막 또는 경피 투여에 있어, 투과하고자 하는 장벽에 적당한 투과제(penetrant)를 제형에 사용한다. 그러한 투과제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있고, 이에는 예를 들어, 경점막 투여에 있어서는 세제, 담즙염 및 푸지딘산 유도체가 포함된다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여에 있어서는, 활성 화합물이 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 연고, 고약, 젤 또는 크림으로 제형된다. 화합물은 좌약(예를 들어, 코코아 버터 및 기타 글리세라이드와 같은 통상적 좌약 기제를 포함함) 또는 직장 전달을 위한 정체 관장의 형태로 제조될 수 있다.

한 실시양태에서, 활성 화합물은 신체로부터의 급속 제거에 대항하여 화합물을 보호할 담체, 예컨대 임플란트 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한, 조절 방출 제형물을 이용하여 제조된다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 그러한 제형물의 제조 방법은 당업계의 숙련가에게 자명할 것이다. 그 물질은 또한 알자 코포레이션(Alza Corporation) 및 노바 파마슈티칼즈 인코포레이트(Nova Pharmaceuticals, Inc.)로부터 상업적으로 입수될 수 있다. 리포좀 부유액(세포-특이적 항원에 대한 단클론성 항체로 감염된 세포를 표적으로 하는 리포좀)이 또한 약학적으로 허용가능한 담체로 사용될 수 있다. 이는 당업계의 숙련가에 공지된 방법에 따라, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호에 기재된 바대로 제조될 수 있다.

투여 용이성 및 투약 균일성을 위해 투약 단위 형태로 경구 또는 비경구 조성물을 제형하는 것이 유리하다. 본원에 사용되는 투약 단위 형태는 피처리 대상에 대한 단일 투약으로 적합화된 물리적으로 구분된 단위를 지칭하고; 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 산출하도록 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다.

그러한 화합물의 독성 및 치료 효능은 예를 들어 LD50(집단의 50%에 대해 치사적인 투여량) 및 ED50(집단의 50%에 치료 유효한 투여량)을 결정하기 위한, 세포 배양에서의 표준 약학적 절차 또는 실험 동물에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과 및 치료 효과 간의 투여량 비가 치료 지수이고, 이는 비 LD50/ED50으로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 독성 부작용을 나타내는 화합물을 사용할 수 있으나, 그러한 화합물을 비감염 세포에 대한 가능한 손상을 최소화하고 이로써 부작용을 감소시키기 위해 영향을 받은 조직의 부위에 표적화하는 전달 시스템을 설계하는데 주의를 기울여야 한다.

세포 배양 검정 및 동물 연구로부터 습득된 데이터를 인간에 사용하기 위한 일정 범위의 투약을 제형하는데 사용할 수 있다. 그러한 화합물의 투약은 바람직하게 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 일정 범위의 순환 농도 내에 속한다. 투약은 이용되는 투약 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 변화할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 화합물에 대해, 치료 유효 투여량이 초기에 세포 배양 검정으로부터 평가될 수 있다. IC50(즉, 증상의 최대 억제의 1/2을 달성하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하도록 투여량이 동물 모델에서 제형될 수 있다. 그러한 정보를 이용하여, 인간에 유용한 투여량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장 내 수준을 예를 들어 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정할 수 있다.

본원에 정의된 바와 같이, 단백질 또는 폴리펩티드의 치료 유효량(즉, 유효 투약량)은 약 0.001 내지 30 mg/kg 체중, 바람직하게 약 0.01 내지 25 mg/kg 체중, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중, 더욱 더 바람직하게는 약 1 내지 10 mg/kg, 2 내지 9 mg/kg, 3 내지 8 mg/kg, 4 내지 7 mg/kg, 또는 5 내지 6 mg/kg 체중의 범위 내이다. 단백질 또는 폴리펩티드는 약 1 내지 10주, 바람직하게 2 내지 8주, 더욱 바람직하게는 약 3 내지 7주, 더욱 더 바람직하게는 약 4, 5 또는 6주 동안 주당 1회 투여될 수 있다. 당업자는, 질환 또는 장애의 중도, 이전 치료, 일반 건강 및/또는 대상 연령 및 기타 현 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 특정 인자가 대상을 유효하게 치료하는데 필요한 투약량 및 타이밍에 영향을 줄 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 치료 유효량의 단백질, 폴리펩티드 또는 항체를 이용한 대상의 치료에는 단일 치료가 포함될 수 있고, 바람직하게는 일련의 치료들이 포함될 수 있다.

뇌의 증식성 장애, 예를 들어 GBM를 치료하는 본 발명의 실시양태들에서, 약학적 조성물 및/또는 투여 방법은 혈-뇌 장벽(BBB) 및/또는 혈-종양 장벽(BTB)을 극복하기 위해 조정되는 것이 바람직하다. 약학적 조성물을 BBB를 횡단하여 전달하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Misra 등, (2003) J Pharm Pharm Sci 6:252-273(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]을 참조한다. 적당한 방법에는 경두개 뇌 약물 전달 방법, 예컨대 뇌내 이식, 뇌심실내(ICV) 주입, 및/또는 전달 강화 확산(convection enhanced diffusion; CED)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 뇌내 이식이 예를 들어, LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자)가 함침된, 중합체 비이드(예컨대, 헤파린 아크릴 비이드) 또는 중합체 웨이퍼(예컨대, 폴리페프로산(polifeprosan) 20)를 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 뇌내 이식은 BMP-4 담지 헤파린 아크릴 비이드를 종양 또는 절제 공동에 입체정위적으로 주사함으로써 수행될 수 있다

본 발명의 약학적 조성물, 예를 들어 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 또는 BMP-8b 제제(또는 이들의 조합물)를 포함하는 약학적 조성물을 상기 방법을 이용하여 비절제 종양에 투여할 수 있고; 대안적으로, 약학적 조성물을 종양 절제 후, 절제 공동에 투여할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 약학적 조성물을 먼저 종양내 투여한 후, 종양 절제 후에 수술후 투여한다.

일부 실시양태들에서, LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자는 혈뇌 장벽(BBB) 수용체-매개 전달(RMT) 시스템의 성분 상의 엑소페이셜(exofacial) 에피토프에 결합할 수 있는 분자와 결합된다. 이러한 방식으로, LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 내인성 RMT 시스템을 이용하여 BBB를 횡단하여 수송할 수 있다. 예를 들어, LIF 또는 BMP 제제는 트랜스페린 수용체(TfR)에 대한 단클론성 항체(예컨대, 0X26)에 접합되어, 접합체의 막횡단 수송을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌 [Pardridge, Neurorx 2(1): 3-14 (2005)(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]를 참조한다. 또한, 나노입자가 예를 들어 0X26에 대한 접합에 의해 BBB를 횡단하도록 유도될 수 있고; 그러한 나노입자는 또한 LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자에 접합될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Olivier 등, Pharm Res. (2002) 19(8): 1137-43(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 0X26에 접합된 리포좀을 사용하여. 캡슐화된 LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 및/또는 BMPR 신호전달 활성자를 BBB를 횡단하여 전달할 수 있다. 문헌 [Huwyler 등, Proc Natl Acad Sci U S A. (1996) 93(24): 14164-9(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]을 참조한다. 또한, BBB 및 BTB를 교란하는 작용제 및 치료를 사용하여, LIF 제제 및/또는 BMP 제제 및/또는 LIFR 신호전달 활성자 또는 BMPR 신호전달 활성자를 BBB 또는 BTB에 통과시킬 수 있다. 예를 들어, 혈관활성 작용제 브래디키닌의 동맥내 주입은 뇌 종양 모세관내 투과성을 선택적으로 증가시킬 수 있다. 문헌 [Matsukado 등, Rrain Res. (1998) 792(1): 10-5(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]을 참조한다.

한 실시양태에서, LIF 및 BMP 제제를 코딩하는 핵산 분자, 폴리펩티드 및 펩티드 LIFR 또는 BMPR 신호전달 활성자를 코딩하는 핵산 분자, 또는 LIFR 또는 BMP 신호전달 활성자인 리보자임, RNAi 분자 및 안티센스 분자를 코딩하는 핵산 분자를 벡터에 삽입하여, 유전자요법 벡터로 사용한다. 유전자 요법 벡터를 대상에게, 예를 들어 정맥내 주사, 국소 투여(미국 특허 제5,328,470호 참조), 입체정위적 주사(예를 들어, 문헌 [Chen 등 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3054-3057; Voges 등 (2003), Ann. Neurol. 54:479-487](이들 각자는 전체적으로 본원에 참조 인용됨) 참조)를 통해 대상에게 전달할 수 있다. 유전자 요법 벡터의 약학적 제제는 허용가능한 희석제 또는 캡슐화제(예컨대, 벡터를 함유하는 리포좀) 내에 유전자 요법 벡터를 포함할 수 있거나, 유전자 전달 비히클이 삽입된 서방성 매트릭스를 포함할 수 있다. 대안적으로, 완전 유전자 전달 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터)와 같이 재조합 세포로부터 비변형 상태로 생성될 수 있는 경우, 약학적 제제는 유전자 전달 시스템을 생산하는 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 문헌 [Consiglio 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Oct 12; 101(41): 14835-14840(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]에 기재된 바와 같이, LIF 및 BMP 제제를 코딩하는 핵산 분자, 또는 폴리펩티드 및 펩티드 LIFR 또는 BMPR 신호전달 활성자를 코딩하는 핵산 분자를, 렌티바이러스 벡터에 의해 포유동물 신경 암 줄기 세포에 전달한다.

일부 실시양태들에서, 본 발명에 따른 단일 활성 화합물, 예를 들어 단일 LIF 제제 또는 단일 BMP 제제를 투여한다. 다른 실시양태들에서, 다중 활성 화합물, 예를 들어 2개의 상이한 LIF 제제; LIF 제제와 BMP 제제; 또는 BMPR 신호전달 활성자와 2개의 상이한 BMP 제제를 동시 투여한다. 또한, 본 발명의 활성 화합물을 다른 약제, 예컨대 화학요법제, 방사선 감작제, 방사선요법제 등과 동시 투여할 수 있다. 본원에서 "동시 투여"라는 표현은, 동일하거나 상이한 경로를 통해, 동일한 제형물 또는 2개의 상이한 제형물로의 동시 투여, 또는 동일하거나 상이한 경로에 의한 순차적 투여를 의미한다. 본원에서 "순차적" 투여라는 표현은, 2가지 유형의 작용제 및/또는 약학적 조성물의 투여 사이의 초, 분, 시간 또는 일의 시간차를 의미한다. 작용제 및/또는 약학적 조성물의 동시 투여는 임의의 순서로 일어날 수 있다.

본원에 개시된 치료 방법 및 약학적 조성물은, 방사선요법제(예컨대, 방사성표지 항체 또는 방사성표지 핵산 리간드), 방사선요법, 및 수술(종양 절제/용적축소 수술 포함)를 화학요법(예컨대, 카르무스틴, 시스플라틴, 파클리탁솔, 테모졸로미드, PCV(프로카르바진, 로무스틴 및 빈크리스틴) 및 IL13-PE38QQR)을 비롯하여 다른 치료법과 함께 이용될 수 있다. 예를 들어, BMP-4 제제는 GBM의 치료를 위해 종양 절제 수술 및 방사선 요법을 행한 후에 화학요법제와 동시 투여될 수 있다. 이 부가적 치료는 본원에 개시된 방법에 따른 치료 전 및/또는 중 및/또는 후에 이용될 수 있다.

도 1A는 인간 신경 줄기 세포에 대한, 각 계대 배양의 종료 시의 이론적 총 세포수 대 계대수의 플롯을 도시한다. 도 1B는 각 계대 배양의 종료 시의 총 세포수의 로그 대 계대수, 및 선형 로그 플롯에 대한 최량 적합 추세선을 도시한다.
도 2A는 LIF가 첨가되거나, LIF가 첨가되지 않은 인간 신경 줄기 세포에 대한, 각 계대 배양의 종료 시의 이론적 총 세포수 대 계대수의 플롯을 도시한다. 도 2B는 각 계대 배양의 종료 시의 총 세포수의 로그 대 계대수, 및 선형 로그 플롯에 대한 최량 적합 추세선을 도시한다. 도 2C는 LIF의 존재 하에서의 줄기 세포 및 선조 세포 빈도의 감소를 그래프를 통해 도시한다.
도 3A는 종양 세포 신경구의 위상차 20배 확대도를 나타낸다. 도 3B는 2개의 상이한 GBM 세포주에 대한 각 분열에서의 이론적 총 세포수를 나타낸다.
도 4A는 일련 계대 배양된 GBM 종양 세포에 대한, 각 계대 배양의 종료 시의 이론적 총 세포수 대 계대수의 플롯을 도시한다. 도 4B는 각 계대 배양의 종료 시의 총 세포수의 로그 대 계대수, 및 선형 로그 플롯에 대한 최량 적합 추세선을 도시한다. 도 4C는 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 빈도를 그래프를 통해 도시한다.
도 5의 주 그래프는 일련 계대 배양된 GBM 종양 세포에 대한 신경 콜로니 형성 세포 검정(NCFCA)에서의 하기 직경 크기 범위의 콜로니를 형성하는, 플레이팅된 총 세포의 %(y-축)를 도시한다: 1,500 내지 2,000 μm; 1,000 내지 1,500 μm; 500 내지 1,000 μm; 및 <500 μm). 도 5의 주 그래프에 대한 삽입도는, 주 그래프와 상이한 y-축 척도를 이용하여, 500 내지 2,000 μm 및 1,000-1,500 μm 직경 범주의 콜로니를 형성하는 플레이팅된 총 세포의 %(y-축)를 도시한다.
도 6은 BMPR1a, BMPR1b 및 BMPR2에 대한 일차적 인간 종양 표본 및 인간 종양 신경 줄기 세포주에서의 실시간 PCR 결과를 도시한다.
도 7은 LIF 또는 BMP-4로 처리된 GBM 세포주 내 줄기 세포 및 선조 세포의 %를 나타낸다.
도 8은 LIF, BMP-4 또는 LIF + BMP-4로 처리된 GBM 세포주 내 줄기 세포 및 선조 세포의 %를 나타낸다.
도 9는 일련 계대 배양 중 연속적으로 BMP-2로 처리되거나, 한 계대 동안 일시적으로 BMP-2로 처리된("BMP-후") GBM 세포주 내 줄기 세포 및 선조 세포의 %를 나타낸다.
도 10은 인간 GBM로부터의 종양 신경 줄기 세포의 이식에 의해 유발되는 면역결핍 마우스 내 GBM을 도시하고(상단 패널), 또한 이식 전에 인간 종양 신경 줄기 세포를 BMP-4 또는 LIF로 예비 처리할 때 GBM 형성이 감소됨을 도시한다(하단 패널).
도 11A는 급성 해리된 GBM 세포 및 배양된 GBM 세포로부터의 세포에 대한 BMPR1A, BMPR1B, BMPR2 및 BMP-4의 전사 수준을 나타낸다. 도 11B-D는 새로 단리된 GBM 세포에서의 BMPR1A, BMPR1B 및 BMPR2 면역반응성을 나타낸다. 도 11E-G는 배양된 GBM 세포에서의 BMPR1A, BMPR1B 및 BMPR2 면역반응성을 나타낸다. 도 11H-I는 GBM 세포에서의 포스포Smad(phosphoSmad) 1,5,8 면역반응성을 나타낸다. 도 11K-P는 GBM 세포에서의 BMP-4, Smad1, 포스포Smad 1,5,8 및 Smad 4의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 나타낸다.
도 12A는 BMP-4의 존재 및 부재 하에서의 GBM 배양액 내의 세포 사멸, 세포 괴사, Ki67 면역반응성 및 CD133 면역반응성의 측정을 나타낸다. 도 12B는 BMP-4의 존재 및 부재 하에서의 GBM 세포의 콜로니 형성 지수를 나타낸다. 도 12C는 BMP-4의 존재 및 부재 하에서의 신경구 검정에 있어 GBM 세포의 전파를 나타낸다.
도 13A는 BMP-4의 존재 하에서의 GBM 세포를 나타낸다. 도 13B는 BMP-4와 함께 배양된 GBM 세포를 나타낸다. 도 13C(대조군 GBM 세포) 및 도 13D(BMP-4 처리 GBM 세포)는 GFAP-면역반응성(IR)을 보여주고; 도 13E(대조군 GBM 세포) 및 도 13F(BMP-4 처리 GBM 세포)는 βIII-튜불린 IR을 보여주며; 도 13G(대조군 GBM 세포) 및 도 13H(BMP-4 처리 GBM 세포)는 GalC IR을 도시한다. 도 13I-K는 GFAP IR, βIII-튜불린 IR 및 GalC IR에 대한 대조군 GBM 세포 및 BMP-4 처리 GBM 세포의 세포형광측정(cytofluorometric) 분석을 도시한다.
도 14A는 미처리 GBM 세포를 주입한 마우스 내의 종양 덩어리를 도시한다. 도 14B는 BMP-4 처리 GBM 세포를 주입한 마우스 내의 동등한 종양 덩어리의 부재를 도시한다. 도 14C는 BMP-4가 결여된 대조군 비이드로 동시 처리된 마우스 내의 종양을 도시한다. 도 14D는 BMP-4 비이드로 동시 처리된 마우스 내의 동등한 종양의 부재를 도시한다. 도 14E는 대조군 비이드로 후처리된 마우스 내의 종양을 도시한다. 도 14F는 BMP-4 비이드로 후처리된 마우스 내의 동등한 종양의 부재를 도시한다. 도 14G는 마우스 내의 미처리 GBM 종양의 세포 형태를 도시한다. 도 14H는 마우스 내의 BMP-4 처리 GBM 종양의 세포 형태를 도시한다. 도 14J는 GBM 주입-전(좌측 패널), -동시(중앙 패널) 및 -후(우측 패널)에 대조군 비이드 또는 BMP-4 비이드로 처리된 GBM 주입 마우스에 대한 생존 그래프를 도시한다
도 15는 GBM 세포의 성장에 대한 각종 BMP의 영향을 나타낸다.

본 발명은 하기 비제한적 실시예에 의해 더욱 기재된다. 실시예 19 내지 23에 있어, 인용된 결과를 얻기 위해 사용된 프로토콜이 실시예 24 내지 29에 제공됨을 주목한다.

실시예 1: 태아 인간 신경 줄기 세포의 일련 계대 배양, 및 수학적 모델링에 기초한 줄기 세포 및 선조 세포 빈도의 분석

일련 계대 배양된 신경구 배양액 내에 존재하는 신경 줄기 세포의 수 및 신경 선조 세포의 수를 계산하기 위해, 알고리즘을 유도하였다. 이 알고리즘을 위해, 모든 세포들을 하기 3가지 범주로 분류한다:

1. 줄기 세포는 (a) 증식, (b) 연장 기간에 걸친 자가 재생, (c) 다수의 후대를 발생시키는 능력, 및 (d) 당해 세포가 수득되도록 하는 출처인 조직의 모든 세포 유형을 발생시키는 능력이 가능한 미분화 세포로 정의된다.

2. 선조 세포는 (a) 증식, (b) 제한된 자가 재생 능력, (c) 제한된 수의 후대의 발생, 및 (d) 후대의 하나 이상의 유형을 발생시키는 능력이 가능한 미분화 세포로 정의된다.

3. 분화 세포는 증식 능력이 제한되거나 없고, 계통 특이적 마커 및 성숙한 기능적 성질 모두를 발현하는 세포로 정의된다.

용어 "줄기 세포" 및 NSC는 본원에서 상호 혼용될 수 있다. 마찬가지로, 용어 "선조 세포" 및 NPC도 또한 본원에서 상호 혼용될 수 있다.

이 알고리즘을 설명함에 있어, 수많은 가정들이 전제되었다:

1. 신경구는 줄기 세포, 선조 세포 및 분화 세포로 구성된다.

2. 모든 신경구는 단일 줄기 세포 또는 단일 선조 세포로부터 성장된다.

3. 줄기 세포는 무한 수명을 가지고, 선조 세포는 유한 수명을 가진다. 유한 수명은 계대인 것으로 정의된다.

4. 줄기 세포는 항상 신경구를 형성하고, 선조 세포는 그 수명의 종료에 달하지 않는 한, 신경구를 형성할 것이다.

5. 모든 신경구는 2가지 가능한 조성들 중 하나의 조성을 가지는 c 세포를 모두 가진다. 가능한 조성은 하기와 같다:

a. 단일 줄기 세포에서 유래된 각 신경구에서, 조성은 s 줄기 세포, p 선조 세포이고, 나머지는 분화 세포이며;

b. 단일 선조 세포에서 유래된 각 신경구에서, 조성은 p 선조 세포이고, 나머지는 분화 세포이다.

각 계대, n에서 총 세포수, T _n 를 기술하는 알고리즘을 유도하였다. 실험 개시 시에, 줄기 세포 유래 신경구가 해리되고, 즉 s 줄기 세포, p 선조 세포, 및 c - s - p 분화 세포가 있다. 줄기 세포 및 선조 세포는 총수가 s + p인 신경구로 성장되게 되고, 분화 세포는 사멸한다. 이어서, 총 신경구 수를 각 신경구 내의 세포수로 곱함으로써, 제1 계대 시기의 총 세포수, T ₁ 이 제공된다:

상기 방정식의 두 번째 등호는, sc가 줄기 세포 유래 신경구 내의 총 세포수를 나타내고, pc가 선조 세포 유래 신경구 내의 총 세포수를 나타내기 때문에 흥미롭다.

선조 세포가 2 세대 동안 산다고 가정한다면, 이 신경구들은 이제 해리된다. 제1 계대에서, s 줄기 세포 유래 신경구가 있고, 이의 각각은 s 줄기 세포, p 선조 세포 및 c-s-p 분화 세포를 포함해야 한다. 또한 제1 계대에서, 선조 세포 유래 신경구가 있고, 이의 각각은 각기 p 선조 세포 및 c-p 분화 세포를 포함한다. 이 새로 해리된 세포는, 사멸하는 분화 세포를 제외하고는, 이제 그 자신의 신경구로 성장하게 된다. 이어서, 제2 계대 시기의 총 세포수, T ₂ 가 하기 식에 의해 제공된다:

부등호의 우측 첫 번째 열은 줄기 세포 유래 신경구를 나타내는 항을 포함한다. 두 번째 열은 선조 세포 유래 신경구를 나타낸다.

T ₂ 방정식에서 두 번째 부등호는 확대된 형태의 총 세포수를 나타낸다. s ² c 항은 다음 세대에서 줄기 세포 유래 신경구가 될 줄기 세포 유래 신경구 내 총 세포수를 나타낸다. 두 번째 항 spc는 다음 세대에서 선조 세포 유래 신경구가 될 줄기 세포 유래 신경구 내 총 세포수를 나타낸다. 마지막 항, p ² c는 수명에 따라 선조 세포 유래 신경구가 되거나 사멸하게 될 선조 세포 유래 신경구를 나타낸다.

이들 세포는 이제 계대 배양되어 제3 세대로 이어진다. 이 세대의 총 세포수는 선조 세포의 수명에 의존한다. 수명이 단지 2 세대일 경우, 선조 유래 선조 세포는 이제 새로운 신경구를 발생시키기 보다 사멸할 것이다. 이러한 가정 하에, 제3 세대의 시기의 총 세포수, T ₃ 은 하기에 의해 제공된다:

마찬가지로, 제4 계대 시의 총 세포수를 결정할 수 있다. 이 방정식을 다시 쓰게 되면 다음과 같다:

따라서, 귀납법에 의해, 제n 계대에서 총 세포수가 하기 식에 의해 제공된다고 말할 수 있다:

(식 중에서, n ≥ 2임)

이 방정식은 선조 세포의 수명이 2 세대라는 가정에 기초한 것임을 재차 강조해야 한다.

선조 세포의 수명이 2 세대보다 긴 경우, 제3 세대의 총 세포수, T ₃ 은 하기 식에 의해 제공된다:

선조 수명이 3 세대인 경우, 제4 세대에 의한 총 세포수는 하기에 의해 제공된다:

따라서, 이러한 특정 가정 하에, 귀납법에 의해, 제n 계대에서의 총 세포수가 하기 식에 의해 제공된다고 말할 수 있다:

(식 중에서, n ≥ 3임)

일반적으로, 유사한 주장에 의해, 본 출원인은 선조 세포 수명이 l 세대인 경우, 제n 계대에서의 총 세포수가 하기에 의해 제공됨을 나타낼 수 있다:

(식 중에서, n < 1임)

(식 중에서, n ≥ 1임)

상기 방정식에서 합계를 위한 공지된 단순화가 있다.

따라서, T _n 발현은 하기와 같이 단순화된다:

(식 중에서, n < 1임)

(식 중에서, n ≥ 1임)

소정의 세포 유형에 있어, p, s, c 및 l이 고정되기 때문에, 꺾쇠괄호 내 항을 상수로 치환할 수 있는 바, 하기와 같다:

(식 중에서, n ≥ 1임)

및

이 방정식은 방정식 (25)의 대수를 취함으로써 선형 형태로 나타내어질 수 있는 바, 하기가 얻어진다:

(식 중에서, n ≥ 1임)

방정식 (27)을 조사해보면, 이 직선의 기울기는 log s이고, y-절편은 로그 B이다. 실험적 관점에서 보면, 이는 총 세포수의 로그를 계대수에 대해 플로팅할 경우, 신경구 내의 줄기 세포의 수가 플롯의 기울기를 조사함으로써 계산될 수 있고, 선조 세포의 수는 y-절편을 조사함으로써 계산될 수 있음을 의미한다. 이 플롯을 작도할 때, 선조 세포의 수명보다 큰 계대수에서의 데이터 점들만을 포함하도록 주의해야 한다. 선조 세포의 수명은, 1 ≥ n인 경우에는 소정의 계대 대 이전의 계대에서의 총 세포수의 비가 일정하나(

), 1 < n인 경우에는 이 비가 일정하지 않음을 주목함으로써 계산된다. 따라서, l = n+1(식 중에서, n이 이 비가 s 이하인 경우의 최대의 정수임)이다. 이 기법은 복잡한 데이터를 다루기 위해 적합화될 수 있다.

제1 l - 1 계대(l, log T ₁ ),...,(l - 1, log T _l _{- 1} )가 직선 상에 있지 않음을 주목하는 것이 중요하다. 이는 방정식 (23) 및 (24)를 조사함으로써 알 수 있다.

방정식 (27)로부터, 신경구 내의 선조 세포, p의 수는 선의 기울기에 영향을 주지 않음을 알 수 있다. 기울기가 변할 경우, 이는 줄기 세포의 수가 변화함을 의미한다. 기울기가 0인 경우, 즉 선이 수평인 경우, 신경구 내에 단지 하나의 줄기 세포만이 있고, 이에 따라 각 계대에서의 총 세포수가 확대되지 않는다.

신경구가 성장하게 되는 조건이 변화할 경우, 예를 들어 성장 인자가 단지 EGF에서 단지 EGF + FGF로 변화할 경우, 선의 기울기는 여전히 단지 신경구 내의 줄기 세포의 수에 의해서만 결정된다. 이 주장의 입증은 이 단락의 나머지를 구성한다.

제r 계대 후에 조건이 변화하고, 생성된 줄기 세포의 수가 q로 변화하며, 선조 세포의 수가 w로 변화하고, 선조 세포의 수명이 m 세대(편의상, m ≤ 1로 가정하나, m > 1의 경우도 유사함)로 변화하는 것으로 추정한다. r + l 계대 후의 총 세포수는 하기 식에 의해 제공된다:

(식 중에서, m ≤ 1임)

r + m - 1 계대 후에 총수는:

이고, r + m 계대 후에 총수는:

이다.

귀납법에 의해, r + N 계대 후의 총 세포수는 하기와 같다:

여기에서,

이다.

선형화할 경우, 하기와 같다:

따라서, 상기와 같이, 조건의 변화 후에, 이 선의 기울기는 단지 줄기 세포의 수에 의해서만 영향을 받음을 알 수 있다.

상기 알고리즘에 기초하여, 줄기 세포 및 선조 세포 빈도는 하기 단계들로부터 계산될 수 있다:

1. 신경구 검정에서 세포를 일련 계대 배양하고, 이전 계대의 총 세포를 현 계대에서 발생된 세포의 증가 배수를 곱함에 기초한 각 계대에서 발생된 총 세포수를 플로팅하는 단계;

2. 각 계대에서 발생된 총 세포의 로그를 취함으로써 대수 성장 곡선을 선형화하는 단계;

3. 최량 적합의 선을 계산한 후, 직선에 대한 공식(y = mx + b)을 이용하여 선의 기울기 및 y-절편을 계산하며, 이에 상기 공식을 이용하여 줄기 세포의 수 및 선조 세포의 수를 구하는 단계.

실시예 2: 태아 인간 신경 줄기 세포의 일련 계대 배양, 및 수학적 모델링에 기초한 줄기 세포 및 선조 세포 빈도의 분석

실시예 1의 수학적 모델을 일련 계대 배양된 태아 인간 신경 줄기 세포에 적용하였다. 문헌 [Vescovi 등 (1999) Exp. Neurol. 156:71-83(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]에 기재된 바와 같이, 태아 인간 신경 줄기 세포를 통상적 기법을 이용하여(즉, 이전 계대로부터의 세포의 분획을 이용하고 미토겐 EGF 및 FGF2로 보충된 무혈청 배지를 이용하여 각 계대에서의 클론 밀도로 플레이팅함) 일련 계대 배양하였다. 각 계대 배양의 종료 시에, 세포를 단일 세포 부유액에 해리하고 생육가능한 세포 및 사멸 세포를 트립판 청색 배제 세포를 이용하여 계수함으로써 총 세포수를 구하였다. 각 계대 배양의 종료 시의 이론적 총 세포수(각 계대 배양의 종료 시에 계수된 총 세포수 및 계수된 세포를 산출하도록 재차 플레이팅된 그 직전의 계대의 분획의 함수임)를 계대수에 대해 플로팅하여(도 1A), 성장 곡선을 수득하였다. 각 계대 배양의 종료 시의 총 세포수의 로그를 또한 계대수에 대해 플로팅하였다(도 1B). 선형 로그 플롯에 대한 최량 적합 추세선을 산출하였고(도 1B), 직선에 대한 식(y = mx + b)을 이용하여 기울기 및 y-절편을 구하였다. 이어서, 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 실시예 1에서의 방정식 (26) 및 (27)(이 때, n = 1, l = n + 1 = 2, c = 1,000임; 이 값들은 또한 하기 실시예들 모두에서 사용됨)에 따라 계산하였다. 줄기 세포 빈도는 총 세포 집단의 0.24%인 것으로 계산되었고, 선조 세포 빈도는 총 세포 집단의 1.15%인 것으로 계산되었다.

실시예 3: 신경 콜로니 형성 세포 검정에서의 태아 인간 신경 줄기 세포의 줄기 세포 및 선조 세포 빈도의 분석

신경 콜로니 형성 세포 검정(NCFCA)을 이용함으로써, 신경 콜로니 크기에 기초한 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 결정할 수 있다. NCFCA가 미국 특허 출원 공보 일련 제2005/0112546호(2005년 5월 26일 공개)(전체적으로 본원에 참조 인용됨)에 기재되어 있다. 간략히, NCFCA는 반고체 배지, 바람직하게 콜라겐-기재 또는 메틸셀룰로스-기재(IMDM, DMEM/F12, 맥코이즈(McKoy's), 이스코브즈(Iscoves)) 반고체 배지 내 신경 세포를 부유함으로써 수행된다. 반고체 배지는, 신경 세포를 배양하는데 사용된 것과 동일한 적당한 배지(예를 들어, 사이토카인 배제, 뉴로컬트(Neurocult)^TM 증식 보충물 첨가, 및 EGF 첨가의 뉴로컬트^TM 스템셀 테크놀로지즈 인코포레이티드(StemCell Technologies, Inc.)] 무혈청 배지)를 포함할 수 있고, 그 배지에는 콜라겐 또는 메틸셀룰로스가 첨가된다. 배지는 바람직하게 무혈청이다. 반고체 배지 내의 세포를 데이터의 통계학적 분석을 위해 충분한 수의 콜로니를 가능하게 하는 농도로 플레이팅한다(예를 들어, 35 mm 배양 디쉬 당, 1,000 내지 25,000 세포, 바람직하게는 2,500 내지 7,500 세포). 형성된 콜로니는 신경 줄기 세포 또는 선조 세포인 단일 세포로부터 발생된다. 콜로니를, 콜로니 크기 간에 크기 및 차이를 식별할 수 있을 때까지 배양한 후(예를 들어, 약 10 내지 30일), 콜로니를 계수하고, 스코어링 디쉬 상의 격자를 이용하여 콜로니 크기를 평가한다. 단일 신경 줄기 세포로부터 발생된 콜로니는 시간 경과에 따라 그 크기가 계속해서 증가하고, 한편 신경 선조 세포에서 발생된 콜로니는 제한된 성장 능력을 가져, 시간 경과에 따라 그 크기가 계속해서 증가하지 않는다. 콜로니 크기는 고증식 가능성-NSC(HPP-NSC), 저증식 가능성-NSC(LPP-NSC) 및 신경 선조 세포를 구별할 것이다. 그러므로, 발생된 콜로니의 크기는, 콜로니가 신경 줄기 세포 또는 신경 선조 세포에서 발생되었는지의 여부, 및 NSC가 고증식성 또는 저증식 가능성을 가지는지의 여부를 가리킬 수 있다. 특히, (디쉬 상의 다른 콜로니에 비해) 보다 큰 콜로니는 고증식 가능성 신경 줄기 세포를 가리키고, 중간 크기의 콜로니는 저증식 가능성 신경 선조 세포를 가리키며, 보다 작은 콜로니는 신경 선조 세포를 가리킨다. "보다 큰 콜로니" 또는 "보다 작은 콜로니"의 실제 직경은 많은 인자들, 예컨대 콜로니 배양 시간 등에 의존할 것이다. 예를 들어, 14 내지 28일 동안 2,500 세포/디쉬를 배양한 후, 콜로니를 직경에 따라 하기 4개 범주 중 하나로 분류하였다: (1) >2.0 mm, (2) 1 내지 2 mm, (3) 0.5 내지 1 mm, 및 (4) <0.5 mm. 그러므로, 콜로니를 14일 이상 동안 배양하는 것으로 가정하면, 2.0 mm 초과의 직경은 신경 줄기 세포로부터 발생된 콜로니를 가리킨다. NCFCA에서의 세포 유형은 또한 세포가 생성한 형태에 따라 구별될 수 있다. 파동형 콜로니는 신경 줄기 세포에 의해 생성되고, 반면 완만한 주변을 갖는 콜로니는 신경 선조 세포에 의해 생성된다. NCFCA을 수행하기 위한 키트는 스템셀 테크놀로지즈 인코포레이티드로부터 상업적으로 입수가능하다.

NCFCA에 세포를 플레이팅함으로써, 태아 인간 신경 줄기 세포에 대한 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 계산하였다. 계대 12 태아 신경 줄기 세포 후대를 단일 세포 부유액으로 해리하고, 20 ng/ml의 EGF 및 10 ng/ml의 bFGF와 함께 2000 세포/ml의 밀도로 플레이팅하였다. 세포를 3주 동안 반고체 배지에 배양한 후, 콜로니의 빈도 및 크기를 계산하였다. 플레이팅된 총 세포의 2% 미만이 줄기 세포 특성을 나타내는 콜로니를 형성하였다. 따라서, 수학적 분석 방법으로부터 얻어진 실시예 2에서의 결과는 NCFCA의 결과와 일치한다.

실시예 4: 백혈병 억제제 인자( LIF )는 일련 계대 배양된 태아 인간 신경 줄기 세포에서의 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 감소시킴

일련 계대 배양된 태아 인간 신경 줄기 세포를, 20 ng/ml의 인간 LIF를 첨가하거나 첨가하지 않은, (미토겐 FGF2 및 EGF를 포함하는) 실시예 2에서와 같은 정상 증식 조건 하에 배양하였다. 양 군 모두에 대해 성장 곡선을 산출하였고(도 2A), 이를 각 계대 배양의 종료 시에 발생된 세포의 이론적 총수의 로그를 취해 선형 척도로 전환하였고(실시예 2 참조), 최량 적합 추세선에 기초하여 기울기 및 y-절편을 구하였다(도 2B). 실시예 1의 방법에 따라 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 분석한 결과, LIF의 존재 하에 줄기 세포 빈도는 48% 감소하고 선조 세포 빈도는 18% 감소한 것으로 나타났다(도 2C; y-축은 대조 값의 %를 나타냄). 이에 따라, LIF를 이용하여, 일련 계대 배양된 인간 신경 줄기 세포에서의 신경 줄기 세포 및 신경 선조 세포 빈도를 감소시킬 수 있다.

실시예 5: 골 형성 단백질 2( BMP -2)는 일련 계대 배양된 태아 인간 신경 줄기 세포에서의 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 감소시킴

일련 계대 배양된 태아 인간 신경 줄기 세포를, 20 ng/ml의 인간 BMP-2 단백질을 첨가하거나 첨가하지 않은, (미토겐 FGF2 및 EGF를 포함하는) 실시예 2에서와 같은 정상 증식 조건 하에 배양하였다. 양 군 모두에 대해 성장 곡선을 산출하였고, 이를 각 계대 배양의 종료 시에 발생된 세포의 이론적 총수의 로그를 취해 선형 척도로 전환하였고, 최량 적합 추세선에 기초하여 기울기 및 y-절편을 구하였다. 실시예 1의 방법에 의해 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 분석한 결과, BMP-2의 존재 하에 양 세포 유형 모두가 감소한 것으로 나타났다. 이에 따라, BMP를 이용하여, 일련 계대 배양된 인간 신경 줄기 세포에서의 신경 줄기 세포 빈도 및 신경 선조 세포 빈도를 감소시킬 수 있다.

실시예 6: 다형성 교모세포종( GBM )으로부터 유래된 일련 계대 배양된 세포는 핵심적 줄기 세포 특성을 나타냄

인간 GBM은 신경 줄기 세포의 체외 성장을 허용하도록 조정된 조건 하에 증식하는 종양 신경 줄기 세포(tNSC)를 포함한다. 문헌 [Galli 등 (2004) Cancer Research 64:7011-7021(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]을 참조한다. tNSC를 문헌 [Galli 등 (2004), 이하 동일, 및 Vescovi 등, Exp. Neurol. 156:71-83 (1999)(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]의 방법에 따라 종양 샘플로부터 단리할 수 있다. 간략히, 07. mg/mL 오보뮤코이드 함유의 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM)/F12에서 마쇄함으로써 종양 샘플을 먼저 해리함으로써 tNSC를 단리할 수 있다. 세포를 원심분리에 의해 수집하여, 2 mM 글루타민, 0.6% 글루코스, 9.6 gm/mL 푸트레신, 6.3 ng/mL 프로게스테론, 5.2 ng/mL 나트륨 셀레나이트, 0.025 mg/mL 인슐린, 0.1 mg/mL 트랜스페린을 함유하는, 성장 인자-비함유 화학적 한정 NS-A 배지(스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies; 캐나다 벤쿠버 소재)에 재부유시킨다. 이어서, 생육가능한 세포를 20 ng/mL EGF 및 20 ng/mL FGF2가 첨가된, 동일한 화학적 한정 NS-A 배지 내 일정 밀도(2,500 내지 5,000 세포/cm²)로 25 cm² 플라스크에 플레이팅한다. 필요한 경우, 배지를 24-48시간마다 새 배지로 교체한다. 플레이팅한지 5 내지 20일 후에, 문헌 [Reynolds & Weiss (1992) Science 255:1707-1710(전체적으로 본원에 참조 인용됨)]에 기재된 바와 같이, 정상 신경 줄기 세포에 의해 시험관내 형성된 정통적(classical) 신경구와 흡사한 종양 세포 신경구를 관찰할 수 있다(위상차 2OX 확대도를 나타내는 도 3A 참조). 종양 세포 신경구를 동일한 조건 하에 해리하여 일련 재계대 배양할 수 있고, 이 때 tNSC는 새 종양 세포 신경구를 확립한다. tNSC는 안정하게 자체 재생되고, 배양액 내 확대된다(2개의 상이한 GBM 세포주의 각 분열에서의 이론적 총 세포수를 나타내는 도 3B 참조). tNSC는, 그 후대가 분화 조건 하에서 뉴런, 희소돌기아교세포 및 성상교세포를 생성시키기 때문에, 시험관내 중복성을 가진다. 예를 들어, 항-베타-튜불린 항체, 항-신경교 아교원섬유 산성 단백질(GFAP) 항체-(GFAP는 성상교세포 분화의 마커임), 및 항-갈락토세레브로시드(GalC) 항체(GalC는 희소돌기아교세포의 마커임)를 이용한 분화된 후대의 염색이 관찰되었다.

tNSC는 면역결핍 마우스의 뇌에 이식될 때, 전형적 인간 GBM에서와 같이, 성상교세포-특이적 마커에 대해 면역반응성을 갖는 GBM을 생성시킨다. 이 종양이 그 자체가 제거되고 tNSC이 재배양되며, 2차 tNSC는 면역결핍 마우스의 뇌에 이식될 때 GBM을 재생시킨다. 따라서, 인간 tNSC는 생체내 단일 가능성을 가지고, 시험관내 중복성을 가지며, 클론 수준까지 종양-형성 세포로서 작용할 수 있고, 일련 재이식 후에도 인간 질환의 핵심 특성과 매우 흡사한 마우스 내에 종양을 확립할 수 있다. 그러므로, 인간 tNSC는 인간 GBM의 성장 및 재발과 관련된 것으로 보인다.

실시예 7: 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 빈도를 계산하기 위한, 일련 계대 배양된 GBM 종양 세포의 수학적 모델링의 이용

실시예 1의 분석 방법을 이용하여 3개의 GBM 세포주에 대해 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 결정하였다. 세포주는 3명의 상이한 환자의 종양(신경학 연구소 C. 베스타(C. Besta)에서 입수하여, 세계보건기구(WHO) 지침에 따라 분류된 종양)으로부터 유래되었다. 종양 세포는 실시예 6의 방법을 이용하여 일련 계대 배양하였고, 발생된 세포의 이론적 총수를 각 세대주에 대한 각 계대별로 플로팅하였다(627, 913, 1022)(도 4A 참조). 각 계대 배양의 종료 시에 발생된 세포의 이론적 총수의 로그를 계산하였고, 최량의 적합 추세선에 기초하여 기울기 및 y-절편을 계산하였다(도 4B 참조). 줄기 세포 및 선조 세포의 수의 빈도를 실시예 1의 방법을 이용하여 계산하였다. 종양 줄기 세포 빈도는 총 세포의 0.44%이었고, 종양 선조 세포 빈도는 총 세포의 1.56%였다(도 4C에서의 3개의 GBM 세포주 각각에 대해 나타냄).

실시예 8: 신경 콜로니 형성 세포 검정( NCFCA )에 있어 GBM 종양 줄기 세포 유래 후대로부터의 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 빈도의 계산

계대 15 GBM 세포를 실시예 3에 기재된 바대로 신경 콜로니 형성 세포 검정(NCFCA)에서 플레이팅하였다. 배양액에 매주 새 배지를 공급하였고, 3주 후, 콜로니 직경을 구하였다. 이 검정에서, 단지 가장 큰 콜로니만이 반고체 배지로부터의 추출 및 서브-클로닝 후에 줄기 세포 특성을 나타낸다. 플레이팅된 총 세포의 0.25% 내지 0.65%가 큰 콜로니를 형성하였다. 하기 직경 크기 범위의 콜로니를 형성하는 총 플레이팅 세포 중의 %(y-축)를 나타내는 도 5에서의 주 그래프를 참조한다: 1,500 내지 2,000 μm; 1,000 내지 1,500 μm; 500 내지 1,000 μm; 및 <500 μm). 도 5에서의 주 그래프에 대한 삽입 그래프는 주 그래프와 상이한 y-축 척도를 이용하여, 1,500 내지 2,000 μm 및 1,000 내지 1,500 μm 직경 범주 내의 콜로니를 형성하는 총 플레이팅 세포 중의 %(y-축)을 보여준다. 따라서, 실시예 7의 NCFCA 및 수학적 분석으로, GBM 종양 세포주 내의 종양 줄기 세포에 대해 유사한 빈도가 얻어진다.

실시예 9: 일차적 종양 샘플 및 tNSC 에 있어 BMP 수용체의 모든 형태의 존재

3개의 BMP 수용체(BMPR1a, BMPR1b 및 BMPR2)의 발현을 하기에 있어 실시간 PCR에 의해 결정하였다:

1. 일차적 인간 뇌 종양 표본: 역형성 성상세포종(AA 031217); 교모세포종(GBM050203, GBM 040114, GBM 040202, GBM 050207, GBM 050208); 및 배아형성장애 신경상피종 신생물(NND 040115);

2. 정상 인간 태아 신경 줄기 세포(fNSC); 및

3. 실시예 6의 방법에 따라 제조된 인간 교모세포종 종양 신경 줄기 세포(tNSC) 주(GBM 010627, GBM 020913, GBM 021022)

하기 방법을 이용하였다. 먼저, 총 RNA를 트라이졸(TRIzol) 시약(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies; 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)을 이용하여 fNSC, tNSC 및 일차적 종양 샘플로부터 단리한 후, 슈퍼스크립트(Superscript) 리보뉴클레아제 H-역전사효소(라이프 테크놀로지즈; 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)를 이용하여 역전사하였다. 주형으로 사용된 모든 cDNA를, 관리 유전자로서의 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로나제(GAPDH) 및 양성 대조군으로서의 MCF-7 세포주를 이용하여 사전 정규화하였다. 이어서, 정량적 실시간 PCR 반응을, 각 BMP 수용체에 대해 특이적인 프라이머를 이용하고 브릴리언트(Brilliant)

SYBR

그린 QPCR 코어 시약 키트(Green QPCR Core Reagent Kit)(스트라타젠(STRATAGENE; 미국 캘리포니아주 라졸라 소재))를 이용하여 3벌로 행하였다. SYBR 그린 염료는 임의의 PCR 생성물에 결합하므로, 서열 특이적 프로브를 사용할 필요가 없다. 브릴리언트 SYBR 그린 마스터 믹스는 UNG 오염제거 프로토콜과 함께 사용하기 위한 dUTP를 함유한다. 사용된 프라이머 서열은 하기와 같다:

프라이머 서열× 역전사된 ( RT ) PCR

hBMPR-1A 전방향: 5'-AATGGAGTAACCTTAGCACCAGAG-3'

hBMPR-1A 역방향: 5'-AGCTGAGTCCAGGAACCTGTAC-3'

hBMPR-1B 전방향: 5'-GGTTGCCTGTGGTCACTTCTGG-3'

hBMPR-1B 역방향: 5'-TAGTCTGTGATTAGGTACAACTGG-3'

hBMPR-2 전방향: 5'-TCAGATATATGGCACCAGAAGTG-3'

hBMPR-2 역방향: 5'-GTGGAGAGGCTGGTGACACTTG-3'

프라이머 서열×실시간 PCR

hBMPR1a 전방향: 5'-caggttcctggactcagctc-3'

hBMPR1a 역방향: 5'-ctttccttgggtgccataaa-3'

hBMPR1b 전방향: 5'-aaaggtcgctatggggaagt-3'

hBMPR1b 역방향: 5'-gcagcaatgaaacccaaaat-3'

hBMPR2 전방향: 5'-gctaaaatttggcagcaagc-3'

hBMPR2 역방향: 5'-cttgggccctatgtgtcact-3'

형광 발광을 실시간으로 기록하였다(크로모 4색 실시간 PCR 검출기(Chromo 4 Four-Color Real-Time PCR Detector), MJ 리서치(MJ Research), 바이오-래드(BIO-RAD, 미국)). 유전자 발현 프로파일링을 상대 정량화의 비교 Ct 방법(Higuchi 등)을 이용하여 완료하였다. 각 유전자에 대해, 상대적 RNA 양을 2개의 내인성 대조군, 즉 GAPDH 및 18s rRNA로 정규화하였다. 각각의 복제물을 정규화하고, 평균 상대량(RQ)을 각 유전자에 대해 보고한다. 평균 변화 배수를, 3개 복제물의 95% 신뢰도 구간 및 표준 편차에 따라 계산하였다.

도 6은 결과를 나타낸다. 결과는, 상이한 공격도(degrees of aggressiveness)를 가지는 상이한 종양이 특징적 BMPR 발현 프로파일을 가짐을 가리킨다. 따라서, 종양의 BMPR 발현 프로파일을 진단 방법에 사용하여, 종양을 특징화하고 종양의 공격도를 예측할 수 있다.

실시예 10: 백혈병 억제 인자( LIF ) 및 BMP 는 일련 계대 배양된 인간 GBM 세포주에 있어 줄기 세포 빈도를 감소시킴

3명의 상이한 환자로부터 수득한 GBM 종양 세포를, LIF(20 ng/ml) 또는 BMP-4(20 ng/ml)를 가지거나 가지지 않는 대조군 배지(미토겐 EGF + FGF2 포함; 실시예 6 참조)에서 일련 계대 배양하였다. 실시예 1의 방법을 이용한 줄기 세포 및 선조 세포 빈도의 분석은, LIF 또는 BMP-4의 첨가에 의해 종양 줄기 세포 수의 유의적 감소(p<O.O1의 통계적 유의성), BMP-4의 첨가에 의해 종양 줄기 세포 수의 유의적 감소(p<O.O5의 통계적 유의성)를 나타냈으나, LIF의 첨가에 의해서는 종양 선조 세포 집단 빈도의 유의적 변화가 없었다. 이 결과는, BMP 분자는 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 증식을 감소시키고, 한편 LIF는 종양 선조 집단에 대한 영향 없이 종양 줄기 세포 수를 선택적으로 감소시킴을 가리킨다. 도 7은 결과를 그래프에 의해 나타낸다(비처리 대조군 결과 대비의 %). 이 결과는, LIF 및 BMP가 미토겐 EGF 및 FGF2의 존재 하에서도 tNSC 증식을 감소시키는데 각기 유효하다는 것을 가리킨다. 이는, LIF 및/또는 BMP 처리가 인간에 있어 뇌 종양을 치료하는데 효과적일 것임을 보여준다.

실시예 11: 일련 계대 배양된 GBM 유래 세포에 대한 LIF 및 BMP -2의 적용이 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 감소시킴

대조군 배지(미토겐 EGF + FGF2 포함; 실시예 6 참조) 내의 일련 계대 배양된 GBM 세포(실시예 6 참조)를 LIF, BMP-2, 또는 BMP-2+LIF의 조합물로 처리하였다. 대조군 일련 계대 배양된 GBM 세포를 어느 단백질로도 처리하지 않았다. 성장 곡선을 실시예 1의 방법을 이용하여 비교함으로써, 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 계산하였다. 데이터는, LIF 및 BMP-2를 단독으로 사용하지 않고 함께 사용할 때, 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 빈도가 더욱 감소됨을 나타낸다. 도 8은 결과를 그래프에 의해 나타낸다(y-축은 비처리 대조군 값 대비의 %를 나타냄). 이 결과는, LIF 및 BMP-2의 동시 투여가 미토겐 EGF 및 FGF2의 존재 하에서도 tNSC의 증식을 감소시키는데 효과적이라는 것과, LIF 및 BMP-2의 동시 투여가 인간에 있어 뇌 종양을 치료하는데 효과적일 것임을 나타낸다.

실시예 12: 배양된 GBM 세포의 BMP -2로의 일시적 처리가 줄기 세포 및 선조 세포 빈도를 영구적으로 감소시킴

3명의 상이한 환자로부터 수득된 GBM 종양 세포를, BMP-2(20 ng/ml)을 첨가하거나(도 9에서 "BMP"로 나타냄), 1 계대 동안 BMP-2에 노출하여(도 9에서 "BMP-후"로 나타냄), 대조군 배지(미토겐 EGF + FGF2 포함; 실시예 6 참조)에서 일련 계대 배양하였다. 실시예 1의 방법을 이용한 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 빈도의 분석은, 양 BMP 군 모두에 있어 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 수의 유의적 감소를 나타냈다. 이 결과는, BMP-2에의 일시적 노출이 미토겐 EGF 및 FGF2의 존재 하에서도 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 빈도의 영구적 감소를 가져옴을 가리킨다. 이 결과는, BMP-2 처리가 인간에 있어 뇌 종양에 지속 효과를 가질 것임을 가리킨다.

실시예 13: LIF 및 BMP 를 이용한 사전 처리 후의 배양된 GBM 세포의 감소된 종양발생성 감소

100,000개의 종양 신경 줄기 세포를 인간 GBM에서 면역결핍 마우스의 뇌(배쪽 가쪽줄무늬체)로의 이식을 입체정위적 주사를 이용하여 수행하였다. 종양 신경 줄기 세포는 마우스에서 GBM을 확립하였다. 이 GBM 병변은 정상 조직에 의해 명료하게 구분되는 넓은 초-핵화 부위로서 분명해졌다(도 10의 상단 패널 참조). 동일한 종양 신경 줄기 세포를 100 ng/mL BMP-4 또는 100 ng/mL LIF로 48시간 동안 예비 처리한 후에 이식할 때, 종양의 형성이 대폭 감소하고(대략 80% 정도 감소), 초-핵화 부위는 종종 검출되기 어려워진다(도 10의 하단 패널 참조). 이 결과는 BMP 및/또는 LIF 처리가 인간 뇌 종양의 치료에 효과적임을 추가로 가리킨다. 부가적 예에 대해 실시예 22를 또한 참조한다.

실시예 14: LIF 및 BMP -2 처리 후의 유방 암종 조직 내 종양 줄기 세포 빈도에 대한 검정

종양 절제에 대해 생검을 받는 동의 환자로부터 종양 표본을 수득하여, 1:1 콜라게나제/히알루로니다제 용액에서 1시간 동안 37℃에서 효소 분해시킨 후, 40μm 필터를 통해 여과하고, 미토겐 EGF 및 FGF2(20 ng/ml)를 가지는 무혈청 DMEM/F12 호르몬 혼합물(뉴로컬트(NeuroCult), 스템 셀 테크놀로지즈)에서 클론성 밀도로 세포를 플레이팅한다. 3 내지 5일 후, 세포의 클론에 의해 유래된 클러스터가 부유액 내 부유하는 것으로 관찰된다. 이 세포를 수집하고, 효소적으로 해리하며, 세포를 새 성장 배지에 다시 플레이팅한다. 4 내지 7일마다 이러한 방식으로 계대 배양된 세포는 발생된 총 세포수의 기하학적 증가를 나타낸다.

일련 계대 배양된 포유동물 종양 유래의 줄기 세포를 LIF 및/또는 BMP-2에 노출하여, 대조군 배양액과 비교한다. 신경 콜로니 형성 세포 검정에서의 해리된 포유동물 구로부터의 세포를 플레이팅하고, 실시예 1의 수학적 모델을 이용하여 일련 성장 곡선을 분석함으로써, 처리군 및 대조군 간의 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 빈도를 분석한다.

실시예 15: LIF 및 BMP -2 처리 후의 전립선 암종 조직에서의 종양 줄기 세포 빈도에 대한 검정

전립선암 세포를 림프절 전이로부터 입수하여, 5% 혈청 및 줄기 세포 미토겐 EGF 및 FGF2가 첨가된 DMEM/F12 호르몬 혼합물(스템셀 테크놀로지즈)에서 배양한다. 클론에 의해 유래된 구상물(spheroid)을 트립신 처리 후의 일련 계대 배양하고, (LIF 및/또는 BMP-2로 처리되거나 처리되지 않은) 계대 배양된 세포로부터의 확대 데이터를 사용하여, 실시예 1의 수학적 모델을 이용하여, 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 빈도를 계산한다.

실시예 16: LIF 및 BMP -2 처리 후의 흑색종 조직에서의 종양 줄기 세포 빈도에 대한 검정

흑색종 세포를 절제된 종양으로부터 입수하고, 줄기 세포를 포유동물 피부로부터의 중복성 줄기 세포를 배양하는데 사용되는 방법에 따라 단리한다(문헌 [Toma 등, Nat Cell Biol. 2001 Sep; 3(9): 778-84(전체적으로 본원에 참조 인용됨)] 참조). 간략히, 조직을 작은(<2mm) 조각으로 절단하고, HEM으로 세정하여, 37℃에서 30분 동안 0.1 트립신으로 분해한다. 샘플을 PBS로 헹구고, 단일 세포 부유액으로 기계적으로 해리하며, 40 uM 세포 스트레이터(strainer)를 통해 여과하여, Nunc T-80 조직 배양 플라스크에서 50,000 세포/ml의 밀도로 플레이팅한다. 성장 배지는 줄기 세포 미토겐 EGF 및 FGF2가 첨가된 호르몬 믹스(스템 셀 테크놀로지즈)를 갖는 무혈청 DMEM/F12이다. 7 내지 10 분열 후, 클론에 의해 유래된 세포 클러스터를 배양액 중 확인한다. 이 멜라노구(melanosphere)를 수집하고, 단일 부유 부유액에 해리하며, 새 매질 줄기 세포 미토겐을 이용하여 다시 플레이팅한다. 이러한 방식으로 계대 배양된 배양액을 LIF 또는 BMP-2로 처리하고, 시간 경과에 따라 발생된 총 세포수를 로그 척도로 플로팅한다. 처리군 및 대조군 간의 종양 줄기 세포 및 종양 선조 세포 빈도를 실시예 1의 수학적 모델을 이용하여 분석한다.

실시예 17: 종양 절제 후에 전달 강화 전달법( CED )에 의한 LIF 투여를 이용하는 재발성 다형성 교모세포종의 치료

재발성 다형성 교모세포종을 앓는 환자를 선택한다. 종양 절제 후, 2 내지 3개의 카테터를 영상 유도 장치(image guidance)를 이용하여 절제 공동 주변에 있는 뇌 실질에 두어, 고랑 또는 뇌실에 들어가는 것을 막는다. 72 밀리리터의 인간 LIF를 1 μg/mL로 시린지 펌프를 이용하여 96시간에 걸쳐 카테터를 통해 주입한다.

실시예 18: 중합체 비이드 하에서의 BMP -4 투여를 이용한 재발성 다형성 교모세포종의 치료

재발성 다형성 교모세포종을 앓는 환자를 선택한다. 종양 절제 후, BMP-4 포화 폴리아크릴 비이드(1주간에 걸쳐 BMP-4를 방출함)를 절제 부위에 이식한다.

실시예 19: GBM 표본으로부터의 세포 내 BMPR 의 발현

GBM 조직으로부터 유래된 세포 내 BMP 및 이의 수용체(BMPR) 전사체 및 단백질의 발현을 GBM 조직에서 유래된 CD133+ tNSC 집단에 대해 평가하였다(Singh, S. K. 등, Nature 432, 396-401 (2004)). 하기 시험관내 데이터는 한 대표적 GBM 표본으로부터의 세포로부터 입수된 데이터를 나타내나, GBM로부터 급성 단리되거나 미토겐과 함께 짧게 배양한 후(배양된 세포)의 CD133+ 분류 또는 비분류 세포를 포함하는 4가지 부가적 샘플에서도 균등한 결과가 얻어졌다(Galli 등, Cancer Res 64, 7011-21 (2004); Singh, S. K. 등, Nature 432, 396-401 (2004)). 3개의 모든 BMPR 서브타입(BMPR1A, -1B, -2) 및 BMP에 대한 전사체가 급성 해리된 GBM 세포 및 배양된 GBM 세포의 모두에서 발견되었다. 도 11A(도면에서, 레인 1은 음성 대조군이고, 레인 2는 급성 해리된 GBM CD133+ 세포이며, 레인 3은 배양된 GBM CD133+ 세포이며, 레인 4는 양성 대조군으로서의 MCF7 세포임)를 참조한다. 또한, 동족 수용체 및 BMP-4 단백질이 양 집단 모두, 즉 CD133+ 분획 및 CD133- 분획 모두에서 발견되었다. 새로 단리된 CD133+ GBM 세포(도 11B-D) 및 배양된 CD133+ GBM 세포(도 11E-G)에서의 표시된 단백질의 면역 형광을 나타내는 도 11B-G를 참조한다.

Smad 1-5-8 인산화가, 가장 효과적인 리간드 중 하나인 포화 농도(100 ng/ml)의 BMP-4를 첨가한 후에 관찰되는 바, BMPR은 기능적이었고, 반면 p38 MAPK 경로의 활성화는 검출되지 않았다. GBM 세포 내 표시된 시점(분)에서의 수용체-활성화 Smad 단백질(안티포스포Smad 1,5,8)의 인산화 및 핵내 이동을 나타내는 도 12H-J를 참조한다.

도 11K-P는 표시된 단백질의 웨스턴 블로트 분석을 나타낸다. 도 11K는 급성 해리된 CD133+ GBM 세포(죄측 레인) 및 배양된 CD133+ GBM 세포(우측 레인) 내의 BMP-4 단백질을 나타낸다. 도 11L은 SmadI 수준이 BMP-4 처리 배양된 세포에서 변화되지 않음을 보여준다(좌측 레인은 대조군이고, 우측 레인은 BMP-4 처리군임). 도 11M-N은 새로 해리된 세포(도 11M) 및 배양된 세포(도 11N)에서 BMP-4의 존재 하에서의 증가된 Smad 1,5,8 인산화를 보여준다(좌측 레인은 대조군이고, 우측 레인은 BMP-4 처리군임). 도 11O-P는 배양된 GBM 세포(도 110) 및 급성 해리된 GBM 세포(도 11P)에서의 증가된 Smad4 발현을 나타낸다(좌측 레인은 대조군이고, 우측 레인은 BMP-4 처리군임).

이 결과는 또한, Smad 1,5,8 복합체가 또한 GBM의 치료를 위한 유용한 치료 표적이 될 수 있음을 보여준다. 예를 들어, 복합체의 인산화를 증가시키는 치료제는 tNSC에 대해 BMP-4와 동일한 영향을 가질 것이다. 그러한 치료제를 수득하기 위해, 본원의 다른 부분에 개시되어 있는 스크리닝 방법을 사용할 수 있다.

실시예 20: GBM tNSC 에 대한 BMP -4 노출의 영향의 연구

GBM으로부터 단리된 세포에 대한 BMP-4의 영향의 본질을 연구하였다. 수모세포종(Graham 등, Mol Cell Neurosci 8, 76-83 (1996))을 포함한, 다른 세포 시스템(Hallahan 등, Nat Med 9, 1033-8 (2003); Zuzarte-Luis & Hurle, Semin Cell Dev Biol 16, 261-9 (2005); Hruska 등, Circ Res 97, 105-14 (2005))과 달리, BMP-4는 세포 사멸(프로피듐 요오다이드 배제에 의해 측정됨) 또는 세포 괴사(TUNEL 검정에 의해 측정됨)를 발생시키지 않았으나, 미토겐에 대한 반응으로 GBM 세포의 증식(Ki67 면역형광에 의해 측정됨)을 유의적으로 감소시켰다. 도 12A는 GBM 배양액 내 BMP-4의 영향을 그래프에 의해 나타낸다(비어진 열은 대조군 배양액이고, 흑색 열은 BMP-4 처리군이며; 평균±SE, n=3; * p,0.005; PI=프로피듐 요오다이드).

증식에 대한 다른 BMP의 영향도 또한 검정하였다. GBM 세포의 성장에 대한 다른 BMP(100 ng/ml)의 영향을 보여주는 도 15를 참조한다. BMP-2, -4, -5, -6, -7, -8b는 세포 성장을 억제하는 반면, BMP1, -3 및 -3b는, 역시 비효과적인 TGFβ1 및 2, 및 TGFβ1.2(키메라 TGFβ 작용자 폴리펩티드)(모두 100 ng/ml임)와 유사하게, 비효과적인 것으로 보인다. * p<0.005 BMP 대 대조군, 평균±SE n=3, 2-테일 스튜던트 t-테스트; ** p<0.001 BMP4 대 대조군, 평균±SE n=3, 2-테일 스튜던트 t-테스트. 따라서, BMP-2, -4, -5, -6, -7, -8b는 또한 본 발명의 방법 및 조성물, 특히 GBM의 치료를 위한 상기 방법 및 조성물에 유용할 것이다.

BMP-4의 항증식 효과는 세포 사이클 분석에 의해 확증되며, BMP-4에 대한 반응으로 S 상태의 세포의 퍼센티지의 감소 및 G0/G1 상의 GBM 세포의 수의 유의적 증가가 나타났다. BMP4와 달리, BMP의 신호전달 경로와 중첩되는 신호전달 경로(Canalis 등, Endocr Rev 2, 218-35 (2003);Golestaneh 등, Oncogene 24, 5722-30 (2005))를 이용하고, 프로- 또는 안티모틱(antimotic) 효과(Jennings 등, J Neurooncol 36, 123-40 (1998))를 도출하여, GBM 세포에서 발견되는 TGFβ(Kjellman 등, Int J Cancer 89, 251-8 (2000))는 GBM 세포 증식에 영향을 주지 않았으며, 이는 본원에 기재된 BMP4 작용의 특이성의 기저를 이룬다.

2가지 정통적 검정, 즉 콜로니 형성 지수를 결정하여, 클론-형성 신경 전구체의 퍼센티지를 측정하는 한 검정(Gritti 등, J Neurosci 16, 1091-100 (1996); Reynolds 등, Dev Biol 175, 1-13 (1996)), 및 성장 역학 데이터에 기초하여 NSC 풀의 크기의 팽창도를 측정하는 다른 한 검정(Galli 등, Development 129, 1633-44 (2002); Reynolds 등, Nat Methods 2, 333-6 (2005))의 결과, BMP-4의 세포증식억제 효과가 GBM 세포 내의 tNSC 집단에 해를 준다는 것이 확인되었다. BMP-4에 48시간 노출한 결과, 시험관내 GBM 세포에서의 콜로니 형성 지수(총 플레이팅 세포 대비 형성된 클론의 %)가 75% 초과 감소가 나타났다(대조군 및 BMP-4 처리 GBM 세포(양자 모두 급성 해리되고 배양됨)에 대한 콜로니 형성 지수를 그래프에 의해 나타낸 도 12B(평균±SE, n=3; * p<0.005)를 참조한다. 또한, 일차적 종양 표본으로부터의 단리 직후에 BMP-4에 GBM 세포를 노출시키면, 그것의 배양액 내 확대 능력이 없어지고, 한편 BMP4를 시험관내 이미 확대되고 있는 GBM 세포에 노출하면 그 성장 속도가 상당히 감소되었다. 신경구 검정을 이용한 시험관내 GBM 세포의 전파를 그래프로 나타내는 도 12C를 참조하며, 이는 급성 해리된 GBM 조직로부터의 세포가 BMP-4의 존재 하에 일련 2차 배양될 수 없음을 나타낸다(흑색 점선 및 흑색 삼각형). 도 12C는 또한 동일한 조건 하에서 짧게 확대된 후(마름모), BMP-4로 처리된 동일한 급성 해리된 조직으로부터의 세포가 또한 그 성장 곡선의 기울기를 유의적으로 감소시킴을 보여주었다(사각형). BMP4-처리 인간 태아 NSC에 대해 유사한 효과가 보여졌고(도 12C 참조, 흑색 별(대조군) 대 흑색 원(BMP-4)), 한편 U87 인간 신경교종 선(BMPR를 가지지 않음)은 영향을 받지 않았다(도 12C 참조, 열린 삼각형, 대조군 대 십자형(BMP-4)).

세포형광측정 분석은, BMP4를 이용한 처리가, 급성 해리된 GBM 세포 및 배양된 GBM 세포 모두에서 CD133+ 집단의 크기가 거의 절반이 되도록 하였음을 보여주었다(도 12A 참조). 더불어, 이 데이터는 BMP-4가 GBM 세포 내 tNSC 집단을 표적으로 할 수 있음을 가리킨다.

GBM 세포의 BMP-4에의 노출로 시험관내 명백한 형태적 변화가 초래되었다. 미토겐 단독으로 성장한 세포에 비해, BMP4를 또한 주입한 세포는 더욱 분화된(정교한 공정으로, 편평, 암 형태(phase dark)를 가졌다. 대조군 세포를 나타내는 도 13A, 및 BMP-4에 48시간 노출된 후의 세포를 나타내는 도 13B를 참조한다. 따라서, 뉴런(βIII-튜불린 및 MAP5) 또는 희소돌기신경교(GalC) 마커에 대한 표지의 덜 집중적인 증대와 더불어, 성상교세포 마커의 발현의 상당한 증가(GFAP-면역반응성[IR])가 관찰되었다. 도 13C-H를 참조한다. 구체적으로, 도 13C(대조군) 및 도 13D(BMP-4)는 GFAP-IR을 보여주고; 도 13E(대조군) 및 도 13F(BMP-4)는 βIII-튜불린 IR을 보여주며; 도 13G(대조군) 및 도 13H(BMP-4)는 GalC IR을 보여준다.

미분화된 증식 GBM 배양액 내, 또한 동일한 세포 내에서의 뉴런 및 신경교 항원의 이상(aberrant) 발현(이 두 현상은 정상 신경 줄기 세포에서는 관찰되지 않음)으로 인해, 특정 분화 마커를 발현하는 세포를 계수함으로써 BMP4의 영향을 정량화하는 것이 어렵다. 그러므로, 세포형광측정 분석을 이용하여, 형광 신호 강도를 측정하였고, 이에 대조군에 비해 BMP-4-처리 배양액이 GFAP-IR의 2배 초과 증가(도 13I 참조)와, βIII-튜불린 및 GalC 면역반응성의 일관되나 유의적이지 않은 증가(각각 (도 13J 및 도 13K)를 나타냄이 밝혀졌다(MEFL = 균등 플루오레신의 분자; MEFE = 균등 파이코에르티린의 분자).

이론 또는 가설에 의해 제한되고자 함은 아니나, 여기 기재된 BMP-4의 영향이, 그 자체가 tNSC이거나, 더 이상 줄기 세포 성질을 보유할 수 없게 되는 tNSC의 분획의 분화인 2개의 동일한 딸세포를 생성시키는 대칭 분열의 수의 감소를 통해 비롯되는 것으로 판단된다. 이와 더불어, 이는 BMP-4가 미토겐성 자극을 압도하여, tNSC에 의해 더 성숙하고 덜 종양발생성인 표현형을 습득하도록 할 수 있음을 제안한다. 이 효과는, BMP-4가 줄기 세포 풀 및 확대 속도를 증가시키는 인간 ES 세포에 대한 항-분화 효과를 발휘하기 때문에, 예상되지 못한 것이다.

실시예 21: BMP -4는 GBSC 의 종양발생 가능성을 억제하고, 생체내 전달될 수 있음

급성 해리된 CD133+ GBM 세포 및 배양된 CD133+ GBM 세포 모두를 배양액 내 48시간 동안 BMP-4에 노출한 후, 면역결핍 scid/bg 마우스에 편측 줄무늬체 주사(3×10⁵ 생육가능한 세포)를 행한다. 종양 형성 및 확대를, 동일한 조건 하에, 단 BMP-4로 처리하지 않고 유지된 GBM 세포를 주입한 대조군 동물에서의 종양 형성 및 확대와 비교하였다.

미처리 GBM 세포를 주입한 모든 동물들은 주사한 측에 잘 확립된 종양 덩어리를 발달시켰다(도 14A 참조). 이는 표시된 핵 정형(nuclear atypia), 이상 신경교 요소의 발현, 광범위한 신생혈관화 및 높은 체세포분열 활성을 포함한 특징적 교모세포종 특성을 나타냈고(Galli 등, Cancer Res 64, 7011-21 (2004)), 가쪽, 세 번째 및 네 번째 뇌실을 침입하였다. 그와 반대로, BMP4-처리 세포는 침입성 종양을 형성하지 않았으나, 주사 부위에 국한된, 작고 국한되지 않은 병변은 낮은 체세포분열 지수를 가졌고, 심실 침입을 나타내지 않았다(도 14B 참조). 주사후 3개월 내지 4개월 후, 모든 대조군 동물이 치사하였고, 반면 BMP-4로 예비 처리된 세포를 주입한 실질적으로 모든 마우스는 생존하였다(처리전(좌측 패널), 동시처리(중앙 패널) 및 처리후(우측 패널) 유형(로그랭크 테스트(Logrank test), 각기 p<0.001, p<0.001, 및 p<0.005)으로 생존율을 그래프에 의해 나타내는 도 14J 참조). BMP-4-처리 GBM 배양액으로부터의 나머지 CD133+ 분획을 FACS에 의해 정제하고 그것의 종양발생성을 대조군 GBM 세포로부터 정제된 동등한 수(1.5×10⁵ CD133+ 세포/동물)의 CD133+ 세포의 종양발생성과 비교하였을 때에도 동일한 결과가 관찰되었다. 또한, 과거에 나타난 바와 같이(Galli 등, Cancer Res 64, 7011-21 (2004); Singh 등, Nature 432, 396-401 (2004)), 급성 해리된 대조군 GBM 세포를 주입한 마우스의 뇌로부터의 CD133+ tNSC를 항상 재배양할 수 있었다(평균 콜로니 형성 빈도: 9.0±1.3% [n=2, 이식후 90일]). 이는 scid / bg 마우스의 뇌로 뇌내 이식될 때, 큰 2차 종양을 발생시켰다. 이와 반대로, 이는 동물에 대해 일차 이식에서 BMP-4-예비 처리 GBM 세포를 주입하였을 때에도 가능하지 않았고, 이 동일 마우스로부터의 일차적 종양으로부터 급성 해리된 3×10⁵ 세포를 직접 주사함으로써 2차 종양을 확립할 수 없었다.

조합해보면, 이 발견 내용들은 심지어 BMP-4에의 일시적 노출도 GBM tNSC 집단을 고갈시키고, GBM 세포의 생체내 종양-개시 능력을 현저히 감소시킴을 입증한다. 또한 실시예 13를 참조한다.

실시예 22: BMP -4의 생체내 전달은 뇌내 종양 확립 및 성장을 방지함

이어서, BMP-4의 생체내 전달을 뇌내 종양 확립 및 성장을 방지하기 위한 치료로서 평가하였다. GBM의 이식은, 세포와 동일한 시간에(동시 처리 유형) 또는 10일 후에(처리 후 유형)으로, 세포의 생착(engraftment) 부위에, 비히클-(대조군) 또는 BMP-4-포화 폴리아크릴 비이드(1주간 BMP-4 방출)를 주사하는 것을 동반하였다. 양 처리에 있어 조직학적 일련의 재구성은, 대조군에 비해 BMP-4-처리 동물에서 종양 덩어리가 최대 확대의 유의적 감소를 나타냈다. 구체적으로, 모든 실험 세팅에서, 대조군 비이드를 주입한 동물은 큰 악성 종양을 발달시켰고(도 14C(배양된 GBM 세포, 주사 후 4주, 동시 처리 유형); 도 14E(새로 단리된 GBM 세포, 세포 주사 후 30일, 처리 후 유형), 곧 치사하였으며(도 14J), 반면 BMP4-방출 비이드를 이식한 마우스는 작은 국한된 병변을 나타냈고(도 14D(배양된 GBM 세포, 주사 후 4주, 동시 처리 유형)); 도 14F(새로 단리된 GBM 세포, 세포 주사 후 30일, 처리 후 유형); 유의적으로 더 오래 생존하였다(도 14J). 대조군 종양은 반응성 크로마틴 및 고 악성 침투 세포와 더불어 다형성의 고 신생물성 요소를 포함하였다(도 14G). 그와 반대로, BMP-4-처리 동물은 거의 신생물성이 아닌 세포, 많은 매우 분화된 요소 및 수많은 대식세포를 포함하는 병변을 나타냈다(도 14H). 체세포분열 지수는 BMP- 4-처리 동물에 비해 대조군에서 유의적으로 더 높았다(동시 처리: 대조군 3.8±0.2 대 BMP-4 0.20±0.1; p<0.01. 처리 후: 대조군 4.3±0.3 대 BMP4 0.7±0.3; p<0.05, 평균±SE, n=4, 2-테일 스튜던트 t-테스트). 생체내 면역형광은 대조군 및 BMP4-처리 종양 모두에 있어, 성상교세포 및 네스틴-양성 세포의 존재를 나타냈으나, 희소돌기아교세포 또는 뉴런 세포의 존재는 나타나지 않았다.

이 결과는, BMP-4를 방출하거나 그와 다른 방식으로 전달하는 장치의 뇌내 이식이 인간에게 있어 GBM를 치료하는데 효과적일 것임을 가리킨다.

실시예 23: 중성화 BMP -4 항체 연구

실시예 19는 내인성 BMP4 및 기타 BMP가 GBM 세포에서 발견됨을 보여준다. 상기 실시예들에 제시된 결과와 일치하게, 중성화 항-BMP4 항체는 tNSC 증식을 증가시킨다. 이는, 내인성 BMP가 생체내 GBM 세포에 대해 생리적으로 작용할 수 있으며, 다만 그 효과는 종양 성장을 중지시키기에 불충분함을 가리킨다. 이 현상 배후의 메커니즘, 예를 들어 종양 내 내인성 BMP 길항자의 가능한 존재(Canalis 등, Endocr Rev 2, 218-35 (2003))의 연구는 GBM의 치유에 대한 대안적 전략에 관한 것일 수 있다. 또한, BMP, 그것의 동족 수용체 및 그것의 관련 세포내 형질도입 메카니즘, 특히 Smad 경로가 GBM 확립 및 확대의 주요 원인이 될 수 있는 세포를 보다 특이적으로 대상으로 하는 유망 표적으로 알려지고 있다.

실시예 24: 일차 배양, 배양 전파, 클로닝 및 세포주 확립

문헌 [Galli 등, Cancer Research (2004) 64: 7011-7021]에 기재된 바와 같이 종양 샘플을 가공함으로써 GBM 세포를 수득하였다. 급성 해리된 세포를 CD133에 대한 그것의 면역반응성에 대해 분류하고(하기 참조), 25 cm² 조직 배양 플라스크에서, 뉴로컬트

NS-A 무혈청 매질(스템 셀 테크놀로지즈) 내 2500개 세포/cm²의 최종 농도로 플레이팅하였다. 문헌 [Galli 등, Development 129, 1633-44 (2002)]에 과거 기재된 동일 조건을 이용하여, 배양 전파, 콜로니 형성 검정 및 집단 분석을 수행하였다. 급성 해리된 CD133+ GBM 세포를 BMP4로 예비 처리하기 위해, 이를 미토겐이 없거나(대조군) 100 ng/ml의 BMP4를 함유하는 동일 매질에 48시간 동안 플레이팅한 후, 이식하였다.

실시예 25: 면역세포화학( Immunocytochemistry )

2.5×10⁴ 세포/cm² GBM 세포를 FGF2/EGF의 존재 하에 마트리겔-코팅 유리 커버슬립 상에 플레이팅하고, 48시간 동안 BMP4(100 ng/ml)로 처리하였다. 이어서, 세포를 세정하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하였다(10분). 신경 항원에 대한 다중 면역형광(GFAP, 다코 코포레이션(Dako Corporation); Tujl, 바브코(Babco); Galc, 케미콘(Chemicon))을 문헌 [Galli 등, Cancer Research (2004) 64: 7011-7021]에 기재된 바대로 수행하였다. Ki67 염색(1:1000, 노보카스트라(NovoCastra)(영국 뉴캐슬 소재)으로써 증식하는 세포를 검출하였다.

4% 파라포름알데히드로 고정한 후, BMPR-1A, -1B 및 -2에 대한 면역염색을 제조업자의 사용설명서(1:50 R&D 시스템즈(R&D Systems))에 따라 수행하였다. 포스포-Smad 1(1:100 셀 시그널링(Cell Signaling)(미국 매사츄세츠주 비버리 소재))에 대한 염색 시에, 세포를 상이한 시간들(5분 내지 2시간)에서 BMP-4(100 ng/ml)로 처리하였다. 적당한 이소타입 또는 음성 대조군이 항상 이 절차 전반에 걸쳐 포함되었다. 플루오레신-dUTP TUNEL 검정(인 시츄 세포 사멸 검출 키트, 플루오레신, 로쉐 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))를 이용하여, 문헌 [Gavrieli 등, J Cell Biol 119, 493-501 (1992)]에 의해 도입된 원래의 TUNEL 방법의 디곡시게닌(digoxigenin)-기재 변형법을 이용하여, 세포 괴사성 세포를 검출하였다. 간략히, 12-mm 커버슬립에 성장한 세포를 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드에서 고정한 후, PBS로 헹구었다. 이어서, 세포를 얼음에서 2분 동안 투과화한 후, 50 ul의 TUNEL 반응 혼합물로 표지하고, 파라필름 커버슬립 하에 습윤화실에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. PBS로 세정한 후, 슬라이드를 DAPI-함유 벡타쉴드(Vectashield)^TM에 올려놓고, 형광 현미경으로 조사하였다. 프로피듐 요오다이드(PI) 염색을 위해, 세포를 실온에서 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS로 헹구며, 실온에서 5분 동안 PI(1 ug/ml)와 함께 인큐베이션하였다. 세정 후, 커버슬립을 DAPI-함유 벡타쉴드^TM에 올려놓고, 형광 현미경으로 조사하였다. PI 배제는 생육가능한 세포를 나타냈다. 실시예 19에서의 검정을 위해, 샘플을 각 시험 조건 하에 6벌로 운용하였다.

실시예 26: 통상적 및 실시간 PCR

트라이졸(TRIzol) 시약(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies; 미국 매릴랜드주 로크빌 소재))을 이용하여, 배양된 GBM 세포 및 급성 해리된 GBM 세포로부터 총 RNA를 단리하였고, 슈퍼스크립트 리보뉴클레아제 H-역전사효소(라이프 테크놀로지즈)를 이용하여 역전사시켰다. 통상적 PCR 반응에서 주형으로 사용되는 cDNA의 양을 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로나제(GAPDH)를 기준으로 하여 정규화하였다. MCF-7 세포주를 BMPR에 대한 양성 대조군으로 사용하였다. PCR 생성물을 에티디움 브로마이드로 염색된 아가로스(1%) 겔 내 전기영동에 의해 가시화하였다.

정량적 RT-PCR 반응을 브릴리언트

SYBR

그린 QPCR 코어 시약 키트(스트라타젠, 미국 캘리포니아주 라졸라 소재)를 이용하여 3벌로 수행하였다. SYBR 그린 염료는 임의의 PCR 생성물에 결합하므로, 서열 특이적 프로브를 사용할 필요가 없다. 형광 발광을 실시간으로 기록하였다(크로모 4색 실시간 PCR 검출기, MJ 리서치, 바이오-래드). 유전자 발현 프로파일링을 상대 정량화의 비교 Ct 방법을 이용하여 완료하였다. 상대적 RNA 양을 2개의 내인성 대조군, 즉 GAPDH 및 18S 리보솜내 RNA(18S rRNA)로 정규화하였다.

통상적 PCR을 위해, 하기 프라이머를 사용하였다: BMP4, 전방향: 5'-cttcagtctggggaggag-3', 역방향: 5'-gatgaggtgcccaggcac-3'; BMPR1A, 전방향: 5'-aatggagtaaccttagcaccagag-3', 역방향: 5'-agctgagtccaggaacctgtac-3'; BMPR1B, 전방향: 5'-ggttgcctgtggtcacttctgg-3', 역방향: 5'-tagtctgtgattaggtacaactgg-3'; BMPR2, 전방향: 5'-tcagatatatggcaccagaagtg-3', 역방향: 5'-gtggagaggctggtgacacttg-3'; GAPDH, 전방향: 5'-cggagtcaacggatttggtcgtat-3', 역방향: 5'-agccttctccatggtggtgaagac-3'. PCR 증폭 조건은 35 사이클로 구성되고, 프라이머는 56℃에서 어닐링하였다.

RT-PCR을 위해, 하기 프라이머들을 사용하였다: BMPR1A, 전방향: 5' -caggttcctggactcagctc-3', 역방향: 5'-ctttccttgggtgccataaa-3'; BMPR1B, 전방향: 5'-aaaggtcgctatggggaagt-3', 역방향: 5'-gcagcaatgaaacccaaaat-3'; BMPR2, 전방향: 5'-gctaaaatttggcagcaagc-3', 역방향: 5'-cttgggccctatgtgtcact-3'; GAPDH: 통상적 PCR에 대해 기재된 바와 동일한 프라이머를 사용하였다: 18S rRNA, 전방향: 5'-agtccctgccctttgtacaca-3', 역방향: 5'-gatccgagggcctcactaaac-3'. 프라이머의 특이성을 해리 곡선 분석에 의해 매 PCR 실행에 대해 확인하였다(옵티콘(Opticon)

2 및 크로모4(Chromo4)^TM 실시간 시스템 소프트웨어, MJ 리서치). RT-PCR 증폭 조건은 40 사이클로 구성되고, 프라이머는 56℃에서의 어닐링하였다.

실시예 27: 웨스턴 블로팅

냉 PBS로 배양된 GBM 세포 및 급성 해리된 GBM 세포를 세정하고, 500 μl의 IX 샘플 완충액(62.5 mM 트리스 HCl, pH 6.8, 25℃; 2% w/v SDS; 10% 글리세롤; 50 mM DTT; 0.01% w/v 브로모페놀 블루)을 이용하여 분해시킴으로써, 단백질을 수확하였다. 샘플을 얼음 상에서 인큐베이션하고, -20℃에서 저장하였다. 분취량을 5분 동안 비등하고, 얼음 상에서 인큐베이션하며, 20 μl/레인을 SDS-PAGE 겔(10 cm×10 cm)에 로딩하였다. 이어서, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 TBS 중 5% 밀크 파우더/0.1% 트윈으로 실온에서 1시간 동안 블로킹하고, 15 ml의 TBS/0.1% 트윈으로 3회 세정하였다. 이어서, 블롯을 항-Smad 1-5-8(1:1000; 셀 시그널링), 항-포스포 Smad1-5-8(1:1000; 셀 시그널링), 항-Smad4(1:200; 산타 크루즈(Santa Cruz)), TBS 중 5% 밀크 파우더/0.1% 트윈 내 항-BMP4(1:400, 케미콘(Chemicon))와 함께 인큐베이션하였다. 모든 블롯에 대해, 막을 15 ml의 TBS/0.1% 트윈으로 3회 세정한 후, TBS 중 5% 밀크 파우더/0.1% 트윈 중 적당한 호스래디쉬 접합 2차 항체(1:1000, 아머샴(Amersham))와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 밴드를 화학발광(ECL; 아머샴)에 의해 가시화하였다.

실시예 28: 유세포분석

p38 및 Smad 1-5-8의 인산화 상태를 결정하기 위해, 세포 제제를 원심분리하고, 0.5 ml의 PBS 및 0.5 ml의 4% 파라포름알데히드에 10분 동안 37℃에 재부유시켰다. 이어서, GBM 세포를, 완만한 보어텍싱 하에 빙냉 100% 메탄올을 예비 냉장 세포에 천천히 첨가하여, 90% 메탄올의 최종 농도가 되도록 함으로써, 투과화하였다. 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하고 원심분리한 후, 세포를 3 ml의 PBS 중 0.5% 소 혈청 알부민(BSA, 시그마(Sigma))로 2회 세정하고, 150 ul의 PBS에 재부유시키며, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 이를 항-포스포 Smad 1-5-8 토끼 다클론성 항체(셀 시그널링)의 1:50 희석액, 또는 포스포-p38 MAP 키나제 토끼 다클론성 항체(셀 시그널링)의 1:50 희석액에 실온에서 1시간 동안 암 상태에서 노출하였다. 철저히 세정한 후, 염소 항-토끼 Ig FITC-표지 항체(BD, 파미젠(Pharmingen))의 1:800 희색액을 첨가하고, 각 튜브를 실온에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. PBS 중 3 ml의, 0.5% BSA(시그마)로 2회 세정한 후, 세포를 0.5 ml의 PBS에 재부유시키고, 유세포분석에 의해 분석하였다. 이 모든 검정을 위해 관례적으로 자가형광 및 이소타입 콘트롤을 수행하였다.

세포 사이클 분석을 위해, 1백만개의 배양된 GBM 세포 및 급성 해리된 GBM 세포/샘플을 표시된 시간 동안 BMP4(100 ng/ml)로 처리하였다. 이어서, GBM 세포를 동 체적의 빙냉 PBS 및 100% 에탄올에 재부유시키고, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 세포 펠렛을 PBS로 3회 세정하고, 5분 동안 원심분리하였다. 이어서, GBM 세포를 리보뉴클레아제(12.5 ug /ml; 시그마) 및 프로피듐 요오다이드(3 ug/ml; 시그마)를 함유하는 1 ml의 PBS에서 암 상태에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고, 유세포분석에 의해 분석하였다.

CD133 발현의 정량화를 위해, 7-아미노 악티노마이신 D(7 AAD)을 이용하여 이중-염색(double-staining) 유세포분석을 수행하여, 생육가능한 세포를 확인하였다. PBS로 세정한 후, 문헌 [Toba 등, J Immunol Methods 182, 193-207 (1995)]에 기재된 바와 같이, GBM 세포를 7AAD 표지 완충액(0.15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% BSA 및 0.004% 사포닌 함유의 0.1 M 포스페이트-시트레이트 완충액, pH 6.0)에 재부유한 후, 최종 농도가 20 uM가 되도록 7AAD를 첨가하였다. 5 내지 7분 동안 7AAD를 인큐베이션한 후, GBM 세포를 4℃에서 30분 동안 단클론성 CD133/1(CD133)-PE 접합 항체 (1:40, 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))와 함께 인큐베이션하고, 1 ml의 성장 배지로 세정하였다. 이어서, 세포를 5분 동안 500×g로 원심분리하고, 0.5 ml의 성장 배지에 재부유시키며, 유세포분석에 의해 분석하였다. 또한, 또 다른 단클론성 CD133/2(293C3)-PE 접합 항체를 이용하여 동일한 분석을 또한 수행함으로써, 동일한 결과를 산출하였다.

CD133/1(CD133)-PE 접합 및 CD133/2(293C3)-PE 접합 항체의 동일한 희석액을 이용하여, GBM 세포 분류(MoFlo 고성능 세포 분류기, 다코사이토메이션(DakoCytomation))을 수행하였다. Singh 등에 의해 기재된 바대로(Nature (2004) 432:396-401), 분류된 세포를, 동일한 항체를 이용하여 FACSCalibur 기기(BD 바이오사이언시스(BD Biosciences))를 사용한 유세포분석에 의해 순도에 대해 분석하였다. 순도는 양성 및 음성 CD133 분획 모두에 대해 87% 이상이었다.

신경교 아교원섬유산성 단백질(GFAP), βIII-튜불린 및 갈락토세레브로시드 C(GalC, 경우에 따라 "GC"로도 칭해짐) 정량화를 위해, 레인보우 교정 입자 혼합물(rainbow calibration particle mixture)(8 피크)(3.0 내지 3.4 um)(BD 바이오사이언시스)를 교정을 위해 사용하고, 세포 표지의 강도를 균등 파이코에리트린(MEPE)의 분자 또는 균등 플루오레신(MEFL)의 분자로서 표시하였다. 간략히, 세포내 염색을 위해, 세포를 실온에서 20분 동안 0.5 ml의 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm) 용액(BD 바이오사이언시스)에 의해 투과화하였다. 세포를 2 ml의 BD 펌/워시 1X(BD 바이오사이언시스)로 세정하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 원심분리 후, 그것을, 적절한 일차적 항체 믹스를 함유하는 0.2 ml BD 펌/워시 용액 1X(BD 바이오사이언시스)에 재부유시켰다. 막 항원을 위해, 세포를 0.2 ml의 성장 배지에 재부유시킨 후, 일차적 항체인 1:400 다클론성 항-GFAP(다코 코포레이션(Dako Corporation)), 단클론성 항-βIII-튜불린(바브코(Babco)), 및 단클론성 항-galC(케미콘(Chemicon))와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세정하고,4℃에서 30분 동안 2차 항체에 노출하였다. 세포내 항원의 경우, 이는 1:800 염소 항-토끼 Ig FITC-표지 또는 염소 항-마우스 IgG R-PE-표지 항체(BD, 파미젠)였고, 한편 막 항원의 경우, 1:1000 FITC-접합 F(ab')2 염소 항-마우스 IgM 또는 FITC-접합 염소 항-마우스 IgM(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch))을 사용하였다. 철저히 세정한 후, 세포를 재부유시키고, 유세포분석에 의해 분석하였다.

상기 모든 검정들을 위해, 셀퀘스트(CellQuest) 소프트웨어(BD 바이오사이언시스)를 이용하여. 유세포분석 (FACSCalibur, BD 바이오사이언시스)에 의해 분석을 수행하였다. 특이적 일차적 항체를 특이적 이소타입 콘트롤로 치환함으로써 배경 형광을 평가하였다. 또한 각 시험 조건 하에서 관례적으로 자가형광을 수행하였다.

실시예 29: 동소성 ( orthotopic ) 주사 및 면역조직화학에 의해 종양발생성의 평가

대조군 조건 하에서 성장되거나 48시간 동안 100 ng/ml의 BMP-4를 추가 첨가하여 성장한 GBM 세포를 동소성 이식함으로써, 종양발생성을 결정하였다. 이식 전에, 세포를 세정하고, PBS(10⁸ 세포/ml)에 재부유시켰다. 3 마이크로리터를, 문헌 [Galli 등, Cancer Research (2004) 64: 7011-7021]에 과거 기재된 바대로, 면역결핍 마우스의 좌측 줄무늬체에 입체정위적으로 주사하였다. BMP-4-로딩 헤파린 아크릴 비이드(100 비이드/동물; 시그마-알드리히(Sigma-Aldrich))를 이용하여, BMP-4의 중합체-기재 전달을 수행하였다. 이식(transplantation) 전, 비이드를 PBS 단독 또는 0.65 μg/μl의 BMP4를 함유하는 PBS에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, PBS로 2 X 3회 철저히 헹군 후, 이식(implantation)하였다. 문헌 [Galli 등, Cancer Res 64, 7011-21(2004)]에 과거 기재된 바대로, 헤마토자일린 및 이오신 염색 및 면역조직화학을 파라핀-포매 4 um-두께의 마이크로톰 구획에 대해 수행하였다.

기간(x-축) 동안의 누적 생존 가능성(y-축)의 하향으로 기우는 플롯을, 소프트웨어 MedCalc(마리아케르케(Mariakerke), 벨기에)을 이용하여 수행하였다. 로그랭크 테스트에 의해 생존율의 유의적 차를 구하였다.

Claims

표적 종양 줄기 세포 및 표적 종양 선조 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포 유형의 과도하거나 이상 제어된 세포 증식을 특징으로 하는 피험체내 신경종양 치료용 약학 조성물로서,
상기 약학 조성물은 백혈병 억제 인자(LIF, Leukemia Inhibitory Factor) 제제 및 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포에서 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR)-매개 신호전달을 증가시킬 수 있는 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유효량의 작용제를 포함하고,
상기 유효량의 작용제는 표적 종양 줄기세포 또는 표적 종양 선조 세포 집단의 크기, 콜로니 형성 지수, 또는 성장 속도 중 적어도 하나를 비가역적으로 감소시켜, 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포의 과도하거나 이상 제어된 세포 증식을 억제하는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 종양이 뇌 종양인 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 뇌 종양이 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme)인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 작용제가 백혈병 억제 인자(LIF) 제제인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 작용제가 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포에서 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR)-매개 신호전달을 증가시킬 수 있는 분자인 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물이 뼈 형성 단백질(BMP, Bone Morphogenetic Protein) 제제를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학 조성물이 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포에서 BMP 수용체(BMPR)-매개 신호 전달을 증가시킬 수 있는 분자를 더 포함하는 것인 약학 조성물.
제6항 또는 제7항에 있어서, 백혈병 억제 인자(LIF) 제제 또는 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포에서 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 매개 신호전달을 증가시킬 수 있는 분자와의 병용 사용이 시너지 효과를 생산하는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유효량의 작용제는 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포에서 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 매개 신호전달을 증가시킬 수 있는 것인 약학 조성물.
제9항에 있어서, 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포에서 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 매개 신호전달의 증가가 세포 생존, 자가 재생(self-renewal), 대칭 분열, 증식 및 분화 성질들로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포 특성을 조절하는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 백혈병 억제 인자(LIF) 제제는 종양에서 표적 종양 줄기 세포 및 표적 종양 선조 세포로부터 선택되는 적어도 하나의 세포 유형의 양을 감소시킬 수 있는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포에서 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 매개 신호전달을 증가시킬 수 있는 분자는 종양에서 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포의 양을 감소시킬 수 있는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조세포에서 백혈병 억제 인자 수용체(LIFR) 매개 신호전달을 증가시키는 분자는 종양의 성장을 감소시키는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유효량의 작용제는 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포가 대칭 분열을 진행할 가능성을 감소시키는 것인 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 작용제는 백혈병 억제 인자(LIF) 제제이고 상기 종양은 인간 환자 내 다형성 교모세포종인 것인 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 백혈병 억제 인자(LIF) 제제가 종양에서 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포의 분화를 유도하는 것인 약학 조성물.
제15항에 있어서, 상기 제제는 다형성 교모세포종의 절제 공동으로 방출되는 것인 약학 조성물.
제15항에 있어서, 항암화학요법(chemotherapy), 방사선요법, 또는 수술과 병용하여 사용되는 것인 약학 조성물
제1항, 제4항, 제5항 및 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 하나 이상의 중합체성 웨이퍼 또는 하나 이상의 중합체성 비이드와 결합된 것인 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 뼈 형성 단백질(BMP) 제제는 하나 이상의 중합체성 웨이퍼 또는 하나 이상의 중합체성 비이드와 결합된 것인 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 표적 종양 줄기 세포 또는 표적 종양 선조 세포에서 뼈 형성 단백질 수용체(BMPR)-매개 신호 전달을 증가시킬 수 있는 분자가 하나 이상의 중합체성 웨이퍼 또는 하나 이상의 중합체성 비이드와 결합된 것인 약학 조성물.