KR20120139371A

KR20120139371A - 인간 성장호르몬 유래 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20120139371A
Application number: KR1020110059148A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2012-12-27
Anticipated expiration: 2031-06-17
Also published as: KR101285261B1

Abstract

본 발명은 인간성장호르몬-유래 펩타이드 및 이의 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 인간 성장인자 유사 펩타이드는 천연의 인간 성장인자류와 동일한 기능 또는 작용을 하며 천연 인간 성장인자들과 비교하여 피부 투과도가 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 인간 성장호르몬의 활성이 요구되는 피부상태를 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다. 또한, 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있다.

Description

인간 성장호르몬 유래 펩타이드 및 이의 용도{Human Growth Hormone?Derived Peptides and Uses Thereof}

본 발명은 인간 성장호르몬(human growth hormone) 유래 펩타이드 및 이의 조성물에 대한 것이다.

인간 성장호르몬은 동물의 뇌하수체에서 분비되는 단백질로서 191개의 아미노산으로 구성된 펩타이드 호르몬이다. 성장호르몬은 오래 전부터 동물체로부터 분리되어 주로 왜소증(dwarfism, 난장이병) 환자들의 치료에 사용되어 왔다. 과거에는 주로 성장호르몬이 사체의 뇌하수체로부터 추출되어 사용됨으로써 분리 과정에서 다른 질병의 원인균까지 환자에게 유입될 수 있는 위험성이 있어 그 사용이 매우 제한되었으나 최근 유전공학의 발달과 더불어 미생물을 이용한 성장호르몬의 대량 생산 및 공급이 가능해지고 다른 질환의 감염 위험성이 적어짐에 따라, 재조합 성장호르몬을 포함하는 단백질제제가 왜소증 치료제 시장의 대부분을 차지하게 되었다. 재조합 성장호르몬은 주사기를 이용하여 자가 치료가 가능할 정도로 보편화되어 있는데, 주로 근육주사로 투여된다. 투여된 인간 성장호르몬은 혈액을 따라 순환하면서 인체의 각 기관에 영향을 미치는데, 성장기에서의 근육의 증가, 지방의 분해, 장기의 성장, 골격의 성장, 성적인 성숙 등에 관계된다. 이 이외에도 인간 성장호르몬을 생리적인 범위의 혈중 농도로 성인에게 투여 시, 근육의 강화, 복부비만의 감소, 활력 증진, 심장순환계 강화, 운동능력의 향상, 동맥경화의 개선, 노인성 우울증의 개선 등의 효과에 대해 언급이 되고 있다. 인간 성장호르몬의 인체에 대한 효능은 그 자체에 기인하기 보다는 인간 성장호르몬에 의하여 발현이 촉발되어 주로 간에서 생산되어 혈중으로 분비되는 인슐린유사 성장인자-1(Insulin-like Growth Factor-1; IGF-1)의 작용에 의한 효능으로 알려져 있다. 인간 성장호르몬의 혈중 반감기는 15분 내외인 반면에 IGF-1의 혈중 반감기는 20 시간가량으로 작용시간이 훨씬 오래 지속될 수 있는데, 뇌하수체에서 분비된 인간 성장호르몬은 혈중에 존재하는 인간 성장호르몬 결합단백질과 결합하여 혈액순환에 따라 운반되어 인체의 각 조직에 퍼져 있는 인간 성장호르몬 수용체를 만나 결합을 하게 되는데 그 결합에 의한 신호전달의 결과로 IGF-1의 합성과 분비가 촉진되게 된다.

한편, 혈액으로 분비된 IGF-1은 다시 IGF-1 결합단백질과 결합하여 혈류를 타고 돌다가 다시 인체의 각 조직에 퍼져있는 IGF-1 수용체와 결합함으로써 인간 성장호르몬의 분비로 야기된 여러 생리적인 효능을 발휘하게 된다. 재조합 성장호르몬은 대량 생산될 수 있음에도 불구하고 일정한 치료 기간동안 요구되는 비용이 상당하고 주사를 이용하는 불편함으로 인하여 최근에는 다양한 투여 경로별의 제제를 개발하려는 시도들이 활발히 진행되고 있다. 주사제 이외의 제형에 따른 성장호르몬 제제의 기본 요건은 체내에서 흡수율이 높아야 하는 동시에, 선택적으로 성장호르몬 분비를 자극할 수 있는 생물학적 활성도를 지니고 있어야 하는 것이다. 보다 높은 체내 흡수율을 갖기 위해서는 분자량이 작을수록 유리하며, 체내에서 생리 활성 작용을 원활하게 수행하려면 구조적으로도 성장인자와 유사한 기능의 특별한 물리화학적 성질을 가져야 한다.

한편, 많은 논문들에서 인간 성장호르몬의 피부에 관한 효과가 많이 알려져 있는데, 상기 한대로 이미 알려져 있는 대부분의 기능, 특히 피부와 관련된 거의 모든 기능은 IGF-1의 작용에 의한 효과일 것이고, 혈액과 직접 접촉이 가능한 진피세포의 표면에 존재하는 IGF-1 수용체의 작용에 의한 피부 개선효과로 볼 수 있을 것이다. 또 다른 논문에는 표피의 세포층과 모공을 이루는 부대기관 및 조직 전반에 걸쳐 인간 성장호르몬의 수용체가 존재한다는 보고가 있다는 사실도 알려져 있다.

통상적으로 피부를 통하여 효율적으로 전달될 수 있는 분자량은 약 900 dalton 이하라는 일반론이 기본적으로 알려져 있으며 화학적인 침투보조제(Chemical Penetration Enhancers, CPE)의 도움을 받을 경우에도 최대분자량은 약 2 kD 을 넘지 못하는 것이 일반적이다. 이러한 이유로 많은 연구자들은 인간 성장호르몬과 같은 고분자를 정상피부에 도포하여 인간 성장호르몬의 작용에 의한 미용적, 의학적 효능을 높이기 위하여 단백질과 같은 고분자를 정상적인 피부에 도포하여 진피층에 전달하는 방법으로 리포좀 또는 나노좀을 이용하는 방법을 모색해 오고 있다. 많은 문헌들에서 리포좀 또는 나노좀으로 단백질을 싸서 전달하는 경우, 표피층 및 모낭을 통하여 전달된다는 논문이 다수 언급되고 있다. 특히 모낭을 통한 전달에는 리포좀이나 나노좀 형태의 운반체나 지방산과 같은 지질을 포함하는 복합물이 효율적인 것으로 알려져 있으며, 에탄올과 같은 유기용매를 포함하는 수용액이나 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol)과 같은 폴리머 고분자를 포함하는 수용액도 모낭을 통한 전달에 이용된다고 알려져 있다. 모낭을 통한 단백질의 피부 전달의 경우가 많아지고 있으며, 리포좀의 전달 과정에 대한 과학적인 반증도 많이 이루어지고 있는데, 리포좀 자체가 들어가기 보다는 리포좀 내외의 pH 및 전하상태를 포함한 인지질의 종류와 인지질에 부착되어 있거나 인지질이 둘러싸고 있는 단백질의 종류와 모공을 이루는 여러 구성조직의 구성성분, 이들 세 요소의 복합적 상호작용에 의해서 전달효율이 결정된다고 보여진다.

피부조직은 표피와 진피 그리고 피하(hypodermis)로 이루어져 있다. 피부의 성질을 결정짓는 부분은 표피로서 표피는 외부로부터 직접적이고 잦은 손상을 받으므로 표피의 수선과 재생은 매우 중요하다. 사람의 표피는 2 주일에 한번씩 교체되므로 표피를 조성하는 피부 줄기세포의 증식능력은 엄청나다고 할 수 있다. 또한, 피부의 만능줄기세포가 모낭의 지질샘 바로 밑 벌지(bulge) 부위에 위치한다는 보고도 많이 언급이 되고 있는데, 이 벌지 줄기세포는 표피 줄기세포, 모근줄기세포(hair matrix stem cells), 지질샘 줄기세포(sebaceous glands stem cells)를 만드는 근간이 되는 줄기세포이다. 대부분의 표피 줄기세포는 3-6 번을 증식하고 나면 분화의 길을 밟는다. 반면에 벌지 줄기세포는 증식은 다른 세 줄기세포보다 느리지만 사람이 사는 동안 무한정 증식하면서 표피줄기세포, 모근줄기세포, 지질샘 줄기세포를 만드는 동시에 그 자신의 줄기세포 성격을 유지할 수 있는 것으로 보인다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 천연의 인간 성장호르몬과 동일한 또는 유사한 기능 또는 작용을 할 수 있는 우수한 펩타이드를 제조하여 다양한 종류의 성장호르몬-유래 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성(예컨대, 콜라겐, 파이브로넥틴 또는 히알루론산 생성 촉진)이 우수할 뿐만 아니라 피부 투과율이 우수한 펩타이드를 선별함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 인간 성장호르몬 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 천연의 인간 성장호르몬과 동일한 또는 유사한 기능 또는 작용을 할 수 있는 우수한 펩타이드를 제조하여, 다양한 종류의 성장호르몬 관련-유래 펩타이드를 제조 및 스크리닝하였다. 그 결과, 많은 펩타이드 후보물질 중에서 생리활성(예컨대, 콜라겐, 파이브로넥틴 또는 히알루론산 생성 촉진)이 우수할 뿐만 아니라 피부 투과율이 우수한 펩타이드를 선별하였다.

본 발명자들은 천연의 인간 성장호르몬의 기능과 관련 있는 부위를 기초하여 상술한 특성을 나타내는 다수의 성장인자-유래 펩타이드를 합성하였다. 좀더 자세히 살펴보면, 성장인자의 수용체 단백질에 대한 결합가능 부위를 예측하고, 이 예측된 부위의 아미노산 서열을 최적화하여 본 발명의 펩타이드가 제조된다. 수용체 결합가능 예상부위를 검사하여 후보 펩타이드들을 제조하고, 이들 후부 펩타이드들 중에서 가장 생리 활성이 우수한 펩타이드를 스크리닝 함으로써, 본 발명의 펩타이드가 제공된다.

본 발명자들은 컴퓨터를 이용한 유사 검색(Homology Search)와 도킹 방법 등을 통해 이미 알려져 있는 가상의 수용체 단백질과의 결합 가능 부위를 선정하여 후보 펩타이드들을 합성하였다. 선정된 다수의 펩타이드들은 2-클로로-트리틸-레진에 Fmoc-아미노산을 이용한 고체상 합성을 수행한 뒤, 트리플로로아세트산을 이용하여 레진에서 떼어낸 뒤 무수에테르에서 원하는 펩타이드를 수득하였다. 합성한 펩타이드는 정제 및 분석과정을 거쳐 함량과 순도를 점검한 뒤 여러 생물학적 테스트를 거쳐 인간 성장호르몬과 유사한 효능을 가지는 펩타이드를 선정하였다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 최종 펩타이드의 아미노산 서열은 표 1에 기재되어 있으며 인간 성장호르몬에서 유래되었다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 각 성장인자류의 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체내 투여시의 반감기를 증가시킨 높은 반감기를 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합되어 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques)에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer . Chem. Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 세포의 성장 촉진능을 갖는다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 섬유아세포의 성장을 촉진한다. 본 발명에 따르면, 세포에 본 발명의 펩타이드류를 다양한 농도로(예컨대, 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml) 처리하여 72시간 동안 배양시킨 후 세포의 성장을 살펴보면, 본 발명의 펩타이드를 처리하였을 때 섬유아세포에서 농도-의존적으로 섬유아세포의 성장 촉진을 유발하였다(참조: 도 2).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 콜라겐 및 파이브로넥틴, 히알루론산의 생성을 농도-의존적으로 증가시킨다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 피부상태 또는 주름 개선에 매우 우수한 효능을 가진다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물의 경우, 연고 등의 제제를 이용하여 상처 치료에 매우 효과적으로 이용될 수 있다(참조: 도 4a-4c).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 인간 성장호르몬의 활성을 나타내는 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명의 펩타이드는 천연 인간 성장호르몬류 보다 분자량이 훨씬 작기 때문에, 피부 침투율이 매우 우수하다. 따라서 본 발명의 조성물을 국소적으로 피부에 도포하는 경우 피부상태를 효과적으로 개선할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물에 의한 피부상태 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 검버섯 제거, 여드름 치료, 상처제거 및 피부재생 효과이며, 보다 바람직하게는 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 상처제거 및 피부재생 효과이다. 예를 들어, 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 섬유아세포의 증식을 촉진하고, 이들 세포로부터 콜라겐, 히알루론산 또는 파이브로넥틴의 합성 증가를 유도하며, 피부의 상피층 및 진피층의 재생 또는 성장시켜, 결국 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 상처제거, 피부재생 등의 효능을 발휘한다.

본 발명의 조성물은 약제학적 조성물과 화장품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 근육 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-1000 ㎍이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 (a) 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount); 및 (b) 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 화장품 조성물이다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 피부 개선 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

한편, 본 발명의 조성물은 인간 성장호르몬 유효성의 질환 또는 상태(conditions)의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 천연 인간 성장호르몬과 동일한 또는 유사한 활성을 가진다. 본 발명에서 유효성분으로 이용되는 펩타이드는 성장인자의 활성을 보유하여, 생체에 적용 시 천연 인간 성장호르몬이 발휘하는 작용 또는 기능을 발휘한다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는 인간 성장호르몬의 작용을 미미킹 하도록 제작된 것이기 때문에, 천연 성장인자들의 다양한 생체 내 활성과 관련된 질환 또는 상태(conditions)의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명의 인간 성장 호르몬-유래 펩타이드는 천연의 인간성장 호르몬과 동일한 기능 또는 작용을 할 수 있다.

(b) 본 발명의 펩타이드는 천연 인간성장 호르몬과 비교하여 피부 투과도가 매우 우수하다.

(c) 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물은 인간 성장호르몬의 활성이 요구되는 피부상태를 개선하는 데 매우 우수한 효능을 발휘한다.

(d) 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

도 1은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 서열1의 펩타이드의 고성능 액상 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 서열1 펩타이드와 대조군 펩타이드를 각 농도별로 처리한 후, 섬유아세포의 세포성장 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 서열1 펩타이드와 대조군 펩타이드를 처리한 후, 섬유아세포의 세포성장 효과를 나타내는 현미경 사진이다.
도 4a는 세포 배양에서 본 발명의 서열1 펩타이드와 대조군 펩타이드에 의한 콜라겐 생성량의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 4b는 세포 배양에서 본 발명의 서열1 펩타이드와 대조군 펩타이드에 의한 히알루론산 생성량의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 세포 배양에서 본 발명의 서열1 펩타이드와 대조군 펩타이드에 의한 파이브로넥틴 생성량의 증가를 나타내는 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: IVQSRSV (서열목록 제1서열)의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ml를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ml를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ml의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Val(Boc)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dichloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ml 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10 ml를 반응용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, 다시 DMF로 3분씩 1회 세척하여 Val(Boc)-CTL 레진을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ml의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Ser(tBu)-OH(Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Ser(tBu)-Val(Boc)-CTL 레진을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Gln(trt), Fmoc-Val(Boc) 및 Fmoc-Ile(pbf) 순으로 각 아미노산을 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅ 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한 뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 81.5%, 증류수 5%, 티오아니졸(Thioanisole) 5%, 페놀(Phenol) 5%, EDT 2.5% 및 TIS 1%] 30 ml을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ml의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 NH₂-Ile-Val-Gln-Ser-Arg-Ser-Val-OH 펩타이드 1을 1.28 g 합성하였다(수율: 80.5%). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 787.9(이론값 : 786.5)를 얻을 수 있었다. 합성된 펩타이드에 대한 분자량 측정기 측정값은 하기 표 1과 같다.

서열 번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
		분석치	이론치
1	IVQSRSV	787.9	786.5

시험예 1: 합성 펩타이드를 활용한 NIH3T3 섬유아세포 성장 효과능 분석

합성예 1에서 합성된 서열1 펩타이드에 대한 대조군 펩타이드와 비교하였을 때 유사한 효능을 갖는다는 것을 분석하기 위해 리지노 등의 방법(Rizzino, et al. Cancer Res . 48:4266(1988))을 참조하여 NIH3T3 섬유아세포를 이용한 SRB(Sulforhodamine B) 비색법을 이용하여 측정하였다.

NIH3T3 섬유아세포(한국세포주은행)를 각각 250 ml 용량의 조직 배양용 플라스크를 이용하여 10% 우태아혈청(FBS; fetal bovine serum, Sigma)을 포함하는 Dulbecco’s modied Eagle's medium(DMEM, Gibco, U.S.A.)에서 배양하였다. 배양된 세포주들을 1% 트립신 용액으로 배양용기 바닥에서 떼어낸 후 원심 분리하여 세포 침전물만을 모았다. 이를 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배양액에 다시 현탁한 후, 96-웰 조직 배양용 평판에 각 웰 당 3 X 10³ 세포가 되도록 넣고 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다. 24시간 뒤 혈청을 완전히 제외한 동일한 배양액으로 배지를 교환한 뒤 표준을 잡기위한 공 시료와 서열1 펩타이드 및 대조군 펩타이드를 10% DMSO에 멸균상태로 녹인 뒤 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml의 농도로 72시간을 위와 동일 조건으로 배양하였다. 배양이 완료된 후 배양 상층액을 제거하고 에탄올을 이용하여 세포를 고정화 한 다음 세포고정이 끝난 후, PBS(phosphate buffer saline)로 3회 세척하였다. 세척용액을 제거한 뒤 비색 SRB 용액으로 처리하고 1% 아세트산으로 충분히 세척을 한 뒤 현미경으로 세포를 관찰하여 생존 세포의 상태를 관찰하였으며, 자외선 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존 상태를 측정하였다.

도 2는 대조군 펩타이드 와 본 발명의 서열1 펩타이드를 처리 한 후의 섬유아세포의 성장을 나타내는 결과이다. 나타내는 바와 같이 섬유아세포에서 본 발명의 서열1 펩타이드는 대조군 펩타이드와 동일한 농도에서 동일한 세포증식 효과를 가져오는 것을 확인 할 수 있었다. 서열1 펩타이드는 대조군 펩타이드보다 아미노산 서열이 짧게 이루어졌음에도 불구하고 섬유아세포의 성장을 동일한 효과를 나타내는 것으로 보아 농도-의존적으로 크게 촉진한 것을 알 수 있다(도 2).

도 3은 세포에 대조군 펩타이드 와 서열1 펩타이드의 동량 처리 (1 ㎍/ml) 72시간 후 세포의 형태적 변화의 현미경 관찰 결과로서 도 2의 섬유아세포에서의 성장효과를 재확인시켜주었다. 비교한 바와 같이 동일한 농도에서 동일하게 섬유아세포의 성장 및 형태학적 모양이 크게 변화하였음을 나타내었으며, 이를 통해 서열1 펩타이드는 대조군 펩타이드와 비교하였을 때 동일한 효과가 있음을 확인하였다(도 3).

시험예 2: 서열1 펩타이드의 세포 내 효능

본 발명의 서열1 펩타이드 와 대조군 펩타이드의 세포 내 효능을 평가하기 위해 섬유아세포에 처리하여 피부주름 개선의 표지 인자인 콜라겐, 파이브로넥틴 및 히알루론산의 농도 변화를 측정하였다. 48시간을 배양한 섬유아세포에 본 발명의 펩타이드 및 대조군 펩타이드를 각 1 ㎍/ml의 농도로 처리하고 72시간 경과 후, 콜라겐 및 파이브로넥틴의 농도를 측정하였다. 농도 측정은 콜라겐 ELISA 키트(R&D, 미국) 및 파이브로넥틴 ELISA 키트(R&D, 미국)을 이용하여 실시하였다.

도 4a , 4b, 4c에서 나타내는 바와 같이, 본 발명의 짧은 서열1의 펩타이드를 처리한 군과 대조군 펩타이드를 처리한 군을 비교하였을 때 콜라겐 및 히알루론산, 파이브로넥틴의 합성률에 있어서 유사한 효능을 보이는 것을 확인 할 수 있었다(도4a, 도4b, 도4c).

실시예 1: 나노화 펩타이드의 제조

상기 합성예에서 얻은 펩타이드를 50 mg을 정확히 칭량한 뒤 증류수 500 ml에 충분히 교반하여 용해하였다. 배합체 용액을 레시틴 5 g, 소듐 올리에이트(sodium oleate) 0.3 ml, 에탄올 50 ml 및 약간의 유상과 함께 혼합한 후, 증류수로 총량을 1 L로 맞춰 준 다음, 마이크로플루다이저로 고압을 이용하여 유화시켜 사이즈 100 nm 정도의 나노좀을 제조하였다. 제조된 나노좀은 최종 농도가 약 50 ppm으로 단독 혹은 복합적으로 화장품 제조용으로 사용되었다.

제형예 1: 유연화장수

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 유연화장수를 일반적인 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
1,3-부틸렌글리콜	6.0
글리세린	4.0
PEG 1500	1.0
소듐히알루로네이트	1.0
폴리솔베이트 20	0.5
에탄올	8.0
방부제, 색소	적량
벤조페논-9	0.05
향	미량
정제수	잔량
합계	100

제형예 2: 영양크림

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양크림을 일반적인 영양크림 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.001
메도우폼오일	3.0
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.5
글리세릴스테아레이트	1.5
유동 파라핀	10.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	0.6
솔비탄 세스퀴올레이트	2.5
스쿠알란	3.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
글리세린	5.0
트리에탄올아민	0.5
토코페릴아세테이트	0.5
방부제, 색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 3: 영양화장수

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 영양화장수를 일반적인 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.002
1,3-부틸렌글리콜	4.0
글리세린	4.0
세테아릴알콜	0.8
글리세릴스테아레이트	1.0
트리에탄올아민	0.13
토코페릴아세테이트	0.3
유동파라핀	5.0
스쿠알란	3.0
마카다미아너트오일	2.0
폴리솔베이트60	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.5
카르복시비닐폴리머	1.0
방부제,색소	적량
향	적량
정제수	잔량
합계	100

제형예 4: 에센스

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드 나노좀을 포함하며, 하기 조성으로 이루어진 에센스를 일반적인 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량(중량%)
펩타이드 나노좀	0.005
글리세린	10.0
1,3-부틸렌글리콜	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐히알루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향, 방부제, 색소	적량
정제수	잔량
합계	100

<110> Caregen <120> Human Growth Hormone-Derived Peptides and Uses Thereof <130> PN110351 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Neutin peptide <400> 1 Ile Val Gln Ser Arg Ser Val 1 5

Claims

서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 성장인자 활성을 나타내는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 인간 성장호르몬(Human Growth Hormone ; HGH) 에서 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 세포의 성장 촉진능을 갖는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 3 항에 있어서, 상기 세포는 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 콜라겐 및 히알루론산. 파이브로넥틴의 생성을 농도-의존적으로 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
상기 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부상태(skin conditions) 개선용 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 피부 상태의 개선은 주름개선, 피부탄력 개선, 피부노화 방지, 피부보습 개선, 검버섯 제거, 여드름 치료, 상처 제거 및 피부재생인 것을 특징으로 하는 조성물.