KR20130021315A - Ｄｋｋ2 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 내피세포 재생용 약학적 조성물, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 개체의 내피세포를 재생시키는 방법 및 개체의 발기부전을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

Description

ＤＫＫ2 단백질 또는 그 유전자를 포함하는 발기부전 예방 또는 치료용 조성물 및 그의 용도{Composition for preventing or treating erectile dysfunction comprising DKK2 protein or gene therefor and use thereof}

본 발명은 내피세포 재생용 약학적 조성물, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 개체의 내피세포를 재생시키는 방법 및 개체의 발기부전을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

DKK2는 Wnt의 억제 단백질인 Dickkopf 류의 일종으로서, Wnt 신호전달경로의 저해 혹은 활성 인자로 작용하는 것으로 보고되고 있다 (Wu W et al., Curr. Biol., 10(24), pp1611-1614, 2000). DKK2는 두개의 특징적인 시스테인이 많은 부위 (cysteine-rich domain: CRD) 가지고 있으며 다양한 길이의 연결부위로 구분되어 있다. 특이 시스테인-2 부분은 이들 Dickkopf 류 간에 고도로 보존되어 있으며 10개의 보존된 시스테인 아미노산을 포함하고 있다 (Krupnik VE et al., Gene, 238(2), pp301-313, 1999). DKK2는 파골세포의 분화에 밀접하게 관계되어 있는 것으로 보고되었으나 (Li X et al., Nat. Genet., 37(9), pp945-952, 2005), 지금까지 DKK2의 발기부전의 예방 또는 치료에 대한 기술내용이 교시되거나 기재된 바 없다.

한편, 발기부전은 남성 성기능 장애의 일종으로써, 남성의 성기가 발기되지 않거나 발기 상태가 지속되지 않아 성행위를 할 수 없는 현상이다. 발기부전의 원인은 크게 심인성 원인과 기질성 원인으로 구별된다. 심인성 발기부전은 심리적, 정신적 영향에 의한 교감신경의 과다한 작용으로 인한 노르아드레날린 (noradrenaline)의 과도한 분비, 음경해면체 평활근 긴장도 증가, 신경 전달물질의 분비 억제 등에 기인한다. 또한, 기질성 발기 부전은 그 원인에 따라, 신경인성, 혈관성, 및 내분비성 발기부전으로 분류된다.

상기 혈관성 발기부전은 고지질혈증, 당뇨, 고혈압, 흡연, 전신 심혈관질환 등으로 인해서 음경 혈관내피세포가 손상되어 혈관내피세포에서 일산화질소 (nitric oxide: NO) 등의 이완성 물질의 분비가 원활하지 않아 생기는 장애이다.

최근 연구는 기질성 원인에 더 비중을 두고 있고, 그의 치료로서 주로 비아그라 (viagra, 성분명: 실데나필)을 포함한 경구용 PDE-5 (phosphodiesterase-5) 저해제가 전세계적으로 사용되고 있다. 이러한 경구용 약물은 음경해면체에 특이적으로 분포하는 PDE-5의 저해에 의한 cGMP의 농도를 증가시킴으로써 음경해면체 내 혈류를 증대시켜 발기를 유도하여 발기부전의 치료효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 두통, 안면홍조, 소화불량, 및 심장마비 등 여러 가지 부작용이 보고되고 있을 뿐만 아니라, 비아그라와 같은 PDE-5 계열의 약물들은 분자적 수준에서 일시적인 단백질 발현 및 관련 인자들을 조절하는 것으로 근본적인 치료라 할 수 없다. 더욱이 당뇨에 의한 발기부전의 경우 이와 같은 치료제의 효과가 잘 나타나지 않을 뿐만 아니라, 설령 효과가 있다 해도 그 효능이 장기간 지속되지 못한다.

따라서, 발기부전 음경내의 비정상화된 혈관 구조를 근본적으로 치료하고, 그 효능도 장기간 지속되는 발기부전 치료제의 필요성이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명의 일 양상은 내피세포 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 양상은 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 양상은 개체의 내피세포를 재생시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 일 양상은 개체의 발기부전을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 내피세포 재생용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에 있어서, "DKK2 단백질"이란 디코프 단백질 2를 의미하는 것으로, 디코프-관련 단백질 (Dickkopf-related protein) 2, 시스테인-리치 분비된 단백질 (cyteine-rich secreted protein) 2, CRSP2, CRISPY2, 또는 CRSP 단백질 2라고도 한다. DKK2는 인간의 경우 DKK2 유전자에 의하여 코딩되는 단백질이다. 이 유전자는 디코프 패밀리의 구성원인 단백질을 코딩한다. DKK2는 분비된 단백질로서 2개의 시스테인 리치 영역을 포함하고, Wnt 신호 전달 경로와의 상호작용을 통하여 배아 발생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, DKK2는 보조인자 kremen 2 및 세포 상태 (context)에 따라 Wnt/beta-catenin 신호전달의 촉진제 또는 길항제로서 작용할 수 있다. 본 발명자들은 DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자가 내피세포의 재생을 유도하는 활성을 가진다는 것을 새롭게 발견하였다. 상기 재생은 내피세포의 성장 및/또는 증식을 촉진하여 이루어지는 것을 포함한다. DKK2는 예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 1-33번 잔기 서열이 제거된 서열을 갖는 것일 수 있다. 서열번호 1의 아미노산 서열은 인간 DKK2 서열로서 Genbank accession no. NP_055236에 해당하는 서열이며, 259aa으로 구성되어 있다. 1-33 번 잔기는 신호 펩티드이고, 77-129번 잔기는 N 말단 시스테인-리치 영역이고, 78-127 번 잔기 및 183-256 번 잔기는 각각 DKK-type Cys-1 및 DKK-type Cys-2 영역으로 명명되어 있다. 상기 DKK2는 서열번호 2의 706-1482번의 염기 서열을 갖는 유전자 (Genbank accession no. NM_014421)에 의하여 코딩될 수 있다.

상기 DKK2 단백질은 DKK2 단백질 전체뿐만 아니라 그의 생리학적 활성 단편을 포함한다. 상기 단편은 DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자의 혈관내피세포 재생 활성을 실질적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 단편은 천연 DKK2의 혈관내피세포 활성에 관여하는 활성 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 상기 DKK2 단백질은 또는 DKK2 전장 단백질 또는 그의 생리학적 활성 단편 자체뿐만 아니라 그의 융합 단백질을 포함한다. 상기 융합 단백질은 DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 유전자의 혈관내피세포 재생 활성을 실질적으로 포함하는 것일 수 있다. 상기 융합 단백질은 DKK2 단백질 또는 그 단편이 DKK2 단백질 또는 그 단편의 분리에 유용한 융합 파트너, 표적부위로의 전달에 유용한 융합 파트너, 체내 안정성을 증가시키기 위한 융합 파트너 등에 연결된 것일 수 있다. 상기 연결은 DKK2 단백질 또는 그 단편의 N 말단 또는 C 말단 또는 측쇄를 통하여 연결된 것일 수 있다. 상기 연결은 공유 또는 비공유 결합에 의하여 이루어진 것일 수 있다. 상기 융합 파트너는 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있다. 분리에 유용한 융합 파트너는 His 서열, 예를 들면, His₆ 서열일 수 있다. 표적부위로의 전달에 유용한 융합 파트너, 또는 체내 안정성을 증가시키기 위한 융합 파트너는 항체 불변 영역, 예를 들면, Fc 영역 또는 PEG와 같은 체내 분해에 저항을 부여하는 중합체일 수 있다.

상기 "DKK2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 DKK2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열일 수 있다.

상기 DKK2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체뿐만 아니라, 다른 물질과 융합된 형태의 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 다른 물질은 상기 DKK2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 전달될 수 있도록 하는 것, 세포 내에서 세포 내의 유전자 발현기구에 의하여 발현될 수 있도록 하는 것, 및 세포 내외에서 안정하게 유지되도록 하는 것으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 융합은 공유 또는 비공유 결합에 의하여 이루어질 수 있다. 상기 융합은 소포 중에 포집되는 형태를 포함한다.

상기 DKK2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터, 오퍼레이터, 인핸서 및/또는 전사종결인자와 같은 유전자 발현 조절인자와 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 DKK2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 플라스미드 또는 바이러스 게놈에 삽입되어 세포 내에서 발현될 수 있도록 된 것일 수 있다. 상기 DKK2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 음경의 내피세포, 예를 들면, 해면체 내피세포 또는 음경 혈관 내피세포에 특이적으로 발현되도록 하는 조절인자와 연결된 구조체일 수 있다. 상기 DKK2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 아데노바이러스 게놈에 삽입되어 해면체 내피세포 또는 음경 혈관 내피세포에 특이적으로 발현되도록 하는 조절인자와 연결된 구조체의 형태일 수 있다. 상기 구조체는 바이러스 입자에 포집되어 있는 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, "유효성분"이란 상기 조성물이 개체에 투여되는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 내피세포 재생을 더 촉진하는 활성을 갖는 것을 포함한다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 상기 "내피세포"는 음경 해면체 내피세포 또는 음경 혈관내피세포인 것일 수 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 약제학적으로 허용가능한 당업계에서 알려진 보조제, 부형제 및/또는 희석제를 포함한다. 상기 담체는 물 예를 들면, 식염수 및 멸균수, 링거액, 완충제, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올을 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 종래 알려진 내피세포 재생 활성을 가진 성분을 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여 제형 또는 비경구 투여 제형일 수 있다. 경구 투여 제형은 예를 들면, 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제 및 건조 시럽제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 비경구 투여 제형은 예를 들면, 주사제 또는 피부 외용제일 수 있다. 상기 외용제는 크림, 로션, 또는 패치의 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

용어 "유효성분"이란 상기 조성물이 개체에 투여되는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 발기부전의 예방 또는 치료하는 활성을 갖는 것을 포함한다. 상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 마우스, 햄스터, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 용어 "예방"이란, 상기 조성물이 투여되지 않은 것에 비하여 발기력이 약화되거나 발기력 지속시간이 감소되는 것을 방지하는 것을 포함한다. 예를 들면, 전체 발기부전의 20 내지 30%에 해당하는 척추 손상이나 복부-골반부 수술에 의한 신경 손상에 의하여 발기 부전이 유발되는 경우, 손상 직후 일정 기간 동안 내피세포를 포함한 발기 조직의 사멸이나 섬유화가 진행될 수 있다. 이 경우 조기에 발기조직에 본 발명의 조성물을 투여함으로써, 발기부전을 예방하거나 발기조직을 재활 (rehabilitation)시킬 수 있다. 용어 "치료"란 상기 조성물이 투여되지 않은 것에 비하여, 약화된 발기력 또는 감소된 발기 지속시간을 더 회복시키는 것을 포함한다.

용어 "DKK2 단백질" 및 "DKK2를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 담체는 약제학적으로 허용가능한 당업계에서 알려진 보조제, 부형제 및/또는 희석제를 포함한다. 상기 담체는 물 예를 들면, 식염수 및 멸균수, 링거액, 완충제, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 및 에탄올을 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 종래 알려진 내피세포 재생 활성을 가진 성분을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 음경해면체 내압을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 조성물은 내피세포에서 내피세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 내피세포 특이적인 단백질은 PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule-1)인 것일 수 있다. 상기 "내피세포"는 음경 해면체 내피세포 또는 음경 혈관내피세포인 것일 수 있다.

상기 발기부전은 음경내피세포의 기능 저하나 손상에 의하여 야기된 것일 수 있다. 이러한 음경내피세포의 이상은 예를 들면, 고지질혈증 (고콜레스테롤증 발기부전 포함), 당뇨병, 고혈압, 음경신경손상 및 이들의 조합으로부터 선택된 것에 의하여 야기된 것일 수 있다.

상기 조성물은 경구 투여 제형 또는 비경구 투여 제형일 수 있다. 경구 투여 제형은 예를 들면, 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제 및 건조 시럽제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다. 비경구 투여 제형은 예를 들면, 주사제 또는 피부 외용제일 수 있다. 상기 외용제는 크림, 로션, 또는 패치의 형태일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 내피세포 재생에 유효한 양의 DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 내피세포 재생용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 내피세포를 재생시키는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 용어 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 상기 개체는 내피세포가 손상되어 있는 개체일 수 있다. 상기 내피세포는 음경의 발기조직의 내피세포, 예를 들면, 해면체 내피세포 및 혈관내피세포 중 하나 이상일 수 있다. 상기 내피세포 손상은 음경신경손상, 고지질혈증 (고콜레스테롤혈증 발기부전을 포함), 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의하여 야기된 것일 수 있다. 상기 개체는 예를 들면, 포유동물, 예를 들면, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말 및 소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 방법에 있어서, "내피세포 재생에 유효한 양"은 상기 조성물이 개체에 투여되는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 내피세포 재생을 더 촉진하도록 하는 양을 포함한다. "내피세포 재생에 유효한 양"은 예를 들면, 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 0.00001mg/kg 내지 1000mg/kg, 예를 들면, 0.00001mg/kg 내지 100mg/kg, 0.00001mg/kg 내지 10mg/kg, 0.00001mg/kg 내지 10mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 1000mg/kg, 0.001mg/kg 내지 1000mg/kg, 0.01mg/kg 내지 1000mg/kg, 0.1mg/kg 내지 1000mg/kg, 1mg/kg 내지 1000mg/kg, 10mg/kg 내지 1000mg/kg, 또는 100mg/kg 내지 1000mg/kg일 수 있다.

상기 방법에 있어서, "DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 내피세포 재생용 약학적 조성물"에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 방법에 있어서, 투여는 상기 조성물을 음경의 발기조직에 도달할 수 있는 임의의 경로를 통한 투여를 포함한다. 상기 투여 경로는 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 음경 해면체 또는 혈관 주사를 포함한 음경 주사, 피하 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 투여는 예를 들면, 주사제 형태의 상기 조성물을 음경 해면체 또는 혈관에 국소적으로 주사하는 것을 포함한다. 또한 투여 경로는 피부를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 크림, 로션, 패치 등의 피부 외용제를 피부에 적용함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 발기부전을 치료하기에 유효한 양의 DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 발기부전을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 용어 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 상기 개체는 발기부전 증상을 가지고 있거나 발기부전 증상을 나타낼 가능성이 있는 개체일 수 있다. 상기 발기부전은 음경신경손상, 고지질혈증 (고콜레스텔롤혈증 발기부전을 포함), 및 당뇨병으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의하여 야기된 것일 수 있다. 상기 개체는 예를 들면, 포유동물, 예를 들면, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐, 쥐, 개, 고양이, 말 및 소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 방법에 있어서, "발기부전을 치료하기에 유효한 양"은 상기 조성물이 개체에 투여되는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 발기부전의 개선, 예를 들면, 발기력의 강화 및/또는 발기 지속 시간을 증가시키는 양을 포함한다. "발기부전을 치료하기에 유효한 양"은 예를 들면, 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 연령 및 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 0.00001mg/kg 내지 1000mg/kg, 예를 들면, 0.00001mg/kg 내지 100mg/kg, 0.00001mg/kg 내지 10mg/kg, 0.00001mg/kg 내지 10mg/kg, 0.0001mg/kg 내지 1000mg/kg, 0.001mg/kg 내지 1000mg/kg, 0.01mg/kg 내지 1000mg/kg, 0.1mg/kg 내지 1000mg/kg, 1mg/kg 내지 1000mg/kg, 10mg/kg 내지 1000mg/kg, 또는 100mg/kg 내지 1000mg/kg일 수 있다.

상기 방법에 있어서, "DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물"에 대하여는 상기한 바와 같다.

상기 방법에 있어서, 투여는 상기 조성물을 음경의 발기조직에 도달할 수 있는 임의의 경로를 통한 투여를 포함한다. 상기 투여 경로는 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 음경 해면체 또는 혈관 주사를 포함한 음경 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 투여는 예를 들면, 주사제 형태의 상기 조성물을 음경 해면체 또는 혈관에 국소적으로 주사하는 것을 포함한다. 또한 투여 경로는 피부를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들면, 크림, 로션, 패치 등의 피부 외용제를 피부에 적용함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 양상에 따른 내피세포 재생용 약학적 조성물에 의하면, 개체의 손상된 내피세포를 재생하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상에 따른 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 개체의 발기부전을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상에 따른 개체의 내피세포를 재생시키는 방법에 의하면, 개체의 손상된 내피세포를 재생시킬 수 있다.

본 발명의 다른 일 양상에 따른 개체의 발기부전을 예방 또는 치료하는 방법에 의하면, 발기부전을 예방 또는 치료할 수 있다.

도 1은 고지혈증 마우스 모델에서 DKK2 유전자 투여군과 대조군에서 음경신경 전기자극에 따른 음경해면체 내압 (발기력)을 나타낸 도면이다.
도 2는 고지혈증 마우스의 음경조직에서 DKK2 유전자 투여군과 대조군의 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM-1의 발현 정도를 나타낸 컨포칼 현미경 사진이다.
도 3은 고지질혈증 마우스의 음경조직에서 DKK2 유전자 투여군과 대조군에서 PECAM-1 및 p-eNOS (phosphorylated endothelial NO synthase)의 발현 양상을 나타내는 컨포칼 현미경 사진이다.
도 4는 EC-특이적 DKK2 Tg 생쥐를 제조하기 위하여 사용된 유전자 구조체 및 제조된 EC-특이적 DKK2 Tg 생쥐를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 DKK2 유전자가 형질도입되거나 되지 않은 당뇨 또는 비당뇨 마우스에서 전기자극에 따른 음경해면체 내압을 나타낸 도면이다.
도 6은 DKK2 유전자가 형질도입되거나, 또는 되지 않은 당뇨 또는 비당뇨 마우스의 음경 발기조직에서 PECAM-1의 발현 양상을 나타내는 컨포칼 현미경 사진이다.
도 7은 DKK2 유전자가 형질도입되거나, 또는 되지 않은 당뇨 또는 비당뇨 마우스의 음경 발기조직에서 PECAM-1 및 p-eNOS의 발현 양상을 나타내는 컨포칼 현미경 사진이다.
도 8은 정상 쥐 및 당뇨 마우스 모델에서 DKK2 단백질 투여군과 대조군에서 음경 신경 전기자극에 따른 음경 해면체 내압 (발기력)을 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 고지질혈증 발기부전 모델에서 DKK2 유전자의 발기부전 치료 효과

생후 2개월 된 수컷 마우스 (C57BL/6J)를 대상으로 하였고, 대조군은 정상식이를 실험군은 고지질식이 (4 중량% cholesterol + 1 중량% cholic acid)를 각각 3개월간 투여하였다. 여기서 정상식이는 고지질식이가 포함되지 않은 일반사료 (약 20 중량% 이상의 단백질, 약 5 중량% 이상의 지방, 기타 비타민 및 미네랄로 구성)를 매일 자유롭게 (하루 용량을 정하지 않고 사료를 충분히 주어서 마우스가 원하는 대로 섭취하게 함) 경구 투여하는 것을 말하고, 고지질식이는 정상식이에 4 중량% 콜레스테롤+ 1 중량% 콜린산이 첨가된 것을 동일한 방법으로 경구 투여하는 것을 말한다. 3개월간 고지질식이를 투여한 생쥐들은 고콜레스테롤성 발기부전 증상을 보였다.

총 7 개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다 (N = 4-7 마리/군; 1군, 정상 대조군; 2군, 고지질식이군; 3군, 고지질식이군 + 바이러스 비히클 (virus vehicle) [2x10⁸ 입자(parts)/20 μl]; 4군, 고지질식이군 + DKK2 아데노바이러스 (adenovirus) [ad-DKK2, 1x10⁸ 입자 (parts)/20 μl]; 5군, 고지질식이군 + ad-DKK2 [2x10⁸ parts/20 μl]; 6군, 고지질식이군 + ad-DKK2 [1x10⁹ parts/20 μl]; 7군, 고지질식이군 + ad-DKK2 [2x10⁹ parts/20 μl]). 여기서 바이러스 비히클은 DKK2 유전자가 도입되지 않은 바이러스 비히클 자체를 말하는 것으로, 아데노바이러스 입자를 말한다.

각각의 유전자 즉, 바이러스 비히클 또는 ad-DKK2를 음경해면체 내에 주사 후 2주째에 음경해면체 신경자극 후 발기력을 측정하였다. 음경해면체 조직에서 혈소판-내피세포 부착 분자-1 (platelet/endothelial cell adhesion molucule-1, PECAM-1) 및 인산화된 내피성산화질소생성효소 (phosphorylated endothelial nitric oxide synthase, p-eNOS)에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 혈관내피세포의 발현변화 및 eNOS 활성화를 조사하였다.

그 결과, DKK2 유전자 투여군 중에서 2x10⁸ 농도에서 가장 높은 발기력 개선효과를 보였고, 정상 대조군의 약 90% 정도까지 발기력이 회복되었다. 고지질증 동물 모델의 음경에서 혈관내피세포의 발현 및 p-eNOS가 정상 대조군에 비해서 현저하게 감소되었고, DKK2 유전자 투여 후 혈관내피세포의 양 및 p-eNOS 발현이 거의 정상 수준으로 현저하게 회복되었다. 이하에서 보다 자세하게 설명하고자 한다.

(1) 전기 자극에 따른 발기력 분석

발기력 측정에 관한 실험방법은, 준비된 마우스의 하복부에서 좌측 표피부분을 개복하고, 전립선의 후외측에 위치한 음경해면체신경 (음경신경)이 잘 보이도록 준비하였다. 음경신경의 전기자극을 위해서 백금전극을 음경신경에 위치시킨 후, 1-5 볼트 12 헤르츠 강도로 약 1분 동안 전기자극을 가하였다. 전기자극을 가하게 되면, 음경은 발기를 하게 된다. 이때 음경 해면체에 삽입된 카테터를 통해서 발기시 음경내부의 압력 (음경해면체 내압)에 대한 데이터 수집을 위하여 컴퓨터와 연결되어 있는 압력 전달기 (바이오스팩 시스템, 미국)를 통해서 측정하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다. 측정된 압력 수치는 음경 발기력을 반영하게 된다.

도 1은 고지혈증 마우스 모델에서 DKK2 유전자 투여군과 대조군에서 음경신경 전기자극에 따른 음경해면체 내압 (발기력)을 나타낸 도면이다. 도 1A에서, 세로축의 ICP (Intracavernous Pressure: 음경해면체내 압력)는 발기시 음경내부의 압력 (음경해면체내압)을 말하며 일반적으로 발기력을 나타내는 지표이다. 가로축은 전기자극 후의 시간을 나타낸다. 도 1A에서 1분간의 전기자극 기간은 가로축에 검정색 막대로 표시하였다. 도 1A는 바이러스 비히클 또는 ad-DKK2를 음경해면체 내에 주사 후 2주째에 음경해면체에 1V 또는 5V로 신경자극 후 발기력을 측정한 결과이다.

또한, 도1B에서 세로축의 MSBP (Mean Systolic Blood Pressure)는 평균수축기혈압을 나타낸다. 일반적으로 발기력을 표현할 때는 최고 음경해면체내압 (Maximal ICP) 또는 음경해면체내압 곡선의 면적 (Total ICP [area under the curve])을 평균수축기혈압 (MSBP)으로 나눈 값으로 나타내게 되는데 이는 혈압자체가 음경해면체내압에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 도 1에서, Control, Diet only, Virus vehicle 및 Ad-DKK2 (1x10⁸, 2x10⁸, 1x10⁹, 2x10⁹)는 각각 상기한 제1 군 내지 제7 군에 해당하는 식이를 섭취한 개체이다.

도 1에 나타난 바와 같이, DKK2 유전자 투여군 (Ad-DKK2)에서 비처치군 (Diet Only) 및 바이러스 비히클 (virus vehicle) 투여군에 비해서 훨씬 높은 발기력을 보였고, 2x10⁸ 농도에서 가장 높은 발기력 개선효과를 보였다. 음경발기에 대한 두 가지 변수, 즉 최고 음경해면체 내압과 음경압력곡선의 면적이 DKK2 유전자 투여 후 현저한 상승을 보였다.

(2) 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM -1 및 p- eNOS 발현분석

음경은 일종의 특수한 혈관조직이다. 정상적인 음경 발기를 위해서는 음경혈관의 정상적인 활동이 필수적이며, 특히 음경 혈관내피세포에서 생성되는 내피성산화질소생성효소 (endothelial nitric oxide synthase: eNOS)는 음경혈관의 이완 및 이로 인한 음경 발기에 중요한 역할을 하는 일산화질소 (NO)를 생성하는 주된 효소이다. 음경 혈관의 비정상적인 구조나 활동력은 발기력을 감소시키는 원인이 된다.

이에 본 발명자들은 고지질식이 투여 후 음경 발기조직 내 혈관의 구조적 변화를 조사하고자 혈관내피세포에 특이적 단백질인 PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molucule-1)의 발현과 내피성산화질소생성효소 (eNOS)의 활성화 정도 즉, 인산화 (phosphorylation) 정도를 확인해 보았다.

마우스를 상기한 제1 군, 제2 군, 제3 군 및 제5 군에 따라 3개월간 각각 상기한 해당하는 식이를 투여한 후 고지질혈증을 유도하였다. 음경조직을 4℃에서 4% 포름알데히드에서 24 시간 동안 고정한 후 동결 절편기에서 8㎛ 두께로 잘라서 음경조직 절편을 준비하였다.

다음으로, 준비된 음경조직 절편을 슬라이드 상에 올리고, PECAM-1 및 p-eNOS 발현 분석을 위해 준비된 슬라이드 상의 조직을 3.7% 파라포름알데히드에서 약 5분간 고정시켰다. 고정된 음경조직 절편들을 세척 버퍼 (2% FBS + 0.1% Sodium Azide in PBS)에 3회 세척한 후에 첫 번째 항체 (항-PECAM-1 햄스터 항체, 항-p-eNOS 가토 항체)를 1:100 비율로 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 그 후 남아 있는 항체를 제거하기 위해서 세척 버퍼로 다시 3회 세척한 다음, PECAM-1 및 p-eNOS에 특이적으로 반응한 항체를 형광으로 확인할 수 있도록 제작된 두 번째 항체 (FITC-표지된 항-가토 항체 또는 TRITC-표지된 항-햄스터 항체)를 1:1000 비율로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 남아있는 항체를 제거하기 위해 세척 버퍼로 다시 3회 세척한 후에 형광현미경이나 형광물질을 확인할 수 있는 컨포칼 현미경으로 발현 정도를 분석하였고, 그 결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2는 고지혈증 마우스의 음경조직에서 DKK2 유전자 투여군과 대조군의 혈관내피세포 특이적 단백질인 PECAM-1의 발현 정도를 나타낸 컨포칼 현미경 사진이다. 도 2에 나타난 바와 같이, 고지질혈증 마우스 (Cholesterol group)의 음경에서 정상 마우스 (Control)에 비해 혈관내피세포의 수가 현저하게 감소되어 있음을 알 수 있다. 여기서, Control은 제1 군 식이법을 적용한 것을 제외하고는, 실험군과 동일하게 준비된 음경조직 절편에 대한 결과이다. DKK2 유전자를 투여한 군 (Ad-DKK2)에서 그렇지 않은 군 (No treatment: 유전자를 투여하지 않은 군, Ad-LacZ: DKK2 유전자 대신 LacZ 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터 투여군)에 비하여 혈관내피세포 특이적 단백질의 발현이 증가되었다. 이는 고질식이에 의하여 감소된 혈관내피세포가 DKK2 유전자에 의하여 그의 재생이 유도되고, 그에 따라 발기력이 회복된다는 것을 증명하는 결과이다.

도 3은 고지질혈증 마우스의 음경조직에서 DKK2 유전자 투여군과 대조군에서 PECAM-1 및 p-eNOS의 발현 양상을 나타내는 컨포칼 현미경 사진이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 고지질혈증 마우스 (Cholesterol group)의 음경에서 정상 마우스 (Control)에 비해 p-eNOS 발현이 현저하게 감소되어 있음을 알 수 있다. DKK2 유전자를 투여한 군 (Ad-DKK2)에서 그렇지 않은 군 (No treatment: 유전자를 투여하지 않은 군, Ad-LacZ: DKK2 유전자 대신 LacZ 유전자를 포함하는 아데노바이러스 벡터 투여군)에 비하여 p-eNOS 발현이 증가되며, 이는 고지질식이에 의하여 야기된 eNOS 활성감소가 DKK2 유전자 주입으로 다시 정상 수준으로 회복하였음을 의미한다. 도 2의 PECAM-1 데이터와 도 3의 PECAM-1 데이터는 동일한 개체의 시료가 아니고, 동일한 방법으로 진행된 다른 실험군의 시료이다.

도 2 및 도 3에서, Control, No Treatment, Ad-LacZ, 및 Ad-DKK2는 각각 상기한 제1 군, 제2 군, 제3 군 및 제5 군에 따라 3개월간 각각 상기한 해당하는 식이를 투여한 마우스에 대한 결과이다.

실시예 2. 당뇨성 발기부전 모델에서 DKK2 유전자 과발현 및 DKK2 단백질의 발기부전 치료 효과

(1) 당뇨성 발기부전 모델에서 DKK2 유전자 과발현의 발기부전 치료 효과

당뇨성 발기부전에서 DKK2 유전자의 기능을 보다 명확하게 규명하기 위해서 DKK2 유전자를 과발현시킨 마우스 (DKK2 transgenic mouse: DKK2 유전자가 형질도입된 마우스)를 이용한 연구를 수행하였다. 상기 DKK2 유전자가 형질도입된 마우스는 내피세포(EC)-특이적 Tie2 프로모터/인핸서의 통제 하에서 생쥐 DKK2 (mDKK2)를 발현하는 형질전환 (transgenic) (Tg) 생쥐를 생성하였다 (도 4).

도 4는 EC-특이적 DKK2 Tg 생쥐를 제조하기 위하여 사용된 유전자 구조체 및 제조된 EC-특이적 DKK2 Tg 생쥐를 분석한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4A는 DKK2가 내피세포에 특이적으로 발현되도록 구성된 유전자 구조체를 나타낸 도면이다. 도 4B는 웨스턴 블롯팅에 의하여 파운더 (founder) 생쥐에 대하여 이식유전자가 존재하는지 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 그룹 당 3 마리의 DKK2 파운더 생쥐에 대하여 확인하였다. 도 4C는 P12 생쥐 망막으로부터 총 RNA를 추출하고, 프라이머 세트 A (DKK2 cDNA-특이적 프라이머 세트: 서열번호 3 및 4) 및 프라이머 세트 B (Tg-특이적 프라이머 세트: 서열번호 5 및 6)를 사용한 RT-PCR에 의하여, Tg-특이적 DKK2 발현이 일어나는 것을 확인한 결과를 나타낸 도면이다. 도 4D는 프라이머 세트 A를 사용한 실시간 RT-PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.

생후 2개월 된 수컷 마우스 (C57BL/6J)를 대상으로 하였고, 총 4 개의 군으로 나누어 실험을 진행하였다 (N = 8/군; 1군, 정상 마우스; 2군, DKK2 유전자가 형질도입된 마우스; 3군, 정상 마우스 + 스트렙토조토신 (streptozotocin)을 이용한 당뇨 유도 [50 mg/kg 농도로 5일 연속으로 복강내 투여]; 4군, DKK2 유전자가 형질도입된 마우스 + 스트렙토조토신을 이용한 당뇨 유도 [50 mg/kg 농도로 5일 연속으로 복강내 투여]). 당뇨 유도 후 8주째에 음경해면체 신경자극 후 발기력을 측정하였다. 음경해면체 조직에서 혈소판-내피세포 부착분자-1 (platelet/endothelial cell adhesion molucule-1, PECAM-1) 및 인산화된 내피성산화질소생성효소 (phosphorylated endothelial nitric oxide synthase, p-eNOS)에 대한 면역조직화학염색을 시행하여 혈관내피세포의 발현변화 및 eNOS 활성화를 조사하였다.

전기자극에 따른 발기력 분석방법 및 면역조직화학염색에 대한 상세한 설명은 실시예 1에서 제시하였다.

도 5는 DKK2 유전자가 형질도입되거나 되지 않은 당뇨 또는 비당뇨 마우스에서 전기자극에 따른 음경해면체 내압을 나타낸 도면이다. 도 5에 나타난 바와 같이, 정상 마우스 (WT)에서 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도한 경우 (WT+STZ) 정상 대조군에 비해서 발기력이 현저하게 감소된 반면, DKK2 유전자 형질도입된 마우스 (DKK2-Tg)에서 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도한 경우 (DKK2-Tg+STZ)에는 발기력 저하가 나타나지 않았고, 정상 마우스와 비슷한 수준으로 발기력이 유지되었다.

도 6은 DKK2 유전자가 형질도입되거나, 또는 되지 않은 당뇨 또는 비당뇨 마우스의 음경 발기조직에서 PECAM-1의 발현 양상을 나타내는 컨포칼 현미경 사진이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 정상 마우스 (WT)에서 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도한 경우 (WT+STZ) 정상 대조군에 비해서 음경 혈관내피세포 양이 현저하게 감소된 반면, DKK2 유전자가 형질도입된 마우스 (DKK2-Tg)에서 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도한 경우 (DKK2-Tg+STZ) 혈관내피세포 특이적 단백질의 발현 저하가 뚜렷하지 않았고, 정상 마우스와 비슷한 수준으로 혈관내피세포 양이 유지되었다. 또한 DKK2 유전자 형질도입된 마우스 (DKK2-Tg)에서 정상 대조군 (WT+STZ)에 비해서 음경 혈관내피세포 양이 현저하게 증가하였다. 이는 DKK2 유전자의 과발현이 혈관내피세포의 생성을 유도하거나 파괴를 예방함으로써 발기력을 회복시키는 것을 증명하는 결과이다.

도 7은 DKK2 유전자가 형질도입되거나, 또는 되지 않은 당뇨 또는 비당뇨 마우스의 음경 발기조직에서 PECAM-1 및 p-eNOS의 발현 양상을 나타내는 컨포칼 현미경 사진이다. 도 7에 나타난 바와 같이, 정상 마우스 (WT)에서 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도한 경우 (WT+STZ) 정상 대조군에 비해서 p-eNOS 발현이 현저하게 감소된 반면, DKK2 유전자가 형질도입된 마우스 (DKK2-Tg)에서 스트렙토조토신으로 당뇨를 유도한 경우 (DKK2-Tg+STZ)에는 p-eNOS 발현 저하가 뚜렷하지 않았고, 정상 마우스와 비슷한 수준으로 p-eNOS 발현이 유지되었다. 또한 DKK2 유전자가 형질도입된 마우스 (DKK2-Tg)에서 정상 대조군 (WT)에 비해서 음경 p-eNOS 발현이 현저하게 증가하였다. 이는 당뇨에 의하여 야기된 p-eNOS 활성감소가 DKK2 과발현으로 다시 정상 수준으로 회복하였음을 의미한다.

상기 결과는 고지혈증 및/또는 당뇨로 인한 발기부전은 음경 혈관내피세포의 손상과 밀접한 관계가 있음을 시사한다.

(2) 당뇨성 발기부전 모델에서 DKK2 단백질의 발기부전 치료 효과

당뇨성 발기부전에서 DKK2 단백질의 발기력 개선효과를 평가하고자 (1)에서 전술한 바와 같이 생후 2개월 된 수컷 마우스 (C57BL/6J)에서 스트렙토조토신을 이용하여 당뇨를 유도하였으며, 당뇨 유도 8주 후 발기실험을 진행하였다.

당뇨 유도된 마우스를 총 4 개의 군으로 나누었으며 (N = 6/군; 1군, 정상군; 2군, 당뇨+비처치 군; 3군, 당뇨+PBS (Phophate buffered solution) 투여군: 4군, 당뇨+ DKK2 단백질 6μg 투여군), 발기력 측정은 PBS 혹은 DKK2 단백질 투여 2주 후에 시행하였다. DKK2 단백질 6μg은 PBS 중 DKK2 단백질 20μl를 투여함으로써 투여되었다.

도 8은 정상 쥐 및 당뇨 마우스 모델에서 DKK2 단백질 투여군과 대조군에서 음경 신경 전기자극에 따른 음경 해면체 내압 (발기력)을 나타낸 도면이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 음경해면체내 DKK2 단백질 투여 당뇨군 (DM+DKK2 protein)에서는 비처치 당뇨군 (DM only)이나 음경해면체내 PBS 투여 당뇨군 (DM+PBS)에 비해 음경 발기에 대한 두 가지 변수, 즉 최고 음경해면체 내압 (도 8의 좌측)과 음경압력 곡선의 면적 (도 8의 우측)이 DKK2 단백질 투여 후 현저한 상승을 보였다 (ANOVA, p<0.05). 이는 DKK2 단백질이 당뇨로 인한 발기부전에서 발기력을 뚜렷하게 개선시킴을 의미한다. 도 8에서, 각 바는 군당 평균±표준편차(SD)를 나타낸다. *는 DM only 군 또는 PBS-처리된 당뇨 군에 비교하여 P <0.05를 나타낸다.

<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Composition for preventing or treating erectile dysfunction comprising DKK2 protein or gene therefor and use thereof <130> PN096354 <150> 10-2011-0083560 <151> 2011-08-22 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 259 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Leu Met Arg Ser Lys Asp Ser Ser Cys Cys Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Ala Ala Val Leu Met Val Glu Ser Ser Gln Ile Gly Ser Ser Arg 20 25 30 Ala Lys Leu Asn Ser Ile Lys Ser Ser Leu Gly Gly Glu Thr Pro Gly 35 40 45 Gln Ala Ala Asn Arg Ser Ala Gly Met Tyr Gln Gly Leu Ala Phe Gly 50 55 60 Gly Ser Lys Lys Gly Lys Asn Leu Gly Gln Ala Tyr Pro Cys Ser Ser 65 70 75 80 Asp Lys Glu Cys Glu Val Gly Arg Tyr Cys His Ser Pro His Gln Gly 85 90 95 Ser Ser Ala Cys Met Val Cys Arg Arg Lys Lys Lys Arg Cys His Arg 100 105 110 Asp Gly Met Cys Cys Pro Ser Thr Arg Cys Asn Asn Gly Ile Cys Ile 115 120 125 Pro Val Thr Glu Ser Ile Leu Thr Pro His Ile Pro Ala Leu Asp Gly 130 135 140 Thr Arg His Arg Asp Arg Asn His Gly His Tyr Ser Asn His Asp Leu 145 150 155 160 Gly Trp Gln Asn Leu Gly Arg Pro His Thr Lys Met Ser His Ile Lys 165 170 175 Gly His Glu Gly Asp Pro Cys Leu Arg Ser Ser Asp Cys Ile Glu Gly 180 185 190 Phe Cys Cys Ala Arg His Phe Trp Thr Lys Ile Cys Lys Pro Val Leu 195 200 205 His Gln Gly Glu Val Cys Thr Lys Gln Arg Lys Lys Gly Ser His Gly 210 215 220 Leu Glu Ile Phe Gln Arg Cys Asp Cys Ala Lys Gly Leu Ser Cys Lys 225 230 235 240 Val Trp Lys Asp Ala Thr Tyr Ser Ser Lys Ala Arg Leu His Val Cys 245 250 255 Gln Lys Ile <210> 2 <211> 3659 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cgggagcccg cggcgagcgt agcgcaagtc cgctccctag gcatcgctgc gctggcagcg 60 attcgctgtc tcttgtgagt caggggacaa cgcttcgggg caactgtgag tgcgcgtgtg 120 ggggacctcg attctcttca gatctcgagg attcggtccg gggacgtctc ctgatcccct 180 actaaagcgc ctgctaactt tgaaaaggag cactgtgtcc tgcaaagttt gacacataaa 240 ggataggaaa agagaggaga gaaaagcaac tgagttgaag gagaaggagc tgatgcgggc 300 ctcctgatca attaagagga gagttaaacc gccgagatcc cggcgggacc aaggaggtgc 360 ggggcaagaa ggaacggaag cggtgcgatc cacagggctg ggttttcttg caccttgggt 420 cacgcctcct tggcgagaaa gcgcctcgca tttgattgct tccagttatt gcagaacttc 480 ctgtcctggt ggagaagcgg gtctcgcttg ggttccgcta atttctgtcc tgaggcgtga 540 gactgagttc atagggtcct gggtccccga accaggaagg gttgagggaa cacaatctgc 600 aagcccccgc gacccaagtg aggggccccg tgttggggtc ctccctccct ttgcattccc 660 acccctccgg gctttgcgtc ttcctgggga ccccctcgcc gggagatggc cgcgttgatg 720 cggagcaagg attcgtcctg ctgcctgctc ctactggccg cggtgctgat ggtggagagc 780 tcacagatcg gcagttcgcg ggccaaactc aactccatca agtcctctct gggcggggag 840 acgcctggtc aggccgccaa tcgatctgcg ggcatgtacc aaggactggc attcggcggc 900 agtaagaagg gcaaaaacct ggggcaggcc tacccttgta gcagtgataa ggagtgtgaa 960 gttgggaggt attgccacag tccccaccaa ggatcatcgg cctgcatggt gtgtcggaga 1020 aaaaagaagc gctgccaccg agatggcatg tgctgcccca gtacccgctg caataatggc 1080 atctgtatcc cagttactga aagcatctta acccctcaca tcccggctct ggatggtact 1140 cggcacagag atcgaaacca cggtcattac tcaaaccatg acttgggatg gcagaatcta 1200 ggaagaccac acactaagat gtcacatata aaagggcatg aaggagaccc ctgcctacga 1260 tcatcagact gcattgaagg gttttgctgt gctcgtcatt tctggaccaa aatctgcaaa 1320 ccagtgctcc atcaggggga agtctgtacc aaacaacgca agaagggttc tcatgggctg 1380 gaaattttcc agcgttgcga ctgtgcgaag ggcctgtctt gcaaagtatg gaaagatgcc 1440 acctactcct ccaaagccag actccatgtg tgtcagaaaa tttgatcacc attgaggaac 1500 atcatcaatt gcagactgtg aagttgtgta tttaatgcat tatagcatgg tggaaaataa 1560 ggttcagatg cagaagaatg gctaaaataa gaaacgtgat aagaatatag atgatcacaa 1620 aaagggagaa agaaaacatg aactgaatag attagaatgg gtgacaaatg cagtgcagcc 1680 agtgtttcca ttatgcaact tgtctatgta aataatgtac acatttgtgg aaaatgctat 1740 tattaagaga acaagcacac agtggaaatt actgatgagt agcatgtgac tttccaagag 1800 tttaggttgt gctggaggag aggtttcctt cagattgctg attgcttata caaataacct 1860 acatgccaga tttctattca acgttagagt ttaacaaaat actcctagaa taacttgtta 1920 tacaataggt tctaaaaata aaattgctaa acaagaaatg aaaacatgga gcattgttaa 1980 tttacaacag aaaattacct tttgatttgt aacactactt ctgctgttca atcaagagtc 2040 ttggtagata agaaaaaaat cagtcaatat ttccaaataa ttgcaaaata atggccagtt 2100 gtttaggaag gcctttagga agacaaataa ataacaaaca aacagccaca aatacttttt 2160 tttcaaaatt ttagttttac ctgtaattaa taagaactga tacaagacaa aaacagttcc 2220 ttcagattct acggaatgac agtatatctc tctttatcct atgtgattcc tgctctgaat 2280 gcattatatt ttccaaacta tacccataaa ttgtgactag taaaatactt acacagagca 2340 gaattttcac agatggcaaa aaaatttaaa gatgtccaat atatgtggga aaagagctaa 2400 cagagagatc attatttctt aaagattggc cataacctgt attttgatag aattagattg 2460 gtaaatacat gtattcatac atactctgtg gtaatagaga cttgagctgg atctgtactg 2520 cactggagta agcaagaaaa ttgggaaaac tttttcgttt gttcaggttt tggcaacaca 2580 tagatcatat gtctgaggca caagttggct gttcatcttt gaaaccaggg gatgcacagt 2640 ctaaatgaat atctgcatgg gatttgctat cataatattt actatgcaga tgaattcagt 2700 gtgaggtcct gtgtccgtac tatcctcaaa ttatttattt tatagtgctg agatcctcaa 2760 ataatctcaa tttcaggagg tttcacaaaa tggactcctg aagtagacag agtagtgagg 2820 tttcattgcc ctctataagc ttctgactag ccaatggcat catccaattt tcttcccaaa 2880 cctctgcagc atctgcttta ttgccaaagg gctagtttcg gttttctgca gccattgcgg 2940 ttaaaaaata taagtaggat aacttgtaaa acctgcatat tgctaatcta tagacaccac 3000 agtttctaaa ttctttgaaa ccactttact acttttttta aacttaactc agttctaaat 3060 actttgtctg gagcacaaaa caataaaagg ttatcttata gtcgtgactt taaacttttg 3120 tagaccacaa ttcacttttt agttttcttt tacttaaatc ccatctgcag tctcaaattt 3180 aagttctccc agtagagatt gagtttgagc ctgtatatct attaaaaatt tcaacttccc 3240 acatatattt actaagatga ttaagactta cattttctgc acaggtctgc aaaaacaaaa 3300 attataaact agtccatcca agaaccaaag tttgtataaa caggttgcta taagcttggt 3360 gaaatgaaaa tggaacattt caatcaaaca tttcctatat aacaattatt atatttacaa 3420 tttggtttct gcaatatttt tcttatgtcc acccttttaa aaattattat ttgaagtaat 3480 ttatttacag gaaatgttaa tgagatgtat tttcttatag agatatttct tacagaaagc 3540 tttgtagcag aatatatttg cagctattga ctttgtaatt taggaaaaat gtataataag 3600 ataaaatcta ttaaattttt ctcctctaaa aactgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3659 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mKK2_A primer <400> 3 cagagatggg atgtgttgcc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mDKK2_A primer <400> 4 cctgatggag cactggtttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mDKK2_B primer <400> 5 gatgggtttt gttgtgctcg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mDKK2_B primer <400> 6 atgtttcagg ttcaggggga 20

Claims (14)

1. DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 내피세포 재생용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 내피세포는 음경 해면체 내피세포 또는 음경 혈관내피세포인 것인 조성물.
3. DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
4. 제3항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 것인 조성물.
5. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 음경해면체 내압을 증가시키는 것인 조성물.
6. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 내피세포에서 내피세포 특이적인 단백질의 수준을 증가시키는 것인 조성물.
7. 제6항에 있어서, 상기 내피세포 특이적인 단백질은 PECAM-1 (platelet/endothelial cell adhesion molecule-1)인 것인 조성물.
8. 제3항에 있어서, 상기 발기부전은 음경내피세포 손상에 의하여 야기된 것인 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 음경내피세포 손상은 고지질혈증 및 당뇨병 중 하나이상에 의하여 야기된 것인 조성물.
10. 제3항에 있어서, 상기 조성물은 주사용 제형인 것인 조성물.
11. 내피세포 재생에 유효한 양의 DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 내피세포 재생용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 내피세포를 재생시키는 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 투여는 음경 해면체 내에 투여하는 것인 방법.
13. 발기부전을 치료하기에 유효한 양의 DKK2 단백질 또는 그를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 발기부전 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 발기부전을 예방 또는 치료하는 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 투여는 음경 해면체 내에 투여하는 것인 방법.

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